BRPI1008091B1

BRPI1008091B1 - Métodos para medir a fluorescência de um composto marcador fluorescente, e para identificar um material a granel, e, aparelho

Info

Publication number: BRPI1008091B1
Application number: BRPI1008091-0A
Authority: BR
Inventors: Vincent Brian Croud; Duncan William John McCallien; Ian Stuart Edworthy
Original assignee: Johnson Matthey Plc.
Priority date: 2009-02-03
Filing date: 2010-02-02
Publication date: 2019-07-02
Also published as: CN102308210B; ZA201105696B; WO2010089587A2; AU2010212129B2; CN102308210A; EP2394161B1; EP2394161A2; AU2010212129A1; US8906698B2; CA2750404C; WO2010089587A3; GB0901658D0; BRPI1008091A2; US20120034702A1; CA2750404A1

Abstract

métodos para medir a fluorescência de um composto marcador fluorescente, e para identificar um material a granel, e, aparelho a invenção refere-se a um método de etiquetar um material a granel com um composto marcador fluorescente e, subsequentemente, identificar o composto fluorescente medindo-se sua emissão fluorescente, em que a fluorescência da amostra etiquetada é medida antes de e após extinguir o composto fluorescente, a fim de corrigir a fluorescência medida para o efeito das propriedades fluorescentes inerentes do próprio material a granel. a medição pode ser ainda corrigida para ser responsável pela absorbância do material que é também sabido ter um efeito sobre a fluorescência medida. também é descrito um aparelho para realizar o método.

Description

“MÉTODOS PARA MEDIR A FLUORESCÊNCIA DE UM COMPOSTO MARCADOR FLUORESCENTE, E PARA IDENTIFICAR UM MATERIAL A GRANEL, E, APARELHO”

A presente invenção está envolvida com a medição da fluorescência, em particular com identificação dos compostos fluorescentes presentes em líquido.

O uso de corantes fluorescentes como marcadores ou etiquetas para materiais líquidos e sólidos é bem conhecido. Uma aplicação típica é o etiquetamento de líquidos, tais como combustíveis hidrocarbonados, a fim de identificar o líquido em um subsequente ponto da cadeia de suprimento. Isto pode ser feito por razões operacionais, p. ex., para auxiliar na distinção de um grau de combustível do outro, ou por outras razões, em particular para assegurar a qualidade do combustível, impedir e detectar adulteração e para prover um meio de verificar que o correto imposto foi pago. Além de combustíveis, outros produtos, tais como óleos vegetais, podem ser marcados para identificar o produto produzido em uma fonte particular, ou certificado em um padrão particular.

Um problema com o método de detectar os compostos fluorescentes usados como marcadores, surge quando o material que é marcado interfere com a fluorescência do marcador absorvendo a luz de excitação ou emitida, exibindo sua própria fluorescência de fundo ou mudando as características da fluorescência do marcador. Este é um problema particular na marcação de líquidos coloridos, tais como produtos derivados de petróleo, com corantes fluorescentes. Os líquidos baseados em hidrocarboneto, tais como combustíveis, exibem uma larga emissão fluorescente. O fundo fluorescente tende a adicionar-se a qualquer sinal fluorescente do corante, porém a absorbância inerente do líquido diminui a fluorescência do corante. A marcação de tais combustíveis, especialmente gasolina e diesel, é um importante uso dos compostos marcadores e a capacidade de detectar únicos ou múltiplos compostos marcadores com um alto grau de certeza é crítico para o uso de tais marcadores em tais produtos valiosos e muito difundidos. O problema tem sido tratado de muitas maneiras, a maioria das quais envolve a separação do composto marcador do líquido por meio de extração em um líquido polar ou sobre um absorvente sólido. Por exemplo, a US 5.358.873 descreve e reivindica um método de detectar adulteração de gasolina pela etiquetação com um corante rodamina e então agitar uma pequena amostra do combustível suspeito em um frasco contendo uma pequena quantidade de sílica grau de cromatografia luminosa não ligada. A presença do corante marcador de rodamina na amostra suspeita colore o vermelho de sílica. A US 4.6549.676 descreve um fluido hidrofóbico complexo fluorescentemente rotulado, produzido dissolvendo-se nele uma porfirina. O fluido hidrofóbico complexo fluorescentemente rotulado é identificado por observação da fluorescência característica na irradiação. Para fins de identificação, a porfirina pode ser primeiro extraída em uma solução aquosa ácida, para determinação da fluorescência. A US 2.392.620 descreve o uso de umbeliferona ou um derivativo como um marcador fluorescente para petróleo com detecção por determinação da fluorescência característica após extração em uma solução alcalina aquosa. Na US 4.735.631, os combustíveis são marcados com certas antraquinonas substituídas, que são subsequentemente detectadas em uma amostra marcada de combustível por extração em um reagente alcalino imiscível.

E um objetivo da invenção, prover um método para determinar a presença de um material fluorescente que supere pelo menos parte das desvantagens de tais métodos anteriores.

De acordo com a invenção, foi provido um método para medir a fluorescência de um composto marcador fluorescente dissolvido ou disperso em um material a granel compreendendo as etapas de:

(a) medir uma característica da fluorescência de uma mistura de dito material a granel e dito composto marcador fluorescente;

(b) extinguir a fluorescência do composto marcador fluorescente, para produzir uma mistura extinta;

(c) medir a características da fluorescência da mistura extinta;

(d) comparar a característica fluorescente da mistura com a característica fluorescente da mistura extinta; e (e) corrigir a característica de emissão fluorescente medida quanto aos efeitos da absorbância do material a granel.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, foi provido um aparelho adequado para uso na realização do método de qualquer uma das reivindicações precedentes, dito aparelho compreendendo:

(a) pelo menos uma fonte de luz de excitação, que seja capaz de emitir luz de um comprimento de onda selecionado para ser um comprimento de onda que excite a fluorescência detectável em pelo menos um dos compostos marcadores fluorescentes;

(b) pelo menos um dispositivo de detecção de luz para detectar a luz fluorescente emitida por dito pelo menos um composto marcador fluorescente;

(c) pelo menos uma fonte de luz de absorbância, que seja capaz de emitir luz de um comprimento de onda selecionado para ser um comprimento de onda que não excite fluorescência detectável de qualquer um dos compostos marcadores de fluorescência, mas que seja absorvido pelo material a granel;

(d) pelo menos um dispositivo de detecção de luz para detectar luz emitida por dita fonte de luz de absorbância que é transmitida através da amostra;

(e) meio de processamento de dados para calcular informações requeridas pelo usuário concernentes à fluorescência corrigida da amostra; e (f) meio de controle para controlar pelo menos uma parte da operação do aparelho.

