BRPI1001299A2

BRPI1001299A2 - Polymeric Formulations for the Treatment of Skin Tumors by Photodynamic Therapy

Info

Publication number: BRPI1001299A2
Application number: BRPI1001299-0A
Authority: BR
Inventors: Mauricio Da Silva Baptista; Daiana Kotra Deda; Koiti Araki; Henrique Eisi Toma; Eduardo Carita
Original assignee: Fundacao De Ampara A Pesquisa Do Estado De Sao Paulo Fapesp; Univ Sao Paulo
Priority date: 2010-04-16
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2015-03-03

Abstract

FORMULAÇÕES POLIMÉRICAS PARA TRATAMENTO DE TUMORES DE PELE POR TERAPIA FOTODINÂMICA A presente invenção se refere a formulações poliméricas para tratamento de tumores de pele por terapia fotodinâmica, constituída de nanocápsulas poliméricas contendo compostos fotoativos encapsulados. TaI. invenção vrsa o tratamento de cancer de pele através de Terapia Fotodinâmica, baseado na injeção "in loco" das formulações poliméricas. Nesse aspecto, os resultados obtidos até o presente momento indicam a potencialidade dc aplicação dessas formulações no procedimento terapêutico visando, além do tratamento de tumores, também dc outras doenças de pele como psoriasis, vitiligo e leishmaniose, bem como para aplicações com fins estéticosThe present invention relates to polymeric formulations for the treatment of skin tumors by photodynamic therapy, consisting of polymeric nanocapsules containing encapsulated photoactive compounds. TaI. The invention is the treatment of skin cancer by Photodynamic Therapy, based on the "in loco" injection of the polymeric formulations. In this regard, the results obtained so far indicate the potential of applying these formulations in the therapeutic procedure aiming, in addition to the treatment of tumors, also of other skin diseases such as psoriasis, vitiligo and leishmaniasis, as well as for aesthetic applications.

Description

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Relatório Descritivo de Patente de Invenção pa ra : "FORMULAÇÕES POLIMÉRICAS PARA TRATAMENTO DE TUMORES DE PELE POR TERAPIA FOTODINÂMICA".Patent Descriptive Report for: "POLYMERIC FORMULATIONS FOR PHOTODYNAMIC TREATMENT OF SKIN TUMORS".

Campo da Invenção Δ presente invenção refere-se a formulações poliméricas para tratamento de tumores de pele e algumas outras moléstias por terapi’a fotodinâmica. Mais f v especificamente, a presente invenção se refere a emulsões compreendendo de micro e nanocápsulas poliméricas contendo drogas fotoativas sendo aplicada in loco. A presente invenção também se refere ao uso das referidas formulações para a fabricação de medicamentos para tratamento de tumores e de algumas outras moléstias por Terapia Fotodinâmica, baseado na injeção in loco das referidas formulações com nanocápsulas poliméricas especificas contendo drogas fotoativas.Field of the Invention The present invention relates to polymeric formulations for treating skin tumors and some other diseases by photodynamic therapy. More specifically, the present invention relates to emulsions comprising polymeric micro and nanocapsules containing photoactive drugs being applied on site. The present invention also relates to the use of said formulations for the manufacture of medicaments for treating tumors and some other diseases by Photodynamic Therapy, based on the in situ injection of said formulations with specific polymeric nanocapsules containing photoactive drugs.

Antecedentes da Invenção A Terapia Fotodinâmica (TFD) vem se consolidando como uma alternativa vantajosa para o tratamento de algumas doenças, particularmente de câncer e de algumas outras moléstias como psoriasis e vitiligo, além de doenças endêmicas como a leishmaniose. Este procedimento, empregado na oncologia há mais de 25 anos, apresenta inúmeras vantagens em relação aos tratamentos convencionais, entre elas a possibilidade de tratar os locais afetados de maneira seletiva, não atingindo',) tecidos saudáveis. Outras vantagens se referem à minimização de efeitos colaterais indesejáveis como enjôos e vômitos causados pela radioterapia e quimioterapia, de inconvenientes causados por intervenções cirúrgicas como mutilações e/ou cicatrizes, e do longo periodo de internação’ pós-tratamento. Isso é t \ resultante do fato do referido tratamento ser dependente da combinação de dois fatores principais: a presença de um agente fotossensibilizador e a irradiação do local desejado com luz de comprimento de onda apropriado.Background of the Invention Photodynamic Therapy (PDT) has been established as an advantageous alternative for the treatment of some diseases, particularly cancer and some other diseases such as psoriasis and vitiligo, as well as endemic diseases such as leishmaniasis. This procedure, employed in oncology for over 25 years, has numerous advantages over conventional treatments, including the ability to treat the affected sites selectively, not reaching ',) healthy tissues. Other advantages refer to the minimization of undesirable side effects such as nausea and vomiting caused by radiotherapy and chemotherapy, inconvenience caused by surgical interventions such as mutilation and / or scarring, and the long period of hospitalization 'after treatment. This is due to the fact that said treatment is dependent on the combination of two main factors: the presence of a photosensitizing agent and the irradiation of the desired location with appropriate wavelength light.

De uma forma geral, o procedimento adotado na TFD consiste em administrar ao paciente (normalmente por via intravenosa, oral ou tópica) a droga fotossensibilizadora. Então, após determinado tempo, necessário para que a droga se distribua pelo corpo e atinja a concentração necessária nas células tumorais, as regiões afetadas são irradiadas com luz de comprimento de onda apropriado, geralmente na faixa conhecida como janela fotodinâmica (cerca de 600 a 900 nm) .In general, the procedure adopted in PDT consists of administering to the patient (usually intravenously, orally or topically) the photosensitizing drug. Then, after a certain amount of time, necessary for the drug to be distributed throughout the body and to reach the required concentration in the tumor cells, the affected regions are irradiated with light of appropriate wavelength, usually in the range known as the photodynamic window (about 600 to 900 nm).

Todo o processo tem inicio quando o fotossensibilizador é excitado pela incidência de radiação e em seguida, dois mecanismos principais de reação podem ocorrer: os mecanismos do tipo I e do tipo l-'ϊ λ II. Nos mecanismos do tipo I, o fotossensibilizador nód estado excitado reage com moléculas do substrato por meio da transferência de prótons e/ou elétrons, gerando espécies radicalares capazes de reagir com o oxigênio no estado fundamental, produzindo uma série de intermediários de oxigênio altamente reativos capazes de causar danos diretos às biomoléculas. Já no caso do í \ \t mecanismo do tipo II, o composto fotoativo no estado excitado triplete interage com o oxigênio no estado fundamental, por meio de transferência de energia, ocasionando a formação de oxigênio singlete, uma espécie altamente reativa e citotóxica. O oxigênio singlete possui um caráter altamente eletrofilico, sendo capaz de causar danos em membranas, proteínas e DNA, tanto por ação direta quanto por formação· de espécies radicalares geradas a partir do mesmo.The whole process begins when the photosensitizer is excited by the incidence of radiation and then two main reaction mechanisms can occur: type I and type l-'ϊ λ II mechanisms. In type I mechanisms, the excited-state photosensitizer reacts with substrate molecules by transferring protons and / or electrons, generating radical species capable of reacting with ground-state oxygen, producing a series of highly reactive oxygen intermediates capable of cause direct damage to biomolecules. In the case of the type II mechanism, the triplet photoactive compound in the excited state interacts with the oxygen in the ground state through energy transfer, causing the formation of singlet oxygen, a highly reactive and cytotoxic species. Singlet oxygen has a highly electrophilic character, being able to cause damage to membranes, proteins and DNA, either by direct action or by formation of radical species generated from it.

Em ambos os mecanismos (tipo I e tipo II) as espécies reativas geradas tendem a se difundir pelo tecido afetado, iniciando uma cadeia de reações bioquímicas que resultam em danos às células. Na maioria dos casos, os agentes fototerapêuticos podem não causar a destruição direta do tumor, mas podem comprometer o sistema vascular, ou seja, o sistema de irrigação tumoral que transporta os nutrientes e oxigênio necessários para o crescimento do tumor, resultando em . X " ^ u hipoxia e morte celular.In both mechanisms (type I and type II) the reactive species generated tend to diffuse into the affected tissue, initiating a chain of biochemical reactions that result in cell damage. In most cases, phototherapeutic agents may not cause direct tumor destruction, but may compromise the vascular system, that is, the tumor irrigation system that carries the nutrients and oxygen needed for tumor growth, resulting in. Hypoxia and cell death.

No final da década de 80, foi desenvolvido o primeiro agente fototerapêutico para ser empregado em PDT com a autorização do FDA (Food and Drug Administration dos Estados Unidos da América): ο Photofrin®, desenvolvido pela QLT Photo-Therapeutics, baseada em oligômeros de hematopòrfirina com duas a nove v unidades de porfirina unidas por meio de ligações éter e éster. O Photofrin®, juntamente com o Levulan® Kerastick e o Visudyne®, são os três principais medicamentos utilizados em PDT, aprovados pela FDA.In the late 1980s, the first phototherapeutic agent to be employed in PDT was developed with FDA (United States Food and Drug Administration) authorization: ο Photofrin®, developed by QLT Photo-Therapeutics, based on oligomers of hematoporphyrin with two to nine v porphyrin units joined by ether and ester bonds. Photofrin®, together with Levulan® Kerastick and Visudyne®, are the top three FDA-approved PDT drugs.

Todavia, tais medicamentos apresentam algumas limitações ou inconvenientes. Por exemplo, o Photofrin® apresenta baixa absortividade na janela terapêutica e pode levar a sérios problemas de fotossensibilidade nos pacientes, que pode durar semanas ou até meses após a realização do tratamento. Além disso, aqueles fotossensibilizadores são administrados por via intravenosa, aumentando os riscos de toxicidade e fototoxicidade. Assim, os esforços no sentido de preparar novos fotossensibilizadores para uso em Terapia Fotodinâmica têm sido continuados, principalmente compostos apresentando propriedades fotofisicas e estruturais adequadas, além de maior biocompatibilidade.However, such drugs have some limitations or drawbacks. For example, Photofrin® has low absorption in the therapeutic window and can lead to serious photosensitivity problems in patients, which may last weeks or even months after treatment. In addition, those photosensitizers are administered intravenously, increasing the risks of toxicity and phototoxicity. Thus, efforts to prepare new photosensitizers for use in Photodynamic Therapy have been continued, mainly compounds with adequate photophysical and structural properties, as well as greater biocompatibility.

Uma lipofilicidade relativamente elevada e o caráter anfifilico são importantes para garantir uma elevada afinidade e capacidade de penetração nas células tumorais, proporcionando maior atividade fotodinâmica das drogas ao serem irradiadas. Assim, os fotossensibilizadores atualmente empregados ou em desenvolvimento apresentam baixa ou nenhuma solubilidade/dispersibilidade ηοέ fluidos corpóreos como t v o sangue, limitando o emprego direto dos mesmos em TFD, pois podem provocar sérios problemas em decorrência da precipitação/aglomeração e o possível entupimento de veias e de artérias. Contudo, as propriedades desses compostos podem ser alteradas encapsulando-os em vesículas, micro e nanocápsulas, micro e nanoesferas, micelas e outros sistemas que exponham uma superfície biocompatível e aquo-solúvel, gerando veículos adequados para a dispersão daquelas drogas no meio biológico.Relatively high lipophilicity and amphiphilic character are important to ensure high affinity and ability to penetrate tumor cells, providing greater photodynamic activity of the drugs upon irradiation. Thus, photosensitizers currently employed or under development have low or no solubility / dispersibility ηοέ body fluids such as blood, limiting their direct use in PDT, as they may cause serious problems due to precipitation / agglomeration and possible clogging of veins and of arteries. However, the properties of these compounds can be altered by encapsulating them in vesicles, micro and nanocapsules, micro and nanospheres, micelles and other systems that expose a biocompatible and water-soluble surface, generating suitable vehicles for the dispersion of those drugs in the biological environment.

