BRPI0616871A2 - improved methods and means for producing hyaluronan - Google Patents

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BRPI0616871A2
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hyaluronan
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BRPI0616871-0A
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Portuguese (pt)
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Bernd Essigmann
Claus Frohberg
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Bayer Cropscience Ag
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MéTODOS APERFEIçOADOS E MEIOS PARA PRODUZIR HIALURONAN. A presente invenção refere-se a células vegetais e plantas que sintetizam um aumento na quantidade de hialuronan, e a métodos para preparação dessas plantas, e também a métodos para preparação de hialuronan com o auxílio dessas células vegetais ou plantas. Aqui, células vegetais ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção apresentam atividade de hialuronan sintase e adicionalmente um aumento na atividade de glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) e um aumento na atividade de UDP glicose desidrogenase (UDP-Glc-DH), comparada com células vegetais do tipo selvagem ou plantas do tipo selvagem. A presente invenção além disso refere-se ao uso de plantas que apresentam aumento na síntese de hialuronan para preparação de hiaíuronan e a gêneros alimentícios ou rações para animais contendo hialuronan.IMPROVED METHODS AND MEANS TO PRODUCE HIALURONAN. The present invention relates to plant cells and plants that synthesize an increase in the amount of hyaluronan, and to methods for preparing these plants, and also to methods for preparing hyaluronan with the aid of those plant or plant cells. Here, plant cells or plants genetically modified according to the invention show hyaluronan synthase activity and additionally an increase in glutamine activity: fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT) and an increase in UDP glucose dehydrogenase activity (UDP-Glc-DH ) compared to wild-type plant cells or wild-type plants. The present invention furthermore relates to the use of plants which show an increase in hyaluronan synthesis for the preparation of hyaluronan and to foodstuffs or animal feed containing hyaluronan.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSAPERFEIÇOADOS E MEIOS PARA PRODUZIR HIALURONAN".Descriptive Report of the Invention Patent for "PERFECT METHODS AND MEANS OF PRODUCING HYALURONAN".

A presente invenção refere-se a células vegetais e plantas quesintetizam uma quantidade elevada de hialuronan, e a métodos de prepara-ção desses vegetais, e também a métodos de preparação de hialuronan como auxílio dessas células vegetais ou plantas. Aqui, células vegetais ou plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção apresentam ativi-dade de hialuronan sintase e adicionalmente um aumento na atividade deglutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) e um aumento na ativi- dade de UDP glicose desidrogenase (UDP-GIc-DH), comparada com célulasvegetais do tipo selvagem ou vegetais do tipo selvagem. A presente inven-ção além disso refere-se ao uso de plantas que apresentam aumento de sín-tese de hialuronan para preparação de hialuronan e alimentos ou comidapara animais rações contendo hialuronan.The present invention relates to plant cells and plants which synthesize a high amount of hyaluronan, and methods of preparing such plants, and also methods of preparing hyaluronan as an aid to such plant cells or plants. Here, genetically modified plant or plant cells according to the invention exhibit hyaluronan synthase activity and additionally an increase in deglutamine activity: fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT) and an increase in UDP glucose dehydrogenase activity ( UDP-GIc-DH) compared to wild type vegetable cells or wild type plant cells. The present invention furthermore relates to the use of plants which exhibit increased synthesis of hyaluronan for preparation of hyaluronan and food or feed for hyaluronan containing feeds.

Hialuronan é um mucopolissacarídeo (glicosaminoglicano) linearnão-ramifiçado que ocorre naturalmente que é construído de moléculas al-ternadas de ácido glicurônico e N-acetil-glicosamina. O bloco de construçãobásico de hialuronan consiste do ácido glicurônico dissacarídeo-beta-1,3-N-acetil-glicosamina. No hialuronan, essas unidades de repetição são ligadas20 umas com as outras, via ligações beta-1,4. Na farmácia, uso é freqüente-mente feito do termo ácido hialurônico. Uma vez que hialuronan está namaioria dos casos presente como um poliânion e não como o ácido livre, aseguir, o termo hialuronan é preferencialmente usado, mas cada termo deve-se entender como abrangendo ambas as formas moleculares.Hyaluronan is a naturally occurring branched-branched mucopolysaccharide (glycosaminoglycan) that is constructed of altered molecules of glucuronic acid and N-acetyl glycosamine. The hyaluronan basic building block consists of disaccharide glucuronic acid beta-1,3-N-acetyl glycosamine. In hyaluronan, these repeating units are linked together via beta-1,4 bonds. In pharmacy, use is often made of the term hyaluronic acid. Since hyaluronan is in most cases present as a polyanion and not as free acid, therefore, the term hyaluronan is preferably used, but each term should be understood to encompass both molecular forms.

Hialuronan apresenta propriedades físico-químicas notáveis, taiscomo, por exemplo, propriedades de polieletrólitos, propriedades viscoelásti-cas, uma alta capacidade de ligar-se em água, propriedades de formaçãoem gel, que, além de de propriedades adicionais de hialuronan, são descri-tas em um artigo de revisão por Lapcik e outros (1998, Chemical Reviews98(8), 2663-2684).Hyaluronan exhibits remarkable physicochemical properties, such as, for example, polyelectrolyte properties, viscoelastic properties, a high water-binding ability, gel-forming properties, which, in addition to the additional properties of hyaluronan, are described. in a review article by Lapcik et al. (1998, Chemical Reviews98 (8), 2663-2684).

Hialuronan é um componente de tecido conectivo extracelular efluídos corpóreos de vertebrados. Em humanos, ácido hialurônico é sintetizadopela membrane cellular de todas as células do corpo, especialmente célulasmesenquimatosas, e ubiquamente presentes no corpo com uma concentra-ção particularmente alta nos tecidos conectivos, a matriz extracelular, o cor-dão umbilical, o fluido articular, o tecido cartilaginòso, a pele e o corpo vítreodo olho (Bernhard Gebauer, 1998, Inaugural-Dissertation, Virchow-KlinikumMedizinische Fakultãt Charité der Humboidt Universitàt zu Berlirr, Fraser eoutros, 1997, Journal of Internai Medicine 242, 27-33).Hyaluronan is a component of extracellular connective tissue efflected from vertebrates. In humans, hyaluronic acid is synthesized by the cellular membrane of all body cells, especially mesenchymal cells, and ubiquitously present in the body with a particularly high concentration in the connective tissues, the extracellular matrix, the umbilical cord, the joint fluid, the cartilage tissue, skin and vitreous body of the eye (Bernhard Gebauer, 1998, Inaugural Dissertation, Virchow-KlinikumMedizinische Fakultät Charité der Humboidt Universitàt zu Berlirr, Fraser et al., 1997, Journal of Internal Medicine 242, 27-33).

Recentemente, hialuronan foi também encontrado em organis-mos animais não-vertebrados (moluscos) (Volpi e Maccari, 2003, Biochimie85, 619-625). Além disso, algumas bactérias gram-positivas patogênicas(Streptococcus grupo A e C) e bactérias gram-negativas (PasteurelIa) sinte-tizam hialuronan como exopolissacarídeos que protegem essas bactériascontra ataque pelo sistema imune de seu hospedeiro, uma vez que hialuro-nan é uma substância não-imunogênica.Recently, hyaluronan has also been found in non-vertebrate animal organisms (mollusks) (Volpi and Maccari, 2003, Biochimie85, 619-625). In addition, some pathogenic gram-positive bacteria (Streptococcus group A and C) and gram-negative bacteria (PasteurelIa) synthesize hyaluronan as exopolysaccharides that protect these bacteria from attack by their host immune system, since hyaluro-nan is a non-immunogenic substance.

Vírus que infectam algas verdes de célula única do gênero Chlo-rella, algumas das quais estão presentes como endosimbiontes em espéciesParameeium, concede a algas verdes de célula única a capacidade de sinte-tizar hialuronan após infecção pelo vírus (Graves e outros, 1999, Virology257, 15-23). Contudo, a capacidade de sintetizar hialuronan não é um as-pecto que caracteriza as algas em questão. A capacidade das algas sinteti-zar hialuronan é mediada por uma infecção com um vírus cujo genoma a-presenta uma seqüência de codificação de hialuronan sintase (DeAngelis,1997, Science 278, 1800-1803). Além disso, o genoma viral contém seqüên-cias de codificação de uma UDP-glicose desidrogenase (-UDP-GIc-DH) euma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT). UDP-GIc-DH ca-talisa a síntese de UDP-ácido glicurônico usado como substrato por hialuro-nan sintase. GFAT converte frutose 6-fosfato e glutaminaem glicosamina 6-fosfato que é um importante metabólito no caminho metabólico de síntese dehialuronan em, por exemplo, bactéria. Ambos os genes de algas codificamproteínas ativas que, tal como o hialuronan sintase do vírus, são transcritossimultaneamente na fase prematura da infecção viral <DeAngelis e outros,1997, Science 278, 1S00-1S03, Graves e outros, 1999, Virology 257, 15-23).A atividade de uma proteína que apresenta atividade glutaminaifrutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) pôde ser detectada nem em extratos decélulas não infectadas por um vírus nem em células infectadas por vírus(Landstein e outros, 1998, Virology 250, 388-396). Conseqüentemente, opapel da expressão de UDP-GIc-DH e GFAT em células Chlorella infectadaspor vírus para a síntese de hialuronan, e quer elas são exigidas para síntesede hialuronan, não é conhecido.Viruses that infect single cell green algae of the genus Chlo-rella, some of which are present as endosymbionts in Parameeium species, give single cell green algae the ability to synthesize hyaluronan following virus infection (Graves et al., 1999, Virology257 , 15-23). However, the ability to synthesize hyaluronan is not an aspect that characterizes the algae in question. The capacity of hialuronan synthesizing algae is mediated by infection with a virus whose genome has a coding sequence for hialuronan synthase (DeAngelis, 1997, Science 278, 1800-1803). In addition, the viral genome contains coding sequences for a UDP-glucose dehydrogenase (-UDP-GIc-DH) and a glutamine: fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT). UDP-GIc-DH catalyzes the synthesis of UDP-glucuronic acid used as a substrate by hyaluro nan synthase. GFAT converts fructose 6-phosphate and glutamine to glycosamine 6-phosphate which is an important metabolite in the metabolic pathway of dehialuronan synthesis in, for example, bacteria. Both algal genes encode active proteins that, like virus hyaluronan synthase, are transcribed simultaneously in the premature phase of viral infection. <DeAngelis et al., 1997, Science 278, 1S00-1S03, Graves et al., 1999, Virology 257, 15- 23). The activity of a protein that exhibits glutamine-fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT) activity could be detected neither in cell extracts uninfected by a virus nor in cells infected with viruses (Landstein et al., 1998, Virology 250, 388-396 ). Therefore, the role of UDP-GIc-DH and GFAT expression in virus-infected Chlorella cells for hyaluronan synthesis, and whether they are required for hyaluronan synthesis, is not known.

Plantas que ocorrem naturalmente elas próprias não apresen-tam quaisquer ácidos nucléicos em seu genoma que codifica proteínas quecatalisam a síntese de hialuronan -e, -embora um grande número de carboi-dratos vegetais tenha sido descrito e caracterizado, até agora não foi possí-vel detectar hialuronan ou moléculas relacionadas a hialuronan em vegetaisque ocorrem naturalmente não-infectados (Graves e outros, 1999, Virology257,15-23).Naturally occurring plants themselves do not have any nucleic acids in their genome that encodes proteins that catalyze the synthesis of hyaluronan - and - although a large number of plant carbohydrates have been described and characterized, until now it has not been possible. detect hyaluronan or hyaluronan-related molecules in naturally occurring uninfected vegetables (Graves et al., 1999, Virology257,15-23).

A catálise da síntese de hialuronan é efetuada por uma únicaenzima integrada a membrana ou associada à membrana, hialuronan sinta-se. As hialuronan sintases que foram até agora estudadas podem ser classi-ficadas em dois grupos: hialuronan sintases de Classe I e hialuronan sinta-ses de Classe Il (DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Scien- ces 56, 670-682).Catalysis of hyaluronan synthesis is effected by a single membrane-integrated or membrane-associated enzyme, hyaluronan feel. Hyaluronan synthases that have been studied so far can be classified into two groups: Class I hyaluronan synthases and Class II hyaluronan synthases (DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56, 670-682) .