Comparando-se a fluorescência medida da mistura com aquela da mistura extinta, a diferença pode ser atribuída à fluorescência do composto marcador, de modo que uma indicação da natureza da concentração do composto marcador na mistura pode ser estimada na presença do material a granel, sem contar com uma etapa de separação. Embora a separação de um composto fluorescente antes de medir sua fluorescência seja útil para estabelecer a presença e identidade do composto através de sua fluorescência característica, uma etapa de separação pode introduzir incerteza em qualquer tentativa de quantificar a quantidade do composto originalmente presente no material a granel.

Por conseguinte, um método para identificar um material a granel compreende a etapa de adicionar em dito material a granel um marcador compreendendo pelo menos um composto fluorescente, para formar uma mistura de dito material a granel e do composto marcador fluorescente e, subsequentemente, medir a fluorescência de dito pelo menos um composto fluorescente, utilizando-se o método para medir a fluorescência da invenção.

O material a granel pode ser sólido ou líquido, porém é preferivelmente um líquido. O líquido pode ser orgânico ou aquoso e pode compreender um ou mais ingredientes dissolvidos ou dispersos. O material é usualmente um produto comercial a que um composto marcador é adicionado, a fim de identificá-lo em um ponto posterior da cadeia de suprimento ou em um processo industrial. Tais produtos incluem combustíveis tais como petróleo e produtos derivados de petróleo, em particular gasolina, diesel, querosene, óleos lubrificantes, etanol, gasoóis, graxas e solventes e também combustíveis bio-derivados, tais como óleos derivados de óleo de palma, jatropha, soja etc. O método pode também ser usado para identificar um composto marcador em produtos tais como perfumes, tintas, vernizes e produtos de pintar.

O composto fluorescente é selecionado dos compostos disponíveis que têm características fluorescentes conhecidas, isto é, que emitem luz fluorescente em um comprimento de onda de emissão quando iluminados com luz de um diferente comprimento de onda de excitação mais curto. A fim de obter-se a resolução mais clara entre a fluorescência, devido ao composto fluorescente, e aquela do material a granel, a diferença entre o comprimento de onda de excitação e o comprimento de onda emitido para o composto deve ser tão diferente quanto possível de quaisquer espécies do material a granel. Na prática, a melhor maneira de obter-se esta distinção é utilizar um composto mostrando a maior possível diferença entre o comprimento de onda da radiação usada para excitá-la e o comprimento de onda de qualquer radiação emitida. E preferível, mas não essencial, utilizar-se o comprimento de onda de excitação que gerará a máxima emissão fluorescente e detectar no comprimento de onda correspondente a mais intensa emissão. A diferença entre a excitação e os comprimentos de onda de emissão é similar a, mas não necessariamente a, mesma que a diferença entre o comprimento de onda de máxima absorção e o comprimento de onda de máxima emissão fluorescente para o composto, que por sua vez é com frequência descrito como a mudança de Stokes. Em subsequente explanação, onde é feita referência à mudança de Stokes de um composto, quaisquer transições não estritamente correspondendo à mudança de Stokes, tais como transições envolvendo outros níveis de energia vibracional, sub-faixas do espectro de fluorescência ou qualquer transição resultando em uma emissão fluorescente, estarão também implícitas.

Tipicamente, a mudança de Stokes de um composto marcador útil é pelo menos de 10 nm, mais usualmente pelo menos 20 nm e com frequência pelo menos 50 nm. Quando o material a granel é inerentemente fluorescente (p. ex., gasolina e diesel) ou contém um ou mais compostos fluorescentes em seu estado desmarcado, prefere-se em uma forma de realização da invenção utilizar-se um composto marcador fluorescente, tendo um maior mudança de Stokes do que o próprio material a granel. O comprimento de onda de excitação do composto marcador fluorescente usualmente situa-se dentro de uma faixa do ultravioleta ao infravermelho, isto é, de cerca de 200 - 1200 nm. Os compostos fluorescentes preferidos incluem corantes fluorescentes tendo um comprimento de onda de excitação e emissão entre cerca de 350 - 850 nm. Tais corantes podem absorver luz na região visível, isto é, eles podem ser visivelmente coloridos, embora, quando usados em um líquido a granel colorido ou em concentração muito baixa, eles podem não ser visíveis quando misturados com o material a granel.

Os materiais fluorescentes adequados incluem qualquer um que tenha sido descrito na arte anterior para uso como marcadores fluorescente e outros compostos que sejam constatados serem adequados para tais usos. Em particular, foram mencionadas ftalocianinas, naftalocianinas, ditiolenos de níquel, compostos de amínio, corantes de metina, corantes de ácido azuleno quadrático, fluoresceína e seus derivativos, antraquinonas substituídas, corantes azo, porfirinas, cumarina, cumarinas substituídas (incluindo umbeliferonas), benzopiranos e seus derivativos, corantes de xanteno (incluindo rodaminas), oxazinas, corantes de crocônio, naftelimidas, naftofluoronas, seminafitofluoronas, tricarbocianinas, bisindolilmaleimidas,

1,3-diaril- e l,3,5-triaril-2-pirazolinas, acridinas, fenantiridinas, dipirrometenos. Uma classe de corantes adequados, baseada em uma benzopirana substituída, é mostrada na Figura 1, onde Rj é um substituinte alquila que pode ser fundido no anel arila contíguo ao substituinte amino; R₂pode ser um grupo imino ou carbonila. Em um exemplo preferido desta classe, Ri é um substituinte butila e R₂ é um grupo imino. A lista acima, que não é destinada a ser limitante, descreve uma faixa muito larga de classes de compostos fluorescentes que podem ser usados no método da invenção, desde que exista meios para extinguir a fluorescência do composto quando presente no material a granel. O composto fluorescente é também selecionado para ser compatível com o material a granel, de modo que possa ser dissolvido ou disperso nele na concentração requerida para marcar o material. Portanto, os compostos podem ser usados em formas iônicas, onde disponível, para uso em líquidos polares ou derivados para melhorar a compatibilidade com e solubilidade em vários líquidos orgânicos. O composto pode ser selecionado para ser visível no material a granel, p. ex., para mostrar que o material é marcado ou, bloco de toque, pode ser selecionado para ser invisível a olho no material a granel, isto é, ele possa ser um marcador “silencioso”. Outros critérios para selecionar um apropriado composto fluorescente inclui sua toxicidade, custo, disponibilidade e estabilidade no material a granel. É vantajoso se um ou mais corantes fluorescentes usados como compostos marcadores fluorescentes estejam presentes no material a granel em uma concentração em que o corante não afete a absorbância medida associada com o material a granel. Preferivelmente, a resposta fluorescente do corante em baixas concentrações é proporcional à concentração, independente da cor do meio.

