BRPI1103059A2 - PROCEDURE FOR OBTAINING A CROP SUBSTRATE FOR PLURIPOTENT STEM CELLS AND CROP SUBSTRATE PRODUCED BY THE SAME - Google Patents
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Abstract
PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UM SUBSTRATO DE CULTIVO PARA CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES E SUBSTRATO DE CULTIVO PRODUZIDO PELO MESMO. O presente pedido de patente de invenção compreende um substrato para o cultivo de células-tronco pluripotentes, o qual é gerado a partir da fixação por etanol de células de fibroblastos fetais de camundongo, e o processo de obtenção do mesmo. A invenção tem o objetivo de estabelecer um substrato com a complexidade necessária para garantir pelo menos 95% das células mantidas pluripotentes. Além disso, o uso de camadas de células alimentadoras é substituído, as condições de cultivo sào mantidas e a contaminação com moléculas animais pela matriz é eliminada, sendo um substrato de baixo custo e compatível com a demanda científica nacional.PROCEDURE FOR OBTAINING A CROP SUBSTRATE FOR PLURIPOTENT STEM CELLS AND CROP SUBSTRATE PRODUCED BY THE SAME. The present patent application comprises a substrate for culturing pluripotent stem cells which is generated from ethanol attachment of fetal mouse fibroblast cells, and the process for obtaining it. The invention aims to establish a substrate with the complexity necessary to ensure at least 95% of the cells maintained pluripotent. In addition, the use of feeder cell layers is replaced, cultivation conditions are maintained and contamination with animal molecules by the matrix is eliminated, being a low cost substrate and compatible with national scientific demand.
Description
PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UM SUBSTRATO DE CULTIVO PARA CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES E SUBSTRATO DE CULTIVOPROCESS FOR OBTAINING A CROP SUBSTRATE FOR PLURIPOTENT STEM CELLS AND CROP SUBSTRATE
PRODUZIDO PELO MESMOPRODUCED BY THE SAME
Campo da invenção: O presente pedido de patente descreve um substrato deField of the invention: The present patent application describes a substrate of
cultivo para células-tronco embrionárias humanas e seu processo de obtenção, o qual se destina ao campo de produtos para pesquisa científica na área biológica e possui potencial para futuro uso na clínica médica. A invenção pode ser utilizada para todos os tipos decultivation for human embryonic stem cells and their procurement process, which is intended for the field of products for scientific research in the biological field and has potential for future use in medical practice. The invention can be used for all types of
células pluripotentes (embrionárias e induzidas), tanto murinas quanto humanas. Também pode ser produzido em larga escala, gerando produtos de baixa perecibilidade.pluripotent cells (embryonic and induced), both murine and human. It can also be produced on a large scale, generating low perishable products.
Fundamentos da técnica: A manutenção das características das células-troncoFundamentals of the technique: Maintaining stem cell characteristics
pluripotentes demanda o uso de substratos complexos, tais como camadas de células alimentadoras de fontes animais ou extratos completos de matriz extracelular.Pluripotent applications require the use of complex substrates such as feeder cell layers from animal sources or complete extracellular matrix extracts.
Tais substratos permitem o crescimento celular e sua manutenção funcional, porém, ao mesmo tempo, contaminam as células-tronco com moléculas imunogênicas que podem causar problemas em casos de transplantes.Such substrates allow cell growth and functional maintenance, but at the same time contaminate stem cells with immunogenic molecules that can cause problems in transplant cases.
As principais formas de produzir substratos de cultivo para células-tronco embrionárias são a matriz produzida in loco, matrigel e proteínas purificadas. A matriz produzida in loco e o matrigel consistem em substratos completos de matriz extracelular, enquanto as proteínas purificadas representam um substrato específico, que contém apenas um ou dois tipos de moléculas presentes. 3 0 A matriz produzida in loco consiste no cultivo de células produtoras de matriz que, após produção da matriz, são lisadas e eliminadas, deixando o substrato livre de células vivas. Uma das maneiras mais comuns de realização deste procedimento é pelo tratamento químico com a amônia, cuja função é eliminar o corpo celular e deixar o substrato apenas com as moléculas da matriz. No entanto, as moléculas não são fixadas ao substrato e são perecíveis, apresentando um curto período de uso. Para o cultivo específico de células-tronco pluripotentes humanas, tal substrato só pode ser utilizado em combinação com outros fatores.The main ways to produce embryonic stem cell culture substrates are on-site matrix, matrigel and purified proteins. The in situ produced matrix and the matrigel consist of complete extracellular matrix substrates, while the purified proteins represent a specific substrate containing only one or two types of molecules present. 30 The matrix produced in loco consists in the cultivation of matrix producing cells which, after matrix production, are lysed and eliminated, leaving the substrate free of living cells. One of the most common ways of performing this procedure is by chemical treatment with ammonia, whose function is to eliminate the cell body and leave the substrate only with the matrix molecules. However, the molecules are not attached to the substrate and are perishable, with a short period of use. For the specific cultivation of human pluripotent stem cells, such substrate may only be used in combination with other factors.