As hialuronan sintases de vertebrados são adicionalmente dis-tinguidas pelas isoenzimas identificadas. As diferentes isoenzimas são refe-ridas na ordem de sua identificação usando números arábicos (por exemplo,hsHASI, hsHAS2, hsHAS3).Vertebrate hyaluronan synthases are further distinguished by the identified isoenzymes. The different isoenzymes are referred to in the order of their identification using Arabic numerals (eg hsHASI, hsHAS2, hsHAS3).

o mecanismo da transferência de moléculas de hialuronan sin-tetizadas através da membrana citoplasma para o meio circunjacente a célu-la não foi ainda totalmente. Hipótese previamente admite-se que transporteatravés da membrana cellular foi efetuado por hialuronan sintase si própria.Contudo, resultados mais recentes indicam que o transporte de moléculasde hialuronan através da membrana citoplasma ocorre por transporte de-pendente de energia via proteínas-de transporte responsável por essa ação.Desse modo, cepas de Streptococcus foram geradas por mutação em que asíntese de uma proteína de transporte ativa foi inibida. Essas cepas sinteti-zaram menos hialuronan do que cepas de bactérias do tipo selvagem cor-respondente (Ouskova e outros, 2004, Glycobiology 14(10), 931-938). Emfibroblastos humanos, foi possível demonstrar, com o auxílio de agentes es-pecificamente que inibem proteínas de transporte conhecidas, que é possí-vel reduzir tanto a quantidade de hialuronan produzida quanto a atividade dehialuronan sintases (Prehm e Schumacher, 2004, Biochemical Pharmaco-logy 68,1401-1410). Nessa quantidade, se de modo algum, não se sabe queproteínas de transporte capazes de transportar hialuronan estão presentesem vegetais.The mechanism of transfer of synthesized hyaluronan molecules across the cytoplasm membrane to the surrounding cell environment has not yet been fully understood. It has previously been hypothesized that transport through the cellular membrane was effected by hyaluronan synthase itself. However, more recent results indicate that the transport of hyaluronan molecules across the cytoplasm occurs by energy-dependent transport via protein-transport responsible for this transport. Thus, Streptococcus strains were generated by mutation in which the synthesis of an active transport protein was inhibited. These strains synthesized less hyaluronan than corresponding wild-type bacterial strains (Ouskova et al., 2004, Glycobiology 14 (10), 931-938). In human fibroblasts, it has been shown, with the aid of agents specifically inhibiting known transport proteins, that it is possible to reduce both the amount of hyaluronan produced and the activity of hyaluronan synthases (Prehm and Schumacher, 2004, Biochemical Pharmaco-logy 68,1401-1410). In this amount, if not at all, it is not known that transport proteins capable of carrying hyaluronan are present in vegetables.

As propriedades incomuns de hialuronan oferecem uma riquezade possibilidades dè aplicação em vários campos, tais còmo, por exemplo,farmácia, a indústria cosmética, na produção de alimentos e rações, em apli-cações técnicas (por exemplo, como lubrificantes), etc. As aplicações maisimportantes onde hialuronan está sendo atualmente usado são no campomédico e cosmético (vide, por exemplo, Lapcik e outros, 1998, Chemical Re-views 98(8), 2663-2684, Goa e Benfield, 1994, Drugs 47(3), 536-566).Hyaluronan's unusual properties offer a wealth of application possibilities in various fields, such as, for example, pharmacy, the cosmetics industry, food and feed production, technical applications (eg as lubricants), etc. The most important applications where hyaluronan is currently being used are in the medical and cosmetic field (see, for example, Lapcik et al., 1998, Chemical Re-views 98 (8), 2663-2684, Goa and Benfield, 1994, Drugs 47 (3). , 536-566).

No campo médico, produtos contendo hialuronan são atualmen-te usados para o tratamento intra-articular de artrose e em oftálmicos usadospara cirurgia do olho. Hialuronan é também usado para tratar distúrbios arti-culares em cavalos de corrida. Além disso, ácido hialurônico é um compo-nente de alguns rinológicos que, por exemplo, na forma de colírios e nasalia,serve para umedecer membranas mucosas secas. Soluções entendo hialu-ronan para injeção são usadas como analgésicos e anti-reumáticos. Emplas-tros que compreendem hialuronan ou derivatidos de hialuronan são empre-gados na cicatrização de ferida. Como dermais, implantes em gel contendohialuronan são usados para corrigir deformações da pele na cirurgia plástica.In the medical field, hyaluronan-containing products are currently used for intra-articular treatment of arthrosis and ophthalmic agents used for eye surgery. Hialuronan is also used to treat joint disorders in racehorses. Furthermore, hyaluronic acid is a component of some rhinological agents which, for example, in the form of eye drops and nasalia, serves to moisten dry mucous membranes. I understand hyialu-ronan injection solutions are used as analgesics and antirheumatics. Plasters comprising hyaluronan or hyaluronan derivatives are employed in wound healing. Likewise, hyaluronan gel implants are used to correct skin deformities in plastic surgery.

Para aplicações farmacológicas, preferência é dada à utilizaçãode hialuronan apresentando um alto peso molecular.For pharmacological applications, preference is given to the use of hyaluronan having a high molecular weight.

Ma medicina cosmética, preparações de hialuronan estão entreos materiais de carga para pele mais adequada. Ao injetar hialuronan, porum período <áe tempo limitado, é possível suavizar rugas ou aumentar o vo-lume de lábios.In cosmetic medicine, hyaluronan preparations are among the most suitable filler materials for skin. By injecting hyaluronan for a limited period of time it is possible to smooth out wrinkles or increase lip volume.

Em produtos cosméticos, em particular, em cremes e loçõespara a pele, hialuronan é freqüentemente usado como hidratante devido asua alta capacidade de ligação em água.In cosmetic products, in particular in skin creams and lotions, hyaluronan is often used as a moisturizer because of its high binding capacity in water.

Além disso, preparações contendo hialuronan são vendidas co-mo supostos nutracêuticos (suplementos alimentícios) que podem ser tam-bém usados em animais (por exemplo cães, cavalos) para a profilaxia e alí-vio de artrose.In addition, hyaluronan-containing preparations are sold as nutraceuticals (food supplements) which can also be used on animals (eg dogs, horses) for prophylaxis and relief of arthrosis.

Hialuronan usado para fins comerciais é atualmente isolado detecidos animais (cristas de galo) ou preparado fermentativamente usandoculturas bacterianas.Hialuronan used for commercial purposes is currently isolated from animal kept (rooster ridges) or fermentatively prepared using bacterial cultures.

US 4.141.973 descreve um processo de isolamento de hialuro-nan de cristas de galo ou alternativamente de cordões umbilicais. Além dehialuronan, tecidos animais (por exempio, cristas de galo. cordões umbili-cais) também contêm adicionalmente mucopolissacarídeos relacionados ahialuronan, tais como sulfato de condroítina, sulfato de dermatano, sulfato dequeratano, sulfato de heparano e heparina. Além disso, organismos animaiscontêm proteínas (hialaderinas) que se ligam especificamente a hialuronan eque são exigidas para as funções mais diferentes no organismo, tais como,por exemplo, a degradação de hialuronan no fígado, a função de hialuronancomo estrutura principal de migração celular, a regulação de endocitose, aancoragem de hialuronan sobre a superfície celular ou a formação de redesde hialuronan (Turley, 1991, Adv. Drug Delivery Rev. 7, 257 ff.; Laurent eFraser, 1992, FASEB J. 6, 183 ff.; Stamenkovic e Aruffo, 1993, MethodsEnzymoL 245,195 ff; Knudson e Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 ff.).US 4,141,973 describes a process of isolating hyaluro-nan from rooster ridges or alternatively umbilical cords. In addition to hyaluronan, animal tissues (eg rooster ridges, umbilical cords) also additionally contain hyaluronan related mucopolysaccharides, such as chondroitine sulfate, dermatan sulfate, dequeratan sulfate, heparan sulfate and heparin. In addition, animaiscal organisms contain proteins (hyaladerins) that specifically bind to hyaluronan and which are required for the most diverse functions in the body, such as, for example, the degradation of hyaluronan in the liver, the function of hyaluronan as the main cell migration structure, endocytosis regulation, hyaluronan cell surface uptake or hyaluronan nets formation (Turley, 1991, Adv. Drug Delivery Rev. 7, 257 ff .; Laurent eFraser, 1992, FASEB J. 6, 183 ff .; Stamenkovic and Aruffo, 1993, MethodsEnzymoL 245,195 (Knudson and Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 ff.).

As cepas de Streptococcus usadas para a produção bacterianade hialuronan são exclusivamente bactérias patogênicas. Durante cultivo,também, essas bactérias produzem exotoxinas (pirogênicas) e hemolisinas(estreptolisina, em particular alfa e beta-hemolisina) (Kilian, M.: Streptoeoe-eus and Enterococcus. In: Medicai Microbiology. Greenwood, D.; Slack1RCA; Peutherer, J.F. (Eds.). Cápitulo 16. Churchill Livingstone, Edinburgh,UK: pp. 174-188, 2002, ISBN 0443070776) que são liberadas para o meio decultura. Isso torna purificação e isolamento do hialuronan preparado com o 'auxílio de cepas de Streptococcus mais difícil. Em particular para aplicaçõesfarmacêuticas, a presença de exotoxinas e hemolisinas nas preparações éum problema.Streptococcus strains used for hyaluronan bacterial production are exclusively pathogenic bacteria. During cultivation, too, these bacteria produce exotoxins (pyrogenic) and hemolysins (streptolysin, in particular alpha and beta-hemolysin) (Kilian, M .: Streptoeoeus and Enterococcus. In: Medical Microbiology. Greenwood, D .; Slack1RCA; Peutherer , JF (Eds.) Chapter 16. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK: pp. 174-188, 2002, ISBN 0443070776) which are released into the culture medium. This makes purification and isolation of hyaluronan prepared with the aid of Streptococcus strains more difficult. In particular for pharmaceutical applications, the presence of exotoxins and hemolysins in the preparations is a problem.

US 4.801.539 descreve a preparação de hialurorian por meio defermentação de uma cepa de bactérias mutagenizadas (Streptococcus zoo-edemicus). A cepa de bactérias mutagenizadas usada não mais sintetizabeta-hemolisina. O rendimento obtido foi de 3,6 g de hialuronan por litro decultura.US 4,801,539 describes the preparation of hyalurorian by defermenting a strain of mutagenized bacteria (Streptococcus zoo-edemicus). The mutagenized bacterial strain used no longer synthesizes beta-hemolysin. The yield obtained was 3.6 g hyaluronan per liter deculture.

EP 0694616 descreve um método de cultivar Streptococcus zo-oedemicus ou Streptococcus equi, em que, sob as condições de cultura em-pregadas, nenhuma estreptolisina, mas quantidades elevadas de hialuronansão sintetizadas. O rendimento obtido foi de 3,5 g de hialuronan por litro decultura.EP 0694616 describes a method of cultivating Streptococcus zo-oedemicus or Streptococcus equi, wherein, under the in-grown culture conditions, no streptolysin, but high amounts of synthesized hyaluronansion. The yield obtained was 3.5 g hyaluronan per liter deculture.

Durante cultivo, cepas de Streptococcus liberam a enzima hialu-ronidase para o meio de cultura, como uma conseqüência de que, nessesistema de produção, também, o peso molecular é reduzido durante purifica-ção. O uso de cepas Streptococcus negativas a hialuronidase ou de méto-dos para a produção de hialuronan em que a produção de hialuronidase du-rante cultivo é inibida são descritos in US 4.782.046. O rendimento obtido foiaté 2,5 g de hialuronan por litro de cultura, e o peso molecular máximo mé-dio obtido foi de 3,8 χ 106 Da, sob uma distribuição de peso molecular de2,4 χ 106 a 4,0 χ 106.Streptococcus strains release hyaluronidase enzyme into the culture medium during cultivation as a consequence of the fact that in this production system, too, the molecular weight is reduced during purification. The use of hyaluronidase-negative Streptococcus strains or methods for hyaluronan production in which hyaluronidase production during cultivation is inhibited is described in US 4,782,046. The yield obtained was 2.5 g hyaluronan per liter of culture, and the average maximum molecular weight obtained was 3.8 χ 106 Da, under a molecular weight distribution of 2.4 χ 106 to 4.0 χ 106 .

