BRPI1002905A2 - Vitamin C quantification method in strawberries - Google Patents
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Abstract
MéTODO DE QUANTIFICAçãO DE VITAMINA C EM MORANGOS A presente invenção desenvolveu uma metodologia para quantificar a vitamina C por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) utilizando coluna e pré-coluna de fase reversa (250 x 4,6 mm; 5pMID). 100% de um tampão pH 6,67, contendo acetato de sódio 0,04 mol.L1, EDTA ácido 0,05 mol.L1, fosfato de tetrabutilamónio 0,5 mol.L1, (1:1:1) como fase móvel, modo isocrático, fluxo 0,6 mL mm 1 e o detector UV, no comprimento de onda de 254 nm. A metodologia desenvolvida apresentou boa resolução entre os picos, a precisão do método foi de 95 a 100%, utilizou como fase móvel soluções aquosas bastante diluídas com pH 6,67, reagentes de baixa periculosidade, em temperatura ambiente (25<198>C) e também otimizou o tempo de análise.METHOD OF QUANTIFYING VITAMIN C IN STRAWBERRIES The present invention developed a methodology to quantify vitamin C by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) using reverse phase column and pre-column (250 x 4.6 mm; 5pMID). 100% pH 6.67 buffer containing 0.04 mol.L1 sodium acetate, 0.05 mol.L1 acid EDTA, 0.5 mol.L1 tetrabutylammonium phosphate (1: 1: 1) as a mobile phase , isocratic mode, flow 0.6 mL mm 1 and the UV detector, at a wavelength of 254 nm. The developed methodology presented good resolution between the peaks, the precision of the method was from 95 to 100%, used as a mobile phase very diluted aqueous solutions with pH 6.67, low hazard reagents, at room temperature (25 <198> C) and also optimized the analysis time.
Description
MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE VITAMINA C EM MORANGOSVITAMIN C QUANTIFICATION METHOD IN STRAWBERRIES
Existem varias técnicas de quantificação de vitamina C por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC), no entanto são demoradas e trabalham no limite do intervalo de pH da coluna. Colunas de fase reversa como a Cie apresenta, na especificação do fabricante, um pH ótimo de trabalho entre 2 e 8. Pode-se verificar, no entanto, que é bastante comum o uso de fase móvel ácida em pH próximo ao limite da coluna. Neste contexto, a presente invenção desenvolveu uma metodologia para quantificar a vitamina C por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) utilizando coluna e pré-coluna de fase reversa (250 χ 4,6 mm; 5pMID). 100% de um tampão pH 6,67, contendo acetato de sódio 0,04 mol.L-1, EDTA ácido 0,05 mol.L-1, fosfato de tetrabutilamônio 0,5 mol.L-1, (1:1:1) como fase móvel, modo isocrático, fluxo 0,6 mL min -1 e o detector UV, no comprimento de onda de 254 nm.There are several techniques for quantifying vitamin C by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), however they are time consuming and work within the limit of the pH range of the column. Reverse phase columns such as Cie have, in the manufacturer's specification, an optimum working pH between 2 and 8. However, it can be seen that the use of acid mobile phase at pH near the column boundary is quite common. In this context, the present invention has developed a methodology for quantifying vitamin C by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) using column and reverse phase precolumn (250 χ 4.6 mm; 5pMID). 100% of a pH 6.67 buffer containing 0.04 mol.L-1 sodium acetate, 0.05 mol.L-1 acid EDTA, 0.5 mol.L-1 tetrabutylammonium phosphate (1: 1 : 1) as mobile phase, isocratic mode, flow 0.6 mL min -1 and UV detector at wavelength 254 nm.
