BRPI0803149A2 - gene recombinante da pró-quimosina bovina e sua expressão em fungos visando a produção de queijos e seus derivados - Google Patents
gene recombinante da pró-quimosina bovina e sua expressão em fungos visando a produção de queijos e seus derivados Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0803149A2 BRPI0803149A2 BRPI0803149-5A BRPI0803149A BRPI0803149A2 BR PI0803149 A2 BRPI0803149 A2 BR PI0803149A2 BR PI0803149 A BRPI0803149 A BR PI0803149A BR PI0803149 A2 BRPI0803149 A2 BR PI0803149A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- bovine
- gene
- chymosin
- recombinant
- expression
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 title claims abstract description 41
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 31
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 79
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 51
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 claims abstract description 71
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 68
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 33
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 33
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 38
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 19
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 17
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 claims description 5
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims description 4
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims description 4
- -1 urea Chemical class 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 3
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 claims description 3
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 241000612703 Augusta Species 0.000 claims description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 55
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 55
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 55
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 abstract description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 5
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 abstract description 5
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 abstract description 4
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 abstract description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 244000309466 calf Species 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 16
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 14
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 13
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 description 11
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 11
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 7
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 7
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 7
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 7
- 108010017640 Aspartic Acid Proteases Proteins 0.000 description 6
- 102000004580 Aspartic Acid Proteases Human genes 0.000 description 6
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 6
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 6
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 5
- 210000003165 abomasum Anatomy 0.000 description 5
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 4
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 4
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000235395 Mucor Species 0.000 description 2
- 101500025418 Mus musculus Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 241000235525 Rhizomucor pusillus Species 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N murodermin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N1)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC=2NC=NC=2)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N2)C(C)C)=O)CSSC1)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101150086876 Amy gene Proteins 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000555825 Clupeidae Species 0.000 description 1
- 241000221756 Cryphonectria parasitica Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 241000222342 Irpex Species 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101000964306 Lactococcus lactis subsp. lactis Endoribonuclease AbiQ Proteins 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000038561 Modiola caroliniana Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 235000020054 awamori Nutrition 0.000 description 1
- 238000011021 bench scale process Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 108010033929 calcium caseinate Proteins 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020248 camel milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000021185 dessert Nutrition 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 1
- 229920006255 plastic film Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 108010044241 tetanus toxin fragment C Proteins 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
A presente invenção refere-se a uma sequência de DNA de uma protease bovina, uma enzima recombinante utilizada no processo de coagulação do leite, em substituição ao coalho tradicional. Mais especificamente se refere à sequência sintética de DNA da pró-quimosina B bovina, a qual pode ser expressa por fungos em geral. A presente invenção visa produzir uma enzima com características semelhantes à quimosina animal, que é a enzima de preferência para coagulação do leite, estágio de produção necessário para a fabricação de queijos de diferentes tipos e outros produtos derivados da coagulação do leite de maneira específica, resolvendo os problemas relacionados com gosto e caracteristicas desejáveis para o produto final.
Description
"GENE RECOMBINANTE DA PRÓ-QUIMOSINA BOVINA E SUAEXPRESSÃO EM FUNGOS VISANDO A PRODUÇÃO DE QUEIJOS E SEUSDERIVADOS"
Campo dã invenção:
A presente invenção refere-se a uma seqüência de DNA de umaprotease bovina, uma enzima recombinante utilizada no processo decoagulação do leite, em substituição ao coalho tradicional. Maisespecificamente se refere à seqüência sintética de DNA da pró-quimosina Bbovina, a qual pode ser expressa por fungos em geral, como por exemplo, osdos gêneros Pichia, Saccharomyces, Yarrowia, Kluyveromyces, Cândida,Hansenula, Aspergillus, Trichoderma, entre outros, referentes a diversasespécies conhecidas e largamente utilizadas tais como, Pichia pastoris,Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis, Cândidamethanolica, Hansenula polymorpha também conhecida como Pichia augusta,
Aspergillus niger var. awamori, Trichoderma reesei, entre outras espécies.
O critério para a escolha do tipo de fungo a ser utilizado estáprincipalmente relacionado com a obtenção da proteína recombinante emquantidade, qualidade e reprodutibilidade, principalmente em escala industrial.
Espécies de Pichia pastoris são particularmente preferidas por reunir uma sériede características desejáveis: além da técnica de expressão de proteínasrecombinantes por este microorganismo ser bem conhecida, sua taxa decrescimento é elevada, podendo crescer em um meio de cultura simples ebarato e o processo de extração da proteína de interesse na forma ativa nãorequerer a utilização de equipamentos caros, já que é obtida na forma solúvelno sobrenadante da cultura de Pichia pastoris e outros fungos.
A enzima recombinante expressa por fungos da presente invenção éeficiente na coagulação do leite, estágio de produção necessário para afabricação de queijos de diferentes tipos e outros produtos derivados dacoagulação do leite de maneira específica, sem comprometer a qualidade.
Dessa maneira, apresenta interesse para indústria de laticínios e de produçãode queijos em geral.Estado da técnica:
A quimosina (EC 3.4.23.4), também conhecida como renina, é umaaspartil protease encontrada no abomaso (quarto estômago dos ruminantes) debezerros lactantes e de outros ruminantes jovens. O papel desta enzima nadigestão é o de coagular o leite ingerido e produzir uma massa semi-líquida,aumentando o tempo de permanência do leite no organismo e permitindo aação das enzimas proteolíticas (FOX, P. F.; MCSWEENEY, P. L. H. Rennets:their role in milk coagulation and cheese ripening. Microbiology andbiochemistry of cheese and fermented milk. Ed. Law, B. A. Blackie Academic &Professional. London. pg. 1-49,1999).
O comportamento funcional da quimosina é marcadamente diferentedas outras proteínas gástricas aspárticas. Enquanto estas apresentam amplaespecificidade e processam com eficiência todas as proteínas no lúmengástrico, a quimosina é específica para uma das caseínas do leite,apresentando baixa atividade proteolítica sobre as outras proteínas. Devido aessa baixa atividade proteolítica extremamente específica por seu substrato, epor possuir uma alta atividade de coagulação do leite, esta enzima tornou-seatraente para a indústria de queijo (Foltmann, B. Prochymosin and chymosin(prorennin and rennin). Biochem J. 115(3):3P-4P, 1969; BEPPU, T. The cloningand expression of chymosin (rennin) genes in microorganisms. Trends.Biotechnol. 1: 85-89, 1993).
A quimosina é produzida intracelularmente na forma pré-pró-quimosina, caracterizada como uma proteína de 381 resíduos de aminoácidos(Figura 1). Os 16 resíduos de aminoácidos hidrofóbicos iniciais consistem emuma seqüência sinal, importante na secreção da enzima pela membranacelular. Esta seqüência sinal é removida durante a via de secreção e, noestômago, a enzima se apresenta na sua forma inativa, a pró-quimosina, demassa molecular 40777 Da. Sob as condições ácidas do estômago (pH<5) apró-quimosina torna-se quimosina por ativação autocatalítica e perda de 42resíduos de aminoácidos N-terminais (PEDERSEN, V. B. et aí., Investigationson the activation of bovine prochymosin. Eur. J. Biochem. 94: 573-580,1978).Bioquimicamente, a quimosina é uma proteína com cadeiapolipeptídica única de 323 resíduos de aminoácidos e massa molecular de35600 Da (GILLILAND, G. L. et ai, The three-dimensional structure ofrecombinant bovine chymosin at 2.3 A resolution. Proteins. 8: 82-101, 1990;NEWMAN, M. et ai, X-ray analyses of aspartic proteinases IV: Structure andrefinement at 2.2 Á resolution of bovine chymosin. J. Mol. Bioi 230: 260-283,1991). Existem duas formas alélicas da quimosina de bezerros naturalmenteproduzidas, quimosinas A e B, que diferem em apenas um resíduo deaminoácido na posição 244: um aspartato na quimosina A e uma glicina naquimosina B. A presença desses resíduos de aminoácidos promove uma maiorafinidade da quimosina A pela caseína k devido a uma estabilizaçãoeletrostática adicional do complexo caseína-k-quimosina, e uma maiorestabilidade da quimosina B em pH baixos (CHITPINITYOL, S.; CRABBE, M. J.C. Chymosin and aspartic proteinases. Food Chem. 61: 395-418,1998).
