BRPI0707455A2 - método de caracterização de um composto biologicamente ativo - Google Patents

Abstract

MéTODO DE CARACTERIZAçãO DE UM COMPOSTOBIOLOGICAMENTE ATIVO Um método de caracterização de um composto biologicamente ativo por colocação de uma mistura celular em um biorreator rotativo, para iniciar uma cultura tridimensional, que compreende um componente biológico e pelo menos uma célula, expansão controlada das células no biorreator rotativo e teste do componente biológico para caracterizar o composto biologicamente ativo. A presente invenção também pode compreender, de preferência, a exposição das células a uma força eletromagnética variável com o tempo.

Description

elatório Descritivo da Patente de Invenção

MÉTODO DE CARACTERIZAÇAO DE UMCOMPOSTO BIOLOGICAMENTE ATIVO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere, de uma maneirageral, ao campo da caracterização de um compostobiologicamente ativo. Mais especificamente, a presente invençãose refere a um método de expandir controlavelmente uma culturatridimensional em um biorreator rotativo, para caracterizar umcomposto biologicamente ativo.

REFERÊNCIA RECÍPROCA A PEDIDOSDE PATENTE RELACIONADOS

O presente pedido de patente reivindica aprioridade do pedido de patente U.S. 60/764524, depositado em 2de fevereiro de 2006, e intitulado "Process for Testing DrugEfficacy

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A maior parte dos compostos biologicamenteativos têm como alvo funções específicas de tecidos, que sãobaseadas nas estruturas detalhadas e nos processos químicos queocorrem em todos os níveis de processos biológicos de estruturade tecido em grande escala molecular. O teste desses compostosbiologicamente ativos para eficiência e determinação domecanismo de ação requer células e tecido de alta fidelidade, e éconduzido em cultura in vitro convencional (para efeitosgritantes), e finalmente em ensaios clínicos em seres humanos.Todos esses métodos têm, no entanto, limitações, introduzidas porbaixa fidelidade e/ou ética. Além do mais, a capacidade deinvestigar o mecanismo detalhado específico ou sítio físico deação de compostos biologicamente ativos é limitada por essesmétodos convencionais de teste. Um caso similar é verdadeiropára o entendimento do mecanismo e do grau de toxicidade parasubstâncias químicas e materiais tóxicos, ou para o entendimentoou a caracterização da atividade biológica de um reagente. Nocaso do uso de animais para o teste, o meio físico biológico émuito complexo, incontrolável, ricos em fatores confusos,representa, freqüentemente muito mal a condição humana, e sofrede limites éticos. As culturas convencionais, tais como as culturasbidimensionais, ou aquelas que requerem agitação, mistura eoutros modos de combinação da cultura, não são capazes dereproduzir biologicamente as interações ativas com as células poiselas iriam interagir no micromeio físico do tecido vivo. Outrastécnicas de cultura, utilizando matrizes fixas em sistemas nãorotativos convencionais, isto é, na ausência de qualquercomponente de material rotativo em suspensão livre, tambémintroduzem limitações na fidelidade, precisão, capacidade deanálise e praticidade para a condução desses estudos. O teste emseres humanos introduz graves limitações éticas graves,juntamente com muitas daquelas inerentes em teste com animais.

As relações estruturais das células funcionaisprimárias entre si, para suportar as células, e para suportarmecanicamente o substrato propiciam um comportamentoespecífico do tecido e da célula natural e preciso. Os aspectos, taiscomo complexos de junção, formação de glândulas, polaridadecelular, e relações geométricas corretas globais para suportarcélulas, e componentes acelulares mediam esse comportamentoda célula e do tecido. Além do mais, as células individuais e ostecidos funcionam de uma maneira dependente desses, e deoutros, aspectos. Outros aspectos também contribuem para asrelações entre as e em meio das células e as interaçõestridimensionais entre as células na estrutura de tecido maior,incluindo mucina, hormônios secretados (insulina de células Betapancreáticas), sinais solúveis intercelulares, marcadoressuperficiais de membranas celulares, enzimas ligadas amembranas, marcadores de identidade imunes, moléculas deaderência, vacúolos, neurotransmissores armazenados e liberados,e maquinário específico interno celular, tais como fibrascontrateis de miosina no caso de músculo, glicogênio eprocessamento de depuração tóxica conjugativa, no caso dehepatócitos. As funções celulares individuais e as interações decélula para célula são dependentes desses e de outros aspectos.

A eficiência e a toxicidade de compostosbiologicamente ativos são testadas e medidas por determinação doefeito que tem o composto biologicamente ativo na célula, tecidoe/ou nesses aspectos. Essas respostas mensuráveis incluemexpressão genética, cariótipo, características de taxa decrescimento, morfologia celular individual e multicelular,medidas metabólicas e relações intercelulares. Essas e outrasrespostas são bem conhecidas, mas a dificuldade tem sido que osmétodos de cultura tradicionais são incapazes de crescer umaquantidade suficiente de células e tecido, de modo que as célulase as interações celulares imitam substancialmente a situação invivo e quaisquer respostas aos compostos biologicamente ativosseriam uma reflexão imprecisa da resposta celular in vivo aocomposto biologicamente ativo. Portanto, os sistemas de culturastradicionais, que não suportam um crescimento vasto e aceleradocelular e de tecido por longos períodos de tempo, nãoproporcionam um modelo in vitro para caracterizar os compostosbiologicamente ativos por teste dos seus efeitos.

O crescimento de uma variedade de ambos ostecidos de mamíferos normais e neoplásticos, em ambas amonocultura e a co-cultura, foi estabelecido em ambos osrecipientes de paredes rotativas perfundidas e alimentadas embateladas, Schwarz et al., patente U.S. 4.988.623 (1991) eSchwarz et al., patente U.S.5.026.590 (1991), e em sistemas deculturas à base de lâmina ou balão convencionais. Em algumasaplicações, o crescimento de estrutura tridimensional, porexemplo, tecidos, nesses sistemas de cultura foi facilitado porsuporte de uma matriz sólida, na forma de polímeros emicroveículo compatíveis. No caso de crescimento esferoidal, aestrutura tridimensional foi obtida sem suporte de matriz,Goodwin, et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 28A: 47 - 60 (1992),Goodwin, et al., Proc. Soe. Exp. Biol. Med., 202 : 181 - 192(1993), Goodwin, et al., J. Cell Biochem., 51 : 301 - 311 (1993),Goodwin, et al., In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., 33 : 366 - 374(1997). No entanto, o tecido humano tem sido bastante refratário,em termos de indução de crescimento controlado e organizaçãotridimensional, sob condições de cultura convencionais. Amicrogravidade efetiva e, em um menor grau, a microgravidadesimulada rotativamente permitiram o crescimento celularotimizado.

Esforços também foram feitos para o uso decampos elétricos estáticos para otimizar o crescimento de nervosna cultura. O desenvolvimento embriônico alterou e isolou comsucesso o nervo, e o crescimento direcional de axônios foiatingido com sucesso. No entanto, a aceleração efetiva dapotencialização de crescimento ou da atividade genética queprovocasse isso não foi atingida. Dispositivos mecânicosintencionados para ajudar no crescimento e na orientação detecido neuronal mamífero tridimensional são atualmentedisponíveis. Fukuda et al., patente U.S. 5.328.843, usou zonasformadas entre lâminas de barbear de aço inoxidável, paraorientar as células neuronais ou axônios. Adicionalmente,eletrodos carregados com potencial elétrico foram empregadospara otimizar a resposta de axônios. Aebischer, patente U.S.5.030.225, descreveu uma membrana tubular implantável,carregada eletricamente, para uso na regeneração de nervosrompidos dentro do corpo humano. Wolf, et al., patente U.S.6.485.963, utilizou força eletromagnética para aumentar ocrescimento celular, mas, em muitos casos, o crescimento, ouexpansão, celular não ocorreu rápido o suficiente para onecessário teste ou tratamento de um paciente.

Remanesce uma necessidade, portanto, para umsistema de cultura in vitro, que reproduz essencialmente omicromeio físico in vivo, para testar o efeito de compostosbiologicamente ativos em células e tecidos, proporcionando,desse modo, respostas que são altamente representativas dasituação in vivo.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um método decaracterização de um composto biologicamente ativo, quecompreende colocar uma mistura celular em um biorreatorrotativo, para iniciar uma cultura tridimensional, em que a culturatridimensional compreende células e um componente biológico,expandindo controlavelmente as células na cultura tridimensional,enquanto mantendo ao mesmo tempo a geometria tridimensionaldas célula e o suporte de célula em célula, e a geometria porrotação do biorreator rotativo, introduzindo um compostobiologicamente ativo na cultura tridimensional, e teste docomponente biológico usando um ensaio para caracterizar ocomposto biologicamente ativo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura é uma vista lateral em projeçãovertical de uma concretização preferida de um biorreator rotativo.

A Figura 2 é uma vista em perspectiva lateral deuma concretização preferida do biorreator rotativo.A Figura 3 ilustra esquematicamente umaconcretização preferida de um circuito fechado de veículo decultura de um biorreator rotativo.

A Figura 4 é a rota orbital de uma célula típicaem um quadro de referência não rotativo.

A Figura 5 é um gráfico da grandeza de desviode uma célula por revolução.

A Figura 6 é uma rota celular representativa,observada em um quadro de referência rotativo do meio decultura.

DESCRIÇÃO DETALHADA DASCONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Em termos mais simples, um biorreator rotativocompreende uma câmara de cultura que, em operação, pode sergirada em torno de um eixo substancialmente horizontal, e temuma parte interna e uma parte externa. A parte interna da câmarade cultura define um espaço, que pode receber, desprendidamente,uma mistura de componente biológico. De preferência, a câmarade cultura é substancialmente cilíndrica. Em uma concretizaçãopreferida do biorreator rotativo, uma bobina eletricamentecondutora é enrolada em torno da parte externa da câmara decultura, fixada de preferência na câmara de cultura,particularmente, fixada desprendidamente na câmara de cultura.Uma fonte de TVEMF é conectada operacionalmente à bobinaeletricamente condutora, de modo que, em uso, a fonte deTVEMF transmite uma TVEMF à parte interna da câmara decultura e à mistura de componente biológico, para expandir oscomponentes biológicos nela. A câmara de cultura tem pelomenos uma abertura, de modo que, quando em uso, a mistura decomponente biológico pode ser colocada na parte interna dacâmara de cultura. A abertura pode ser também, de preferência,usada para a troca de meio de cultura e/ou compostobiologicamente ativo, e a remoção das amostras do componentebiológico para teste, e, de preferência, a abertura é equipada parauso com uma seringa.

Nos desenhos, a Figura 1 é uma vista lateral emprojeção vertical em seção transversal de uma concretizaçãopreferida de um biorreator rotativo 10. Nessa concretizaçãopreferida, um alojamento de motor 12 é suportado por uma base.Um motor 16 é fixado dentro do alojamento de motor 12 econectado por um primeiro fio 18 e um segundo fio 20 a umacaixa de controle 22, que aloja nele um dispositivo de controle,em que a velocidade do motor 16 pode ser controladaincrementalmente por giro do botão de controle 24. Estendendo-se do alojamento de motor 12 fica um eixo de motor 26. Umsuporte rotativo 28 recebe desprendidamente um retentor debiorreator rotativo 30, que recebe desprendidamente uma câmarade cultura 32, de preferência, descartável, e tambémpreferivelmente substancialmente cilíndrica, que é fixada, depreferência, desprendidamente, dentro do retentor de biorreatorrotativo 30, de preferência, por um parafuso 34. A câmara decultura 32 é montada, de preferência, desprendidamente, nosuporte rotativo 28. O suporte rotativo 28 é recebido pelo eixo demotor 26. Em uso, quando o botão de controle 24 é ligado, acâmara de cultura 32 é girada. Pelo termo "girada" e termossimilares, tem-se a intenção de que, em uso, a rotação da câmarade cultura impede a colisão das células, tecido ou massa celularcom a parte interna do biorreator de TVEMF rotativo. A câmarade cultura pode ser também, de preferência, perfundida.

A câmara de cultura do biorreator rotativo 10 dapresente invenção pode ser, de preferência, descartável,significando que pode ser jogada fora e uma outra usada emculturas posteriores, caso necessário. O biorreator rotativo 10pode ser também, de preferência, esterilizado, por exemplo, emuma autoclave, após cada uso e reusado para culturas posteriores.