A extinção da fluorescência pode ser conseguida tratando-se fisicamente a mistura, por exemplo, por calor, ou quimicamente tratando-se a mistura, por exemplo, mudando-se o pH da mistura, mudando-se a polaridade do solvente, adicionando-se agentes “branqueadores” tais como oxidantes ou redutores ou um composto de extinção químico. A extinção da fluorescência do composto fluorescente muda suas características fluorescentes. Por “mudança” incluímos uma mudança de comprimento de onda de excitação ou emissão e/ou uma mudança na quantidade de luz fluorescente emitida. Usualmente extinguindo-se reduz a quantidade de fluorescência, conforme medido pela altura do pico de emissão no espectro de fluorescência e, com frequência, o pico é diminuído a menos do que 20% de sua altura na mistura não-extinta. O composto fluorescente pode ser considerado como sendo completamente extinto quando sua altura de pico de emissão fluorescente, quando estimulado usando-se luz em um comprimento de onda dentro de ± 5 nm de seu comprimento de onda de excitação, não é distinguível de uma variação típica em resposta a instrumento, quando se medindo o material a granel na ausência do composto fluorescente. Não é necessário que a fluorescência do composto fluorescente seja completamente extinta, porém é preferível extinguir substancial e completamente.

O meio de extinção deve ser selecionado de acordo com o marcador fluorescente usado. Um composto de extinção reage com o composto fluorescente para muar suas características fluorescentes. A reação pode ser por associação de par iônico, complexação, uma mudança da configuração molecular tal como pode ser realizada por uma mudança de solvente, oxidação do cromóforo, a criação de espécies não-fluorescentes insolúveis ou por outros meios. Compostos de extinção adequados dependem da natureza do composto fluorescente. Agentes de extinção conhecidos para alguns corantes fluorescentes bem conhecidos, tais como xanteno, tioxanteno, derivativos de perileno e benzopirano, incluem mas não são limitados a sais de polioxometalato (p. ex., ácido fosfomolibdico e ácido fosfotúngstico, ácido tungstossilícico, ácido tungstomolibídico); tiocinato de potássio (opcionalmente em conjungação com um reagente de transferência de íon), Nclorossuccinimida, aminas tais como tri-2-aminoetilamina e diazabiciclooctano, solução de hidróxido de tetrabutilamônio, ácido triclorocianúrico, ácido peracético, peróxidos tais como próxio de hidrogênio e benzoilperóxido, anilinas tais como N-metilanilina e N,N-dimetilailina, nitrobenzenos tais como 1,3-dinitrobenzeno, complexos metálicos de transição solúveis, cloro e espécies hipoclorito. Agentes de extinção preferidos para uso em meios não-polares, tais como combustíveis hidrocarbonados, são soluções polares dos sais de polioxometalato, especialmente em soluções baseadas em álcool. Quando adicionados em elevadas quantidades ppm estes instantânea e substancialmente extinguem a fluorescência dos corantes porém deixam a resposta fluorescente do líquido a granel imutada.

O WO 2005/052560 descreve a remoção de um corante fluorescente de uma mistura líquida absorvendo-se o corante em um material absorvente, de modo que a densidade óptica da amostra líquida possa ser medida para possibilitar que uma correção seja aplicada à fluorescência emitida medida da amostra líquida contendo o corante, com base na densidade óptica do meio líquido, na ausência do corante. A remoção do corante do material a granel usando-se um absorvente é muito mais trabalhoso do que a extinção do corante in situ quando ele se baseia na eluição do e então do cartucho de separação e então uma subsequente diluição precisa em um volume conhecido. O método da WO 2005/052560 é, portanto, excluído da presente invenção.

A emissão fluorescente da mistura não-extinta é corrigida comparando-a com a emissão fluorescente da mistura extinta. Isto determinar a quantidade de fluorescência surgindo somente da uma ou mais etiquetas fluorescentes em solução. Em uma forma de realização preferida, o espectro de emissão da mistura extinta é subtraído daquele da mistura não extinta. É ainda preferido corrigir o efeito de absorção da luz pelo material a granel. O espectro de emissão corrigido é usado pra determinar as características fluorescentes da amostra testada. Uma ou mais destas características (p. ex., o comprimento de onda e/ou magnitude da emissão fluorescente) podem então ser comparadas com as características similares obtidas de uma amostra padrão da mistura contendo uma quantidade conhecida do marcador fluorescente em um meio de cor e fluorescência de fundo conhecidos. Uma discrepância entre a emissão detectada da amostra medida e aquela da amostra padrão é então indicativa de que o material a granel, de que a amostra foi tirada, foi mudado, p. ex., diluído ou de outro modo falsificado. As características de uma amostra padrão podem ser registradas e usadas como uma comparação numérica simples com a amostra medida.

Constatou-se que a resposta fluorescente de um corante usualmente varia aproximadamente linearmente com a cor do meio em que o corante é dissolvido, uma vez o efeito do fundo fluorescente do meio tenha sido considerado. Isto é devido à absorção pelo meio de uma ou outra ou de ambas da luz de excitação e da luz fluorescente emitida. Isto é particularmente /relevante quando o material a ser marcado é um líquido colorido, tal como um combustível hidrocarbonado, que pode exibir significantes variações de cor no mesmo produto e que pode também mudar a cor naturalmente durante o tempo. Em uma forma preferida, o método da invenção possibilita apropriada correção da resposta fluorescente (grau de fluorescência, excitação ou emissão de comprimento de onda) após correção para a fluorescência de fundo do meio (isto é, o material a granel) e também se considerando sua cor. A resposta fluorescente corrigida pode então ser convertida em uma concentração de corante, usando-se uma calibração. Confirmou-se também as observações atrás da equação Lippert-Mataga de que o grau de fluorescência é dependente da polaridade do meio em que é dissolvido. Isto significa que a correlação de fluorescência com absorbância deve idealmente ser feita somente em líquidos com similares polaridades. Se um marcador fluorescente for usado que seja pouco afetado pela polaridade do solvente, então os dados para combustíveis baseados em gasolina e diesel podem ser comparados na mesma plotagem. E portanto preferido a utilização de marcadores fluorescentes que sejam menos sensíveis a variações da polaridade do meio em que eles são dispersos. Se um marcador fluorescente for usado que seja fortemente afetado pela polaridade do solvente, então se prefere comparar os resultados quanto a combustíveis baseados em gasolina somente com outros combustíveis baseados em gasolina, isto é, separadamente dos combustíveis baseados em gasolina. Se os marcadores fluorescentes forem usados que tenham uma florescência fortemente dependente de solvente, então a polaridade do meio deve ser padronizada pela adição de outro solvente antes de qualquer análise.

