BRPI1005557A2 - sistemas enzimÁticos À base de amilases obtidos por meio de tecnologia de dna recombinante - Google Patents

Abstract

SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE. A presente invenção se refere à obtenção de um sistema enzimático à base de amílases, com características adequadas para emprego em associação com fluidos de completação para poços de petróleo. Mais particularmente a invenção trata da obtenção de um sistema de enzimastermorresistente transformadas por meio de tecnologia de DNA recombinante, a partir do genoma de Pyrococcus furiosus, expresso de forma heteróloga em leveduras, e, alternativamente, em bactérias, com vistas a sua aplicação em formulações de fluidos de completação para uso em poços de petróleo.

Description

SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata da obtenção de um sistema enzimático para aplicação em formulações de fluidos de completação para poços de petróleo. Particularmente, a invenção se refere à obtenção de um sistema enzimático à base de amilases, com características adequadas para emprego em associação com fluidos de completação para poços de petróleo. Mais particularmente, a invenção se refere à obtenção de uma enzima termorresistente proveniente do genoma de um organismo termofílico, com vistas à sua aplicação em formulações de fluidos de completação para uso em poços de petróleo. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A metodologia para perfuração de poços de petróleo sofreu poucas mudanças com o passar dos anos. De forma geral, um fluido de perfuração é empregado de modo a manter a integridade do poço perfurado, remover detritos provenientes das operações de perfuração e promover o equilíbrio de pressão hidrostática no poço.

O fluido de perfuração é utilizado em todas as etapas de perfuração de um poço de petróleo, e fica em constante contato com a formação geológica. É bombeado pelo interior de uma tubulação e chega à broca de perfuração por meio de uma pluralidade de orifícios, retornando à superfície pelo espaço anular formado entre o poço, ou revestimento de superfície, e a referida tubulação. Nesta fase, é comum que o fluido de perfuração fique aderido à superfície da formação geológica, formando o que ficou conhecido como "reboco".

Em uma fase conhecida como completação do poço, o fluido de perfuração é finalmente removido. Na maioria das vezes, a remoção é efetuada por meio de circulação de um fluido específico. Um dos métodos mais conhecidos na técnica para remover o reboco consiste em bombear para o interior do poço soluções contendo ácidos fortes, surfactantes aniônicos e substâncias capazes de fazer trocas catiônicas, por exemplo. Essas substâncias tendem a dissolver ou desintegrar parcialmente o reboco e nâo removê-lo completamente. Além disso, o contato destas substâncias com a formação geológica pode comprometer a produção de petróleo. O uso de ácidos fortes e outras substâncias com alto potencial corrosivo tornam o processo de remoção de reboco potencialmente perigoso, além de acelerar o processo de corrosão dos equipamentos envolvidos e provocar um impacto ambiental indesejável.

Desta forma, os especialistas na matéria buscam a obtenção de fluidos de completação que não sejam poluentes nem agressivos, minimizando riscos ambientais e/ou operacionais. Ademais, procura-se desenvolver metodologia que atenda a uma variedade de aplicações e de geometria de poços de petróleo, sem causar danos aos reservatórios.

Os fluidos de perfuração comumente apresentam em sua composição: polímeros naturais ou sintéticos como amido, por exemplo, utilizados como controlador de filtrado, ou goma xantana (usada como viscosificante), inibidores de argilas e adensantes, por exemplo, os sais de KCI ou NaCI, e o carbonato de cálcio micronizado (empregado como tamponante). Estes fluidos reduzem amplamente a permeabilidade prevenindo o fluxo de filtrado para dentro da formação durante a perfuração.

Uma alternativa à forma tradicional de remoção de reboco é a utilização de composições enzimáticas para digestão parcial do amido e/ou da goma xantana presentes no reboco. Esta alternativa tem a vantagem de minimizar os riscos ambientais e operacionais.

As enzimas capazes de degradar os polímeros naturais e sintéticos, acima citados, são geralmente as amilases, que são responsáveis pela degradação dos componentes baseados em amido, e as celulases, responsáveis pela hidrólise dos componentes a base de celulose.

