BRPI1107432A2 - Inibidores das enzimas poligalacturonases de fungos fitopatogênicos - Google Patents

Abstract

INIBIDORES DAS ENZIMAS POLIGALACTURONASES DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS A presente invenção se refere a um método para desenhar computacionalmente novos compostos com potencial função inibitória da enzima endopoligalacturonase e envolvida em processos de invasão cm céIulas vegetais. Notadamente, uma das principais aplicações desta tecnologia consiste no desenvolvimento de inibidores de enzimas de fungos patogênicos dc solo do gênero Fusarium, envolvidos em uma série de fitopatogenias, responsáveis por grandes prejuízos à agricultura.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção: “INIBIDORES DAS ENZIMASPOLIGALACTURONASES DE FUNGOS FITOPATOGÊNICOS”.

CAMPO DA INVENÇÃO O presente documento de patente refere-se a um método para desenhar 5 computacionalmente novos compostos com potencial função inibitória da enzima endopoligalacturonase produzida por fungos fitopatogênicos e envolvida em processos de invasão destes fungos em células vegetais. Um enfoque especial é dado às enzimas de fungos patogênicos de solo do gênero Fusarium, envolvidos em uma série de fitopatogenias e responsáveis por amplo espectro de prejuízos à Agricultura.

ESTADO DA TÉCNICA

Grande parte das doenças de plantas que causam prejuízos para a agricultura brasileira e mundial é causada por fungos fitopatogênicos, e a maioria deles de solo. Seria ideal a redução do potencial patogênico destes fungos em áreas infestadas de forma a permitir o plantio. Uma medida que tem sido utilizada é a de incorporação de 15 matéria orgânica no solo, já que a introdução de antagonistas é uma medida de controle biológico. Entretanto, os índices de controle obtido com este método, isoladamente, podem estar abaixo do necessário para impedir danos à cultura (W. Bettiol, R. Ghini, Controle Biológico. In: A. ergamim Filho, Kimati, L. Amorin, Manual de Fitopatologia -Princípios e Conceitos. 3 edição. São Paulo'Agronômica Ceres, 1995. p. 717-728).

O uso e desenvolvimento de cultivares resistentes seria uma melhor opção de

controle destas doenças, todavia, muitos hospedeiros não apresentam resistência a esses patógenos. A funcionalidade nem sempre é possível, devido à inexistência no mercado, de cultivares com todas as características desejadas (M.M.Q. Ambrósio, Sobrevivência em microcosmo e em campo solarizado de fitopatógenos submetidos à fermentação 25 acelerada de diferentes materiais orgânicos. Tese (Doutorado em Agronomia) Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP, Botucatu-SP, 2006).

Existem métodos de controle químico contra os fungos fitopatógenos, como por exemplo, o realizado, até há pouco tempo, com um agrotóxico de amplo espectro, o brometo de metila utilizado nos últimos 60 anos como fumigante de solo em pré30 plantio. Embora altamente eficaz, rápido, fácil penetração no solo, amplo espectro e baixa resistência dos fungos foi comprovado que este confere riscos para o ambiente, para o homem e para a camada de ozônio (R. Ghini, Alternativas para substituir o brometo de metila na agricultura. Summa Phytopathologica, Jaboticabal, v. 27, η. 1, p. 162, 2001).

Os membros do gênero Fusarium são fungos que podem provocar doenças em plantas, humanos e animais, sendo que nesses dois últimos provocam doenças atuando como patógenos oportunistas ou através de suas toxinas (metabólitos secundários) causando problemas de crescimento, dentre outros. São conhecidos desastres agrícolas causados por fungos desse gênero, como a queda em produção da banana no Panamá, na década de 60 e bilhões de dólares perdidos em trigo e cevada no meio-oeste norteamericano. Muitas plantas têm pelo menos uma doença associada aoFusarium', segundo o American Phytopathological Society, em 2006, das 101 plantas listadas como economicamente importantes pelo menos 81 delas têm alguma doença associada a esse patógeno. Os fungos desse gênero atacam plantas em qualquer estágio de desenvolvimento causando podridão de caules, raízes, sementes e frutos, doenças de folhas, gangrenas e murchamentos (J.F. Leslie, B.A. Summerell e S. Bullock. The Fusarium laboratory manual, Wiley-Blackwell, 2006). Segundo a Food and Agriculture Organization of the United Nations, estima-se que cerca de 50% das perdas agrícolas no mundo se devem aoFusarium (L. Gilchrist, H.J. Dubin, Fusarium Head Blight, http://www.fao.org/docrep/006/y4011e/y4011e0j.htm, acessado em janeiro de 2010). A fitopatogenicidade se dá pela penetração de hifas modificadas para invasão de tecido vegetal através da parede celular, propiciando crescimento intra e intercelular. Esta penetração das hifas só se faz possível devido à secreção de enzimas (Cell walldegrading enzymes - CWDE) pelo fungo que hidrolisam moléculas estruturais que constituem a parede celular. Essas enzimas são cutinases, proteases, celulases, quitina deacetilases, aminoácido permeases e poligalacturonases (K. Mandgen, M. Hahn e H. Deising, Morphogenesis and mechanisms of penetration by plant pathogenic fungi, Annu.Rev. Phytopahol, 1996 34:367-86). Fusarium é o nome dado a forma assexuada (anamorfo) dos fungos desse gênero e às formas sexuadas (teleomorfos) são distribuídas nos gêneros Gibberella, Haematoneetria e Albonectria, sendo o gênero Gibberella o mais comum por estar relacionado a maioria das espécies de Fusarium. O International Code of Botanical Nomenclature recomenda que seja utilizado o nome do teleomorfo, sendo permitido empregar o nome do anamorfo sob certas condições. Porém, os teleomorfos de Fusarium não são comumente encontrados em campo, então é mais empregado o uso da nomenclatura do anamorfo (J.F. Leslie, B.A. Summerell, The Fusarium Laboratory, Blackwell Publishing, capítulos 8-10, págs. 81-100, 2006).

As poligalacturonases são de grande importância para a penetração do microrganismo nos tecidos vegetais, pois agem catalisando a clivagem dos polímeros de ácido galacturônico que formam a região lisa, sem ramificações, da pectina. Sendo a pectina o maior componente da parede celular vegetal, a ação de enzimas que agem quebrando sua estrutura é bastante deletéria para a estrutura da parede celular como um todo (N.C. Carpita e D.M. Gibeaut, Structucral models of primary cell walls in flowering plans-consistency molecular structure with the physical properties of the walls during growth, Plant J. 3, 1-31, 1993). As poligalacturonases agem catalisando a hidrólise das ligações alfa-1,4 entre os resíduos do polímero de galacturonato, transformando-o em fragmentos menores e desestruturando o arcabouço de pectina da lamela média e da parede celular primária favorecendo o crescimento de hifas do fungo dentro dos tecidos da planta (R. DOvidio, B. Mattei, S. Roberti, D. Bellincampi, Polygalacturonases, polygalacturonase-inhibiting proteins and pectic oligomers in plantpathogen interactions, Biochim. Biophys. Acta 1696, 237-244, 2004). Há três tipos de poligalacturonases: endopoligalacturonase (PG), exopoligalacturonase (EPG) e a exopoli-alfa-galacturonosidase (EPGD), que diferem no modo de ação na catálise da hidrólise da pectina. A PG catalisa randomicamente os resíduos de ácido galacturônico gerando fragmentos de oligogalacturonato, enquanto que a EPG remove um único resíduo de ácido galacturônico da extremidade não redutora do fragmento, completando dessa forma a quebra do oligômero em monômeros de galacturonato; a EPGD catalisa a hidrólise de dois resíduos de galacturonato a partir da extremidade não redutora do polímero (O. Markovic e S. Janecek, Pectin degrading glycoside hydorlases of family 28: sequence-structural features, spefcificities and evolution, Protein Eng. 14, 615-631, 2001).

Contudo, as poligalacturonases não estão presentes apenas em microrganismos fitopatogênicos, como também são produzidas pelas plantas e participam no processo de crescimento e desenvolvimento da planta, utilizando o mesmo mecanismo de quebra 30 dos polímeros de ácido galacturônico e sua expressão é controlada conforme a necessidade da planta. A diferença entre as poligalacturonases vegetais e as de fitopatógenos é pouca, mas reside em particularidades estruturais como demonstradopor Federici et al em um estudo sobre os requisitos para que ocorra a ligação entre poligalacturonase de F moniliforme e PGIP (polygalacturonase-inhibiting protein) de Phaseolus vulgaris. Nesse trabalho, Federici e colaboradores resolveram a estrutura tridimensional da poligalacturonase do F. moniliforme e tambémanalisaram as 5 diferenças de interação entre PGIP e PG com resíduos do sítio catalítico e ligante modificados. Foram mais relevantes para a interação os resíduos do sítio de ligação Hisl88, Arg267 e Lys269. Além desses resíduos também se notou diferença em um aminoácido estrutural: em fitopatógenos geralmente ocorrem aminoácidos com resíduos hidrofóbicos e de pequeno volume na posição 270, porém em vegetais encontra-se 10 aminoácidos com resíduos hidrofóbicos volumosos, o que pode interferir na interação do PGIP com a PG vegetal, de forma a não ser por ele inibida (L. Federici, C. Caprari, B. Mattei, C. Savino, A. di Mateo, G. De Lorenzo, F. Cervone, D. Tsemoglou, Structural requirements of endopolygalacturonase for the interaction with PGIP, PNAS, 98(23), 13425-13430, 2001). No trabalho citado, foi feita ainda uma troca de 15 aminoácidos (não volumoso por um volumoso - serina por triptofano) nessa posição da seqüência do F. moniliforme e observou-se que com a troca não houve interação com o PGIP, o que reforça a idéia de que o tamanho do resíduo do aminoácido na posição 270 interfere na interação entre PG e PGIP.

As PGIPs são glicoproteínas localizadas na parede celular que reduzem a atividade catalítica das PGs e podem desencadear respostas de defesa das plantas. Pertencem à família de proteínas com seqüência rica em repetições de leucina (leucinerieh repeat - LRR), relacionadas a genes de resistência. A produção de PGIP é desencadeada pela ação de patógenos e moléculas como salicilato, jasmonato, oligogalacturonatos, e fatores físicos como baixa temperatura e estabelecimento de lesões nos tecidos da planta. A inibição da PG pelo PGIP pode ser competitiva ou não competitiva (Cuixia Di, Manxiao Zhang, Shijian Xu, Tuo Cheng, Lizhe An, Role of polygalacturonase-inhibiting protein in plant defense, Criticai Review in Microbiology, 32, 91-100, 2006). Um PGIP produzido naturalmente por determinada planta não é capaz de inibir todas as formas de poligalacturonases produzidas pelos diversos tipos de fitopatógenos e por isso a transgênese da seqüência dessa proteína inibidora em outras plantas não assegura proteção efetiva. Não obstante, é interessante utilizar os PGIPs disponíveis para se estudar os tipos de interações que diferenciam enzimas vegetais das de fitopatógenos para a modelagem de estruturas com o intuito de criar inibidores que não afetem o funcionamento da enzima das plantas e o desenvolvimento vegetal, mas que ao mesmo tempo possam ser capazes de inibir um espectro maior de fitopatógenos do que o fazem os PGIPs naturais. Além disso, um PGIP é uma proteína de grande peso 5 molecular, que interage entrando em contato com grande área superficial da PG, na maior parte com interações fracas, exceto a região carregada negativamente que interage com os resíduos no 267_RIK das PGs (A. Di Matteo, L. Fedreici, B. Mattel, G. Salvi, K.A. Johnson, C. Savino, G. De Lorenzo, D. Tsemoglou, F. Cervone, The crystal structure of polyglacturonase-inhibiting protein (PGIP), a leucine-rich repeat protein 10 involved in plant defense, PNAS, 100(17):10124-10128, 2003), o que faz com que qualquer sensível diferença de superfície que as enzimas de fitopatógenos tiverem já não as deixam ser inibidas pelo PGIP e, por essa razão, as diferenças que as PGs têm entre si, mesmo que fora do sítio ligante, podem interferir na interação com o PGIP. A vantagem de um ligante relativamente pequeno e que explore apenas as áreas 15 conservadas que existem nas PGs é a de que este pode interagir com várias PGs diferentes, pois mesmo as PGs produzidas por microrganismos de espécies e gêneros diferentes mantêm bastante conservados os resíduos envolvidos na ligação com o substrato.

