CA1203741A

CA1203741A - Process for the detection and assay of a biological substance by erythroadsorption

Info

Publication number: CA1203741A
Application number: CA000438301A
Authority: CA
Inventors: Jean-Luc Guesdon; Stratis Avrameas
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1983-10-04
Filing date: 1983-10-04
Publication date: 1986-04-29

Abstract

" Procédé de détection et de dosage d'une substance biologique par érythroadsorption" 1. Procédé de détection d'une substance biologique immobilisée sur un support. 2. Il consiste : 1) à faire incuber, après lavage, la substance immobilisée sur un support avec le produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes; 2) à ajouter des érythrocytes ; 3) à plonger l'ensemble dans une solution d'un agent fixateur, 4) à mesurer l'érythroadsorption, après avoir retourné le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi."Method for detecting and dosing a biological substance by erythroadsorption" 1. Method for detecting a biological substance immobilized on a support. 2. It consists of: 1) incubating, after washing, the substance immobilized on a support with the coupling product of a specific ligand and of a ligand capable of reacting with erythrocytes; 2) adding erythrocytes; 3) immerse the assembly in a solution of a fixing agent, 4) measure the erythroadsorption, after having inverted the support in order to allow the elimination of unreacted red blood cells.

Description

7L?~
1.

" Proc~dé de détection et de dosage d'une substance biologique par érythroadsorption "
La présente invention est relative au domai~
ne biologique et plus particuli.èrement à la mise en ~-5 vidence, par érythroadsorption, d'une substance biologi-que immobilisée sur un support.
Elle concerne notamment des perfectionnements au procé~dé de détection et de closage d'une substance biologique par ~rythroadsorption d~crit dans la demande 10 de brevet FR 80 15 293, publiée 15 Jan.1982, no.~,486,657.
Dans cette demande de brevet FR 80 15 2~3 on a d~jà décrit un procédé de mise en évidence et de dosa-ge d'une substance biologique par érythroadsorption. Ce procede met en oeuvre, à ti~re de r~actif de dosage, le 15 produit de couplage d'un ligand spécifique et d'un li-gand capable de réagir avec des érythrocytes, et des é-rythrocytes ~ titre de révélateur.
Ce proc~dé de détection et de dosage d'une substance biologique par ~rythroadsorption consiste :
1~ à immobiliser sur un support une substance ayant une affinit~ de fixation pour la subst2nce biolo-gique ~ doser; 7L? ~
1.

"Process for detecting and dosing a substance biological by erythroadsorption "
The present invention relates to domai ~
not biological and more particularly to the setting ~ -5 evidence, by erythroadsorption, of a biological substance that immobilized on a support.
It concerns in particular improvements to the process of detecting and closing a substance biological by ~ rhythmroadsorption described in the request 10 of patent FR 80 15 293, published Jan 15, 1982, no. ~, 486,657.
In this patent application FR 80 15 2 ~ 3 on ad ~ jà describes a process of highlighting and dosa-age of a biological substance by erythroadsorption. This method implements, ti ~ re r ~ assay active, 15 coupling product of a specific ligand and a li-gand capable of reacting with erythrocytes, and rhythm cells ~ as developer.
This process of detecting and dosing a biological substance by ~ rythroadsorption consists of:
1 ~ to immobilize a substance on a support having a fixing affinity for the biologic substance gique ~ dose;

2) à ~aire incuber cette substance avec le milieu liquide contenant la ~,ubstaDce biologique à do-25 ser; 2) to ~ incubate this substance with the liquid medium containing the ~, biological ubstaDce to do-25 ser;

3~ a faire incuber, après lavage, le milieu r~actionnel r~sultant avec le produit de couplage d'un ligand sp~ci~ique et dlun ligand capable de r~agir avec des ~rythrocytes; 3 ~ to incubate, after washing, the medium r ~ action r ~ sultant with the coupling product of a specific ligand and a ligand capable of reacting with ~ rhythm cells;

4) ~ ajouter des érythrocytes; et 4) ~ add erythrocytes; and

5) à déterminer l'érythroadsorption.
Ce proc~d~ est approprié pour doser, ~ titre de substances biologiques, des antig~nes, des anticorps, des haptènes, des hormones, des immunoglobulines et 35 au-tres substances d'int~rêt biologique.

~t~
~' 4~L

Selon les enseignements de ce brevet FR
80 15 2~3 la détermination de l'érythroadsorption peut se faire de plusieurs façons.
Par exemple, on peut constater visuellement 5 que les globules rouges sont adsorbés à la surface du support sur lequel a ét~ immobilis~e la substance ayant une af~inité de fixation pour la substance biologique à
doser. Dans ce cas, le procédé permet d'identifier dans un liquide biologique donné une subs-tance biologique 10 particulière. Si, au contraire, le liquide biologique ne contient pas la substance biologique particulière, les érythrocytes ne sont pas adsorbés et forment un cu-lot au fond du récipient, par exemple des puits de la microplaque. Le procédé de dosage par érythroadsorption 15 selon ce brevet FR 80 15 293 permet aussi de déterminer quantita~tivement une substance biologique donn~e. A cet effet, on élimine les globules rouges n'ayant pas réagi, par exemple par aspiration à la pipette. Puis on lyse les érythrocytes adsorbés, par exemple à l'eau distil-20 l~ée, et on dose par spectrophotom~trie les substanceslibér~es par les globules rouges, par exemple l'hémoglo-bine ou les substances arti~iciellement introduites par l'expérimentateur.
L'hémoglobine peut également etre dosée par ~5 une réaction enzymatique Par exemple, on peut utiliser un des substrats de la peroxydase, tels que l'ortho~di-anisidine ou l'ortho-phénylè~e-diamine La lecture se ~ait aussi par spectrophotom~trie à 400 nm pour l'ortho-dianisidine et à 492 nm pour l'ortho-ph~nylène-diamine.
La quantit~ de substances libér~es par les globules rouges, par exemple la quantité d'hémoglobine lib~r~e, est proportionnelle à la quantité de la subs-tance ~ doser, ce qui permet d'obtenir, par exemple, le dosage d'un ant.g~ne ou d'un anticorps présent dans l'é-35 chantillon en se r~férant à une gamme étalon d'hemolyse ~ ~l~w~

