BRPI0812348B1

BRPI0812348B1 - Método para regulação descedente ou de redução da função biológica de uma proteína,molécula quimérica,vetor recombinate e método para isolar uma proteína de uma amostra

Info

Publication number: BRPI0812348B1
Application number: BRPI0812348-9A
Authority: BR
Inventors: Joost Schymkowitz; Frederic Rousseau
Original assignee: Vib Vzw; Vrije Universiteit Brussel
Priority date: 2007-06-04
Filing date: 2008-06-03
Publication date: 2019-07-09
Also published as: CN101772512A; CA2689120A1; IL202355A0; EP2162461B1; JP5689680B2; CA2689120C; BRPI0812348B8; IL202355A; AU2008258636B2; AU2008258636A1; US20100256069A1; CN104758918A; JP2015057387A; JP2010528637A; EP2162461A1; WO2008148751A1; BRPI0812348A2; DK2162461T3

Abstract

método para regulação descendente ou de redução da função biológica de uma proteína, molécula quimérica, vetor recombinante e método para isolar uma proteína de uma amostra a presente invenção pertence à área técnica de agregação de proteínas. a invenção divulga um método para interferência na função de uma proteína alvo e utiliza uma molécula não natural, concebida por um usuário, designada como agregador, que possui uma especificidade para uma proteína alvo e que induz agregação ao contatar a referida proteína alvo. a presente invenção divulga igualmente essas moléculas agregadoras e o uso das mesmas em aplicações terapêuticas e de diagnóstico.

Description

» MÉTODO PARA REGULAÇÃO DESCENDENTE OU DE REDUÇÃO DA FUNÇÃO

BIOLÓGICA DE UMA PROTEÍNA, MOLÉCULA QUIMÉRICA, VETOR RECOMBINANTE E MÉTODO PARA ISOLAR UMA PROTEÍNA DE UMA AMOSTRA

Campo da invenção ι A presente patente insere-se na área técnica de *

agregação de proteínas. A invenção divulga um método de interferência na função de uma proteína alvo e utiliza uma molécula não natural concebida por um usuário, designada 10 como agregador, que apresenta uma especificidade relativamente a uma proteína alvo e que induz agregação ao contatar a referida proteína alvo. A presente invenção também divulga essas moléculas agregadoras e sua utilização em aplicações terapêuticas e de diagnóstico.

Antecedentes da invenção ' A agregação de proteínas tornou-se um tópico de grande importância tanto nas ciências de biotecnologia guanto de medicina. Ela constitui o principal obstáculo na produção de proteínas, estreitando o espectro de polipeptídeos relevantes obtidos por técnicas de recombinação; reduz o tempo de vida útil de armazenagem e pode aumentar a imunogenicidade de drogas polipeptídicas;

' além de se encontrar associada com um crescente número de doenças humanas de caráter crítico, incluindo a doença de 25 Alzheimer, encefalopatias -espongiformes, diabetes mellitus e doença de Parkinson. Na última década começaram a ser acumulados dados que sugerem que a composição e a estrutura primária de um polipeptideo determina em grande medida sua propensão para se agregar, e que pequenas alterações podem ter uma enorme influência em termos de solubilidade. A capacidade para prever a propensão de agregação de uma proteína a partir de sua seqüência é de grande valor conforme é testemunhado pelos inúmeros algoritmos capazes de prever seqüências de beta-agregação em proteínas. Estes algoritmos são úteis no controle de eventos de deposição de proteínas indesejáveis através de métodos terapêuticos 10 específicos orientados para seqüências ou na descobertas de variantes mais solúveis de proteínas de interesse biotecnológico. É normalmente suposto que nem todas as regiões de um polipeptideo são igualmente importantes para determinação de sua tendência à agregação. Neste contexto, 15 foi recentemente provado que extensões muito curtas de aminoácidos específicos podem atuar como facilitadores ou inibidores de formação de fibrilas amilóides. No campo da proteomia funcional existe uma necessidade de desenvolvimento de tecnologias inovadoras para aceleração 20 das descobertas e para maximização de potencial apresentado por métodos complementares em genômica funcional. Seria desejável ter acesso a uma tecnologia flexível capaz de tomar diretamente como alvo a função biológica de uma proteína extracelular ou intracelular específica ao invés 25 de tomar como alvo o mRNA que realiza a transferência da mesma ou manipular o gene que codifica a mesma. Na presente invenção, os inventores procuraram desenvolver uma tecnologia para orientação a alvo de proteínas especificas com base em agregação. Até este ponto, a agregação de proteínas tem sido principalmente estudada como um fenômeno indesejável e causador de doenças, sendo amplamente 5 aceitada a proposição de que a agregação com mediação betacruzada constitui o mecanismo de agregação de ocorrência mais frequente e biologicamente mais relevante². A agregação beta-cruzada é o termo utilizado para indicar que a agregação é nucleada através da formação de beta-lâminas 10 intermoleculares para as quais cada molécula do agregado contribui com uma fita idêntica compreendendo tipicamente pelo menos três aminoácidos contíguos. O pedido de patente internacional n° WO 03/102187 (Scegen, Pty, Ltd) divulga um método para aumentar a atividade de uma molécula mediante 15 fusão da referida molécula a uma sequência de translocalização de membrana, em que a molécula quimérica resultante se auto-organiza formando um agregado de peso molecular mais elevado. O documento norte americano n° US 2005/50026165 (Areté Associates) divulga a utilização de 20 peptídeos conformacionais, capazes de interação com a conformação de lâminas beta de proteínas insolúveis tais como príons, como uma ferramenta de diagnóstico para doenças envolvendo príons. O pedido de patente internacional n° WO 2007/7010110 descreve a indução de 25 agregação de proteínas mediante a utilização de compostos policíclicos.

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a uma tecnologia para agregação de proteínas controlada e passível de indução relativamente a proteínas alvo específicas. A invenção lí também proporciona moléculas concebidas de novo, aqui designadas como moléculas agregadoras, que compreendem pelo menos uma região de beta-agregação acoplada a uma região de ligação com uma afinidade para uma proteína alvo. Em uma configuração preferencial a molécula agregadora compreende pelo menos uma região de beta-agregação que é fundida com uma região capaz de se ligar (ou interagir com) a proteína alvo. Após o contato entre uma proteína alvo selecionada e uma molécula agregadora especificamente concebida, ocorre uma co-agregação específica entre o alvo e o agregador, produzindo como resultado uma deleção knock-out ou uma regulação descendente da função biológica da referida proteína alvo. Este knock-down de proteína depende da presença de agregados, que são induzidos pela presença da molécula agregadora. Uma vantagem adicional consiste no fato de a intensidade da interferência na proteína poder ser controlada experimentalmente mediante variação do número de regiões de beta-agregação na molécula agregadora. A invenção não somente proporciona um instrumento de pesquisa eficiente para regulação descendente (down25 regulation) da função biológica de uma proteína extracelular ou intracelular específica mas possui igualmente importantes aplicações nas áreas terapêutica, de agricultura e de diagnóstico.

Legendas das Figuras

Figura 1:

A figura ilustra a atividade residual percentual de

HRP no sobrenadante após a remoção dos co-agregados por centrifugação (vide o Exemplo 1). A presença do agregador (peptídeo biotinilado) remove claramente a enzima da fração solúvel.

Objetivos e descrição detalhada da invenção

Na presente invenção, os inventores desenvolveram um processo para regulação descendente da função biológica de uma proteína mediante a utilização de moléculas de ocorrência não natural que compreendem uma região capaz de se ligar à referida proteína e pelo menos uma seqüência de beta-agregação. Após o contato com uma proteína alvo, ocorre uma co-agregação entre a referida molécula de ocorrência retira o resultado solúvel.

não alvo um natural e a proteína alvo.

de seu ambiente solúvel e knock-down

A agregação produz como funcional da proteína alvo

O termo 'agregação' deverá ser entendido no sentido de que a agregação pode consistir alternativamente em agregação amórfica ou fibrilar (os termos amilóide ou fibrilar beta-cruzado são termos equivalentes). Na realidade, o tipo da região de beta-agregação determina a indução de agregação amórfica ou fibrilar de uma proteína alvo.

Assim, em uma configuração, a invenção proporciona um método para regulação descendente da função biológica de uma proteína, compreendendo a provisão de contato da referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural compreendendo uma região capaz de se ligar à referida proteína e pelo menos uma seqüência de betaagregação. A expressão 'capaz de se ligar a uma proteína alvo' significa 'capaz de interagir com uma proteína alvo' ou em outras palavras ainda, significa 'tendo uma afinidade relativamente à proteína alvo'. Deverá ser entendido que a referida afinidade se situa na faixa de afinidade micromolar até afinidade picomolar, preferencialmente na faixa de afinidade nanomolar a picomolar. Desta forma, a afinidade de um agregador (ou um domínio de ligação do mesmo capaz de se ligar a uma proteína alvo) relativamente 15 a uma proteína alvo é de pelo menos 10⁴ mol”¹ (por exemplo, pelo menos ΙΟ⁵, ΙΟ⁶, ΙΟ⁷, ΙΟ⁸, ΙΟ⁹, ΙΟ¹⁰, 10¹¹ ou 10¹² mol·¹) .

Deverá ser entendido que uma tal molécula de ocorrência não natural é uma molécula quimérica que compreende uma fusão de dois elementos: uma região de ligação e pelo menos uma 20 seqüência de beta-agregação, em que os dois elementos não têm afinidade relativamente um ao outro e/ou os referidos elementos não se ligam um ao outro. Uma ausência de afinidade significa que a afinidade é menor que um valor superior a 10⁴ mol¹. Em uma configuração preferencial os 25 referidos elementos são diferentes da proteína alvo que se pretende regular descendentemente (ou em termos equivalentes: que se pretende agregar). Em uma outra configuração preferencial adicional a referida região de ligação pode modular a função de uma proteína alvo. Em uma outra configuração preferencial adicional a referida região de ligação não modula a função de uma proteína alvo, significando que a região de ligação (quando apenas de ligação) meramente liga a proteína alvo sem interferir na função biológica da proteína alvo. Em uma configuração específica, uma proteína alvo é uma proteína de fusão tal como uma proteína de fusão de histidina, uma proteína de 10 fusão de estreptavidina, uma proteína de fusão de GFP, e similares.

termo 'região de ligação' ou 'domínio de ligação' refere-se tipicamente a uma molécula que interage com a proteína alvo. Em certos casos um domínio de ligação é um 15 composto químico (por exemplo, um pequeno composto com uma afinidade relativamente a pelo menos uma proteína alvo) e em certos outros casos um domínio de ligação é um polipeptídeo, em certos outros casos um domínio de ligação é um domínio de proteína. Um domínio de ligação de proteína 20 é um elemento da estrutura geral de proteína que é autoestabilizável e frequentemente dobra-se independentemente do resto da cadeia de proteínas. Os domínios de ligação variam em extensão desde cerca de 25 aminoácidos até 500 aminoácidos e mais. Muitos domínios de ligação podem ser 25 classificados em dobras e constituem estruturas 3-D identificáveis e passíveis de reconhecimento. Algumas dobras são tão comuns em muitas diferentes proteínas que são atribuídos nomes especiais às mesmas. Exemplos não limitativos incluem as dobras de Rossman, os barris TIM, as repetições armadillo, os zípers de leucina, os domínios de caderina, os domínios causadores de morte (death effector domains), os domínios similares a imunoglobulina, os domínios de ligação de fosfotirosina, o domínio de homologia pleckstrin, o domínio 2 de homologia de src, o domínio de BRCT de BRCA1, os domínios de ligação de proteína-G, o domínio de homologia Eps 15 (EH) e o domínio 10 de ligação de proteína de p53. Os anticorpos são o protótipo natural das proteínas de ligação específica com especificidade mediada através de regiões de enlace hipervariável, normalmente designadas como regiões de determinação complementar (Complementary

Determining

Regions - CDR). Muito embora de uma forma geral, os scaffolds semelhantes a anticorpos tenham provado funcionar bem como ligantes específicos, tornou-se aparente que não é absolutamente necessário aderir estritamente ao paradigma de um scaffold rígido que apresenta enlaces 20 tipo CDR. Adicionalmente aos anticorpos, muitas outras proteínas naturais mediam interações específicas de alta afinidade entre domínios. As alternativas às imunoglobulinas proporcionaram pontos de partida atraentes para a construção de novas moléculas de ligação (reconhecimento). O termo scaffold, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a uma estrutura de proteína capaz de portar aminoácidos alterados ou inserções de proteínas alvo seqüências que conferem ligação a específicas. A engenharia de scaffolds e a construção de bibliotecas constituem processos mutuamente interdependentes. Para obtenção de ligantes específicos, é 5 necessário gerar uma biblioteca combinatorial do scaffold. Isto é normalmente realizado ao nível de DNA mediante randomização dos códons em posições de aminoácido apropriadas, mediante a utilização alternativa de trinucleotídeos ou códons degenerados. Uma ampla gama de diferentes scaffolds não constituídos por imunoglobulina com origens e características amplamente diversas é atualmente utilizada combinatoriais. Alguns dimensões a passo que scaffolds variam de um scFv de a maioria modulares tamanho repetitivas.