Um veículo carreador de drogas ideal em TFD deve se acumular no tecido tumoral e liberar seu conteúdo de modo que atinja concentrações terapêuticas somente naquelas células, em detrimento das células sadias. O sistema carreador deve ainda apresentar uma alta eficiência de entrega da droga, não alterar sua atividade, além de ser biocompatível e/ou biodegradável.An ideal drug carrier vehicle in PDT should accumulate in the tumor tissue and release its contents so that it reaches therapeutic concentrations only in those cells, to the detriment of healthy cells. The carrier system must also have a high drug delivery efficiency, not alter its activity, and be biocompatible and / or biodegradable.

Sabe-se que sistemas de liberação de drogas tendem a se acumular em tumores devido a um fenômeno conhecido como "aumento da permeabilidade e efeito de retenção".'?-· Isso se deve ao fato de que tecidos tumorais geralmente apresentam maior atividade metabólica e uma barreira endotelial mais permeável, que permite a difusão de partículas relativamente grandes para dentro das células alvo.Drug delivery systems are known to tend to accumulate in tumors due to a phenomenon known as' increased permeability and retention effect '.'? - This is due to the fact that tumor tissues generally exhibit increased metabolic activity and a more permeable endothelial barrier that allows relatively large particles to diffuse into target cells.

De fato, quando moléculas, hanopartícuias ou outros i materiais são colocados em contato com tecidos biológicos, a primeira interação ocorre com a superfície externa da membrana celular. Eventuais danos provocados à mesma podem levar ao extravasamento do conteúdo intracelular, liberação intracelular de Ca2+ e indução de apoptose. Pode ocorrer também a desnaturação ou degradação de proteínas, resultando em mudanças nas suas estruturas primária, secundária ou terciária, e conseqüente alterações funcionais, por exemplo, na atividade enzimática e de sinalização molecular. Também, há algumas evidências de que certas nanopartícuias podem atingir o núcleo, causando danos ao DNA.In fact, when molecules, hanoparticles or other materials are placed in contact with biological tissues, the first interaction occurs with the outer surface of the cell membrane. Eventual damage to it may lead to intracellular content leakage, intracellular Ca2 + release and apoptosis induction. Protein denaturation or degradation may also occur, resulting in changes in their primary, secondary or tertiary structures, and consequent functional changes, for example in enzymatic activity and molecular signaling. Also, there is some evidence that certain nanoparticles can reach the nucleus, causing DNA damage.

Nos inúmeros estudos e desenvolvimentos realizados até o momento, os tratamentos se baseiam na administração intravenosa de formulações ou drogas que devem se distribuir pelo organismo e preferencialmente concentrar-se nos tecidos tumorais. Entretanto, essa metodologia aumenta os riscos de intoxicação e eventuais fc V efeitos colaterais como a f otossensibili zação da pelè;-por tempos mais ou menos prolongados. A presente invenção tem como finalidade minimizar tais problemas, empregando no tratamento uma formulação com elevada eficiência de entrega de moléculas fotoativas diretamente às células tumorais. A utilização de porfirinas è compostos similares em í i Terapia Fotodinâmica já é conhecida há algumas décadas.In the numerous studies and developments to date, treatments are based on intravenous administration of formulations or drugs that should be distributed throughout the body and preferably concentrated in the tumor tissues. However, this methodology increases the risks of intoxication and possible side effects such as skin photosensitivity for longer or shorter periods. The present invention aims to minimize such problems by employing in the treatment a formulation with high delivery efficiency of photoactive molecules directly to tumor cells. The use of porphyrins and similar compounds in photodynamic therapy has been known for some decades.

Pedido de patente internacional WO 2010/033678 (PCT/US2009/057283 ) , intitulado: "Novel method and application of unsymmetrically meso-substituted porphyrins and chlorins for PDT"; em nome de CERAMOPTEC INDUSTRIES, INC, publicado em 25 de março de 2010 descreve compostos biologicamente ativos, que podem ser usados como fotossensibilizadores para aplicações diagnosticas e terapêuticas, especialmente para tratamento PDT, infecções e outras doenças hiperproliferativas, diagnóstico e diagnóstico de fluorescência e tratamento de PDT de uma indicação não-tumorosa, tal como artrite, doenças inflamatórias, infecções virais ou bacterianas, oftalmológica, dermatológica ou distúrbios urológicos. Uma modalidade consiste em um método para sintetizar uma porfirina com um arranjo definido de meso-substituintes e, em seguida, converter esse sistema porfirina a um sistema clorina Η por dihidroxilação ou redução, e se houver mais de Ü3n,, isômero se separa por cromatografia. Em outra modalidade é fornecido compostos anfifilicos com uma alta afinidade de membrana e aumentada eficácia PDT. A classe de compostos que é reivindicada no documento WO 2010/033678 consiste de anéis semelhantes às porfirinas, mas que são denòminadas de clorinas e * '.possuem um dos anéis que forma o macrociclo reduzido. Com relação aos substituintes nas posições meso do anel, estes diferem dos compostos da presente invenção, visto que a presente invenção descreve porfirinas e clorinas com quatro substituintes nas posições meso, sendo que três são fenilas e o quarto é um substituinte com carga positiva, que se trata de uma piridina ligada a uma metila (ou outros grupos alquila) ou complexo de rutênio.International Patent Application WO 2010/033678 (PCT / US2009 / 057283), entitled: "Novel method and application of unsymmetrically meso-substituted porphyrins and chlorins for PDT"; on behalf of CERAMOPTEC INDUSTRIES, INC, published March 25, 2010 describes biologically active compounds that can be used as photosensitizers for diagnostic and therapeutic applications, especially for PDT treatment, infections and other hyperproliferative diseases, fluorescence diagnosis and diagnosis, and treatment. PDT of a non-tumor indication, such as arthritis, inflammatory diseases, viral or bacterial infections, ophthalmic, dermatological or urological disorders. One embodiment is a method of synthesizing a porphyrin with a defined arrangement of meso-substituents and then converting that porphyrin system to a chlorine Η system by dihydroxylation or reduction, and if more than Ü3n, isomer is separated by chromatography. . In another embodiment amphiphilic compounds with high membrane affinity and increased PDT efficacy are provided. The class of compounds which is claimed in WO 2010/033678 consists of porphyrin-like rings, but which are called chlorines and have one of the rings that form the reduced macrocycle. As regards the substituents at the meso ring positions, they differ from the compounds of the present invention in that the present invention describes porphyrins and chlorins with four substituents at the meso positions, where three are phenyl and the fourth is a positively charged substituent which It is a pyridine attached to a methyl (or other alkyl groups) or ruthenium complex.

De forma análoga aos compostos do documento WO 2010/033678, as porfirinas da presente invenção apresentam também um caráter anfifilico, entretanto, a presença do grupo periférico carregado positivamente tende a favorecer e intensificar a interação, por exemplo, com membranas celulares e mitocôndria. A formulação lipossomal que foi descrita no documento WO 2010/033678 trata-se de partículas lipidicas contendo essas clorinas encapsuladas, ou seja, «% além do principio ativo ser diferente do que é revelad^ na presente invenção, o material no qual é encapsulado também é diferente. A presente invenção consiste em uma formulação de porfirinas encapsuladas em material polimérico biocompativel e visando uma aplicação direta na pele. O Pedido de patente interAacional WO 2009/038659 v (PCT/US2008/010608), intitulado: "Organically modified silica nanoparticles with covalently incorporated photosensitizers for drug delivery in photodynamic therapy", em nome de HEALTH RESEARCH INC e THE RESEARCH FOUNDATION OF STATE UNIVERSITY OF NEW YORK, publicado em 26 de março de 2009 revela nanoparticulas contendo moléculas fotossensibilizadoras covalentemente ligadas que superam a desvantagem da · liberação prematura e, assim, melhoram o resultado de PDT. Na reivindicação 4 do referido documento é descrito que a nanoparticula tem pelo menos um grupo Rl ou R3 selecionado do grupo consistindo de porfirinas, clorinas bacterioclorinas, benzoclorinas, benzoporfirinas e derivados dos mesmos. O documento WO 2009/038659 relata a invenção de nanoparticulas de silica que contém na sua superfície moléculas de porfirina ou derivados porfirinicos ligadas, as quais permitem ainda a ligação de peptideos, anti-corpos, radioisótopos e outros agente que permitam /- direcionar essas nanoparticulas para células alvo e' propiciem o diagnóstico e tratamento de doenças. A principal diferença com relação ao sistema polimérico da presente invenção é o fato de que a porfirina encontra-se encapsulada no interior do material polimérico, e não na superfície da partícula como descrito no documento WO 2009/038659. Alem disso, o 1 fato das formulações í v poliméricas da presente invenção serem desenvolvidas para aplicação local, não torna imprescindível a presença de grupos que possam direcionar as cápsulas para as células alvo, uma vez que elas serão aplicadas no local de interesse, isto é, não passando pela corrente sanguínea, deste modo, apresentando baixíssima ou nenhuma toxidade. O pedido de patente americano US 2009131500, intitulado: "Porphyrin derivates and their use as photosensitizers in photodynamic therapy", em nome de ROEDER BEATE; ERMILOV EUGENY, JUX NORBER e JASINSKI STEFAN, publicado em 21 de maio de 2009 se refere a novos derivados de porfirina de fórmula (I), especialmente para as porfirinas que carregam moléculas fenil substituídas na posição meso. Os derivados de porfirina do documento US 2009131500 são úteis como fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica (PDT), especialmente na terapia fotodinâmica do tumor. Devido às excelentes propriedades fotofisicas dos compostos % fórmula I, estes são extremamente eficientes no tratamento fotodinâmico.Similarly to the compounds of WO 2010/033678, the porphyrins of the present invention also have an amphiphilic character, however, the presence of the positively charged peripheral group tends to favor and intensify interaction, for example with cell membranes and mitochondria. The liposomal formulation which has been described in WO 2010/033678 is lipid particles containing such encapsulated chlorins, that is,% besides the active ingredient being different from that disclosed in the present invention, the material in which it is encapsulated also is different. The present invention is a formulation of porphyrins encapsulated in biocompatible polymeric material and intended for direct application to the skin. International Patent Application WO 2009/038659 v (PCT / US2008 / 010608) entitled: "Organically modified silica nanoparticles with covalently incorporated photosensitizers for photodynamic therapy" on behalf of HEALTH RESEARCH INC and THE RESEARCH FOUNDATION OF STATE UNIVERSITY OF NEW YORK, published March 26, 2009 discloses nanoparticles containing covalently linked photosensitizing molecules that overcome the disadvantage of premature release and thus improve the PDT result. In claim 4 of said document it is disclosed that the nanoparticle has at least one group R1 or R3 selected from the group consisting of porphyrins, bacteriochlorins chlorines, benzochlorines, benzoporphyrins and derivatives thereof. WO 2009/038659 discloses the invention of silica nanoparticles containing on their surface porphyrin molecules or bound porphyrin derivatives, which further allow the binding of peptides, antibodies, radioisotopes and other agents that allow / - direct these nanoparticles target cells and provide the diagnosis and treatment of diseases. The main difference with respect to the polymeric system of the present invention is that porphyrin is encapsulated within the polymeric material rather than on the particle surface as described in WO 2009/038659. Moreover, the fact that the polymeric formulations of the present invention are developed for local application does not make it necessary to have groups that can direct the capsules to the target cells, as they will be applied at the site of interest, that is. , not passing through the bloodstream, thus presenting very low or no toxicity. US Patent Application 2009131500 entitled "Porphyrin derivatives and their use of photosensitizers in photodynamic therapy" in the name of ROEDER BEATE; ERMILOV EUGENY, JUX NORBER and JASINSKI STEFAN, published May 21, 2009, refer to novel porphyrin derivatives of formula (I), especially for porphyrins carrying meso-substituted phenyl molecules. Porphyrin derivatives of US 2009131500 are useful as photosensitizers in photodynamic therapy (PDT), especially in tumor photodynamic therapy. Due to the excellent photophysical properties of the formula I compounds, they are extremely efficient in photodynamic treatment.