Entretanto, a temperatura dos poços de petróleo varia numa faixa de valores compreendida entre 50°C e 120°C. Sabe-se que em temperaturas acima de 50°C ocorre a desnaturação da maioria das amilases comerciais utilizadas nas formulações de completação. Portanto, há que se obter fluidos de completação que atendam a essas premissas e também mantenham suas propriedades. TÉCNICA RELACIONADA

Nos últimos anos tem sido grande o esforço para desenvolver tecnologias limpas, que permitam utilizar os recursos naturais de maneira segura, a baixo custo e que não causem dano ao meio ambiente. A literatura técnica especializada descreve alguns métodos que estão sendo empregados.

É conhecido que as amilases são as enzimas mais utilizadas para degradação do amido, razão pela qual são componentes largamente utilizados na formulação dos fluidos que são injetados nos poços de petróleo.

Na patente norte-americana US 4.734.365, citada como referência, descreve-se um processo para liquefação de amido que utiliza uma alfa- amilase termoestável obtida a partir de Clostridium sp. São apresentados ensaios comparativos com amilases de diferentes origens.

O documento de patente ES 2322825, citada como referência, trata da obtenção de variantes mutantes de alfa-amilases do tipo Termamyl, que apresentam termoestabilidade aumentada em relação a amilases do mesmo tipo, trazendo vantagem para sua aplicação em tratamentos industriais que utilizam amido (liquefação, sacarificação e similares).

A patente norte-americana US 6.638.896, citada como referência, se refere a fluidos de completação que utilizam sistemas enzimáticos combinados com um sistema surfactante viscoelástico, por exemplo, EDTA/alfa-amilases. A publicação norte-americana US 2008/196892, citada como referência, descreve um fluido para ser utilizado em recuperação avançada de petróleo, que possui enzimas em sua formulação.

A publicação norte-americana US 2010/098804, citada como referência, descreve um método para produzir enzimas híbridas a base de alfa-amilase usando a técnica de DNA recombinante, a partir de fragmentos de Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Klebsiella, Micrococcus, Thermoanaerobacter ou Termoaerobaeterium. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção trata da obtenção de uma enzima

termorresistente por meio de tecnologia de DNA recombinante, a partir do genoma de Pyroeoeeus furiosus, expressa de forma heteróloga em leveduras, e, alternativamente, em bactérias, com vistas a sua aplicação em formulações de fluidos de completação para uso em poços de petróleo. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 apresenta um gel de PCR (Poiymerase Chain Reaction) no qual se pode observar a amplificação do gene da amilase de Pyroeoeeus furiosus utilizando-se os iniciadores Pyramy, desenhados para este fim.

A Figura 2 mostra um gel de agarose de uma Miniprep do vetor

pPIC9 contendo o inserto de interesse (pyrfu amylase).

A Figura 3 apresenta um gel de PCR de colônias transformadas.

A Figura 4 apresenta uma placa de Petri com o resultado de um experimento representativo que confirma as colônias produtores de amilase.

A Figura 5 mostra uma eletroforese em gel de poliacrilamida de amostras removidas no décimo dia pós-indução.

A Figura 6 apresenta um gráfico da atividade amilolítica da enzima de Pyroeoeeus furiosus expressa em levedura Piehia pastoris exibida por três diferentes clones comparada ao resultado obtido com cepas com o vetor vazio ou sem transformação (Gs115 selvagem).

A Figura 7 mostra a atividade amilolítica obtida de um dos clones mais responsivos em função de alta temperatura de ensaio (60°C - 120°C).

A Figura 8 mostra a atividade amilolítica obtida de um dos clones mais responsivos em função de variações de pH.

A Figura 9 mostra a atividade amilolítica obtida de um dos clones mais responsivos em função de salinidade através da adição de KCI ao meio de ensaio (de 0,2 M a 1,0 M).

A Figura 10 apresenta um gel de PCR do gene da amilase clonada no vetor pUC57.