US 20030175902 e WO 03 054163 descrevem a preparação de hialuronan com o auxílio de expressão heteróloga de uma hialuronan sintasede Streptococcus equisimilis em Bacillus subtilis. Para obter a produção dequantidades suficientes de hialuronan, além da expressão heteróloga deuma hialuronan sintase, expressão simultânea de uma UDP-glicose desidro-genase nas células de Bacillus é também exigida. US 20030175902 e WO03 054163 não expressam a quantidade absoluta de hialuronan obtida naprodução com o auxílio de Bacillus subtilis. O peso molecular máximo médioobtido foi aproximadamente 4,2 χ 106. Entretanto, esse peso molecular mé-dio foi apenas obtido para a cepa recombinante de Bacillus em que uma co-dificação gênica para o gene de hialuronan sintase de Streptococcus equi-similis e a codificação gênica para a UDP-glicose desidrogenase de Bacillussubtilis foram integrada no genoma de Bacillus subtilis sob o controle dopromotor amyQ, onde ao mesmo tempo o gene cxpY endógeno a Bacillussubtilis (o qual codifica um citocromo P450 oxidase) foi inativado.US 20030175902 and WO 03 054163 describe the preparation of hyaluronan with the aid of heterologous expression of a Streptococcus equisimilis hyaluronan synthase in Bacillus subtilis. To obtain sufficient amounts of hyaluronan, in addition to the heterologous expression of a hyaluronan synthase, simultaneous expression of a UDP-glucose dehydrogenase in Bacillus cells is also required. US 20030175902 and WO03 054163 do not express the absolute amount of hyaluronan obtained in production with the aid of Bacillus subtilis. The mean maximum molecular weight obtained was approximately 4.2 χ 106. However, this average molecular weight was only obtained for the recombinant Bacillus strain in which a gene co-complication for the Streptococcus equi-similis hyaluronan synthase gene and gene coding for Bacillussubtilis UDP-glucose dehydrogenase were integrated into the Bacillus subtilis genome under the control of the amyQ dopromotor, where at the same time the endogenous cxpY gene Bacillussubtilis (which encodes a cytochrome P450 oxidase) was inactivated.

WO 05 012529 descreve uma preparação de plantas transgêni-cas de tabaco que foram transformadas usando moléculas de ácido nucléicoque codificam hialuronan sintases de vírus infectantes Chlorella. In WO 05012529, fez-se uso, por outro lado, de seqüências de ácido nucléico que co-dificam hialuronan sintase da cepa CVHI1 de vírus Chlorella e, por outro la-do, da cepa CVKA1 do vírus Chlorella para transformação de plantas de ta-baco. A síntese de hialuronan pôde apenas ser demonstrada para uma plan-ta transformada com uma seqüência de ácido nucléico que codifica um hialu-ronan sintase isolada da cepa CVKA1 de vírus Chlorella. Para plantas detabaco transformadas com uma seqüência de ácido nucléico que codifica umhialuronan sintase isolado da cepa CVHI1 do vírus Chlorella, não foi possíveldetectar síntese de hialuronan nas plantas transgênicas correspondentes. Aquantidade de hialuronan sintetizada por apenas planta de tabaco transgêni-ca que produz hialuronan in WO 05 012529 é estabelecida como sendo a -proximadamente 4,2 pg de hialuronan por ml de volume medido que, levan-do em conta a descrição da realização do experimento em questão, corres-ponde aproximadamente a uma quantidade de no máximo 12 pg de hialuro-nan produzido por grama de peso novo de material vegetal.WO 05 012529 describes a preparation of transgenic tobacco plants that have been transformed using nucleic acid molecules encoding Chlorella infecting virus hyaluronan synthases. In WO 05012529, on the other hand, nucleic acid sequences have been used which co-difficult hyaluronan synthase of the Chlorella virus strain CVHI1 and, on the other hand, the Chlorella virus strain CVKA1 for transformation of seedlings. -spleen. Hyaluronan synthesis could only be demonstrated for a plant transformed with a nucleic acid sequence encoding a hyaluronan synthase isolated from the CVKA1 strain of Chlorella virus. For detabaco plants transformed with a nucleic acid sequence encoding a hyaluronan synthase isolated from the CVHI1 strain of the Chlorella virus, it was not possible to detect hyaluronan synthesis in the corresponding transgenic plants. The amount of hyaluronan synthesized by only the transgenic tobacco plant producing hialuronan in WO 05 012529 is established to be approximately 4.2 pg of hyaluronan per ml measured volume, taking into account the description of the experiment. in question, it corresponds to approximately 12 pg of hyaluro-nan produced per gram of new weight of plant material.

Hialuronan sintase catalisa a síntese de hialuronan a partir dosmateriais de partida UDP-N-acetil-glicosamina e UDP-ácido glicurônico. Am-bos os materiais de partida mencionados estão presentes em células vege-tais.Hyaluronan synthase catalyzes the synthesis of hyaluronan from UDP-N-acetyl glycosamine and UDP-glucuronic acid starting materials. Both mentioned starting materials are present in plant cells.

Em células vegetais, UDP-ácido glicurônico funciona como me-tabólito para um de uma pluralidade de caminhos possíveis para sintetizarácido ascórbico {Lorence e outros, 2004, Plant Physioi. 134, 1200-1205) ecomo um metabólito central para a síntese dos componentes da parede ce-Iular pectina e hemicelulose que são sintetizados no retículo endoplasmáticoda célula vegetal (Reiter1 1998, Plant Physiol. Biochem. 36(1), 167-176). Omonômero de pectina mais importante e mais freqüentemente ocorrente éácido D-galacturônico (2004, H. W. Heldt in" Plant Biochemistiy', 3a Edição,Academic Press, ISBN 0120883910) o qual é sintetizado usando UDP-ácidoglicurônico. Além disso, é também possível, entre outros, sintetizar UDP-xilose, UDP-arabinose, UDP-ácido galacturônico e UDP-apiose, metabólitospara a síntese de hemicelulose e pectina, usando UDP-ácido glicurônico(Seitz e outros, 2000, Plant Journal, 21(6), 537-546). Em células vegetais,UDP-ácido glicurônico pode ser sintetizado via o metabolismo fosfato hexoseque compreende, entre outros, a conversão de UDP-glicose em UDP-ácidoglicurônico por UDP-GIc-DH ou pelo metabolismo oxidativo mio-inositol quecompreende a conversão de glicoronato 1-fosfato em UDP-ácido glicurônicopor glicoronato 1 -fosfato uridilil transferase. Ambos os caminhos metabólicospara sintetizar ácido glicurônico parecem existir independentemente um dooutro e alternativamente em diferentes estágios tecidos/desenvolvimento deplantas Arabidopsis (Seitz e outros, 2000, Plant Journal 21 (6), 537-546). Arespectiva contribuição dos dois caminhos metabólicos mencionados (meta-bolismo fosfato hexose ou oxidativo mio-inositol) no sentido da síntese deUDP-ácido glicurônico não foi ainda elucidado (Kàrkõnen, 2005, Plant Bi-osystems 139(1), 46-49).In plant cells, UDP-glucuronic acid functions as a me-tabolite for one of a plurality of possible pathways for ascorbic acid synthesis {Lorence et al., 2004, Plant Physioi. 134, 1200-1205) and as a central metabolite for the synthesis of cell wall components pectin and hemicellulose that are synthesized in the plant cell endoplasmic reticulum (Reiter1 1998, Plant Physiol. Biochem. 36 (1), 167-176). The most important and most frequently occurring pectin monomer is D-galacturonic acid (2004, HW Heldt in 'Plant Biochemistiy', 3rd Edition, Academic Press, ISBN 0120883910) which is synthesized using UDP-glycuronic acid. others synthesize UDP-xylose, UDP-arabinose, UDP-galacturonic acid and UDP-apiose, metabolites for hemicellulose and pectin synthesis using UDP-glucuronic acid (Seitz et al. 2000, Plant Journal, 21 (6), 537- In plant cells, UDP-glucuronic acid can be synthesized via hexose phosphate metabolism which comprises, inter alia, the conversion of UDP-glucose to UDP-glycuronic acid by UDP-GIc-DH or the myo-inositol oxidative metabolism which comprises conversion. of glycuronate 1-phosphate to UDP-glucuronic acid by glycoronate 1-uridylyl phosphate transferase. Both metabolic pathways for synthesizing glucuronic acid appear to exist independently of each other and alternatively. at different tissue / developmental stages of Arabidopsis plants (Seitz et al., 2000, Plant Journal 21 (6), 537-546). The respective contribution of the two mentioned metabolic pathways (meta-bolus hexose phosphate or oxidative myo-inositol) towards the synthesis of UDP-glucuronic acid has not yet been elucidated (Kàrkönen, 2005, Plant Bi-osystems 139 (1), 46-49).

A enzima UDP-GIc-DH catalisa a conversão de UDP-glicose emUDP-ácido glicurônico. Samac e outros (2004, Applied Biochemistry and Bio-technology 113-116, Humana Press, EditorAshok Mulehandani, 1167-1182)descrevem a superexpressão especifica a tecido de uma UDP-GIc-DH desoja em células floema de Alfafa com o objetivo de aumentar o teor de pecti-na nos estirpes dessas plantas. A atividade de UDP-GIc-DH, comparadacom as plantas do tipo selvagem correspondentes, foi aumentada por maisde 200%; contudo, a quantidade de pectina produzida pelas plantas corres-pondentes foi menor que a quantidade de pectina produzida pelas plantas dotipo selvagem correspondentes. A quantidade de monômeros xilose e ram-nose na fração da parede celular das plantas transgênicas em questão foiaumentada, visto que a quantidade de monômeros manose na fração daparede celular foi reduzida.The enzyme UDP-GIc-DH catalyzes the conversion of UDP-glucose to UDP-glucuronic acid. Samac et al (2004, Applied Biochemistry and Bio-technology 113-116, Human Press, EditorAshok Mulehandani, 1167-1182) describe the tissue-specific overexpression of a UDP-GIc-DH dislocates in Alfalfa phloem cells with the aim of enhancing pectin content in strains of these plants. UDP-GIc-DH activity compared to corresponding wild type plants was increased by more than 200%; however, the amount of pectin produced by the corresponding plants was less than the amount of pectin produced by the corresponding wild type plants. The amount of xylose and ram-nose monomers in the cell wall fraction of the transgenic plants in question was increased, as the amount of mannose monomers in the cell wall fraction was reduced.

A superexpressão constitutiva de um UDP-GIc-DH em plantasArabidosis resultou em crescimento aberrante das plantas em questão com-paradas com as plantas do tipo selvagem correspondentes e um fenótipoanão. A fração da parede celular das plantas correspondentes apresentavaum aumento na quantidade de manose e galactose e uma quantidade redu-zida de xilose, arabinose e ácidos urônicos comparada com as plantas dotipo selvagem correspondentes (Roman, 2004, "Studies on The Role ofUDP-GIe-DH in Polysaceharide Biosynthesis", tese PhD, Aeta UniversitatisUpsaliensis, ISBN 91-554-6088-7, ISSN 0282-7476). Desse modo, essesresultados contradizem pelo menos em parte os resultados de Samac e ou-tros (2004, Applied Biochemistry and Bioteehnology 113-116, HumanaPress, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182) que detectaram uma quanti-dade reduzida de manose e uma quantidade elevada de xilose na fração daparede celular de plantas transgênicas correspondentes.Constitutive overexpression of a UDP-GIc-DH in Arabidosis plants resulted in aberrant growth of the plants in question compared with the corresponding wild-type plants and a non-phenotype. The cell wall fraction of the corresponding plants showed an increase in the amount of mannose and galactose and a reduced amount of xylose, arabinose, and uronic acids compared with the corresponding wild type plants (Roman, 2004, "Studies on the Role ofUDP-GIe- DH in Polysaceharide Biosynthesis ", PhD thesis, Aeta UniversitatisUpsaliensis, ISBN 91-554-6088-7, ISSN 0282-7476). Thus, these results at least partially contradict the results of Samac and others (2004, Applied Biochemistry and Bioteehnology 113-116, HumanaPress, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182) who detected a reduced amount of mannose and an amount xylose in the cell wall fraction of corresponding transgenic plants.