Como discutido anteriormente, a classe de compostos revelada pela presente invenção são compostos fotoativos consistindo de porfirinas e clorinas meso-substituídas monocatiônicas. A principal vantagem dos compostos da t i presente invenção quando comparados aos compostos do documento US 2009131500 é o fato da carga positiva dos compostos sintetizados da presente invenção permitir uma maior incorporação/interação, por exemplo, com a membrana das células e organelas. Esse fato é de extrema importância, visto que uma interação mais efetiva com sistemas biológicos resulta em uma maior eficiência fotodinâmica, ou seja, maiores eficiências fotodinâmicas e melhores resultados no tratamento. O pedido de patente americano US 2007218049, intitulado: "Nanoparticle based photodynamic therapy and methods of making and using same", em nome de CHEN WEI e ZHANG JUN, publicado em 20 de setembro de 2007 descreve um método para tratamento de câncer, que combina a radioterapia e a terapia fotodinâmica (PDT). Mais especificamente, as nanoparticulas luminescentes com fotossensibilizadores, tais como porfirinas, são usadas como um novo tipo de agente para a terapia fotodinâmica. O documento US 2007218049 relata mais uma v e /. a utilização de porfirinas como fotossensibilizadores em Terapia Fotodinâmica, mas essas porfirinas contém grupos ligados ao anel que permitem a ligação com nanopartículas luminescentes. São essas partículas luminescentes que, uma vez excitadas por uma fonte externa de calor ou radiação iònizante, emitem luz, a { i qual é absorvida pela porfirina. Este sistema difere dos sistemas convencionais, onde o fotossensibilizador é excitado por uma fonte de luz externa. Entretanto, embora esse sistema descrito relate mais uma vez a importância da utilização de porfirinas como fotossensibilizadores, este difere das formulações poliméricas contendo as porfirinas e clorinas monocatiônicas encapsuladas da- presente invenção, uma vez que não são utilizadas nanopart ículas como fonte de luz, e sim, uma fonte de radiação externa. O pedido de patente internacional WO 03/064426 (PCT/CA03/00120), intitulado: "N,N'-dimethylated N- confused porphyrins", em nome de THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, publicado em 29 de janeiro de 2003 descreve compostos compreendendo o grupo porfirina mas com um anel pirrólico rotacionado. Estes compostos têm uma absorção intensa em torno de 7 90 nm. Eles tem, portanto, potencial para sensibilizadores PDT (terapia fotodinâmica) .As discussed above, the class of compounds disclosed by the present invention are photoactive compounds consisting of porphyrins and monathionic mesosubstituted chlorins. The main advantage of the compounds of the present invention compared to the compounds of US 2009131500 is that the positive charge of the synthesized compounds of the present invention allows for greater incorporation / interaction, for example with the cell membrane and organelles. This is of utmost importance as more effective interaction with biological systems results in higher photodynamic efficiency, ie higher photodynamic efficiencies and better treatment results. US Patent Application 2007218049 entitled "Nanoparticle based photodynamic therapy and methods of making and using same" in the name of CHEN WEI and ZHANG JUN, published September 20, 2007, describes a method for cancer treatment that combines radiotherapy and photodynamic therapy (PDT). More specifically, photosensitizing luminescent nanoparticles, such as porphyrins, are used as a new type of agent for photodynamic therapy. US 2007218049 reports one more v and /. the use of porphyrins as photosensitizers in photodynamic therapy, but these porphyrins contain ring-bonded groups that allow bonding with luminescent nanoparticles. It is these luminescent particles that, when excited by an external source of heat or ionizing radiation, emit light, which is absorbed by porphyrin. This system differs from conventional systems where the photosensitizer is excited by an external light source. However, although this described system once again reports the importance of using porphyrins as photosensitizers, it differs from the polymeric formulations containing the encapsulated monorionic porphyrins and chlorins of the present invention in that nanoparticles are not used as a light source, and yes, a source of external radiation. International Patent Application WO 03/064426 (PCT / CA03 / 00120) entitled: "N, N'-dimethylated N-confused porphyrins" in the name of THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA, published January 29, 2003, describes compounds comprising the porphyrin group but with a rotated pyrrolic ring. These compounds have an intense absorption around 790 nm. They therefore have potential for PDT (photodynamic therapy) sensitizers.

Como relato anteriormente, já é conhecido desde o inicio do século passado que porfirinas possuem propriedades de fotossensibilizadores. Entretanto, diferentes modificações podem ser feitas em sua estrutura a fim de aumentar a sua atividade fotodinâmica, por meio de uma interação mais efetiva com í v sistemas biológicos. Dessa forma, diferentes porfirinas podem ser sintetizadas, mas não necessariamente serão eficientes quando dispersas no meio biológico.As previously reported, it has been known since the beginning of the last century that porphyrins have photosensitizing properties. However, different modifications can be made to its structure in order to increase its photodynamic activity through a more effective interaction with biological systems. Thus, different porphyrins can be synthesized, but will not necessarily be efficient when dispersed in the biological environment.

Sumário da Invenção Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação à formulação polimérica para tratamento de tumores e algumas outras moléstias por terapia fotodinâmica, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/beneficio mais favorável. A presente invenção trata de uma formulação eficiente para o tratamento de tumores, baseado na injeção in loco de uma formulação de micro e nanocápsulas poliméricas biocompativeis contendo fotossensibilizadores incorporados. Tais partículas apresentam elevada capacidade de entrega do conteúdo fotoativo e são capazes de interagir fortemente com as «fc-y /Λ células de modo a limitar sua migração ê'j biodistribuição, permitindo um tratamento localizado da região tumoral sem afetar outras partes do organismo. 0 tratamento utiliza derivados porfirinicos como moléculas fotoativas e se caracteriza pelo fato de não utilizar o método de administração intravenosa para a realização do tratamento, mas se vale da limitáda migração do material $ \ v fotoativo, que fica concentrado nas vizinhanças da região de inoculação, minimizando os efeitos colaterais ou tóxicos.SUMMARY OF THE INVENTION In order to solve the above problems, the present invention will provide significant advantages over the polymeric formulation for treating tumors and some other photodynamic therapy disorders, enabling an increase in their performance and having a more favorable cost / benefit ratio. The present invention is an efficient tumor treatment formulation based on the in situ injection of a biocompatible polymeric micro and nanocapsule formulation containing incorporated photosensitizers. Such particles exhibit high photoactive content delivery capacity and are able to interact strongly with cells to limit their migration and biodistribution, allowing localized treatment of the tumor region without affecting other parts of the organism. The treatment uses porphyrin derivatives as photoactive molecules and is characterized by the fact that it does not use the intravenous administration method to perform the treatment, but relies on the limited migration of the photoactive material, which is concentrated in the vicinity of the inoculation region, minimizing side effects or toxic effects.

Breve Descrição dos Desenhos A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição: A Figura 1 mostra um esquema de sintese da meso-3-mono-piridil (trifenil)porfirina (3-MPyTPP) ; A figura 2 mostra um esquema de sintese da meso-3-raetil-mono-piridil(trifenil)porfirina, 3MMe; A Figura 3 mostra um esquema dos derivados porfirinicos coordenados ao complexo Ru[(bipy) 2C1 ] + A Figura 4 mostra a distribuição de tamanho das partículas submetidas a 10 minutos de ultrassonicação, nas concentrações de tween 20 de: (a) 0%; (b) 0,4%; (c) 0,8%; (d) 1,0%; (e) 1,2% e (f) 1,6%.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The structure and operation of the present invention, together with further advantages thereof may be better understood by reference to the accompanying drawings and the following description: Figure 1 shows a synthetic scheme of meso-3-mono-pyridyl. (triphenyl) porphyrin (3-MPyTPP); Figure 2 shows a synthetic scheme of meso-3-methyl-pyridyl (triphenyl) porphyrin, 3MMe; Figure 3 shows a schematic of the Ru [(bipy) 2C1] + coordinated porphyrinic derivatives + Figure 4 shows the size distribution of the particles subjected to 10 minutes of ultrasound at tween 20 concentrations of: (a) 0%; (b) 0.4%; (c) 0.8%; (d) 1.0%; (e) 1.2% and (f) 1.6%.

*P A Figura 5 raostra uma fotomicrografia das partículas submetidas a 10 minutos de ultrassonicação, nas concentrações de tween 20 de: (a) 0%; (b) 0,4%; (c) 0,8%; (d) 1,0%; (e) 1,2% e (f) 1,6%. A Figura 6 mostra imagens de microscopia Confocal de fluorescência de microcápsulas de atelocolágeno marinho: Figura 6(a) sem polfirina e Figura 6(b) í v contendo 1,0.10-4 Mol. L"1 da porfirina 3MMe, λΕχο = 514nm; A Figura 7 mostra os espectros de emissão obtidos para uma emulsão contendo 1,2% de tween 20, antes (linha continua )e após ser submetida a processamento por ultrassonicação durante 10 minutos (linha tracejada ----) e 20 minutos (linha pontilhada "") ; λΕχο = 421 nm; A Figura 8 mostra a porcentagem de células viáveis após 3 horas de incubação, na ausência (controle) e presença de cápsulas poliméricas de ACM sem o composto fotoativo (A e C) e contendo lxlO-6 mol L-1 de 3MMe (B e D) ; não irradiadas (A e B) ; e irradiadas (C e D) ; A Figura 9 representa um gráfico em blocos mostrando a influência do tempo de incubação na citotoxicidade da porfirina 3MMe encapsulada em cápsulas de ACM; A Figura 10 (A) e Figura 10 (B) representam gráficos em blocos mostrando a influência do tempo de incubação (A) e do tempo de irradiação (B) na ÇU4 fototoxicidade da porfirina 3MMe encapsulada em micrdjçe nanocápsulas de ACM; A Figura 11 mostra um gráfico em barras da comparação da toxicidade (A e B) e fototoxicidade (C e D) das formulações polimérica e lipidica. Os Experimentos A e C foram realizados com as micro e nanocápsulas poliméricas; e experimentos B e D foram f v realizados com os lipossomas de PC; A Figura 12 mostra histogramas de distribuição de tamanho das partículas (a) poliméricas e (b) lipídicas; e (c) espectros de fluorescência da porfirina 3MMe encapsulada nas partículas poliméricas (linha contínua) e lipídicas (linha tracejada), Aexc = 421 nm; A Figura 13 mostra um gráfico indicando a Intensidade de fluorescência em 655 nm (em contagem de fótons por segundo, cp.s-1) em função da concentração de 3MMe, na faixa de 1,0 x 1CT9 a 1,0 x 10“6 Mol.L-1, Xexc = 421 nm. As amostras foram diluídas em meio de cultura DMEM incolor; A Figura 14 mostra um gráfico indicando a porcentagem de incorporação da porfirina 3MMe em células HeLa, em função do tempo de incubação, para as formulações lipidica (indicada pelos quadrados) e polimérica de ACM (indicada pelos triângulos); A Figura 15 mostra imagens do tumor (A) antes da V'-;f ^ aplicação do tratamento; (B) 12 dias após a primeirâi' aplicação do tratamento de TFD; (C) 4 dias após a segunda aplicação da TFD; (D) 12 dias após a segunda aplicação do tratamento de TFD; A Figura 16 mostra um gráfico indicando a variação do volume tumoral durante o periodo do experimento. As setas indicam as duas aplicações 'do tratamento de TFD; e ? v A Figura 17 é uma representação esquemática do método de tratamento de tumores de pele, utilizando a Terapia Fotodinâmica, empregando as formulações desenvolvidas.Figure 5 shows a photomicrograph of particles subjected to 10 minutes of ultrasound at tween 20 concentrations of: (a) 0%; (b) 0.4%; (c) 0.8%; (d) 1.0%; (e) 1.2% and (f) 1.6%. Figure 6 shows Confocal fluorescence microscopy images of marine atelocollagen microcapsules: Figure 6 (a) without polyrin and Figure 6 (b) v containing 1.0.10-4 Mol. L "1 of porphyrin 3MMe, λΕχο = 514nm; Figure 7 shows the emission spectra obtained for an emulsion containing 1.2% tween 20 before (continuous line) and after being sonicated for 10 minutes (dashed line ----) and 20 minutes (line ""); λΕχο = 421 nm; Figure 8 shows the percentage of viable cells after 3 hours of incubation, in the absence (control) and presence of polymeric MCA capsules without photoactive compound (A and C) and containing 1x10- 6 mol L-1 of 3MMe (B and D), non-irradiated (A and B) and irradiated (C and D) Figure 9 is a block graph showing the influence of incubation time on the cytotoxicity of encapsulated 3MMe porphyrin in ACM capsules; Figure 10 (A) and Figure 10 (B) represent block graphs. s showing the influence of incubation time (A) and irradiation time (B) on the phototoxicity of 3MMe porphyrin encapsulated in ACM nanocapsule microdecs; Figure 11 shows a bar graph of the comparison of toxicity (A and B) and phototoxicity (C and D) of the polymeric and lipid formulations. Experiments A and C were performed with polymeric micro and nanocapsules; and experiments B and D were performed with the PC liposomes; Figure 12 shows histograms of size distribution of (a) polymeric and (b) lipid particles; and (c) fluorescence spectra of 3MMe porphyrin encapsulated in polymeric (solid line) and lipid (dashed) particles, λ max = 421 nm; Figure 13 shows a graph indicating the fluorescence intensity at 655 nm (in photon count per second, cp.s-1) as a function of 3MMe concentration in the 1.0 x 1CT9 range at 1.0 x 10 “ 6 Mol.L-1, Xexc = 421 nm. Samples were diluted in colorless DMEM culture medium; Figure 14 shows a graph indicating the percent incorporation of 3MMe porphyrin into HeLa cells as a function of incubation time for the lipid (indicated by squares) and polymeric formulations of ACM (indicated by triangles); Figure 15 shows images of the tumor (A) prior to treatment application; (B) 12 days after the first application of PDT treatment; (C) 4 days after the second application of PDT; (D) 12 days after the second application of PDT treatment; Figure 16 shows a graph indicating the change in tumor volume during the experiment period. Arrows indicate the two applications of PDT treatment; and ? v Figure 17 is a schematic representation of the method of treating skin tumors using photodynamic therapy employing the formulations developed.

Descrição Detalhada da Invenção Embora a presente invenção possa ser suscetível a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui. A presente invenção refere-se a formulações poliméricas para tratamento de tumores de pele e algumas outras moléstias por terapia fotodinâmica. Mais especificamente, a presente invenção se refere a emulsões compreendendo de micro e nanocápsulas poliméricas contendo drogas fotoativas sendo aplicada in yU --1.-.. loco. Tal procedimento combina a alta eficiêncí^ de í>\__ '1 „í/,ç - interação e de entrega do conteúdo às células doentes pelas partículas poliméricas, associada à posterior irradiação com luz de comprimento de onda adequado.Detailed Description of the Invention Although the present invention may be susceptible to different embodiments, it is shown in the drawings and the following detailed discussion, a preferred embodiment with the understanding that the present embodiment should be considered an exemplification of the principles of the invention and is not intended to limit the scope of the invention. present invention as illustrated and described herein. The present invention relates to polymeric formulations for treating skin tumors and some other photodynamic therapy disorders. More specifically, the present invention relates to emulsions comprising photoactive drug-containing polymeric micro and nanocapsules being applied in situ. This procedure combines the high efficiency of interaction and delivery of content to diseased cells by the polymeric particles, associated with subsequent irradiation with light of adequate wavelength.

As formulações da presente invenção são constituídas principalmente de cápsulas poliméricas de diâmetros nanométricos, com ’elevada capacidade de v interação e entrega dos compostos fotoativos encapsulados (particularmente porfirinas, clorinas, benzoporfirinas, bacterioclorinas, ftalocianinas, bem como outras moléculas lipofílicas com eficiência fotodinâmica comprovada, onde foi desenvolvida e testada.The formulations of the present invention are comprised primarily of nanometer-diameter polymeric capsules with high interaction and delivery ability of encapsulated photoactive compounds (particularly porphyrins, chlorines, benzoporphyrins, bacteriochlorins, phthalocyanines, as well as other lipophilic molecules with proven photodynamic efficiency). where it was developed and tested.

As cápsulas são constituídas por um invólucro polimérico disposto ao redor· de um núcleo oleoso, estando a molécula fotoativa dissolvida no mesmo e/ou adsorvida à parede polimérica.The capsules are comprised of a polymeric shell arranged around an oily core, the photoactive molecule being dissolved therein and / or adsorbed to the polymeric wall.

Como constituintes do núcleo oleoso das partículas, podem ser empregados os óleos de canola, de semente de uva, de amêndoas e ácido oléico, além de co-adjuvantes tais como tween 20, tween 80, Triton, propileno glicol, miristato de isopropila e palmitato de octila. O invólucro polimérico pode ser constituído de diversos materiais biocompatíveis e/ou biodegradáveis, especialmente ácido láctico/poliláctico, polietilenoglicol, goma xantana, goma arabicaf)., hidroxietilcelulose, atelocolágeno e alginato.As constituents of the oil core of the particles, canola, grape seed, almond and oleic oils may be employed, as well as co-adjuvants such as tween 20, tween 80, Triton, propylene glycol, isopropyl myristate and palmitate. of octyl. The polymeric shell may be comprised of various biocompatible and / or biodegradable materials, especially lactic / polylactic acid, polyethylene glycol, xanthan gum, arabica gum), hydroxyethylcellulose, atelocollagen and alginate.

As formulações da presente invenção são constituídas de micro e nanocápsulas poliméricas, obtidas através do método de coacervação. Tal método utiliza elevada velocidade de agitação, seguida de ultrassonicação gue resulta na 1 formação de quantidade í v vconsiderável de partículas com diâmetros nanométricos na faixa de 100 a 1000 nm. A utilização de nanocápsulas para aplicação tópica se torna interessante devido a possibilidade de penetrarem nas camadas mais profundas da pele e de se dispersarem mais prontamente em tecidos biológicos. No caso do tratamento de tumores por Terapia Fotodínâmica, a utilização de nanossistemas poliméricos tem como principais objetivos superar os mecanismos de resistência celular e não-celular, solubilizar compostos lipofilicos e aumentar a seletividade frente à células tumorais em detrimento dos tecidos saudáveis.The formulations of the present invention are comprised of polymeric micro and nanocapsules obtained by the coacervation method. Such a method utilizes a high agitation rate followed by ultrasound which results in the formation of a considerable amount of particles with nanometer diameters in the range 100 to 1000 nm. The use of nanocapsules for topical application becomes interesting because they can penetrate deeper layers of the skin and disperse more readily in biological tissues. In the case of treatment of tumors by photodynamic therapy, the use of polymeric nanosystems aims to overcome the mechanisms of cellular and non-cellular resistance, solubilize lipophilic compounds and increase selectivity against tumor cells over healthy tissues.

Como citado anteriormente, o tratamento por Terapia Fotodínâmica é baseado na aplicação de compostos fotoativos seguido de irradiação com uma fonte de luz numa faixa específica, comumente um laser de radiação vermelha. Assim, a avaliação da toxicidade no escuro e com irradiação é fundamental para avaliar a eficiência de um agente terapêutico. vtt Nesse sentido, as formulações reveladas pela presente invenção apresentaram excelentes resultados, não tendo sido observado nenhuma toxicidade na ausência de luz nos ensaios realizados utilizando-se formulações com ACM e células do tipo HeLa. Entretanto, demonstraram elevada fototoxicidade quando’ irradiados com luz $ v v vermelha, provocando cerca de 60% de morte celular em apenas uma sessão de 10 minutos, em condições experimentais otimizadas. Verificou-se que tal atividade fotodinâmica se deve principalmente à incorporação de maior quantidade dos compostos fotoativos nas células, particularmente no citoplasma, onde a concentração aumenta significativamente em função do tempo de incubação.As mentioned earlier, photodynamic therapy treatment is based on the application of photoactive compounds followed by irradiation with a light source in a specific range, commonly a red radiation laser. Thus, the evaluation of toxicity in the dark and with irradiation is fundamental to evaluate the efficiency of a therapeutic agent. In this regard, the formulations disclosed by the present invention showed excellent results and no toxicity was observed in the absence of light in the assays performed using formulations with ACM and HeLa-like cells. However, they demonstrated high phototoxicity when irradiated with red light, causing about 60% cell death in just a 10 minute session under optimized experimental conditions. Such photodynamic activity was found to be mainly due to the incorporation of more photoactive compounds into cells, particularly in the cytoplasm, where the concentration increases significantly as a function of incubation time.

As formulações reveladas pela presente invenção mostraram-se mais eficientes que formulações lipossomais de fosfatidilcolina, contendo a mesma concentração dos compostos fotoativos. De fato, uma taxa significativamente maior de morte celular foi verificada nas culturas de células HeLa tratadas com as formulações poliméricas e irradiadas, em relação as tratadas com as formulações de fosfatidilcolina, devido ao fato dos primeiros serem mais eficientes na entrega dos compostos fotoativos para as células, levando a uma concentração ν'Λ iíüó:,,„, maior das drogas nas mesmas condições de tratamento V i O · Estudos in vivo, utilizando melanomas desenvolvidos em camundongos, comprovaram a eficiência do tratamento, reduzindo em praticamente 100% o volume tumoral após aplicação de duas sessões do tratamento. A formulação foi aplicada por meio de uma injeção in loco e, após cerca de 60 minutos, o tumor' foi irradiado durante í \ apenas 7 minutos, com um laser vermelho e potência local de 100 mW/cm2. O tratamento foi repetido após cerca de 12 dias levando a eliminação quase total da massa tumoral e regeneração total da pele após 24 dias.The formulations disclosed by the present invention were more efficient than phosphatidylcholine liposomal formulations containing the same concentration as the photoactive compounds. In fact, a significantly higher rate of cell death was observed in HeLa cell cultures treated with polymeric and irradiated formulations than in those treated with phosphatidylcholine formulations, because the former were more efficient in delivering photoactive compounds to the cells. cells leading to a higher concentration of drugs under the same treatment conditions V i O · In vivo studies using mouse-developed melanomas have proven treatment efficiency by reducing the volume by almost 100%. tumor after two treatment sessions. The formulation was applied by injection on site and after about 60 minutes the tumor was irradiated for only 7 minutes with a red laser and local power of 100 mW / cm 2. The treatment was repeated after about 12 days leading to almost total elimination of tumor mass and total skin regeneration after 24 days.