Uma compreende ligantes para exibição de deles são comparáveis bibliotecas em termos de um anticorpo (cerca de 30 kDa) , dos mesmos são muito menores.

baseados dependendo lista não baseados no de tipo III humano, ligantes ao

Os em proteínas do número limitativa

10° domínio de baseados em de de repetidas unidades exemplos fibronectina lipocalinas, ligantes baseados em domínio

SH3, ligantes baseados em membros da família das knotinas, ligantes baseados em CTLA-

4, receptores de células-T, neocarzinostatina, módulo de ligação de carboidrato 4-2, tendamistat, inibidores de 25 domínio de kunitz, domínios PDZ, domínio de homologia de

Src (SH2), toxinas de escorpião, defensina A de insetos, proteínas de dedo de homeodomínio de plantas, enzima bacteriana TEM-1 beta-lactamase, domínio de ligação de lg de proteína A de Staphylococcus aureus, proteína de imunidade E7 de colicina de E. coli, citocromo b562 de E. coli, domínios de repetição de anquirina. Também são 5 incluídos como domínio de ligação compostos com uma especificidade para uma determinada proteína alvo, ligantes de peptídeos lineares e cíclicos, aptâmeros de peptídeos, proteínas de avímero multivalentes ou drogas imunofarmacêuticas com baixas características modulares, 10 ligantes com uma especificidade para um receptor ou um coreceptor, parceiros de ligação de proteínas identificados em uma análise de dois-híbridos, domínios de ligação baseados na especificidade da interação de alta afinidade de biotina-avidina, domínios de ligação baseados na 15 especificidade de proteínas de ligação de ciclofilinaFK506. São igualmente incluídas lectinas com uma afinidade para uma estrutura específica de carboidrato.

Em uma outra configuração ainda, a invenção proporciona um método para regulação descendente da função 20 biológica de uma proteína compreendendo o contato da referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural (ou com uma molécula quimérica) que compreende uma parte A e uma parte B em que i) a parte A é a região de ligação capaz de se ligar à referida proteína e ii) a parte 25 B que compreende pelo menos 1 região de beta-agregação. Em uma configuração específica, a referida pelo menos uma região de beta-agregação consiste em pelo menos 3 aminoácidos contíguos. Em uma configuração específica, a referida região de beta-agregação é derivada da proteína alvo. Em uma outra configuração específica, a referida região de beta-agregação é diferente da proteína alvo (isto 5 é, é derivada de uma proteína diferente) . Em uma outra configuração ainda a referida região de beta-agregação é uma seqüência artificial de polipeptídeo (isto é, não derivada de uma seqüência de proteína existente, isto é, não encontrada na natureza). Em uma outra configuração 10 específica, um elemento de ligação encontra-se presente entre as partes

A e B. Um tipo particular de região de beta-agregação uma região amilóide.

Em uma outra configuração, a parte B da molécula de ocorrência pelo menos nao natural (ou molécula quimérica) compreende regiões de beta-agregação.

termo 'molécula de ocorrência não natural' ou 'molécula refere-se quimérica' ou 'molécula quimérica ao fato de essa molécula ser humana. Por exemplo, quando uma molécula é de de fusão' fabricação um polipeptídeo (isto é, tanto a parte A quanto a parte B essa parte B do polipeptídeo é construída in silico ou é isolada de uma proteína na natureza (isto é, uma região de beta-agregação) ou mediante fusão (ou acoplamento) da referida parte B à referida parte A que é uma região capaz 25 de se ligar a uma proteína, em que é entendido que A e B não possuem afinidade entre si (isto é, não se ligam entre si, ou em outras palavras: não interagem entre si). Ainda em outras palavras, a região (ou seqüência) de betaagregação funde-se com uma região de ligação que é diferente de uma fusão de ocorrência natural entre a parte A e a parte B em pelo menos um aminoácido natural.

Tipicamente, essas moléculas quiméricas não existirão na forma de um polipeptideo contíguo em uma proteína codificada por um gene em um genoma não recombinante.

Deverá ficar claro que as moléculas agregadoras podem ser construídas de uma forma modular, mediante 10 introdução de repetição e alteração da ordem das partes A e B. Uma lista não limitativa das seguintes combinações é: um agregador com a estrutura A-B -, um agregador com a estrutura B-A -, um agregador com a estrutura A'-B-A e um agregador com a estrutura B'-A-B em que se encontra opcionalmente presente um elemento de ligação (espaçador) entre as partes A, A', A e Β, B', B. A, A' e A são frações diferentes ou similares (por exemplo, diferentes seqüências de peptídeos ou diferentes frações químicas). B, B' e B são seqüências de auto-associação diferentes ou 20 similares (por exemplo, B é uma seqüência de beta-agregação derivada da proteína alvo e B' é uma seqüência de betaagregação sintética).

A expressão 'regulação descendente da função de uma proteína' significa que a atividade biológica normal de uma 25 proteína é reduzida (inibida, regulada descendentemente, reduzida e perturbada são aqui palavras equivalentes) ou que a proteína é retirada de seu ambiente biológico normal (por exemplo, uma proteína que é um residente normal de um retículo endoplásmico não se encontra presente mediante regulação descendente de sua função) através de agregação induzida (isto é, uma co-agregação entre o agregador e a proteína alvo). Desta forma, mediante aplicação do método da invenção, a função de uma proteína é perturbada mediante uma agregação da referida proteína realizando-se o contato da referida proteína com a molécula não natural da presente invenção. A referida molécula não natural é aqui designada como 'o agregador' ou a 'molécula agregadora'. A agregação refere-se ao fato de uma proteína que é normalmente solúvel ser transformada em uma proteína insolúvel ou uma proteína agregada em seu ambiente biológico normal mediante contato direto ou ligação com o agregador. A expressão 'regulação descendente da função de uma proteína' pode igualmente ser intercambiada com a expressão 'knocking down da função de uma proteína' ou 'interferência negativa na função de uma proteína'. A regulação descendente da função de uma proteína pode igualmente significar que a proteína já não se encontra presente em uma forma solúvel na célula ou que uma proteína já não se encontra presente em uma forma solúvel em seu ambiente biológico normal (por exemplo, sua localização (sub)-celular ou extracelular) . Adicionalmente, a expressão pode igualmente significar que a proteína agregada é degradada através dos mecanismos de limpeza naturais da célula e já não é detectável em forma solúvel ou insolúvel. Adicionalmente, a expressão pode igualmente

significar	que uma proteína receptora transmembrana não
pode mais	ligar-se a seu ligante normal através de uma
agregação	induzida por agregador da referida proteína

transmembrana (por exemplo, por formação de uma fusão entre um ligante que normalmente se liga ao referido receptor de fator de crescimento com pelo menos um domínio de betaagregação). Desta forma, a regulação descendente da função de uma proteína pode igualmente significar que uma proteína que é normalmente residente, por exemplo, em mitocôndrios não se encontra mais ali presente através do método de agregação de proteína induzida. Em uma configuração específica, a 'regulação descendente da função de uma proteína' ou a 'interferência negativa na função de uma proteína' ou 'knocking down da função de uma proteína' constitui uma perda de função de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mesmo de 100% em comparação com a função normal (100%) da proteína.

A função de uma proteína ou a ausência da presença de uma proteína em seu ambiente (localização) biológico normal não pode ser convenientemente determinada por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, dependendo da proteína alvo de interesse, a função pode ser determinada mediante medição da atividade enzimática reduzida. A presença reduzida de uma proteína em sua localização biológica normal pode, por exemplo, ser medida pela ausência de formação de um complexo, pela ausência de ocorrência de uma proteína alvo em um compartimento subcelular, a presença da proteína alvo em forma solúvel, a presença da proteína alvo em uma forma agregada (insolúvel é aqui um termo equivalente). Alternativamente, o efeito da regulação descendente de uma proteína alvo pode ser medido em um ensaio celular (por exemplo, perda ou ganho de crescimento, perda ou ganho de invasão, perda ou ganho de atividade proteolítica).

Em uma configuração específica essa atividade biológica normal (ou função normal ou localização normal) de uma proteína pode ser objeto de interferência por via intracelular ou extracelular. 'Intracelular' refere-se à localização de uma proteína no interior da célula de um organismo ou hospedeiro (por exemplo, o citoplasma, os mitocôndrios, o lisossoma, o vacúolo, o núcleo, cloroplasto,

Reticulum mitocôndrica, 'Extracelular'

ER) não retículo endoplásmico (Endoplasmic , a membrana celular, a membrana membrana cloroplástica, somente se refere à localização de uma proteína no meio extracelular da célula mas refere-se igualmente a proteínas que contatam o meio extracelular tais como proteínas ancoradas a membrana, uma proteína transmembrana, etc. Exemplos não limitativos de proteínas 25 extracelulares são proteínas segregadas (por exemplo, proteases, anticorpos e citocinas presentes no sangue ou plasma) ou proteínas presentes na matriz extracelular (por exemplo, metaloproteínas matriciais e proteínas transmembrana (por exemplo, um receptor de fator de crescimento)).

As células ou hospedeiros que podem ser constituídos como alvos através do método da invenção compreendem células procarióticas e eucarióticas. Exemplos não limitativos são vírus, bactérias, fermentos, funqos, protozoários, plantas e mamíferos, incluindo seres humanos.

Deverá ser claro que o método de regulação descendente da função biológica de uma proteína pode ser utilizado para interferência na função biológica de 1, 2, 3, 4, 5 ou até mais proteínas simultaneamente. Particularmente na medida em que a parte A compreende pelo menos uma região de ligação, a parte A pode por exemplo compreender diferentes regiões de ligação, cada uma das mesmas sendo específica para uma proteína diferente.

O agregador utilizado para interferência na função biológica de pelo menos uma proteína alvo não se encontra naturalmente presente na natureza e não pode ser obtido através de síntese química ou através de expressão de proteína recombinante ou através de uma combinação destas últimas.

Desta forma, uma molécula agregadora compreende pelo menos uma região de beta-agregação (portanto a parte B compreende pelo menos uma região de beta-agregação). Uma 'região de beta-agregação' é aqui definida como uma seqüência contígua de aminoácidos que apresenta uma elevada tendência para formar um conjunto molecular estrito com seqüências idênticas ou muito proximamente associadas. Uma 'região de beta-agregação' pode igualmente ser designada como uma 'região de auto-associação' . A expressão 'tem uma elevada tendência para formar um conjunto molecular estrito' pode igualmente ser interpretada como 'tem uma elevada afinidade'

A afinidade é normalmente traduzida em valores de dissociação (valores Kd) . Os valores Kd entre regiões de beta-agregação situam-se tipicamente entre faixas micromolares e nanomolares, porém podem ser subnanomolares ou supra-micromolares. Exemplos de regiões de beta-agregação são regiões de folha beta intermolecular, elementos alfa-helicoidais, regiões amilóides, enlaces tipo gancho de cabelo (hairpin loops), seqüências 15 transmembrana e seqüências de sinalização. Em uma configuração especifica pelo menos uma região de betaagregação encontra-se presente na parte B. Em uma outra configuração especifica pelo menos duas regiões de betaagregação encontram-se presentes na parte B. Em uma outra 20 configuração especifica, 3, 4, 5, 6 ou mais regiões de beta-agregação encontram-se presentes na parte B. As referidas regiões de beta-agregação podem ser interligadas por uma região de interligação (por exemplo, um espaçador de cerca de 2 até cerca de 4 aminoácidos). A proteína alvo 25 é aqui definida como a proteína em cuja função se pretende interferir. Desta forma, para tornar o agregador específico para pelo menos uma proteína, pelo menos uma região de ligação na parte A deverá ser capaz de se ligar à referida proteína alvo. É preferencial que a extensão de uma região de beta-agregação consista em pelo menos 3 aminoácidos contíguos. Em uma configuração preferencial a referida 5 região consiste em cerca de 3 até cerca de 30 aminoácidos.

Em uma outra configuração preferencial a referida região consiste em cerca de 3 até cerca de 25 aminoácidos. Em uma configuração particularmente preferencial, a referida região consiste em cerca de 5 até cerca de 20 aminoácidos.

As regiões de beta-agregação presentes na parte B da molécula agregadora são opcionalmente acopladas com um espaçador (ou elemento de ligação) entre as referidas regiões de beta-agregação. Por exemplo, as regiões de betaagregação que podem ser utilizadas podem ser derivadas de regiões de beta-agregação de proteínas que não ocorrem normalmente no hospedeiro (desta forma, algumas regiões de beta-agregação na parte B podem ser obtidas de um organismo não associado). A natureza das regiões de beta-agregação determina inibição) induzida.

utilizada o nível de uma

Mais de de inibição (isto é, a intensidade de proteína alvo através de agregação uma região de beta-agregação pode ser em uma molécula agregadora, e podem igualmente ser utilizadas regiões de beta-agregação configuração específica, tais regiões consistem em uma seqüência sintética que sintéticas. Em uma de beta-agregação não é derivada de proteínas existentes e portanto não ocorre na natureza.

Exemplos de tais regiões de auto-associação sintéticas são descritos em López de la Paz M e outros (2002) PNAS 99, 25,

p. 16053, tabela 1, que se encontra aqui incorporado a título de referência.

