BRPI1003895A2 - processo de obtenÇço de supermachos (yy) e fÊmeas duplo haploides (xx) de tilÁpias com manipulaÇço cromossâmica, linhagens de super machos (yy) e linhagens de fÊmeas duplo haploides (xx), processo de transferÊncia de gene da caracterÍstica de interesse para tilÁpias normais e seus usos - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE OBTENÇçO DE SUPERMACHOS (YY) E FÊMEAS DUPLO HAPLOIDES (XX) DE TILÁPIAS COM MANIPULAÇçO CROMOSSOMICA, LINHAGENS DE SUPER MACHOS (YY) E LINHAGENS DE FÊMEAS DUPLO HAPLOIDES (XX), PROCESSO DE TRANSFERÊNCIA DE GENE DA CARACTERISTICA DE INTERESSE PARA TILÁPIAS NORMAIS E SEUS USOS A presente invenção se refere ao processo de produção de linhagem de tilápia supermacho (YY), especialmente tilápia nilótica variedade careca, por meio de manipulação cromossômica, fecundação in vitro e do emprego da característica morfológica dos indivíduos gerados como marcadores fenotípicos, para controle do processo de obtenção dos peixes de interesse. Processo inserido no campo técnico de criação de animais aquáticos e os peixes obtidos proporcionam a criação de tilápias em escala industrial, melhorias nas condições de manejo e no rendimento de produção de carne do produto final. Tal processo também é utilizado para a obtenção de fêmeas duplohaplóides (XX), utilizadas principalmente como matrizes para a manutenção e propagação de tilápias carecas. Este processo ainda é utilizado para produção de matrizes e/ou reprodutores adequados à produção de peixes (XY)/GMT (Tilapia male genetically) utilizados no processo de engorda. Ainda é proposto um processo de geração e multiplicação da linhagem de tilápias carecas a partir de indivíduos normais.

Description

"PROCESSO DE OBTENÇÃO DE SUPERMACHOS (YY) E FÊMEAS DUPLO HAPLOIDES (XX) DE TILÁPIAS COM MANIPULAÇÃO CROMOSSÔMICA, LINHAGENS DE SUPER MACHOS (YY) E LINHAGENS DE FÊMEAS DUPLO HAPLOIDES (XX), PROCESSO DE TRANSFERÊNCIA DE GENE DA CARACTERÍSTICA DE INTERESSE PARA TILÁPIAS NORMAIS E SEUS USOS"

A presente invenção se refere ao processo de produção de uma nova linhagem de tilápia supermacho (YY)1 mais especificamente, tilápia nilótica da espécie Oreochromis niloticus, variedade careca, por meio de manipulação cromossômica, fecundação in vitro e do emprego da característica morfológica dos indivíduos gerados como marcador fenotípico, para controle do processo de obtenção dos peixes de interesse.Tal processo se insere no campo técnico de criação de animais aquáticos e os peixes com a característica de supermachos obtidos têm a finalidade de proporcionar a criação de tilápias em escala industrial, especialmente da espécie O. niloticus, melhorias nas condições de manejo durante o cultivo e melhorias no rendimento de produção de carne do produto final, representado pelo peixe adulto, pronto para o abate e posterior consumo humano ou processamento de outros produtos alimentícios a base de carne de peixe ou seus derivados (óleos, cartilagem, ossos, pele, etc.)· A presente invenção também está relacionada à obtenção de

fêmeas duplo haplóides (XX), mais especificamente, tilápia nilótica da espécie Oreochromis niloticus, variedade careca. Essas fêmeas são utilizadas principalmente como matrizes adequadas à manutenção e propagação do processo de obtenção de tilápias carecas. Estes peixes, apesar de serem obtidos com técnicas de

manipulação cromossômica nos indivíduos parentais, sua prole não se referem a Organismos Modificados Geneticamente (GMO) e as modificações relacionadas às técnicas de androgênese utilizadas, não interferem nos padrões de aspecto e sabor da carne, representando um processo de criação de tilápias livre de adição de hormônios sexuais. Além disso, a seleção das variedades de supermachos (YY) e de fêmeas duplo haplóides (XX) pelo processo aqui proposto, também permite o seu emprego de forma isolada como reprodutores ou matrizes respectivamente, e ainda com a possibilidade de cruzamento entre os supermachos (YY) com fêmeas normais para obtenção de progênie 100% machos do tipo (XY)1 também conhecidos como peixes GMT (Tilapia male genetically), geralmente destinado à engorda comercial. Dessa forma, o processo de obtenção de tilápias com manipulação cromossômica aqui proposto é utilizado para produção de matrizes e/ou reprodutores adequados à produção de tilápias por outros processos já estabelecidos pela técnica, como por exemplo, peixes (XY)/GMT largamente utilizados no processo de engorda.

Outro aspecto da presente invenção está relacionado ao processo de transferência do gene da característica de interesse, mais especificamente da variedade "careca", para a obtenção de tilápias carecas, a partir de tilápias normais. Este processo envolve etapas de seleção dos indivíduos de interesse e cruzamentos controlados para formação de híbridos ou indivíduos melhorados geneticamente, especialmente envolvendo a participação das linhagens duplo haploides obtidas pelo processo de obtenção de tilápias aqui proposto.

Estado da Técnica

Em aquicultura, o desenvolvimento de técnicas de manejo e cultivo de peixes, especialmente tilápias, tem despertado o interesse nos últimos anos. Dentre as espécies de tilápias, tais como tilápia do Nilo ou nilótica (Oreochromis niloticus), tilápia vermelha (Oreochromis aureus), tilápia mossambica (Oreochromis mossambicus), tilápia de Zanzibar (Oreochromis hornorum) etc., as tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) são as mais promissoras para o cultivo em grande escala devido, principalmente, a algumas características desejáveis: boa qualidade de carne (textura e sabor), elevada resistência às doenças relativamente comuns em peixes, ampla tolerância a diferentes condições ambientais ou climáticas e facilidade de reprodução em cativeiro.

Atualmente, no Brasil o processo de reprodução comercial de tilápias envolve criadores especializados, os quais mantêm um plantei de matrizes e reprodutores, e fornecem os alevinos aos piscicultores de uma determinada região. Geralmente, é feita a reprodução natural em tanques redes com malha de 1 a 2 mm, conhecidos por "hapas", retirando-se os ovos da boca das fêmeas periodicamente, e posteriormente, realizando-se a incubação em galpões, utilizando-se incubadoras específicas. Após o nascimento, as larvas recebem ração com hormônio (masculinizante) por 30 a 40 dias, e se transformam em alevinos prontos para serem recriados em viveiros ou gaiolas de engorda.

Existe uma preferência dos piscicultores de engorda em conseguir

"alevinões" também chamados de juvenis, Os juvenis podem ser produzidos a partir dos alevinos. Neste caso, um criador intermediário gasta cerca de 40 a 60 dias de manutenção dos alevinos em sua propriedade e no final vende os juvenis com peso entre 25 a 65g. A avaliação dos peixes obedece a critérios de qualidade em relação à procedência, idoneidade do produtor e garantia do índice de inversão sexual, que deve ter uma média de 98% de machos e apresentar homogeneidade no lote e estar livre de doenças. Para isso, alguns cuidados são necessários, tais como: aspectos nutricionais do alimento, proteção contra predadores, estrutura para o acesso do tratador e adequação da estabilidade dos parâmetros físico/químicos do meio.

