BRPI0908097B1 - Peptídeo, formulação farmacêutica, e, uso de um composto - Google Patents

Abstract

USO DE PELO MENOS UM COMPOSTO, PEPTÍDEO, E, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção diz respeito ao uso de pelo menos um composto compreendendo, a sequência de aminoácidos: (X) axlx2x3PVx4x5x6(x7) (Formula I), em que X; é qualquer resíduo de aminoácido, X2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em ácido aspártico (D) ácido glutâmico (E), X; é qualquer resíduo de aminoácido, X, é qualquer resíduo de aminoácido, X4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em prolina (P) é alanina (A), Xs 6 um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consista em ácido aspártico (D) acido glutâmico (E), X; é qualquer resíduo de aminoácido, n e, independentemente,sio 0 ou um número inteiro maior que 0, é em que a sequência de aminoácidos de acordo com a formula I não é idêntica, ou não compreende, o fragmento de polipeptídeo de 8-mer de alfa sinucleina com a sequência de aminoácidos DMPVDPDN, 0 dito composto com uma capacidade de ligação a um anticorpo que e especifico para um epítopo de alfa-sinucleina que compreende a sequência de aminoácidos DMPVDPDN para produzir um medicamento para prevenir e/ou tratar sinucleinopatias.

Description

[0001] A presente invenção diz respeito a um medicamento a ser usado para prevenir e/ou tratar sinucleinopatias.

[0002] Sinucleinopatias são um grupo diverso de distúrbios neurodegenerativos que compartilham uma característica patológica comum: em exames neuropatológicos, lesões características podem ser detectadas contendo agregados anormais de proteína alfa-sinucleína (alfa-sin) em populações selecionadas de neurônios e células da glia. Alfa-sin (inicialmente identificada como PARK1 e PARK4) é uma proteína com 140 aminoácidos amplamente expressa no neocórtex, hipocampo, giro dentado, bulbo olfatório, estriado, tálamo e cerebelo. Alfa-sin também é amplamente expressa em células hematopoiéticas, incluindo células B, T e NK, bem como monócitos e plaquetas. O papel exato nestas células não é conhecido, mas foi implicado na diferenciação de megacariócitos (precursores de plaqueta).

[0003] As sinucleinopatias mais comuns incluem, mas sem limitação, demência com corpos de Lewy (LBDs) do tipo doença de Parkinson (PD), doença de Parkinson com demência (PDD) e demência com corpos de Lewy (DLB), bem como atrofia de múltiplos sistemas (MSA) ou neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo I (NBIA Tipo I). As opções de tratamento atuais para estas doenças incluem medicações sintomáticas tais como L-dopa, medicamentos anticolinérgicos, bem como inibidores de monoamina oxidase. Entretanto, todas as oportunidades de tratamento apresentadas atualmente levam apenas ao alívio sintomático, mas não induzem um efeito modificador da doença de longa duração em pacientes.

[0004] A demência com corpos de Lewy (LBD) são distúrbios neurodegenerativos progressivos caracterizados por tremor, rigidez, bradicinesia e pela perda de neurônios dopaminérgicos no cérebro. No caso de DLB e PDD os sinais também incluem déficit cognitivo. Até 2% da população abaixo de 60 anos de idade nos países do ocidente desenvolvem os sinais típicos de PD/LBD. Apenas atualmente o tratamento sintomático está disponível. Infelizmente, esta terapia fornece apenas alívio temporário dos sintomas precoces e não impede a progressão da doença.

[0005] A patogênese de PD/LBD não é ainda completamente entendida, mas parece que a susceptibilidade genética e fatores ambientais estão envolvidos no desenvolvimento da doença. Apesar de todos os avanços genéticos, PD/LBD é principalmente um distúrbio esporádico sem nenhuma causa conhecida (também denominado PD/LBD idiopático). Pacientes que sofrem desta doença desenvolvem inclusões intracelulares ubiquitinadas características denominadas corpos de Lewy (LBs) nas áreas corticais e subcorticais do cérebro. Especialmente regiões com alto teor de neurônios dopaminérgicos ou projeções neuronais mostram esta característica patológica típica.

[0006] Recentemente, diversos estudos podem mostrar que a proteína alfa-sin sináptica desempenha um papel central na patogênese de LBD. Na LBD, alfa-sin acumula-se nos LBs em todas as áreas cerebrais afetadas. Adicionalmente, pode-se demonstrar que mutações pontuais únicas, bem como duplicações ou multiplicações no gene alfa-sin, são associadas a formas familiares raras de parquinsonismo. De maneira importante, com base nos resultados de estudos de superexpressão em camundongos transgênicos (tg), bem como em Drosophila melanogaster, entende-se como o papel chave na patogênese de PD/LBD nestes modelos animais imitar diversas características de PD.

[0007] Uma outra sinucleinopatia muito importante é a atrofia de múltiplos sistemas (MS A). MS A é um distúrbio neurodegenerativo esporádico que é caracterizado por sintomas de parquinsonismo resistente a L-DOPA, ataxia cerebelar e disautonomia. Pacientes que sofrem desta perda neuronal multissistêmica que afeta vária áreas cerebrais incluindo estriado, substância negra, cerebelo, ponte, bem como as olivas inferiores e a medula espinhal. A MSA é caracterizada por inclusões citoplasmáticas gliais alfa-sin- positivas (GCI) e neuronais raras em todo o sistema nervoso central. Estas inclusões estão associadas com degeneração estriatonigral, atrofia olivopontocerebelar, e o envolvimento de núcleos autonômicos em medula e medula espinhal. Sabe-se e enfatiza-se que a importância de GCIs para a patogênese de MSA é em geral por análise recente de modelos de camundongos transgênicos que analisam o efeito de superexpressão de alfa- sin na oligodendroglia. Em camundongos tg que superexpressam alfa-sin humana tanto agregados do tipo GCI quanto marcadores bioquímicos de MSA foram observados.

[0008] Embora os mecanismos exatos pelos quais o acúmulo de alfa- sin leva às características típicas de neurodegeneração em sinucleopatias e os sintomas característicos de sinucleopatias não sejam completamente entendidos, estudos recentes implicam que a formação e acúmulo anormal de oligômeros de alfa-sin estão envolvidos nos processos degenerativos que fundamentam a sinucleinopatia.

[0009] Acredita-se atualmente que tal formação de oligômero, por exemplo, nos terminais sinápticos e axônios desempenham um papel importante para o desenvolvimento de PD/LBD. Consequentemente, a redução de deposição e oligomerização de alfa-sin podem ser benéficas no tratamento de sinucleopatias, especialmente de LBD/PD e MAS idiopáticas e podem apresentar a primeira estratégia para o tratamento destas doenças neurodegenerativas além do mero alívio de sintomas que resultam das estratégias de tratamento atuais como a aplicação de L-DOPA.

[00010] Em Iwatsubo T. (Neuropathology 27 (5) (2007): 474-478) a correlação de deposições de alfa-sinucleína, bem como sua foforilação, com uma patogênese de alfa-sinucleopatias é examinada. O autor desta publicação observou que serina 129 de alfa-sinucleína depositada em lesões de sinucleopatia é extensivamente fosforilada.

[00011] U.S. 2007/213253 diz respeito a alfa-sinucleína humana mutante, bem como peptídeos derivados desta, que pode ser usada para inibir a agregação da alfa-sinucleína humana tipo selvagem.

[00012] Em WO 2004/041067, meios e métodos para prevenir ou tratar doenças associadas com agregação alfa-sinucleína que são revelados compreendem o uso de fragmentos de alfa-sinucleína.

[00013] Em U.S. 2003/166558, peptídeos que são descritos podem ser usados para induzir resposta imune em depósitos de proteína.

[00014] U.S. 2005/198694 diz respeito a fragmentos de alfa-sinucleína compreendendo pelo menos 100 aminoácidos e com uma deleção de terminal C de 1 a 23 aminoácidos.

[00015] Embora a terapia experimental utilizando fatores neurotróficos e enxertia de células dopaminérgicas tenha rendido resultados promissores, abordagens alternativas projetadas para reduzir o acúmulo neuronal de alfa- sin são exigidas.

[00016] Recentemente, imunoterapia ativa e passiva tem se tomado de maior interesse como uma nova estratégia de tratamento potencial para doenças neurodegenerativas como doença de Alzheimer (AD), doença de Prion, bem como coréia de Huntington e esclerose lateral amilóide (ALS). Por exemplo, estudos recentes em modelos de camundongo tg de AD mostraram que anticorpos contra beta-amilóide 1-42 (Aβ) promovem a remoção de amilóide do cérebro, resultando em melhor desempenho cognitivo. De maneira importante, moléculas Aβ estão principalmente localizadas extracelularmente e, assim, estão constituindo epítopos acessíveis ao sistema imune. Ao contrário de tais alvos “clássicos” para imunoterapia, experimentos foram realizados para avaliar o potencial da imunoterapia em reduzir acúmulo de moléculas patogênicas intracelulares. As abordagens de vacinação que alvejam a proteína prion e huntington mostraram ser efetivas em neurônios de camundongos tg na redução do acúmulo de ambas as moléculas que, como alfa-sin, se acumulam intracelularmente. Além do mais, experimentos recentes também descrevem terapia anti-Tau e anti-SODl como estratégias de tratamento inédito contra agregados protéicos patogênicos intracelulares em AD e ALS respectivamente. Assim, existe acúmulo de evidência convincente que agregados intracelulares em células cerebrais têm que ser alvejados por imunoterapia. De fato, recentemente um mostrou-se potencial similar para o tratamento de sinucleopatias. Camundongos tg que superexpressam alfa-sin humana foram vacinados com proteína alfa-sin humana. Em camundongos que produziram anticorpos de alta afinidade relativa mediante vacinação houve um menor acúmulo de alfa-sin agregada em corpos celulares neuronais e sinapses, que estavam associados com menor neurodegeneração. Além do mais, anticorpos produzidos por animais imunizados também detectaram formas agregadas anormais de alfa-sin associadas com a membrana neuronal e promoveram a degradação destes agregados, provavelmente por meio de vias lisossomais. Efeitos similares foram observados usando imunoterapia passiva com um anticorpo alfa-sin-específico aplicado exogenamente. Estes resultados sugerem que a vacinação é efetiva em reduzir acúmulo neuronal de agregados de alfa-sin e que o desenvolvimento adicional desta abordagem pode produzir efeitos benéficos no tratamento de LBD e sinucleinopatias.

[00017] É um objetivo da presente invenção fornecer um medicamento para prevenir e tratar sinucleinopatias a base de uma vacina.

[00018] Portanto, a presente invenção diz respeito ao uso de pelo menos um composto compreendendo a sequência de aminoácidos(Xx)nX2X3PVX4X5X6(X7)H1 (Fórmula 1),em queXi é qualquer resíduo de aminoácido,X2 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E), X3 é qualquer resíduo de aminoácido, X4 é qualquer resíduo de aminoácido, X5 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em prolina (P) e alanina (A),Xe é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E),X7 é qualquer resíduo de aminoácido,nem, independentemente, são 0 ou um número inteiro maior que 0,e em que a sequência de aminoácidos de acordo com a fórmula I não é idêntica, ou não compreende, o fragmento de polipeptídeo de 8-mer de alfa-sinucleína com a sequência de aminoácidos DM-PVDPDN,o dito composto com uma capacidade de ligação a um anticorpo que é específico para um epítopo de alfa-sinucleína que compreende a sequência de aminoácidos DMPVDPDN para produzir um medicamento para prevenir e/ou tratar sinucleinopatia.

[00019] Os compostos de acordo com a presente invenção são capazes de induzir a formação in vivo de anticorpos direcionados (que se ligam) à alfa-sinucleína, em particular ao epítopo de alfa-sinucleína que compreende a sequência de aminoácidos DMPVDPDN (incluindo também fragmentos de alfa-sinucleína compreendendo a dita sequência de aminoácidos). Anticorpos direcionados (que se ligam) ao dito epítopo, entretanto, não mostram nenhuma ou apenas uma reatividade imune significativamente menor a beta- sinucleína do que a alfa-sinucleína. Ao contrário deste, anticorpos induzidos por imunização com o epítopo alfa-sinucleína original compreendendo DMPVDPDN que se liga surpreendentemente tanto à alfa-sinucleína quanto à beta-sinucleína. Portanto, diferente da alfa-sinucleína original ou fragmento(s) desta, os compostos de acordo com a presente invenção fornecem uma especificidade com relação ao agente relacionado à doença e evitam reatividade cruzada com doença não relacionada à beta-sinucleína. Isto sugere efetivamente superioridade significativa com relação a eficiência e segurança, a última, em particular, em decorrência das características neuroprotetoras que foram descritas para beta-sinucleína. Hashimoto M. et al., J Biol Chem. 2004 May 28;279(22) :23622-9. Hashimoto M, Neuron. 2001 Oct 25; 32 (2): 213- 23.

[00020] Os anticorpos alfa-sinucleína específicos induzidos pela administração dos compostos da presente invenção podem não apenas se ligar a formas monoméricas de alfa-sinucleína, mas também a formas multiméricas. Isto permite reduzir a quantidade de oligômeros de alfa- sinucleína no corpo de um indivíduo a ser tratado. A redução de alfa- sinucleína é particularmente benéfica no tratamento de sinucleopatias.

[00021] Considera-se que a sequência de aminoácidos (Xi) nX2XsPVX4XsX6 (X7)m é um mimotopo do epítopo de alfa-sinucleína que compreende a sequência de aminoácidos DMPVDPDN. De acordo com a presente invenção, a palavra "mimotopo" refere-se a uma molécula que tem uma conformação que apresenta uma topologia equivalente ao epítopo do qual ela é semelhante. O mimotopo liga-se à mesma região de ligação de antígeno de um anticorpo que se liga à imunoespecificidade em um antígeno desejado. O mimotopo produzirá uma resposta imunológica em um hospedeiro que é reativo ao antígeno ao qual ele é semelhante. O mimotopo também pode agir como um concorrente para o epítopo do qual é semelhante a ensaios de inibição in vitro (por exemplo, ensaios de inibição de ELISA) que envolvem o epítopo e uma ligação de anticorpo ao dito epítopo. Entretanto, um mimotopo da presente invenção pode não necessariamente prevenir ou competir com a ligação do epítopo do qual ele é semelhante em um ensaio de inibição in vitro, embora seja capaz de induzir uma resposta imune específica quando administrado a um mamífero.

[00022] Da maneira aqui usada, a palavra "epítopo" refere-se a uma região imunogênica de um antígeno que é reconhecida por uma molécula de anticorpo particular. Em geral, um antígeno possuirá um ou mais epítopos, cada um capaz de se ligar a um anticorpo que reconhece o epítopo particular.

[00023] Os mimotopos da presente invenção podem ser sinteticamente produzidos por métodos de síntese química que são bem conhecidos na técnica, tanto como um peptídeo isolado quanto como uma parte de um outro peptídeo ou polipeptídeo. Altemativamente, o mimotopo de peptídeo pode ser produzido em um microrganismo que produz o mimotopo de peptídeo que é então isolado e, se desejado, purificado adicionalmente. O mimotopo de peptídeo pode ser produzido em microrganismos tais como bactérias, levedura ou fungo, em células de eucarioto tal como uma célula de mamífero ou uma célula de inseto, ou em um vetor de vírus recombinante tais como adenovirus, poxvirus, herpesvirus, vírus da floresta de Semliki, baculovírus, bacteriófago, vírus sindbis ou vírus sendai. Bactérias adequadas para produzir o mimotopo de peptídeo incluem E.coli, B.subtilis ou qualquer outra bactéria que é capaz de expressar peptídeos tais como o mimotopo de peptídeo. Tipos de levedura adequados para expressar o mimotopo de peptídeo incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris ou qualquer outra levedura capaz de expressar peptídeos. Os métodos correspondentes são bem conhecidos na técnica. Igualmente, métodos para isolar e purificar peptídeos recombinantemente produzidos são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, etc.

[00024] Para facilitar o isolamento do mimotopo de peptídeo, um polipeptídeo de fusão pode ser preparado, no qual o mimotopo de peptídeo é translacionalmente fundido (covalentemente ligado) a um polipeptídeo heterólogo que capacita o isolamento por cromatografia de afinidade. Os polipeptídeos heterólogos típicos são His-Tag (por exemplo Hisβ; 6 resíduos de histidina), GST-Tag (Glutationa-S-transferase) etc. O polipeptídeo de fusão facilita não apenas a purificação dos mimotopos, mas também podem prevenir o polipeptídeo de mimotopo de ser degradado durante a purificação. Se for desejado remover o polipeptídeo heterólogo após a purificação, o polipeptídeo de fusão pode compreender um sítio de clivagem na junção entre o mimotopo de peptídeo e o polipeptídeo heterólogo. O sítio de clivagem consiste em uma sequência de aminoácidos que é clivada com uma enzima específica para a sequência de aminoácidos no sítio (pθr exemplo, proteases).

[00025] Os mimotopos da presente invenção também podem ser modificados nos terminais N e/ou C ou próximos a eles, de maneira tal que nas ditas posições um resíduo de cisteína é ligado a estes. Em uma modalidade preferida, os resíduos de cisteína posicionados terminalmente (localizados nos terminais N e C do peptídeo) são usados para ciciar os peptídeos através de uma ligação de dissulfeto.

[00026] Os mimotopos da presente invenção também podem ser usados em vários ensaios e estojos, em particular em ensaios e estojos imunológicos. Portanto, é particularmente preferível que o mimotopo possa fazer parte de um outro peptídeo ou polipeptídeo, particularmente uma enzima que é usada como um repórter em ensaios imunológicos. Tais enzimas repórteres incluem, por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase do rábano silvestre.

[00027] Os mimotopos de alfa-sinucleína de acordo com a presente invenção são preferivelmente polipeptídeos antigênicos que em sua sequência de aminoácidos variam a partir da sequência de aminoácidos de alfa- sinucleína ou de fragmentos de alfa-sinucleína. Com relação a isto, os mimotopos inventivos podem não apenas compreender substituições de aminoácidos de um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência natural, mas também de um ou mais aminoácidos não naturais (isto é, não dos 20 aminoácidos "clássicos") ou podem ser completamente montados de tais aminoácidos não naturais. Além do mais, os antígenos inventivos que induzem anticorpos anti-alfa-sinucleína podem ser montados de aminoácidos D ou L ou de combinações de aminoácidos DL e, opcionalmente, podem ser mudados por modificações adicionais, fechamentos de anéis ou derivações. Os antígenos que induzem anticorpos anti-alfa-sinucleína adequados podem ser fornecidos a partir de bibliotecas de polipeptídeos comercialmente disponíveis. Preferivelmente, estes peptídeos têm pelo menos 7 aminoácidos, e os comprimentos preferíveis podem ter de até 16, preferivelmente até 14 ou 20 resíduos de aminoácidos (por exemplo, 7 ou 8 a 20, 7 ou 8 a 16 etc.). De acordo com a invenção, entretanto, também peptídeos maiores podem ser muito bem empregados como antígenos que induzem anticorpo anti-alfa- sinucleína. Além do mais, os mimotopos da presente invenção também podem ser parte de um polipeptídeo e, consequentemente, compreender em seus terminais N e/ou C pelo menos um resíduo adicional de aminoácido.

[00028] Para preparar mimotopos de alfa-sinucleína (isto é, antígenos que induzem anticorpo anti-alfa-sinucleína), certamente também bibliotecas de fago, as bibliotecas de peptídeo são adequadas, por exemplo, produzidas por meio de química combinatória ou obtidas por meio de técnicas de seleção de alto rendimento para a maioria das estruturas de variação (Display: A Laboratory Manual por Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec; 50 ( 6): 837- 54).

[00029] Além do mais, de acordo com a invenção, também antígenos que induzem anticorpos anti-alfa-sinucleína a base de ácidos nucléicos ("aptâmeros") podem ser empregados, e este, muito, pode ser observado com a\s principais bibliotecas de variação (oligonucleotídeo) (por exemplo, com 2- 180 resíduos de ácido nucléico) (por exemplo, Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Ace. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, etc.). Em antígenos que induzem anticorpo anti-alfa-sinucleína a base de ácidos nucléicos, o cerne de ácido nucléico pode ser fornecido, por exemplo, pelos compostos de fósforo-diéster naturais, ou também por fosforotioatos ou combinações ou variações químicas (por exemplo, as PNA), em que as bases, de acordo com a invenção, principalmente U, T, A, C, G, H e mC podem ser empregadas. Os resíduos 2' dos nucleotídeos que podem ser usados de acordo com a presente invenção são preferivelmente H, OH, F, Cl, NH2, O-metila, O- etila, O-propila ou O-butila, em que os ácidos nucléicos também podem ser modificados de maneira diferente, isto é, por exemplo, com grupos protetores, já que são comumente empregados na síntese de oligonucleotídeo. Assim, antígenos a base de aptâmero que induzem anticorpo anti-alfa-sinucleína são também antígenos preferidos que induzem anticorpo anti-alfa-sinucleína no escopo da presente invenção.

[00030] De acordo com a presente invenção a palavra "sinucleinopatia" inclui tosos os distúrbios neurodegenerativos caracterizados por agregações patológicas de sinucleína. Vários distúrbios neurodegenerativos incluindo doença de Parkinson (PD), doença de corpos de Lewy (LBD), doença de corpos de Lewy difusa (DLBD), demência com corpos de Lewy (DLB), parquinsonismo com demência (PDD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo I (NBIA Tipo I) são coletivamente agrupados como sinucleinopatias.

[00031] O composto de acordo com a presente invenção pode ser empregado não apenas para tratar sinucleinopatias, mas também para prevenir as ditas doenças em indivíduos que estão em risco de desenvolver uma sinucleinopatia (por exemplo, predisposto, por exemplo, geneticamente predisposto, para desenvolver uma sinucleinopatia).

[00032] As abreviações para os resíduos de aminoácidos revelados na presente invenção seguem as recomendações IUPAC:

[00033] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção Xi e/ou X7 é um resíduo de aminoácido acetilado ou cisteína (C).

[00034] De acordo com uma outra modalidade preferida da presente invenção, X2 é ácido glutamina, por meio do qual o dito ácido glutamina também pode ser derivado de ácido piroglutâmico. Se X2 compreender um ácido piroglutâmico, Xi é 0.

[00035] De acordo com uma modalidade adicional preferida da presente invenção, X3 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em glutamina (Q), serina (S), treonina (T), arginina (R), asparagina (N), valina (V), histidina (H), metionina (M), tirosina (Y), alanina (A) e leucina (L).

[00036] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, X4 é um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em glutamina (Q), triptofano (W), treonina (T), arginina (R), ácido aspártico (D), isoleucina (I), valina (V), histidina (H), prolina (P), tirosina (Y), alanina (A), serina (S) e leucina (L).

[00037] O composto da presente invenção também pode ser parte de um polipeptídeo compreendendo 7 a 16 resíduos de aminoácidos. Consequentemente, nem podem ser independentemente um número inteiro selecionado do grupo de 1, 2, 3,4, 5, 6,7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 e 25.

[00038] O composto de acordo com a presente invenção pode consistir na sequência de aminoácidos (Xi)nX2X3PVX4X5X6(X7)m, em que nem são independentemente 0 ou 1 ou são parte de um polipeptídeo que compreende pelo menos 7 resíduos de aminoácidos, preferivelmente pelo menos 10 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 15 resíduos de aminoácidos, e/ou um máximo de 50 resíduos de aminoácidos, preferivelmente um máximo de 30 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente de 16 resíduos de aminoácidos.

[00039] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção o composto compreende um peptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em (C)DQPVLPD, (C)DMPVLPD, (C)DSPVLPD, (C)DSPVWAE, (C)DTPVLAE, (C)DQPVLPDN, (C)DMPVLPDN, (C)DSPVLPDN, (C)DQPVTAEN, (C)DSPVWAEN, (C)DTPVLAEN, (C)HDRPVTPD, (C)DRPVTPD, (C)DVPVLPD, (C)DTPVYPD, (C)DTPVIPD, (C)HDRPVTPDN, (C)DRPVTPDN, (C)DNPVHPEN, (C)DVPVLPDN, (C)DTPVYPDN, (C)DTPVIPDN, (C) DQPVLPDG, (C) DMPVLPDG, (C)DSPVLPDG, (C)DSPVWAEG, (C) DRPVAPEG, (C) DHPVHPDS, (C)DMPVSPDR, (C)DSPVPPDD, (C)DQPVYPDI, (C)DRPVYPDI, (C) DHPVTPDR, (C)EYPVYPES, (C)DTPVLPDS, (C)DMPVTPDT, (C) DAPVTPDT, (C)DSPVVPDN, (C)DLPVTPDR, (C)DSPVHPDT, (C)DAPVRPDS, (C)DMPVWPDG, (C) DAPVYPDG, (C) DRPVQPDR, (C)YDRPVQPDR, (C)DMPVDPEN, (C) DM- PVDADN, DQPVLPD(C), DMPVLPD(C), (C)EMPVDPDN e (C)DNPVHPE.

[00040] Surpreendentemente, constata-se que os compostos de acordo com a presente invenção, que compreendem ou consistem nas sequências de aminoácidos listadas anteriormente, são adequados de maneira particular para serem usados na fabricação de um medicamento a ser usado para tratar ou prevenir sinucleinopatias. Estes peptídeos (mimotopos) são capazes de induzir a formação in vivo de anticorpos direcionados ao epítopo original de alfa- sinucleína humana que compreende a sequência de aminoácidos DMPVDPDN e a própria proteína alfa-sinucleína humana. Os ditos peptídeos (mimotopos), entretanto, não são capazes de induzir ou são apenas capazes de induzir uma reatividade imune muito limitada contra a proteína beta- sinucleína humana. Surpreendentemente, anticorpos induzidos por alfa- sinucleína original (que compreendem a sequência de aminoácidos DMPVDPDN) se ligam a alfa-sinucleína, bem como especificamente a beta- sinucleína. Assim, os ditos peptídeos (mimotopos) induzem uma resposta imune mais refinada (anticorpos) como o peptídeo original. As resposta imunes induzidas por mimotopo, entretanto, não necessariamente discriminam entre alfa-sinucleína e beta-sinucleína. Os anticorpos induzidos por peptídeo são responsáveis pela remoção de alfa-sinucleína (que está envolvida na formação de agregados de alfa-sinucleína, corpos de Lewy) e/ou pela dissolução de agregados de alfa-sinucleína (corpos de Lewy) em um indivíduo.

[00041] Os peptídeos listados anteriormente podem compreender ou não nos terminais N o resíduo de cisteína e, certamente, o resíduo C também pode ser adicionado aos terminais C igualmente. Portanto, a presente invenção inclui os peptídeos a seguir sem o resíduo de cisteína em seus terminais N ou terminais C: DQPVLPD, DMPVLPD, DSPVLPD, DSPVWAE, DTPVLAE, DQPVLPDN, DMPVLPDN, DSPVLPDN, DQPVTAEN, DSPVWAEN, DTPVLAEN, HDRPVTPD, DRPVTPD, DVPVLPD, DTPVYPD, DTPVI- PD, HDRPVTPDN, DRPVTPDN, DNPVHPEN, DVPVLPDN, DTPVYPDN, DTPVIPDN, DQPVLPDG, DMPVLPDG, DSPVLPDG, DSPVWAEG, DRPVAPEG, DHPVHPDS, DM- PVSPDR, DSPVPPDD, DQPVYPDI, DRPVYPDI, DHPVTPDR, EYPVYPES, DTPVLPDS, DMPVTPDT, DAPVTPDT, DSPVVPDN, DLPVTPDR, DSPVHPDT, DAPVRPDS, DMPVWPDG, DAPVYPDG, DRPVQPDR, YDRPVQPDR, DMPVDPEN, DMPVDADN, EMPVDPDN e DNPVHPE.

[00042] O composto de acordo com a presente invenção pode ser usado para a preparação de um medicamento, em particular uma vacina, que pode ser usado para tratar alfa-sinucleinopatia, por meio do qual o medicamento é particularmente adequado para tratar sinucleinopatia selecionada do grupo que consiste em doença de Parkinson (PD), doença de corpo de Lewy (LBD), doença de corpo de Lewy difusa (DLBD), demência com corpos de Lewy (DLB), parquinsonismo com demência (PDD), atrofia de múltiplos sistemas (MSA) e neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo I (NBIA Tipo I).

[00043] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o composto é acoplado a um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente KLH (hemocianina do molusco Keyhole limpet), toxóide tetânico, proteína de ligação de albumina, albumina bovina sérica, um dendrímero (MAP; Biol. Chem. 358: 581), ligantes de peptídeo (ou regiões flanqueantes), bem como as substâncias adjuvantes descritas em Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (em particular, aquelas na tabela 1 deste documento), e O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (em particular, os compostos imunopotenciais endógenos e sistemas de distribuição aqui descritos), e outros ou misturas destes. A química de conjugação (por exemplo, por meio de compostos heterobifuncionais tais como GMBS e, certamente, também outros da maneira descrita em "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson) neste contexto pode ser selecionada de reações conhecidas pelos versados na técnica. Além do mais, a composição da vacina pode ser formulada com um adjuvante, preferivelmente uma composição pouco solúvel em alumínio, em particular hidróxido de alumínio. Certamente, também podem ser usados adjuvantes do tipo fosfato de alumínio MF59, fosfato de cálcio, citocinas (por exemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), saponinas (por exemplo, QS21), derivados de MDP, oligos CpG oligos, IC31, LPS, MPL, polifosfazenos, emulsões (por exemplo, de Freund, SAF), lipossomos, virossomos, ISCOMs, co-quelatos, micropartículas PLG, partículas de poloxâmeros, partículas semelhantes a vírus, enterotoxina termossensível (LT), toxina do cólera (CT), toxinas mutantes (por exemplo, LTK63 e LTR72), micropartículas e/ou lipossomos polimerizados.

[00044] O composto da presente invenção é preferivelmente ligado ao veículo ou adjuvante por meio de um ligante, que é selecionado do grupo que consiste em NHS-poli (óxido de etileno) (PEO) (por exemplo NHS- PEO4- maleimida).

[00045] Uma vacina que compreende o presente composto (mimotopo) e o veículo farmaceuticamente aceitável pode ser administrada por qualquer modo de aplicação adequado, por exemplo, i.d., i.v., i.p., i.m., intranasalmente, oralmente, subcutaneamente, etc., e em qualquer dispositivo de distribuição adequado (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). O composto da presente invenção é preferivelmente formulado para administração intravenosa, subcutânea, intradérmica ou intramuscular (ver, por exemplo, "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).

[00046] Tipicamente, a vacina contém o composto de acordo com a invenção em um quantidade de 0,1 ng a 10 mg, preferivelmente 10 ng a 1 mg, em particular 100 ng a 100 μg ou, altemativamente, por exemplo, 100 pmol a 10 μmol, preferivelmente 10 pmol a 1 μmol, em particular, 100 pmol a 100 nmol. Tipicamente, a vacina também pode conter substâncias auxiliares, por exemplo, tampões, estabilizadores, etc.

[00047] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um peptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em (C)DQPVLPD, (C)DMPVLPD, (C)DSPVLPD, (C)DSPVWAE, (C)DTPVLAE, (C)DQPVLPDN, (C)DMPVLPDN, (C)DSPVLPDN, (C)DQPVTAEN, (C)DSPVWAEN, (C)DTPVLAEN, (C)HDRPVTPD, (C)DRPVTPD, (C)DVPVLPD, (C)DTPVYPD, (C)DTPVIPD, (C)HDRPVTPDN, (C)DRPVTPDN, (C)DNPVHPEN, (C)DVPVLPDN, (C)DTPVYPDN, (C)DTPVIPDN, (C)DQPVLPDG, (C)DMPVLPDG, (C)DSPVLPDG, (C)DSPVWAEG, (C)DRPVAPEG, (C)DHPVHPDS, (C) DMPVSPDR, (C) DSPVPPDD, (C)DQPVYPDI, (C)DRPVYPDI, (C)DHPVTPDR, (C)EYPVYPES, (C) DTPVLPDS, (C) DMPVTPDT, (C)DAPVTPDT, (C)DSPVVPDN, (C) DLPVTPDR, (C)DSPVHPDT, (C)DAPVRPDS, (C)DMPVWPDG, (C)DAPVYPDG, (C)DRPVQPDR, (C)YDRPVQPDR, (C)DMPVDPEN, (C)DMPVDADN, DQPVLPD(C), DMPVLPD(C), (C) EMPVDP- DN e (C) DNPVHPE.

[00048] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o peptídeo é acoplado a um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente KLH (hemocianina do molusco Keyhole limpet).

[00049] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a uma formulação farmacêutica, preferivelmente uma vacina, compreendendo pelo menos um peptídeo de acordo com a presente invenção e que é selecionado do grupo que consiste em (C)DQPVLPD, (C)DMPVLPD, (C)DSPVLPD, (C)DSPVWAE, (C)DTPVLAE, (C)DQPVLPDN, (C) DMPVLPDN, (C)DSPVLPDN, (C)DQPVTAEN, (C)DSPVWAEN, (C)DTPVLAEN, (C)HDRPVTPD, (C)DRPVTPD, (C)DVPVLPD, (C)DTPVYPD, (C)DTPVIPD, (C)HDRPVTPDN, (C)DRPVTPDN, (C)DNPVHPEN, (C)DVPVLPDN, (C)DTPVYPDN, (C)DTPVIPDN, (C)DQPVLPDG, (C)DMPVLPDG, (C)DSPVLPDG, (C)DSPVWAEG, (C)DRPVAPEG, (C)DHPVHPDS, (C)DMPVSPDR, (C)DSPVPPDD, (C)DQPVYPDI, (C)DRPVYPDI, (C)DHPVTPDR, (C)EYPVYPES, (C)DTPVLPDS, (C)DMPVTPDT, (C)DAPVTPDT, (C)DSPVVPDN, (C)DLPVTPDR, (C)DSPVHPDT, (C)DAPVRPDS, (C)DMPVWPDG, (C)DAPVYPDG, (C)DRPVQPDR, (C)YDRPVQPDR, (C)DMPVDPEN, (C)DM- PVDADN, DQPVLPD(C), DMPVLPD(C), (C)EMPVDPDN e (C)DNPVHPE.

[00050] A formulação farmacêutica, de acordo com a presente invenção, que pode ser formulada como uma vacina, por exemplo, para administração subcutânea, intravenosa e/ou intramuscular, pode ser usada no tratamento de qualquer tipo de sinucleinopatia.

[00051] A presente invenção é ilustrada adicionalmente nas figuras e exemplos a seguir, entretanto, sem ficar restrito a estes.

[00052] A figura 1 mostra a detecção de epítopos específicos de alfa- sinucleína por ELISA usando um monoclonal específico para alfa-sinucleína humana na posição 115-122.

[00053] Os peptídeos p4446 (alfa-sinucleína), p4449 e p4448 (epítopos humanos) são detectados pelo anticorpo. Os peptídeos controle negativos p4447 (beta-sinucleína) e p4450, p4451 (epítopos de camundongo), não são detectados. O peptídeo irrelevante pl252 não mostra ligação no ensaio de ELISA. Os dados são apresentados em uma escala linear.

[00054] A figura 2 mostra uma detecção de mimotopos por ELISA usando um monoclonal específico para alfa-sinucleína humana na posição 115-122.

[00055] Os dados para dois mimotopos (p4553, p4557) são exibidos. O peptídeo p4557 mostra ligação mais fraca do que o peptídeo original p4448. O peptídeo p4553 mostra ligação forte com o anticorpo de detecção. O peptídeo irrelevante pl253 não mostra nenhuma ligação no ensaio ELISA da maneira esperada. Ambos os mimotopos induzem títulos >1/20.000 mediante vacinação de camundongos e são considerados como aglutinantes fortes.

[00056] A figura 3 mostra a detecção de competição de mimotopos por ELISA usando um monoclonal específico para alfa-sinucleína humana na posição 115-122.

[00057] Os valores representados são medidos por ELISA usando 40μg de peptídeo no ensaio de inibição. O peptídeo irrelevante pl253 e o mimotopo p4492 não mostram competição comparados ao peptídeo original p4448. Mimotopos p4490 e p4491 mostram competição similar como o peptídeo original p4448. A competição é calculada comparando OD em ELISA em peptídeo com concentração de 40μg com o epítopo original. Todos os mimotopos são comparados a esta referência que resulta em um índice de competição. Os valores em tomo de 1 indicam alta capacidade de inibição. Os peptídeos com um índice de competição abaixo de 5 são classificados como não competidores.

[00058] A figura 4 mostra uma resposta imune contra peptídeo injetado e um peptídeo irrelevante.

[00059] A) Soros de camundongos imunizados mostram títulos elevados contra seus peptídeos injetados (epítopo original (p4448) e mimotopos (p4456, p4466 e p4467 respectivamente) após 4 vacinações. Os títulos medidos em ELISA são em tomo de 1:10.000 (OD média-máxima), os dados são apresentados em uma escala logarítmica. Como um controle positivo para o ELISA, um anticorpo monoclonal específico de alfa- sinucleína foi usado (pos CTRL).

[00060] B) os mesmos soros de camundongos imunizados não conseguem detectar um peptídeo irrelevante (pl253).Os títulos medidos em ELISA são abaixo de 1:100 (OD média-máxima), mais do que 100 vezes menor que um sinal de um anticorpo monoclonal específico para o peptídeo irrelevante (pos CTRL). Como um controle negativo, nenhum anticorpo principal é usado. Os dados são apresentados em uma escala linear.

[00061] A figura 5 mostra uma resposta imune contra sinucleínas após repetidas imunizações com mimotopo.

[00062] A) Os soros agrupados de todos os animais nos grupos respectivos mostram títulos de anticorpo contra p4448, um peptídeo localizado na parte do terminal C de alfa-sinucleína. Os dados são apresentados em uma escala logarítmica.

[00063] B) Os soros agrupados de camundongos imunizados (p4448, p4457 e p4463) mostram títulos contra alfa-sinucleína após 4 vacinações, os soros agrupados de camundongos imunizados (p4466 e p4467) não detectam alfa nem beta-sinucleína (Os títulos medidos em ELISA são bem menores que 1:100 média-máxima). Soros agrupados de camundongos imunizados com o epítopo original (p4448) detectam alfa e beta-sinucleína. Os títulos em ELISA, que são menores do que 1:100 média-máxima são indicados por um asterisco, que corresponde a valores próximos aos inferiores. A maioria dos mimotopos testados induz anticorpos que não reagem de maneira cruzada com beta-sinucleína. Os dados são apresentados em uma escala logarítmica.

[00064] A figura 6A mostra uma coloração controle positiva usando um anticorpo comercialmente disponível que detecta especificamente a-sin humana. Em 6B, o mesmo anticorpo foi usado para corar cérebro de camundongo não transgênico da mesma área que não consegue detectar nenhum tecido a-sin positivo, já que este animal não expressa a-sin humana. Em 6C, uma coloração a-sin específica similar à coloração presente em 6A é produzida por um soro induzido por mimotopo (soro induzido por p4498). Coloração a-sin positiva no hipocampo de murino é caracterizada pelos padrões de coloração manchada da maneira mostrada em 6A e 6C. As setas indicam três exemplos para tais inclusões a-sin positivas em 6A e 6C, respectivamente.

EXEMPLOS :

[00065] Um anticorpo que pode ser usado para a identificação do mimotopo, de acordo com a presente invenção, detecta a sequência de aminoácidos derivada de alfa-sinucleína humana DMPVDPDN (= epítopo original, SEQ ID No. 1) e alfa-sinucleína humana de comprimento total. Não reconhece beta-sinucleína humana. O anticorpo pode ser uma preparação de anticorpo monoclonal ou policlonal ou qualquer parte de anticorpo ou derivado deste e liga-se especificamente ao epítopo DMPVDPDN de alfa- sinucleína humana, isto é, se liga ao peptídeo e proteína de comprimento total, mas não se liga a beta- sinucleína humana.

[00066] Os mimotopos são identificados e caracterizados adicionalmente com tais anticorpos monoclonais (que detectam uma sequência nos aminoácidos 115-122 da proteína alfa-sinucleína humana) e bibliotecas de peptídeo.

Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais para detectar especificamente epítopo de alfa-sinucleína original humana C-DMPVDPDN e alfa-sinucleína humana, mas não beta-sinucleína humana.

[00067] Um anticorpo monoclonal derivado da fusão "AFFiRiS 3": Camundongos Balb/c foram imunizados com alfa-sinucleína epítopo original C-DMPVDPDN acoplado a BTG (tiroglobulina bovina) e CFA (adjuvante completo de Freund; primeira injeção), bem como IFA (adjuvante incompleto de Freund; 3 injeções impulsionadoras) como adjuvante. Hibridomas produzidos por anticorpos específicos para o peptídeo DMPVDPDN são detectadas por ELISA (placas de ELISA revestidas por peptídeo DMPVDPDN). Alfa-sinucleína humana (proteína recombinante) é usada como peptídeo controle positivo: Hibridomas que reconhecem a proteína recombinante imobilizada nas placas de ELISA são incluídos em decorrência de estarem ligados especificamente tanto ao peptídeo quanto à alfa-sinucleína de comprimento total. Beta-sinucleína humana (proteína recombinante) é usada como peptídeo controle negativo: hibridomas que reconhecem tanto proteínas recombinantes imobilizadas em placas de ELISA são excluídos em decorrência de não se distinguirem entre as duas proteínas de sinucleína diferentes.

[00068] O clone do hibridoma (AFFÍRÍS3/9 (nome interno "A509"; IgGl) foi analisado para detecção específica do epítopo DMPVDPDN alfa- sinucleína humana natural. A509 reconhece o epítopo injetado, bem como proteína alfa-sinucleína de comprimento total (proteína recombinante; obtida de rPeptide, Bogart, GA, USA) em ELISA. Entretanto, não detecta proteína beta-sinucleína (proteína recombinante, obtida da rPeptide, Bogart, GA, USA) em ELISA. Além do mais, os anticorpos A509 não detectam o peptídeo que codifica o variante de camundongo de alfa-sinucleína. Os resultados similares podem ser obtidos com clones mAB comercialmente disponíveis (isto é, alfa- sinucleína (LB509) anticorpo monoclonal com número de catálogo SIG- 39725; Covance (Princton, NJ, USA)).

Exemplo 2: Exibição de fago, ligação e inibição de ELISA in vitro

[00069] As bibliotecas de exibição de fago usadas neste exemplo foram: Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (biblioteca linear 7mer) e Ph.D. 12: New England BioLabs E8111L (biblioteca linear 12mer) A exibição de fago foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (www.neb.com).

[00070] Após 2 ou 3 ciclos subsequentes de movimento giratório, os clones de fago único foram escolhidos e os sobrenadantes de fago foram submetidos a ELISA em placas revestidas com o anticorpo que foi usado para o procedimento de movimento giratório. Os clones de fago que foram positivos neste ELISA (sinal forte para o alvo, mas nenhum sinal para controle inespecífico) foram sequenciados. A partir das sequências de DNA, as sequências de peptídeo foram deduzidas. Estes peptídeos foram sintetizados e caracterizados em ligação e inibição de ELISA. Em alguns peptídeos, aminoácidos adicionais foram anexados aos terminais C. Adicionalmente, alguns mimotopos inéditos foram criados combinando a informação da sequência de mimotopos identificados na seleção. Ambos os grupos que contêm mimotopos recentemente projetados foram usados para auxiliar a identificação de uma sequência consensual para uma vacinação de mimotopo.

1. Ensaio de ligação in vitro (ELISA)

[00071] Os peptídeos derivados da exibição de fago, bem como variantes prolongados a partir do terminal C destes foram acoplados à BSA e ligados às placas de ELISA (IμM; da maneira indicada nas respectivas figuras) e incubados subsequentemente com o anticorpo monoclonal que foi usado para o procedimento de seleção para analisar a capacidade de ligação dos peptídeos identificados.

2.Ensaio de inibição in vitro (ELISA)

[00072] Diferentes quantidades de peptídeos (concentrações que variam de 40 μg a 0,3μg (diluições seriadas), da maneira indicada nas respectivas figuras) derivados da exibição de fago foram incubados com o anticorpo monoclonal que foi usado para o procedimento de seleção. Os peptídeos que diminuem a ligação subsequente do anticorpo com o epítopo de alfa-sinucleína original humana (aminoácidos: 115-122 de proteína alfa- sinucleína humana) revestidos em placas de ELISA foram considerados como inibidores neste ensaio.

Exemplo 3: Teste in vivo de mimotopos : análise da imunogenicidade e reatividade cruzada 1. Teste in vivo de mimotopos

[00073] Peptídeos de inibição, bem como os de não inibição, foram acoplados à KLH e injetados em camundongos (camundongos C57/B16 tipo selvagem; injeção subcutânea no flanco) junto com um adjuvante apropriado (hidróxido de alumínio). Os animais foram vacinados 4-6 vezes em intervalos bissemanais e os soros foram obtidos de duas em duas semanas igualmente. Os títulos dos peptídeos injetados, bem como de um peptídeo irrelevante, foram determinados com cada soro. Os títulos contra a proteína recombinante alfa-sinucleína humana e recombinante beta-sinucleína humana foram determinados iniciando com soro 3, respectivamente. Os soros agrupados foram testados contra o epítopo de alfa-sinucleína original humana (aall5- 122). Em geral, os soros foram analisados por reação contra peptídeos acoplados à albumina bovina sérica (BSA) e proteínas de comprimento total recombinantes que foram imobilizadas em placas de ELISA. Os títulos foram determinados usando anticorpos IgG anti camundongo específicos. Para resultados detalhados, ver figuras 4 e 5.

2. Teste in situ de mimotopos

[00074] Os soros selecionados que produzem uma reatividade cruzada com a-sin também foram testados quanto a capacidade de detectar a-sin humana em seções cerebrais de camundongo. Para resultados detalhados, ver figura 6.

3. Resultados 3.1. Identificação de uma alfa-sinucleína específica mAB:

[00075] A figura 1 representa a caracterização do anticorpo monoclonal específico de alfa-sinucleína AFFÍRÍS3/9 (nome interno "A509"; IgGl) derivado da fusão AFFiRiS 3.

3.2. Seleção com alfa-sinucleína específica mAB:

[00076] 3.2.1. Exibição de biblioteca de fago Ph.D. 7 e 12

[00077] 3.2.1.1. Seleção com anticorpo monoclonal direcionado contra DMPVDPDN

[00078] 51 sequências foram identificadas selecionando bibliotecas deexibição de fago PhD 7 e PhD 12 nesta seleção: A tabela 1 sumariza os peptídeos identificados e sua capacidade de ligação da maneira comparada ao epítopo original.Tabela 1: Ligação de mimotopos de alfa-sinucleína ao anticorpo parental Legenda da tabela 1: a capacidade de ligação é codificada pelo código deligação a seguir: 1:X descreve o fator de diluição do AB parental.

3.3. Caracterização in vitro de mimotopos identificados na seleção de bibliotecas de exibição de fago com um anticorpo monoclonal direcionado contra alfa-sinucleína:

[00079] As figuras 2 e 3 mostram exemplos representativos paraensaios de ligação e inibição usados para caracterizar mimotopos in vitro. Osdados obtidos são sumarizados nas tabelas 1 e 2 respectivamente.

[00080] A partir das 51 sequências apresentadas, 29 sequências inibem a ligação do anticorpo monoclonal específico de experimentos de competição de alfa-sinucleína in vitro: 22 sequências adicionais que foram identificadas não inibem a ligação de anticorpo monoclonal em experimentos de competição in vitro, mas ainda mantêm a capacidade de ligação ao anticorpo parental:Tabela 2: Mimotopos de alfa-sinucleína identificados nesta invençãofornecem resultados positivos em ensaios de inibição

[00081] Legenda da tabela 2: a capacidade de inibição é codificada pelo código a seguir:

[00082] A inibição fraca significa que mais peptídeo é exigido em menor ligação AB do que com o epítopo original; inibição forte significa que quantidades similares de peptídeo são exigidas para mimotopo e epítopo original diminuírem a ligação AB. Os mimotopos são comparados ao peptídeo original como padrão. A OD em 40μg de peptídeo usado no ensaio é usado para calcular a capacidade de competição comparada ao peptídeo original.Tabela 3: Peptídeos e proteínas não mimotopos:

3.4. Caracterização in vivo de mimotopos identificados na seleção de bibliotecas de exibição de fago com um anticorpo monoclonal direcionada contra alfa-sinucleína:

[00083] Camundongos C57/B16 fêmeas, 5-6 camundongos por grupo, foram imunizados subcutaneamente com 30 μg de peptídeo acoplado à KLH. Os grupos controle foram administrados no conjugado p4448-KLH. Como adjuvante, sulfato de alumínio foi usado (sempre 1 mg por camundongo). Os peptídeos administrados foram todos capazes de se ligar à ligação especificamente de anticorpos monoclonais aall5-122 de alfa-sinucleína humana, embora alguns dos peptídeos não inibam a ligação do epítopo original ao seu anticorpo parental in vitro (em um ensaio de inibição in vitro). O ensaio ELISA in vitro para determinar o título do anticorpo foi realizado com soros de camundongos únicos ou soros agrupados (ver figura 5) após cada vacinação em um intervalo de duas semanas (ver figura 4 e 5, respectivamente). Os poços da placa de ELISA foram revestidos com conjugado mimotopo-BSA e um conjugado peptídeo irrelevante-BSA (controle negativo). O controle positivo foi realizado por reação do anticorpo parental com o respectivo conjugado mimotopo-BSA. A detecção foi realizada com IgG anti-camundongo. Adicionalmente, proteínas recombinantes foram imobilizadas em placas de ELISA e os soros reagidos dessa maneira.

