BRPI1004360A2

BRPI1004360A2 - Development of a process for obtaining human albumin pegylate (hsba)

Info

Publication number: BRPI1004360A2
Application number: BRPI1004360-8A
Authority: BR
Inventors: Celso De Amorim Camara; Tania Maria Sarmento Da Silva; Rui Macedo Oliveira; Fábio Santos De Souza; Sérgio Luiz Dalmora
Original assignee: Rodrigo Albuquerque Da Costa
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2015-08-11

Abstract

Desenvolvimento de processo de obtenção de peguilado de albumina humana (hsba) a presente invenção refere-se a um processo de síntese inédito de preparação da albumina humana peguilada (hsba-peg) através de uma reação de substituição nucleofilica. A reação ocorre a partir do metoxipolietilenoglicol. Propionaldeido (2) e o grupo alfa-amino do aminoácido livre da hsba em meio ácido com o agente redutor hidreto de metal complexo.Development of a Process for Obtaining Human Albumin Pegylate (hsba) The present invention relates to a novel synthesis process for preparing pegylated human albumin (hsba-peg) by a nucleophilic substitution reaction. The reaction occurs from methoxypolyethylene glycol. Propionaldehyde (2) and the alpha-amino group of the free amino acid of hsba in acid medium with the complex metal hydride reducing agent.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO DESENVOLVIMENTO DE PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PEGUILADO DE ALBUMINA HUMANA (HSBA) Estado da arte No final dos anos 50, a modificação de proteínas tomou-se uma prática comum e foram desenvolvidas técnicas para facilitar a análise das relações entre estrutura e atividade das moléculas de proteína. Existem resíduos de aminoácidos com diferentes reatividades em uma proteína, dependendo de sua localização na estrutura da proteína nativa1.DESCRIPTIVE REPORT DEVELOPMENT OF HUMAN ALBUMIN PEGUILATE OBTAINING PROCESS (HSBA) State of the art In the late 1950s, protein modification became a common practice and techniques were developed to facilitate the analysis of the relationships between structure and activity of molecules. of protein. There are amino acid residues with different reactivities in a protein, depending on its location in the structure of the native protein1.