Para a síntese de UDP-N-acetilglicosamina em células vegetais,WO 98 35047 descreve um caminho metabólico em que glicosamina é con-vertida por várias etapas de reação sucessivas enzimaticamente catalisadascom formação dos metabólitos N-acetil-glicosamina, N-acetil-glicosamina 6-fosfato, N-acetil-glicosamina 1-fosfato para UDP-N-acetilglicosamina. Umcaminho metabólico alternativo compreende a reação de frutose 6-fosfato eglutamina fornecendo glicosamina 6-fosfato que é subseqüentemente con-vertida por várias etapas de reação sucessivas enzimaticamente catalisadascom formação dos metabólitos glicosamina 1-fosfato e N-acetil-glicosamina1-fosfato para UDP-N-acetilglicosamina. A conversão de frutose 6-fosfato eglutamina em glicosamina 6-fosfato é catalisada por uma proteína que apre-senta atividade de glutaminarfrutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT)(Mayer e outros, 1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107).For the synthesis of UDP-N-acetylglycosamine in plant cells, WO 98 35047 describes a metabolic pathway in which glycosamine is converted by several successive enzymatically catalyzed reaction steps with formation of the metabolites N-acetyl glycosamine, N-acetyl glycosamine 6. phosphate, N-acetyl glycosamine 1-phosphate to UDP-N-acetyl glycosamine. An alternative metabolic pathway comprises the reaction of fructose 6-phosphate eglutamine providing glycosamine 6-phosphate which is subsequently converted by several successive enzymatically catalyzed reaction steps with formation of the metabolites glycosamine 1-phosphate and N-acetyl glycosamine1-phosphate to UDP-N -acetylglycosamine. The conversion of fructose 6-phosphate eglutamine to glycosamine 6-phosphate is catalyzed by a protein that exhibits glutaminarfructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT) activity (Mayer et al., 1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107).

WO 00 11192 descreve a superexpressão específica a endos-perma de uma molécula de ácido nucléico de milho que codifica uma proteí-na que apresenta a atividade enzimática de uma GFAT em plantas de milhotransgênicas com o objetivo de sintetizar um amido catiônico em plantas queapresentam moléculas 2-amino-ánidroglicose. O caminho metabólico descri-to que, de acordo com a descrição de WO 00 11192, deve resultar em 2-amino-anidroglicose que é incorporada no amido, compreende entre outros aincorporação de UDP-glicosamina por amido sintases e/ou glicogênio sinta-ses no amido. É estabelecido que quantidades elevadas de UDP-glicosamina pode ser detectada em farinha de endosperma das plantas demilho transgênicas em questão superexpressando uma molécula de ácidonucléico que codifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma GFAT transacionalmente fundida com um peptídeo de sinal plastí-dio. Quando a proteína que apresenta à atividade (enzimática) de umaGFAT foi expressa sem peptídeo de sinal, foi possível detectar uma quanti-dade elevada de glicosamina 1-fosfato nas farinhas correspondentes de te-cido endosperma de milho. Não foi possível detectar amido catiônico nasplantas transgênicas.WO 00 11192 describes the endosperm-specific overexpression of a maize nucleic acid molecule encoding a protein that exhibits the enzymatic activity of a GFAT in milhotransgenic plants for the purpose of synthesizing a cationic starch in plants presenting molecules 2. -amino-anhydroglucose. The metabolic pathway described which, according to the description of WO 00 11192, should result in 2-amino anhydroglucose which is incorporated into starch comprises, among others, the incorporation of UDP-glycosamine by starch synthase and / or glycogen. in starch. It is established that high amounts of UDP-glucosamine can be detected in endosperm meal of the transgenic corn plant in question by overexpressing a nucleic acid molecule encoding a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT transactionally fused to a plastid signal peptide. Hate When the protein exhibiting the (enzymatic) activity of umaGFAT was expressed without signal peptide, a high amount of glycosamine 1-phosphate could be detected in the corresponding endosperm maize tissue flours. It was not possible to detect cationic starch in transgenic plants.

A produção de hialuronan por meio de fermentação de cepasbacterianas associa-se a altos custos, uma vez que as bactérias têm de serfermentadas em recipientes estéreis selados sob condições de cultura dis-pendiosas controladas (vide, por exemplo, US 4.897.349). Além disso, aquantidade de hialuronan que pode ser produzida por meio de fermentaçãode cepas bacterianas é limitada pelas facilidades de produção presentes emcada caso. Aqui, também tem de ser levado em consideração que fermenta-dores, como uma conseqüência de leis físicas, não podem ser formados porvolumes de cultura excessivamente grandes. Menção particular poderá serfeita neste relatório, de mistura homogênea das substâncias alimentadas doexterior (por exemplo, fontes nutrientes essenciais de bactérias, reagentespara regular o pH, oxigênio) com o meio de cultura exigido para produçãoeficiente, que, em grandes fermentadores, pode ser garantida apenas comgrande gasto técnico, se de modo algum.The production of hyaluronan by fermentation of bacterial strains is associated with high costs since bacteria must be fermented in sealed sterile containers under controlled expensive culture conditions (see, for example, US 4,897,349). In addition, the amount of hyaluronan that can be produced by fermentation of bacterial strains is limited by the production facilities present in each case. Here it must also be taken into account that fermenters, as a consequence of physical laws, cannot be formed by excessively large crop volumes. Particular mention may be made in this report of the homogeneous mixing of externally fed substances (eg essential nutrient sources of bacteria, pH-regulating reagents, oxygen) with the culture medium required for efficient production, which in large fermenters can only be guaranteed. with great technical expense, if at all.

A purificação de hialuronan a partir de organismos de animais écomplicada devido à presença, em tecidos animais, de outros mucopolissa-carídeos e proteínas que especificamente se ligam a hialuronan. Em pacien-tes, o uso de preparações medicinais contendo hialuronan contaminadas porproteínas animais pode resultar em reações imunológicas do corpo indese-jáveis (US 4.141.973), em particular se o paciente é alérgico a proteínas a-nimais (por exemplo, clara de ovo de galinha). Além disso, as quantidades(rendimentos) de hialuronan que podem ser obtidas de tecidos animais naqualidade e pureza satisfatórias são baixas (crista de galo: 0,079% p/p,EP 0144019, US 4.782.046), as quais necessitam do processamento degrandes quantidades de tecidos animais. Um problema adicional no isola-mento de hialuronan de tecidos animais consiste pelo fato de que o pesomolecular de hialuronan durante purificação é reduzido uma vez que tecidosanimais também contêm uma enzima degradante de hialuronan (hialuroni-dase).Purification of hyaluronan from animal organisms is complicated due to the presence in animal tissues of other mucopolysaccharides and proteins that specifically bind to hyaluronan. In patients, the use of medicinal preparations containing hyaluronan contaminated with animal proteins may result in undesirable body immune reactions (US 4,141,973), in particular if the patient is allergic to animal proteins (eg, clear from chicken's egg). In addition, the amounts (yields) of hyaluronan obtainable from animal tissues of satisfactory quality and purity are low (rooster crest: 0.079% w / w, EP 0144019, US 4,782,046), which require processing of large quantities. of animal tissues. An additional problem in the isolation of hyaluronan from animal tissues is that the hyaluronan pesomolecular during purification is reduced since animal tissues also contain a degrading enzyme of hyaluronan (hyaluroni-dase).

Além das hialuronidases e exotoxinas mencionadas, cepas deStreptococcus também produzem endotoxinas as quais, quando presentesem produtos farmacológicos, apresentam riscos para a saúde do paciente.Em um estudo científico, mostrou-se que mesmo produtos medicinais con-tendo hialuronan no mercado contêm quantidades detectáveis de endotoxi-nas bacterianas (Dick e outros, 2003, Eur. J. Opthalmol. 13(2), 176-184).Uma desvantagem adicional do hialuronan produzido com o auxílio de cepasde Streptococcus é o fato que o hialuronan isolado apresenta um peso mo-lecular menor que o hialuronan isolado de crista de galo (Lapcik e outros1998, Chemical Reviews 98(8), 2663-2684). US 20030134393 descreve ouso de uma cepa de Streptoeoceus para produzir hialuronan que sintetizauma cápsula de hialuronan particularmente pronunciada (supercapsulada).O hialuronan isolado após fermentação apresentava um peso molecular de9,1 χ 106 Da. Entretanto, o rendimento foi apenas 350 mg por litro.In addition to the hyaluronidases and exotoxins mentioned, Streptococcus strains also produce endotoxins which, when present in pharmacological products, pose risks to the patient's health. In a scientific study, it was shown that even medicinal products containing hyaluronan on the market contain detectable amounts of bacterial endotoxins (Dick et al., 2003, Eur. J. Opthalmol. 13 (2), 176-184). An additional disadvantage of hyaluronan produced with the aid of Streptococcus strains is the fact that isolated hyaluronan has a modest weight. -lecular lower than rooster crest isolated hyaluronan (Lapcik et al. 1998, Chemical Reviews 98 (8), 2663-2684). US 20030134393 describes the use of a Streptoeoceus strain to produce hyaluronan which synthesizes a particularly pronounced (supercapsulated) hyaluronan capsule. The isolated hyaluronan after fermentation had a molecular weight of 9.1 χ 106 Da. However, the yield was only 350 mg per liter.

Algumas das desvantagens de produzir hialuronan por meio defermentação bacteriana ou por isolamento de tecidos animais podem serevitadas através de produção de hialuronan usando plantas transgênicas;contudo, as quantidades de hialurano atualmente obtidas que podem serproduzidas usando plantas transgênicas exigiria uma área relativamentegrande sob cultivo para produzir quantidades relativamente grandes de hia-luronan. Além disso, o isolamento ou purificação de hialuronan a partir deplantas que apresentam um menor teor de hialuronan é consideravelmentemais complicado e dispendioso que o isolamento ou purificação de plantasque apresentam um maior teor de hialuronan.Some of the disadvantages of producing hyaluronan through bacterial defermentation or isolation of animal tissues can be prevented by producing hyaluronan using transgenic plants, however the currently obtained amounts of hyalurane that can be produced using transgenic plants would require a relatively large area under cultivation to produce quantities. relatively large amounts of hia-luronan. In addition, isolation or purification of hyaluronan from plants with a lower hyaluronan content is considerably more complicated and expensive than isolation or purification of plants which have a higher hyaluronan content.

Embora hialuronan apresente propriedades incomuns, isto é,devido a sua escassez e o alto preço, raramente, se de modo algum, usadopara aplicações industriais.Although hyaluronan has unusual properties, that is, due to its scarcity and high price, rarely, if at all, used for industrial applications.

Conseqüentemente, é um objetivo da presente invenção propor-cionar meios e métodos que permitam a provisão de hialuronan em quanti-dades e qualidade suficientes e que tornam possíveis proporcionar hialuro-nan ainda para aplicações industriais e aplicações no campo de alimentos erações.Accordingly, it is an object of the present invention to provide means and methods which enable the provision of hyaluronan in sufficient quantities and quality and which make it possible to provide hyaluro-nan for both industrial and food applications.

Esse objetivo é obtido pelas modalidades descritas em linhasgerais nas reivindicações.This objective is achieved by the embodiments described in the general lines in the claims.

Desse modo, a presente invenção refere-se a células vegetaisgeneticamente modificadas ou plantas geneticamente modificadas que apre-sentam uma molécula de ácido nucléico que codifica um hialuronan sintaseestavelmente integrado em seu genoma, em que essas células vegetais ouplantas adicionalmente apresentam um aumento na atividade de uma prote-Tna que apresenta a atividade (enzimática) de uma glutamina.frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) e um aumento na atividade de uma proteí-na que apresenta a atividade {enzimática) de uma UDP-glicose desidroge-nase (UDP-GIc-DH), comparada com as células vegetais do tipo selvagemnão geneticamente modificado ou plantas do tipo selvagem não genetica-mente modificado correspondentes.Thus, the present invention relates to genetically modified plant cells or genetically modified plants which present a nucleic acid molecule encoding a hyaluronan which is syntactically integrated into their genome, wherein such plant cells additionally exhibit an increase in the activity of a Tna-protein that exhibits the (enzymatic) activity of a glutamine.fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT) and an increase in the activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a UDP-glucose dehydrogenase (UDP- GIc-DH), compared with the non-genetically modified wild-type plant cells or corresponding non-genetically modified wild-type plants.