3~

des globules rouges ~tablie dans les memes conditions.
La détermination quantitative de l'~rythroad-sorption dé~inie ci-dessus nécessite donc l'~limination des globules rouge~ n'ayant pas r~agi et le dosage des 5 substances lib~r~es par les globules rouges ou des sub~
tances arti~ieiellement introduites par l'expérimenta-teur Dans ce proc~d~, la substance biologique ~
doser est immobilis~e sur ur. support par fixation sp~-10 eifique, e'est-à dire par l'interm~diaire dtune subs-tance ayant une affinit~ de fixatio~ pour la substance biologique à d~terminer.
On peut ~galement déterminer par ~rythroad-sorption~ selon le même mode op~ratoire, des substances 15 fixées sur un support par tout autre moyen, par exemple par adsorption passive ou par liaison chimique.
~ n a maintenant trouvé que la d~termination de l'erythr~adsorption peut etre effectu~e sans mettre en oeuvre une ~tape de dosage des substances lib~ré2s 20 par les globules rouges ayant ét~ adsorbé~ ou des subs-tances introduites par l'exp~rime~tateur Cette détermi-nation s'effectue d'une mani~re plus simple et permet u-ne meilleure quantification que celle d~crite dans le bre~et FR 80 15 293.
Ainsi, la pr~sente invention concerne un pro-c~d~ de d~tection et/ou de dosa~e, par érythroadsorp-tion, d'une substance biologique im~lobilisée sur un ~upport qui consiste ~ d~terminer llérythr~adsorption après avoir, d'une part élimin~ les globules rouges n'-30 ayant pas r~agi et d'autre part fix~ chimiquement sur l'immunoadsorbant les globules rouges adsorb~s, unique-Tnent par mise en oeuvre d'une ~olution d'un agent ixa-teur ~
Sous son aspect le plus ~éneral, la presente invention concerne un procede de dosage ~ualitatif etquantitat:if ~A

3a.

d'une substance biologique immobilisee sur un support, caract~rise en ce qu'il consiste~ tl) ~ faire incuber la substance immobilisee sur un support avec le produit de couplage d'un ligand sp~cifique et d~un ligand capable de reagir avec des erythrocytes; (2) ~ ajouter des érythrocytes; (3) a mettre l'ensemble en contac~ avec une solution d'un agent fixateur en séparant les erythrocy~es non fixés sur ledit ligand, (4~ ~ mesurer l'érythroad-sorption.
Sous un autre aspect le procede de dosage quali-tatif ou quantitatif d'une substance biologique par ~rythroadsorption consiste ~ immobiliser sur un support une substance ayant une affinite de fixation pour la substance biologique a doser, a faire incuber ladite substance immobilisee avec le milieu liquide contenant la ~ubstance biologique ~ doser, a faire incuber aprés lavage, le milieu réactionnel résultant avec le produit de couplage d'un ligand specifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes, a ajouter des erythrocytes et a determiner llerythroadsorption spécifique par hemolyse ou comptage, ledit procede etant caracterisé en ce que, aprés avoir ajouté les erythrocytes, on met en contact avec une solution d'un agen~t de fixation en separant les érythrocytes non fixés sur le ligand~ avant la mesure de 2S l'erythroadsorption Sou~ un autre aspect le presente invention concerne un coffret pour le dosage d'une substance bio-logique par ledit procédé caractérise en ce qu'il comporte: des anticorps anti-substance biologique a doser couples ~ un ligand susceptible de reagir avec des erythorcytes; du tampon phosphate; une solution d'agent fixateur; un support; et un support de reférence.
Sous un autre aspect le procéde consiste:

:35 1) ~ faire incuber, après lavage, la substan-ce immobilisée sur un support avec le produit de cou-plage d'un ligand spécifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes;
2) ~ ajouter des ~rythrocytes;
3) à plonger l'ensemble dans une solution d'~
un agent fixateur, 4) à mesurer l'é;rythroadsorption, apr~s avoir retourné le support a~in de permettre l'~limination des 10 globules rouges n'ayant pas réagi.
A l'aide de la solution d'agent fixateur mise en oeuvre dans le procédé de l'invention, on fixe chimi-quement les ~rythrocytes adsorb(és à la surface du sup-port sur lequel a été immobilisée la substance biologi-15 que à mettre en évidence et on per~et l'élimination ra-pide des érythrocytes n'ayant pas réagi. Ainsi il se forme sur le support un tapis homogène d'~rythrocytes adsorbés et ~ixés chimiquement, dont la densit~ est fonction de la concentration de la substance à mettre 20 en évidance.
Par "agent ~ixateur" selon l'invention on dé~
signe tout a~ent capable de fixer les érythrocyte~ sur le support tout en évitant l'h~molyse de ceux-ci.
On r~alise :Eréque~ment des fixations de cellu-25 les vivantes en histologie pour l'~tude de celles-ci.
Les agents fixateu~s mis en oeuvre ~ cet ef~et doivent être t~ls qu'ils permettent la ~ixation desdites cellu-les avec un minimum de perturbations des structure~ cel-lulaires (voir Histochemistry, PEARSE Churchill Living-30 stone 3e ed. 1968 et "La Cellule" ~. DURAND et B. FAVARDCollec~ion Hexmann Paris 1967).
Dans le cas présent, il importe peu qu'il y ait ou non des perturbations des structures cellulaires, mais il est impéra-tif que la fixation, lorsqu'elle a 35 lieu, soit ~aite dans des condi-tions qui évitent l'hémo-lyse des érythrocytes.
La plupart des agents fixateurs monofonction-nels ou plurifonctionnels couramment utilisés dans le domaine de l'histologie conviennent aux ~illS de l'in-S vention, en particulier les aldéhydes, tels que le ~or-maldéhyde, le glutaraldéhyde, ce dernier étant préf~ré.
La concentration de la solution en l'agent fixateur doit être suffisante pour permettre la fixa-tion chimique des érythrocytes ayant réagi, mais elle 10 ne doit pas atteindre la concentration qui provoquerait une ~ixation en masse de tous les érythrocytes.
A titre d'exemple, on indiquera que, lorsque l'agent fixateur est le glutaraldéhyde, la concentration de la solution doit être comprise entre 0,1 et 0,5 % en 15 poids.
Le produit de couplage mis en oeuvre à titre de réacti~ dans le proc~dé selon l'invention est le pro-duit de couplage d'un ligand sp~cifique et d'un ligand capable de réagir avec des érythrocytes Par "li~and" spéci~ique on désigne dans la pr~ésente description toute substance soluble qui peut r~agir de façon spécifique avec la substance ayant une affinit~ pour la substance biologique ~ doser ou avec la substance biologique elle-même.
Par "substance soluble" on désigne dans la pr~sente descri~tion toute substance soluble dans les milieux couramment utilisés pour les ré~actions biologi-ques. Il peut s'agir de milieux aqueux, tels que les milieu~ physiologiques, ou des m~langes de milieux a-30 queux et organiques De plus~ le ligand spécifique mis en oeuvre doit être tel que le produit de couplage ligand spéci-~ique-ligand capable de réagir avec des érythrocytes soit soluble en milieu aqueux.
Par "milieu aqueux", on d~signe selon l'in-~3~