0 extrato de matriz em forma de gel é comercializado sob o nome de matrigel e consiste em uma mistura gelatinosa de proteínas, lipídios e carboidratos, que são produzidos por células de camundongo. 0 matrigel tem sido utilizado no cultivo de células-tronco embrionárias humanas há cerca de uma década, porém também requer o uso combinado com outros fatores, o que o torna mais custoso.The gel matrix extract is marketed under the name of matrigel and consists of a gelatinous mixture of proteins, lipids and carbohydrates, which are produced by mouse cells. Matrigel has been used in the cultivation of human embryonic stem cells for about a decade, but it also requires combined use with other factors, which makes it more costly.
0 uso de proteínas purificadas de matriz extracelular, como a laminina e a fibronectina, também requer condições especiais de cultivo, uma vez que o substrato acelular produzido por proteínas purificadas não é tão rico quanto a matriz completa produzida pelo próprio fibroblasto.The use of purified extracellular matrix proteins, such as laminin and fibronectin, also requires special culture conditions, since the acellular substrate produced by purified proteins is not as rich as the complete matrix produced by fibroblast itself.
Células-tronco pluripotentes humanas são cultivadas em meio condicionado, os quais podem ser: - Substrato celular (MEF - fibroblastos embrionáriosHuman pluripotent stem cells are grown in conditioned medium, which may be: - Cellular substrate (FEM) - embryonic fibroblasts
murinos) + FGF-2 (4 a 8ng/mL)murine) + FGF-2 (4 to 8ng / mL)
- Substrato acelular + FGF-2 (40 a lOOng/mL)- Acellular substrate + FGF-2 (40 to 100ng / mL)
- Substrato acelular + FGF-2 (4 a 8ng/mL) + meio condicionado com MEF- Acellular substrate + FGF-2 (4 to 8ng / mL) + MEF conditioned medium
3 0 Assim, pode-se observar que, quando o substrato de cultivo é acelular, não há modelo de cultivo de células- tronco em baixa concentração de FGF-2 sem que haja o condicionamento do meio com MEF.Thus, it can be observed that when the cultivation substrate is acellular, there is no model of stem cell cultivation in low FGF-2 concentration without media conditioning with MEF.
A presente invenção descreve um substrato no qual as camadas de células alimentadoras são substituídas por células de fibroblastos fetais de camundongo. Assim, obtém- se um substrato altamente eficiente, que apresenta baixo teor de contaminação cruzada, armazenamento simples e por longo período de tempo sem alteração das características, além de baixo custo de produção.The present invention describes a substrate in which the feeder cell layers are replaced by mouse fetal fibroblast cells. Thus, a highly efficient substrate is obtained, which has low cross contamination content, simple and long-term storage without changing characteristics, and low production cost.
Estado da técnica:State of the art:
O documento de anterioridade US 2003175956 Al descreve um método que permite a proliferação indiferenciada de células-tronco em uma matriz extracelular fibroblástica com meio nutriente adicionado de FGF, no qual o ambiente de crescimento não apresenta células alimentadoras. A matriz descrita neste documento só é eficiente se for utilizado um meio condicionado na presença de FGF-2 (5 ng/mL), enquanto que, no presente pedido, a matriz pode ser utilizada com qualquer meio de cultivo próprio para células-tronco pluripotentes humanas. Além disso, o modo de preparo do substrato também é diferente, tratando-se de uma Iise celular provocada pelo hidróxido de amônio.US 2003175956 A1 discloses a method that allows undifferentiated proliferation of stem cells in a fibroblastic extracellular matrix with nutrient medium added with FGF, in which the growth environment has no feeder cells. The matrix described in this document is only effective if a conditioned medium is used in the presence of FGF-2 (5 ng / mL), whereas in the present application the matrix can be used with any pluripotent stem cell culture medium. Human Furthermore, the method of substrate preparation is also different in the case of cell lysis caused by ammonium hydroxide.