Extratos enzimáticos obtidos do abomaso de bezerros lactantes, quecontém 84% de quimosina, são tradicionalmente utilizados como agentescoagulantes do leite na fabricação de queijo. Esses extratos são extraídos pelalavagem e secagem do estômago, que é cortado em pequenos pedaços emacerado em uma salmoura contendo aditivos necessários à preparação e àconservação, durante 4-5 dias. Esta solução, que na verdade é uma mistura dequimosina com outras enzimas gástricas, é adicionada na etapa inicial doprocesso de produção de queijo, em quantidades determinadas segundo areceita de cada queijo (MOHANTY, A. K. et ai, Bovine chymosin: Production byrDNA technology and application in cheese manufacture. Biotechnol. Adv. 17:205-217, 1999).
Nos anos 1960, a FAO (Food and Agriculture Organization) previuuma severa queda no uso da quimosina de bezerro. Foi antecipado que umademanda de carne poderia levar à necessidade de abater os bezerros em umaidade mais madura, o que reduziria a produção de quimosina (quanto maisjovem o animal, mais enzima é secretada) (MOSCHOPOULOU, E. E. et ai,Purification and characterization of chymosin and pepsin from kid. J. Dairy Res.73: 49-57, 2006). A necessidade de carne, a desaprovação do uso de enzimaanimal por alguns grupos religiosos, e o custo elevado devido ao sacrifício debezerros, fez com que os fabricantes de queijo buscassem por fontesalternativas de menor custo, que não afetassem a qualidade dos queijos(CHITPINITYOL, S.; CRABBE, M. J. C. Chymosin and aspartic proteinases.Food Chem. 61: 395-418,1998).
A pepsina de porco surgiu como primeira alternativa à quimosinabovina, mas o alto grau de atividade proteolítica apresentado por esta enzimamostrou-se indesejável pelo gosto incomum que confere ao queijo. Enzimascom uma atividade proteolítica alta podem ser eficientes em coagular o leiterapidamente, mas, devido à indesejável ação proteolítica sobre as caseínas a eB durante a coagulação, levam a perdas no rendimento da produção. Essa altaatividade também é desfavorável por promover uma desestruturação da matrizde caseína e alterar a consistência característica dos queijos (KAPPELER, S.R. et ai, Characterization of recombinant camel chymosin reveals superiorproperties for the coagulation of bovine and camel milk. Biochem. Biophys. Res.Commun. 342: 647-654, 2006).
Alguns microrganismos foram identificados como produtores dequimosinas. Essas quimosinas microbianas foram caracterizadas como menosproteolíticas que a pepsina de porco e um pouco mais ativas que as debezerro. Um número de fungos e bactérias foi identificado como potenciaisfontes de quimosina, especialmente, Mucor pusillus, Mucor meihei, Entothiaparasitica, Aspergillus oryzae e Irpex lactis (BELDARREÍN, A. et ai,Characterization of Mucor pusillus rennin expressed in Pichia pastoris: enzymic,spectroscopic and calorimetric studies. Biotechnoi Appi Biochem. 31: 77-84,2000; SARDINAS, J. L. Rennin enzyme of Endothia parasitica. Appi Microbiol.16: 248-255, 1967; AIKAWA, J. et ai, Effects of glycosylation on the secretionand enzyme activity of Mucor rennin, an aspartic proteinase of Mucor pusillus,produced by recombinant yeast. J. Bioi Chem. 265: 13955-13959, 1990).
Atualmente, algumas indústrias utilizam quimosinas microbianasproduzidas por algumas destas fontes, já que os custos são reduzidos e podemser produzidas em quantidades satisfatórias em fermentações industriais.Entretanto, a demanda por quimosina animal, a enzima de preferência, queproduz um gosto característico aos queijos ainda é preferível, já que existemproblemas associados com os queijos produzidos por fontes microbianas. Aatividade proteolítica destas enzimas causa problemas secundários, como porexemplo, dificuldades com o endurecimento do coalho e perda significativa degordura e proteínas no soro, conseqüentemente, o rendimento do queijo émenor e podem desenvolver um gosto diferente e um sabor amargo (RAO, S.Extraction and purification of chymosin from buffalo calves. PhD thesis, Natl.Dairy Res. Inst, Karnal, índia,1984).
Como uma possível solução para se obter uma molécula similar aquimosina animal, foi proposta a clonagem do gene que codifica a quimosinamediante técnicas de DNA recombinante. Em anos recentes essa tecnologiapermitiu que o gene da quimosina animal fosse clonado e expresso comsucesso, como um produto da fermentação de linhagens não-patogênicas debactérias, leveduras e fungos filamentosos.
Wang construiu um plasmídio que permitiu a hiperexpressão da pró-quimosina (39% do total de proteína celular) na bactéria Escherichia coli K-12(WANG, G. High-level expression of prochymosin in E. coli. Effect of thesecondary structure of the ribosome binding site. Protein. Expr. Purif. 6:284-290, 1995). No entanto, a quimosina produzida nesta bactéria acumula emcorpos de inclusão, aumentando consideravelmente o custo do processo depurificação (NISHIMORI, K. et a/., Expression of cloned calf prochymosin genesequence in E. coli. Gene. 254: 8447-8456, 1982; EMTAGE, J. S. et ai,Synthesis of calf prochymosin (prorennin) in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad.Sei. (USA). 80: 3671-3675, 1983; MARSTON, F. A. O. et ai, Solubilization andactivation of recombinant calf prochymosin from E. coli. Biochem. Soe. Trans.13: 1035, 1985).
Outros sistemas de bactérias foram usados para expressar a pró-quimosina. Parente e colaboradores clonaram a seqüência do gene da pró-quimosina em Bacillus subtilis, no entanto, também obtiveram a expressão daenzima como um agregado insolúvel (PARENTE, D. et ai, Prochymosinexpression in Bacillus subtilis. FEMS. Microbiol. Lett. 77: 243-249, 1991). Aprodução extracelular da pró-quimosina foi conseguida fusionando o gene daenzima com uma seqüência sinal da proteína subtilisina de B. subtilis. Noentanto, foram obtidos apenas baixos níveis de expressão (100 ug.L"1). Aclonagem em Lactococcus lactis também apresentou níveis de produção muitobaixos (SIMONS, G. et ai, Production of prochymosin in Lactococci. Structureand function of aspartic proteinases. Ed. B. M. Dunn Plenum Press (NY).115-119, 1991), assim como em Proteus mirabilis (KAPRÁLEK, F. et ai,Fermentation conditions for high-level expression of the fac-promoter-controlledcalf prochymosin cDNA in Escheríchia coli HB101. Biotechnol. Bioeng. 37:71-79, 1991).
Na levedura Saccharomyces cerevisiae, os genes codificando parapré-pró-quimosina, pró-quimosina e quimosina madura foram expressos, masas proteínas foram sintetizadas, principalmente, na forma insolúvel,acumulando nas células e dificultando a ativação e purificação. Já a leveduraKluyveromyces lactis foi usada com sucesso para a secreção da pró-quimosina. Os fungos filamentosos Aspergillus niger var. awamorí eTrichoderma reesei também apresentaram altos níveis de expressão dequimosina bovina recombinante. A produção em A. niger chegou a 1,3 g.L"1,combinando mutagênese e um eficiente programa de screening (GOFF, C. G.et ai, Expression of calf prochymosin in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 27:35-46, 1984; VAN DEN BERG, J. A. et ai, Kluyveromyces as a host forheterologous gene expression: expression and secretion of prochymosin.Biotechnol. 8: 135-139, 1990; WARD, M. et ai, Improved production ofchymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion.Biotechnol. 8: 435-440, 1991; DUNN-COLEMAN, N. S. et ai, Commercialleveis of chymosin production by Aspergillus. Biotechnol. (NY). 9: 976-981,1991; HARKKI, A. et ai, A novel fungai expresion system: secretion of activecalf chymosin from the filamentous fungus Trichoderma reesei. Biotechnol.7: 596-603, 1989; CARDOZA, R. E. et ai, Expression of a synthetic copy of thebovine chymosin gene in Aspergillus awamorí from constitutive and pH-regulated promoters and secretion using two different pre-pro sequences.Biotechnol. Bioeng. 83: 249-259, 2003).Atualmente, apenas três empresas internacionais (Pfizer,Chr-Hansen e Girst Brocades) produzem e comercializam quimosinasrecombinantes (MOHANTY, A. K. et ai, Bovine chymosin: Production by rDNAtechnology and application in cheese manufacture. Biotechnol. Adv. 17:205-217, 1999).