vention les milieux aqueux, tamponnés ou non, couram-ment utilisés dans le domaine biologique, tels que les solutions tampon phosphate, les solutions tampons conte-nant un d~tergent, tel que le Tween*ou de la gélatine, 5 la s~rumalbumine bovine, la lactalbumine bovine et au-tres substances habituellement mises en oeuvre dans de tels domaines.
Les ligands sp~ci~iques r~pondant ~ une telle d~finition sont notamment les anticorps, les antig~nes lO macromol~culaires, les haptènes, les hormones et leurs r~cepteurs et substances similaires. Parmi les ligands sp~cifiques cités ci-dessus, on utilise le plus commu-n~ment les anticorps et les antigènes.
Le ligand capable de r~agir avec de~ érythro-15 cytes est une substance qui possède des sites de recon-~aissance de d~terminants spécifiques des ~rythrocytes ou des substances fix~es sur des ~rythrocytes.
A titre de tels ligands, on peut citer les anticorps anti-globules rouges, l'avidine, la biotine 20 e~ produits analogues On peut ~galement utiliser une lectine. Ainsi, le produit de couplage d'un ligand sp~-cifique avec un ligand capable de r~agir avec des éry-throcytes peut être le produit de couplage entre une leotine et un ligand sp~ci~ique, tel que décrit dans le 25 brevet FR 80 11 470, publiée 27 Nov. 1981, no 2,482,981, cite a titre de reférence. Le produit de couplage d'un ligand specifique avec un ligand capable de reagir avec des ~rythrocytes peut egalement être le produit de couplage entre une albumine et un ligand specifique, tel 30 que decrit dans la demande de brevet FR 82 04 247, publiee 12 Mars.1982,no.2,523,311, cit~ a titre de reference.
La détermination de 1' rythroadsorption peut être e~fectu~e soit visuellement, soit avec un photomè-tre r~glé ~ 414 nm, une loupe binoculaire ou un micros-35 cope invers~.
Le proc~d~ de l'invention est appropri~ pour * marque de commerce.

~` t~ J 1~ IL
7.

mettre en évidence, soit de manière quantitative, soitde manière qualitative, toute substance immobilisée sur un support d'une façon quelconque.
A titre de support, on peut utiliser n'impor-5 te quel support insoluble plat, présentant ou non descavités, tel que par exemple des feuilles ou bandes, des microplaques ou des tubes.
A titre de substance constitutive de tels supports, on peut utiliser la cellulose et ses dérivés, 10 le polyacrylamide, les polyméthacrylates d'alkyle et autres polym~res d'origine naturelle ou synthétique ainsl ~ue le verre.
On utilise avantageusement des microplaques pour immobiliser la substance biologique à doser, par 15 exemple des microplaques en polystyrène, ayant de~
puits en forme de U ou de V ou des puits ~ fond plat.
On peut également utiliser de3 tubes individuels ainsi que des supports plats, par exemple des feuilles de ni-trate de cellulose.
Par exemple, lorsque le support est une feuil-le de nitrate de cellulose, :La substance à mettre en é-vidence peut y être fixée ou déposée directement ou in-directement, par exemple par empreinte après une élec-trophorèse. De cette manière, on peut mettre en éviden-25 ce des IgG humaines.
Le proc~dé de l'invention convient également pour la détection des clônes d'hybridomes qui synthéti-sent des anticorps spbci~iques des antigènes ayant ser-vi à la fabrication dasdits hybridomes. Dans ce cas, on 30 pr~lève les surnageants des clônes, on fixe les surna-geants sur le nitrate de cellulose en ~euille et on ré-vèle la présence de l'anticorps en ajoutant un antigène spécifiq~e marqu~ avec un ligand capAble de réagir avec les érythrocytes Selon le procédé de l'invention, on peut met-~3~
~.

tre en évidence aussi bien une substance isol~e, qu'une substance contenue dans un milieu impur, étant donné que l'on met en oeuvre un réactif spéci~ique de la substance à déterminer S Selon une autre variante du procédé de l'~n-vention la substance biologique à mettre en ~vidence peut etre immobilisée sur le suppor-t d'une mani~re spé~
cifique, c'est-à dire par l'intermédiaire d'une substan-ce ayant une a~finité de ~ixation pour la substance bio-10 logique considérée.
Dans ce cas particulier, on immobilise tout d'abord sur le support une substance ayant une a~finité
de ~ixation pour la substance biologique à doser, puis on fait incuber cette substance ainsi immobilisée avec 15 le milieu liquide contenant la substance biologique à
déterminer; on peut alors effsctuer une détermination ~uantitative ou dosage. Sous cet aspect, le proc~dé de l'invention concerne un perfectionnement au proc~dé de détection et de dosage, par érythroadsorption d'une 20 substance biologique décrit dans la demande de brevet FR 80 15 2g3.
Selon cette variante, le procéd~ de l'inven-tion consiste :
1) ~ immobiliser sur un support une substance 25 ayant une a~inité de fixation pour la substance biolo-gique ~ doser;
2) ~ faire incuber cette substance avec le mi-lieu liquide contenant la substance biologique à doser;
3) ~ faire incuber, après lavage, le milieu 30 réac-tionnel résultant avec le produit de couplage d'un ligand sp~ci~ique et d'un ligand capable de reagir avec des ~rythrocytes;
4) à ajouter des ~rythrocytes;
5) ~ plonger l'ensemble dans une solution d'un 35 agent ~ixate~ur. 5) to determine erythroadsorption.
This process is suitable for metering, of biological substances, antigens, antibodies, haptens, hormones, immunoglobulins and 35 other substances of biological interest.

~ t ~
~ ' 4 ~ L

According to the teachings of this FR patent 80 15 2 ~ 3 the determination of erythroadsorption can be done in several ways.
For example, we can see visually 5 that red blood cells are adsorbed on the surface of the support on which has been ~ immobilized ~ e the substance having af ~ initiation of fixation for the biological substance to dose. In this case, the method makes it possible to identify in a biological fluid given a biological substance 10 particular. If, on the contrary, the biological fluid does not contain the particular biological substance, the erythrocytes are not adsorbed and form a cu-batch at the bottom of the container, for example wells of the microplate. The erythroadsorption assay process 15 according to this patent FR 80 15 293 also makes it possible to determine quantitatively a given biological substance. In this effect, we eliminate the unreacted red blood cells, for example by aspiration with a pipette. Then we lyse erythrocytes adsorbed, for example in distilled water 20 l ~ ée, and we dose by spectrophotom ~ sort the substances released ~ es by red blood cells, for example hemoglo-bine or the substances arti ~ here introduced by the experimenter.
Hemoglobin can also be measured by ~ 5 an enzymatic reaction For example, one can use one of the substrates of peroxidase, such as ortho ~ di-anisidine or ortho-phenyle ~ e-diamine Reading ~ also by spectrophotom ~ sorts at 400 nm for ortho-dianisidine and at 492 nm for ortho-ph ~ nylene-diamine.
The quantity of substances released by red blood cells, such as the amount of hemoglobin lib ~ r ~ e, is proportional to the quantity of the subs-tance ~ doser, which allows to obtain, for example, the dosage of an ant.g ~ ne or an antibody present in the 35 sample referring to a standard range of hemolysis ~ ~ l ~ w ~