A determinação da vitamina C em alimentos é bastante complexa, em função dos baixos níveis em que esta pode ser encontrada, além da presença de substâncias interferentes da matriz estudada que podem, inclusive, contribuir para a sua degradação. Como está presente em níveis baixos, nos alimentos, a escolha de um método de dosagem de vitamina C total deve considerar o custo/benefício dos resultados obtidos.The determination of vitamin C in foods is quite complex, due to the low levels in which it can be found, as well as the presence of interfering substances from the studied matrix that may even contribute to its degradation. As it is present at low levels in foods, choosing a total vitamin C dosage method should consider the cost / benefit of the results obtained.
O método mais usual para a determinação de vitamina C em frutos é o de Strohecker & Henning (1967). Trata-se um método espectrométrico que utiliza ácido sulfúrico concentrado para quantificação. Outros métodos para se determinar esta vitamina em frutos também são utilizados, como a cromatografia líquida de alta eficiência, em que se encontram várias técnicas com diferentes formas de extração e condições cromatográficas.The most common method for the determination of vitamin C in fruits is that of Strohecker & Henning (1967). This is a spectrometric method that uses concentrated sulfuric acid for quantitation. Other methods to determine this vitamin in fruits are also used, such as high performance liquid chromatography, where various techniques with different extraction forms and chromatographic conditions are found.
Existem várias técnicas para se determinar vitamina C em frutos por HPLC. Rodriguez et al. (1992) determinaram vitamina C e ácidos orgânicos em vários frutos utilizando coluna de fase reversa e, como fase móvel, solução de ácido sulfúrico pH 2,2. Hernández et al. (2006) determinaram vitamina C em frutos tropicais utilizando como fase estacionária uma coluna C18 e, como fase móvel, ácido ortofosfórico 0,2%. Odriozola-Serrano et al. (2007) determinou vitamina C em frutos em duas diferentes condições cromatográficas. Na primeira, eles utilizaram como fase móvel uma solução de ácido sulfúrico a 0,01% em pH 2,6 e, como fase estacionária, uma coluna de fase reversa e, no outro experimento, eles utilizaram como fase móvel uma solução de lOmmol.L" 1 de fosfato de potássio di-hidrogenado pH 2,6 e acetonitrila, na proporção de 60:40 e, como fase estacionária, uma coluna de NH2-Spherisorb S5. Colunas de fase reversa como a C18 apresenta, na especificação do fabricante, um pH ótimo de trabalho entre 2 e 8. Pode-se verificar, no entanto, que é bastante comum o uso de fase móvel ácida em pH próximo ao limite da coluna.There are several techniques for determining vitamin C in fruits by HPLC. Rodriguez et al. (1992) determined vitamin C and organic acids in various fruits using reverse phase column and, as mobile phase, sulfuric acid solution pH 2.2. Hernández et al. (2006) determined vitamin C in tropical fruits using as stationary phase a C18 column and, as mobile phase, orthophosphoric acid 0.2%. Odriozola-Serrano et al. (2007) determined vitamin C in fruits under two different chromatographic conditions. In the first, they used as a mobile phase a 0.01% sulfuric acid solution at pH 2.6 and as a stationary phase a reverse phase column and in the other experiment they used as a mobile phase a 10mmol solution. L "1 of dihydrogenated potassium phosphate pH 2.6 and acetonitrile, in the ratio of 60:40 and, as a stationary phase, a NH2-Spherisorb S5 column. Reverse phase columns such as C18 show, in the manufacturer's specification , an optimum working pH between 2 and 8. It can be seen, however, that it is quite common to use acid mobile phase at pH close to the column boundary.
Poucas patentes são encontradas relacionadas á presente tecnologia. A Patente PI0605756-0 A2 "Métodos para analisar um ingrediente farmacêutico ativo", somente se assemelha a nossa tecnologia pelo fato destes métodos utilizarem tanto o HPLC quanto métodos termogravimétricos.Few patents are found related to the present technology. PI0605756-0 A2 "Methods for Analyzing an Active Pharmaceutical Ingredient" only resembles our technology in that these methods use both HPLC and thermogravimetric methods.