A quimosina recombinante teve sua aprovação em 1980, reduzindoo abate de animais ainda jovens e trazendo grande economia à indústria delaticínios. Trata-se da primeira enzima recombinante a ser registrada epermitida pela FDA (Food and Drug Administration) para uso alimentar. Hoje,aproximadamente 80% dos queijos fabricados no mundo são feitos com essasfontes de quimosina. Este tipo de produção é de grande importância, já quediminui o custo em 40-50% e se obtém proteínas mais puras e mais previsíveisem termos de atividade, quando comparadas com aquelas extraídas doestômago de bezerros (GREEN, M. L. et ai, Cheddar cheese-making withrecombinant calf chymosin synthesized in Escherichia coli. J. Dairy. Res. 52:281-286, 1985; KAWAGUCHI, Y. et ai, Production of chymosin in Escherichiacoli cells and its enzymatic properties. Agric. Biol. Chem. 51: 1871-1877, 1987;HICKS, C. L. et ai., Use of recombinant chymosin in the manufacture ofcheddar and Colby cheese. J. Dairy Sei. 71: 1127-1131, 1988; BINES, V. E. etai., Comparison of cheddar cheese made with a recombinant calf chymosin andwith standard calf rennet. J. Dairy Res. 56: 657-664, 1989; FLAMM, E. L. HowFDA approved chymosin: A case history. Biotechnol. 9: 349-351, 1991;FOLTMANN, B. Prochymosin and chymosin (prorennin and rennin). MethodsEnzymol. 19: 421-436, 1970; WARD, M. et ai, Improved production ofchymosin in Aspergillus by expression as a glucoamylase-chymosin fusion.Biotechnol. 8: 435-440, 1991; BRUSGARD, C. Regulatory approval andcommercialization of chymogen. Scan. Dairy Infor. 6: 46-47, 1993).
As quimosinas recombinantes são submetidas a rigorosos testesbioquímicos, toxicológicos e microbiológicos para garantir a sua pureza. Foiconcluído pelo FDA que as enzimas recombinantes são idênticas e mais purasque os extratos enzimáticos extraídos de bezerro, o que conferiu o statusGRAS (Generally Regarded As Safe) para estas preparações. O rendimento, atextura e a qualidade dos queijos obtidos utilizando-se essas enzimas sãocomparáveis à quando são usadas enzimas naturais (JOHNSON, M. E.;LUCEY, J. A. Major technological advances and trends in cheese. J. Dairy Sei.89: 1174-1178, 2006).
No Brasil, é fabricada uma grande variedade de queijos. A ABIQ(Associação Brasileira das Indústrias de Queijo) calcula que existam cerca de2.500 laticínios produzindo queijos no País. De um modo geral, o consumo detodos os tipos de queijo está crescendo, seja de forma direta ou indireta e aquimosina utilizada pela maioria das indústrias brasileiras é a enzimarecombinante, que é importada. Não existe no Brasil produção de quimosinarecombinante, apenas são produzidos coalhos naturais por meio da extraçãodo estômago de bezerro. Embora o custo da quimosina recombinante sejasuperior ao da quimosina natural produzida por indústrias brasileiras, apreferência pela recombinante se deve, principalmente, à pureza daspreparações quando comparadas às naturais que estão contaminadas comoutras proteases.
A expressão de quimosina por microrganismos é, portanto, degrande interesse industrial devido à limitada disponibilidade do produto nomercado nacional. A quimosina recombinante é potencialmente útil nafabricação de queijo e seus derivados e pode substituir por completo asenzimas de origem animal sem nenhuma alteração na qualidade do queijo.
Além deste benefício, a enzima recombinante é de alta pureza eespecificidade, com baixa atividade proteolítica, e conta com a aprovação deconsumidores vegetarianos. Os queijos que utilizam essa forma de quimosinanão são considerados produzidos por um OGM (Genetically Modify Organism -Organismo Geneticamente Modificado), mas sim, por um produto deste.Conseqüentemente, todos os queijos vendidos são livres de OGM. O aumentodos esforços para a expressão de quimosina em microrganismos no Brasil é,pois, de grande interesse comercial por diminuir os custos da produção econseqüentemente, do produto final.
O objetivo da presente invenção foi de obter uma enzimarecombinante similar à quimosina bovina natural, para resolver os problemasde qualidade, principalmente os relacionados a gosto e consistênciaindesejáveis aos queijos produzidos a partir da coagulação específica do leite,e também evitar problemas relacionados com a aprovação desse tipo deproduto para consumo humano por órgãos competentes. O tipo demicroorganismo escolhido para expressar tal enzima recombinante levou aindaem consideração questões de custo para uma produção efetiva da proteína deinteresse em quantidade, qualidade e reprodutibilidade (forma ativa da enzima).Organismos multicelulares normalmente requerem meios complexos ricos emnutrientes, incluindo aminoácidos, vitaminas e fatores de crescimento. Estesmeios de cultura aumentam significativamente o custo de produzir proteínasrecombinantes. Por outro lado, os fungos do gênero Pichia podem crescer nosmeios que contêm somente uma fonte do carbono e uma fonte do nitrogênio.Estes fungos podem crescer em meio de um álcool simples, como o metanol,como fonte de energia (microorganismos metilotróficos). O meio contendometanol é letal para uma grande variedade de microorganismos, sendo assim,não há necessidade de tratamento adicional para evitar acontaminação/proliferação de outros microorganismos, como por exemplo, aadição de antibióticos para controlar bactérias e manter o rendimento deprodução de proteína de interesse. Além disso, Pichia cresce em altasdensidades celulares. Isto é importante industrialmente, pois o rendimento daproteína da expressão em um micróbio é aproximadamente igual ao produto daproteína produzida por quantidade de células. Pichia possui algumaspropriedades durante a expressão da proteína recombinante, que neste casoespecífico, é fundamental para obtenção da enzima em sua forma ativa esolúvel, que é a forma apropriada para aplicações a que se destina a presenteinvenção. Os autores escolheram o sistema heterólogo de Pichia pastoris paraa expressão e produção da pró-quimosina bovina. Pichia pastoris é umalevedura metilotrófica muito utilizada atualmente na expressão de proteínasheterólogas para pesquisa básica e uso industrial. Usando este sistema, maisde 400 proteínas já foram expressas nesta levedura com graus variados desucesso (CREGG, J. M. et al., Heterologous protein expression in themethylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS. Microbiol. Rev. 24: 45-66, 2001).Dentre as características vantajosas de P. pastoris como sistemasde expressão heteróloga destacam-se as seguintes: a levedura desfruta dostatus GRAS, é de fácil manipulação genética, expressa proteínas em altosníveis, e possui uma via eucariótica de secreção capaz de promovermodificações pós-traducionais como formação de pontes dissulfeto, O- e N-glicosilação e processamento de seqüências sinais (HOHENBLUM, H. et ai,Effects of gene dosage, promoters, and substrates on unfolded protein stress ofrecombinant Pichia pastoris. Biotechnol. Bioeng. 85: 367-375, 2004). Essesistema é também considerado de uso rápido, fácil, e mais econômico que ossistemas de expressão derivados de eucariotos superiores, como os sistemasbaseados em cultura de células de mamíferos (GELLISSEN, G. Heterologousprotein production in methylotrophic yeast. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54:741-750, 2000).