Nas moléculas agregadoras a parte B e a parte A podem ser opcionalmente interligadas (ou acopladas) por meio de uma região de interligação (um espaçador é uma palavra equivalente). A referida região de interligação pode consistir, por exemplo, em um elemento de interligação não natural obtido por síntese química (por exemplo, um elemento de interligação flexível tal como uma cadeia de alcano hidróxi-substituído, dextran, polietileno glicol e o elemento de interligação pode igualmente consistir em homólogos de aminoácidos) ou o referido elemento de interligação pode existir em aminoácidos naturais tais como poli(treonina) ou poli(serina). Preferencialmente, quando o elemento de interligação compreender aminoácidos, a extensão da referida região de interligação será de entre cerca de 3 e cerca de aminoácidos, mais preferencialmente entre cerca de cerca de aminoácidos.

Frequentemente poderá ser selecionado um elemento de interligação flexível, porém é previsto que um elemento de interligação rígido será igualmente eficiente.

As seqüências de elementos de interligação flexíveis podem ser obtidas da natureza, na maioria dos casos essas regiões ligam domínios em proteínas de ocorrência natural, tal como o elemento de interligação entre os domínios SH2 e SH3 de src tirosina quinase ou o elemento de interligação entre os domínios BRCT de BRCA1.

O termo 'contato' refere-se ao processo em que o agregador e a proteína alvo interagem. Em uma forma o agregador é adicionado (por exemplo, o agregador encontrase presente em uma concentração particular em uma solução) a uma amostra compreendendo a proteína alvo. Em uma outra forma, a molécula agregadora é injetada em um organismo compreendendo a proteína alvo. 0 contato pode, por exemplo, ser realizado através do processo de transformação de uma célula compreendendo a proteína alvo, por exemplo, uma célula isolada, por exemplo em uma cultura de células, um microorganismo unicelular ou uma célula ou uma pluralidade de células em um organismo multicelular. A transformação implica que a molécula agregadora seja introduzida em um hospedeiro (por exemplo, uma célula) através de métodos conhecidos de transfecção ou transformação (por exemplo, por técnicas de transferência genética incluindo fosfato de cálcio, DEAE-dextran, eletroporação, microinjeção, métodos virais, utilização de lipossomos catiônicos (vide, por exemplo, Feigner

P. L. e outros (1987),

Proc. Natl. Acad.

Sei USA 84, 7 413), formulações lipídicas catiônicas disponíveis comercialmente, por exemplo, Tfx 50 (Promega) ou Lipofectamin2000 (Life Technologies), bombardeio com partículas, etc.). A molécula agregadora pode ser codificada por um vetor recombinante (por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo, um vetor viral) e pode ser sintetizada no interior de um hospedeiro. Em uma configuração alternativa a molécula agregadora pode ser introduzida em uma célula mediante fornecimento mediado por um carreador, por exemplo, por carreadores lipossomais ou nano-particulas ou por injeção. Em uma outra configuração alternativa adicional, a molécula agregadora pode ingressar em uma célula através de uma seqüência que media a penetração na célula (ou translocalização da célula). No último caso a molécula agregadora é adicionalmente modificada através do acoplamento sintético ou recombinante de uma seqüência de penetração de célula. Desta forma, a molécula agregadora (por exemplo, na forma de um polipeptideo) pode se adicionalmente fundida ou acoplada quimicamente a uma seqüência que facilita a transdução das proteínas acopladas por fusão ou acoplamento químico para células procarióticas ou eucarióticas. As seqüências que facilitam a transdução de proteínas são conhecidas das pessoas versadas na técnica e incluem, sem limitação,

Domínios	de Transdução de Proteínas. Preferencialmente, a
referida	seqüência é selecionada do qrupo que compreende a
proteína	TAT de HIV, uma seqüência de poliarginina,

penetratina e pep-1. Ainda outros peptídeos permeáveis para células normalmente utilizáveis (tanto peptídeos naturais quanto peptídeos artificiais) são divulgados em Joliot A. e

Prochiantz A. (2004) Nature Cell Biol. 6 (3) 189-193.

Em uma configuração específica o agregador consiste essencialmente em aminoácidos. Um Polipeptideo refere-se a um polímero no qual os monômeros são aminoácidos e são unidos entre si por ligações de amida, alternativamente referidos como um peptídeo. Quando os aminoácidos são alfaaminoácidos, é possível utilizar alternativamente o isômero ótico L ou o isômero ótico D. Adicionalmente, os 5 aminoácidos não naturais, por exemplo, beta-alanina, fenilglicina e homoarginina são igualmente incluídos. Os aminoácidos normalmente encontrados que não são codificados por genes podem igualmente ser utilizados na presente invenção. A totalidade ou parte dos aminoácidos utilizados 10 nos agregadores pode consistir alternativamente no isômero

D ou no isômero L. Adicionalmente, outros peptidomiméticos são igualmente úteis na presente invenção. Os presentes inventores referem-se especificamente e incorporam aqui a análise do desenvolvimento e uso de peptidomiméticos como 15 antagonistas para interações proteína-proteína de Sillerud

LO e Larson RS (2005) Curr Protein Pept Sei. 6(2):151-69.

Adicionalmente, os D-aminoácidos podem ser adicionados à seqüência de peptídeo para estabilização de características de alteração (turn features) (particularmente no caso da 20 glicina). Em uma outra abordagem, produtos de mimetização de alteração alfa, beta, gama ou delta (tais como dipeptídeos alfa, beta, gama ou delta podem ser empregados para mimetização de motivos estruturais e características de alteração em um peptídeo e podem simultaneamente 25 proporcionar estabilidade relativamente a proteólise e intensificar outras propriedades tais como, por exemplo, estabilidade conformacional e solubilidade.

Isolação de uma região de beta-agregaçao de uma proteína alvo :

As seqüências de beta-agregação são freqüentemente hidrofóbicas, porém isto nem sempre ocorre. Por exemplo, as regiões de beta-agregação (ou auto-associação) de fermento são beta-cruzada de polipeptídeo ou dos prions bastante polares. Na realidade, a agregação uma região de aminoácido derivada uma proteína pode ser iniciada mesma apresentar uma elevada hidrofobia, apresentar uma apresentar uma for exposta proteína de equivalente de um quando (D a (2) mesma boa propensão para β-lâmina, (3) mesma carga de valor líquido baixo (4) mesma um solvente.

Desta forma, as regiões de beta-agregação para 'região') enterradas no estado solvente. Este último experimental de que dobrado fato é ('segmento' são muito e não são um termo freqüentemente expostas ao confirmado pela descoberta em muitas proteínas globulares, agregação ocorre durante a re-dobradura ou em condições que estados desnaturados ou encontra significativamente concentração condições de

Com algoritmos agregação constitui em elevada ou como desestabilização.

base nestas de computador (segmentos parcialmente dobrados populados, isto é, resultado de mutações se em ou descobertas foram desenvolvidos capazes de prever regiões de betaou extensões de β-agregação uma expressão equivalente) em proteínas. Um desses algoritmos, o algoritmo TANGO, baseado em um algoritmo de mecânica estatística que considera os três parâmetros físico-químicos descritos acima mas considera igualmente a competição entre conformações estruturais diferentes: agregados alteração-beta, hélice-alfa, lâmina5 beta e o estado dobrado (Fernandez-Escamilla, AM e outros (2004) Nat. Biotechnol. 22, 1302-1306, em que particularmente a seção de Métodos nas páginas 1305 e 1306 é aqui especificamente incorporada a título de referência, bem como as Notas Suplementares 1 e 2 do mesmo artigo para 10 detalhes adicionais dos métodos e conjuntos de dados utilizados para calibração e teste do algoritmo TANGO).

Desta forma, as regiões de beta-agregação presentes em proteínas alvo são passíveis de obtenção por algoritmos de computador tal como o TANGO. Um outro algoritmo que 15 determina regiões de beta-agregação, particularmente regiões amilóides, é o algoritmo SALSA que é descrito por Zibaee S e outros (2007) Protein Sc. 16(5):906-18. Um outro algoritmo ainda que pode determinar regiões com estrutura amilóide em proteínas é o algoritmo PASTA que é descrito 20 por Trovato A e outros (2006) PLoS Comput Biol 2(12):el70.

Um outro algoritmo ainda é o algoritmo Aggrescan (Conchillo-Sole O e outros (2007) BMC Bioinformatics 8:65. Este último algoritmo também prevê segmentos tendentes a agregação (isto é, regiões de beta-agregação) em proteínas.

As regiões de beta-agregação encontram-se frequentemente enterradas no núcleo das proteínas alvo¹⁰, protegendo efetivamente o peptídeo contra associação intermolecular através de uma barreira de energia correspondente à estabilidade das proteínas alvo¹¹. Em seu ambiente normal (por exemplo, citoplasma, matriz extracelular) a proteína alvo tem assistência de auxiliares 5 moleculares que ajudam a proteína a manter sua forma funcional monomérica¹². 0 algoritmo TANGO pode ser acessado na World Wide Web em http://tango.embl.de/. 0 algoritmo zyggregator constitui um outro exemplo (Pawar AP e outros (2005) J. Mol. Biol. 350, 379-392). Estes algoritmos identificam seqüências com tendência a agregação mediante comparação da classificação de propensão à agregação de uma determinada seqüência de aminoácido com uma propensão média calculada de um conjunto de seqüências de extensão similar.

A presente invenção utiliza estas regiões de beta15 agregação para a preparação de moléculas agregadoras que são utilizadas para a indução específica de agregação de proteínas. A parte B das moléculas agregadoras compreende pelo menos 1 região de agregação. É possível controlar a intensidade da interferência na proteína (a intensidade da 20 interferência na proteína é por exemplo o percentual de perda de função biológica de uma proteína alvo quando a referida proteína ou célula compreendendo a referida proteína é colocada em contato com uma molécula agregadora específica) através da incorporação de mais de uma região 25 de agregação na parte B da molécula agregadora. Na realidade, as regiões de agregação com uma classificação TANGO baixa (tipicamente entre 5% e cerca de 20%) podem ser repetidas na parte de B do agregador para 2, 3, 4 ou mais regiões de agregação. Como configuração alternativa, 1, 2 ou 3 ou 4 ou mais diferentes regiões de agregação com uma classificação TANGO baixa podem ser incorporadas à parte B 5 do agregador. Como outra configuração alternativa, 1, 2, 3, ou mais regiões de agregação sintéticas podem ser combinadas para a parte B para intensificação da regulação descendente de uma proteína alvo.

Desta forma, em uma outra configuração, a invenção proporciona uma molécula de ocorrência não natural capaz de agregar uma proteína alvo, em uma configuração específica a referida molécula não natural de natureza proteinácea.

Proteináceo aminoácidos aminoácidos significa que ou D-aminoácidos ou molécula compreende uma mistura de L- e

LDou uma combinação de aminoácidos naturais peptidomiméticos.

Em uma outra configuração ainda a invenção proporciona uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de beta-agregação isolada de um domínio de proteína capaz de ser solúvel em água em que a referida região de beta-agregação é fundida com uma fração que impede agregação da referida região de beta-agregação.

Em uma outra configuração ainda, a invenção proporciona uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de beta-agregação fundida com uma região capaz de se ligar a uma proteína alvo .

Em uma configuração específica, as moléculas agregadoras que compreendem pelo menos uma região de betaagregação fundida a uma região de ligação capaz de 5 interagir com uma proteína alvo consistem em polipeptídeos.

Em uma outra configuração específica a invenção proporciona um vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo que codifica essas moléculas agregadoras.

Em uma outra configuração específica, as moléculas 10 agregadoras da invenção são utilizadas como medicamento.

Aplicações terapêuticas das moléculas agregadoras

As proteínas são responsáveis por atividades biológicas situadas em uma faixa de numerosas reações enzimáticas, através de transdução de sinais para provisão 15 de estrutura. As alterações de estrutura de proteína, abundância ou atividade constituem a causa básica de muitas doenças. Muitas drogas atuam através de interferência específica com uma ou um número limitado de proteínas. A presente invenção proporciona um método para 20 desenvolvimento de uma nova classe de compostos capazes de interferirem especificamente com uma proteína alvo selecionada mediante utilização de uma região de ligação capaz de interagir com uma proteína alvo. Estes novos compostos são designados como agregadores.

Desta forma, em uma outra configuração ainda, a invenção proporciona a utilização como medicamento de uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de beta-agregação, em que a referida região de beta-agregação é fundida com uma região capaz de interagir com uma proteína alvo. A referida região de ligação impede a auto-agregação da referida molécula agregadora.

As referidas moléculas agregadoras podem ser utilizadas para tratamento de doenças e/ou na fabricação de um medicamento para tratamento de doenças, tal como câncer, associadas a uma expressão aberrante de pelo menos uma proteína alvo, tal como uma proteína oncogênica. O termo 'expressão aberrante' refere-se por exemplo à (sobre)expressão de uma proteína oncogênica em um caso de câncer, e inclui igualmente a expressão de uma proteína negativa dominante, a localização indesejável de uma proteína específica ou variante de splice de uma proteína específica, a expressão indesejável de uma variante de splice específica de uma proteína específica, uma atividade mais intensa de uma proteína mutante ou uma atividade mais intensa de uma proteína específica.