A Figura 11 mostra um gel que evidencia a digestão do pGEM-T contendo a amilase e do pET26b (linearização).

A Figura 12 apresenta o gel da confirmação da ligação do gene da amilase de Pyrfu no vetor de expressão em bactéria pET26b. A Figura 13 apresenta o gel da expressão da alfa-amilase de

Pyrococcus furiosus em E. coli após coloração por prata. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A tecnologia de DNA recombinante consiste basicamente das seguintes etapas: (a) amplificação;

(b) clonagem;

(c) sequenciamento; e

(d) expressão do gene extracelular.

A construção do material genômico de Pyrococcus furiosus para obtenção do sistema enzimático, objeto da presente invenção, compreende os seguintes passos:

- amplificar um fragmento específico de DNA de Pyrococcus furiosus codificando alfa-amilase, pelo uso de iniciadores Pyramy;

- submeter o material a um PCR utilizando uma faixa de temperatura entre 50°C e 105°C; - clonar os fragmentos desejados, usando um vetor de clonagem pUC57 Iinearizado com EcoRl e HindIII em presença de T4 DNA- ligase;

- proceder à eletroporação com as células da linhagem selecionada para obter células transformadas;

- remover das células transformadas, através de miniprep, o plasmídeo com o DNA de interesse para produzir um vetor de clonagem contendo o gene da amilase de P. furiosus;

- obter um vetor de clonagem do microorganismo hospedeiro;

- transferir o vetor de interesse produzido, obtendo o plasmídeo de

expressão desejado.

Para que a invenção possa ser mais bem compreendida e avaliada será feita uma descrição detalhada das etapas de execução da metodologia empregada.

(a) Amplificacão

A partir de um material genômico da Pyrococcus furiosus, cuja qualidade e pureza foram devidamente atestadas por autoridade competente [INCDS/FIOCRUZ], procedeu-se à amplificação de um fragmento específico de DNA codificando a alfa-amilase, através do uso

de iniciadores (primers) desenhados para este fim (Pyramy). Foram utilizados para a amplificação do gene os iniciadores "forward" e "reverse" sintetizados, apresentando Tm= 57,9°C e Tm= 59,2°C, respectivamente.

O gene completo de 1,3 Kb de tamanho, foi amplificado usando-se uma Taq-DNA polimerase comercial, fornecida por Promega, otimizada

para Mg2+ de acordo com a recomendação do fabricante. O ciclo de amplificação envolveu as seguintes etapas:

- uma desnaturação inicial de 3 minutos a 94°C;

- 30 ciclos seguidos com os seguintes passos: 94°C por 1,5 minutos;

59°C por 1,5 minutos como temperatura de anelamento e 72°C por

1,5 minutos como temperatura de extensão; - uma extensão final de 10 minutos a 72°C.

Esta condição de PCR (Polymerase Chain Reaction) se mostrou mais eficaz, conforme evidenciado na Figura 1, onde se pode ver claramente a amplificação do DNA (fragmento de 1,3 KB) fornecido comercialmente, com diferentes amostras realizadas em dias diferentes, usando o mesmo conjunto de DNA e iniciadores, o que atesta a reprodutibilidade do método.

A linha 1 representa o padrão de DNA (DNA ladder); a linha 2 representa o controle negativo, enquanto as linhas 3, 4 e 5 representam o fragmento de 1,3 Kb. (b) Clonagem

Os fragmentos desejados foram eluídos a partir de gel de agarose, concentrados e purificados, usando-se o Kit Geneclean II, fornecido comercialmente por QBiogene. Então, a amostra foi ligada em um vetor de clonagem pUC57, Iinearizado com EcoRl e HindIII, empregando-se 5 μΙ_ do material purificado, 1 μΙ_ de vetor vazio e 1 μΙ_ de T4 DNA-ligase. As amostras foram submetidas à diálise contra água milliQ autoclavada, após cuidadosa mistura e incubação a 22°C por duas horas, de acordo com o procedimento descrito a seguir. Sobre uma placa de Petri coberta com água deionizada é deixado

repousar, por pelo menos 90 minutos, um pequeno pedaço de nitrocelulose, com a parte brilhante voltada para cima, tendo sobre ela μΙ_ do produto de ligação. A amostra é então recolhida em um pequeno "eppendorf". Células competentes da linhagem BL-21, cedidas pelo IBqM/UFRJ, foram transformadas, seguindo-se o seguinte protocolo de eletroporação:

1-Ao produto de ligação foram adicionados 50 μΙ_ de uma suspensão de células BL-21; o material foi acondicionado em cubeta de eletroporação, previamente lavada e descontaminada por radiação ultravioleta (UV); 2-Após a eletroporação adicionou-se imediatamente 1 ml_ de meio LB (Luria-Bertani) líquido na cubeta e seu conteúdo foi transferido para um tubo Falcon estéril, o qual foi mantido sob agitação por 1 hora;

3-Placas de Agar foram preparadas e nelas adicionadas 10 pL de

IPTG 1M e 40 pL de X-gal (20 mg/mL) em presença de ampicilina; as placas foram secas e plaqueadas cada com 200pL da transformação, colocadas em estufa a 37°C durante toda a noite;

4-A transformação foi observada visualmente por meio do crescimento de células nas placas de Agar/LB com amplicilina -

colônias azuis indicavam culturas resistentes, ou seja, vetor inserido, mas não clonado, enquanto as colônias brancas foram selecionadas, pois apontavam o sucesso na transformação.

(c) Seauenciamento

A remoção do vetor de clonagem contendo o DNA de interesse das

colônias selecionadas foi realizada utilizando-se o kit Wizard Plus SV, fornecido comercialmente por Promega. O material foi devidamente examinado por autoridade competente para verificação de sequenciamento e falhas. Foi constatado não haver falhas na seqüência manipulada.

(d) Expressão do gene e secrecão da proteína de interesse.

O DNA de interesse do vetor de clonagem obtido foi transferido para um vetor de clonagem de leveduras (pPIC9). O inserto de interesse foi sacado do pUC57 com enzimas de restrição e montado em um novo vetor, para uso nas leveduras, o pPIC9.

Uma amostra do vetor de expressão pPIC9 para uso em levedura Pichia pastoris foi Iinearizada com as enzimas Xhol e EcoRl de forma a expor o sítio de inserção para o gene da amilase de Pyrococcus furiosus. A inserção se deu logo após o fator alfa de Saccharomyees eerevisae e do promotor AOX da enzima álcool oxidase (áreas do vetor de Piehia que comandam a secreção do material a ser expresso). Foi inserida uma seqüência espaçadora GLU-ALA-GLU-ALA em frame de leitura através de uma ligação "blunt end". O código foi otimizado para expressão em Pichia sp. A seqüência também foi incluída em um dos construtos para verificar se este espaçador apresentaria alguma influência sobre o resultado final da expressão.

Antes da realização dos testes de expressão, o vetor com a seqüência de interesse foi transfectado por meio da técnica padrão de choque térmico [Sambrook e colaboradores, 1982], onde E. co//'-DH5-alfa foi usada para amplificação e imortalização do vetor pPIC9.

Culturas consideradas "sucesso" a partir do tratamento com ampicilina foram plaqueadas e seu material Iisado foi encaminhado para uma mini-prep, com o objetivo de aumentar a massa de plasmídeo. Nesta etapa foram utilizados quatro clones positivos. Ensaio em gel de agarose revelou o tamanho do vetor amplificado: os quatro clones mostraram banda de 9,2 kDa, que corresponde ao peso do vetor pPIC9 com a inserção e sem digestão. Para comprovação da qualidade do material a ser empregado nos experimentos seguintes, foi realizada uma digestão do vetor com enzimas de restrição Sall e Xhol, adotando-se o seguinte procedimento: inicialmente a reação de digestão foi processada por 3 horas a 37°C com a enzima Xhol para a linearização do vetor e depois a reação foi interrompida, incubando-se em banho-maria 65°C por 15 minutos. A seguir, 5μΙ_ de SaM foram adicionados e a reação de digestão foi processada por mais 3 horas a 37°C, sendo interrompida da mesma maneira que a reação anterior.