Uma câmara de cultura descartável 32 pode ser manufaturada eembalada em um meio físico estéril, permitindo, desse modo, queseja usada pelo profissional médico ou de pesquisa de uma formabastante semelhante que são usados outros dispositivos médicosdescartáveis.

A Figura 2 é uma vista em perspectiva lateral deum biorreator rotativo 10. A Figura 2 ilustra o alojamento demotor 42 retendo um botão de controle 54 e suportado por umabase 44. Estendendo-se do alojamento de motor 42 fica um eixode motor 56. Um suporte rotativo 58 recebe desprendidamente umretentor de biorreator rotativo 60, que recebe desprendidamenteuma câmara de cultura. Uma bobina eletricamente condutora 59 éenrolada em torno da parte externa da câmara de cultura. Abobina eletricamente condutora 59 pode ser feita, de preferência,de qualquer material eletricamente condutor, que conduzeletricidade incluindo, mas não limitado a, os seguintes materiaiscondutores: prata, ouro, cobre, alumínio, ferro, chumbo, titânio,urânio, um metal ferromagnético, e zinco, ou uma combinaçãodeles. A bobina eletricamente condutora 59 pode ser também, depreferência, um solenóide. Além do mais, a bobina eletricamentecondutora 59 pode ser, de preferência, contida em um isolanteelétrico, compreendendo, mas não limitado a, borracha, plástico,silicones, vidro e cerâmica. A bobina eletricamente condutora 59pode ser enrolada em tomo da parte externa da câmara de cultura,e, desse modo, a câmara de cultura suporta uma forma da bobinaeletricamente condutora 59, tendo, de preferência, uma seçãotransversal substancialmente oval, particularmente, uma seçãotransversal substancialmente elíptica, e, especialmente, uma seçãotransversal substancialmente circular. A bobina eletricamentecondutora 59, que é integral com uma câmara de cultura, que é, depreferência, descartável, é instalada no biorreator rotativo 10,juntamente com a câmara de cultura descartável, e conectadaoperacionalmente a uma fonte de TVEMF 64. Quando a câmarade cultura descartável é descartada, a bobina eletricamentecondutora 59 é descartada com ela.

Em uma primeira extremidade, um primeiro fiocondutor 62 e um segundo fio condutor 66, ambos sendo integraiscom a bobina eletricamente condutora 59, são conectadosoperacionalmente a uma fonte de TVEMF 64, tendo um botão defonte 65, que, em uso, pode ser ligado para gerar uma TVEMF.

Em uma segunda extremidade, os fios 62, 66 são conectados apelo menos um anel, para facilitar a rotação da bobinaeletricamente condutora 59. Quando o botão de controle 54 éligado, a câmara de cultura e a bobina eletricamente condutora 59são giradas simultaneamente. Além do mais, a bobinaeletricamente condutora 59 se mantém fixada na, e abrangendo a,câmara de cultura, de modo que, em uso, fornece uma TVEMF àscélulas na câmara de cultura.

A câmara de cultura de um biorreator rotativopode ser equipada, de preferência, com um circuito fechado defluxo de meio de cultura 100, para o suporte de troca de gásrespiratório em, suprimento de nutrientes em, e remoção deprodutos de refugo metabólicos de uma cultura tridimensional.

Uma concretização preferida de um circuito fechado de fluxo demeio de cultura 100 é ilustrada na Figura 3, tendo uma câmara decultura 119, um oxigenador 121, um aparelho para facilitar ofluxo direcional do meio de cultura, de preferência, por uso deuma bomba principal 115, e uma derivação múltipla desuprimento 117, para a introdução seletiva de requisitos de meiosde cultura, tais como, mas não limitados a, nutrientes 106,tampões 105, meio fresco 105, citocinas 109, fatores decrescimento Ille hormônios 113. Nessa concretização preferida,a bomba principal 115 proporciona meio de cultura fresco daderivação múltipla de nutrientes 117 para o oxigenador 121, noqual o meio de cultura é oxigenado e passado pela câmara decultura 119. O refugo no meio de cultura exaurido da câmara decultura 119 é removido, de preferência, pela bomba principal 115e transferido para o refugo 118, e o volume remanescente de meiode cultura não removido para o refugo 118 é retornado para aderivação múltipla de suprimento 117, na qual pode, depreferência, receber uma carga fresca de requisitos de meio decultura, antes de ser reciclado pela bomba 115, pelo oxigenador121, para a câmara de cultura 119.

Nessa concretização preferida de um circuitofechado de fluxo de meio de cultura 100, ajustes são feitos emresposta a sensores químicos (não mostrados), que mantêmcondições constantes dentro da câmara de cultura 119. O controledas pressões de dióxido de carbono e a introdução de ácidos oubases corrige o pH. Oxigênio, nitrogênio e dióxido de carbono sãodissolvidos em um sistema de troca de gás (não mostrado), parasuportar a respiração celular. O circuito fechado de fluxo de meiode cultura 100 adiciona oxigênio e remove dióxido de carbono deuma capacitância de gás circulante. Embora a Figura 3 seja umaconcretização preferida de um circuito fechado de fluxo de meiode cultura, que pode ser usada na presente invenção, a invençãonão é intencionada para ser assim limitada. A introdução derequisitos de meio de cultura, tais como, mas não limitados a,oxigênio, nutrientes, tampões, meio fresco, citocinas, fatores decrescimento e hormônios em um biorreator de TVEMF rotativopode ser também feita manualmente, automaticamente ou poroutros meios de controle, como podem ser o controle e a remoçãode refiigo e dióxido de carbono.

Como várias mudanças podem ser feitas embiorreatores TVEMF rotativos, tais como as que são consideradasna presente invenção, sem que se afaste do âmbito da invenção,intenciona-se que toda a matéria contida no presente relatóriodescritivo seja interpretada como ilustrativa e não limitante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA

INVENÇÃO

As seguintes definições são mencionadas paraajudar na descrição e no entendimento dos termos definidos nocontexto da presente invenção. As definições não sãomencionadas para limitar esses termos a menos do que é descritoao longo desse pedido de patente. Além do mais, várias definiçõessão incluídas relativas à TVEMF - todas as definições nesseaspecto devem ser consideradas como complementares entre si enão consideradas opostas entre si.

Como usado ao longo desse pedido de patente, otermo "TVEMF" se refere à "força eletromagnética variável como tempo". Como discutido acima, a TVEMF desta invenção estáem uma onda delta, particularmente, uma onda quadradadiferencial e, especialmente, uma onda quadrada (seguindo umacurva de Fourier). A TVEMF é selecionada, de preferência, deuma das seguintes: (1) uma TVEMF com uma amplitude de forçainferior a 100 gauss e uma taxa de virada superior a 1.000 gausspor segundo; (2) uma TVEMF com uma onda quadrada bipolar desubstancialmente baixa amplitude de força, a uma freqüênciainferior a 100 Hz; (3) uma TVEMF com uma onda quadrada desubstancialmente baixa amplitude de força com menos de 100%de ciclo de atividade; (4) uma TVEMF com taxas de viradasuperiores a 1.000 gauss por segundo, para duração de pulsosinferiores a 1 ms; (5) uma TVEMF com pulsos similares a umafunção delta bipolar de taxa de virada com um ciclo de atividadeinferior a 1%; (6) uma TVEMF com uma amplitude de forçainferior a 100 gauss pico a pico e pulsos similares a uma funçãodelta bipolar de taxa de virada, e em que o ciclo de atividade éinferior a 1%; (7) uma TVEMF aplicada usando uma bobina desolenóide, para criar uma intensidade de força uniforme por toda acultura tridimensional; e (8) uma TVEMF aplicada utilizando umconcentrador de fluxo para proporcionar gradientes espaciais defluxo magnético e foco de fluxo magnético dentro da culturatridimensional. A faixa de freqüências na intensidade de forçaeletromagnética oscilante é um parâmetro que pode serselecionado para obter a estimulação desejada na culturatridimensional. No entanto, esses parâmetros não sãomencionados para serem limitantes à TVEMF da presenteinvenção, como tal, podem variar com base em outros aspectosdesta invenção. A TVEMF pode ser medida, por exemplo, porequipamento usual, tal como um medidor Gauss de sensor celular.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "bobina eletricamente condutora" se refere a qualquermaterial eletricamente condutor, que conduz eletricidade,incluindo, mas não limitado a, os seguintes materiais condutores:prata, ouro, cobre, alumínio, ferro, chumbo, titânio, urânio, ummetal ferromagnético, e zinco, ou uma combinação deles. Abobina eletricamente condutora pode também compreender, depreferência, água salgada. A bobina eletricamente condutora podeser também, de preferência, um solenóide. Além do mais, abobina eletricamente condutora pode ficar, de preferência, contidaem um isolante elétrico, compreendendo, mas não limitado a,borracha, plástico, silicones, vidro e cerâmica. A bobinaeletricamente condutora pode ser enrolada em torno da parteexterna da câmara de cultura do biorreator de TVEMF rotativo, e,portanto, de preferência, a câmara de cultura suporta uma formada bobina eletricamente condutora, tendo, de preferência, umaseção transversal substancialmente oval, particularmente, umaseção transversal substancialmente elíptica, e, especialmente, umaseção transversal substancialmente circular. A câmara de culturasuporta, de preferência, uma forma da bobina eletricamentecondutora, porque a forma da câmara de cultura e a forma dabobina eletricamente condutora são substancialmente similares.Por "enrolada em torno", intenciona-se que a bobina eletricamentecondutora abranja a câmara de cultura, de modo que, depreferência, em operação, uma TVEMF substancialmenteuniforme é transferida para a parte interna da câmara de cultura edas células nela. Por "abrange", quer-se mencionar que a bobinaeletricamente condutora circunda a câmara de cultura, e, em uso,transmite, de preferência, uma TVEMF substancialmenteuniforme para a parte interna da câmara de cultura.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "componente biológico" se refere a uma parte da culturatridimensional no biorreator rotativo, durante a etapa de expansãocontrolável do método da presente invenção. O componentebiológico pode ser, de preferência, testado durante a cultura, oupor outros meios, após a cultura ter sido completada, ou aindaapós extermínio para técnicas analíticas especiais, tal comomicroscopia eletrônica. O componente biológico é testado paracaracterizar um composto biologicamente ativo. O componentebiológico pode ser, de preferência, células em qualquer forma, porexemplo, células T ativadas, e qualquer parte da célula incluindoa membrana, a parede celular (no caso de vegetais) e/ou organelasde células internas incluindo as mitocôndrias. O componentebiológico a ser testado pode também incluir, de preferência,material selecionado, por exemplo, mucina, colágeno e matriz,hormônios selecionados (insulina de células Beta pancreáticas),componentes estruturais intercelulares secretados, matrizesestruturais introduzidas, matrizes aderentes, substratos decrescimento, sinais solúveis intercelulares, marcadoressuperficiais de membranas celulares, enzimas ligadas amembranas, marcadores de identidade imunes, moléculasaderentes, vacúolos, neurotransmissores armazenados e liberados,e maquinário específico interno celular, tais como fibrascontráteis de miosina no caso de músculo, glicogênio, meio decultura, compostos sob teste, toxinas suspeitas sob teste, reagentessob teste, fungos, e complexos conjugados no caso de hepatócitos.

