BRPI1015499A2

BRPI1015499A2 - enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: construction and use

Info

Publication number: BRPI1015499A2
Application number: BRPI1015499A
Authority: BR
Inventors: Gilvanda Silva Nunes; Jean-Louis Marty
Original assignee: Univ Fed Do Maranhão
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2016-03-01

Abstract

biossensor amperométrico enzimático feito de grafite modificado-fibras de carbono para detecção de agentes de nervos: construção e modo de usar. a presente invenção constitui-se de um biossensor amperométrico que serve para detectar, mediante ensaios de inibição enzimática, com precisão e elevada sensibilidade, concentrações de agentes de nervos em níveis de traços, seja em amostras ambientais ou biológicas. os modos de preparo e uso do biossensor são extremamente simples, e a detecção dos agentes de nervos pode ser realizada tanto em laboratório como diretamente no campo. para construção do biossensor, i nicialmente um precipitado de mbrs foi preparado (1, 2, 3, 4) e, a este, acrescentado o mediador tcnq, pó de grafite (5) e, sequencialmente, hec, parafina liquida, pbs (ph 7,5) e a enzima bsa (6). a enzima ache, previamente imobilizada em pva-sbq (7), foi então adicionada à pasta de grafite modificada (8), e a mistura resultante foi utilizada para preencher um tubo dc polietileno oco, contendo em seu interior fibras de carbono (9), que foram seladas termicamente mas extremidades (10). o contato elétrico foi feito com fio de platina (11) e a extremidade superior do eletrodo polida com papel sulfite (12), antes de ser conectado a um potenciostato (13), juntamente com o eletrodo de referencia (ag/agcl), tendo sido ambos os eletrodos imersos em uma célula eletroquímica (14), na qual foram realizadas as medidas cronoamperométricas.Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for nerve agent detection: construction and mode of use. The present invention is an amperometric biosensor which serves to detect, by enzymatic inhibition assays, with precision and high sensitivity, concentrations of nerve agents at trace levels, either in environmental or biological samples. The modes of preparation and use of the biosensor are extremely simple, and the detection of nerve agents can be performed both in the laboratory and directly in the field. To construct the biosensor, initially a mbrs precipitate was prepared (1, 2, 3, 4) and to this was added the tcnq mediator, graphite powder (5) and sequentially hec, liquid paraffin, pbs (ph 7.5) and the enzyme bsa (6). The ache enzyme, previously immobilized on pva-sbq (7), was then added to the modified graphite paste (8), and the resulting mixture was used to fill a hollow polyethylene tube containing carbon fibers (9). , which have been heat sealed but ends (10). the electrical contact was made with platinum wire (11) and the upper end of the sulfite paper polished electrode (12), before being connected to a potentiostat (13), together with the reference electrode (ag / agcl), having Both electrodes were immersed in an electrochemical cell (14), in which the chronoamperometric measurements were performed.

Description

“BIOS SENSOR AMPEROMÉTRICO ENZIMÁTICO FEITO DE GRAFITE MODIFICADO-FIBRAS DE CARBONO PARA DETECÇÃO DE AGENTES DOS NERVOS: CONSTRUÇÃO E MODO DE USAR” A presente invenção constitui-se em um biossensor amperométrico, com corpo de polietileno preenchido com uma pasta de grafite modificada, contendo uma enzima imobilizada e fibras de carbono, de fácil construção, e elevadas precisão e sensibilidade na detecção, em laboratório ou in loco, de agentes dos nervos.Enzymatic Amperometric Sensor BIOS Made of Modified Graphite-Carbon Fiber for Nerve Agent Detection: Construction and Usage an immobilized enzyme and carbon fibers, easily constructed, and high precision and sensitivity in the detection, in the laboratory or in situ, of nerve agents.

Os agentes dos nervos são utilizados como armas químicas. Fisiologicamente, o efeito tóxico dos agentes dos nervos ocorre pela desativação da enzima acetilcolinesterase (AChE), que controla a transmissão dos impulsos nervosos, e sem esse controle as funções biológicas, como a respiração, param de operar. Quando aplicados em áreas onde se encontram os inimigos, tais agentes provocam sérios distúrbios no Sistema Nervoso Central (SNC), levando ao coma e posteriormente à morte. Os agentes dos nervos pertencem ao grupo dos compostos organofosforados, como o tabun, o soman, o sarin e o vx.Nerve agents are used as chemical weapons. Physiologically, the toxic effect of nerve agents occurs by the deactivation of the enzyme acetylcholinesterase (AChE), which controls the transmission of nerve impulses, and without this control biological functions, such as respiration, stop operating. When applied to areas where enemies are present, such agents cause serious disturbances in the central nervous system (CNS), leading to coma and subsequent death. Nerve agents belong to the group of organophosphate compounds such as tabun, soman, sarin and vx.

Quando a detecção dos agentes dos nervos se dá diretamente no campo, o biossensor deverá ser acoplado a um potenciostato de menor porte. Existem modelos portáteis no mercado, bastante sensíveis e reprodutíveis, que operam com batería. Se a amostra analisada for de água, a medida pode ser feita de forma direta, apenas inserindo a camada sensível do biossensor (que contém a enzima) na água. Se a água for proveniente de um corpo de água corrente, deve-se realizar uma coleta no local e proceder à medida diretamente no frasco de coleta, que deve ser preferencialmente de vidro. O mesmo deve ser feito se a amostra for de outro líquido, como sangue, urina ou outro fluido biológico. Se a amostra for sólida, como por exemplo uma porção de solo ou mesmo parte de um órgão supostamente lesado (fígado, por exemplo), então deve-se proceder a uma extração prévia, simplesmente macerando-se a amostra com tampão «í citrato pH 8,0 e realizando-se em seguida a medida eletroquímica.When nerve agents are detected directly in the field, the biosensor should be coupled to a smaller potentiostat. There are portable models in the market, very sensitive and reproducible, that operate with battery. If the sample is from water, the measurement can be made directly by simply inserting the sensitive biosensor layer (which contains the enzyme) into the water. If the water comes from a body of running water, it should be collected on site and measured directly on the collection bottle, which should preferably be glass. The same should be done if the sample is from another fluid, such as blood, urine or another biological fluid. If the sample is solid, such as a portion of soil or even part of a supposedly damaged organ (liver, for example), then pre-extraction should be done by simply macerating the sample with pH citrate buffer. 8.0 and then the electrochemical measurement.

ESTADO DA TÉCNICATECHNICAL STATE

Os agentes dos nervos são compostos que possuem em sua estrutura um átomo de fósforo central pentavalente, ligado a um átomo de oxigênio ou enxofre por uma dupla ligação. Além dos agentes dos nervos, muitos compostos com poder inseticida são também organofosforados, e possuem o mesmo modo de ação, tanto frente aos mamíferos como frente aos insetos: sua toxicidade é baseada na inibição da enzima AChE, essencial para transmissão de impulsos nervosos. Vários biossensores eletroquímicos para detecção de agentes anticolinesterase têm sido descritos em artigos científicos, a maioria dos quais objetivando a análise de inseticidas organofosforados [1]. Em alguns casos, ao invés da enzima acetilcolinestrease (AChE), foi empregada a enzima butiiilcolinesterase (BChE) como elemento de biorreconhecimento.Nerve agents are compounds that have in their structure a pentavalent central phosphorus atom, attached to an oxygen or sulfur atom by a double bond. In addition to nerve agents, many compounds with insecticidal power are also organophosphate, and have the same mode of action in both mammals and insects: their toxicity is based on inhibition of the enzyme AChE, which is essential for nerve impulse transmission. Several electrochemical biosensors for the detection of anticholinesterase agents have been described in scientific articles, most of them aiming at the analysis of organophosphate insecticides [1]. In some cases, instead of acetylcholinestrease (AChE) enzyme, butylylcholinesterase (BChE) enzyme was used as a biorecognition element.

Algumas patentes de biossensores também têm surgido, como por exemplo a Patente CN101587092 (A), depositada no escritório de patentes chinês em 25/11/2009 [2], que descreve um biossensor serigrafado contendo dois eletrodos de trabalho e um eletrodo de referência compartilhado, sendo que, imobilizada à superfície dos eletrodos de trabalho, encontra-se uma enzima AChE comercial. Dois biossensores para organofosforados foram depositadas nos Estados Unidos: a Patente IL146193 (A) [3], depositada em 31/05/2010, que descreve procedimentos para preparo de biossensores à base de enzimas AChE, imobilizadas covalentemente em superfícies porosas e não-porosas, e a Patente W09829738 A(l) [4], depositada em 09/07/2008, que descreve um procedimento para preparo de um biossensor, tendo como enzimas imobilizadas, além da AChE, a peroxidase e a colina-oxidase.Some biosensor patents have also emerged, such as Patent CN101587092 (A), filed with the Chinese patent office on 11/25/2009 [2], which describes a screen-printed biosensor containing two working electrodes and a shared reference electrode. immobilized to the surface of the working electrodes is a commercial AChE enzyme. Two organophosphate biosensors have been filed in the United States: Patent IL146193 (A) [3], filed May 31, 2010, which describes procedures for preparation of AChE enzyme biosensors, covalently immobilized on porous and nonporous surfaces. , and WO98 / 29738 A (1) [4], filed July 7, 2008, which describes a procedure for preparing a biosensor, having as immobilized enzymes, besides AChE, peroxidase and choline oxidase.

Biossensores à base de enzima aceticolinesterase (AChE) são baseados na inibição enzimática pelo agente tóxico, que pode ser um inseticida ou uma arma química (agente do nervo). Quando a enzima AChE é imobilizada na superfície do eletrodo de trabalho, há interação com o substrato, produzindo uma espécie eletroativa. Nessa estratégia, acetiltiocolina (ATCh) pode substituir o substrato original da AChE, a acetilcolina. Assim, esse novo substrato (ATCh) é hidrolisado da mesma forma como o substrato original, produzindo tiocolina (TCh) e o ácido carboxílico correspondente (ácido? acético, HA, no caso). Os elétrons gerados durante a reação eletroquímica são coletados no potenciostato, e a corrente final é a medida quantitativa da atividade da enzima |5|.Aceticolinesterase (AChE) -based biosensors are based on enzymatic inhibition by the toxic agent, which may be an insecticide or a chemical weapon (nerve agent). When the AChE enzyme is immobilized on the surface of the working electrode, there is interaction with the substrate, producing an electroactive species. In this strategy, acetylthiocholine (ATCh) can replace the original AChE substrate, acetylcholine. Thus, this new substrate (ATCh) is hydrolyzed in the same manner as the original substrate, producing thiocoline (TCh) and the corresponding carboxylic acid (β acetic acid, HA, in this case). The electrons generated during the electrochemical reaction are collected in the potentiostat, and the final current is the quantitative measure of enzyme activity | 5 |.

Os biossensores reportados foram construídos a partir de eletrodos de diferentes materiais, tais como: tubos de vidro ou de plástico, membranas maleáveis de celofane, impregnadas coma enzima e ligadas a um eletrodo metálico conveniente, e eletrodos serigrafados contendo dois eletrodos (de referência e de trabalho) ou três eletrodos (de referência, de trabalho e auxiliar), nos quais a enzima AChE estava imobilizada. As bases para serigrafia variaram desde cerâmica até PVC transparente e maleável.Reported biosensors were constructed from electrodes of different materials, such as glass or plastic tubes, cellophane, enzyme-impregnated membranes attached to a convenient metal electrode, and screen-printed electrodes containing two electrodes (reference and work) or three electrodes (reference, work and auxiliary), in which the AChE enzyme was immobilized. The bases for screen printing ranged from ceramic to transparent and malleable PVC.

Na escolha do material do eletrodo de trabalho deve-se considerar que as respostas obtidas estão relacionadas com as reações redox que ocorrem em sua superfície ou na interface eíetrodo-solução. Desta forma, o analito de interesse pode interagir com a superfície eletródica e tal interação resultar na transferência de elétrons. Eletrodos sólidos como os de platina, ouro, -carbono, níquel, ferro e cobre, que apresentam janela de potencial positiva, têm considerável aplicabilidade em construção de biossensores. Outro tipo de eletrodo sólido que vêm sendo usado com esse mesmo fim é o de diamante dopado com boro (DDB), devido às suas propriedades particulares (extensa janela eletroquímica, grande resistência a vários meios agressivos e baixas correntes capacitivas).In choosing the material of the working electrode it must be considered that the responses obtained are related to the redox reactions that occur on its surface or on the electrode-solution interface. Thus, the analyte of interest can interact with the electrode surface and such interaction results in electron transfer. Solid electrodes such as platinum, gold, carbon, nickel, iron and copper, which have a positive potential window, have considerable applicability in biosensor construction. Another type of solid electrode that has been used for this same purpose is the boron-doped diamond (DDB) due to its particular properties (extensive electrochemical window, high resistance to various aggressive media and low capacitive currents).

Para facilitar o transporte dos elétrons gerados durante a reação da enzima AChE com o substrato (ATCh), da superfície do eletrodo de trabalho até o potenciostato, normalmente são empregados mediadores eletroquímicos. Estes mediadores são considerados os principais modificadores de eletrodos e têm permitido a realização de medidas amperométricas a um potencial de trabalho (fixo) mais baixo, diminuindo assim as interferências eletroquímicas provocadas pelos componentes eletroativos que possam estar presentes na amostra, ou mesmo por pequenas flutuações externas de voltagens (ruído) do instrumento de medição. Como o analito irá interagir diretamente com o agente modificante, os eletrodos quimicamente modificados são mais seletivos e mais sensíveis que os eletrodos-base. Entre os mediadores mais empregados na construção de biossensores de agentes anticolínesterase, destacam-se os corantes Azul da Prússia e ftalocianina de cobalto, (Co-PC) e o composto 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano (TCNQ). A finalidade desses mediadores pode ser perfeilamente compreendida, por exemplo, se prepararmos uma pasta de grafite misturada a um agente aderente (hidroxietilcelulose, gel de ágar, etc.) mais a enzima AChE, e esta pasta preencher um tubo qualquer, no qual no seu interior está inserido um fio de platina, este artefato pode ser considerado um eletrodo de trabalho sensível a compostos organofosforados. Como este eletrodo não contém nenhum mediador eletroquímico, ao ser acoplado a um eletrodo de referência (por exemplo, Ag/AgCl), as medidas de corrente serão tomadas provavelmente a um potencial fixo superior a 800 mV. Contudo, se a esta pasta sensível de grafite for adicionado um pouco do corante Co-PC, então o potencial de trabalho cai para 350 mV [6], e se adicionarmos o mediador TCNQ, o valor de potencial de trabalho chega a 150 mV, resultando em uma extrema vantagem, do ponto de vista analítico [7].To facilitate the transport of electrons generated during the reaction of the enzyme AChE with the substrate (ATCh) from the working electrode surface to the potentiostat, electrochemical mediators are usually employed. These mediators are considered the main electrode modifiers and have allowed amperometric measurements to be made at a lower (fixed) working potential, thus decreasing the electrochemical interference caused by electroactive components that may be present in the sample, or even by small external fluctuations. voltage (noise) of the measuring instrument. Because the analyte will interact directly with the modifying agent, chemically modified electrodes are more selective and more sensitive than base electrodes. Among the mediators most commonly used in the construction of biosensors of anticholinase agents are Prussian Blue and cobalt phthalocyanine (Co-PC) and 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane (TCNQ). The purpose of such mediators can be perfectly understood, for example, if we prepare a graphite paste mixed with an adherent agent (hydroxyethylcellulose, agar gel, etc.) plus the enzyme AChE, and this paste fills any tube, in which in its Inside is a platinum wire, this artifact can be considered a working electrode sensitive to organophosphate compounds. Since this electrode does not contain any electrochemical mediators, when coupled to a reference electrode (eg Ag / AgCl), current measurements are likely to be taken at a fixed potential greater than 800 mV. However, if a bit of Co-PC dye is added to this graphite sensitive paste, then the working potential drops to 350 mV [6], and if we add the TCNQ mediator, the working potential value reaches 150 mV, resulting in an extreme analytical advantage [7].

Biossensores à base da enzima aldeído desidrogenase (AldHE) foram descritos, tendo como mediador eletroquímico uma combinação de Meldola’s Blue com Sal de Reinecke (MBRS). O biossensor foi empregado na detecção de fungicidas ditiocarbamatos, inibidores da AldHE, tendo operado com valor de potencial de zero volts, apresentado elevada estabilidade, porém ainda baixa sensibilidade para análises de traços [8]. Fibras de carbono são filamentos longos e finos (diâmetros entre 5 e 10 pm), compostos em grande parte por átomos de carbono, e têm sido empregadas, com o objetivo de facilitar a transferência e elétrons, em biossensores amperométricos [9]. A técnica de fixação da enzima AChE na superfície do eletrodo de trabalho tem grande influencia sobre o desempenho do biossensor, e varia desde procedimentos físicos até químicos. Dos procedimentos físicos, destacam-se: adsorção em esferas de sílica, em membranas (nylon, nitrato de celulose, acetato de celulose) ou em resinas epóxi, e microencapsulação em géis de poliacrilamida ou de álcool polivinílico contendo grupamentos estirilpiridínicos (PVA-SbQ). Entre os procedimentos químicos, destacam-se a reação cruzada com glutaraldeído e a ligação covalente com resinas, agarose e celulose modificadas e PYC [10]. O procedimento de detecção dos agentes dos nervos se dá pelo monitoramento da corrente gerada pela reação entre a AChE e seu substrato, antes e após inibição enzimática. A inibição ocorre mediante incubação do biossensor em uma solução contendo o inibidor, ou mesmo através do contato deste com uma amostra qualquer, supostamente contaminada com o inibidor. A inibição da enzima por esses compostos tóxicos pode ser calculada em termos percentuais, pela redução da corrente geradâ durante a reação enzimática, após inibição. Assim, a inibição é proporcional à concentração do agente do nervo presente, e pode ser efetuada em amostras líquidas (água, sangue, urina), como também pastosas (alimentos, vegetais, etc.), onde o biossensor pode ser mergulhado.Aldehyde dehydrogenase (AldHE) -based biosensors have been described, using a combination of Meldola's Blue with Reinecke Salt (MBRS) as the electrochemical mediator. The biosensor was used to detect dithiocarbamate fungicides, AldHE inhibitors, and operated with a potential value of zero volts, presenting high stability, but still low sensitivity for trace analysis [8]. Carbon fibers are long thin filaments (diameters between 5 and 10 pm), composed largely of carbon atoms, and have been employed to facilitate transfer and electrons in amperometric biosensors [9]. The technique of AChE enzyme fixation on the working electrode surface has a great influence on the biosensor performance, ranging from physical to chemical procedures. Physical procedures include: adsorption on silica spheres, membranes (nylon, cellulose nitrate, cellulose acetate) or epoxy resins, and microencapsulation in polyacrylamide or polyvinyl alcohol gels containing PYR-SbQ. . Among the chemical procedures, the glutaraldehyde cross reaction and covalent bonding with modified resins, agarose and cellulose and PYC stand out [10]. The procedure for detecting nerve agents is by monitoring the current generated by the reaction between AChE and its substrate, before and after enzymatic inhibition. Inhibition occurs by incubating the biosensor in a solution containing the inhibitor, or even by contacting it with any sample allegedly contaminated with the inhibitor. Inhibition of the enzyme by these toxic compounds can be calculated in percentage terms by reducing the current generated during the enzyme reaction after inhibition. Thus, inhibition is proportional to the concentration of nerve agent present, and can be performed on liquid samples (water, blood, urine) as well as pasty (foods, vegetables, etc.) where the biosensor can be dipped.

PONTOS DEFICIENTES DO ESTADO DA TÉCNICADEFICIENT POINTS OF TECHNICAL STATE

Podemos destacar, como inconvenientes analíticos da maior parte dos biossensores enzimáticos, a falta de reprodutibilidade, seja pela perda da atividade da AChE ao longo do tempo de armazenagem, seja pelo processo de imobilização da enzima na superfície do eletrodo. Na prática, verifica-se que ocorrem modificações na camada enzimática do biossensor, e isto está diretamente relacionado ao processo de imobilização da AChE e à seleção do mediador eletroquímico. Além disso, a sensibilidade dos biossensores citados na literatura, e mesmo os patenteados até hoje, é ainda é muito baixa para análises de traços.We can highlight, as analytical drawbacks of most enzymatic biosensors, the lack of reproducibility, either by the loss of AChE activity over the storage time, or by the enzyme immobilization process on the electrode surface. In practice, it appears that changes in the biosensor enzyme layer occur, and this is directly related to the immobilization process of AChE and the selection of the electrochemical mediator. Moreover, the sensitivity of biosensors cited in the literature, and even patented to this day, is still too low for trace analysis.

OBJETIVOS E ATIVIDADE INVENTIVA DO BIOSSENSOR O biossensor apresentado é construído à base da enzima AChE, que pode ser tanto comercial quanto geneticamente modificada, imobilizada em um eletrodo de grafite modificado com uma mistura de TCNQ e Meldola’s Blue Sal de Reinecke (MBRS). A pasta sensível serve para preencher um tubo de polietileno, já contendo fibras de carbono, e este tubo se constituiu em um eletrodo de trabalho de grafite modifícado-fihra de carbono. O procedimento diferenciado de imobilização enzimática se constitui em uma novidade no campo dos biossensores, pois combina o microencapsulamento da AChE em PVA-SbQ e a dispersão desta matriz poliméríca sensível em tomo de microfibras de carbono. Também, a combinação TCNQ-MBRS permite se trabalhar com valores de potencial de trabalho bem baixos, o que é desejável eletroquimicamente. O objetivo final foi melhorar a estabilidade e a sensibilidade dos biossensores para detecção dos agentes de nervo em níveis de sub-partes por bilhão.OBJECTIVES AND INVENTIVE BIOSSENSOR ACTIVITY The biosensor presented is built on the AChE enzyme, which can be either commercially or genetically modified, immobilized on a modified graphite electrode with a mixture of TCNQ and Meldola's Blue Salt of Reinecke (MBRS). The sensitive paste is used to fill a polyethylene tube already containing carbon fibers, and this tube was a carbon-modified graphite working electrode. The differentiated procedure of enzymatic immobilization is a novelty in the field of biosensors, since it combines the microencapsulation of AChE in PVA-SbQ and the dispersion of this sensitive polymer matrix around carbon fibers. Also, the TCNQ-MBRS combination allows working with very low work potential values, which is desirable electrochemically. The ultimate goal was to improve the stability and sensitivity of biosensors for nerve agent detection at sub-parts per billion levels.

Em relação às características eletroquímicas do biossenssor, este operou em valor de potencial de trabalho bastante baixo (cerca de 60 mV), e apresentou excelente reprodutibilidade, com valor médio de corrente, obtida durante as medidas cronoamperométricas da reação enzimática entre a AChE e solução de ATCh 1,0 mmol/L, em tomo de 152 nA. As medidas cronoamperométricas (medida da corrente gerada ao longo do tempo) foram realizadas em célula de vidro de 10 mL de capacidade, onde nesta estava mergulhado o eletrodo de trabalho e o de referência. O coeficiente de variação foi de 6,3% (n=12), para eletrodos recém-preparados.Regarding the electrochemical characteristics of the biosensor, it operated at a very low work potential value (about 60 mV), and presented excellent reproducibility, with average current value obtained during the chronoamperometric measurements of the enzymatic reaction between AChE and solution. ATCh 1.0 mmol / L, around 152 nA. Chronoamperometric measurements (measurement of current generated over time) were performed in a 10 mL capacity glass cell, where the working and reference electrodes were immersed. The coefficient of variation was 6.3% (n = 12) for freshly prepared electrodes.

Os ensaios de inibição com os biossensores foram realizados mediante medida inicial da corrente gerada conforme acima, seguida de incubação do eletrodo em uma solução do agente de nervo Sarin (um conhecido organofosfato extremamente tóxico de nome metilfosfonofluoridrato de orto-isopropila, CAS 107-44-8). Em seguida, procedeu-se a nova medida de corrente e cálculo do percentual de inibição relativa. O ensaio de inibição foi realizado em concentrações crescentes do agente de nervo. A resposta inibitória foi linear entre 1,0x10'9 mol/L e 3,5x10'6 mol/L de Sarin (η = 11, r = 0,9976), que equivale a uma faixa de 0,14 a 490 pg/L do agente do nervo. O limite de detecção, considerando uma inibição relativa de 10% em presença do agente de nervo Sarin, foi de 1,9x 10'8 mol/L (ou 2,7 pg/L).Inhibition assays with biosensors were performed by initial measurement of the current generated as above, followed by incubation of the electrode in a solution of the Sarin nerve agent (a known highly toxic ortho-isopropyl methylphosphonofluorhydrate, CAS 107-44- 8). Then, the current was measured and the relative inhibition percentage was calculated. The inhibition assay was performed at increasing nerve agent concentrations. The inhibitory response was linear between 1.0x10'9 mol / L and 3.5x10'6 mol / L Sarin (η = 11, r = 0.9976), which equals a range of 0.14 to 490 pg / L of the nerve agent. The limit of detection, considering a relative inhibition of 10% in the presence of the Sarin nerve agent, was 1.9x108 mol / L (or 2.7 pg / L).

Em relação à estabilidade dos biossensores, estes puderam ser armazenados em geladeira (4°C), em recipiente fechado e livre de umidade, por cerca de 3 meses, com perda de apenas 13% aproximadamente da atividade enzimática. O biossensor aqui descrito é altamente reprodutível, devido à facilidade no preparo em macroescala e ao fato de operar em condições eletroquímicas favoráveis (baixíssimo potencial de trabalho, ausência de ruídos detectáveis). Manteve-se também estável, por um período de armazenamento relativamente longo (3 meses), sem perda considerável da atividade enzimática. Além disso, sua sensibilidade bastante elevada, aliada à capacidade de ser portátil, desde que acoplado a um potenciostato pequeno, lhe confere atributos para detecção dos agentes dos nervos em níveis de traços, diretamente no campo. Esta pode vir a se constituir em uma potencial ferramenta, em casos de invasões por países inimigos, pois as armas químicas são, para grupos de terroristas e indivíduos isolados, uma alternativa viável às armas convencionais. Com esse biossensor, é possível detectar em poucos minutos a presença dos agentes dos nervos e tomar as decisões cabíveis.Regarding the stability of the biosensors, they could be stored in a refrigerator (4 ° C), in a closed and moisture-free container, for about 3 months, with only approximately 13% loss of enzymatic activity. The biosensor described here is highly reproducible due to the ease of macroscale preparation and the fact that it operates under favorable electrochemical conditions (very low working potential, no detectable noise). It was also stable for a relatively long storage period (3 months) without considerable loss of enzyme activity. In addition, its very high sensitivity, coupled with its ability to be portable, as long as coupled with a small potentiostat, gives it attributes for detecting nerve agents at trace levels directly in the field. This may become a potential tool in case of invasions by enemy countries, because chemical weapons are a viable alternative to conventional weapons for terrorist groups and isolated individuals. With this biosensor, it is possible to detect the presence of nerve agents within minutes and make appropriate decisions.

PROCEDIMENTO DE PREPARO DO BIOSSENSOR A invenção passará a ser descrita a seguir, com referência a todos os passos para dbtenção e uso do biossensor, bem como alternativas para a sua construção, e também com referência aos desenhos apensos, nos quais: A Figura 1 ilustra as etapas de preparo da pasta de grafite modificada simultaneamente com dois mediadores eletroquímicos, e contendo a enzima AChE. A Figura 2 ilustra o preparo do eletrodo de carbono, construído a partir da fixação de fibras de carbono na pasta de grafite modificado, dentro de um tubo cilíndrico de polietileno.BIOSSENSOR PREPARATION PROCEDURE The invention will now be described with reference to all steps for designing and using the biosensor, as well as alternatives for its construction, and also with reference to the accompanying drawings in which: Figure 1 illustrates the steps of preparing the modified graphite paste simultaneously with two electrochemical mediators, and containing the AChE enzyme. Figure 2 illustrates the carbon electrode preparation, constructed from the attachment of carbon fibers to the modified graphite pulp, within a cylindrical polyethylene tube.

Preparo da Pasta Enzimática misturada a Grafite Modificado (Figura 1) 1. Preparo do compósito MBRS: dissolveu-se, separadamente, entre 0,5 e 1,0 mmol do sal de Reinecke em um volume de água deionizada entre 40 e 80 mL, e entre 0,5 e 1,0 mmol de MB em um volume de água deionizada entre 40 e 80 mL. Em seguida, as duas soluções foram misturadas, e o precipitado MBRS foi mantido em contato com a soluçâo-mãe durante 5 dias para envelhecimento (1). Após filtração a vácuo em funil de Bückner (2) e repetidas lavagens com água deionizada, o precipitado negro foi seco em estufa por 12 h em uma temperatura entre 50 e 60 °C (3). Em seguida, foi finamente pulverizado em gral de ágata e guardado ao abrigo da luz por 2 a 3 meses (4). 2. Preparo da Pasta de Grafite 'Modificado: Pesou-se uma massa de 0,5 g de grafite em pó, finamente pulverizado (passando 100% na peneira de malha de 0,15 mm). Separadamente, adicionou-se o compósito MBRS ao TCNQ (proporção 1:1), e em seguida juntou-se essa mistura ao grafite (proporção grafite:MBRS/TCNQ de 20:80). Macerou-se em gral de ágata, homogeneizando-se bem a mistura de pós (5). Em seguida, transferiu-se a mistura para um béquer de 5mL e adicionou-se, seqüencialmente, 250pL de uma solução de hidroxietilcelulose (HEC) a 3% (m/v), 250 pL de parafina líquida ultrapura, 500 pL de solução tampão fosfato (PBS, pFI 7,5) e 250 pL de solução da enzima soroalbumina bovina (BSA) 0,3% (m/v) (6). Flomogeneizou-se bem a pasta e deixou-se repousar, em vidro âmbar fechado, por cerca de 3 horas. 3. Preparo da Pasta Enzimática: Preparou-se uma mistura de solução da enzima AChE com um gel de álcool polivinílico contendo grupamentos estirilpiridínicos (PVA-SbQ), na proporção AChE-PVA-SbQ de 20:80 (m/m) (7). Partiu-se de ■1 uma solução estoque entre 200 e 300 U/mL, sendo esta atividade relativa monitorada pelo método espectrofotométrico descrito na literatura [8]. A pasta pode ser armazenada por no máximo 3 horas em geladeira, antes do uso na construção dos biossensores, com perda máxima da atividade enzimática de 8 a 10%. Imediatamente antes do preparo do eletrodo, a pasta de grafite modificado foi misturada à pasta enzimática, na proporção 2:1 (8).Preparation of Modified Graphite Mixed Enzyme Paste (Figure 1) 1. Preparation of MBRS composite: between 0.5 and 1.0 mmol of Reinecke salt was dissolved separately in a volume of deionized water between 40 and 80 mL, and between 0.5 and 1.0 mmol MB in a volume of deionized water between 40 and 80 mL. Then the two solutions were mixed, and the MBRS precipitate was kept in contact with the mother solution for 5 days for aging (1). After vacuum filtration on a Bückner funnel (2) and repeated washes with deionized water, the black precipitate was oven dried for 12 h at a temperature between 50 and 60 ° C (3). It was then finely sprayed on agate and stored in the dark for 2 to 3 months (4). 2. Preparation of Modified Graphite Paste: A mass of 0.5 g finely pulverized graphite powder was weighed (passing 100% in the 0.15 mm mesh sieve). Separately, the MBRS composite was added to the TCNQ (1: 1 ratio), and then added to the graphite (20:80 graphite: MBRS / TCNQ ratio). It was macerated in agate, mixing the powder mixture well (5). The mixture was then transferred to a 5mL beaker and 250pL of a 3% (w / v) hydroxyethylcellulose (HEC) solution, 250pL of ultrapure liquid paraffin, 500pL of buffer solution were added sequentially. phosphate (PBS, pFI 7.5) and 250 µl 0.3% (w / v) bovine serum albumin (BSA) enzyme solution (6). The paste was well shaped and allowed to stand in closed amber glass for about 3 hours. 3. Enzyme Paste Preparation: A mixture of the AChE enzyme solution was prepared with a polyvinyl alcohol gel containing styryl pyridine groups (PVA-SbQ), in the 20:80 (w / w) AChE-PVA-SbQ ratio (7 ). A stock solution between 200 and 300 U / mL was started from ■ 1, and this relative activity monitored by the spectrophotometric method described in the literature [8]. The paste can be stored for a maximum of 3 hours in a refrigerator before use in the construction of biosensors, with a maximum loss of enzymatic activity of 8 to 10%. Immediately prior to electrode preparation, the modified graphite paste was mixed with the enzymatic paste in a 2: 1 ratio (8).

Preparo do Biossensor (Figura 2) 4. Preparo do biossensor: O eletrodo foi construído com 30 fibras de carbono (de marca japonesa Toray T-700), que foram inseridas dentro de um tubo de polietileno oco de 6 mm de diâmetro interno e 3 cm de comprimento, com fundo tampado. Os espaços entre as fibras de carbono foram preenchidos com a pasta enzimática, até que todo o tubo estivesse preenchido (9). Deixou-se cerca de 5 mm de fibras de carbono expostas, selando-se em seguida a junção por aquecimento (10). O contato elétrico foi' feito com fio de platina inserido no centro do eletrodo (11). A parte superior do eletrodo foi em seguida polida cuidadosamente com auxílio de papel sulfite, em movimentos manuais circulares (12), tratado eletroquimicamente em potencial fixo de + 800 mY por 20 segundos e imerso em solução tampão fosfato (pll 7,5) por aproximadamente 20 minutos, antes do uso. Em cada biossensor, a atividade relativa ideal esteve na faixa de 1,0 a 2,0 mU/eletrodo. 5. Acoplamento do Biossensor ao Potenciostato: Foi feita mediante uso de um conector comum (13), interligando o eletrodo de trabalho acima descrito e o eletrodo de referência (no caso, optou-se por um eletrodo de Ag/AgCl) ao potenciostato, ambos inseridos em uma mesma célula de 10 mL de capacidade (14). Dependendo das dimensões do potenciostato/galvanostato, o biossensor é facilmente transportado para o campo, permitindo análises in loco. Assim, o biossensor constituir-se-á de um dispositivo eletrônico portátil e de baixo custo.Biosensor Preparation (Figure 2) 4. Biosensor Preparation: The electrode was constructed of 30 carbon fibers (Japanese brand Toray T-700), which were inserted into a 6 mm hollow polyethylene tube 3 cm long, with covered bottom. The spaces between the carbon fibers were filled with the enzymatic paste until the entire tube was filled (9). About 5 mm of exposed carbon fibers were left, and the heat sealing (10) was then sealed. The electrical contact was made with platinum wire inserted in the center of the electrode (11). The upper part of the electrode was then carefully polished with the aid of sulfite paper in circular hand motions (12), electrochemically treated at + 800 mY fixed potential for 20 seconds and immersed in phosphate buffer solution (pll 7.5) for approximately 20 minutes before use. In each biosensor, the ideal relative activity ranged from 1.0 to 2.0 mU / electrode. 5. Biosensor Coupling with Potentiostat: It was made using a common connector (13), connecting the working electrode described above and the reference electrode (in this case, an Ag / AgCl electrode) was chosen to the potentiostat. both inserted into the same 10 mL capacity cell (14). Depending on the potentiostat / galvanostat dimensions, the biosensor is easily transported to the field, allowing on-site analysis. Thus, the biosensor will be a portable and inexpensive electronic device.

MODO DE USO DO BIOSSENSOR 1. Armazenamento: os biossensores podem ser armazenados em geladeira, em recipiente livre da umidade e ao abrigo da luz. 2. Medidas Eletroquímicas e Ensaios de Inibição: Para obtenção da corrente *1 inicial, o potencial de trabalho foi fixado em 60 mV. O eletrodo de trabalho de grafite modificado-fibras de grafite, contendo a enzima AChE, foi acoplado ao potenciostato, juntamente com o eletrodo de referência, tendo sido ambos imersos em uma célula de trabalho contendo a solução do substrato (cloreto de acetiltiocolina, ATChCl, 1,0 mmol/L), sob agitação constante. A corrente gerada foi estabilizada (o tempo total para estabilização foi de 30 segundos) e o valor (em nA) registrado. Esta medida foi denominada de I0. Em seguida, o potenciostato foi desligado e o eletrodo foi lavado com PBS, pH 7,5, (com cuidado, para não molhar os contatos elétricos), e logo em seguida, imersa a base sensível do eletrodo na solução ou amostra contendo o agente de neivo. Seguiu-se à incubação da enzima com o inibidor por 12 minutos e, findo esse tempo, procedeu-se a uma nova lavagem do sensor com PBS, pH 7,5. O potenciostato foi novamente ligado, e então nova medida de corrente foi registrada, após imersão da parte inferior sensível do eletrodo na solução do substrato (ATChCl 1,0 mmol/L). Esta nova medida foi denominada de I. Pode-se obervar um decréscimo da corrente, após inibição, e a inibição relativa (IR %) é, portanto, proporcional à concentração do agente de nervo. 3, Análise Qualitativa: a presença de um inibidor da enzima AChE pode ser evidenciada pelo decréscimo da corrente observada no ensaio de inibição anteriormente descrito. 4. Análise Quantitativa: Desde que se tenha uma indicação do composto que está causando a inibição, o teor exato deste poderá ser determinado através da extrapolação do valor de IR% encontrado, em uma curva padrão construída a partir dos valores de inibição obtidos em crescentes concentrações do inibidor.BIOSSENSOR INSTRUCTIONS FOR USE 1. Storage: Biosensors may be stored in a refrigerator, moisture-free container and protected from light. 2. Electrochemical Measurements and Inhibition Tests: To obtain the initial current * 1, the working potential was set at 60 mV. The graphite-modified graphite fiber working electrode containing the AChE enzyme was coupled to the potentiostat, together with the reference electrode, and both were immersed in a working cell containing the substrate solution (acetylthiocoline chloride, ATChCl, 1.0 mmol / l) under constant stirring. The generated current was stabilized (the total stabilization time was 30 seconds) and the value (in nA) recorded. This measure was called I0. Then the potentiostat was turned off and the electrode was washed with PBS, pH 7.5 (carefully not to wet the electrical contacts), and then immediately immersed the sensitive base of the electrode in the solution or sample containing the agent. of neivo. The enzyme was incubated with the inhibitor for 12 minutes and after that time the sensor was rinsed again with PBS, pH 7.5. The potentiostat was reconnected, and then a new current measurement was recorded after immersion of the sensitive bottom of the electrode in the substrate solution (ATChCl 1.0 mmol / L). This new measurement was called I. A decrease in current can be observed after inhibition, and relative inhibition (RI%) is therefore proportional to nerve agent concentration. 3, Qualitative Analysis: The presence of an AChE enzyme inhibitor can be evidenced by the decrease in current observed in the inhibition assay described above. 4. Quantitative Analysis: Provided there is an indication of the compound causing the inhibition, the exact content of this compound can be determined by extrapolating the IR% value found in a standard curve constructed from the inhibition values obtained in crescents. inhibitor concentrations.

ALTERNATIVAS PARA CONSTRUÇÃO DO BIOSSENSOR 1. Corpo do Biossensor: ao invés de ser de polietileno, poderá ser constituído de um tubo de vidro ou de cobre. As dimensões do tubo de polietileno também podem ser variadas. 2. Enzima AChE: a enzima acetilcolinesterase a ser imobilizada no eletrodo de trabalho pode ser obtida comercialmente (proveniente de diferentes fontes, tais como enguia elétrica, eritrócito bovino, soro bovino, soro eqüino, sangue humano, etc.); pode ser geneticamente modificada (como é o caso das enzimas *1 AChE extraídas da mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster, e posteriormente modificadas geneticamente em laboratório) [7], ou pode ser proveniente da extração direta a partir de encéfalos de ratos albinos adultos, segundo metodologia previamente descrita [11]. De todas as formas, a atividade relativa (em U/mL) da solução de AChE a ser incorporada na pasta deverá ser controlada, de forma a manter sempre a mesma atividade de enzima, em cada eletrodo. 3. Carga Enzimática no Eletrodo: pode variar de 0,5 a 20 mU/eletrodo. 4. Fibra de carbono: as fibras de carbono podem ser da marca Toray T-800H, em substituição à Toray T-700, do mesmo fabricante, sem grande modificação na resposta do sensor. Esta última é relativamente mais cara, por ter diâmetro mais fino. 5. Contato elétrico: pode-se substituir o fio de platina por fio de ouro (Au) ou de cobre (Cu), sendo que este último deverá ser recoberto com pasta de carbono condutora, de elevada rigidez (o fio de Cti revestido pode ser da marca Leit-C condutive carbon cement, do fabricante Neuhauer Chemikalien, Miinster, Alemanha). 6. Eletrodo de referência: o eletrodo de Ag/AgCl pode ser substituído pelo eletrodo de calomelano saturado (ECS). 7. Substrato Enzimático: além da acetiltiocolina (ATCh), podem ser empregados outros substratos eletroativos, tais como acetilcolina (ACh), butirilcolina (BCh) e butiriltiocolina (BTCh), em variadas concentrações.BIOSSENSOR BUILDING ALTERNATIVES 1. Biosensor Body: Instead of being made of polyethylene, it may consist of a glass or copper tube. The dimensions of the polyethylene pipe can also be varied. 2. AChE Enzyme: The enzyme acetylcholinesterase to be immobilized on the working electrode can be obtained commercially (from different sources such as electric eel, bovine erythrocyte, bovine serum, equine serum, human blood, etc.); can be genetically modified (as is the case with * 1 AChE enzymes extracted from fruit fly, Drosophila melanogaster, and later genetically modified in the laboratory) [7], or may come from direct extraction from albino rat brains adults, according to previously described methodology [11]. In any case, the relative activity (in U / mL) of the AChE solution to be incorporated into the paste should be controlled to always maintain the same enzyme activity at each electrode. 3. Enzyme Electrode Charge: may range from 0.5 to 20 mU / electrode. 4. Carbon Fiber: Carbon fibers can be Toray T-800H brand replacing Toray T-700 from the same manufacturer without major modification in sensor response. The latter is relatively more expensive because it has a thinner diameter. 5. Electrical contact: platinum wire may be replaced by gold (Au) or copper (Cu) wire, the latter shall be covered with high-stiff conductive carbon paste (coated Cti wire may be of the Leit-C conducive carbon cement brand, from the manufacturer Neuhauer Chemikalien, Miinster, Germany). 6. Reference electrode: Ag / AgCl electrode can be replaced by saturated calomel electrode (ECS). 7. Enzymatic Substrate: In addition to acetylthiocoline (ATCh), other electroactive substrates such as acetylcholine (ACh), butyrylcholine (BCh) and butyrylthiocoline (BTCh) may be employed in varying concentrations.

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Claims

1. Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: Construction and method of use, characterized in that it consists of two working electrodes (carbon fiber modified graphite) (9,10) and another reference (Ag / AgCl or calomel) (14).

Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: Construction and method of use according to Claim 1, characterized in that it has the enzyme AChE as a biorecognition element in the working electrode. (7, 8), whose final enzymatic charge is in the range of 0.5 to 20 mU / electrode.

Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: Construction and method of use according to claim 2, characterized in that it accepts both commercial enzymes as the source of the enzyme AChE (7). (extracted from various matrices, such as electric eel, bovine serum, equine serum, human blood), as derived from rat and fruit fly extracts (Drosophila melanogaster), which may be both original and genetically modified enzymes. .

Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: Construction and method of use according to Claim 3, characterized in that the enzyme AChE is immobilized on a PVA-SbQ polymeric gel. (7), and the ratio of AChE-PVA-SbQ solution can range from 80:20 to 60:40.

Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon-fiber graphite for nerve agent detection: Construction and method of use according to claim 4, characterized in that it is a carbon matrix formed of graphite modified with the mixture of Meldola's precipitate. Reinecke Blue-Salt (MBRS) <1 (1: 1 ratio) and a second electrochemical mediator, 7,7,8,8-tetracyanoquinodimethane (TCNQ) (1, 2, 3, 4, 5).

Enzymatic amperometric biosensor made of carbon fiber modified graphite for nerve agent detection: Construction and method of use according to one of claims 1 to 5, characterized in that it contains in the electrode formed of MBRS-modified graphite paste TCNQ, a sufficient amount of hydroxyethylcellulose and liquid paraffin to provide the binding point, a certain amount of bovine serum albumin enzyme sufficient to aid in immobilization of AChE, and a certain amount of phosphate buffer solution to maintain the pH at a range 7.5-8.0 (6).

Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for the detection of nerve agents: Construction and method of use according to one of Claims 1 to 6, characterized in that it has a hollow polyethylene tube as its working electrode. of varying dimensions, with one end closed, filled with modified graphite paste and carbon fibers (9,10), where: the amount of fibers varies from 30 to 60 depending on the inside diameter of the tube and the thickness of the fiber).

Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: Construction and method of use according to claims 1 to 7, characterized in that the electrode is easily connected to an electrochemical system (potentiostat / galvanostat) ) by means of simple metal electrical connections such as platinum, copper or gold wire (11).

Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection according to claims 1 to 8, characterized in that it is the working electrode connected to the electrochemical system together with a reference electrode (13).

Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for nerve agent detection: Construction and method of use according to claims 1 to 9, characterized in that it allows connection with any type of reference electrode, for example. Ag / AgCl and calomel (14).

Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for the detection of nerve agents according to claims 1 to 10, characterized in that it operates by means of chronoamperometric measurements (current formed as a function of time), where: to be monitored is that generated during the reaction between the enzyme AChE, contained in the carbon-modified-carbon electrode (7, 8, 9), and the enzyme substrate, which may be acetylcholine (ACh), acetylthiocoline (ATCh), butyrylcholine (BCh) and butythylthiocholine (BTCh), in varying concentrations; and that: the substrate solution is only found within an electrochemical cell (14) of varying size according to the size of the electrodes; and that the electrodes, during chronoamperometric measurements, are with their sensitive lower layers immersed within the electrochemical cell (14).

Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for the detection of nerve agents: Construction and method of use according to Claims 1 to 11, characterized in that it is capable of detecting organophosphate compounds by inhibition assays by incubation of the working electrode in inhibitor solution or even contaminated sample, followed by recording of the decrease in current generated during enzyme-substrate reaction.

13. Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: Construction and mode of use, characterized in that it allows coupling to a small potentiostat / galvanostat (14), resulting in an ideal portable tool for field measurements.

Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for nerve agent detection: Construction and method of use according to claims 1 to 13, characterized in that it allows screening-type analyzes in liquid and solid samples, in the latter case. proceeding a previous extraction of the analyte.

Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for the detection of nerve agents: Construction and method of use according to claims 1 to 14, characterized in that it allows qualitative analysis by inhibiting AChE, whereby: chronoamperometric measurements can be performed in the laboratory or in the field; 4 inhibition measures should be performed by taking incubation times of AChE with the sample containing the inhibitor, from 10 to 15 minutes, depending on the case; All inhibition tests follow the same protocol, with the following parameters as fixed: substrate type and concentration, enzymatic load on each electrode, enzyme-inhibitor incubation time, expected time for current value stabilization, applied work potential.

Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for nerve agent detection: Construction and method of use according to claims 1 to 15, characterized in that it allows quantitative analysis provided that, having prior knowledge of the nature of the nerve agent employed at the site, an inhibition curve (of inhibitor concentration versus relative inhibition type) is constructed.

17. Enzymatic amperometric biosensor made of modified graphite-carbon fibers for the detection of nerve agents: Construction and method of use, characterized in that it can be stored for about 3 months in a refrigerator (at 4 ° C) with minimal loss ( maximum 13%) of enzymatic activity.

18. Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: Construction and mode of use, characterized by high sensitivity (LD = 2.7 pg / L for Sarin nerve agent) and reproducibility ( CV = 6.3%, n = 12) for freshly prepared electrodes.

19. Enzymatic amperometric biosensor made of modified carbon fiber graphite for nerve agent detection: Construction and mode of use, characterized by allowing industrial application, with production in micro and macro scale.