Abaixo são apresentados a preparação, caracterização e os resultados dos estudos- in vitro e in vivo obtidos utilizando-se uma das formulações da presente invenção com um · derivado porfirinico encapsulado em nanocápsulas poliméricas de atelocolágeno marinho (ACM). 1) Método de preparação dos derivados porfirinicos fotoativos Os derivados porfirinicos anfifilicos (a serem posteriormente encapsulados) foram preparados de acordo com metodologia desenvolvida pelo nosso grupo de pesquisa, baseada no método de Fleischer de sintese de porfirinas contendo diferentes substituintes periféricos. O macrociclo porfirinico meso-substituido foi preparado através da reação de ciclização entre o pirrol e o aldeido correspondente na proporção de 3:1, utilizando refluxo em ácido acético glacial. Foram utilizados três aldeidos: o 2-piridil-carboxaldeido, o 3-piridil-carboxaldeido e o 4-piridil-carboxaldeido, de forma a obter as porfirinas de interesse: a meso-2- monopiridil(trifenil)portirina ’(2-MPyTPP), a meso-3-vmonopiridil(trifenil)porfirina (3-MPyTPP) e a meso-4-monopiridil(trifenil)porfirina (4-MPyTPP), respectivamente. A figura 1 ilustra a reação para o caso do macrociclo apresentando a piridina ligada pela posição 3. Após a sintese, o solvente foi removido no evaporador rotatório e o sólido do balão disperso em metanol onde a porfirina precipitou instantaneamente, sendo posteriormente filtrada a vácuo, utilizando um funil de placa sinterizada. A figura 2 representa a preparação dos compostos metilados, em que se reagiu a meso-mono-piridil(trifenil)porfirina com um grande excesso de tosilato de metila, em dimetilformamida (DMF) em refluxo, por cerca de 4 horas. A reação foi monitorada por cromatografia em camada delgada (TLC), para verificar o final da reação. Após esfriar, o solvente da mistura reacional foi removido no evaporador rotatório. Ν.·-'\ Ο sólido foi dissolvido em DMF e a solução foi gotejada,,, em uma solução de cloreto de sódio, onde a porfirina precipitou instantaneamente. O sólido foi filtrado e lavado várias vezes com água. A porfirina foi purificada em coluna de alumina neutra usando como fase móvel diclorometano, o qual foi responsável pela eluição da pbrfirina não metilada, vseguida da adição de metanol que levou a eluição do composto desejado.Below are the preparation, characterization and results of in vitro and in vivo studies obtained using one of the formulations of the present invention with a porphyrinic derivative encapsulated in polymeric marine atelocollagen (ACM) nanocapsules. 1) Method of preparing the photoactive porphyrin derivatives The amphiphilic porphyrin derivatives (to be further encapsulated) were prepared according to the methodology developed by our research group, based on Fleischer's method of synthesizing porphyrins containing different peripheral substituents. The mesosubstituted porphyrinic macrocycle was prepared by the cyclization reaction between pyrrol and the corresponding aldehyde in a 3: 1 ratio using reflux in glacial acetic acid. Three aldehydes were used: 2-pyridyl carboxaldehyde, 3-pyridyl carboxaldehyde and 4-pyridyl carboxaldehyde to obtain the porphyrins of interest: meso-2-monopyridyl (triphenyl) portirine '(2-MPyTPP ), meso-3-vmonopyridyl (triphenyl) porphyrin (3-MPyTPP) and meso-4-monopyridyl (triphenyl) porphyrin (4-MPyTPP), respectively. Figure 1 illustrates the reaction for the macrocycle showing pyridine bound by position 3. After synthesis, the solvent was removed on the rotary evaporator and the flask solid dispersed in methanol where porphyrin precipitated instantaneously and was then vacuum filtered. using a sintered plate funnel. Figure 2 shows the preparation of the methylated compounds in which the meso-pyridyl (triphenyl) porphyrin was reacted with a large excess of methyl tosylate in refluxing dimethylformamide (DMF) for about 4 hours. The reaction was monitored by thin layer chromatography (TLC) to verify the end of the reaction. After cooling, the solvent of the reaction mixture was removed on the rotary evaporator. The solid was dissolved in DMF and the solution was dripped into a sodium chloride solution, where porphyrin precipitated instantly. The solid was filtered and washed several times with water. Porphyrin was purified on a neutral alumina column using dichloromethane as the mobile phase, which was responsible for the elution of unmethylated pbrfirine, followed by the addition of methanol which eluted the desired compound.

Os derivados porfirinicos coordenados ao complexo cloro-bis-bipiridinarutênio(II) , [Ru(bipy) 2C1 ] , foram sintetizados refluxando-se o complexo por cerca de 15 minutos na presença de quantidade adequada, quase estequiométrica de nitrato de prata, em uma mistura água:etanol, a fim de obter o respectivo aqua-complexo, conforme a reação descrita abaixo: [Ru (bipy) 2C12] + AgN03 -> [Ru (bipy) 2C1 (H20) ] + + AgCl<s) (D O cloreto de prata formado foi removido e o filtrado, contendo essencialmente o aqua-complexo, foi concentrado no evaporador rotatório, e adicionado a uma mistura de CH2C12: DMF contendo a massa de porfirina adequada. A figura 3 ilustra a reação de obtenção da porfirina contendo um complexo de rutênio coordenado a um dos anéis piridinicos. O sistema foi mantidõí·* em -Qte ■ refluxo por cerca de 1 hora e a reação foi acompanhada através de espectroscopia no ultravioleta-visivel. Após esfriar, o solvente foi removido, o sólido redissolvido em DMF, e essa solução foi gotejada sobre uma solução de trifluorometanossulfonato de litio (LiTFMS), precipitando o respectivo sal ’de TFMS“. O sólido foi í v posteriormente centrifugado e lavado várias vezes com água .The porphyrinic derivatives coordinated to the chloro-bis-bipyridinaruthenium (II) complex, [Ru (bipy) 2C1], were synthesized by refluxing the complex for about 15 minutes in the presence of an almost stoichiometric amount of silver nitrate in a water: ethanol mixture to obtain its aqua-complex according to the reaction described below: [Ru (bipy) 2C12] + AgN03 -> [Ru (bipy) 2C1 (H20)] + + AgCl <s) (OD The silver chloride formed was removed and the filtrate, containing essentially the aqua-complex, was concentrated on the rotary evaporator, and added to a mixture of CH 2 Cl 2: DMF containing the appropriate porphyrin mass. a ruthenium complex coordinated to one of the pyridine rings.The system was kept at reflux for about 1 hour and the reaction was followed by ultraviolet-visible spectroscopy.After cooling, the solvent was removed, the solid removed. redissolved in DMF, and is The solution was dripped onto a lithium trifluoromethanesulfonate (LiTFMS) solution, the respective TFMS salt 'precipitating out. The solid was then centrifuged and washed several times with water.

Uma purificação em coluna de alumina neutra foi realizada a fim de separar o composto de interesse das impurezas remanescentes. Para tal procedimento, foi utilizada como fase móvel uma mistura diclorometano:etanol, sendo a polaridade aumentada gradativamente. O centro do macrociclo porfirinico também foi metalado com o ion Zn2+, utilizando acetato de zinco em refluxo em ácido acético.Neutral alumina column purification was performed to separate the compound of interest from the remaining impurities. For this procedure, a dichloromethane: ethanol mixture was used as the mobile phase, and the polarity was gradually increased. The center of the porphyrinic macrocycle was also metallized with the Zn2 + ion using refluxing zinc acetate in acetic acid.

Dessa forma, foi obtida uma série de compostos monossubstituidos, cujas estruturas estão apresentadas abaixo: \ s s Estas séries de derivados porfirinicos apresentam um elevado caráter lipofilico, tendo uma grande capacidade de interação/penetração' com membranas biológicas e, consequentemente, uma elevada ação fotodinâmica.Thus, a series of monosubstituted compounds were obtained, whose structures are presented below: \ ss These series of porphyrin derivatives have a high lipophilic character, have a great interaction / penetration capacity with biological membranes and, consequently, a high photodynamic action. .

Além disso, foi obtido uma série de compostos monossubstituidos, derivados porfirinicos com um dos anéis pirrólicos reduzido, cujas estruturas estão apresentadas abaixo. Essas clorinas foram obtidas pela reação de redução das respectivas porfirinas utilizando uma mistura de sulfonil hidrazina e carbonato de potássio em piridina, e purificadas por cromatografia em coluna de silica, utilizando mistura de CH2Cl2/etanol '7- como eluente. u t Além disso, outros derivados contendo grupos fenil alquil-substituidos e outros grupos alquila ligadas ao átomo de nitrogênio piridinico foram preparados utilizando-se procedimentos similares aos descritos acima, e as estruturas são mostradas abaixo. ■'t t n "H porfirinas clorinas R= Ph, p-toluil, fenil alquil R’- Alquil, aril, tipicamente grupos metila M= 2H+, Zn2+, Mg2+ Entretanto, todos esses derivados porfirinicos anfifilicos apresentam baixa ou nenhuma solubilidade em água. Essa característica limita a utilização direta destes compostos como fotossensibilizadores em Terapia Fotodinâmica, pois podem ocasionar o entupimento de veias e artérias devido a formação de agregados. Assim a utilização de veículos e sistemas que possam permitir a dispersão destas drogas na corrente sanguínea (meio aquoso), bem como liberá-las de forma controlada é de extrema importância. 2) Formulação de Nanocápsulas Poliméricas '■V.In addition, a series of monosubstituted compounds, porphyrin derivatives with one of the reduced pyrrole rings, whose structures are shown below, were obtained. These chlorins were obtained by reducing their porphyrins using a mixture of sulfonyl hydrazine and potassium carbonate in pyridine, and purified by silica column chromatography using CH2Cl2 / ethanol '7- mixture as eluent. In addition, other derivatives containing alkyl-substituted phenyl groups and other alkyl groups attached to the pyridine nitrogen atom were prepared using procedures similar to those described above, and the structures are shown below. Porphyrins chlorines R = Ph, p-toluyl, phenyl alkyl R'-alkyl, aryl, typically methyl groups M = 2H +, Zn2 +, Mg2 + However, all of these amphiphilic porphyrin derivatives have low or no water solubility. This feature limits the direct use of these compounds as photosensitizers in Photodynamic Therapy, as they may cause clogging of veins and arteries due to the formation of aggregates. Thus, the use of vehicles and systems that allow the dispersion of these drugs in the bloodstream (aqueous medium), as well as releasing them in a controlled manner is extremely important.2) Formulation of Polymeric Nanocapsules' ■ V.

As moléculas fotoativas foram encapsuladas'? utilizando-se o método de coacervação simples. Primeiramente, a droga fotoativa, dissolvida em solvente adequado (tipicamente clorofórmio), foi dispersa na fase oleosa. Essa solução oleosa foi adicionada sobre uma solução aquosa do polimero, sob agitação vigorosa (tipicamente na faixa de l.C?00 a 24.000 rpm) e, i1 v finalmente, adicionou-se sulfato de sódio anidro ao sistema.Have photoactive molecules been encapsulated? using the simple coacervation method. First, the photoactive drug, dissolved in a suitable solvent (typically chloroform), was dispersed in the oil phase. This oily solution was added over an aqueous solution of the polymer under vigorous stirring (typically in the range of 1.00 to 24,000 rpm) and finally anhydrous sodium sulfate was added to the system.