Aqui, a modificação genética de células vegetais geneticamentemodificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamente modifica-das de acordo com a invenção pode ser qualquer modificação genética re-sultando em uma integração estável de uma molécula de ácido nucléico quecodifica um hialuronan sintase em uma célula vegetal ou uma planta e au-mentando a atividade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimáti-ca) de uma GFAT e aumentando a atividade de uma proteína que apresentaa atividade (enzímática) de uma UDP-GIc-DH em células vegetais genetica-mente modificadas ou plantas geneticamente modificadas comparadas comcélulas vegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas ou plantasdo tipo selvagem não geneticamente modificadas correspondentes.Here, the genetic modification of genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention may be any genetic modification resulting in stable integration of a nucleic acid molecule that encodes a hyaluronan synthase into a cell. increasing the activity of a protein that exhibits the activity (enzymatic) of a GFAT and increasing the activity of a protein that exhibits the activity (enzymatic) of a UDP-GIc-DH in genetically modified plant cells. genetically modified or genetically modified plants compared to non-genetically modified wild-type plant cells or corresponding non-genetically modified wild-type plants.

No contexto da presente invenção, o termo "célula vegetal dotipo selvagem" deve-se entender como significando células vegetais queserviram como material de partida para a preparação das células vegetaisgeneticamente modificadas de acordo com a invenção, isto é, sua formaçãogenética, exceto às modificações genéticas introduzidas e resultando emuma integração estável de uma molécula de ácido nucléico que codifica umhialuronan sintase e aumentando a atividade de uma proteína que apresentaa atividade de uma GFAT e aumentando a atividade de uma proteína queapresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH, a qual corresponde àquela deuma célula vegetal geneticamente modificada de acordo com a invenção.In the context of the present invention, the term "wild-type plant cell" is to be understood to mean plant cells which have served as a starting material for the preparation of genetically modified plant cells according to the invention, i.e. their genetic formation, except for genetic modifications. introduced and resulting in a stable integration of a nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase and increasing the activity of a protein having GFAT activity and increasing the activity of a protein which represents the activity of a UDP-GIc-DH, which corresponds to that of a genetically modified plant cell according to the invention.

No contexto da presente invenção, o termo "planta do tipo sel-vagem" deve-se entender como significando plantas que serviram como ma-terial de partida para a preparação das plantas geneticamente modificadasde acordo com a invenção, isto é, sua informação genética, exceto às modi-ficações genéticas introduzidas e resultando em uma integração estável deuma molécula de ácido nucléico que codifica um hialuronan sintase e au-mentando a atividade de uma proteína que apresenta a atividade de umaGFAT e aumentando a atividade de uma proteína que apresenta a atividadede uma UDP-GIc-DH, a qual corresponde àquela de uma planta genetica-mente modificada de acordo com a invenção.In the context of the present invention, the term "wild type plant" shall be understood to mean plants which have served as starting materials for the preparation of genetically modified plants according to the invention, i.e. their genetic information, except for the genetic modifications introduced and resulting in the stable integration of a nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase and increasing the activity of a protein that exhibits the activity of aGFAT and increasing the activity of a protein that exhibits a UDP-GIc-DH which corresponds to that of a genetically modified plant according to the invention.

No contexto da presente invenção, o termo "correspondendo"significa que, quando uma pluralidade de objetivos são comparados, os obje-tivos em questão que são comparados uns com os outros têm sido mantidossob as mesmas condições de ser. No contexto da presente invenção, o ter-mo "correspondendo" no contexto de células vegetais do tipo selvagem ouplantas do tipo selvagem entende-se que as células vegetais ou plantascomparadas umas com as outras foram cultivadas sob as mesmas condi-ções de cultivo e que elas apresentam a mesma idade (cultura).No contexto da presente invenção, o termo "hialüronan sintase"(EC 2.4.1.212) deve-se entender como significando uma proteína que sinte-tiza hialüronan a partir dos substratos UDP-ácido glicurônico (UDP-GIcA) eN-acetil-glicosamina (UDP-GIcNAc). A síntese de hialüronan é catalisada deacordo com os esquemas de reação abaixo:In the context of the present invention, the term "corresponding" means that when a plurality of objectives are compared, the objectives in question that are compared with each other have been maintained under the same conditions of being. In the context of the present invention, the term "corresponding" in the context of wild-type plant cells or wild-type plants is understood to mean that plant cells or plants compared with each other have been grown under the same cultivation conditions and that they are the same age (culture). In the context of the present invention, the term "hialüronan synthase" (EC 2.4.1.212) is to be understood to mean a protein which synthesizes hialüronan from UDP-glucuronic acid substrates (UDP) -Glyc) and N-acetyl glycosamine (UDP-GIcNAc). The synthesis of hialüronan is catalyzed according to the reaction schemes below:

nUDP-GIcA + nUDP-GIcNAc beta-1,4-[GlcA-beta-1,3-GlcNAc]n + 2 nUDPMoléculas de ácido nucléico e seqüências de proteína corres-pondentes que codificam hialüronan sintases são descritas, entre outros, emrelação aos seguintes organismos: coelho (Oryctolagus cuniculus) ocHas2(EMBL AB055978.1, US 20030235893), ocHas3 (EMBL AB055979.1, US20030235893); babuíno (Papio anubis) paHasl (EMBL AY463695.1); rã(.Xenopus laevis) xlHasl (EMBL M22249.1, US 20030235893), xlHas2 (DG42)(EMBL AF168465.1), xlHas3 (EMBL AY302252.1); humano (Homo sapiens)hsHASI (EMBL D84424.1, US 20030235893), hsHAS2 (EMBL U54804.1,US 20030235893), hsHAS3 (EMBL AF232772.1, US 20030235893); camun-dongo (Mus musculus), mmHasl (EMBL D82964.1, US 20030235893), m-mHAS2 (EMBL U52524.2, US 20030235893), mmHas3 (EMBL U86408.2,US 20030235893); gado (Bos taurus) btHas2 (EMBL AJ004951.1, US20030235893); frango (Gallus gallus) ggHas2 (EMBL AFI 06940:1, US20030235893); rato (Rattus norvegieus) rnHas 1 (EMBL AB097568.1, Itano eoutros, 2004, J. Biol. Chem. 279(18) 18679-18678), rnHas2 (EMBL AF008201.1);rnHas 3 (NCBI NM_172319.1, Itano e outros, 2004, J. Biol. Chem. 279(18)18679-18678), cavalo (Equus caballus) ecHAS2 (EMBL AY056582.1,G1:23428486), porco (Sus scrofa) sscHAS2 (NCBI NM_214053.1, Gl:47522921),sscHas 3 (EMBLAB159675), peixe-zebra (Danio rerío) brHasl (EMBLAY437407), brHas2 (EMBL AF190742.1) brHas3 (EMBL AF190743.1); Pas-teurella multocida pmHas (EMBL AF036004.2); Streptococcus pyogenes s-pHas (EMBL, L20853.1, L21187.1, US 6.455.304, US 20030235893); Strep-tococcus equis seHas (EMBL AF347022.1, AY173078.1), Streptocoeeus u-beris suHasA (EMBL AJ242946.2, US 20030235893), Streptocoeeus equisi-milis seqHas (EMBL AF023876.1, US 20030235893); Sulfolobus solfatarieusssHAS (US 20030235893), Sulfolobus tokodaii stHas (AP000988.1), Para-mecium bursaria Chlorella Vírus 1, cvHAS (EMBL U42580.3, PB42580, US20030235893).nUDP-GIcA + nUDP-GIcNAc beta-1,4- [GlcA-beta-1,3-GlcNAc] n + 2 nUDPMNucleic acid molecules and corresponding protein sequences encoding hialüronan synthases are described, among others, in relation to following organisms: rabbit (Oryctolagus cuniculus) ocHas2 (EMBL AB055978.1, US 20030235893), ocHas3 (EMBL AB055979.1, US20030235893); baboon (Papio anubis) paHasl (EMBL AY463695.1); frog (.Xenopus laevis) x1Has1 (EMBL M22249.1, US 20030235893), x1Has2 (DG42) (EMBL AF168465.1), x1Has3 (EMBL AY302252.1); human (Homo sapiens) hsHASI (EMBL D84424.1, US 20030235893), hsHAS2 (EMBL U54804.1, US 20030235893), hsHAS3 (EMBL AF232772.1, US 20030235893); dongo (Mus musculus), mmHasl (EMBL D82964.1, US 20030235893), m-mHAS2 (EMBL U52524.2, US 20030235893), mmHas3 (EMBL U86408.2, US 20030235893); cattle (Bos taurus) btHas2 (EMBL AJ004951.1, US20030235893); chicken (Gallus gallus) ggHas2 (EMBL AFI 06940: 1, US20030235893); rat (Rattus norvegieus) rnHas 1 (EMBL AB097568.1, Itano et al., 2004, J. Biol. Chem. 279 (18) 18679-18678), rnHas2 (EMBL AF008201.1); rnHas 3 (NCBI NM_172319.1, Itano et al., 2004, J. Biol. Chem. 279 (18) 18679-18678), horse (Equus caballus) ecHAS2 (EMBL AY056582.1, G1: 23428486), pig (Sus scrofa) sscHAS2 (NCBI NM_214053.1, Gl : 47522921), sscHas 3 (EMBLAB159675), zebrafish (Danio rerio) brHasl (EMBLAY437407), brHas2 (EMBL AF190742.1) brHas3 (EMBL AF190743.1); Pasteurella multocida pmHas (EMBL AF036004.2); Streptococcus pyogenes s-pHas (EMBL, L20853.1, L21187.1, US 6,455,304, US 20030235893); Strep-tococcus equis seHas (EMBL AF347022.1, AY173078.1), Streptocoeeus u-beris suHasA (EMBL AJ242946.2, US 20030235893), Streptocoeeus equisi-milis seHas (EMBL AF023876.1, US 20030235893); Sulfolobus solfatarieusssHAS (US 20030235893), Sulfolobus tokodaii stHas (AP000988.1), Para-mecium bursaria Chlorella Virus 1, cvHAS (EMBL U42580.3, PB42580, US20030235893).

No contexto da presente invenção, o termo "UDP-glicose desi-drogenase (UDP-GIc-DH)" (E.C. 1.1.1.22) deve-se entender como significan-do uma proteína que sintetiza, a partir de UDP-glicose (UDP-GIc) e NAD+,UDP-ácido glicurônico (UDP-GIcA) e NADH. Essa catálise prossegue de a-cordo com o esquema de reação abaixo:In the context of the present invention, the term "UDP-glucose dehydrogenase (UDP-GIc-DH)" (EC 1.1.1.22) shall be understood to mean a protein which synthesizes from UDP-glucose (UDP -GIc) and NAD +, UDP-glucuronic acid (UDP-GIcA) and NADH. This catalysis proceeds according to the reaction scheme below:

UDP-GIc + 2 NAD+ -> UDP-GIcA + 2 NADHUDP-GIc + 2 NAD + -> UDP-GIcA + 2 NADH

No contexto da presente invenção, o termo "glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT)" (E.C. 2.6.1.16), na literatura técnica tam-bém referida como glicosamina sintase, deve-se entender como significandouma proteína que sintetiza, a partir dos materiais de partida glutamina e fru-tose 6-fosfato (Fruc-6-Ρ), glicosamina 6-fosfato (GlcN-6-Ρ). Essa catáliseprossegue de acordo com o seguinte esquema de reação:In the context of the present invention, the term "glutamine: fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT)" (EC 2.6.1.16), in the technical literature also referred to as glycosamine synthase, is to be understood as meaning a protein which synthesizes from of the starting materials glutamine and fructose 6-phosphate (Fruc-6-Ρ), glycosamine 6-phosphate (GlcN-6-Ρ). This catalysis proceeds according to the following reaction scheme:

Glutamina + Fruc-6-Ρ -»· GlcN-6-Ρ + GlutamatoGlutamine + Fruc-6-Ρ - »· GlcN-6-Ρ + Glutamate