Pl 0513525-5 A "Componentes de aparelho e métodos de utilizar componentes de aparelho para detectar a presença de um analisado". Diferentemente da nossa tecnologia, esta relaciona componentes de um aparelho incluindo suportes rígidos para uso em uma coluna de afinidade, colunas de afinidade e uma coluna de afinidade em comunicação com uma coluna analítica, como em uma coluna de HPLC.Pl 0513525-5 A "Instrument Components and Methods of Using Instrument Components to Detect the Presence of an Analyzer". Unlike our technology, it relates components of an apparatus including rigid brackets for use in an affinity column, affinity columns, and an affinity column in communication with an analytical column, such as an HPLC column.
A Pl 0405871-2 A "Processo para a separação de ácido ascórbico a partir de um solvente", é a Patente mais próxima da nossa tecnologia, pois se refere a um processo para a separação do ácido ascórbico e ácido 2-ceto-L- gulônico em um solvente polar, através de extração líquido-líquido.Pl 0405871-2 A "Process for separating ascorbic acid from a solvent" is the closest patent to our technology as it relates to a process for separating ascorbic acid and 2-keto-L- gulonic acid in a polar solvent by liquid-liquid extraction.
A presente invenção apresenta uma metodologia desenvolvida para quantificar vitamina C por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em morangos proporcionando resultados dentro de 6,89 min após a extração do fruto sendo empregada com sucesso e podendo ser adaptada para determinação de ácido ascórbico em outros frutos, pois a precisão do método é de 95 a 100%. Tal método apresentou-se eficiente com um menor tempo além de trabalhar em pH neutro. A presente invenção desenvolveu uma metodologia para quantificar a vitamina C por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) utilizando coluna e pré-coluna de fase reversa (250 χ 4,6 mm; 5μΜΙD). Como fase móvel, modo isocrático foi usado 100% de um tampão pH 6,67, contendo acetato de sódio 0,04 mol L11 EDTA ácido 0,05 mol L"1, fosfato de tetrabutilamônio 0,5 mol L"1 (1:1:1), fluxo 0,6 mL min"1 e o detector UV o comprimento de onda de 254 nm. A vitamina C foi eluída da coluna em 6,89 min, sendo o tempo total da corrida de 15 min. O desvio padrão do método foi de 7,72%, apresentando uma recuperação de 95 a 100%.The present invention provides a methodology developed to quantify vitamin C by High Performance Liquid Chromatography in strawberries providing results within 6.89 min after fruit extraction being successfully employed and can be adapted for ascorbic acid determination in other fruits as The accuracy of the method is from 95 to 100%. Such method was efficient with a shorter time besides working at neutral pH. The present invention has developed a methodology for quantifying vitamin C by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) using reverse phase column and pre-column (250 χ 4.6 mm; 5μΜΙD). As a mobile phase, isocratic mode was used 100% of a pH 6.67 buffer containing 0.04 mol L11 sodium acetate 0.05 mol L "1 EDTA acid, 0.5 mol L" 1 tetrabutyl ammonium phosphate (1: 1: 1), flow 0.6 mL min "1 and UV detector wavelength 254 nm. Vitamin C was eluted from the column at 6.89 min and the total run time was 15 min. The standard method was 7.72%, with a 95 to 100% recovery.
A metodologia desenvolvida apresenta boa resolução entre os picos, utiliza como fase móvel soluções aquosas bastante diluídas com pH 6,67, reagentes de baixa periculosidade, em temperatura ambiente (25°C) e também otimiza o tempo de análise.The developed methodology presents good resolution between the peaks, uses as mobile phase very dilute aqueous solutions with pH 6.67, low hazardous reagents, at room temperature (25 ° C) and also optimizes the analysis time.
Como, naturalmente, o ácido ascórbico está presente em níveis baixos nos alimentos, a escolha de um método de dosagem de vitamina C total deve considerar o custo/benefício dos resultados obtidos.Since, of course, ascorbic acid is present at low levels in foods, choosing a total vitamin C dosage method should consider the cost / benefit of the results obtained.
