BRPI1104177B1

BRPI1104177B1 - use of physaline and ethnolic and aqueous extracts in the proliferation of neuronal stem cells of the dentate gyrus

Info

Publication number: BRPI1104177B1
Application number: BRPI1104177-3A
Authority: BR
Inventors: Milton Nascimento da Silva; Ricardo Augusto De Melo Reis; Mara Sílvia Pinheiro Arruda; Danila Teresa Valeriano Alves; Gilmara Nazereth Tavares Bastos; José Luiz Martins Do Nascimento; Edilene Oliveira Da Silva
Original assignee: Universidade Federal Do Pará
Priority date: 2011-07-18
Filing date: 2011-07-18
Publication date: 2020-12-01
Also published as: BRPI1104177A2

Abstract

Uso da Fisalina D e dos extratos etanólico e aquoso na proliferação de células tronco neuronais giro denteado. A presente patente refere-se à utilização de extrato aquoso,etanólico e substância purificada da espécie Physalis angulata, como agente neurogênico. A atividade exercida é sobre o aumento da proleferação de células-tronco hipocampais e a diferenciação destas em células-progenitoras no nicho neurogênio hipocampal na dose de 5mg/Kg in vivo e na concentração de 10uM in vitro. Neste sentido, a busca de moléculas de fácil obtenção que apresentem atividade eficácia na proleferação de células-tronco, na diferenciação células progenitoras neuronais e que não cause reações adversas é apresentada aqui através do EE, EA e FD. Essa molécula e os extratos podem vir a seu usada no tratamento de doenças neurodegenerativas e déficit de memór.Use of Fisalin D and the ethanolic and aqueous extracts in the proliferation of gyrous dentate neuronal stem cells. The present patent refers to the use of aqueous, ethanolic extract and purified substance of the species Physalis angulata, as a neurogenic agent. The activity exercised is on the increase in the proliferation of hippocampal stem cells and their differentiation into progenitor cells in the hippocampal neurogen niche at a dose of 5mg / kg in vivo and a concentration of 10uM in vitro. In this sense, the search for easily obtainable molecules that have effective activity in stem cell proliferation, in differentiating neuronal progenitor cells and that do not cause adverse reactions is presented here through EE, EA and FD. This molecule and extracts can be used to treat neurodegenerative diseases and memory deficits.

Description

A presente patente refere-se ao uso dos extratos aquoso (EA), etanólico (EE) e da substância pura Fisalina D oriunda da planta Physalis angulata como agentes promotores de neurogênese. Essa planta é conhecida popularmente como camapú, é encontrada em áreas tropicais da Ásia, África e Américas incluindo a floresta Amazônica.The present patent refers to the use of aqueous (EA), ethanolic (EE) extracts and the pure substance Fisalina D from the Physalis angulata plant as neurogenesis promoting agents. This plant is popularly known as camapú, it is found in tropical areas of Asia, Africa and the Americas including the Amazon rainforest.

Physalis angulata já vem sendo usada na medicina tradicional sob a forma de extratos ou infusos em vários países para fins de tratamento de diversas doenças, tais como malária, asma, hepatite, dermatite, reumatismo e gonorréia (Lin et al., 1992; Cáceres et al., 1995). Bastos e colaboradores (2006) mostraram o efeito analgésico do extrato aquoso obtido da raiz da Physalis angulata, aplicada em diferentes doses (10, 20, 30, 60 mg/Kg) por via intraperitonial ou oral. Já efeitos antiinflamatórios foram demonstrados inicialmente por Choi e Hwang (2003) no modelo de inflamação de edema de pata induzido por carragenina. Esses mesmos autores usaram modelo de artrite induzida por formaldeído e modelo de alergia, com atividade antialérgica contra reação de hipersensibilidade tipo IV induzida por contato com 2,4 dinitrofluorobenzeno (DNFB). Os extratos foram testados por via oral sob a forma metanólica a partir das flores da Physalis angulata, em uma única dose de 200 mg/Kg. Bastos e colaboladores (2008) ao usarem o modelo experimental da bolsa de ar também mostraram o efeito antiinflamatório do extrato aquoso da raiz dessa mesma planta em diferentes doses (0,5, 1 e 5 mg/Kg) em ratos adultos através de administração intraperitoneal. Os efeitos observados foram diminuição do volume do exsudato, do número total de células, dos níveis de óxido nítrico e da inibição de PGE2 (Bastos et al. 2008). É interessante ressaltar que as doses usadas por Bastos e colaboladores estavam bem abaixo daquela usada por Choi e Hwang (2003) e foi também possível descrever os mecanismos da ação antiinflamatória da planta.Physalis angulata has already been used in traditional medicine in the form of extracts or infusions in several countries for the treatment of various diseases, such as malaria, asthma, hepatitis, dermatitis, rheumatism and gonorrhea (Lin et al., 1992; Cáceres et al., 1995). Bastos et al. (2006) showed the analgesic effect of the aqueous extract obtained from the Physalis angulata root, applied in different doses (10, 20, 30, 60 mg / Kg) intraperitoneally or orally. Anti-inflammatory effects were first demonstrated by Choi and Hwang (2003) in the model of inflammation of paw edema induced by carrageenan. These same authors used a formaldehyde-induced arthritis model and an allergy model, with antiallergic activity against type IV hypersensitivity reaction induced by contact with 2.4 dinitrofluorobenzene (DNFB). The extracts were tested orally in methanolic form from the flowers of Physalis angulata, in a single dose of 200 mg / Kg. Bastos and colaboladores (2008) when using the experimental model of the air bag also showed the anti-inflammatory effect of the aqueous extract of the root of the same plant in different doses (0.5, 1 and 5 mg / Kg) in adult rats through intraperitoneal administration . The observed effects were a decrease in the volume of exudate, in the total number of cells, in the levels of nitric oxide and in the inhibition of PGE2 (Bastos et al. 2008). It is interesting to note that the doses used by Bastos and collaborators were well below that used by Choi and Hwang (2003) and it was also possible to describe the mechanisms of the plant's anti-inflammatory action.