Desde 1970 foram publicados diversos artigos referentes à modificação química das proteínas pela conjugação com macromoléculas sintéticas, que são derivadas do polietilenoglicol (PEG)1. Os objetivos destas modificações protéicas incluíram a redução da imunoreatividade ou da imunogenicidade e a supressão da produção de imunoglobulina. Provavelmente, uma das características mais marcantes da modificação molecular usando o PEG é o aumento da meia vida e da concentração das proteínas terapêuticas no plasma sanguíneo. Estas características podem ser atribuídas, em parte, pelo aumento do peso molecular da molécula conjugada com o PEG, alterando o sistema de filtração renal e também pela redução da proteólise enzimática2. As reações de peguilação estão sendo aplicadas em compostos de natureza protéica que possuem excelentes atividades biológicas. Alguns desses compostos já estão disponíveis para o mercado ou em fase de teste clínico3. Destaca-se também o avanço no sentido do desenvolvimento de novas moléculas, especialmente a forma monopeguilada de interferon a-2a, que foi conjugada com polietileno glicol através da lisina4 observando-se que a proteína peguilada conservava a atividade antiviral, aprimorando os parâmetros farmacocinéticos5. Tais modificações também foram aplicadas na albumina sérica e na catalase na qual apresentaram redução da imunoreatividade para os respectivos anticorpos1. A proteína utilizada neste trabalho foi a albumina sérica humana (HSBA), amplamente estudada no campo da bioquímica. A HSBA é a proteína mais abundante no plasma sanguíneo sendo a principal proteína que contribui para a pressão coloidal osmótica do sangue e também para o transporte de outras proteínas para numerosos compostos endógenos e exógenos. A estrutura secundária da HSBA contém muitos resíduos de cisteína e são helicoidais em grande parte da cadeia. Apresenta fácil isolamento em grandes quantidades favorecendo sua alta estabilidade e solubilidade em água. Com uma massa molecular de 60KDa, consiste em uma única cadeia polipeptídica, contendo cerca de 580 aminoácidos. A HSBA passa por notáveis mudanças reversíveis na conformação, usualmente sob condições não fisiológicas6. Derivados peguilados na forma de amina foram desenvolvidos para reagir com carbonilas de albumina bovina por amidação em pH alcalino7 A utilização de aldeídos peguilados na literatura é encontrada para reação com o N-terminal alfa-amino de fatores de estimulação de granulócitos em condições ácidas. Tal síntese é uma reação de substituição nucleófílica e não há relato na literatura dessa síntese com o grupamento alfa-amino dos resíduos de aminoácido da HSBA.Since 1970, several articles have been published concerning the chemical modification of proteins by conjugation with synthetic macromolecules, which are derived from polyethylene glycol (PEG) 1. The objectives of these protein modifications included reduced immunoreactivity or immunogenicity and suppression of immunoglobulin production. Probably one of the most striking features of molecular modification using PEG is the increased half life and concentration of therapeutic proteins in blood plasma. These characteristics may be attributed, in part, by increasing the molecular weight of the PEG-conjugated molecule, altering the renal filtration system and also by reducing enzymatic proteolysis2. Pegylation reactions are being applied to proteinaceous compounds that have excellent biological activities. Some of these compounds are already available for the market or in clinical trials3. Also noteworthy is the advance towards the development of new molecules, especially the monopegylated form of interferon a-2a, which was conjugated to polyethylene glycol through lysine4, noting that the pegylated protein retained antiviral activity, improving pharmacokinetic parameters5. Such modifications were also applied to serum albumin and catalase in which they showed reduced immunoreactivity for their antibodies1. The protein used in this work was human serum albumin (HSBA), widely studied in the field of biochemistry. HSBA is the most abundant protein in blood plasma and is the major protein that contributes to blood osmotic