Até o presente momento, no que diz respeito à inibição da enzima poligalacturonase, há apenas trabalhos voltados para a engenharia genética publicados na literatura científica. A expressão de PGIP de pêra em tomate transgênico limita a colonização pelo fungo Botrytis cinerea, o que evidencia a importância da enzima na atividade patogênica (A.L.T. Powell, J. van Kan, A. ten Have, J. Visser, L.C. Greve, A.B. Bennet, J.M. Labavitch, Transgenic expression of pear PGIP in tomato limits fungai colonization, ASP Joumals, 13(9), 942-950, 2000). Em outro notável trabalho, a expressão de PGIP de feijão em trigo transgênico conferiu resistência a fungos fitopatogênicos F. moniliforme e Bipolaris sorokiniana (M. Janni, L. Sella, F. Favaron, A.E. Blechl, G. De Lorenzo, R. DOvidio, The expression of a bean PGIP in transgenic wheat confers increased resistance to the fungai pathogen Bipolaris sorokiniana, MPMI, 21(2), 171-199, 2008). Portanto, a inibição bem sucedida das poligalacturonases afeta a invasão do microrganismo nos tecidos vegetais. Porém, apesar de efetivo por um tempo, é sabido que as pestes podem desenvolver resistência mesmo aos organismos transgênicos, cujas PGIPs não interagem apenas com o sítio ligante do substrato natural, mas com uma região menos conservada e por isso mais susceptível a variações. A vantagem de uma molécula menor capaz de se ligar com maior afinidade ao sítio ligante, que compreende a região com resíduos conservados, do que o ligante natural 5 (galacturonato), mas sendo ao mesmo tempo estruturalmente semelhante ao ligante natural, é a de que pode ser eficaz contra uma grande variedade de enzimas sem sofrer grandes variações de afinidade, pois não interage com as regiões não conservadas da proteína assim como o faz o PGIP.

A expressão de genes de endopoligalacturonase (PG) em Fusarium moniliforme na ocasião da infecção em cana-de-açúcar foi avaliada por recentes trabalhos (R. Mendes, Diversidade e caracterização genética de comunidades microbianas endofíticas associadas à cana-de-açúcar. 119p. Tese - Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba-SP, 2008) e verificou-se que a enzima está presente neste fungo em todos os estágios da infecção: desde o contato inicial com a planta hospedeira até a aquisição de nutrientes e fase necrótica. Interessantemente, este fungo expressou a PG mesmo na fase de resposta à defesa da planta, o que reforça a importância desta enzima durante a infecção deste fungo, e sugere que esta seja indispensável para romper as barreiras celulares da planta (R. Kahmann, C. Basse, Fungai gene expression during pathogenesis-related development and host plant colonization. Current Opinion in Microbiology, London, v. 4, p. 374-380, 2001).

Outros fungos fitopatogênicos de importância econômica mencionados neste documento, com a finalidade de estabelecer semelhanças que possibilitem o emprego das moléculas propostas em tratamento anti-fúngico de amplo espectro, são: Fusarium 25 graminearum, Fusarium oxysporum f sp. lycopersici, Botrytis cinerea (Botryotinia fuckeliana), Colletotrichum lupini, Cryphoneetria parasitica Sclerotinia sclerotiorum, Aspergillus niger, A. Aeuleatus, A. flavus e Stereum purpureum.

O Fusarium graminearum é um fungo filamentoso amplamente distribuído em plantas e soloeo maior patógeno de grãos cultivados, sendo o causador do Fusarium head blight (FHB - conhecido também como “scab”, ou sarna) no trigo e na cevada, e lidera como causa de prejuízos nestas plantações (J.F. Leslie e B.A. Summerell, The fusarium laboratory manual, Blackwell, Ames, Iowa, 2006). Em publicação da Food and AgricuIture Organization of The United Nations (FAO) estima-se de que o FHB seja responsável por cerca de 50% das perdas agrícolas mundiais (L. Gilchrist, H.J. Dubin, Fusarium head blight, em Bread Wheat, FAO Plant Production and Protection Series n°30, 2002, http://www.fao.org/docrep/006/y4011e/y4011e0j.htm). Trinta e dois genes desse fungo codificam para enzimas envolvidas na degradação de parede celular vegetal (Cell wall-degrading enzymes - CDWE) que ocorre durante a invasão pelo fungo. Esses genes, dentre outros, são expressos exclusivamente durante a infecção (C.A. Cuomo, U. Gülgener, Jin-Rong Xu, F. Trail, B. Gillian Turgeon, A. Di Pietro, J.D. Wallow, Li-Jun Ma, S.E. Baker, M. Rep, G. Adam, J. Antoni, T. Baldwin, S. Calvo, Yueh-Long Chang, D. DeCaprio, L.R. Gale, S. Gnerre, R.S. Gaswani, K. Hammond-Kosack, L.J. Harris, K. Hilbum, J.C. Kennell, S. Kroken, J.K. Magnuson, G. Mannhaupt, E. Mauceli, H.W. Mewes, R. Mitterbauer, G. Muehlbauer, M. Münsterkõtter, D. Nelson, K. 0'Donnell, T. Ouellet, W. Qi, H. Quenesville, M.I.G. Roncero, Kye-Yong Seong, I.V. Tetko, M. Urban, C. Waalwijk, T.J. Ward, Jiqiang Yao, B.W. Birren, H.C. Kistler, The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization, Science 317, 1400, 2007). A redução de secreção das CDWE retarda o crescimento do fungo no hospedeiro e o estabelecimento da infecção (Gisele Eleonora Kikot, Roque Alberto Hours e Teresa Maria Alconada, Contribution of cell walldegrading enzymes to pathogenesis of fusarium graminearum: a review, Journal of Basic Microbiology, 49,231 -241, 2009).

O fungo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, agente causador da murcha de Fusarium, uma doença extremamente freqüente em todas as regiões onde há cultivo de tomate e é favorecida por temperaturas entre 21 e 33°C (sendo ótimo a 28°C). Produz macroconídios hialinos e microconídios hialinos, além de clamidósporos, estruturas de 25 resistência, que permitem a sobrevivência do fungo no solo por mais de 10 anos (C. Kurozawa, M.A. Pavan, Doenças do tomateiro, in: H. Kimati, L. Amorim, A. Bergami Filho, L. Camargo, J. Rezende, Manual de fitopatologia, ed. Ceres, 690-719, 1997). Este fungo invade sua planta hospedeira através das raízes e coloniza o sistema vascular. Vários estudos já foram conduzidos sobre as doenças causadas por este fungo que tem 30 demonstrado a participação da PG no estabelecimento das fitopatogenias. Um destes estudos foi realizado por Huertas-González e colaboradores sobre o patossistema tomate e Fusarium oxysporum, confirmando o uso de poligalacturonases, especialmente a endopoligalacturonase I (com os maiores níveis de expressão e secreção) na penetração e colonização da planta hospedeira (Roncero MI, Di Pietro A, Ruiz-Roldán MC, Huertas-González MD, Garcia-Maceira FI, Méglecz E, Jiménez A, Caracuel Z, SanchoZapatero R, Hera C, Gómez-Gómez E, Ruiz-Rubio M, González-Verdej o Cl, Páez 5 MJ.Role of cell wall-degrading enzymes in pathogenicity of Fusarium oxysporum. Rev Iberoam Micol. 2000 Mar;17(l):S47-53).

O fungo Botrytis cinerea (Botryotinia fuckeliana) causa o “mofo cinzento” em mais de 200 espécies de plantas, podendo causar danos em temperaturas menores que 2°C o que afeta vegetais estocados. A infecção se dá na seqüência: penetração pela superfície do hospedeiro, formação de lesão primária por morte do tecido vegetal, expansão da lesão com maceração dos tecidos vegetais e esporulação. O fungo expressa poligalacturonases durante a infecção para penetração e para criar espaço para a colonização na lamela média (M. Choquer, E. Foumier, C. Kunz, C. Levis, J.M. Pradier, A. Simon, M. Viaud, Botrytus cinerea virulence factors: new insights into a necrotrophic and polyphageous pathogen, minireview, Federation of European Microbiological Letters, 277, 1-10, 2007). No tomate, a PG fúngica precisa estar presente para que ocorra infecção plena, porém na sua ausência a infecção ainda pode ocorrer, contudo com expansão muito mais lenta, (Have A, Mulder W, Visser J, van Kan JA. The endopolygalacturonase gene Bcpgl is required for full virulence of Botrytis cinerea. Mol Plant Microbe Interact. 1998 Oct;l 1(10):1009-16).

O Colletotrichum lupini é agente causador da antracnose, doença favorecida pelo clima quente e úmido típico dos trópicos afetando as agriculturas que crescem nesse ambiente, como as mangueiras e pupunheira, por exemplo. Nas regiões temperadas é mais conhecido como patógeno do lupino. Infecta as plantas em todos os 25 estágios de desenvolvimento, causando necrose de seus tecidos. Também produz enzimas poligalacturonases que colaboram na penetração da parede celular (H.I. Nirenberg, U. Feiler, G. Hagedom, Description of Colletotrichum lupini comb. nov. in modem terms, Mycologia, 94(2), 307-320, 2002).

O Cryphonectria parasitica afeta principalmente as castanheiras estando presente na maior parte dos países europeus, asiáticos, EUA e Canadá. Atinge os hospedeiros por meio do vento e da chuva e também é transmitido por besouros e pássaros. Causa gangrenas no caule e ferrugem nas castanhas, evidenciadas por alteração da coloração. Entre 1904 e 1950, esse fungo quase dizimou as castanheiras dos EUA. É considerado pelos European and Medierranean Plant Protection Organization (EPPO), North American Plant Protection Organization (NAPPO) e Interafrican Phytosanitary Council (IAPSC) como organismo de quarentena (EPPO 5 quarantine pest, Cryphonectria parasitica, Datasheets on Quarantine Pests, www.eppo .org/ QU ARANTINE/fungi/Cryphonectria_parasitica/ENDOPA_ds.pdf ).

O fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum, também conhecido por mofo branco, é o causador da doença “podridão branca”, que acomete muitas espécies de plantas de interesse agrícola. Dentre as principais enzimas produzidas na ocasião da infecção da 10 planta, para transpassar a barreira da parede celular está a endopoligalacturonase (K. Mendgen, M. Hahn e H. Deising, Morphogenesis and Mechanisms of Penetration by plant pathogenic fungi, Annul Reviews on Phytopathology, 34, 367-386, 1996).

O Aspergillus niger tem principal aplicação na indústria de alimentos e bebidas utilizando-se da ação de suas pectinases, endo e exopoligalacturonases, metil e acetilesterases, pectinases e pectatoliases, ramnogalacturonases e liases. Bussink e colaboradores demonstraram em quatro estudos a presença de sete diferentes genes para poligalacturonases noAspergillus niger N400, o que leva a crer que essas enzimas têm grande demanda e são de grande importância no processo de quebra da parede celular vegetal (Bussink, Kester e Visser, Molecular clonning, nucleotide sequence and expression of the gene eonconding pre-pro-polygalacturonase II of Aspergillus niger, FEBS Lett. 273, 127-130, 1990; Bussink, Brouwer, de Graaf, Kester e Visser, Identification and characterization of a second polygalacturonase gene of Aspergillu niger, Curr. Genet., 20, 301-307, 1991; Bussink, van den Homberg, van den Ijssel e Visser, Characterization of polygalacturonase-overprocing Aspergillus niger transformants, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 324-329; Bussink, Buxton, Fraaye, de Graaf e Visser, The polygalacturonases of Aspergillus niger are encoded by a family of diverged genes, eur. J. Biochem. 208, 83-90), Outros estudos conduzidos demonstraram que a PG foi requerida para a completa virulência de Aspergillus flavus nas infecções no algodão (Shieh MT, Brown RL, Whitehead MP, Cary JW, Cotty PJ, Cleveland TE, Dean RA. Molecular genetic evidence for the involvement of a specific polygalacturonase, P2c, in the invasion and spread of Aspergillus flavus in cotton bolls. Appl EnvironMicrobiol 1997; 63:3548-3552). Com o intuito de se combater as fitopatogenias causadas pelos fungos, principalmenteos supracitados, através do desenvolvimento e produção de estruturas com potenciais para inibição dessas enzimas, ao longo do trabalho foram utilizadas técnicas computacionais para desenho de compostos (“computer-aided drug design” 5 CADD), através do desenho computacional de fármacos baseado na estrutura do ligante (“Ligand-Based Drug Design”-LBDD), sendo o ligante o Ácido Galacturônico. Avanços importantes na produção de fármacos já foram obtidos por meio de abordagens computacionais. O CADD pode predizer resultados experimentais com razoável precisão em tempo reduzido se comparado com os métodos mais clássicos. Métodos de 10 CADD já são amplamente utilizados pela indústria farmacêutica com a finalidade de identificar novos compostos ou aperfeiçoar compostos já existentes que apresentam atividade contra um alvo biológico. Através de simulações de docking, que propõem predizer as interações proteína-ligante de interesse levando em consideração parâmetros físico-químicos que interferem na ligação (D.B. Kitchen, H. Decomez, J.R. Furr, J. 15 Bajorath, Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications, Nature Reviews - Drug Discovery, 3, 935-949, 2004) é possível identificar compostos que potencialmente servirão como ligantes na proteína alvo.