Outra ação biológica da planta foi atividade imunoduladora (Soares, et al., 2003). Nesse trabalho, os autores usaram pela primeira vez, fisalinas purificadas (B, F e G) isoladas do extrato etanólico de Physalis angulata em modelo de cultura de macrófagos ativados por lipopolissacarídeo e interferon-y. Os achados foram umaAnother biological action of the plant was immunodulatory activity (Soares, et al., 2003). In this work, the authors used purified physalins (B, F and G) isolated from the ethanolic extract of Physalis angulata for the first time in a culture model of macrophages activated by lipopolysaccharide and interferon-y. The findings were a

k redução substancial na produção de óxido nítrico. A fisalina B teve um efeito adicional ao reduzir significativamente os níveis de TNF-a, interleucina-6 e interleucina-12.k substantial reduction in the production of nitric oxide. Physalin B had an additional effect by significantly reducing levels of TNF-a, interleukin-6 and interleukin-12.

Além disso, já está descrito na literatura a propriedade antileishmanicida da fisalina B e F, inibindo o crescimento de Leishmania amazonensis em macrófagos infectados com este parasita. Devido a esta atividade foi realizado em Abril de 2003, junto ao Instituto Americano de propriedade intelectual (United States Patents), depósito de patente com número de processo 09417779, intitulada “Process for isolating physalins from plants and pharmaceutical compositions containing physalins” que reivindica o uso antileshimanicida. Este mesmo grupo realizou o depósito de patente no Instituto Brasileiro de Propriedade Intelectual, com número PI0404635-8, intitulada “Processo para a obtenção de esteróides seco derivados de ergostano” que reivindica o processo de obtenção de fisalinas.In addition, the antileishmanicidal property of physalin B and F is already described in the literature, inhibiting the growth of Leishmania amazonensis in macrophages infected with this parasite. Due to this activity, it was carried out in April 2003, with the American Institute of Intellectual Property (United States Patents), patent deposit with case number 09417779, entitled “Process for isolating physalins from plants and pharmaceutical compositions containing physalins” which claims antileshimanicida use. This same group filed the patent at the Brazilian Institute of Intellectual Property, under number PI0404635-8, entitled “Process for obtaining dry steroids derived from ergostane” that claims the process of obtaining physalins.

Entretanto, até o momento o potencial farmacológico dessa planta sobre o sistema nervoso não foi estudado. A busca por novas classes de moléculas que tenham impacto funcional direto em processos cognitivos estão entre as prioridades da neurofarmacologia. Nosso grupo, ao realizar investigações sistemáticas in vivo, observou pela primeira vez um efeito neurogênico dessa planta em células-tronco hipocampais de camundongos adultos. Usamos para isso, extrato aquoso (EA), extrato etanólico (EE) e a fisalina D, que foi isolada pela primeira vez por Mulchandani em 1975. Portanto, descrevemos aqui, os métodos experimentais desenvolvidos para obtenção do efeito neurogênico do EA, EE e da fisalina D, não havendo na literatura qualquer relato desses procedimentos. O efeito observado está relacionado com a produção de células progenitoras no nicho neurogênico hipocampal de camundongos adultos.However, until now the pharmacological potential of this plant on the nervous system has not been studied. The search for new classes of molecules that have a direct functional impact on cognitive processes are among the priorities of neuropharmacology. Our group, when carrying out systematic investigations in vivo, observed for the first time a neurogenic effect of this plant in hippocampal stem cells of adult mice. For this, we use aqueous extract (EA), ethanolic extract (EE) and physalin D, which was first isolated by Mulchandani in 1975. Therefore, we describe here, the experimental methods developed to obtain the neurogenic effect of EA, EE and of physalin D, with no reports of these procedures in the literature. The observed effect is related to the production of progenitor cells in the hippocampal neurogenic niche of adult mice.