A programação da produção (e da comercialização) somente será possível com o domínio da disponibilidade de juvenis. A engorda dos peixes, até atingir o peso comercial (produto final entre 400 a 800g), pode ser feita em gaiolas nos reservatórios e também em tanques escavados. A próxima fase é a despesca e venda final para um frigorífico ou consumidor final (HEIN, G.; PARIZ, M.L.V.; BRIANESE, R.H. Tilapia Referência modular para o Oeste do Paraná Agricultor familiar, semi-intensivo, Tanques escavados, clima Cfa (segundo classificação de Kõppen). Uma atividade que agrega renda a propriedade em áreas marginais (EMATER, Toledo-PR, 27 p. 1994). É de conhecimento, que em sistemas de criação de tilápias, o

desenvolvimento dos indivíduos machos (da fase Iarval à fase adulta) é mais rápido e uniforme do que os observados para as fêmeas. Além disso, a precoce maturação sexual das fêmeas acaba competindo com seu crescimento devido à procriação, sendo comum durante a coleta, a presença de grande quantidade de indivíduos fêmea com tamanhos pequenos e disformes com relação aos machos, representando uma diminuição na quantidade de carne estimada para a produção de peixe para um determinado período. Neste sentido, o maior problema na produção comercial de tilápias está relacionado ao crescimento mais lento das fêmeas em relação ao dos machos. Entretanto, há algumas propostas técnicas para produção de tilápias que visam solucionar esses problemas que afetam a produtividade. Entre estas técnicas destacam-se: - o uso de alimentação especial; - inversão sexual ou indução de sexo via administração de hormônios adequados, principalmente na fase de diferenciação sexual; - processos de obtenção de larvas híbridas de tilápias com características adequadas; e - processos de produção e engorda somente de indivíduos machos. O emprego de alimentação especial normalmente visa o aumento

da taxa de crescimento e/ou a taxa de sobrevivência, como por exemplo, a formulação de alimentação de tilápia descrita no pedido de patente CN101473904-A a base de proteína, gordura, entre outros ingredientes. Existem ainda formulações alimentícias para tilápias especialmente elaboradas de acordo com o seu estágio de desenvolvimento, como por exemplo, a descrita no pedido de patente CN101461468-A, destinada à alimentação de tilápia em estágio pós-larval, ou de acordo com o perfil da espécie, como por exemplo, o promotor de crescimento de tilápias híbridas em fase Iarval apresentada no pedido de patente CN101574125-A, contendo fosfolipídios, vitaminas CeE, entre outros aditivos. Propostas de melhora da qualidade da carne do peixe produzido por meio da alimentação são encontradas, como é o caso citado no pedido de patente CN101548728-A, destinada à alimentação de algumas espécies de tilápias. De forma geral, nos processos de cultura de tilápias a alimentação especial é utilizada como aditivo alimentar para redução de custos. Para o caso das técnicas de inversão sexual, suas aplicações

visam à criação e engorda de todos os indivíduos com características de macho, geralmente alcançadas pela administração de hormônios sexuais adequados, preferencialmente, na fase de diferenciação sexual. Essa prática é relativamente comum em processos de criação de tilápia. Por exemplo, é empregada em técnicas de feminilização dos indivíduos machos, para a obtenção de fêmeas com cromossomos (XY). Neste caso os estrógenos como o estradiol, a progesterona dentre outros são largamente utilizados nesses processos de obtenção de fêmeas genotipicamente "macho". Por outro lado, uma situação inversa é obtida com hormônios masculinos como o alfa metil testoterona, largamente utilizado nos processos de obtenção de machos genotipicamente fêmeas.

Práticas que envolvem pelo menos uma etapa de feminilização da tilápia são apresentadas nos pedidos de patente CN101449664-A, CN101416613-A, PI0603193-5A e KR0139567B por meio do uso de hormônios femininos. Os peixes assim obtidos geralmente destinam-se a programas de melhoramento genético e/ou obtenção dos peixes supermachos.

Também são utilizadas práticas que visam a obtenção de maior número de machos no meio produtivo, a partir da masculinização das fêmeas. Entretanto, mesmo com o sucesso dessa técnica, os peixes invertidos sexualmente, apresentam um crescimento mais lento e maior consumo de ração, sendo observadas variações nas taxas de crescimento (pouca homogeneidade no produto final). Dessa forma, processos de produção para a obtenção de supermachos (YY) são bastante promissoras, pois não apresentam tais inconvenientes. Este é o caso do processo de criação de tilápia supermacho (YY) apresentado em PI0603193-5A, que combina os processos de feminilização e seleção de alevinos na obtenção de indivíduos supermachos (YY). Normalmente, estas práticas requerem posterior seleção e cruzamento entre os indivíduos selecionados, o que demanda um maior tempo na obtenção do indivíduo de interesse; o que não ocorre para o processo de produção de supermachos (YY) da presente invenção. Estes casos são inseridos em técnicas de produção exclusiva de machos, os quais abordam diferentes estratégias na obtenção de indivíduos machos na prole de tilápia do Nilo. Estratégias baseadas em repetições de seleção e cruzamento de

indivíduos selecionados geralmente apresentam uma limitação de custo operacional com mão de obra, custo com alimentação e com espaços de cultivo isolados ou que requerem práticas de marcação dos indivíduos de interesse, até a obtenção de matrizes adequadas, pois devido ao elevado número de testes de progênie, somado às dificuldades técnicas de marcação, é comum a ocorrência de erros durante a seleção.

Tentativas de minimizar tais erros, principalmente em processos de obtenção de tilápias, que requerem números elevados de cruzamentos controlados, são apresentados em alguns pedidos de patentes, por meio de métodos de marcação ou rotulagem individual, como apresentado em CN101433188-A, que apresenta a introdução de um pino plástico apropriado (entre 2 e 4 cm) nas tilápias por meio de um injetor de etiquetas, envolvendo anestesia e insumos para a desinfecção local durante a aplicação. Outro exemplo de marcação artificial para a criação seletiva de tilápias é descrito em CN101238800-A.

Outras propostas visam minimizar os erros e facilitar os processos de seleção dos indivíduos. Notadamente propiciados por barreiras físicas e marcação do corpo dos indivíduos envolvidos. Este é o caso do método de acoplamento entre tilápias macho e fêmea em gaiolas dispostas em lagoas naturais ou artificiais ao ar livre ou cobertas descrito em CN101138329-A, onde a marcação para a seleção e controle é feita por um corte no maxilar superior das tilápias. Para aplicação dessa técnica é necessário ambiente livre de contaminação, esterilização dos equipamentos utilizados e da parte do corpo do peixe onde sofrerá o corte, representando gastos com mão de obra e de insumos para a desinfecção/descontaminação.

A utilização de critérios de seleção relacionados à detecção de alguma característica física visual marcante (característica fenotípica) se mostra bastante viável por não requerer o emprego de marcadores artificiais ou sistemas físicos de separação dos indivíduos de interesse. Entretanto, o principal problema encontrado está ligado ao fato de que algumas características singulares, que podem ser utilizadas como critérios de marcação, muitas vezes são bastante sutis, sendo necessária a observação de outros critérios de seleção para minimizar os erros provenientes de testes de progênie envolvendo indivíduos inadequados. Este é o caso do método de produção de tilápia do Nilo baseado apenas na seleção, cruzamentos controlados e separação dos indivíduos para novos cruzamentos descritos no pedido de patente CN1926971-A ou CN100496232-C, onde a cor do peixe é um fator importante para a seleção dos indivíduos de interesse. Entretanto, neste caso, a cor e o tamanho atingido pelo peixe adulto devem ser analisados em conjunto para minimizar erros provenientes de seleção apenas pela cor. Os processos de hibridação entre espécies de tilápias também são aplicados na criação de peixes exclusivamente machos. Por exemplo, o caso apresentado em CN101411313-A, que divulga um método de produção de híbridos de tilápia vermelha geneticamente masculina. Esta hibridação é fundamentada pelo cruzamento entre tilápia vermelha fêmea e supermachos (YY) de tilápia nilótica para a propagação do cruzamento, sendo a tilápia vermelha previamente selecionada (10 anos para a purificação) e o supermacho (YY) de tilápia nilótica obtido por meio da técnica de YY/GMT. A técnica GMT (a sigla GMT em inglês significa "genetically male tilapia") refere-se aos peixes machos de genótipo também (XY) obtidos a partir do cruzamento entre fêmeas normais (XX) com machos (YY) e não de machos (XY). Estes peixes (XY)/GMT são os que se destinam à engorda, enquanto os (YY) só são utilizados como reprodutores. Esta condição é alcançada por cruzamentos controlados diferentes do convencional: quando cruzados, seguindo o padrão biológico da espécie, um macho normal (XY) com uma fêmea também normal (XX) de tilápia nilótica, obtém-se peixes 50% (XY) machos normais e 50% (XX) fêmeas normais, no entanto, quando cruzamos peixes (YY) com fêmeas normais (XX) obtemos teoricamente 100% (98-100%) de peixes (XY) que apesar de serem machos e terem o mesmo genótipo (XY) dos machos convencionais, não foram obtidos da mesma forma e então são conhecidos como GMT.