A Figura 2 mostra o resultado deste teste. A linha P representa o padrão de DNA (DM4 Iadder); as linhas 1 e 2 correspondem a dois clones diferentes (clones 1 e 6 respectivamente) e mostram uma banda com 9,2 kb, que corresponde ao vetor cheio. A linha 3 é o clone 1 digerido com Sall e Xhol (posteriormente foi empregado o clone 1 por ser mais limpo) e a linha 4 é o clone 6 digerido com as mesmas enzimas de restrição. Na linha 4 se evidencia um pouco do vetor não digerido (banda de 9.2 kDa). Como se observa na linha 3, a combinação dos cortes proporcionados pelas duas enzimas de restrição utilizadas removeu um fragmento de aproximadamente 3,2 Kb à montante da entrada do inserto (sítio Xhol), o que permitiu a detecção de dois fragmentos, um com cerca de 6,0 Kb e outro com 3,2 Kb.

Obtida a confirmação foi realizada uma midi-prep para preparar o material para a eletroporação. A midi-prep foi realizada a partir da propagação do clone 1 em meio LB líquido com ampicilina, enriquecido com peptona de carne.

As células foram Iisadas e o material aplicado em um kit comercial para midi-prep SV Wizard Plus, fornecido por Promega, seguindo-se rigorosamente o protocolo descrito pelo fabricante. Foram obtidos 42 μg de DNA plasmidal em 150 μΙ_ de volume da midi-prep.

Novamente o material foi submetido à digestão com Sall para Iinearizar o vetor, seguido de sua extração em gel de agarose. Após corrida do gel por 40 minutos a banda foi visualizada em um transiluminador UV (coloração com brometo de etídio); as bandas foram excisadas do gel com auxílio de estilete; o material liqüefeito foi aplicado no kit de extração de DNA comercial, fornecido por Promega.

A eletroporação foi realizada incubando-se duas colônias de leveduras: GS115 e SMD1168 em 5 mL de meio Yeast Potato Dextrose (YDP) a 28°C durante toda a noite. Quando a D.O. (Densidade Óptica a 660 nm) atingiu 1,34 o material foi centrifugado a 3500 rpm por 15 minutos; o sobrenadante foi descartado. O precipitado celular foi lavado exaustivamente e ao final novamente suspenso em sorbitol 1M gelado.

Às cubetas para eletroporação, previamente resfriadas, foi adicionado 320 μΙ_ de sorbitol gelado e 80 μΙ_ da suspensão de células; após mistura foram adicionados 5 μΙ_ de DNA plasmidal linearizado, mantendo-se a suspensão no gelo por 5 minutos. O aparelho foi ajustado para voltagem 2,43 KV1 capacitância 25 mF e resistência 400 ohms e a amostra foi submetida ao pulso. O material foi mantido em gelo até o momento do plaqueamento, que foi realizado adicionando-se 5 μΙ_, 10 μΙ_, 20 μί e 100 μ!_ do material em placa de Petri com meio Yeast Nitrogen Base (YNB) sólido, incubadas a 30°C por 3 dias.

A transformação dos clones foi confirmada através de PCR de colônia de 56 clones, utilizando-se sonda comercial direcionada para o gene AOX (indutor de resistência a metanol) presente no material genético do vetor pPIC9, visto que somente as leveduras transformadas apresentariam este gene.

O resultado é mostrado na Figura 3. Os produtos PCR de cada colônia receberam tampão de amostra e foram submetidas a um gel de agarose 1%. Devem-se observar as primeiras linhas do primeiro gel e linhas do gel do meio.

Uma vez identificados os clones em que potencialmente a banda do gene AOX era mais evidente, foi dado prosseguimento aos experimentos de indução da expressão de interesse (amilase de Pyrfu).