Em uma configuração específica, a expressão aberrante refere-se à presença indesejável de uma proteína modificada pós-transferencialmente ou à presença indesejável de uma proteína modificada não-póstransferencialmente. As modificações pós-transferenciais dos aminoácidos físico-químicas alteram as propriedades

modificados,	e como tal apresentam um	potencial
alteração da	tendência de agregação de	um determi
segmento de	polipeptídeo que pode ser	utilizado

para para nado constituir especificamente como alvo a forma que apresenta a tendência de agregação mais forte. Desta forma, se uma modificação pós-transferencial reduzir significativamente a tendência de agregação da região de beta-agregação, a 5 interferência será então mais eficiente com a proteína não modificada. Em contraste, no caso de modificações póstransf erenciais que aumentem a tendência de agregação da região de beta-agregação, a interferência será mais eficiente com a proteína modificada. Tomando com base 10 somente a hidrofobicidade, é suposto que modificações tais como fosforilação e glicosilação reduzirão a tendência de agregação, ao passo que o acoplamento de lipídeos aumentará a tendência de agregação.

A proteína alvo à qual a molécula agregadora de 15 acordo com a invenção é dirigida pode ser associada a uma condição patológica. Por exemplo, a proteína pode ser uma proteína associada a um patógeno, por exemplo, uma proteína viral, uma proteína associada a um tumor, ou uma proteína associada a uma doença auto-imune. Em um aspecto, a 20 invenção apresenta um método de tratamento de um paciente em uma situação de risco de, ou já tendo contraído uma condição de proliferação celular indesejável, por exemplo, uma proliferação de células malignas ou não malignas. O método inclui: provisão de uma molécula agregadora, por 25 exemplo um agregador possuindo uma estrutura conforme aqui descrita, em que a referida molécula agregadora é capaz de interferir na (inibir a) função e/ou presença de uma proteína que promoveu uma proliferação celular indesejável e a administração do referido agregador a um paciente, preferencialmente um paciente humano, dessa forma tratando o paciente.

Em uma configuração preferencial, a proteína é um fator de crescimento ou um receptor de fator de crescimento, uma quinase (por exemplo, uma tirosina, serina ou treonina quinase de proteína), uma proteína adaptadora, uma proteína da super-família de receptores acoplados a 10 proteína G, ou um fator de transcrição. Em uma configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função biológica da proteína PDGF-beta, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente que for portador ou se encontrar em risco de contrair um distúrbio 15 caracterizado por uma expressão indesejável de PDGF-beta, por exemplo, cânceres dos testículos e dos pulmões. Em uma outra configuração preferencial o agregador inibe (knocks down) a função e/ou presença da proteína Erb-B, e portanto pode ser utilizado para tratamento de um paciente que for 20 portador ou se encontrar em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de Erb-B, por exemplo, câncer de mama. Em uma outra configuração preferencial, o agregador inibe a função (ou interfere na função, o que é equivalente) da (ou interfere na presença 25 da) proteína Src, e portanto pode ser utilizado para tratamento de um paciente que for portador ou se encontrar em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de Src, por exemplo, cânceres do cólon. Em uma outra configuração preferencial, o agregador inibe a função e/ou a presença da proteína CRK, e portanto pode ser utilizado para tratamento de um paciente portador de ou correndo um risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de CRK, por exemplo, cânceres do cólon e/ou dos pulmões. Em uma outra configuração preferencial, o agregador interfere na função e/ou na presença da proteína GRB2, e portanto pode ser utilizado para tratamento de um paciente portador de ou correndo um risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de GRB2, por exemplo, carcinoma de célula escamosa. Em uma outra configuração preferencial a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença do gene RAS, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de ou correndo um risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de RAS, por exemplo, cânceres do pâncreas, do cólon e dos pulmões, e leucemia crônica. Em uma outra configuração preferencial a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína MEKK, e desta forma pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou correndo um risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de MEKK, por exemplo, carcinoma de célula escamosa, melanoma ou leucemia. Em uma outra configuração preferencial a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína

JNK, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de JNK, por exemplo, cânceres do pâncreas ou da mama. Em uma outra 5 configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína RAF e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de RAP, por exemplo, câncer do pulmão 10 ou leucemia. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína Erkl/2, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão 15 indesejável de Erkl/2, por exemplo, câncer do pulmão. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína PCNA (p21), e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio 20 caracterizado por uma expressão indesejável de PCNA, por exemplo, câncer do pulmão. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína MYB, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em 25 risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de MYB, por exemplo, câncer do cólon ou leucemia mielogênica crônica. Em uma configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína c-MYC, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de c-MYC, por exemplo, linfoma de

Burkitt ou neuroblastoma. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína JUN, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de JUN, por exemplo, cânceres dos ovários, da próstata ou da mama. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína FOS, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de FOS, por exemplo, cânceres de pele ou da próstata. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína BCL-2, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de BCL-2, por exemplo, câncer do pulmão ou da próstata ou linfoma não-Hodgkin. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína Ciclina D, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de Ciclina D, por exemplo, cânceres do esôfago e do cólon. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína VEGF, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de VEGF, por exemplo, cânceres do esôfago, do cólon ou angiogênese patológica. Em uma configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína EGFR, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de EGFR, por exemplo, câncer da mama. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína Ciclina A, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de Ciclina A, por exemplo, cânceres do pulmão e do colo cervical. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína Ciclina E, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de Ciclina E, por exemplo, cânceres do pulmão e da mama. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína WNT-1, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de WNT-1, por exemplo, carcinoma de células basais. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína beta-catenina, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de betacatenina, por exemplo, adenocarcinoma ou carcinoma hepatocelular. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína c-MET, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado pbr uma expressão indesejável de c-MET, por exemplo, carcinoma hepatocelular.

Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína quinase C (PKC), e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de PKC, por exemplo, câncer da mama. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína NFKappa-B, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de NFKappa-B, por exemplo, câncer da mama. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína STAT3, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de STAT3, por exemplo, câncer da próstata.

Em uma outra configuração preferencial, molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína survivina, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de survivina, por exemplo, cânceres do colo cervical ou do pâncreas. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína Her2/Neu, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de Her2/Neu, por exemplo, câncer da mama. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína topoisomerase I, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de topoisomerase I, por exemplo, câncer dos ovários e cânceres do cólon. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína topoisomerase II alfa, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de topoisomerase

II alfa, por exemplo, cânceres da mama ou do cólon.

Em um aspecto, invenção proporciona um método para tratamento de um paciente, por exemplo, um ser humano, em risco de incorrer ou tendo incorrido uma doença ou distúrbio que poderá obter benefícios através de inibição de angiogênese, por exemplo, câncer. O método inclui: provisão de uma molécula agregadora, por exemplo, uma molécula agregadora possuindo uma estrutura aqui descrita, cuja molécula agregadora é capaz de inibir (ou interferir na função de) uma proteína que media angiogênese e administração da molécula agregadora a um paciente, dessa forma tratando o paciente. Em uma configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína alfa v-integrina, e desta forma pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma presença indesejável de alfa v-integrina, por exemplo, tumores do cérebro ou tumores de origem epitelial. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína de receptor Fit-1, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma expressão indesejável de receptores de Fit-1, por exemplo, câncer e artrite reumatóide. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função e/ou na presença da proteína tubulina, e portanto pode ser utilizada para tratamento de um paciente portador de, ou em risco de contrair um distúrbio caracterizado por uma presença indesejável de tubulina, por exemplo, câncer e neovascularização retinal.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de um paciente infectado com um vírus ou em risco de contrair ou já tendo contraído um distúrbio ou doença associado com uma infecção viral. 0 método inclui: provisão de uma molécula agregadora, por exemplo, uma molécula agregadora possuindo a estrutura aqui descrita, cuja molécula agregadora é homóloga relativamente a, e capaz de silenciar, uma proteína viral ou uma proteína celular que media uma função viral, por exemplo, de entrada ou crescimento; e administração da referida molécula agregadora a um paciente, preferencialmente um paciente humano, dessa forma tratando o paciente. Como tal, a invenção proporciona métodos de utilização de agregadores para fabricação de um medicamento para tratamento de pacientes infectados por vírus incluindo o Vírus de Papiloma Humano, o Vírus de Imunodeficiência Humano (HIV), o Vírus de Hepatite B (HBV), o Vírus de Hepatite A (HAV), o Vírus de Hepatite C (HCV), o Vírus Sincicial Respiratório (RSV), o Vírus de Herpes Simplex (HSV), o Citomegalovirus (CMV), o Vírus de Epstein Barr (EBV), um rinovírus, o Vírus do Oeste do Nilo, o vírus de encefalite portado por carrapato, o vírus do sarampo (MV), ou o vírus da poliomielite.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta métodos de tratamento de um paciente infectado com um patógeno, por exemplo, um patógeno bacteriano, um patógeno de ameba, um patógeno parasita, ou um patógeno fúngico. 0 método inclui:

provisão de uma molécula agregadora, por exemplo, uma molécula agregadora possuindo uma estrutura aqui descrita, em que a referida molécula agregadora é capaz de interferir na função de uma proteína patogênica derivada do referido patógeno e administração da referida molécula agregadora a um paciente, preferencialmente um paciente humano, dessa forma tratando o paciente. A proteína alvo do patógeno pode ser uma proteína envolvida em crescimento, síntese de parede celular, síntese de proteína, transcrição, metabolismo de energia (por exemplo, o ciclo de Krebs), ou produção de toxina. Desta forma, a presente invenção proporciona um método para tratamento de pacientes infectados, por exemplo, por Plasmodium falciparum,

Mycobacterium ulcerans,

Mycobaterium tuberculosis,

Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus,

Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Chlamydia pneumoniae, ou Mycoplasma pneumoniae.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratamento de um paciente, por exemplo de um ser humano, em risco de contrair ou já tendo contraído uma doença ou distúrbio caracterizado por uma resposta imune indesejável, por exemplo, um distúrbio ou doença 5 inflamatória, ou um distúrbio ou doença auto-imune. O método inclui: provisão de uma molécula agregadora, por exemplo, uma molécula agregadora possuindo uma estrutura aqui descrita, em que tal molécula agregadora é capaz de inibir (regular descendentemente) a função e/ou presença de 10 uma proteína mediadora de uma resposta imune indesejável, e administração da referida molécula agregadora a um paciente, dessa forma tratando o paciente. Em uma configuração preferencial, a doença ou distúrbio consiste em uma isquemia ou lesão de reperfusão, por exemplo uma 15 lesão ou reperfusão de isquemia associada com infarto agudo do miocárdio, angina instável, bypass cardiopulmonar, intervenção cirúrgica (por exemplo, angioplastia, tal como angioplastia coronária transluminal percutânea), uma resposta a um tecido ou órgão transplantado (por exemplo, 20 tecido vascular ou cardíaco transplantado), ou trombólise.

Em uma outra configuração preferencial, a doença ou distúrbio consiste em restenose, por exemplo, restenose associada com uma intervenção cirúrgica (por exemplo, angioplastia, tal como angioplastia coronária transluminal 25 percutânea). Em uma outra configuração preferencial, a doença ou distúrbio é uma Doença Inflamatória do Intestino, por exemplo, Doença de Crohn ou Colite Ulcerativa. Em uma outra configuração preferencial, a doença ou distúrbio consiste lesão. Em em uma inflamação associada a uma infecção ou uma outra configuração preferencial, a doença ou distúrbio consiste em asma, lupus, esclerose múltipla, diabetes, por exemplo diabetes tipo II, artrite, por exemplo, reumatóide ou psoriática.

Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função de uma integrina ou de um co-ligante da mesma, por exemplo, VLA4, VCAM, ICAM. Em uma outra configuração 10 preferencial, a molécula agregadora interfere na função de uma selectina ou co-ligante da mesma, por exemplo Pselectina, E-selectina (ELAM), L-selectina, ou glicoproteina de P-selectina (PSGL1). Em uma outra configuração preferencial a molécula agregadora interfere 15 na função de um componente do sistema complementar, por exemplo, C3, C5, C3aR, C5aR, C3 convertase, C5 convertase.

Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função de uma quimioquina ou receptor da mesma, por exemplo, TNF-α, IL-Ια, IL-2, IL-2R,

IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-8, TNFRI, TNFRII, IgE, SCYAll ou CCR3.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método para tratamento de um paciente, por exemplo, um ser humano, em risco de sofrer ou já sofrendo dor aguda ou dor 25 crônica. 0 método inclui a provisão de uma molécula agregadora, por exemplo, uma molécula agregadora possuindo uma estrutura aqui descrita, em que essa molécula agregadora é capaz de interferir com uma proteína mediadora do processamento da dor e administração da referida molécula agregadora a um paciente, dessa forma tratando o paciente. Em uma outra configuração preferencial, a molécula agregadora interfere na função de um componente de um canal iônico. Em uma outra configuração particularmente preferencial, a molécula agregadora interfere na função de um ligante ou receptor de neurotransmissor.

Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método de tratamento de um paciente, por exemplo, um ser humano, em risco de sofrer ou sofrendo uma doença ou distúrbio de caráter neurológico. 0 método inclui a provisão de uma molécula agregadora, por exemplo, uma molécula agregadora possuindo uma estrutura aqui descrita, em que essa molécula agregadora é capaz de interferir em uma proteína mediadora de uma doença ou distúrbio neurológico, e administração da

referida	molécula agregadora a um paciente, dessa forma
tratando	o paciente. Em configurações específicas, as

referidas doenças (ou distúrbios) passíveis de tratamento incluem a Doença de Alzheimer (neste caso a molécula agregadora interfere na função de uma secretase que causa o processamento de APP, por exemplo, uma proteína envolvida no complexo gama-secretase (por exemplo, a proteína de presenilina 1 ou 2, uma proteína Aphl, nicastrina, BACE1 ou BACE2). O agregador inibe o processamento de APP e impede a formação de beta amilóide insolúvel. A mesma estratégia pode ser utilizada para prevenção e/ou para tratamento de outras doenças neurodegenerativas tais como a doença de

Huntington, uma ataxia espinocerebelar (por exemplo, SCA1,

SCA2, SCA3 (doença de Machado-Joseph), SCA7 ou SCA8).

Desta forma, em um aspecto a invenção proporciona um método para produção ou fabricação de um medicamento ou de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma molécula agregadora e adicionalmente misturando a referida molécula agregadora com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma configuração preferencial a molécula agregadora um polipeptídeo e pode ser produzida sinteticamente ou como uma proteína recombinante. A proteína recombinante pode ser fabricada mediante utilização de sistemas de expressão recombinante compreendendo células bacterianas, células de fermentos, células animais, células de insetos, células de plantas ou plantas ou animais transgênicos. A proteína recombinante pode ser purificada por meio de qualquer procedimento de purificação de proteínas convencional até um ponto próximo da homogeneidade e/ou pode ser misturada com aditivos.

A administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula agregadora pode ser realizada por administração oral, por inalação, por administração transdérmica ou parenteral (incluindo administração intravenosa, intratumoral, intraperitoneal, intramuscular, intra-cavidade, e subcutânea) . O composto ativo pode ser administrado isoladamente ou pode ser preferencialmente formulado como uma composição farmacêutica. Uma dose unitária conterá normalmente 0,01 até 500 mg, por exemplo 0,01 até 50 mg, ou 0,01 até 10 mg, ou 0,05 até 2 mg de composto ou de um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. As dosagens unitárias serão normalmente administradas uma vez ao dia ou mais de uma vez ao dia, por exemplo, 2, 3, ou 4 vezes por dia, mais normalmente 1 até 3 vezes por dia, de tal forma que a dose diária total fique normalmente situada na faixa de 0, 0001 até 10 mg/kg; desta forma uma dose diária total adequada para um adulto de 70 kg será de 0,01 até 700 mg, por exemplo, 0,01 até 100 mg, ou 0,01 até 10 mg ou mais normalmente 0,05 até 10 mg.

É preferencial que o composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo seja administrado na forma de uma composição em dose unitária, tal como uma composição em dose unitária para administração oral, parenteral, transdérmica ou por inalação. Essas composições são preparadas por mistura de adição e são adequadamente adaptadas para administração oral, por inalação, transdérmica, ou parenteral, e como tal podem encontrar-se na forma de comprimidos, cápsulas, preparações liquidas para administração oral, pós, grânulos, losangos, pós reconstituiveis, suspensões ou soluções para injeção ou infusão ou supositórios ou aerossóis.

Os comprimidos e cápsulas para administração oral são normalmente apresentados em uma dose unitária, e contêm excipientes convencionais tais como agentes aglutinantes, agentes de preenchimento, diluentes, agentes formadores de comprimido, agentes de lubrificação, agentes de desintegração, corantes, flavorizantes, e agentes de umedecimento. Os comprimidos podem ser revestidos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Os agentes de preenchimento adequados para utilização incluem celulose, manitol, lactose e outros agentes similares. Os agentes desintegrantes adequados incluem goma, polivinil pirrolidona e derivados de goma tais como glicolato de goma de sódio. Os agentes lubrificantes adequados incluem, por exemplo, estearato de magnésio. Os agentes de umedecimento adequados e farmaceuticamente aceitáveis incluem lauril sulfato de sódio. Estas composições orais sólidas podem ser preparadas por métodos convencionais de mistura, preenchimento, formação de comprimidos ou similares. Podem ser utilizadas operações de mistura repetitivas para distribuição do agente ativo através das composições empregando grandes quantidades de agentes de preenchimento. Essas operações são, como é óbvio, convencionais na técnica.

As preparações líquidas orais podem encontrar-se na forma, por exemplo, de suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes, ou elixires, ou podem ser apresentadas na forma de um produto seco para reconstituição com água ou outro veículo adequado anteriormente à utilização. Essas preparações líquidas podem conter aditivos convencionais tais como agentes de suspensão, por exemplo, sorbitol, xarope, metil celulose, gelatina, hidróxietilcelulose, carbóximetil celulose, gel de estearato de alumínio ou gorduras comestíveis hidrogenadas, agentes emulsionantes, por exemplo, lecitina, monooleato de sorbitan, ou acácia; veículos não-aquosos (que podem incluir óleos comestíveis), por exemplo, óleo de amêndoa, óleo de coco fracionado, ésteres oleosos tais como ésteres de glicerina, propileno glicol, ou álcool etílico; agentes de preservação, por exemplo, metil ou propil phidróxibenzoato ou ácido sórbico, e se assim for desejado, agentes flavorizantes ou corantes convencionais. As formulações orais incluem igualmente formulações de liberação prolongada convencionais, tais como comprimidos ou grânulos possuindo um revestimento entérico.

Preferencialmente, as composições para inalação são apresentadas para administração ao trato respiratório na forma de um rapé ou um aerossol ou solução para um nebulizador, ou como um pó micro-fino para insuflação, isoladamente ou em combinação com um veículo inerte tal como lactose. Nesse caso as partículas do composto ativo possuirão adequadamente diâmetros inferiores a 50 mícrons, preferencialmente inferiores a 10 mícrons, por exemplo entre 1 e 5 mícrons, tal como entre 2 e 5 mícrons. Alternativamente podem ser utilizadas nano-partículas revestidas, com um tamanho de partícula entre 30 e 500 nm. Uma dose preferencial para inalação irá encontrar-se na faixa de 0,05 até 2 mg, por exemplo 0,05 até 0,5 mg, 0,1 até 1 mg ou 0,5 até 2 mg.

Para administração parenteral, as formas fluidas de dosagem unitária são preparadas contendo um composto de acordo com a presente invenção e um veículo estéril. O composto ativo, dependendo do veículo e da concentração, pode ser alternativamente suspenso ou dissolvido. As soluções parenterais são normalmente dissolução do composto em um veículo preparadas mediante e esterilização por filtração antes de preencherem um frasco ou ampola adequado e serem ali vedados. Vantajosamente, adjuvantes tal como um anestésico local, agentes de preservação e agentes tampão são igualmente dissolvidos no veículo. Para aumento da estabilidade, a composição pode ser congelada após ser preenchida no frasco e a água pode ser removida sob vácuo. As suspensões parenterais são preparadas substancialmente

da mesma forma com exceção do	fato	de o	composto ser
suspenso no	veículo ao invés	de	ser	dissolvido e
esterilizado	mediante exposição	a	óxido	de etileno
anteriormente	à suspensão	no	veículo estéril.
Vantajosamente	, um agente tensoativo	ou	um agente de

composição para facilitar a incluído na umedecimento é distribuição uniforme do composto ativo. Quando for apropriado, pequenas quantidades de bronco-dilatadores, por exemplo aminas simpatomiméticas tais como isoprenalina, isoetarina, salbutamol, fenilefrina e efedrina; derivados de xantina tais como teofilina e aminofilina e corticosteróides tais como prednisolona e estimulantes adrenais tais como ACTH podem ser incluídos.

Conforme é prática comum, as composições serão

normalmente	acompanhadas por	instruções	escritas	ou
impressas	para utilização no	tratamento	medicinal	em
questão.
Em	uma configuração	preferencial	a molécula
agregadora	compreende adicionalmente um	domínio	de
transdução	de proteína. Foi demonstrado que	uma série	de

pequenos domínios de proteínas, designados como domínios de transdução de proteína (Protein Transduction Domains PTD's), cruzam membranas biológicas de forma eficiente e independentemente de agentes de transporte ou receptores específicos, e promovem o fornecimento de peptídeos e proteínas para células. Por exemplo, a proteína TAT do vírus de imunodeficiência humano (HIV-1) é capaz de fornecer proteínas biologicamente ativas in vivo.

Similarmente,	a terceira alfa-hélice do homeodomínio
Antennapedia,	e a proteína VP22 do vírus de herpes simplex

promovem o fornecimento de proteínas ou peptídeos com interligação covalente para células (estudado no trabalho

de Ford KG	e outros (2001) Gene Ther. 8, 1-4). 0
fornecimento	de proteínas baseado em um agente de

transporte de peptídeo anfifático curto, Pep-1, é eficiente para fornecimento de uma variedade de peptídeos e proteínas para diversas linhagens de células em uma forma totalmente biologicamente ativa, sem necessidade de acoplamento covalente químico prévio (Morris MC e outros, (2001) Nat.

Biotechnol. 19, 1173-1176). A capacidade das proteínas quiméricas VP22 para se espalharem da célula transduzida primária para células circundantes pode aperfeiçoar as abordagens de terapia genética (Zender L e outros (2002) Câncer Gene Ther. 9, 489-496). As seqüências que facilitam a transdução de proteínas são conhecidas das pessoas versadas na técnica e incluem, sem limitações, Domínios de Transdução de Proteínas. Preferencialmente, a referida seqüência é selecionada do grupo que compreende a proteína TAT de HIV, uma seqüência de poliarginina, penetratina e pep-1. Outros peptídeos permeáveis para células de utilização comum (tanto naturais quanto artificiais) são divulgados no trabalho de Joliot A. e Prochiantz A. (2004) Nature Cell Biol. 6 (3) 189-193.

Um segundo aspecto de uma composição farmacêutica consiste na utilização de uma seqüência de nucleotídeos que codificam as moléculas agregadoras. Caso seja utilizada uma seqüência de ácido nucléico que codifica a molécula agregadora, o referido medicamento é preferencialmente destinado ao fornecimento do referido ácido nucléico à célula, em um tratamento de terapia genérico. Um grande número de métodos de fornecimento são bem conhecidos daqueles que são versados na técnica. Preferencialmente, os ácidos nucléicos são administrados para utilizações em terapia genética in vivo ou ex vivo. Sistemas de fornecimento de vetor não viral incluem plasmídeos de DNA, ácido nucléico por si mesmo, e ácido nucléico complexado com um veículo de fornecimento tal como um lipossomo. Os sistemas de fornecimento de vetor viral incluem vírus de

DNA e RNA, que possuem alternativamente genomas epissomais ou integrados após fornecimento à célula. Os métodos de fornecimento não-viral de ácidos nucléicos incluem lipofecção, micro-injeção, biolística, virossomas, lipossomos, imunolipossomos, policátio ou conjugados de ácido nucléico: lipídeo, DNA por si mesmo, vírions artificiais, e recaptação de DNA intensificada por agente. A lipofecção é descrita, por exemplo, na patente norteamericana n° US 5.049.386, na patente norte-americana n° US 4.946.787; e na patente norte-americana n° US 4.897.355, e os reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectan™ e

Lipofectin™).

Os lipídeos catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção eficiente de reconhecimento de receptor de polinucleotídeos incluem aqueles de Flegner,

WO 91/1724,

WO 91/16024.

fornecimento pode ser feito às células (administração ex vivo) ou tecidos alvo (administração in vivo).

preparação de complexos de ácido nucléico:lipídeo, incluindo lipossomos alvos tais como complexos imunolipídicos, é bem conhecida de uma pessoa versada na técnica (vide, por exemplo, Crystal, 1995; Blaese e outros,

1995; Behr, 1994;

Remy e outros, 1994; Gao e Huang, 1995;

patentes norte-americanas números US

4.186.183,

US

4.217.344,

US

4.485.054,

US

4.501.728,

US uso de sistemas baseados em vírus de RNA ou DNA para fornecimento de ácidos nucléicos beneficiam-se das vantagens de processos altamente evoluídos para direcionamento de um vírus para alvos constituídos por células específicas no corpo e tráfego da carga útil viral para o núcleo. Os vetores virais podem ser administrados diretamente a pacientes (in vivo) ou podem ser utilizados para tratamento de células in vitro e as células modificadas são administradas a pacientes (ex vivo). Os sistemas de base viral convencionais para fornecimento de ácidos nucléicos incluem, entre outros, vetores retrovirais, lentivírus, adenovirais, adeno-associados e vetores de vírus de herpes simplex para transferência de genes. Os vetores virais constituem atualmente o método mais versátil e eficiente de transferência de genes em tecidos e células alvos. A integração no genoma hospedeiro é possível com os métodos de retrovírus, lentivírus, e de transferência de genes de vírus adeno-associados, resultando frequentemente em uma expressão de longo prazo do transgene inserido. Adicionalmente, foram observadas elevadas eficiências de transdução em muitos diferentes tipos de células e tecidos alvos. Em casos em que é preferencial uma expressão transiente do ácido podem ser utilizados sistemas de base adenoviral, nucléico, incluindo replicação de vetores adenovirais deficientes. Os vetores de base adenoviral são capazes de obterem uma eficiência de transdução muito elevada em muitos tipos de células e não requerem divisão celular. Com esses vetores, foram obtidos elevadas titulações e níveis de expressão. Este vetor pode ser produzido em grandes quantidades em um sistema relativamente simples. Os vetores de vírus adeno-associados (Adeno-Associated Vírus - AAV), incluindo vetores de vírus adeno-associados recombinantes são igualmente utilizados para transdução de células com ácidos nucléicos alvos, por exemplo, na produção in vitro de ácidos nucléicos e peptídeos, e para procedimentos terapêuticos genéticos in vivo e ex vivo (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° US 4.797.368; o documento internacional WO 93/24641; Kotin, 1994; A construção de vetores de AAV recombinantes é descrita em um número de publicações, incluindo na patente norte-americana n° US 5.173.414; Hermonat & Muzyczka, 1984; Samulski e outros, 1989).