3 ~

red blood cells ~ established under the same conditions.
The quantitative determination of the ~ rythroad-sorption de ~ inie above therefore requires ~ elimination red blood cells which have not reacted and the dosage of 5 substances released by red blood cells or sub ~
tances artificially introduced by the experimenta-tor In this process ~ d ~, the biological substance ~
dosing is immobilized on ur. support by fixing sp ~ -10 eifique, that is to say through dtune subs-tance having an affinity ~ of fixatio ~ for the substance biological to be determined.
We can also ~ determine by ~ rythroad-sorption ~ in the same op ~ mode ratoire, substances 15 fixed on a support by any other means, for example by passive adsorption or by chemical bond.
~ now only found the determination erythr ~ adsorption can be done without putting implement a ~ dosing tape for lib substances re2s 20 by red blood cells having been ~ adsorbed ~ or subs-tances introduced by the experimenter This determi-nation is carried out in a simpler way and allows u-no better quantification than that described in the bre ~ and FR 80 15 293.
Thus, the present invention relates to a pro-c ~ d ~ d ~ tection and / or dosa ~ e, by erythroadsorp-tion of a biological substance im ~ immobilized on a ~ upport which consists ~ d ~ complete llerythr ~ adsorption after having, on the one hand eliminated ~ the red blood cells do 30 having not reacted and on the other hand chemically fixed on the immunoadsorbent red blood cells adsorb ~ s, unique-Tnent by implementing a ~ olution of an agent ixa-tor ~
In its most general aspect, the present The invention relates to a dosing method ~ quantitative and quantitative: if ~ A

3a.

of a biological substance immobilized on a support, character ~ it consists of ~ tl) ~ incubate the substance immobilized on a support with the product of coupling of a specific ligand and a capable ligand to react with erythrocytes; (2) ~ add erythrocytes; (3) to put the whole in contact with a solution of a fixing agent by separating erythrocytes ~ es not attached to said ligand, (4 ~ ~ measure erythroad-sorption.
In another aspect the qualitative dosing process tative or quantitative of a biological substance by ~ rhythmroadsorption consists of immobilizing on a support a substance with a binding affinity for biological substance to be dosed, to be incubated substance immobilized with the liquid medium containing the ~ biological material ~ to dose, to incubate after washing, the resulting reaction medium with the product of coupling of a specific ligand and a capable ligand to react with erythrocytes, to add erythrocytes and to determine specific erythroadsorption by hemolysis or counting, said method being characterized in that, after adding the erythrocytes, we put in contact with a solution of a fixing agent by separating the erythrocytes not attached to the ligand ~ before measuring 2S erythroadsorption Sou ~ another aspect the present invention concerns a box for the dosing of a bio-logic by said process characterized in that it contains: anti-biological substance antibodies to be assayed couples ~ a ligand likely to react with erythorcytes; phosphate buffer; agent solution fixer; a support; and a reference support.
In another aspect the procedure consists:

: 35 1) ~ incubate, after washing, the substance this immobilized on a support with the product of range of a specific ligand and a ligand capable of react with erythrocytes;
2) ~ add ~ rhythm cells;
3) immerse the assembly in a solution of ~
a fixing agent, 4) to measure e; rhythmroadsorption, after having returned the media to allow the removal of 10 unreacted red blood cells.
Using the fixing agent solution used in the process of the invention, chemically fixed only ~ adsorbed rhythocytes (és on the surface of the sup-port on which the biological substance was immobilized 15 that to highlight and we per ~ and elimination ra-pid unreacted erythrocytes. So it turns out forms on the support a homogeneous mat of ~ rhythm cells adsorbed and ~ chemically attached, the density of which is depending on the concentration of the substance to be put 20 in evidence.
By "agent ~ ixator" according to the invention we de ~
signs all ~ ent capable of fixing the erythrocyte ~ on the support while avoiding the h ~ molyse thereof.
We realize: Ereque ~ ment of cell fixings 25 living in histology for the study of these.
The fixing agents used in this effort and must be t ~ ls they allow the ~ ixation of said cells-them with a minimum of structural disturbance ~ cel-lenses (see Histochemistry, PEARSE Churchill Living-30 stone 3rd ed. 1968 and "La Cellule" ~. DURAND and B. FAVARDCollec ~ ion Hexmann Paris 1967).
In this case, it does not matter that there whether or not there are disturbances in cell structures, but it is imperative that the fixation, when it has 35 place, or ~ aite in conditions which avoid hemo-lysis of erythrocytes.
Most single-function fixing agents nels or multifunctional commonly used in the histology field suitable for ~ illS of in-S vention, especially aldehydes, such as ~ or-maldehyde, glutaraldehyde, the latter being pref ~ re.
The concentration of the solution in the agent fixer must be sufficient to allow the fixation chemical reaction of the reacted erythrocytes, but it 10 must not reach the concentration that would cause ~ ixation en masse of all erythrocytes.
By way of example, it will be indicated that, when the fixing agent is glutaraldehyde, the concentration of the solution must be between 0.1 and 0.5% by 15 weights.
The coupling product used as of reacti ~ in the process ~ die according to the invention is the pro coupling product of a specific ligand and a ligand able to react with erythrocytes By "specific li" and "we mean in the pr ~ present description any soluble substance which may r ~ act specifically with the substance having a affinity ~ for biological substance ~ dose or with the biological substance itself.
By "soluble substance" is meant in the presents ~ descri ~ tion any substance soluble in media commonly used for biological reactions ques. They may be aqueous media, such as ~ physiological environment, or mixtures of environments a-30 tails and organic In addition ~ the specific ligand used must be such that the specific ligand coupling product ~ ique-ligand capable of reacting with erythrocytes is soluble in an aqueous medium.
By "aqueous medium", we mean ~ according to the ~ 3 ~

attention aqueous media, buffered or not, common used in the biological field, such as phosphate buffer solutions, the buffer solutions a detergent, such as Tween * or gelatin, 5 bovine rumalbumin, bovine lactalbumin and very substances usually used in such areas.
The specific ligands responding to such a definition are notably antibodies, antigens lO macromol ~ cells, haptens, hormones and their receptors and the like. Among the ligands specific above, we use the most common n ~ ment antibodies and antigens.
The ligand capable of reacting with erythro-15 cytes is a substance that has recognition sites ~ growth of specific determinants of ~ rhythm cells or substances fixed on ~ rhythm cells.
As such ligands, mention may be made of antibodies to red blood cells, avidin, biotin 20 e ~ similar products We can also ~ use a lectin. So the coupling product of a sp ~ ligand -specific with a ligand capable of reacting with ery-throcytes may be the coupling product between a leotin and a sp ~ ci ~ ic ligand, as described in 25 patent FR 80 11 470, published 27 Nov. 1981, no 2,482,981, cites as a reference. The coupling product of a specific ligand with a ligand capable of reacting with ~ rhythm cells can also be the product of coupling between an albumin and a specific ligand, such 30 as described in patent application FR 82 04 247, published March 12, 1982, no. 2,523,311, cited for reference.
Determination of rhythmroadsorption can be e ~ fectu ~ e either visually or with a photomè-be adjusted ~ 414 nm, a binocular magnifier or a micros-35 reverse cope ~.
The process of the invention is suitable for * trademark.