A fluorescência da mistura extinta e não-extinta é medida irradiando-se uma amostra da mistura com luz de um comprimento de onda que excite a emissão fluorescente do composto marcador fluorescente. Isto pode ser feito usando-se um fluorímetro padrão, em que uma amostra, normalmente contida em um elemento transparente ou cubeta, é irradiada com luz de comprimento de onda conhecido (a radiação de excitação) . Por transparente pretendemos significar que o elemento de amostra, ou pelo menos uma parte dele, é substancialmente transparente à radiação de excitação e à fluorescência emitida. A luz emitida pela amostra é então coletada usando-se um dispositivo de detecção de luz e o comprimento de onda e intensidade da luz emitida são medidos. A radiação de excitação é usualmente de um comprimento de onda predeterminado, que é escolhido para ser um comprimento de onda que seja capaz de ser absorvido por e produzindo emissão fluorescente de um dos materiais fluorescentes da amostra. O comprimento de onda selecionado para a radiação de excitação depende do formato do pico de absorção do composto marcador fluorescente particular em uso. O comprimento de onda de excitação pode ser uma faixa de comprimento de onda dentro da qual o corante é estimulado a fluorescer. O comprimento de onda de excitação é preferivelmente menor do que ou aproximadamente igual ao comprimento de onda da absorção máxima, a fim de evitar detecção da radiação de excitação e interferência com o espectro de emissão de fluorescência. O comprimento de onda selecionado para a radiação de excitação pode depender do formato do pico de absorção do composto fluorescente particular em uso. A radiação de excitação pode ser produzida por qualquer fonte conhecida, p. ex., uma fonte de luz de espectrototal com um filtro de passagem de faixa adequado ou grade de difração ou, por uma única ou fonte de faixa estreita, tal como um laser. As fontes de luz laser são disponíveis em muitos diferentes comprimentos de onda e podem ser selecionadas ou sintonizadas para prover luz do correto comprimento de onda para excitar fluorescência em pelo menos um dos materiais fluorescentes. Uma fonte de luz particularmente adequada compreende um LED, selecionado para emitir luz da intensidade e espectro desejados. Prefere-se prover uma fonte de luz separada para cada material marcador fluorescente presente na amostra, cada um sendo selecionado e sintonizado ou filtrado para emitir radiação na ou próximo da frequência de máxima absorção de um respectivo marcador fluorescente. Quando mais do que uma fonte de luz está presente, meios são providos para indicar para o processador de dados que a fonte de radiação está sendo usada. A radiação emitida pela fonte deve idealmente ter um comprimento de onda pico central que não variar mais do que ± 2 nm durante o período de tempo levado para testar a amostra, a fim de assegurar que o espectro de absorção não varie. Quando se utilizando uma fonte de luz que produza radiação de saída cujo comprimento de onda varia com a temperatura, por exemplo, então uma fonte estabilizada deve ser selecionada e o meio de estabilização de temperatura, tal como um módulo Peltier ou dissipador de calor alternativo deve ser provido. O meio de estabilização de temperatura pode também ser útil para aquecer a fonte de luz se necessário para trazer a fonte para sua temperatura operacional ótima. E possível desviar uma parte da radiação de excitação diretamente para um detector de radiação, a fim de determinar o comprimento de onda pico central e/ou a intensidade de um comprimento de onda particular da luz emitida e sua variabilidade. Onde o comprimento de onda de pico central ou a intensidade de um comprimento de onda particular das radiação de excitação muda entre amostras, pode ser possível calcular-se um fator de aumento ou redução para o espectro de fluorescência amostra para compensar por mudanças na radiação de excitação, o que faz com que a amostra absorva mais ou menos energia.

Em ordem a diferenciar entre luz transmitida através da amostra e emissão fluorescente pela amostra, é usual colocar o detector de luz fora do trajeto da luz transmitida. O detector de luz pode ser uma fotocélula ou fotodiodo, incluindo um dispositivo acoplado por carga. A radiação emitida pela amostra pode ser dirigida para dentro do trajeto do detector de radiação por uma ou mais lentes ou espelhos ou uma combinação deles, como é sabido da pessoa hábil. Prefere-se que a radiação emitida seja coletada sobre o inteiro comprimento do trajeto da amostra para máxima sensibilidade para mudanças de emissão entre amostras. A radiação pode passar através de uma fenda ou abertura, para reduzir a divergência da luz alcançando o detector e, assim, aumentar a resolução do espectro. A abertura é preferivelmente de dimensão similar ao comprimento do trajeto. O detector pode ser qualquer um daqueles usados em aparelho de espectroscopia padrão, incluindo, por exemplo, uma fotocélula, um dispositivo acoplado-carga etc. Normalmente, a radiação emitida pela amostra é dividida em comprimentos de onda individuais, p. ex., por uma grade de difração, um espelho holográfico prismático ou côncavo e a intensidade da luz em cada comprimento de onda é então medida pelo detector. O sistema óptico compreendendo o espelho, lente, grade de difração e detector são preferivelmente projetados como um sistema óptico acoplado-próximo.

O aparelho de acordo com a presente invenção é também provido com meios para medir a absorbância do meio além da óptica para medir a fluorescência da amostra descrita acima. A absorbância do meio deve ser medida usando-se uma fonte de luz, referida a seguir como uma “fonte de luz de absorbância”, que não faz com que o corante fluoresça. Na prática, esta fonte de luz deve ser demasiado fraca para fazer com que qualquer corante presente fluoresça a uma extensão que é mensurável pelo detector de luz, ou a fonte de luz deve produzir luz que é pelo menos um comprimento de onda que não provoca a ocorrência de fluorescência mensurável de qualquer um dos corantes presentes. A fonte de luz de absorbância pode compreender um ou mais filtros, a fim de produzir as desejadas características para medir a absorbância do meio. Como será observado, a absorbância da amostra é calculada referenciando-se a quantidade de luz transmitida através da amostra com a luz transmitida através de um padrão de referência incolor, cuja absorbância é considerada ser “absorbância zero” e que é medida durante calibração do instrumento. A absorbância, pela amostra, de luz emitida pela fonte de luz de absorbância pode ser medida pelo mesmo detector de luz usado para medir uma emissão fluorescente da amostra. Alternativamente, um detector separado pode ser usado pra medir a absorbância.