[00084] Para todos os mimotopos testados em camundongos C57/B16, os anticorpos que reagem com o peptídeo injetado no indivíduo podem ser detectados após vacinação repetida. Adicionalmente, 2 além dos 4 mimotopos representados (ver figura 5 e tabela 1 respectivamente) desenvolveram anticorpos que reagem com alfa-sinucleína humana, mas não com beta- sinucleína humana. 2/4 não mostraram nenhuma reatividade cruzada com proteínas recombinantes. De maneira importante, o epítopo original DMPVDPDN levou a uma resposta imune que não foi distinguida entre as duas proteínas sinucleínas recombinantes.

[00085] A figura 4 e 5 mostram exemplos representativos para ensaios usados para caracterizar mimotopos in vivo. A figura 4 mostra um exemplo para caracterizações in vivo da resposta imune produzida por vacinação com mimotopo, analisando a resposta imune contra o peptídeo injetado e um peptídeo irrelevante contendo uma sequência não relacionada. O epítopo original p4448, o peptídeo controle positivo e os mimotopos p4456, p4466 e p4467, produziram respostas imunes contra o peptídeo injetados (nos próprios), mas não conseguiram induzir uma resposta imune inespecífica contra uma sequência não relacionada (p1253).

[00086] A figura 5 mostra um exemplo para caracterizações in vivo da resposta imune produzida por vacinação com mimotopo contra alfa-sinucleína e beta-sinucleína de comprimento total. Todas as vacinas testadas neste exemplo montaram uma resposta imune detectável contra o epítopo de alfa- sinucleína original 115-122. Quase todos os mimotopos e o epítopo original testados neste exemplo (exceção: p4466 e p4467) mostram também, além do mais, reatividade com alfa-sinucleína de comprimento total. Entretanto, a resposta imune induzida por epítopo original também detectou a proteína beta-sinucleína de comprimento total, perdendo assim a especificidade para alfa-sinucleína e a capacidade de distinção entre as duas proteínas. Ao contrário, nestes achados, a maioria dos soros (mas não todos) induzidos por mimotopo não conseguiram detectar beta-sinucleínam preservando assim a capacidade de discriminar entre as duas proteínas sinucleínas e que garante alta especificidade com anti alfa-sinucleína de um programa de imunização ativa para obter eficiência e um perfil excelente de segurança.

3.5. Teste in situ de mimotopos

[00087] Mimotopos que produzem uma resposta imune específica de a- sin também podem detectar inclusões imunorreativas a-sin em tecido cerebral de camundongo transgênico. Da maneira representada na figura 6, os soros derivados de animais vacinados com mimotopo são capazes de corar estruturas positivas a-sin presentes nas seções cerebrais de camundongo de animais que superexpressam a-sin humana. Resumidamente, os soros positivos para reatividade de a-sin em ELISA foram usados para imunoistoquímica (IHC). A parafina embebida em cortes de 7μM de cérebro de camundongo, montada em lâminas de vidro Superfrost Plus, foi submetida a IHC. Os cortes foram incubados com soros (diluição 1:100 e 1:400 em PBS) e subsequentemente corados de acordo com protocolos padrões para imunoistoquímica usando sistema que bloqueia VECTASTAIN ABC, DAB e MOM (todas as reações foram realizadas usando reagentes comercialmente disponíveis obtidos de Vector labs, respectivamente, e foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante). A contracoloração foi realizada com hematoxilina. As lâminas foram montadas em Entellan e subsequentemente documentadas usando microscopia convencional de campo claro. Um anticorpo monoclonal específico para a-sin humana (LB509, Covance) foi usado como um controle positivo para a detecção de sinucleína em uma diluição final de 1/250.

[00088] Na figura 6A é representada uma coloração positiva controle. Em 6B, o mesmo anticorpo foi usado no cérebro de camundongo não transgênico a mesma área que não consegue detectar nenhum tecido a-sin positivo, já que este animal não expressa a-sin humana. Em 6C, uma coloração a-sin humana específica similar à coloração apresentada em 6A é produzida por um soro induzido por mimotopo (soro induzido por p4498). A coloração a-sin positiva no hipocampo de murino é caracterizada pelos padrões de coloração manchada da maneira mostrada em 6A e 6C. Exemplos para o potencial de induzir anticorpos a-sin específicos incluem, mas sem limitação, vacinas a base de p4456, p4498 e p4562 respectivamente.

Claims (7)

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de ter uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em CDQPVLPD (SEQ ID NO: 2), CDMPVLPD (SEQ ID NO: 3), CDSPVLPD (SEQ ID NO: 4), CDQPVLPDN (SEQ ID NO: 7), CDMPVLPDN (SEQ ID NO: 8), CDSPVLPDN (SEQ ID NO: 9), CHDRPVTPD (SEQ ID NO: 13), CDRPVTPD (SEQ ID NO: 14), CDVPVLPD (SEQ ID NO: 16), CDTPVYPD (SEQ ID NO: 17), CDTPVIPD (SEQ ID NO: 18), CHDRPVTPDN (SEQ ID NO: 19), CDRPVTPDN (SEQ ID NO: 20), CDVPVLPDN (SEQ ID NO: 22), CDQPVLPDG (SEQ ID NO: 25), CDMPVLPDG (SEQ ID NO: 26), CDSPVLPDG (SEQ ID NO: 27), CDMPVSPDR (SEQ ID NO: 31), CDRPVYPDI (SEQ ID NO: 34),CDHPVTPDR (SEQ ID NO: 35), CDMPVTPDT (SEQ ID NO: 38),CDAPVTPDT (SEQ ID NO: 39), CDSPVVPDN (SEQ ID NO: 40),CDSPVHPDT (SEQ ID NO: 42), CDAPVRPDS (SEQ ID NO: 43),CDMPVWPDG (SEQ ID NO: 44), CYDRPVQPDR (SEQ ID NO: 47), CDMPVDADN (SEQ ID NO: 49), DQPVLPDC (SEQ ID NO: 50) e DMPVLPDC (SEQ ID NO: 51), em que o peptídeo é acoplado a uma proteína carreadora farmaceuticamente aceitável.

2. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo como definido na reivindicação 1.

3. Uso de um composto, compreendendo um peptídeo como definido na reivindicação 1 acoplado a uma proteína carreadora farmaceuticamente aceitável, o dito composto com uma capacidade de ligação a um anticorpo que é específico para um epítopo de alfa-sinucleína que compreende a sequência de aminoácidos DMPVDPDN e sendo capaz de induzir in vivo a formação de anticorpos ligantes à alfa-sinucleína, caracterizado pelo fato de ser para produzir um medicamento para prevenir e/ou tratar sinucleinopatias.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é selecionada do grupo que consiste em distúrbios dos corpos de Lewy (LBDs), atrofia de múltiplos sistemas (MSA) ou neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo I (NBIA Tipo I).

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é selecionada de distúrbios dos corpos de Lewy (LBDs).

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é doença de Parkinson (PD), doença de Parkinson com demência (PDD) e demência com corpos de Lewy (DLB).

7. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a sinucleinopatia é atrofia de múltiplos sistemas (MSA).