Para a produção de uma proteína recombinante ser comercialmenteatraente os rendimentos deve ser alto. Para tanto, há a necessidade de adaptara seqüência gênica ao sistema hospedeiro. Quando expressando um geneeucariótico em P. pastoris, os códons de um gene codificando uma proteínapodem não ser ótimos para acomodar altos níveis de expressão da proteína.Códons que são comuns em algumas espécies podem ser raras em outras e aexpressão pode ser limitada as quantidades disponíveis de aminoacil-tRNA nacélula. Terminação prematura da tradução pode ocorrer quando aconcentração de um dado aminoacil-tRNA é reduzido, assim como quando aseqüência do gene apresenta uma alta proporção de bases AT. A alteraçãodos códons preferenciais, assim como o aumento da proporção de bases GCno DNA são estratégias que podem ser usadas para melhorar os níveis deexpressão. Um exemplo desta estratégia pode ser visto na expressão do fatorde crescimento epidermal de camundongo (mEGF) em P. pastoris, onde ogene foi sintetizado com códons preferenciais da levedura (CLARE, J. J. et ai.,High-level expression of tetanus toxinfragment C in Pichia pastoris strainscontaining multiple tandem integrations of the gene. BioTechnolog. 9: 455-460,1991). O gene da a-amilase também foi sintetizado para melhorar o conteúdoGC e os códons usados para expressão em P. pastoris. Similarmente, osgenes codificando para (3-glicosidase (OLSEN, O. et a/., Transplanting twounique beta-glucanase catalytic activities into one multienzyme, which formsglucose. BioTechnology. 14: 71-76, 1996) e o fragmento da toxina tetânicaforam alterados para o conteúdo de GC, levando a um aumento dos níveis deexpressão das proteínas correspondentes (Clare et ai, 1991, acima citado).
A alteração da seqüência primária de DNA do gene da pró-quimosina B bovina para acomodar melhores níveis de conteúdo de bases GC,assim como alteração para os códons preferenciais de P. pastoris levaria aoaumento da expressão da pró-quimosina.
O pedido de patente PI8204898 descreve a produção de pró-quimosina bovina recombinante usando o cDNA da pró-quimosina bovinaclonada e expressa em Escherícchia coli, entretanto, a proteína é produzida deforma insolúvel. O pedido de patente GB2100737A descreve a construção devetores de expressão para o cDNA da pré-quimosina, e das versõesmodificadas metionina-pró-quimosina; metionina-quimosina, e expressão em E.coli. Enquanto o pedido de patente PI8307386A descreve a produção dasquimosinas recombinantes produzidas pelas bactérias recombinantes descritasem GB2100737A. Uma característica negativa das construções em E. coli éque a quimosina é produzida na forma insolúvel o que requer odesenvolvimento de estratégias de solubilização e processamento da pró-quimosina. No pedido de patente PI8307386A, os autores comentam que aexpressão heteróloga da metionina-pró-quimosina em S. cerevisiae leva aprodução de 75% da proteína na forma insolúvel. Nestas patentes foi usado ocDNA da pró-quimosina bovina com algumas modificações na extremidade 5'do cDNA para produção intracelular, como adição do códon para metioninaN-terminal e remoção da seqüência sinal de secreção da proteína para o meiode cultura. O pedido de patente US20020164696A1 descreve a expressãoheteróloga do cDNA e produção de quimosina, pró-quimosina e pré-pró-quimosina de camelo em Aspegillus niger var awamorí fusiohada a seqüênciade DNA correspondente a seqüência sinal de secreção do gene codificando aenzima glicoamilase. As únicas modificações feitas no DNA foram: a mudançasilenciosa de códon, isto é sem alteração do aminoácido especificado pelo ditocódon, para criação de um sítio de restrição para a enzima Pm/1 para facilitar afusão dos dois fragmentos de DNA. As construções foram usadas para atransformação por integração do cassete de expressão, portando a quimosina,a pró-quimosina ou a pré-pró-quimosina em Aspergillus awamori.
A presente invenção descreve a modificação silenciosa extensiva dogene codificando para a pró-quimosina bovina para a produção da quimosinasolúvel no sobrenadante da cultura de Pichia pastoris e outros fungos. Aexpressão dessa enzima recombinante pode ser feita por uma grandevariedade de fungos, como por exemplo, os dos gêneros Pichia,
Saccharomyces, Yarrowia, Kluyveromyces, Cândida, Hansenula, Aspergillus,Trichoderma, entre outros, referentes a diversas espécies conhecidas elargamente utilizadas tais como, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica,Kluyveromyces lactis, Cândida methanolica, Hansenula polymorpha ou Pichiaaugusta, Aspergillus niger var. awamori, Trichoderma reesei, entre outrasespécies, além de Pichia pastoris.
Descrição do invento:
- PRÓ-QUIMOSINA SINTÉTICA
A quimosina ou renina industrial é classificada pela IUBMB (UniãoInternacional de Bioquímica e Biologia Molecular) como uma protease do tipoaspartil endopeptidase com o número de identificação EC 3.4.23.4. Aquimosina ou renina, é uma enzima protease que contém 323 resíduos deaminoácidos com três pontes de dissulfito, que adicionada ao leite produz aprimeira etapa de formação do queijo ou para a formação do "junket" (espéciede coalhada fresca com sal ou sobremesa de leite coagulado e aromatizado). Aenzima converte partículas de caseinato de cálcio do leite, no relativamenteinsóluvel paracaseinato de cálcio, que na presença de íons cálcio coagula paradar forma a um produto coagulado denominado "coalho".
A fonte tradicional de renina é o abomaso (ou coagulador, quartoestômago dos ruminantes) de bezerros lactentes (que ainda dependem do leitematerno para a sua sobrevivência) ou de outros ruminantes jovens. Osbezerros recém-nascidos e outros ruminantes produzem no estômago a reninapara coagular o leite ingerido produzindo uma massa semi-líquida, que permiteaumentar o tempo de permanência do leite no organismo. Caso contrário, oleite fluiria pelo sistema digestivo restante produzindo diarréia. Com o tempo, aquantidade de renina diminui, sendo substituída pela pepsina, permitindo odesmame do filhote.
É também possível produzir a renina a partir de fungos. Atualmente,a maioria da renina comercial é produzida a partir de leveduras (fungosunicelulares) ou bactérias geneticamente modificadas, permitindo a produçãode um queijo considerado vegetariano. Acredita-se que a renina produzidadeste modo rende um queijo de consistência e com qualidade superior do queaquele produzido a partir da renina animal tradicional.
A coagulação do leite pela quimosina é um processo de duasetapas: a primeira fase (catalítica) começa com o reconhecimento específico daseqüência His98-Lys111 da caseína k (BEPPU, T. The cloning and expressionof chymosin (rennin) genes in microorganisms. Trends. Biotechnol. 1: 85-89,1993; MOHANTY, A. K. et ai, Bovine chymosin: Production by rDNAtechnology and application in cheese manufacture. Biotechnol. Adv. 17:205-217, 1999) e posterior clivagem proteolítica específica da ligação Phe105-Met106. Essa quebra resulta na liberação de um fragmento solúvel chamadomacropeptídeo, que passa para o soro, e outro, chamado p-K-caseína insolúvelque permanece na micela. A p-K-caseína não tem a propriedade de estabilizara estrutura micelar, causando diminuição na repulsão eletrostática entre asmicelas (REID, J. R. et ai, The action of chymosin on K-casein and itsmacropeptide: effects of pH and analysis of products of secondary hydrolysis.Int. Dairy J. 7: 559-569, 1997). A fase seguinte, não enzimática, consiste naagregação da p-k-caseína com as outras caseínas sob a associação de íonscálcio, o que, eventualmente, resulta na formação do coágulo micelar. Estefenômeno é, portanto, produzido pela desestabilização da solução coloidal dacaseína que origina a aglomeração de micelas livres concentrando a proteínado leite e retendo gordura. A fase aquosa contendo os elementoshidrossolúveis constitui o soro (LAWRENCE, K. et ai, Micelle stability: K-caseinstructure and function. J. Dairy Sei. 81: 3004-3012, 1998).O gene sintético possui 1098 pb e apresenta 76,14% de identidadecom o gene nativo de Bos taurus. De um total de 365 códons, 225 foramsubstituídos por códons preferenciais para P. pastoris. No entanto, todas asmudanças caracterizaram mutações silenciosas no gene nativo, codificandouma proteína idêntica à original. O conteúdo de GC (43,2%) foi mantidopróximo ao presente nos genes da levedura (42,73%). A seqüência deinteresse Seq. ID N2 1, foi sintetizada quimicamente pela empresa EpochBiolabs (EUA) a partir de dados fornecidos pelos autores da presente invenção.
A Seq. ID N2 1 resultante foi clonada no sítio de EcoRV do vetor comercialpBluescriptll SK (Stratagene) gerando o vetor pBSSK-CHYM para facilitar aamplificação da seqüência, principalmente in vivo (Figura 2).
O gene sintético da presente invenção, representado pelaSeq. ID N° 1 (código de sequenciamento descrito na Listagem em anexo)corresponde à pró-região, requerida para o correto dobramento da quimosina eestabilização do mRNA, além de seqüências codificadoras para a proteínamadura. Os sítios de restrição para as enzimas de restrição Xho I e Not I foramadicionados às extremidades 5'e 3' do gene, respectivamente, para facilitar aclonagem nos vetores de expressão. Os sítios para as proteases Kex2p eSte13p foram adicionados logo após o sítio de Xho I para permitir a perfeitaremoção dos sinais de secreção de levedura e liberação da pró-quimosina B.As marcações para os sítios das enzimas de restrição e os sítios de proteasesencontram-se destacados na Figura 3.
- EXPRESSÃO DA PRÓ-QUIMOSINA SINTÉTICA EM FUNGOS
O processo de obtenção da pró-quimosina bovina B por célulashospedeiras contendo o gene representado pela Seq. ID N2 1, de forma geralsegue os procedimentos estabelecidos pela técnica de obtenção de proteínasrecombinantes.
Geralmente, cada célula hospedeira, neste caso representado pelofungo, tem um protocolo de obtenção de proteína recombinante próprio,normalmente diferente para outros tipos de fungo. Por exemplo, o uso defungos filamentosos em substituição a Pichia levariam a processos detransformação do fungo, análise de expressão e de produção da proteína deinteresse obedecendo a um protocolo de procedimentos diferente do utilizadoem Pichia. No Exemplo 1 é abordado o caso específico da célula hospedeiraPichia pastoris. As diferenças também estão relacionadas ao meio nutrientepara as células hospedeiras, sendo que os meios de cultura para uma grandevariedade de fungos já está estabelecido pela técnica. Por outro lado, hápassos comuns de produção de pró-quimosina sintética por meio de suaexpressão em fungos em geral. As etapas principais se referem à introduçãodo plasmídio pBSSK-CHYM em E. coli utilizando a técnica de transformaçãopor cloreto de cálcio (Cohen, S. N. et ai, Nonchromosomal antibiotic resistancein bactéria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc.Natl. Acad. Sei. (USA). 69: 2110-2114, 1972). Neste caso, o promotor utilizadoé o AOX1. Uma vez amplificado em bactéria, o plasmídio é extraído e digeridocom as enzimas de restrição Xho I e Not I. O gene sintético, representado pelaSeq. ID N° 1, presente no plasmídio pBSSK-CHYM é purificado esubseqüentemente clonado nos vetores de expressão específicos para cadahospedeiro.
De forma geral, algumas condições para a produção pró-quimosinabovina B recombinante pelo cultivo do fungo Pichia pastoris de diferenteslinhagens tais como, linhagens GS115, X33, SMD1168, SMD1165, SMD1163,KM71, KM71H, principalmente as de linhagens GS115 ou outro organismohospedeiro que contém o gene que codifica a pró-quimosina bovina B dapresente invenção, são descritas a seguir:
- período de cultivo de 5 a 180 horas, preferencialmente de 12 a 72horas;
- pH entre 3,5 a 7,0, preferivelmente de 5,0 a 6,0, atingidos pelaadição de soluções tampões previamente preparadas ou obtidascomercialmente, ou ainda, pela adição de sais inorgânicos apropriados.
- temperaturas no intervalo de 12 a 42°C, preferivelmente de 26 a30°C;
- emprego de nutrientes adequados para cada tipo de fungo,contendo pelo menos uma fonte de carbono, nitrogênio e sais inorgânicos,utilizados de forma combinada ou isolada;- recuperação da quimosina de interesse por métodos de separaçãoconhecidos da técnica.
Para o caso de P. pastoris, principalmente para linhagens GS115,X33, SMD1168, SMD1165, SMD1163, KM71, KM71H, modificadas pelo generepresentado pela Seq. ID N2 1, as fontes de carbono e de nitrogênio sãorelativamente simples e de baixo custo. Esses fungos utilizam como fonte decarbono, um álcool, como o metanol, introduzido no sistema de cultivo de formaisolada ou combinada com outros compostos nutrientes de acordo com aquantidade de microorganismos iniciais. Fontes de nitrogênio como uréia,extrato de levedura ou YNB (Yeast Nitrogen Base) em associação com ometanol (fonte de carbono) são capazes de aumentar a produção enzimática.Após o cultivo, o processo de obtenção da proteína de interesse é finalizadoseguido da recuperação da quimosina desejada por métodos conhecidos datécnica. No Exemplo 1, a purificação da quimosina produzida por P. pastoris dalinhagem GS115, contendo o gene representado pela Seq. ID Ns 1 foi emescala de bancada, seguindo as etapas de obtenção do extrato bruto(concentração por liofilização) e separações utilizando técnicas decromatografia e ultrafiltração. A finalidade foi de caracterizar a enzima deinteresse e avaliar sua expressão em fungos para o emprego em processos decoagulação do leite, e conseqüente utilização na produção de queijos e seusderivados.
A invenção poderá ser melhor compreendida por meio da seguintedescrição detalhada mediante o Exemplo 1 para a obtenção da pró-quimosinabovina B recombinante expressa em Pichia pastoris. Os procedimentosexperimentais realizados estão descritos nos tópicos abordados nesteexemplo. Os resultados experimentais obtidos são apresentados nas Figurasde 1 a 14, as quais são apresentadas a seguir:
A Figura 1 representa o desenho esquemático da estrutura primáriada pré-pró-quimosina.
A Figura 2 representa o desenho esquemático do mapa físico dovetor pBSSK-CHYM.A Figura 3 ilustra o sequenciamento do gene recombinante da pró-quimosina bovina expressa em fungos, com marcações para os sítios dasenzimas de restrição Xho I e Not I, adicionados, respectivamente, àsextremidades 5'e 3' do gene representado por Seq. ID N° 1 (regiõesdestacadas pelos retângulos cinza mais baixo) e para os sítios das proteasesKex2p e Ste13p, adicionados logo após o sítio de Xho I (regiões destacadaspelos retângulos pretos mais altos).
A Figura 4 representa a análise eletroforética em gel de agarose0,8% do perfil de restrição do vetor pPIC9-CHYM, em: 1) pPIC9-CHYM intacto;2) pPIC9-CHYM/H/nd III; 3) Marcador A EcoR \IHind III; 4) pPIC9-CHYM/Xr70\/Not I; 5) pPIC9-CHYM intacto.
A Figura 5 representa a análise eletroforética em gel de agarose0,8% do perfil de digestão do vetor pPIC9-CHYM para liberação do cassete deintegração, em: 1) Marcador 1 kb Ladder Promega; 2) pPIC9-CHYM/eg/ II; 3) pPIC9-CHYM intacto.
A Figura 6 representa o comportamento da cultura em frasco dosclones A3 e controle negativo (C-) em: (A) Curva de crescimento e (B) Curvade atividade (U.mL"1) do sobrenadante das culturas em um período de até 96horas de crescimento.
A Figura 7 representa o ensaio de atividade em placa de agarose eleite nos intervalos de 0 a 96 horas. Sobrenadante ativado das culturas dosclones A3 (2) e controle negativo (1). Os halos de hidrólise compreendem asregiões escuras. O último halo corresponde ao controle positivo utilizando aenzima recombinante comercial Hannilase.
A Figura 8 representa a análise do perfil protéico do sobrenadanteda cultura do clone A3 em gel SDS-PAGE 12,5% corado com Coomassie blue,em: C-) Sobrenadantes do controle negativo após 96 horas de cultura; 1) e 2)Sobrenadante da cultura após 72 e 96 horas de cultivo, respectivamente;M) Marcador Prestained Protein Marker Broad Range. A seta indica a posiçãoda banda de -36 kDa.
A Figura 9 representa a análise por Southern blotting do DNAgenômico de P. pastoris clone A3, A: Gel de agarose 0,8% com o DNA totaldigerido com Bgl II; (1) Marcador A EcoR MHind III; (2) DNA do clone negativo;
(3) DNA do clone A3; (4) sonda purificada (cassete de integração contendo ogene CHYMb clonado no vetor pPIC9) (controle positivo), e outra B: Southernblotting do gel mostrado em A.
A Figura 10 representa o perfil cromatográfico da amostra dequimosina da presente invenção em uma coluna Sephacryl S-100. Quadrado
(■) representa o perfil de proteínas totais de cada fração e diamante (♦) atividade de coagulação do leite em U.mL .
A Figura 11 representa a análise eletroforética das amostras deproteínas do processo de purificação em gel SDS-PAGE 12,5% corado comprata para: H) Quimosina recombinante comercial (Hannilase) produzida pelofungo A. awamori; 1-4) Amostra 1 (frações 14 e 15), 2 (frações 16-18),3 (frações 19-22) e 4 (frações 23-29), respectivamente. A seta indica a posiçãoda quimosina.
A Figura 12 representa a caracterização eletroforética em gel SDS-PAGE 12,5%, corado com prata, da enzima recombinante produzida por P.pastoris da presente invenção tratada com PNGase F. 1) Marcador UnstainedProtein Molecular Weight Marker, 2) Amostra 2 não tratada; 3) Amostra 2ativada; 4) Amostra 2 tratada com PNGase F. A amostra 2 corresponde afrações 16-18 obtidas do processo de purificação.
A Figura 13 representa a análise eletroforética em gel SDS-PAGE12,5%, corado com Coomassie blue, da digestão de caseínas a, p e k com aquimosina purificada de P. pastoris (CHYMb) e com enzima recombinantecomercial (Hannilase) produzida pelo fungo A. awamori. Como controle foimontado sistema de digestão com água e na ausência de qualquer enzima. M)Marcador Unstained Protein Molecular Weight Marker; 1-2-3) Caseínas a, p ek, respectivamente.
A Figura 14 representa o perfil eletroforético em gel SDS-PAGE,corado com Coomassie blue, de diferentes fontes de quimosina. M) MarcadorUnstained Protein Molecular Weight Marker, 1) Quimosina purificada produzidapor P. pastoris da presente invenção; 2) Hannilase; 3) ENZIMAX. A seta indicaa posição da quimosina.Exemplo 1:
- CLONAGEM DO GENE SINTÉTICO REPRESENTADO PELA Seq. ID N2 1EM VETOR DE EXPRESSÃO DE PICHIA PASTORIS
O fragmento correspondente a Seq. ID N2 1 (1130 pb) foi liberado dovetor pBSSK-CHYM por digestão com as enzimas de restrição Xho I e Not I.Em seguida, o vetor pPIC9-Amy foi linearizado com as mesmas enzimas derestrição {Xho I e Not I) liberando o gene Amy (-3,5 kb), além do sítio para aprotease Kex2p do vetor que é restaurado quando o gene CHYMb é sub-clonado. Os DNAs digeridos foram aplicados em gel de agarose 1% esubmetidos a eletroforese por duas horas até que os fragmentos de DNAfossem separados. Detalhes da estrutura primária, do vetor e do fragmento deDNA de interesse são visualizados nas Figuras 1 a 3. A banda de gelcorrespondente ao fragmento da Seq. ID N- 1 e do plasmídio linearizado foramcortados do gel e purificados utilizando kit comercial kit QIAquick GelExtraction. O fragmento contendo a Seq. ID N2 1 foi ligado ao plasmídio pPIC9(Invitrogen) linearizado nas razões molares de 1:3 e 1:10. A enzima T4 DNALigase foi utilizada com os tampões de reação fornecidos pelos fabricantes. Ossistemas foram incubados a 4°C por pelo menos 14 h antes de serem utilizadospara transformação de bactérias. A ligação do gene foi direcionada para entrarem fase com o peptídeo sinal do fator a de S. cerevisiae presente no vetor.
Após transformação bacteriana, os clones transformantes foramsubmetidos a procedimentos para extração de DNA plasmidial e um clone foiselecionado para confirmar a clonagem do gene CHYMb.
Na Figura 4, poço 2, pode-se visualizar o vetor resultante da ligaçãodigerido com a enzima de restrição Hind III. Com essa digestão, na presençado inserto, foram produzidos um fragmento de ~7,5 kb e outro de 1500-1800pb. Foi realizada também, dupla digestão com as enzimas utilizadas naclonagem, Xho I e Not I, para liberação do fragmento correspondente ao genesintético, como visualizado no poço 4 (Figura 4). Após a confirmação daclonagem, esse vetor foi denominado pPIC9-CHYM. As análises de restriçãocomprovaram a presença do inserto no vetor de expressão e a integridade domesmo (Figura 4).- TRANSFORMAÇÃO DA LINHAGEM GS115 DE P. PASTORIS
Para integração no genoma de P. pastoris, o vetor pPIC9-CHYM foidigerido com a enzima de restrição Bgl II para liberação do cassete deintegração (-6,7 kb) (Figura 5). Na Figura 5 pode-se visualizar no poço 2 apresença de dois fragmentos de DNA resultantes do plasmídio acima digeridocom a enzima Bgl II, com tamanhos de 2,3 kb e 6,8 kb, correspondentes asseqüências bacterianas para amplificação do plasmídio em bactéria e aocassete de integração para Pichia pastoris, respectivamente. Após a digestão,esse fragmento, que contém o cassete de expressão e a marca HIS4, expõenas extremidades seqüências do locus AOX1 para direcionar'a integração, quepode ocorrer no locus HIS4, assim como no locus AOX1 por substituição ouinserção. Para controle negativo da expressão o vetor pPIC9 original foi tambémdigerido com a enzima Bgl II e usado para transformação de P. pastoris.
A linhagem GS115 de P. pastoris foi transformada por eletroporaçãocom o vetor de expressão pPIC9-CHYM linearizado. Os transformantes com ovetor pPIC9-CHYM foram selecionados pela capacidade de crescimento emmeio mínimo-ágar (MD-ágar) sem histidina. A transformação resultou em ~500transformantes.
- SELEÇÃO DOS TRANSFORMANTES PRODUTORES DE QUIMOSINA
Para screening dos clones expressando a pró-quimosinarecombinante, 94 clones (designados A1-94) e dois clones controle negativoforam selecionados aleatoriamente e submetidos a crescimento em meiolíquido em placas tipo deep well. Em uma placa de deep well (96 poços comcapacidade de 2 ml) foram adicionados 800 uL de meio BMGY aos poços e emcada um deles foi inoculada uma colônia escolhida aleatoriamente das placasde transformação. A placa foi vedada com filme plástico e incubada em umshakera 30 °C e 200 rpm para crescimento das células. Após três dias, a placafoi centrifugada a 1280 x g por 10 minutos e o sobrenadante foi descartado.
Foram adicionados a cada poço 800 uL de meio BMMY. A placa foi novamentefechada com o filme plástico e incubada em um shaker nas mesmas condiçõesdescritas anteriormente. Foi adicionado metanol para uma concentração finalde 0,5% (v/v), a cada 24 horas aos poços dos transformantes crescendo emmeio BMMY. Após centrifugação a 1280 x g por 10 minutos, uma alíquota de50 uL do sobrenadante de cada transformante foi retirada a cada 24 horas,para análise da atividade. Cada sobrenadante foi analisado pela capacidade decoagulação do leite e formação de halos de hidrólise em placa com leite.
Aproximadamente 74% dos transformantes expressaram a enzima,porém, em níveis variados. Não foi detectada atividade enzimática nossobrenadantes das culturas dos controles negativos. Quatro transformantes dosistema de transformação com o vetor pPIC9-CHYM, que exibiram as maioresatividades de coagulação, foram analisados em frascos quanto ao temponecessário para 100 uL do sobrenadante ativado coagular 400 uL de leitedurante o intervalo de 0 a 96 horas de cultivo. Os resultados estão mostradosna Tabela 1. Como pode ser observado, o clone A3 apresentou os menorestempos para coagular amostras de leite, sendo identificado como o maiorprodutor de atividade enzimática dentre os clones analisados.
TABELA 1
<table>table see original document page 22</column></row><table>
- INDUÇÃO E EXPRESSÃO DE RECOMBINANTES EM FRASCO
Usando uma colônia isolada, fez-se um pré-inóculo em 25 mL demeio BMGY em um Erlenmeyer de 250 mL. Crescidas a 28 °C sob agitação atéa cultura atingir uma OD6oo de 2-6 (aproximadamente 16-18 horas). As célulasforam coletadas por centrifugação a 1500 x g por 5 minutos a temperaturaambiente e o sobrenadante desprezado. As células foram ressuspendidas emErlenmeyer aletado de 1 L com 100 mL de meio de indução BMMY e retornadasa incubadora para continuar o crescimento. Adicionou-se metanol 100% parauma concentração final no meio de cultura de 0,5% (v/v), a cada 24 horas decrescimento para manter a indução dos transformantes com o plasmídiocontendo o promotor AOX1. A indução foi realizada num período de 96 horas. Acada tempo de indução foram retirados 5 ml_ de cada cultura. Apóscentrifugação e descarte das células, o sobrenadante foi utilizado para mediçãoda OD6oo, da atividade enzimática e análise do perfil protéico em gel SDS-PAGE.