Neurogênese é o processo pelo qual as células-tronco neuronais (CTNs), multipotentes apresentam capacidade de auto-renovação e diferenciação nos principais fenótipos celulares do SNC, como neurônios, oligodendrócitos e astrócitos (Gage, 2000). As CTNs podem ser isoladas de muitas áreas do sistema nervoso de adultos, mas em condições fisiológicas se localizam exclusivamente na zona subventricular do bulbo olfatório (Lois & Alvarez-Buylla; 1993) e na zona subgranular do giro denteado hipocampal (Zhao, 2008). É suposto que o microambiente da ZSG e ZSV apresenta diversos fatores que permitem a diferenciação e a integração destes novos neurônios k (Zhao, 2008). Relatos na literatura têm demonstrado a presença de células-tronco neurais no cérebro de mamíferos adultos na zona subventricular e no giro denteado hipocampal (Gage et al, 2002). Estas células apresentam a habilidade de proliferar e diferenciar em neurônios e glias (Ono et al., 2001). Após amadurecimento, estas células ■ 5 integram e formam conexões neurais. A neurogênese no hipocampo envolve um processo complexo, que ocorre no giro denteado, que se inicia com a proliferação de CTNs na ZSG, seguido da diferenciação e espontânea migração das células para a camada granular e por último a maturação com possível sobrevivência ou morte das células neurais (Eriksson et. al., 1998). No giro dentado de roedores, as células 10 neuronais recém-formadas na ZSG migram para a camada granular, onde se diferenciam em células neuronais e aumentam suas projeções axonais para a área de CA3 hipocampal (Altman et al, 1965). Em ratos, células granulares imaturas estendem os axônios para CA3 entre 4-10 dias após o início da mitose, enquanto que o processo de maturação dessas células formadas, da proliferação na ZSG, migração para a camada 15 granular e diferenciação em célula neuronal, leva aproximadamente 4 semanas (Cameron et al., 1993; Hastings e Gould, 1999).Neurogenesis is the process by which multipotent neuronal stem cells (CTNs) are capable of self-renewal and differentiation in the main CNS cellular phenotypes, such as neurons, oligodendrocytes and astrocytes (Gage, 2000). CTNs can be isolated from many areas of the adult nervous system, but under physiological conditions they are located exclusively in the subventricular zone of the olfactory bulb (Lois &Alvarez-Buylla; 1993) and in the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (Zhao, 2008). It is assumed that the microenvironment of ZSG and ZSV has several factors that allow the differentiation and integration of these new k neurons (Zhao, 2008). Literature reports have demonstrated the presence of neural stem cells in the brain of adult mammals in the subventricular zone and in the hippocampal dentate gyrus (Gage et al, 2002). These cells have the ability to proliferate and differentiate into neurons and glia (Ono et al., 2001). After maturing, these ■ 5 cells integrate and form neural connections. Neurogenesis in the hippocampus involves a complex process, which occurs in the dentate gyrus, which begins with the proliferation of CTNs in the ZSG, followed by the differentiation and spontaneous migration of cells to the granular layer and finally maturation with possible survival or death of cells neural disorders (Eriksson et. al., 1998). In the rodent dentate gyrus, the newly formed neuronal cells 10 in the ZSG migrate to the granular layer, where they differentiate into neuronal cells and increase their axonal projections to the hippocampal CA3 area (Altman et al, 1965). In rats, immature granular cells extend the axons to CA3 between 4-10 days after the onset of mitosis, while the maturation process of these formed cells, from proliferation in the ZSG, migration to the granular layer 15 and differentiation into neuronal cells, takes approximately 4 weeks (Cameron et al., 1993; Hastings and Gould, 1999).

No cérebro de roedores, foi feita uma abordagem quantitativa desses novos neurônios gerados e observou-se que aproximadamente nove mil novos neurônios foram gerados, o que significa dizer que ocorre um aumento de 3,3% ao mês na população de células 20 sub-granulares no GD (Kerpermann et al., 1997), enquanto que, em cérebros de primatas adultos, estima-se que pelo menos 0,004% da população neuronal na camada de célula sub-granular são gerados por dia (Komack & Rakic, 1999). Portanto, a taxa relativa de neurogênese em macacos adultos é 10 vezes menor do que no GD de roedores adultos (Komack & Rakic, 1999). Em humanos adultos, a neurogênese no GD 25 foi comprovada através da técnica de imunofluorescência para BrdU em amostras de tecido cerebral obtidas de pacientes que morreram de câncer. Eles usaram a técnica de BrdU para avaliar a atividade proliferativa das células hipocampais e encontraram uma forte marcação em fatias de GD. Entretanto, nesse estudo, não foi feito um estudo quantitativo que pudesse estimar a percentagem de neurônios gerados (Eriksson et al. 30 (1998).In the brain of rodents, a quantitative approach was made to these new neurons generated and it was observed that approximately nine thousand new neurons were generated, which means that there is an increase of 3.3% per month in the population of 20 sub-granular cells in the GD (Kerpermann et al., 1997), while in adult primate brains, it is estimated that at least 0.004% of the neuronal population in the sub-granular cell layer is generated per day (Komack & Rakic, 1999). Therefore, the relative rate of neurogenesis in adult monkeys is 10 times lower than in the adult rodent GD (Komack & Rakic, 1999). In adult humans, neurogenesis in GD 25 has been proven using the BrdU immunofluorescence technique in brain tissue samples obtained from patients who died of cancer. They used the BrdU technique to assess the proliferative activity of the hippocampal cells and found a strong marking on GD slices. However, in this study, a quantitative study was not carried out that could estimate the percentage of neurons generated (Eriksson et al. 30 (1998).