Apesar de o método colorimétrico apresentar-se bastante simples e acessível, ele tem algumas desvantagens, tais como está sujeito a muitos interferentes, apresenta longo tempo de análise, utiliza grande quantidade de amostra e pode haver a oxidação do ácido ascórbico. O método via HPLC tem a vantagem de ser simples no preparo dos reagentes, sensível, rápido, utiliza pequeno volume de amostra e apresenta elevado grau de confiabilidade nos resultados; o pH da fase móvel é 6,6 e apresenta rendimento elevado, o que indica que não há decomposição do A.A.Although the colorimetric method is quite simple and affordable, it has some disadvantages, as it is subject to many interferences, has a long analysis time, uses a large amount of sample and there may be oxidation of ascorbic acid. The HPLC method has the advantage of being simple in the preparation of reagents, sensitive, fast, uses small sample volume and has a high degree of reliability in the results; The pH of the mobile phase is 6.6 and high yield, which indicates no decomposition of A.A.
A metodologia desenvolvida para a análise de ácido ascórbico em morangos proporciona resultados dentro de 6,89 min após a extração do fruto. É empregada com sucesso e pode ser adaptada para determinação de ácido ascórbico em outros frutos, pois a precisão do método foi de 95 a 100%, bem como se apresentou eficiente com um menor tempo além de trabalhar em pH neutro. Duzentos morangos da cultivar Oso-Grande foram colhidos em um pomar. Foram selecionados 160 frutos em relação ao tamanho, ao estádio de maturação e à ausência de defeitos.The methodology developed for the analysis of ascorbic acid in strawberries provides results within 6.89 min after fruit extraction. It is successfully used and can be adapted for ascorbic acid determination in other fruits, since the accuracy of the method was 95 to 100%, as well as being efficient with a shorter time besides working at neutral pH. Two hundred strawberries of the cultivar Oso-Grande were harvested in an orchard. 160 fruits were selected in relation to size, maturity stage and absence of defects.
Os 160 frutos foram imersos em uma solução de dicloroisocianurato de sódio a uma concentração de 200pg L-1, por 15 minutos, para desinfecção Em seguida, foram colocados sobre papel-toalha para secar a temperatura ambiente. Após essa etapa, foram separados, ao acaso, em 4 lotes de 40 frutos cada e armazenados à temperatura ambiente, 21±1,4°C e 55±5,7% UR, por 6 dias. As análises foram iniciadas logo após o armazenamento (dia zero) e, a cada dois dias, até o fim do período de armazenamento.The 160 fruits were immersed in a solution of sodium dichloroisocyanurate at a concentration of 200pg L-1 for 15 minutes for disinfection. They were then placed on paper towels to dry at room temperature. After this stage, they were randomly separated into 4 batches of 40 fruits each and stored at room temperature, 21 ± 1.4 ° C and 55 ± 5.7% RH, for 6 days. Analyzes were started immediately after storage (day zero) and every two days until the end of the storage period.
Pesaram-se 5 g de morangos, previamente triturados e 50 mL de ácido oxálico 0,5%. Agitou-se, por 15 minutos, em agitador orbital-TECNAL e filtrou- se com papel celulósico, conforme a técnica de Strohecker & Henning (1967).5 g of previously ground strawberries and 50 ml of 0.5% oxalic acid were weighed. It was shaken for 15 minutes on an orbital-TECNAL shaker and filtered with cellulosic paper according to the Strohecker & Henning (1967) technique.
