BRPI0711055A2 - process of liver stem cell derivation and induction of hgp expression - Google Patents
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Abstract
PROCESSO DE DERIVAçãO DE CéLULAS-TRONCO HEPáTICAS E DE INDUçãO DA EXPRESSãO DE HGP. A presente invenção fornece um processo para derivar células-tronco hepáticas partindo de células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático. Em uma modalidade da invenção, as células-tronco hepáticas são derivadas de células-tronco adiposas. A invenção fornece ainda um processo de aumento da produção de citocinas hepáticas (por exemplo, HGF) partindo de ASCs, que podem ser úteis na regeneração do tecido hepático quando transplantadas in vivo. São fornecidas as condições de cultura de tecido, incluindo as condições de meios.PROCESS OF DERIVING HEPATIC STEM CELLS AND INDUCING HGP EXPRESSION. The present invention provides a process for deriving liver stem cells from stem cells derived from non-hepatic tissue. In one embodiment of the invention, liver stem cells are derived from adipose stem cells. The invention further provides a process for increasing the production of liver cytokines (e.g., HGF) starting from ASCs, which can be useful in the regeneration of liver tissue when transplanted in vivo. Tissue culture conditions, including media conditions, are provided.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE DERIVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO HEPÁTICAS E DE INDUÇÃO DA EXPRESSÃO DE HGP".Report of the Invention Patent for "HEP CELL DERIVATION AND HGP EXPRESSION INDUCTION PROCESS".
REFERÊNCIA CRUZADA A DE PATENTES RELACIONADOSCROSS REFERENCE TO RELATED PATENTS
Este pedido de patente reivindica prioridade ao Pedido de Paten- te U.S. Provisório N2 60/794.508, depositado em 25 de abril de 2006 e ao Pedido de Patente U.S. Provisório N2 60/894.128, depositado em 9 de março de 2007, cujas descrições são incorporadas aqui como referência em sua totalidade.This patent application claims priority to Provisional US Patent Application No. 60 / 794,508, filed April 25, 2006 and Provisional US Patent Application No. 60 / 894,128, filed March 9, 2007, the disclosures of which are incorporated. here by reference in its entirety.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION
A presente invenção refere-se de forma geral ao campo de tera- pias baseadas^etCLçálütas. Mais especificamente, a presente invenção refe- re-se à derivação de células-tronco hepáticas partindo de células-tronco de- rivadas de células que não são do fígado.The present invention relates generally to the field of therapeutics. More specifically, the present invention relates to the derivation of hepatic stem cells from stem cells derived from non-liver cells.
A falência hepática secundária à hepatite, à exposição a hepato- toxinas e à cirrose põe em risco os fígados de milhares de pessoas apenas nos Estados Unidos da América. Estimativas de custos diretos anuais para o cuidado da saúde para doença do fígado nos EUA variam de $60 bilhões até mais de $100 bilhões. $20-40 bilhões adicionais para a incapacitação física são pagos anualmente para estes pacientes e suas famílias pela Social Se- curity Administration. Infelizmente, neste momento, o transplante de fígado é a única opção terapêutica disponível para os pacientes além de medidas paliativas.Liver failure secondary to hepatitis, exposure to hepatotoxins and cirrhosis endangers the livers of thousands of people in the United States alone. Estimated annual direct costs for liver disease health care in the US range from $ 60 billion to over $ 100 billion. An additional $ 20-40 billion for physical disability is paid annually to these patients and their families by the Social Security Administration. Unfortunately, at this time, liver transplantation is the only therapeutic option available to patients other than palliative measures.
Entretanto, devido à limitação de órgãos doadores, menos de um terço de todos os pacientes nas listas de espera para fígados realmente receberá um. De acordo com o United Network of Organ Sharing (UNOS), 15.700 pacientes aguardam transplante de fígado atualmente nos Estados Unidos da América, mas apenas 4.000 até 5.000 fígados doadores que po- dem ser transplantados estão disponíveis anualmente. Uma vez que, com algumas exceções, um órgão doador ajuda apenas um receptor, ao longo da última década uma lacuna crescente vem surgindo entre doadores disponí- veis e candidatos a transplante em espera. Portanto, são necessárias novas terapias.However, due to limited donor organs, less than a third of all patients on liver waiting lists will actually receive one. According to the United Network of Organ Sharing (UNOS), 15,700 patients are currently awaiting liver transplantation in the United States, but only 4,000 to 5,000 donor livers that can be transplanted are available annually. Since, with some exceptions, a donor agency only helps one recipient, over the past decade a growing gap has emerged between available donors and waiting transplant candidates. Therefore, new therapies are required.
Terapias com células-tronco apresentam uma opção terapêutica alternativa para aqueles que necessitam da reconstituição total ou parcial da função hepática. De muitas maneiras, as terapias com células hepáticas são uma alternativa desejável para o transplante de órgãos inteiros, porque um fígado pode ser utilizado para tratar vários pacientes e porque os procedi- mentos cirúrgicos envolvidos nas terapias celulares são mais seguros, mais fáceis e menos caros para o paciente. O transplante de células-tronco ofere- ce uma modalidade de tratamento que melhora de forma segura e eficiente a função bioquímica dentro do fígado em falência.Stem cell therapies offer an alternative therapeutic option for those who need full or partial liver function reconstitution. In many ways, liver cell therapies are a desirable alternative to whole-organ transplantation because a liver can be used to treat multiple patients and because surgical procedures involved in cell therapies are safer, easier, and less expensive. for the patient. Stem cell transplantation offers a treatment modality that safely and efficiently improves the biochemical function within the failing liver.
Assim, há uma necessidade de métodos para derivar células- tronco hepáticas partindo de tecido sem ser hepático.Thus, there is a need for methods to derive liver stem cells from non-hepatic tissue.
SUMÁRIO DA INVENÇÃOSUMMARY OF THE INVENTION
Em uma modalidade da presente invenção, é fornecido um mé- todo de derivação de células-tronco hepáticas partindo de células-tronco não hepáticas que compreende: (a) o fornecimento de células-tronco derivadas de tecido sem ser hepático; e (b) o cultivo das células-tronco sobre uma ma- triz extracelular que compreende pelo menos uma proteína de matriz fibrilar e em meio de cultura isento de soro que compreende o fator de crescimento hepático (HGF), em que as células-tronco derivadas de tecido sem ser hepá- tico se diferenciam em células-tronco hepáticas. Os exemplos de tecido sem ser hepático, incluem, mas não estão limitados ao baço, ao intestino e ao tecido adiposo. Em uma modalidade preferida, as células-tronco adiposas são derivadas de tecido adiposo à fonte de células-tronco não hepáticas; entretanto, o tecido que não hepático pode ser de qualquer mamífero adulto. A pelo menos uma proteína de matriz fibrilar é preferencialmente seleciona- da do grupo que consiste em colágeno I e colágeno III. Em algumas modali- dades da invenção, o meio de cultura pode compreender ainda Oncostatin M, DMSO ou ambos e a matriz extracelular pode compreender ainda fibro- nectina, matrigel, vitrogen ou combinações dos mesmos.In one embodiment of the present invention, a method of deriving liver stem cells from non-hepatic stem cells is provided comprising: (a) providing non-hepatic tissue derived stem cells; and (b) culturing stem cells on an extracellular matrix comprising at least one fibrillar matrix protein and in serum-free culture medium comprising hepatic growth factor (HGF), wherein the stem cells Non-hepatic tissue derivatives differentiate into hepatic stem cells. Examples of nonhepatic tissue include, but are not limited to, the spleen, intestine, and adipose tissue. In a preferred embodiment, adipose stem cells are derived from adipose tissue to the source of nonhepatic stem cells; however, nonhepatic tissue may be from any adult mammal. The at least one fibrillar matrix protein is preferably selected from the group consisting of collagen I and collagen III. In some embodiments of the invention the culture medium may further comprise Oncostatin M, DMSO or both and the extracellular matrix may further comprise fibronectin, matrigel, vitrogen or combinations thereof.
Em algumas modalidades, mais de aproximadamente 70% das células-tronco derivadas de tecido sem ser hepático se diferenciam em célu- las-tronco hepáticas.In some embodiments, more than approximately 70% of non-hepatic tissue-derived stem cells differentiate into hepatic stem cells.
Em uma outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método de indução da expressão de HGF partindo de células-tronco não hepáticas que compreende: (a) o fornecimento de células-tronco derivadas de tecido sem ser hepático; e (b) o cultivo das células-tronco sobre uma matriz extracelular que compreende pelo menos uma proteína de matriz fibrilar e em meio de cultura isento de soro que compreende EGF, bFGF ou ambos, em que as células-tronco derivadas do tecido sem ser hepático produzem HGF. O meio de cultura pode compreender ainda difosfato ascórbico de sódio.In another embodiment of the present invention, there is provided a method of inducing HGF expression from nonhepatic stem cells comprising: (a) providing non-hepatic tissue derived stem cells; and (b) culturing stem cells on an extracellular matrix comprising at least one fibrillar matrix protein and in serum-free culture medium comprising EGF, bFGF or both, wherein the tissue-derived stem cells are not liver cells produce HGF. The culture medium may further comprise sodium ascorbic diphosphate.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS
A figura 1 é a representação esquemática da derivação de célu- las-tronco hepáticas partindo de células-tronco não hepáticas (por exemplo, ASCs) de acordo com a presente invenção.Figure 1 is a schematic representation of the derivation of hepatic stem cells from non-hepatic stem cells (e.g. ASCs) according to the present invention.
A figura 2 mostra a expressão de mRNA relativa de albumina (ALB) e alfa-fetoproteína (AFP) em células-tronco hepáticas derivadas de ASCs.Figure 2 shows the expression of relative albumin (ALB) and alpha-fetoprotein (AFP) mRNA in ASC-derived liver stem cells.
A figura 3 mostra o armazenamento de glicogênio em células- tronco hepáticas derivadas de ASCs.Figure 3 shows glycogen storage in ASC-derived liver stem cells.
A figura 4 mostra a morfologia de células-tronco hepáticas deri- vadas de ASCs.Figure 4 shows the morphology of ASC-derived liver stem cells.
A figura 5 fornece um gráfico que mostra que o EGF e o difosfato ascórbico de sódio possuem a capacidade combinada de induzir a expressão de HGF em ASCs humanas.Figure 5 provides a graph showing that EGF and sodium ascorbic diphosphate have the combined ability to induce HGF expression in human ASCs.
A figura 6 fornece um gráfico que compara a capacidade do EGF e do bFGF com ou sem difosfato ascórbico de induzir a expressão de HGF em ASCs.Figure 6 provides a graph comparing the ability of EGF and bFGF with or without ascorbic diphosphate to induce HGF expression in ASCs.
A figura 7 é uma análise de RT-PCR de receptores expressos em ASCs.Figure 7 is an RT-PCR analysis of receptors expressed in ASCs.
A figura 8 mostra a secreção de citocinas selecionadas (n= 6 até 8 doadores de ASCs) em tempos variáveis após a exposição ao Iipopolissa- carídeo durante períodos de 0 até 24 horas.Figure 8 shows the secretion of selected cytokines (n = 6 to 8 ASC donors) at varying times after exposure to Iipopolysaccharide over periods of 0 to 24 hours.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADESDETAILED DESCRIPTION OF MODALITIES
A presente invenção se direciona a métodos para a derivação de células-tronco hepáticas partindo de tecido sem ser hepático. A invenção não está limitada ao tecido de qualquer um dos estágios de vida. Ou seja, os méto- dos da presente invenção podem compreender tecidos adultos, fetais ou embrionários. Além disso, a fonte de tecido é amplamente direcionada a qualquer tecido sem ser hepático. Os exemplos não Iimitantes de tecido "sem ser hepático" incluem tecido adiposo, intestino, cérebro, sangue do cordão umbilical e medula óssea. Assim, embora muito da invenção seja descrito aqui com referência ao tecido adiposo adulto, tal referência é mera- mente um exemplo e não deve ser interpretada como limitante.The present invention is directed to methods for the derivation of hepatic stem cells from non-hepatic tissue. The invention is not limited to the tissue of any of the life stages. That is, the methods of the present invention may comprise adult, fetal or embryonic tissues. In addition, the tissue source is largely directed to any non-hepatic tissue. Non-limiting examples of "non-hepatic" tissue include adipose tissue, intestine, brain, cord blood, and bone marrow. Thus, while much of the invention is described herein with reference to adult fat tissue, such reference is merely an example and should not be construed as limiting.
Derivação de células-tronco não hepáticas partindo de tecido sem ser hepáticoDerivation of nonhepatic stem cells from nonhepatic tissue
As células-tronco não hepáticas podem ser derivadas de tecido adiposo (isto é, células-tronco adiposas, "ASCs"), de fontes humanas ou de outros mamíferos. As ASCs humanas podem ser isoladas de tecido adiposo subcutâneo obtido preferencialmente de pacientes do sexo masculino ou feminino saudáveis, por exemplo, daqueles sofrendo procedimentos de Iipo- aspiração eletivos. As ASCs murinas também podem ser isoladas de tecido adiposo subcutâneo obtido preferencialmente partindo de camundongos C57BL76 machos e/ou camundongos ROSA-26 machos. Partindo destas fontes, dentro de um período de 5 dias de cultura, é típica a recuperação de aproximadamente 250.000 ASCs de um mililitro de aspirado de Iipoaspira- ção. A amostra de lipoaspiração humana média é maior que aproximada- mente 500 mL. Números ainda maiores de células são recuperados partindo de volumes equivalentes de tecido adiposo murino, presumidamente devido à idade jovem dos animais doadores.Nonhepatic stem cells may be derived from adipose tissue (ie adipose stem cells, "ASCs"), from human or other mammalian sources. Human ASCs may be isolated from subcutaneous adipose tissue preferably obtained from healthy male or female patients, for example, from those undergoing elective liposuction procedures. Murine ASCs may also be isolated from subcutaneous adipose tissue preferably obtained from male C57BL76 mice and / or male ROSA-26 mice. From these sources, within a period of 5 days of culture, it is typical to recover approximately 250,000 ASCs from one milliliter of liposuction aspirate. The average human liposuction sample is larger than approximately 500 mL. Even larger numbers of cells are recovered from equivalent volumes of murine adipose tissue, presumably due to the young age of donor animals.
Os métodos de derivação de células-tronco adiposas partindo de tecido adiposo são apresentados nos USP N2s 6153432, 6391297, 6429013, 6555374, 6841150, 7001746 e 7033587, cujas descrições são incorporadas aqui em sua totalidade como referência. Sucintamente, em um exemplo, uma vez que o tecido é obtido, este é submetido à centrifugação diferencial e é expandido em cultura. Um único grama de tecido produz tipicamente en- tre 50.000 até 100.000 células-tronco dentro do período de 24 horas de cul- tura. Os meios de expansão compreendem preferencialmente 60% de DMEM (baixo teor de glicose) e 40% de MCDB-201 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS); 5 pg/mL de insulina, 5 pg/mL de transferrina e 5 ng/mL de selênio; 10-9M de dexametasona; 10 ng/mL de fator de crescimen- to da epiderme (EGF) e/ou 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblasto, básico (bFGF); 10-4 M de ácido 2-fosfato ascórbico; 100 U/mL de penicilina; e 100 U/mL de estreptomicina. Sem ficar preso ou ligado à teoria, acredita- se que a adição de EGF, bFGF ou ambos, ao meio aumenta a capacidade das ASCs de se diferenciarem posteriormente em células-tronco hepáticas. O ácido 2-fosfato ascórbico pode ter um efeito similar sobre as ASCs particu- larmente em relação a sua capacidade de expressar HGF (discutido abaixo).Methods of deriving adipose stem cells from adipose tissue are set forth in USP Nos. 6153432, 6391297, 6429013, 6555374, 6841150, 7001746 and 7033587, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety. Briefly, in one example, once the tissue is obtained, it is subjected to differential centrifugation and expanded in culture. A single gram of tissue typically produces between 50,000 to 100,000 stem cells within 24 hours of culture. The expansion media preferably comprises 60% DMEM (low glucose) and 40% MCDB-201 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS); 5 pg / ml insulin, 5 pg / ml transferrin and 5 ng / ml selenium; 10-9M dexamethasone; 10 ng / mL epidermal growth factor (EGF) and / or 10 ng / mL basic fibroblast growth factor (bFGF); 10-4 M 2-ascorbic acid phosphate; 100 U / ml penicillin; and 100 U / ml streptomycin. Without being bound or bound by theory, it is believed that the addition of EGF, bFGF or both to the medium increases the ability of ASCs to later differentiate into liver stem cells. Ascorbic acid 2-phosphate may have a similar effect on ASCs particularly in relation to their ability to express HGF (discussed below).
O HGF promove a diferenciação das células-tronco em direção à linhagem hepática. Acredita-se que a adição de HGF às presentes condições de cultura, quando indicado, é capaz de complementar o processo de dife- renciação. Assim, em uma modalidade da presente invenção, a produção de HGF partindo das populações de células descritas aqui pode ser utilizada in vitro e in vivo (por exemplo, após o transplante) para ajudar a diferenciação de células-troncos de outra maneira "nascentes" em hepatócitos funcionais.HGF promotes differentiation of stem cells toward the liver line. The addition of HGF to the present culture conditions, where indicated, is believed to be able to complement the differentiation process. Thus, in one embodiment of the present invention, HGF production from the cell populations described herein may be used in vitro and in vivo (e.g., after transplantation) to aid differentiation of otherwise "nascent" stem cells in functional hepatocytes.
Meios de diferenciaçãoMeans of differentiation
Na presença de dexametasona, insulina, isobutilmetilxantina e uma tiazolidinadiona, as ASCs sofrem adipogênese. As células acumulam vacúolos lipídicos, que podem ser corados em relação ao lipídeo neutro e expressam marcadores específicos aos adipócitos, incluindo a Ieptina de citocina secretada e o ácido graxo que se liga à proteína aP2. Entretanto, o potencial de diferenciação das ASCs não está limitado à linhagem de adipó- citos. Para a diferenciação em células-tronco hepáticas e hepatócitos, o meio de expansão isento de soro é adicionalmente suplementado com 10 ng/mL de EGF e/ou 10 ng/mL de bFGF, 10 ng/mL de HGF, 10 ng/mL de On- costatin M (OSM), 1% de DMSO ou combinações dos mesmos.In the presence of dexamethasone, insulin, isobutyl methyl xanthine and a thiazolidinedione, ASCs undergo adipogenesis. Cells accumulate lipid vacuoles, which can be stained relative to the neutral lipid, and express adipocyte specific markers, including secreted cytokine Ieptin and aP2 protein-binding fatty acid. However, the differentiation potential of ASCs is not limited to adipocyte lineage. For differentiation into liver stem cells and hepatocytes, serum-free expansion medium is additionally supplemented with 10 ng / mL EGF and / or 10 ng / mL bFGF, 10 ng / mL HGF, 10 ng / mL Oncostatin M (OSM), 1% DMSO or combinations thereof.
Condições de diferenciaçãoConditions of differentiation
As ASCs são inicialmente plaqueadas com meio de expansão a uma densidade de aproximadamente 5-15 X 103 células/cm2 em uma placa de tecido ou um poço pré-revestido com colágeno I. As placas de tecido re- vestidas com colágeno I estão disponíveis comercialmente (por exemplo, MATRIGEL da BectonDickinson, VITROGEN da PureGeI), das quais qual- quer uma pode ser utilizada com a presente invenção. Em adição, sem ficar preso ou ligado à teoria, os presentes inventores aprenderam que o uso de proteínas de matriz hepática fibrilar (por exemplo, colágenos, preferencial- mente colágenos I e colágeno III) é preferido no método da invenção uma vez que seu uso parece reproduzir melhor o ambiente in vivo das células- tronco encontradas no tecido hepático adulto. Em outras palavras, as proteí- nas de matriz fibrilar parecem fornecer sinais de diferenciação que não estão disponíveis ou não tão fortes com outras proteínas de matriz.ASCs are initially plated with expansion media at a density of approximately 5-15 X 10 3 cells / cm2 in a collagen I pre-coated tissue plate or well. Collagen I-coated tissue plates are commercially available. (e.g., BectonDickinson's MATRIGEL, PureGeI's VITROGEN), any of which may be used with the present invention. In addition, without being bound by or bound by theory, the present inventors have learned that the use of fibrillar hepatic matrix proteins (e.g. collagen, preferably collagen I and collagen III) is preferred in the method of the invention since their use seems to better reproduce the in vivo environment of stem cells found in adult liver tissue. In other words, fibrillar matrix proteins appear to provide differentiating signals that are not available or not as strong with other matrix proteins.
A fibronectina, por exemplo, é uma molécula não fibrilar; é uma glicoproteína (os colágenos não são glicoproteínas), que permite primaria- mente que as células se liguem às outras moléculas de matriz ou à placa de cultura de tecido. Ou seja, acredita-se que a fibronectina é uma ponte para ligar integrinas na superfície das células à matriz de colágeno de revestimen- to no órgão (in vivo) ou do fundo de uma placa de cultura de tecido (in vitro). Assim, provavelmente os sinais que são ativados pela ligação da fibronecti- na são bastante diferentes dos ativados pela ligação de colágeno. Embora o uso de proteínas não fibrilares, tal como a fibronectina não seja necessário, estas podem ser utilizadas em associação com as proteínas fibrilares de a - cordo com a invenção. Em algumas modalidades, a matriz extracelular não compreende fibronectina.Fibronectin, for example, is a non-fibrillar molecule; It is a glycoprotein (collagen is not glycoprotein), which primarily allows cells to bind to other matrix molecules or tissue culture plate. That is, fibronectin is believed to be a bridge to bind integrins on the cell surface to the organ-coating collagen matrix (in vivo) or to the bottom of a tissue culture plate (in vitro). Thus, the signals that are activated by fibronectin binding are probably quite different from those activated by collagen binding. Although the use of non - fibrillary proteins such as fibronectin is not necessary, they may be used in combination with the fibrillar proteins according to the invention. In some embodiments, the extracellular matrix does not comprise fibronectin.
Desta maneira, acredita-se que o presente método direciona a "conversão" de células-tronco não hepáticas em células-tronco hepáticas, que, em alguns casos, podem então se diferenciar em hepatócitos maduros, ao invés de uma diferenciação direta das células-tronco não hepáticas dire- tamente em hepatócitos, pulando o estágio de célula-tronco hepática de uma vez só. Esta noção é representada de forma esquemática na Figura 1. Os exemplos de outras proteínas de matriz, que podem ser adequadas na pre- sente invenção, incluem proteínas de matriz hepáticas embrionárias.Thus, it is believed that the present method directs the "conversion" of nonhepatic stem cells into hepatic stem cells, which in some cases may then differentiate into mature hepatocytes rather than a direct differentiation of the stem cells. nonhepatic stem cells directly into hepatocytes, skipping the hepatic stem cell stage at once. This notion is shown schematically in Figure 1. Examples of other matrix proteins that may be suitable in the present invention include embryonic liver matrix proteins.
Durante este período inicial, é permitido que as células atinjam mais de aproximadamente 80% de confluência, que pode levar até 3 dias e são incubadas no meio de expansão descrito anteriormente. Após atingir mais de aproximadamente 80% de confluência, as células são lavadas duas ou três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) isoladamen- te e subseqüentemente plaqueadas em meio de diferenciação isento de so- ro. As ASCs são mantidas sob estas condições de cultura durante um perío- do adicional de 4 até 20 dias para que a diferenciação ocorra. As culturas representativas podem ser coletadas em intervalos regulares para análise. EXEMPLO 1During this initial period, cells are allowed to reach more than approximately 80% confluence, which may take up to 3 days and are incubated in the expansion medium described above. After reaching more than approximately 80% confluence, cells are washed two or three times with phosphate buffered saline (PBS) alone and subsequently plated in serum-free differentiation medium. ASCs are maintained under these culture conditions for an additional period of 4 to 20 days for differentiation to occur. Representative cultures can be collected at regular intervals for analysis. EXAMPLE 1
As ASCs humanas foram plaqueadas em meio de expansão (i-Human ASCs were plated on expansion medium (ie
sento de soro). Após 2-3 passagens, a população de células foi dispersa com tripsina e inoculada e uma densidade de 5.000 até 10.000 células por cm2 em placas revestidas com colágeno I. As células foram propagadas até que aproximadamente 80% de confluência fossem atingidos, em cujo tempo 15 o meio foi trocado pelo meio de diferenciação hepática [compreendido de meio de expansão isento de soro suplementado com 10 ng/ml_ de HGF, 10 ng/mL de Oncostatin M (OSM) e 0,1% de DMSO]. O meio foi trocado a cada três dias.wheezing). After 2-3 passages, the cell population was trypsin-dispersed and inoculated at a density of 5,000 to 10,000 cells per cm 2 in collagen coated plates. The cells were propagated until approximately 80% confluence was reached, at which time. 15 medium was exchanged for hepatic differentiation medium [comprised of serum-free expansion medium supplemented with 10 ng / ml HGF, 10 ng / ml Oncostatin M (OSM) and 0.1% DMSO]. The medium was changed every three days.
Os Iisados de células foram coletados em vários pontos de tem- 20 po após a diferenciação para a análise de RT-PCR ou fixos para a análise histológica de biomarcadores hepáticos. Alguns dos biomarcadores utiliza- dos para avaliar a hepatogênese in vitro incluíam: (a) a expressão de albu- mina (ALB) e α-fetoproteína (AFP) por RT-PCR; e (b) o armazenamento de glicogênio (um marcador hepático de estágio tardio analisado através da 25 coloração de PAS positiva).Cell lysates were collected at various time points after differentiation for RT-PCR analysis or fixed for histological analysis of liver biomarkers. Some of the biomarkers used to assess in vitro hepatogenesis included: (a) the expression of albumin (ALB) and α-fetoprotein (AFP) by RT-PCR; and (b) glycogen storage (a late-stage hepatic marker analyzed by positive PAS staining).
A figura 2 mostra a expressão de AFP e ALB das ASCs incuba- das durante 10 dias em diferenciação média. O RNA total foi purificado par- tindo de células utilizando kits disponíveis comercialmente. 2 pg de RNA to- tal foram transcritos de forma inversa utilizando MMLV-RT com Oligo dT a 30 42 eC durante 1 hora em uma reação de 20 pL. 40 ciclos de PCR foram rea- lizados utilizando 2 pL de cDNA diluído (1:10). 5 pL dos produtos amplifica- dos foram separados em um gel de agarose a 2% e visualizados com EtBr. (Α Ciclofilina B (CycIo) foi utilizada como controle para o cDNA de entrada).Figure 2 shows the AFP and ALB expression of ASCs incubated for 10 days in mean differentiation. Total RNA was purified from cells using commercially available kits. 2 pg of total RNA were reverse transcribed using MMLV-RT with Oligo dT at 30 42 ° C for 1 hour in a 20 pL reaction. 40 cycles of PCR were performed using 2 µl diluted cDNA (1:10). 5 µl of the amplified products were separated on a 2% agarose gel and visualized with EtBr. (Cyclophilin B (CycIo) was used as a control for incoming cDNA).
Os dados mostram que embora a albumina seja expressa na população, pouca até nenhuma AFP está presente na mesma população, que é indicati- vo de uma população de células que compreende substancialmente células- tronco hepáticas. Na verdade, acredita-se que a expressão de AFP indica a presença de células hepáticas mais maduras que podem ter sido diferencia- das partindo das células-tronco hepáticas. Uma análise adicional confirmou que estas células exibiam outros marcadores de células-tronco hepáticas, incluindo a expressão positiva de Ep-CAM e ICAM-1 e a expressão negativa de MHC de classe Ia.The data show that although albumin is expressed in the population, little to no AFP is present in the same population, which is indicative of a cell population that comprises substantially liver stem cells. In fact, AFP expression is believed to indicate the presence of more mature liver cells that may have been differentiated from liver stem cells. Further analysis confirmed that these cells exhibited other liver stem cell markers, including positive expression of Ep-CAM and ICAM-1 and negative expression of MHC class Ia.
A figura 3 mostra ASCs de passagem inicial [p3] inoculadas em placas de 6 poços, cultivadas até aproximadamente 80% de confluência e transferidas para meio de diferenciação hepática. Os poços individuais foram fixos no dia O (painel A) e no dia 17 (painel B) e corados em relação ao gli- cogênio (sombreamento escuro). A figura 4 mostra ainda que as células, que foram incubadas durante 18 dias em condições de diferenciação, pos- suem morfologia de hepatócito.Figure 3 shows initial passage [p3] ASCs inoculated into 6-well plates, cultured to approximately 80% confluence and transferred to hepatic differentiation medium. The individual wells were fixed on day O (panel A) and day 17 (panel B) and stained for glycogen (dark shading). Figure 4 further shows that cells, which were incubated for 18 days under differentiation conditions, have hepatocyte morphology.
Tomados juntos, estes dados indicam que as ASCs podem ser diferenciadas em células-tronco hepáticas. Algumas destas células-tronco podem então maturar em hepatócitos ou células biliares, (Figura 1) mas também podem se auto-regenerar.Taken together, these data indicate that ASCs can be differentiated into liver stem cells. Some of these stem cells may then mature into hepatocytes or biliary cells, (Figure 1) but may also self-regenerate.
Em uma outra modalidade da invenção, é fornecido um método para induzir a expressão de citocinas que podem desempenhar uma função na regeneração do fígado partindo das ASCs. Tais citocinas podem incluir HGF, VEGF, IL-6, LIF, TNFa1 Ieptina e combinações dos mesmos. A presen- te invenção fornece condições de cultura para aumentar a produção de uma ou de todas estas citocinas. Novamente, sem ficar preso ou limitado à teoria, os presentes inventores aprenderam que o uso de proteínas de matriz fibrilar (por exemplo, colágeno I), geralmente, é preferido no método de invenção uma vez que seu uso parece reproduzir melhor o ambiente in vivo das célu- las-tronco hepáticas no tecido adulto. Além disso, a incorporação do EGF isoladamente ou com ascorbato de sódio parece aumentar substancialmente a produção de citocinas sob estas condições. Fatores/condições adicionais que podem contribuir para a produção de citocinas de regeneração hepática incluem, ésteres de forbol, FGFs, heparina, hipoxia (definida como < 5% de 02) ou combinações dos mesmos.In another embodiment of the invention, a method is provided for inducing expression of cytokines that may play a role in liver regeneration from ASCs. Such cytokines may include HGF, VEGF, IL-6, LIF, TNFα Ieptin and combinations thereof. The present invention provides culture conditions for increasing the production of one or all of these cytokines. Again, without being bound or bound by theory, the present inventors have learned that the use of fibrillar matrix proteins (e.g. collagen I) is generally preferred in the method of invention since their use seems to better reproduce the in vivo environment. of liver stem cells in adult tissue. Furthermore, incorporation of EGF alone or with sodium ascorbate appears to substantially increase cytokine production under these conditions. Additional factors / conditions that may contribute to the production of liver regenerating cytokines include phorbol esters, FGFs, heparin, hypoxia (defined as <5% of 02) or combinations thereof.
EXEMPLO 2EXAMPLE 2
As ASCs humanas foram propagadas em meio DMEM/F12 su- plementado com 3% de soro e o efeito de EGF e ascorbato difosfato de só- dio sobre a produção de citocina foi determinado. Poços em triplicata, inocu- lados a 5-10 χ 103 células por cm2 foram incubados com EGF em concen- trações de 0, 0,1, 1 ou 10 ng/mL de +/- ascorbato difosfato de sódio. Após 72 horas, o meio foi coletado para a detecção por ELISA de HGF. A figura 5 é representativa dos dados, normalizados em pg de HGF/106 células (n=3). O meio isoladamente não continha HGF. Os dados demonstram que na au- sência de EGF e ascorbato de sódio, o HGF é sintetizado em mais de 10.680 pg/106 células. Entretanto, esta produção é aumentada quase 5 ve- zes na presença de ambos os fatores.Human ASCs were propagated in DMEM / F12 medium supplemented with 3% serum and the effect of EGF and sodium ascorbate diphosphate on cytokine production was determined. Triplicate wells inoculated at 5-10 x 10 3 cells per cm 2 were incubated with EGF at concentrations of 0, 0.1, 1 or 10 ng / mL sodium +/- ascorbate diphosphate. After 72 hours, the medium was collected for HGF ELISA detection. Figure 5 is representative of the data, normalized to pg HGF / 10 6 cells (n = 3). The medium alone did not contain HGF. The data demonstrate that in the absence of EGF and sodium ascorbate, HGF is synthesized in more than 10,680 pg / 106 cells. However, this production is increased almost 5 times in the presence of both factors.
EXEMPLO 3EXAMPLE 3
As ASCs humanas não diferenciadas foram propagadas em meio DMEM/F12 suplementado com 3% de soro e 10 ng/mL de ou de qual- quer um de EGF ou bFGF. A figura 6A mostra que na presença de EGF1 as ASCs não diferenciadas expressavam HGF em níveis maiores que 3000 ng/milhão de células, o que reflete um aumento de 2 vezes em relação aos níveis da linha de base. A presença de ácido 2-fosfato ascórbico aumentou adicionalmente o efeito indutor de EGF até uma indução de 25 vezes. Sob as mesmas condições, as ASCs diferenciadas de adipócitos expressavam níveis de HGF em 2,0 e 6,3 vezes adicionais, na ausência ou na presença de ácido 2-fosfato ascórbico, respectivamente. (Figura 6B) Na presença de bFGF, a expressão de HGF pelas huASCs não diferenciadas também era estatisticamente maior. (Figura 6C) Entretanto, o bFGF falhou em afetar a expressão de HGF partindo das ASCs diferenciadas partindo de adipócitos. (Figura 6D).Undifferentiated human ASCs were propagated in DMEM / F12 medium supplemented with 3% serum and 10 ng / mL of either EGF or bFGF. Figure 6A shows that in the presence of EGF1 undifferentiated ASCs expressed HGF at levels greater than 3000 ng / million cells, reflecting a 2-fold increase from baseline levels. The presence of ascorbic 2-phosphate further increased the EGF inducing effect up to a 25-fold induction. Under the same conditions, adipocyte-differentiated ASCs expressed HGF levels by an additional 2.0 and 6.3 times, in the absence or presence of ascorbic 2-phosphate, respectively. (Figure 6B) In the presence of bFGF, HGF expression by undifferentiated huASCs was also statistically higher. (Figure 6C) However, bFGF failed to affect HGF expression from differentiated ASCs from adipocytes. (Figure 6D).
A análise subseqüente do RNA total por RT-PCR demonstrou que tanto as huASCs não diferenciadas quanto diferenciadas partindo de adipócitos expressavam o receptor de bFGF e de EGF receptor, assim como o receptor de HGF (c-met) (Figura 7). Expressão de Citocinas pelas ASCsSubsequent analysis of total RNA by RT-PCR demonstrated that both undifferentiated and differentiated adipocyte huASCs expressed the bFGF receptor and EGF receptor as well as the HGF receptor (c-met) (Figure 7). ASC Cytokine Expression
Em adição ao HGF, as ASCs humanas secretam uma faixa am- pla de citocinas hematopoiéticas e outras funcionais. Quando induzidas com lipopolissacarídeo (LPS, 100 ng/mL), culturas de ASC de outra maneira qui- escentes exibem um nível no estado estacionário maior dos mRNAs para as interleucinas 6, 7, 8 e 11 (IL-6,-7,-8,-11); o fator inibidor de leucemia (LIF); o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF); o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); o fator estimulador de colô- nias de granulócitos (G-CSF); o Iigante de flt-3 (Flt3L) como mostrado na Figura 8 assim como o Iigante de kit (KL, também conhecido com fator de células-tronco); o fator de necrose de tumor α (TNFa); e as proteínas morfo- gênicas ósseas 2 e 4 (BMP-2, -4). Tanto as células-tronco derivadas da me- dula óssea murina quanto humana também expressam estas mesmas cito- cinas. Como mostrado na Tabela 1 abaixo e na Figura 8, as ASCs aumen- tam significativamente sua secreção de IL-6, IL-7, IL-8, GM-CSF e M-CSF dentro de um período de 24 horas após o estímulo com LPS. Tabela 1. Indução com LPS de citocinas secretadas (ELISA, pg/mL)In addition to HGF, human ASCs secrete a wide range of hematopoietic and other functional cytokines. When induced with lipopolysaccharide (LPS, 100 ng / mL), otherwise hot ASC cultures exhibit a higher steady-state level of mRNAs for interleukins 6, 7, 8, and 11 (IL-6, -7, - 8, 11); leukemia inhibiting factor (LIF); macrophage colony stimulating factor (M-CSF); granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF); granulocyte colony stimulating factor (G-CSF); the flt-3 ligand (Flt3L) as shown in Figure 8 as well as the kit ligand (KL, also known as stem cell factor); tumor necrosis factor α (TNFα); and bone morphogenic proteins 2 and 4 (BMP-2, -4). Both murine and human bone marrow-derived stem cells also express these same cytokines. As shown in Table 1 below and Figure 8, ASCs significantly increase their secretion of IL-6, IL-7, IL-8, GM-CSF, and M-CSF within 24 hours of stimulation with LPS Table 1. LPS induction of secreted cytokines (ELISA, pg / mL)
<table>table see original document page 11</column></row><table><table> table see original document page 11 </column> </row> <table>
Desta maneira, as ASCs transplantadas imediatamente ou logo após um dano hepático podem melhorar a regeneração do fígado, em parte, através da liberação local de HGF e VEGF. A introdução das ASCs em um mamífero pode ser realizada através de qualquer um dos métodos conheci- dos e disponíveis na técnica, incluindo a injeção. Em um outro método de fornecimento de células, as ASCs são transplantadas no mamífero receptor através de injeção intraparenquimal ou intra-hepática após encapsulamento. O transplante de células embebidas, por exemplo, em uma matriz de algina- to, oferece várias vantagens, incluindo: (a) fornecer às células um "ambiente 3-D" que aumenta a viabilidade após o implante; (b) permitir que um número maior de células seja implantado; (c) criar um microambiente que sustenta o crescimento e a diferenciação; e (d) permitir o co-encapsulamento de fatores (por exemplo, fatores de crescimento ou vários tipos de células como descri- to anteriormente) antes do transplante.Thus, ASCs transplanted immediately or soon after liver damage can improve liver regeneration, in part through local release of HGF and VEGF. The introduction of ASCs into a mammal may be accomplished by any of the methods known and available in the art, including injection. In another method of cell delivery, ASCs are transplanted into the recipient mammal by intraparenchymal or intrahepatic injection after encapsulation. Transplanting cells embedded, for example, in an alginate matrix, offers several advantages, including: (a) providing cells with a "3-D environment" that enhances viability after implantation; (b) allow a larger number of cells to be implanted; (c) create a microenvironment that supports growth and differentiation; and (d) allow for co-encapsulation of factors (eg growth factors or various cell types as described above) prior to transplantation.
Em adição, uma vez que as células são embebidas em um hi- drogel, são menos propensas à dispersão para outros sítios do corpo como é freqüentemente observado quando suspensões de células são utilizadas para transplantes.In addition, since cells are soaked in a hydrogel, they are less prone to dispersal to other body sites as is often observed when cell suspensions are used for transplants.
Sucintamente, o encapsulamento das células é realizado utili- zando um aparato de produção de esferas eletrostáticas após a mistura das células em uma solução de alginato de sódio. As esferas são ressuspensas em PBS em uma concentração de células equivalente a aproximadamente 107 células/mL. Uma incisão para minilaparotomia é realizada utilizando uma técnica de esterilização após atingir anestesia e sedação adequadas do re- ceptor. A suspensão de células é fornecida através da injeção direta com serin- ga na periferia do tecido (o fornecimento de 0,1 ml_ é comum em camun- dongos) com hemostase conseguira através da compressão tópica. Esta técnica pode ser igualmente aplicável a seres humanos e modelos de muri- nos.Briefly, cell encapsulation is performed using an electrostatic bead production apparatus after mixing the cells in a sodium alginate solution. The beads are resuspended in PBS at a cell concentration equivalent to approximately 107 cells / ml. An incision for minilaparotomy is performed using a sterilization technique after adequate receiver anesthesia and sedation have been achieved. Cell suspension is provided by direct injection with serine into the tissue periphery (delivery of 0.1 ml is common in mice) with hemostasis achieved by topical compression. This technique may also apply to humans and mouse models.
Em uma segunda metodologia de transplante, até 106 células podem ser injetadas de forma intra-esplênica após a adesão a esferas mi- croveículos Cytodex 3TM (Amersham Pharmacia). Após o transplante, as células se translocam rapidamente para as sinuosidades do fígado e podem ser detectadas no fígado dentro do período de duas horas de transplante.In a second transplantation methodology, up to 106 cells can be injected intrasplenically following adhesion to Cytodex 3TM microbeads (Amersham Pharmacia). After transplantation, cells rapidly translocate to liver sinuosities and can be detected in the liver within two hours of transplantation.