Em particular em organismos animais, é possível demonstrarduas diferentes isoformas de proteínas que apresentam a atividade (enzimá-tica) de uma GFAT (referida como GFAT-1 e GFAT-2, respectivamente, naliteratura). Hu e outros (2004), J. BioL Chem. 279(29), 29988-29993 descre-vem diferenças das respectivas proteínas do camundongo: além das dife-renças na expressão das proteínas específicas a tecido em questão que a-presenta a atividade (enzimática) de uma glutamina:frutose 6-fosfato amido-transferase 1 (GFAT-1) e uma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase2 (GFAT-2), foi possível mostrar que ambas as isoformas são reguladas pormeio de fosforilação por uma proteína quínase dependente de cAMP. A ati-vidade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de umaGFAT-1 é inibida por meio de fosforilação de um resíduo serina conservado(serina 205 na GFAT-1 do camundongo, GenBank No. de Ac.: AF334736.1)da seqüência de aminoácidos em questão, visto que a atividade de uma pro-teína que apresenta a atividade de uma GFAT-2 é aumentada por meio defosforilação de um resíduo serina conservado (serina 202 na GFAT-2 docamundongo, GenBankHo. de Ac.: NM_013529) da seqüência de aminoáci-dos em questão. Tanto proteínas que apresentam a atividade de uma GFAT-1 quanto proteínas que apresentam a atividade de uma GFAT-2 são inibidasde uma maneira dependente de concentração por UDP-N-acetilglicosamina;contudo, em relação a uma proteína que apresenta a atividade de umaGFAT-2, a inibição por UDP-N-acetilglicosamina é menor (redução máximade atividade por UDP-N-acetilglicosamina aproximadamente 15%) compara-da com uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT-1 (reduçãomáxima de atividade por UDP-N-acetilglicosamina aproximadamente 51% ou80%). Há indicações de que a inibição de uma proteína que apresenta a ati- vidade de uma GFAT-1 em organismos animais baseia-se no fato que sobconcentrações elevadas de UDP-N-acetilglicosamina há uma glicosilação O-glicose-N-acetilglicosamina das proteínas em questão. Se uma regulação daatividade de proteínas por O-glicosilação também ocorre em células vegetaisnão é ainda totalmente entendido (Huber e Hardin, 2004, Current Opinion inPlant Biotechnology 7, 318-322).In particular in animal organisms, it is possible to demonstrate two different protein isoforms that exhibit the activity (enzymatic) of a GFAT (referred to as GFAT-1 and GFAT-2, respectively, in the literature). Hu et al. (2004), J. BioL Chem. 279 (29), 29988-29993 describe differences in the respective proteins of the mouse: besides the differences in the expression of the specific tissue proteins in question that presents the (enzymatic) activity of a glutamine: fructose 6-phosphate starch -transferase 1 (GFAT-1) and a glutamine: fructose 6-phosphate amidotransferase2 (GFAT-2), it was shown that both isoforms are regulated by phosphorylation by a cAMP-dependent protein kinase. The activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of umaGFAT-1 is inhibited by phosphorylation of a conserved serine residue (mouse serine 205 in GFAT-1, GenBank Ac. No. AF334736.1) of the amino acid sequence in question, since the activity of a protein that exhibits the activity of a GFAT-2 is increased by dephosphorylation of a conserved serine residue (serine 202 in GFAT-2 docamundongo, GenBankHo. de Ac .: NM_013529) of the amino acid sequence in question. Both GFAT-1 activity proteins and GFAT-2 activity proteins are inhibited in a concentration-dependent manner by UDP-N-acetylglycosamine, however with respect to a protein that exhibits a GFAT-1 activity. 2, UDP-N-acetylglycosamine inhibition is lower (maximal reduction of activity by UDP-N-acetylglycosamine approximately 15%) compared to a protein that exhibits GFAT-1 activity (maximal reduction of activity by UDP-N- acetylglycosamine approximately 51% or 80%). There are indications that inhibition of a protein that exhibits GFAT-1 activity in animal organisms is based on the fact that high concentrations of UDP-N-acetylglycosamine has an O-glucose-N-acetylglycosamine glycosylation of proteins in question. Whether regulation of protein activity by O-glycosylation also occurs in plant cells is not yet fully understood (Huber and Hardin, 2004, Current Opinion in Plant Biotechnology 7, 318-322).

No contexto da presente invenção, o termo "glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase-1 (GFAT-1)" deve-se entender como significandouma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT e cuja atividade éinibida por meio de fosforilação por uma proteína quinase dependente de cAMP.In the context of the present invention, the term "glutamine: fructose 6-phosphate amidotransferase-1 (GFAT-1)" is to be understood as meaning a protein that exhibits the activity of a GFAT and whose activity is inhibited by phosphorylation by a protein kinase. cAMP dependent.

No contexto da presente invenção, o termo "glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase-2 (GFAT-2)" deve-se entender como significandouma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT e que é ativada pormeio de fosforilação por uma proteína quinase dependente de cAMP.In the context of the present invention, the term "glutamine: fructose 6-phosphate amidotransferase-2 (GFAT-2)" is to be understood as meaning a protein that exhibits the activity of a GFAT and is activated by phosphorylation by a protein dependent kinase. of cAMP.

No contexto da presente invenção, o termo "glutamina:frutose6-fosfato amidotransferase (GFAT)" é usado como um termo compreensivoque inclui todas as proteínas que apresentam a atividade de uma GFAT.Conseqüentemente, também compreende proteínas referidas na literaturacomo "glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase-1 (GFAT-1)" ou como"glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase-2 (GFAT-2)", mas não se limi-ta a essas.In the context of the present invention, the term "glutamine: fructose6-phosphate amidotransferase (GFAT)" is used as a comprehensive term that includes all proteins exhibiting the activity of a GFAT. Accordingly, it also includes proteins referred to in the literature "glutamine: fructose 6" phosphate amidotransferase-1 (GFAT-1) "or as" glutamine: fructose 6-phosphate amidotransferase-2 (GFAT-2) ", but not limited to these.

No contexto da presente invenção, o termo "aumento da ativida-de de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT1significa um aumento na expressão de genes endógenos que codificam pro-teínas que apresentam a atividade de uma GFAT e/ou um aumento na quan-tidade de transcritos que codificam proteínas que apresentam a atividade deuma GFAT e/ou um aumento na quantidade de proteína que apresenta aatividade de uma GFAT nas células e/ou um aumento na atividade enzimáti-ca de proteínas que apresenta a atividade de uma GFAT nas células.In the context of the present invention, the term "increased activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a GFAT1" means an increase in the expression of endogenous genes encoding proteins that exhibit activity of a GFAT and / or a an increase in the amount of transcripts encoding GFAT activity proteins and / or an increase in the amount of GFAT activity activity in cells and / or an increase in enzymatic activity of GFAT activity proteins. a GFAT in the cells.

No contexto da presente invenção, o termo "aumento na ativida-de de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-Glc-DH" significa um aumento na expressão de genes endógenos que codi-ficam proteínas que apresentam a atividade de uma UDP-GIc-DH e/ou umaumento na quantidade de transcritos que codificam proteínas que apresen-tam a atividade de uma UDP-GIc-DH e/ou um aumento na quantidade deproteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH nas células e/ou umaumento na atividade enzimática de proteínas que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH nas células.In the context of the present invention, the term "increase in the activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a UDP-Glc-DH" means an increase in the expression of endogenous genes encoding proteins that exhibit the activity of a UDP-Glc-DH. UDP-GIc-DH and / or an increase in the amount of protein-encoding transcripts that exhibit the activity of a UDP-GIc-DH and / or an increase in the amount of protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH in cells and / or an increase in protein enzymatic activity that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH in cells.

As células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou as plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção satisfazem em cada caso pelo menos uma das condições mencionadasacima significando um aumento na atividade enzimática de uma proteína emrelação a proteínas que apresentam a atividade (enzimática) de uma GFATe em relações a proteínas que apresentam a atividade (enzimática) de umaUDP-GIc-DH.Genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention in each case satisfy at least one of the above conditions meaning an increase in the enzymatic activity of a protein relative to proteins that exhibit (enzymatic) activity. of a GFATe in relation to proteins that exhibit the activity (enzymatic) of aUDP-GIc-DH.

Um aumento na expressão pode ser determinado, por exemplo,medindo a quantidade de transcritos que codificam uma proteína que apre-senta a atividade de uma GFAT ou que codifica uma proteína que apresentaa atividade de uma UDP-GIc-DH, por exemplo, por análise Northern blot ouTA-PCR. Aqui, um aumento, preferencialmente significa um aumento naquantidade de transcritos comparado com células vegetais do tipo selvagemnão geneticamente modificadas ou plantas do tipo selvagem não genetica-mente modificadas correspondentes por pelo menos 50%, em particular porpelo menos 70%, preferencialmente, por pelo menos 85% e, particular e pre-ferencialmente por pelo menos 100%. Um aumento da quantidade de trans-critos que codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma GFATou que codifica uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH também significa que plantas ou células vegetais que apresentam ne-nhuma quantidade detectável de transcritos que codificam uma proteína queapresenta a atividade de uma GFAT e/ou que codifica uma proteína que a-presenta a atividade de uma UDP-GIc-DH apresentam, após modificaçãogenética de acordo com a invenção, quantidades detectáveis de transcritosque codificam uma proteína que apresentam a atividade de uma GFAT e/ouque codifica uma proteína quê apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH.An increase in expression can be determined, for example, by measuring the amount of transcripts encoding a protein that exhibits GFAT activity or encoding a protein that exhibits UDP-GIc-DH activity, for example by analysis. Northern blot orTA-PCR. Here, an increase preferably means an increase in transcripts compared to non-genetically modified wild-type plant cells or corresponding non-genetically modified wild-type plants by at least 50%, in particular by at least 70%, preferably by at least 85% and particularly preferably at least 100%. An increase in the amount of transcripts encoding a GFAT activity-encoding protein or a protein encoding a UDP-GIc-DH activity also means that plants or plant cells that have no detectable amount of transcripts which encode a protein which exhibits the activity of a GFAT and / or which encode a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH exhibit, upon genetic modification according to the invention, detectable amounts of transcripts which encode a protein which exhibit activity of a GFAT and / or encoding a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH.

O aumento na quantidade de proteína que apresenta a atividadede uma GFAT ou de proteínas que apresentam a atividade de uma UDP-GIc-DH resultando em um aumento na atividade dessas proteínas nas célu-las vegetais em questão pode ser determinada, por exemplo, por métodosimunológicos, tais como análise Western blot, ELISA (Ensaio Imunoenzimá-tico ligado a Enzima) ou RIA (Radioimunoensaio). Métodos de preparaçãode anticorpos que reagem especificamente com uma proteína particular, istoé, ligando-se especificamente a essa proteína, são conhecidos daquele ver-sado na técnica (vide, por exemplo, Lottspeich e Zorbas (Eds.), 1998, Bioa-nalytik [Bioanalysis], Spektrum akad. Verlag, Heidelberg, Berlim, ISBN 3-8274-0041 -4). Algumas empresas (por exemplo, Eurogentec, Bélgica) ofere-cem a preparação desses anticorpos como uma ordem de serviço. Aqui, umaumento na quantidade de proteína preferencialmente significa um aumentona quantidade de proteína que apresenta a atividade de uma GFAT e/ou deproteínas que apresentam a atividade de uma UDP-GIc-DH comparada comcélulas vegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas ou plantasdo tipo selvagem não geneticamente modificadas correspondentes por pelomenos 50%, em particular, por pelo menos 70%, preferencialmente, por pelomenos 85% e, particular e preferencialmente, por pelo menos 100%. Umaumento na quantidade de proteína que apresenta a atividade de uma GFATe/ou de proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH tambémsignifica que plantas ou células vegetais que apresentam nenhuma quanti-dade detectável de uma proteína que apresenta a atividade de uma GFATe/ou que apresenta nenhuma atividade detectável de uma proteína que a-presenta a atividade de uma UDP-GIc-DH apresentam, após modificaçãogenética de acordo com a invenção, uma quantidade detectável de uma proteí-na que apresenta a atividade de uma GFAT e/ou uma quantidade detectávelde uma proteína que apresenta a atividade de uma proteína UDP-GIc-DH.The increase in the amount of protein that exhibits GFAT activity or the proteins that exhibit the activity of a UDP-GIc-DH resulting in an increase in the activity of these proteins in the plant cells in question may be determined, for example, by immunological methods. , such as Western blot analysis, ELISA (Enzyme-Linked Immunoenzyme Assay) or RIA (Radioimmunoassay). Methods of preparing antibodies that react specifically with a particular protein, i.e., specifically binding to that protein, are known from the art (see, for example, Lottspeich and Zorbas (Eds.), 1998, Bioa-nalytik [ Bioanalysis], Spektrum Akad Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041 -4). Some companies (eg Eurogentec, Belgium) offer the preparation of these antibodies as a work order. Here, an increase in the amount of protein preferably means an increase in the amount of protein that exhibits the activity of a GFAT and / or deproteins that exhibit the activity of a UDP-GIc-DH compared to non-genetically modified wild-type plant cells or non-wild-type plants. corresponding genetically modified by at least 50%, in particular by at least 70%, preferably by at least 85% and particularly preferably by at least 100%. An increase in the amount of protein that shows activity of a GFATe / or protein that shows activity of a UDP-GIc-DH also means that plants or plant cells that have no detectable amount of a protein that show activity of a GFATe / or which exhibits no detectable activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH exhibit, upon genetic modification according to the invention, a detectable amount of a protein that exhibits the activity of a GFAT and / or a detectable amount of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH protein.

O aumento na atividade de uma proteína que apresenta a ativi-dade de uma GFAT em extratos vegetais pode ser determinado por métodosconhecidos daquele versado na técnica conforme descritos, por exemplo, inSamac e outros (2004, Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116,Humana Press, Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182, ISSN 0273-2289).The increase in activity of a protein that exhibits GFAT activity in plant extracts can be determined by methods known to those skilled in the art as described, for example, inSamac et al. (2004, Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116, Humana Press , Editor Ashok Mulehandani, 1167-1182, ISSN 0273-2289).

Um método preferido de determinação da quantidade da atividade de umaproteína que apresenta a atividade de uma GFAT é dado em Métodos Ge-rais, item 6.A preferred method of determining the amount of activity of a protein that exhibits the activity of a GFAT is given in General Methods, item 6.

O aumento na atividade de uma proteína que apresenta a ativi-dade de uma UDP-GIc-DH em extratos vegetais pode ser descrito usandométodos conhecidos daquele versado na técnica, conforme descritos, porexemplo, in WO 00 11192. Um método preferido de determinação da quanti-dade da atividade de uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH é dado em Métodos Gerais, item 7.The increase in activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH in plant extracts can be described using methods known to those skilled in the art, as described, for example, in WO 00 11192. A preferred method of determining the amount The age of activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH is given in General Methods, item 7.

Um aumento na quantidade de atividade (enzimática) de proteí-nas que apresentam a atividade de uma GFAT ou de proteínas que apresen-tam a atividade de uma UDP-GIc-DH, preferencialmente, significa um au-mento da atividade dessas proteínas por pelo menos 50%, preferencialmen-te por pelo menos 70%, especial e preferencialmente, por pelo menos 85%e, particular e preferencialmente por pelo menos 100% comparado com célu-las vegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas ou plantas dotipo selvagem não geneticamente modificadas correspondentes. Um aumen-to na quantidade de atividade (enzimática) de proteínas que apresentam aatividade de uma GFAT e/ou de uma proteína que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH também significa que plantas ou células vegetais que a-presentam nenhuma quantidade detectável de uma proteína que apresentaa atividade de uma GFAT e/ou que apresenta nenhuma atividade detectávelde uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH apresen-tam, após modificação genética de acordo com a invenção, uma quantidadedetectável de uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT e/ouuma quantidade detectável de uma proteína que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH.An increase in the amount of (enzymatic) activity of proteins that exhibit the activity of a GFAT or of proteins that exhibit the activity of a UDP-GIc-DH preferably means an increase in the activity of these proteins by at least at least 50%, preferably at least 70%, especially preferably at least 85% and particularly preferably at least 100% compared to non-genetically modified wild type plant cells or non-genetically wild type plants corresponding changes. An increase in the amount of (enzymatic) activity of proteins that show the activity of a GFAT and / or a protein that shows the activity of a UDP-GIc-DH also means that plants or plant cells that have no detectable amount of a protein that exhibits activity of a GFAT and / or that exhibits no detectable activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH exhibit, upon genetic modification according to the invention, a detectable amount of a protein that exhibits the activity of a GFAT and / or a detectable amount of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH.

No contexto da presente invenção, o termo "genoma" deve-seentender como significando o material genético completo presente em umacélula vegetal. Sabe-se aquele versado na técnica que, além do núcleo, ou-tros compartimentos (por exemplo, plastídios, mitocôndria) também contêmmaterial genético.In the context of the present invention, the term "genome" shall be understood to mean the complete genetic material present in a plant cell. It is well known to one of skill in the art that, in addition to the nucleus, other compartments (eg, plastids, mitochondria) also contain genetic material.

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácidonucléico estavelmente integrada" deve-se entender como significando a in-tegração de uma molécula de ácido nucléico no genoma da planta. Uma mo-lécula de ácido nucléico estavelmente integrada caracteriza-se pelo fato deque, durante a replicação do sítio de integração correspondente, ela é multi-plicada juntamente com as seqüências de ácido nucléico do hospedeiro queforma fronteira com o sítio de integração, de modo que o sítio de integraçãona fita de DNA replicada é circunjacente pelas mesmas seqüências de ácidonucléico como na fita interpretada que funciona como uma matriz para a re-plicação.In the context of the present invention, the term "stably integrated nucleic acid molecule" is to be understood to mean the integration of a nucleic acid molecule into the plant genome. A stably integrated nucleic acid molecule is characterized in that, during replication of the corresponding integration site, it is multiplied together with the host nucleic acid sequences that border the integration site, so that the integration site in the replicated DNA strand is surrounding the same sequences of nucleic acid as in the interpreted strand that acts as a matrix for replication.

Um grande número de técnicas de moléculas de ácido nucléicoestavelmente integradas em uma célula vegetal hospedeira é disponível.Essas técnicas incluem a transformação de células vegetais com T-DNA u-sando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como meiosde transformação, fusão de protoplastos, injeção, eletroporação de DNA,introdução de DNA pela abordagem biolística e também adicionalmente op-ções (revisão in " Transgenic Plants", Leandro ed., Humana Press 2004,ISBN 1-59259-827-7).A large number of nucleic acid molecule techniques stably integrated into a host plant cell are available. These techniques include transformation of plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as means of transformation, protoplast fusion, injection, electroporation. of DNA, introduction of DNA by the biolistic approach and also additionally options (review in "Transgenic Plants", Leandro ed., Humana Press 2004, ISBN 1-59259-827-7).

O uso de transformação de células vegetais mediadas por agro-bactérias tem sido objeto de estudos aprofundados e foi descrito exaustiva-mente in EP 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offset-drukkeríj Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Capítulo V; Fraleye outros, Crit.Rev. Plant Sei. 4, 1-46 e in An e outros EMBO J. 4, (1985), 277-287. Em re-lação à transformação de batatas vide, por exemplo, Rocha-Sosa e outros,EMBO J. 8, (1989), 29-33, em relação à transformação de plantas de tomatevide, por exemplo, US 5.565.347.The use of agro-bacterium-mediated plant cell transformation has been the subject of in-depth studies and has been thoroughly described in EP 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offset-drukkeríj Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraleye Others, Crit.Rev. Plant I know. 4,1-46 and in An and others EMBO J. 4, (1985), 277-287. With regard to potato processing see, for example, Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33, for transformation of tomatevide plants, for example, US 5,565,347.

A transformação de plantas monocotiledôneas usando vetorescom base em transformação de Agrobacterium foi descrita, também (Chan eoutros, PIant Moi Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei e outros, Plant J. 6, (1994)271-282; Deng e outros, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink e ou-tros, Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May e outros, Bio/Technology 13,(1995), 486-492; Conner e Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555;Ritchie e outros, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265). Um sistema alternati-va de transformação de plantas monocotiledôneas é a transformação usan-do a abordagem biolística (Wan e Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48;Vasil e outros, Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala e outros, PlantMoi Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer e outros, Theor. Appi Genet. 79,(1990), 625-631), a transformação de protoplastos, a eletroporação de célu-las parcialmente permeabilizadas, a introdução de DNA usando fibras devidro. Em particular, a transformação de milho foram descritas diversas ve-zes na literatura (conforme, por exemplo, W095/06128, EP0513849,EP0465875, EP0292435; Fromm e outros, Biotechnology 8, (1990), 833-844;Gordon-Kamm e outros, PIantCeII 2, (1990), 603-618; Koziel e outros, Biote-chnology 11 (1993), 194-200; Moroc e outros, Theor. Appi Genet. 80, (1990),721-726). A transformação de outras gramíneas, tal como, por exemplo,"switchgrass" (Panicum virgatum) foi também descrita (Riehards e outros,2001, Plant Cell Reporters 20, 48-54).Transformation of monocotyledonous plants using Agrobacterium transformation-based vectors has also been described (Chan et al., PIant Moi Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng et al., Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May et al., Bio / Technology 13, (1995), 486 Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al., Transgenic Res. 2 (1993), 252-265). An alternative monocotyledon plant transformation system is transformation using the biolistic approach (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bio / Technology 11 (1993), 1553). Ritala et al., PlantMoi Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appi Genet. 79 (1990), 625-631), protoplast transformation, cell electroporation. partially permeabilized, the introduction of DNA using fiberglass. In particular, corn transformation has been described several times in the literature (as, for example, WO95 / 06128, EP0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm and others, PIantCeII 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appi Genet. 80 (1990), 721-726). Transformation of other grasses such as, for example, switchgrass (Panicum virgatum) has also been described (Riehards et al., 2001, Plant Cell Reporters 20, 48-54).

A transformação bem-sucedida de outras espécies cereais étambém descrita, por exemplo, de cevada (Wan e Lemaux, vide acima; Rita-Ia e outros, vide acima; Krens e outros, Nature 296, (1982), 72-74) e de trigo(Nehra e outros, Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker e outros, 1994, PlantJournal 5, 299-307). Todos os métodos acima são adequados no contextoda presente invenção.Comparadas com o estado da técnica, células vegetais geneti-camente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção oferecem a vantagem de que elasproduzem quantidades maiores de hialuronan do que plantas que apresen-tam apenas a atividade de um hialuronan sintase. Isso permite que hialuro-nan seja produzido sob pouco custo uma vez que o isolamento de hialuro-nan de plantas que apresentam um maior teor de hialuronan é menos com-plicado e mais eficiente no custo. Além disso, comparadas com as plantasdescritas no estado da técnica, áreas de cultivo menores são exigidas paraproduzir hialuronan usando as plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção. Isso leva à possibilidade de proporcionar hialuronan emquantidades suficientes mesmo para aplicações industrais em que ele é atu-almente não usado devido à sua escassez e o alto preço. Organismos vege-tais infectados por vírus do gênero Chlorella são inadequados para produzirquantidades relativamente grandes de hialuronan. Na produção de hialuro-nan, algas infectadas por vírus apresentam a desvantagem de que os genesexigidos por hialuronan sintase não são estavelmente integrados em seugenoma (Van Etten e Meints, 1999, Annu. Rev. Microbiol. 53, 447-494), demodo que, para produzir hialuronan, a infecção por vírus tem de ser repeti-da. Conseqüentemente, não é possível isolar células individuais Chlorellaque sintetizam continuamente a qualidade e quantidade desejada de hialu-ronan. Além disso, em algas Chlorella infectadas por vírus, hialuronan é a-penas produzido por um período de tempo limitado, e como um resultado daIise causada pelo vírus, as algas são exterminadas apenas cerca de 8 horasapós a infecção (Van Etten e outros, 2002, Arch. Viroi 147, 1479-1516). Emcontraste, a presente invenção oferece a vantagem de que as células vege-tais geneticamente modificadas de acordo com a invenção e as plantas ge-neticamente modificadas de acordo com a invenção podem ser propagadasde uma maneira não-limitada vegetativa ou sexualmente e que elas produ-zem hialuronan continuamente.Successful transformation of other cereal species is also described, for example, from barley (Wan and Lemaux, see above; Rita-la and others, see above; Krens and others, Nature 296, (1982), 72-74) and of wheat (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, PlantJournal 5, 299-307). All the above methods are suitable in the context of the present invention. Compared to the prior art, genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention offer the advantage that they produce larger amounts of hyaluronan than plants. which present only the activity of a hyaluronan synthase. This allows hyaluro-nan to be produced at low cost since the isolation of hyaluro-nan from plants with a higher hyaluronan content is less complicated and more cost efficient. Furthermore, compared to plants described in the prior art, smaller cultivation areas are required to produce hyaluronan using genetically modified plants according to the invention. This leads to the possibility of providing hyaluronan in sufficient quantities even for industrial applications where it is currently unused due to its scarcity and high price. Vegetable organisms infected with the Chlorella genus are inadequate to produce relatively large amounts of hyaluronan. In the production of hyaluro-nan, virus-infected algae have the disadvantage that the genes required by hyaluronan synthase are not stably integrated into their genome (Van Etten and Meints, 1999, Annu. Rev. Microbiol. 53, 447-494). , to produce hyaluronan, the virus infection has to be repeated. Consequently, it is not possible to isolate individual Chlorella cells that continuously synthesize the desired quality and quantity of hyalu-ronan. Also, in virus-infected Chlorella algae, hyaluronan is only produced for a limited period of time, and as a result of the lysis caused by the virus, algae are exterminated only about 8 hours after infection (Van Etten et al., 2002). , Arch. Viroi 147, 1479-1516). In contrast, the present invention offers the advantage that genetically modified plant cells according to the invention and genetically modified plants according to the invention can be propagated in a vegetatively or sexually non-limited manner and that they produce hyaluronan continuously.