Na ZSG, os progenitores hipocampais encontram-se opostos a camada de células granulares que inclui neurônios maduros e imaturos, dentro deste mesmo microambiente há também astrócitos, oligodendrócitos e outros tipos de neurônios „ (Zhao et al., 2008). Os astrócitos do hipocampo desempenham um papel fundamental na neurogênese da ZSG, promovendo a diferenciação dos progenitores neurais e a integração in vitro desses novos neurônios do hipocampo de ratos adultos (Song et al.,2002). Além disso, neurogênese em adultos pode ser regulada por diversos fatores • 5 fisiológicos e patológicos, tais como estado emocional, alterações patológicas e psicológicas (Christie & Cameron, 2006; Elder et. al., 2006). Em modelos de neuroinflamação induzida pela administração periférica da endotoxina bacteriana lipopolissacarídeo (LPS) em camundongos adultos, observa-se uma intensa ativação de células microgliais, que liberam citocinas proinflamatórias e promovem uma redução 10 da neurogênese no giro denteado hipocampal, além de inibir a sobrevivência de células- tronco (Monje et al., 2003; Bastos et al., 2008). A neurogênese também pode ser influenciada pelo estado de humor do indivíduo, em situações como a depressão, existe uma redução no número de células em proliferação na zona subgranular do giro denteado. Em 1992, Gould e colaboradores, mostraram pela primeira vez que a divisão 15 celular no giro denteado de ratos adultos é suprimida devido ao aumento no nível de corticosteróides, sendo freqüentemente elevado em animais que sofreram estresse e em pacientes com depressão. Mudanças morfológicas no hipocampo também têm sido demonstradas em resposta ao estresse, incluindo a atrofia e perda de neurônios piramidais de CA3 após a exposição ao estresse físico ou psicológico (McEwen, 1999).In ZSG, hippocampal parents are opposite the layer of granular cells that includes mature and immature neurons, within this same microenvironment there are also astrocytes, oligodendrocytes and other types of neurons „(Zhao et al., 2008). Hippocampal astrocytes play a key role in the neurogenesis of ZSG, promoting the differentiation of neural progenitors and the in vitro integration of these new hippocampal neurons from adult rats (Song et al., 2002). In addition, neurogenesis in adults can be regulated by several physiological and pathological factors, such as emotional state, pathological and psychological changes (Christie & Cameron, 2006; Elder et. Al., 2006). In neuroinflammation models induced by peripheral administration of bacterial lipopolysaccharide (LPS) endotoxin in adult mice, intense activation of microglial cells is observed, which release proinflammatory cytokines and promote a reduction 10 of neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus, in addition to inhibiting survival stem cells (Monje et al., 2003; Bastos et al., 2008). Neurogenesis can also be influenced by the individual's mood, in situations such as depression, there is a reduction in the number of proliferating cells in the subgranular zone of the dentate gyrus. In 1992, Gould and colleagues showed for the first time that cell division in the dentate gyrus of adult rats is suppressed due to an increase in the level of corticosteroids, and is often elevated in stressed animals and in patients with depression. Morphological changes in the hippocampus have also been demonstrated in response to stress, including atrophy and loss of CA3 pyramidal neurons after exposure to physical or psychological stress (McEwen, 1999).

O uso de medicamentos antidepressivos, entre eles a fluoxetina, revertem ou previnem a redução da neurogênese induzida por estresse (Hen et al., 2006; Encinas et al., 2006; Malberg et al., 2000). Desta forma, é possível que a modulação da proliferação, migração e diferenciação de células-tronco neuronais seja uma estratégia muito promissora em manter a plasticidade cerebral e a preservação da capacidade de memória 25 em pacientes com déficit de memória senil. Adicionalmente, existe uma progressiva morte neuronal e uma redução na capacidade regenerativa do cérebro em doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson. Isso parece ocorrer devido a redução na proliferação celular e formação de novos neurônios no giro denteado (Lindvall & Kokaia, 2006).The use of antidepressant medications, including fluoxetine, reverses or prevents the reduction of stress-induced neurogenesis (Hen et al., 2006; Encinas et al., 2006; Malberg et al., 2000). Thus, it is possible that the modulation of proliferation, migration and differentiation of neuronal stem cells is a very promising strategy for maintaining brain plasticity and preserving memory capacity 25 in patients with senile memory deficit. In addition, there is a progressive neuronal death and a reduction in the regenerative capacity of the brain in neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's and Parkinson's. This appears to be due to reduced cell proliferation and the formation of new neurons in the dentate gyrus (Lindvall & Kokaia, 2006).

