BRPI0904468B1

BRPI0904468B1 - IMMUNOTHERAPY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE OF IMMUNOTHERAPY FOR THE MANUFACTURING OF DRUG FOR USE IN THE TREATMENT OF CANCER

Info

Publication number: BRPI0904468B1
Application number: BRPI0904468-0A
Authority: BR
Inventors: Luciana Cezar De Cerqueira Leite; Ivan Pereira Nascimento; Daher Cezar Chade; Ricardo Carneiro Borra; Fabiola Elizabeth Villanova; Enrico Ferreira Martins De Andrade; Katia Ramos Moreira Leite; Miguel Srougi; Isaías Raw; Priscila Maria De Andrade Borra
Original assignee: Fundação Butantan; Hospital Alemão Oswaldo Cruz
Priority date: 2009-10-07
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2021-07-13
Also published as: BRPI0904468A2

Abstract

imunoterápico, composição farmacêutica e uso de imunoterápico para manufatura de medicamento para uso no tratamento de câncer. a presente invenção refere-se a um imunoterápico que compreende uma cepa de mycobacterium bovis, bacilius calmette guerin (bcg) recombinante que codifica ao menos um antígeno de bordetella pertussis. a presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas que compreendem os imunoterápicos descritos na presente invenção. a presente invenção refere-se ainda ao uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para a manufatura de medicamentos com ação inflamatória e ativação inespecifica do sistema imune para uso no tratamento ou prevenção de câncer.immunotherapeutic, pharmaceutical composition and use of immunotherapeutic for the manufacture of medicine for use in the treatment of cancer. The present invention relates to an immunotherapeutic comprising a recombinant strain of mycobacterium bovis, bacilius calmette guerin (bcg) that encodes at least one bordetella pertussis antigen. the present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising the immunotherapeutics described in the present invention. the present invention further refers to the use of the immunotherapeutics described in the present invention for the manufacture of drugs with inflammatory action and non-specific activation of the immune system for use in the treatment or prevention of cancer.

Description

FIELD OF THE INVENTION

A presente invenção refere-se a um imunoterápico que compreende uma cepa de Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinante que codifica ao menos um antigeno de Bordetella pertussis.The present invention relates to an immunotherapeutic comprising a recombinant Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) strain that encodes at least one Bordetella pertussis antigen.

Em particular a presente invenção refere-se a um imunoterápico que compreende uma cepa de Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinante, auxotrófica para lisina ou outros amino ácidos, complementada com o gene lysA ou outros, e que codifica também um antigeno de Bordetella pertussis, tal como a subunidade 1 da toxina pertussis, S1PT. *In particular, the present invention relates to an immunotherapeutic comprising a recombinant Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) strain, auxotrophic for lysine or other amino acids, complemented with the lysA gene or others, and which also encodes an antigen of Bordetella pertussis, such as pertussis toxin subunit 1, S1PT. *

A presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas que compreendem os imunoterápicos descritos na presente invenção.The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising the immunotherapeutics described in the present invention.

A presente invenção refere-se ainda ao uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para a manufatura de medicamentos com ação inflamatória e ativação inespecifica do sistema imune para uso no tratamento ou prevenção de câncer.The present invention further refers to the use of the immunotherapeutics described in the present invention for the manufacture of drugs with inflammatory action and non-specific activation of the immune system for use in the treatment or prevention of cancer.

FUNDAMENTALS OF THE INVENTION

Do Câncer. O câncer é o resultado de uma série de alterações nos genes que controlam o crescimento e o comportamento celular. Essas alterações provocam um crescimento celular desordenado e continuo, inferindo nessas células anormais a capacidade de invadir tecidos e órgãos adjacentes, bem como a capacidade de migrar e se alojar em outras regiões do organismo (metástase). O câncer pode surgir de qualquer tipo de célula e de qualquer tipo de tecido, não sendo uma doença única, mas um grande número de doenças caracterizadas pelo seu local de origem.Of Cancer. Cancer is the result of a series of changes in genes that control cell growth and behavior. These alterations cause a disordered and continuous cell growth, inferring in these abnormal cells the capacity to invade adjacent tissues and organs, as well as the capacity to migrate and lodge in other regions of the organism (metastasis). Cancer can arise from any type of cell and from any type of tissue, and it is not a single disease, but a large number of diseases characterized by their place of origin.

Dividindo-se rapidamente, estas células anormais tendem a ser muito agressivas e incontroláveis, determinando a formação de tumores ou neoplasias (acúmulo de células cancerosas). Existem centenas de formas distintas, sendo três os principais subtipos: os sarcomas, os carcinomas e os linfomas (leucemias). O câncer é a segunda maior causa de morte de adultos no mundo ocidental, e é uma das principais causas de morte por doença em crianças de 1 a 14 anos.Dividing quickly, these abnormal cells tend to be very aggressive and uncontrollable, causing the formation of tumors or neoplasms (accumulation of cancer cells). There are hundreds of different forms, with three main subtypes: sarcomas, carcinomas and lymphomas (leukemias). Cancer is the second leading cause of adult death in the Western world, and is one of the leading causes of disease death in children aged 1 to 14 years.

Atualmente existem quatro tipos principais de tratamento: cirurgia, radioterapia, quimioterapia e imunoterapia. Essas terapias são largamente utilizadas, podendo ser usadas isoladamente ou em combinação entre si. O determinante para escolha do tratamento dependerá do local, tamanho e fase do tumor, bem como o estado de saúde global do paciente.There are currently four main types of treatment: surgery, radiotherapy, chemotherapy and immunotherapy. These therapies are widely used and can be used alone or in combination with each other. The determinant for choosing the treatment will depend on the location, size and stage of the tumor, as well as the patient's overall health status.

Embora a terapia atual para o câncer dependa, principalmente, do uso de cirurgia, irradiação e quimioterapia, a evolução na compreensão da biologia da transformação maligna e das diferenças no controle da proliferação da célula normal e cancerosa proporcionou a descoberta de novos alvos potenciais para o tratamento do câncer através da imunoterapia, uma vez que nem sempre é possivel garantir a erradicação total das células cancerosas com a utilização de tais terapias.Although current cancer therapy depends mainly on the use of surgery, irradiation and chemotherapy, the evolution in understanding the biology of malignant transformation and the differences in the control of normal and cancer cell proliferation has led to the discovery of new potential targets for cancer. cancer treatment through immunotherapy, since it is not always possible to guarantee the total eradication of cancer cells with the use of such therapies.

Estudos imunológicos revelaram que a progressão da doença tecidual para a forma invasiva do câncer requer células que participam normalmente de processos de cicatrização e outras atividades funcionais, para serem desviadas para o local onde se está iniciando a formação de tecido pré-maligno; essas células são mobilizadas nesse ambiente favorecendo a carcinogênese. Assim compreende-se que um tumor não é apenas um conjunto de células anormais, mas é dependente também de vários fatores como o micro ambiente tumoral que abrange células do tecido imunológico e sinais quimicos que cruzam uma extensa rede de vasos sanguíneos. Esse novo enfoque sobre o câncer reforça a necessidade de erradicar até a última célula cancerosa (Coussens LM, Werb Z. Nature 2002;170:964-969).Immunological studies revealed that the progression of tissue disease to the invasive form of cancer requires cells that normally participate in healing processes and other functional activities, to be diverted to the site where the formation of pre-malignant tissue is starting; these cells are mobilized in this environment, favoring carcinogenesis. Thus, it is understood that a tumor is not only a set of abnormal cells, but is also dependent on several factors such as the tumor microenvironment that encompasses immune tissue cells and chemical signals that cross an extensive network of blood vessels. This new focus on cancer reinforces the need to eradicate every last cancer cell (Coussens LM, Werb Z. Nature 2002;170:964-969).

A resposta imunológica é caracterizada em Thl ou Th2 conforme o padrão de citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4+ e CD8+. A resposta Thl está ligada à imunidade celular inata, que protege o organismo contra agentes patogênicos específicos e toxinas, além de proporcionar ação antitumoral, enquanto que a Th2 favorece a resposta humoral ou adaptativa, que é medida pela ação de anticorpos. As duas respostas interagem entre si, com efeitos inibitórios e/ou regulatório, sendo que em indivíduos acometidos por neoplasias observa-se uma modulação negativa da resposta do tipo celular (Van Kempen LC, et al. Differentiation research in biological diversity 2002;70:610-623).The immune response is characterized as Th1 or Th2 according to the pattern of cytokines produced by CD4+ and CD8+ T lymphocytes. The Thl response is linked to innate cellular immunity, which protects the body against specific pathogens and toxins, in addition to providing an antitumor action, while the Th2 favors the humoral or adaptive response, which is measured by the action of antibodies. The two responses interact with each other, with inhibitory and/or regulatory effects, and in individuals affected by neoplasms there is a negative modulation of the cell-type response (Van Kempen LC, et al. Differentiation research in biological diversity 2002;70:70: 610-623).

Os conhecimentos adquiridos no campo da imunologia, em especial no que se refere à imunidade inata, forneceram importantes indícios da conexão entre inflamação e câncer, transformando completamente o entendimento da fisiopatologia neoplásica. A imunoterapia é hoje utilizada, na tentativa de curar ou modificar o crescimento tumoral através da intensificação da resposta imune do paciente, contra os antígenos tumorais (Mantovani, et al. Nature 2008;454:436-444).The knowledge acquired in the field of immunology, especially with regard to innate immunity, provided important clues to the connection between inflammation and cancer, completely transforming the understanding of neoplastic pathophysiology. Immunotherapy is now used in an attempt to cure or modify tumor growth by enhancing the patient's immune response against tumor antigens (Mantovani, et al. Nature 2008;454:436-444).

Do uso do bacilo de Calmette-Guérin. (BCG) na terapia de câncer.From the use of the Calmette-Guérin bacillus. (BCG) in cancer therapy.

Albert Calmette e Camille Guérin, no inicio do século passado, atenuaram uma cepa virulenta de Mycobacterium bovis. Esta cepa é conhecida atualmente como bacilo de Calmette-Guérin (BCG), tendo sido utilizada como vacina contra a tuberculose em cerca de 3 bilhões de indivíduos em todo o mundo.Albert Calmette and Camille Guérin, at the beginning of the last century, attenuated a virulent strain of Mycobacterium bovis. This strain is currently known as Bacillus Calmette-Guérin (BCG), having been used as a vaccine against tuberculosis in about 3 billion individuals worldwide.

Em 1976, Morales, Eidinger e Bruce foram os primeiros a relatar o sucesso da terapêutica do câncer superficial de bexiga empregando o bacilo de Calmette-Guérin (BCG) (Morales A, Eidinger D, Bruce AW. The Journal of Urology 1976;116:180-183). Desde então, essa imunoterapia na forma de infusão de BCG intravesical vem sendo utilizada para tratar e prevenir a recorrência de tumores superficiais de bexiga (Patente US 5,712,123). O bacilo de Calmette-Guérin (BCG) também tem demonstrado eficácia contra outros tipos de tumores, como por exemplo: melanomas, câncer de pulmão e leucemia (Patente US 5,712,123).In 1976, Morales, Eidinger and Bruce were the first to report the success of superficial bladder cancer therapy using the bacillus Calmette-Guérin (BCG) (Morales A, Eidinger D, Bruce AW. The Journal of Urology 1976;116: 180-183). Since then, this immunotherapy in the form of intravesical BCG infusion has been used to treat and prevent the recurrence of superficial bladder tumors (US Patent 5,712,123). Bacillus Calmette-Guérin (BCG) has also been shown to be effective against other types of tumors, such as melanomas, lung cancer and leukemia (US Patent 5,712,123).

Embora o mecanismo de efeito antitumoral do BCG não esteja completamente definido, há um consenso geral que a aplicação intravesical de BCG causa reação inflamatória não especifica do sistema imune. Deste modo, leva a ativação e infiltração de células T, induzindo predominantemente, a produção de citocinas relacionadas à resposta Thl, maior responsável pelo efeito antitumoral. Há também estimulação da resposta Th2, como a liberação de citocinas IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, o que pode estar relacionado aos efeitos colaterais locais e sistêmicos da imunoterapia intravesical com BCG (Luo Y. et al. Clinicai and experimental immunology 2006;146:181-188).Although the mechanism of antitumor effect of BCG is not completely defined, there is a general consensus that the intravesical application of BCG causes a non-specific inflammatory reaction of the immune system. Thus, it leads to activation and infiltration of T cells, predominantly inducing the production of cytokines related to the Thl response, which is more responsible for the antitumor effect. There is also stimulation of the Th2 response, such as the release of cytokines IL-4, IL-5, IL-6 and IL-10, which may be related to local and systemic side effects of intravesical immunotherapy with BCG (Luo Y. et al. Clinical and experimental immunology 2006;146:181-188).

Cerca de 90% dos tumores vesicais de bexiga são carcinomas de células transicionais (CCT) que surgem no revestimento interno da bexiga chamado de urotélio. Desses, cerca de 75% dos casos apresentam recorrência, onde 45% levam a progressão para doença invasiva (Sylvester RJ. et al. The Journal of Urology 2005;174:86-91).About 90% of bladder bladder tumors are transitional cell carcinomas (TCC) that arise in the inner lining of the bladder called the urothelium. Of these, about 75% of cases present recurrence, where 45% lead to progression to invasive disease (Sylvester RJ. et al. The Journal of Urology 2005;174:86-91).

A terapêutica clinica do câncer vesical baseia-se, principalmente, em fenômenos antineoplásicos decorrentes da estimulação de respostas imunológicas do tipo celular e humoral. Apesar dos recentes avanços na procura por novas terapias, como o uso de Epirrubicina, Doxorrubicina, Gencitabina e Mitomicina C, a aplicação intravesical do BCG continua apresentando a maior eficácia na prevenção de recorrência de progressão tanto do carcinoma urotelial, quanto no carcinoma in situ (CIS) da bexiga. (Bohle, A. et al. The Journal of urology 2003;169:90-95).Clinical therapy for bladder cancer is mainly based on antineoplastic phenomena resulting from the stimulation of cellular and humoral immune responses. Despite recent advances in the search for new therapies, such as the use of Epirubicin, Doxorubicin, Gemcitabine and Mitomycin C, the intravesical application of BCG continues to show the greatest effectiveness in preventing the recurrence of progression of both urothelial carcinoma and carcinoma in situ ( CIS) of the bladder. (Bohle, A. et al. The Journal of urology 2003;169:90-95).

O grande avanço no desenvolvimento de terapêuticas baseadas em modulação da resposta imunológica foi decorrente de pesquisas in vivo. Os modelos animais propiciaram estudos da fisiopatologia, da imunologia do tumor vesical e, inclusive, avaliação de efeitos colaterais frente às novas terapêuticas. O modelo ortotópico singênico utiliza células da linhagem MB-49, provenientes de tumor vesical de camundongo C57BL/6. As células MB-49 são conhecidas por induzir a produção das IL-10 e IL-4 que direcionam o sistema imune para resposta do tipo Th2, dificultando, assim, uma reação antitumoral mais efetiva. Esta importante característica, também, é encontrada em tumores vesicais de humanos, logo, o modelo animal com células MB-49 apresenta resposta imune semelhante ao humano favorecendo os estudos comparativos (Gunther, J. H. et al. Cancer Res 1999;59:2834-2837). Do BCG Recombinante.The great advance in the development of therapies based on modulation of the immune response was the result of in vivo research. Animal models provided studies on the pathophysiology, immunology of the bladder tumor, and even the assessment of side effects in the face of new therapies. The syngeneic orthotopic model uses cells of the MB-49 lineage, originating from a C57BL/6 mouse bladder tumor. MB-49 cells are known to induce the production of IL-10 and IL-4 that direct the immune system to a Th2 type response, thus hindering a more effective antitumor reaction. This important feature is also found in human bladder tumors, so the animal model with MB-49 cells presents an immune response similar to that of humans, favoring comparative studies (Gunther, JH et al. Cancer Res 1999;59:2834-2837 ). From the Recombinant BCG.

O BCG é a vacina mais utilizada no mundo por apresentar resposta imune duradoura e frequência muito baixa de efeitos adversos sérios. Essa e outras características tornam a BCG um excelente candidato a veiculo para apresentação de antigenos heterólogos, tendo em vista uma possivel vacina recombinante baseada em BCG (Patente US 6,673,353).BCG is the most widely used vaccine in the world because of its long-lasting immune response and a very low frequency of serious adverse effects. These and other characteristics make BCG an excellent candidate as a vehicle for the presentation of heterologous antigens, considering a possible recombinant vaccine based on BCG (US Patent 6,673,353).

O mecanismo imunoterápico do BCG ficou melhor compreendido com a identificação dos genes responsáveis pelo efeito antitumoral, possibilitando a produção de organismos recombinantes capazes de estimular resposta Thl mais intensa, visando uma diminuição da dose a ser empregada e, consequentemente, menos efeitos colaterais.The immunotherapeutic mechanism of BCG was better understood with the identification of genes responsible for the antitumor effect, enabling the production of recombinant organisms capable of stimulating a more intense Thl response, aiming at a reduction in the dose to be used and, consequently, fewer side effects.

A expressão de dominios imunogênicos de bactérias, virus e parasitas tem sido utilizado com sucesso no BCG, gerando cepas recombinantes (rBCG), as quais produzem resposta imune não só contra o bacilo da tuberculose, mas também, contra os patógenos cujas proteínas estariam expressas nesse rBCG (Patente US 5,504,005). A adição de uma dominio imunogênico especifico em uma rBCG confere a proteção imunologica especifica esperada, no entanto, reações distintas das que são de conhecimento habitual ainda não foram descritas.The expression of immunogenic domains of bacteria, viruses and parasites has been successfully used in BCG, generating recombinant strains (rBCG), which produce an immune response not only against the tuberculosis bacillus, but also against pathogens whose proteins would be expressed in this rBCG (US Patent 5,504,005). The addition of a specific immunogenic domain in an rBCG confers the expected specific immunological protection, however, reactions distinct from those that are commonly known have not yet been described.

Também já é de conhecimento do estado da técnica a viabilidade do uso da rBCG como estratégia para a expressão de citocinas, agentes farmacológicos e agentes antitumorais, promovendo a base para uma nova estratégia de tratamento de certos tipos de câncer (Patente US 5,776,465). A utilização dessa estratégia confere a rBCG a capacidade de expressar proteinas ou polipeptidios específicos que atuam como inibidores do crescimento celular ou como substâncias citotóxicas para células cancerosas (ex: interferon ot ou β, interleucinas 1-7 ou fator de necrose tumoral α ou β).The state of the art is also aware of the feasibility of using rBCG as a strategy for the expression of cytokines, pharmacological agents and antitumor agents, providing the basis for a new treatment strategy for certain types of cancer (US Patent 5,776,465). The use of this strategy gives rBCG the ability to express specific proteins or polypeptides that act as cell growth inhibitors or as cytotoxic substances for cancer cells (eg interferon ot or β, interleukins 1-7 or tumor necrosis factor α or β) .

Também já foi demonstrado que vacinas rBCG são capazes de promover uma resposta imune tanto humoral quanto celular, sendo uma opção no tratamento de determinados tipos de câncer. A possibilidade de utilizar a rBCG para espressar agentes antitumorais específicos (Patente US 5,776,465) também já é conhecida como uma possivel alternativa no tratamento do câncer. Do rBCG-Pertussis (rBCG-SIPT).It has also been shown that rBCG vaccines are capable of promoting both humoral and cellular immune responses, being an option in the treatment of certain types of cancer. The possibility of using rBCG to express specific antitumor agents (US Patent 5,776,465) is also already known as a possible alternative in the treatment of cancer. From rBCG-Pertussis (rBCG-SIPT).

Bordetella pertussis é uma bactéria que causa uma doença infecciosa do trato respiratório conhecida como coqueluche, pertussis ou "tosse cumprida". Uma vacina celular efetiva contra pertussis foi desenvolvida na década de 40 por Kendrick e colaboradores (Kendrick, P. L. et al. Am. J. Public health 1947;37:803-810). No entanto, esta vacina celular obtida a partir de células inteiras é dificil de ser padronizada e pode produzir efeitos colaterais indesejáveis e por vezes de gravidade considerável. Tais efeitos adversos levaram ao desenvolvimento das vacinas acelulares contra pertussis (Patente US 5,877,298).Bordetella pertussis is a bacterium that causes an infectious disease of the respiratory tract known as whooping cough, pertussis, or "whooping cough". An effective cellular vaccine against pertussis was developed in the 1940s by Kendrick et al. (Kendrick, P.L. et al. Am. J. Public health 1947;37:803-810). However, this cellular vaccine obtained from whole cells is difficult to be standardized and can produce undesirable side effects and sometimes of considerable severity. Such adverse effects have led to the development of acellular pertussis vaccines (US Patent 5,877,298).

A toxina pertussis é um importante fator de virulência e é o principal determinante imunogênico utilizado nas vacinas produzidas atualmente contra a Bordetella pertussis (Sato, Y. & Sato, H. Biologicals 1999;27, 61-69) .The pertussis toxin is an important virulence factor and is the main immunogenic determinant used in vaccines currently produced against Bordetella pertussis (Sato, Y. & Sato, H. Biologicals 1999;27, 61-69) .

No Centro de Biotecnologia do Instituto Butantan, uma vacina de rBCG foi desenvolvida através da expressão da subunidade não-tóxica SI da toxina pertussis (PT) de Bordetella Pertussis utilizando um vetor de expressão de micobactérias, sob o controle do promotor da β-lactamase (pBlaF ) de M. fortuitum, contendo um gene de resistência a kanamicina (Nascimento IP, et al. Infection and immunity 2000;68:4877-4883). O BCG-Pertussis recombinante (rBCG- SIPT) possibilitaram, como esperado uma imunização neonatal contra Pertussis e uma imunização, de mesma eficácia que o BCG, contra a infecção por Mycobacterium tuberculosis (tuberculose) , e como tal, consiste numa variante do BCG tradicional.At the Biotechnology Center of the Butantan Institute, an rBCG vaccine was developed by expressing the non-toxic SI subunit of the pertussis toxin (PT) from Bordetella Pertussis using a mycobacterial expression vector, under the control of the β-lactamase promoter ( pBlaF ) from M. fortuitum, containing a kanamycin resistance gene (Nascimento IP, et al. Infection and immunity 2000;68:4877-4883). Recombinant BCG-Pertussis (rBCG-SIPT) enabled, as expected, a neonatal immunization against Pertussis and an immunization, with the same efficacy as BCG, against Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) infection, and as such, consists of a variant of traditional BCG .

OBJECTIVES OF THE INVENTION

A vacina rBCG-SIPT desenvolvida no Instituto Butantan apresentou o efeito técnico inesperado de provocar uma resposta imune antitumural mais intensa quando comparada com o BCG tradicional. Ou seja, a adição de um dominio imunogênico, como por exemplo, a subunidade não-tóxica SI da toxina pertussis, que sabidamente não tem nenhuma ligação com nenhum tipo de câncer, em uma cepa de BCG, provocou um aumento da resposta imune antitumoral de BCG.The rBCG-SIPT vaccine developed at the Butantan Institute had the unexpected technical effect of eliciting a more intense antitumor immune response when compared to traditional BCG. That is, the addition of an immunogenic domain, such as the non-toxic SI subunit of the pertussis toxin, which is known to have no connection with any type of cancer, in a strain of BCG, caused an increase in the anti-tumor immune response of BCG.

Em vista do exposto, tem a presente invenção o objetivo de prover um imunoterápico que compreende uma cepa de Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinante que codifica ao menos um antigeno de Bordetella pertussis.In view of the above, the present invention has the objective of providing an immunotherapeutic that comprises a recombinant Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) strain that encodes at least one Bordetella pertussis antigen.

Em particular constitui um objetivo da presente invenção, prover um imunoterápico que compreende uma cepa de Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinante, auxotrófica para lisina ou outros amino ácidos, complementada com o gene lysA ou outros, e que contém outro gene que codifica um antigeno de Bordetella pertussis, tal como, mas não limitado, à subunidade 1 da toxina pertussis, S1PT.In particular, it is an objective of the present invention to provide an immunotherapy that comprises a strain of Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinant, auxotrophic for lysine or other amino acids, complemented with the lysA gene or others, and which contains another gene that encodes a Bordetella pertussis antigen, such as, but not limited to, pertussis toxin subunit 1, S1PT.

Constitui um outro objetivo da presente invenção prover composições farmacêuticas que compreendem os imunoterápicos descritos na presente invenção.It is another object of the present invention to provide pharmaceutical compositions comprising the immunotherapeutics described in the present invention.

Constitui um outro objetivo da presente invenção o uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para a manufatura de medicamentos com ação inflamatória e ativação inespecifica do sistema imune para uso no tratamento ou prevenção de câncer.Another objective of the present invention is the use of the immunotherapeutics described in the present invention for the manufacture of drugs with inflammatory action and non-specific activation of the immune system for use in the treatment or prevention of cancer.

DEFINITIONS

No âmbito deste pedido de patente são utilizadas por diversas vezes abreviaturas cujas definições conforme empregues neste pedido se encontram resumidas abaixo: • BCG refere-se ao Mycobacterium bovis atenuado, bacilo de Calmette-Guérin; • BCG-lysA’ refere-se ao BCG auxotrófico para lisina; • PT refere-se à toxina pertussis de Bordetella pertussis; e • S1PT refere-se à subunidade SI da toxina pertussis de Bordetella pertussis.In the scope of this patent application, abbreviations are used several times whose definitions as used in this application are summarized below: • BCG refers to the attenuated Mycobacterium bovis, Calmette-Guérin bacillus; • BCG-lysA’ refers to auxotrophic BCG for lysine; • PT refers to the pertussis toxin from Bordetella pertussis; and • S1PT refers to the SI subunit of the pertussis toxin from Bordetella pertussis.

DESCRIPTION OF THE FIGURES

As figuras a seguir fazem parte do presente relatório e estão aqui inclusas a fim de ilustrar determinados aspectos da invenção. O objeto da presente invenção pode ser melhor entendido com referência a uma ou mais dessas figuras, em combinação com a descrição detalhada da modalidade preferida aqui apresentada.The following figures form part of this report and are included here to illustrate certain aspects of the invention. The object of the present invention can be better understood with reference to one or more of these figures, in combination with the detailed description of the preferred embodiment presented herein.

A Figura 1 mostra o nivel de expressão de S1PT em ambos os vetores pNL71-SlPT e pNL7lSl-lysA-kan’. Os extratos totais de BCG e rBCG (30 μg) foram analisados por Western blotting usando um anticorpo policlonal anti-PT, sendo: 1)BCG; 2)rBCG-SIPT; 3 e 4) rBCG-lysA’-SllysA+kan~.Figure 1 shows the expression level of S1PT in both pNL71-SlPT and pNL7lSl-lysA-kan’ vectors. The total extracts of BCG and rBCG (30 μg) were analyzed by Western blotting using a polyclonal anti-PT antibody, as follows: 1)BCG; 2)rBCG-SIPT; 3 and 4) rBCG-lysA’-SllysA+kan~.

A Figura 2 mostra o peso médio das bexigas nos grupos que receberam implante de células tumorais MB49 e foram tratados com imunoterápicos.Figure 2 shows the mean weight of bladders in the groups that received MB49 tumor cell implants and were treated with immunotherapeutics.

A Figura 3 mostra a expressão gênica relativa (GAPDH), quantificada por Real Time PCR, dos padrões de resposta imune dos grupos que receberam imunoterápicos após o implante intravesical tumoral.Figure 3 shows the relative gene expression (GAPDH), quantified by Real Time PCR, of the immune response patterns of the groups that received immunotherapeutics after intravesical tumor implantation.

A Figura 4 mostra a viabilidade das células tumorais MB4 9 em co-cultura com esplenócitos de camundongos tratados com BCG, rBCG-SIPT ou SF.Figure 4 shows the viability of MB49 tumor cells in co-culture with splenocytes from mice treated with BCG, rBCG-SIPT or SF.

A Figura 5 mostra a sobrevida dos camundongos tratados com BCG, rBCG-SIPT ou SF, após implante intravesical de células tumorais MB49.Figure 5 shows the survival of mice treated with BCG, rBCG-SIPT or SF after intravesical implantation of MB49 tumor cells.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Descrição dos imunoterápicos. A presente invenção refere-se à imunoterápicos que compreendem uma cepa de Mycobacterium bovis, bacillus Calmette Guerin (BCG), recombinante que codifica ao menos um antigeno de Bordetella pertussis.Description of immunotherapeutics. The present invention relates to immunotherapeutics comprising a strain of Mycobacterium bovis, bacillus Calmette Guerin (BCG), recombinant that encodes at least one Bordetella pertussis antigen.

Preferencialmente a cepa de Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinante é auxotrófica complementada.Preferably the Mycobacterium bovis, recombinant Bacillus Calmette Guerin (BCG) strain is complemented auxotrophic.

Ainda mais preferencialmente a cepa de Mycobacterium bovis, Bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinante é auxotrófica para lisina e complementada com o gene lysA.Even more preferably the Mycobacterium bovis, recombinant Bacillus Calmette Guerin (BCG) strain is auxotrophic for lysine and complemented with the lysA gene.

Preferencialmente o antigeno de Bordetella pertussis é a subunidade 1 da toxina pertussis, S1PT. O imunoterápico da presente invenção é obtido preferencialmente a partir de uma cepa de BCG, como carreador para apresentação de uma ou mais antigenos de organismos distintos, obtidos e clonados em vetor de expressão em micobactéria e inserido em BCG recombinante por meio de manipulação genética. Propriedades dos imunoterápicos.Preferably the Bordetella pertussis antigen is subunit 1 of the pertussis toxin, S1PT. The immunotherapeutic of the present invention is preferably obtained from a strain of BCG, as a carrier for the presentation of one or more antigens from different organisms, obtained and cloned into a mycobacterial expression vector and inserted into recombinant BCG through genetic manipulation. Properties of immunotherapeutics.

Os imunoterápicos da presente invenção apresentam o efeito técnico inesperado de provocar uma resposta imune antitumural mais intensa quando comparado com o BCG tradicional. Ou seja, adição de um dominio imunogênico, como por exemplo a subunidade não-tóxica SI da toxina pertussis, que sabidamente não tem nenhuma ligação com nenhum tipo de câncer, em uma cepa de BCG, provocou um aumento da resposta imune antitumoral de BCG.The immunotherapeutics of the present invention have the unexpected technical effect of causing a more intense antitumor immune response when compared to traditional BCG. That is, the addition of an immunogenic domain, such as the non-toxic SI subunit of the pertussis toxin, which is known to have no connection with any type of cancer, in a strain of BCG, caused an increase in the anti-tumor immune response of BCG.

Em particular os imunoterápicos da presente invenção promoveram uma diminuição do volume tumoral em modelos animais de tumor vesical.In particular, the immunotherapeutics of the present invention promoted a decrease in tumor volume in animal models of bladder tumor.

Além disso, os imunoterápicos da presente invenção levaram a um aumento significativo da expressão de TNF-ot em relação ao grupo controle, fato este que sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl. Uma vez que o TNF-OÍ é relacionado como sinalizador da ação pro-inflamatória, caracterizando a fase aguda do processo inflamatório desencadeado pelos bacilos, então os imunoterápicos da presente invenção promovem a ativação direta do sistema imune.Furthermore, the immunotherapeutics of the present invention led to a significant increase in the expression of TNF-ot in relation to the control group, a fact that signals a polarized Thl-type response. Since TNF-OI is related as a signaling agent of pro-inflammatory action, characterizing the acute phase of the inflammatory process triggered by the bacilli, then the immunotherapeutic agents of the present invention promote the direct activation of the immune system.

Os imunoterápicos da presente invenção levaram também a um aumento significativo de IL-10, uma interleucina considerada essencial no direcionamento da resposta imune para Th2 e/ou inibição para Thl. O IL-10, também, é importante para modulação negativa da resposta imunológica de hipersensibilidade tardia (Asadullah, K., Sterry, W. and Volk, H. D. Pharmacol Ver 2003;55:241-269). Por outro lado, vários experimentos têm mostrado efeitos diversos em relação ao IL-10 sobre a resposta imune ao câncer. Dependendo do modelo experimental, o IL-10 parece favorecer ou inibir a progressão do tumor. Em neoplasia gástrica, cólon, linfoma, renal há associação ao pior prognóstico. Também, IL-10 esta relacionado diretamente a inibição do desenvolvimento de novos vasos sanguíneos do tumor (Nadlerm, R. et al. Clin Exp Immunol 2003;131:206-216). No entanto, conforme nossos resultados demonstraram que apesar do aumento de IL-10 com o uso do rBCG-SIPT houve aumento significativo da curva de sobrevida e redução do volume tumoral, neste grupo de animais. Especula-se, então, que este aumento de IL-10 foi desencadeado na tentativa de contrabalancear a forte resposta do TNF-α. Sugerimos que o IL-10 esteja participando de um mecanismo compensatório à forte resposta ao TNF-a, sendo um fator limitante ao processo inflamatório excessivo, impedindo seus efeitos deletérios.The immunotherapeutics of the present invention also led to a significant increase in IL-10, an interleukin considered essential in directing the immune response to Th2 and/or inhibition to Th1. IL-10 is also important for down-modulating the delayed hypersensitivity immune response (Asadullah, K., Sterry, W. and Volk, H.D. Pharmacol See 2003;55:241-269). On the other hand, several experiments have shown different effects in relation to IL-10 on the immune response to cancer. Depending on the experimental model, IL-10 appears to favor or inhibit tumor progression. In gastric, colon, lymphoma, renal neoplasms, there is an association with a worse prognosis. Also, IL-10 is directly related to inhibition of tumor new blood vessel development (Nadlerm, R. et al. Clin Exp Immunol 2003;131:206-216). However, according to our results, despite the increase in IL-10 with the use of rBCG-SIPT, there was a significant increase in the survival curve and a reduction in tumor volume in this group of animals. It is speculated, then, that this increase in IL-10 was triggered in an attempt to counterbalance the strong TNF-α response. We suggest that IL-10 is participating in a compensatory mechanism to the strong response to TNF-a, being a limiting factor to the excessive inflammatory process, preventing its deleterious effects.

Além disso, o ensaio de viabilidade celular demonstrou que os esplenócitos dos camundongos tratados com os imunoterápicos da presente invenção foram mais eficientes na destruição das células tumorais. Sugerindo que as citocinas secretadas pelo estimulo dos imunoterápicos da presente invenção com o sistema imune favoreceu uma maior produção de linfócitos BCG-ativados ou outras células efetoras.In addition, the cell viability assay demonstrated that the splenocytes of mice treated with the immunotherapeutics of the present invention were more efficient in destroying tumor cells. Suggesting that the cytokines secreted by the stimulation of the immunotherapeutics of the present invention with the immune system favored a greater production of BCG-activated lymphocytes or other effector cells.

Em resumo, a terapia com os imunoterápicos recombinantes da presente invenção demonstrou beneficios importantes e inesperados no tratamento de tumor vesical, evidenciado pela diminuição de peso da bexiga, que indiretamente se relaciona com menor massa tumoral, e aumento na sobrevida dos camundongos, além de os eplenócitos, dos animais testados exibirem maior citotoxicidade à celúlas MB49.In summary, therapy with the recombinant immunotherapeutics of the present invention demonstrated important and unexpected benefits in the treatment of bladder tumors, evidenced by the decrease in bladder weight, which is indirectly related to a smaller tumor mass, and increased survival in mice, in addition to the eplenocytes from the tested animals exhibit greater cytotoxicity to MB49 cells.

Finalmente podemos concluir que os imunoterápicos da presente invenção ao combinarem BCG e toxinas de outros preferencialmente de Bordetella pertussis gerando uma cepa de BCG recombinante, constituem um novo imunoterápico, mais potente e eficaz que o BCG convencional para o tratamento do câncer de bexiga.Finally, we can conclude that the immunotherapeutics of the present invention, by combining BCG and other toxins, preferably from Bordetella pertussis, generating a recombinant BCG strain, constitute a new immunotherapeutic, more powerful and effective than conventional BCG for the treatment of bladder cancer.

Uses of immunotherapeutics.

Considerando as propriedades dos imunoterápicos da presente invenção descritas acima, constitui um outro aspecto desta invenção, o uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para tratar ou prevenir câncer em animais ou humanos.Considering the properties of the immunotherapeutics of the present invention described above, another aspect of this invention is the use of the immunotherapeutics described in the present invention to treat or prevent cancer in animals or humans.

Em particular, constitui um outro aspecto desta invenção, o uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para tratar ou prevenir câncer de bexiga em animais ou humanos.In particular, another aspect of this invention is the use of the immunotherapeutics described in the present invention to treat or prevent bladder cancer in animals or humans.

Dadas as possibilidades de aplicações terapêuticas dos imunoterápicos descritos na presente invenção, constitui um outro aspecto desta invenção, o uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para a manufatura de medicamentos para uso no tratamento ou prevenção de câncer em animais ou humanos.Given the possibilities of therapeutic applications of the immunotherapeutics described in the present invention, another aspect of this invention is the use of the immunotherapeutics described in the present invention for the manufacture of drugs for use in the treatment or prevention of cancer in animals or humans.

Em particular, constitui um outro aspecto desta invenção, o uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para a manufatura de medicamentos para uso no tratamento ou prevenção de câncer de bexiga em animais ou humanos.In particular, another aspect of this invention is the use of the immunotherapeutics described in the present invention for the manufacture of medicaments for use in the treatment or prevention of bladder cancer in animals or humans.

Constitui ainda um outro objetivo da presente invenção o uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para a manufatura de medicamentos com ação inflamatória e ativação inespecifica do sistema imune para uso no tratamento ou prevenção câncer.Another objective of the present invention is the use of the immunotherapeutics described in the present invention for the manufacture of drugs with inflammatory action and non-specific activation of the immune system for use in the treatment or prevention of cancer.

Constitui ainda um outro objetivo da presente invenção o uso dos imunoterápicos descritos na presente invenção para a manufatura de medicamentos de infusão intravesical.Another objective of the present invention is the use of the immunotherapeutics described in the present invention for the manufacture of intravesical infusion medications.

Constitui também um aspecto desta invenção, composições farmacêuticas que compreendem os imunoterápicos descritos na presente invenção.Pharmaceutical compositions comprising the immunotherapeutics described herein are also an aspect of this invention.

Mais especificamente constitui um outro aspecto desta invenção, composições farmacêuticas que compreendem os imunoterápicos descritos na presente invenção, e um veiculo, excipiente, diluente ou solvente fisiologicamente aceitável.More specifically, pharmaceutical compositions comprising the immunotherapeutics described in the present invention and a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent or solvent constitute another aspect of this invention.

Composições farmacêuticas que compreendem um ou mais imunoterápicos descritos na presente invenção, como ingrediente ativo podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais de combinação farmacêutica [vide Remington's Pharmaceutical Sciences, 18° Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, EUA (1990)]. Tipicamente, uma quantidade do ingrediente ativo será misturada com um excipiente farmaceuticamente aceitável. O excipiente pode ter uma grande variedade de fórmulas dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, intravenosa, oral ou parenteral. As composições podem conter também agentes estabilizantes, preservativos e similares.Pharmaceutical compositions comprising one or more immunotherapeutics described in the present invention as active ingredient can be prepared according to conventional pharmaceutical combination techniques [see Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, USA (1990 )]. Typically, an amount of the active ingredient will be mixed with a pharmaceutically acceptable excipient. The excipient may have a wide variety of formulas depending on the form of preparation desired for administration, for example, intravenous, oral or parenteral. The compositions can also contain stabilizing agents, preservatives and the like.

"Composição farmacêutica" significa porções coerentes, adequadas e fisicamente discretas para administração médica. "Composição farmacêutica na forma de dosagem única" significa unidades fisicamente coerentes, discretas e apropriadas para a administração médica, cada uma contendo uma dose diária ou múltiplas ou um sub-múltiplo de uma dose diária do composto ativo na associação com um excipiente e/ou incluida dentro de uma carteia. Se a composição contém uma dose diária ou, por exemplo, a metade, um terço ou um quarto da dose diária, a composição farmacêutica será administrada uma vez ou, por exemplo, duas, três ou quatro vezes por dia, respectivamente."Pharmaceutical composition" means coherent, suitable and physically discrete portions for medical administration. "Pharmaceutical composition in single dosage form" means physically coherent, discrete and suitable units for medical administration, each containing a daily dose or multiples or a sub-multiple of a daily dose of the active compound in association with an excipient and/or included within a portfolio. If the composition contains a daily dose or, for example, half, a third or a quarter of the daily dose, the pharmaceutical composition will be administered once or, for example, two, three or four times a day, respectively.

O termo "sal", como usado na presente invenção, denota os sais ácidos e/ou básicos, formados com ácidos e/ou bases inorgânicas ou orgânicas, preferivelmente sais básicos. Os sais destes compostos podem ser preparados por técnicas conhecidas no estado da arte. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitantes a, adição de sais inorgânicos e orgânicos, tais como os hidrocloretos, sulfatos, nitratos ou fosfatos e acetatos, trifluoroacetatos, propionatos, succinatos, benzoatos, citratos, tartaratos, fumaratos, maleatos, metano sulfonatos, isotionatos, teofilina acetatos, salicilatos, respectivamente, ou similares. Sais de amónio alquil quaternário baixos, e similares também são apropriados.The term "salt", as used in the present invention, denotes acidic and/or basic salts, formed with inorganic or organic acids and/or bases, preferably basic salts. Salts of these compounds can be prepared by techniques known in the art. Examples of pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, addition of inorganic and organic salts such as hydrochlorides, sulfates, nitrates or phosphates and acetates, trifluoroacetates, propionates, succinates, benzoates, citrates, tartrates, fumarates, maleates, methane sulfonates, isothionates, theophylline acetates, salicylates, respectively, or the like. Lower alkyl quaternary ammonium salts, and the like are also suitable.

Como usado na presente invenção, o emprego do termo "farmaceuticamente aceitável" significa um sólido não- tóxico, inerte, enchimento liquido semi-sólido, diluente, encapsulamento do material, formulação auxiliar de qualquer tipo, ou simplesmente um meio aquoso estéril, tal como salina. Alguns exemplos dos materiais que podem servir como veiculos farmaceuticamente aceitáveis são açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, os amidos, tais como amido de milho e o amido de batata, a celulose e os seus derivados, tais como a carboximetil celulose de sódio, a etil celulose e o acetato de celulose, ciclodextrina, malte, gelatina, talco; excipientes, tais como ceras da manteiga e do supositório de cacau; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de girasol, óleo de gergelim, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de semente de soja; glicóis, tais como propilenoglicol, polióleos, tais como glicerinaglicol, sorbitol, manitol e de polietileno; ésteres, tais como o laurato etílico, oleato etílico, ágar; agentes tamponantes, tais como o hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio; ácido alginico; água livre de pirogênio; salina isotônica, solução de Ringer; soluções tampões de álcool etílico e fosfato, assim como outras substâncias não tóxicas compatíveis usadas em formulações farmacêuticas.As used in the present invention, the use of the term "pharmaceutically acceptable" means a non-toxic, inert solid, semi-solid liquid filler, diluent, encapsulating material, auxiliary formulation of any kind, or simply a sterile aqueous medium such as saline. Some examples of materials that can serve as pharmaceutically acceptable carriers are sugars such as lactose, glucose and sucrose, starches such as corn starch and potato starch, cellulose and its derivatives such as sodium carboxymethyl cellulose , ethyl cellulose and cellulose acetate, cyclodextrin, malt, gelatin, talc; excipients such as cocoa butter and suppository waxes; oils such as peanut oil, cottonseed oil, sunflower oil, sesame oil, olive oil, corn oil and soybean oil; glycols such as propylene glycol, polyoils such as glycerin glycol, sorbitol, mannitol and polyethylene; esters such as ethyl laurate, ethyl oleate, agar; buffering agents such as aluminum hydroxide and magnesium hydroxide; alginic acid; pyrogen-free water; isotonic saline, Ringer's solution; phosphate and ethyl alcohol buffer solutions, as well as other compatible non-toxic substances used in pharmaceutical formulations.

Agentes umidificantes, emulsões e lubrificantes, tais como lauril sulfato de sódio e lauril estearato de magnésio, assim como agentes corantes, agentes liberadores, agentes de revestimento, adoçantes, sabores artificiais e agentes aromatizantes, preservativos e antioxidantes podem também estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, antioxidantes solúveis em água tais como ácido ascórbico, hidrocloreto de cisteína, bissulfeto de sódio, metabisulfeto de sódio, sulfeto de sódio, e similares; antioxidantes solúveis em óleo, tais como ascorbil palmitato, butilatohidroxianisol (BHA), butilatohidroxitolueno (BHT), lecitina, propil gaiato, alfa-tocoferol e similares; e agentes quelantes tais como o ácido cítrico, o ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, o ácido fosfórico e similares.Wetting agents, emulsions and lubricants such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl stearate, as well as coloring agents, release agents, coating agents, sweeteners, artificial flavors and flavoring agents, preservatives and antioxidants may also be present in the composition, according to the judgment of the formulator. Examples of pharmaceutically acceptable antioxidants include, but are not limited to, water-soluble antioxidants such as ascorbic acid, cysteine hydrochloride, sodium bisulfide, sodium metabisulfide, sodium sulfide, and the like; oil-soluble antioxidants such as ascorbyl palmitate, butylatehydroxyanisole (BHA), butylatehydroxytoluene (BHT), lecithin, propyl gallate, alpha-tocopherol and the like; and chelating agents such as citric acid, ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), sorbitol, tartaric acid, phosphoric acid and the like.

Para a administração oral, os compostos podem ser formulados em preparações sólidas ou liquidas tais como cápsulas, pilulas, comprimidos, pastilhas, melados, pós, suspensões ou emulsões. Na preparação de composições na forma de dosagem oral, alguns dos meios farmacêuticos usuais podem ser empregados, como, por exemplo, a água, os glicóis, os óleos, os álcoois, sabores artificiais, preservativos, corantes, suspensões, e similares no caso de preparações liquidas orais (como, por exemplo, as suspensões, os elixires e as soluções); ou veiculos tais como amidos, açúcares, diluentes, agentes granuladores, lubrificantes, pastas, agentes desintegrantes e similares no caso de preparações orais sólidas (como, por exemplo, os pós, as cápsulas e os comprimidos) . Por causa de sua facilidade de administração, comprimidos e cápsulas representam a forma mais vantajosa de administração oral de dosagem única, em que os excipientes farmacêuticos sólidos são obviamente empregados. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos de açúcar ou revestidos de protetores entéricos por técnicas padrão. Os imunoterápicos descritos na presente invenção podem estar encapsulados para torná- los estáveis para passagem através do trato gastrointestinal e ao mesmo tempo permitir a passagem através da barreira hemato-encefálica como descrito no documento de patente WO 96/11698.For oral administration, the compounds can be formulated into solid or liquid preparations such as capsules, pills, tablets, lozenges, molasses, powders, suspensions or emulsions. In preparing compositions in oral dosage form, some of the usual pharmaceutical media may be employed, such as, for example, water, glycols, oils, alcohols, artificial flavors, preservatives, dyes, suspensions, and the like in the case of oral liquid preparations (such as suspensions, elixirs and solutions); or carriers such as starches, sugars, diluents, granulating agents, lubricants, pastes, disintegrating agents and the like in the case of solid oral preparations (such as, for example, powders, capsules and tablets). Because of their ease in administration, tablets and capsules represent the most advantageous form of single-dose oral administration, in which solid pharmaceutical excipients are obviously employed. If desired, tablets can be sugar coated or coated with enteric protectants by standard techniques. The immunotherapeutics described in the present invention can be encapsulated to make them stable for passage through the gastrointestinal tract and at the same time allow passage across the blood-brain barrier as described in patent document WO 96/11698.

Para a administração parenteral, o composto pode ser dissolvido em um veiculo farmacêutico e ser administrado como uma solução ou uma suspensão. Exemplos de veiculos apropriados são água, salina, soluções de dextrose, soluções de frutose, etanol ou óleos de origem animal, vegetal ou sintético. Outros veiculos podem também conter outros ingredientes, por exemplo, preservativos, agentes suspensores, agentes solubilizantes, tampões e similares. Quando os compostos forem administrados intratecalmente, estes podem também ser dissolvidos no liquido cerebroespinhal.For parenteral administration, the compound can be dissolved in a pharmaceutical carrier and administered as a solution or suspension. Examples of suitable vehicles are water, saline, dextrose solutions, fructose solutions, ethanol or oils of animal, vegetable or synthetic origin. Other carriers may also contain other ingredients, for example, preservatives, suspending agents, solubilizing agents, buffers and the like. When the compounds are administered intrathecally, they can also be dissolved in the cerebrospinal fluid.

As composições farmacêuticas devem conter aproximadamente 0,0001 a 99%, preferivelmente aproximadamente 0,001 a 50%, mais preferivelmente aproximadamente 0,01 a 10% do peso de um ou mais dos imunoterápicos descritos na presente invenção para o peso total da composição. Além de um ou mais dos imunoterápicos descritos na presente invenção, as composições farmacêuticas e os medicamentos podem também conter outros compostos farmaceuticamente ativos. Quando usados em conjunto com outros compostos farmaceuticamente ativos, os imunoterápicos da presente invenção podem ser oferecidos na forma de coquetel de drogas. Um coquetel de drogas é uma mistura de alguns compostos usados na presente invenção com uma outra droga ou agente. Nesta incorporação, um veiculo comum de administração (por exemplo, pilula, comprimido, implante, bomba, solução injetável, etc.) poderá conter ambos, a composição atual em combinação com agentes potenciadores suplementares. As drogas individuais do coquetel são cada uma administrada em quantidades terapeuticamente eficazes para alcançar os efeitos desejados.Pharmaceutical compositions should contain approximately 0.0001 to 99%, preferably approximately 0.001 to 50%, more preferably approximately 0.01 to 10% by weight of one or more of the immunotherapeutics described in the present invention to the total weight of the composition. In addition to one or more of the immunotherapeutics described in the present invention, pharmaceutical compositions and drugs may also contain other pharmaceutically active compounds. When used in conjunction with other pharmaceutically active compounds, the immunotherapeutics of the present invention can be offered in the form of a drug cocktail. A drug cocktail is a mixture of some compounds used in the present invention with another drug or agent. In this embodiment, a common delivery vehicle (e.g., pill, tablet, implant, pump, solution for injection, etc.) may contain both the actual composition in combination with supplemental enhancing agents. The individual drugs in the cocktail are each administered in therapeutically effective amounts to achieve the desired effects.

Uma variedade de vias de administração dos imunoterápicos e das composições farmacêuticas descritas na presente invenção está disponível. O modo particular selecionado dependerá do composto em particular selecionado, da severidade do estado da doença que está sendo tratada e a dosagem necessária para eficácia terapêutica. Os métodos da presente invenção, geralmente, podem ser praticados usando qualquer modo de administração biologicamente aceitável, i.e. qualquer modalidade que produzir niveis eficazes dos compostos ativos sem causar efeitos adversos clinicamente indesejáveis. Tais modos de administração incluem as vias oral, retal, sublingual, tópica, nasal, transdermal ou parenteral. O termo "parenteral" inclui subcutânea, intravenosa, epidural, irrigação, intramuscular, bombas de liberação, ou de infusão.A variety of administration routes for the immunotherapeutics and pharmaceutical compositions described in the present invention are available. The particular mode selected will depend on the particular compound selected, the severity of the disease state being treated and the dosage required for therapeutic efficacy. The methods of the present invention, generally, can be practiced using any biologically acceptable mode of administration, i.e. any modality that produces effective levels of the active compounds without causing clinically undesirable adverse effects. Such modes of administration include oral, rectal, sublingual, topical, nasal, transdermal or parenteral routes. The term "parenteral" includes subcutaneous, intravenous, epidural, irrigation, intramuscular, delivery, or infusion pumps.

Assim, a administração de um ou mais imunoterápicos descritos na presente invenção pode ser conseguida usando todos os meios apropriados de oferta, incluindo: (a) bomba (b) microencapsulamento (vide os documentos de patente 4,352,883; 4,353,888 e 5,084,350); (c) implantes de polimero de liberação continua (vide o documento de patente US 4,883,666); (d) macroencapsulamento (vide os documentos de patente US 5,284,761; 5,158,881; 4,976,859 e 4,968,733 e os pedidos de patente WO92/19195 e WO95/05452); (e) enxertos celulares não capsulados no sistema nervoso central (vide os documentos de patente US 5,082,670 e 5,618,531); (f) injeção subcutânea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, ou em outro local apropriado; ou (g) administração oral em cápsula, liquido, comprimido, pilula ou formulação de liberação prolongada.Thus, administration of one or more immunotherapeutics described in the present invention can be accomplished using all appropriate means of delivery, including: (a) pump (b) microencapsulation (see patent documents 4,352,883; 4,353,888 and 5,084,350); (c) continuous release polymer implants (see US patent document 4,883,666); (d) macroencapsulation (see US patent documents 5,284,761; 5,158,881; 4,976,859 and 4,968,733 and patent applications WO92/19195 and WO95/05452); (e) unencapsulated cell grafts in the central nervous system (see US patent documents 5,082,670 and 5,618,531); (f) subcutaneous, intravenous, intraarterial, intramuscular, or other appropriate injection; or (g) oral administration in capsule, liquid, tablet, pill or sustained-release formulation.

Preferencialmente as composições farmacêuticas da presente invenção são infusões para administração intravesical.Preferably the pharmaceutical compositions of the present invention are infusions for intravesical administration.

Um ou mais imunoterápicos descritos na presente invenção são administrados preferivelmente em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Por uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou simplesmente "uma quantidade média suficiente do imunoterápico para tratar a doença desejada, mantendo uma razoável proporção risco/beneficio aplicável a qualquer tratamento médico. A quantidade real administrada, a taxa e o tempo de curso de administração, dependerão da natureza e da severidade das condições que estão sendo tratadas. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões de dosagem, duração, etc., dependem do acompanhamento da doença a ser tratada, da condição individual do paciente, da via e do método de administração, e outros fatores tipicos de conhecimento dos clinicos que estão dentro das responsabilidades dos clinicos gerais ou dos especialistas,One or more immunotherapeutics described in the present invention are preferably administered in a therapeutically effective amount. By a "therapeutically effective amount" or simply "an average sufficient amount of the immunotherapeutic to treat the desired disease, maintaining a reasonable risk/benefit ratio applicable to any medical treatment. The actual amount administered, the rate and time of course of administration, will depend on the nature and severity of the conditions being treated. The prescription of treatment, eg decisions on dosage, duration, etc., depend on the follow-up of the disease to be treated, the individual condition of the patient, the route and the method administration, and other typical factors of knowledge of clinicians that are within the responsibilities of general practitioners or specialists,

A dosagem pode ser ajustada apropriadamente para conseguir niveis desejados do imunoterápico, localmente ou sistemicamente. EXEMPLOSDosage can be adjusted appropriately to achieve desired levels of the immunotherapeutic, locally or systemically. EXAMPLES

Para permitir uma melhor compreensão da presente invenção e demonstrar claramente os avanços técnicos obtidos são agora apresentados como exemplos os resultados dos diferentes ensaios efetuados com relação a esta invenção.In order to allow a better understanding of the present invention and clearly demonstrate the technical advances obtained, the results of the different tests carried out in relation to this invention are now presented as examples.

No Exemplo 1 é descrita a obtenção do imunoterápico usado na presente invenção. Nos demais Exemplos (2 a 5) são ilustradas as propriedades e o uso do imunoterápico da presente invenção.In Example 1 the obtaining of the immunotherapeutic used in the present invention is described. In the remaining Examples (2 to 5) the properties and use of the immunotherapeutic of the present invention are illustrated.

Estes Exemplos são apresentados a titulo meramente ilustrativo e não devem ser de forma alguma considerados como limitativos do âmbito e do alcance da presente invenção.These Examples are offered for illustrative purposes only and should in no way be considered as limiting the scope and scope of the present invention.

EXAMPLE 1: Obtaining the rBCG-Pertussis immunotherapy

Este exemplo descreve a obtenção do imunoterápico rBCG-Pertussis (rBCG-SIPT). a) Obtenção da cepa de BCG auxotrófica para lisina baseada na cepa de BCG Moreau, BCG-lysA-: a cepa de BCG- lysA” ou BCG auxotrófica para lisina foi obtida por meio de recombinação homóloga utilizando a técnica desenvolvida no laboratório de Dr. William R. Jacobs, Jr (Albert Einstein College of Medicine-NY-USA) (Patente US 5,750,384) e colaboradores (Bardarov, S. et al. Microbiology 2002;148: 3007-3017). A recombinação homóloga foi realizada através de um plasmideo ponte, o gual foi introduzido no BCG por transfecção. Este plasmideo é formado por uma unidade plasmidial ligada ao genoma de um micobacteriófago que teve sequências não essenciais de seu genoma retiradas para a inserção deste plasmideo. 0 plasmideo possui um cassete de expressão do gene de sacB e um marcador de resistência a higromicina e ambos estão flanqueados pelo mesmo sitio de restrição Van I, no qual serão introduzidos duas sequências, previamente amplificadas por PCR, uma à esquerda (LEFT) e outra à direita (RIGHT) da sequência gênica que será deletada através da recombinação homóloga. A obtenção da cepa BCG-lysA’, foi feita pela deleção de 95 pares de base (pb) da sequência gênica da descarboxilase diaminopimelato lysA (DAP descarboxilase ou lysA), um gene essencial na via biosintética do aminoácido lisina (Pavelka, M. S. Jr. and Jacobs, W. R. Jr. ; J. Bacterial 1996;178:6496-6507). Os oligonucletideos utilizados para amplificar a sequência LEFT foram a SEQ ID NO 1 e a SEQ ID NO 2 e para amplificar a sequência RIGHT foram a SEQ ID NO 3 e SEQ ID NO 4, os quais geraram fragmentos de 895 pb e 864 pb, respectivamente. Após a recombinação, o gene lysA perdeu 96 pares de bases de sua sequência gênica SEQ ID NO 5, tornando-se assim não funcional. b) Obtenção do gene S1PT mu t ado de Bordetella pertussis: foi desenvolvida uma forma detoxicada de toxina pertussis (PT) , onde alelos dos genes da PT foram manipulados geneticamente para introduzir a substituição de dois aminoácidos (Arg/9 por Lys, e Glu/129 por Gly) no sitio ativo da subunidade SI da toxina pertussis (S1PT). Esse gene mutado (PT-9K/129G) foi introduzido no cromossomo de uma cepa de Bordetella pertussis. Esta cepa produz moléculas mutantes de PT que são atóxicas, mas mantém sua imunogenicidade, e que protegem camundongos de um desafio intracerebral com uma cepa virulenta de Bordetella pertussis (Pizza, M. et. al. Science 1989;246:497-500). O gene da subunidade 1 da Toxina Pertussis mutado (PT- 9K/129G), foi clonado no plasmideo pUC-PT-9K/129G, e foi cedido pelo Dr. Rino Rappuoli (Novartis, Siena, Itália). c) Obtenção do plasmideo ou vetor de expressão de micobactéria: o vetor de expressão de micobactéria usado para expressão de S1PT em BCG recombinante é denominado pLA71 e foi desenvolvido no laboratório das Dras. Brigitte Gicquel e Nathalie Winter (Unité de Genétique Mycobactérienne, Instituto Pasteur, Paris, França). Sequência gênica do plasmideo pLA71 e a SEQ ID NO 6.This example describes the obtainment of the rBCG-Pertussis immunotherapy (rBCG-SIPT). a) Obtaining the auxotrophic BCG strain for lysine based on the BCG Moreau strain, BCG-lysA-: the BCG-lysA strain” or BCG auxotrophic for lysine was obtained through homologous recombination using the technique developed in the laboratory of Dr. William R. Jacobs, Jr (Albert Einstein College of Medicine-NY-USA) (US Patent 5,750,384) and coworkers (Bardarov, S. et al. Microbiology 2002;148:3007-3017). Homologous recombination was performed using a bridge plasmid, which was introduced into the BCG by transfection. This plasmid is formed by a plasmid unit linked to the genome of a mycobacteriophage that had non-essential sequences of its genome removed for the insertion of this plasmid. The plasmid has a sacB gene expression cassette and a hygromycin resistance marker and both are flanked by the same Van I restriction site, in which two sequences, previously amplified by PCR, one on the left (LEFT) and the other will be introduced to the right (RIGHT) of the gene sequence that will be deleted through homologous recombination. The BCG-lysA' strain was obtained by deleting 95 base pairs (bp) of the gene sequence of the diaminopimelate decarboxylase lysA (DAP decarboxylase or lysA), an essential gene in the biosynthetic pathway of the amino acid lysine (Pavelka, MS Jr. and Jacobs, WR Jr.; J. Bacterial 1996;178:6496-6507). The oligonucleotides used to amplify the LEFT sequence were SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 and to amplify the RIGHT sequence were SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4, which generated fragments of 895 bp and 864 bp, respectively . After recombination, the lysA gene lost 96 base pairs of its gene sequence SEQ ID NO 5, thus becoming non-functional. b) Obtaining the mutated S1PT gene from Bordetella pertussis: a detoxified form of pertussis toxin (PT) was developed, where alleles of the PT genes were genetically manipulated to introduce the replacement of two amino acids (Arg/9 by Lys, and Glu /129 per Gly) at the active site of the pertussis toxin SI subunit (S1PT). This mutated gene (PT-9K/129G) was introduced into the chromosome of a strain of Bordetella pertussis. This strain produces mutant PT molecules that are non-toxic but retain their immunogenicity, and that protect mice from an intracerebral challenge with a virulent strain of Bordetella pertussis (Pizza, M. et. al. Science 1989;246:497-500). The mutated Pertussis Toxin 1 subunit gene (PT-9K/129G), was cloned into plasmid pUC-PT-9K/129G, and was donated by Dr. Rino Rappuoli (Novartis, Siena, Italy). c) Obtaining the mycobacterial expression plasmid or vector: the mycobacterial expression vector used for S1PT expression in recombinant BCG is called pLA71 and was developed in the laboratory of Drs. Brigitte Gicquel and Nathalie Winter (Unité de Genétique Mycobactérienne, Pasteur Institute, Paris, France). Gene sequence of plasmid pLA71 and SEQ ID NO 6.

Este vetor de expressão é um plasmideo ponte que contém origem de replicação de E. coli e micobactéria, o gene aminoglicosidio fosfotransferase, um marcador de seleção para kanamicina, e o promotor pBlaF*, um promotor mutado da β-lactamase de M. fortuitum. O promotor pBlaF* é seguido da sequência sinal de exportação do gene da β- lactamase. O vetor pLA71 apresenta um inserto de 1384 pb contendo o promotor pBlaF* mais a região codificadora de 32 aminoácidos da sequência sinal de exportação da β-lactamase e 5 aminoácidos da proteina madura, fundidos ao gene da fosfatase alcalina (phoA) (Tim, J. et al. Mol Microbiol 1994;12: 491-502) . d) Construção do vetor de expressão do gene S1PT em BCG reco∑nbinante: o vetor de expressão do gene S1PT em BCG recombinante foi construído usando métodos convencionais de biologia molecular. O gene S1PT foi amplificado por PCR a partir do plasmideo pUC-9K/129G, usando os seguintes oligonucleotideos: N-terminal SEQ ID NO 7 (5'- TAGTAGTCTAGAGGTACCGGACGACGATCCTCCCGCCACC-3'), contendo os sitios de restrição Xba I (negrito) e Kpn I (sublinhado) e C-terminal SEQ ID NO 8 (5'-TAGTAGTCTAGAGCGGCCGCCTAGAAC GAATACGCGATGCT-3'), contendo os sitios de restrição Xba I (negrito) e Not I (sublinhado) (Bio-Synthesis, Inc., Lewisville, Tex.). O produto de PCR correspondente ao gene S1PT-9K/129G foi gerado usando as seguintes condições de PCR: 94°C por 4 minutos; 25 ciclos de 94°C por 1 min, 50°C por 1 min e 72°C por 30 s; e 4°C final. Esse produto de PCR foi então digerido com Xba I e subclonado em pUC19 (New England Biolabs, Bervely, Mass) para se obter maior quantidade de DNA. O plasmideo resultante, pUC19-SlPT- 9K/129G, foi posteriormente digerido com as enzimas de restrição Kpn I e Not I e então clonado no vetor de expressão pLA71, que foi também previamente digerido com as enzimas Kpn I e Not I, gerando assim o vetor de expressão denominado de pLN71-SlPT conforme descrito em Nascimento, I. P. et al. Infect Immun. 2000;68: 4877-4883. e) Clonagem do gene lysA no vetor pNL71-SlPT: para a complementação da cepa BCG-lysA", foi utilizado o gene de lysA de Mycobaterium smegmatis. Este gene codifica a proteína diaminopimelato carboxilase e é essencial na via biosintética do aminoácido lisina (Pavelka, M. S. Jr. and Jacobs, W. R. Jr. ; J. Bacterial 1996;178:6496-6507). Este gene já havia sido previamente clonado no plasmideo pJH137 e foi, gentilmente, cedido pelo Dr. William R. Jacobs, Jr (Albert Eistein College of Medicine - NY-USA). Sequência de lysA, incluindo a região de ligação a ribossomo (RBS) SEQ ID NO 9:This expression vector is a bridge plasmid that contains E. coli and mycobacterial origin of replication, the aminoglycoside phosphotransferase gene, a selectable marker for kanamycin, and the pBlaF* promoter, a mutated M. fortuitum β-lactamase promoter. The pBlaF* promoter is followed by the β-lactamase gene export signal sequence. The pLA71 vector has a 1384 bp insert containing the pBlaF* promoter plus the 32 amino acid coding region of the β-lactamase export signal sequence and 5 amino acids of the mature protein, fused to the alkaline phosphatase (phoA) gene (Tim, J et al. Mol Microbiol 1994;12:491-502). d) Construction of the S1PT gene expression vector in recombinant BCG: the S1PT gene expression vector in recombinant BCG was constructed using conventional methods of molecular biology. The S1PT gene was amplified by PCR from plasmid pUC-9K/129G, using the following oligonucleotides: N-terminal SEQ ID NO 7 (5'-TAGTAGTCTAGAGGTACCGGACGACGATCCTCCCGCCACC-3'), containing restriction sites Xba I (bold) and Kpn I (underlined) and C-terminal SEQ ID NO 8 (5'-TAGTAGTCTAGAGCGGCCGCCTAGAAC GAATACGCGATGCT-3'), containing restriction sites Xba I (bold) and Not I (underlined) (Bio-Synthesis, Inc., Lewisville, Tex.). The PCR product corresponding to the S1PT-9K/129G gene was generated using the following PCR conditions: 94°C for 4 minutes; 25 cycles of 94°C for 1 min, 50°C for 1 min and 72°C for 30 s; and 4°C final. This PCR product was then digested with Xba I and subcloned into pUC19 (New England Biolabs, Bervely, Mass) to obtain more DNA. The resulting plasmid, pUC19-SlPT-9K/129G, was further digested with the restriction enzymes Kpn I and Not I and then cloned into the expression vector pLA71, which was also previously digested with the enzymes Kpn I and Not I, thus generating the expression vector called pLN71-SlPT as described in Nascimento, IP et al. Infect Immun. 2000;68:4877-4883. e) Cloning of the lysA gene in the pNL71-SlPT vector: for the complementation of the BCG-lysA strain", the lysA gene from Mycobaterium smegmatis was used. This gene encodes the protein diaminopimelate carboxylase and is essential in the biosynthetic pathway of the amino acid lysine (Pavelka , MS Jr. and Jacobs, WR Jr.; J. Bacterial 1996;178:6496-6507) This gene had previously been cloned into plasmid pJH137 and was kindly provided by Dr. William R. Jacobs, Jr (Albert Einstein College of Medicine - NY-USA) lysA sequence including ribosome binding region (RBS) SEQ ID NO 9:

O plasmideo pNL71-SlPT foi digerido com a enzima Not I e este sitio de restrição tornado coesivo por tratamento com a enzima Klenow. Em seguida a sequência do gene lysA contendo uma sequência RBS foi excisada do vetor pJH137 através das enzimas de restrição Cla I e Pst I e ambas as extremidades tornadas coesivas por tratamento com a enzima Klenow. O fragmento gerado por esta digestão foi então clonado no vetor pNL71SlPT no sitio Not I coesivo, gerando assim o vetor denominado pNL71Sl-lysA.Plasmid pNL71-SlPT was digested with Not I enzyme and this restriction site made cohesive by treatment with Klenow enzyme. Then the lysA gene sequence containing an RBS sequence was excised from the pJH137 vector by restriction enzymes Cla I and Pst I and both ends made cohesive by treatment with Klenow enzyme. The fragment generated by this digestion was then cloned into the pNL71SlPT vector at the Not I cohesive site, thus generating the vector named pNL71Sl-lysA.

Desta forma o gene lysA ficou sob o controle do mesmo promotor pblaF*, responsável também pela expressão do gene S1PT, caracterizando assim um sistema operon. O produto de ligação desta construção foi selecionado em E. coli na presença de kanamicina e o plasmideo pNL71Sl-lysA purificado. O gene de resistência a kanamicina foi retirado através da digestão de pNL71Sl-lysA com Nde I, cujos sitios de restrição flanqueiam a sequência do gene de resistência a kanamicina e o plasmideo foi religado gerando pNL71Sl- lysA-kan".Thus, the lysA gene was under the control of the same pblaF* promoter, also responsible for the expression of the S1PT gene, thus characterizing an operon system. The ligation product of this construct was selected in E. coli in the presence of kanamycin and purified plasmid pNL71S1-lysA. The kanamycin resistance gene was removed by digesting pNL71Sl-lysA with Nde I, whose restriction sites flank the kanamycin resistance gene sequence and the plasmid was religated generating pNL71Sl-lysA-kan".

Este plasmideo foi então usado para transformar a cepa de Mycobacterium smegmatis auxotrófica para lisina (Mycobacterium smegmatís-lysA") (Gentilmente cedida por Dr. William R. Jacobs, Jr) . 0 plasmideo pNL7lSl-lysA-kan" foi então purificado a partir de M. smegmatis-lysPC usando um Kit comercial para purificação de DNA plasmidial (Mini- prep-PROMEGA) e este usado para transformar uma cepa auxotrófica, BCG-lysA“. f) Preparação de lote estoque de BCG-lysA” competente a partir do obtido na etapa a) e da cepa de rBCG-Pertussis (auxotrófico/ complementado): para preparação de estoques de BCG-lysA“ competente, uma ou mais colônias de BCG-lysA- foi cultivada em meio liquido Middlebrook 7H9 mais Tween-80 e suplementado com albumina-dextrose-catalase 10% (MB7H9/Tw/ADC) mais lisina 10% até a fase exponencial.This plasmid was then used to transform the auxotrophic strain of Mycobacterium smegmatis to lysine (Mycobacterium smegmatis-lysA") (Kindly courtesy of Dr. William R. Jacobs, Jr.) Plasmid pNL7lSl-lysA-kan" was then purified from M. smegmatis-lysPC using a commercial plasmid DNA purification kit (Mini-prep-PROMEGA) and this used to transform an auxotrophic strain, BCG-lysA“. f) Preparation of competent BCG-lysA" stock batch from that obtained in step a) and the rBCG-Pertussis strain (auxotrophic/complemented): for preparation of competent BCG-lysA" stocks, one or more BCG colonies -lysA- was grown in Middlebrook 7H9 liquid medium plus Tween-80 and supplemented with 10% albumin-dextrose-catalase (MB7H9/Tw/ADC) plus 10% lysine until exponential phase.

Composição do meio Middlebrook 7H9 de acordo com o fabricante (Difco-BD): Sulfato de Amónio, Ácido L- Glutâmico, Citrato de Sódio, Piridoxina, Biotina, Di- Fosfato de Sódio, Mono-fosfato de Potássio, Citrato de Amónio Férrico, Sulfato de Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco e Sulfato de Cobre. Em seguida, a cultura foi sedimentada por centrifugação a 4000 rpm e lavada duas vezes com glicerol 10% a 4 °C, sendo finalmente re- suspendida em 5% do volume original com glicerol 10% e armazenada à -70°C até ser transformada por eletroporação com o plasmideo pNL7ISl-lysA-Kan”. Para eletroporação, uma alíquota estoque de 50-200 μl de BCG-lysA“ competente foi misturada com 1-5 μg de pNL71Sl-lysA-kan~, em cubetas de eletroporação de 2 mm e esta submetida a pulsações de 2,5 kV, 25 μF e 1000 Q, num eletroporador de pulsação (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, UK) . Após eletroporação, o conteúdo das cubetas foi recuperado em 5 mL de meio (MB7H9/Tw/ADC) sem antibiótico e incubado a 37°C por 20 h antes de ser semeado em meio sólido Middlebrook 7H10 (Difco) suplementado com ácido oléico-albumina- dextrose-catalase 10%(MB7H9/OADC). Composição aproximada do meio sólido Middlebrook 7H10 de acordo com o fabricante (Difco-BD): Sulfato de Amónio, Mono-fosfato de Potássio, Bi-Fosfato de Potássio, Citrato de Sódio, Sulfato deComposition of Middlebrook 7H9 medium according to manufacturer (Difco-BD): Ammonium Sulfate, L-Glutamic Acid, Sodium Citrate, Pyridoxine, Biotin, Sodium Diphosphate, Potassium Monophosphate, Ferric Ammonium Citrate, Magnesium Sulfate, Calcium Chloride, Zinc Sulfate and Copper Sulfate. Then, the culture was sedimented by centrifugation at 4000 rpm and washed twice with 10% glycerol at 4°C, finally being resuspended in 5% of the original volume with 10% glycerol and stored at -70°C until transformed by electroporation with plasmid pNL7ISl-lysA-Kan”. For electroporation, a 50-200 μl stock aliquot of competent BCG-lysA“ was mixed with 1-5 μg of pNL71Sl-lysA-kan~ in 2 mm electroporation cuvettes and subjected to 2.5 kV pulsations, 25 µF and 1000 Q, in a pulsed electroporator (GenePulser, BioRad, Hemel Hempstead, UK). After electroporation, the contents of the cuvettes were recovered in 5 mL of medium (MB7H9/Tw/ADC) without antibiotics and incubated at 37°C for 20 h before being seeded in solid Middlebrook 7H10 medium (Difco) supplemented with oleic acid-albumin - dextrose catalase 10% (MB7H9/OADC). Approximate Composition of Middlebrook 7H10 Solid Medium According to Manufacturer (Difco-BD): Ammonium Sulphate, Potassium Monophosphate, Potassium Bi-Phosphate, Sodium Citrate, Potassium Sulphate

Magnésio, Cloreto de Cálcio, Sulfato de Zinco, Sulfato de Cobre Ácido L-Glutâmico, Citrato de Amónio Férrico, Hidrocloreto de Piridoxina, Biotina, Verde de Malaquita e Agar.Magnesium, Calcium Chloride, Zinc Sulfate, Copper Sulfate L-Glutamic Acid, Ferric Ammonium Citrate, Pyridoxine Hydrochloride, Biotin, Malachite Green and Agar.

Após introdução de pNL71Sl-lysA-kan" em BCG-lysA", os transformantes foram selecionados em placas contendo meio (MB7H10/OADC) na ausência de kanamicina. As colônias de rBCG selecionadas foram então transferidas para 5 mL de meio de cultura MB7H9/Tw/ADC (sem lisina), com e sem kanamicina, para confirmar a complementação do gene de lisina e a perda de resistência a kanamicina. Todas as colônias selecionadas cresceram apenas na ausência de kanamicina, confirmando assim o seu fenótipo lysA”/+/kan”, cepa esta que passou a ser chamada de rBCG-Pertussis. g) Preparação dos lotes de rBCG-Pertussis: Em seguida os clones desta cepa foram expandidos para 50 mL de meio liquido MB7H9/Tw/ADC ou em qualquer meio descrito para cultivo de micobactérias. Após 2-3 semanas, quando o cultivo atinge D06oo 0,6-0,8, as amostras foram centrifugadas, lavadas duas vezes com H20 miliQ, resuspendidas em 1 mL de glicerol 10% e aliquotadas em volume de 100 μl e então armazenadas a -70°C, para posterior utilização nos ensaios de imunização. h) Avaliação dos Lotes de rBCG-Pertussis: a viabilidade dos lotes de rBCG-Pertussis foi avaliada por meio de contagem do número de unidade formadora de colônia (UFC) . O número de UFC foi determinado como segue: uma ou mais aliquotas do lote congelado a -70°C foram descongeladas e realizadas várias diluições sucessivas (IxlO2, IxlO4, lxlO5 e lxlO6). Em seguida as diluições lxlO5 e lxlO6 foram plaqueadas em meio MB7H10/OADC e incubadas a 37° C. Após 3-4 semanas fez-se a contagem do número de colônias na placa.After introducing pNL71Sl-lysA-kan" into BCG-lysA", transformants were selected on plates containing medium (MB7H10/OADC) in the absence of kanamycin. Selected rBCG colonies were then transferred to 5 mL of MB7H9/Tw/ADC culture medium (without lysine), with and without kanamycin, to confirm complementation of the lysine gene and loss of resistance to kanamycin. All selected colonies grew only in the absence of kanamycin, thus confirming their lysA”/+/kan” phenotype, a strain that came to be called rBCG-Pertussis. g) Preparation of batches of rBCG-Pertussis: Next, the clones of this strain were expanded to 50 ml of liquid medium MB7H9/Tw/ADC or in any medium described for the cultivation of mycobacteria. After 2-3 weeks, when the culture reaches D06oo 0.6-0.8, the samples were centrifuged, washed twice with H20 milliQ, resuspended in 1 mL of 10% glycerol and aliquoted in a volume of 100 μl and then stored at -70°C, for further use in immunization assays. h) Evaluation of rBCG-Pertussis lots: the viability of rBCG-Pertussis lots was evaluated by counting the number of colony forming unit (CFU) . The number of CFU was determined as follows: one or more aliquots of the batch frozen at -70°C were thawed and made several successive dilutions (Ix102, Ix104, 1x105 and 1x106). Then the 1x105 and 1x106 dilutions were plated in MB7H10/OADC medium and incubated at 37°C. After 3-4 weeks the number of colonies on the plate was counted.

Para verificação da expressão do gene S1PT, foi utilizado um imunoensaio (Western blotting) usando um soro policlonal anti-PT, procedendo-se da seguinte maneira: uma ou mais aliquotas estoques de rBCG-pertussis foram sonicadas por 1,5 min sob gelo numa amplitude constante correspondente a metade do valor máximo (Soniprep 150 MSE, UK) e centrifugadas para precipitação de sólidos. Os sobrenadantes foram recuperados e a concentração de proteínas dosada usando o kit BIO-RAD Protein Assay (BioRad) , utilizando albumina bovina como padrão. Amostras contendo 30 μg de proteínas foram aplicadas em gel de poliacrilamida 10% em presença de duodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE 10 %). A eletroforese foi realizada à temperatura ambiente a 120 V até o corante atingir o final do gel. Após eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose com poros de 0,2 μm (Protran), utilizando- se um sistema de transferência semi-seco. Os géis contendo rBCG-Pertussis e rBCG-pNL71-SlPT, como controle positivo, foram colados sob as membranas de nitrocelulose, mergulhados em tampão de transferência (Tris 0,25 M, pH 8,3, glicina 0,129 M e metanol 20 %) e colocados entre cinco folhas de filtro também embebidos no mesmo tampão. O conjunto foi colocado entre duas placas e submetido a uma corrente de 120 mA por 1,5 h a temperatura ambiente. Ao final da eletrotransferência, as membranas foram retiradas do sistema e incubadas em solução bloqueadora (PBS contendo leite 5% - PBS-L) a 4 °C, durante toda noite. Ao término do bloqueio, as membranas foram incubadas a temperatura ambiente por 2 h com soro anti-PT diluidos em PBS-L (diluição 1:1000). Após este periodo de incubação as membranas de nitrocelulose foram lavadas três vezes, sob leve agitação, com PBS/Tween20 0,1% (PBS-T), em intervalos de 10 min. As membranas foram então incubadas por 2 h nas mesmas condições em PBS-L contendo anticorpo anti-IgG conjugado a HRP (Sigma, Chem Co, St. Luis) e novamente lavadas 3 vezes com PBS-T. A revelação foi feita por quimiluminescência usando o kit ECL (Amersham) por exposição a filme de raios-X (Figura 1).To verify the expression of the S1PT gene, an immunoassay (Western blotting) was used using a polyclonal anti-PT serum, proceeding as follows: one or more stock aliquots of rBCG-pertussis were sonicated for 1.5 min on ice in an constant amplitude corresponding to half the maximum value (Soniprep 150 MSE, UK) and centrifuged to precipitate solids. Supernatants were recovered and protein concentration measured using the BIO-RAD Protein Assay kit (BioRad), using bovine albumin as a standard. Samples containing 30 μg of proteins were applied to a 10% polyacrylamide gel in the presence of sodium duodecyl sulfate (10% SDS-PAGE). Electrophoresis was performed at room temperature at 120 V until the dye reached the end of the gel. After electrophoresis, proteins were transferred to nitrocellulose membrane with 0.2 μm pores (Protran), using a semi-dry transfer system. Gels containing rBCG-Pertussis and rBCG-pNL71-SlPT, as positive control, were pasted under nitrocellulose membranes, dipped in transfer buffer (0.25 M Tris, pH 8.3, 0.129 M glycine and 20% methanol) and placed between five filter sheets also soaked in the same buffer. The set was placed between two plates and subjected to a current of 120 mA for 1.5 h at room temperature. At the end of the electrotransfer, the membranes were removed from the system and incubated in a blocking solution (PBS containing 5% milk - PBS-L) at 4 °C, overnight. At the end of the blockade, the membranes were incubated at room temperature for 2 h with anti-PT serum diluted in PBS-L (1:1000 dilution). After this incubation period, the nitrocellulose membranes were washed three times, under gentle agitation, with PBS/Tween20 0.1% (PBS-T), at intervals of 10 min. The membranes were then incubated for 2 h under the same conditions in PBS-L containing anti-IgG antibody conjugated to HRP (Sigma, Chem Co, St. Luis) and again washed 3 times with PBS-T. Development was done by chemiluminescence using the ECL kit (Amersham) by exposure to X-ray film (Figure 1).

Em resumo, na produção do imunoterápico de rBCG- Pertussis prevalece a utilização dos mesmos métodos de cultivo da vacina BCG, resultando num produto composto por uma cepa de BCG recombinante expressando um antigeno de Bordetella pertussis e o gene de complementação lysA, ambos sob o controle do mesmo promotor, o que manterá a pressão seletiva para a manutenção da expressão heteróloga.In summary, in the production of the rBCG-Pertussis immunotherapeutic, the use of the same methods of cultivation of the BCG vaccine prevails, resulting in a product composed of a recombinant BCG strain expressing a Bordetella pertussis antigen and the complementation gene lysA, both under control from the same promoter, which will maintain the selective pressure for the maintenance of heterologous expression.

EXAMPLE 2: Development of the animal model of bladder tumor.

Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 {Mus musculus, Rodentia, Mammalia) , fêmeas, adultas, pesando entre 15 e 18 gramas, com 8 a 10 semanas de vida, provenientes e mantidos nas condições padrões do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.Mice of the lineage C57BL/6 (Mus musculus, Rodentia, Mammalia), female, adult, weighing between 15 and 18 grams, with 8 to 10 weeks of life, from and maintained in standard conditions of the Central Animal Facility of the Faculty of Medicine of University of Sao Paulo.

Utilizou-se a linhagem de células de tumor urotelial de bexiga MB4 9 de camundongo C57BL/6 (doadas pelo Dr. Yi Lou - Universidade de Iowa, EUA) , a qual foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 2 mmol/L L-glutamina, 50 U/mL penicilina, e 0,05 mg/mL estreptomicina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) em estufa a 37 °C e 5% CO2. A suspensão celular de MB49, corada com azul de trypan, foi quantificada em câmara de Neubauer ao microscópio, e somente, suspensões com no minimo de 90% de células viáveis foram usadas implantação tumoral na bexiga.The mouse bladder urothelial tumor cell line MB49 C57BL/6 (donated by Dr. Yi Lou - University of Iowa, USA) was used and grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum , 2 mmol/L L-glutamine, 50 U/mL penicillin, and 0.05 mg/mL streptomycin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in an oven at 37°C and 5% CO 2 . The cell suspension of MB49, stained with trypan blue, was quantified in a Neubauer chamber under a microscope, and only suspensions with at least 90% viable cells were used for tumor implantation in the bladder.

A implantação das células tumorais seguiu o método descrito por Kadhim, S. A. et al. (J Urol. 1997 Aug;158(2):646-52), com pequenas modificações descritas a seguir. Os camundongos foram anestesiados através da injeção intraperitoneal (I.P.) de 100 μL de uma solução composta por 1,5 mg de ketamina (Dopalen - Agribrands do Brasil - Paulinia / SP) e 0,1 mg de xilazina [Anasedam - Agribrands do Brasil - Paulinia/SP (GORSKA 2000)] . Em seguida, os animais foram submetidos à cateterização transuretral, com cateter de polietileno 24-gauge sem agulha. A seguir, procedeu-se à lesão quimica do epitélio vesical com 0,3 M de nitrato de prata (AgNO3) , seguido de lavagem com soro fisiológico 0,9% (SF) e instilação intravesical de 0,1 mL de suspensão de células MB49 (5 x 105 células/camundongo).Tumor cell implantation followed the method described by Kadhim, S.A. et al. (J Urol. 1997 Aug;158(2):646-52), with minor modifications described below. The mice were anesthetized by intraperitoneal (IP) injection of 100 μL of a solution composed of 1.5 mg of ketamine (Dopalen - Agribrands do Brasil - Paulinia / SP) and 0.1 mg of xylazine [Anasedam - Agribrands do Brasil - Paulinia/SP (GORSKA 2000)]. Then, the animals underwent transurethral catheterization with a 24-gauge needleless polyethylene catheter. Then, the vesical epithelium was chemically injured with 0.3 M silver nitrate (AgNO3), followed by washing with 0.9% saline (SF) and intravesical instillation of 0.1 mL of cell suspension. MB49 (5 x 105 cells/mouse).

Os animais foram acompanhados por quatro semanas, após este periodo todos foram sacrificados por deslocamento cervical, tendo a sua bexiga retirada para exame macroscópico de comprovação da presença de massa tumoral. A taxa de 90% de implantação tumoral das células MB49, obtida em nosso estudo, foi compatível com os relatos apresentados na literatura, onde os valores variam de 75 a 100% (Bohle, A., Brandau, S. J Urol 2003;170:964-969). A análise anátomo-patológica confirmou o diagnóstico de carcinoma urotelial infiltrativo, o que, também corroborou com a confirmação do estabelecimento deste modelo de câncer vesical. O aspecto macroscópico dos tumores foi semelhante entre os vários animais. Os animais em que não foi evidenciado tumor através da análise anátomo-patológica e/ou macroscópica foram excluidos dos experimentos subsequentesThe animals were followed for four weeks, after this period they were all sacrificed by cervical dislocation, having their bladder removed for macroscopic examination to confirm the presence of a tumor mass. The 90% rate of tumor implantation of MB49 cells obtained in our study was consistent with reports presented in the literature, where values range from 75 to 100% (Bohle, A., Brandau, S. J Urol 2003;170 :964-969). The anatomopathological analysis confirmed the diagnosis of infiltrative urothelial carcinoma, which also corroborated the confirmation of the establishment of this model of bladder cancer. The macroscopic appearance of the tumors was similar among the various animals. Animals in which no tumor was evidenced through the anatomopathological and/or macroscopic analysis were excluded from subsequent experiments

EXAMPLE 3: Treatment of animal models of bladder tumor with immunotherapeutics.

Procedeu-se conforme descrito no Exemplo 2, porém após a implantação das células tumorais, iniciou-se, no dia seguinte, o tratamento com os imunoterápicos de interesse. No Io dia, os camundongos (n=60) foram transportados e confinados no biotério nivel dois de Biosegurança do Laboratório de Biotecnologia IV do Instituto Butantan, onde procedemos à instilação intravesical dos imunoterápicos.The procedure was carried out as described in Example 2, but after the implantation of the tumor cells, the treatment with the immunotherapeutic of interest was started the following day. On the 1st day, the mice (n=60) were transported and confined in the Biosafety Level Two Animal Facility of the Biotechnology Laboratory IV of the Butantan Institute, where we proceeded with the intravesical instillation of the immunotherapeutics.

Os animais foram divididos em três grupos (n=20): • Grupo BCG: animais tratados com 0,1 mL de suspensão de BCG [lxlO6 cfu/camundongo suspensas em soro fisiológico (SE)]; • Grupo rBCG-SIPT: animais tratados com 0,1 mL de suspensão de rBCG-SIPT (lxlO6 cfu/camundongo suspensas em SF) ; • Grupo Controle: animais tratados com 0,1 mL de SF.The animals were divided into three groups (n=20): • BCG group: animals treated with 0.1 mL of BCG suspension [1x106 cfu/mouse suspended in saline (SE)]; • rBCG-SIPT group: animals treated with 0.1 mL of rBCG-SIPT suspension (1x106 cfu/mouse suspended in SF); • Control Group: animals treated with 0.1 mL of SF.

Para tal procedimento, os animais foram novamente anestesiados e tiveram a uretra cateterizada, como descrito no Exemplo 2. Os tratamentos propostos para cada grupo foram realizados através de uma aplicação por semana, nos dias 1, 8, 15, 22, totalizando 4 aplicações. No 29° dia, os camundongos foram sacrificados e as bexigas retiradas (cistectomia), pesadas em balança analitica de precisão, congeladas em nitrogênio liquido e armazenadas em freezer - 80 °C. O baço, usado para obtenção dos esplenócitos, foi removido e mantido em placa de petri contendo meio de cultura RPMI1640 a 4 °C. a)Peso das Bexigas: a avaliação dos pesos (mg) das bexigas, retiradas dos animais deste ensaio, mostrou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos tratados com BCG e rBCG-SIPT em relação ao grupo controle (SF) (Figura 2). Utilizou-se o teste One-way Analysis of Variance (p<0.01) para analisar a diferença dos pesos vesicais entre os vários grupos e o teste Student-Newman- Keuls para a análise par a par, após os dados serem convertidos na escala logaritimica. A média do peso (mg) do grupo controle foi de 230±110 mg, do grupo BCG foi de 137±87 mg e do grupo RBCG-S1PT foi de 93±50 mg. Foi considerado urn valor de p<0.05 para análise estatística significante. Os valores foram obtidos de três experimentos realizados independentemente. Ou seja, o grupo que recebeu solução salina foi o que apresentou maiores pesos vesicais, e consequentemente o maior volume tumoral. Enquanto o grupo tratado com rBCG-SIPT mostrou os menores pesos vesicais, o que corresponde a um retardo maior no crescimento tumoral no grupo tratado com rBCG-SIPT em comparação com o grupo controle. c) Padrões de Resposta Imune Thl/Th2: os padrões de resposta imune Thl/Th2 dos grupos tratados com SF, BCG e rBCG-SIPT foram analisados pela técnica de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR). Inicialmente, Os fragmentos vesicais congelados em nitrogênio liquido foram processados para a extração de RNA total (RNAt) pela técnica do Trizol® de acordo com instruções do fabricante (GIBCO/BRL Life Technologies, Inc.). Em seguida, as amostras de RNAt foram purificadas em colunas de silica RNeasy seguindo-se as recomendações do fabricante (QIAGEN). A quantidade (ODA26onrn x 20) e a pureza (ODA260nm/ODA28onm) do RNA extraido foi verificada através de espectrofotometria. Em seguida, lμg do RNAt foi convertido em DNA complementar (cDNA) através de reação de transcriptase reversa, usando- se: a enzima Superscript™ III {Life Technologies') , iniciadores oligo-dT e termociclador (MJ Research PTC-200 Thermocycler, Watertown, MA, USA) . Posteriormente, os cDNA de cada uma das amostras foram amplificados usando-se iniciadores apropriados para os seguintes genes IL-2, IL-5, IL-12p40, iNOS, TGF-β, TNF-α, INF-y, IL-10 e IL-6. Neste ensaio foi utilizada a solução Universal PCR MasterMix {Applied Biosystems Inc -USA) e o equipamento de 7500 Fast Real-Time PCR {Applied Biosystems) , de acordo com o protocolo de quantificação baseado no SYBR Green (Applied Biosystems). Todas as reações foram realizadas em triplicatas. Os resultados de expressão dos genes analisados foram normalizados pela expressão do gene constitutivo GAPDH usando iniciadores definidos por Overbergh, em 1999 (Overbergh L, Valckx D, Waer M, Mathieu C (1999) Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR. Cytokine 11:305-312). Nos grupos tratados com imunoterápicos observou-se um aumento significativo da expressão de TNF-a em relação ao grupo controle, sendo que no grupo tratado com rBCG-SIPT esta resposta foi mais intensa. Fato este, que sinaliza para uma resposta polarizada do tipo Thl. Quando analisamos as interleucinas relacionadas ao padrão de resposta Th2, observou-se uma aumento significativo de expressão de IL-10 no grupo tratado com rBCG-SIPT (Figura 3) . É importante salientar que em ensaios experimentais com a linhagem de células tumorais MB49 detectou-se que estas não produzem IL-10, logo os niveis quantificados são provenientes da resposta local da bexiga dos camundongos testados. c) Ensaio de viabilidade co-cultura esplenócito - célula tumoral MB49: inicialmente, as células tumorais MB49 foram cultivadas em meio de cultura contendo RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg /ml) e 10% de soro bovino fetal, sendo mantidas em incubadora a 37 °C com atmosfera de CO2 a 5%. Após as células atingirem confluência foram tripsinizadas, contadas em câmara de Neubauer e tiveram sua viabilidade avaliada através da coloração de azul de Trypan. Procedeu-se, então, diluição celular, com RPMI 1640, na concentração de lxlO5 células/ mL, seguida de semeadura em placa de cultura celular de 48 poços e incubadas por 24 horas.For this procedure, the animals were again anesthetized and had the urethra catheterized, as described in Example 2. The treatments proposed for each group were carried out through one application per week, on days 1, 8, 15, 22, totaling 4 applications. On the 29th day, the mice were sacrificed and the bladders removed (cystectomy), weighed on a precision analytical balance, frozen in liquid nitrogen and stored in a freezer at 80 °C. The spleen, used to obtain splenocytes, was removed and kept in a petri dish containing RPMI1640 culture medium at 4 °C. a) Bladder weight: the evaluation of the weights (mg) of the bladders, taken from the animals in this trial, showed statistically significant differences between the groups treated with BCG and rBCG-SIPT in relation to the control group (SF) (Figure 2). The One-way Analysis of Variance test (p<0.01) was used to analyze the difference in bladder weights between the various groups and the Student-Newman-Keuls test for the pair-by-pair analysis, after the data were converted to the logarithmic scale. . The mean weight (mg) for the control group was 230±110 mg, for the BCG group it was 137±87 mg and for the RBCG-S1PT group it was 93±50 mg. A value of p<0.05 was considered for statistically significant analysis. Values were obtained from three experiments performed independently. In other words, the group that received saline solution had the highest bladder weights, and consequently the highest tumor volume. While the group treated with rBCG-SIPT showed the lowest bladder weights, which corresponds to a greater delay in tumor growth in the group treated with rBCG-SIPT compared to the control group. c) Thl/Th2 Immune Response Patterns: Thl/Th2 immune response patterns of the groups treated with SF, BCG and rBCG-SIPT were analyzed by the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. Initially, the bladder fragments frozen in liquid nitrogen were processed for the extraction of total RNA (tRNA) by the Trizol® technique according to the manufacturer's instructions (GIBCO/BRL Life Technologies, Inc.). Then, tRNA samples were purified on RNeasy silica columns following the manufacturer's recommendations (QIAGEN). The amount (ODA26onrn x 20) and purity (ODA260nm/ODA28onm) of the extracted RNA was verified by spectrophotometry. Then, 1μg of tRNA was converted into complementary DNA (cDNA) through reverse transcriptase reaction, using: the enzyme Superscript™ III (Life Technologies'), oligo-dT primers and thermocycler (MJ Research PTC-200 Thermocycler, Watertown, MA, USA). Subsequently, the cDNAs from each of the samples were amplified using appropriate primers for the following genes IL-2, IL-5, IL-12p40, iNOS, TGF-β, TNF-α, INF-y, IL-10 and IL-6. The Universal PCR MasterMix solution (Applied Biosystems Inc -USA) and the 7500 Fast Real-Time PCR equipment (Applied Biosystems) were used in this assay, according to the quantification protocol based on SYBR Green (Applied Biosystems). All reactions were performed in triplicate. The expression results of the analyzed genes were normalized by the expression of the constitutive gene GAPDH using primers defined by Overbergh, in 1999 (Overbergh L, Valckx D, Waer M, Mathieu C (1999) Quantification of murine cytokine mRNAs using real time quantitative reverse transcriptase PCR Cytokine 11:305-312). In the groups treated with immunotherapeutics, a significant increase in TNF-a expression was observed in relation to the control group, and in the group treated with rBCG-SIPT this response was more intense. This fact signals for a Thl-type polarized response. When we analyzed the interleukins related to the Th2 response pattern, a significant increase in IL-10 expression was observed in the group treated with rBCG-SIPT (Figure 3). It is important to point out that in experimental assays with the MB49 tumor cell line it was detected that they do not produce IL-10, therefore the quantified levels come from the local response of the bladder of the tested mice. c) Splenocyte co-culture viability assay - MB49 tumor cell: initially, MB49 tumor cells were cultured in culture medium containing RPMI 1640 (GIBCO Life Technologies), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml) and 10% fetal bovine serum, being kept in an incubator at 37 °C with a 5% CO2 atmosphere. After the cells reached confluence, they were trypsinized, counted in a Neubauer chamber and had their viability evaluated by Trypan blue staining. Cellular dilution was then carried out with RPMI 1640 at a concentration of 1x105 cells/mL, followed by seeding in a 48-well cell culture plate and incubated for 24 hours.

Os baços que foram removidos dos camundongos tratados foram macerados e passados por peneiras com porosidade de 70 μm {Cell stralner-BD Falcon, Bedford, MA). Os esplenócitos, assim obtidos, de cada grupo (SF, BCG e rBCG- SIPT) foram lavados duas vezes em PBS e colocado em co- cultura, amostras em triplicata, com as células MB49 nas proporções de 10:1 e 50:1 por 18 horas.Spleens that were removed from the treated mice were macerated and passed through 70 µm porosity sieves (Cell stralner-BD Falcon, Bedford, MA). The splenocytes thus obtained from each group (SF, BCG and rBCG-SIPT) were washed twice in PBS and placed in co-culture, samples in triplicate, with MB49 cells in the proportions of 10:1 and 50:1 per 18 hours.

Quantificou-se, então a viabilidade das células MB49 utilizando-se o ensaio de citotoxidade com Alamar Blue (Biosource, Carlsbad, CA) , conforme orientações do fabricante, onde metade do volume do meio da co-cultura foi substituído por novo RPMI 1640 contendo 20% de Alamar Blue , e mantido em incubação por 4 horas. A seguir, o nivel de redução da solução foi medido (OD570- 600 r]m) em leitor monocromador de microplacas da SpectraMax 340PC (Molecular Devices - USA).The viability of MB49 cells was then quantified using the cytotoxicity assay with Alamar Blue (Biosource, Carlsbad, CA), according to the manufacturer's guidelines, where half the volume of the co-culture medium was replaced by a new RPMI 1640 containing 20% Alamar Blue, and incubated for 4 hours. Next, the reduction level of the solution was measured (OD570-600 m]m) in a SpectraMax 340PC monochromator microplate reader (Molecular Devices - USA).

Como controles internos do ensaio, foram utilizadas culturas de esplenócitos de cada um dos grupos em estudo, células MB49 vivas e mortas. Como parâmetro de viabilidade 0% (morte) foi adicionado o detergente triton X 100 nas células MB49 na concentração final de 1%.As internal controls of the assay, cultures of splenocytes from each of the study groups, live and dead MB49 cells, were used. As a 0% viability parameter (death) the detergent triton X 100 was added to MB49 cells at a final concentration of 1%.

A viabilidade das células MB49 foi calculada baseada na seguinte equação: Viabilidade=(MBSp - Sp - MBD) / (MBL - MBD) quando MBSp= OD (570- 600 T|m) de MB49 + poço esplenócitos co-cultura, MBL= OD (570- 600 T|m) do poço da MB49 viva em cultura simples, MBD= OD (570- 600 T|m) do poço de MB49 morta e Sp= OD (570- 600 T|m) do poço de cultura de esplenócitos.The viability of MB49 cells was calculated based on the following equation: Viability=(MBSp - Sp - MBD) / (MBL - MBD) when MBSp= OD (570-600 T|m) of MB49 + well splenocytes co-culture, MBL= OD (570-600 T|m) of live MB49 well in single culture, MBD= OD (570-600 T|m) of dead MB49 well and Sp= OD (570-600 T|m) of culture well of splenocytes.

A análise de citotoxicidade com a linhagem celular MB49 após lδh de co-cultura com esplenócitos de camundongos tratados com doses semanais de BCG, rBCG-SIPT ou SF, durante quatro semanas, evidenciou menor viabilidade das células tumorais frente ao rBCG-SIPT, nas duas proporções testadas (1:10 e 1:50). O teste estatístico utilizado foi análise de variância (p<0,05) (Figura 4).Cytotoxicity analysis with the MB49 cell line after 1δh of co-culture with splenocytes from mice treated with weekly doses of BCG, rBCG-SIPT or SF, for four weeks, showed lower viability of tumor cells against rBCG-SIPT, in both tested proportions (1:10 and 1:50). The statistical test used was analysis of variance (p<0.05) (Figure 4).

O ensaio de viabilidade celular demonstrou que os esplenócitos dos camundongos tratados com rBCG-SIPT foram mais eficientes na destruição das células tumorais.The cell viability assay demonstrated that splenocytes from mice treated with rBCG-SIPT were more efficient in destroying tumor cells.

EXAMPLE 4: Survival Assay

Procedeu-se como descrito no Exemplo 3, porém, os animais não foram sacrificados e, sim, acompanhados por 60 dias e, diariamente, os mortos de cada grupo iam sendo contabilizados. A quantidade de células tumorais MB49, também diferiu neste experimento implantou-se lx 105 por camundongo.Proceeded as described in Example 3, however, the animals were not sacrificed, but followed for 60 days and, daily, the deaths of each group were being counted. The amount of MB49 tumor cells also differed in this experiment, lx 105 per mouse was implanted.

A curva de sobrevida individual dos animais com tumor vesical demonstrou diferença significativa entre o grupo tratado com rBCG-SIPT e os demais (Figura 5).The individual survival curve of animals with bladder tumor showed a significant difference between the group treated with rBCG-SIPT and the others (Figure 5).

Claims

1. Immunotherapy characterized by the fact that it comprises a strain of Mycobacterium bovis, bacillus Calmette Guerin (BCG) recombinant that encodes at least one Bordetella pertussis antigen, in which the strain is auxotrophic for lysine, complemented with the lysA gene, and in which the Bordetella pertussis antigen is subunit 1 of the pertussis toxin, S1PT.

2. Pharmaceutical composition characterized in that it comprises an immunotherapeutic agent as defined in claim 1, and one or more of a physiologically acceptable vehicle, excipient, diluent or solvent.

3. Pharmaceutical composition according to claim 2, characterized in that it is for infusion.

4. Pharmaceutical composition according to claim 3, characterized in that the infusion is for intravesical administration.

5. Use of an immunotherapeutic as defined in claim 1 characterized by the fact that it is for the manufacture of a drug.

6. Use according to claim 5, characterized in that it is for the manufacture of a drug with inflammatory action and nonspecific activation of the immune system.

7. Use according to claim 5, characterized in that it is for the manufacture of a medicine for use in the treatment or prevention of cancer.

8. Use according to claim 7, characterized in that it is for the manufacture of a medicine for the treatment or prevention of bladder cancer.

9. Use according to claim 5, characterized in that it is for the manufacture of a medicine for intravesical infusion.