A hibridação de tilápias visando à obtenção de machos também é utilizada na resolução do problema da reprodução excessiva no processo de criação de tilápias, contribuindo simultaneamente com o crescimento mais uniforme entre os indivíduos, propiciando bons resultados na coleta da safra e reduzindo os custos de produção. Um exemplo está descrito no pedido de patente CN101518216-A, onde a população masculina de tilápias provém de cruzamentos entre as espécies O. mossambicus (fêmea) e O. hornorum (masculino).

Existem ainda, propostas de obtenção de criação de tilápias do Nilo majoritariamente machos, como a apresentada em CN101564018-A, baseada na estimulação da produção de machos pelo controle da temperatura da água e promoção de choque térmico. A criação de tilápias é bastante promissora em todo o mundo, mesmo em condições climáticas adversas, principalmente em regiões frias, como apresentado em CN101518215-A, referente ao método de cultivo de tilápias resistentes ao frio, baseadas na seleção e cruzamentos de indivíduos de interesse.

O grande problema dos processos de criação de tilápias abordados acima é o tempo relativamente longo para a seleção dos indivíduos de interesse (utilizados para a criação e engorda), o que não ocorre para o processo de produção de tilápias da presente invenção. Não se trata de uma tecnologia que envolve simplesmente a seleção de alevinos e sucessivos cruzamentos específicos até a obtenção da população de supermachos (YY) pretendida. Estes supermachos apresentam genótipo (YY) (dois cromossomos sexuais machos) ao invés da forma comum encontrada (XY) do genótipo macho. Os indivíduos supermachos (YY) e seus descendentes são peixes absolutamente normais com grande taxa de crescimento e homogeneidade de tamanhos.

O processo de produção de tilápias, aqui proposto, envolve de

forma geral as etapas de: seleção de matrizes e reprodutores; manipulação cromossômica na promoção da inativação do genoma e da restauração da diploidia, inserida na técnica de manipulação cromossômica conhecida por androgênese; e aproveitamento das características fenotípicas dos indivíduos de interesse para a avaliação do sucesso de obtenção de supermachos (YY). Por exemplo, para tilápias da espécie O. niloticus, variedade careca, a ausência das nadadeiras dorsal e anal servem como marcadores fenotípicos, aparentes a olho nu, sem necessidade de acompanhamento com testes de progênie controlados, os quais requerem tempo longos de monitoração até alcançar os resultados, demandando mão-de-obra e custos de manejo no cultivo dos peixes.

Para a fase de seleção de matrizes e reprodutores a referência é HERBST (2002) (HERBST, Eric Christopher. Induction of tetraploidy in zebrafish Danio rerio and Nile tilápia Oreochromis niloticus. 2002. 100f. Dissertation (Master of Science in Forestry, Wildlife and Fisheries) Lousiana State University and Agricultural and Mechanical College). Para as fases de inativação do genoma e restauração da diploidia do genoma, as referências são BONGERS et ai. (1994) e VOZZI et al. (2003) (BONGERS, A. B. J.; VELD, Ε. P. C.; ABO- HASHEMA, K.; BREMMER, I. M.; EDING, Ε. H.; KOMEN, J.; RICHTER, C. J. J. Androgenesis in common carp (Cyprinus carpio L.) using UV irradiation in a synthetic ovarian fluid and heat shocks. Aquaculture, 122, 119-132, 1994; e VOZZI, Ρ. A.; SÁNCHES, S.; PERMINGEAT, E. D. Inducción de triploidia en Rhamdia queien (PISCES, PIMELODIDAE). Boletim do Instituto de Pesca, 29(1), 87-94, 2003).

A "tilápia careca" foi escolhida devido às suas características fenotípicas marcantes. Trata-se de um peixe que não possui a nadadeira dorsal nem a anal. Por se tratar de uma característica recessiva estável e não letal, pode ser utilizada também como marcadora fenotípica, para confirmação do sucesso da aplicação da tecnologia de manipulação cromossômica conhecida como androgênese, constituindo em um diferencial do presente processo de obtenção de supermachos (YY) com relação às demais propostas.

A característica utilizada como marcadora fenotípica em indivíduos carecas provém de mutação natural, sendo os peixes aqui utilizados, anteriormente selecionados e caracterizados por GUILHERME (1994) (GUILHERME, L. C. Constatação, seleção e reprodução da tilápia nilótica Oreochromis niloticus sem as nadadeiras dorsal e anal. Ciência e Prática, Lavras, v. 18, n. 1, p. 123 - 124, 1994) por meio de pesquisa, indicando que as anomalias observadas (ausência de algumas nadadeiras específicas) em uma progênie de tilápia nilótica (O. niloticus) não se tratavam de gene letal. A ação do gene ocorria quando em homozigose, sendo recessiva. Entretanto, tal característica é contrária àquela reportada na Universidade de Auburn, estado do Alabama, nos Estados Unidos no mesmo período, sendo considerada letal para os indivíduos com tal mutação (TAVE, D.; BARTELS, J. E.; SMITHERMAN, R. O. Saddleback: a dominant. Lethal gene in Sarotherodon aureus (Steindachner) (= Tilápia aurea). Journal of Fish Diseases, 6, 59-73, 1983). Esta foi a primeira referência sobre "tilápia careca". Estes autores identificaram no plantei de Tilapia aurea (Sarotherodon aureus, hoje rebatizada como Oreochromis aureus), espécie distinta da utilizada nesta proposta, exemplares com deformações na nadadeira dorsal e anal, e às vezes, as nadadeiras peitorais e pélvicas, também se apresentavam deformadas. A ausência destas nadadeiras foi relacionada à ação de um gene letal dominante, que se manifestava quando em homozigose, sendo que os animais heterozigotos eram os portadores da anomalia. Os animais portadores foram denominados "saddleback".

O autor da presente invenção não tinha conhecimento do trabalho realizado nos Estados Unidos (TAVE et al (1983), mencionado anteriormente), mas as pesquisas e os processos de seleção desses peixes continuaram. A partir daí, uma linhagem de tilápias, sem a nadadeira dorsal e anal, foi selecionada. Este peixe destacou-se como peixe forrageiro e foi intensamente utilizado como alimento vivo nas criações de espécies carnívoras, no final da década de 1980 e início da de 1990 no Brasil. Multiplicado em uma Estação de Piscicultura particular, localizada na cidade de São Sebastião do Paraíso no estado de Minas Gerais, foi distribuído para diversos estados brasileiros. Nesta época, este peixe teve destaque em uma matéria exclusiva na televisão no programa Globo Rural. Durante a reportagem, colocada no ar em 21/11/1993, a descoberta de GUILHERME recebeu o apelido de "Tilápia careca" que se mantém até hoje, sendo citado o artigo submetido em 1992 e, posteriormente, publicado em 1994 (GUILHERME (1994)).

Neste período, as tilápias de um modo geral, não tinham o prestígio de hoje. Confundida com as tilápias descobertas na Universidade de Auburn, que apresentavam a característica "saddleback", provocada por um gene letal, também não despertou interesse nos pesquisadores. Mesmo apresentando as vantagens de não ferir os trabalhadores com os raios duros da nadadeira dorsal e anal, e não embaraçar as redes, a "tilápia careca" não foi selecionada ou melhorada para ocupar este espaço, permanecendo apenas com o status de aberração curiosa. Estes fatos são confirmados pela total ausência de trabalhos publicados envolvendo este peixe desde a comunicação científica feita por GUILHERME (1994) e por TAVE et al (1983), mencionados anteriormente.

Ressalta-se que os indivíduos mutantes naturais "saddleback" sem algumas nadadeiras são diferentes da "tilápia careca" utilizada no processo de obtenção de supermachos (YY) da presente invenção. Embora o estágio inicial do processo de obtenção desses peixes seja obtido com técnicas de manipulação cromossômica, os indivíduos de "tilápia careca", são provenientes de mutações naturais, e o produto final de interesse (supermachos (YY) e seus descendentes) não corresponde a Organismos Modificados Geneticamente (GMO). Os animais Geneticamente Modificados são aqueles que apresentam genes oriundos de outras espécies inseridos no seu DNA por técnicas de engenharia genética, o que não ocorre no processo de obtenção de supermachos (YY) da presente invenção. Além disso, ressalta-se que esses peixes não representam danos à saúde dos consumidores. Os aspectos de purificação e avaliação da estabilidade genética das tilápias nilóticas (O. niloticus) dos mutantes "carecas", contaram com acompanhamento da criação desses peixes ao longo de 20 anos, contribuindo com a apuração de que a característica "careca" proporciona estabilidade de geração em geração, dando suporte à aplicação do presente processo de forma segura e por não interferir nos padrões de qualidade do produto final (carne com aspecto, textura e sabor preservados com relação a O. niloticus normal, sem a mutação de interesse), uma vez que são utilizados na etapa inicial do processo, machos "carecas" como reprodutores devidamente selecionados.