Hoje, existe uma busca incessante por novos fármacos que aumentem a cognição, ou seja, substancias que influenciam e expandam a atividade cerebral, tais como aprendizagem e memória. Essas substâncias devem ser de origem natural ou pelo menos similares as substancias naturais encontradas endogenamente. Outro aspecto „ importante é que essas drogas não sejam ilícitas e nem provoquem dependência química. Essa patente descreve os procedimentos experimentais da physalina D e seus extratos aquosos e etanólicos na promoção e restauração da neurogênese no nicho neurogênico hipocampal e sua interferência positiva em áreas relacionadas com a ■ 5 aprendizagem e memória.Today, there is an incessant search for new drugs that increase cognition, that is, substances that influence and expand brain activity, such as learning and memory. These substances must be of natural origin or at least similar to the natural substances found endogenously. Another „important aspect is that these drugs are not illegal and do not cause chemical dependency. This patent describes the experimental procedures of physalina D and its aqueous and ethanolic extracts in promoting and restoring neurogenesis in the hippocampal neurogenic niche and its positive interference in areas related to ■ 5 learning and memory.

Camundongos machos adultos, BALBc, com 6 a 8 semanas que foram mantidos em caixas à temperatura ambiente; água e comida ad libidum e ciclo de claro/escuro de 12 horas. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com o guia de cuidados animais para laboratório do comitê de ética do ICB/UFPA.Adult male BALBc mice aged 6 to 8 weeks that were kept in boxes at room temperature; water and food ad libidum and 12 hour light / dark cycle. All procedures were conducted according to the ICB / UFPA ethics committee's laboratory animal care guide.

A extração da FD se deu a partir das partes aéreas da Physalis angulata secas em estufa com temperatura de 100°C, por dois dias, sendo posteriormente trituradas em moinho, obtendo-se cinco quilogramas de material seco e moído. Quatro quilogramas deste material foram submetidos a três extrações por maceração com hexano por 24 horas, seguido de filtração e evaporação do solvente em evaporador rotativo. Em 15 seguida, a partir do resíduo, foi realizada uma extração por Sohxlet com álcool etílico em sete ciclos de 8 horas. O solvente foi eliminado em evaporador rotativo obtendo 70 gramas do extrato etanólico (EE). Cento e cinqüenta gramas de material seco e triturado foram colocados em 700 mililitros de água e aquecidos até 100°C por 10 minutos. A solução resultante foi liofilizada rendendo 2,7 gramas do material liofilizado (EA). Os 20 extratos EA e EE foram estocados ao abrigo da luz e da umidade.The extraction of FD took place from the aerial parts of Physalis angulata dried in an oven at a temperature of 100 ° C, for two days, after which they were crushed in a mill, obtaining five kilograms of dry and ground material. Four kilograms of this material were subjected to three extractions by maceration with hexane for 24 hours, followed by filtration and evaporation of the solvent in a rotary evaporator. Then, from the residue, an extraction by Sohxlet with ethyl alcohol was carried out in seven cycles of 8 hours. The solvent was eliminated in a rotary evaporator obtaining 70 grams of the ethanolic extract (EE). One hundred and fifty grams of dry and crushed material were placed in 700 milliliters of water and heated to 100 ° C for 10 minutes. The resulting solution was lyophilized yielding 2.7 grams of the lyophilized material (EA). The 20 extracts EA and EE were stored away from light and moisture.

Para a obtenção de FD purificada, 50 gramas do EE foram fracionadas em Coluna Cromatográfica de sílica gel, utilizando-se um litro das seguintes misturas de solventes: Hexano/Acetato de etila 90:10 (Fl); Hexano/Acetato de etila 70:30 (F2); Hexano/Acetato de etila 50:50 (F3); Acetato de etila 100% (F4); Acetato de 25 etila/Metanol 80:20 (F5) e Metanol 100% (F6), obtendo-se, após evaporação dos solventes 71 mg de Fl; 237 mg de F2; 950 mg de F3; 6,0 g de F4; 278 mg de F5 e 30 g de F6. A FD foi obtida a partir de F5 através de fracionamento por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, usando uma coluna de fase reversa Cl8 e fase móvel composta por uma mistura de água e acetonitrila (75:25) com vazão de 4,7 ml/minuto.To obtain purified FD, 50 grams of EE were fractionated on a silica gel chromatographic column, using one liter of the following solvent mixtures: Hexane / ethyl acetate 90:10 (Fl); 70:30 Hexane / ethyl acetate (F2); 50:50 Hexane / ethyl acetate (F3); 100% ethyl acetate (F4); 25 ethyl acetate / 80:20 Methanol (F5) and 100% Methanol (F6), obtaining, after evaporation of solvents 71 mg of Fl; 237 mg of F2; 950 mg of F3; 6.0 g of F4; 278 mg of F5 and 30 g of F6. The FD was obtained from F5 by fractionation by High Performance Liquid Chromatography, using a column of reverse phase Cl8 and mobile phase composed of a mixture of water and acetonitrile (75:25) with flow rate of 4.7 ml / minute .