~ `t ~ D 1 ~ IT
7.

highlight, either quantitatively or qualitatively, any substance immobilized on support in some way.
As support, one can use any 5 which flat insoluble support, with or without cavities, such as for example sheets or strips, microplates or tubes.
As a constituent substance of such supports, cellulose and its derivatives can be used, Polyacrylamide, polymethyl alkyl methacrylates and other polymers of natural or synthetic origin so the glass.
Advantageously, microplates are used to immobilize the biological substance to be dosed, by 15 example of polystyrene microplates, having ~
U-shaped or V-shaped wells or wells ~ flat bottom.
You can also use 3 individual tubes as well as flat supports, for example sheets of ni-cellulose trate.
For example, when the support is a film-cellulose nitrate,: The substance to be vidence can be attached or deposited directly or indirectly directly, for example by fingerprint after an election trophoresis. In this way, we can highlight 25 this human IgG.
The process of the invention is also suitable for the detection of hybridoma clones which synthesize feels spbci ~ ic antibodies of antigens having served vi the manufacture of said hybridomas. In this case, we 30 collects the supernatants of the clones, the supernatants are fixed giants on cellulose nitrate in ~ euille and we re-checks the presence of the antibody by adding an antigen specifiq ~ e marked ~ with a ligand capable of reacting with erythrocytes According to the process of the invention, it is possible to ~ 3 ~
~.

be in evidence both an isolated substance and a substance contained in an impure medium, since a specific reagent of the substance is used to be determined S According to another variant of the process of ~ n-vention the biological substance to highlight can be immobilized on the suppor-t in a way ~ re spe ~
specific, i.e. through a substance this having a ~ purpose of ~ ixation for the bio-substance 10 logic considered.
In this particular case, we immobilize everything first on the support a substance having a ~ purpose of ixation for the biological substance to be assayed, then this immobilized substance is incubated with 15 the liquid medium containing the biological substance to determine; we can then make a determination ~ uantitative or dosage. Under this aspect, the process of the invention relates to an improvement to the process of detection and assay, by erythroadsorption of a 20 biological substance described in the patent application FR 80 15 2g3.
According to this variant, the procedure of the invention tion consists of:
1) ~ immobilize a substance on a support 25 having a fixing initiation ~ for the biolo-gique ~ dose;
2) ~ incubate this substance with half liquid place containing the biological substance to be dosed;
3) ~ incubate, after washing, the medium 30 reaction resulting with the coupling product of a specific ligand and a ligand capable of reacting with ~ rhythm cells;
4) adding ~ rhythm cells;
5) ~ immerse the whole in a solution of 35 agent ~ ixate ~ ur.

6) ~ mesurer l'érythroadsorption, après avoir retourné le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas r~agi.
La substance ayant une affinité de fixation 5 vis-~-vis de la substance biologique ~ doser peut être toute substance capable de se ~ixer de façon sp~cifique avec ladite substance biologique. Par exemplej si la substance biologique à doser est un anticorps, la subs-tance ayant une af~inité de ~i~ation sera alors un an-10 tigène et r~ciproquement.
La substance ayant une a~finité de fixationpour la substance biologique à doser est immobilisée sur un support quelconque par des techniques classiques.
Les supports, par exemple ceux constitués de 15 ~euilles de nitrate de cellulose sur lesquels est fixée la substance ayant une affinité de fixation pour la substance biologique ~ doser constitue un moyen pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
Les premières étapes du procédé ci-dessus, à
20 savoir les ~tapes 1 à 3 sont réalisées conformément au brevet ~ 80 15 293. Si besoin est, 1'homme de 1'art pourxa se ré~rer à la description de ce brevet.
Cependant, on rappellera ci-après le mode o-pératoire général pour le dosage des anticorps, sans 25 pour au~ant en limiter la portée de l'invention à ce seul type de dosage.
Au cours de la première ~tape du proc~de de l'invention on immobilise sur un support des antig~nes (~g ) .
L'immobilisation des antigènes, qui consti-tuent dans ce cas particulier la substance ayant une affinité pour la substance biologique à doser, à savoir l'anticorps, est réalisée par exemple par adsorption passive ou, si nécessaire, par liaison covalente selon 35 la nature du support.

~P3~
1~ .

L'étape ~2) consiste en une incubation de 1'-antigène immobilisé avec le liquide biologique conte-nant l'anticorps (Ac) à doser, par exemple le sérum à
titrer. Après cette étape d'incubation, au cours de la-5 quelle l'antigène (Ag) interagit avec l'anticorps ~Ac)correspondant, s'il est présent dans le sérum à tester, on lave le suppor-t à l'aide d'une solution tampon, par exemple une solution de tampon phosphate contenant é-ventuellement un détergent tel que le "Tween" dénommé
10 ci~après PBS ou PBS Tween.
L'~tape (3) du procédé de l'invention consis-te à incuber le support résultant de l'étape (2) avec un produit de couplage ligand spécifique-ligand capable de r~agir avec des érythrocytes. Dans ce cas particu-15 lier, le ligand spéci~ique est un anticorps dirige con-tre les immunoglo~ulines de l'espèce humaine ou animale du s~rum à titrer. Après cette incubation, on lave le systeme résul-tant comme d~crit ci-dessus pour éliminer le produit de couplage nlayant pas réagi Puis, on ajou~
~O te des ~rythrocytes, qui sont adsorbés par le produit de couplage seulement si le sérum à titrer contient 1'-anticorps correspondant à l'antigène immobilisé, sinon les érythrocytes ne sont pas fix~és et tombent au fond du récipient Quel que soit le mode d'immobilisation de la substance biologique à d~terminer, on ajoute, selon un mode de r~alisation préféré du proc~dé de l'invention, suf~isamment d'érythrocytes pour remplir jusqu'à débor-dement les puits de la microplaque utilisée comme sup-30 port, a~in d'~viter la formation de bulles d'air dans les puits de ladite plaque. On recouvre ensuite ladite plaque, par exemple avec un film souple en matière plas-tique. Ainsi revêtue, la microplaque est plongée dans la solution d'agent ~ixateur, par exemple une solution de 35 glutaraldehyde, puis re-tournée le fond vers le haut. La ~3~
11 .

