BRPI1015727A2

BRPI1015727A2 - bioactive phthalimide phenyl pyrazole compounds, process for preparing the compounds, their use and pharmaceutical compositions

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Publication number: BRPI1015727A2
Application number: BRPI1015727A
Authority: BR
Inventors: Ana Luisa Palhares De Miranda; Carlos Alberto Manssour Fraga; Cleverton Kleiton Freitas De Lima; Eliezer Jesus De Lacerda Barreiros; Milla Machado Fumian; Rodolfo Do Couto Maia; Uros Laban
Original assignee: Univ Rio De Janeiro
Priority date: 2010-09-08
Filing date: 2010-09-08
Publication date: 2016-05-03
Also published as: BRPI1015727B1

Abstract

compostos fenil-pirazóis ftalimídicos bioativos, processo para preparação dos compostos, seu uso e composições farmacêuticas. a inovação ora proposta diz respeito a novos compostos fenil pirazóis ftalimídicos capazes de atuarem como antinflamatório e analgésico. a presente invenção se refere também a composições farmacêuticas contendo tais compostos e seu uso no tratamento e modulação de condições e doenças mediadas por tnf-.bioactive phthalimide phenyl pyrazole compounds, process for preparing the compounds, their use and pharmaceutical compositions. The innovation proposed here concerns new phthalimide phenyl pyrazole compounds capable of acting as anti-inflammatory and analgesic. The present invention also relates to pharmaceutical compositions containing such compounds and their use in the treatment and modulation of TNF-mediated conditions and diseases.

Description

COMPOSTOS FENIL-PIRAZÓIS FTALIMÍDICOS BIOATIVOS, PROCESSO PARA PREPARAÇÃO DOS COMPOSTOS, SEU USO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS Campo da invenção A presente invenção se refere a novos compostos fenil pirazóis ftalimídicos capazes de atuarem como antinflamatório e analgésico. A presente invenção se refere também a composições farmacêuticas contendo tais compostos e seu uso no tratamento e modulação de condições e doenças mediadas porTNF-a.Fields of the Invention The present invention relates to novel phthalimide phenyl pyrazole compounds capable of acting as antinflammatory and analgesic. The present invention also relates to pharmaceutical compositions containing such compounds and their use in the treatment and modulation of TNF-α mediated conditions and diseases.

Fundamentos da invenção O fator de necrose tumoral (TNF) consiste em uma citocina pleiotrópica, regulando diversos eventos celulares e biológicos, dentre eles as respostas imunológica e inflamatória, a diferenciação e a proliferação celular, a apoptose e o metabolismo energético (CAWTHORN & SETHI, 2008).BACKGROUND OF THE INVENTION Tumor necrosis factor (TNF) consists of a pleiotropic cytokine, regulating various cellular and biological events, including immune and inflammatory responses, cell differentiation and proliferation, apoptosis and energy metabolism (CAWTHORN & SETHI, 2008).

Atualmente são conhecidos dois tipos de fator de necrose tumoral: o TNF-α e o TNF-β (ou linfotoxina), os quais apresentam uma similaridade notória em sua estrutura tridimensional, a despeito da baixa homologia sequencial (c.a. 33%) encontrada na estrutura primária de suas proteínas (GRAY et ai, 1984; PENNICA et ai, 1984; BANNER et ai, 1993). As atividades de ambas as citocinas, TNF-α e TNF-β, são muito semelhantes, tanto in vitro quanto in vivo, embora elas sejam antigenicamente distintas (SACK, 2002). O TNF-α é a citocina mais amplamente estudada pertencente à superfamília dos TNFs. As principais fontes de TNF-α in vivo são monócitos ativados, fibroblastos e células endoteliais. Macrófagos, células T, linfócitos B, granulócitos, células da musculatura lisa, eosinófilos, condrócitos, osteoblastos, mastócitos, células da glia e queratinócitos também produzem TNF-α após estimulação (MUKHOPADHYAY et ai, 2006). Ο TNF-α é uma citocina versátil que altera a remodelagem tecidual, aumenta a permeabilidade da barreira celular epitelial, induz a ativação de macrófagos, o recrutamento de células inflamatórias e a expressão de moléculas de adesão. Exerce, ainda, um papel fundamental no desenvolvimento, na homeostase e na resposta adaptativa do sistema imunológico (SURYAPRASAD & PRINDIVILLE, 2003).Two types of tumor necrosis factor are currently known: TNF-α and TNF-β (or lymphotoxin), which show a remarkable similarity in their three-dimensional structure, despite the low sequential homology (ca 33%) found in the structure. of its proteins (GRAY et al, 1984; PENNICA et al, 1984; BANNER et al, 1993). The activities of both cytokines, TNF-α and TNF-β, are very similar, both in vitro and in vivo, although they are antigenically distinct (SACK, 2002). TNF-α is the most widely studied cytokine belonging to the TNFs superfamily. The main sources of TNF-α in vivo are activated monocytes, fibroblasts and endothelial cells. Macrophages, T cells, B lymphocytes, granulocytes, smooth muscle cells, eosinophils, chondrocytes, osteoblasts, mast cells, glia cells and keratinocytes also produce TNF-α upon stimulation (MUKHOPADHYAY et al, 2006). Ο TNF-α is a versatile cytokine that alters tissue remodeling, increases epithelial cell barrier permeability, induces macrophage activation, inflammatory cell recruitment, and adhesion molecule expression. It also plays a fundamental role in the development, homeostasis and adaptive response of the immune system (SURYAPRASAD & PRINDIVILLE, 2003).

Por outro lado, a despeito da relevância fisiológica desta citocina para o funcionamento adequado do organismo, é sabido que o aumento de sua biossíntese e liberação conduzem à exacerbação das respostas inflamatória e oxidativa, as quais estão relacionadas à patogênese de uma ampla gama de doenças, e.g. artrite reumatóide, psoríase, doença de Crohn, eritema nodoso leproso e mieloma múltiplo (HASHIMOTO, 2002; MUKHOPADHYAY et ai, 2006; LIN et ai, 2008).On the other hand, despite the physiological relevance of this cytokine for the proper functioning of the organism, it is known that the increase of its biosynthesis and release lead to the exacerbation of inflammatory and oxidative responses, which are related to the pathogenesis of a wide range of diseases. eg rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, leprosy erythema nodosum and multiple myeloma (HASHIMOTO, 2002; MUKHOPADHYAY et al, 2006; LIN et al, 2008).

Evidências consistentes mostram a inibição do TNF- α como um alvo para o controle de dor inflamatória. Neste contexto diferentes fármacos têm sido desenvolvidos para o tratamento de doenças inflamatórias como a artrite reumatóide, lúpos eritematoso, psoríase, câncer (MARRIOT et ai, 1997; SAMPAIO et ai, 2002; PALLADINO et ai, 2003; CUNHA et ai, 2005; DASGUPTA et ai, 2009;).Consistent evidence shows TNF-α inhibition as a target for the control of inflammatory pain. In this context different drugs have been developed for the treatment of inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, psoriasis, cancer (MARRIOT et al, 1997; SAMPAIO et al, 2002; PALLADINO et al, 2003; CUNHA et al, 2005; DASGUPTA et al., 2009;).