O documento W02001097098 descreve um método para obtenção de moléculas com potencial inibitório a partir de bancos de dados contendo as estruturas dos 20 compostos químicos (PubChem), potenciais efetores da função das enzimas cuja atividade deve ser alterada, inibição ou potencialização, utilizando docking para selecionar entre as moléculas encontradas no PubChem, baseando-se em scores fornecidos pelos programas, tais como GOLD, que simulam o atracamento do ligante em sitio de ligação - alvo escolhido.

O documento RPI 2036 descreve o desenvolvimento de herbicidas contra uma

enzima específica através da técnica de docking seguido de modificação molecular dos ligantes selecionados com melhores scores, considerando propriedades estéricas e eletrostáticas na interação ligante-proteína. Por fim, os resultados de docking foram corroborados pelos resultados experimentais.

O documento US2002/01509061 refere-se à utilização de método computacional

para determinar homologia entre proteínas através de alinhamento de estruturas primárias entre pelo menos duas proteínas e determinação da estrutura terciária de uma delas a partir do alinhamento com a seqüência de uma proteína molde com estrutura tridimensional já resolvida utilizando o programa MODELLER.

O documento US7383135 refere-se ao desenvolvimento de inibidores que agem em uma determinada região conservada entre as proteínas de uma família de quinases.

O trabalho utiliza uma isoforma com estrutura tridimensional resolvida como molde para resolver a estrutura tridimensional de proteínas homólogas e para o desenho de compostos com potencial para se ligarem à isoforma ou aos homólogos.

Na presente patente, foi selecionada a estrutura tridimensional da enzima Endopoligalacturonase do fungo Fusarium moniliforme como alvo terapêutico para o desenho de novos compostos que atuariam como inibidores (código PDB: 1HG8, cadeia A). Esta estrutura, publicada no Protein Data Bank foi resolvida através de cristalografia e difração de raios X, com resolução de 1,73 Â por Federici et al, 2001 (L. Federici, C. Caprari, B. Mattei, C. Savino, A. di Mateo, G. De Lorenzo, F. Cervone, D. Tsemoglou, Structural requirements of endopolygalacturonase for the interaction with PGIP, PNAS, 98(23), 13425-13430, 2001). A numeração dos aminoácidos adotada é a mesma usada pelos autores da estrutura de código 1HG8. Foi escolhida a PG do F. moniliforme (FmPG) por ser o único do gênero Fusarium com estrutura tridimensional resolvida além de apresentar identidade e similaridade maiores que 90% na análise do BLASTp (SF Altschul, TL Madden, AA Schãffer, Z Zhang, W Miller, DJ Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Res. 1997 Sep l;25(17):3389-402) com vários fungos do mesmo gênero e maiores que 66% para identidade e 78%) para similaridade com a PG3 de Botrytionia fuckeliana (Botrytis cinerea) e Sclerotium sclerotiorum. Algumas PGs fungicas são mais similares à outra enzima com estrutura resolvida e depositada no PDB, a PG de Colletotrichum lupini (C1PG), portanto esta foi usada como molde, “template”, para a modelagem por homologia destas PGs.

O desafio do presente trabalho não reside apenas em produzir moléculas com potencial inibitório das Endopoligalacturonases de fungos fitopatógenos, mas também em produzir compostos de baixo risco para a população exposta e para o meio ambiente. 30 Isso se deve principalmente à semelhança dos fungos com os tecidos de plantas e animais, também eucariotos. Por essa razão, sempre foi bastante difícil o tratamento contra infecções causadas por fungos tanto no ambiente agrícola como na saúde humana e animal, já que os medicamentos geralmente empregados causam vários efeitos colaterais indesejáveis de grau moderado a grave.Portanto, é difícil realizar um controle eficaz destes fungos fitopatógenos para que estes não representem grande prejuízo para a agricultura e animais, incluindo o homem. Dessa forma, é proposto o desenho de 5 novos compostos que atuariam como inibidores da enzima Endopoligalacturonase destes fungos, descrita como essencial para o estabelecimento de suas patogenias e baseando-se no fato de que experimentos que demonstraram a inibição desta enzima, ou deleção ou mutação para formas não ativas, indicaram expressiva redução na capacidade patogênica destes fungos. A presente patenteapresenta uma solução na busca 10 por novas possibilidades de transformar este conhecimento em inovação e em um produto por conseqüência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se ao desenho computacional de novos compostos com potencial inibitório para enzimas Endopoligalacturonases (PG) de fungos fitopatogênicos com o intuito de evitar ou diminuir a colonização desses microrganismos nos tecidos vegetais. A PG integra um grupo de enzimas secretadas por microrganismos fitopatogênicos durante o processo de invasão dos tecidos vegetais, participando na catalise da hidrólise da pectina, o que culmina na desestruturação do arcabouço da parede celular, o que favorece a invasão de hifas dos fungos. Uma gama de microrganismos fitopatogênicos utiliza essas enzimas como fatores de patogenicidade que levam a doenças em uma grande variedade de plantas de interesse econômico como otrigo, a cevada, o tomate, o morango, a manga, o arroz, a cana-deaçúcar, dentre outros. Com o objetivo de minimizar as perdas causadas por estes patógenos, são desenhadaspequenas moléculas planejadas para se ligarem com alta afinidade aos resíduos do sítio de ligação ao substrato.

Assim sendo, o presente trabalho consistiu no desenho computacional de novos compostos com base em metodologias de “Ligand-Based Drug Design”, onde o ligante natural (o substrato Galacturonato) é utilizado como referência para o desenho de compostos similares para atuação como inibidor competitivo das PGs. Além disso, 30 metodologias de “Structure-Based Drug Design” sãoutilizadas, nas quais as interações das moléculas desenhadas com a proteína em sua região alvo são avaliadas por meio de docking e novos compostos são desenhados a partir destes resultados com o intuito de otimizar a ligação com os resíduos conservados do sítio catalítico. Estruturas similares ao ligante natural também sãoutilizadas para rodadas de docking. Adicionalmente, a estrutura de PGs de outros fungos é analisada para verificar se estruturalmente, a regiãoalvo é conservada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura l.Alinhamento das estruturas primárias das enzimas poligalacturonases usadas neste trabalho. As seqüências de fungos usadas neste alinhamento (com fundo cinza), com seus respectivos identificadores do NCBI GenPept e códigos, foram: PG de Fusarium moniliforme, 17942538, FmPGA; hipotética proteína de Fusarium 10 graminearum, 46138993, FgPG; de Aspergillus niger, 39654258, AnPGAl e 6435555, AnPGA2; de Fusarium oxysporum f sp. lycopersici, 3348099, FoPG; Cryphonectria parasitica, 1208810, CpPGA; de Cochliobolus carbonum, 167221, CcPG; de Sclerotinia selerotiorum, 156044128, SsPG; de Botrytis cinerea (Botrytinia fuckeliana), 125629516, BfPGl; de Aspergillus flavus, 238490452, AfPG; de Stereum purpureum, 15 21465803, SpPGl; de Colletotridhum lupini, 159794838, C1PGA; e de Aspergillus aculeatus, 15988279, AaPGA. Além das seqüências fúngicas, seqüências de PGs de plantas (com fundo em branco) foram usadas com o intuito de verificar a conservação dos resíduos mais importantes envolvidos na catálise e a existência de outros resíduos que sejam exclusivos de PGs fúngicas e estejam espacialmente próximos ao sítio 20 catalítico/ligante, o que poderia indicar a existência de alvos adicionais e preferenciais, pois um composto que se ligue fortemente a um resíduo específico de fungos provavelmente não causará efeitos quanto à ligação na PG de planta. As PGs vegetais usadas foram: de Arabidopsis thaliana, 15230328, AtPGJPIant; de Brassica rubra, 21530799, BrPGPlant e de Solanum lycopersicum, 7381227, SlPG_Plant. Nota-se que 25 os resíduos N189, D191, D212, D213, H234,G235, R267, K269 e T302 apresentam-se bem conservados. Os resíduos mais importantes na ligação ao substrato, altamente conservados dentre as diversas espécies de fungos fitopatogênicos e plantas estão destacados em barras longas em cinzas claro e escuro, sendo os cinza escuro a tríade catalítica composta pelos Aspartatos 191,212e213. Os resíduos destacados por barras 30 transparentes com contorno preto (H188, D194 e G305) são os resíduos considerados “alvos-preferenciais”, uma vez que estão próximos aos resíduos catalíticos e de ligação ao substrato, porém possuem ocorrência restrita às PGs de fungos fitopatogênicos, não existindo em PGs de plantas.

Figuras 2A e B. Alinhamento da estrutura da enzima do F. moniliforme (1HG8) (em cinza) as enzimas dos fungos (em preto) Stereum purpureum (1K5C, figura 2a) e Colletotrichum lupini (2IQ7, figura 2b) obtidas do Protein Data Bank. Os alinhamentos foram feitos com o programa PyMol, também usado para gerar as imagens moleculares (W.L Delano, The PyMol molecular graphics system Delano Scientific, San Carlos, CA, USA, http://www.pymol.com.org) e TM-align, usado também para fornecer dados de RMSD e TM-score sobre a qualidade dos alinhamentos (Yang Zhang, J. Skolnick, TMalign: a protein structure alignment algorithm based on th TM-score, Nucleic Acid Research, 33(7): 2302-2309, 2005). Nas estruturas foram selecionados os resíduos H234, K244, R267, K269 e Y302 para mostrar a posição de cada um nas enzimas (cada resíduo está da mesma cor de sua enzima correspondente). O alinhamento demonstra alta similaridade estrutural no que diz respeito às posições dos resíduos do sítio ligante, o que está de acordo com os resultados mostrados na tabela 6 (TM-Scores próximos de

1 e baixos RMSDs).

Figura 3. Alinhamento da estrutura terciária das enzimas FmPG (lHG8.pdb) e SpPG (lKCD.pdb) feito no PyMol e importado pelo MVD para geração de imagem. Figura 3 A) apresenta em destaque o resíduo de monogalacturonato posicionado no sitio 20 catalítico (D 191, D213 e D213 aparecem como traços finos) e dos resíduos que fazem parte do sitio ligante (H234, R267 e K269, não mostrados na figura), estes últimos adotados como alvos para inibição. O monogalacturonato da SpPG (lKCD.pdb) é resultante da clivagem de oligogalacturonato (em preto) co-cristalizado com a enzima. Na FmPG (lHG8.pdb), as moléculas de tri e mono galacturonato foram introduzidas na 25 estrutura por docking(mostrado em cinza claro) e observa-se que os resíduos encontram-se em posição muito similar em ambas as enzimas. Essa constatação valida a técnica de docking para os resíduos de aminoácidos da região em que se encontram os monogalacturonatos.

Figura 4. Representação estrutural das moléculas desenhadas computacionalmente que obtiveram melhores resultados nos dockings com 1HG8 e 2IQ7 (tabelas 6 e 7) e que provavelmente possuirão caráter inibitório para as PGs. Figura 5. Ligante dh321 posicionado no sítio alvo da lHG8.pdb. A figura, em escala de cinza, representa as regiões catalítica e ligante da enzima FmPG (lHG8.pdb). Esse é o ligante que apresentou melhor resultado de interação entre os resíduos específicos de PGs fúngicas: D194, H188 e G3Q5, tanto na 1HG8 quanto na 2IQ7 5 (tabelas 6 e 7). Possui grupos químicos que conferem polaridades diferentes para cada extremidade da estrutura desta molécula o que o faz encaixar na região do sítio ligante e do catalítico através de complementaridade eletrostática. A região catalítica é predominantemente negativa e na imagem aparece como cinza de tonalidade média; a região ligante, majoritariamente positiva, aparece na imagem como o cinza de 10 tonalidade mais escura; as regiões em cinza claro são apolares.