Nesta primeira etapa, o sistema é constituído principalmente por microcápsulas (partículas apresentando diâmetros superiores a 1000 nm) . Assim, a emulsão obtida foi reprocessada utilizando-se um ultrassonicador (VibraCell, da Sonics, durante 1 a 60 minutos), visando a redução do tamanho das partículas até atingir diâmetros nanométricos. A utilização de nanocápsulas para aplicação tópica se torna interessante devido a possibilidade de penetrarem nas camadas mais profundas da pele e de se dispersarem mais prontamente em tecidos biológicos.In this first stage, the system consists mainly of microcapsules (particles having diameters greater than 1000 nm). Thus, the emulsion obtained was reprocessed using an ultrasonic sonicator (VibraCell, from Sonics, for 1 to 60 minutes), aiming to reduce the particle size until reaching nanometric diameters. The use of nanocapsules for topical application becomes interesting because they can penetrate deeper layers of the skin and disperse more readily in biological tissues.

No caso do tratamento de tumores por Terapia Fotodinâmica, a utilização de nanossistemas poliméricos tem como principais objetivos superar os mecanismos de resistência celular e não-celular, solubilizar compostos lipofilicos e aumentar a seletividade frente à células v. > *■' tumorais em detrimento dos tecidos saudáveis. * * Substâncias tensoativas podem ser utilizadas como aditivos para controlar o tamanho das partículas. Assim, um estudo detalhado da influência de tensoativos no diâmetro das cápsulas foi realizado, variando-se sua concentração na emulsão de 0 a 10%. A Figura 4 mostra um exfemplo de resultados na í v forma de histogramas das emulsões variando-se a concentração de um surfactante. Pode-se notar que inicialmente há uma distribuição de tamanho das partículas bastante larga, com um maior número de cápsulas de diâmetros superiores a cerca de 1500 nm. A adição dos tensoativos, mesmo em baixas concentrações, altera significativamente os histogramas, tornando a distribuição de tamanho de cápsulas menos dispersa e, principalmente, aumentando o número de partículas na região de 200-500 nm. Todavia, parece haver uma tendência de aumento do tamanho das partículas na emulsão final contendo a maior concentração de tensoativo investigada. As emulsões preparadas na faixa de cerca de 0,5-2,0% de tensoativo apresentaram o perfil de distribuição de tamanho das partículas mais adequados, visto que a população de cápsulas com diâmetros na faixa nanométrica aumenta consideravelmente. A figura 5 mostra imagens de microscopia ópticg ·*¥ £> obtidas para as emulsões preparadas com as várias concentrações de surfactantes pesquisadas, por exemplo, tween 20 . Pode-se acompanhar a redução do tamanho das partículas através da diminuição da população de microcápsulas com diâmetros passíveis de serem observados com o aumento de 900^ da lente utilizada. Na í v ausência e na presença de pequenas quantidades^ de surfactante, observa-se uma grande população de cápsulas com diâmetros em torno de 15 e 20 pm. Em concentrações mais elevadas essa população reduz consideravelmente, sendo observados basicamente cápsulas com tamanhos próximos a 5 pm como sendo as maiores partículas da emulsão. A distribuição de tamanhos das cápsulas com diâmetros superiores a 100 nm, e maior população de partículas com tamanhos inferiores a 1000 nm foi tomada como padrão para a preparação das formulações que foram posteriormente utilizadas nos estudos de interação com estruturas biológicas e das respectivas eficiências fotodinâmicas. Os resultados descritos a partir de agora são referentes a formulação contendo a porfirina meso-3-metil-mono-piridil (trifenil)porfirina (3MMe), cuja estrutura está representada abaixo, como composto fotoativo encapsulado. $ j A Figura 6 mostra imagens de microscopia Confocal acoplada ao modo de fluorescência de modo a detectar a presença da porfirina 3MMe no interior das microcápsulas de atelocolágeno marinho. A Figura 6a) sem porfirina e figura 6(b) contendo 1,0.10-4 Mol.L-1 da porfirina 3MMe, λΕχο = 514nm.In the case of tumor treatment by photodynamic therapy, the use of polymeric nanosystems aims to overcome the mechanisms of cellular and non-cellular resistance, solubilize lipophilic compounds and increase selectivity against v cells. > * ■ 'Tumor over healthy tissues. * * Surfactants may be used as additives to control particle size. Thus, a detailed study of the influence of surfactants on the capsule diameter was performed, varying its concentration in the emulsion from 0 to 10%. Figure 4 shows an example of results in the form of emulsion histograms varying the concentration of a surfactant. It may be noted that initially there is a fairly wide particle size distribution, with a larger number of capsules of diameters greater than about 1500 nm. The addition of surfactants, even at low concentrations, significantly alters histograms, making the size distribution of capsules less dispersed and mainly increasing the number of particles in the region of 200-500 nm. However, there seems to be a tendency to increase particle size in the final emulsion containing the highest concentration of surfactant investigated. Emulsions prepared in the range of about 0.5-2.0% surfactant had the most suitable particle size distribution profile, as the population of capsules with nanometer diameters increased considerably. Figure 5 shows optical microscopy images obtained for emulsions prepared with the various concentrations of surfactants screened, for example tween 20. Particle size reduction can be accompanied by decreasing the microcapsule population with observable diameters with the 900% magnification of the lens used. In the absence and presence of small amounts of surfactant, a large population of capsules with diameters around 15 and 20 Âµm is observed. At higher concentrations this population decreases considerably, with capsules of about 5 pm being the largest particle size of the emulsion. The size distribution of capsules with diameters greater than 100 nm and larger population of particles smaller than 1000 nm was taken as standard for the preparation of formulations which were later used in studies of interaction with biological structures and their photodynamic efficiencies. The results described hereinafter refer to the formulation containing the porphyrin meso-3-methyl-mono-pyridyl (triphenyl) porphyrin (3MMe), the structure of which is shown below, as encapsulated photoactive compound. Figure 6 shows Confocal microscopy images coupled to the fluorescence mode to detect the presence of 3MMe porphyrin within the marine atelocollagen microcapsules. Figure 6a) without porphyrin and figure 6 (b) containing 1.0.10-4 Mol.L-1 of porphyrin 3MMe, λΕχο = 514nm.

Na figura 6a tem-se uma imagem confocal obtida para uma emulsão preparada nas mesmas condições e submetida à excitação no mesmo comprimento de onda de excitação da porfirina (514 nm) , mostrando a ausência de emissão na emulsão preparada sem o corante. A figuras 6b mostra imagem de microscopia Confocal, acoplada ao modo de fluorescência detectando a presença da porfirina no interior das cápsulas. Estas imagens foram obtidas para a mesma formulação, apenas em dois diferentes modos de visualização. Na imagem da figura 6b, as setas indicam os principais pontos de detecção da emissão. Da mesma maneira que realizado anteriormente, a imagem foi obtida focando-se nas partículas maiores papa Ά; uma melhor visualização.Figure 6a shows a confocal image obtained for an emulsion prepared under the same conditions and subjected to excitation at the same excitation wavelength as porphyrin (514 nm), showing the absence of emission in the emulsion prepared without the dye. Figures 6b shows Confocal microscopy image coupled to the fluorescence mode detecting porphyrin within the capsules. These images were obtained for the same formulation, only in two different viewing modes. In the image of figure 6b, the arrows indicate the main emission detection points. As before, the image was obtained by focusing on the larger papa Ά particles; a better view.

Espectros de fluorescência também foram obtidos utilizando-se emulsões igualmente diluídas, onde se observou que a porfirina encontra-se predominantemente na forma monomérica, pois a intensidade de emissão aumenta consideravelmente após processamento por -k vultrassonicação, como mostra a figura 7.Fluorescence spectra were also obtained using equally diluted emulsions, where it was observed that porphyrin is predominantly in monomeric form, as the emission intensity increases considerably after -k vultrasonication processing, as shown in Figure 7.

Sabe-se que a presença de agregados, mesmo em pequena extensão pode resultar em uma diminuição da intensidade de emissão de derivados porfirínicos. Assim, estes resultados indicam, provavelmente, que a quebra de cápsulas maiores em partículas menores promove uma certa diluição pelo aumento da área superficial interna das cápsulas e a diminuição da concentração de pequenos clusters de associação (provavelmente de dímeros), resultando no aumento da fluorescência. 3) Toxicidade e fototoxicidade da formulação polimérica Como citado anteriormente, o tratamento por Terapia Fotodinâmica é baseado na aplicação de compostos fotoativos seguido de irradiação com uma fonte de luz específica, comumente um laser de radiação vermelha. Assim, a avaliação da toxicidade no escuro e com irradiação é fundamental para avaliar a eficiência de um , 1- t V; > ·. agente terapêutico. ''"Λ Nesse sentido, as formulações poliméricas desenvolvidas pela presente invenção, por exemplo, contendo a porfirina 3MMe como composto fotoativo, apresentou excelentes resultados como pode ser observado na figura 8 . A figura 8 mostra a porcentagem de células viáveis \ após 3 horas de incubação, na ausência (controle) e presença de cápsulas poliméricas de ACM sem o composto fotoativo (A e C) e contendo lxlCT6 mol L-1 de 3MMe (B e D) ; não irradiadas (A e B) ; e irradiadas (C e D) . Portanto, não tendo sido observado nenhuma toxicidade na ausência de luz (experimento B) nos ensaios realizados utilizando-se células do tipo HeLa.The presence of aggregates, even to a small extent, is known to result in a decrease in the emission intensity of porphyrin derivatives. Thus, these results probably indicate that breaking larger capsules into smaller particles promotes some dilution by increasing the inner surface area of the capsules and decreasing the concentration of small association clusters (probably dimers), resulting in increased fluorescence. . 3) Toxicity and Phototoxicity of the Polymeric Formulation As mentioned above, photodynamic therapy treatment is based on the application of photoactive compounds followed by irradiation with a specific light source, commonly a red radiation laser. Thus, evaluation of dark and irradiated toxicity is critical to assess the efficiency of one, 1- t V; > ·. therapeutic agent. In this sense, the polymeric formulations developed by the present invention, for example containing 3MMe porphyrin as photoactive compound, showed excellent results as can be seen in Figure 8. Figure 8 shows the percentage of viable cells \ after 3 hours incubation in the absence (control) and presence of polymeric MCA capsules without photoactive compound (A and C) and containing 3xM6e LxlCT6 mol L-1 (B and D), non-irradiated (A and B), and irradiated ( Therefore, no toxicity was observed in the absence of light (experiment B) in the assays performed using HeLa cells.

Entretanto, demonstrou elevada fototoxicidade quando irradiado com luz vermelha, provocando quase 60% de morte celular quando irradiadas durante 10 minutos (Experimento D) . Avaliou-se também a toxicidade e fototoxicidade da formulação da presente invenção preparada sem o composto fotoativo, onde em nenhum dos casos foi observada uma taxa de morte celular significativa (experimentos A e C, respectivamente).However, it demonstrated high phototoxicity when irradiated with red light, causing almost 60% cell death when irradiated for 10 minutes (Experiment D). The toxicity and phototoxicity of the formulation of the present invention prepared without the photoactive compound were also evaluated, where in no case was a significant cell death rate observed (experiments A and C, respectively).