Doenças inflamatórias crônicas podem ser divididas em doenças auto-imunes como artrite reumatóide, doença de Crohn e lúpus eritematoso, e doenças que são causadas pela presença de inflamação persistente como aterosclerose e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) (McCULLOCH, et ai, 2006). Em geral essas doenças são caracterizadas pela presença anormal de neutrófilos, macrófagos ativados, monócitos e de linfócitos ativados, especialmente linfócitos T. Entre os mediadores envolvidos destacam-se elevados níveis de citocinas como TNF-α, IL-1 β e IL-6 (0’SHEA, et ai, 2002).Chronic inflammatory diseases can be divided into autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, Crohn's disease and lupus erythematosus, and diseases that are caused by the presence of persistent inflammation such as atherosclerosis and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) (McCULLOCH, et al, 2006). . In general, these diseases are characterized by the abnormal presence of neutrophils, activated macrophages, monocytes and activated lymphocytes, especially T lymphocytes. Among the mediators involved are high levels of cytokines such as TNF-α, IL-1 β and IL-6 ( O'HEA, et al., 2002).

As doenças infiamatórias crônicas afetam cerca de 5% da população mundial, com destaque para a artrite reumatóide, doença pulmonar obstrutiva crônica, aterosclerose e doença de Crohn. O funcionamento do sistema imunológico é finamente modulado pela atividade de citocinas e mediadores pró e anti-inflamatórios (PALLADINO et al., 2003). Desequilíbrios presentes neste sistema podem conduzir ao desenvolvimento de quadros inflamatórios crônicos, doenças auto-imunes e ao aumento da susceptibilidade e/ou não resolução de infecções (HANADA & YOSHIMURA, 2002). Nos distúrbios inflamatórios imunomediados (do inglês, immune-mediated inflammatory disorders, IMIDs), o equilíbrio imunológico tecidual é rompido e, por conseguinte, não há resolução do quadro inflamatório, que evolui promovendo dano tecidual (LIN et al., 2008).Chronic inflammatory diseases affect about 5% of the world's population, especially rheumatoid arthritis, chronic obstructive pulmonary disease, atherosclerosis and Crohn's disease. The functioning of the immune system is finely modulated by the activity of pro and anti-inflammatory cytokines and mediators (PALLADINO et al., 2003). Imbalances present in this system may lead to the development of chronic inflammatory conditions, autoimmune diseases and increased susceptibility and / or resolution of infections (HANADA & YOSHIMURA, 2002). In immune-mediated inflammatory disorders (IMIDs), the tissue immune balance is disrupted and, therefore, there is no resolution of the inflammatory picture, which promotes tissue damage (LIN et al., 2008).

As abordagens terapêuticas atualmente empregadas no tratamento destes distúrbios focam, em sua maioria, na supressão da produção de mediadores pró-inflamatórios e na inibição do desencadeamento da resposta imunológica, utilizando, por exemplo, a modulação das vias de sinalização de citocinas.The therapeutic approaches currently employed in the treatment of these disorders focus mostly on suppressing the production of proinflammatory mediators and inhibiting the triggering of the immune response, using, for example, modulation of cytokine signaling pathways.

Em particular, o emprego de moduladores da produção e atividade biológica do TNF-α tem sido amplamente descrito e discutido na literatura (LIN et al., 2008), uma vez que o aumento da concentração tecidual e/ou plasmática desta citocina está associado ao estabelecimento e à evolução de diversas doenças de origem autoimune - e.g. doença de Crohn, diabetes, psoríase, artrite reumatóide e lúpus eritematoso sistêmico; infecciosa — e.g. hepatite C, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), choque séptico e eritema nodoso leproso; e tumoral - e.g. mieloma múltiplo e câncer ovariano (MARRIOT et al., 1997; SAMPAIO et al., 2002; PALLADINO et al., 2003; STEINWURZ, 2003; SIROHI & POWLES, 2004; PAUL et al., 2006; DASGUPTA et al., 2009).In particular, the use of modulators of TNF-α production and biological activity has been widely described and discussed in the literature (LIN et al., 2008), since the increased tissue and / or plasma concentration of this cytokine is associated with establishment and evolution of various diseases of autoimmune origin - eg Crohn's disease, diabetes, psoriasis, rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus; infectious - e.g. hepatitis C, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), septic shock and leprosy erythema nodosum; and tumoral - eg multiple myeloma and ovarian cancer (MARRIOT et al., 1997; SAMPAIO et al., 2002; PALLADINO et al., 2003; STEINWURZ, 2003; SIROHI & POWLES, 2004; PAUL et al., 2006; DASGUPTA et al., 2009).

Neste contexto, a busca de abordagens terapêuticas eficientes na modulação do TNF-α tem sido alvo de diversos esforços de pesquisa. Aproximadamente um milhão de pessoas ao redor do mundo estão em tratamento ou já foram tratadas com inibidores desta citocina disponíveis no mercado farmacêutico, englobando indicações que incluem a artrite reumatóide, a artrite psoriática, a psoríase e as doenças inflamatórias intestinais, além de inúmeras aplicações clínicas potenciais atualmente em diferentes estágios de avaliação (SURYAPRASAD & PRINDIVILLE, 2003; FELDMANN et ai, 2005; HOCHBERG et ai, 2005; LIN et ai, 2008).In this context, the search for efficient therapeutic approaches in TNF-α modulation has been the target of several research efforts. Approximately one million people around the world are being treated or have already been treated with pharmaceutically available cytokine inhibitors, including indications including rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, psoriasis and inflammatory bowel disease, and numerous clinical applications. potentials currently at different stages of assessment (SURYAPRASAD & PRINDIVILLE, 2003; FELDMANN et al, 2005; HOCHBERG et al, 2005; LIN et al, 2008).

Compostos N-fenil, 5-heteroaril, 4-amino pirazólicos e seus efeitos anti-inflamtórios foram descritos por Barreiro e Colaboradores (Veloso, Μ. P., 2000, Tese de Doutorado).N-phenyl, 5-heteroaryl, 4-amino pyrazolic compounds and their anti-inflammatory effects have been described by Barreiro and Collaborators (Veloso, Μ. P., 2000, PhD Thesis).

Durante sua tese de doutorado, Veloso (2000) foi responsável pelo planejamento e síntese de uma série de derivados amino-bipirazólicos, dentre eles, LASSBio-455 e LASSBio-715, propostos como inibidores da enzima prostaglandina endoperoxido sintase-2 (PGHS-2). Estudos farmacológicos realizados para estes derivados confirmaram a capacidade dos mesmos em inibir o edema de pata de rato induzido por carragenina, a hipernocicepção induzida por formalina e carragenina e a produção de PGE2, mas de forma não seletiva (dados não divulgados).During his doctoral dissertation, Veloso (2000) was responsible for the planning and synthesis of a series of amino-bipyrazole derivatives, including LASSBio-455 and LASSBio-715, proposed as inhibitors of the prostaglandin endoperoxide synthase-2 enzyme (PGHS-2). ). Pharmacological studies performed for these derivatives have confirmed their ability to inhibit carrageenan-induced rat paw edema, formalin- and carrageenan-induced hypernociception, and PGE2 production, but not selectively (data not disclosed).

Compostos estruturalmente semelhantes foram descritos por Laban (2009), durante seu projeto de pós-doutoramento, responsável pela síntese de uma série de derivados tendo como protótipo o derivado LASSBio-715, promovendo diferentes modificações estruturais e originando uma nova série de derivados fenilpirazólicos entre eles o derivado LASSBio-1425, objeto deste invenção.Structurally similar compounds were described by Laban (2009), during his postdoctoral project, responsible for the synthesis of a series of derivatives having as prototype the derivative LASSBio-715, promoting different structural modifications and giving rise to a new series of phenylpyrazolic derivatives among them. the LASSBio-1425 derivative, object of this invention.

As principais modificações estruturais foram realizadas no anel aromático e no grupo amino ligados à subunidade fenilpirazólica, além da obtenção de diferentes tipos de sal formados para alguns dos derivados.The main structural modifications were made in the aromatic ring and amino group linked to the phenylpyrazolic subunit, besides obtaining different salt types formed for some of the derivatives.