Figura 6. Ligante 602 posicionado no sítio alvo da 1HG8. Esse é o ligante que apresentou melhores resultados de interação com os resíduos conservados do sítio de ligação ao substrato: H234, R267, K 269 e Y302, apresentando energias bastante negativas com esses resíduos tanto no docking com a 1HG8 quanto com a 2IQ7 (tabelas 15 6 e 7). Esse ligante também se destacou na análise de ADMET (tabela 8), apresentando bons valores de cLogP, solubilidade, Druglikeness, Drug-score e, principalmente, ausência de risco de efeito tóxico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método paradesenhar computacionalmente 20 novos compostos com potencial função inibitória da enzima endopoligalacturonase produzida por fungos fitopatgênicos e envolvida em processos de invasão destes fungos em células vegetais. Um enfoque especial é dado às enzimas de fungos patogênicos de solo envolvidos em uma série de fitopatogenias e responsáveis por amplo espectro de prejuízos à Agricultura.

O método proposto consiste das seguintes etapas:

1- Obter arquivos de coordenadas referentes às estruturas tridimensionais (a partir do banco PDB) da estrutura da PG do F. moniliforme e das PGs de outros fungos mencionados.

2- Fazer busca por seqüências homólogas (que também possuam estrutura depositada no PDB) às estruturas primárias das enzimas dos organismos de interesse

usando o BLASTp contra o banco de dados de seqüências primárias do PDB. O BLAST fornece os dados referentes às características do alinhamento de seqüência primária, como: identidades (porcentagem de aminoácidos idênticos em posições correspondentes), positivos (são o número aminoácidos idênticos somado ao número de aminoácidos não são idênticos entre duas seqüências numa determinada posição, mas que possuem propriedades similares, considerado como um “Positivo” por indicar 5 substituições nas quais a matriz BLOSUM-62 pontua positivamente segundo Altshul e colaboradores (1997). Os gaps indicam o número de regiões que representam lacunas no alinhamento (seja devido a inserções e deleções no histórico evolutivo dos genes) e, por último, a coluna e-value (Expect Value) representa um parâmetro estatístico do programa BLAST que indica o número de diferentes alinhamentos que ocorreriam em 10 um banco de dados por mero acaso com Score equivalentes ou melhores que o obtido para um determinado alinhamento. Quanto menor o e-value, mais significante é o score obtido no alinhamento em questão (S.F. Altschul, T.L. Madden, A.A. Schãffer, Z. Zhang, W. Miller, D.J. Lipman, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acid Res, 25(17):3389-3402, 1997) para 15 análise de homologia e com o programa ClustalW (M.A Larkin, G. Blackshields, N.P. Brown, R. Chenna, RA. McGettingan, H. McWillian, F. Valentin, I.M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J.D. Thompson, T.J. Gibson, D.G. Higgins, Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioinformatics, 23, 2947-2948, 2007).

3- Predizer modelos de estruturas tridimensionais das PGs que não possuírem estrutura depositada nos bancos públicos utilizando as seqüências primárias das enzimas dos organismos de interesse e como molde (template) as estruturas cujas seqüências primárias são homólogas à seqüência de interesse e foram identificadas usando o BLASTp (como descrito no item 2). Programas como o Swiss-MODEL (Guex, N. e Peitsch, M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb-Viewer: An environment for comparative protein modelling. Electrophoresis 18:2714-2723, 1997.) e o programa MODELLER 9v8 (N. Eswar, M.A. Marti-Renom, B. Webb, M.S. Madhusudhan, D. Eramian, M. Shen, Li. Pieper, A. Sali, Comparative protein structure modeling with MODELLER, Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc. Supp 15, 5.6.1-5.6.30, 2006) podem ser usados para a modelagem das proteínas de interesse. A finalidade dos modelos seria de comparar as posições dos aminoácidos de interesse nas estruturas terciárias. A partir do alinhamento entre a seqüência a ser modelada e uma estrutura conhecida similar a ela em termos de seqüência primaria, o programa gera um modelo tridimensional (num procedimento de modelagem por homologia).

4- Em seguida, usando o programa Deep-View, realiza-se a edição das estruturas otimizando a numeração de resíduos na seqüência primaria, dentre outras ações (Guex, N. e Peitsch, M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb-Viewer: An environment for comparative protein modelling. Electrophoresis 18:2714-2723, 1997). Adicionalmente, utiliza-se o GROMACS para minimizar energia dos modelos gerados. Com a minimização de energia os aminoácidos dos modelos adotam conformações mais favoráveis energeticamente, o que toma o modelo mais próximo de uma conformação real (D. Van Der Spoel, E. Lindhal, B. Hess, G. Groenhof, A.E. Mark, H.J Berendsen, GROMACS: fast, flexible, and free, J Comput Chem, 26(16), 1701-18, 2005). As estruturas terciárias são visualizadas através do PyMol para análise da sobreposição das estruturas terciárias(W.L Delano, The PyMol molecular graphics system Delano Scientific, San Carlos, CA, USA, http://www.pymol.com.org), a avaliação da qualidade dos modelos gerados é feita pela análise de gráficos Ramachandran, que fornece o percentual de aminoácidos que possuem ângulos de torção aceitáveis (ψ e φ). Os dados de cada aminoácido são distribuídos em um gráfico subdividido em regiões. Isso é importante na análise dos modelos uma vez que durante a modelagem alguns aminoácidos podem adotar conformações teoricamente não permitidas (Ramachandran, G. N., Ramarkrishnan, C., Sasisekharan, V. Stereochemistry of polypeptide chain conformations. J. Mol Biol 7:95-99, 1963). Os dados do Ramachandran são gerados através do Java Protein Dossier da plataforma STING (Neshich, G., Togawa, R., Mancini, A. L., Kuser, P. R., Yamagishi, Μ. E. B., Pappas Jr., G., Torres, W. V., Campos, T. F., Ferreira, L. L., Luna, F. M., Oliveira, A. G., Miura, R. T., Inoue, Μ. K., Horita, L. G., de Souza, D. F., Dominiquini, F., Álvaro, A., Lima, C. S., Ogawa, F. O., Gomes, B. G., Palandrani, J. C. F., dos Santos, G. F., de Freitas, E. M., Mattiuz, A. R., Costa, I. C., de Almeida, C. L., Souza, S., Baudet, C. and Higa, R. H. STING Millennium: a Web based suite of programs for comprehensive and simultaneous analysis of protein structure and sequence. Nucleic Acids Research, 31:13, 3386-3392, 2003). Os modelos são analisados em relação a erros na estrutura tridimensional pelo ProSa-web, que calcula um valor (z-score) referente à qualidade geral de uma estrutura específica comparado com os valores de todas as cadeias de proteínas experimentalmente determinadas e depositadas no PDB (M. Wiederstein, M.J. Sippl, ProSa-web: Interactive web service for the recognition of errors in three-dimensional structures of proteins, Nucleic acids Research, 35, 407-410,2007).

5- Alinhar a FmPG (lHG8.pdb) às estruturas depositadas no PDB com o TMalign para análise da sobreposição das estruturas terciárias e para analisar os desvios

(RMSD - voot-mean-square deviation) e TM-score. O RMSD fornece em  a média quadrática das distâncias entre pares de resíduos correspondentes, depois da sobreposição de uma estrutura sobre a outra. O TM-score utiliza o fator de LevittGerstein que considera os pares de resíduos em menores distâncias como mais 10 relevantes do que aqueles a maiores distâncias e também é mais sensível à topologia geral do que a variações estruturais localizadas. O TM-score é normalizado de forma a não ser dependente do tamanho da proteína, seu valor pode ir de 0.0 a 1.0, sendo valores maiores que 0.17 indicativos de similaridade estrutural elevada (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th TM-score, 15 Nucleic Acid Research, 33(7): 2302-2309, 2005).

6- Fazer alinhamentos entre a estrutura primária de proteínas homólogas à proteína de interesse através do programa ClustalW 2.0 (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWillian, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J., D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. 2007. Clustal

W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) e incluir proteínas de outros organismos, evidenciando as similaridades e diferenças entre estes dois conjuntos de proteínas e buscando as correspondências no alinhamento de estrutura primária dos resíduos importantes. Seguindo certos critérios como: presença exclusivamente nas seqüências de fungos fitopatogênicos, escolher os alvos terapêuticos preferenciais.

7- Buscar estruturas de compostos no PubChem

(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) por similaridade maior que 90% com o ligante natural (galacturonato) e proceder simulações de docking empregando o programa Molegro Virtual Docker (MVD). O docking consiste na predição da orientação de uma molécula em relação a uma segunda quando elas se ligam para formar um complexo 30 ligante-proteína. Há vários programas que realizam docking molecular, tais como DOCK, AUTODOCK, GOLD, FLEXX, ZDOCK, M-ZDOCK, MS-DOCK, Surflex, MCDOCK, MolDock, GemDock, entre outros. Os métodos usados por cada programa diferem basicamente na busca pela conformação que melhor se liga a proteína. Há três principais tipos: Estocástico e Sistemático, por Dinâmica Molecular e Algoritmos Genéticos/Evolucionários. O método de busca Estocástica e Sistemática por ligantes é bastante empregado e variado. O programa DOCK, por exemplo, utiliza um método 5 baseado em conformações randômicas; FLEXX é baseado no espaço conformacional do sítio ativo. O método por Dinâmica Molecular, utilizado pelo AUTODOCK, calcula as várias conformações que a proteína alvo pode adotar durante a interação com o ligante. O MVD utiliza o algoritmo MolDcok que é baseado em Algoritmo Evolucionário (uma variedade de Método Estocástico e Sistemático) para simular as interações ligante10 proteína. Os algoritmos evolucionários podem ser definidos como um grupo de aproximações computacionais baseadas nos conceitos da Teoria da Evolução de Darwin. O MolDock é uma implementação do algoritmo evolucionário focado em simulações de docking molecular, onde aproximações computacionais de um processo evolutivo são aplicadas para simular a permanência das características mais favoráveis (Thomsen R, 15 Christensen MH.: MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking. J Med Chem. 2006 Jun 1;49(11):3315-21.;W.F. De Azevedo Jr, MolDock applied to structure-based virtual screening, Current Drug Targets, ll(3):327-334, 2010). Trabalhos que comparam os programas mais utilizados indicam que programas baseados em algoritmo evolucionário tais como GemDock e MolDock apresentam 20 melhor performance geral do que Flexx, GOLD e Surflex (R. Thomsen, M.H. christensen, MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking, J Med Chem, 49, 3315-21, 2006; J.M. Yang, C.C. Chen, GemDock: a generic evolutionary method for molecular docking, Proteins, 55, 288-304, 2004). Neste trabalho, os dockings foram feitos entre os ligantes obtidos no PubChem e a enzima do F. 25 moniliforme para seleção de estruturas com melhor afinidade com os resíduos do sítio alvo principalmente em relação aos aminoácidos conservados.

8- Uma análise detalhada do nano-ambiente do sitio alvo é realizada usando-se o programa STING Java Protein Dossier (Neshich G., Rocchia W., Mancini A.L., Yamagishi M.E., Kuser P.R., Fileto R., Baudet C., Pinto I.P., Montagner A.J., Palandrani 30 J.F., Krauchenco J.N., Torres R.C., Souza S., Togawa R.C., Higa R.H. 2004. JavaProtein Dossier: a novel web-based data visualization tool for comprehensive analysis of protein structure. Nucleic Acids Res. Jul 1;32 (Web Server issue):W595-601, 2004) e a ferramenta “select”. Desta forma, são determinados conjuntos de parâmetros físicoquímicos e estruturais que descrevem o nano-ambiente que é composto pelos resíduos que compõem o sítio-alvo, no qual se espera que os ligantes atraquem. Estes conjuntos são usados não apenas para identificação nas estruturas estudadas, como também para 5 melhor compreender o ambiente para qual o inibidor seria construído, tendo a eficácia necessária para sua aplicação final. Portando estes parâmetros indicam as características físico-químicas do alvo terapêutico para o adequado desenho computacional e modificação dos novos compostos.