Para análise proliferativa de células-tronco hipocampais os animais receberam uma dose de 50mg/kg de BrdU por via intraperitoneal e diferentes doses do extrato de P. angulata. Estes animais foram sacrificados com 24 horas e 7 dias após a sua ¥ administração. Este tempo é equivalente ao período de proliferação e diferenciação das células-tronco hipocampais, respectivamente. Bromodeoxiuridina (BrdU) é um análogo sintético da timidina que durante a fase-S do ciclo celular incorpora-se ao DNA da célula. O número total de células BrdU-positivas foram quantificadas na camada sub- • 5 granular do hipocampo que é definida pela área (10pm-dois corpos celulares) entre o hilo e a camada granular hipocampal em cada corte (Bastos et al, 2008).For proliferative analysis of hippocampal stem cells, the animals received a dose of 50mg / kg of BrdU intraperitoneally and different doses of P. angulata extract. These animals were sacrificed 24 hours and 7 days after their ¥ administration. This time is equivalent to the period of proliferation and differentiation of the hippocampal stem cells, respectively. Bromodeoxyuridine (BrdU) is a synthetic analogue of thymidine that during the S-phase of the cell cycle is incorporated into the cell's DNA. The total number of BrdU-positive cells were quantified in the sub- • granular layer of the hippocampus, which is defined by the area (10 pm- two cell bodies) between the hilum and the hippocampal granular layer in each cut (Bastos et al, 2008).

Após os animais serem eutanizados, estes foram perfundidos com solução salina seguido de paraformoldeído (PFA) a 4%. Os cérebros foram dissecados e pós-fixados a 4°C em PFA a 4% por 12 horas e depois crioprotegidos em sacarose a 20%. Os cérebros 10 foram fatiados a 40pm em criostato. Para a imunohistoquímica de BrdU, as fatias foram tratadas com HC1 (2N) a 37°C por 20 min, seguido da neutralização com Tampão de Borato de Sódio (0.15 M, pH 8.5) por 10 min. Após serem lavados com Tampão fosfato salina (PBS), bloqueadas com solução de BSA 2,5% por 2 horas em seguida as fatias foram incubadas com anticorpo primário anti-BrdU por 12 horas em temperatura 15 ambiente. Em seguida as amostras foram incubadas com anticorpo secundário conforme a especificidade do anticorpo primário utilizado.After the animals were euthanized, they were perfused with saline followed by 4% paraformoldehyde (PFA). The brains were dissected and post-fixed at 4 ° C in 4% PFA for 12 hours and then cryoprotected in 20% sucrose. Brains 10 were sliced at 40pm in cryostat. For BrdU immunohistochemistry, the slices were treated with HCl (2N) at 37 ° C for 20 min, followed by neutralization with Sodium Borate Buffer (0.15 M, pH 8.5) for 10 min. After being washed with phosphate buffered saline (PBS), blocked with 2.5% BSA solution for 2 hours then the slices were incubated with primary anti-BrdU antibody for 12 hours at room temperature. Then the samples were incubated with secondary antibody according to the specificity of the primary antibody used.

Os hipocampos de ratos wistar (P1-P5) foram dissecados e dissociados mecanicamente. As células viáveis foram semeadas em placas de 4 poços (NUNC) na densidade de 106 células/poço contendo meio de cultura Neurobasal sem soro ou fator 20 de crescimento. Após 24 horas as células foram lavadas e no grupo tratado foi adicionado FD, enquanto que no grupo controle foi adicionado 10ng/ml de EGF e FGF- 2. As culturas foram mantidas em estufa a 37°C com 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico.The hippocampus of wistar rats (P1-P5) were dissected and dissociated mechanically. Viable cells were seeded in 4-well plates (NUNC) at a density of 106 cells / well containing Neurobasal culture medium without serum or growth factor 20. After 24 hours the cells were washed and FD was added to the treated group, while 10ng / ml EGF and FGF-2 were added to the control group. Cultures were kept in an oven at 37 ° C with 5% CO2 and 95% of atmospheric air.