O documento de anterioridade CN 1986781 A revela um método para o cultivo de células-tronco mesenquimais em um ambiente contendo uma matriz extracelular separado a partir de fibroblasto humano. Por outro lado, a invenção pleiteada neste pedido destina-se ao cultivo de células-tronco pluripotentes.CN 1986781 A discloses a method for culturing mesenchymal stem cells in an environment containing an extracellular matrix separated from human fibroblast. On the other hand, the invention claimed in this application is for the cultivation of pluripotent stem cells.
O documento europeu EP 2267116 Al se refere a um meio nutriente, ausente de células alimentadoras e com pelo menos 8 0 ng/mL de FGF, para a proliferação indiferenciada de células-tronco pluripotentes. De acordo com o protocolo apresentado na EP, a adaptação celular na matriz ocorre após 6 passagens (aproximadamente 42 dias), enquanto que, na presente invenção, apenas 2 passagens (cerca de 14 dias) são suficientes para a adaptação. Além disso, o substrato acelular ora descrito é composto de uma matriz completa gerada por fibroblastos. O documento coreano KR 20080087264 A revela uma matrizEP 2267116 A1 relates to a nutrient medium, absent from feeder cells and containing at least 80 ng / ml FGF, for undifferentiated proliferation of pluripotent stem cells. According to the protocol presented in EP, cellular adaptation in the matrix occurs after 6 passages (approximately 42 days), whereas in the present invention only 2 passages (about 14 days) are sufficient for the adaptation. Furthermore, the acellular substrate described herein is composed of a complete matrix generated by fibroblasts. Korean document KR 20080087264 A reveals an array
de fibroblasto de placenta para proliferação e aderência de células-tronco mesenquimais oriundas do cordão umbilical, enquanto que a presente invenção serve para o cultivo de células-tronco pluripotentes e a preparação do substrato é diferente.of placenta fibroblasts for umbilical cord stem cell proliferation and adherence, while the present invention is for culturing pluripotent stem cells and substrate preparation is different.
O documento WO 2009079409 Al descreve um substrato de cultivo que compreende uma mistura de fibronectina e albumina (proteínas purificadas), o qual deve ser acrescido de altas concentrações de FGF-2 com a finalidade de manter as características das células-tronco.WO 2009079409 A1 describes a cultivation substrate comprising a mixture of fibronectin and albumin (purified proteins), which must be added to high concentrations of FGF-2 in order to maintain stem cell characteristics.
O pedido brasileiro BR 0514778 A ensina um método para o cultivo de células-tronco humanas não diferenciadas em matriz enriquecida na ausência de células alimentadoras. As células-tronco são cultivadas em alta concentração de FGF-2 (40 a 100 ng/mL), enquanto que na presente invenção utiliza-se apenas 4 a 8 ng/mL de FGF-2.Brazilian application BR 0514778 A teaches a method for culturing undifferentiated human stem cells in enriched matrix in the absence of feeder cells. Stem cells are cultured at a high concentration of FGF-2 (40 to 100 ng / mL), whereas in the present invention only 4 to 8 ng / mL of FGF-2 is used.
O pedido BR 0514641 A ensina a formação de uma matriz humanizada para cultura de células-tronco embrionárias compreendendo colágeno, fibronectina, vitronectina e laminina, com adição de fator de crescimento de fibroblasto em uma concentração de pelo menos 4 0 ng/ml. No entanto, uma mistura de proteínas como descrito neste pedido não possui as mesmas características biológicas de uma matriz completa.Application BR 0514641 A teaches the formation of a humanized matrix for embryonic stem cell culture comprising collagen, fibronectin, vitronectin and laminin, with addition of fibroblast growth factor at a concentration of at least 40 ng / ml. However, a protein blend as described in this application does not have the same biological characteristics as a complete matrix.
Sumário da Invenção:Summary of the Invention:
0 presente pedido de patente de invenção compreende um substrato para o cultivo de células-tronco pluripotentes, o qual é gerado a partir da fixação alcoólica de células de fibroblastos fetais de camundongo, e o processo de obtenção do mesmo.The present patent application comprises a substrate for culturing pluripotent stem cells which is generated from the alcoholic attachment of mouse fetal fibroblast cells, and the process for obtaining it.