9- As estruturas selecionadas no item “7” são modificadas racionalmente, de acordo com as características físico-químicas e estruturais encontradas no item “8” (por

exemplo, se o potencial eletrostático local é alto, adicionam-se os átomos adequados para diminuir este potencial no composto inicial), a fim de aumentar os valores de afinidade de ligação. As alterações nos compostos são feitas computacionalmente através do programa ChemBioDraw, no qual também são feitas minimização de energia 15 e dinâmica das estruturas de ligantes desenhadas (Zhenjiang Li, Honggui Wan, Yuhu Shi, Pingkai Ouyang, Personal experience with four kinds of chemical structure drawing software: review on ChemDraw, ChemWindows, ISIS/Draw, and ChemSketch, J. Chem. Inf. Comput. Sci., 44, 1886-1890, 2004). Além da busca por ligantes baseados na estrutura de galacturonatos no PubChem, também érealizada busca por ligantes 20 baseados na forma da cavidade criada pelo MVD na região dos resíduos de interesse. Os demais passos de docking e modificações estruturais também são aplicados a esses ligantes.

10- Realizar predição de parâmetros moleculares que interferem na Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade utilizando a ferrametna online Osiris

Property Explorer (Thomas Sander, Actelion Pharmaceuticals Ltd., http://www.organicchemistry.org/prog/peo/) para orientar no desenho dos compostos. O programa Osiris fornece dados de risco de toxicidade: mutageninicade, tumorogenicidade, irritante e com efeito reprodutivo, baseados em fragmentos de moléculas conhecidas depositados no banco de dados RTECS. Também prediz valores de cLogP, solubilidade em água, 30 peso molecular e fornece o Drug-score que é um valor geral resultante da combinação de todos os parâmetros anteriores mais o Druglikeness, que compara fragmentos do composto desenhado com base de dados de compostos comercializados e com base de dados de compostos que não servem como fármacos (Fluka).

EXEMPLO

A invenção será agora descrita em maiores detalhes por meio do exemplo a seguir, o qual não deve ser interpretado como limitativo do escopo da invenção.

Foram obtidos os arquivos de coordenadas referentes às estruturas tridimensionais existentes de fungos fítopatogênicos através do Protein Data Bank (http://www.pdb.org). As PGs fúngicas, cujas estruturas tridimensionais estão resolvidas e depositadas no PDB, são: Fusarium moniliforme (1HG8), Aspergillus aculeatus (1AI5), Aspergillus niger (1NHC, PGl; ICZFs PG2), Colletotrichum lupini (2IQ7) e Stereum purpureum (1K5C; IKCD - PG em complexo com dois resíduos de galacturonato). Como o trabalho tem como alvo principal o estudo de PGs do gênero Fusarium para o desenvolvimento de drogas, foi executado o programa BLASTp usando como query a seqüência da PG de F. moniliforme (FmPG) contra a database NR do NCBI filtrada para proteínas de outros fungos Ascomicetos. Foram evidenciados altos valores de identidade e similaridade, ambos acima de 90%, para a maioria das seqüências de Fusarium obtidas como “hits” no BLASTp (Tabela 1), o que sugere alta conservação entre estas PGs. No entanto, foi observado que seqüências de PGs de alguns dos fungos discutidos anteriormente exibem valores de identidades baixos em relação à PG de Fusarium moniliforme e que estas seqüências eram mais similares à PG de Colletotrichum lupini (C1PG). Os resultados de BLAST usando-se como query a ClPG contra o NR filtrado para Ascomicetos demonstram que os alinhamentos da ClPG com PGs de fungos como Gibberella zeae, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum f sp. lycopersici, Cryphonectria parasítica, Cochliobolus carbonum, Sclerotinia sclerotiorum e Botrytis cinerea possuem maiores valores de identidade e positivos em relação ao alinhamento destes com a FmPG (Tabela 2). Foi também feito o BLASTpcom enzimas de plantas (Tabela 3) cujos alinhamentos com as seqüências “queries” FmPG (1HG8_A) e ClPG (2iq7_A) apresentaram valores de similaridade e identidade menores. Além disso, não foi encontrada nenhuma estrutura disponível no PDB de poligalacturonase vegetal. Tabela 1: Resultados obtidos com o BLASTp entre a FmPG (1HG8) e seqüências do banco NR do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov), sendo reportados os hits obtidos contra Gibberella e outros Fusarium. São fornecidos os dados referentes às características do alinhamento de seqüência primária realizado pelo BLAST, como: identidades 5 (porcentagem de aminoácidos idênticos em posições correspondentes), positivos (são o número aminoácidos idênticos somado ao número de aminoácidos não idênticos entre duas seqüências numa determinada posição, mas que possuem propriedades similares, considerado como um “Positivo” por indicar substituições nas quais a matriz BLOSUM-62 pontua positivamente segundo Altshul e colaboradores 1997; SF Altschul, 10 TL Madden, AA ScháíFer, Z Zhang, W Miller, DJ Lipman. 1997; Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Res. 1997 Sep l;25(17):3389-402), a coluna gaps indica o número de regiões que representam lacunas no alinhamento (seja devido a inserções e deleções no histórico evolutivo dos genes) e, por último, a coluna e-value (Expect Value) que representa um 15 parâmetro estatístico do programa BLAST que indica o número de diferentes alinhamentos que ocorreriam em um banco de dados por mero acaso com Score equivalentes ou melhores que o obtido para um determinado alinhamento. Quanto menor o e-value, mais significante é o score obtido no alinhamento em questão. _Resultados de BLASTp: FnPG (1HG8 pdb) contra NR do NÇBI

Fungo 92 96 0 --- - “ -! Giberella thapsina E-valuè 0 Fusarium nygamaí 92 96 0 0 Fusarium proliferatum 91 96 0 0 FijsmumiSamtwi« : 91 96 0 1e-180 Fysar/i/m oxysporum fsp dianthi 91 96 0 Se-ISI Fusarium oxysporum fsp radicis-fycopersici 91 96 0 2e-179 Tusarium pxyspomm fsp lycopersici 91 96 0 3e-179 Fusarium oxysporum f sp conqhtimm Fusarium oxyspoum fcubense 90 95 0 3e~179 Fusarium oxysporum fsp fragariae 90 96 G 4e-179 Fusarium oxysporum fsp Iagenariae Fusarium oxysporum f sp niveum Fusarium oxyporum f sp cucumerínum 96 :ί3ΐΙ11ί õe-179 Fusarium oxysporum fsp Iagenariae Fusarium oxysporum fso mo/engenae Fusarium oxysporum fsp phaseofj Fusarium oxysporum fsp tulipae 90 96 0 1e-178 Fusarium suhglutinans 90 95 0 le-178 Fusarium anthophilum 90 95 G 1e-178 Fusarium oxysporum fsp colocasiae Fusarium 2e-178 oxysporum fso spinaciae Fusarium oxysporum fsp Iactucae 90 95 0 6©-178 QifcbensMa cirúifíata “ 96 0 Se-173 Tabela 2: Resultados de BLASTp contra o banco de seqüências protéicas NR do NCBI usando-se como seqüência de busca (“query sequence”) a seqüência da PG de Colletotrichum lupini (C1PGA, PDB 2IQ7_A). São mostrados os resultados “hits” encontrados para as seqüências de PGs dos fungos de importância econômica descritos na seção “Estado da Técnica”, sendo que alguns estão anotados com códigos PDB, o que indica que sua estrutura já foi resolvida. A descrição das colunas segue o padrão da tabela 1. Resultados dc BLASTp. CP< 3 (2IQ7.pdb) contra NR dc NCBI E-vafueP identidade =SiiaiPiS QislDS,. ........ _ gíj^i®cjs|;íS’ Gibberella Zeae {Fusarium graminearum) 79 86 1 4e-153 Fusarium moniliforme 47 64 3 3e-81 Asperqillus niqer 62 77 0 3e-122 Fusarium oxysporum fsp lycopersici 79 85 0 2e-143 Cryphonectria parasitica 77 83 0 5e-145 Cochlioholus carbonum 73 84 0 2e-143 Sderotinia sclorotiorum 70 82 2 2e-120 Botytis cinerea IBotryotinia fuckeliana: 67 80 2 2e-í15 Aspergillus fíavus 69 80 1 8e-128 Fusarium moniliforme (PDB 1HG8 A) 47 64 3 Se-S 1. Aspergillus niger (PG2, PDB 1CZF A) 65 77 0 5e-120 Aspergilíus aculeatus (PDB 1IA5 A) 65 78 f 3e-117 Aspergillus niger (PG1, PDB 1NHC A) 62 77 0 3e-122 Stereum purpurem (PDB 1KCD) 'Mym 56 6e-57 Tabela 3: Resultados obtidos com o programa BLASTp usando-se como seqüência de busca a estrutura primária da FmPG (lHG8.pdb) e da ClPGA (2IQ7.pdb) contra o banco de seqüências protéicas NR do NCBI filtrado para seqüências de Viridiplantae (taxid

33090).

Rcsí. íados ce DWi Tb. FirPG ílK-S.Mbi e CPO Í2i07.pd3) cort-a NR de cla;:Uw do NCI?! fBMM· 4H68 A ;' ■ ' 2.U7 A. 'ΓΤ9Πι3§: : 1 :.· 3 .-,1J-SJdd .-fD F-W .e Irieiiliitddei6-O) STnIandadefx ■BB Ms mifera (parreira de uva) 28 49 2e-18 31 46 3e-21 -.Sotmum tycopemcvm (tomateiro) 26 48 4e-20 31 51 1e-22 íOncidium OmerRamsey (orquídea) 27 47 2e-16 29 47 2e-21 lArabidopsis (fmlíana 27 48 1e-15 28 ' 47 2e-1£ IBrassica napus (couza) 27 48 2e-26 29 48 2e-2€ iZea mvs (mtiho) 25 44 2e-10 31 48 1e-13 ϊMaius x domestica (macieira) 28 52 2e-17 29 52 4e-16 ICucumis melo (melão) 30 48 2e-14 30 49 2e43 \Daucus carota (cenoura) 29 48 3e-16 30 50 8e-1S \Ricinuscommunis (mamona} 27 49 3e-O0 25 42 2e-05 iPninus pérsica (pessequeiro) 27 52 5e-17 27 46 4e-17 iPmnus domestica (ameixeira) 27 45 5e-18 31 48 2e-18 \Persea americana fabacateim) 29 49 1e-23| 29 48 4e-21 IMedtago sativa (atfafa) 28 46 36-1Θ 31 50 1e-1S iLvcopersicon escuientum (tomateiro) 26 48 4e-2Q 31 51 1e-22 Gfydne max (soja) 27 48 1e-21 .-D 45 3e-21 \ Actirtidia deídosa (kiwi) 26 49 3e-17 27 48 2e-1S IRubusktaeus (framboesa) 28 47 ?c-?7 23 47 Se-19 Sabendo-se da importância destes fungos patogênicos na produção agrícola e pensando-se no desenho de um fármaco de alta abrangência, foi feito um alinhamento de seqüência primária usando o programa ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWillian, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J., D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. ClustaI W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948, 2007) incluindo todos os fungos patogênicos citados anteriormente e este está mostrado na figura 1. Nesta figura também estão alinhadas três seqüências de PGs vegetais (de Arabidopsis thaliana, Ricinus comunis e Brassica rubra) com o intuito de compará-las com seqüências de PGs 5 fúngicas e buscar por aminoácidos que sejam específicos de fungos em relação às plantas e que estejam envolvidos na ligação com o substrato estando próximos espacialmente a eles. Isso remete à discussão sobre como identificar um ideal alvo terapêutico para o desenho computacional de novos compostos. Anderson (2003) publicou uma descrição de como deve ser realizado o procedimento de desenho 10 computacional de fármacos baseado em estruturas protéicas, desde os critérios que devem ser adotados para a escolha do alvo terapêutico para tal desenho até os processos de desenvolvimento, docking e virtual screening (AC Anderson. The process of structure-based drug design. Chem Biol. Sep;10(9):787-97, 2003). O trabalho discute que o desenho de drogas antimicrobianas deve se basear em alvos que sejam essenciais, 15 principalmente encontrados nos patógenos (em relação a organismos não-patogênicos, e .ao hospedeiro), tenham uma função única no patógeno e que sejam passíveis de sofrerem inibição por pequenas moléculas. Pensando nisso, o alvo considerado, a proteína PG, é essencial para a patogenicidade destes fungos, é passível de inibição, já demonstrada praticamente através de estudos com a PGIP, e, sugerimos a seguir 20 resíduos a serem usados como alvos preferenciais por existirem especificamente em PGs de fungos e ausentes nas de plantas.