Com o intuito de determinar uma curva dose resposta dos extratos de Physalis 25 angulata e da FD na área neurogênica do Hipocampo, os animais receberam uma única dose de 50mg/kg de BrdU por via intraperitoneal e foram sacrificados com 24 horas após a administração de EA. As doses usadas foram 0,1; 1 e 5 mg/Kg. Houve um aumento significativo do número de células BrdU-positivas no giro denteado nos grupos tratados em relação ao grupo controle [Controle, 92.3 ± 24.2 (n=9); EA 0,1 mg/Kg, 30 160.7± 21.4 (n=4); EA lmg/Kg, 310.5 ± 4.6 (n=4); e 5mg/Kg 519±27.7 (n=4),p<0,05].In order to determine a dose-response curve of the extracts of Physalis 25 angulata and FD in the neurogenic area of the Hippocampus, the animals received a single dose of 50mg / kg of BrdU intraperitoneally and were sacrificed 24 hours after the administration of AS. . The doses used were 0.1; 1 and 5 mg / kg. There was a significant increase in the number of BrdU-positive cells in the dentate gyrus in the treated groups compared to the control group [Control, 92.3 ± 24.2 (n = 9); EA 0.1 mg / Kg, 30 160.7 ± 21.4 (n = 4); EA lmg / Kg, 310.5 ± 4.6 (n = 4); and 5mg / Kg 519 ± 27.7 (n = 4), p <0.05].

Os resultados indicam que o extrato apresenta efeito proliferativo sobre as CTNs no giro „ denteado do hipocampo de camundongos adultos, sendo a dose que apresentou maior eficácia foi de 5 mg/Kg.The results indicate that the extract has a proliferative effect on CTNs in the dentate gyrus of the hippocampus of adult mice, and the dose that showed the greatest efficacy was 5 mg / kg.

Foi realizada também uma análise qualitativa das células marcadas para BrdU no giro denteado de camundongos adultos por microscopia de fluorescência. Nos animais que receberam a dose de 0,1 mg/Kg foi possível observar a formação de aglomerado de células localizados apenas no giro denteado. Este aglomerado é uma das principais características do processo de neurogênese que se chama neurosfera. No grupo que recebeu a dose de 5 mg/Kg, as células BrdU-positivas aparecem distribuídas ao longo de todo o giro denteado hipocampal e também foi observado a formação de aglomerados de células. No grupo controle, foi observado imunomarcação, mas em um número reduzido de células BrdU-positivas.A qualitative analysis of cells marked for BrdU in the dentate gyrus of adult mice was also performed by fluorescence microscopy. In the animals that received the dose of 0.1 mg / kg, it was possible to observe the formation of a cell cluster located only in the dentate gyrus. This cluster is one of the main characteristics of the neurogenesis process that is called neurosphere. In the group that received the 5 mg / kg dose, BrdU-positive cells appear distributed throughout the hippocampal dentate gyrus and the formation of cell clusters was also observed. In the control group, immunostaining was observed, but in a reduced number of BrdU-positive cells.

Para ratificar os resultados qualitativos obtidos anteriormente, usamos Hoescht, um marcador fluorescente de núcleo celular, para ver se houve ou não uma sobreposição das imagens de células marcadas e formadas no giro denteado nos diferentes grupos controle e experimental. A dupla marcação (BrdU e Hoescht) confirma a presença de novas células no Hipocampo.To confirm the qualitative results obtained previously, we used Hoescht, a fluorescent cell nucleus marker, to see whether or not there was an overlap of the images of cells marked and formed in the dentate gyrus in the different control and experimental groups. The double labeling (BrdU and Hoescht) confirms the presence of new cells in the Hippocampus.

E interessante ressaltar que os extratos utilizados aumentaram o número de células BrdU positivas no giro denteado hipocampal atuando única e exclusivamente na ZSG, região do giro denteado localizada entre o hilo e a camada de células granulares que corresponde ao local de proliferação de CTNs que se dividem e migram para a camada de células granulares. No mesmo experimento, quantificamos o número de células BrdU positivas em todas as sub-regiões do giro denteado hipocampal (zona sub-granular, camada de células granulares, molecular e hilo) e comparamos a capacidade proliferativa dos extratos sobre as outras regiões do hipocampo. Os resultados mostraram que os extratos ou a substância purificada atuam somente no nicho neurogênico e não produzem proliferação ectópica, ou seja, a presença de células fora da camada sub-granular. A proliferação ectópica é considerada uma característica patológica, que não foi o caso desse trabalho.It is interesting to note that the extracts used increased the number of positive BrdU cells in the hippocampal dentate gyrus acting solely and exclusively in the ZSG, the region of the dentate gyrus located between the hilum and the granular cell layer that corresponds to the proliferation site of dividing CTNs and migrate to the granular cell layer. In the same experiment, we quantified the number of positive BrdU cells in all sub-regions of the hippocampal dentate gyrus (sub-granular zone, granular cell layer, molecular and hilum) and compared the proliferative capacity of the extracts over the other regions of the hippocampus. The results showed that the extracts or the purified substance act only in the neurogenic niche and do not produce ectopic proliferation, that is, the presence of cells outside the sub-granular layer. Ectopic proliferation is considered a pathological feature, which was not the case in this study.