As colônias 3, 6, 8, 22, 24, 33 e 45 apresentaram diferentes graus de positividade e foram plaqueadas em meios agar-amido contra um controle negativo (colônia 48).

O resultado é apresentado na Figura 4, onde um halo claro em volta da colônia evidencia a positividade. A colônia negativa está localizada no topo da placa, do lado esquerdo. Após a identificação dos clones efetivamente transformados, uma

série de testes de expressão foi realizada. As colônias selecionadas foram semeadas em meio BBS enriquecido com elementos traço, e a indução foi realizada sempre com metanol adicionado diariamente ao meio de cultivo (0,7% final).

As culturas foram crescidas sob agitação constante a 30°C em agitadores de 220 rpm em frascos erlenmeyer de 2000 mL; amostras do sobrenadante das colônias foram removidas em diferentes dias pós- indução. A eletroforese em gel de poliacrilamida 15% das amostras removidas após 10 dias de indução sem nenhuma concentração prévia é mostrada na Figura 5. A linha 1 representa o padrão de peso e, em seqüência, clones 14, 39 e 43. A atividade amilásica foi detectada nesses e também em outros clones.

Para determinação da atividade amilásica é utilizado o método do micro-DNS (DNS= ácido dinitrosalicílico), adaptado a partir do original de Miller [Anal. Chem. 31: 426 - 428 1959]. Este método dosa os açúcares redutores, produto da quebra enzimática do amido, tendo glicose como referência. Foi utilizada uma modificação do ensaio para esta dosagem dos açúcares redutores do 3,5 di-nitro salicilato; dito ensaio modificado permite o emprego de menores volumes de amostra. Medidas da atividade amilolítica da enzima de Pyrococcus furiosus

expressa em levedura Pichia pastoris, efetuadas utilizando-se o método do DNS com 50 μΙ_ do sobrenadante de cultura a 85°C são apresentadas no Gráfico da Figura 6, a atividade obtida para os dois clones mais ativos representados no gráfico foi de cerca de 1000 U/mg o que corresponde a um valor bastante elevado para uma enzima que não sofreu nenhum tipo de concentração ou purificação. Curvas controles com o sobrenadante de cultivo de cepas transfectadas com o plasmídeo vazio ou de leveduras não transformadas não exibiram atividade enzimática.

A fig. 7 mostra a resposta da enzima obtida do clone 7 ao incremento progressivo da temperatura (de 60°C a 120°C). O resultado mostra que a enzima estava plenamente ativada a 120°C e exibiu um perfil termo resistente.

A Fig. 8 mostra a atividade enzimática da enzima obtida do clone 7 em função de diferentes pHs, a enzima exibiu um perfil acidófilo com um ótimo de pH no valor de 4,5, com uma atividade máxima comparável aos valores obtidos anteriormente.

A fig. 9 mostra a variação da atividade amilolítica em função da salinidade (utilizando KCI como sal) e mostra que a enzima possui um perfil halotolerante até 1,0 M de KCI1 muito acima da salinidade da água do mar.

Com o objetivo de obter alternativas de baixo custo e quantidades suficientes para a expressão de amilase termorresistente de Pyrococcus furiosus foi realizado um procedimento semelhante usando a bactéria Escherichia eoli como sistema de expressão. Com isto foi possível obter parâmetros comparativos das proteínas expressas em bactérias e em leveduras, tendo em mente que as bactérias e as leveduras poderiam expressar, enovelar ou processar a proteína de modo ou quantidade diferente.