A invenção tem o objetivo de estabelecer um substrato com a complexidade necessária para garantir pelo menos 95% das células mantidas pluripotentes.The invention aims to establish a substrate with the complexity necessary to ensure at least 95% of the cells maintained pluripotent.
Além disso, o uso de camadas de células alimentadoras é substituído, as condições de cultivo são mantidas e a contaminação com moléculas animais advindas da matriz é eliminada, sendo um substrato de baixo custo e compatível com a demanda científica nacional.In addition, the use of feeder cell layers is replaced, culture conditions are maintained, and contamination with animal molecules from the matrix is eliminated, being a low cost substrate and compatible with national scientific demand.
Descrição das Figuras:Description of the Figures:
2 0 As Figuras IA e IB são fotomicrografias que mostram a20 Figures IA and IB are photomicrographs showing the
morfologia típica de colônias características de células- tronco pluripotentes sob condição controle (A) e MEF etanol (B), respectivamente.typical morphology of characteristic colonies of pluripotent stem cells under control (A) and MEF ethanol (B) conditions, respectively.
A Figura IC é um gráfico que demonstra o ritmo de crescimento celular em ambas as condições de (A) e (B).Figure IC is a graph showing the rate of cell growth under both conditions (A) and (B).
As Figuras 2A, 2B, 2C e 2D são gráficos que mostram os níveis dos marcadores de pluripotência Oct-4, SOX-2, SSEA-4 e TRA-1-60, respectivamente, nas células-tronco cultivadas sob condição controle e MEF etanol.Figures 2A, 2B, 2C and 2D are graphs showing the levels of Oct-4, SOX-2, SSEA-4 and TRA-1-60 pluripotency markers, respectively, in stem cells grown under control and MEF ethanol. .
3 0 As Figuras 3A e 3B são fotomicrografias que mostram a morfologia típica de corpos embrióides formados a partir de células-tronco cultivadas sob os substratos controle (A) e etanol (B), respectivamente.Figures 3A and 3B are photomicrographs showing the typical morphology of embryoid bodies formed from stem cells grown under control (A) and ethanol (B) substrates, respectively.
A Figura 3C é um gráfico que analisa o diâmetro dos corpos embrióides em ambas as condições de (A) e (B).Figure 3C is a graph analyzing the diameter of embryoid bodies under both conditions of (A) and (B).
A Figura 4 é um gráfico que demonstra a quantificação dos níveis de ácido siálico Neu5Gc nas células-tronco.Figure 4 is a graph demonstrating the quantification of Neu5Gc sialic acid levels in stem cells.
Descrição detalhada da invenção:Detailed Description of the Invention:
O presente pedido de patente descreve um substrato de cultivo para células-tronco embrionárias humanas, o qual é produzido pelo tratamento de fibroblastos de camundongo com etanol, que promove a Iise celular e leva à fixação da matriz.This patent application describes a culture substrate for human embryonic stem cells which is produced by treating mouse fibroblasts with ethanol, which promotes cell lysis and leads to matrix fixation.
O substrato ora descrito apresenta uma complexidade mínima necessária para garantir pelo menos 95% das células mantidas pluripotentes, além de apresentar baixo custo e ser imunocompatível.The substrate described here has the minimum complexity necessary to guarantee at least 95% of the cells kept pluripotent, besides being low cost and being immunocompatible.
Processo de obtenção do substrato:Substrate obtaining process:
O substrato desta invenção é obtido da seguinte forma: Etapa 1:The substrate of this invention is obtained as follows: Step 1:
As placas de petri próprias para o cultivo celular (ou seja, que apresentam superfície negativamente carregada) são rinsadas com uma solução 0,1% de gelatina estéril e colocadas abertas em fluxo laminar até a secagem do líquido.Petri dishes suitable for cell culture (ie having a negatively charged surface) are rinsed with a 0.1% sterile gelatin solution and placed open in laminar flow until the liquid has dried.
Este passo tem a função de garantir a boa adesão das células a serem cultivadas à superfície da placa.This step has the function of ensuring the good adhesion of the cells to be cultured to the plate surface.