Analisando-se o alinhamento e características estruturais de resíduos próximos aos envolvidos na catálise e ligação ao substrato, pode-se perceber a existência de três aminoácidos importantes, presentes exclusivamente nas PGs de fungos e, portanto, 25 ausentes nas PGs vegetais: Hisl88, Aspl94 e G305. A estrutura da SpPGl depositada no PDB (IKCD) possui, co-cristalizada dois resíduos de ácido galacturônico e, através de visualização no programa Java Protein Dossier da plataforma STING (Neshich G., Rocchia W., Mancini A.L., Yamagishi M.E., Kuser P.R., Fileto R., Baudet C., Pinto I.P., Montagner A.J., Palandrani J.F., Krauchenco J.N., Torres R.C., Souza S., Togawa R.C., 30 Higa R.H. JavaProtein Dossier: a novel web-based data visualization tool for comprehensive analysis of protein structure. Nucleic Acids Res. 2004 Jul 1;32 (Web Server issue):W595-601, 2004), foi possível extrair informações de que aminoácidos estão interagindo por meio de contatos com estes resíduos glicídicos. Estes são os resíduos do sítio ativo Asp212, Asp213 e Aspl91, e sítio ligante: Asnl89, His234, Gly239, Ser 240, Arg267, Lys269 e Tyr302 que, como exposto por Markovic e Janecek (2001), estão altamente conservados entre as PGs e possuem alta similaridade estrutural 5 com os correspondentes nas estruturas de fungos já resolvidas (A. niger (1CZF e 1NHC), F. moniliforme (1HG8), C. lupini (2IQ7), A. aculeatus (1IA5)) e, somados à similar estrutura geral, os fazem ser classificados como hidrolases da família 28, apesar da baixa identidade de seqüência.

No alinhamento, o alto grau de identidade dos resíduos especificamente envolvidos na catálise e ligação do substrato e a alta similaridade nos leva a crer os compostos aqui desenhados para a PG de Fusarium moniliforme, por exemplo, seriam igualmente capazes de inibir as PGs destes outros fungos. Além disso, foram selecionados resíduos próximos (distância menor que 2Â) aos resíduos mencionados que participam do sítio catalítico e sítio ligante através do programa JavaProtein Dossier. Estes foram analisados cuidadosamente no alinhamento mostrado na figura 1 quanto à exclusiva presença em PGs fúngicas em detrimento de PGs vegetais e também na presença em posições correspondentes no maior número possível de PGs de fungos o que vai de encontro à idéia de desenhar um composto que teria alta abrangência e não traria efeitos indesejáveis para o desenvolvimento da planta. Foram encontrados, portanto, os resíduos Hisl88, Aspl94 e G305, que foram escolhidos como “alvos preferenciais”. Coincidentemente, o resíduo Hisl88 é considerado um dos mais importantes quanto à interação do inibidor protéico de PGs (PGIP) na inibição das PGs, como é mostrado no trabalho de Federici et al (L. Federici, C. Caprari, B. Mattei, C. Savino, A. di Mateo, G. De Lorenzo, F. Cervone, D. Tsemoglou, Structural requirements of endopolygalacturonase for the interaction with PGIP, PNAS, 98(23), 13425-13430, 2001).

Um alinhamento de estrutura primária já foi publicado contendo toda a família de 28 hidrolases glicosídicas a que pertencem essas enzimas (O. Markovic, S. Janecek, Pectin degradin glycoside hydrolases of family 28: sequence-structural features, 30 specificities and evolution, Protein Engineering, 14(9):615-631, 2001) onde foi evidenciado, pelo alinhamento das seqüências de 115 enzimas dessa família oriundas de plantas, insetos, fungos e bactérias, que as regiões que compreendem os aminoácidos Ν189, Τ190 Dl91, D212,D213, G233,H234, G235, R267, 1268, K269 e o aminoácido Y302 (numeração da FmPG) estão altamente conservadas em todas as PGs, EPGs e EPGDs.

Para uma análise mais profunda acerca das posições estruturais dos resíduos destacados no alinhamento da figura 1, optamos por modelar a estrutura tridimensional das PGs de outros fungos, como: Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, F graminearum, Aspergillus flavus, Botrytis cinerea, Cochliobus carbonum, Crypphonectria parasitica e Sclerotinia sclerotiorum a fim de se verificar as correspondências quanto às posições dos aminoácidos envolvidos na ligação, A estrutura que serviu de molde (“template”) para modelagem por homologia usando o programa Modeller 9v8 (Eswar, N., Marti-Renom, M. A., Webb, B. , Madhusudhan, M. S., Eramian, D., Shen, M., Pieper, U., Sali., A. Comparative Protein Structure Modeling With MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30, 2006), foi a PG do C. lupini (código PDB 2iq7) pois este apresentou maior identidade e similaridade com seqüências dos fungos de importância econômica citados (Tabela 2). Após a modelagem, uma rodada de minimização de energia foi efetuada usando o programa Gromacs (D. Van Der Spoel, E. Lindhal, B. Hess, G. Groenhof, A.E. Mark, H.J Berendsen, GROMACS: fast, flexible, and free, J Comput Chem, 26(16), 1701-18, 2005). Adicionalmente, usando o programa DeepView (Guex, N. e Peitsch, M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb-Viewer: An environment for comparative protein modelling. Electrophoresis 18:2714-2723, 1997), foi realizada edição das estruturas otimizando a numeração de aminoácidos na estrutura primaria, dentre outras ações.

Foi feita a validação das PG modeladas usando a análise de gráficos de 25 Ramachandran (Ramachandran, G. N., Ramarkrishnan, C., Sasisekharan, V. Stereochemistry of polypeptide chain conformations. J. Mol Biol 7:95-99, 1963) em uma interface gráfica da plataforma STING (Neshich, G., Togawa, R., Mancini, A. L., Kuser, P. R., Yamagishi, Μ. E. B., Pappas Jr., G., Torres, W. V., Campos, T. F., Ferreira, L. L., Luna, F. M., Oliveira, A. G., Miura, R. T., Inoue, Μ. K., Horita, L. G., de Souza, 30 D. F., Dominiquini, F., Álvaro, A., Lima, C. S., Ogawa, F. O., Gomes, B. G., Palandrani, J. C. F., dos Santos, G. F., de Freitas, E. M., Mattiuz, A. R., Costa, I. C., de Almeida, C. L., Souza, S., Baudet, C. and Higa, R. H. STING Millennium: a Web based suite of programs for comprehensive and simultaneous analysis of protein structure and sequence. Nucleic Aeids Research, 31:13, 3386-3392, 2003), que indicou que, para todos os modelos obtidos, cerca de 84-86% dos resíduos se encontravam em regiões permitidas, o que não difere muito da estrutura que serviu de molde (C1PG, PDB: 5 21Q7_A, resolução 1.94 Â), que teve 85.55% de resíduos em regiões permitidas. Considerando que a qualidade dos modelos está muito próxima da qualidade do molde, os modelos são considerados aceitáveis. A validação através do ProsaWeb indicou que os valores de z-score eqüivaleram a -7.75, -7.54, -7.29, -7.04, -7.88, -7.58, -7.59, respectivamente para as PGs modeladas de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, F 10 graminearum, Aspergillus flavus, Botrytis cinerea, Cochliobus carbonum, Crypphonectria parasitica e Selerotinia sclerotiorum; e o z-score da enzima do Colletotrichum lupini (ClPG) foi de -7.59. Estes z-scores estão contidos no intervalo de resultados normalmente encontrados para as proteínas nativas de tamanho similar (Whiederstein, M., Sippl, M. J. ProSA-web: Interactive web Service for the recognition 15 of errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acid Research, Web Server issue: W407-10, 2007). Portanto, os modelos foram considerados aceitáveis para a continuação das análises.

Para uma análise comparativa das posições estruturais dos aminoácidos relevantes ao presente estudo, foram efetuadas sobreposições estruturais dos modelos gerados com a estrutura molde e entre as diversas estruturas resolvidas e depositadas no PDB (Tabelas 4 e 5). Foram calculados os valores de desvio no alinhamento entre as estruturas terciárias alinhadas através do programa TM-align (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th TM-score, Nucleic Acid Research, 33(7): 2302-2309, 2005). Observa-se que os valores de RMSD e TM-score são satisfatórios entre os modelos e a enzima 1HG8 e entre os modelos e seu “template”, a enzima 2IQ7. A visualização e confecção de imagens foram feitas com o programa PyMol (W.L Delano, The PyMol molecular graphics system Delano Scientifíc, San Carlos, CA, USA, http://www.pymol.org) e MVD (Thomsen R, Christensen MH.: MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking. J Med Chem. 2006 Jun 1;49(11):3315-21.;W.F. De Azevedo Jr, MolDock applied to structure-based virtual screening, Current Drug Targets, ll(3):327-334, 2010). Os alinhamentos estruturais entre a PG do F. moniliforme e as estruturas depositadas no PDB são mostradas nas figuras 2a, 2b, 2c, 2d e 2e com enfoque nos resíduos importantes do sítio ligante (H234, R267, K269 e Y302) e na sobreposição geral das estruturas. Os valores fornecidos pelo TM-align são o RMSD e o TM-score, sendo que o primeiro calcula a média quadrática da distância entre os resíduos correspondentes 5 considerando apenas as distâncias entre pares de resíduos e sendo influenciado pelo tamanho da proteína, não levando em conta sua topologia. Já o TM-Score é calculado levando em conta a topologia das estruturas sobrepostas, o que é bastante importante uma vez que a maioria das interações entre proteínas são influenciadas pela topologia. Foi observado, nestas sobreposições, que as posições dos aminoácidos nos sítios 10 ligantes das proteínas são bastante conservadas estruturalmente, o que reforça a idéia de que um ligante que funcione como inibidor da PG ligando-se a esses aminoácidos pode ter grandes chances de também ter atividade inibitória para as outras PGs fungicas. A finalidade em se obter modelos tridimensionais das enzimas que não possuem estrutura resolvida por métodos experimentais é o de fornecer resultados adicionais para a 15 modelagem dos ligantes além daqueles fornecidos pelas simulações entre ligantes e PGs que possuem estrutura depositada no PDB. Os valores de RMSD e TM-score foram considerados satisfatórios, pois como pode ser visto nas figuras (Figura 2) e no alinhamento (Figura 1), as enzimas são muito semelhantes estruturalmente.

Tabela 4: Valores de RMSD e TM-Score resultantes de alinhamento estrutural entre as estruturas de PGs fúngicos e enzima FmPG (lHG8.pdb). O RMSD fornece a média quadrática das distâncias entre pares correspondentes de resíduos depois da sobreposição de uma estrutura sobre a outra. O TM-score utiliza o fator de LevittGerstein que considera os pares de resíduos em menores distâncias como mais 25 relevantes do que aqueles a maiores distâncias e também é mais sensível à topologia geral do que a variações estruturais localizadas. O TM-score é normalizado de forma a não ser dependente do tamanho da proteína, seu valor pode ir de 0.0 a 1.0, sendo valores maiores que 0.17 indicativos de similaridade estrutural elevada (Yang Zhang, J. Skolnick, TM-align: a protein structure alignment algorithm based on th TM-score, 30 Nucleic Acid Research, 33(7): 2302-2309, 2005). Como o TM-score leva em consideração principalmente a topologia, esses resultados indicam que todas as enzimas possuem alta correlação estrutural com a FmPG (lHG8.pdb). Alinhamento estrutural com a FmPG (1HG8.pdb) 5* PDBs Funpos RMSD TM-score i 1IA5 AspetxiiHu s aculeaíus 1 54 0.95 1CZF A AsperpiRtts fíiçç&T 1,63 0 96 IfJHC A Aspergillus niger 1,48 0.97 2IQ7 A Coíleíotnchum lupini 1 55 o.se 1K5C Stereum purpureum 1.72 0,93 Stereum purpureum 1J3 0 93 Tabela 5: Valores de RMSD e TM-Score resultantes de alinhamento estrutural entre as estruturas modeladas de PGs fúngicas e as estruturas das enzimas FmPG (lHG8.pdb) e ClPG (2IQ7.pdb).