Para a realização destes experimentos foi utilizado um plasmídeo contendo uma seqüência sinal de endereçamento da proteína expressa para o periplasma da bactéria (pelB). A estratégia de clonagem foi feita a partir do gene de Pyrocoeeus furiosus, já inserido no vetor pl)C57, utilizado anteriormente para obtenção dos clones de Piehia pastoris, gerando um novo produto de PCR. O gene da amilase termófila foi clonado e amplificado utilizando dois novos inieiadores desenhados com sítios para as enzimas de restrição Xhol e EcoRl, porém invertidos em relação aos clones utilizados para Piehia pastoris, devido ao fato que os plasmídios que se mostraram mais adequados para a expressão em Eseheriehia eoli (pET26b e pET22b) apresentavam os sítios de digestão invertidos comparado ao pPIC9. Assim, os dois inieiadores desenhados para a clonagem do gene de E. eoli foram hibridizados diretamente com o pUC57 contendo o gene, e, em seguida, a reação de PCR (primer 5'-3' EcoRI, primer 3'-5'Xho1), utilizando Taq comercial fornecida pela Promega, seguindo as recomendações do fornecedor, de modo a deixar uma adenina nas extremidades do produto PCR e facilitar a clonagem no sistema pGEM-T. O PCR foi efetuado a temperaturas entre 50°C e 60°C para diminuir as amplificações inespecíficas.

A Figura 10 apresenta o resultado obtido a partir de diversos clones todos mostrando o inserto no valor de 1,3 kb.

Foi corrido o gel de agarose 0,8% com o produto de amplificação e

as bandas do produto de PCR foram excisadas; o produto foi purificado com o kit SV-PIus, fornecido por Promega. Com o produto purificado foi efetuada a ligação ao plasmídio pGEM-T (Promega) utilizando a enzima T4- ligase.

Os plasmídios com a inserção do gene foram purificados e

transfectados para E. coli, linhagem DHlOb para ampliação da massa do plasmídio. As células transformadas pelo pGEM-T são resistentes a ampicilina, portanto, foram selecionadas, e podem ser facilmente reconhecidas em culturas de LB agar-sólido com ampicilina/Xgal/ITPG em

placas de Petri.

As culturas com a inserção do gene crescem com aspecto normal enquanto as culturas transfectadas com o plasmídio sem o gene inserido apresentam coloração azulada. O gene pGEM-T foi amplificado em DHlOb foi extraído e digerido em Xhol e EcoRl, conforme confirmação

apresentada na Figura 11. A linha 1 representa o pGEM-T cortado com Xhol e EcoRl; a linha P é o padrão Iambda-PSTl; a linha 2 é o pET26b e a linha 3 o vetor não digerido que ainda apresenta alguma estruturação.

Após a confirmação da digestão e do tamanho correto do gene, por eletroforese em gel de agarose 1%, este foi excisado e purificado com o kit

SV-PIus. Então o gene da amilase de Pyrococcus furiosus foi inserido no vetor de expressão pET26b Iinearizado com EcoRl e Xhol, de modo a permitir a inserção no sentido e seqüência de leitura corretos. O inserto após o corte com EeoRl e Xhol mediu 1,3 Kb. Após foi coletada uma alíquota de cada e reagido com T4-ligase durante toda a noite a 16°C.

Após a incubação foi obtido o plasmídio de expressão (pET26b+) com 5,3 Kb, contendo o gene para amilase de Pyrococcus furiosus inserido, conforme mostrado na Figura 12, onde se apresenta o gel de confirmação da ligação do gene da amilase de Pyrfu no pET26b. A linha P é o padrão lambda-pSTl, a linha 1 é o pET26 não digerido, a linha 2 é o pET26 digerido com EcoRl e Xhol, linhas 3 e 4 são dois clones mostrando a amilase dentro do pGEM-T e por fim as linhas 5 e 6 são dois clones mostrando a amilase saindo do pET26b evidenciando o mesmo peso esperado para o inserto e o vetor digerido.

Este vetor de expressão (pET26b+) contém um forte promotor T7 induzido por IPTG (isopropil- β-D-tiogalactosídeo), que codifica o peptídio sinal pelB de endereçamento para o periplasma e que contém um sítio de clivagem por uma protease bacteriana. Isto faz com que a proteína expressa seja secretada para o meio após a proteólise, com uma pequena extensão na extremidade N-terminal, aumentando ligeiramente o peso molecular aparente do produto, porém sem afetar a atividade da enzima. Assim, o plasmídio pET26b foi novamente purificado utilizando-se o kit SV-PIus e transfectado em E. coli por eletroporação.