Um aparelho preferido compreende um instrumento para medir a fluorescência e absorbância que têm duas ou mais fontes de luz e um ou mais detectores. Todas exceto uma das fontes de luz são fontes de luz de “excitação”, adequadas para emitir luz em um comprimento de onda que excita o um ou mais compostos fluorescente a fluorescer. Em um forma de realização preferida, cada tal fonte de luz compreende um LED arranjado em combinação com um filtro de passagem de faixa adequado. A luz fluorescente emitida pela amostra (se alguma) é detectada pelo um ou mais detectores situados fora do trajeto da luz transmitida, preferivelmente a cerca de 90° em relação ao trajeto da luz transmitida. A outra “fonte de luz de absorbância” é escolhida para não provocar fluorescência, mas é situada de modo a emitir luz diretamente para um detector de luz arranjado para medir a luz transmitida através da amostra, que pode ser um dos detectores de luz usados para medir uma emissão fluorescente. A luz emitida pela fonte de luz de absorbância deve ser incapaz de provocar excitação do corante, porém capaz de ser absorvido pelo meio. Em uma forma de realização preferida do aparelho, a fonte de luz de absorbância é um LED selecionado para emitir luz branca, porém de intensidade relativamente baixa, com as fontes de luz providas para excitar a fluorescência. Esta fonte de luz de absorbância e seu detector, são juntos usados para determinar a absorbância do meio. Por um arranjo adequado dos eletrônicos associados com o instrumento, um detector compartilhado, isto é, um detector que é usado para detectar absorbância ou transmitância e fluorescência, pode ser operado a fim de determinar se está detectando luz transmitida da fonte de luz de absorbância ou luz emitida por fluorescência. Tal arranjo pode incluir sincronizar o detector com o instante de ativação da(s) fonte(s) de luz de “excitação de fluorescência e a fonte de luz de “absorbância”. Arranjos alternativos podem basear-se em distinguir entre a luz transmitida usada para a medição de absorbância e a luz fluorescente, usada para a medição de fluorescência pela diferença entre os comprimentos de onda de luz transmitida e os comprimentos de onda de luz fluorescente. Este detector compartilhado pode, portanto, ser usado para coletar dados adequados para medições tanto de absorbância como de fluorescência.

Os dados dos detectores são detectados e analisados usando-se um processador de dados que produz as informações requeridas pelo usuário concernentes à fluorescência corrigida da amostra. O processador de dados é preferivelmente programado para comparar a fluorescência da mistura extinta com aquela da mistura não-extinta e, preferivelmente, para compensar a absorbância do meio e também para fazer os apropriados cálculos para produzir um espectro de subtração, diferença ou agregado. Os cálculos podem operar em somente um ou alguns pontos de dados, p. ex., a altura do pico em um comprimento de onda particular, em vez de um inteiro espectro. Quando o usuário requer informações concernentes à luz emitida em cada comprimento de onda, o dispositivo de processamento de dados pode produzir esta informação na forma de um diagrama ou gráfico etc. O processador de dados pode ser ligado a um dispositivo de armazenagem de dados, de modo que informações sobre plotagens anteriores podem ser recuperadas e comparadas.

Um meio de controle controla a operação do aparelho, pelo menos em parte. O meio de controle assegura a ativação da apropriada fonte de luz no apropriado tempo e por um duração apropriada, de acordo com o método de medição usado. O meio de controle pode também provê operação automática ou semi-automática do aparelho, em resposta a uma interface do usuário. Por exemplo, operação semi-automática pode compreender a geração de mensagens de informação e instrução para incitar o usuário a operar ou manipular uma parte do aparelho ou mudar ou inserir uma amostra. O meio de controle e o processador de dados são convenientemente providos como um microprocessador eletrônico adequadamente programado.

O aparelho de medição é preferivelmente portátil, tendo todos os componentes localizados dentro de um único alojamento. Preferivelmente, meios adequados são providos para auxiliar sua portabilidade, tais como um ou mais cabos, correias ou outros meios de carregar, como requerido. Os controles são providos para abrir/fechar o suporte de amostra e operar o instrumento para permitir que luz da fonte de radiação selecionada entre na amostra. O alojamento preferivelmente também compreende uma fonte de força, tal como um pacote de bateria ou um adaptador de força. A fonte de força pode, entretanto, ser provida em um alojamento separado, de modo que calor gerado pela fonte de força possa ser dissipado sem afetar a temperatura do aparelho. O alojamento pode incorporar um monitor para indicar os resultados de uma amostra, o status do instrumento ou instruções e informações quanto a seu método de uso. O meio de indicação pode compreender uma tela, monitor de mensagem ou algum outro indicador tal como uma luz.

O método de utilizar o aparelho da invenção compreende uma etapa de calibração. Na etapa de calibração, um cadinho ou elemento de amostra contendo um líquido incolor tal como água ou um solvente orgânico incolor, é colocado no suporte de amostra a transmissão de luz da “fonte de luz de absorbância” é medida para determinar a absorbância do líquido. O valor é então registrado como “absorbância zero” para a calibração. Como uma outra calibração, amostras de luz e líquidos escuros similares às amostras a serem medidas, cada uma não contendo nenhuma etiqueta (ou uma etiqueta extinta) ou uma quantidade padrão de etiquetante não-extinto são introduzidos sequencialmente dentro do suporte de amostra e a fluorescência é determinada. A fluorescência medida é então usada para calibrar o instrumento, de modo que a diferença entre a medição de fluorescência de uma amostra etiquetada e uma mostra não-etiquetada (ou extinta) é conhecida para o aparelho particular, tanto para líquidos coloridos claros como líquidos coloridos escuros. Descobrimos que a calibração para absorbância zero (empregando um líquido incolor) é preferivelmente repetida diária ou semanalmente, dependendo do uso do aparelho ou antes de cada medição de amostra desconhecida ou batelada de tais medições. A calibração empregando-se luz e líquidos escuros deve ser realizada cada vez que houver uma significativa carga na natureza das amostras a serem medidas, por exemplo, quando se carregando entre amostras de gasolina e diesel, ou quando a cor ou polaridade das amostras varia significativamente daquelas dos líquidos de calibração. A calibração permite que o processador de dados calcule uma relação entre a absorbância das amostras de calibração e a fluorescência das etiquetas conhecidas padrão das amostras de calibração. Esta calibração pode então ser usada para ajustar a fluorescência medida das amostras subsequentes para corrigir o efeito da cor da amostra sobre a fluorescência medida da etiqueta. Um método de calcular a correção é mostrado nos Exemplos. Neste método, a calibração indica a fluorescência calculada das amostras de calibração em uma amostra de absorbância zero, por extrapolação. Usando-se a calibração, a fluorescência medida de cada amostra pode então ser ajustada a um valor calculado em absorbância zero, de modo que os efeitos da cor possa então ser ignorado no cálculo da quantidade de etiqueta presente na fluorescência emitida pela amostra colorida.