plaq~e flotte à la surface de la solution et le film est retiré En opérant de cette ~açon, les globules rouges non adsorbés sp~cifiquement sont ~liminés de la pla~ue, parce qu'ils tombent dans le fond du récipient 5 contenant la solution de l'agent fixateur.
L'action de l'agent ~ixateur, tel que le glu-tarald~hyde a deux e~ets :
1) les globules rouges trait~s par le gluta-rald~hyde décantent plus rapidement que les globules 10 rouges non trait~s;
2) les globules rouges liés de ~açoll spécifi-que 5ur la phase solide sont alors fix~s chimiquement par le glutaraldéhyde, de sorte que, la stabilit~ est augment~e.
Lorsque les globules rouges non liés sont é-liminés, la plaque est ret~urnée e~ ~vitant que les bul-les d'air p~nètrent dans les puits. Les puits, ayant re-çu un échan$illon n~gatif, sont vides. Les fonds des puits ayant reçu ltéchantillon positif sont recouverts 20 par un tapis de globules rouges dont la densit~ est fonction de la concentration de la substance à doser.
Le r~sultat final peut etre lu ~ l'oeil nu, avec un photombtre régl~ à 414 nm ou à l'aide d'une loupe binoculaire ou d'un microscope invers~.
Lorsqu'on utilise un support plat pour l'immo-bili~ation de la substance biologlque ~ mettre en ~vi-dence, par exemple une ~euille, on le ~ixe dans le ~ond d'un récipient avant l'additlon des ~rythrocytes et on opère comme ci-dessus.
Pour la mise en oeuvre du proc~dé de l'inven-tion, on met en oeuvre une suspension d'~rythrocytes dont la concentration n'a pas une importance critiqueO
Il suf~it dans la pratique de choisir une concentration capable de fournir l'~rythroadsorptioIl optimale. Grâce 35 ~ l'op~ration de retournement du support, qui constitue ~Z~3~7L.~1 12 .

une caractéristique essentielle du procéd~ de l'inven-tion, les érythrocytes éventuellement en excès ne gê-nent absolument pas la lecture, puisqu'ils sont ~limi-nés. En général, des concentrations de l'ordre de 0,5 %
5 sont convenables. On peut, cependant, sans inconvénient, utiliser des concentrations de 1 ou 2 %. On notera qu'-en dessous de 0,5 %, on n'est pas sur que l'érythroad-sorption soit optimale. Ceci constitue un avantage im-portant, car on n'a pas besoin d'étalonner de façon 10 précise la valeur des concentrations des suspensions d'érythrocytes.
Le procédé de l'invention permet d'étendre 1'-utilisation de la technique d'~rythroadsorption aux mé-thodes immuno-chimiques qui n~cessitent l'utilisation 15 d'un procédé de visualisation. Ainsi, les procédés d'au-t~radiographie, de coloration enzymatique, de fluores-cence peuvent être remplacés avantageusement par ce nou-veau procédé qui consiste à visualiser une substance en utilisant successivement un conjugué r~alisé en couplant 20 le ligand spécifique de la substance recherchée avec une lectine ou un anticorps anti-~lobules rouges, et une suspension de globules rouges.
La présente invention concerne également un co~ret pour la d~tection d'une substance biologi~ue, 25 ledit co~iret comprenant :
- des anticorps anti-substance biologique ~
doser couplés ~ un li~and susceptible de r~-agir avec des érythrocytes - du tampon PBS;
- une solution d'agent ~ixateur;
- un support - un support de r~f~rence Le support de r~férence mis en oeuvre dans le cof~ret selon l'invention est obtenu par le procédé de 35 détection de l'invention. Pour la r~alisation de ce sup-13 .

port de r~férence on immobilise une substance biologi-- que donnée avec le produit de couplage d'un ligand sp~-cifique et d'un ligand capable de réagir avec des éry-throcytes, on ajoute ensuite des érythrocytes de préfé-5 rence frais et on plonge l'ensemble dans une solution d'un agent de fixation, on retourne le support afin de permettre l'élimination des globules rouges n'ayant pas réagi et on obtient ainsi un support de référence, c'-est-à-dire un support sur lequel sont ~ixés des éryth-10 rocytes en une quantité correspondant à la substancebiologique donnée Pour illustrer mais sans aucunement limiter le perfectionnement selon l'invention, on donne les e-xemples ci-après :
15 EXE~PLE 1 : Détection qualitative d'IgG humaines adsor-b~es sur une feuille de nitrate de cellulose.
On a dépos~ 2/ul d'un tampon borate, 0,1 ~ pH
8,0 contenant des concentrations variables d'IgG humai-nes (de 100/ug/ml à l/ug/ml) sur une feuille de nitrate 20 de cellulose. Après évaporation (15 minut0s à tempéra-ture ambiante) et saturation avec de la g~latine, la feuille de nitrate de cellulose a été incub~e avec un conjugué réalisé en couplant des anticorps anti-IgG hu-maines avec des anticorps antiglobules rouges. Deux heu-25 res plus tard, la feuille a été lavée, attach~e physi-quement au fond d'un récipient. Le récipient a ensuite ét~ rempli avec une suspension (0,5 %) de globules rou-ges de mouton. Après une heure, les globules rouges ont ~té ~limin~s en renversant doucement le récipient dans 30 une solution pbysiologique tamponnée contenant 0~2 % de glutaraldéhyde. Quand tous les globules rouges ont été
~liminés~ on a retourn~ la feuille. De cette façon, il a été possible de voir un dépôt de globules rouges lors~
que la quantité d'IgG humaines fixées sur la feuille de 35 nitrate de cellulose était égale ou supérieure à 2 ng.

~P3~
14.