Etapa 2:Step 2:
Prepara-se o meio de cultivo dos fibroblastos, o qual consiste em: - DMEM/F12 (meio base)The fibroblast culture medium is prepared, which consists of: - DMEM / F12 (base medium)
- 10% soro fetal bovino- 10% fetal bovine serum
- 2mM glutamina- 2mM glutamine
- 0,2% 2-mercaptoetanol Etapa 3:- 0.2% 2-mercaptoethanol Step 3:
O criotubo contendo os fibroblastos embrionários murinos é descongelado em banho-maria a 37 0C com leve agitação manual por 1 a 2 minutos e, em seguida, são diluídas em meio de fibroblasto na proporção de 1 parte deThe cryotube containing the murine embryonic fibroblasts is thawed in a 37 ° C water bath with gentle manual agitation for 1 to 2 minutes and then diluted in fibroblast medium in a proportion of 1 part.
meio de congelamento para 2 partes de meio de fibroblasto.freezing medium for 2 parts fibroblast medium.
O material é centrifugado a 240 g por 5 minutos, o sobrenadante sendo descartado e o pellet (células) sendo suspenso novamente em meio de fibroblastos.The material is centrifuged at 240 g for 5 minutes, the supernatant discarded and the pellet (cells) resuspended in fibroblasts.
Etapa 4:Step 4:
Os fibroblastos descongelados são plaqueados nasThawed fibroblasts are plated on the
placas em uma densidade de 2,6xl04 células/cm2 e incubados a 370C em 5% CO2 por 48 horas.plates at a density of 2.6x10 4 cells / cm2 and incubated at 370 ° C in 5% CO 2 for 48 hours.
Etapa 5:Step 5:
Após 48 horas de incubação, as placas cultivadas sãoAfter 48 hours of incubation, the cultured plates are
2 0 rinsadas com água estéril, com volume suficiente para20 rinsed with sterile water of sufficient volume to
cobrir toda a superfície da placa.cover the entire surface of the plate.
Etapa 6:Step 6:
A água é aspirada e aplica-se o mesmo volume de etanol 70%, deixando-se a placa tampada no fluxo laminar por 5Water is aspirated and the same volume of 70% ethanol is applied, leaving the plate capped in laminar flow for 5 minutes.
minutos à temperatura ambiente, sendo o etanol aspirado em seguida.minutes at room temperature and the ethanol is then aspirated.
Etapa 7:Step 7:
A placa é novamente rinsada com etanol 70%, aspirada e seca destampada em fluxo laminar por aproximadamente 5 a 10The plate is again rinsed with 70% ethanol, aspirated and dried in laminar flow for approximately 5 to 10
3 0 minutos. Etapa 8:30 minutes. Step 8:
A placa é selada com parafilm ou guardada em embalagem estéril e acondicionada a 40C por até 2 meses ou a temperatura ambiente por até 1 semana.The plate is sealed with parafilm or stored in sterile packaging and stored at 40 ° C for up to 2 months or at room temperature for up to 1 week.
Ainda, para armazenamentos mais longos (superior a 2Also, for longer storage (greater than 2
meses), a placa deve ser acondicionada com solução de etanol 70% a -20°C.months), the plate should be conditioned with 70% ethanol solution at -20 ° C.
Etapa 9:Step 9:
Para utilização da placa para o cultivo de células- tronco pluripotentes, deve-se deixar a placa atingir a temperatura ambiente e plaqueá-la.To use plaque for cultivation of pluripotent stem cells, plaque should be allowed to reach room temperature and plated.
Em caso de células-tronco embrionárias murinas, o meio deve ser complementado com o fator LIF (mesma concentração utilizada para o cultivo sobre camadas alimentadoras inativadas).In case of murine embryonic stem cells, the medium should be supplemented with the LIF factor (same concentration used for cultivation on inactivated feeder layers).
Para células-tronco embrionárias humanas, o uso do fator FGF-2 na concentração de 8 ng/mL é suficiente para a manutenção das características das células, mas pode-se utilizar concentrações superiores de acordo com o meio de cultivo utilizado.For human embryonic stem cells, the use of FGF-2 at a concentration of 8 ng / mL is sufficient to maintain cell characteristics, but higher concentrations may be used depending on the culture medium used.
Testes e resultados:Tests and results:
- Quanto à morfologia e crescimento celular:- Regarding cell morphology and growth:
As figuras IA e IB representam fotomicrografias em campo claro (escala 50μπ\) que mostram a morfologia típica de colônia característica das células-tronco pluripotentes.Figures IA and IB represent brightfield photomicrographs (50μπ \ scale) showing the typical colony morphology characteristic of pluripotent stem cells.