colloidal pressure and also to the transport of other proteins to numerous endogenous and exogenous compounds. The secondary structure of HSBA contains many cysteine residues and is helical in much of the chain. It presents easy isolation in large quantities favoring its high stability and solubility in water. With a molecular mass of 60KDa, it consists of a single polypeptide chain containing about 580 amino acids. HSBA undergoes notable reversible changes in conformation, usually under non-physiological conditions6. Pegylated amine derivatives have been developed to react with alkaline pH amidation of bovine albumin carbonyls. 7 The use of pegylated aldehydes in the literature is found for reaction with the alpha-amino N-terminal of granulocyte stimulation factors under acidic conditions. Such a synthesis is a nucleophilic substitution reaction and there is no report in the literature of this synthesis with the alpha-amino grouping of HSBA amino acid residues.

Descrição do evento Este pedido de patente aplica-se a um processo jnédito de preparação da albumina humana peguilada (HSBA-PEG) através de uma reação de substituição nucleófílica, uma vez que não há relato na literatura dessa síntese com o grupamento alfa-amino dos resíduos de aminoácido da HSBA. A síntese ocorre a partir do metoxipolietilenoglicol propionaldeido (8) e HSBA em meio ácido com o agente redutor hidreto de metal complexo. A preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeido (8) se deu da seguinte maneira: Primeiramente ocorre uma reação ácido-base entre o PEG 2000 (1) e o tert-butóxidode potássio 95%( tBuOK)(6) com formação de um nucleófilo (2). Preferencial mente pode-se utilizar como catalisador para a reação SN2 um haleto metálico adicional. O nucleófilo haleto substitui o bromo na molécula do 2-(2-bromoetil)-1,3-dioxalano (3), originando o 2-(2-haloetil)-1,3-dioxalano(4), mais reativo. O haleto formado é melhor grupo abandonador, favorecendo a reação com o alcóxido originando o acetal (5). O acetal (5) é então hidrolisado em ácido mineral aquoso resultando no aldeído (8). A síntese da albumina humana peguilada (HSBA-PEG) ocorre através do ataque dos resíduos amina nucleofíücos (7) (pares de elétrons disponíveis no nitrogênio do resíduo alfa-amino dos aminoácidos livres da proteína) no carbono eletrofílico do aldeído peguilado (8) com formação de um intermediário deficiente de elétrons no nitrogênio (9), que sofre eliminação de água com a formação de um intermediário estável imina (10). Esta sofre uma redução pela ação do cianoboridreto de sódio em meio ácido e resultando na amina peguilada (11).Event Description This patent application applies to a novel process of preparing pegylated human albumin (HSBA-PEG) by a nucleophilic substitution reaction, as there is no report in the literature of such synthesis with alpha-amino grouping of HSBA amino acid residues. Synthesis takes place from methoxypolyethylene glycol propionaldehyde (8) and HSBA in acid medium with the complex metal hydride reducing agent. Methoxypolyethylene glycol propionaldehyde (8) was prepared as follows: First, an acid-base reaction occurs between PEG 2000 (1) and 95% potassium tert-butoxide (tBuOK) (6) with formation of a nucleophile (2) . Preferably, an additional metal halide may be used as the catalyst for reaction SN2. The nucleophile halide replaces bromine in the 2- (2-bromoethyl) -1,3-dioxalane (3) molecule, yielding the more reactive 2- (2-haloethyl) -1,3-dioxalane (4). The halide formed is the best leaving group, favoring the reaction with the alkoxide giving rise to acetal (5). Acetal (5) is then hydrolyzed to aqueous mineral acid resulting in aldehyde (8). Synthesis of pegylated human albumin (HSBA-PEG) occurs by attack of nucleophilic amine residues (7) (electron pairs available in nitrogen from alpha-amino acid residue of protein free amino acids) in electrophilic carbon of pegylated aldehyde (8) with formation of a nitrogen deficient electron intermediate (9), which undergoes water elimination with the formation of a stable imine intermediate (10). This is reduced by the action of sodium cyanoboride in acidic medium resulting in pegylated amine (11).