Após calibração, o método de utilizar o instrumento preferivelmente compreende as etapas a seguir. Uma amostra de líquido contendo uma quantidade desconhecida de etiqueta (um amostra “desconhecida”) é colocada no suporte de amostra. O instrumento determina a fluorescência da amostra fazendo com que uma ou mais da(s) fonte(s) de luz de excitação de fluorescência ilumine a amostra e medindo-se a luz fluorescente emitida pela amostra que é detectada por um ou mais dos detectores de luz. Este espectro de luz fluorescente (ou parte do espectro) é registrado, p. ex., como “espectro A”. O instrumento também determina a absorbância da amostra iluminando a amostra com luz da fonte de luz de “absorbância” e medindo a amostra de luz transmitida através da amostra medida pelo detector que é arranjado para detectar a luz transmitida. O aparelho então mede a fluorescência de uma amostra do líquido desconhecido, que foi tratado para extinguir a fluorescência da etiqueta. Esta amostra pode ser a mesma amostra que a anteriormente medida, em seguida a subsequente tratamento para extinguir a fluorescência, ou uma segunda amostra do mesmo líquido desconhecido, que foi tratado para extinguir a fluorescência da etiqueta. Este espectro de luz fluorescente (ou parte do espectro) é registrado, por exemplo, como “espectro B”. O aparelho então calcula a fluorescência, isto é, a quantidade de luz emitida em um ou mais dos comprimentos de onda fluorescentes da etiqueta, devido unicamente à etiqueta, subtraindo o espectro registrado (ou parte do espectro) B do espectro gravado (ou parte de espectro) A ou por qualquer outro apropriado meio pelo qual a diferença de fluorescência pode ser verificada. Quando referimo-nos a “parte do espectro” pretendemos dizer que o inteiro espectro não precisa ser medido ou registrado porque, em muitos casos, pode ser necessário medir e/ou gravar somente a parte do espectro situando-se entre certos comprimentos de onda predefinidos, porque as características fluorescentes da etiqueta serão conhecidas. O espectro parcial pode incluir os comprimentos de onda entre os quais um pico característico de fluorescência ocorre ou pode ser ainda mais estreito do que o espectro de um inteiro pico.

O usuário pode requerer colocar cada amostra no suporte de amostra antes de cada medição. Altemativamente, o usuário pode colocar uma amostra de amostra não-extinta e extinta em um suporte de amostra que é adaptado para conter mais do que uma amostra. Um tal suporte de amostra pode também ser adaptado para conter uma amostra de um líquido incolor padrão, para calibração de “absorbância zero”. A amostra apropriada pode ser movida para dentro ou para fora do trajeto da luz da ou de cada fonte de luz, como necessário. Como uma outra alternativa, o aparelho pode desviar a luz da fonte de luz excitante-fluorescência e/ou a fonte de luz de absorbância através de cada amostra por operação de espelhos ou por meios alternativos. O aparelho pode altemativamente incluir um número adequado de fontes ou meios de luz para dividir a luz das fontes de luz em um número adequado de feixes pelos quais mais do que uma amostra pode ser iluminada simultaneamente. O aparelho pode ser operado totalmente manual, automática ou semi-automaticamente. Na operação semi-atomática, o operador toma tais ações manuais que são requeridas, p. ex., para mudar a amostra que é iluminada, em resposta a uma excitação gerada pelo sistema de controle do aparelho.

A composição marcadora pode compreender um ou mais do que um material fluorescente. Preferivelmente, mais do que um material fluorescente está presente, por exemplo, 1 a 4 materiais fluorescentes, cada um estando presente na composição marcadora em uma quantidade conhecida, que pode ser diferente da quantidade de cada outro material da composição. Outros materiais podem também estar presentes, tais como um solvente, outros tipos de composto marcador, corantes não-fluorescentes etc. A composição marcadora é adicionada ao líquido em uma quantidade predeterminada, que contém uma quantidade conhecida de cada material fluorescente contido dentro da composição. A composição marcadora pode ser suprida em um recipiente contendo uma quantidade medida da composição, calculada para prover uma concentração selecionada do ou de cada material fluorescente, quando dissolvida em uma quantidade medida do líquido.

A invenção será ainda descrita no Exemplos abaixo, em que espectros de emissão foram registrados em um espectrômetro de fluorescência Fluoromax-3 Jobin Yvon em um comprimento de onda de excitação de 510 nm, empregando-se um largura de faia de 2,0 nm, registrando-se a emissão a 10 nm. Ultraviolta e espectros visíveis foram registrados em um espectrofotômetro UV-visível Thermo Spectronic UV1 com um lâmpada de 325 nm e um largura de faixa de 2,0 nm. Todas as medições foram feitas usando-se uma cubeta de 10 mm. O corante 1, usado nos seguintes exemplos, é o composto mostrado na Fig. 1, onde Rj é um substituinte butila e R₂ é um grupo imino.

Nos desenhos anexos:

A Figura 1 mostra a estrutura química de uma classe adequada de composto fluorescente.

As Figuras 2 e 3 mostram os espectros de emissão fluorescentes de querosene e álcool-motor não-etiquetados, etiquetados e extintos, respectivamente, como descrito nos Exemplos 1 e 2.

A Figura 4 é uma plotagem de concentração versus fluorescência de Corante 1 em quatro combustíveis A - D.

A Figura 5 é uma plotagem da emissão de fluorescência do Corante 1 dissolvido em oito diferentes combustíveis a 100 pg/l, versus absorbância dos combustíveis a 610 nm.

A Figura 6 é uma plotagem da emissão de fluorescência do Corante 1, dissolvido nos Combustíveis A - D a 25, 50, 75 pg/l versus absorbância dos combustíveis a 610 nm.

A Figura 7 é uma plotagem da emissão de fluorescência do Corante 1 versus absorbância a 610 nm, para os Exemplos 5, 6 & 7.