Células da linhagem H9 foram cultivadas sobre uma condição controle (A) e no substrato MEF etanol (B) aqui descrito.H9 strain cells were cultured under a control condition (A) and on the MEF ethanol substrate (B) described herein.
Conforme pode ser observado no gráfico 1C, o ritmo de 3 0 crescimento das células H9 não foi alterado ao se comparar as condições controle e MEF etanol.As can be seen from graph 1C, the rate of growth of H9 cells was not altered by comparing the control and MEF ethanol conditions.
Assim, comprova-se que as células-tronco pluripotentes humanas mantêm sua morfologia e ritmo de crescimento característicos no substrato MEF etanol.Thus, human pluripotent stem cells are shown to maintain their characteristic morphology and growth rate in the MEF ethanol substrate.
- Quanto à pluripotência da cultura:- Pluripotency of the crop:
A figura 2 ilustra graficamente a quantificação dos marcadores de pluripotência Oct-4 (A) e SOX-2 (B) , através de fotomicrografias de imunomarcação das células-tronco pluripotentes, e a quantificação dos marcadores SSEA-4 (C) e TRA-1-60 (D) através de análise por citometria.Figure 2 graphically illustrates the quantification of pluripotency markers Oct-4 (A) and SOX-2 (B) by pluripotent stem cell immunostaining photomicrographs, and the quantification of markers SSEA-4 (C) and TRA- 1-60 (D) by cytometric analysis.
Isso significa que as células-tronco pluripotentes humanas da linhagem H9 mantêm altos níveis dos marcadores de pluripotência Oct-4, SOX-2, SSEA-4 e TRA-1-60 quando cultivadas por pelo menos 100 dias nas condições controle e sobre o substrato MEF etanol.This means that H9 strain human pluripotent stem cells maintain high levels of Oct-4, SOX-2, SSEA-4 and TRA-1-60 pluripotency markers when grown for at least 100 days under control and substrate conditions. MEF ethanol.
- Quanto à diferenciação em corpos embrióides:- Regarding differentiation in embryoid bodies:
As figuras 3A e 3B representam fotomicrografias em campo claro (escala ΙΟΟμτη) de corpos embrióides formados a partir de células H9 cultivadas sobre uma condição controle 2 0 (A) e no substrato MEF etanol (B) aqui descrito.Figures 3A and 3B represent brightfield photomicrographs (ΙΟΟμτη scale) of embryonic bodies formed from H9 cells cultured under a control condition 20 (A) and on the MEF ethanol substrate (B) described herein.
Conforme pode ser observado no gráfico 3C, o diâmetro dos corpos embrióides formados não foi alterado ao se comparar as condições controle e MEF etanol.As can be seen in graph 3C, the diameter of the embryoid bodies formed did not change when comparing the control and MEF ethanol conditions.
Assim, comprova-se que as células-tronco pluripotentes humanas mantêm sua capacidade de diferenciação em corpos embrióides quando cultivadas no substrato MEF etanol.Thus, it is proved that human pluripotent stem cells maintain their ability to differentiate into embryonic bodies when cultured in the MEF ethanol substrate.
- Quanto ao nível de ácido siálico:- As regards the level of sialic acid:
A figura 4 ilustra graficamente a quantificação de imunomarcação do ácido siálico NeuSGc por citometria das células-tronco pluripotentes. Conforme pode ser observado, as células H9 cultivadas sobre a condições controle apresentam mais células positivas (3 8%) para Neu5Gc do que as células H9 cultivadas sobre o substrato MEF etanol (29%).Figure 4 graphically illustrates the immunostaining quantification of NeuSGc sialic acid by pluripotent stem cell cytometry. As can be seen, H9 cells grown under control conditions have more Neu5Gc positive (38%) cells than H9 cells grown on MEF ethanol substrate (29%).
Além disso, fibroblastos embrionários murinos (MEF)In addition, murine embryonic fibroblasts (MEF)
foram utilizados como controle positivo do experimento e apresentaram 64% de células positivas.were used as positive control of the experiment and presented 64% of positive cells.
Isso significa que as células-tronco pluripotentes humanas da linhagem H9 mantidas sobre o substrato MEF etanol apresentaram menores níveis do ácido siálico não- humano Neu5Gc.This means that human pluripotent H9 stem cells maintained on the MEF ethanol substrate showed lower levels of Neu5Gc non-human sialic acid.
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| B08E | Application fees: payment of additional fee required [chapter 8.5 patent gazette] |
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/06/2011, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |