BRPI0904752A2 - processo de preparação de um sistema de liberação controlada de clorexidina e seus compostos de inclusão, a partir de cimento resinoso, produto e uso - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE PREPARAçãO DE UM SISTEMA DE LIBERAçãO CONTROLADA DE CLOREXIDINA E SEUS COMPOSTOS DE INCLUSãO, A PARTIR DE CIMENTO RESINOSO, PRODUTO E USO. A presente invenção descreve um sistema de liberação controlada baseado na sílica porosa (S) nanoparticulada contendo clorexidina e seus sais, e seus compostos de inclusão ou associação com ciclodextrinas, a partir de um cimento resinoso polimerizável (O), e produto para uso odontológico. O sistema, ora proposto, permite levar o agente antimicrobiano diretamente ao sítio alvo de contaminação, causado por microorganismos, particularmente do gênero Enterococcus sp. e Candida sp. Em seu aspecto mais geral, a presente invenção descreve sistemas de liberação controlada contendo diacetato dicloridrato e digluconato de clorexidina, OxA, CxD e CxG, respectivarnente, puros ou livres e em forma de compostos de inclusão, em ciclodextrina, em proporção molar que pode variar de 1:1 a 4:1(ciclodextrina/digluconato de clorexidina ou diacetato de clorexidina ou dicloridrato de clorexidina), não restrito.

Description

PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA DE LIBERAÇÃOCONTROLADA DE CLOREXIDINA E SEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, APARTIR DE CIMENTO RESINOSO, PRODUTO E USO.

Campo da Invenção

A presente invenção descreve um sistema de liberação controladabaseado na sílica porosa (S) nanoparticulada contendo clorexidina e seus sais,e seus compostos de inclusão ou associação com ciclodextrinas, a partir de umcimento resinoso polimerizável (C)1 e produto para uso odontológico. Osistema, ora proposto, permite levar o agente antimicrobiano diretamente aosítio alvo de contaminação, causado por microorganismos, particularmente dogênero Enterococcus sp. e Candida sp.

Em seu aspecto mais geral, a presente invenção descreve sistemas deliberação controlada contendo diacetato, dicloridrato e digluconato declorexidina, CxA1 CxC e CxG, respectivamente, puros ou livres e em forma decompostos de inclusão, em ciclodextrina, em proporção molar que pode variarde 1:1 a 4:1(ciclodextrina/digluconato de clorexidina ou diacetato de clorexidinaou dicloridrato de clorexidina), não restrito.

Estado da técnica

A prática da Odontologia abrange uma grande variedade deprocedimentos, que podem incluir desde um simples exame até uma cirurgiamais complexa. Após esses procedimentos, infecções remanescentes são umagrande preocupação, independente do tipo de intervenção realizada. Umexemplo específico é o reaparecimento de bactérias, após o tratamento de umcanal radicular (tratamento endodôntico), que podem levar ao desenvolvimentode lesões periapicais (ZENG, P. et al. Concentration dependent agregationproperties of chlorhexidine salts. IntJPharm, 367, 1-2, 73-78, 2009).

A assepsia do canal radicular contaminado é o foco primordial dotratamento endodôntico, e a persistência de microorganismos compromete oseu sucesso. O tratamento endodôntico começa pela preparação mecânico-química do conduto radicular, que compreende o alargamento e conformaçãodo conduto através de brocas e limas, removendo mecanicamente umacamada de dentina contaminada, e irrigação simultânea do conduto comsoluções antimicrobianas à base de hipoclorito de sódio. O conduto, então, épreenchido com uma medicação intracanal, geralmente hidróxido de cálcio, atéo momento do fechamento final (obturação). Durante a obturação final, oconduto é preenchido com finos cones de guta-percha, que são levados aocanal junto com um agente cimentante à base de óxido de zinco e eugenol,com o objetivo de selar o conduto.

Apesar das propriedades antimicrobianas da preparação mecânico-química e da medicação intracanal entre as consultas, a eliminação dosmicroorganismos pode não ser completa devido à diferença entre avulnerabilidade das espécies envolvidas, bem como devido à complexaanatomia dos canais e, a permanência de microorganismos viáveis no condutocontribui significativamente para o insucesso do tratamento (KOMOROWSKI,R., GRAD, H., WU, X.Y., FRIEDMANN, S. Antimicrobial substantivity ofchlorhexidine-treateds bovine root dentin. J Endod, 26, 6, 315-317, 2000;GOMES, B.P.F.A. et al. Antimicrobial action of intracanal medicaments on theexternai root surfface. J Dent, 31, 1, 76-81, 2009; DAMETTO, F.R. et al.Source: Oral surgery oral medicine oral pathology oral radiology andendodontics, 99, 6, 768-772, 2005).

Os canais radiculares podem ser colonizados, por no mínimo 150espécies de microorganismos e alguns deles são responsáveis por lesõesendodônticas associadas à necrose pulpar. Esses microorganismos tambémsão encontrados dentro dos túbulos dentinários dos canais e podem reinfectaro canal após o tratamento, se não forem eliminados. Dentre essesmicroorganismos destaca-se o Enterococcus faecalis, que penetra facilmentenos túbulos dentinários, resistindo às soluções irrigadoras do canal. Além doEnterococcus faecalis, a Candida albicans também é freqüentementeobservada nas lesões periapicais refratárias, e tem fatores de virulênciaimportantes, que podem contribuir para o desenvolvimento dessas lesões,sendo consideradas as espécies mais resistentes (CARDOSO, M.G. et al.Effectiveness of ozonated water on Candida albicans, Enterococcus faecalis,and endotoxins in root canais. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral RadiolEndod, 105, 3, 85-91, 2008).

Diversos autores identificaram o Enterococcus faecalis como a espéciepredominante encontrada em lesões periapicais persistentes em canaispreviamente tratados. A eliminação completa do Enterococcus faecalis é difícildevido a sua inerente resistência frente aos agentes antibacterianos, aliada àsua habilidade em sobreviver no ambiente inóspido do canal, durante apreparação mecânico-química. Quando o ambiente torna-se propícionovamente, a bactéria retoma sua função normal podendo formar biofilme(KISHEN, A. et al. Influence of irrigation regimens on the aderence ofEnterococcus faecalis to root canal dentin. J Endod, 34, 7, 850-854, 2008; LEE,J-K. et al. Chlorhexidine gluconate attenuates the ability of Iipotheichoic acidfrom Enterococcus faecalis to stimulate toll-like receptor 2. J Endod, 35, 2, 212-215, 2009; WILLIAMSON, A.E., CARDON, J.W., DRAKE, D.R. Antimicrobialsusceptibility of monoculture biofilms of a clinicai isolate of Enterococcusfaecalis. J Endod, 35, 1, 95-97, 2009).

O protocolo convencional de preparação mecânico-química e demedicação intracanal, entre as consultas, tem se mostrado ineficaz naeliminação do Enterococcus faecalis e da Candida albicans. Rosenthal S. ecolaboradores demonstraram que a utilização da solução irrigante hipocloritode sódio, e do hidróxido de cálcio como medicação intracanal não foramcapazes de eliminar esses microorganismos, e também não apresentaramsubstantividade. Os autores propuseram então, diversas formas de associaçãoentre esses agentes antimicrobianos e a clorexidina obtendo resultadossatisfatórios, tanto como solução irrigadora, como para medicação intracanal(ROSENTHAL, S., SP NGBERG, L., SAFAVI, K. Chlorhexidine substantivity inroot canal dentin. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Raduiol Endod, 98, 4,488-492, 2004). Outros autores também relataram a ineficácia da utilizaçãoapenas de soluções irrigantes para descontaminação do conduto radicular(BASRANI, B., GHANEM, A., TJADERHANE, L. Physical and chemicalproperties of chlorhexidine and calcium hydroxide-containing medications. JEndod, 30, 6, 413-417, 2004; SCHAFER, E., BÕSSMANN, K. Antimicrobialefficacy of chlorhexidine and two calcium hydroxide formulations againstEnterococcus faecalis. J Endod, 31, 1, 53-56, 2005; DAMETTO1 F. R etal.Source: ORAL SURGERY ORAL MEDICINE ORAL PATHOLOGY ORALRADIOLOGYAND ENDODONTICS, 99, 6, 768-772, 2005; ERCAN, E., DALLI,M., DÜLGERGIL, Ç.T. In vitro assessment of effectiveness of chlorhexidine geland calcium hydroxide paste with chlorhexidine against Enterococcus faecalisand Candida albicans. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 102,2, 27-31, 2006; PAQUETTE, L. et al. Antibacterial efficacy of chlorhexidinegluconate intracanal medication in vivo. J Endod, 33, 7, 788-795, 2007).

Recentemente, a clorexidina tem sido recomendada para os tratamentosradiculares devido à sua ação antimicrobiana, alta substantividade, ou seja,após sua adsorção aos tecidos dentários sua liberação ocorre em níveisterapêuticos de forma lenta e prolongada. Além disso, estudos in vitrodemonstraram que a clorexidina produz menos efeitos adversos que ohipoclorito de sódio, podendo ser utilizada em baixas concentrações (LENET,B.J. et al. Antimicrobial substantivity of bovine root dentin exposed to differentchlorhexidine delivery vehicles. J Endod, 26, 11, 652-655, 2000). Entretanto,para atingir a substantividade com efeito antimicrobiano, por tempo maisprolongado, a exposição da dentina infectada à clorexidina precisa ocorrer porum tempo maior, tornando necessário o desenvolvimento de dispositivosintracanal que possibilitem essa exposição prolongada.

A substância quimioterápica mais efetiva contra o Enterococcus faecalis,Candida albicans e S. mutans tem sido a clorexidina. Sua efetividadeantimicrobiana deve-se à adsorção devido à grande afinidade entre a paredeaniônica do microorganismo e a forte carga catiônica da molécula. Essaadsorção aumenta a permeabilidade da membrana bacteriana, permitindo apenetração da substância no citoplasma, causando-lhe a morte (HUGO, W.B.,LONGWORTH, A.R. Some aspects of the mode of action of chlorhexidine. J,16, 10, 655-662, 1964).

Uma das tentativas para levar e manter a clorexidina no conduto foi odesenvolvimento de quatro protótipos para liberação controlada de clorexidinaintracanal, utilizando cone de papel absorvente contendo clorexidina nãorevestidos, e revestidos com a quitosana, o PLGA (ácido poli-láctico glicólico) eo PMMA (poli-metil-metacrilato) (LEE, D-Y. et al.The sustained effect of threepolymers on the release of chlorhexidine from a controlled release drug devicefor root canal disinfection. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,100, 2, 105-111, 2005). O dispositivo não revestido apresentou liberação maisrápida (duas horas) se comparado àqueles revestidos pela quitosana, PLGA ePMMA respectivamente, mostrando que o recobrimento com o polímero podecontrolar a liberação do fármaco. A efetividade antibacteriana desses mesmosdispositivos recobertos com PMMA foi avaliada frente ao E. faecalis inoculadosem dentina radicular de dentes humanos. Os dispositivos foram comparados auma solução salina (controle positivo), uma solução salina de hidróxido decálcio, a dispositivos de PMMA sem clorexidina e a uma solução 0,2% declorexidina. Os resultados mostraram que a efetividade antimicrobiana foimantida pelo dispositivo contendo clorexidina recoberto com PMMA durante operíodo experimental (1 semana), e foi superior à irrigação com solução declorexidina 0,2% (LEE, Y. et al. Antimicrobial efficacy of a polymericchlorhexidine release device using in vitro model of Enterococcus faecalisdentinal tubule infection. J Endod, 34, 7, 855-858, 2008).

A finalidade básica do agente cimentante é promover a união entre opino e as paredes do conduto radicular, e preencher os espaços existentesentre esses substratos (ROSENSTIEL, S. F., LAND, M. F., CRISPIN, B. J.Dental Iuting agents: a review of current literature. J Prosthet Dent1 80, 3, 280-301,1998). Classicamente, têm sido descritos quatro tipos de agentescimentantes: cimento fosfato de zinco, cimento de policarboxilato de zinco,cimento de ionômero de vidro e, mais recentemente, os cimentos resinososque apresentaram uma significativa evolução em relação aos seusantecessores, por serem insolúveis no meio bucal e, compatíveis com ossistemas adesivos modernos. Estudos comparativos entre as propriedadesfísicas e mecânicas de cimentos convencionais e resinosos mostraram que oscimentos resinosos possuem a melhor combinação dessas propriedades (UY1J. N. et al. Load fatigue performance of gold crowns Iuted with resin cements. JProsthet Dent, 95, 4, 315-322; ATTAR, N., ΤΑΜ, L. E., McCOMB, D.Mechanical and physical properties of contemporary dental Iuting agents. JProsthet Dent, 89, 2, 127-134, 2003; IRIE, M., SUZUKI, K., WATTS, D. C.Marginal and flexural integrity of three classes of Iuting cement, with earlyfinishing and water storage. Dent Mater, 20,1,3-11, 2004).

Os cimentos resinosos podem ser classificados em três categorias deacordo com a forma de iniciação de sua reação de polimerização: a) osautopolimerizáveis, que possuem sistema de indução por peróxido de benzoíla(pasta base) e uma amina terciária (pasta catalisadora) que entram em contatoapós a manipulação das duas pastas, e são indicados para a cimentação derestaurações de grande espessura e pinos intraradiculares, nos quais a luzpara fotopolimerização não consegue penetrar satisfatoriamente; b) osfotopolimerizáveis (pasta única), nos quais o iniciador da polimerização é acanforoquinona ativada por uma fonte de luz externa, indicados pararestaurações delgadas; c) e os cimentos com duplo sistema de polimerizaçãoou dual, nos quais ocorre tanto a polimerização ativada pela luz quanto aquelainiciada pelo peróxido de benzoíla (PAGANI, D. F. et al. Resin cements:actuality. J Prosthet Dent, 70, 5, 503-511, 2000).

Em uma revisão sobre as propriedades antimicrobianas de diversoscompostos resinosos, concluiu-se que a maioria dos produtos disponíveiscomercialmente não tinha propriedades antimicrobianas significativas. Aefetividade demonstrada por alguns materiais não apresentou relevânciaclínica. Esses resultados não foram surpreendentes, pois os componentesfundamentais destes compostos apresentam pouco ou nenhum efeitobacteriostático/bactericida (IMAZATO S. Antibacterial properties of resincomposites and dentin bondin systems. Dent Mater, 19, 6, 449-457, 2003). Acarga de preenchimento, que em geral é a sílica, é inerte, e os monômerosconstituintes da matriz bis-GMA (bisfenol-A glicidilmetacrilato), TEGDMA (tri-etileno-glicol dimetacrilato) ou UDMA (uretano dimetacrilato) também não sãoativos frente ao S. mutans e o catalisador nesses compostos em geral, é umaamina terciária, que só tem efeito antimicrobiano em altas concentrações.

Visto que as propriedades antimicrobianas dos materiais resinosos,incluindo os agentes cimentantes, não se mostraram relevantes clinicamente, aincorporação de várias classes de antimicrobianos, em variadasconcentrações, mostrou-se um caminho viável para superar o problema. Umadas primeiras tentativas de associação material resinoso/antimicrobiano avalioua adição da clorexidina a resinas compostas restauradoras. Os resultadosmostraram que a atividade antimicrobiana frente ao S. mutans aumentousensivelmente, sem alterações significativas das propriedades mecânicas daresina (JEDRYCHOWSKI, J.R., CAPUTO, A.A., KERPER, S. Antibacterial andmachanical properties of restorative materiais combined with chlorhexidines. JOral Rehabil, 10, 5, 373-381, 1983).

A incorporação de diacetato de clorexidina a dois tipos de cimentosresinosos diferentes, um autopolimerizável e outro dual, mostrou efetividadeantimicrobiana frente ao S.mutans, e alteração das propriedades mecânicas,havendo diminuição na microdureza Knoop (AKAKI, E. et al. SEM/EDX andFTIR characterization of a dental resin cement with antibacterial agentsincorporated. Key Engin. Mat1 284-286, 391-394, 2005).

MEHDAWI, I. e colaboradores propuseram a incorporação demonofosfato de cálcio hidratado (MCPM)1 β-tricálcio fosfato e diacetato declorexidina a compostos resinosos à base de metacrilatos, produzindo ummaterial com propriedades antimicrobianas e remineralizantes. A hipótese dosautores era que o MCPM solúvel aumentaria a sorção de água pela resina,aumentando a liberação de clorexidina e de fosfato de cálcio. Os resultadosmostraram que a liberação de clorexidina foi proporcional à raiz quadrada dotempo por quatro semanas, como esperado para um processo de liberaçãocontrolado por difusão. Após esse período, a liberação diminuiusignificativamente, possivelmente devido à precipitação de cristais de fosfatode dicálcio dihidratado. Outra razão, poderia ser a natureza catiônica daclorexidina, que poderia se ligar a íons fosfato ou cloreto, formando sais debaixa solubilidade. Todas as amostras contendo clorexidina mostraramatividade antimicrobiana tanto no teste de difusão em ágar, quanto nos estudoscom biofilmes, quando comparadas ao controle (MEHDAWI, I. et al.Development of remineralizing, antibacterial dental materiais. Acta Biomater., 5,7, 2525-2539, 2009).Em outro aspecto, diversos sistemas carreadores têm surgido nosúltimos anos, visando melhorar o padrão de administração dos fármacosdiminuindo a freqüência de dosagem, a toxicidade e melhorando a eficiênciaterapêutica. Dentre estes sistemas podemos citar as microesferas compolímeros orgânicos, as micelas, lipossomas, nanoesferas encapsuladas,sistemas baseados na formação de compostos de inclusão com asciclodextrinas e sistemas baseados na sílica porosa em suas variadasapresentações.

Dispositivos de liberação controlada têm como princípio básico aliberação lenta de certa quantidade de um princípio ativo, com alvo específico,por determinado intervalo de tempo, de forma eficiente e precisa. Cumprindoesses requisitos, surgem as ciclodextrinas, que são oligossacarídeos cíclicos,contendo uma cavidade hidrofóbica e superfície externa hidrofílica.

A configuração tridimensional mais estável para as ciclodextrinas é oformato de um cone truncado. Ambas as bordas do cone estão ocupadas porhidroxilas que lhe conferem solubilidade em água.

A presença dessa cavidade hidrofóbica faz com que as ciclodextrinassejam capazes de alojar uma molécula convidada, formando assim compostosde inclusão. A principal propriedade das ciclodextrinas é sua habilidade emalterar as propriedades físico-químicas e biológicas de princípios ativos, taiscomo solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade. A capacidade dasciclodextrinas de formar compostos de inclusão baseia-se na versatilidade desuas propriedades físicas e químicas, as quais possibilitam a formação deinterações intermoleculares do tipo hóspede-hospedeiro com outras moléculassendo que, ligações covalentes não são estabelecidas entre as espécies. Aformação de compostos de inclusão está baseada nos princípios da químicasupramolecular, na qual as interações entre dois ou mais componentes em umarranjo organizado são feitas por forças intermoleculares fracas, tipo van derWaals, ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas ou interaçõeshidrofóbicas (DUCHÊNE, D., WOUESSIDJEWE, D., PONCHEL, G.Cyclodextrins and carrier systems. J Control Release, 62, 1-2, 262-268, 1999;UEKEAMA, K., IRIEi Τ. Pharmaceutical applieations of eyelodextrins. III.Toxicological issues and safety evaluation. J Pharm Sei, 86, 2, 147-162, 1997).

As interações que ocorrem entre o diacetato de clorexidina e a β-ciclodextrina foram relatadas por Ql1 H. e colaboradores (Ql1 H., NISHIHATA,T., RYTTING, J.H. Study of the interactions between β-cyclodextrin andchlorhexidine. Pharm Res, 11, 8, 1207-1210, 1994). A caracterização eavaliação do composto de inclusão entre o cloridrato de clorexidina e a β-ciclodextrina foram relatadas por Cortês, M. e colaboradores (CORTÊS, Μ. E.et al. The chlorhexidine:p-cyclodextrin inclusion compound: Preparation,characterization and microbiological evaluation. J Inclusion Phenom 40, 4, 297-302, 2001). O complexo molecular clorexidina^-ciclodextrina é considerado dealta substantividade, ou seja, permanece em contato com o sistema biológicopor tempo prolongado, pois pode se ligar a grupos hidroxila de diversasestruturas, aumentando o nível de ação da clorexidina. (DENADAI, A.M.L. etal. Supramolecular self-assembly of β-cyclodextrin: an effective carrier ofantimicrobial agent chlorhexidine. Carbohyd Res, 342,15, 2286-2296, 2007).

A sílica porosa constitui-se de um retículo tridimensional de partículas eporos, formando uma rede de túneis interligados, produzindo um sólidoaltamente poroso. A estrutura das paredes dos poros é uma cadeia de pontesde siloxanos e grupos silanóis livres capazes de reagir com moléculashóspedes capazes de formar ligações químicas, físicas ou interaçõesintermoleculares, comportando-se como uma matriz para adsorção e liberaçãocontrolada. Devido à sua porosidade, tem sido muito utilizada como carreadorde diversas classes de fármacos (FIDALGO, A., ILHARCO, L.M. Correlationbetween physical properties and strueture of silica xerogels. J Non-CrystallineSolids, 347, 1-3, 128-137, 2004; VALLET-REGÍ, M. et al. Hexagonal orderedmesoporous material as a matrix for the controlled release of amoxilin. SolidState lonics, 172, 1-3, 435-439, 2004; LI, Ζ. Z. et al. Fabrication of poroushollow silica nano particles and their applieations in drug release control. JControl Release, 98, 2, 245-254, 2004). A sílica porosa, na forma de aerogéis exerogéis, tem atraído muita atenção devido às suas características epropriedades: baixa densidade, alta estabilidade química, baixa constantedielétrica e alta resistência térmica. É inorgânica, amorfa, biodegradável,compatível com a maioria das moléculas, biocompatível e bioativa, e apresentaainda grande área superficial específica, e suas propriedades de superfície emorfológicas podem ser controladas durante a síntese (KORTESUO, P. et al.

Silica xerogel as an implantable carrier for controlled drug delivery- Evaluationof drug distribution and tissue effects after implantation. Biomater, 21, 2, 193-198, 2000; CHEN, J.F. et al. Preparation and characterization of porous hollowsilica nanoparticles for drug delivery application. Biomater, 25, 4, 723-727,2004).

A incorporação do fármaco à sílica pode ser feita diretamente por meioda embebição do gel seco em uma solução concentrada do fármaco, com ousem pressão, ou incorporando-o ao sol durante a síntese. O segundo processoleva a uma distribuição heterogênea do fármaco no gel, o que pode afetar ataxa de liberação, embora em geral, a taxa de incorporação seja maior nesseprocesso (WANG, S. Ordered mesoporous materiais for drug delivery. MicroporMesoporMat, 117, 1-2, 1-9, 2009).

A natureza físico-química das interações fármaco-sílica estabelece opadrão de adsorção e liberação da molécula incorporada. Essas interaçõesdependem da estrutura dos poros (tamanho, presença de grupos silanóis livresem suas paredes), dos grupos funcionais presentes na molécula a serincorporada, e da funcionalização da sílica com outros grupos funcionais deinteresse.

A influência do tamanho do poro das matrizes de sílica na taxa deliberação do ibuprofeno foi estudada por HORCAJADA e colaboradores. Osautores observaram que quanto menor o tamanho do poro, menor a taxa deincorporação e de liberação (HORCAJADA, P. et al. Influence of pore size ofMCM-41 matrices on drug delivery rate. Micropor Mesopor Mat, 68, 1-3, 105-109, 2004). Em relação aos grupos silanóis livres, quanto maior a presençadesses grupos, mais interações de hidrogênio poderiam ser formadas entre ofármaco e a matriz de sílica. As características da molécula convidada tambémdevem ser consideradas, pois se observa que fármacos neutros são liberadosmais rapidamente, enquanto os básicos teriam liberação mais sustentada. Paraaumentar essas interações sílica-fármaco a matriz pode ser funcionalizada, eos grupos funcionais presentes no fármaco são de grande importância paradeterminar quais os grupos ideais para a funcionalização (WANG, S. Orderedmesoporous materiais for drug delivery. Micropor Mesopor Mat, 117, 1-2, 1-9, 2009).

Inúmeros trabalhos vêm registrando a biocompatiblidade e bioatividadeda sílica porosa, consolidando cada vez mais seu uso em sistemas deliberação implantáveis e reabsorvíveis possibilitando a liberação de compostos.

Como exemplo, pode-se citar o uso da sílica porosa com a heparina, facilitandoa sua aplicação, pois esses sistemas não precisam ser removidosposteriormente (TEBBE, D., THULL1 R., GBURECK, U. Correlation betweenheparin release and polymerization degree of organically modified silicaxerogels from 3-methacryloxypropylpolysilsesquioxane. Acta Biomater, 3, 6,829-837, 2007), o uso de implantes subcutâneos contendo toremifene(KORTESUO, P. et al. Silica xerogel as an implantable carrier for controlleddrug delivery- Evaluation of drug distribution and tissue effects afterimplantation. Biomater, 21, 2,193-198, 2000), recobrimento de pinos de titânioutilizados na fixação de fraturas com um filme fino de sílica xerogel contendovancomicina (RADIN, S. & DUCHEYNE, P. Controlled release of vancomycinfrom thin sol-gel films on titanium alloy fractura plate material. Biomater, 28, 9,1721-1729, 2007).

No estado da técnica, o pedido de patente Pl 0702738-9 revela umprocesso de preparação de um dispositivo de liberação controlada de agentesantibióticos ou anti-sépticos incluídos ou associados em ciclodextrina em umabase de guta-percha, bem como seus produtos e os seus usos. A aplicaçãodesta tecnologia abrange o uso clínico do produto como material para aOdontologia (obturação de canais radiculares, medicação intracanal, agenterestaurador temporário de cavidades e anti-hemorrágico). O trabalho descreveuma técnica para aumentar a atividade biológica a partir da inclusão ouassociação à ciclodextrina, porém o documento não relaciona o seu uso emuma formulação a partir de um cimento resinoso contendo um dispositivo deliberação controlada, a partir de uma base de sílica porosa.Assim também, o pedido de patente Pl 0405347-8 revela um processode preparação de géis mucoadesivos para prevenção de cárie, usos e produtosderivados. Caracteriza-se por aprimorar o processo de preparação de géisentre polímeros aniônicos, e a clorexidina, e entre os polímeros não-iônicos, eos compostos de inclusão em ciclodextrina tornando-os compatíveis, com aadição de ácido cítrico e/ou antioxidante. O processo descrito melhorou asolubilidade dos sais de acetato, cloridrato e digluconato de clorexidina, e destaforma se obtiveram géis homogêneos, mucoadesivos, com atividadeprolongada contra S. mutans, E faecalis e Cândida albicans em baixasconcentrações para a prevenção de cáries dentais, porém o documento nãorelaciona o seu uso em uma formulação a partir de um cimento resinosocontendo um dispositivo de liberação controlada, baseado na sílica porosa.

O documento W0/2001/074321 diz respeito à aplicação tópica de umasolução de clorexidina seguida pela aplicação de um selante em superfíciesradiculares expostas, evitando a destruição do cimento e esmalte expostoassociado à junção cimento-esmalte, e evitando a inflamação do tecidogengival. Esse documento reivindica a liberação controlada da clorexidina,porém, ele não apresenta a formulação baseada em sílica porosa, a partir deum cimento resinoso.

A patente US 4,288,355 diz respeito a um cimento cirúrgicocompreendendo composições de um concentrado não gelificado depolicarboxilatos em uma solução aquosa de ácido clorídrico e uma suspensãoaquosa de óxido metálico em pó que quando misturados formam uma massaplástica que é moldável no formato desejado antes que endureça. Tambémrelata a possibilidade de incorporação de agentes bacteriostáticos na pasta,porém, não cita e nem reivindica nada relacionado à liberação controlada defármacos, onde a invenção destaca a liberação do flúor.

A patente US 6,437,019 fornece um sistema cimento ionomérico departes múltiplas que compreende uma composição orgânica que ésubstancialmente isenta de água, e uma composição aquosa compreendendoágua. A composição contém pelo menos um componente hidrofílico e umcomposto de função ácida cujo peso é superior a 1,0% do peso da composiçãoorgânica. Os ingredientes líquidos das composições são miscíveis, ambosquando em composições distintas e quando misturados. Embora a clorexidinae a sílica poderiam estar presentes, esta invenção não visa à liberaçãocontrolada e dá destaque a liberação de flúor.

A patente US 4,171,544 diz respeito a uma composição consistindo devidro e cerâmica de alta porosidade com pelo menos cerca de 80% de dióxidode silício (sílica) com grande área superficial específica, capaz de desenvolverfortes laços com o tecido ósseo. Essa composição acrescida de cimentoinorgânico forma um forte vínculo com os ossos e implantes quando utilizadona fixação de implantes odontológicos e cirúrgicos. Essa invenção não serelaciona à dispositivos de liberação controlada de fármacos.

Problemas do estado da técnica

A análise do estado da técnica mostra inúmeras tentativas do uso daclorexidina, descrita como o melhor padrão para agentes antimicrobianos,associada a materiais resinosos. Relata também, problemas significativoscomo a redução das propriedades mecânicas das matrizes resinosas,precipitação em presença de íons cloreto formando sais de baixa solubilidadeque, mesmo em baixas concentrações reduzem a taxa de liberação, as taxasde incorporação e a biocompatibilidade.

Por outro lado, a alta incidência da ocorrência de lesão periapicalrecorrente devido à proliferação de microorganismos após os tratamentosendodônticos reforça a necessidade da presença de agentes antimicrobianosno canal radicular após o tratamento.

Vantagens da invenção

Uma estratégia para superar os problemas encontrados, seria autilização da clorexidina na forma de sistemas de liberação controlada,baseados nos princípios da química supramolecular, usando o encapsulamentomolecular do tipo hospedeiro:hóspede (fármaco: ciclodextrina), e o posteriorencapsulamento em sílica porosa. O estado da técnica atual não descreve umprocesso de preparação de um dispositivo de liberação controlada de agentesantimicrobianos incluídos ou associados à ciclodextrina em uma base de sílicaporosa, a partir de cimentos resinosos polimerizáveis.

Neste sentido a presente invenção propõe uma associação inovadora dananotecnologia da sílica porosa com a química dos compostos de inclusão eum antimicrobiano. Mais particularmente, propõe o uso de ciclodextrinasassociadas à clorexidina como agente antibacteriano com uma das finalidadesde preparação de um compósito odontológico para cimentação de pinos intraradiculares, para cimentação de cones de gutapercha na obturação do canal oucimentação de restaurações, contendo sílica porosa como sistema de liberaçãocontrolada.

Outro diferencial da tecnologia ora proposta está relacionada ao caráterantimicrobiano associado ao agente material, uma vez que esta atividadepossui um perfil de liberação lenta e gradual mantendo concentraçõesinibitórias satisfatórias. Assim, é possível obter um maior controle de infecçõesnos tratamentos odontológicos, com o uso do agente antimicrobiano emmenores concentrações. Em outro aspecto, é importante mencionar que atecnologia ainda pode ser utilizada em fixações de órteses, dispositivosintracorpóreos, reconstruções ósseas, em sítios cirúrgicos e recobrimento desuperfícies de implantes.

Breve descrição das Figuras

A Figura 1 apresenta as curvas de liberação controlada de clorexidina apartir dos sistemas SCxA (sílica porosa, diacetato de clorexidina) e SpcdCxA(sílica porosa, β-ciclodextrina, diacetato de clorexidina), em função do tempoem horas.

A Figura 2 apresenta as curvas de liberação controlada de clorexidina apartir dos sistemas SCxG (sílica porosa, digluconato de clorexidina) e SpcdCxG(sílica porosa, β-ciclodextrina, digluconato de clorexidina), em função do tempoem horas.

A Figura 3 apresenta as curvas de liberação controlada de clorexidina apartir dos cimentos modificados obtidos após a incorporação dos sistemas deliberação controlada à base de sílica, CSCxA (cimento, sílica porosa, diacetatode clorexidina), CSCxG (cimento, sílica porosa, digluconato de clorexidina),CSPcdCxA (cimento, sílica porosa, β-ciclodextrina, diacetato de clorexidina), eCSPcdCxG (cimento, sílica porosa, β-ciclodextrina, digluconato de clorexidina),em função do tempo em horas.

A Figura 4 apresenta as curvas de liberação controlada de clorexidina apartir dos cimentos modificados obtidos após a incorporação dos agentesantimicrobianos sem sílica, CCxA (cimento, diacetato de clorexidina), CCxG(cimento, digluconato de clorexidina), CpcdCxA (cimento, β-ciclodextrina,diacetato de clorexidina), e CβcdCxG (cimento, β-ciclodextrina, digluconato declorexidina), em função do tempo em horas.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção descreve um sistema de liberação controladabaseado na sílica porosa nanoparticulada contendo clorexidina e seus sais, eseus compostos de inclusão ou associação com ciclodextrinas, a partir de umcimento resinoso polimerizável, e produto para uso odontológico. O sistema,ora proposto, permite levar o agente antimicrobiano diretamente ao sítio alvode contaminação, causado por microorganismos, particularmente do gêneroEnterococcus sp. e Candida sp.

Em seu aspecto mais geral, a presente invenção descreve sistemas deliberação controlada contendo diacetato, dicloridrato e digluconato declorexidina puros ou livres e em forma de compostos de inclusão, emciclodextrina, em proporção molar que pode variar de 1:1 a4:1(ciclodextrina/digluconato de clorexidina ou diacetato de clorexidina oudicloridrato de clorexidina), não restrito.

A presente invenção, que, pode ser melhor entendida através dosseguintes exemplo, não limitantes:

Exemplo 1 - Obtenção dos compostos de inclusão entre a β-ciclodextrinae a clorexidina

Inicialmente foram dissolvidos 0,6 mmol de β-ciclodextrina em 10 ml_ deágua sob agitação e temperatura entre 40-50°C. Em seguida foramadicionados 0,3 mmol de diacetato de clorexidina (CxA) dissolvidos em 10 mLde água sobre a solução de β-ciclodextrina (Pcd). A mistura permaneceu emagitação, por aproximadamente 24 horas. Após esse período a mistura foicongelada em nitrogênio líquido e submetida ao processo de liofilização por 48h, obtendo-se assim o composto de inclusão.

O processo foi repetido para a obtenção do composto de inclusãoutilizando o digluconato de clorexidina (CxG)1 nas mesmas proporções molaresdescritas acima. Assim, foram obtidos os compostos de inclusão: PcdCxA (β-ciclodextrina/diacetato de clorexidina) e PcdCxG (β-ciclodextrina/digluconato declorexidina), na proporção molar 2:1.

Com o objetivo de comparação, foram preparadas as respectivasmisturas mecânicas nas mesmas proporções molares dos compostos deinclusão (2:1) entre a β-ciclodextrina e o diacetato e o digluconato declorexidina.

Exemplo 2 - Obtenção dos sistemas sílica porosa/clorexidina

A sílica porosa (S) foi pulverizada e adicionada a uma solução aquosade diacetato de clorexidina a 2,0% formando uma suspensão numa proporção2:1 p/p (CxA.S), a qual ficou sob agitação magnética por 60 horas, àtemperatura ambiente.

Após a centrifugação por 10 minutos a 16000 rpm, o materialsedimentado foi lavado com água destilada 3 vezes para remoção daclorexidina não adsorvida e secado em estufa à vácuo a 40°C, por 3horas.

O processo foi repetido utilizando uma solução a 2% de digluconato declorexidina, à qual foi misturada a sílica porosa mantendo-se a proporção 2:1fármaco/sílica, como descrito acima. Assim, foram obtidos 2 sistemas: SCxA(sílica porosa:CxA) e SCxG (sílica porosa:CxG).

Exemplo 3 - Obtenção dos sistemas sílica porosa/compostos de inclusãoP-ciclodextrina:clorexidina

A preparação foi realizada de acordo com o método supracitado, nasmesmas proporções molares, utilizando os compostos de inclusãoPcd/clorexidina previamente preparados com o diacetato e o digluconato declorexidina. Foram obtidos os 2 sistemas: SpcdCxA (sílica porosa (S) e P-ciclodextrina (Pcd):diacetato de clorexidina (CxA)) e SpcdCxG (sílica porosa ePcd: digluconato de clorexidina (CxG)).

Tabela 1- Taxa de incorporação (% p/p) de sais de acetato e de gluconato declorexidina e seus compostos de inclusão em β-ciclodextrina (Pcd), na sílicaporosa (S).

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Para todos os sistemas a taxa de incorporação obtida foi semelhanteaos valores encontrados na literatura para carreadores baseados na sílicaporosa. Observa-se que a maior taxa foi obtida para o sistema preparado comCxA (22,6%).

Como todos os sistemas foram preparados sob as mesmas condições, enas mesmas proporções molares, as diferenças entre as taxas de incorporaçãopoderiam estar associadas à relação entre o tamanho da molécula do fármacoe dos compostos de inclusão, e o diâmetro do poro da matriz de sílica, pois ataxa de incorporação de um fármaco a uma matriz porosa diminui quando otamanho da molécula aumenta, bem como com a diferença entre a afinidadefísico-química entre o fármaco e a matriz.

A análise por adsorção/dessorção de N2, mostrou que o volume total dosporos diminuiu significativamente para todas os sistemas SPcdCxA, SpcdCxG,SCxG e SCxA nesta ordem, em relação a sílica porosa pura, indicando quedurante o processo de incorporação do fármaco, os poros antes livrespassaram a ficar ocupados pelo fármaco, havendo menor adsorção do N2.Concomitante à diminuição do volume dos poros, observou-se uma diminuiçãono diâmetro dos poros de todas as amostras nesta ordem:

SpcdCxG<SpcdCxA<SCxG< SCxA1 como esperado após o processo deincorporação do fármaco.

Exemplo 4 - Incorporação dos sistemas SCxA, SCxGl SpcdCxA eSpcdCxG obtidos ao cimento resinoso

Para os testes de liberação controlada, os cimentos modificados forampreparados usando o cimento Cement-Post (Angelus®)(C) através de métodoconhecido no estado da técnica. Este cimento compõe-se de uma pasta base(contendo cerâmica de vidro de Bário, sílica pirogênica, bis-GMA (bis-fenolglicidil dimetacrilato), TEGDMA (tetraetilenoglicol dimetacrilato), BHT,aceleradores de polimerização e pigmentos) e uma pasta catalisadora(contendo cerâmica de vidro de Bário, sílica pirogênica, bis-GMA,TEGDMA,peróxido de benzoíla e estabilizantes) que foram misturadas em proporçõesiguais p/p (55 mg de cada pasta). Os sistemas (SCxA1 SCxG1 SpcdCxA eSpcdCxG), foram pesados de forma a conter cerca de 0,7 μιτιοΙ de clorexidina,e posteriormente adicionados à pasta base. Em seguida, os materiais pesadosforam misturados à pasta catalisadora com espátula plástica, fazendo-se amanipulação de acordo com as especificações do fabricante. Os cimentosmodificados obtidos, denominados CSCxA, CSCxG, CSpcdCxA e CSpcdCxG,foram transferidos para um molde, medindo 2 mm de diâmetro por 3 mm deprofundidade, onde ocorreu a polimerização. Para os testes de viabilidade eproliferação celular utilizou-se um molde de 1,5 mm de diâmetro por 2 mm deprofundidade, 0,3 μητιοΙ de clorexidina e 25 mg de cada pasta do cimento. Osdiscos para os testes antimicrobianos de difusão em ágar foram conformadosnum molde medindo 5mm de diâmetro por 1mm de profundidade, e forampreparados com 0,05 - 1,5 μιτιοΙ de clorexidina para cada 50 mg de cimento(25mg de pasta base e 25mg de pasta catalisadora).

Para efeito de comparação, foram preparados simultaneamente outroscorpos de prova para serem submetidos aos mesmos testes, mantendo asmesmas proporções molares, contendo os agentes antimicrobianos puros, eforam denominados: CCxA1 CCxG1 CpcdCxA e CpcdCxG.

Exemplo 5 - Estudo da liberação da clorexidina

Inicialmente foram pesados, em triplicata, cerca de 10 mg de cadasistema sílica porosa:clorexidina obtido: sílica porosa:diacetato de clorexidina(SCxA), sílica porosa:digluconato de clorexidina (SCxG), sílicaporosa:composto de inclusão com diacetato de clorexidina (SpcdCxA) e sílicaporosa:composto de inclusão com digluconato de clorexidina (SpcdCxG).

Cada 10 mg de sistema carreador contendo o agente antimicrobiano foicolocado em tubos Eppendorf, contendo 1,5 mL de água destilada e mantidossob agitação constante de 82 rpm, à temperatura de 37°C. Após a primeirahora, os tubos foram centrifugados e coletados 1,5 mL de cada um eadicionados mais 1,5 mL de água destilada. Este procedimento foi realizado de1 em 1 hora durante as primeiras oito horas após o início do experimento, e apartir daí a cada 24 horas chegando até 750 horas (cerca de 31 dias). AsFiguras 1 e 2 apresentam as curvas de liberação controlada da clorexidina apartir dos sistemas SCxA1 SpcdCxA e SCxG1 SpcdCxG1 respectivamente, emfunção do tempo em horas.

Os sistemas SCxA e SpcdCxA apresentaram liberação controlada declorexidina até cerca de 750 horas, sendo que o sistema SCxA apresentou um"efeito explosão" inicial de 7% (0,13 mg) nas primeiras 8 horas, e mais 10%(0,18 mg) de liberação até 400 horas, alcançando patamar de 23% (0,42 mg)até 750 horas. Já o sistema SPcdCxA apresentou um maior efeito "explosãoinicial" com 17,5% (0,067 mg) de liberação até 8 horas, com mais 11% (0,041mg) de liberação até 400 horas, alcançando 33% (0,13 mg) até 750 horas.

Os sistemas SCxG e SPcdCxG também apresentaram efeito "explosãoinicial" de 11% (0,12 mg) e de 50% (0,125 mg), respectivamente. Após asprimeiras 8 horas, a liberação alcançou 17% (0,18mg) para SCxG e 70% (0,18mg) para SpcdCxG até 360 horas. Os sistemas SCxG e SpcdCxGapresentaram maior efeito "explosão inicial" e liberação mais rápida até 360horas, o que pode ser atribuído, principalmente, à maior solubilidade dodigluconato de clorexidina em água (é totalmente miscível), quando comparadoà solubilidade do diacetato que é 1/55 em água, ou 60 mmol/L (MARTINDALE,W., The extra Pharmacopeia, 28 ed, London: The Pharmaceutical Press, 106-110, 1982).

Os sistemas baseados na sílica porosa foram capazes de manter umaliberação controlada de clorexidina por até 31 dias, tanto na forma livre, comona forma de composto de inclusão.

Exemplo 6 - Liberação controlada da clorexidina a partir doscimentos modificados

Cada corpo de prova contendo os sistemas preparados, em triplicata(CSCxA, CSCxG, CSpcdCxA e CSpcdCxG) foi colocado em tubos Eppendorf,contendo 1,5 mL de água destilada e mantido sob agitação constante de 82rpm, à temperatura de 37°C. Após a primeira hora, os tubos foramcentrifugados e coletados 1,5 mL de cada um e adicionados mais 1,5 mL deágua destilada. Este procedimento foi realizado de 1 em 1 hora durante asprimeiras oito horas após o início do experimento, e a partir daí a cada 24horas chegando até 500 horas.

Para efeito de comparação, o experimento foi realizado simultânea eigualmente em triplicata utilizando corpos de prova contendo os agentesantimicrobianos sem sílica CCxA, CCxG, CpcdCxA e CpcdCxG. As Figuras 3 e4 apresentam as curvas de liberação controlada de clorexidina a partir doscimentos modificados obtidos após a incorporação dos sistemas de liberaçãocontrolada à base de sílica, CSCxA, CSCxG, CSpcdCxA, e CSpcdCxG, eobtidos após a incorporação dos agentes antimicrobianos sem sílica, CCxA,CCxG, CPcdCxA, e CPcdCxG, respectivamente, em função do tempo emhoras.

Os cimentos modificados, contendo os sistemas de liberação controladade clorexidina, baseados na sílica apresentaram efeito "explosão inicial" de45% (0,16 mg) para CSCxA, 55% (0,19 mg) para CSpcdCxA, 55% (0,19 mg)para CSCxG e 62% (0,22 mg) para CSpcdCxG, nas primeiras 8 horas. A partirdaí, os cimentos CSCxA, CSpcdCxA, CSCxG e CSpcdCxG mostraramliberação controlada alcançando 72% (0,25 mg), 92% (0,32mg), 96% (0,34 mg)e 99% (0,35 mg) de massa cumulativa, respectivamente, até 400 horas (cercade 15 dias). Para os cimentos modificados CSCxG e CSpcdCxG observou-seuma liberação mais rápida.

Os cimentos modificados CCxA, CPcdCxA, CCxG e CpcdCxGpreparados com os agentes antimicrobianos sem sílica, mostraram liberaçãode 74% (0,26mg), 63% (0,22mg), 75% (0,26mg e 64% (0,22mg) de clorexidina,respectivamente, nas primeiras 8 horas. A partir daí, até 160 horas, CCxACpcdCxA, CCxG e CpcdCxG, e alcançaram 81% (0,28mg), 72% (0,25mg),85% (0,3mg) e 78% (0,27mg) de massa cumulativa liberada, respectivamente.Observa-se que todos esses cimentos tiveram pouca liberação (cerca de 10%)após as primeiras 24 horas. As curvas apresentam perfis semelhantes comliberação em dois estágios.

Pode-se dizer que a incorporação do fármaco ao cimento resinosopreviamente incorporado à matriz de sílica porosa, modulou a liberação daclorexidina, permitindo a sua liberação de forma lenta e controlada por muitomais tempo. Vale a pena salientar que, esses sistemas apresentaram essesresultados utilizando uma concentração bem mais baixa do agenteantimicrobiano, cerca de 0,3% p/p, quando comparado aos valores usualmenterelatados na literatura que variam de 1 a 5%.

De fato, pode-se dizer que a incorporação dos sistemas de liberaçãobaseados na sílica porosa é muito promissora, pois sugere solucionar um dosdesafios da incorporação da clorexidina a materiais resinosos, que é a suainteração química com a matriz polimérica. Por estar incorporada à sílica, que écompatível com a matriz polimérica, a clorexidina ficaria protegida, impedindoou minimizando sua ligação à matriz bem como sua precipitação.

Exemplo 7 - Determinação da atividade antimicrobiana dos sistemaspreparados (SCxA, SCxG, SpcdCxA e SpcdCxG

Para o cultivo dos microrganismos Enterococcus faecalis (ATCC 14508)e Candida albicans (ATCC 18803) foram utilizados os caldos BHI (Brain Heartlnfusion) e Sabouraud Dextrosado (Biobrás®), respectivamente, e ágar MüllerHinton (Biobrás®). Os sistemas SCxA1 SCxG1 SPcdCxA e SpcdCxG foramcolocados em água e avaliados em triplicata nas concentrações 100, 50 e25pg/mL de clorexidina. Foram utilizados como controle na avaliação daatividade antimicrobiana os antimicrobianos sem sílica: CxA1 CxG, PcdCxA ePcdCxG. Os microorganismos E.f. e C.a. foram previamente cultivados emcaldo BHI e caldo Sabouraud dextrosado, respectivamente por 24 horas. Asamostras foram ajustadas por espectrofotometria (λ= 580nm) de acordo com aescala McFarIand para uma concentração final de 1,5x10® UFC/mL (Unidadesformadoras de colônias). Alíquotas de 5 μΙ_ das cepas testadas foramcolocadas no meio de cultura contendo o antimicrobiano. As amostras foramcultivadas em estufa a 37°C e 34°C para o E.f. e C.a., respectivamente, por 24horas. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.

A Tabela 2 apresenta os resultados quanto à inibição do crescimento deculturas de Enterococcus faecalis e Candida albicans pelos sistemas SCxA1SCxG, SpcdCxA e SpcdCxG, e agentes antimicrobianos sem sílica CxA1 CxG1PcdCxA e PcdCxG pelo método "Pour plate".

Tabela 2- Concentração inibitóriaioo (pg/mL) do crescimento de culturas deEnterococcus faecalis (ATCC 14508) e Candida albicans (ATCC 18803) pelossistemas SCxA, SCxG, SPcdCxA e SPcdCxG e agentes antimicrobianos purosCxA, CxG, PcdCxA e PcdCxG pelo método "Pour plate".

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Todos os sistemas mostraram inibição frente aos microorganismostestados. Frente ao Enterococcus faecalis, o sistema com sílica SPcdCxGmostrou a menor concentração inibitória (25 pg/mL), assim como o PcdCxA(sem sílica).

Frente a Candida albicans todos os sistemas com sílica apresentaram amesma concentração inibitória de 50 pg/mL. Para os agentes antimicrobianossem sílica observa-se que o melhor resultado, 25 pg/mL, foi obtido para oscompostos de inclusão PcdCxA e PcdCxG.

Pelo teste KrusKaI-WaIIis, não paramétrico (p<0,05), não houvediferenças estatisticamente significativas entre os grupos, tanto para o E.f.quanto para a C.a..

Numa primeira análise, as concentrações inibitórias apresentadas pelosagentes antimicrobianos sem sílica, parecem menores que aquelas para ossistemas preparados na base da sílica porosa. Entretanto, é relevante salientarque, nos meios contendo os sistemas de liberação baseados na sílica, aconcentração real de clorexidina, após as 24 horas de experimento é de: 4,9pg/mL para SCxA, 13,9 pg/mL SpcdCxA, 3,4 pg/mL para SCxG e 4,7 pg/mLpara SPcdCxG, baseado nos dados de liberação controlada até 24 horas.

Então, esses sistemas apresentam alta efetividade antimicrobiana, em faixasde concentrações inibitórias menores que aquelas apresentadas pelosantimicrobianos sem sílica.

Assim, sugere-se que estes resultados estejam associados àcaracterística nanoparticulada da sílica, que pode ter facilitado a difusão dofármaco e sua ação antimicrobiana frente os microorganismos testados.Exemplo 8 - Determinação da atividade antimicrobiana doscimentos modificados CSCxA, CSCxG, CSpcdCxA e CSpcdCxG.

Para o teste de difusão em ágar foram utilizados corpos de prova comcimento Cement-Post em forma de disco, contendo 0,2 pmol (100pg) declorexidina por 50mg de cimento contendo os sistemas previamentepreparados: CSCxA, CSCxG, CSβcdCxA e CSpcdCxG. Como controle, foramutilizados outros corpos de prova contendo os agentes antimicrobianos semsílica: CCxA, CCxG, CpcdCxA e CpcdCxG. Os corpos de prova esterilizadosforam distribuídos na superfície das placas preparadas de maneira simétrica,respeitando-se a distância de 15 mm entre cada um deles e a borda da placa.

Todas as placas foram incubadas em condições de microaerofilia e aerofilia, a37°C e 34°C para o E.f. e C.a., respectivamente, em estufa bacteriológica, por24 horas. Todos os testes foram realizados em triplicata. A atividadeantimicrobiana dos agentes testados foi avaliada pela medida dos halos deinibição formados em torno dos corpos de prova. Os resultados obtidos estãoapresentados na Tabela 3.

Tabela 3- Diâmetro dos halos de inibição frente a culturas de E. f. e C. a. nostestes de difusão em ágar para os dispositivos CSCxA, CSCxG1 CSPcdCxA eCSpcdCxG e para os agentes antimicrobianos puros incluídos no cimentoCCxA, CCxG, CpcdCxA e CpcdCxG .

<table>table see original document page 25</column></row><table>Houve formação do halo de inibição do crescimento microbiano paratodos os materiais testados. Frente ao Enterococcus faecalis, os cimentosmodificados pelos sistemas com sílica, CSCxA, CSCxG, CSpcdCxA eCSPcdCxG, apresentaram halos de inibição medindo 7, 8, 14, e 14 mm,respectivamente. Aqueles cimentos contendo os agentes antimicrobianos semsílica, CCxA1 CpcdCxG, CPcdCxA e CCxG1 mostraram halos de inibiçãomaiores, 14, 15, 16 e 18mm, respectivamente.

Houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos demateriais testados (teste Kruskal-Wallis não paramétrico, p<0,01).

Frente a Candida albicans, o padrão de inibição foi o mesmo. Oscimentos modificados CSCxA1 CSCxG, CSpcdCxA e CSpcdCxG mostraramzonas de inibição medindo 7, 7, 13, e 13 mm, respectivamente, todas menoresque aquelas observadas para CCxA, CpcdCxG, CpcdCxA e CCxG, mostrandohalos de 13, 15, 16 e 18 mm, respectivamente.

Houve diferença estatisticamente significativa, entre os grupos (testeKruskal-Wallis não paramétrico, p<0,01).

Analisando os resultados conjuntamente para os dois microorganismos,entre os cimentos modificados contendo sistemas com sílica, CSpcdCxA eCSpcdCxG, apresentaram maior efetividade antimicrobiana. Este fato deve-seà maior quantidade de fármaco liberado a partir dos compostos de inclusão, deacordo com curvas de liberação (Figura 3). A massa cumulativa de clorexidinaliberada até 24 horas para esses sistemas é cerca de 0,055 mg paraCSPcdCxA e 0,065 mg para CSpcdCxG. Novamente, devemos considerar queos meios de liberação dos experimentos são diferentes (água e ágar), e oscálculos de massa cumulativa liberada para os testes de difusão em ágar foramfeitos baseado nos valores obtidos a partir da liberação em água.

Todos os cimentos modificados com agentes antimicrobianos sem sílica,foram mais efetivos que aqueles modificados com os sistemas à base de sílicaporosa tanto para o E. f. como para C. a., o que pode ser atribuído ao maiorefeito "explosão inicial" (Figura 4), correspondendo à liberação de cerca de0,074 mg de clorexidina para CCxA, 0,075 mg para CCxG, 0,063 mg paraCpcdCxA e 0,065 mg para CpcdCxG, durante as 24 horas de experimento. Osmicroorganismos testados foram mais susceptíveis ao cimento modificado comdigluconato livre, CCxG.

A incorporação de clorexidina 1% ou em concentrações maiores emmateriais resinosos mostrou clara inibição do crescimento antibacteriano,entretanto a sua liberação ocorreu rapidamente em poucos dias, seguido deuma drástica redução de sua concentração. Esse resultado coaduna comaqueles relatados por ADDY et al. (ADDY, M., THAW1 M. In vitro studies intothe release of chlorhexidine acetate, predonisolone sodium phosphate, andpredonisolone alcohol from cold cure denture base acrylic. J Biomed MaterRes, 16, 2, 145-157, 19882) e WILSON et al. (WILSON, S.J., WILSON, H.J. Therelease of chlorhexidine from modified dental acrylic resin. J Oral Rehabil, 20, 3,311-319,1993).

Os cimentos modificados, deste exemplo, apresentavam concentração deapenas 0, 2% p/p de clorexidina.

Exemplo 9 - Testes de viabilidade e proliferação celular

A citotoxicidade foi avaliada por meio do ensaio do MTT que determinaa capacidade de metabolização do sal de tetrazólio [brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio] pelas enzimas desidrogenases, queproduzem cristais de Formazan ao final da reação. Tais cristais produzem umareação de cor característica que pode ser quantificada através da leitura emespectrofotômetro.

As células utilizadas neste ensaio foram obtidas de uma cultura primáriade osteoblastos da calota craniana de camundongo na 4a passagem. Ososteoblastos foram semeados (106 células/poço) em placas de 24 poços,acrescidos de meio DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Médium) + 10% SoroBovino Fetal (SFB) antibiótico antifúngico (Sigma®), e incubadas em estufa, a37°C, 5% CO2, por 48 h, em placas de 75 cm2, para aderência das células.

Após esse tempo, observou-se boa aderência e aspectos morfológicoscaracterísticos de osteoblastos. O meio de cultura foi removido e os poçosforam lavados com 1mL de solução de PBS 0,15M para remoção de quaisquercélulas não aderidas. Então, as células foram: 1- mantidas na ausência dosmateriais em teste, identificados como grupos controle positivo, 2- expostasaos materiais em teste para comparação de todos os materiais separadamente(sílica pura, cimento puro, CxA, CxG, 3cdCxA, PcdCxG, SCxA, SCxG,SpcdCxA, SPcdCxG) e 3- expostas aos corpos de prova dos cimentosmodificados a serem testados (CSCxA, CSCxG, CSpcdCxA e CSpcdCxG). Osmateriais a serem testados foram re-suspendidos (quando estavam na foramde pó) em 1mL de meio de manutenção (DMEM sem SFB) e os corpos deprova dos dispositivos foram adicionados a cada poço já contendo 1mL demeio de manutenção (DMEM sem SFB). Todas as amostras foram testadas emtriplicata, inclusive o controle positivo. Após 48h de cultivo em estufa a 37°C,5% CO2, o meio contendo os materiais em teste foi removido e as célulasforam lavadas cuidadosamente, duas vezes, com 1mL de PBS 0,15M, pararemoção de qualquer remanescente de material em teste. A partir daí, foramacrescidos em cada poço, 30 μl de solução de MTT (na concentração de PBS15 mg/mL) + 300 μl DMEM + 10% SFB e a placa foi incubada durante 4 horas,em estufa a 37°C, 5% CO2.

A Tabela 4 apresenta os valores de redução na proliferação e viabilidadecelular de outros materiais resinosos cimentantes de uso odontológico.Tabela 4- Valores de redução na proliferação e viabilidade celular de outrosmateriais resinosos cimentantes de uso odontológico.

<table>table see original document page 28</column></row><table>

(a: AMES, J.M., et al. Contemporary methacrylate resin-based root canal sealers exhibitdifferent degrees of ex vivo cytotoxicity when cured in their self-cured mode. J Endod, 35, 2,225-228, 2009 b: MENDONÇA, A.A.M. et al. Citotoxic effects of hard setting cements appliedon the odontoblastic cell Iine MDPC-23. Oral Surg1 Oral Med1 Oral Pathol1 Oral Radiol1 OralEndod, 104, 4, e102-e108, 2007)A Tabela 5 apresenta os dados obtidos, relativos à redução naproliferação e viabilidade celular dos osteoblastos, em percentagem, para osmateriais testados, obtidos após conversão dos dados de absorvância do testeMTT.

Tabela 5- Redução na proliferação e viabilidade celular dos osteoblastos paraos materiais testados, em percentagem.

Redução na viabilidade e proliferação celular (%)

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A concentração de cada material foi 0,3 pmol/poço (15(^g/mL), excetopara a sílica que foi 100 mg, e para o cimento puro 50mg. Observa-se que asílica porosa pura não apresentou citotoxicidade, mostrando 100% deviabilidade e proliferação celular, assim como o controle positivo de células,concordando com os dados da literatura quanto à biocompatibilidade destematerial, (SLOWING et al., Mesoporous silica nanoparticles as controlledrelease drug delivery and gene transfection carriers. Adv Drug Deliv Rev, 60,11, 1278-1288, 2008).

Dentre os agentes antimicrobianos sem sílica, o mais citotóxico foi oPcdCxG (23% de redução na proliferação celular) e PcdCxA o maisbiocompatível. Este resultado concorda com a maior solubilidade dodigluconato de clorexidina, como discutido anteriormente. A análise estatística(ANOVA) para este grupo mostrou diferenças estatisticamente significativaspara PcdCxG e CxG (p<0,05).Após a incorporação destes agentes à sílica, houve redução naviabilidade celular, uma vez que as porcentagens para SPcdCxG, SpcdCxA,SCxG1 e SCxA aumentaram para 25,5%, 20,5%, 18%, e 15%, respectivamente.O sistema contendo PcdCxG mostrou maior redução na viabilidade celular,como observado para o antimicrobiano sem sílica. Houve diferençaestatisticamente significativa entre esses grupos (ANOVA, p<0,05).

O cimento puro Cement-Post mostrou 22,3% de redução na viabilidadecelular, e para os cimentos modificados temos que a redução foi de 41,7% paraCSpcdCxA, 39,4% para CSCxG, 32,8% para CSpcdCxG e 25,5% para CSCxA.Todos os valores são maiores que aqueles apresentados pelos sistemas eagentes antimicrobianos sem sílica. A análise estatística (ANOVA, p<0,05)mostrou diferença estatisticamente significativa entre os cimentos modificadose o controle positivo.

O cimento puro mostrou toxicidade aos osteoblastos, cerca 22,3%,possivelmente devido à liberação de monômeros residuais. Subtraindo-seesse valor do total obtido para cada cimento modificado, obteríamos: 3,3%,17,1%, 19,4%, e 10,5% para CSCxA, CSCxG, CSpcdCxA1 CSpcdCxG e,respectivamente. Esses valores são comparáveis aos obtidos para os sistemase agentes antimicrobianos sem sílica.

Mendonça e colaboradores relataram uma redução de 78,1% naatividade metabólica de odontoblastos para o cimento Rely X e 2,64% para oRely X UNICEM, após 24 horas, e 79,04% e 10,51%, após 7 dias,respectivamente (MENDONÇA, Α. A. M. et al. Citotoxic effects of hard settingcements applied on the odontoblastic cell Iine MDPC-23. Oral Surg Oral MedOral Pathol Oral Radiol Oral Endod, 104, 4, e102-e108, 2007). Outrasavaliações sobre cimento de uso intracanal resinosos também detectaram umalto potencial citotóxico destes materiais contendo metacrilatos (PINNA, L. et alIn vitro citotoxicity evaluation of a self-adhesive, mathacrylate resin-based rootcanal sealer. J Endod, 34, 9, 1085-1088, 2008; AMES, J.M. et al.Contemporary methacrylate resin-based root canal sealers exhibit differentdegrees of ex vivo cytotoxicity when cured in their self-cured mode. J Endod,35, 2, 225-228,2009). Comparando-se esses valores com o padrão decitotoxicidade dos cimentos modificados deste estudo demonstraram maiorviabilidade celular que aquele apresentado pelo Rely X, EndoRez, Real Seal, emenor viabilidade que o Rely X UNICEM.

Os resultados obtidos mostram que, comparados à materiaisamplamente utilizados em condutos intraradiculares, os cimentos modificadosdesenvolvidos apresentam citotoxicidade aceitável. Os resultados obtidosdemonstram que os cimentos modificados CSCxA e CSβcdCxG apresentamboa biocompatibilidade e, portanto, são promissores para utilização in vivo,mais particularmente em cimentações de restaurações, tratamentosendodônticos, fixações de órteses, dispositivos intracorpóreos, dispositivossubcutâneos, sítios cirúrgicos, e outros.

Exemplo 10- Degradação da matriz de sílica porosa

A degradação de matrizes à base de sílica porosa ocorre, em geral, porerosão, havendo hidrólise dos grupos Si-O-Si, formando ácido orto-silícico. Aespectrometria por ionização de plasma é uma técnica que permite a dosagemdo silício em baixas concentrações, sendo por isso uma técnica adequadaneste estudo. A Tabela 6 apresenta as concentrações de Sitotai (mg/L)determinadas através da espectroscopia de ionização de plasma no meiocolhido durante os experimentos de liberação controlada para os sistemasSCxA1 SCxG1 SpcdCxA, e S3cdCxG.Tabela 6- Concentração de Si totai (mg/L) determinadas através daespectroscopia de ionização de plasma no meio colhido durante osexperimentos de liberação controlada para os sistemas SCxA1 SCxG1SpcdCxA1 e SpcdCxG.

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Observa-se que nos primeiros 14 dias os sistemas SCxA (7,9 mg/L) eSPcdCxA (8,3 mg/L) apresentaram maior dissolução quando comparados aossistemas SCxG (2,3 mg/L) e SpcdCxG (2,0 mg/L), e a partir de 15 dias, apenasos 2 primeiros sistemas continuaram a apresentar dissolução da matriz. Essesresultados podem ser compreendidos considerando-se que a sílica não sedissolve de maneira homogênea, mas preferencialmente a partir das regiões deonde a molécula do fármaco foi liberada (ANDERSSON, J. et al. Influences ofmaterial characteristics on ibuprofen drug Ioading and release profiles fromordered micro and mesoporous silica matrices. Chem Mater, 16, 21, 4160-4167, 2004).

A degradação da matriz é uma vantagem adicional deste material, pois oproduto da degradação é biocompatível, inerte para o homem e totalmenteexcretado pelos rins, sugerindo assim uma excelente matriz para a liberaçãocontrolada de fármacos (ZANETTA, M. et al. Ability of polyurethane foams tosupport cell proliferation and the differentiation of MSCs into osteoblasts. ActaBiomater, 5, 4, 1126-1136, 2009). Verifica-se ainda, que em doses até 1,5 g/kgde material degradado não são observadas alterações histológicas no fígado,pulmões ou linfonodos, de acordo com os estudos de KORTESUO, P. et al.Silica xerogel as an implantable carrier for controlled drug delivery- Evaluationof drug distribution and tissue effects after implantation. Biomater, 21, 2, 193-198, 2000.

Claims (16)

1.- PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA DE LIBERAÇÃOCONTROLADA DE CLOREXIDINA E SEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO,caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) incorporação de clorexidina e/ou seus sais em sistemas de sílica porosa;oub) incorporação do composto de inclusão ou associação de clorexidina e/ouseus sais em sistemas de sílica porosa; ec) pesagem dos sistemas obtidos sistema compreendendo uma faixa de-0,05 a 1,5 pmol de clorexidina livre; ed) Incorporação dos sistemas obtidos ao cimento resinoso polimerizável.

2.- PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA DE LIBERAÇÃOCONTROLADA DE CLOREXIDINA E SEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO,de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos sais de clorexidina seremselecionados do grupo consistindo de diacetato, digluconato e cloridrato declorexidina.

3.- PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA DE LIBERAÇÃOCONTROLADA DE CLOREXIDINA E SEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO,de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa "a" compreender aadição de solução a 2% de clorexidina e/ou seus sais à sílica porosamantendo-se a proporção 1:1 a 4:1 p/p fármaco/sílica.

4.- PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA DE LIBERAÇÃOCONTROLADA DE CLOREXIDINA E SEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO,de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa "b" compreendercompostos de inclusão ou associação de clorexidina em ciclodextrinas naproporção molar de 1:1 a 1:5, incorporados em sílica porosa na proporção 1:1 a-4:1 p/p fármaco/sílica.

5.- PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM SISTEMA DE LIBERAÇÃOCONTROLADA DE CLOREXIDINA E SEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO,de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelas ciclodextrinas seremnaturais e/ou sintéticas, selecionadas do grupo compreendendo alfa, beta ougama ciclodextrinas e/ou um derivado selecionado do grupo compreendendoalquil, hidróxialquil, hidróxipropil e acill ciclodextrinas.

6. - SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, caracterizado por compreender sílicaporosa, cimento resinoso polimerizável, clorexidina e/ou seus sais e seuscompostos de inclusão em ciclodextrinas

7. - SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelos sais de clorexidina serem selecionados do grupoconsistindo de diacetato, digluconato e cloridrato de clorexidina

8. - SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelas ciclodextrinas serem naturais e/ou sintéticas,selecionadas do grupo compreendendo alfa, beta ou gama ciclodextrinas e/ouum derivado selecionado do grupo compreendendo alquil, hidróxialquil,hidróxipropil e acill ciclodextrinas.

9. - SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 8,caracterizado por apresentar atividade antimicrobiana contra bactérias efungos, preferencialmente frente aos microrganismos Enterococcus faecalis eCandida albicans

10. - SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 9,caracterizado por conferir proteção ã clorexidina, impedindo ou minimizandosua ligação a materiais resinosos e também sua precipitação.

11. - SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 9,caracterizado pela obtenção de um sistema com perfil de liberação controlada.

12. - SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 11,caracterizado por apresentar produto de degradação da matriz biocompatível.

13.- SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 12,caracterizado por apresentar biocompatibilidadde semelhante ou maior queoutros cimentos resinosos de uso odontológico.

14.- SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 13,caracterizado por apresentar baixa citotoxicidade, comparável com demaiscimentos resinosos de uso odontológico.

15.- SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, caracterizado pelo uso odontológico,preferencialmente na fixação de pino intracanal, na cimentação de cones deguta-percha, na obturação dos sistemas de canais radiculares, na cimentaçãode coroas, pontes, braquetes, restaurações metálicas, resinosas ou cerâmicas,pinos de fibra de vidro, de carbono ou metálicos.

16.- SISTEMA DE LIBERAÇÃO CONTROLADA DE CLOREXIDINA ESEUS COMPOSTOS DE INCLUSÃO, caracterizado pelo uso em fixações deórteses, dispositivos intracorpóreos, reconstruções ósseas, sítios cirúrgicos erecobrimento de superfícies de implantes.