Mcdelos Alinhamento estrutural com FâmPS; (1HG8.pdb) e CIPG Í2IQ7 pc RMSD TM-score U 1 Fn PG RMSD TM-score AfFG AspergiHus flaws 1.45 0,96 0,29 0.99 BPG Botryotinia fuckeliarw 1,19 0,96 0,31 0,98 CcPG Cochiiobolus carbonum 1,34 0.96 0,27 0,99 CpPG Cryphonectm parasitica 1,44 0 95 0,36 0,99 FqPG Fusarium graminearum 1,48 0,97 0,29 1 FoPG Fusarium oxysporum f sp tycopersid 1,46 0.96 0,3 0.99 SsPG Sclemtmia sclerotiomm 1,42 0,96 0,32 0,99 Adicionalmente, foi feita sobreposição da PG de F. moniliforme (FmPG) com a 10 PG do S. Purpureum (SpPG), sendo que esta última foi cristalizada em complexo com galacturonato no trabalho de Shimizu et al (T. Shimizu, T. Nakatsu, K. Miyairi, T. Okuno, H. Kato, Active-site architecture of endopolygalacturonase I from Stereum purpureum revealed by crystal structures in native and ligand-bound forms at atomic resolution, Biochemistry, 41, 6651-6659, 2001). Foi observado que a FmPGsobreposta à 15 de S. purpureum apresentou boa sobreposição de aminoácidos no sítio de interesse; e também que a posição do galacturonato cristalizado em complexo com a SpPGl corresponde à posição obtida pelos ligantes no dockingcom a FmPG, o que valida a técnica para atracamento de ligantes no sítio alvo da proteína (Figura 3) e pode ser considerada um controle positivo da metodologia.

Um adicional trabalho foi realizado para a análise da conservância de parâmetros

físico-químicos e estruturais dentre os resíduos importantes entre as estruturas de PGs fúngicas. Sabe-se que a função da proteína é mais conservada com relação à estrutura 3D do que em relação à seqüência primária (Chothia C, Lesk AM. The relation between the divergence of sequence and structure in proteins. EMBO J. Apr;5(4):823-6, 1986), havendo várias proteínas com pouca ou nenhuma similaridade de seqüência que, mesmo assim, têm similaridade estrutural. Conhecer a estrutura permite-nos explicar o mecanismo bioquímico pelo qual a proteína implementa sua funcionalidade. Os fatores 5 que determinam a funcionalidade do sítio ativo de uma proteína são muito complexos e dependem da estrutura tridimensional, além das propriedades bioquímicas e biofísicas.

É possível analisar os sítios funcionais como um nano-ambiente físico-químico que acompanha uma função, ao invés de considerá-los como um grupo de resíduos fixos. Assim, buscamos uma caracterização mais genérica do sítio ativo (e/ou conjunto 10 dos aminoácidos que constroem o chamado sítio de ligação ao substrato), a partir de descritores estruturais, sem considerar necessariamente a conservação como o principal fator e sim a geometria específica, que sejam úteis para a previsão dos resíduos catalíticos das enzimas.

Aplicamos um método para seleção de descritores da estrutura contidos no STING_DB (Neshich, G., Togawa, R., Mancini, A. L., Kuser, R R., Yamagishi, Μ. E. B., Pappas Jr., G., Torres, W. V., Campos, T. F., Ferreira, L. L., Luna, F. M., Oliveira, A. G., Miura, R. T., Inoue, Μ. K., Horita, L. G., de Souza, D. F., Dominiquini, F., Álvaro, A., Lima, C. S., Ogawa, F. O., Gomes, B. G., Palandrani, J. C. F., dos Santos, G. F., de Freitas, E. M., Mattiuz, A. R., Costa, I. C., de Almeida, C. L., Souza, S., Baudet, C. and Higa, R. H. STING Millennium: a Web based suite of programs for comprehensive and simultaneous analysis of protein structure and sequence. Nucleic Acids Research, 31:13, 3386-3392, 2003), projetado especificamente para previsão do sítio catalítico e do sítio de ligação ao substrato de enzimas. Apenas alguns resíduos da enzima participam da catálise, ao passo que a grande maioria dos resíduos são não reativos. Outros resíduos são caracterizados como aqueles que servem para o atracamento de ligante ou substrato e estes também tem suas características que podem ser usadas para sua seleção e consequentemente, para descrição do nano-ambiente criado por este conjunto de resíduos que compõem o sítio de ligação. Com a identificação de um conjunto dos descritores de nano ambiente, estamos habilitados para a construção de uma tabela de assinaturas (consulta sobre os descritores estruturais dos resíduos restringindo seus intervalos de valores) para os diversos membros de famílias enzimáticas. Estas assinaturas devem funcionar em todos os membros se identificadas com rigor. No caso da proteína PG, identificamos apenas dois parâmetros que com sucesso foram capazes de selecionar em todas as estruturas existentes no PDB o conjunto de resíduos que compõem o sítio catalítico que, como já foi mencionado anteriormente, é constituído por três aminoácidos idênticos - ácidos aspárticos (Glu), que tem numerações 191, 212 e 213 no FmPG 1HG8.

Foram examinadas 7 estruturas de PGs fúngicas (em parêntesis a numeração dos aminoácidos da tríade catalítica correspondentes em cada estrutura) lhg8 (191, 212,213), Ikcd (153, 173,174), lk5c (153, 173,174), lia5 (159,180,181), Iczf (180,201,202), 2iq7 (178,199,200) e Ibhe (202,223,224). Usando a ferramenta Select 10 do Java Protein Dossier. O conjunto de descritores e seus intervalos de valores que caracterizam unicamente estes resíduos foram: Valor do parâmetro Conservation HSSP Relative Entropy <=2 e do parâmetro Electrostatic Potencial no último átomo pesado (LHA) num intervalo de [-300,-167 kT/e], o que indica a característica do potencial eletrostático medido em volta de último átomo pesado da cadeia lateral, sendo este 15 negativo e os resíduos possuem alta conservação na evolução deste aminoácido no contexto da estrutura desta enzima (indicado pelo baixo valor de “Conservation HSSP Relative Entropy”).

Em adição, foram identificados os aminoácidos constituintes de sitio de ligação ao substrato para estas estruturas, de acordo com a sua presença estabelecendo interações com a molécula de galacturonato na estrutura da SpPG (PDB 1KCD). O conjunto de descritores e seus respectivos valores, usados para identificar o nano ambiente criado na estrutura protéica por eles, são bem mais complexos e diversos. É constituído pelos seguintes parâmetros STING, com seus respectivos intervalos: Conservation HSSP Relative Entropy <= 4; Reliability (xlOO) >= 80; Rotamers Percent<= 8; Electrostatic Potencial Average Range:[-12,50]; Unused Contacts Total >= 62; Unused Contacts Energy Total >= 127; Hydrophobic Scale Isolation < I; Surface Accessibility Isolation < 33. Pode-se observar que estes aminoácidos, além de conservados altamente, têm baixo teor de rotâmetros, também possuem baixo valor de intervalo de potencial eletrostático médio (calculado como uma media em volta de todos os átomos) bem mais positivo que aquele calculado em volta do LHA para resíduos do sitio catalítico. Outra característica observada foi o alto número de contatos não usados (indicando alto potencial em fazer contatos com molécula de substrato) e tendo hidrofobicidade baixa e acessibilidade das moléculas ao solvente não expressiva porém existente. Estes conjuntos foram usados não apenas para identificação nas estruturas estudadas, como também para melhor compreender o ambiente para qual o inibidor seria construído, tendo a eficácia necessária para sua aplicação final. Portanto, estes 5 parâmetros indicam as características físico-químicas do alvo terapêutico para o adequado desenho dos novos compostos.

Para o desenho computacional de ligantes partiu-se da estrutura do ligante natural, galacturonato. A partir dele foram feitas buscas por compostos que possuíam similaridade na estrutura química acima de 90% na base de dados PubChem 10 (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) através do “PubChem Structure Search” (Junguk Hur, David J Wild: PubChemSR: A search and retrieval tool for PubChem, Chemistry Central Journal, 2:11 doi:10.1186/1752-153X-2-11, 2008) e, ao todo, foram obtidas 2004 estruturas. Também foi feito o desenho de ligantes tendo como alvo principal os resíduos D194, Hl88 e G305, que são conservados apenas nos fungos; as plantas 15 possuem prolina/leucina no lugar da histidina e histidina/treonina no lugar do aspartato. A estratégia para o desenho desses ligantes partiu da observação da posição de todos os aminoácidos do sítio ligante e confirmação de conservação estrita a fungos através de vários alinhamentos feitos usando o CLUSTALw entre estruturas primárias de fungos e plantas (apenas algumas seqüências de plantas são mostradas na Figura I). Todas as 20 estruturas desenhadas foram então submetidas a simulações de docking com a estrutura da FmPG, código PDB 1HG8. O docking foi realizado com o programa Molegro Virtual Docking (MVD) (Thomsen R, Christensen MH.: MolDock: a new technique for highaccuracy molecular docking. J Med Chem. Jun 1;49(11):3315-21, 2006.), que é baseado em algoritmo evolutivo para simular as interações ligante-proteína.

As simulações de docking (com ligante flexível) usando-se o programa MVD,

foram efetuadas centralizando-se nos resíduos do sítio ativo mencionado e com um raio de esfera de espaço de busca de 30Â (que envolveu quase toda a proteína). O algoritmo de cálculo de score usado foi o MolDock Score [GRID], usando uma resolução de Grid de 0,3Â (avaliando-se o ligante por meio de Interações internas de pontes de hidrogênio, 30 interações eletrostáticas e torções Sp2-Sp2). O algoritmo de busca e docking usado foi o MolDock Optimizer (que é uma implementação de uma variação do algoritmo evolutivo), com 10 rodadas, tamanho de população igual a 50 e com 2000 iterações. Após o docking, o MVD realizou Minimização de energia e otimização de pontes de Hidrogênio das “poses” (sendo que uma pose é um modo de ligação candidato) obtidas.

Com o MVD é possível visualizar os resultados das simulações em modelos tridimensionais, o que toma possível eliminar facilmente as “poses” que adotaram 5 posições visualmente errôneas, não tendo de levar apenas em consideração os valores numéricos fornecidos pelo programa para isso. Dada a importância dos resíduos preferenciais H188, D194 e G305 e os envolvidos na interação ligante-proteína D194, Hl88, H234, R234, K269, T302 e G305, os compostos foram então selecionados de acordo com os valores de energia, em relação a esses resíduos, fornecidos pelo 10 programa através do módulo “Ligand Energy Inspector”. Foi também considerado o MolDock score, que é a energia total da pose, como parâmetro secundário na seleção de ligantes.

A cada docking seguiu-se a seleção de ligantes e modificações estruturais nos mesmos a fim de melhorar a interação com os resíduos-alvo. As modificações foram feitas com o programa ChemBioDraw

(http://www.cambridgesoft.com/software/ChemBioDraw/) e as estruturas foram energeticamente minimizadas com o mesmo.

Foram obtidas 11 estruturas (Figura 4) derivadas daquelas que apresentaram melhores resultados nas rodadas de dockingsanteriores e que se sugere que podem apresentar atividade inibitória para a(s) enzima(s) poligalacturonase(s). Nas tabelas 6 e 7 são demonstrados os resultados de docking dos ligantes desenhados e de duas simulações de docking executadas usando os ligantes naturais trigalacturonato e monogalacturonato, contra as enzimas FmPG e C1PGA, sendo que foi feito também docking com esta última devido a maiores identidade e similaridade com as enzimas modeladas do que o apresentado pela FmPG. Os valores de energia na interação com os resíduos escolhidos como alvo (numeração da C1PGA: H234, R267, K269 e soma das energias dos resíduos D194, Hl 88 e G305 e segundo numeração da FmPG; H221, R254, K256 e soma das energias dos resíduos D181, H175 e G292, numeração da C1PGA) são menores para os ligantes desenhados, bem como os valores de MolDock score, interação com proteína, interações de hidrogênio e o LEl (divisão do valor do MolDock score pelo número de átomos do ligante, exceto hidrogênios), significando que o complexo formado entre os compostos desenhados computacionalmente e até mais estável.