DosagemDosage
Para seres humanos, uma "dose" de aproximadamente 3 χ 109 células ou 1% de massa do fígado quando injetada no sistema circulatório hepático é preferida com base na experiência desta dose em estudos com camundongos. Na verdade, em camundongos, é preferida uma dose de 2 milhões de células. Os níveis de doses médias e altas de 4 e 6 milhões de células, respectivamente, se baseavam nos resultados de um estudo de Ieta- lidade aguda piloto em cujos grupos de 3 camundongos NOD-SCID machos cada receberam administrações de doses de O, 2,5, 5, 10, 20 e 40 milhões de células hepáticas humanas em um volume de um mililitro. O transplante de 10, 20 e 40 milhões de células resultou em uma mortalidade de 100% e o transplante de 5 milhões de células produziu mortalidade em 1 de 3 camun- dongos dentro do período de 20 horas, enquanto 2,5 milhões de células por camundongo foram bem tolerados. A dose alta de 6 milhões de células, que seriam administradas em um volume de dose de 0,2 mL, foi selecionada porque foi considerada como sendo a dose máxima que podia ser adminis- trada sem ruptura do baço e era esperado que a maioria dos animais tole- rasse a dose (isto é, uma MTD). A dose média de 4 milhões de células é preferida como um ponto médio entre os níveis de doses baixas e altas.For humans, a "dose" of approximately 3 χ 109 cells or 1% liver mass when injected into the hepatic circulatory system is preferred based on the experience of this dose in mouse studies. In fact, in mice, a dose of 2 million cells is preferred. Medium and high dose levels of 4 and 6 million cells, respectively, were based on the results of an acute pilot pilot study in which groups of 3 male NOD-SCID mice each received doses of O, 2, 5, 5, 10, 20 and 40 million human liver cells in a volume of one milliliter. Transplantation of 10, 20 and 40 million cells resulted in 100% mortality and transplantation of 5 million cells produced mortality in 1 of 3 mice within the 20 hour period, while 2.5 million cells per mice were well tolerated. The high dose of 6 million cells, which would be administered in a 0.2 mL dose volume, was selected because it was considered to be the maximum dose that could be administered without rupturing the spleen and it was expected that most animals tolerated the dose (ie one BAT). The average dose of 4 million cells is preferred as a midpoint between low and high dose levels.
Particularmente, quando seres humanos são tratados, todas as etapas de processamento devem ser conduzidas de acordo com padrões de cGMP com SOPs apropriados. As ASCs humanas são preferencialmente isoladas através da digestão com tripsina. As células poderiam ser utilizadas imediatamente ou ser criopreservadas antes do uso. As ASCs humanas, se criopreservadas, seriam descongeladas e suspensas em um meio isoosmó- tico isento de soro adequado para a infusão a uma concentração de não menos que aproximadamente 0,1 e não mais que 10 milhões de células por mL. A viabilidade das células pode ser avaliada através da exclusão com "typhan blue" ou de um ensaio equivalente. As células seriam armazenadas à temperatura ambiente ou em gelo úmido e avaliadas através da verificação microscópica em relação à evidência de qualquer formação de grumos. Se observados, as células seriam submetidas à seleção através de um filtro de trama de náilon (40 microns) e a concentração final de células seria determi- nada novamente. As células seriam infundidas de forma intravenosa em um receptor sofrendo de danos no fígado (por exemplo, causados pela exposi- ção aguda a toxinas) a uma dose de 1 até 10 milhões de células por kg de peso corporal. Os receptores seriam monitorados em relação à evidência de quaisquer reações agudas, tal como febre, calafrios ou alteração na condi- ção mental e se estas fossem observadas, seriam tratadas sintomaticamente através de prática médica padronizada. Os indivíduos seriam então monito- rados ao longo do período de 2 meses seguintes através da química do soro semanalmente para avaliar a recuperação da função hepática.Particularly, when humans are treated, all processing steps should be conducted according to cGMP standards with appropriate SOPs. Human ASCs are preferably isolated by trypsin digestion. The cells could be used immediately or cryopreserved prior to use. Human ASCs, if cryopreserved, would be thawed and suspended in a serum-free isoosmotic medium suitable for infusion at a concentration of not less than approximately 0.1 and no more than 10 million cells per mL. Cell viability can be assessed by typhan blue exclusion or an equivalent assay. The cells would be stored at room temperature or on wet ice and evaluated by microscopic examination for evidence of any lump formation. If observed, the cells would be screened through a 40 micron nylon mesh filter and the final cell concentration would be determined again. Cells would be infused intravenously into a recipient suffering from liver damage (eg, acute exposure to toxins) at a dose of 1 to 10 million cells per kg body weight. Recipients would be monitored for evidence of any acute reactions, such as fever, chills, or change in mental condition, and if observed, would be treated symptomatically through standard medical practice. Subjects would then be monitored over the next 2 months through weekly serum chemistry to assess liver function recovery.
Como tal, esta invenção pode beneficiar o tratamento de várias formas de falência hepática, tanto aguda quanto crônica. A disponibilidade de ASCs humanas autólogas ou alogênicas na forma de uma célula-tronco adulta para melhorar a função hepática possui valor para pacientes sofrendo danos no fígado secundários a uma exposição a toxinas (tetracloreto de car- bono, acetaminofeno), a um agente infeccioso (hepatite, citomegalovírus) ou à excisão cirúrgica devido à metástase de tumor ou trauma. A capacidade das ASCs humanas de se diferenciar em hepatócitos funcionais e/ou de Iibe- rar fatores de crescimento que sustentam a proliferação e a diferenciação progenitores de hepatócitos endógenos pode fornecer um mecanismo para melhorar e acelerar a recuperação da função hepática nestas condições.As such, this invention may benefit the treatment of various forms of both acute and chronic liver failure. The availability of autologous or allogeneic human ASCs in the form of an adult stem cell to improve liver function is of value to patients suffering from liver damage secondary to exposure to toxins (carbon tetrachloride, acetaminophen), an infectious agent ( hepatitis, cytomegalovirus) or surgical excision due to tumor metastasis or trauma. The ability of human ASCs to differentiate into functional hepatocytes and / or to disrupt growth factors that underpin progenitor proliferation and differentiation of endogenous hepatocytes may provide a mechanism for improving and accelerating the recovery of liver function under these conditions.
Embora a invenção tenha sido descrita em associação com as modalidades específicas da mesma, será entendido que é capaz de sofrer modificações adicionais e é pretendido que este pedido de patente cubra quaisquer variações, usos ou alterações da invenção a seguir. Em geral, os princípios da invenção e inclusive tais variações da presente divulgação co- mo em relação à prática conhecida ou costumeira dentro da técnica à qual pertence a invenção e como podem ser aplicados às características essen- ciais apresentadas aqui antes e como a seguir no âmbito das reivindicações anexas.While the invention has been described in connection with specific embodiments thereof, it will be understood that it is capable of further modification and it is intended that this patent application cover any variations, uses or alterations of the following invention. In general, the principles of the invention and even such variations of the present disclosure as with respect to known or customary practice within the technique to which the invention belongs and how they may be applied to the essential characteristics set forth hereinbefore and as follows in scope of the appended claims.
Claims (13)
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