Exemplo 1

Os espectros de emissão fluorescente de uma amostra nãoetiquetada de querosene foram registrados através das faixas de 500 - 700 nm. Os espectros UV-Vis do querosene foi também registrado de 400 - 900 nm usando-se iso-octana como o solvente de referência. Uma solução de 100 micrograma/litro (pg/l) de Corante 1 foi preparada em 10 ml do querosene, pra formar um querosene etiquetado. O espectro de fluorescência foi registrado de 500 - 700 nm. 250 microlitros de ácido 12-molibdofosfórico (5 g/l em etilexanol) foram adicionados à amostra de 10 ml do querosene etiquetado, a fim de extinguir a fluorescência do Corante 1. Após inverter o frasco para assegurar completa mistura, o espectro de fluorescência foi novamente registrado de 500 - 700 nm.

Os espectros de emissão fluorescente do querosene nãoetiquetado, etiquetado e extinto são mostrados na Figura 2. O sinal fluorescente surgindo do corante foi extinto muito eficazmente, com o espectro resultante sendo muito similar àquele do combustível não-etiquetado, especialmente em tomo do comprimento de onda usado pra medir a emissão fluorescente do corante. A emissão fluorescente ‘corrigida’ do Corante 1 em querosene pode ser considerada como a emissão fluorescente do corante mais fluorescência de fundo do combustível menos a emissão fluorescente do corante extinto no combustível. A seguir, “fluorescência corrigida” deve ser interpretada como significando a diferença entre a intensidade fluorescente a 610 nm da amostra não-extinta contendo Corante 1 e a intensidade fluorescente a 610 nm da amostra extinta, isto é, após adição do agente de extinção ácido molibdofosfórico.

Exemplo 2

O experimento descrito no Exemplo 1 foi repetido usando-se álcool-motor. Os espectros de emissão fluorescente do álcool-motor nãoetiquetado, etiquetado e extinto são mostrados na figura 3. Pode ser visto claramente, comparando-se o combustível não contendo etiqueta ou etiqueta extinta da Figura 2 com as correspondentes curvas da Figura 3, que a fluorescência de fundo associada com o querosene é muito menor do que a fluorescência de fundo associada com o álcool-motor.

Exemplo 3: Correlação da Fluorescência com Concentração

A emissão fluorescente do Corante 1 foi medida em quatro combustíveis diferentemente coloridos, designados A, B, C e D na Figura 4. A Figura 4 mostra a variação da resposta fluorescente com concentração para estes combustíveis. Em todos os combustíveis, a resposta fluorescente do corante é linearmente proporcional a sua concentração nas faixas de concentração de corante consideradas. O efeito visto na Figura 4, que a resposta fluorescente do corante em baixas concentrações é proporcional à concentração, independente da cor do meio, aplica-se genericamente.

Exemplo 4: Correlação de Fluorescência com Absorbância

A emissão fluorescente corrigida do Corante 1 foi medida em oito diferentemente coloridos combustíveis, utilizando-se o método descrito no Exemplo 1. A cor de cada combustível foi medida medindo-se sua absorbância a 610 nm. A Figura 5 é uma plotagem mostrando a variação da fluorescência corrigida do Corante 1 com absorbância para os oito combustíveis. Na prática, alguns dos combustíveis coloridos mostrou absorbâncias negativas com referência a iso-octana, possivelmente devido a uma desigualdade no índice refrativo entre o combustível e a iso-octana. A fim de simplificar a Figura 5, ao combustível menos colorido foi atribuído absorbância zero e os valores de absorbância para os outros combustíveis foram elevados desse maneira. Pode ser visto que a fluorescência varia linearmente com a absorbância do meio, presumindo-se que a polaridade dos diferentes meios são essencialmente as mesmas. Conhecendo-se a variação da fluorescência com absorbância provê-se um método pra calcular a quantidade de corante em um meio de cor arbitrária e fluorescência de fundo arbitrária.

A linha de melhor ajuste para os oito pontos de dados da Figura 5 tem a equação:

Equação 1) Absorbância = -2,00 x 10' x Florescência + 0,0554

Esta equação somente aplica-se a combustíveis contendo 100 pg/l de corante. Entretanto, sabemos pela Figura 4 que a resposta fluorescente do corante a abaixo de 100 pg/l é proporcional a sua concentração, independente da cor do meio. A Figura 6 mostra dados para o Corante 1 dos 4 diferentes combustíveis usados no Exemplo 3 a 25, 50 e 75 ppb e pode ser visto que todas as correlações da resposta fluorescente com absorbância passa através do mesmo ponto do eixo-geométrico-y correspondendo à intercepção da Equação 1.

A fim de calcular a concentração de corante em uma amostra desconhecida, podemos somente medir sua fluorescência e absorbância. A outra informação requerida é a intercepção-y da Equação 1. Isto possibilita a geração de uma nova linha reta, com a intercepção-y dada pela Equação 1 e que passa através do ponto de dados para a amostra desconhecida. A intercepção-x da nova linha reta corresponde à resposta fluorescente da amostra desconhecida que ocorrería fosse o meio incolor, isto é, se a absorbância for zero. A intercepção-x da Equação 1 corresponde à fluorescência de 100 mg/1 corante que ocorrería fosse o meio incolor. Portanto, comparando-se a intercepção-x da nova linha reta calculada pela amostra desconhecida com a intercepção-x da Equação 1, dada por amostras contendo 100 pg/l, podemos calcular a concentração do corante na amostra desconhecida.

Exemplo 5

Os dados de absorbância e fluorescência para um combustível desconhecido foram 0,001 e 263.000, respectivamente. Sabendo-se que a intercepção para a correlação de absorbância com fluorescência é uma constante, dada na Equação 1, então o gradiente para uma plotagem empregando-se estes dados seria -2,00 x 10, mostrado na Fig. 7. Isto implicaria em uma resposta fluorescente em um meio incolor de 258000. Pela intercepção-x da Equação 1, podemos calcular uma concentração de 0,097 mg/1 corante. O nível real de corante foi de 100 pg/l, de modo que o valor calculado tinha um erro de somente 3%.

Exemplo 6

Os dados de absorbância e fluorescência para um segundo combustível desconhecido foram 0,03 e 136.000, respectivamente. Usando-se a intercepção-7 encontrada pela Equação 1, podemos calcular um gradiente para uma plotagem usando-se estes dados como sendo -l,87x IO⁷, mostrado na Fig. 7. Isto implicaria em uma resposta fluorescente em um meio incolor de 296500 ou com referência à intercepção-x da Equação 1 uma concentração de 0,107 mg/L corante. O nível real de corante foi de 100 pg/l e o combustível foi álcool-motor. Este é um erro de 7%. Simplesmente comparando-se a fluorescência do corante em álcool-motor com a fluorescência do corante em um meio de absorbância zero ter-se-ia predito meramente 0,050 pg/l para o exemplo 2, que é um erro de 50%.