Os presentes inventores verificaram que, interessantemente, a substituição do grupo 4-amino ligado ao anelpirazólico por grupo ftalimídico, levou a uma nova classe de compostos com efeito inibitório sobre a produção de TNF-α. Efeito esse que foi comprovado tanto em modelo de cultura celular de macrófagos murinos como em modelo de inflamação induzida por carragenina, em camundongos.Interestingly, the present inventors have found that, interestingly, the replacement of the 4-amino group attached to the ring pyrazole with the phthalimide group has led to a new class of compounds with inhibitory effect on TNF-α production. This effect has been proven in both murine macrophage cell culture model and carrageenan-induced inflammation model in mice.

Descrição da Invenção Em um primeiro e principal aspecto, a presente invenção se refere a novos compostos que apresentam a estrutura geral (1): Onde: W pode ser hidrogênio, C1-C6 alquila ou cicloalquila, hidroxila, metoxila, cloro, flúor, bromo, ciano. Z, X e Y podem ser hidrogênio, C1-C6 alquila ou cicloalquila, trifluormetila, fenila.Description of the Invention In a first and main aspect, the present invention relates to novel compounds having the general structure (1): Where: W may be hydrogen, C1-C6 alkyl or cycloalkyl, hydroxyl, methoxy, chlorine, fluorine, bromine cyan. Z, X and Y may be hydrogen, C1-C6 alkyl or cycloalkyl, trifluoromethyl, phenyl.

Ri pode ser hidrogênio, flúor, cloro, bromo, metila, nitro, amino, metoxila, hidroxila, carboxila. R2 pode ser hidrogênio, flúor, cloro, bromo, metila, metoxila, hidroxila. R3 pode ser hidrogênio, flúor, cloro, bromo, metoxila. R4 pode ser hidrogênio, flúor, cloro, bromo.R1 may be hydrogen, fluorine, chlorine, bromine, methyl, nitro, amino, methoxy, hydroxyl, carboxyl. R2 may be hydrogen, fluorine, chlorine, bromine, methyl, methoxyl, hydroxyl. R3 may be hydrogen, fluorine, chlorine, bromine, methoxyl. R4 may be hydrogen, fluorine, chlorine, bromine.

Ou sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.Or pharmaceutically acceptable salts and solvates thereof.

Os novos compostos de fórmula (1) foram obtidos em rendimentos químicos que variaram de bom a excelente, empregando-se metodologia sintética aqui descrita, que caracteriza-se por apresentar poucas etapas, com elevados rendimentos, partindo-se de compostos comercialmente disponíveis, o que qualifica esta metodologia sintética para utilização industrial. Os compostos de fórmula (1) da presente invenção podem ser preparados por um processo que compreende as etapas sintéticas de: • Nitração de derivados 5-cloro-fenil-1 H-pirazólicos adequados, de forma regiosseletiva, com ácido nítrico fumegante em anidrido acético; • Acoplamento carbono-nitrogênio, através de substituição nucleofílica aromática, para inserção do segundo núcleo pirazólico adequado na posição 5 do núcleo fenil-1H-pirazólico de partida em meio básico utilizando como solventes dimetilssulfóxido (DMSO) e tetrahidrofurano (THF); • Redução quimiosseletiva do grupo nitro inserido em etapa anterior ao grupo amino com ferro metálico em meio ácido utilizando como solventes etanol e água destilada; • Acoplamento com os respectivos anidridos ftálicos através de fusão térmica (130°C) para a obtenção dos derivados bipirazolo-isoindolinodiônicos. Esta reação é feita sem a presença de solventes.The new compounds of formula (1) were obtained in chemical yields ranging from good to excellent, using the synthetic methodology described here, which is characterized by presenting few steps, with high yields, starting from commercially available compounds. qualifies this synthetic methodology for industrial use. The compounds of formula (1) of the present invention may be prepared by a process comprising the synthetic steps of: • Nitration of suitable regioselectively 5-chloro-phenyl-1 H -pyrazole derivatives with fuming nitric acid in acetic anhydride ; • Carbon-nitrogen coupling, via aromatic nucleophilic substitution, for insertion of the appropriate second pyrazolic nucleus at position 5 of the starting phenyl-1H-pyrazolic nucleus in basic medium using dimethylsulfoxide (DMSO) and tetrahydrofuran (THF) solvents; • Chemoselective reduction of the nitro group inserted in a step prior to the amino group with metallic iron in acid medium using ethanol and distilled water as solvents; • Coupling with the respective phthalic anhydrides by thermal fusion (130 ° C) to obtain the bipyrazole-isoindolinodionic derivatives. This reaction is performed without the presence of solvents.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso dos compostos acima descritos para a produção de medicamentos úteis para o tratamento ou modulação de doenças e condições mediadas por TNF-α, ou seja, a utilização dos ditos compostos, nas formulações de medicamentos, em diferentes formas farmacêuticas úteis, orais ou não, para o tratamento de condições dolorosas de várias origens e inflamatórias, crônicas e agudas, de naturezas diversas, mediadas ou não, por citocinas, incluindo o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a). A produção de medicamentos contendo os novos compostos ora descritos pode ser realizada com base em formulações e processos de manufatura usuais e atualmente disponíveis no estado da técnica, sendo sua utilização, proposta, na preparação de medicamentos, para o tratamento de doenças inflamatórias agudas e crônicas e hiperalgesia em mamíferos, preferencialmente humanos, mais especificamente, no tratamento das doenças inflamatórias, que são doenças inflamatórias crônico degenerativas, exemplificadas na artrite reumatóide, espondilite, doença de Crohn, psoríase e asma. A título de exemplificação serão descritas a síntese dos seguintes compostos: a) 5-cloro-3-metil-4-nitro-1 -fenil-1 H-pirazol; b) 5-(3,5-dimetil-1 H-pirazolil)-3-metil-4-nitro-1 -fenil-1 H-pirazol; c) 5-(3,5-dimetil-1 H-pirazolil)-3-metil-1 -fenil-4-amino-1 H-pirazol; d) 2-(5-(3,5-dimetil-1 H-pirazolil)-3-metil-1-fenil-1 H-pirazolil)isoindolino-1,3-diona.In another aspect, the present invention relates to the use of the compounds described above for the manufacture of medicaments useful for the treatment or modulation of TNF-α mediated diseases and conditions, i.e. the use of said compounds in drug formulations. in different pharmaceutical forms useful, oral or otherwise, for the treatment of various chronic and acute painful and inflammatory conditions of various natures, whether or not mediated by cytokines, including tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) . The production of drugs containing the new compounds described above can be based on the usual formulations and manufacturing processes currently available in the state of the art, and their proposed use in the preparation of medicines for the treatment of acute and chronic inflammatory diseases. and hyperalgesia in mammals, preferably humans, more specifically in the treatment of inflammatory diseases, which are chronic degenerative inflammatory diseases, exemplified in rheumatoid arthritis, spondylitis, Crohn's disease, psoriasis and asthma. By way of example, the synthesis of the following compounds will be described: (a) 5-chloro-3-methyl-4-nitro-1-phenyl-1H-pyrazole; b) 5- (3,5-dimethyl-1H-pyrazolyl) -3-methyl-4-nitro-1-phenyl-1H-pyrazole; c) 5- (3,5-dimethyl-1H-pyrazolyl) -3-methyl-1-phenyl-4-amino-1H-pyrazole; d) 2- (5- (3,5-dimethyl-1H-pyrazolyl) -3-methyl-1-phenyl-1H-pyrazolyl) isoindoline-1,3-dione.