Os vetores de terapia genética podem ser fornecidos in vivo mediante administração a um paciente individual, tipicamente por administração sistêmica (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratraqueal, subdérmica, ou infusão intracraniana) ou aplicação tópica. Em uma configuração específica a invenção também contempla a utilização de um método terapêutico genético hidrodinâmico. A terapia genética hidrodinâmica é divulgada no documento norte americano n° US 6.627.616 (Mirus Corporation, Madison) e envolve o fornecimento intravascular de ácidos nucléicos não virais codificando um agregador, e gue dessa forma a permeabilidade dos vasos é aumentada, por exemplo através da aplicação de uma pressão aumentada no interior do referido vaso ou através da coadministração de compostos de aumento de permeabilidade de vaso tais como, por exemplo, papaverina.

Alternativamente, podem ser fornecidos vetores para células ex vivo, tais como células extraídas de um paciente individual (por exemplo, linfócitos, aspirados de tutano ósseo, biópsia de tecidos) ou células tronco hematopoiéticas doadoras universais, com subsequente reimplantação das células em um paciente, normalmente após 10 seleção de células que incorporaram o vetor. A transfecção de células ex vivo para diagnóstico, pesquisa, ou para terapia genética (por exemplo, através de re-infusão das células transfectadas para o organismo hospedeiro) é bem conhecida daqueles que são versados na técnica. Em uma 15 configuração preferencial, as células são isoladas do organismo em causa, são transfectadas com um ácido nucléico (gene ou cDNA), e são reintroduzidas por infusão novamente no organismo em questão (por exemplo, um paciente). Diversos tipos de células adequados para transfecção ex 20 vivo são bem conhecidos daqueles que são versados na técnica (vide, por exemplo, Freshney e outros, 1994, e as referências aqui citadas relativamente a uma discussão de como isolar e cultivar células de pacientes).

Em uma outra configuração ainda, o método de agregação de proteínas (ou interferência em proteínas) de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para determinação da função de uma proteína em uma célula ou um organismo capaz de mediar interferência em proteínas. A célula pode ser uma célula procariótica ou pode ser uma célula eucariótica ou pode consistir em uma linhagem celular, por exemplo, uma célula de planta ou uma célula de animal, tal como uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula embrionária, uma célula tronco pluripotente, uma célula tumoral, por exemplo uma célula de teratocarcinoma ou uma célula infectada por vírus. 0 organismo é preferencialmente um organismo eucariótico, por exemplo, uma planta ou um animal, tal como um mamífero, particularmente um ser humano.

A proteína alvo à qual a molécula agregadora de acordo com a invenção é orientada pode ser associada a uma condição patológica. Por exemplo, a proteína pode ser uma proteína associada a patógeno, por exemplo, uma proteína viral, uma proteína associada a um tumor ou uma proteína associada a uma doença auto-imune. A proteína alvo pode igualmente consistir em um gene heterólogo expressado em uma célula recombinante ou organismo geneticamente alterado. Mediante inibição da função de uma tal proteína, podem ser obtidas valiosas informações e benefícios terapêuticos no campo da agricultura ou no campo da medicina ou da medicina veterinária. Em uma configuração particularmente preferencial, o método de acordo com a invenção é utilizado com uma célula eucariótica ou um organismo não humano eucariótico apresentando um fenótipo de knockout específico para proteína alvo, compreendendo pelo menos uma expressão parcialmente deficiente de pelo menos uma proteína alvo endógena em que a referida célula ou organismo é contatada com pelo menos uma molécula agregadora capaz de inibir a função de pelo menos uma 5 proteína alvo endógena ou com um vetor codificando pelo menos uma molécula agregadora capaz de interferir na função e/ou na presença de pelo menos uma proteína endógena. Deverá ser observado que a presente invenção também permite um knockout específico para alvo de várias diferentes 10 proteínas endógenas devido à especificidade da molécula agregadora.

Fenótipos de knockout específicos para proteínas de células ou organismos não-humanos, particularmente de células humanas ou de mamíferos não humanos, podem ser 15 utilizados em procedimentos analíticos, por exemplo na análise funcional e/ou fenotípica de processos fisiológicos complexos tais como análise de proteomas. Por exemplo, é possível prepara os fenótipos de knockout de proteínas humanas em células cultivadas que são supostamente 20 reguladores de processos de splicing alternativos. Entre estas proteínas encontram-se particularmente os membros da família de fatores de splicing SR, por exemplo, ASF/SF2, SC35, SRp20, SRp40 ou SRp55. Adicionalmente, os efeitos das proteínas SR nos perfis de mRNA de genes alternativamente 25 submetidos a splicing previamente determinados, tais como CD44, podem ser analisados.

Mediante utilização das tecnologias de knockout baseadas em proteínas aqui descritas, é possível inibir a expressão de uma proteína alvo endógena em uma célula alvo ou em um organismo alvo. Ά proteína endógena pode ser complementada por um ácido nucléico alvo exógeno que codifica a proteína alvo ou uma variante ou forma mutante da proteína alvo, por exemplo, um gene ou um cDNA, e pode opcionalmente ser fundido com uma seqüência adicional de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo ou peptídeo detectável, por exemplo, um marcador de afinidade, particularmente um marcador de múltipla afinidade.

Variantes ou formas mutantes da proteína alvo diferem da proteína alvo endógena no fato de diferirem da proteína endógena deleções em substituições de aminoácidos, inserções e/ou de aminoácidos únicos ou múltiplos. As variantes ou formas mutantes podem ter a mesma atividade biológica que a proteína alvo endógena. Por outro lado, a proteína alvo mutante ou variante pode igualmente ter uma atividade biológica, que difere da atividade biológica da proteína alvo endógena, por exemplo uma atividade parcialmente deletada, uma atividade totalmente deletada, uma atividade intensificada, etc. A complementação pode ser realizada mediante co-expressão do polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico exógeno, por exemplo uma proteína de fusão compreendendo a proteína alvo e o marcador de afinidade e a molécula agregadora para knocking out da proteína endógena na célula alvo. Esta co-expressão pode ser realizada mediante utilização de um vetor de expressão adequado expressando tanto o polipeptideo codificado pelo ácido nucléico exógeno, por exemplo, a proteína alvo modificada por marcador e a molécula agregadora ou alternativamente mediante utilização de uma combinação de 5 vetores de expressão, ou alternativamente a molécula agregadora podendo contatar a célula alvo a partir do lado externo da célula. As proteínas e os complexos de proteínas que são sintetizados de novo na célula alvo irão conter a proteína exógena, por exemplo, a proteína de fusão 10 modificada. Para evitar supressão da função da proteína exógena com a molécula agregadora, a proteína exógena deverá ter suficientes diferenças de aminoácidos na região de agregação que é selecionada para a construção da molécula agregadora. Alternativamente, a proteína alvo 15 endógena pode ser complementada por proteínas correspondentes de outras espécies, ou a proteína alvo endógena pode ser complementada por uma forma de splice da referida proteína alvo. A combinação de knockout de uma proteína endógena e salvamento mediante utilização de 20 um alvo mutante, por exemplo, um alvo exógeno parcialmente deletado, apresenta vantagens em comparação com o uso de uma célula de knockout. Adicionalmente, este método é particularmente adequado para identificação de domínios funcionais da proteína alvo.

Em uma configuração preferencial adicional, é realizada uma comparação, por exemplo, de perfis de expressão de genes e/ou proteomas e/ou características fenotípicas de pelo menos duas células ou organismos. Estes organismos são selecionados de: (i) uma célula de controle ou organismo de controle sem inibição de proteína alvo, (ii) uma célula ou organismo com inibição de proteína alvo e (iii) uma célula ou organismo com inibição de proteína alvo e adicionalmente complementação de proteína alvo por um ácido nucléico alvo exógeno que codifica a referida proteína alvo.

Os métodos de acordo com a invenção são igualmente adequados em um procedimento para identificação e/ou caracterização de agentes farmacológicos, por exemplo, identificação de novos agentes farmacológicos de uma coleção de substâncias de teste e/ou caracterização de mecanismos de ação e/ou efeitos colaterais de agentes farmacológicos conhecidos. Assim, a presente invenção também se refere a um sistema para identificação e/ou caracterização de agentes farmacológicos atuando em pelo menos uma proteína alvo compreendendo: (a) uma célula eucariótica ou um organismo não humano eucariótico capaz de expressar pelo menos um gene alvo endógeno que codifica a referida proteína alvo, (b) agregadora capaz de inibir a menos um gene alvo endógeno e pelo menos expressão do (c) uma ou uma coleção de substâncias de propriedades farmacológicas da referida uma molécula referido pelo substância teste em substância de teste que as de teste ou referida coleção deverão ser identificadas e/ou caracterizadas. Adicionalmente, o sistema conforme descrito acima compreende preferencialmente: (d) pelo menos um ácido nucléico alvo exógeno que codifica a proteína alvo ou uma variante ou forma mutante ou forma de splice da proteína alvo em que a referida proteína alvo exógena difere da proteína alvo endógena no nível de aminoácido das regiões de agregação de tal forma que a função da proteína alvo exógena é substancialmente menos inibida pela molécula agregadora que a expressão da proteína endógena.

Adicionalmente, a invenção também compreende células e organismos compreendendo uma molécula agregadora. Um organismo pode, por exemplo, consistir em uma planta transgênica que porta as informações genéticas que codificam um agregador. Uma tal planta transgênica, em uma configuração preferencial, é uma planta silenciada (isto é, na qual uma proteína alvo específica foi objeto de regulação descendente devido à presença de um agregador específico em um subconjunto de células ou órgãos ou presente em todas as células ou órgãos da referida planta).

As células compreendendo um agregador podem mediante contato das referidas células eletroporação das referidas células com ser produzidas ou mediante uma molécula agregadora específica. Em uma configuração específica as células que compreendem um agregador são geradas através de transfecção (ou transformação) em que o agregador codificado por um vetor de expressão recombinante tal como um plasmídeo ou um vetor viral.

ISOLAÇÃO: SEPARAÇÃO e DETECÇÃO

Em uma outra configuração a invenção proporciona um método para isolar uma proteína de uma amostra compreendendo o contato da referida amostra com uma molécula de ocorrência não natural compreendendo pelo menos uma região de beta-agregação fundida com uma região capaz de se ligar a uma proteína alvo e isolação do resultante complexo de proteína-molécula co-agregada da referida amostra.

Em outras palavras, a invenção proporciona um método para isolação de uma proteína de uma amostra compreendendo:

contato da referida proteína com uma molécula de ocorrência não natural que compreende uma parte A e uma parte B em que i) a parte A é uma região capaz de se ligar a uma proteína e ii) a parte B que compreende pelo menos 1 região de beta-agregação consistindo em pelo menos 3 aminoácidos contíguos e em que um elemento de interligação se encontra opcionalmente presente entre as partes A e B e isolação do resultante complexo molécula co-agregada da referida de proteínaamostra.

SEPARAÇÃO

Em uma configuração adicional, o método para isolação de pelo menos uma proteína compreende adicionalmente a separação de pelo menos uma proteína de uma amostra.

Uma aplicação da separação de pelo menos uma proteína de uma amostra consiste na remoção (ou esgotamento) de proteínas altamente abundantes de uma amostra. Na realidade, um desafio significativo na descoberta e validação de proteínas alvo consiste na forma de dissecar especificamente amostras de proteínas complexas (por exemplo, plasma, urina, fluido cérebro-espinal) e medir alvos residuais. As proteínas abundantes apresentam frequentemente uma concentração de 6-10 ordens de magnitude maior que as proteínas pouco abundantes. Desta forma, as proteínas altamente abundantes devem ser removidas para detecção e medição de proteínas residuais com importância medicinal. Na medida em que a albumina, IgG, antitripsina, IgA, transferina e haptoglobina formam aproximadamente 90% do conteúdo total de proteínas no soro humano, existe uma necessidade crítica de ferramentas de diagnóstico para esgotamento rápido destas proteínas abundantes indesejáveis e para desmascaramento dos biomarcadores de proteínas menos abundantes, de baixo peso molecular. Diversos métodos já são utilizados na técnica: 1) imunoglobulina G (IgG) como reagente de afinidade para captura e separação de alvos de proteínas abundantes, 2) gema de imunoglobulina (IgY) são anticorpos similares a IgG isolados de gemas de ovo de aves imunizadas, 3) é utilizada pré-fracionamento para separação de uma mistura de proteínas em diferentes frações para remoção de certas proteínas na mistura original, e 4) a proteína A e a proteína G são proteínas de parede celular bacteriana com uma especificidade para anticorpos de IgG, e desta forma as resinas de afinidade das proteínas A e G proporcionam uma remoção de IgG e 5) micro-gotas sólidas (microbeads) de IgG e IgY são utilizadas para detecção de proteínas.

DETECÇÃO

Em uma outra configuração específica, o método para isolação de pelo menos uma proteína compreende adicionalmente a detecção de pelo menos uma proteína no referido complexo de proteína-molécula.

A detecção pode ser realizada mediante separação do complexo de proteína alvo-molécula agregadora através, por exemplo, de eletroforese, cromatografia de coluna, centrifugação, filtração, atração eletrostática, atração magnética ou paramagnética, espectrometria de massa e similares.

Em uma configuração específica a molécula agregadora consiste em um pequeno composto químico ou uma droga (por exemplo, um composto medicinal ativo para o qual as proteínas alvo são desconhecidas) fundido a uma região de beta-agregação. Essa molécula agregadora pode ser utilizada para identificar (ou para detectar) drogas alvo em uma mistura de proteína complexa (por exemplo, um lisado de células).

As tecnologias de bio-detecção mais amplamente utilizadas são baseadas na utilização de anticorpos. Os anticorpos reconhecem e ligam-se a outras moléculas com base em seu formato e propriedades fisico-quimicas. Os anticorpos são altamente adequados para detecção de pequenas quantidades de proteínas alvo na presença de 5 misturas complexas de proteínas. A presente invenção demonstra que a utilização de moléculas agregadoras (com uma especificidade e afinidade (reconhecimento) relativamente a pelo menos uma proteína específica) quando a região de ligação é diferente de um elemento de 10 ligação de anticorpo - pode ser utilizado como alternativa ao uso de anticorpos (como elemento de reconhecimento) para a captura específica de proteínas alvo. De fato, as moléculas agregadoras podem ser utilizadas em numerosas aplicações nas quais são tipicamente utilizados anticorpos.

Para designar somente alguns casos, são previstas aplicações em diagnóstico, micro-análise, medicina legal e na detecção específica de patógenos.

Para as aplicações de detecção e separação da invenção, a molécula agregadora, com uma especificidade 20 para uma determinada proteína alvo, pode ser ligada a um veículo. Um veículo pode consistir em uma superfície plana tal como um plástico ou nitrocelulose ou uma coluna de cromatografia, mas consiste preferencialmente em uma gota sólida (bead) tal como gotas sólidas micro-esféricas. A 25 ligação (acoplamento) do agregador pode ser mediada através da parte A (a região de ligação com uma afinidade para uma proteína específica) ou através da parte B (a pelo menos uma região de beta-agregação). Uma discussão geral sobre vários tipos de gotas sólidas (beads) e micro-esferas, que cumprem o propósito de ligar as moléculas agregadoras, encontra-se descrita nas páginas 9 e 10 do documento norte americano n° US 6.682.940 e é aqui especificamente incorporada a título de referência.

Em uma configuração específica, a molécula agregadora é ligada a um tipo de veículo de carboidrato, por exemplo, celulose ou agarose. O agregador pode se acoplado covalentemente ao referido veículo de carboidrato com um agente de reticulação tal como glutaraldeído.

Em uma outra configuração específica o agregador é ligado sobre um suporte tal como celulose, vidro ou um polímero sintético. O acoplamento covalente pode ser realizado através de resíduos de aminoácidos da parte A ou

B e uma azida, carbodiimida, isocianato ou outros derivados químicos.

Em uma outra configuração específica adicional o suporte é uma micro-gota sólida (micro bead de vidro silanisado poroso.

agregador pode ser unido covalentemente através de seus grupos amina de peptídeo (por reação de

Schiff seguida por redução com borohidreto de sódio) para grupos aldeído formados por oxidação de periodato de grupos glicidóxipropilsilano ligados quimicamente aos átomos de sílica (este acoplamento é descrito em Sportsman e Wilson (1980) Anal. Chem. 52, 2013

2018) .

Em uma configuração especifica a parte transportadora é envolvida por um filme proteináceo com o qual o agregador é reticulado (vide as reivindicações 1-50 e exemplos relativos ao transportador no documento norte americano n° US 4.478.946).

Em uma outra configuração especifica, o suporte é uma gota sólida (bead) fluorescente tal como uma partícula de látex fluorescente. A patente norte americana n° US 4.550.017, e particularmente a página 4 da mesma, descreve compostos fluorescentes que podem ser utilizados para fabricação de gotas sólidas (beads) fluorescentes.

Em uma outra configuração específica, as gotas sólidas (beads) variam de tamanho e podem igualmente conter ou ser impregnadas com pigmentos fluorescentes. Devido à variação de tamanhos e pigmentações das gotas sólidas (beads) é possível detectar e quantificar uma multiplicidade de proteínas em uma única reação. Os procedimentos para o desenvolvimento dessas gotas sólidas (beads) são descritos no documento norte americano n° US 6.159.748.

Em uma outra configuração específica adicional o acoplamento entre a gota sólida (bead) e o agregador ocorre através de uma poli(treonina), uma poli(serina), dextran ou poli(etileno glicol). Os exemplos 6, 7, 8 e 9 do documento norte americano n° US 6.399.317 ilustram como este acoplamento pode ser realizado.

Em uma outra configuração específica adicional, o

6 suporte consiste em uma gota sólida (bead) magnética. As gotas sólidas (beads) magnéticas, o acoplamento entre as gotas sólidas magnéticas e um agente de proteína (tal como um agregador polipeptídico) e seus usos são descritos na

página 8 do	pedido de	patente norte	americana	n° US
6.489.092.
Definições
Salvo	definição	em	contrário,	todos os	termos
técnicos e científicos	aqui	utilizados	possuem o	mesmo

significado que é normalmente entendido por aqueles que são normalmente versados na técnica à qual a invenção pertence. Muito embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou testes da presente invenção, são descritos métodos e materiais preferenciais. Para os propósitos da presente invenção, os termos a seguir encontram-se definidos abaixo.

Os artigos um, uma são aqui utilizados para referência a uma quantidade de um ou mais de um (isto é, a 20 pelo menos um, do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, uma proteína alvo significa uma proteína alvo ou mais de uma proteína alvo.

Conforme é aqui utilizada, a expressão cerca de refere-se a uma quantidade, nível, valor, dimensão, 25 tamanho, ou porção que varia em até 30%, preferencialmente em até 20%, e mais preferencialmente em até 10% relativamente à quantidade, nível, valor, dimensão, tamanho ou porção de referência.

Um agente de reticulação bifuncional refere-se a um reagente contendo dois grupos reativos, em que o reagente tem capacidade de interligar covalentemente dois elementos tais como uma parte A e uma parte B da molécula agregadora. Os grupos reativos em um reagente de reticulação pertencem tipicamente às classes de grupos funcionais que incluem ésteres de succinimidila, maleimidas e haloacetamidas tais como iodoacetamidas. De princípio a fim do presente relatório descritivo, salvo quando o contexto requerer uma interpretação diferente, as palavras compreendem, compreende, e compreendendo deverão ser entendidas como significando implicitamente a inclusão de uma etapa ou elemento enunciado ou um grupo de etapas ou elementos enunciados porém não significando a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos.

As expressões vetor de expressão ou vetor recombinante significam qualquer elemento genético autônomo capaz de dirigir a síntese de uma molécula agregadora codificada pelo vetor. Esses vetores de expressão são conhecidos das pessoas que praticam a técnica.

O termo derivado significa uma molécula agregadora que foi derivada da seqüência básica através de modificação, por exemplo mediante conjugação ou complexação com outras frações químicas (por exemplo, pegilação) ou por técnicas de modificação pós-transferencial conforme serão entendidas na técnica. O termo derivado também inclui em seu escopo alterações que tenham sido feitas em uma seqüência mãe, incluindo adições ou deleções que proporcionem moléculas funcionalmente equivalentes.

A expressão quantidade eficaz, no contexto de modulação de uma atividade ou de tratamento ou prevenção de uma doença significa a administração de uma quantidade de uma molécula agregadora a um indivíduo que necessita uma tal modulação, tratamento, ou profilaxia, alternativamente em dose única ou como parte de uma série, que é eficaz para a modulação desse efeito ou para o tratamento ou profilaxia dessa doença. A quantidade eficaz irá variar dependendo do estado de saúde e da condição física do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado, da formulação da composição, da avaliação da situação médica, e de outros fatores relevantes. É previsto que a quantidade fique situada em uma faixa relativamente ampla capaz de ser determinada através de ensaios de rotina.

O termo isolado significa um material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o mesmo em seu estado nativo. Por exemplo, um polipeptídeo isolado, conforme o termo é aqui utilizado, refere-se a um polipeptídeo que foi purificado das seqüências que flanqueiam o mesmo em um estado de ocorrência natural, por exemplo, uma seqüência de betaagregação que foi removida das seqüências que se encontram normalmente adjacente à referida seqüência. Uma seqüência de beta-agregação pode ser gerada por síntese química de aminoácidos ou pode ser gerada por produção recombinante.

termo oligonucleotideo conforme é aqui utilizado refere-se a um polímero composto por uma multiplicidade de unidades de nucleotideo (deóxiribonucleotideos ou ribonucleotídeos, ou variantes estruturais associadas ou análogos sintéticos dos mesmos) interligadas por ligações fosfodiéster (ou variantes

Um oligonucleotideo tem uma extensão tipicamente relativamente curta, geralmente desde cerca de 10 até 30 nucleotideos, porém termo pode referir-se a moléculas de qualquer extensão, muito embora o termo polinucleotídeo ou ácido nucléico seja tipicamente utilizado para grandes oligonucleotideos.

termo polinucleotídeo ou ácido nucléico, conforme aqui utilizado, designa mRNA, RNA, cRNA, cDNA ou DNA.

termo refere-se tipicamente a oligonucleotideos com uma extensão de mais de 30 nucleotideos.

expressão polinucleotideo recombinante, conforme é aqui utilizada, refere-se a um polinúcleotideo formado in vitro através da manipulação de ácido nucléico para uma forma normalmente não encontrada na natureza. Por exemplo, o polinucleotídeo recombinante pode ter a forma de um vetor de expressão. Geralmente, esses vetores de expressão incluem ácido nucléico de regulação transcricional e transferenciai operacionalmente interligado à seqüência de nucleotídeos.

A expressão operacionalmente interligado significa que os ácidos nucléicos reguladores de transcrição e transferência são posicionados relativamente a um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo de tal forma que o polinucleotídeo é transcrito e o polipeptideo é transferido.

Os termos sujeito' ou indivíduo ou paciente conforme são aqui utilizados de forma intercambiável, referem-se a qualquer indivíduo, particularmente um indivíduo vertebrado, e ainda mais particularmente a um indivíduo mamífero, para o qual é desejada uma terapia ou profilaxia. Os animais vertebrados adequados que se inserem no escopo da invenção incluem, sem restrições, primatas, aves, peixes, répteis, animais de criação (por exemplo, carneiros, vacas, cavalos, burros, porcos), animais para testes em laboratório (por exemplo, coelhos, camundongos, ratos, cobaias, hamsters) animais domésticos (por exemplo, gatos, cachorros) e animais selvagens em cativeiro (por exemplo, raposas, veados, cães selvagens Australianos (dingoes). Entretanto, deverá ser entendido que os termos anteriormente mencionados não implicam a presença de sintomas.

A expressão veículo farmaceuticamente aceitável significa um agente de preenchimento sólido ou líquido, um diluente, ou uma substância de encapsulação que pode ser utilizada com segurança em administração tópica ou sistêmica a um paciente.

Os termos polipeptideo, peptídeo e proteína são aqui utilizados de forma intercambiável como referência a um polímero de resíduos de aminoácidos e a variantes e análogos sintéticos do mesmo. Desta forma, estes termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos consiste em um aminoácido de ocorrência não natural, sintético, tal como um análogo químico de um aminoácido correspondente de ocorrência natural, bem como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural.

A expressão polipeptideo recombinante significa um polipeptideo obtido mediante utilização de técnicas de recombinação, isto é, mediante a expressão de um polinucleotídeo sintético ou recombinante. Quando polipeptideo quimérico ou uma parte biologicamente ativa do mesmo é produzida de forma recombinante, ela é também preferencialmente substancialmente isenta de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos de cerca de

20%, mais preferencialmente menos de cerca de 10%, e ainda mais preferencialmente menos de cerca de 5% do volume da preparação de proteína.

A expressão identidade de seqüência conforme é aqui utilizada refere-se à medida em que seqüências são idênticas em uma base de nucleotídeo-por-nucleotideo ou em uma base de aminoácido-por-aminoácido em uma janela de

comparação.	Desta forma, uma percentagem de identidade de
seqüência	é calculada mediante comparação de duas
seqüências	idealmente alinhadas através da janela de
comparação,	determinando-se o número de posições em que a

base de ácido nucléico idêntica (por exemplo, A, B, C, G,

I) ou o resíduo de aminoácido idêntico (por exemplo, Ala,

Pro, Ser, Thr, Gly, Vai, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His,

Asp, Glu, Asn, Gin, Cys e Met) ocorre em ambas as seqüências para obtenção do número de posições equiparadas, dividindo-se o número de posições equiparadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho de janela), e multiplicando-se o resultado por 100 para obtenção da percentagem de identidade de seqüência.