Exemplo 7

Os dados de absorbância e fluorescência para um terceiro combustível desconhecido sabido conter Corante 1 foram 0,019 e 68.500, respectivamente. Sabendo-se que a intercepção para todas as correlações entre absorbância e fluorescência é uma constante, dada na Equação 1, então o gradiente para uma plotagem usando estes dados seria -5,39 x 10', mostrada na Fig. 7. Isto implicaria em uma resposta fluorescente em um meio incolor de 102500 ou com referência à intercepção-x da Equação 1 uma concentração de 0,037 pg/l corante. O nível real de corante foi de 37,5 pg/l e o combustível uma mistura de álcool-motor e gasolina octana UK 95. Simplesmente comparando-se a fluorescência do corante com a fluorescência do corante em um meio de zero absorbância ter-se-ia predito 0,025 mg/1.

Assim, correlacionando-se a resposta fluorescente de um etiquetante, após ter-se extinguido-o seletivamente, com a absorbância do meio em que ele é dissolvido, temos aperfeiçoado significativamente o método para quantificar aquele etiquetante fluorescente, especialmente quando o meio em que é dissolvido tem fluorescência e absorbância desconhecidas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para medir a fluorescência de um composto marcador fluorescente dissolvido ou disperso em um material a granel, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

(a) medir uma característica da fluorescência de uma mistura de dito material a granel e dito composto marcador fluorescente;

(b) extinguir a fluorescência do composto marcador fluorescente para produzir uma mistura extinta;

(c) medir a característica da fluorescência da mistura extinta;

(d) comparar a característica fluorescente da mistura com a característica fluorescente da mistura extinta; e (e) corrigir a característica de emissão fluorescente medida para os efeitos da absorvência do material a granel.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o material a granel ser um líquido.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de dito composto marcador fluorescente ser de uma classe química selecionada do grupo consistindo de ftalocianinas, naftalocianinas, ditiolenos de níquel, compostos de amínio, corantes de metina, corantes de ácido azuleno quadrático, fluoresceína e seus derivativos, antraquinonas substituídas, corantes azo, porfirinas, cumarina, cumarinas substituídas (incluindo umbeliferonas), benzopirano e seus derivativos, corantes xanteno (incluindo rodaminas), oxazinas, corantes de crocônio, naftalimidas, naftofluoronas, seminaftofluoronas, tricarbocianinas, bisindolilmaleimidas,

1,3-diaril- e l,3,5-triaril-2-pirazolinas, acridinas, fenantridinas, dipirrometenos.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a extinção ser realizada por meio de calor, por mudança do pH da mistura, mudando-se a polaridade da mistura, por adição de agentes oxidantes ou redutores ou por adição de um composto de extinção química.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a extinção do composto fluorescente ser realizada pela adição de um composto de extinção química.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de dito composto de extinção ser selecionado do grupo consistindo de sais de polioxometalato, tiocianato de potássio, N-clorossuccinimida, aminas, hidróxidos de amônio quaternário, diazabiciclo-octana, ácido triclorocianúrico, ácido paracético, peróxidos, anilinas substituídas, nitrobenzenos substituídos, complexos metálicos de transição solúveis, cloro e hipocloritos.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a emissão de fluorescente da mistura extinta em pelo menos um comprimento de onda ser substituída daquela da mistura não-extinta, a fim de corrigir a emissão fluorescente do material a granel.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de a característica de emissão fluorescente medida ser corrigida quanto aos efeitos da absorvência do material a granel por meio de uma calibração obtida medindo-se a característica da emissão fluorescente do mesmo composto fluorescente na mesma concentração em materiais diferentemente coloridos.
9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de a emissão corrigida ser comparada com a emissão de uma amostra padrão de uma mistura marcada similar.
10. Método para identificar um material a granel, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de adicionar a dito material a granel um marcador compreendendo pelo menos um composto fluorescente, para formar uma mistura de dito material a granel e do composto marcador fluorescente e, subsequentemente, medir a fluorescência de dito pelo menos um composto fluorescente em uma amostra de dito material a granel, empregando-se o método para medir a fluorescência como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
11. Aparelho adequado para uso em realizar o método como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de compreender:

(a) pelo menos uma fonte de luz de excitação, que é capaz de emitir luz de um comprimento de onda selecionado para ser um comprimento de onda que excita a fluorescência detectável em pelo menos um dos compostos marcadores fluorescentes;

(b) pelo menos um dispositivo de detecção de luz para detectar luz fluorescente emitida por dito pelo menos um composto marcador fluorescente;

(c) pelo menos uma fonte de luz de absorvência, que é capaz de emitir luz que não excita fluorescência detectável de qualquer um dos compostos marcadores fluorescentes, porém que é absorvido pelo material a granel;

(d) pelo menos um dispositivo de detecção de luz pra detectar luz emitida por dita fonte de luz de absorvência, que é transmitida através da amostra;

(e) meio de processamento de dados para calcular informação requerida pelo usuário concernente à fluorescência corrigida da amostra; e (f) meio de controle pra controlar pelo menos uma parte da operação do aparelho.
12. Aparelho de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de pelo menos um dispositivo de detecção de luz ser um detector compartilhado, sendo adaptado para detectar luz fluorescente emitida por pelo menos um composto marcador fluorescente e também para detectar luz emitida por dita fonte de luz de absorvência, que é transmitida através da amostra.
13. Aparelho de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o detector compartilhado ser operado a fim de determinar se está detectando luz transmitida ou luz fluorescente.
14. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de o processador de dados ser adaptado para calcular uma relação entre a absorvência das amostras de calibração e a fluorescência de etiquetas conhecidas padrão das amostras de calibração, de modo que dita relação calculada possa então ser usada para ajustar a fluorescência medida de amostras para corrigir o efeito da cor de amostra na fluorescência medida da etiqueta.
15. Aparelho de acordo eom qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de ser adaptado para ser portátil e incluir um único alojamento contendo todos os componentes de dito aparelho.
16. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de a luz emitida por pelo menos uma fonte de luz de absorbância ser muito fraca para fazer quaisquer compostos marcadores fluorescentes presentes fluorescerem a uma extensão que seja mensurável pelo dispositivo de detecção de luz para detectar luz fluorescente.
17. Aparelho de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de fato de a luz emitida por pelo menos uma fonte de luz de absorbância ser de um comprimento de onda selecionado para ser um comprimento de onda que não excita fluorescência detectável de quaisquer compostos marcadores fluorescentes.