Os seguintes exemplos experimentais servem para ilustrar a presente invenção sem, contudo, limitar o escopo da invenção ora apresentada. EXEMPLO 1: Preparação do derivado 5-cloro-3-metil-4-nitro-1-fenil-1 H- PIRAZOLThe following experimental examples serve to illustrate the present invention without, however, limiting the scope of the present invention. EXAMPLE 1: Preparation of 5-Chloro-3-methyl-4-nitro-1-phenyl-1H-PIRAZOL derivative

Procedimento: Em um balão de 3 bocas (2 L), equipado com termômetro sustentado por um septo de borracha posicionando o bulbo em direção ao centro do balão, foram adicionados 100 g de 5-cloro-1-fenil-3-metilpirazol (0.51 mol). Em seguida adicionou-se 580 ml de anidrido acético previamente resfriado a 4 °C. Imergiu-se o balão num banho de etilenoglicol e gelo seco (-18 °C) e sob agitação magnética foram adicionados 100 ml de ácido nítrico fumegante por 20 minutos gota a gota. Após meia hora o frasco de reação foi transferido para um banho de gelo e cloreto de sódio (-4 °C). A temperatura de -10 °C—> -4 °C foi mantida durante mais uma hora através da adição de pequenos pedaços de gelo seco. Depois desse tempo, permitiu-se que a temperatura subisse gradualmente até 13 °C, onde ocorreu a precipitação de um sólido amarelo que foi vertido sobre 1,3 L de gelo moldo em um béquer de 4 L. Após derretido o gelo, o sólido foi filtrado, lavado com 1 L de água e seco por filtragem (1 h). O sólido amarelo obtido foi recristalizado em etanol para fornecer a nitropirazola (35 g) como agulhas brancas. Da solução amarela etanólica restante foram obtidos após outra recristalização, 8,8 g adicionais, totalizando 43,8 g (0,18 mois) do produto desejado. Esse material foi usado na etapa subseqüente depois de secado sob vácuo por 4 horas. Sólido amarelo, pf. 99-102°C. RMN 1H (200MHz, CDCI3, TMS) δ (ppm): 2,62 (s, 3H, CH3); 7,53 (s, 5H). RMN 13C (50MHz, CDCI3, TMS) δ (ppm): 14,7; 125,6; 128,1; 129,5; 129,9; 137,0; 147,7. IV (umax, KBr) υ (cm·1): 3111, 3076, 3002, 2935, 2977, 1596, 1542, 1358. EXEMPLO 2: Preparação do derivado 5-(3,5-dimetil-1H-pirazolil)-3-metil-4- NITRO-1 -FENIL-1H-PIRAZOLProcedure: In a 3-mouth (2 L) balloon equipped with a thermometer supported by a rubber septum positioning the bulb toward the center of the balloon, 100 g of 5-chloro-1-phenyl-3-methylpyrazole (0.51 mol). Then 580 ml of acetic anhydride previously cooled to 4 ° C were added. The flask was immersed in an ethylene glycol bath and dry ice (-18 ° C) and under magnetic stirring 100 ml of steaming nitric acid was added for 20 minutes dropwise. After half an hour the reaction flask was transferred to an ice and sodium chloride bath (-4 ° C). The temperature of -10 ° C -> -4 ° C was maintained for a further hour by the addition of small pieces of dry ice. After this time, the temperature was allowed to gradually rise to 13 ° C, where a yellow solid precipitated and was poured into 1.3 L of molten ice in a 4 L beaker. After melting the ice, the solid It was filtered, washed with 1 L of water and dried by filtration (1 h). The yellow solid obtained was recrystallized from ethanol to afford nitropyrazole (35 g) as white needles. From the remaining ethanolic yellow solution was obtained after further recrystallization an additional 8.8 g totaling 43.8 g (0.18 mo) of the desired product. This material was used in the subsequent step after vacuum drying for 4 hours. Yellow solid, mp. 99-102 ° C. 1H-NMR (200MHz, CDCl3, TMS) δ (ppm): 2.62 (s, 3H, CH3); 7.53 (s, 5H). 13 C-NMR (50MHz, CDCl 3, TMS) δ (ppm): 14.7; 125.6; 128.1; 129.5; 129.9; 137.0; 147.7. IR (umax, KBr) υ (cm -1): 3111, 3076, 3002, 2935, 2977, 1596, 1542, 1358. EXAMPLE 2: Preparation of 5- (3,5-dimethyl-1H-pyrazolyl) -3 derivative -methyl-4-NITRO-1-PHENYL-1H-PIRAZOL

Em um balão de 1 L foram adicionados 6 g NaOH (0,15 mois), 13 g (0,14 mois) 3,5-dimetilpirazol em 265 mL DMSO. A solução foi exposta a ultra-som (opcional) por 30 minutos sobre atmosfera de argônio. O balão foi transferido num banho de gelo e 5-cloro-1-fenil-3-metil-4-nitropirazol (30,4 g; 0,13 mois) em 120 mL THF foi adicionado com seringa. O frasco foi exposto a ultra-som mais uma vez ate o CDD indicou o termino de reação (30-50 min.). A solução foi vertida sobre 1L de gelo e após o sólido escuro foi coletado por filtração. A solução filtrada foi extraída com diclorometano (3 x 200 mL), lavada com água (3 x 200 mL), solução saturada de cloreto de sódio (2 x 300 mL) e seca com MgS04 anidro. O sólido escuro obtido previamente foi dissolvido nessa solução e filtrada (200 mL celite) para remover impurezas insolúveis. Após de remoção do solvente foi obtido um óleo marrom-vermelho que foi seco em alto vácuo por 2 horas. O material semi-solificado obtido foi dissolvido em EtOH (100-150 mL) e precipitado com adição lenta de água destilada com agitação magnética. Apos de secado no alto vácuo, 30,9 g (0,104 mois; 80 %) do produto desejado foram obtidos na forma de um pó bege que foi utilizado na etapa subseqüente sem purificações adicionais. Sólido bege, pf. 84-87°C. RMN 1H (200MHz, CDCI3, TMS) δ (ppm): 1,92 (s, 3H, CH3); 2,18 (s, 3H, CH3); 2,61 (s, 3H, CH3); 5,94 (s, 1H); 7,18 (m, 2H); 7,30 (m, 3H). RMN 13C (50MHz, CDCI3, TMS) δ (ppm): 11,0; 13,8; 14,6; 107,8; 123,2; 129,1; 129,5; 134,5; 137,2; 143,3; 146,9; 152,8. IV (omaX! KBr) o (cm’1): 3110, 3074, 3022, 2998, 2972, 2928, 1603, 1582, 1502, 1426, 1365. EXEMPLO 3: Preparação do derivado 5-(3,5-dimetil-1 H-pirazolil)-3-metil-1- FENIL-4-AMINO-1H-PIRAZOLTo a 1 L flask was added 6 g NaOH (0.15 mo), 13 g (0.14 mo) 3,5-dimethylpyrazole in 265 ml DMSO. The solution was exposed to ultrasound (optional) for 30 minutes under argon atmosphere. The flask was transferred to an ice bath and 5-chloro-1-phenyl-3-methyl-4-nitropyrazole (30.4 g; 0.13 mo) in 120 mL THF was added with syringe. The flask was sonicated once more until the CDD indicated the reaction termination (30-50 min.). The solution was poured into 1 L of ice and after dark solid was collected by filtration. The filtered solution was extracted with dichloromethane (3 x 200 mL), washed with water (3 x 200 mL), saturated sodium chloride solution (2 x 300 mL) and dried with anhydrous MgSO4. The previously obtained dark solid was dissolved in this solution and filtered (200 mL celite) to remove insoluble impurities. After removal of solvent a brown-red oil was obtained which was dried under high vacuum for 2 hours. The obtained semi-soluble material was dissolved in EtOH (100-150 mL) and precipitated with slow addition of distilled water with magnetic stirring. After drying under high vacuum, 30.9 g (0.104 mo; 80%) of the desired product was obtained as a beige powder which was used in the subsequent step without further purification. Beige solid, mp. 84-87 ° C. 1H-NMR (200MHz, CDCl3, TMS) δ (ppm): 1.92 (s, 3H, CH3); 2.18 (s, 3H, CH 3); 2.61 (s, 3H, CH 3); 5.94 (s, 1H); 7.18 (m, 2H); 7.30 (m, 3H). 13 C-NMR (50MHz, CDCl 3, TMS) δ (ppm): 11.0; 13.8; 14.6; 107.8; 123.2; 129.1; 129.5; 134.5; 137.2; 143.3; 146.9; 152.8. IR (λmax KBr) o (cm -1): 3110, 3074, 3022, 2998, 2972, 2928, 1603, 1582, 1502, 1426, 1365. EXAMPLE 3: Preparation of the 5- (3,5-dimethyl) derivative 1H-pyrazolyl) -3-methyl-1-phenyl-4-AMINO-1H-PIRAZOL