Alguns fatores podem influenciar fortemente a ação de um agente terapêutico em linhagens celulares, como o tempo de incubação e de irradiação. ^ f vVA^ i < J, Assim, avaliou-se também a citotoxicidade V.,, e fototoxicidade das porfirinas encapsuladas, por exemplo, 3MMe, em tempos mais longos de incubação. A Figura 11 mostra um gráfico de barras indicando a influência do tempo de incubação na citotoxicidade da porfirina 3MMe encapsulada em cápsulas de ACM. De forma análoga ao observado na figuta 11, as formulações í v poliméricas da presente invenção não se mostraram tóxicas, mesmo quando incubadas durante 9 horas.Some factors can strongly influence the action of a therapeutic agent on cell lines, such as incubation and irradiation time. Thus, the cytotoxicity V., and phototoxicity of the encapsulated porphyrins, e.g. 3MMe, were also evaluated at longer incubation times. Figure 11 shows a bar graph indicating the influence of incubation time on the cytotoxicity of encapsulated 3MMe porphyrin in ACM capsules. Similarly to that shown in Fig. 11, the polymeric formulations of the present invention were not toxic even when incubated for 9 hours.

Em contrapartida, a atividade fotodinâmica aumentou consideravelmente de acordo com o tempo de incubação, alcançando uma taxa de morte celular de cerca de 90% no tempo máximo investigado, como observado na figura 12(A).In contrast, photodynamic activity increased considerably according to incubation time, reaching a cell death rate of about 90% at the maximum time investigated, as observed in Figure 12 (A).

Outro fator que se mostrou determinante na determinação da viabilidade celular foi o tempo de irradiação. A Figura 12(B) mostra a Influência do tempo de irradiação na fototoxicidade dos derivados porfirínicos encapsulados, por exemplo, 3MMe, em micro e nanocápsulas de ACM. Como apresentado na figura 12 (B) , uma taxa significativa de morte celular só é observada quando as células são irradiadas por mais de 5 minutos, de forma que no maior tempo investigado (10 minutos), a viabilidade celular é inferior a 50%. Vale ressaltar que nesses experimentos, onde se analisou a influência dò *■'1 tempo de incubação e de irradiação na fototoxicidade das formulações poliméricas, utilizando-se tempos fixos de irradiação (10 minutos) e de incubação (3 horas), respectivamente.Another determining factor in determining cell viability was the irradiation time. Figure 12 (B) shows the influence of irradiation time on the phototoxicity of encapsulated porphyrin derivatives, eg 3MMe, on ACM micro and nanocapsules. As shown in Figure 12 (B), a significant cell death rate is only observed when cells are irradiated for more than 5 minutes, so that in the longest time investigated (10 minutes), cell viability is less than 50%. It is noteworthy that in these experiments, where the influence of incubation and irradiation time on the phototoxicity of polymeric formulations was analyzed using fixed irradiation (10 minutes) and incubation (3 hours) times, respectively.

No sentido de comparar a eficiência das formulações poliméricas em relação as Respectivas formulações {lipidicas, foram realizados estudos avaliando a fototoxicidade das porfirinas encapsuladas em micro e nanocápsulas, por exemplo 3MMe em ACM, em relação a mesma porfirina incorporada em lipossomas de fosfatidilcolina (PC) foram realizados, sendo os resultados apresentados na figura 11.In order to compare the efficiency of the polymeric formulations in relation to the respective formulations {lipidic}, studies evaluating the phototoxicity of the encapsulated porphyrins in micro and nanocapsules, for example 3MMe in ACM, in relation to the same porphyrin incorporated in phosphatidylcholine (PC) were performed and the results are shown in figure 11.

Pode-se observar que, assim como as partículas poliméricas, as partículas lipidicas não apresentam uma citotoxicidade significativa (experimentos A e B).It can be observed that, like polymeric particles, lipid particles do not show significant cytotoxicity (experiments A and B).

Entretanto, a ação fotodinâmica dos derivados porfirínicos nas formulações poliméricas da presente invenção foram cerca de quatro vezes maior em relação às mesmas porfirinas incorporadas nas formulações lipidicas. A Figura 12 representa histogramas de distribuição de tamanho das partículas: Figura 12(a) para cápsulas poliméricas e Figura 12(b) para cápsulas lipidicas e Figura 12 (c) espectros de fluorescência da porfirina 3MMe encapsulada nas partículas poliméricas e lipídicas. λ0ΧΟ = 421 nm.However, the photodynamic action of porphyrin derivatives in the polymeric formulations of the present invention was about four times greater than the same porphyrins incorporated in lipid formulations. Figure 12 depicts histograms of particle size distribution: Figure 12 (a) for polymeric capsules and Figure 12 (b) for lipid capsules and Figure 12 (c) fluorescence spectra of 3MMe porphyrin encapsulated in polymeric and lipid particles. λ0 = 421 nm.

Assim como as partículas poliméricas que apresentam diâmetros nanométricos (figura 12a), na faixa de 100-1000 nm, os lipossomas também foram preparados de forma que apresentassem um tamanho na escala nanométrica, como t pode ser observado na figura 12b, onde o histograma t v obtido por espalhamento dinâmico de luz indica que o diâmetro médio das partículas lipídicas é de cerca de 100 nm. Vale lembrar também que os lipossomas foram preparados de forma a apresentar a mesma concentração dos derivados porfirínicos contidos nas cápsulas poliméricas aplicadas as células (Ι,ΟχΙΟ-6 Mol.L-1). Embora as duas formulações apresentassem as mesmas concentrações, o estado de agregação das mesmas nas duas partículas são diferenciados como mostrado nos espectros de fluorescência das formulações apresentados na figura 12c. A intensidade de fluorescência dos derivados porfirínicos nas formulações poliméricas da presente invenção é muito menor quando comparada a das formulações lipídicas.Like the polymeric particles with nanometric diameters (figure 12a) in the range 100-1000 nm, the liposomes were also prepared to have a size on the nanometer scale, as t can be seen in figure 12b, where the tv histogram obtained by dynamic light scattering indicates that the average diameter of the lipid particles is about 100 nm. It is also worth remembering that the liposomes were prepared to present the same concentration of porphyrin derivatives contained in the polymeric capsules applied to the cells (Ι, ΟχΙΟ-6 Mol.L-1). Although the two formulations had the same concentrations, the state of aggregation of them in the two particles is differentiated as shown in the fluorescence spectra of the formulations shown in Figure 12c. The fluorescence intensity of porphyrin derivatives in the polymeric formulations of the present invention is much lower as compared to the lipid formulations.

Verificou-se que a maior atividade fotodinâmica da formulação polimérica se deve, principalmente, à incorporação de maior quantidade do composto fotoativo νΛ nas células . A incorporação dos derivados porfirínicos em células HeLa foi investigada através da incubação das células com os compostos fotoativos encapsulados da presente invenção em ACM. A técnica de espectroscopia de absorção é comumente utilizada nestes experimentos para avaliar a incorporação de drogãs. Entretanto, como se t v trata de um sistema particulado, a quantificação da absorção de luz da porfirina fica comprometida em virtude do espalhamento de luz gerado pelas partículas. Assim, utilizou-se a técnica de espectroscopia de fluorescência para avaliar a incorporação dos derivados porfirinicos, visto que exibem elevada fluorescência na região do vermelho. Inicialmente, registraram-se os espectros de emissão das formulações poliméricas, diluídas diferentes vezes em meio de cultura incolor, de forma a obter soluções onde a concentração dos derivados porfirínicos se encontrasse na faixa de concentração de 1,0 x 10“9 a 1,0 x 10“6 Mol. If1. Registrou-se a intensidade de emissão em 655 nm (comprimento de onda máximo de emissão) para todas as soluções, de maneira que verificaram-se excelentes correlações lineares (R = 0,9998) em função da concentração dos derivados porfirínicos, por exemplo 3MMe, como pode ser observado na figura 13, indicando que a técnica poderia ser empregada para a determinação da taxa de i ncorporação - ·"< dos derivados porfirinicos nas células. A incorporação dos derivados porfirinicos, calculadas através da equação 1, também seguem um perfil linear (R = 0,9980), aumentando significativamente com o tempo de incubação como pode ser observado na figura 14. ;í V ji V (Equação 1) De acordo com resultado apresentado anteriormente (figura 10a), a viabilidade celular diminui com o aumento do tempo de incubação, de forma que a eficiência fotodinâmica em tempos mais longos de incubação deve ser resultado da maior quantidade de fotossensibilizador incorporada.It was found that the greater photodynamic activity of the polymeric formulation is mainly due to the incorporation of larger amount of photoactive compound νΛ in the cells. Incorporation of porphyrin derivatives into HeLa cells was investigated by incubating the cells with the encapsulated photoactive compounds of the present invention in ACM. The absorption spectroscopy technique is commonly used in these experiments to evaluate drug incorporation. However, as it is a particulate system, the quantification of porphyrin light absorption is compromised due to the scattering of light generated by the particles. Thus, the fluorescence spectroscopy technique was used to evaluate the incorporation of porphyrin derivatives, as they exhibit high fluorescence in the red region. Initially, the emission spectra of the polymeric formulations, diluted different times in colorless culture medium, were recorded in order to obtain solutions where the concentration of porphyrin derivatives was in the concentration range of 1.0 x 10 “9 to 1, 0x10-6 Mol. If1. Emission intensity was recorded at 655 nm (maximum emission wavelength) for all solutions, so that excellent linear correlations (R = 0.9998) were found as a function of the concentration of porphyrin derivatives, for example 3MMe. , as can be seen in Figure 13, indicating that the technique could be employed for the determination of the incorporation rate of porphyrin derivatives in cells. The incorporation of porphyrin derivatives, calculated by equation 1, also follows a profile. (R = 0.9980), increasing significantly with the incubation time as shown in Figure 14.; V Ji V (Equation 1) According to the result presented above (Figure 10a), cell viability decreases with increased incubation time, so that photodynamic efficiency over longer incubation times should be a result of the greater amount of photosensitizer incorporated.

Na figura 14 também estão os resultados referentes a incorporação dos derivados porfirinicos, por exemplo, 3MMe, quando incorporados em lipossomas, onde observa-se uma taxa de incorporação significativamente inferior em relação a das formulações poliméricas. Tal resultado provavelmente indica que a baixa taxa de morte celular observada com a aplicação das formulações lipidicas (dados apresentados na figura 11) é resultado da baixa incorporação dos derivados porfirinicos contidos nos lipossomas de PC, ao passo que a maior fototoxicidade V das formulações de ACM deve estar relacionada à maiot'; /· taxa de incorporação nas células. 4) Aplicação das Formulações da presente invenção no Tratamento de câncer de Pele.Also shown in Figure 14 are the results for incorporation of porphyrin derivatives, for example 3MMe, when incorporated into liposomes, where a significantly lower incorporation rate than that of polymeric formulations is observed. Such a result probably indicates that the low rate of cell death observed with the application of lipid formulations (data shown in Figure 11) is a result of the low incorporation of porphyrin derivatives contained in PC liposomes, whereas the higher phototoxicity V of ACM formulations. must be related to maiot '; / · Incorporation rate in cells. 4) Application of the Formulations of the present invention in the treatment of Skin cancer.

