BRPI0904913A2 - sistema para análise de viabilidade de sêmen de vertebrados por meio de processamento de imagens - Google Patents

Abstract

SISTEMA PARA ANáLISE DE VIABILIDADE DE SêMEN DE VERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS. O presente invento refere-se a um sistema para análise de viabilidade de espermatozóides de vertebrados, o qual analisa componentes cinéticos de sémen de ruminantes e aves, relacionados à viabilidade e fertilidade espermátícas, utilizando para tal, técnicas de processamento de imagens. Este sistema apresenta aplicação em áreas módicas e biológicas, especialmente em segmentos que trabalham com produção de material de multiplicação genética de origem animal e avaliação clinica de fertilidade e subfertilidade em reprodução animal. Baseia-se na aquisição de imagens microscópicas de amostras, na divisão destas imagens em frames e na segmentação destas imagens por limiarização ou determinação de intervalos de threshold e na avaliação da atividade espermática por estatística de sequnda ordem. Caracteriza-se por ser um produto e um método, os quais poderão ser comercializados separadamente, de acordo com a disponibilidade do setor produtivo; permitindo uma rápida análise do material, de forma objetiva e com baixo custo, além de flexibilidade para o meio produtivo, utilizando ferramentas de análise de imagens. que podem ser implementadas em software livre.

Description

"SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS".

Apresentação do invento:

A presente invenção refere-se à análise de componentes cinéticos dosêmen de ruminantes e aves, relacionados à viabilidade e fertilidadeespermáticas, por meio da utilização de técnicas de processamento deimagens. A segmentação de imagens é uma abordagem metodológica e deavaliação inédita na área de análise de sêmen, notadamente na estimativa doparâmetro físico "turbilhonamento" do ejaculado, que ocorre em certasespécies de interesse em Medicina Veterinária, também conhecido como"motilidade em massa" dos espermatozóides.

A análise de imagens tem sido cada vez mais utilizada para a solução deinúmeros problemas tecnológicos, sendo que para cada demanda pode existiruma série de abordagens a partir de diversas técnicas de processamento. Ouso destas técnicas tem permitido análises computadorizadas, automatização,precisão e rapidez.

O cenário da indústria de produção de material genético para fins deinseminação artificial, transferência de embriões, fertilização in vitro e clonagemencontra-se em franca expansão. Os centros de inseminação artificial, que atéa década passada, praticamente trabalhavam com materiais de multiplicaçãogenética da espécie bovina e com poucas opções de sêmen congelado,atualmente ampliaram seu leque de produtos, produzindo e comercializandosêmen de pequenos ruminantes (ovinos e caprinos), sêmen sexado por meiode citometria de fluxo e sêmen heterospérmico, além do comércio de embriõescongelados.

O sêmen de ruminantes (Bovidae, Capridae e Ovidae) e aves galiformesCGallus gallus domesticus, Meleagris gallopavo) apresenta uma característicaparticular, quando examinado microscopicamente, relacionada ao padrão demotilidade dos espermatozóides e à concentração de células do ejaculado,denominada motilidade em massa ou turbilhonamento.

Atualmente, a avaliação do turbilhonamento é realizada peloslaboratórios da indústria de inseminação artificial por meio de microscopia deluz, com o objetivo de se estimar indiretamente a população de células móveis,assim como sua intensidade de movimento (vigor espermático) e aconcentração de espermatozóides no ejaculado. Esta estimativa é realizadacolocando-se uma amostra de sêmen em lâmina aquecida por platinaaquecedora e utilizando-se o menor aumento do microscópio óptico, não secolocando lamínula sobre a amostra. Do profissional que realiza esta avaliaçãoexige-se um alto grau de treinamento e experiência, para garantir arepetibilidade e confiabilidade nos resultados. Além disso, existe sempre umavariação de padrão de avaliação entre os analistas, o que justifica odesenvolvimento de metodologias e sistemas que eliminem a subjetividadehumana do processo.

Estado da técnica:

Nas últimas décadas a maioria dos esforços que resultaram emproteção intelectual em reprodução artificial concentrou-se na área deidentificação do sexo dos espermatozóides, como por exemplo, as patentesUS5346990-A ("Sepd. X- and Y- sex associated membrane proteins - used toproduce antibodies for increasing probability that a mammalian offspring will beof a desired sex") e a patente PI0300604 -2 ("Processo de seleção do sexo deespermatozóides mamíferos e método de controle de qualidade de doses desêmen sexado congelado")