Tabela 6: Valores de energias de interação (em Kcal/mol) entre os ligantes e os resíduos conservados entre todas as PGs (H234, R267, K269 e Y302), soma das energias de interações estabelecidas entre os ligantes e os resíduos específicos de fungo (H188, Dl94 e G305) e valores de Moldock score (energia total do ligante), Protein (total energia de interação do ligante com a proteína), Hbond (energia decorrente de interações de Hidrogênio) e LEl (valor do MolDock score dividido pelo número de átomos pesados, exceto hidrogênios) fornecidos pelo Molegro Virtual Docker, no módulo Ligand Energy Inspector. Estes resultados foram obtidos da simulação de dockingdos ligantes desenhados com o espaço de busca centralizado no sítio catalítico da FmPG. Para o desenho das moléculas foram especialmente consideradas as interações com os resíduos especificados. A soma das energias de interação entre os ligantes e esses resíduos foi o primeiro parâmetro de avaliação para exclusão e modificação das estruturas dos compostos. O segundo parâmetro utilizado foi o MolDock score. Também foram consideradas as energias de interação com proteína, de ligação de hidrogênio e o LEI. Observa-se então que são menores os valores de energia total entre esses resíduos e os ligantes desenhados se comparados aos valores encontrados no docking das moléculas de galacturonatos, o que sugere que a ligação dos ligantes desenhados a esses resíduos pode ser mais estável.

Tabela 7: Valores fornecidos pelo docking dos ligantes desenhados com espaço de busca centralizado no sítio catalítico da ClPGA (2IQ7.pdb), conforme padrão da tabela 6. Foi feito um docking com essa enzima, pois ela serviu de molde para a confecção de modelos para as seqüências enzimáticas que não possuíam estrutura terciária resolvida e devido à sua maior similaridade e identidade. Observa-se que são menores os valores de energia total de interação entre os resíduos H221, R254, K256, Y289 (mesmos resíduos da 1HG8 citados na tabela 6, mas com numeração diferente, agora correspondentes a numeração encontrada no 2IQ7.pdb) e os ligantes desenhados comparado com os 5 valores dos galacturonatos, o que sugere que a ligação dos compostos desenhados a esses resíduos pode ser mais estável. No entanto, os valores de energia de interação entre os ligantes e os resíduos Dl81, G292 e H175, não foram muito diversos dos valores dos galacturonatos, exceto no caso dos ligantes dh3211, 204 e 402, que apresentaram menores valores de energia.

10

Considerando que os compostos serão para uso agrícola e seus resíduos poderão ser consumidos por humanos e animais é fundamental que o desenho de novos compostos seja analisado em relação ao potencial de risco de produção de efeitos indesejáveis. Pensando nisso, foi feita predição de parâmetros moleculares que 15 influenciam na Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade (ADMET) utilizando-se o Osiris Property Explorer (Thomas Sander, Actelion Pharmaceuticals Ltd., http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/). Essa ferramenta permite analisar cLogP, solubilidade em água, peso molecular e riscos de toxicidade; além disso, fornece dois parâmetros: Druglikeness e Drug-score. O Druglikeness baseia-se na comparação 20 do composto desenhado com compostos de base de dados de compostos comercializados e de base de dados de compostos sem propriedades farmacológicas (Fluka). O Drug-score fornece um valor geral que considera todos os parâmetros anteriores. Os resultados da análise constam na Tabela 8. Como não é interessante que os compostos sejam absorvidos pelo trato gastrointestinal dos consumidores, valores 25 menores de cLogP são desejáveis. Alta solubilidade em água também é desejável, pois favorece a aplicação do produto na agricultura e se mantém superficialmente na planta, o que é interessante, pois vários fungos chegam à planta pela superfície. Também é possível uma aplicação com água no solo, que seria absorvida pelas raízes (outra porta de entrada às infecções fúngica) e disseminar-se para outros pontos da planta pelo Xilema. Ademais, alta solubilidade em água também favorece a difusão através da rede vascular vegetal quando for de interesse que o composto atue na inibição das PGs 5 vegetais. O Osiris fornece dados de toxicidade animal tais como risco de mutagenicidade, tumorogenicidade, efeito reprodutivo e irritação baseado em fragmentos moleculares com toxicidades conhecidas armazenadas em base de dados (RTECS).

Tabela 8: Resultados da análise de ADMET, feita pelo programa Osiris Property Explorer (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/) com osdados de risco de toxicidade tais como mutagenicidade, tumorgenicidade, irritabilidade e eventuais efeitos colaterais reprodutivos, baseados em fragmentos de moléculas conhecidas depositados no banco de dados RTECS. Este programa fornece um valor de LogP, o coeficiente de 15 partição entre água e n-octanol, que mede a hidrofobicidade (quanto maior o valor, maior a solubilidade do composto em lipídeos). No caso das plantas e tratando-se de um composto de uso superficial (não precisa ser absorvido para agir), ter um LogP baixo pode ser algo positivo pois será menos absorvido e menos distribuído em tecidos animais. Fornece um valor de LogS (solubilidade), parâmetro que afeta tanto absorção e 20 distribuição, cujo valor deve ser maior que -4, baseado no LogS médio dos medicamentos comercializados. Fornece o Drug-score que é um valor geral resultante da combinação de todos os parâmetros anteriores mais o Druglikeness, que compara fragmentos do composto desenhado com base de dados de compostos comercializados e com base de dados de compostos que não servem como fármacos (Fluka). E desejável 25 que tanto Druglikeness quanto o Drug-score sejam positivos. irritante Resultados solubífidâde........ -6,6 0,26 -2,96 -1.14 202 irritante -3 27 -0.78 -2.62 0,24 203 n/a -3.39 -0,88 -1 17 0 51 204 efeito reprodutivo -1.52 -1,521 0.56 205 efeito reprodutivo -1.81 -1.8 1,86 0.72 401 mutagêníco -6,13 0.92. -6,74 0 32 402 mutagênico -6,05 0,64 2,81 0 46 602 iIIi P.r:.>.·· yMmW *3,79 -0,04 -0*57 0,58 604 n/a -2,21 -0,38 -7,36 047 605 efeito reprodutivo -2,43 -0,12 -7,03 0 37 Temos 2 ligantes que se destacam:

- dh3211, nome IUPAC (3S,Z)-3-amino-4-((3S,4S,E)-6-(2-aminoethylidene)-4- (hydroxymethyl)hexahydropyridazin-3-yl)-l-((3R,4R)-4-(3,3-dihydroxyallyl)-2-

hydroxy-6-((E)-3 -hydroxyprop-1 -en-1 -yl)-3,4-dihydro-2H-pyran-3-yl)but-1 -ene-2,3 diol, SMILE

C1(=0)0C(=C(C(C1(\C(=C(/0[H])C(0[H])(N([H])[H])C(C2(C(C(\C(N(N2[H])[H])= C([H])/C(N([H])[H])([H])[H])([H])[H])([C](0[H])[H])[H])[H])([H])[H])[H])[H])([H])\ C(=C(\C(=0)0[H])[H])[H])[H])\C(=C(\C(0[H])([H])[H])[H])[H] (este ligante, atracado ao sítio alvo, está mostrado na figura 5)

- 602, nome IUPAC (3S,4S,E)-2,6-bis((l,l,4,4-tetrahydroxybutan-2-yl)oxy)hex-5- ene-l,l,3,4,5-pentaol, SMILE

0(C(C(0[H])(C(0[H])(C(/0[H])=C(\OC(C(C(0[H])(0[H])[H])([H])[H])(C(0[H])(0[ H])[H])[H])[H])[H])[H])(C(0[H])(0[H])[H])[H])C(C(C(0[H])(0[H])[H])([H])[H])(C( 0[H])(0[H])[H])[H] (este ligante, atracado ao sítio alvo, está mostrado na figura 6).

O primeiro composto, dh3211, obteve ótimas interações com os resíduos H188, D194 e G305, que são específicos para fungos e o segundo, 602, com os resíduos H234, R267 e K269, que são resíduos conservados inclusive em plantas, como pode ser visto 20 nas tabelas 6 e 7. Além disso, o 602 também obteve destaque na análise de ADMET (tabela 8). Ambos podem ser considerados como bons potenciais para inibição das enzimas fúngicas, porém a maior afinidade específica à PGs Fúngicas pelo dh3211 nas simulações feitas são indicativo de que esse composto tem um potencial de uso mais seguro em relação ao 602, pois os resíduos com os quais interage melhor não estão 25 presentes em plantas. Porém, se considerarmos outras aplicações para esses compostos além da fungicida, como por exemplo, retardamento da maturação de frutos ou mesmo da germinação de sementes (funções fitofísiológicas essas que tem relação direta com a expressão de PG vegetal) todos os compostos, inclusive aqueles que são potencialmente inibidores de enzimas vegetais, podem contribuir para a produção agrícola. Além disso, 5 outras funções das PGs vegetais poderão ser manipuladas usando estes compostos caso seja confirmada sua ação inbitória sobre as PGs de plantas, tais como: processos de separação de células, germinação, abscisão de órgãos, deiscência das anteras, maturação do grão de pólen, amadurecimento do fruto, formação das células do xilema e crescimento do tubo polínico (Kim J, Shiu SH, Thoma S, Li WH, Patterson SE. Pattems 10 of expansion and expression divergence in the plant polygalacturonase gene family. Genome Biol. 7(9):R87, 2006). Acreditamos que o composto desenhado dh3211, por ter apresentado fortes interações com resíduos específicos de PGs fúngicas, terá maior especificidade à ligação sobre estas enzimas em detrimento das PGs vegetais (que possuem resíduos com propriedades físico-químicas antagônicas aos resíduos 15 específicos de PGs fúngicas). Possivelmente o composto dh3211 seria um bom candidato para aplicação em campo sem causar inibição da enzima vegetal.

Claims (3)

1.Método paradesenhar computacionalmente novos compostos com potencial função inibitória da enzima endopoligalacturonase caracterizado pelas seguintes etapas: (i) obtenção de arquivos de coordenadas referentes às estruturas tridimensionais, a partir do banco PDB, da estrutura da enzima endopoligalacturonase (PG); (ii) busca por seqüências homólogas, que também possuam estrutura depositada no PDB, às estruturas primárias das enzimas dos organismos de interesse usando o BLASTp contra o banco de dados de seqüências primárias do PDB; (iii) predição de modelos de estruturas tridimensionais das PGs que não possuírem estrutura depositada nos bancos públicos utilizando as seqüências primárias das enzimas dos organismos de interesse e como molde (template) as estruturas cujas seqüências primárias são homólogas à seqüência de interesse; (iv) edição das estruturas otimizando a numeração de resíduos na seqüência primaria usando o programa Deep-View, minimização da energia dos modelos gerados através do programa GROMACS, visualizadas das estruturas terciárias para análise da sobreposição das estruturas terciárias através do PyMol, avaliação da qualidade dos modelos gerados através da análise de gráficos Ramachandran, gerados através da utilização do Java Protein Dossier e da plataforma STING, e analise dos modelos em relação a erros na estrutura tridimensional pelo ProSa-web; (v) alinhar a FmPG (lHG8.pdb) às estruturas depositadas no PDB com o TM-align; (vi) fazer alinhamentos entre a estrutura primária de proteínas homólogas à proteína de interesse através do programa ClustalW 2.0 e incluir proteínas de outros organismos, evidenciando as similaridades e diferenças entre estes dois conjuntos de proteínas e buscando as correspondências no alinhamento de estrutura primária dos resíduos importantes, seguindo certos critérios como: presença exclusivamente nas seqüências de fungos fítopatogênicos; (vii) buscar estruturas de compostos no PubChem por similaridade maior que 90% com o ligante natural e proceder simulações de docking empregando o programa Molegro Virtual Docker (MVD); (viii) analisar detalhadamente o nanoambiente do sitio alvo usando-se o programa STING Java Protein Dossier e a ferramenta “select”; (ix) modificar computacionalmente através do programa ChemBioDraw as estruturas selecionadas na etapa vii de acordo com as características físico-químicas e estruturais encontradas na etapa viii a fim de aumentar os valores de afinidade de ligação e buscar por ligantes baseados na forma da cavidade criada pelo MVD na região dos resíduos de interesse; e (x) realizar predição de parâmetros moleculares que interferem na Absorção, Distribuição, Metabolismo, Excreção e Toxicidade utilizando a ferrametna online Osiris Property Explorer.

2.Método de inibição ou inativação das enzimas poligalacturonases por meio de ligação parcial ou total de inibidor desenvolvido de acordo com a reivindicação 1.

3.Método de prevenção ou tratamento contra microrganismos que utilizam as enzimas poligalacturonases para invadir os tecidos do hospedeiro utilizando-se compostos de acordo com a reivindicação 2.