Em um balão de 1 L imerso num banho de gelo contendo 280 mL de monohidrato de hidrazina (98%) (5,44 mois) sobre agitação magnética, foi adicionado, acido fórmico (201,6 ml; 5,34 mois) gota a gota pelo condensador (50 cm). Diretamente após de termino da adição, essa soluça de monoformato de hidrazina foi transferida pela decantação para um frasco contendo 16 g (53,85 mmols) de 5-(3,5-dimetilpirazol-1H-il)-1-fenil-3-metil-4~nitropirazol, 2,5 g Pd/C 10%, 15 g Zn, 100 mL EtOH e 200 mL MeOH. A suspensão resultante foi mantida em banho de ultrasom até o término da reação (30-45 min.) indicado pelo CCD. A suspensão foi filtrada em celite (500 mL) que foi posteriormente lavado com a solução alcoólica MeOH/EtOH 1:1 (200 mL). Os solventes alcoólicos foram removidos à vácuo e a solução aquosa restante foi extraída com acetato de etila (3 x 150 ml). A fase orgânica foi lavada com água (3x100 mL), solução saturada de cloreto de sodio (2 x 100 mL), seca (MgS04), filtrada e evaporada à vácuo para se obter um óleo amarelo que foi seco em alto vácuo (2h). O óleo obtido foi dissolvido em 1.5 L de dietil éter em um balão de 2L com agitação magnética e HCI gasoso (~30 min) foi introduzido promovendo a precipitação de cloridrato como um pó branco. A agitação magnética foi interrompida e o solvente amarelo foi descartado. Mais um litro de éter foi adicionado, e a solução agitada brevemente e enquanto o produto se deposita no fundo de após que solvente ácido foi descartado. Esse processo foi repetido mais uma vez com acetato de etila. O produto foi filtrado e recristalizado (EtOH/EtOAc.) para fornecer 13,6 g (40,12 rnols; 75%) o produto desejado na forma de dicloridrato. Pf: 199-209 °C. Sólido bege, pf. 84-87°C. RMN 1H (200MHz, CDCI3, TMS) δ (ppm): 1,73 (s, 3H, CH3); 2,20 (s, 3H, CH3); 2,21 (s, 3H, CH3); 2,86 (s, 2H, NH2) 5,85 (s, 1H); 6,97 (m, 2H); 7,11 (m, 3H). RMN 13C (50MHz, CDCI3, TMS) δ (ppm): 10,8; 11,6; 14,1; 106,8; 121,1; 123,8; 125,2; 126,2; 129,2; 139,0; 139,6; 143,0; 151,5. IV (omax, KBr) o (cm'1): 3404, 3322, 3214, 3067, 2954, 2923, 1638, 1597, 1503. EXEMPLO 4: Preparação do derivado 2-(5-(3,5-dimetil-1H-pirazolil)-3-metil-1-fenil-1H-pirazolil)isoindolino-1,3-diona(LASSBio-1425) Em um balão foram colocados 8,8 g (33,0 mmols) de 5-(3,5-dimetil-1H-pirazolil)-3-metil-1-fenil-4-amino-1H-pirazol e 4,9 g (33,0 mmols) de anidrido ftálico, após isso, o balão foi acoplado a um condensador e aquecido até 130°C, o balão foi mantido sob este aquecimento por uma hora. Em seguida, a mistura reacional foi dissolvida em acetato de etila e lavado com solução 10% de HCI. A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro e em seguida evaporada a vácuo. O produto foi purificado em coluna cromatográfica (hexano/acetato de etila 9:1) fornecendo 10,48 g (36,4 mmols, 80%) de LASSBio-1425 como um sólido branco. Sólido branco, pf. 201-202°C. RMN 1H (200MHz, CDCI3> TMS) δ (ppm): 1,81 (s, 3H, CH3); 2,04 (s, 3H, CH3); 2,27 (s, 3H, CH3); 5,96 (s, 1H); 7,07 (d, 2H); 7,41 (m, 3H); 7,87 (m, 4H). RMN 13C (50MHz, CDCI3i TMS) δ (ppm): 10,7; 12,4; 13,8; 107,7; 110,65; 122,3; 124,4; 128,4; 130,0; 131,7; 134,4; 135,7; 138,3; 143,0; 147,2; 151,3; 166,5. IV (omax, KBr) υ (cm'1): 1722, 1510, 1399, 1372, 718.To a 1 L flask immersed in an ice bath containing 280 mL of hydrazine monohydrate (98%) (5.44 mo) under magnetic stirring, formic acid (201.6 mL; 5.34 mo) was added dropwise. drop by the condenser (50 cm). Directly after the addition was complete, this hydrazine monoformate solution was transferred by decantation into a flask containing 16 g (53.85 mmols) of 5- (3,5-dimethylpyrazol-1H-yl) -1-phenyl-3-one. methyl-4-nitropyrazole, 2.5 g 10% Pd / C, 15 g Zn, 100 mL EtOH and 200 mL MeOH. The resulting suspension was kept in an ultrasound bath until the completion of the reaction (30-45 min.) Indicated by the CCD. The suspension was filtered over celite (500 mL) which was then washed with 1: 1 MeOH / EtOH alcohol solution (200 mL). The alcoholic solvents were removed in vacuo and the remaining aqueous solution was extracted with ethyl acetate (3 x 150 ml). The organic phase was washed with water (3x100 mL), saturated sodium chloride solution (2 x 100 mL), dried (MgSO 4), filtered and evaporated in vacuo to give a yellow oil which was dried under high vacuum (2h). . The obtained oil was dissolved in 1.5 L of diethyl ether in a 2 L flask with magnetic stirring and HCl gas (~ 30 min) was introduced promoting precipitation of hydrochloride as a white powder. The magnetic stirring was stopped and the yellow solvent was discarded. An additional liter of ether was added, and the solution stirred briefly and as the product settle to the bottom after acidic solvent was discarded. This process was repeated once again with ethyl acetate. The product was filtered and recrystallized (EtOH / EtOAc) to provide 13.6 g (40.12 mmol, 75%) of the desired product as a dihydrochloride. Mp: 199-209 ° C. Beige solid, mp. 84-87 ° C. 1H-NMR (200MHz, CDCl3, TMS) δ (ppm): 1.73 (s, 3H, CH3); 2.20 (s, 3H, CH 3); 2.21 (s, 3H, CH 3); 2.86 (s, 2H, NH 2) 5.85 (s, 1H); 6.97 (m, 2H); 7.11 (m, 3H). 13 C NMR (50MHz, CDCl 3, TMS) δ (ppm): 10.8; 11.6; 14.1; 106.8; 121.1; 123.8; 125.2; 126.2; 129.2; 139.0; 139.6; 143.0; 151.5. IR (ν max, KBr) o (cm -1): 3404, 3322, 3214, 3067, 2954, 2923, 1638, 1597, 1503. EXAMPLE 4: Preparation of 2- (5- (3,5-dimethyl-1H) derivative -pyrazolyl) -3-methyl-1-phenyl-1H-pyrazolyl) isoindoline-1,3-dione (LASSBio-1425) In a flask was placed 8.8 g (33.0 mmols) of 5- (3.5 -dimethyl-1H-pyrazolyl) -3-methyl-1-phenyl-4-amino-1H-pyrazole and 4.9 g (33.0 mmols) of phthalic anhydride, after which the flask was coupled to a condenser and heated. up to 130 ° C, the flask was kept under this heating for one hour. Then the reaction mixture was dissolved in ethyl acetate and washed with 10% HCl solution. The organic phase was dried with anhydrous sodium sulfate and then evaporated in vacuo. The product was purified by column chromatography (9: 1 hexane / ethyl acetate) affording 10.48 g (36.4 mmols, 80%) of LASSBio-1425 as a white solid. White solid, mp. 201-202 ° C. 1H-NMR (200MHz, CDCl3> TMS) δ (ppm): 1.81 (s, 3H, CH3); 2.04 (s, 3H, CH 3); 2.27 (s, 3H, CH 3); 5.96 (s, 1H); 7.07 (d, 2H); 7.41 (m, 3H); 7.87 (m, 4H). 13 C-NMR (50MHz, CDCl3 TMS) δ (ppm): 10.7; 12.4; 13.8; 107.7; 110.65; 122.3; 124.4; 128.4; 130.0; 131.7; 134.4; 135.7; 138.3; 143.0; 147.2; 151.3; 166.5. IR (ν max, KBr) υ (cm -1): 1722, 1510, 1399, 1372, 718.