Diversas patentes, tais como: W02005080944-A1; EP1718952-A1·US2006066837-A1; DE3543515-A; FR2591347-A; US4780907-A; CA1294047-C; DE3543515-C, GB2130718-A, W08101935-A; GB2079096-A; EP42377-A"JP56501858-W; DE2953927-A; GB2079096-B; CA1180832-A; EP42377-B;DE2953927-C; JP2004077452-A, W0200190796-A; EP1285300-A"W0200190796-Α2; AU200165060-A; US6518554-B1; ΕΡ1285300-Α2·US2003168577-A1; US6900426-B2; AU2001265060-A8; W08101935-AGB2079096-A; ΕΡ42377-Α; JP56501858-W; DE2953927-A; GB2079096-B"CA1180832-A; ΕΡ42377-Β; DE2953927-C, demonstram o esforço realizado pornúmeros pesquisadores para buscar a melhor abordagem de substituir asubjetividade humana por processos automáticos de análise de imagens.

Nestas patentes foram utilizados procedimentos para se determinar o caminhoda célula espermática, a dispersão da luz promovida pelo movimento, o uso dedistintos focos, dentre outros artifícios e ferramentas em análise de imagens.

Pesquisas atuais têm buscado identificar o deslocamento das célulasespermáticas em frames sucessivos, como é citado na patente EP1718952-A1"Method of analyzing morphology and motility of spermatozoa in male fertilityinvestigation, involves calculating relative displacement of cell in framecompared to previous frame, to determine cell motility", a qual pode exigir muitamanipulação de imagem e dados, além da complexa tarefa de calcular osdeslocamentos individuais. Isto vale também para as patentes DE3543515-A;FR2591347-A; US4780907-A; CA1294047-C; DE3543515-C.

Outra abordagem para estas análises seria de forma indireta, utilizandoa dispersão da luz como meio de avaliação, como pode ser observado nodocumento da patente US2006066837-A1 "Imaging system to determineparameters of moving object e.g. cell, comprises collection Iens to focus Iightfrom object; Iight dispersing element to produce dispersed light; imaging Iens toproduce images and detector to receive images". Neste caso, a medida éindireta, o que obsta na necessidade de padronização para evitar ainterferência de luz externa, ou meio mais denso nos resultados. Esta é umalinha similar adotada também pelas patentes US6900426-B2; AU2001265060-A8.

Estes esforços são relevantes e demonstram o interesse de seconseguir analisar a motilidade dos espermatozóides de forma objetiva econfiável.Por outro lado, existem pesquisas mais sofisticadas que usam o lasercomo base de instrumentação, tal como citado nas patentes PI0301926-8 "Usodo Bio-Speckle Laser como quantificador de atividade biológica - medidor deumidade, identificador de fungos em sementes e quantificador de atividade emsêmen animal ou humano" e Pl 0401519-03 "Método implementado emmicrocomputador para captura e processamento de imagem do bio-specklelaser e uso", e também em outros diversos documentos tais como: EP555212-A; W09208122-A; W09208122-A1; EP555212-A1; EP555212-B1·DE69013366-E.

Objeto da invenção:

A correlação entre os parâmetros físicos do sêmen que levam aoturbilhonamento e a fertilidade dos espermatozóides ainda não foi estabelecida.

O escopo de técnicas que tentam avaliar a capacidade de fecundação dosespermatozóides aumentou com a utilização de tecnologias de reproduçãoartificial de terceira e quarta gerações (como a fertilização in vitro, clonagem,etc.), mas o seu alcance efetivo na determinação da fertilidade espermáticaainda é limitado. Recentemente técnicas que separam espermatozóides deacordo com suas propriedades cinéticas foram descritas nos EUA e, grupos daEuropa trabalham no conceito de determinações de subpopulações ou"clusters" de espermatozóides.

O presente invento propõe uma abordagem inusitada e representa umavanço em relação às metodologias existentes atualmente na classificação einterpretação das "ondas" formadas por agrupamentos de células espermáticasque caracterizam o fenômeno do turbilhonamento. Basicamente avalia acorrelação da concentração dos espermatozóides, motilidade em massa eintensidade de movimento ao longo do tempo com a viabilidade do sêmen. Acorrelação se baseia na manipulação de massa de dados provenientes deimagens obtidas em filme da amostra a ser analisada. A análise das imagenspermite a ausência da intervenção humana, eliminando a subjetividade doprocesso de análise.

O aspecto inovador da presente invenção consiste no fato de apresentaroutra abordagem metodológica para análise dos dados provenientes deimagens coletadas de amostras de sêmen de ruminantes. A abordagemproposta permite uma rápida análise do material, de forma objetiva e com baixocusto, além de flexibilidade para o meio produtivo, utilizando ferramentas deanálise de imagens, que podem ser implementadas em software livre. Apresente invenção caracteriza-se por um produto e um método, que podem sercomercializados separadamente de acordo com a disponibilidade do setorprodutivo dos equipamentos necessários para a geração com qualidade dosfilmes a ser utilizado nas análises.

As "ondas" de agrupamentos de células espermáticas formam imagens,no campo microscópico, que são captadas por uma câmera digital, em umperíodo de aproximadamente um minuto. As imagens apresentam diferentesformas, áreas e tonalidades de cor, onde as regiões mais escuras são locaisnos quais existe maior concentração de espermatozóides, e as áreas maisclaras são locais onde a concentração espermática é menor. Estas áreas sãoarbitrariamente separadas em diversos subcomponentes e suas dimensõessão acompanhadas nos diversos frames no qual o filme é fragmentado. Com oauxílio do software livre Image J o comportamento destes subcomponentes aolongo do tempo é analisado e obtém-se um padrão, tanto do número desubcomponentes, como de sua variação em área ao longo do tempo. A relaçãoentre subcomponentes e suas dimensões permite inferências acerca daviabilidade da amostra de sêmen. Subcomponentes de cor mais escura (áreasde maior concentração de células espermáticas, que apresentam maior vigor)podem ser medidos, e, sendo majoritários nos diversos frames dos filmes, sãoindicativos de amostra com maior viabilidade. Os gráficos obtidos após adeterminação dos subcomponentes permitem avaliar as variações sofridas, noque diz respeito à área de cada subcomponente, durante o tempo determinadopela filmagem, de onde são alocados os frames. A partir desta avaliaçãoverifica-se, relativamente, a proporção dos diversos subcomponentes e otempo no qual cada subcomponente começou a diminuir ou aumentar (porexemplo, a tendência de componentes de alta concentração/vigor é diminuir, àmedida que o tempo passa, e aí então aumentam as proporções desubcomponentes de baixa concentração/vigor). As determinações estatísticasdestas relações geram índices, que podem ser considerados objetivos, que sãoaplicáveis à estimativa de viabilidade das células espermáticas presentes noejaculado.

Na área de análise de imagens em biologia, as patentes WO2004040314-A1; AU 2003275940-A1; EP 1558934-A1 e JP 2006504937apresentam uma possibilidade de separação em "clusters" de célulasespermáticas. Esta técnica, entretanto, aplica-se à identificação de parâmetrosquantitativos e qualitativos de partículas presentes em tecidos, células, vírus oumacromoléculas, e não ao exame de populações de células móveis, comdiferentes graus de intensidade de movimento, como o método ora proposto.

Outra abordagem complementar de análise das imagens faz uso deestatística de segunda ordem por meio da manipulação das imagens originais.

A partir das imagens secundárias provenientes da manipulação é aplicada atécnica estatística de segunda ordem conhecida como Momento de Inércia,que oferece a informação no nível de atividade do conjunto de imagensanalisado. Este nível de atividade é associado à dinâmica do turbilhonamento,oferecendo uma avaliação objetiva para o nível de atividade a ser monitorado.

A técnica mostra sensível capacidade de seguir as mudanças ocorridas noturbilhonamento, que pode ainda ser separada por canais de cor, onde épossível avaliar a influência dos subcomponentes que compõem oturbilhonamento.

Descrição do invento:

A presente invenção pode ser complementarmente entendidaetapas descritas a seguir:Etapa 1: Captura e segmentação de imagens:

A captura das imagens do ejaculado se dá por meio de microscópioóptico com câmera acoplada, permitindo que a movimentação do sêmen possaser gravada em filme com extensão do tipo x, y, ζ como pode ser observadonas Figuras 1 e 2.

As imagens devem estar em foco, e o filme pode ser colorido ou preto ebranco (PB). O tempo recomendado para filmagem é de pelo menos 5 minutos.

No processamento das imagens ocorre a transformação de filme em cores paraPB, momento em que o filme é então processado para que seja colocado emníveis de cinza. A seguir, ocorre a divisão do filme em frames (Figura 1), paradeterminação do tamanho e da quantidade de imagens que será utilizada noprocesso. Neste momento, se avalia quantos frames se utilizará nos cálculos.

Se a capacidade de captura da câmera for alta, um número alto deframes estará disponível, o que aumenta a resposta do sistema. Uma vezdefinida a quantidade de frames, os mesmos passam por um processo defiltragem para que possa ser evitada a captura da imagem dosespermatozóides em movimentos individuais, buscando observar apenas amovimentação, formação e desaparecimento do turbilhão.

Etapa 2: Determinação do nível de atividade do sêmen utilizando atécnica do threshold (limiarização):

Nesta etapa as imagens são preparadas para a segmentação, por meioda determinação de intervalos de threshold. Estes intervalos determinam ossubagrupamentos apresentados pelos espermatozóides (áreas em diferentestons de cinza) e fazem uma distinção entre o turbilhão e o fundo da imagem(Figura 3). Após a segmentação se faz a classificação das áreas (Figura 4)com a finalidade de determinação dos diferentes "clusters" de atividade cinéticapresentes na amostra.

A relação entre turbilhão, subcomponentes e área total é disposta emforma gráfica, mostrando o comportamento da atividade cinética de cadasubcomponente ao longo do tempo (ANEXO A), que dá as informações sobre aviabilidade do sêmen. Os cálculos podem ser ainda realizados de formaseparada para cada componente de cor (RGB) o que oferece uma visãofragmentada e mais completa da influência de cada subagrupamento nacomposição final do turbilhão.

Etapa 3: Determinação do nível de atividade do sêmen usando a técnicado momento de inércia:

A técnica do momento de inércia baseia-se em uma abordagemproveniente da análise de imagens de iluminação de material biológico pela luzlaser. As imagens obtidas pelo microscópio óptico são distintas daquelasprovenientes da iluminação com o laser, mas sua atividade permite a suaadoção, que fornece a informação de quão ativo é o material. A fundamentaçãomatemática para o cálculo do momento de inércia pode ser vista em Arizaga1R., Trivi1 M.R., Rabal, H.J. Speckle time evolution characterization by co-ocorrence matrix analysis. Optics & LaserTechnoIogy, v.4-5, n.3, p.1-7, 1999,que é também conhecido como estatística de segunda ordem. Para o cálculo énecessária a montagem de outra imagem, conhecida como STS (Spatial TimeSpeckle), que é o agrupamento de um conjunto de linhas ou colunas retiradasdas imagens originais. No caso das imagens provenientes do filme obtido nomicroscópio óptico, cada STS formado é composto por uma coluna de umframe compondo um tamanho de imagem igual à imagem original. Como oconjunto de frames é grande, é possível montar uma seqüência de STS's, oque permite acompanhar o comportamento da atividade cinética ao longo dotempo. Os momentos de inércia são calculados para cada frame e dispostosem forma gráfica para interpretação pelo analista (ANEXO B). Os cálculospodem ser ainda realizados de forma separada para cada componente de cor(RGB) o que oferece uma visão fragmentada e mais completa da influência decada subagrupamento na composição final do turbilhão.

A presente invenção, objeto deste pedido, caracteriza-se por ser umproduto e um método, os quais podem ser comercializados separadamente, deacordo com a disponibilidade do setor produtivo; proporcionando uma rápidaanálise do material, de forma objetiva e com baixo custo, além de flexibilidadepara o meio produtivo, utilizando ferramentas de análise de imagens, quepodem ser implementadas em software livre.

Claims (8)

1. SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENScaracterizado por avaliar, ao longo do tempo, a relação da concentração dosespermatozóides móveis e intensidade de movimento (determinantes damotilidade em massa e atividade espermáticas), com a viabilidade do sêmen.

2. SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS de acordocom reivindicação 1 caracterizado pela obtenção de um filme por meio decâmara acoplada em microscópio de luz e divisão deste filme em framesarbitrariamente determinados.

3. SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS de acordocom reivindicações 1 e 2 caracterizado pela segmentação das imagens dofilme proveniente de microscopia de luz.

4. SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS de acordocom reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo processamento e análise deimagens após o estabelecimento dos intervalos de threshold ou limiarização.

5. SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS de acordocom reivindicações 1 a 4, caracterizado por determinar o nível de atividadedo sêmen e separar diferentes subcomponentes ou "clusters" de diferentesintensidades de cinética espermática na população de células da amostra;

6. SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS de acordocom reivindicações 1 a 5, caracterizado por permitir a montagem, emqualquer frame, de padrões conhecidos como "Pseudo"- STS (Spatial TemporalSpeckle), já que os frames não são speckles provenientes da iluminação comluz coerente, que fornecem informações da atividade cinética por estatística desegunda ordem.

7. SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS de acordocom reivindicações 1 a 6, caracterizado por utilizar conjuntos de imagensseparadas pelos componentes de cor (RGB), que oferecem informaçõesadicionais, fragmentadas e completas da influência de cada "cluster"espermático no turbilhão.

8. SISTEMA PARA ANÁLISE DE VIABILIDADE DE SÊMEN DEVERTEBRADOS POR MEIO DE PROCESSAMENTO DE IMAGENS de acordocom reivindicações 1 a 7, caracterizado por determinações estatísticasobservadas entre os "clusters" advindos do processo de segmentação, dosmomentos de inércia e do comportamento dos "clusters", ao longo do tempo,nos diferentes frames, estabelece índices objetivos que estimam a viabilidadedas células presentes na amostra de sêmen.