A cultura controle e o clone A3 apresentaram o mesmo perfil decrescimento e densidade celular, como indica o comportamento dos gráficosmostrados na Figura 6 A e B. Isto sugere que a produção de quimosina pelalevedura não causa inibição do crescimento celular. Como esperado, não foidetectada expressão de pró-quimosina nas culturas não induzidas (pré-inóculoe tempo 0). No entanto, com a troca do meio com glicerol pelo meio commetanol (como única fonte de carbono), o promotor AOX1 foi induzido, sendodetectada atividade nas primeiras 24 horas de crescimento. Depois disso, como progresso da fase de indução houve um aumento gradual nos níveis deatividade, como sugere o perfil de crescimento e densidade celular mostradona Figura 6 A e B. A maior produção (50 U.mL"1) foi encontrada no último pontoanalisado, após 96 horas de indução. Não foi detectada atividade nosobrenadante do controle negativo. Estes resultados confirmam que a atividadeenzimática é devido a expressão do gene sintético e não a uma atividadeproteásica intrínseca da hospedeira utilizada.
- ANÁLISE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA QUIMOSINA EM PLACA DEPETRI CONTENDO LEITE
Na placa de hidrólise (Figura 7), também ficou evidente a detecçãode atividade de coagulação do leite no sobrenadante da cultura. No perfil doclone A3 (Figura 7, coluna 2), a partir de 48 horas, podem ser observados halosde hidrólise de tamanhos crescentes com o decorrer da cultura, semelhantes aoproduzido pela enzima comercial Hanilase. Os baixos níveis de secreção após24 horas propiciaram sobrenadante que não foi capaz de formar halo. Ossobrenadantes do controle negativo (Figura 7, coluna 1) sob condições deindução não formaram halos.
ANÁLISE DO PERFIL PROTEÍCO
A fim de detectar a enzima recombinante e determinar sua massamolecular, as proteínas presentes no sobrenadante da cultura do clone A3 com96 horas de indução foram submetidas a eletroforese em gel SDS-PAGE.Como controles foram usados os sobrenadantes (96 horas) das linhagenscontrole (C~), e a enzima recombinante comercial Hannilase. A partir do perfilde migração das proteínas no gel foi possível identificar uma bandacorrespondente à enzima recombinante de P. pastoris no sobrenadante dacultura e que não está presente no perfil do controle negativo (Figura 8, poços1, 2 e C"). A massa molecular desta proteína foi estimada em ~36 kDa, quecorrespondente à massa molecular predita da quimosina processada, comodescrito por Foltmann e colaboradores (Foltmann, B. et ai, The completeamino acid sequence of prochymosin. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74(6):2321-2324, 1977).
- ANÁLISE DO NÚMERO DE CÓPIAS INTEGRADAS
Para determinar o número de cópias do gene integradas, o tipo deintegração (substituição ou inserção) e o lócus de integração no genoma de P.pastoris, foi realizado um experimento de Southern blotting. Os resultados estãomostrados na Figura 9 A e B. A sonda homóloga utilizada (Figura 9, poço 4)corresponde a toda a região do cassete de integração do vetor pPIC9-CHYM. Aprópria sonda foi utilizada como controle positivo do experimento (Figura 8 A eB, poço 4), sendo responsável por um sinal de -6,7 kb na autoradiografia(Figura 8B, poço 4). Analisando os dados apresentados, ficou comprovada aintegração do cassete de expressão no genoma de P. pastoris do clone A3,devido à presença de sinal de tamanho correspondente ao cassete deexpressão no seu DNA genômico (Figura 9B, comparar poço 3 e 4). Foiobservado também que o clone controle (Figura 8B, poço 2), assim como o A3(Figura 9B, poço 3), manteve o gene AOX1 selvagem (bandas de 2,4 kb e1,7 kb), provavelmente devido à ocorrência de evento de recombinação simples(integração por inserção) na região 5'AOX1 ou 3'AOX1. Ainda, a hibridizaçãocom a sonda permitiu identificar que houve dupla integração do cassete deexpressão no genoma do clone A3 (Figura 9B, poço 3). Para estimar o númerode cópias integradas, foi comparada a intensidade das bandas correspondentesao cassete de integração (Figura 9B, poço 3, banda de ~6,7 kb) com a bandacorrespondente ao lócus HIS4 (Figura 9B, poço 3, banda de 2,7 kb), queapresenta apenas uma cópia no genoma de P. pastoris por meio do programaScion Image. A análise do mapa de restrição do DNA genômico descrito naliteratura reforça a veracidade dos resultados obtidos, tanto no que se refere aotamanho dos fragmentos de hibridação quanto ao número deles.
- PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ENZIMÁTICA
Aproximadamente 400 ml_ de uma cultura de 72 horas de indução foiconcentrada por liofilização (extrato bruto), e submetida a uma cromatografia emcoluna de gel filtração (Sephacryl S-100) previamente equilibrada com tampãofosfato 50 mM pH 6,0. Frações de 5 ml_ de eluato foram coletadas por tubo,totalizando 95 frações. O perfil de atividade enzimática e do conteúdo deproteínas de cada fração, após a cromatografia, é apresentado na Figura 10.
Embora a eluição com tampão fosfato tenha resultado em um grande pico deproteína ladeado por dois outros menores, apenas as proteínas eluídas nasfrações 14 a 29 apresentaram atividade de coagulação do leite.
As frações correspondentes ao pico de atividade foram reunidas em 4diferentes amostras: Amostra 1, as duas primeiras frações que apresentaramatividade enzimática (14 e 15); Amostra 2, frações que apresentaram maioratividade (16,17 e 18); Amostra 3, frações no final do pico (19-22) e Amostra 4,frações que apresentaram apenas atividade residual (23-29). As quatroamostras, após concentração por ultrafiltração, foram analisadas em gel SDS-PAGE, conforme apresentado na Figura 11. Foi revelada a presença de bandasem todas as amostras com exceção da Amostra 4, no entanto, apenas nasAmostras 2 e 3 a enzima foi purificada. No caso da Amostra 2, uma segundabanda, com massa molecular aparente próxima à da quimosina, também foirevelada, indicando possível presença da enzima recombinante não processadaou glicosilada.Para verificação dessa hipótese, a Amostra 2 foi analisada em gelSDS-PAGE após passar pelo processo de ativação e pela digestão com aenzima de deglicosilação, PNGase F. Como pode ser observado na Figura 12,não houve alteração no perfil eletroforético após o processo de ativação. Noentanto, o tratamento com a PNGase F por 2 h resultou no desaparecimento dabanda superior, indicando a presença de N-glicosilações na enzimarecombinante. Pela comparação das bandas encontradas no gel de purificaçãoda Amostra 2, realizada pelo programa Scion Image, foi estimado queaproximadamente 23% de quimosina recombinante secretada por P. pastoris églicosilada.
Para análise de especificidade, a enzima purificada (Amostra 2) foiincubada com as caseínas a, p, e k (Figura 12, poços 1, 2 e 3 CHYMb),separadamente, e os produtos da digestão analisados em gel SDS-PAGE(Figura 13). Os resultados foram comparados com aqueles obtidos com aquimosina recombinante comercial (Figura 13, poços 1, 2 e 3, Hanilase). Ahidrólise da caseína k com a quimosina recombinante de P. pastoris (Figura 13,poço 3, CHYMb) produziu uma banda com massa molecular aparente deaproximadamente 14-15 kDa, que não foi observada na preparação não tratada(apenas solução aquosa), e que corresponde ao perfil esperado após a hidrólisedesta caseína com a enzima quimosina. A hidrólise da caseína k com aquimosina comercial gerou o mesmo produto (Figura 13, poços 3, Hanilase). Jáo tratamento das caseínas a e p não produziu bandas adicionais (Figura 13,poços 1 e 2 CHYMb e Hanilase). Os resultados indicam claramente que aquimosina recombinante purificada testada para frações da caseína, atuaespecificamente sobre a caseína k.
Para efeito de comparação, foi analisado em gel SDS-PAGEamostras de quimosina bovina comercial extraída de bezerros (ENZIMAX),quimosina bovina comercial recombinante produzida pelo fungo A. awamori(Hannilase) e a quimosina bovina recombinante purificada produzida por P.pastoris da presente invenção. Como pode ser observado na Figura 14, opreparado extraído do estômago de bezerro (Figura 14, poço 3) é contaminadocom diversas outras proteínas do lúmen gástrico, enquanto que as duasenzimas recombinantes (Figura 14, poços 1 e 2) purificadas apresentam umaúnica espécie protéica correspondente a enzima quimosina.
O conjunto dos resultados apresentados demonstra que o generepresentado pela Seq. ID N9 1 foi expresso com sucesso e a quimosinarecombinante resultante se apresentou na sua forma solúvel no meio de culturae foi purificada em apenas uma etapa. As características bioquímicas daquimosina recombinante foram mantidas sendo indistinguíveis da sua versãocomercial (Hanilase). Testes de coagulação do leite mostraram que a quimosinarecombinante é capaz de atuar com a mesma eficiência que a versão comercial.
Sendo assim, o uso de quimosina codificada pelo gene representado pelaSeq. ID N2 1 deve ser considerado para a produção de queijos e seus derivados.
No processo de produção de queijos e seus derivados, a partir dacoagulação de leite pela quimosina recombinante da presente invenção, asquantidades usadas da enzima seguem as mesmas proporções utilizadas paraquimosina natural ou recombinante comercial (conhecimento da técnica) porapresentar as mesmas características da pró-quimosina bovina nativa ounatural.
Claims (9)
1.- GENE RECOMBINANTE DA PRÓ-QUIMISINA BOVINA B expressa emfungos caracterizado por compreender a seqüência Seq. ID N2 1.
2.- GENE RECOMBINANTE DA PRÓ-QUIMISINA BOVINA B de acordo coma reivindicação 1, caracterizado por ser expresso em fungos de diferentestipos, tais como os dos gêneros Pichia, Saccharomyces, Yarrowia,Kluyveromyces, Cândida, Hansenula, Aspergillus e Trichoderma.
3.- GENE RECOMBINANTE DA PRÓ-QUIMISINA BOVINA B de acordo coma reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser expresso em fungos dediferentes espécies, tais como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae,Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis, Cândida methanolica, Hansenulapolymorpha ou Pichia augusta, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillusnidulans e Trichoderma reesei.
4.- GENE RECOMBINANTE DA PRÓ-QUIMISINA BOVINA B de acordo coma reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser expresso em Pichia pastorislinhagens GS115, X33, SMD1168, SMD1165, SMD1163, KM71, KM71H,principalmente as de linhagens GS115.
5.- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PRÓ-QUIMISINA BOVINA B expressapor fungos conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelofato de compreender o cultivo de fungos que contém o gene que codifica apró-quimosina bovina B, representado pela Seq. ID N2 1, em um meionutriente adequado, contendo pelo menos uma fonte de carbono, nitrogênioe sais inorgânicos, seguido da recuperação da quimosina desejada pormétodos conhecidos da técnica.
6.- PROCESSO DE PRODUÇÃO DE PRÓ-QUIMISINA BOVINA B de acordocom a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é cultivado o fungoPichia pastoris ou outro organismo hospedeiro que contém o gene quecodifica a pró-quimosina bovina B, representado pela Seq. ID N2 1, durante operíodo de 5 a 180 horas, preferencialmente de 12 a 72 horas, em pH entre 3,5 a 7,0 preferencialmente de 5,0 a 6,0, em temperaturas no intervalo de 12 a 42°C, preferencialmente de 26 a 30°C.
7.- PROCESSO DE PRODUÇÃO DA PRÓ-QUIMISINA BOVINA B de acordocom a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que é cultivado ofungo Pichia pastoris de uma das linhagens GS115, X33, SMD1168,SMD1165, SMD1163, KM71, KM71H que contêm o gene que codifica a pró-quimosina bovina B, representado pela Seq. ID N9 1, utilizando como fontede carbono, um álcool, como o metanol, usado no sistema de cultivo deforma isolada ou combinada com outros compostos nutrientes, tais comouréia, YNB e sais inorgânicos.
8.- Uso da seqüência do gene recombinante conforme definido nareivindicação 1, caracterizado por ser para expressar a pró-quimisinabovina B, utilizada no processo de coagulação do leite.
9.- Uso da pró-quimosina bovina B obtida pela expressão do generecombinante conforme descrito na reivindicação 1, caracterizado por serpara coagular o leite no processo de produção de queijos e seus derivados.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0803149-5A BRPI0803149A2 (pt) | 2008-07-31 | 2008-07-31 | gene recombinante da pró-quimosina bovina e sua expressão em fungos visando a produção de queijos e seus derivados |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0803149-5A BRPI0803149A2 (pt) | 2008-07-31 | 2008-07-31 | gene recombinante da pró-quimosina bovina e sua expressão em fungos visando a produção de queijos e seus derivados |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0803149A2 true BRPI0803149A2 (pt) | 2010-06-08 |
Family
ID=42234058
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0803149-5A BRPI0803149A2 (pt) | 2008-07-31 | 2008-07-31 | gene recombinante da pró-quimosina bovina e sua expressão em fungos visando a produção de queijos e seus derivados |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BR (1) | BRPI0803149A2 (pt) |
-
2008
- 2008-07-31 BR BRPI0803149-5A patent/BRPI0803149A2/pt not_active Application Discontinuation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kumar et al. | Chymosin and other milk coagulants: sources and biotechnological interventions | |
| Mohanty et al. | Bovine chymosin: production by rDNA technology and application in cheese manufacture | |
| Neelakantan et al. | Production and use of microbial enzymes for dairy processing | |
| Jiang et al. | Constitutive expression, purification and characterization of bovine prochymosin in Pichia pastoris GS115 | |
| IE53517B1 (en) | Process for the production of a polypeptide | |
| Tyagi et al. | Functional expression of recombinant goat chymosin in Pichia pastoris bioreactor cultures: A commercially viable alternate | |
| Sternberg | Microbial rennets | |
| Espinoza-Molina et al. | Codon optimization of the “Bos Taurus Chymosin” gene for the production of recombinant chymosin in Pichia pastoris | |
| McCaman et al. | Enzymatic properties and processing of bovine prochymosin synthesized in Escherichia coli | |
| JPH05505523A (ja) | チーズの生産方法 | |
| Feng et al. | Codon optimization of the calf prochymosin gene and its expression in Kluyveromyces lactis | |
| EP0114507B1 (en) | Method for activating microbial rennet and further production of cheese | |
| WO2016005587A1 (en) | Milk clotting aspartic protease enzyme composition | |
| Ersöz et al. | The combined effect of the gene copy number and chaperone overexpression on the recombinant bovine chymosin production in Pichia pastoris, with mutant ADH2 promoter | |
| Bakr et al. | Purification and characterization of milk clotting enzyme from edible mushroom (Pleurotus Florida) | |
| WO2015150532A1 (en) | Proline-specific endoprotease | |
| Balabova et al. | Can recombinant tree shrew (Tupaia belangeri chinensis) chymosin coagulate cow (Bos taurus) milk? | |
| BRPI0803149A2 (pt) | gene recombinante da pró-quimosina bovina e sua expressão em fungos visando a produção de queijos e seus derivados | |
| US4935354A (en) | Rennin from recombinant microbial cells for preparation of cheese | |
| US10196624B2 (en) | Aspartic proteases | |
| US10202594B2 (en) | Proline-specific endoprotease and use thereof | |
| JPS589687A (ja) | ポリペプチドの生産方法 | |
| US4961938A (en) | Preparation of cheese with rennin from recombinant microbial cells | |
| US20240352091A1 (en) | Animal free- alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin fusion milk proteins and a process for preparing the same | |
| RU2769175C1 (ru) | Способ микробиологической продукции химозина быка с использованием рекомбинантного штамма Pichia pastoris, содержащего синтетический ген варианта химозина с коэкспрессией фактора HAC1 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE 7A. E 8A. ANUIDADE(S) |
|
| B08G | Application fees: restoration [chapter 8.7 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] |