EXEMPLO 5: AÇÃO INIBITÓRIA DE LASSBIO-1425 SOBRE A PRODUÇÃO DE TNF-A EM MODELO DE CULTURA CELULAR DE MACRÓFAGOS MURINOS O derivado LASSBio-1425 foi capaz de inibir a produção de TNF-α em modelo in vitro de dosagem de TNF-α em cultura de macrófagos murinos estimulados com LPS (100 ng/mL) utilizando a metodologia descrita por GALLILY e colaboradores (1997)onde camundongos suíços (25g a 30g) foram estimulados com uma solução de tioglicolato 3% administrada por via intraperitoneal. Após 3 dias, os macrófagos foram coletados por lavagem do peritônio com RPMI, as células foram então contadas em câmara de Neubauer e a concentração foi ajustada para 100.000 células/ml. Posteriormente, 300 μΙ desta suspensão de células foram plaqueados em placa de 96 poços e incubados por 1 hora em estufa de C02 (5% C02, temperatura 37°C, umidade 80-90 %) para permitir a adesão dos macrófagos à superfície dos poços. Após este período, os poços foram lavados por 2 vezes com PBS para a retirada das células que não aderiram, adicionados de 300 pL de RPMI suplementado com 10 % de soro fetal bovino inativado, estreptomicina e penicilina (50 U/mL), incubando-os com 1 μΙ de DMSO ou da solução estoque das substâncias teste por 1 hora nas mesmas condições citadas acima. Após este período, os macrófagos foram estimulados com LPS (100 ng/ml) por 24 horas. Após 24 horas de estímulo, o sobrenadante foi coletado e o TNF-α dosado por ensaio imunoenzimático, utilizando o kit adequado conforme as instruções do fabricante. LASSBio-1425 apresentou uma potência superior ao fármaco talidomida, apresentando uma Cl50 de 44,7 μΜ enquanto que a talidomida apresentou uma CI5o superior a 200 μΜ.EXAMPLE 5: INHIBITORY ACTION OF LASSBIO-1425 ON TNF-A PRODUCTION IN CELL CULTURE MODEL OF MURINE MACROPHAGES The LASSBio-1425 derivative was able to inhibit TNF-α production in an in vitro model of TNF-α dosage in culture of LPS-stimulated murine macrophages (100 ng / mL) using the methodology described by GALLILY et al. (1997) where Swiss mice (25g to 30g) were stimulated with an intraperitoneally administered 3% thioglycolate solution. After 3 days, macrophages were collected by washing the peritoneum with RPMI, the cells were then counted in a Neubauer chamber and the concentration adjusted to 100,000 cells / ml. Subsequently, 300 μΙ of this cell suspension was plated in a 96-well plate and incubated for 1 hour in a CO2 oven (5% CO2, temperature 37 ° C, humidity 80-90%) to allow macrophages to adhere to the surface of the wells. . After this time, the wells were washed twice with PBS to remove non-adherent cells, added with 300 µl RPMI supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum, streptomycin and penicillin (50 U / mL), incubating. 1 μΙ of DMSO or stock solution of test substances for 1 hour under the same conditions as above. After this period, macrophages were stimulated with LPS (100 ng / ml) for 24 hours. After 24 hours of stimulation, the supernatant was collected and TNF-α assayed by enzyme-linked immunosorbent assay using the appropriate kit as directed by the manufacturer. LASSBio-1425 had a higher potency than the drug thalidomide, with a Cl50 of 44.7 μΜ while thalidomide had an IC50 of greater than 200 μΜ.

Tabela 1: Potência anti-TNF-α de LASSBio-1425, no modelo de dosagem de TNF-α em macrófagos peritoneais de camundongos CI5o = concentração inibitória correspondente a 50% do efeito máximo. O efeito de LASSBio-1425 em inibir a produção de TNF-α foi confirmado pois LASSBio-1425 não apresentou toxicidade (não promoveu morte celular)no estudo da viabilidade celular pelo teste do MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)que foi avaliada adaptando-se um protocolo descrito por MOSMANN e colaboradores (1983) onde uma suspensão de macrófagos peritoneais de camundongos suíços foram extraídos e plaqueados em placas de 96 poços (30.000 cels/poço) seguindo a mesma metodologia descrita para dosagem de TNF-α em cultura de macrófagos até o estímulo das células com LPS. Após 18 horas de estímulo com LPS, adiciona-se 20 pl de uma solução de MTT (5 mg/ml) à cultura de macrófagos, seguida pela incubação por mais 4 horas a 37°C. Ao final deste tempo, foram adicionados 200 μΙ de DMSO para a solubilização de toda a substância depositada. A leitura da densidade óptica foi realizada em leitor de microplaca a 490 nm. EXEMPLO 6: Ação inibitória de LASSBIO-1425 sobre a produção de TNF-a EM MODELO DE INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR CARRAGENINATable 1: LASSBio-1425 anti-TNF-α potency in the TNF-α dosage model in mouse peritoneal macrophages CI 50 = inhibitory concentration corresponding to 50% of the maximum effect. The effect of LASSBio-1425 on inhibiting TNF-α production was confirmed as LASSBio-1425 showed no toxicity (did not promote cell death) in the cell viability study by the MTT test (3- (4,5-dimethyl-2- thiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) which was evaluated by adapting a protocol described by MOSMANN et al. (1983) where a suspension of peritoneal macrophages from Swiss mice was extracted and plated in 96-well plates (30,000 cels / well). following the same methodology described for dosing TNF-α in macrophage culture until stimulation of cells with LPS. After 18 hours of LPS stimulation, 20 µl of a MTT solution (5 mg / ml) is added to the macrophage culture, followed by incubation for a further 4 hours at 37 ° C. At the end of this time, 200 μΙ DMSO was added for solubilization of all deposited substance. Optical density reading was performed on a 490 nm microplate reader. EXAMPLE 6: Inhibitory Action of LASSBIO-1425 on TNF-α Production in CARRAGENIN-INDUCED INFLAMMATION MODEL

Cinco horas após o estímulo inflamatório pela injeção intraplantar de carragenina (100 pg/pata), os animais foram sacrificados, os tecidos cutâneos plantar foram retirados. As amostras foram homogeneizadas em 500μΙ de tampão apropriado contendo inibidores de proteases. Os níveis de TNF-α foi determinado por ELISA. LASSBio-1425 foi capaz de inibir a produção de TNF-α em tecido plantar inflamado estimulado com carragenina, reduzindo desta forma, a produção desta citocina pró-inflamatória no local da inflamação, reduzindo o processo inflamatório e o processo hiperalgésico. A figura 1 mostra o gráfico 1 onde é representado o efeito de LASBio-1425 sobre a produção de TNF-α após injeção intraplantar de carragenina. A substância LASSBio-1425 foi administrada por via oral em suspensão de goma arábica 5% na dose de 100 pmol/kg, 1h antes do estímulo com carragenina 100 pg/pata. 5 h após o estímulo os tecidos foram retirados para dosagem de TNF-α por ELISA. Os resultados são expressos em produção de TNF-α (pg/ml) ± EPM, n = 4 animais, * p< 0,05; # p <0,001; (teste “t” de student), comparados com o grupo controle e salina respectivamente. EXEMPLO 7: Ação inibitória de LASSBIO-1425 sobre a hipernocicepção MECÂNICA INDUZIDA POR CARRAGENINA É conhecido que a administração de carragenina (100 pg/pata) intraplantar em camundongos induz uma hipernocicepção mecânica através da liberação de uma cascata de citocinas de seqüência definida, por células residentes ou migratórias. A primeira citocina a ser liberada é o TNF-α (CUNHA et ai, 2005). Desta maneira, com o intuito de avaliar a participação de LASSBio-1425 sobre a produção destas citocinas, foi realizado o estudo da atividade deste derivado fenilpirazólico no modelo de hipernocicepção mecânica induzida por carragenina. LASSBio-1425 nas doses de 100 e 300 pmol/kg foi capaz de inibir a hipernocicepção mecânica induzida por carragenina. A figura 2 mostra o gráfico onde é representado o efeito anti-hipernociceptivo temporal de LASSBio-1425 no modelo de hipernocicepção mecânica induzida por carragenina 100 pg/pata. A substância LASSBio-1425 foi administrada por via oral em suspensão de goma arábica 5% nas respectivas doses, 1h antes do estímulo. Os resultados são expressos em Δ do limiar de retirada (g) ± EPM, n = 10 animais, ** p<0,01; *** p<0,001; (teste ANOVA One-way, post test Bonferroni), comparados com o grupo controle. EXEMPLO 8: Ação inibitória de LASSBio-1425 sobre a migração celular no MODELO DE HIPERNOCICEPÇÃO MECÂNICA INDUZIDA POR CARRAGENINA. EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DE LASSBlO-1425 A administração intraplantar de carragenina (100 pg/pata) em camundongos é capaz de induzir a inflamação e o fenômeno hipernociceptivo. Sabe-se também que a administração deste mesmo agente é capaz de induzir a migração de neutrófilos que sustentam os fenômenos citados (POSADAS et al, 2004; CUNHA et al., 2005). Sendo assim, foi avaliada a capacidade de LASSBio-1425 em inibir a migração de neutrófilos nas patas de camundongos submetidas ao estímulo da carragenina, por uma medida indireta, através da dosagem de atividade mieloperoxidase nos tecidos cutâneos plantar. A administração de carragenina promoveu um aumento da atividade mieloperoxidase, aumento este que é inibido pela administração prévia da substância LASSBio-1425 quando administrada por via oral nas doses de 100 pg/kg e 300 pg/kg. A figura 3 mostra o gráfico 3 onde é representado o efeito de LASSBio-1425 sobre a migração de neutrófilos no modelo de dosagem da atividade mieloperoxidase em patas de camundongos estimuladas com carragenina (100 pg/pata). A substância LASSBio-1425 foi administrada por via oral nas respectivas doses em suspensão de goma arábica 5% 1h antes do estímulo com carragenina. 5h após o estímulo os tecidos foram retirados para avaliação. Os resultados são expressos em n° de neutrófilos / mg. de tecido cutâneo plantar, n = 4-5 animais, * p<0,05; (teste “t” de Student) comparados com o grupo controle.Five hours after inflammatory stimulation by intraplantar injection of carrageenan (100 pg / paw), the animals were sacrificed, the plantar skin tissues were removed. Samples were homogenized in 500μΙ of appropriate buffer containing protease inhibitors. TNF-α levels were determined by ELISA. LASSBio-1425 was able to inhibit TNF-α production in carrageenan-stimulated inflamed plantar tissue, thereby reducing the production of this proinflammatory cytokine at the site of inflammation, reducing the inflammatory process and the hyperalgesic process. Figure 1 shows graph 1 depicting the effect of LASBio-1425 on TNF-α production following intraplantar carrageenan injection. LASSBio-1425 was administered orally in 5% gum arabic suspension at a dose of 100 pmol / kg, 1h before stimulation with 100 pg / paw carrageenan. 5 h after stimulation the tissues were removed for TNF-α dosage by ELISA. Results are expressed as TNF-α production (pg / ml) ± SEM, n = 4 animals, * p <0.05; # p <0.001; (Student's t-test), compared with the control and saline groups respectively. EXAMPLE 7: Inhibitory Action of LASSBIO-1425 on CARRAGENIN-INDUCED MECHANICAL Hypernociception It is known that administration of intraplantar carrageenan (100 pg / paw) in mice induces mechanical hypernociception by the release of a sequence-defined cytokine cascade by cells. resident or migratory. The first cytokine to be released is TNF-α (CUNHA et al, 2005). Thus, in order to evaluate the participation of LASSBio-1425 on the production of these cytokines, the activity of this phenylpyrazole derivative was studied in the carrageenan induced mechanical hypernociception model. LASSBio-1425 at doses of 100 and 300 pmol / kg was able to inhibit carrageenan-induced mechanical hypernociception. Figure 2 shows the graph depicting the temporal antihypernociceptive effect of LASSBio-1425 in the 100 pg / paw carrageenan-induced mechanical hypernociception model. LASSBio-1425 was administered orally in 5% gum arabic suspension at the respective doses, 1h before stimulation. Results are expressed as Δ withdrawal threshold (g) ± SEM, n = 10 animals, ** p <0.01; *** p <0.001; (One-way ANOVA test, Bonferroni post test), compared with the control group. EXAMPLE 8: Inhibitory Action of LASSBio-1425 on Cell Migration in CARRAGENIN-INDUCED MECHANICAL HYPERNOCICEPTION MODEL. LASSBLO-1425 ANTI-INFLAMMATORY EFFECT Intraplantar administration of carrageenan (100 pg / paw) in mice is capable of inducing inflammation and the hypernociceptive phenomenon. It is also known that the administration of this same agent is able to induce the migration of neutrophils that support the mentioned phenomena (POSADAS et al, 2004; CUNHA et al., 2005). Therefore, the ability of LASSBio-1425 to inhibit neutrophil migration in the paws of mice submitted to carrageenan stimulation was evaluated by an indirect measure through the measurement of myeloperoxidase activity in the plantar skin tissues. Carrageenan administration promoted an increase in myeloperoxidase activity, which is inhibited by prior administration of the substance LASSBio-1425 when administered orally at doses of 100 pg / kg and 300 pg / kg. Figure 3 shows graph 3 showing the effect of LASSBio-1425 on neutrophil migration in the myeloperoxidase activity dosing model in carrageenan-stimulated mouse paws (100 pg / paw). LASSBio-1425 was administered orally at the respective doses in gum arabic suspension 5% 1h before carrageenan stimulation. 5h after stimulation the tissues were removed for evaluation. Results are expressed as neutrophil number / mg. of plantar cutaneous tissue, n = 4-5 animals, * p <0.05; (Student's t-test) compared with the control group.