Tendo em vista os excelentes resultados obtidos nos estudos in vitro, utilizando cultura de células HeLa, deu-se inicio aos testes utilizarido modelos animais, i v Estes estudos in vivo foram realizados utilizando melanomas desenvolvidos em camundongos (Figura 15A) , através da inoculação de células B16 na região dorsal dos animais. Após 21 dias após a inoculação, quando o volume tumoral era cerca de 1000 mm3, a formulação polimérica foi aplicada através de uma injeção intratumoral. Após um tempo de espera tipicamente de 10 a 240 minutos, deu-se inicio a irradiação, utilizando um laser vermelho (λ = 650 nm) , durante 7 minutos (irradiância de 34 mW/cm2; fluência de 14 J/cm2) . Observou-se uma redução significativa do volume tumoral, o qual foi reduzido a praticamente metade do volume inicial como pode ser observado na imagem da figura 15B.In view of the excellent results obtained from in vitro studies using HeLa cell culture, testing using animal models was initiated, iv These in vivo studies were performed using mouse-developed melanomas (Figure 15A) by inoculating cells. B16 in the dorsal region of the animals. After 21 days after inoculation, when the tumor volume was about 1000 mm3, the polymeric formulation was applied by intratumoral injection. After a typical waiting time of 10 to 240 minutes, irradiation was started using a red laser (λ = 650 nm) for 7 minutes (34 mW / cm 2 irradiance; 14 J / cm 2 creep). A significant reduction in tumor volume was observed, which was reduced to almost half of the initial volume as can be seen in the image in figure 15B.

Uma segunda aplicação do tratamento foi então realizada, adotando o mesmo procedimento descrito anteriormente. Na figura 15C tem-se a imagem do tumor no primeiro dia após a aplicação do tratamento, onde se observa a formação de uma ferida em decorrência dos danos provocados pela TFD as células tumorais. Após 24 dias (Figura 15D) , observa-se que a massa tumoral foi quase totalmente removida após uma segunda aplicação do tratamento, além do fato de que a cicatrização do local tratado foi total. A figura 14 apresenta um gráfico do volume tumoral em função do tempo, com indicações para as duas v aplicações do tratamento. Pode-se observar a redução quase que total do tumor após cerca de 30 dias do inicio do tratamento, não tendo sido observado rescidiva ou aumento do volume tumoral após uma semana do tratamento. A metodologia de aplicação da formulação desenvolvida, esta pode ser ilustrada como indicado na figura 17 . Uma região da pele (A) , na qual um tumor foi desenvolvido (B) , recebe uma pequena quantidade de uma das formulações poliméricas de nanocápsulas (D) por meio de uma injeção intratumoral (C) . As formulações contêm compostos fotoativos micro e nano-encapsulados, as quais interagem com a membrana das células tumorais (E), entregando seu conteúdo, que pode atingir diferentes regiões intracelulares. O tecido tumoral é irradiado com luz vermelha, provocando danos que ocasionam a morte das células. Após a eliminação natural dos tecidos tumorais tratados, a pele tende a se regenerar integralmente não deixando cicatrizes, além de não provocar perda de cartilagem o tecido, que levam ao aparecimento de s'·** \ depressões no local tratado.A second treatment application was then performed, following the same procedure described above. Figure 15C shows the tumor image on the first day after treatment application, where a wound formation is observed as a result of the damage caused by TFD to the tumor cells. After 24 days (Figure 15D), it is observed that the tumor mass was almost completely removed after a second treatment application, in addition to the fact that the healing of the treated site was complete. Figure 14 is a graph of tumor volume versus time, with indications for both treatment applications. Almost total reduction of the tumor can be observed after about 30 days of initiation of treatment, with no resurgence or increase in tumor volume after one week of treatment. The application methodology of the developed formulation can be illustrated as shown in figure 17. A region of the skin (A) in which a tumor has been developed (B) receives a small amount of one of the nanocapsule polymeric formulations (D) via an intratumoral injection (C). The formulations contain micro and nano-encapsulated photoactive compounds, which interact with the tumor cell membrane (E), delivering their contents, which can reach different intracellular regions. Tumor tissue is irradiated with red light, causing damage that causes cell death. After the natural elimination of the treated tumor tissues, the skin tends to fully regenerate leaving no scars, and does not cause loss of cartilage tissue, which lead to the appearance of depressions in the treated site.

Com relação à proposta de uma metodologia de aplicação da formulação desenvolvida pela presente invenção, esta pode ser ilustrada como indicado na figura 19. Uma região da pele (A), na qual um tumor foi desenvolvido (B) , recebe uma pequena quantidade de uma t vdas formulações poliméricas de micro e nanocápsulas (D) por meio de uma injeção intratumoral (C). As formulações contém compostos fotoativos micro e nano-encapsulados, as quais interagem com a membrana das células tumorais (E) , entregando seu conteúdo, que pode atingir diferentes regiões intracelulares. 0 tecido tumoral é irradiada com luz vermelha provocando danos que ocasionam a morte das células. Após a eliminação natural dos tecidos tumorais tratados, a pele tende a se regenerar integralmente não deixando cicatrizes, além de não provocar perda de cartilagem e tecido, que levam ao aparecimento de depressões no local tratado.With respect to the proposed formulation application methodology developed by the present invention, this can be illustrated as shown in Figure 19. A skin region (A) in which a tumor has been developed (B) receives a small amount of a All micro and nanocapsule polymeric formulations (D) are injected intratumorally (C). The formulations contain micro and nano-encapsulated photoactive compounds, which interact with the tumor cell membrane (E), delivering their contents, which can reach different intracellular regions. Tumor tissue is irradiated with red light causing damage that causes cell death. After the natural elimination of the treated tumor tissues, the skin tends to fully regenerate leaving no scars, and does not cause loss of cartilage and tissue, which lead to the appearance of depressions in the treated site.

Como pode ser observado o uso de compostos meso- metilpiridinio(triaril)porfirinas e correspondentes clorinas como compostos fotoativos, tem a vantagem de poderem ser obtidas com alta pureza, em grandes quantidades e a custos menores que os dos compostos encontrados no estado da técnica. Outras substâncias fotoativas com propriedades fotoquimicas e de interação-' adequadas podem ser encapsuladas usando as cápsulas poliméricas da presente invenção, gerando produtos com propriedades similares.As can be seen the use of porphyrin mesomethylpyridinium (triaryl) compounds and corresponding chlorines as photoactive compounds has the advantage that they can be obtained with high purity, in large quantities and at lower costs than those found in the prior art. Other photoactive substances with suitable photochemical and interacting properties may be encapsulated using the polymeric capsules of the present invention, generating products with similar properties.

As formulações da presente invenção são usadas na forma de suspensão de nanocápsulas poliméricas, preparadas utilizando polimèros, componentes e t v substâncias naturais biocompativeis. O método de aplicação associada às formulações da presente invenção constitui um aspecto totalmente inovador, visto que, os demais métodos de tratamento usam injeção intravenosa, isto é, aguardam a circulação pelo corpo e concentração natural ou induzida nos tumores, e posterior irradiação. Desta maneira estes métodos aumentam as possibilidades de aparecimento de efeitos colaterais como fotossensibilidade e toxicidade aguda, além de aumentar o volume injetado e o custo de produção. No caso da presente invenção, as formulações são injetadas localmente, e as propriedades foram controladas, de modo que não haja migração ou difusão significativas, de modo que o material ativo fique concentrado nas proximidades do local da injeção intradérmica intratumoral.The formulations of the present invention are used in the suspension form of polymeric nanocapsules prepared using polymers, components and biocompatible natural substances. The method of application associated with the formulations of the present invention is a totally novel aspect, since the other treatment methods use intravenous injection, that is, they await circulation by the body and natural or induced concentration in the tumors, and subsequent irradiation. Thus, these methods increase the chances of side effects such as photosensitivity and acute toxicity, as well as increase the injected volume and the cost of production. In the case of the present invention, the formulations are injected locally, and the properties have been controlled so that there is no significant migration or diffusion so that the active material is concentrated near the intratumoral intradermal injection site.

As formulações poliméricas da presente invenção têm maior estabilidade que as formulações lipossomais.The polymeric formulations of the present invention have greater stability than liposomal formulations.

Assim, embora tenha sido mostrada apenas uma", modalidade da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações na forma das formulações poliméricas para tratamento de tumores por terapia fotodinâmica podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção. 1 > v É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção.Thus, although only one embodiment of the present invention has been shown, it will be appreciated that various omissions, substitutions and changes in the shape of polymeric photodynamic therapy tumor formulations may be made by one of ordinary skill in the art without departing from the art. It is expressly provided that all combinations of elements that perform the same function in substantially the same manner to achieve the same results are within the scope of the invention.

Substituições de elementos de uma modalidade descrita para outro são também totalmente pretendidos e contemplado.Substitutions of elements from one described embodiment to another are also fully intended and contemplated.

Também é preciso entender que os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas. φ\ λ cud:One must also understand that the drawings are not necessarily to scale, but that they are only of a conceptual nature. The intent is therefore to be limited as indicated by the scope of the appended claims. ud \ λ cud:

Claims

1. Polymeric formulations for photodynamic therapy treatment of tumors characterized by the fact that they comprise: a) one of the compounds belonging to the group of photoactive monathionic porphyrinic derivatives: chlorine R = Ph, p-tolyl, substituted alkyl phenyl M = 2H +, Zn2 +, Mg2 + b) micro and nanocapsules of biocompatible polymers; and c) pharmaceutically acceptable carrier, preferably saline or phosphate buffer.

Polymeric formulations according to claim 1, characterized in that the photoactive monathionic porphyrin derivatives are preferably meso-3-monopyridyl (triphenyl) porphyrin (3-MPyTPP) or meso-4-monopyridyl ( triphenyl) porphyrin (4-MPyTPP).

Polymeric formulations according to claim 1, characterized in that they are in the form of emulsions. > v x (

Polymeric formulations according to claim 1, characterized in that the biocompatible / biodegradable polymers are selected from the group comprised of: lactic / polylactic acid; polyethylene glycol; xanthan gum; arabic gum; hydroxyethylcellulose; atelocolagen and alginate.

Polymeric formulations according to claim 4, characterized in that the biocompatible polymer is preferably atelocollagen.

Polymeric formulations according to claim 1, characterized in that the polymeric capsules consist of a polymeric shell arranged around an oil core, the photoactive molecule being dissolved therein and / or adsorbed to the polymeric wall.

Polymeric formulations according to claim 6, characterized in that the encapsulated photoactive compounds are selected from the group comprising particularly porphyrins, chlorines. , benzoporphyrins and phthalocyanines, as well as other lipophilic molecules with proven photodynamic efficiency.

Polymeric formulations according to claim 1, characterized in that the biocompatible polymer micro and nanocapsules comprise: a core consisting of natural and biocompatible oils; and an oily core consisting of biocompatible adjuvants.

Polymeric formulations according to claim 6, characterized in that said natural and biocompatible oils are selected from the group comprising: canola oil, grape seed oil, almond oil and oleic acid.

Polymeric formulations according to claim 1, characterized in that the polymeric micro and nanocapsules have a nanometric diameter in the range 100 to 1000 nm.

Polymeric formulations according to claim 6, characterized in that said biocompatible adjuvants are selected from the group comprising: tween 20, tween 80, Triton, propylene glycol, isopropyl myristate; octyl palmitate.

Polymeric formulations according to claim 6, characterized in that the oil core also contains porphyrin-derived photoactive molecules as well as other suitable dissolved and / or pu dyes adsorbed on the polymeric wall. i>

Use of the polymeric formulations as defined by claims 1 to 9 characterized in that they are for the preparation of medicaments for photodynamic therapy treatment of tumors.

Use according to claim 13, characterized in that the injection is applied locally to the area to be treated.

Use according to claim 13, characterized in that it is for the treatment of other skin diseases, preferably psoriasis, vitiligo and leishmaniasis, in addition to aesthetic applications.