O conteúdo de ácido ascórbico (após a oxidação a ácido dehidroascórbico) foi determinado pelo método colorimétrico com 2,4- denitrofenilhidrazina, segundo Strohecker & Henning (1967) e pelo método HPLC, utilizando um equipamento UFLC Shimadzu modelo (LC 20 A), equipado com bomba binária de alta pressão, injetor automático com autoamostrador, forno e detector UV em 254 nm. Os padrões e as amostras foram injetados em uma coluna (250 χ 4,6 mm, 5μm ID- Nucleosil), acoplada a uma pré-coluna C18 (15 χ 3,2 mm (partícula de 5 μm). A fase móvel foi composta por 100% de solução tampão acetato de sódio, pH 6,67, contendo acetato de sódio 0,04 mol L-1, EDTA ácido 0,05mol L-1, fosfato de tetrabutilamônio 0,5 mmol L-1 (1:1:1), no modo isocrático, fluxo de 0,6 mL min-1 e o volume de injeção de 20 pL. A temperatura da coluna foi mantida constante em 15°C. A vitamina C foi eluída da coluna em 6,89 minutos, sendo o tempo total da corrida de 15 minutos. O desvio padrão do método foi de 7,72%, apresentando recuperação de 95 a 100%, conforme a técnica de Silva et al. (2009).Ascorbic acid content (after oxidation to dehydroascorbic acid) was determined by the 2,4-denitrophenylhydrazine colorimetric method according to Strohecker & Henning (1967) and by the HPLC method using a Shimadzu model (LC 20 A) UFLC device equipped with with high pressure binary pump, auto injector with autosampler, oven and UV detector at 254 nm. The standards and samples were injected into a column (250 χ 4.6 mm, 5μm ID-Nucleosil) coupled to a C18 pre-column (15 χ 3.2 mm (5 μm particle). per 100% sodium acetate buffer solution, pH 6.67, containing 0.04 mol L-1 sodium acetate, 0.05 mol L-1 EDTA, 0.5 mmol L-1 tetrabutyl ammonium phosphate (1: 1 : 1), in isocratic mode, flow of 0.6 mL min-1 and injection volume of 20 pL Column temperature was kept constant at 15 ° C. Vitamin C was eluted from the column in 6.89 minutes , with the total running time being 15 minutes and the standard deviation of the method was 7.72%, with recovery from 95 to 100%, according to the technique of Silva et al. (2009).
O padrão de ácido ascórbico e as amostras foram filtrados em membrana 0,45 μm e diretamente injetados no sistema cromatográfico. A adição de padrão às amostras também foi usada como padrão de identificação. A quantificação foi realizada utilizando método de padronização externa com concentração de solução estoque de AA.The ascorbic acid standard and samples were filtered through 0.45 μm membrane and directly injected into the chromatographic system. Adding a pattern to samples was also used as an identification standard. Quantification was performed using external standardization method with concentration of AA stock solution.
O armazenamento influenciou significativamente no teor de vitamina C dos frutos conforme apresentado na Figura 1. Observa-se que, em ambos os métodos de quantificação, houve uma diminuição dos teores de vitamina C dos frutos ao longo do armazenamento, oriundas das transformações sofridas no processo de amadurecimento.The storage significantly influenced the vitamin C content of the fruits as shown in Figure 1. It is observed that, in both quantification methods, there was a decrease in the vitamin C content of fruits during storage, resulting from the transformations undergone in the process. of ripening.
Os valores de vitamina C dos morangos variaram entre 58,56 a 22,04 mg/100g.The vitamin C values of strawberries ranged from 58.56 to 22.04 mg / 100g.
Em média os valores das áreas dos picos da amostra e do padrão foram de 7,35x106 e 9,58x106 u.a. e com um tempo de retenção de 6,89 e de 6,77 min respectivamente, como mostram as Figuras 2 e 3.The mean peak and sample peak area values were 7.35x106 and 9.58x106 u.a. and with a retention time of 6.89 and 6.77 min respectively, as shown in Figures 2 and 3.