O processo de manipulação cromossômica utilizado na criação desses supermachos (YY) é descrito pela técnica de androgênese. A androgênese consiste da obtenção de indivíduos com material genético apenas paterno, e é utilizada para se obter peixes supermachos (YY) (SHELTON, W. L. Methods for androgenesis techniques applicable to tilápia. In: McEIwee, k.; Burke, D.; Niles, M.; Cummings, X.; Egna, H. (Editors), Seventeenh Annual Technical Report. Pond Dynamics /Aquaculture CRSP, Oregon State University, Corvallis, Oregon, p. 51 - 55, 2000). Este autor descreve dois tratamentos distintos para a aplicação da técnica de androgênese em peixes: inicialmente é realizada a desativação do genoma feminino. Os ovócitos tratados com Luz Ultra Violeta (UV) são ativados por espermatozóides normais. Em seguida, aplica-se o choque térmico para interromper a primeira cariocinese mitótica recuperando-se assim a diploidia.

A modificação genética conhecida como androgênese, tem como princípio básico a manipulação cromossômica e esta se refere às alterações no sexo e na ploidia celular. O uso de peixes modificados geneticamente apresenta como principais vantagens, a eliminação do uso de hormônios e redução do manejo de reprodutores em instalações simplificadas. Esta técnica é relativamente bem estabelecida, apresentando diversas formas de aplicação, como exemplificado a seguir:

MARENGONI & ONOVE (1998) descreveram um método para obtenção de peixes com características androgenéticas (MARENGONI, N. G.; ONOVE, Y. Ultraviolet-induced androgenesis in Nile tilápia, Oreochromis niloticus (L), and hybrid Nile χ blue tilápia, O. áureas (Steindachner). Aquaculture Research. 29, 359-366, 1998).

HORVÁTH & ORBÁN (1995) discutiram sobre as implicações das modificações dos genomas de peixes (HORVÁTH, L.; ORBÁN, L. Genome and gene manipulation in the common carp. AquacultureA29, 157-181, 1995).

GRUNINA et al (1995) também realizaram a técnica da androgênese e obtiveram peixes modificados androgeneticamente (GRUNINA, A. S.; RECOUBRATSKY, Α. V.; EMELYANOVA, O. V.; NEYFAKH, A. A. Induced androgenesis in fish: production of viable androgenetic diploid hybrids. AquacultureA37, 149-160, 1995).

MYERS et al (1995) e MAIR (1993) também realizaram experiências envolvendo androgênese na criação de tilápias e discutiram sobre as implicações da utilização dessa técnica (MYERS, J. M.; PENMAN, D. J.; RANA, K. J.; BROMAGE, N.; POWELL, S. F.; McANDREW, B. J. Apllications of induced androgenesis with tilápia. Aquaculture. 137, 149-160, 1995; MAIR, G. C. Chromosome-set manipulation in tilápia - techniques, problems and prospects. Aquaculture. 111(1-4), 227-244, 1993).

O processo de obtenção de supermachos (YY) de tilápia nilótica em escala industrial mais difundido ou o mais próximo da presente invenção está descrito na patente coreana KR0139567B. Estes supermachos (YY) são utilizados como reprodutores na piscicultura comercial, principalmente em países asiáticos, onde são empregados na produção de populações monossexo machos, conhecidos como GMT (Genetically Male Tilapia). Estes animais começaram a aparecer no Brasil por meio de importações, tornando-nos dependentes desta tecnologia, apesar de haver um pedido de patente PI0603193-5A referente a um processo similar de obtenção de peixes descritos na patente KR0139567B. Portanto, a presente invenção visa contribuir com o desenvolvimento socioeconômico nacional, propiciando um melhoramento na tecnologia da criação de tilápias em escala industrial e disponibilizar matrizes e reprodutores para alcançar um nível de melhoramento genético de qualidade e competitividade frente às exigências de um mercado globalizado.

Na patente KR0139567B, bem como no pedido PI0603193-5A, a metodologia de obtenção de tilápias supermachos (YY) utiliza a feminilização das larvas, que darão origem às matrizes, por meio da técnica de inversão sexual, como ponto inicial do processo, seguido de várias gerações, cujas progênies são criadas e selecionadas para se chegar aos supermachos (YY). Este conjunto de ações não ocorre na presente invenção e constitui uma das principais diferenças entre os processos da presente invenção, possibilitada pela aplicação da manipulação cromossômica inserida na técnica de androgênese na fase inicial e uso das características fenotípicas da variedade careca como marcadoras para a seleção dos indivíduos de interesse.

O processo de obtenção de supermachos (YY), aqui proposto, visa à obtenção do peixe (YY) já na primeira geração, não sendo necessária a criação até a fase adulta, para reconhecimento dos machos (YY). Esta facilidade só é possível devido à utilização de reprodutores com a característica fenotípica recessiva para a ausência das nadadeiras dorsal e anal, encontrada na "tilápia careca", que permite identificar o genótipo em questão (YY) e que torna a aplicação da androgênese viável para este fim. A aplicação dos supermachos (YY) e/ou fêmeas duplo haploides (XX), resultantes desse processo de obtenção supermachos (YY), também poderá ser utilizada para a obtenção de peixes GMT, de características comerciais atualmente empregados em piscicultura. Alguns trabalhos já foram realizados para comprovar o melhor desempenho dos peixes GMT quando criados comercialmente em diversos ambientes. MAIR, et a/.(1995) é um dos trabalhos mais significantes nesse sentido (MAIR, G. C.; ABUCAY, j. S.; BEARDMORE, J. A.; SKIBINSKIA, D. O. F. Growth performance trials of genetically male tilapia (GMT) derived from YY-males in Oreochromis niloticus L.: On station comparisons with mixed sex and sex reversed male populations. Aquaculture, 137, 1-4, 313-323, 1995). Os resultados desse trabalho indicam que a cultura de peixes GMT pode melhorar o rendimento comercial em todos os ambientes. Em viveiros, em um primeiro experimento, os resultados para GMT apresentaram maior rendimento do que as tilápias sem sexagem, ou seja, machos e fêmeas misturados (+58,8%) e tilápias com inversão de sexo (+31,03%). O segundo experimento, seguindo a mesma concepção, mostrou uma tendência similar, embora as diferenças fossem menores. As produções médias de GMT são 11,9% maior do que tiiápias sem

sexagem manual criadas consorciadas com cultura de arroz e entre 33,6% a 47,0% maiores nos sistemas de recirculação. Portanto, GMT produzidos a partir de cruzamentos utilizando-se machos (YY) tem potencial para aumentar os rendimentos da cultura de tilápias.

Dessa maneira, ressaltam-se como vantagens do processo de

obtenção de tilápias supermachos (YY) a partir do emprego de tilápias da espécie O. niloticus, variedade careca:

• Peixes (YY) apresentam taxas de crescimento maiores, tanto em relação a indivíduos que sofreram inversão sexual (XY)1 quanto para fêmeas (XX), possibilitando ao criador aumentar o número de safras por ano ou

aumentar a produção de carne.

• Práticas de cultivo simplificadas e mais baratas por não requererem marcações de indivíduos e separação física de lotes para a seleção de matrizes, não havendo necessidade de controle de qualidade da água livre de contaminantes e insumos de desinfecção, necessários quando se emprega

marcação física nos peixes (introdução de objetos ou cortes específicos no corpo dos peixes).

• Apresenta manejo de peixes com maior segurança operacional, devido à ausência de nadadeiras em certas posições do corpo, contribuindo com a redução de riscos de ferimentos dos trabalhadores. Esta característica

também confere facilidade no manejo e redução com gastos de manutenção/reposição de redes, devido ao fato de não embaraçarem na rede com os raios duros presentes nas nadadeiras dorsal e anal.

• Insere nos quesitos de segurança alimentar e produto ecologicamente correto, pelo emprego e utilização de peixes não classificados

como Organismos Geneticamente Modificados (GMO) e uso de processo de obtenção de supermachos (YY) livres da utilização de hormônios sexuais artificiais em peixes destinados ao mercado consumidor, referente à obtenção de peixes GMT. • Propicia ao processo de produção de tilápias nilóticas (O. niloticus) a criação exclusiva de reprodutores supermachos (YY) de maneira simplificada, sem a necessidade do uso de números elevados de testes de progênie.

· Aumento do controle de produção e redução considerável dos

erros de progênie (praticamente ausentes) na produção em larga escala de tilápias, não submetendo o animal a dor ou sofrimento, pois o monitoramento será por características fenotípicas;

• Não interferem na qualidade do produto final, sendo preservadas

suas características ligadas ao aspecto, textura e sabor da carne do peixe com

relação à apresentada pelas tilápias nilóticas (O. niloticus).

• Não interfere com a gerência de cultivo já instalada, pois pode ser readequado facilmente à finalidade de criação (obtenção e comercialização de matrizes, alevinos, criação e engorda, etc.).

· Reduz a mão de obra necessária para se fazer o manejo de

matrizes e reprodutores para a retirada de ovos na boca das fêmeas e incubação que passam a ser facultativos.

• No caso da aplicação da técnica GMT, aumenta o número de alevinos viáveis, pois os filhos serão sempre machos e prontos para a engorda.

· Maior facilidade de se obter lotes de peixes mais homogêneos,

porque iniciam a fase de crescimento e engorda logo após o nascimento, não sendo necessária a fase de inversão de sexo por hormônios que é estressante e prejudica o desenvolvimento inicial do peixe.

• Estabilidade de geração em geração para a característica

recessiva para a ausência simultânea de nadadeiras anal e dorsal para a

variedade "tilápia careca".

• Facilidade de obtenção e manutenção de tilápias nilóticas (O. niloticus), variedade "careca", a partir de tilápias normais, por meio de seleção e cruzamento controlados, baseado no emprego das fêmeas carecas duplo

haploides (XX), obtidas pela manipulação cromossômica aqui proposta ou de indivíduos carecas naturais, como reprodutoras. Descrição detalhada do invento

A aplicação direta do processo de produção de tilápias, aqui proposto, resulta simultaneamente em peixes de linhagens de tilápia supermacho (YY) e de fêmeas duplo haplóides (XX), mais especificamente, tilápia nilótica da espécie Oreochromis niloticus, variedade careca. Tal processo é baseado pelo emprego de pelo menos as etapas de: - utilizar como matriz ou reprodutor indivíduos de "tilápias carecas" (mutantes naturais estáveis, sem as nadadeiras dorsal e anal simultaneamente); ~ utilizar de procedimentos de manipulação cromossômica, preferencialmente os descritos na técnica de androgênese, na promoção da inativação do genoma dos oócitos por meio de tratamento com luz UV anterior à fecundação, e posterior restauração da diploidia pós fecundação in vitro, preferencialmente por meio de choque térmico, resultando em material com carga genética proveniente apenas do pai; - utilizar as características morfológicas dos indivíduos gerados como marcador fenotípico (ausência de nadadeiras dorsal e anal), para controle do processo de obtenção dos peixes de interesse. Essas modificações permitem a obtenção de tilápias e grau de controle de produção, as quais não seriam possibilitadas por eventos de cruzamentos isolados na natureza:

A multiplicação e manutenção desses peixes dependem do objetivo de criação de peixes e tanto as tilápias de partida, quanto as obtidas, são consideradas espécies exóticas, portanto, não sendo exclusivamente de origem no território brasileiro.

O processo de produção de tilápias supermachos (YY) e de fêmeas duplo haplóides (XX) é o mesmo, e para simplificar a descrição é referenciado apenas como processo de produção de supermachos (YY).

O processo de produção de tilápias supermachos (YY) compreende as etapas de:

a) Seleção de matrizes (fêmeas normais) e reprodutores (machos

carecas);

b) Coleta de sêmen e ovócitos; c) manipulação cromossômica nos ovócitos, compreendendo a técnica de androgênese, que consiste na aplicação de luz UV adequada, destinada à promoção da inativação do genoma;

d) fecundação in vitro dos ovócitos resultantes da etapa (c) com sêmen coletado nos machos carecas;

e) restauração da diploidia do material obtido na etapa (d), compreendendo o choque térmico controlado. Isso se refere à restauração da quantidade do DNA contido nos cromossomos do espermatozoide que fecundou o ovócito inativado, mencionado na etapa (d);

f) incubação dos ovos e obtenção das larvas e alevinos;

g) identificação nos alevinos das características fenotípicas dos indivíduos de interesse para a avaliação do sucesso na obtenção de supermachos (YY) e fêmeas duplo haploides (XX);

h) multiplicação dos peixes supermachos (YY) por meio de cruzamentos controlados e uso de hormônios feminilizante, principalmente

estrógenos.

Ng etapa (a), os indivíduos preferenciais de partida, utilizados como matrizes no presente processo de produção de supermachos (YY) correspondem às fêmeas de tilápia normal (O. niloticus) e os machos devidamente selecionados utilizados como reprodutores correspondem à tilápias da espécie O. niloticus, variedade careca.

Na etapa (b), um número limitado de matrizes (fêmeas) deverá ser mantido em tanques ou aquários adequados, por exemplo, os de capacidade de 1000 L, comportando um conjunto de 5 fêmeas por aquário, as quais deverão ser monitoradas diariamente para a identificação do desenvolvimento das gônadas. As fêmeas preparadas serão capturadas para extrusão dos ovócitos.

Os machos serão agrupados em tanques escavados, gaiolas ou tanques internos de 5000 a 12.000 L com recirculação da água. A seguir, aqueles em fase de espermiação, serão capturados e o sêmen coletado. Na etapa (c) os ovócitos colhidos na etapa anterior são tratados

com luz na região Ultra-Violeta (UV) do espectro eletromagnético, utilizando uma câmara devidamente ajustada ao tratamento desses materiais (exposição aos raios luminosos em condições livres de contaminação), contendo fontes artificiais de luz adequadas (lâmpadas ou Ieds ou suas combinações), ocasionando desativação completa do genoma feminino.

Na etapa (d): após a inativação do DNA dos cromossomos dos ovócitos, pelo tratamento com luz UV anterior, procede-se a fecundação dos mesmos, utilizando o sêmen coletado nos machos carecas (etapa b).

A etapa (e) refere-se a aplicação de choque térmico, devidamente controlado sobre o material resultante da etapa (d) com o objetivo de interromper a primeira cariocinese mitótica e recuperar a diploidia do DNA dos ovos obtidos. Dessa forma, garante-se a preservação do material genético proveniente do pai.

Na etapa (f), os ovos resultantes são incubados de forma usual ou convencional. Após o nascimento das larvas, estas serão criadas e alimentadas até a sua transformação em alevinos. Na etapa (g) são verificados visualmente a ausência das

nadadeiras dorsal e anal que caracterizam o sucesso da experiência. Em caso de confirmação positiva em relação à manipulação cromossômica (peixes com características "carecas"), os animais serão criados até a fase adulta e separados os machos (YY) das fêmeas (XX) por sexagem visual da papila genital, podendo haver realização de cruzamentos com fêmeas normais ou carecas duplo haploides para confirmação da técnica e obtenção de peixes GMT 100% macho para engorda.

A etapa (h) correspondente à multilicação de peixes (YY), visando a obtenção dos mesmos em larga escala. Nesta etapa os peixes carecas (YY), resultantes do processo (etapas (a) a (g)) substituirão os machos carecas utilizados na etapa (a), repetindo-se novamente as etapas (b) a (f). O resultado será a obtenção de larvas 100% machos carecas (YY). Essas larvas serão submetidas ao tratamento hormonal, com hormônios estrogênicos, principalmente estradiol, para inversão de sexo para fêmeas genotipicamente (YY). Essas fêmeas ao atingirem o estágio adulto serão utilizadas como matrizes de produção industrial de machos reprodutores carecas (YY), por meio do cruzamento com machos (YY) carecas (reprodutores selecionados). Este procedimento permitirá a multiplicação de peixes machos (YY). Os animais obtidos (100% supermachos (YY)) serão preferencialmente comercializados como reprodutores. Os piscicultores utilizarão esse peixe para a produção de alevinos para engorda, cruzando-os com fêmeas normais para obtenção de progênie 100% macho do tipo (XY), conhecidos como GMT (Tilapia male genetically) ou "macho genético de tilápia", que é o animal destinado à engorda comercial.