EXEMPLE 2 : D3sage d'IgE humaines Grâce ~ ce procédé d'élimination des érythro-cytes n'~yant pas réagi, on peut ~tablir des courbes d'étalonnage en utilisant des quantités données d'anti-S corps et d'antigènes~ telles que celles représentée surla figure annex~e, sur laquelle on a port~ en abscisses la concentration en IgE en Ul/ml de solutions connues d'IgE et en ordonnées le pourcentage d'érythroadsorp~
tion par rapport au plateau 100 % défini pour une con-10 centration en IgE de 100 UI/ml.
Pour établir cette courbe, on a procéd~ de lamanière suivante : les puits d'une plaque à fonds plats ont ~t~ remplis par 100/ul d'anticorps anti IgE (l/ug/
ml). La plaque a ~té incubée pendant 2 heures à 37~C et 15 une nuit à 4~C, puis lav~e avec du PBS contenant 0,1 %
de Tween 20. Les puits ont reçu alors 100/ul d'une dilu-tion du sérum de r~f~rence contenant une quantité connue d'IgE. La plaque a ensuite été incubée 4 heures à 37C
et 1 nuit à 4C. Après l'incubation, la plaque a été de 20 nouveau lavée et chaque puits à reçu 100/ul d'une solu-tion d'anticorps anti IgE couplés avec des anticorps anti-globules rouges de mouton. Après l'incubation (2 heures à 37C) et lavage de la plaque, les puits ont é-t~ remplis par 400/ul d'une suspension de globules rou-25 ges de mouton (0,5 %). Une heure plus tard, les globulesrouges non adsorh~s de ~açon sp~ci~ique ont été élimin~s selon le mode op~ratoire dé~crit dans l'exemple 1 et 1'-absorption de la lumière ~ 414 nm a été mesurée avec un photom~tre Titertek Multiskan MC. Les puits ayant re~u 30 la solution d'IgE ~ 100 UI/ml ont servi de réf~rence (100 % d'~rythroadso.rption) pour calculer le pourcenta-ge d'erythroadsorption.
EXEMPLE 3 :
Avec une bandelette de nitrate de cellulose préparée selon le proc~dé d~crit à l'exemple 1, on peut 3'~
15.

doser les IgG présentes dans un ~chantillon de s~rum.
L'intensit~ des taches d'érythrocytes ayant r~agi avec les anticorps anti IgG-lectine est comparée ~ celles pr~sentes sur la bandelette de r~férence et permet la 5 d~tection et le dosage des IgG pr~sentes dans ledit ~-chantillon. 6) ~ measure erythroadsorption, after having returned the support to allow the elimination of red blood cells that have not reacted.
The substance with a binding affinity 5 screws ~ ~ screw of the biological substance ~ dose can be any substance capable of binding in a specific manner with said biological substance. For example if the biological substance to be assayed is an antibody, the tance having an af ~ inity of ~ i ~ ation will then be a year-10 tigene and r ~ reciprocally.
The substance having a fixing purpose for the biological substance to be assayed is immobilized on any support by conventional techniques.
The supports, for example those made up of 15 ~ cellulose nitrate eyes on which is fixed the substance having a binding affinity for biological substance ~ dosing is a means for implementation of the method of the invention.
The first steps of the above process, to 20 know ~ steps 1 to 3 are carried out in accordance with patent ~ 80 15 293. If necessary, the skilled person pourxa re ~ rer to the description of this patent.
However, the mode o- will be recalled below.
general peratorium for antibody testing, without 25 for au ~ ant to limit the scope of the invention to this only type of dosage.
During the first stage of the process the invention immobilizes on a support antig ~ nes (~ g).
The immobilization of antigens, which constitute in this particular case kill the substance having a affinity for the biological substance to be assayed, namely the antibody, is produced for example by adsorption passive or, if necessary, by covalent bond according to 35 the nature of the support.

~ P3 ~
1 ~.

Step ~ 2) consists of an incubation of 1'-antigen immobilized with the biological fluid contained nant the antibody (Ac) to be assayed, for example the serum to titrate. After this incubation step, during the-5 which antigen (Ag) interacts with the corresponding antibody ~ Ac), if it is present in the serum to be tested, the suppor-t is washed with a buffer solution, by example a phosphate buffer solution containing é-possibly a detergent such as "Tween" called 10 ci ~ after PBS or PBS Tween.
The step (3) of the process of the invention consists to incubate the support resulting from step (2) with a specific ligand-ligand coupling product capable to react with erythrocytes. In this particular case 15 bind, the specific ligand is an antibody directed con-be the immunoglobulins of the human or animal species s ~ rum to titrate. After this incubation, the resulting system as described above to eliminate the coupling product does not react then, we add ~
~ O te ~ rythrocytes, which are adsorbed by the product only if the serum to be titrated contains 1'-antibody corresponding to the immobilized antigen, otherwise the erythrocytes are not fixed and fall to the bottom of the container Whatever the mode of immobilization of the biological substance to be determined, according to a preferred embodiment of the process of the invention, Sufficient ~ enough erythrocytes to fill until debor-the wells of the microplate used as support 30 port, to prevent the formation of air bubbles in the wells of said plate. We then cover said plate, for example with a flexible plastic film-tick. Thus coated, the microplate is immersed in the solution of agent ~ ixator, for example a solution of 35 glutaraldehyde, then re-turned the bottom up. The ~ 3 ~
11.

plaq ~ e floats on the surface of the solution and the film is removed By operating this ~ açon, the globules reds not adsorbed sp ~ specifically are ~ eliminated from the pla ~ ue, because they fall into the bottom of the container 5 containing the solution of the fixing agent.
The action of the ixing agent, such as glu-tarald ~ hyde has two effects:
1) red blood cells treated by gluta-rald ~ hyde decant faster than globules 10 untreated reds;
2) specific red blood cells of ~ açoll that 5 on the solid phase are then chemically fixed by glutaraldehyde, so that the stability is increased.
When the unbound red blood cells are eliminated, the plate is ret ~ urnate e ~ ~ as the bul-the air p ~ enter the wells. The wells, having re-received a negative sample, are empty. The funds of wells receiving the positive sample are covered 20 by a carpet of red blood cells, the density of which is depending on the concentration of the substance to be dosed.
The final result can be read with the naked eye, with a photometer adjusted to 414 nm or using a binocular magnifier or an inverted microscope ~.
When using a flat stand for immo-bili ~ ation of the biological substance ~ put in ~ vi-dence, for example a ~ euille, it is ~ ixed in the ~ ond of a container before the additive of the ~ rhythocytes and operates as above.
For the implementation of the process of the invention tion, a suspension of ~ rhythm cells is used whose concentration is not of critical importance It is enough in practice to choose a concentration able to provide optimal rhythmroadsorption. Thanks 35 ~ op ~ ration reversal of the support, which constitutes ~ Z ~ 3 ~ 7L. ~ 1 12.

an essential characteristic of the procedure of the invention tion, possibly excess erythrocytes do not interfere with do not read at all, since they are ~ limited born. In general, concentrations of around 0.5%
5 are suitable. We can, however, without inconvenience, use concentrations of 1 or 2%. Note that-below 0.5%, we are not sure that the erythroad-sorption is optimal. This is an im-bearing because there is no need to calibrate 10 specifies the value of the concentrations of the suspensions erythrocytes.
The method of the invention makes it possible to extend 1'-use of ~ rhythmroadsorption technique immuno-chemical methods which require use 15 of a display method. Thus, the processes of t ~ radiography, enzymatic staining, fluorescence cence can be replaced advantageously by this new calf process which consists in visualizing a substance in successively using a conjugate r ~ produced by coupling 20 the specific ligand of the desired substance with a lectin or an antibody to ~ red lobules, and a suspension of red blood cells.
The present invention also relates to a co ~ ret for the detection of a biological substance, 25 said co ~ iret comprising:
- anti-biological substance antibodies ~
dosing coupled ~ a li ~ and likely to r ~ -act with erythrocytes - PBS buffer;
- a solution of agent ~ ixator;
- a support - a reference support The reference support used in the cof ~ ret according to the invention is obtained by the process of 35 detection of the invention. For the realization of this sup-13.