EXEMPLO 9: AÇÃO INIBITÓRIA DE LASSBIO-1425 SOBRE A HIPERNOCICEPÇÃO MECÂNICA INDUZIDA POR TNF-A A injeção intraplantar de TNF-a (1 ng/pata), promove efeito hipernociceptivo nas primeiras horas. Uma hora após a injeção de TNF-α pode-se observar um efeito hipernociceptivo, na terceira hora após o estímulo este efeito atingiu um pico de atividade e na quinta hora houve um decaimento da mesma. Foi avaliado o efeito de LASSBio-1425 sobre a hipernocicepção mecânica induzida por TNF-α com o intuito de investigar a participação deste derivado fenilpirazólico sobre a cascata de citocinas envolvida no processo hipernociceptivo. LASSBio-1425 foi capaz de inibir a hipernocicepção induzida porTNF-α nas três primeiras horas do ensaio. A figura 4 mostra o Gráfico onde é mostrado o efeito anti-hipernociceptivo temporal de LASSBio-1425 no modelo de hipernocicepção mecânica induzida por TNF-α (1ng/pata). A substância LASSBio-1425 foi administrada por via oral em suspensão de goma arábica 5% na dose de 100 pmol/kg, 1h antes do estímulo com TNF-α. Os resultados são expressos em Δ do limiar de retirada (g) ± EPM, n - 10 animais, * p<0,05; *** p<0,001; (teste ANOVA One-way, post test Bonferroni), comparados com o grupo controle. EXEMPLO 10: Ação INIBITÓRIA DE LASSBIO-1425 sobre a hipernocicepção MECÂNICA INDUZIDA POR KC (QUIMIOCINA DERIVADA DE QUERATINÓCITO) A injeção intraplantar de KC (10 ng/pata) na pata de camundongos promove uma hipernocicepção térmica na terceira hora de ensaio mantendo este efeito até a quinta hora. LASSBio-1425 administrado por via oral na dose de 100 pmol/kg foi capaz de inibir a hipernocicepção térmica induzida por KC a partir da terceira hora de ensaio. A figura 5 mostra o gráfico onde é representado o efeito anti-hipernociceptivo temporal de LASSBio-1425 no modelo de hipernocicepção mecânica induzida por KC (10 ng/pata). A substância LASSBio-1425 foi administrada por via oral em suspensão de goma arábica 5% na dose de 100 pmol/kg, 1h antes do estímulo. Os resultados são expressos em Δ do limiar de retirada (g) ± EPM, n = 10 animais, ** p<0,01; *** p<0,001; (teste ANOVA One-way, post test Bonferroni), comparados com o grupo controle.EXAMPLE 9: INHIBITORY ACTION OF LASSBIO-1425 ON TNF-A-MECHANICAL MECHANICAL HYPERNOCICEPTION Inplantar injection of TNF-a (1 ng / paw) promotes a hypernociceptive effect in the first hours. One hour after TNF-α injection a hypernociceptive effect can be observed, in the third hour after stimulation this effect reached a peak of activity and in the fifth hour there was a decay of it. The effect of LASSBio-1425 on TNF-α induced mechanical hypernociception was evaluated in order to investigate the participation of this phenylpyrazolic derivative on the cytokine cascade involved in the hypernociceptive process. LASSBio-1425 was able to inhibit TNF-α-induced hypernociception in the first three hours of the assay. Figure 4 shows the Graph showing the temporal antihypernociceptive effect of LASSBio-1425 in the TNF-α induced mechanical hypernociception model (1ng / paw). LASSBio-1425 was administered orally in a 5% gum arabic suspension at a dose of 100 pmol / kg 1h before stimulation with TNF-α. Results are expressed as Δ withdrawal threshold (g) ± SEM, n - 10 animals, * p <0.05; *** p <0.001; (One-way ANOVA test, Bonferroni post test), compared with the control group. EXAMPLE 10: LASSBIO-1425 INHIBITORY ACTION ON MECHANIC KC-INDUCED MECHANICAL Hypernociception (KERATINOCYTE-DERIVED CHEMOCYCIN) Intraplantar injection of KC (10 ng / paw) in the paw of mice promotes a thermal hypernociception in the third hour of testing by maintaining this thermal effect until the third hour of testing. the fifth hour. Orally administered LASSBio-1425 at a dose of 100 pmol / kg was able to inhibit KC-induced thermal hypernociception from the third hour of testing. Figure 5 shows the graph depicting the temporal antihypernociceptive effect of LASSBio-1425 in the KC-induced mechanical hypernociception model (10 ng / paw). LASSBio-1425 was administered orally in 5% gum arabic suspension at a dose of 100 pmol / kg, 1h before stimulation. Results are expressed as Δ withdrawal threshold (g) ± SEM, n = 10 animals, ** p <0.01; *** p <0.001; (One-way ANOVA test, Bonferroni post test), compared with the control group.

ReivindicaçõesClaims

Claims

1- Bioactive phthalimidic phenyl pyrazolic compounds of the class 2- (1-phenyl-5- (1 H-1-pyrazolyl) -1H-4-pyrazolyl) isoindoline-1,3-dione, characterized in that they have the general formula ( 1): Where: W may be hydrogen, C1-C6 alkyl or cycloalkyl, hydroxyl, methoxy, chlorine, fluorine, bromine, cyano; Z, X and Y may be hydrogen, C1-C6 alkyl or cycloalkyl, trifluoromethyl, phenyl; R1 may be hydrogen, fluorine, chlorine, bromine, methyl, nitro, amino, methoxy, hydroxyl, carboxyl; R2 may be hydrogen, fluorine, chlorine, bromine, methyl, methoxyl, hydroxyl; R3 may be hydrogen, fluorine, chlorine, bromine, methoxyl; R4 may be hydrogen, fluorine, chlorine, bromine.

Process for the preparation of the compounds described in claim 1, characterized in that it comprises the following steps: Nitration of regioselectively suitable 5-chloro-phenyl-1H-pyrazole derivatives with fuming nitric acid in acetic anhydride; B Carbon-nitrogen coupling by aromatic nucleophilic substitution for insertion of the appropriate second pyrazolic nucleus at position 5 of the starting phenyl-1H-pyrazolic nucleus in basic medium using dimethylsulfoxide (DMSO) and tetrahydrofuran (THF) as solvents; C Chemoselective reduction of the nitro group inserted in a step prior to the amino group with metallic iron in acid medium using ethanol and distilled water as solvents; D Coupling with the respective phthalic anhydrides by thermal fusion (130 ° C) to obtain the bipyrazole-isoindolinodionic derivatives, this reaction being performed without the presence of solvents.

The use of the compounds as described in claim 1, characterized in that they are used in drug formulations in different pharmaceutical forms useful, oral or otherwise, for the treatment of painful conditions of various origins and inflammatory, chronic and acute. different natures, whether or not mediated by cytokines, including tumor necrosis factor-alpha (TNF-a).

Pharmaceutical compositions comprising the compounds as defined in claim 1 having at least one pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent.

Use of the pharmaceutical compositions according to claim 4, characterized in that they are used in the preparation of medicaments for the treatment of acute and chronic inflammatory diseases and hyperalgesia in mammals, preferably humans.

Use of the pharmaceutical compositions according to claim 5, characterized in that the inflammatory diseases are degenerative chronic inflammatory diseases, exemplified in rheumatoid arthritis, spondylitis, Crohn's disease, psoriasis, asthma.