As células transformadas foram selecionadas por meio da resistência ao antibiótico kanamicina, 15 clones positivos foram selecionados, dos quais dois foram aleatoriamente escolhidos para confirmação da inserção (vide Figura 12).

Após a transfecção as culturas foram crescidas em meio LB (Luria- Bertani) e induzidas com IPTG: a incubação durou toda a noite a 37°C, sendo usadas para controle células transfectadas, porém não induzidas. Os resultados para a expressão da alfa-amilase de Pyrococcus furiosus em Eseheriehia coli, após coloração do gel por prata [técnica de Ansorge e colaboradores, 1985], são mostrados na Figura 13.

Pode-se observar que nas colônias induzidas por IPTG é visível o aparecimento de uma banda com peso molecular próximo a 50kDa, correspondente à amilase adicionada do pequeno peptídeo precursor. Nota-se que houve expressão de outras proteínas, porém a proteína de interesse é claramente majoritária.

Como anteriormente mencionado, o objetivo da invenção é prover um sistema enzimático com vistas a sua aplicação em fluidos de completação de poços de petróleo. Sistemas enzimáticos baseados em duas atividades enzimáticas com requerimentos diferentes de temperatura permitem o desenvolvimento de formulações contendo em um mesmo fluido de completação, um sistema de enzimas com características distintas como aquelas aqui descritas, visto existirem relatos de campos de petróleo em que produtos comerciais disponíveis sofreram desnaturação térmica quando aplicados em poços de petróleo deste tipo.

Claims (11)

1.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, caracterizado por construir um material genômico de Pyrococcus furiosus expresso em levedura, e, alternativamente, em bactéria.

2.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a levedura hospedeira utilizada é Pichia pastoris.

3.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser a bactéria hospedeira Escheriehia eoli.

4.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, caracterizado por construir um material genômico de Pyroeoceus furiosus de acordo com os seguintes passos: - amplificar um fragmento específico de DNA de Saccharomyees eerevisiae codificando alfa-amilase, pelo uso de iniciadores Pyramy; - submeter o material a um PCR utilizando uma faixa de temperatura entre 50°C e 105°C; - clonar os fragmentos desejados um usando vetor de clonagem pUC57 Iinearizado com EcoRI e Hindlll em presença de T4 DNA- ligase; - proceder à eletroporação com as células da linhagem selecionada para obter as células transformadas; - remover das células transformadas o DNA de interesse para produzir um vetor de clonagem contendo o gene da amilase de Pyroeoceus furiosus; - obter um vetor de clonagem do microorganismo hospedeiro; - transferir o vetor de interesse produzido, obtendo o plasmídio de expressão desejado.

5.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado por a amplificação de um fragmento específico de DNA codificando a alfa-amilase para uso em leveduras, utilizar iniciadores Pyramy desenhados para este fim, "forward" e "reverse", apresentando Tm= 57,9°C e Tm= 59,2°C, respectivamente.

6.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado por utilizar um vetor de clonagem pUC57, Iinearizado com EcoRl e HindIII, e T4 DNA-Iigase feito a partir do gene de Pyrococcus furiosus.

7.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado por o vetor de expressão pPIC9 para uso em levedura Pichia pastoris ser Iinearizado com as enzimas Xhol e EcoRl.

8.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado por utilizar iniciadores pelB para amplificação de um plasmídio contendo uma seqüência sinal de endereçamento da proteína expressa para o periplasma da bactéria.

9.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1, 4 e 5, caracterizado por utilizar um vetor de clonagem pGEM-T amplificado em DH 10b, extraído e digerido em Xhol e EcoRl.

10.- SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1, 4 e 5, caracterizado por utilizar o vetor de expressão pET26b para uso em bactéria Escherichia coli ser Iinearizado com as enzimas Xhol e EcoRl.

11. SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE, de acordo com as reivindicações 1, 4 e 5, caracterizado por o gene da amilase de Pyrococcus furiosus ser inserido no vetor de expressão pET26b+ Iinearizado com EcoRl e Xho 1.