port of reference ~ we immobilize a biological substance - that given with the coupling product of a ligand sp ~ -cific and a ligand capable of reacting with eryth-throcytes, we then add erythrocytes of 5 fresh rence and the whole is immersed in a solution a fixing agent, the support is turned over in order to allow the elimination of red blood cells that do not have reacted and we thus obtain a reference support, that is to say a support on which are ixed eryth-10 rocytes in an amount corresponding to the given biological substance To illustrate but in no way limit the improvement according to the invention, the e-xample below:
15 EXE ~ PLE 1: Qualitative detection of human IgG adsor-b ~ es on a sheet of cellulose nitrate.
~ 2 / µl of borate buffer, 0.1 ~ pH was deposited 8.0 containing varying concentrations of human IgG
nes (100 / ug / ml to l / ug / ml) on a nitrate sheet 20 of cellulose. After evaporation (15 minutes at room temperature) ambient) and saturation with Latin g, the cellulose nitrate sheet was incubated with a conjugate produced by coupling anti-IgG antibodies to hands with red anti-globule antibodies. Two hours 25 res later, the sheet was washed, attached ~ e-only at the bottom of a container. The container then was ~ filled with a suspension (0.5%) of red blood cells sheep ages. After an hour, the red blood cells have ~ tee ~ limin ~ s by gently inverting the container in 30 a buffered physiological solution containing 0 ~ 2% of glutaraldehyde. When all the red blood cells have been ~ eliminated ~ we turned ~ the sheet. In this way, it was able to see a deposit of red blood cells during ~
that the amount of human IgG fixed on the sheet 35 cellulose nitrate was 2 ng or more.

~ P3 ~
14.

EXAMPLE 2: D3age of human IgE
Thanks to this erythro- elimination process cytes not reacting, we can establish curves calibration using given amounts of anti S body and antigens ~ such as those shown in the appended figure ~ e, on which we have port ~ on the abscissa the IgE concentration in IU / ml of known solutions of IgE and on the ordinate the percentage of erythroadsorp ~
compared to the 100% plateau defined for a con-10 IgE centering of 100 IU / ml.
To establish this curve, we proceeded in the following way: the wells of a flat bottom plate were ~ t ~ filled with 100 µl anti IgE antibody (l / µg /
ml). The plate was incubated for 2 hours at 37 ° C. and 15 overnight at 4 ~ C, then washed with PBS containing 0.1%
Tween 20. The wells then received 100 µl of a diluent.
tion of reference serum containing a known amount of IgE. The plate was then incubated for 4 hours at 37C.
and 1 night at 4C. After incubation, the plate was 20 washed again and each well received 100 µl of solution tion of anti IgE antibodies coupled with antibodies sheep red blood cells. After incubation (2 hours at 37C) and washing the plate, the wells were t ~ filled with 400 μl of a suspension of red blood cells 25 sheep (0.5%). One hour later, the non-adsorbed red blood cells of ~ a ~ specific ace were eliminated ~ s according to the op ~ ratoire mode described in Example 1 and 1'-light absorption ~ 414 nm was measured with a Titertek Multiskan MC photometer. Wells having received 30 the IgE solution ~ 100 IU / ml served as a reference (100% ~ rythroadso.rption) to calculate the percenta-erythroadsorption ge.
EXAMPLE 3:
With a strip of cellulose nitrate prepared according to the process described in Example 1, we can 3 '~
15.

assay the IgG present in a sample of s ~ rum.
The intensity of erythrocyte stains having reacted with anti IgG-lectin antibodies are compared ~ those present on the reference strip and allows the 5 detection and assay of IgG present in said ~ -sample.

Claims

1.Qualitative and quantitative dosing process of a biological substance immobilized on a support, characterized in that it consists:

1) to incubate the immobilized substance on a support port with the coupling product of a specific ligand and a ligand capable of reacting with erythrocytes;
2) adding erythrocytes;
3) to put the whole in contact with a solution of fixing agent by separating erythrocytes not fixed on said ligand, 4) to measure erythroadsorption.

2. Method according to claim 1 characterized in that that the separation of non-fixed erythrocytes is done by rotation of the support in a bath of fixing agent.

3. Method according to one of claims 1, charac-terized in that the fixing agent solution is a solution buffered glutaraldehyde, at a concentration of 0.1 to 0.5% by weight approximately.

4. Method according to one of claims 1 to 3 characterized in that a flat support is used as support for immobilizing the biological substance to be assayed.

5. Method according to one of claims 1 to 3 charac-in that we use a flat support as support to immobilize the biological substance to be dosed, and charac-terized in that the flat support is a sheet or a strip in cellulose nitrate.

6. Method according to one of claims 1 to 3 charac-in that we use a flat support as support to immobilize the biological substance to be dosed, and charac-terized in that the support is fixed in a container for be saturated with erythrocytes before the whole is introduced, with inversion, in the bath of fixing agent.

7. Method according to one of claims 1 to 3 characterized in that the support is a microplate having wells.

8. Method according to one of claims 1 to 3 characterized in that the support is a microplate having wells, and characterized in that the microplate well with erythrocytes, before cover the plate with a flexible plastic film, and to immerse the plate thus coated in a solution of a fixing agent then, to invert the plate and remove the plastic film, after which it is left to settle unreacted erythrocytes before measuring erythroadsorption.

9, Qualitative or quantitative dosing process of a biological substance by substantial erythroadsorption to immobilize on a support a substance having a binding affinity for the biological substance to be assayed, incubating said immobilized substance with the medium liquid containing the biological substance to be dosed, to be made incubate after washing, the resulting reaction medium with the coupling product of a specific ligand and a ligand able to react with erythrocytes, to add erythrocytes and to determine specific erythroadsorption by hemolysis or counting, said process being characterized by which, after adding the erythrocytes, we put in contact with a solution of a fixing agent, separating the erythrocytes not attached to the ligant, before measuring erythroadsorption.

10. Process according to claim 9 characterized in what separation of unbound erythrocytes is done by inversion of the support in a bath of fixing agent.

11. Method according to one of claims 9 characterized in that the fixing agent solution is a buffered glutaraldehyde solution of high concentration taken between 0.1 and 0.5% by weight approximately.

12. Method according to one of claims 9 to 11 characterized in that a sheet or strip of cellulose nitrate as support.

13. Method according to one of claims 9 to 11 characterized in that a well microplate is used as support.