Detalhes do procedimento experimental químico Preparação do metoxipolietilenoglicol propionaldeido 2g de metoxipolietilenoglicol (2000KDa)( Mpeg) (1) foram dissolvidos em 25 mL de solvente dipolar aprótico não-nitrogenado e adicionados em pequenas porções sob agitação magnética vigorosa 0,308 g de tert-butoxido de potássio 95% (tBuOK) (6) à temperatura ambiente. Após 2 horas o solvente foi removido em rotaevaporador e bomba de vácuo. O sólido obtido foi solubilizado com igual volume de solvente dipolar aprótico não-nitrogenado e foram adicionados 0,15 ml de 2-(2-Bromoetil)-1,3-dioxalano 96% (3), e 0,018 g de haleto metálico. A mistura reacional ficou em temperatura ambiente e sob agitação magnética durante 5 horas. O solvente foi rotoevaporado e o sólido obtido foi dissolvido em diclorometano (50 ml). Fez-se três extrações de 10ml de água, e o extrato orgânico submetido à secagem com sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado em rotoevaporador. O produto foi cromatografado em coluna flash com clorofórmio-metanol 95:5. A formação do acetal (5) (rendimento 80 %) foi acompanhada em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHCb 95: MeOH 5 e o consumo do Mpeg foi acompanhado com auxílio do revelador de vanilina. O acetal (5) purificado foi solubilizado em 10 ml de etanol P.A. e submetido a hidrolise sob refluxo com 1 ml de ácido mineral aquoso 10% e leve aquecimento (30-40°C) até a formação do aldeído (8). A formação do aldeído peguilado (8) (75% de rendimento) foi acompanhado em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHGI3 95: MeOH 5 e revelador DNPH (2,4 dinitrofenilhidrazina 0.1% w/v em HCI 0.4% v/v). Tal síntese foi desenvolvida para aumentar o rendimento do metoxipropionaldeido peguilado8 Preparação da albumina humana peguilada 1 a 10M de metoxipolietilenoglicol propionaldeido (8) foram solubilizados em 20 ml de tampão fosfato de sódio (0,1M) (pH= 4,0) e adicionados 1M de albumina humana (7) e 20 mM de NaCNBH3, a qual ficaram sob agitação magnética ' durante 3 horas e sob temperatura ambiente. A peguilação foi realizada com uma razão molar de 1 e 10 do aldeído (8). A formação da HSBA-PEG (11) foi acompanhado pelo consumo do aldeído peguilado em cromatografia de camada delgada analítica utilizando como eluente CHCI3 95: MeOH 5 e revelador DNPH ( 2,4 dinitrofenilhidrazina 0.1% w/v em 0.4% HCI v/v).Details of the chemical experimental procedure Preparation of methoxypolyethylene glycol propionaldehyde 2g methoxypolyethylene glycol (2000KDa) (Mpeg) (1) was dissolved in 25 mL of non-nitrogenous aprotic dipolar solvent and added in small portions under vigorous magnetic stirring 0.308 g of potassium tert-butoxide 95% (tBuOK) (6) at room temperature. After 2 hours the solvent was removed by rotary evaporator and vacuum pump. The obtained solid was solubilized with an equal volume of non-nitrogenous aprotic dipolar solvent and 0.15 ml of 96% 2- (2-Bromoethyl) -1,3-dioxalane (3), and 0.018 g of metal halide were added. The reaction mixture was at room temperature and under magnetic stirring for 5 hours. The solvent was rotoevaporated and the solid obtained was dissolved in dichloromethane (50 ml). Three 10 ml water extractions were made, and the organic extract was dried with anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated by rotoevaporator. The product was flash column chromatographed with 95: 5 chloroform-methanol. The formation of acetal (5) (80% yield) was followed by analytical thin layer chromatography using CHCb 95: MeOH 5 as eluent and the consumption of Mpeg was monitored with the aid of the vanillin developer. Purified acetal (5) was solubilized in 10 mL of P.A. ethanol and hydrolyzed under reflux with 1 mL of 10% aqueous mineral acid and warmed slightly (30-40 ° C) to the formation of aldehyde (8). Formation of pegylated aldehyde (8) (75% yield) was followed by analytical thin layer chromatography using as eluent CHGI3 95: MeOH 5 and DNPH developer (2.4 dinitrophenylhydrazine 0.1% w / v in HCI 0.4% v / v ). Such synthesis was developed to increase the yield of pegylated methoxypropionaldehyde8. Preparation of 1 to 10M pegylated human albumin of methoxypolyethylene glycol propionaldehyde (8) was solubilized in 20 ml of sodium phosphate buffer (0.1M) (pH = 4.0) and added 1M of human albumin (7) and 20 mM NaCNBH3, which were under magnetic stirring for 3 hours and at room temperature. Pegylation was performed with a molar ratio of 1 and 10 aldehyde (8). The formation of HSBA-PEG (11) was accompanied by the consumption of pegylated aldehyde in analytical thin layer chromatography using CHCl3 95: MeOH 5 and DNPH developer (2.4 dinitrophenylhydrazine 0.1% w / v in 0.4% HCI v / v as eluent). ).