Para determinar se o EA na dose de 5mg/Kg aumenta o número de células BrdU positivas no giro denteado durante o período de diferenciação das CTNs, camundongos adultos foram sacrificados 7 dias após a administração de BrdU. Observamos que o extrato promoveu um aumento significativo no número de células BrdU-positivas , quando comparado com o grupo controle [controle 98,75±7,2 (n=4) e 5 mg/Kg; 130,66±16,8 (n=4)].To determine whether EA at a dose of 5mg / kg increases the number of positive BrdU cells in the dentate gyrus during the CTN differentiation period, adult mice were sacrificed 7 days after BrdU administration. We observed that the extract promoted a significant increase in the number of BrdU-positive cells, when compared to the control group [control 98.75 ± 7.2 (n = 4) and 5 mg / Kg; 130.66 ± 16.8 (n = 4)].

Novamente foi realizada uma análise qualitativa das células marcadas para BrdU nesse grupo de animais. Nos animais que foram tratados com 5mg/Kg constatamos a 5 formação de um aglomerado de células BrdU-positivas e a presença destas exclusivamente na ZSG do giro denteado do hipocampo, enquanto que no grupo controle o numero de células marcadas estava reduzido.Again, a qualitative analysis of cells marked for BrdU was performed in this group of animals. In animals that were treated with 5mg / Kg, we noticed the formation of a cluster of BrdU-positive cells and their presence exclusively in the ZSG of the hippocampal dentate gyrus, whereas in the control group the number of marked cells was reduced.

Em seguida, foram realizados experimentos in vitro, com a substância purificada FD. Para este experimento, células hipocampais foram expostas à 10pM de FD por 24 10 horas e em seguida as células foram imunomarcadas com anticorpo que evidencia a presença de células-tronco progenitoras, nestina. FD aumentou o número de células nestina-positivas presentes na cultura. Esses resultados mostram que células tronco hipocampais estão se diferenciando em células progenitoras. Desta forma nossos resultados demonstram que EE, EA e FD apresentam atividade neurogênica em modelo 15 in vivo e in vitro e, portanto, apresentam moléculas bioativas que são candidatos a promoverem a restauração da neurogênese no nicho neurogênico hipocampal.Then, in vitro experiments were carried out with the purified substance FD. For this experiment, hippocampal cells were exposed to 10pM of FD for 24 10 hours and then the cells were immunostained with antibody that shows the presence of progenitor stem cells, nestin. FD increased the number of nestin-positive cells present in the culture. These results show that hippocampal stem cells are differentiating into progenitor cells. Thus, our results demonstrate that EE, EA and FD present neurogenic activity in model 15 in vivo and in vitro and, therefore, present bioactive molecules that are candidates to promote the restoration of neurogenesis in the hippocampal neurogenic niche.

Claims

1.Use of Fisalin D and ethanolic and aqueous extracts, characterized for being for the preparation of a medication to treat neurodegenerative disease and / or Alzheimer's and / or senile dementias that promote memory deficit and / or death of hippocampal neurons.

2. Use of Fisalin D and ethanolic and aqueous extracts in the proliferation of neural stem cells of the dentate gyrus according to claim 1, characterized by being the starting nucleus for the transformation of new molecules with neurogenic activity to treat neurodegenerative disease and / or Alzheimer's and / or senile dementias that promote memory deficit and / or death of hippocampal neurons.

3. Use of Fisalin D and ethanolic and aqueous extracts in the proliferation of neural stem cells in the dentate gyrus, according to claim 1 and 2, characterized by incorporating in full pharmaceutical forms relative to the use as pharmaceutical forms with neurogenic effect to treat any disease neurodegenerative and / or Alzheimer's and / or senile dementias that promote memory deficit and / or death of hippocampal neurons.

4. Use of Fisalin D and ethanolic and aqueous extracts in the proliferation of neural stem cells in the dentate gyrus, according to claims 1, 2 and 3 characterized by having synergistic action with another active molecule in order to potentiate the neurogenic effect to treat any neurodegenerative disease and / or Alzheimer's and / or senile dementias that promote memory deficit and / or death of hippocampal neurons.

5. Use of Fisalin D and ethanolic and aqueous extracts in the proliferation of neural stem cells of the dentate gyrus according to claims 1, 2, 3 and 4, characterized by having effects and mechanisms acting on stem cells in general to treat neurodegenerative disease and / or Alzheimer's and / or senile dementias that promote memory deficit and / or death of hippocampal neurons.

6. Use of Fisalin D and ethanolic and aqueous extracts in the proliferation of neural stem cells in the dentate gyrus, according to claims 1, 2, 3, 4 and 5, characterized by being growth factors in neurogenic and non-neurogenic niches for treat any neurodegenerative disease and / or Alzheimer's and / or senile dementias that promote memory deficit and / or death of hippocampal neurons.