A quantidade de ácido ascórbico nos morangos encontrados pelo doseamento via HPLC foi superior ao obtido por espectrometria durante todo o armazenamento (Figura 1).The amount of ascorbic acid in strawberries found by HPLC assay was higher than that obtained by spectrometry throughout storage (Figure 1).
Isso, porque, durante o doseamento via espectrometria, a adição de ácido sulfúrico concentrado pode ter oxidado o ácido ascórbico, uma vez que este é um complexo termolábil sensível e, para que a sua extração ou doseamento apresentem rendimento elevado e não haja qualquer decomposição do mesmo, são necessários cautela e experiência dos analistas para que a amostra não degrade e não carbonize. Em ambos os casos, o resultado obtido foi diferente do teor real de ácido ascórbico na amostra, para mais ou para menos.This is because, during spectrometric dosing, the addition of concentrated sulfuric acid may have oxidized ascorbic acid, as this is a sensitive thermolabile complex and, for its extraction or dosing to yield high yield and no decomposition of the sulfuric acid. same, analysts' caution and experience are required to ensure that the sample does not degrade and carbonize. In both cases, the result was different from the actual ascorbic acid content in the sample, plus or minus.
Observa-se, na Figura 2, que o tempo de retenção da amostra na determinação via HPLC é pequeno (6,89 minutos) e que há uma boa resolução do pico. O teor de AA em amostras de morango obtidos via HPLC foi cerca de duas vezes maior que o teor obtido por espectrometria, exceto no ultimo dia (Figura 1).Figure 2 shows that the retention time of the sample in HPLC determination is small (6.89 minutes) and there is a good resolution of the peak. The AA content in strawberry samples obtained via HPLC was about twice as high as that obtained by spectrometry except on the last day (Figure 1).
Como, naturalmente, o ácido ascórbico está presente em níveis baixos nos alimentos, a escolha de um método de dosagem de vitamina C total deve considerar o custo/benefício dos resultados obtidos.Since, of course, ascorbic acid is present at low levels in foods, choosing a total vitamin C dosage method should consider the cost / benefit of the results obtained.
Apesar de o método colorimétrico apresentar-se bastante simples e acessível, ele tem algumas desvantagens, tais como está sujeito a muitos interferentes, apresenta longo tempo de análise, utiliza grande quantidade de amostra e pode haver a oxidação do ácido ascórbico. O método via HPLC tem a vantagem de ser simples no preparo dos reagentes, sensível, rápido, utiliza pequeno volume de amostra e apresenta elevado grau de confiabilidade nos resultados; o pH da fase móvel é 6,6 e apresenta rendimento elevado, o que indica que não há decomposição do A.A.Although the colorimetric method is quite simple and affordable, it has some disadvantages, as it is subject to many interferences, has a long analysis time, uses a large amount of sample and there may be oxidation of ascorbic acid. The HPLC method has the advantage of being simple in the preparation of reagents, sensitive, fast, uses small sample volume and has a high degree of reliability in the results; The pH of the mobile phase is 6.6 and high yield, which indicates no decomposition of A.A.
A metodologia desenvolvida para a análise de ácido ascórbico em morangos proporciona resultados dentro de 6,89 min após a extração do fruto foi empregada com sucesso e poderá ser adaptada para determinação de ácido ascórbico em outros frutos, pois a precisão do método foi de 95 a 100%, bem como se apresentou eficiente com um menor tempo além de trabalhar em pH neutro.The methodology developed for the analysis of ascorbic acid in strawberries provides results within 6.89 min after fruit extraction was successfully employed and could be adapted for ascorbic acid determination in other fruits, as the method accuracy was 95 to 100%, as well as efficient with a shorter time besides working at neutral pH.
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Cited By (2)
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CN111337613A (en) * | 2020-04-18 | 2020-06-26 | 新拓洋生物工程有限公司 | High performance liquid detection method for D-isoascorbic acid potassium |
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2010
- 2010-08-23 BR BRPI1002905-2A patent/BRPI1002905A2/en not_active Application Discontinuation
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