Para os propósitos da presente invenção, identidade de seqüência deverá ser entendido como significando a percentagem de equiparação calculada pelo programa de computador DNASIS (Versão 2.5 para Windows; disponibilizado pela empresa Hitachi Software Engineering Co., Ltd., South San Francisco, Califórnia, Estados Unidos da América) utilizando valores padrão convencionais conforme utilizados no manual de referência que acompanha o software. Similaridade refere-se ao número percentual de aminoácidos que são idênticos ou constituem substituições conservadoras. A similaridade pode ser determinada mediante utilização de programas de comparação de seqüências tal como o GAP (Deveraux e outros, 1984, Nucleic Acids Research

12, 387-395). Desta forma, seqüências com uma extensão similar ou substancialmente diferente daquelas aqui citadas podem ser comparadas mediante inserção de intervalos no alinhamento, tais intervalos sendo determinados, por exemplo, pelo algoritmo de comparação utilizado pelo 5 programa GAP.

termo transformação significa alteração do genótipo de um organismo, por exemplo uma bactéria, um fermento ou uma planta, mediante introdução de ácido nucléico externo ou endógeno. Os vetores para transformação 10 incluem plasmídeos, retrovírus e outros virus de animais,

YAC' s (Yeast Artificial Chromosome), BAC's (Bacterial Artificial Chromosome) e similares. 0 termo vetor significa uma molécula de polinucleotídeo, preferencialmente uma molécula de DNA derivada, por 15 exemplo, de um plasmídeo, de um bacteriófago, de um fermento ou vírus, na qual pode ser inserido ou clonado um polinucleotídeo. Um vetor contém preferencialmente um ou mais locais de restrição singulares e pode ser capaz de replicação autônoma em uma célula hospedeira definida 20 incluindo um tecido ou célula alvo ou um tecido ou célula progenitora respectiva, ou pode ser passível de integração com o genoma do hospedeiro definido de tal forma que a seqüência clonada seja passível de reprodução. Desta forma, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, 25 um vetor que existe como uma entidade extra-cromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo circular fechado ou linear, um

cromossoma artificial. 0 elemento extra-cromossômico, ou um vetor pode conter qualquer meio para assegurar a autoreplicação. Alternativamente, o vetor pode ter a caracteristica de, quando introduzido na célula hospedeira, 5 ser integrado no genoma e replicado juntamente com o(s) cromossoma(s) no(s) qual/quais foi integrado. Um sistema de vetor pode compreender um único vetor ou plasmídeo, dois ou mais vetores ou plasmídeos, que em conjunto contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou 10 um transposon. A seleção de vetor será tipicamente dependente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor deverá ser introduzido. Em uma configuração preferencial, o vetor é preferencialmente um vetor viral ou um vetor derivado de vírus, que é 15 operacionalmente funcional em células animais e preferencialmente em células de mamíferos. O vetor pode igualmente incluir um marcador de seleção tal como um gene de resistência a antibiótico que pode ser utilizado para seleção de agentes de transformação adequados. Exemplos desses genes de resistência são conhecidos das pessoas versadas na técnica e incluem o gene nptil que confere resistência aos antibióticos kanamicina e G418 (Geneticin®) e o gene hph que confere resistência ao antibiótico higromicina B.

Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que é normalmente entendido por aqueles que são normalmente versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Muito embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou testes da presente invenção, são descritos 5 abaixo métodos e materiais úteis. Os materiais, métodos, e exemplos são meramente ilustrativos e não pretendem ser limitativos. Outras características e vantagens da invenção serão aparentes na descrição detalhada e nas reivindicações.

Exemplos

1. Esgotamento de uma enzima de solução

Neste exemplo foi construído um agregador mediante fusão de biotina como uma região de ligação acoplada a uma região de beta-agregação. Este agregador foi utilizado para 15 esgotamento de uma proteína de fusão N-terminal entre Peroxidase do Rábano Silvestre (Horse Radish Peroxidase HRP) e estreptavidina (uma estreptavidina de proteína de 60 kDa da bactéria Streptomyces avidinii) . A HRP é uma enzima que converte 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) em um 20 produto azul que absorve luz com eficiência a 370 nm. A biotina (como elemento de ligação) tem uma forte afinidade para a estreptavidina (a constante de dissociação (Kd) do complexo biotina-estreptavidina é da ordem de ~10’¹⁵ mol/L). O algoritmo TANGO foi utilizado para identificar uma 25 seqüência de aminoácidos de beta-agregação a partir de beta-galactosidase de E. coli. Esta seqüência de betaagregação foi sintetizada obtida da empresa Jerini Peptide

Technologies, Alemanha) e foi acoplada a uma molécula de biotina (como uma fusão N-terminal) resultando em um agregador com a seguinte seqüência: Biotina-ALAVVLQ-NH2. Para demonstrar o esgotamento entre a proteína de fusão 5 HRP-estreptavidina da solução devido à co-agregação com o agregador, os presentes inventores co-incubaram o agregador com a proteína de fusão estreptavidina-HRP. 0 objetivo deste experimento consistiu em que, através da interação biotina-estreptavidina, a enzima HRP se co-agregasse com o 10 peptídeo de agregação, causando uma queda de atividade de

HRP na fração solúvel. Para este efeito, uma solução de estreptavidina-HRP (AbD Serotec, produto número 71005) foi diluída em uma razão de 1:20.000 em PBS e incubada com o agregador a uma concentração final de 1 μΜ. As amostras 15 foram incubadas durante a noite com agitação a 750 rpm à temperatura ambiente. Uma amostra de controle consistindo na proteína de fusão SA-HRP individualmente em tampão idêntico (PBS mais 10% de DMSO) foi incluída.

Adicionalmente uma amostra de controle da seqüência de 20 beta-agregação não-biotinilada foi igualmente incluída para demonstração de especificidade. Após uma incubação durante a noite, o material co-agregado foi removido da amostra por centrifugação durante 15 minutos a 17.000 g em microcentrifugadora de bancada refrigerada a 10° C. Do total do 25 sobrenadante, 10 pL foram recuperados e adicionados a uma placa de 96 receptáculos (Falcon, 353072) a 90 μ!3 de solução de TMB. Esta mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 1 minuto, e subsequentemente a reação colorimétrica foi sustada mediante adição de 100 qL de 2 M de H2SO4. A absorvência do produto amarelo resultante foi medida a OD_450nm utilizando-se um dispositivo de leitura 5 Ultra Microplate Reader (BioTEK, EL_x808IU). A Figura 1 ilustra a percentagem residual de atividade de HRP no sobrenadante após a remoção dos agregados por centrifugação (vide acima). A presença do agregador (peptídeo biotinilado) remove claramente a enzima da fração solúvel.

2. Esgotamento de um anticorpo monoclonal de solução

Os presentes inventores construíram uma molécula agregadora em que a parte B consistiu em três regiões de beta-agregação sintéticas com elementos de interligação curtos de dois aminoácidos (STLIVL-QN-STVIFE-QN-STVIFE) 15 interligando as referidas regiões de beta-agregação. As referidas regiões de beta-agregação são hexapeptídeos com forte tendência à agregação. Observação: no texto da presente invenção todas as seqüências de aminoácidos são ilustradas a partir da parte terminal amino que são lidas 20 na direção da parte terminal carbóxi - desta forma, STLIVL é lido como NH2-STLIVL-COOH) . A parte B da molécula interferente sintética foi fundida N-terminalmente a uma região de ligação (parte A) que impede auto-agregação das referidas regiões de beta-agregação e coloca as 25 referidas regiões de beta-agregação em contato direto com o ambiente (neste caso o citosol de E. coli) . (A Fig. 1 ilustra a estrutura da construção do agregador sintético).

A referida região de ligação é a proteína NusA, que é frequentemente utilizada como um marcador de solubilização em produção de proteínas recombinantes¹³, fundida Nterminalmente com um marcador de polihistidina. A molécula 5 interferente sintética resultante (estrutura de marcador de histidina-A-B) foi fabricada e purificada de forma recombinante em E. coli.

Para esgotamento de um anticorpo monoclonal de uma solução através de co-agregação com o agregador, os presentes inventores empregaram uma proteína de fusão consistindo em um anticorpo monoclonal de camundongo com uma especificidade para polihistidina (6xHis) fundido com a enzima de

HRP provê anticorpo peroxidase de rábano silvestre (HRP). A enzima um sistema de (vide o Exemplo leitura para a presença do

Mediante co-incubação da anti-his mAb com o agregador com marcação his, os presentes inventores procuravam remover mAb solução mediante marcação his. Para em uma proporção co-agregação este propósito, com anti de 1:5000 em PBS e seu agregador com

His-HRP foi diluído foi incubado com o agregador em uma concentração final de 1 ng/mL. As amostras foram incubadas durante a noite em um dispositivo Eppendorf

Thermomixer com agitação (750 rpm) tanto à temperatura ambiente quanto a 37° C. As amostras de controle consistindo somente em anti His-HRP em tampão idêntico foram igualmente incluídas. Após a incubação o material agregado foi removido da amostra por centrifugação (15 minutos, 10° C, 17.000 g) em um dispositivo de microcentrifugação de bancada. Uma quantidade de 5 x 10 μΐ de cada sobrenadante foi rapidamente recuperada para uma placa de 96 receptáculos (Falcon, 353072). Foram adicionados 90 μΐ de solução de TMB e após incubação à temperatura ambiente durante 1 minuto a reação foi interrompida por adição de 100 μΕ de 2M de H₂SO₄. A absorvência do produto amarelo resultante foi medida a OD450nm utilizando um dispositivo de leitura Ultra Microplate Reader (BioTEK,

EL_x808IU). A incubação durante a noite em RT com o constructo de agregação a 10 pg/μ L produziu como resultado uma queda de atividade de HRP de 20,5% do valor observado para o controle (em que não se encontrava presente nenhum agregador).

Claims

- REIVINDICAÇÕES -

1. MOLÉCULA QUIMÉRICA, caracterizada por compreender uma região capaz de se ligar a uma proteína e pelo menos uma sequência de beta-agregação para utilização na regulação descendente da função biológica da proteína em que ocorre uma co-agregação entre a referida molécula quimérica e a proteína, em que a referida utilização é in vivo e em que a referida região capaz de se ligar a uma proteína é um anticorpo.
2. MOLÉCULA QUIMÉRICA, de acordo com a reivindicação 1, em que a referida sequência de betaagregação consiste em pelo menos 3 aminoácidos contíguos.
3. MOLÉCULA QUIMÉRICA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, em que um elemento de interligação está presente entre a referida sequência de beta-agregação e o referido elemento de ligação.
4. MOLÉCULA QUIMÉRICA de acordo com a reivindicação 3, em que o referido elemento de interligação é um polipeptídeo ou é de natureza não polipeptídica.
5. A MOLÉCULA QUIMÉRICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a referida molécula é um polipeptídeo e é codificada por uma sequência nucleotidica presente num vetor recombinante e que, após transformação numa célula ou organismo, produz o referido polipeptídeo na referida célula ou organismo.
6. MÉTODO IN VITRO PARA REGULAR DESCENDENTEMENTE A FUNÇÃO BIOLÓGICA DE UMA PROTEÍNA, caracterizado por

Petição 870180149534, de 08/11/2018, pág. 8/10

2/3 compreender contacto da referida proteína com uma molécula quimérica compreendendo uma região capaz de se ligar à referida proteína e pelo menos uma sequência de betaagregação em que ocorre uma co-agregação entre a referida molécula quimérica e a proteína, em que a referida região capaz de se ligar a uma proteína e um anticorpo ou, em que se a proteína a ser regulada descendentemente é uma proteína de fusão consistindo na proteína e uma porção fundida, a referida região capaz de se ligar a uma proteína e a referida porção é um par selecionado entre um anticorpo e o seu antígeno correspondente, e biotina e avidina ou estreptavidina.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida sequência de beta-agregação consiste em pelo menos 3 aminoácidos contíguos.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 e 7, caracterizado por um elemento de interligação está presente entre a dita sequência de betaagregação e o dito elemento de ligação.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido elemento de interligação é um polipeptídeo ou é de natureza não polipeptídica.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, caracterizado por a referida molécula ser um polipeptídeo e é codificada por uma sequência nucleotídica presente num vetor recombinante e que, após transformação numa célula ou organismo, produz o referido

Petição 870180149534, de 08/11/2018, pág. 9/10

3/3 polipeptídeo na referida célula ou organismo.
11. MÉTODO PARA ISOLAR UMA PROTEÍNA DE UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender colocar em contacto a referida amostra com uma molécula quimérica compreendendo uma região capaz de se ligar a referida proteína e pelo menos uma sequência de beta-agregação e isolar o complexo molécula-proteína co-agregado resultante da referida amostra, em que a referida região capaz de se ligar à referida proteína é um anticorpo ou, em que se a proteína a ser isolada for uma proteína de fusão consistindo na proteína e uma fração nela fundida, a referida região capaz de se ligar a uma proteína e à referida fração é uma par selecionado de um anticorpo e seu antígeno correspondente, e biotina e avidina ou estreptavidina.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender ainda a detecção de uma proteína na referida amostra.