De forma geral, a presente invenção trata-se de um processo eficiente e menos trabalhoso para a obtenção de supermachos (YY), propiciada pelo emprego de matrizes normais e reprodutores "carecas" de tilápias nilóticas, associada ao uso das características das tilápias "carecas" como marcadoras fenotípicas, do que aquelas apresentadas nas patentes KR0139567B e PI0603193-5A.

A invenção poderá ser melhor compreendida através da seguinte descrição detalhada mediante as Figuras de 1 a 4, apresentadas apenas para ilustração e comparação com o estado da técnica mais próximo com a presente invenção. Estas figuras frisam as diferenças entre as tilápias utilizadas (espécie de referência corresponde a Oreochromis niloticus) no processo de obtenção de supermachos (YY) aqui proposto e de outros peixes de interesse.

A FIGURA 1 representa a fotografia dos indivíduos representantes das espécies de Oreochromis niloticus, considerados como: A) tilápias normais, sem mutação de interesse; e B) tilápias carecas, com mutação de interesse.

A FIGURA 2 representa um esquema ilustrativo para as características genotípicas dos gametas utilizados nos cruzamentos necessários à obtenção de indivíduos supermachos (YY) referente ao estado da técnica. A FIGURA 3 representa um esquema ilustrativo para as

características genotípicas dos gametas utilizados nos cruzamentos necessários à obtenção de indivíduos supermachos (YY) da presente invenção.

A FIGURA 4 representa o esquema ilustrativo do processo de transferência de genes da característica de interesse (ausência de nadadeiras dorsal e anal) para tilápias normais (com nadadeiras dorsal e anal).

Na FIGURA 1 são mostrados os peixes com as características essenciais para obtenção dos machos de tilápia careca (YY), sendo observada a fêmea de tilápia nilótica (O. niloticus) utilizada como matriz, destacando a presença da nadadeira dorsal (1.a) e nadadeira anal (2.a). As características do macho de tilápia careca utilizado como reprodutor também é evidenciada, destacando a ausência da nadadeira dorsal (3.b) e ausência da nadadeira anal (4.b). Estes indivíduos são preferencialmente utilizados na etapa (a) do processo de obtenção de tilápias supemnachos (YY) aqui proposto.

Na FIGURA 2 é mostrado um esquema ilustrativo para a obtenção de supermachos (YY) referente ao empregado na patente KR0139567B. Neste caso, o sexo cromossômico das tilápias é representado pela combinação das letras (X) e (Y). Os machos apresentam duas coleções destes cromossomos combinados em (XY), as fêmeas também apresentam duas coleções, porém (XX). Portanto, os machos podem produzir espermatozóides dos tipos (X) e (Y), enquanto as fêmeas só produzem ovócitos do tipo (X). Desta forma, o sexo é definido pelo espermatozóide que fecunda o ovócito. Se for o espermatozóide (X) a fecundar o ovócito (X), o resultado será um embrião do sexo feminino (XX). Se for o espermatozóide (Y) o embrião será masculino (XY). O sexo dos peixes, além das letras (Y) e (X), também é representado pelos símbolos S e $ para macho e fêmea, respectivamente, e os números seguidos do sinal de percentagem (%) indicam a proporção de peixes com o genótipo indicado. Neste processo (Figura 2), a obtenção de indivíduos supermachos

(YY) ocorre por meio de tratamento com estrógenos na fase Iarval (tratamento com hormônios sexuais, destinado à inversão de sexo). Após o desenvolvimento destes peixes, realiza-se o primeiro teste de progênie, cruzando todas as fêmeas com machos normais, para distinguir as fêmeas (XX) das transformadas (XY), o que se faz por comparação da segregação dos cromossomos (X) e (Y) que produz no cruzamento com fêmeas normais a proporção de 50% entre os sexos e os das fêmeas transformadas (XY), 75% de machos e 25% de fêmeas, o que permite identificar o sexo cromossômico das matrizes e reprodutores. Neste caso, obtém-se um grupo de descendentes onde os cromossomos se combinam nas formas: fêmeas (XX), machos (XY) e supermachos (YY).

Ainda com referência ao processo do estado da técnica para a obtenção de supermachos (YY), ilustrado na FIGURA 2, observa-se: o cruzamento convencional entre macho normal (XY) de tilápia nilótica (O. niloticus) (1') e fêmea normal (XX) indicada em (2'). Progênie normal de fêmeas (XX) indicado em (3') e machos (XY) em (4'). Estes peixes (3') e (4') recebem alimentos contendo estrógenos que afetam apenas os machos (XY)1 indicados em (4'), transformando-os em fêmeas (XY). O cruzamento entre fêmeas transformadas (XY) com machos normais (XY) é representado em (5') e o cruzamento para teste de progênie com confirmação do aparecimento do super macho (YY) é mostrado em (6') e (7'). A freqüência dos tipos cromossômicos possíveis destes cruzamentos é visualizada em (8'), (9'), (10'), (11'), (12') e (13').

Na FIGURA 3 é mostrado um esquema ilustrativo para a obtenção de supermachos (YY) referente à presente invenção. O sexo dos peixes, além das letras (Y) e (X), também é representado pelos símbolos S e Ç para macho e fêmea, respectivamente. Neste caso, a formação dos indivíduos supermachos (YY) ocorre já na primeira geração, correspondendo a indivíduos supermachos "carecas" (YY), por meio da manipulação cromossômica conhecida por androgênese e uso de reprodutores de tilápia machos "carecas", conforme representado na FIGURA 1B. Ressalta-se que as indicações mostradas nesta figura são: - (1) e (2) representam a contribuição paterna dos machos carecas, onde (X) e (Y) são os gametas para determinação sexual feminina e masculina respectivamente, produzidos na proporção de 50% e encontrados no sêmen desses animais; - (3) representa as fêmeas normais, doadoras de ovócitos, cujo DNA de todos os cromossomos foram desativados, não sendo, portanto, portadoras dos cromossomos (X); - (4) indica a fecundação com os gametas masculinos sobre os ovócitos desativados seguida da diploidização de todos os cromossomos e inclusive os cromossomos (X) e (Y) como parte da aplicação da técnica de androgênese; - (5) e (6) indicam a formação de peixes (YY) e fêmeas (XX), ambos duplo haploides de origem única paterna. Sendo sinalizados para cada passagem (1 a 6): d a indicação dos gametas (espermatozoides) oriundos do sêmen dos machos carecas; - 0 representa os gametas (ovócitos) com DNA dos cromossomos desativados, oriundos das fêmeas selecionadas; - ($) a indicação de fêmea (XX) duplo haplóide, resultante do processo tendo origem única paterna; e - (S) os machos (YY) duplo haploides resultantes do processo tendo origem única paterna. No esquema da FIGURA 3 ressalta-se que: o sêmen do macho de tilápia nilótica (O. niloticus) "careca" produz dois tipos de espermatozóides com cromossomos (X) e (Y)1 indicados, respectivamente por (1) e (2). A fêmea de tilápia nilótica (O. niloticus) "normal" produz ovócitos com cromossomos (X), mas estes são tratados e ficam desativados, conforme indicado em (3). Essa desativação ocorre por meio de tratamento eletromagnético adequado, principalmente com luz UV. A fase de restauração da diploidia com duplicação dos cromossomos (X) e (Y) oriundos do macho "careca" é representada pela seta (4). A progênie de supermachos "carecas" duplo haplóides (YY)1 indicados em (5) e fêmeas "carecas" duplo haplóides (XX) mostradas em (6), nascem como resultado direto da aplicação da técnica de androgênese ((3) e (4)). A herança recessiva para a ausência das nadadeiras serve para confirmar o acerto do uso da técnica resultando numa prole onde 100% dos machos nascidos são supermachos (YY), indicados por (5). Os peixes produzidos de acordo com esse processo, assim como

os seus descendentes, são obtidos por meio de manipulação cromossômica, na constituição de uma nova variedade de tilápia nilótica "careca", se mantendo preservadas as características desejáveis do produto final. Esta variedade pode ser cruzada novamente com indivíduos de tilápias nilóticas normais, possibilitando o surgimento de descendentes sem as típicas características das "tilápias carecas", por ser uma característica recessiva.