Posteriormente a mistura reacional foi liofilizada. Os rendimentos da reação foram obtidos em tomo de 45 a 90%. Os produtos peguilados foram caracterizados por RMN1H e RMN13C. Os dados dos principais deslocamentos de RMN1H (200 MHz, =ppm, CDCI3) e RMN13C (200 MHz, =ppm, CDCI3) estão listados na tabela 1.Subsequently the reaction mixture was lyophilized. Reaction yields were obtained around 45 to 90%. Pegylated products were characterized by1 H-NMR and13 C-NMR. Data on the major shifts of 1 H NMR (200 MHz, = ppm, CDCl 3) and 13 C NMR (200 MHz, = ppm, CDCl 3) are listed in table 1.

REFERÊNCIAS 1. KODERA,Y., MATSUSH1MA, A., HIROTO,M.,NISHIMURA, H., ISHII, A., UENO, T., INADA, Y., PEGylation of proteins and bioactive substances for medicai and technical applications, prog. Polym.sci, v.23, p. 1233-1271, 1998. 2. GRENNWALD, R. B., PEG drugs: an overview, Journal of controlled release, v. 74, p.159-171, 2001, S.Parveen, Suphiya; Sahoo, Sanjeeb K. Clinicai Applications of Polyethylene Glycol Conjugated Proteins and Drugs. Ciin Pharmacokinet V 45 (10), P. 965-988. 2006. 4. FOSER, S.; SCHACHER, A.; WEYER, K. A.; BRUGGER, D.; DIETEL, E.; MARTI, S.; SCHREITMÜLLER, T. Isolation, structural characterization, and antiviral activity of positional isomers of monopegylated interferon a-2a (PEGASYS). Protein Expression and Purification, v.30, p. 78-87, 2003. 5. ARDUINI, R. M.; LI, Z.; RAPOZA, A.; GRONKE, R.; HESS, D. M.; WEN, D.; MIATKOWSKI, K.; COOTS, C.; KAFFASHAN, A.; VISEUX, N.; DELANEY, J.; DOMON, B.; YOUNG, C. N.; BOYNTON, R.; CHEN, L. L.; CHEN, L.; BETZENHAUSER, M.; MILLER, S.; GILL, A.; PEPINSKY, R. B.; HOCHMAN, P. 5. ; BAKER, D. P. Expression, purification, and characterization of rat interferon-β and preparation of an N-terminally PEGylated form with improved pharmacokinetic parameters. Protein Expression and Purification, v. 34, p. 229-242, 2004. 6. NAKAMURA, K., ERA, S., OZAKI, Y., SOGAMI, M..HAYASHI, T., MURA KAMI, M., Conformation changes in seventeen cystine disulfide bridges of bovine serum albumin proved by raman spectroscopy, federation of European biochemical societies letters, v. 417, p.375-378, 1997. 7. WANG, W., Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, intemational joumal of Pharamceuticals, v. 203, p. 1-60, 2000. 8. ZHAO,YONG-JIANG, ZHAI, YAN-QIN. SU. ZHI-GUO. Kinetic analysis and ímprovement of the Williamson reaction for the synthesis of (polyethylene glycol) propionaldehyde. Journal of applied polymer Science, vol.111. pag 1638-1643. 2009REFERENCES 1. KODERA, Y., MATSUSH1MA, A., HIROTO, M., NISHIMURA, H., ISHII, A., UENO, T., INADA, Y., PEGylation of proteins and bioactive substances for medical and technical applications, prog. Polym.sci, v.23, p. 1233-1271, 1998. 2. GRENNWALD, R. B., PEG drugs: an overview, Journal of controlled release, v. 74, p.159-171, 2001, S. Parveen, Suphiya; Sahoo, Sanjeeb K. Clinical Applications of Polyethylene Glycol Conjugated Proteins and Drugs. Ciin Pharmacokinet V 45 (10), P. 965-988. 2006. 4. FOSER, S .; SCHACHER, A .; Weyer, K. A .; Brugger, D .; DIETEL, E .; MARTI, S .; SCHREITMÜLLER, T. Isolation, structural characterization, and antiviral activity of positional isomers of monopegylated interferon a-2a (PEGASYS). Protein Expression and Purification, v.30, p. 78-87, 2003. 5. ARDUINI, R. M .; L1, Z .; RAPOZA, A .; GRONKE, R .; HESS, D. M .; WEN, D .; MIATKOWSKI, K .; COOTS, C .; KAFFASHAN, A .; VISEUX, N .; DELANEY, J .; DOMON, B .; YOUNG, C.N .; BOYNTON, R .; CHEN, L.L .; CHEN, L .; BETZENHAUSER, M .; Miller, S .; GILL, A .; PEPINSKY, R. B .; HOCHMAN, P. 5.; BAKER, D. P. Expression, purification, and characterization of interferon-β rat and preparation of an N-terminally PEGylated form with improved pharmacokinetic parameters. Protein Expression and Purification, v. 34, p. 229-242, 2004. 6. NAKAMURA, K., ERA, S., OZAKI, Y., SOGAMI, M.HAYASHI, T., MURA KAMI, M., Conformation changes in seventeen cystine disulfide bridges of bovine serum albumin prov by raman spectroscopy, federation of European biochemical societies letters, v. 417, p.375-378, 1997. 7. WANG, W., Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, international journal of Pharmaceuticals, v. 203, p. 1-60, 2000. 8. ZHAO, YONG-JIANG, ZHAI, YAN-QIN. SU. ZHI-GUO. Kinetic analysis and improvement of the Williamson reaction for the synthesis of (polyethylene glycol) propionaldehyde. Journal of Applied Polymer Science, Vol.111. page 1638-1643. 2009

Claims

1.

DEVELOPMENT OF HUMAN ALBUMIN PEGUILATE PROCESSING (HSBA) A.

Use of the methoxypolyethylene glycol propionaldehyde pegylated albumin (HSBA) process at 1 to 10 M aldehyde to 1 M HSBA ratios; B. Use of lyophilization technology to obtain pegylated HSBA with methoxypolyethylene glycol propionaldehyde; C. Use of pegylated HSBA lyophilized product obtained with methoxypolyethylene glycol propionaldehyde and HSBA in 1 to 10 M proportions of aldehyde to 1 M HSBA. D. Use of the metal halide catalyst in the nucleophilic substitution step to increase the alkylation yield of Mpeg with 2- (2-Bromoetii) -1,3-dioxalane.