Um componente biológico pode ser também, de preferência, umvírus, que fica contido na cultura tridimensional no biorreatorrotativo, durante a expansão. Esses vírus podem incluir, mas nãosão limitados a, HIV, gripe de Bird, SIV, hepatite, HPV, o vírusda herpes, que podem conter DNA viral, ou no caso de retrovírus,RNA e partículas virais. O componente biológico pode sertambém, de preferência, células bacterianas. O componentebiológico pode ser também, de preferência, quaisquer outrasnucleases, DNA, RNA, proteína, partículas bioativas artificiaistais como nanopartículas, e/ou genes, mas não é limitado a eles. Ocomponente biológico pode estar, de preferência, contido namistura celular, ou adicionado à cultura tridimensional, oucolocado no biorreator rotativo, antes da adição da misturacelular. O componente biológico é o foco de um teste paracaracterizar um composto biologicamente ativo.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "composto biologicamente ativo" se refere a qualquersubstância biológica, sintética ou não sintética, que vai sercaracterizado pelo método da presente invenção. O compostobiologicamente ativo pode estar, de preferência, em qualquerforma, incluindo, mas não limitada a, pó, líquido, vapor e gás. Ocomposto biologicamente ativo pode ser também, de preferência,mas não limitado a, proteína, células, substâncias químicas, gases,metais, fatores de crescimento, radiação, nanopartículas, vírus,bactérias, e/ou água, e/ou quaisquer de suas combinações. Ocomposto biologicamente ativo pode ser também, de preferência,qualquer material tóxico a qualquer parte de uma culturatridimensional, que compreende células e um componentebiológico. Como usado neste pedido de patente, o termo toxina serefere a qualquer material ou processo físico, que é suspeito ouconhecido como afetando negativamente uma função de célulasou tecido, ou que a faz desviar-se da função normal. As toxinaspodem ser, de preferência, metais pesados e também, depreferência, exposições térmicas, de radiação ou ainda elétricas.Além do mais, um composto biologicamente ativo pode sertambém, de preferência, um reagente que tem um efeito na culturatridimensional, que compreende células e um componentebiológico. Como usado ao longo deste pedido de patente, o termo"reagente" se refere a qualquer material ou processo físico, que éutilizado para provocar uma variação na função celular ou detecido, arquitetura, estrutura, crescimento, período de vida útil,composição genética, características de crescimento, materialsecretado, estado de diferenciação, predisposição de linhagem dediferenciação, ou expressão de marcador superficial, estadometabólico, estrutura de organela de células internas, estrutura demembranas, ou tumorosidade. Além do composto biologicamenteativo preferido, como insulina, o transporte para uma célula eprovocando transporte interno de glicose, um compostobiologicamente ativo pode, de preferência, se referir a etapas dereagentes, tais como eletroporação, quimioporação e interações denanopartículas. Os métodos de poração são particularmente úteispara a produção de hibridomas para produção de anticorposmonoclonais. Não se ligando à teoria, mas o conteúdo de culturatridimensional bem distribuído possibilitado por rotação dasculturas das paredes é ideal para maximizar a troca genética, entreas células transformadas e imunológicas na formação híbrida. Issopode aperfeiçoar a produção bem-sucedida de híbridos desejadosproduzindo anticorpos desejáveis. Alguns exemplos preferidosadicionais de um composto biologicamente ativo incluem, masnão são limitados a, insulina, interleucinas, fatores decrescimento, moduladores de diferenciação, agentes quimiotáticose inibidores. De acordo com a presente invenção, um compostobiologicamente ativo pode ser caracterizado por teste dos seusefeitos em um componente biológico.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "células" se refere a uma célula em qualquer forma, porexemplo, células individuais, tecidos, agregados celulares, célulashíbridas, células pré-fixadas em substratos de fixação de células,por exemplo, microcontas portadoras, estruturas em forma detecido, ou ressecções de tecidos intactos. As células nestainvenção também podem ser, de preferência, eucarióticas,particularmente, procarióticas. As células, que podem ser usadasnesta invenção, são, de preferência, células de mamíferos,particularmente, humanas, mais particularmente células troncoadultas, especialmente, células tronco adultas de sangueperiférico, e, mais especialmente, células mesenquimais. Outrascélulas de mamíferos, que podem ser usadas no método dapresente invenção, incluem, de preferência, mas não são limitadasa, coração, fígado, hematopoiética, pele, músculo, intestinal,pancreática, sistema nervoso central, cartilagem, pulmonarconectiva, baço, osso e pulmão.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "biorreator rotativo" é mencionado para compreender ummotor conectado a uma câmara de cultura, com uma parte internae uma parte externa e que pode ser girada a uma velocidade. Depreferência, o biorreator rotativo é substancialmente cilíndrico. Obiorreator rotativo pode ter também, de preferência, uma bobinaeletricamente condutora enrolada em torno da parte externa dacâmara de cultura. Além do mais, o biorreator rotativo pode tertambém um circuito fechado de fluxo de meio de cultura fixadonele, para ajudar a facilitar o fluxo de meio de cultura para a epela cultura tridimensional nele. O fluxo do meio de cultura pelacâmara de cultura pode ser por perfusão. Uma fonte de TVEMFpode ser, de preferência, conectada operacionalmente à bobinaeletricamente condutora. Em uso, um biorreator rotativo pode sergirado e, sem que se deseje estar ligado à teoria, a rotação deveser controlada para promover, suportar e manter uma culturatridimensional, como descrito, por exemplo, na DESCRIÇÃO DAINVENÇÃO. Em uma concretização preferida tendo uma bobinaeletricamente condutora, uma TVEMF pode ser gerada pela fontede TVEMF, e um nível de gauss adequado pode ser, depreferência, transmitido para a parte interna da câmara de cultura,pela bobina eletricamente condutora. O volume do biorreatorrotativo é, de preferência, de cerca de 15 mL a cerca de 2 L.Consultar, por exemplo, as Figuras 1 e 2 no presente relatóriodescritivo para os exemplos (não intencionados para seremlimitantes) de um biorreator rotativo.

A câmara de cultura de um biorreator rotativotem paredes rotativas da câmara de cultura na parte interna, demodo que, em operação as paredes da câmara são ajustadas paraum movimento relativo ao meio de cultura, e, portanto, a culturatridimensional, de modo que não há essencialmente qualquerdesvio de tensão de fluido no meio de cultura. A câmara decultura também tem pelo menos uma abertura para adição e/ouremoção de meio de cultura, células, e/ou componente biológicoou partes dele, e também para introdução de um compostobiologicamente ativo. A câmara de cultura do biorreator rotativo édisposta substancialmente horizontalmente. A câmara de cultura étambém, de preferência, substancialmente cilíndrica com duasextremidades e é capaz de rotação em torno de um eixosubstancialmente horizontal. A câmara de cultura é, depreferência, transparente em parte, de modo que o componentebiológico, o meio de cultura, e/ou a cultura tridimensional nelapossam ser determinados, caso necessário. Além do mais, acâmara de cultura pode ser também equipada com ummicroscópio, para determinar o componente biológico, a culturatridimensional e/ou as células. Sem querer estar ligado à teoria, arotação das células em um biorreator rotativo proporciona umaexpansão controlável das células com o tempo, enquanto que, aomesmo tempo, promove, suporta e mantém a geometriatridimensional intrincada, suporte célula a célula e geometria dascélulas.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "mistura celular" e termos similares se referem a umamistura de células, de preferência, com uma outra substância,incluindo, mas não limitado a, meio de cultura (com e semaditivos), plasma, tampão e preservativos. A mistura celular podetambém compreender o componente biológico.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "cultura tridimensional" se refere às células e aocomponente biológico na câmara de cultura do biorreator rotativosendo expandidas controlavelmente pelo método da presenteinvenção. As células na cultura tridimensional têm uma geometriatridimensional e um suporte célula a célula e geometriapromovidos, suportados e mantidos no meio de cultura. Ascélulas na cultura tridimensional têm essencialmente a mesmageometria tridimensional e suporte e geometria célula a célula queas células in vivo. As estruturas tridimensionais de tecidos,massas celulares não necróticas e/ou em forma de tecidos tambémpodem se desenvolver das células e serem sustentadas e aindaexpandidas na cultura tridimensional e, ao mesmo tempo,reproduzirem o micromeio físico in vivo. A cultura tridimensionalpode ser expandida (crescida em número), sustentada, oudegenerada, dependendo da finalidade do experimento. Em outraspalavras, dependendo dos efeitos do composto biologicamenteativo e/ou do micromeio físico preferido, necessário paracaracterizar o composto biologicamente ativo, a culturatridimensional vai ser expandida controlavelmente, o que podesignificar, de preferência, expansão, manutenção ou degeneraçãoda composto biologicamente ativo, ou de partes dela.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "ligado operacionalmente" e termos similares sãointencionados para significar que a fonte de TVEMF pode serconectada, de preferência, desprendidamente, à câmara de cultura,de uma maneira tal que, em operação, a fonte de TVEMF confereuma TVEMF à parte interna da câmara de cultura de umbiorreator rotativo e à cultura tridimensional contida nela. A fontede TVEMF é conectada operacionalmente se, em uso, puderconferir uma TVEMF à parte interna da câmara de cultura, depreferência, substancialmente uniforme.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "exposição" e termos similares se referem ao processo desuprir uma TVEMF à cultura tridimensional contida na parteinterna da câmara de cultura de um biorreator rotativo. Emoperação, uma fonte de TVEMF é ligada e ajustada a uma faixade gauss preferida e a uma forma de onda preferida, de modo quea mesma é transferida, pela fonte de TVEMF, para uma bobinaeletricamente condutora, enrolada em torno da parte externa dacâmara de cultura do biorreator rotativo. A TVEMF é depoistransmitida para cultura tridimensional contendo células nacâmara de cultura, expondo, desse modo, as células à TVEMF, depreferência, uma TVEMF substancialmente uniforme.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "meio de cultura" e termos similares se referem a umlíquido, que compreende, mas não é limitado a, meio decrescimento e nutrientes, o que significa uma sustentação dascélulas com o tempo. O meio de cultura pode ser enriquecido comquaisquer dos seguintes, mas não são limitados a, meio decrescimento, tampões, fatores de crescimento, hormônios ecitocinas. O meio de cultura é suprido à mistura celular parasuspensão dentro da câmara de cultura do biorreator rotativo esuportar a expansão. O meio de cultura pode ser, de preferência,combinado com a mistura celular, antes de ser adicionado àcâmara de cultura do biorreator rotativo, ou pode ser, depreferência, adicionado à câmara de cultura, antes da misturacelular ser adicionada, misturando, desse modo, o meio de culturae as células no biorreator rotativo. O meio de cultura pode ser, depreferência, enriquecido e/ou renovado, durante a expansão, casonecessário. O refugo contido no meio de cultura, bem como opróprio meio de cultura, podem ser, de preferência, removidos dacultura tridimensional na câmara de cultura, durante a expansão,caso necessário. O refugo contido no meio de cultura pode ser,mas não é limitado a, refugo metabólico, células mortas e outrosresíduos tóxicos. O meio de cultura pode ser, de preferência,enriquecido com oxigênio e tem, de preferência, capacidades detransporte de oxigênio, dióxido de carbono e nitrogênio.Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "colocação" e termos similares se referem ao processo decombinação da mistura celular e do meio de cultura, antes daadição das células ao biorreator rotativo. O termo "colocação"pode também referir-se, de preferência, à adição da misturacelular ao meio de cultura, que já está presente no biorreatorrotativo. As células podem ser, de preferência, colocadas nobiorreator rotativo, juntamente com os substratos de fixação dascélulas, tais como microcontas portadoras.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "expansão controlável" e termos similares se referem aoprocesso de aumentar, manter ou reduzir o número de células emum biorreator rotativo por rotação da câmara de cultura. Em umaconcretização preferida, a expansão controlável das célulastambém compreende a exposição da cultura tridimensional a umaTVEMF. De preferência, as células são expandidas semdiferenciação. Se um aumento no número de células for preferido,então o aumento no número de células por volume éexpressamente não devido a uma simples redução no volume defluido, por exemplo, redução do volume do meio de cultura de 70mL para 10 mL e, desse modo, aumentando o número de célulaspor mL. A expansão controlável das células por, de preferência,expansão (aumento em número) das células em um biorreatorrotativo proporciona células que têm substancialmente a mesmageometria tridimensional que as células antes da expansão, depreferência, substancialmente, a mesma geometria e as interaçõescélula a célula que as células apresentam no ajuste ou tecidonatural que existem naturalmente, o micromeio físico in vivo.Também, de preferência, a expansão controlável pode se referir àsustentação de uma cultura tridimensional nelas, por exemplo, umefeito de composto biologicamente ativo preferido é impedir oaumento do número de células. Particularmente, a culturatridimensional também pode ser sustentada para caracterizar ocomposto biologicamente ativo. A expansão controlável em umacultura tridimensional de um biorreator rotativo também podereferir-se, de preferência, a uma cultura degenerativa, na qual, porexemplo, um efeito de composto biologicamente ativo preferido éo de degenerar a cultura tridimensional. Particularmente, a culturatridimensional pode ser intencionalmente degenerada paracaracterizar um composto biológico preferido. Outros aspectos daexpansão também podem proporcionar as característicasexcepcionais das células da presente invenção.

De preferência, as células e/ou o tecido sofremexpansão, desde que seja necessário testar um componentebiológico para caracterizar um composto biologicamente ativo. Acultura tridimensional pode sofrer, de preferência, expansão porpelo menos 160 dias em um biorreator rotativo.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "rotação" e termos similares se referem à rotação da câmarade cultura do biorreator rotativo, que é, de preferência,substancialmente cilíndrica e é girada em torno de um planosubstancialmente horizontal. De preferência, as velocidades derotação variam de cerca de 1 revolução por minuto (RPM) a cercade 120 RPM e, particularmente, de cerca de 2 RPM a cerca de 30RPM. O biorreator rotativo pode ser, de preferência, giradoautomaticamente, ou girado manualmente. Além disso, avelocidade de rotação pode ser manualmente ajustada, iniciada ouinterrompida, ou, particularmente, ajustada, iniciada ouinterrompida automaticamente por uso de um sensor.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "introdução de um composto biologicamente ativo" serefere ao processo de adição de um composto biologicamenteativo à câmara de cultura antes, durante e/ou após a etapa deexpansão controlável. O composto biologicamente ativo pode ser,de preferência, adicionado, quando necessário, durante o métododa presente invenção e antes e/ou depois de várias etapas.Dependendo do teste preferido sendo conduzido, o compostobiologicamente ativo pode ser adicionado em diferentesconcentrações e em vários momentos ao longo do método dapresente invenção. O composto biologicamente ativo pode estartambém inerentemente contido na cultura tridimensional.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "teste" se refere ao processo de caracterização de umcomposto biologicamente ativo, por análise do efeito docomposto biologicamente ativo em um componente biológico.Dependendo do componente biológico a ser testado, os testes vãovariar. Por exemplo, se o composto biologicamente ativo foresperado executar o DNA ou RNA de um componente biológico,então o composto biologicamente ativo pode ser caracterizado porteste do efeito no DNA pela reação de cadeia de polimerase ouRNA pela reação em cadeia de polimerase de transcriptase.Outros testes e métodos de teste incluem, mas não são limitadosa, os seguintes instrumentos e técnicas, que incluem:espectroscopia de massa, citometria de fluxo, imunofluorescência,cromatografia, anticorpos mono- e biclonais, teste de viabilidade,testes de toxicidade, testes de espécies, bioensaios, testes deconcentração efetiva e diluição, testes de respostas a doses, testesde refugos nocivos, testes de concentração letal, testes de triagem,testes de renovação estática, testes de crescimento celular e denúmero de células, e radiomarcação. De preferência, a presenteinvenção proporciona um método para caracterizar um compostobiologicamente ativo por teste do seu efeito na tumorosidade eanomalias genéticas. Outros exemplos de testes, que podem serconduzidos pelo método da presente invenção, para caracterizarum composto biologicamente ativo, incluem, mas não sãolimitados a, testes relacionados com a expressão genética,cariótipo, características de taxas de crescimento, morfologiacelular individual e multicelular, medidas metabólicas, e relaçõesintercelulares. Os testes vão ser preferivelmente dirigidos amedidas de complexos de junção, formação de glândula,polaridade celular e relações geométricas entre as célula(geometria célula a célula), e componentes acelulares. A presenteinvenção proporciona um método, que compreende a etapa deexpansão controlável de células, de modo que a geometriatridimensional das células se mantém como é no ajuste natural,proporcionando, desse modo um componente biológico paracaracterização de um composto biologicamente ativo por teste dosseus efeitos de um composto biologicamente ativo em umcomponente biológico em um micromeio físico, que éessencialmente igual como o encontrado na situação in vivo. Ocomponente biológico pode ser testado para caracterizar osmecanismos de ação, os efeitos biológicos, a eficiência, acapacidade de transferência, a utilidade e/ou a toxicidade docomposto biologicamente ativo.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "caracterizar" se refere ao processo de determinação doefeito que tem um composto biologicamente ativo em umcomponente biológico, por condução de testes no componentebiológico. Os testes podem ser conduzidos, de preferência, porteste das eficiência e toxicidade do composto biologicamenteativo. O componente biológico pode ser testado para caracterizaros mecanismos de ação, os efeitos biológicos, a eficiência, acapacidade de transferência, a utilidade e/ou a toxicidade docomposto biologicamente ativo.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "geometria célula a célula" se refere à geometria dascélulas, incluindo o espaçamento, a distância entre, e a relaçãofísica das células relativas entre si. Por exemplo, em umaconcretização preferida da presente invenção, quando dautilização das células, as células expandidas, incluindo aquelesdos tecidos, os agregados celulares e as estruturas similares atecidos, a retenção das células relativamente entre si, como nomicromeio físico in vivo. As células expandidas ficam dentro dasligações do espaçamento natural entre as células, em contrastecom, por exemplo, as câmaras de expansão bidimensionais, nasquais esse espaçamento não é mantido com o tempo e a expansão.

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "suporte célula a célula" se refere ao suporte que umacélula proporciona a uma célula adjacente. Por exemplo, tecidos,agregados celulares, estruturas em forma de tecido, e célulasmantêm interações, tais como químicas, hormonais, neurais(quando aplicável / adequado) com outras células. Além disso, ascélulas proporcionam suporte estrutural entre si. Não é necessárioque as células se toquem fisicamente, para proporcionar suportecélula a célula. Na presente invenção, essas interações sãomantidas dentro de parâmetros de funcionamento normais,significando que não começa, por exemplo, a enviar sinais tóxicosou danosos a outras células (a menos que isso fosse feito meiofísico neutral celular e de tecido).

Como usado ao longo deste pedido de patente, otermo "geometria tridimensional" se refere à geometria de célulasem um estado tridimensional (igual ou muito similar aos seusestados naturais), oposta à geometria bidimensional, por exemplo,como a encontrada nas células crescidas em uma cápsula Petri,nas quais as células ficam achatadas e/ou esticadas. Não sequerendo estar ligado à teoria, mas a geometria tridimensional dascélulas é mantida, suportada e preservada, de modo que a célulapossa desenvolver-se em estruturas de agregados celulares,tecidos ou em forma de tecido tridimensionais, na culturatridimensional do biorreator rotativo, enquanto que, ao mesmotempo, mantendo a geometria tridimensional, e suporte egeometria célula a célula. Por rotação da cultura tridimensional nacâmara de cultura, as células nela podem manter uma geometriatridimensional, uma geometria e um suporte célula a célula,células diferentes crescidas em meios físicos agitados, tais comopor sacudimento, uso de bolhas e agitação. Além disso, a rotaçãodo biorreator rotativo mantém as células bem próximas entre si,de modo que possam estabelecer e manter a tridimensionalidadeque é encontrada nas células no meio físico in vivo.

Para cada uma das três definições mencionadasacima, relativas à manutenção de "suporte célula a célula" e"geometria célula a célula" e "geometria tridimensional" dascélulas da presente invenção, o termo "essencialmente igual" e"substancialmente igual" significam que a geometria e o suportenaturais são proporcionados na expansão, de modo que as célulasnão são, de modo algum, alteradas para ficarem disfuncionais,tóxicas ou nocivas para a cultura tridimensional. Em vez disso, ascélulas da presente invenção, durante e após a expansão,reproduzem a situação in vivo.

Em operação, uma mistura celular é colocada nacâmara de cultura do biorreator rotativo. Em uma concretizaçãopreferida, a câmara de cultura é girada por um período de tempo,enquanto que, ao mesmo tempo, uma TVEMF é gerada na câmarade cultura pela fonte de TVEMF. Por "enquanto que, ao mesmotempo", quer-se mencionar que a iniciação da transferência daTVEMF pode ser antes, concorrente com, ou após a rotação dacâmara de cultura ser iniciada. Em um biorreator rotativo maiscomplexo, um meio de cultura enriquecido com requisitos demeio de cultura, incluindo, mas não limitado a, meio decrescimento, tampão, nutrientes, hormônios, citocinas e fatores decrescimento, o que proporcionar sustentação às células, pode serperiodicamente renovado e removido. O componente biológicocontido na cultura tridimensional do biorreator rotativo pode sertestado a qualquer momento ao longo do processo de expansão.Além do mais, o composto biologicamente ativo sendocaracterizado pode ser introduzido na cultura tridimensional aqualquer momento, antes, durante ou após a iniciação da culturatridimensional no biorreator rotativo. Por teste do componentebiológico, o composto biologicamente ativo pode sercaracterizado.

Em uso, um biorreator rotativo proporciona ummeio físico de cultura estabilizado no qual células podem serintroduzidas, suspensas, reunidas, crescidas e mantidas comretenção ou desenvolvimento aperfeiçoado de integridadetridimensional delicada, por minimização simultânea da tensão decisalhamento do fluido, proporcionando uma liberdadetridimensional para orientação espacial das células e do substrato,e aumentando a localização das células em uma região espacialparticular, durante a expansão. Em uma concretização preferida, aexpansão controlada de células em um biorreator rotativo éproporcionada por esses três critérios (a seguir referidos como "ostrês critérios mencionados acima"), e, ao mesmo tempo, as célulassão expostas a uma TVEMF. De interesse particular para apresente invenção é a dimensão da câmara de cultura, a taxa desedimentação das células, o campo gravitacional externo, aTVEMF, e a interação do composto biologicamente ativo e docomponente biológico.

A presente invenção proporciona que mesmoum processo degradante celular, em resposta a um compostobiologicamente ativo, vai representar um processo degradante invivo. Por exemplo, a caracterização de um compostobiologicamente ativo, tal como um agente quimioterapêutico, pordeterminação de se há qualquer redução no tamanho e no númerode células e tecido tumorogênico, e a determinação dosmecanismos de ação podem envolver o teste de um componentebiológico associado com ele. Qualquer redução de tumor bem-sucedida, em resposta a um agente quimioterapêutico, vaicaracterizar a eficiência do agente quimioterapêutico. Nesse caso,a transferência do composto biologicamente ativo para o tumorpode ser analisada para penetração na ou em torno das células, epor métodos pelos quais essa transferência pode ser otimizada poroutras manipulações ou medicamentos. A identificação dadistribuição do medicamento no constructo de tecido de cultura,dentro dos subvolumes celulares internos, ou na superfície dacélula é crítica para o preciso entendimento da transferênciaefetiva de medicamento (análises de compostos tóxicos, ou açõesde reagentes). O tumor de modelo cultivado é depois analisadopara resposta a tratamentos potenciais (quimioterapêuticos, deregime de radiação, de função de nanopartículas, ou suascombinações) por análises ultra-estrutural de tecidos e células,molecular, imunológica e física convencionais. Nessaconcretização preferida, o composto biologicamente ativoconsiste de elementos imunoativos, tais como compostoscontendo anticorpos ou mesmo células imunes vivas (que podemser elas mesmas modificadas por meios imunoterapêuticosadotivos - ativação de célula T exterminadora). Como tal, ocomposto biologicamente ativo pode conter, de preferência, umcomponente biológico vivo, eu pode ser particularmente bemtestado pela presente invenção, em vista da liberdade demovimento desses elementos, de modo que podem interagirlivremente com o tecido alvo (tumor nesse caso).

O meio físico de cultura estabilizado referido naoperação do biorreator rotativo é aquela condição no meio decultura, particularmente, os gradientes de velocidade de fluido,antes da introdução de célula, que vão suportar uma suspensãoquase uniforme de células após introdução delas, iniciando, dessemodo, uma cultura tridimensional por adição da mistura celular.Em uma concretização preferida, o meio de cultura é estabilizadoinicialmente em uma rotação horizontal de corpo quase sólido, emtorno de um eixo dento do qual limita uma parede de câmaraigualmente rotativa de um biorreator rotativo. Nessa condição, asparedes da câmara de cultura se movimentam na mesmavelocidade angular que o conteúdo da câmara de cultura, porqueas transições de partida, e os gradientes de velocidade de fluidotransientes associados, são dissipados. As paredes da câmara decultura são ajustadas em movimento relativo ao meio de cultura,de modo a introduzir inicialmente rotação ao conteúdo da câmarade cultura. Durante essa transição, que também ocorre durante adesaceleração da câmara, gradientes de velocidade de fluidosignificativos e tensões de cisalhamento de fluido associadasestão presentes. Após a câmara de cultura e o conteúdo atingiremum estado constante, esses gradientes são reduzidossignificativamente e o campo de cisalhamento por tensão defluido fica em um mínimo. As células são introduzidas no, e semovimentam pelo, meio de cultura no meio físico de culturaestabilizado e mantendo uma cultura tridimensional. A culturatridimensional se movimenta sob a influência da gravidade, porforças centrífugas ou de Coriolis, e a presença de células,partículas ou quaisquer outros elementos dentro do meio decultura da cultura tridimensional induz efeitos secundários aomeio de cultura. Por meio do termo "elementos", quer-semencionar que são incluídos quaisquer deles no meio de culturada cultura tridimensional, incluindo, mas não limitados a, vírus,nanopartículas, refugo, células mortas, células e quaisquer outrosobjetos nele. O movimento significativo do meio de cultura comrelação à câmara de cultura, uma tensão de cisalhamento de fluidosignificativa, e outros movimentos de fluido, são devido àpresença dessas células, partículas e/ou elementos dentro do meiode cultura.

Prefere-se também que alguns desses elementospossam ser fixados com a rotação das paredes da câmara decultura, para conveniência ou vantagem, com outros elementoslivres para movimentação dentro do compartimento de líquidodentro da câmara de cultura. Esses elementos "fixos" podem serobjetos (tais como substratos), que seriam de outro modo muitopesados de suspender apenas pela rotação do fluido, os elementosque são danificados por sedimentação ainda que muito baixainduzida por cisalhamento de fluido residual dentro da câmara decultura, afetados adversamente por impactos de parede inevitáveisexperimentados pelos elementos suspensos livremente, para umaobservação mais próxima, ou simplesmente para conveniência dooperador (tal como localizar mais tarde um elemento particular).É notável que a introdução desses elementos "fixos" representaum aperfeiçoamento no próprio processo de cultura,independentemente dos testes do composto biologicamente ativo,que são o objeto principal deste documento. Por exemplo, umexemplo seria "pendurar" um substrato em forma de válvulacardíaca dentro de uma câmara de cultura girando, pois maiscélulas são introduzidas para fixação nesse substrato, paraconstruir uma válvula cardíaca aperfeiçoada.

Na maior parte dos casos, as células com asquais o meio físico de cultura estabilizado recebe primeiro umacamada de sedimento a uma baixa taxa, de preferência, sob 0,5centímetro por segundo. Portanto, é possível, nesse estágio inicialda cultura tridimensional, selecionar de uma ampla gama de taxasrotacionais (de preferência, de cerca de 1 a cerca de 120 rpm,particularmente, de cerca de 2 a cerca de 30 rpm) e diâmetros decâmara (de preferência, de cerca de 1,3 a 91,4 centímetros - cercade 0,5 a cerca de 36 polegadas). De preferência, a taxa rotacionalmais baixa é vantajosa, porque minimiza o desgaste doequipamento e outras logísticas associadas com o manuseio dacultura tridimensional.

Não se querendo estar ligado à teoria, a rotaçãoem torno de um eixo substancialmente horizontal, com relação aovetor de gravidade externo a uma taxa angular, otimiza a rotaorbital das células suspensas dentro da cultura tridimensional. Emoperação, as células se expandem para formar uma massa deagregados celulares, tecidos tridimensionais, massas celulares nãonecróticas e/ou estruturas em forma de tecido, que aumentam emtamanho na medida em que a cultura tridimensional progride. Asinterações entre as células, tais como a geometria tridimensional ea geometria e o suporte célula a célula, reproduzem,substancialmente, o que se encontra no ajuste natural das células,o micromeio físico in vivo. O progresso da cultura tridimensionalé determinado, de preferência, por uma determinação visual,manual ou automática de um aumento no diâmetro da massacelular tridimensional na cultura tridimensional. Um aumento ouuma diminuição no tamanho e/ou número de agregados celulares,tecidos, massas celulares não necróticas ou estruturas em formade tecido na cultura tridimensional pode requerer um ajusteadequado da velocidade de rotação, para otimizar as rotasparticulares. A rotação da câmara de cultura controla,otimamente, as freqüências de colisão, as intensidades de colisãoe a localização das células em relação às outras células, e tambémas bordas limitantes da câmara de cultura do biorreator deTVEMF rotativo. Para controlar a rotação, se as células sãoobservadas como excessivamente distorcidas no lado para baixo epara fora no lado para cima, então as revoluções por minuto"rpm") podem ser preferivelmente aumentadas. Se as células sãoobservadas como centrifugando excessivamente para as paredesexternas, então as rpm podem ser, de preferência, reduzidas. Nãose querendo estar ligado à teoria, na medida em que os limitesoperacionais são atingidos, em termos de altas taxas desedimentação de célula ou altas resistências à gravidade, ooperador pode ser incapaz de satisfazer ambas essas condições epode ser forçado a aceitar a degradação em desempenho, como amedida contra os três critérios mencionados acima.

A taxa de sedimentação celular e o campo degravitações externas colocam um limite mais baixo na tensão decisalhamento obtenível, mesmo dentro da faixa operacional dobiorreator rotativo, devido ao impulso induzidogravitacionalmente das células e/ou dos elementos pelo meio decultura da cultura tridimensional. Os cálculos e as medidascolocam essa tensão de cisalhamento do fluido mínima muitopróxima daquela resultante da velocidade de sedimentaçãoterminal das células e/ou dos elementos (pelo meio de cultura)para a resistência ao campo gravitacional externo. O movimentoinduzido por forças centrífuga e de Coriolis [a cinemática angularclássica proporciona a equação a seguir relativa à força deCoriolis em uma massa (m) de objeto, a sua velocidade em umquadro rotativo (vr) e a velocidade angular do quadro rotativo dereferência (□): FCorioiis = -2 m (w χ vr)], juntamente com os efeitossecundários, devido às interações das células e do meio decultura, agem para degradar ainda mais o nível de tensão decisalhamento do fluido, na medida em que as células seexpandem.

Sem estar ligado à teoria, mas na medida emque o campo de gravidade externo é reduzido, estruturastridimensionais muito mais densas e maiores podem ser obtidas.Para obter o nível de tensão de cisalhamento de fluido mínimo, épreferível que a câmara de cultura seja girada substancialmente namesma velocidade que o meio de cultura. Sem estar ligado àteoria, mas isso minimiza o gradiente de velocidade do fluidoinduzido na cultura tridimensional. É vantajoso controlar as taxa etamanho de formação de tecido, para manter o tamanho dascélulas (e taxa de sedimentação associada) dentro de uma faixapara a qual a taxa de expansão é capaz de satisfazer os trêscritérios mencionados acima. No entanto, de preferência, ogradiente de velocidade e a tensão de cisalhamento do fluidoresultante podem ser intencionalmente introduzidos e controladospara fins específicos de pesquisa, tal como o estudo da tensão decisalhamento nos agregados celulares tridimensionais. Alémdisso, os rompimentos transientes do processo de expansão sãopermitidos e tolerados para, entre outras razões, fins logísticosdurante iniciação do sistema, aquisição de amostra, manutençãodo sistema e terminação da cultura tridimensional.

A rotação das células em torno de um eixosubstancialmente perpendicular à gravidade pode produzir váriastaxas de sedimentação, todas de acordo com a presente invençãose mantendo localizadas espacialmente em regiões distintas porlongos períodos de tempo, variando de segundos (quando ascaracterísticas de sedimentação são grandes) a horas (quando asdiferenças de sedimentação são pequenas). Sem estar ligado àteoria, mas isso permite que essas células tenham um temposuficiente para interagir quanto necessário, para formar estruturasmulticelulares, e associação entre si em uma culturatridimensional. As células podem, de preferência, se expandir nobiorreator rotativo, quando necessário. As células podem, depreferência, continuar a se expandir no biorreator rotativo porpelo menos 160 dias.

As dimensões da câmara de cultura tambéminfluenciam a rota das células na cultura tridimensional dapresente invenção. Um diâmetro da câmara de cultura éselecionado, de preferência, para que tenha o volume adequado,de preferência, de cerca de 15 mL a cerca de 2 L para a culturatridimensional intencionada, e que propicie uma densidade denucleação suficiente das células. Sem estar ligado à teoria, mas oimpulso das células para fora, devido à força centrífuga, éexagerado em maiores raios de câmara de cultura e para célulasde rápida sedimentação. Desse modo, é preferível limitar o raiomáximo da câmara de cultura em função das propriedades desedimentação dos tecidos antecipadas nos estágios finais dacultura tridimensional (quando são formados os maioresagregados celulares com altas taxas de sedimentação).

A rota das células na cultura tridimensional foicalculada analiticamente, incorporando o movimento celularresultante da gravidade, centrifugação e efeitos de Coriolis. Umasimulação de computador dessas equações reguladoras permiteque o operador modele o processo e selecione os parâmetrosaceitáveis (ou ótimos) para a cultura tridimensional planejadaparticular. A Figura 4 mostra a forma típica da órbita observadado quadro de referência (não rotativo) externo. A Figura 5 é umgráfico do desvio radial de uma célula do fluxo circular idealplotado em função das rpm (para uma sedimentação celular típicaa uma velocidade terminal de 0,5 cm por segundo). Esse gráfico(Figura 5) mostra a amplitude decrescente do desvio das célulasradial variando senoidalmente, induzido por sedimentaçãogravitacional. A Figura 5 também mostra um desvio das célulasradial crescente (por revolução), devido à centrifugação namedida em que as rpm são aumentadas. Essas limitações opostasinfluenciam a seleção cuidadosa das rpm ótimas para, depreferência, minimizar o impacto celular com, ou acúmulo em, asparedes da câmara. Uma família de curvas é gerada, que écrescentemente restritiva em termos de seleções operacionais dasrpm, na medida em que a resistência ao campo gravitacional éaumentada ou a taxa de sedimentação celular é aumentada. Essafamília de curvas, ou, de preferência, o modelo computadorizadoque soluciona essas equações de órbita reguladoras, é utilizado, depreferência, para selecionar as rpm e dimensões da câmara ótimaspara a expansão das células de uma dada taxa de sedimentação,em uma dada resistência ao campo gravitacional externo. Semestar ligado à teoria, mas como uma cultura tridimensional típicaé expandida, os tecidos, os agregados celulares e as estruturas emforma de tecidos aumentam em tamanho e taxa de sedimentação,e, portanto, a velocidade de rotação pode ser, de preferência,ajustada para sua otimização.

Na cultura tridimensional, a órbita celular(Figura 4) do quadro de referência rotativo do meio de cultura éobservada como movimentando-se em uma rota quase quecircular, sob a influência do vetor de gravidade rotativo (Figura6). Sem estar ligado à teoria, mas as duas pseudoforças, a deCoriolis e a centrífuga, resultam do quadro de referência rotativo(acelerado) e provocam distorção da rota circular de outro modoquase que circular. Os maiores níveis de gravidade e as maiorestaxas de sedimentação celular produzem rotas circulares de raiosmaiores, que correspondem a desvios de trajetória maiores daórbita circular ideal, como observado no quadro de referência nãorotativo. No quadro de referência rotativo, imagina-se, sem estarligado à teoria, que as células de diferentes taxas de sedimentaçãovão ficar localizadas espacialmente próximas entre si por longosperíodos de tempo, com uma separação cumulativa resultantebastante reduzida do que se o vetor de gravidade não fosse girado,as células se sedimentam, mas em um pequeno círculo (como oobservado no quadro de referência rotativo). Desse modo, emoperação o biorreator rotativo proporciona células de diferentespropriedades de sedimentação, com tempo suficiente parainteragir mecanicamente e por sinais químicos solúveis,reproduzindo, desse modo, substancialmente os mesmos suporte egeometria célula a célula, como encontrado in vivo. Em operação,a presente invenção proporciona taxas de sedimentação de, depreferência, cerca de 0 cm/s até 10 cm/s.

Além do mais, em operação, a câmara decultura da presente invenção tem pelo menos uma abertura, depreferência, para a entrada de meio de cultura fresco, uma misturacelular, um componente biológico, e um compostobiologicamente ativo, e também a remoção de um volume demeio de cultura exaurido contendo refugo metabólico e amostrasde componente biológico, mas não limitado a isso. Depreferência, a troca do meio de cultura pode ser também por meiode um circuito fechado de meio de cultura, no qual meio decultura fresco ou reciclado pode ser movimentado dentro dacâmara de cultura, de preferência, a uma taxa suficiente parasuportar troca de gás metabólico, transferência de nutriente, eremoção de produto de refugo metabólico. Isso pode degradarligeiramente a de outro modo cultura tridimensional quiescente. Epreferível, portanto, introduzir um mecanismo para o suporte doscomponentes preferidos, incluindo, mas não limitados a, troca degás respiratório, transferência de nutriente, transferência de fatorde crescimento par ao meio de cultura da cultura tridimensional, etambém um mecanismo para a remoção de produto de refugometabólico, para proporcionar uma cultura tridimensional delongo prazo, capaz de suportar cargas metabólicas significativaspor períodos de horas a meses.

A presente invenção expõe, de preferência, acultura tridimensional e, portanto, o componente biológico e ascélulas, a uma TVEMF, que não apenas proporciona umaexpansão acelerada das células, que mantêm as suas geometriastridimensionais e os suporte e geometria célula a célula, mas alémdisso, podem afetar algumas propriedades das células durante aexpansão, por exemplo, supra-regulação de genes promotores decrescimento, ou infra-regulação de genes impeditivos decrescimento. O campo eletromagnético é gerado por uma fonte deTVEMF. Em operação, uma bobina eletricamente condutora deum biorreator rotativo é, de preferência, rotativa com a câmara decultura, significando aproximadamente o mesmo eixo que o dacâmara de cultura e na mesma direção. Também, a bobinaeletricamente condutora pode ser, de preferência, fixada emrelação a uma câmara de cultura de um biorreator TVEMFperfundido rotativamente. A bobina eletricamente condutora podeser, de preferência, integral com, significando fixada e enroladaem torno da parte externa da câmara de cultura da bobinaeletricamente condutora da câmara de cultura do biorreator deTVEMF rotativo. A fonte de TVEMF é conectadaoperacionalmente ao biorreator de TVEMF rotativo. O método dapresente invenção proporciona esses três critérios mencionadosacima, de uma maneira até o momento não obtida e otimiza umacultura tridimensional, e, ao mesmo tempo, facilita e suporta aexpansão, de modo que uma expansão suficiente (aumento nonúmero por volume, diâmetro em referência ao tecido, ouconcentração) seja detectada em um período de tempo suficiente.

Além das células qualitativamente únicas, quesão produzidas pela operação do biorreator rotativo, sem estarligado à teoria, uma maior eficiência com relação à utilização dovolume total da câmara de cultura, para cultura de células etecido, pode ser obtida devido à suspensão homogêneasubstancialmente uniforme obtida. Vantajosamente, portanto, umbiorreator rotativo, em operação, proporciona um maior númerode células no mesmo biorreator rotativo com menos recursoshumanos. Muitos tipos de células podem ser utilizados nessemétodo. A pesquisa fundamental da biologia das células e tecido,bem como as aplicações clínicas requerendo modelos in vivoprecisos de comportamento das células in vivo, são aplicaçõespara as quais a presente invenção e o método de uso da mesmaproporcionam uma melhoria, porque, como indicado acima e aolongo desse pedido de patente, as células e o tecido expandidos dapresente invenção têm, essencialmente, as mesmas geometriatridimensional e suporte célula a célula e geometria célula a célulaque as células e tecido não expandidos, naturais. O teste de umcomposto biologicamente ativo em um meio físico, que reproduzaestreitamente a situação in vivo, é útil.

Uma toxicidade e uma eficiência do compostobiologicamente ativo podem ser testadas para caracterizar ocomposto biologicamente ativo. Para testar um compostobiologicamente ativo, a formação de um modelo de tecido in vitropreciso é altamente desejável. Um biorreator rotativo é capaz deproporcionar condições in vitro úteis e únicas, incluindo umacultura tridimensional essencialmente quiescente, na qual ascélulas podem responder aos compostos biologicamente ativos, deuma maneira que representa estreitamente o micromeio físico invivo.

As diferentes classes de medicamentos têmmecanismos de ação significativamente diferentes, mas háaspectos gerais partilhados pelo processo de desenvolvimento demedicamentos que a presente invenção aborda. Por exemplo, nocaso de medicamentos antivirais, o ciclo de vida completo dapartícula viral oferece oportunidade para intervenção. O ciclo devida viral inclui, por exemplo, transporte inicial da partícula virale localização próxima da célula alvo, penetração de membranacelular, incorporação genética, manufatura de subpartículas virais,conjunto de partículas virais e liberação viral. Essas etapasparticulares no ciclo de vida viral são etapas nas quais oscompostos biologicamente ativos, tais como os medicamentosantivirais, são dirigidos e testados para eficiência. Portanto, essestestes requerem um comportamento de nível de tecido celular emulticelular de alta fidelidade, que reproduz estreitamente omicromeio físico in vivo, que é proporcionado pela expansão emum biorreator rotativo, como na presente invenção. Os exemplosbásicos de vírus que podem ser preferivelmente testados pelométodo da presente invenção incluem HIV, gripe de Bird,hepatite, o vírus da herpes e incluem o baseado em DNAconvencional, bem como partículas virais infecciosas de RNAretroviral (dependente de transcriptase reversa). Um programasimilar pode ser seguido para testar, de preferência, os efeitos deum composto biologicamente ativo, de preferência, um agenteantibacteriano em uma infecção bacteriana, que pode ser testadopara síndromes tóxicas com relação à exposição à toxina, eproporcionar métodos de intervenção corretiva (por exemplo,exposição a metais pesados).

Outros compostos biologicamente ativos podemser preferivelmente testados para determinar os seus efeitos nasfunções e morfologia normais de células e tecidos, incluindo se oscompostos biologicamente ativos podem ajustar essas funções decélulas e tecidos normais, para restaurar potencialmente asfunções das células e tecidos normais ou inibir os estados dedoença. Sem estar ligado à teoria, nas funções das células etecidos normais em estados de doença, que estão super- ousubexpressas, freqüentemente, devido aos problemas demecanismos de realimentação e regulatórios. Por exemplo, nocaso de diabete de início na vida adulta, a resposta celular ainsulina (para admitir glicose) é inadequada, devido aosreceptores de insulina de membranas celulares rarefeitas,receptores ineficientes ou receptores (anticorpos) bloqueados. Ofluxo contínuo de medicamentos sendo testados para abordardiabete de início na vida adulta é dirigido para a restauração dessafunções e estruturas celulares à normalidade. Um modelo in vitro,que reproduz substancialmente a situação in vivo, em que ascélulas tendo substancialmente a mesma geometria tridimensionale suporte e geometria célula a célula, como em micromeio físicoin vivo, e que sustenta as funções celulares e dos tecidos, quereproduzem a situação in vivo, é proporcionado na presenteinvenção para teste dos efeitos dos compostos biologicamenteativos, e, portanto, caracterizam o mesmo.

De preferência, ao mesmo tempo em que aeficiência de um composto biologicamente ativo está sendotestada, a toxicidade para as células e/ou tecido alvo, bem comooutros tecidos não relacionados, que podem ser também expostosao medicamento e que podem também ser cultivados paramelhorar a fidelidade in vitro, pode ser também testada pelosmétodos da presente invenção. De preferência, o tecido e ascélulas funcionando anormalmente podem ser cultivados de modosimilar em uma cultura tridimensional de um biorreator rotativo,para avaliação da eficiência potencial do compostobiologicamente ativo contra o alvo patogênico, tal como, mas nãolimitado a, tecido transformado malignamente (canceroso).Alguns compostos biologicamente ativos preferidos, que podemser testados contra tecido maligno, incluem, mas não sãolimitados a, agentes quimioterapêuticos, radioterapêuticos,antimetastáticos, de privação de vasculatura de tumor e denanopartículas. Também, de preferência, as linhas celulareshíbridas podem ser testadas pelos métodos da presente invenção.

É notável que o futuro parece altamentepromissor para as modalidades de tratamento com nanopartículas(por meio do termo "nanopartículas", quer-se mencionarpartículas bioativas artificiais) (para câncer, bem como correçãode estado de doença não transformada) e o desenvolvimentodessas vai ser dependente da cultura de tecido precisa em modelosin vitro (ambos doentes e normais). De preferência, portanto, oscompostos biologicamente ativos que são dirigidos para teste dasfunções de nanopartículas, incluindo, mas não limitadas a, asseguintes funções de residência, identificação de alvo, aderência,admitância, intervenção de partículas direta, funções de partículassecundárias tais como liberação de medicamento, tempo de vidaútil / ciclo de partículas, e depuração, podem ser testadas peloprocesso de expansão da presente invenção em um biorreatorrotativo. De preferência, os híbridos que consistem de vírusalterado, para satisfazer os objetivos terapêuticos, podem sertestados de forma similar.

A presente invenção também proporciona ummétodo de testar, de preferência, os mecanismos de modular,alterar ou corrigir farmacologicamente a renovação e odesenvolvimento diferencial de células tronco ao longo de rotasdirigidas para tanto renovar um conjunto de células tronco (oucélulas progenitoras), quanto produzir o tecido desejado (oulinhagem progenitora envolvida) de células tronco. A presenteinvenção proporciona, em uma concretização preferida, ummétodo para expandir precisamente células tronco in vitro,enquanto mantendo, ao mesmo tempo, a mesma geometriatridimensional, suporte e geometria de célula a célula, comoencontradas in vivo. Nessa concretização preferida, uma culturatridimensional tendo células tronco, que podem ser testadas para aresposta delas a mecanismos de controle de contato direto esolúveis, também podem ser preferivelmente testadas para usoclínico indireto, tal como determinação de qualidade de implante.Para ilustrar a ampla aplicabilidade da presente invenção, algumasconcretizações preferidas adicionais incluem o teste dedesempenho diurético e toxicidade renal em túbulos de pulmão ecomplexos matrizes; respostas a tratamentos de controle depressão sangüínea em músculo liso expandido em um biorreatorrotativo; e teste de compostos biologicamente ativos em modelosauto-imunes.

A presente invenção é bem adaptada paraconduzir os objetos e obter as finalidades e vantagensmencionados no presente relatório descritivo, bem como aquelesinerentes a eles. Sem afastar-se do âmbito da invenção,intenciona-se que todo o conteúdo contido no presente relatóriodescritivo seja interpretado como ilustrativo e não limitante. Vaiser evidente para aqueles versados na técnica que váriasmudanças podem ser feitas na invenção, sem que se afaste dosespírito e âmbito dela, e, portanto, a invenção não é limitada peloque está envolvido nos desenhos e relatório descritivo, masapenas como indicado nas reivindicações em anexo.

MÉTODO OPERACIONAL

Em operação, um biorreator rotativo tendo, depreferência, uma câmara de cultura de 15 mL a cerca de 2 L, écompletamente enchida com o meio de cultura adequado, depreferência, suplementado com albumina (5%) e também, depreferência, G-CSF para células humanas a serem expandidas,com espaço apenas para quaisquer volumes adicionaisintencionados de meio de cultura, células, compostosbiologicamente ativos, e/ou outros componentes preferidos domeio de cultura da cultura tridimensional intencionada. Depreferência, , uma incubadora de meio físico controlado circundacompletamente o biorreator rotativo, e é, de preferência, ajustadapara cerca de 5% de CO2 e cerca de 21% de oxigênio, e atemperatura é, de preferência, de cerca de 26 a cerca de 410C, e,particularmente, cerca de 37 ± 2°C. De preferência, o biorreatorrotativo pode ter também um termômetro, um aquecedor, econtrole de ar (incluindo controle de CO2, O2 e/ou nitrogênio)integrais.

Inicialmente, um meio físico de culturaestabilizado é criado no meio de cultura. A rotação pode, depreferência, começar a cerca de 10 rpm. Dez rpm é a taxapreferida que produz uma trajetória orbital de microconta veículo,na qual as contas vão se acumular consideravelmente nas paredesda câmara, ou por sedimentação induzida pela gravidade ou porcentrifugação induzida por rotação. Desse modo, o biorreatorrotativo produz os gradientes de velocidade de fluido e tensões decisalhamento mínimos na cultura tridimensional.

Se vão ser usados substratos para fixação decélulas, os substratos para fixação de células são, de preferência,introduzidos simultânea ou seqüencialmente com as células nacâmara de cultura, para propiciar uma densidade adequada, depreferência, 5 mg de substrato para fixação de células por mL demeio de cultura, e, de preferência, o substrato para fixação decélulas para as células dependentes de ancoragem sãomicrocontas veículos. A mistura celular é, de preferência, injetadano meio físico de cultura estabilizado, para iniciar uma culturatridimensional pela abertura na câmara de cultura, de preferência,por um curto período de tempo, de preferência, 2 minutos, demodo a minimizar o dano celular, enquanto passando pelo sistemade transferência. De preferência, a mistura celular e/ou o substratopara fixação de células, se usado, são transferidos por umaseringa.

Após a injeção das células estar completa, acâmara de cultura é rapidamente retornada para a rotação inicialem torno de um eixo substancialmente horizontal, de preferência,em menos de um (1) minuto, de preferência, a 10 rpm, dessemodo, retornando a tensão de cisalhamento do fluido para o nívelmínimo obtenível para as células. Durante as fases de carga efixação iniciais, as células são deixadas equilibrar por um curtoperíodo de tempo, de preferência, de 2 horas a 4 horas,particularmente, por um tempo suficiente para que os fluxostransientes sejam amortecidos.

O composto biologicamente ativo a ser testadona presente invenção é introduzido na cultura tridimensionalantes, durante e/ou depois de expansão das células. O método deintrodução do composto biologicamente ativo vai depender daforma na qual o composto biologicamente ativo está (isto é,gasosa, líquida ou sólida), e também da abertura pela qual ocomposto biologicamente ativo vai ser introduzido na câmara decultura. Além do mais, a concentração vai também depender doteste preferido, para ser finalmente conduzido e do resultadodesejado do composto biologicamente ativo.

Na medida em que a expansão da culturatridimensional progride, espera-se que o tamanho e a taxa desedimentação das células reunidas aumentem, dependendo doefeito de um composto biologicamente ativo, e as velocidades derotação do sistema podem ser aumentadas (aumentando emincrementos de, de preferência, cerca de 1 a 2 rpm), para reduzir adistorção orbital induzida gravitacionalmente das linhas decorrente circulares ideais dos pedaços de tecidos de diâmetrosentão aumentados. Dependendo dos efeitos do compostobiologicamente ativo, as células reunidas, ou a massa celular,pode aumentar ou diminuir em tamanho. De qualquer modo, avelocidade de rotação da cultura tridimensional pode precisar serajustada, para impedir colisão com a parte interna do biorreatorrotativo. Os impactos nas paredes não são preferidos, embora,sejam possíveis. Um biorreator rotativo, no entanto, proporcionapara que qualquer impacto, se algum, seja um impacto energéticosuficientemente baixo, de modo que não perturba a culturatridimensional quiescente.

Durante a expansão, a velocidade rotacional dacultura tridimensional na câmara de cultura pode ser determinadae ajustada, de modo que as células na cultura tridimensional semantenham substancialmente no ou em torno do eixo horizontal.Aumentando-se a velocidade rotacional, quer-se impedir umimpacto nas paredes excessivo, que é prejudicial para ocrescimento tridimensional adicional da estrutura delicada. Porexemplo, um aumento na rotação é preferido, se as células nacultura tridimensional caírem excessivamente para dentro e parafora no lado descendente do ciclo de rotação, e excessivamentepara fora e insuficientemente para cima no lado ascendente dociclo de rotação. Otimamente, o usuário é advertido paraselecionar, de preferência, uma velocidade rotacional quepromova uma freqüência e uma intensidade de colisão nasparedes mínimas, de modo a manter a geometria tridimensional, osuporte célula a célula e a geometria de célula a célula das células.A velocidade preferida da presente invenção é de cerca de 2 acerca de 30 rpm e, particularmente, de cerca de 10 a cerca de 30rpm.A cultura tridimensional pode ser, depreferência, determinada visualmente pela câmara de culturapreferivelmente transparente e ajustada manualmente. Asdeterminação e ajuste da cultura tridimensional também podemser automatizados por um sensor (por exemplo, um laser), quemonitora a localização das células dentro da câmara de cultura.Uma leitura de sensor indicando muito movimento celular vaiprovocar automaticamente um mecanismo para ajustar,conseqüentemente, a velocidade rotacional.

Após a carga inicial da mistura celular e, depreferência, a fase de fixação, se substratos para fixação decélulas são utilizados (2 a 4 horas), em uma concretizaçãopreferida da presente invenção, a fonte de TVEMF é ligada eajustada de modo que a saída de TVEMF gere o campoeletromagnético desejado na cultura tridimensional, na câmara decultura. A TVEMF pode ser também, de preferência, aplicada àcultura tridimensional, durante a carga e a fase de fixação iniciais.

E preferível que a TVEMF seja suprida à cultura tridimensionalpela duração do tempo de expansão, até que este seja terminado.

O tamanho da bobina eletricamente condutora, eo número de vezes em que é enrolada em torno da câmara decultura do biorreator de TVEMF rotativo são tais, que quandouma TVEMF é suprida à bobina eletricamente condutora, umaTVEMF é gerada dentro da cultura tridimensional na câmara decultura do biorreator de TVEMF rotativo. A TVEMF éselecionada, de preferência, de uma das seguintes: (1) umaTVEMF com uma amplitude de força inferior a 100 gauss e umataxa de virada superior a 1.000 gauss por segundo; (2) umaTVEMF com uma onda quadrada bipolar de baixa amplitude deforça, a uma freqüência inferior a 100 Hz; (3) uma TVEMF comuma onda quadrada bipolar de baixa amplitude de força, com umciclo de atividade de 100%; (4) uma TVEMF com taxas de viradasuperiores a 1.000 gauss por segundo, para durações de pulsoinferiores a 1 ms; (5) uma TVEMF com pulsos na forma defunções delta bipolares de taxa de virada com um ciclo deatividade inferior a 1%; (6) uma TVEMF com uma amplitude deforça inferior a 100 gauss pico a pico e pulsos em forma defunções delta bipolares com taxa de virada e em que o ciclo deatividade é inferior a 1%; (7) uma TVEMF aplicada por uso deuma bobina de solenóide, para criar uma intensidade de forçauniforme por toda a mistura celular; e (8) uma TVEMF aplicadautilizando um concentrador de fluxo, para proporcionar gradientesespaciais de fluxo magnético e foco de fluxo magnético dentro damistura celular. A faixa de freqüências na oscilação daintensidade de força eletromagnética é um parâmetro que pode serselecionado para obter a estimulação desejada das células nacultura tridimensional. No entanto, esses parâmetros não sãomencionados para serem limitantes para a TVEMF da presenteinvenção, e, como tal, podem variar com base em outros aspectosdesta invenção. A TVEMF pode ser medida, por exemplo, pormeio de equipamento usual, tal como um medidor Cell SensorGauss EN131.A rápida expansão celular e a demandametabólica total podem precisar da adição intermitente decomponentes preferidos, enriquecendo o meio de cultura nacultura tridimensional, incluindo, mas não limitado a, nutrientes,meio de crescimento fresco, fatores de crescimento, hormônios ecitocinas. Essa adição é preferivelmente aumentada quandonecessário para manter os níveis de glicose e de outros nutrientes.Durante a rápida expansão das células e do tecido no biorreatorrotativo, o meio de cultura, compreendendo o refugo pode ser, depreferência, removido, quando necessário. As amostras docomponente biológico também podem ser removidas da culturatridimensional a ser testada, e a rotação da câmara de cultura podeser interrompida temporariamente para permitir o manuseioprático. A cultura tridimensional pode ser, de preferência, deixadaprogredir além do ponto no qual é possível selecionar as órbitascelulares excelentes; em um ponto no qual a gravidade introduziulimitações que de algum modo degradam o desempenho emtermos de uma cultura tridimensional de baixo cisalhamento.Além do mais, após expansão, as células podem ser usadas parafins terapêuticos, incluindo a regeneração de tecido, pesquisa etratamento de doença.

Os exemplos apresentados a seguir sãoilustrações preferidas da invenção, mas não são intencionadaspara limitarem a invenção a eles.EXEMPLO 1 - EXPANSÃO DE CÉLULASTRONCO ADULTAS E DE UM COMPOSTOBIOLOGICAMENTE ATIVO

Preparação

Uma câmara de cultura de 75 mL de umbiorreator rotativo, ilustrada na concretização preferida dasFiguras 1 e 2, pode ser preparada, de preferência, por lavagemcom solução desinfetante detergente e germicida (Roccal II), naconcentração recomendada para desinfecção e limpeza, seguidapor enxaguadura abundante e embebimento com água deionizadade alta qualidade. O biorreator rotativo pode ser esterilizado emautoclave, depois enxaguado mais uma vez com meio de cultura.Se uma câmara de cultura descartável de um biorreator rotativo éutilizada, então, de preferência, a câmara de cultura descartável jáestá esterilizada e precisa, meramente, ser removida de qualquerembalagem e montada no motor. Para a concretização preferidatendo uma bobina eletricamente condutora, a bobinaeletricamente condutora é conectada à fonte de TVEMF dobiorreator rotativo.

Expansão de células tronco de sangue periférico

O biorreator rotativo pode ser preferivelmentecheio com meio de cultura, que consiste de meio Dulbeccomodificado por Isocove (IMDM) (GIBCO, Grand Island, NY),suplementado com 5% de albumina humana, 100 ng/mL de G-CSF humana recombinante (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) e100 ng/mL de fator de célula tronco humana recombinante (SCF)(Amgen). Além disso, ácido D-penicilamina [D(-)-2-amino-3-mercato-3-metilbutonóico] (Sigma-Aldrich), um agente quelantede cobre, dissolvido em DMSO, pode ser, de preferência,introduzido no meio de cultura no biorreator rotativo, em umaproporção de 10 ppm. As células tronco adultas de sangueperiférico (CD34+/-CD38-) podem ser colocadas preferivelmentena câmara de cultura do biorreator rotativo, a uma concentraçãode 0,75 χ IO6 células / mL. De preferência, a câmara de cultura éequilibrada antes da mistura celular ser colocada nela. Se umcircuito fechado de fluxo de meio de cultura for utilizado, comoilustrado na concretização preferida na Figura 3, então aequilibração do meio de cultura é também preferível, para criarum meio físico de cultura estabilizado. O meio físico de culturaestabilizado proporciona níveis de tensão de cisalhamentosubstancialmente baixos para a adição da mistura celular.

O motor deve ser ligado, de preferência, a umavelocidade de aproximadamente 30 rpm. Se a câmara de cultura eo meio de cultura nela tiverem sido equilibrados, a velocidade derotação deve ser retornada lentamente para a velocidade derotação preferida. A rotação do biorreator rotativo pode ser, depreferência, determinada todos os dias e ajustada para manter arotação a uma velocidade que impeça impacto nas paredes emanter as células da cultura tridimensional substancialmente nomeio da câmara de cultura. A fonte de TVEMF também pode ser,de preferência, ligada na faixa de gauss e oscilação preferida,preferivelmente de cerca de 1 mA a cerca de 1.000 mA. Aexpansão deve ser, de preferência, foi deixada prosseguir por setedias e depois terminada, em cujo momento, as células foramtestadas.

Amostras e resultados

Pelo menos duas amostras de células tronco desangue periférico devem ser preferivelmente expandidas nobiorreator rotativo, sob as condições mencionadas acima. Aamostra 1 deve ser expandida por sete dias e depois ter a suaviabilidade determinada por uso de microscópio. Espera-se que ascélulas na primeira se mantenham saudáveis e multiplicadas. Umcomposto biologicamente ativo deve ser, de preferência,introduzido na amostra 2, no início da cultura tridimensional. Ocomposto biologicamente ativo pode ser, de preferência, bactériasde Pseudomonas aeruginosa a 3 ppm. As condições de expansãoentre as amostras 1 e 2, diferentes das bactérias, devem ser, depreferência, as mesmas. Após sete dias, as culturas experimentaisdevem ser terminadas e a viabilidade das células determinadascom microscópio. Espera-se que o exame microscópico reveleque as células da amostra 2, contendo um compostobiologicamente ativo bacteriano, sejam mortas, enquanto que ascélulas na amostra 1 vão ficar viáveis e saudáveis. Essesresultados prevêem que essa bactéria preferida vai ficarprovavelmente tóxica, se deixada entrar na corrente de sangueperiférico. A viabilidade das células pode ser determinada porqualquer método conhecido e aceito conhecido na técnica.EXEMPLO 2 - EXPANSÃO DE CÉLULASRENAIS DE RATOS E DE UM COMPOSTOBIOLOGICAMENTE ATIVO

Preparação

O biorreator rotativo deve ser preparado comoindicado no Exemplo 1 acima.

Expansão de células renais de ratos

Células renais de ratos podem ser, depreferência, isoladas de córtex renal colhido de ratos SpragueDawley (Harlan Sprage-Dawley, Cleveland, Ohio) que sofrerameutenia. Em suma, o córtex renal pode ser dissecado com tesoura,picado finamente em um tampão de células renais de 137 mmolde NaCl, 5,4 mmol de KCl, 2,8 mmol de CaCl2, 1,2 mmol deMgCl2, 10 mmol de HEPES-Tris, pH de 7,4. O tecido picadopode ser, de preferência, colocado em 10 mL de uma solução decolagenase do tipo IV a 0,1% e tripsina a 0,1%, em solução salinanormal. A solução contendo o tecido pode ser, de preferência,incubada em um banho de água a 37°C em sacudimento, por 45minutos com titulação intermitente. As células podem ser, depreferência, colocadas em uma centrífuga e centrifugadascuidadosamente (800 rpm por 5 minutos), o sobrenadanteaspirado, as células ressuspensas em 5 mL de tampão de célulasrenais com soro bovino a 0,1%, e passadas por uma malha fina(70 mm). A fração passando pela malha pode ser, de preferência,estratificada por um gradiente descontínuo de 5% de albuminabovina sérica e centrifugada cuidadosamente (800 rpm por 5minutos). O sobrenadante deve ser de novo descartado, deixandouma pelota de células de células renais de ratos. Nesse ponto, ascélulas podem ser, de preferência, congeladas (de preferência, a -80°C, particularmente, em nitrogênio líquido), como necessáriopara uso futuro.

A pelota de células renais de ratos pode ser, depreferência, ressuspensa em meio DMEM/F-12 (tratado comciprofloxacina e fungizona), em uma concentração que éaproximadamente 1 χ IO6 células / mL. Pelo menos duas amostrasde células (1 χ IO6 células / mL) são preferivelmente expandidasna câmara de cultura de um biorreator rotativo. O biorreatorrotativo deve ser colocado em uma incubadora com 5% de CO2 e95% de O2, ou ter uma atmosfera de temperatura e ar integralajustada nele. As células renais de ratos deve ser, de preferência,expandida por 7 dias.

Amostras e resultados

A amostra 1 das células renais de ratos deve serexpandida sem quaisquer aditivos, incluindo quaisquer compostosbiologicamente ativos. Um composto biologicamente ativo, 10ppm de plastificante de ftalato de diisoctila, deve ser introduzidona amostra 2, de preferência, no início da cultura tridimensional.Ambas as amostras 1 e 2 devem ter a viabilidade das célulasdeterminada, de preferência, após 7 dias, por métodos conhecidosna técnica, tal como determinação microscópica. Espera-se que ascélulas na amostra 1 se expandam a pelo menos sete vezes a maisdo que quando foram colocadas no biorreator rotativo. Por outrolado, espera-se que a grande parte das células na amostra 2 vámorrer. Esses resultados prevêem que o ftalato de diisoctila ficatóxico, se deixado ser introduzido no corpo e acumular-se nascélulas renais. Diferentemente daquelas para o compostobiologicamente ativo, todas as outras condições são, depreferência, as mesmas para as amostras 1 e 2. Além disso, ascondições de cultura e a rotação do biorreator rotativo devem ser,de preferência, iguais àquelas no Exemplo 1. No entanto, a culturatridimensional é, de preferência, não exposta a uma TVEMFnesse Exemplo 2.

EXEMPLO 3 - EXPANSÃO DE CÉLULASRENAIS DE RATOS E DE UM COMPOSTOBIOLOGICAMENTE ATIVO

Preparação

O biorreator rotativo deve ser preparado comoindicado no Exemplo 1 acima.

Expansão de células renais de ratos, amostras eresultados

No Exemplo 3, o Exemplo 2 deve ser repetido,exceto que na Amostra 2, o plastificante de ftalato de diisoctila é,de preferência, substituído com cisplatina a 10 ppm. O teste é, depreferência, repetido 10 vezes, nas mesmas condições que aquelasno Exemplo 2. Em quase todos os casos, espera-se que as célulasna amostra 1 se mantenham viáveis. Espera-se que com as célulasna amostra 2, e tendo na maior parte dos casos 10 ppm decisplatina, as células renais de ratos vão ficar saudáveis e viáveis.Esses resultados prevêem, portanto, que a adição de 10 ppm decisplatina às células renais de ratos e a expansão delas em umbiorreator rotativo não produzem quaisquer efeitos adversos,sugerindo, basicamente, que a cisplatina pode, de fato, provar serútil em evitar insuficiência renal. Estudos adicionais devem serconduzidos na prevenção de insuficiência renal por uso decisplatina, antes do uso desta sem seres humanos.

EXEMPLO 4 - EXPANSÃO DE CÉLULASTRONCO DE SANGUE PERIFÉRICO E DE UMCOMPOSTO BIOLOGICAMENTE ATIVO

Preparação

O biorreator rotativo deve ser preparado comoindicado no Exemplo 1 acima.

Expansão de células tronco de sangue periféricoO biorreator rotativo pode ser, de preferência,enchido com meio de cultura consistindo de meio Dulbeccomodificado por Isocove (IMDM) (GIBCO, Grand Island, NY),suplementado com 5% de albumina humana, 100 ng/mL de G-CSF humana recombinante (Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) e100 ng/mL de fator de célula tronco humana recombinante (SCF)(Amgen). Além disso, ácido D-penicilamina [D(-)-2-amino-3-mercato-3-metilbutonóico] (Sigma-Aldrich), um agente quelantede cobre, dissolvido em DMSO, pode ser, de preferência,introduzido no meio de cultura no biorreator rotativo, em umaproporção de 10 ppm. As células tronco adultas de sangueperiférico (CD34+/CE38-) podem ser, de preferência, colocadasna câmara de cultura do biorreator rotativo, a uma concentraçãode 0,75 χ IO6 células/mL.

Duas amostras de células tronco de sangueperiférico devem ser, de preferência, preparadas por esse método.A amostra 1 deve ser, de preferência, de um indivíduo semqualquer dano ao fígado conhecido. A amostra 2 deve ser, depreferência, de um indivíduo com dano ao fígado conhecido. Asamostras devem ser preparadas como indicado acima e colocadasem dois diferentes biorreatores rotativos, sob as condiçõesindicadas no Exemplo 1. O composto biologicamente ativo, 20ppm de acetaminofeno, deve ser adicionado à amostra 2, no inícioda cultura tridimensional. Ambas as amostras 1 e 2 devem ser, depreferência, expostas a uma região afilada de cerca de 1 mA acerca de 1.000 mA, como no Exemplo 1, pela duração doprocesso de expansão.

Resultados

De preferência, ao final de 14 dias, cadaviabilidade de amostra deve ser determinada e o número decélulas contado, por exemplo, em um microscópio com umhematocitômetro. Espera-se que as células na amostra 1 seexpandam pelo menos dez vezes o número em que foramcolocadas no biorreator rotativo. Espera-se também que as célulasna amostra 2 nem morram nem cresçam, mas em vez disso, semantenham inalteradas. Mais teste deve ser conduzido paradeterminar os efeitos de expor as células do fígado aacetaminofeno.Espera-se, portanto, que uma expansão celularrápida e significativa seja feita por expansão no biorreator rotativoda presente invenção, como descrito no presente relatóriodescritivo. Espera-se também que a expansão rápida esignificativa seja feita por interações tridimensionais e de célula acélula, para que seja substancialmente similar como em ummicromeio físico in vivo.

Várias alterações podem ser feitas na invenção,sem que se afaste do espírito e do âmbito dela, e, portanto, ainvenção não é limitada pelo que está incluído nos desenhos erelatório descritivo, incluindo os exemplos.

Claims (22)

1. Método de caracterização de um compostobiologicamente ativo, caracterizado pelo fato de quecompreende:- colocar uma mistura celular em um biorreatorrotativo, para iniciar uma cultura tridimensional, em que a culturatridimensional compreende células e um componente biológico;- expandir controlavelmente as células nacultura tridimensional, enquanto que, ao mesmo tempo, as célulasmantêm suas geometria tridimensional e suporte e geometriacélula a célula, por rotação do biorreator rotativo;- introduzir um composto biologicamente ativona cultura tridimensional; e- testar o componente biológico por uso de umteste, para caracterizar o composto farmacêutico.

2. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o componente biológico éselecionado do grupo consistindo de uma célula, uma parte deuma célula, materiais secretados (mucina, colágeno, matriz),hormônios secretados, componentes estruturais intercelularessecretados, matrizes estruturais introduzidas, matrizes deaderência, substratos de crescimento, nanopartículas, sinaissolúveis intercelulares, marcadores superficiais de membranascelulares, enzimas ligadas a membranas, marcadores deidentidade imunes, moléculas de aderência, vacúolos,neurotransmissores armazenados e liberados, maquinárioespecífico interno celular, glicogênio, meios de cultura,compostos em teste, toxinas suspeitas em teste, reagentes emteste, fungos, complexos conjugados, tecido, enzimas, DNA,RNA, vírus, proteína, partículas bioativas artificiais e um gene.

3. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o biorreator rotativo compreendeuma parede de câmara de cultura rotativa e em que uma parte dacultura tridimensional é fixada com relação à parede de câmara decultura rotativa.

4. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a etapa de expansão controladadas células compreende ainda a exposição das células a uma forçaeletromagnética variável com o tempo ("TVEMF").

5. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as células são expandidas a pelomenos sete vezes o número que foram colocadas no biorreatorrotativo.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou-4, caracterizado pelo fato de que as células são selecionadas degrupo consistindo de eucarioto, procarioto, animal, fungo, planta,células funcionando anormalmente, células contendonanopartículas, células híbridas, híbridos de células contendovírus alterado.

7. Método de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que as células de animais são célulastronco de mamíferos adultos.

8. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o teste é para pelo menos um dogrupo consistindo de qualidade de enxerto, toxicidade, eficiência,patologia, tumorosidade, expressão genética, cariótipo,características de taxa de crescimento, morfologia multicelular,morfologia celular individual, relações intercelulares, medidasmetabólicas, uma parte de um ciclo de vida viral, desempenhodiurético, toxicidade renal, controle de pressão sangüínea efunções de nanopartículas.

9. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o composto biologicamente ativoé em uma forma selecionada de um grupo consistindo de pó,líquido, vapor e gás.

10. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o composto biologicamente ativoé pelo menos um selecionado do grupo consistindo de umaproteína, pelo menos uma célula, uma toxina, um reagente, umasubstância química, um gás, um metal, um compósito de metais,radiação, pelo menos uma nanopartícula, pelo menos um vírus,uma proteína, antibacteriano, eletroporação, poração química, umderivado ativado de uma célula imune, e água.

11. Método de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o teste é para caracterização depelo menos um selecionado do grupo consistindo de mecanismosde modulação farmacológica de renovação de células tronco,alteração de renovação de células tronco, correção de renovaçãode células tronco, modulação farmacológica de diferenciação decélulas tronco, e correção de diferenciação de células tronco.

12. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o biorreator rotativo é girado auma velocidade de cerca de 1 revolução por minuto a cerca de-120 revoluções por minuto.

13. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o biorreator rotativo é girado auma velocidade de cerca de 2 revoluções por minuto a cerca de 30revoluções por minuto.

14. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o composto biologicamente ativoé introduzido antes da etapa de expansão controlada das células.

15. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o composto biologicamente ativoé introduzido durante a etapa de expansão controlada das células.

16. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o componente biológico é testadoantes da colocação da mistura celular no biorreator rotativo.

17. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o componente biológico é testadodurante a etapa de expansão controlada das células.

18. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o componente biológico é testadoapós a etapa de expansão controlada das células.

19. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o componente biológico é testadodurante e após a etapa de expansão controlada das células.

20. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o componente biológico é testadoantes, durante e após a etapa de expansão controlada das células.

21. Método de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende o uso do componentebiológico para enxerto de tecido de mamífero.

22. Método de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que a TVEMF é selecionado a partirdo grupo consistindo em uma TVEMF com uma amplitude deforça inferior a 100 gauss e uma taxa de virada superior a 1.000gauss por segundo, uma TVEMF com uma onda quadrada bipolarde substancialmente baixa amplitude de força, a uma freqüênciainferior a 100 Hz., uma TVEMF com uma onda quadrada desubstancialmente baixa amplitude de força com menos de 100%de ciclo de atividade, uma TVEMF com taxas de viradasuperiores a 1.000 gauss por segundo, para duração de pulsosinferiores a 1 ms., uma TVEMF com pulsos similares a umafunção delta bipolar de taxa de virada com um ciclo de atividadeinferior a 1%, uma TVEMF com uma amplitude de força inferiora 100 gauss pico a pico e pulsos similares a uma função deltabipolar de taxa de virada, e em que o ciclo de atividade é inferiora 1%, uma TVEMF aplicada usando uma bobina de solenóide,para criar uma intensidade de força uniforme por toda a culturatridimensional, e uma TVEMF aplicada utilizando umconcentrador de fluxo para proporcionar gradientes espaciais defluxo magnético e foco de fluxo magnético dentro da culturatridimensional.