Após a aplicação desse processo de obtenção de supermachos (YY), para o caso de replicação ou comercialização dos peixes: Quando for utilizado o supermacho (YY) careca para cruzar com fêmeas normais, pelos piscicultores, para se obter os GMT, esses peixes serão normais, ou seja, apresentarão nadadeiras dorsal e anal (não diferindo dos ditos normais). No entanto, caso venha a utilizar as fêmeas (XX) duplo haplóides carecas (que aparecem no final do processo de obtenção dos (YY)), os GMT serão também carecas. Por outro lado, o emprego direto de reprodutores (YY) e matrizes (XX) obtidas pela utilização do processo aqui proposto, deve ser evitado para não ocorrerem efeitos deletérios devido à consangüinidade. Uma alternativa seria a utilização de algumas linhagens de fêmeas normais a partir de tilápias melhoradas e que já existem no mercado. O processo de obtenção de supermachos (YY) da presente invenção é utilizado preferencialmente a partir do emprego de matrizes fêmea de tilápia (O. niloticus) consideradas "normais" e machos reprodutores de tilápia nilótica (O. niloticus) mutante "careca", conforme descrito anteriormente (etapas a, b, c e d) em consonância com o esquema ilustrativo mostrado na FIGURA 3.

A multiplicação e manutenção desses peixes dependem do objetivo de criação de peixes e tanto as tilápias de partida, por exemplo, a produção exclusiva de machos. Neste caso, a etapa d, preferida para a multiplicação de tilápias supermachos (YY) requer a repetição das etapas a, b e c descrita anteriormente, onde após a obtenção dos alevinos carecas (YY) para multiplicá-los, e posteriormente, produzir machos e fêmeas (YY) é necessário fazer a inversão de sexo para fêmeas em alguns desses peixes, de modo a se obter fêmeas (YY).

Por outro lado, caso se utilize ovócitos de fêmeas carecas, com DNA cromossômico desativado e sêmen de macho normal, o resultado será machos (YY) e fêmeas (XX) normais, porém, não é possível se confirmar o resultado positivo da técnica, pois todos os alevinos nascerão normais e não se tem como observar qualquer característica externa que distinga os peixes modificados (dificuldade de emprego da etapa c - referente à manuipulação cromossômica descrita pela técnica de androgenia). Neste caso, testes de progênie serão necessários para avaliação do sucesso do processo de obtenção de tilápias da presente invenção.

A mesma técnica para se fazer supermachos (YY) em quantidade (multiplicação e manutenção) poderá ser utilizada para se obter linhagens de fêmeas duplo haplóides (XX). Neste caso, emprega-se hormônio masculinizante, para transformar fêmeas carecas duplo haplóides (XX) selecionadas para produzir peixes fenotipicamente machos, mas, geneticamente fêmeas duplo haplóides (XX), que ao serem cruzados com fêmeas duplo haplóides (XX) produzirão progênie 100% fêmeas duplo haplóides (XX), mas portadoras da característica careca e podem a partir daí serem utilizadas num programa de melhoramento para obtenção de peixes carecas com melhor desempenho de ganho de peso, rusticidade, e podem ser utilizadas em linhagens subsequentes para melhorar a linhagem futura de carecas (YY). Alguns hormônios masculinizantes adequados para esta finalidade são conhecidos pela técnica e exemplificados por PANDIA & SHEELA, 1995 (PANDIAN, T. J.; SHEELA, S. G. Hormonal induction of sex reversal in fish. Aquaculture, Amsterdam, v. 138, p. 1- 22, 1995).

Também existe a possibilidade de se produzir um peixe tetraploide

por meio da aplicação de choque térmico (TEBALDI, P. C.; JÚNIOR, H. A. Produção de tetraplóides de tilápia do nilo (Oreochromis niloticus). Revista electrónica de Veterinaria. 10(10), 2009, disponibilizada em: http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n101009/100908.pdf). Essa técnica é aplicada sobre os ovócitos de fêmeas (YY), obtidas com inversão sexual utilizando o estradiol (hormônio feminilizante), cruzadas com machos (YY), levando à produção de machos (YYYY) (tetraplóides). Nesse caso, esse reprodutor produziria espermatozóides (YY), que ao fecundar os ovócitos (X) de qualquer fêmea, produz 100% de peixes machos (XYY), os quais são estéreis. Um exemplo de produção e aplicação dessa técnica pode ser visto em HUSSAIN et al (1995) (HUSSAIN, M. G., RAO, G.P.S.; RANDALL, C.F.; PENMAN, D.J.; KIME, N.; BROMAGE, N.R.; MYERS, J.M.; McaNDREW, B. J. Comparative performance of growth, biochemical composition and endocrine profiles in diploid and triploid tilapia Oreochromis niloticus L. Aquaculture, 1 38(1-4), 87-97,1995). Esses peixes promoveriam uma proteção ou controle ambiental no caso de fugas dos tanques dos criadores para os cursos d'água, uma vez que sendo estéreis o impacto estaria restrito ao tempo de vida do peixe.

Processo da transferência do gene para a característica de interesse em tilápias normais

No contexto de criação de tilápias em escala industrial utilizando as características fenotípicas dos indivíduos carecas, também são importantes práticas de preservação e manutenção das "tilápias carecas", se destacando o processo de se transferir o gene da careca. Permitindo que a partir de tilapias normais (com nadadeiras dorsal e anal) se obtenha "tilápias carecas". Este processo é baseado na seleção e cruzamento controlado, possibilitando a geração de peixes híbridos ou melhoramento genético de tilápias, utilizando o esquema apresentado na Figura 4. As principais etapas envolvidas são:

1) Selecionar os parentais (P1) e (P2) das tilápias carecas e normais respectivamente. As tilápias normais (P2) podem ser: - tilápias nilóticas

puras; - híbridos entre tilápias nilóticas com outras espécies de tilápias; - ou tilápias oriundas de outros processos de melhoramento genético, inclusive as de linhagem (YY) obtidos por outros métodos.

2) Cruzar uma tilápia "careca" (P1) (macho ou fêmea), por exemplo da linhagem duplo haploide aqui descrita, com uma outra tilápia nilótica normal

(P2). Os alevinos gerados desse cruzamento (F1) são híbridos normais fenotipicamente, mas heterozigotos para o(s) gene(s) da característica careca.

3) cruzar os peixes (F1) entre si obtendo-se descendentes (F2) normais e "carecas" na proporção de 3:1 respectivamente.

4) Selecionar e cruzar machos "carecas" e fêmeas "carecas" da geração (F2). Os alevinos nascidos a partir desse cruzamento (F2) serão todos

carecas e com essa característica fixada, e, portanto, as futuras gerações também serão carecas, desde que ambos pais sejam carecas.

Para a multiplicação dos peixes, preferencialmente, as etapas de (1) a (4) devem ser repetidas seguidamente, porém, trocando-se os machos carecas obtidos no (F2), que passa a ser o próximo (P1), para se obter peixes "carecas" e recuperar a mesma carga genética existente nas tilápias normais melhoradas.

Uma alternativa no processo de transferência é a obtenção de (F1) di-híbridos, oriundos de cruzamentos entre linhagens de (F1) diferentes. Esses peixes (F1) são obtidos a partir do cruzamento entre linhagens de tilápias normais com tilápias carecas.

Outra opção para transferência de gene de interesse é o cruzamento entre os (F1) (machos ou fêmeas) com outros reprodutores ou matrizes carecas. Neste caso, a próxima geração (R1) será de 50% careca e 50% normal ao invés da proporção 3:1 descrita anteriormente. Os peixes carecas obtidos na geração (R1) já apresentam a característica fixada (careca) e podem ser cruzados entre si ou com carecas de outras linhagens, resultando em somente peixes machos e fêmeas carecas.

Claims (20)

1. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS caracterizado por compreender pelo menos as etapas de: - utilizar como matriz ou reprodutor, indivíduos de tilápias carecas, correspondentes a mutantes naturais estáveis ou seus descendentes, sem as nadadeiras dorsal e anal simultaneamente, - realizar manipulação cromossômica, preferencialmente em dois passos descritas pela técnica de androgênese, sendo um anterior à fecundação, referente à inativação dos genomas dos oócitos maternos e outro em estágio pós-fecundação In vitro, relacionado à restauração da diploidia, resultando em material com carga genética originário exclusivamente do pai, - utilizar as características morfológicas dos indivíduos gerados como marcador fenotípico referente à ausência de nadadeiras dorsal e anal, para controle do processo de obtenção dos peixes de interesse.

2. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a utilização de matriz ou reprodutor de tilápia nilótica da espécie Oreochromis niloticus, variedade careca.

3. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender a manipulação cromossômica para a inativação dos genomas dos oócitos maternos, preferencialmente por meio de tratamento com luz na região Ultra-Violeta do espectro eletromagnético, e posterior restauração da diploidia pós-fecundação, preferencialmente por meio de choque térmico controlado para interromper a primeira cariocinese mitótica e recuperar a diploidia do DNA dos ovos obtidos.

4. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado por compreender o tratamento com luz UV dos oócitos maternos, para a desativação completa do genoma feminino, por meio de uma câmara devidamente ajustada à exposição desses materiais aos raios luminosos em condições livres de contaminação, contendo fontes artificiais adequadas de luz UV provenientes de lâmpadas ou Ieds ou suas combinações.

5. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS SUPERMACHOS (YY) conforme reivindicação 1, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) Seleção de matrizes e reprodutores de tilápias, sendo um deles correspondente à variedade careca e outro normal com todas as nadadeiras, b) Coleta de sêmen e ovócitos, c) manipulação cromossômica nos ovócitos, compreendendo a técnica de androgênese, que consiste na aplicação de luz UV adequada, destinada à promoção da inativação do genoma, d) fecundação in vitro dos ovócitos resultantes da etapa (c) com sêmen coletado nos machos carecas, e) restauração da diploidia do material obtido na etapa (d), preferencialmente por meio de choque térmico controlado para a restauração da quantidade do DNA contido nos cromossomos do espermatozoide que fecundou anteriormente o ovócito inativado na etapa (d), f) incubação dos ovos e obtenção das larvas e alevinos, g) identificação nos alevinos das características fenotípicas dos indivíduos de interesse para a avaliação do sucesso na obtenção de supermachos (YY) e fêmeas duplo haploides (XX), com possibilidade de separação dos indivíduos machos e fêmeas por sexagem visual da papila genital, e opcionalmente a realização posterior de cruzamentos com fêmeas normais ou carecas duplo haploides para confirmação da técnica. h) multiplicação dos peixes supermachos (YY).

6. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS SUPERMACHOS (YY) de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por compreender preferencialmente a utilização de matrizes de tilápia normais, principalmente da espécie Oreochromis niloticus, e a utilização de reprodutores de tilápias da espécie Oreochromis niloticus, variedade careca na etapa (a).

7. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS SUPERMACHOS (YY) de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela multiplicação dos peixes supermachos (YY) da etapa (h) compreender cruzamentos controlados e uso de hormônios feminiiizantes, principalmente estrógenos.

8. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS SUPERMACHOS (YY) de acordo com a reivindicação 5 ou 7, caracterizado pela multiplicação dos peixes supermachos (YY) da etapa (h) compreender o uso dos peixes carecas (YY) resultantes da seqüência de etapas (a) a (g) como machos carecas reprodutores, repetindo-se novamente as etapas (a) a (f), sendo as larvas obtidas no final desse estágio 100% machos carecas (YY)1 as quais posteriormente recebem tratamento hormonal, com hormônios estrogênicos, principalmente estradiol, para inversão de sexo para fêmeas genotipicamente

9. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS SUPERMACHOS (YY) de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pela multiplicação dos peixes supermachos (YY) da etapa (h) compreender a utilização de fêmeas genotipicamente (YY), resultantes do tratamento hormonal adequado de larvas de supermachos (YY), como matrizes para o cruzamento com reprodutores selecionados referentes a supermachos (YY) carecas.

10. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS SUPERMACHOS (YY), caracterizado por compreender pelo menos uma etapa referente ao emprego da fêmea duplo haplóide (XX), preferencialmente, tilápia nilótica da espécie Oreochromis niloticus, variedade careca, obtida do processo de produção de supermachos (YY) conforme a reivindicação 5.

11. Uso dos supermachos (YY) de acordo com uma das reivindicações de 5 a 10, caracterizado por serem utilizados como reprodutores em processos de criação de peixes para a produção de alevinos para a engorda, principalmente pelo cruzamento com fêmeas normais para obtenção de progênie 100% macho do tipo (XY)/GMT.

12. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS FÊMEAS DUPLO HAPLÓIDES (XX), caracterizado por compreender o processo de produção de tilápias conforme as reivindicações 5 e 6, sendo a multiplicação dos peixes fêmeas duplo haplóides (XX) envolver a utilização de hormônios masculinizantes adequados para transformá-las fenotipicamente em machos (XX), que posteriormente são empregados como reprodutores no cruzamento com fêmeas (XX), portadoras ou não da característica careca.

13. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE TILÁPIAS TETRAPLÓIDES caracterizado por compreender a utilização de choque térmico sobre os oócitos de fêmeas (YY), obtidas por meio da inversão sexual mediante tratamento das larvas de supermachos (YY) obtidos conforme a reivindicação 5 ou 6, com hormônios feminilizantes adequados, preferencialmente estradiol, a serem cruzadas com reprodutores supermachos (YY), resultando em prole 100% tetraplóide (YYYY).

14. USO das tilápias tetraplóides de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender sua utilização na produção de peixes estéreis (XYY), a partir do cruzamento dos reprodutores tetraplóides (YYYY) com qualquer fêmea, pela fecundação dos espermatozóide (YY) com os ovócitos (X), aplicados em processos de proteção ou controle ambiental.

15. PROCESSO DE TRANSFERÊNCIA DE GENE DE CARACTERÍSTICA DE INTERESSE PARA TILÁPIAS NORMAIS relacionado à manutenção e multiplicação de tilápias com características careca, sem as nadadeiras dorsal e anal, caracterizado por compreender as seguintes etapas: 1) Selecionar os parentais das tilápias: (P1) carecas e (P2) normais, 2) Cruzar uma tilápia careca (P1) macho ou fêmea para a obtenção da prole (F1), 3) Cruzar os peixes (F1) entre si obtendo-se descendentes (F2) normais e carecas na proporção de 3:1, respectivamente, 4) Selecionar e cruzar machos carecas e fêmeas carecas da geração (F2), 5) Realizar a multiplicação dos peixes.

16. PROCESSO DE TRANSFERÊNCIA DE GENE de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender os parentais de tilápias normais (P2) selecionadas entre tilápias nilóticas puras ou híbridas entre tilápias nilóticas com outras espécies de tilápias ou tilápias oriundas de processos de melhoramento genético, inclusive as de linhagem (YY) obtidos por métodos já estabelecidos pela técnica, e parentais de tilápias carecas, preferencialmente as de linhagens duplo haplóides (XX).

17. PROCESSO DE TRANSFERÊNCIA DE GENE de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender a multiplicação de peixes com a característica careca na etapa (5) a repetição das etapas (1) a (4), substituindo os machos carecas obtidos no (F2), que passa a ser o próximo (P1) sucessivamente.

18. PROCESSO DE TRANSFERÊNCIA DE GENE de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender a obtenção da prole (F1) correspondente a di-híbridos, provenientes de cruzamentos entre linhagens de (F1) diferentes, principalmente obtidos a partir do cruzamento entre linhagens de tilápias normais com tilápias carecas.

19. PROCESSO DE TRANSFERÊNCIA DE GENE de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender a obtenção da prole (F1) e posterior cruzamento entre os (F1) obtidos, machos ou fêmeas, com outros reprodutores ou matrizes carecas, sendo a próxima geração (R1) composta de 50% careca e 50% normal ao invés da proporção de 3:1 da etapa (3), sendo os peixes carecas (R1) obtidos, posteriormente cruzados entre si ou com tilápias carecas de outras linhagens, resultando em somente peixes machos e fêmeas carecas.

20. Linhagens de tilápia supermacho (YY) e de fêmeas duplo haplóides (XX), caracterizadas por serem obtidas por um dos processos conforme uma das reivindicações de 1 a 19, preferencialmente resultando em tilápias nilóticas da espécie Oreochromis niloticus, variedade careca, sem as nadadeiras dorsal e anal.