As plantas transgênicas descritas in WO 05 012529, que apre-sentam uma molécula de ácido nucléico que codifica um hialuronan sintase,sintetizam uma quantidade relativamente pequena de hialurano. Em contras-te, a presente invenção oferece a vantagem de que células vegetais geneti-camente modificadas de acordo com a invenção e plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção sintetizam consideravelmente quan-tidades maiores de hialuronan.The transgenic plants described in WO 05 012529, which contain a nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase, synthesize a relatively small amount of hyalurane. In contrast, the present invention offers the advantage that genetically modified plant cells according to the invention and genetically modified plants according to the invention considerably synthesize larger amounts of hyaluronan.

Conseqüentemente, a presente invenção também proporcionacélulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção que sinteti-zam hialuronan. Células vegetais geneticamente modificadas de acordo coma invenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãopreferencialmente sintetizam pelo menos 100, com preferência pelo menos600, particular e preferencialmente, pelo menos 1000 e, especial e preferen-cialmente, pelo menos 1500 pg de hialuronan por g de massa fresca (MF) dematerial planta.Accordingly, the present invention also provides genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention which synthesize hyaluronan. Genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention preferably synthesize at least 100, preferably at least 600, particularly preferably at least 1000 and especially preferably at least 1500 pg of hyaluronan per g. of fresh pasta (MF) plant material.

Preferencialmente, células vegetais de acordo com a invençãoou plantas de acordo com a invenção sintetizam no máximo 25.000 pg dehialuronan por grama de massa fresca, com preferência no máximo 20.000pg de hialuronan por grama de massa fresca, particularmente preferível, nomáximo 15.000 pg de hialuronan por grama de massa fresca, especialmentepreferível, no máximo 10.000 pg de hialuronan por grama de massa fresca eprincipalmente preferível, no máximo 6.500 pg de hialuronan por grama demassa fresca.Preferably, plant cells according to the invention or plants according to the invention synthesize a maximum of 25,000 pg dehyaluronan per gram of fresh pasta, preferably a maximum of 20,000 pg of hyaluronan per gram of fresh pasta, particularly preferably 15,000 pg of hyaluronan per gram. gram of fresh pasta, especially preferable, a maximum of 10,000 pg of hyaluronan per gram of fresh pasta and mainly preferable, a maximum of 6,500 pg of hyaluronan per gram too fresh.

Para determinar o teor de hialuronan com relação à massa fres-ca em células vegetais geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, prefe-rência é dada para usar o método do material de planta descrito sob Méto-dos Gerais item 2 e o método de determinação da quantidade de hialuronandescrito sob Métodos Gerais item 4.To determine the hyaluronan content with respect to fresh mass in genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention, preference is given to using the plant material method described below. General Methods item 2 and the method for determining the amount of hyaluronand described under General Methods item 4.

A presente invenção também proporciona células vegetais gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção que sintetizam pelo menos 1.000,preferencialmente pelo menos 2.000, particular e preferencialmente pelomenos 4.000, especial e preferencialmente pelo menos 5.000 pg de hialuro-nan por g de massa seca (MS) de material planta. Para determinar o teor dehialuronan com relação ao peso seco nas células vegetais geneticamentemodificadas de acordo com a invenção ou as plantas geneticamente modifi-cadas de acordo com a invenção, preferência é dada para usar o método deprocessamento do material Ianta descrito no Exemplo 13 k) e o método dedeterminação da quantidade de hialuronan descrito sob Métodos Gerais item 4.The present invention also provides genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention which synthesize at least 1,000, preferably at least 2,000, particularly preferably at least 4,000, especially preferably at least 5,000 pg of hyaluro. -nan per g dry mass (MS) of plant material. To determine the content of hyaluronan with respect to dry weight in genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention, preference is given to using the material processing method described in Example 13 (k) and The method of determining the amount of hyaluronan described under General Methods item 4.

Observou-se que, durante o tempo de desenvolvimento, hialuro-nan acumula no tecido vegetal; conseqüentemente, a quantidade de hialuro-nan com relação à massa fresca ou com relação à massa seca nas célulasvegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou nas plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção deve ser determi-nada com preferência particular durante colheita ou alguns (um ou dois) diasantes de colheita das células vegetais em questão ou das plantas em ques-tão. Aqui, faz-se uso em particular de material planta (por exemplo, tubércu-los, sementes, folhas) com relação à quantidade de hialuronan que deve serusado para processamento adicional.During the developmental time, hyaluro-nan accumulates in plant tissue; therefore, the amount of hyaluro-nan with respect to fresh weight or to dry weight in genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention should be determined with particular preference during harvesting. or a few (one or two) days prior to harvesting the plant cells in question or the plants in question. Here, particular use is made of plant material (eg, tubers, seeds, leaves) with respect to the amount of hyaluronan which should be used for further processing.

Células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãoque sintetizam hialuronan podem ser identificadas isolando o hialuronan queé sintetizado pelas mesmas e comprovando sua estrutura.Genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention which synthesize hyaluronan can be identified by isolating hyaluronan which is synthesized by them and proving its structure.

Uma vez que tecido vegetal apresenta a vantagem que ele nãocontém hialuronidases, um método de isolamento simples e rápido pode serusado para confirmar a presença de hialuronan em células vegetais geneti-camente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção. Para essa finalidade, adiciona-seágua ao tecido vegetal para ser examinado e o tecido vegetal é em seguidafragmentado mecanicamente (com o auxílio de, por exemplo, um moinho decontas, um moinho batedor, um misturador Warring, um extrator de suco,etc.). Se exigido, mais água poderá em seguida ser adicionada à suspensão,e detritos celulares e componentes insolúveis em água são em seguida re-movidos por meio de centrifugação ou peneiração. A presença de hialuronanno sobrenadante obtido após centrifugação pode em seguida ser demons-trada usando, por exemplo, uma proteína que se liga especificamente a hia-luronan. Um método de detector hialuronan com o auxílio de uma proteínaque se liga especificamente a hialuronan é descrito, por exemplo, in US5.019.498. Kits de teste para realizar o método descrito in US 5.019.498 sãocomercialmente disponíveis (por exemplo, o kit de teste ácido hialurônico(HA) de Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001; vide também Mé-todos Gerais item 4). Em paralelo, é possível inicialmente digerir uma alíquo-ta do sobrenadante de centrifugação obtido com uma hialuronidase e emseguida confirmar a presença de hialuronan com o auxílio da proteína queespecificamente se liga a hialuronan, conforme descrito acima. Pela ação dahialuronidase na batelada paralela, o hialuronan presente nesse particular édegradado, de modo que após digestão completa não é mais possível detec-tar quantidades significativas de hialuronan.Since plant tissue has the advantage that it does not contain hyaluronidases, a simple and rapid isolation method can be used to confirm the presence of hyaluronan in genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention. For this purpose, water is added to the plant tissue for examination and the plant tissue is then mechanically broken (with the help of, for example, a bead mill, a whisk mill, a Warring mixer, a juice extractor, etc.) . If required, more water may then be added to the suspension, and cellular debris and water-insoluble components are then removed by centrifugation or sieving. The presence of hyaluronan in the supernatant obtained after centrifugation can then be demonstrated using, for example, a protein that specifically binds hia-luronan. A protein-assisted hyaluronan detector method specifically binds to hyaluronan is described, for example, in US5,019,498. Test kits for carrying out the method described in US 5,019,498 are commercially available (for example, the Corgenix, Inc., Colorado, USA Hyaluronic Acid (HA) Test Kit, Prod. No. 029-001; see also All General item 4). In parallel, it is initially possible to digest an aliquot of the spin supernatant obtained with a hyaluronidase and then confirm the presence of hyaluronan with the aid of the protein that specifically binds to hyaluronan, as described above. By the action of hyaluronidase on the parallel batch, the hyaluronan present in this particular is degraded, so that after complete digestion it is no longer possible to detect significant amounts of hyaluronan.

A presença de hialuronan no sobrenadante de centrifugaçãopode além disso também ser confirmado usando outros métodos de análise,tais como, por exemplo, IV, RMN ou espectroscopia de massa.The presence of hyaluronan in the centrifugation supernatant can furthermore be confirmed using other analysis methods such as, for example, IR, NMR or mass spectroscopy.

Conforme já discutido acima, não é claro que caminho metabóli-co (fosfato hexose ou caminho metabólico oxidativo mio-inositol) seja princi-palmente usado em células vegetais para sintetizar UDP-ácido glicurônico, ese ambos os caminhos metabólicos tornam-se diferentes contribuiçõesquantitativas para a síntese de UDP-ácido glicurônico, dependendo do tecidoe/ou estágio de desenvolvimento da planta. Além disso, a superexpressãode uma UDP-GIc-DH em plantas transgênicas não leva a resultados consis-tentes, e não foi possível obter o alvo para aumentar o teor de pectina daparede celular que adota tal abordagem. Adicionalmente, a regulação daatividade de proteínas que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH é ini-bida por UDP-xílose. Isso foi demonstrado tanto para proteínas relevantesque se originam de procariotos (Campbell e outros, 1997, J. Biol. Chem.272(6), 3416-3422; Schiller e outros, 1973, Biochim. Biophys Acta 293(1), 1-10), de organismos animais (Balduini e outros, 1970, Biochem. J. 120(4),719-724) quanto de plantas (Hinterberg, 2002, Plant Physiol. Biochem. 40,1011-1017). Além disso, os produtos de reação com ácido glicurônico e NA-DH que se originam da reação catalisada por uma proteína que apresenta aatividade de uma UDP-GIc-DH são inibidores que regulam a atividade deuma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT (Campbell e outros,1997, J. Bioi Chem. 272(6), 3416-3422, Ordman e Kirkwood, 1977, Biochim.Biophys. Acta 482(1) 25-32; Turner e Botha, 2002, Archives of Biochem. Bi-ophys. 407, 209-216).As discussed above, it is unclear which metabolic pathway (phosphate hexose or myo-inositol oxidative metabolic pathway) is primarily used in plant cells to synthesize UDP-glucuronic acid, and both metabolic pathways become different quantitative contributions to UDP-glucuronic acid synthesis, depending on the tissue and / or stage of plant development. Furthermore, overexpression of a UDP-GIc-DH in transgenic plants does not lead to consistent results, and it was not possible to obtain the target to increase the cell wall pectin content that adopts such an approach. In addition, regulation of protein activity exhibiting the activity of a UDP-GIc-DH is inhibited by UDP-xylose. This has been demonstrated for both relevant proteins originating from prokaryotes (Campbell et al., 1997, J. Biol. Chem. 272 (6), 3416-3422; Schiller et al., 1973, Biochim. Biophys Acta 293 (1), 1- 10), animal organisms (Balduini et al., 1970, Biochem. J. 120 (4), 719-724) and plants (Hinterberg, 2002, Plant Physiol. Biochem. 40,1011-1017). In addition, reaction products with glucuronic acid and NA-DH that originate from a protein-catalyzed reaction that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH are inhibitors that regulate the activity of a protein that exhibits the activity of a GFAT (Campbell et al., 1997, J. Bioi Chem. 272 (6), 3416-3422, Ordman and Kirkwood, 1977, Biochim.Biophys Acta 482 (1) 25-32; Turner and Botha 2002 Archives of Biochem. ophys 407, 209-216).

A superexpressão, em milho, de uma proteína que apresenta aatividade (enzimática) de uma GFAT fundida transacionalmente com umpeptídeo de sinal plastídio resultou em um aumento no teor deUDP-glicosamina, e a superexpressão citosólica, em milho, de uma proteínaque apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT resultou em um au-mento no teor de glicosamina 1 -fosfato em tecido de endosperma moído.Entretanto, UDP-glicosamina e 1-fosfato de glicosamina não são materiaisde partida para a síntese de hialuronan por meio de hialuronan sintase. Alémdisso, sabe-se que glicosamina apresenta um efeito citotóxico sobre célulasvegetais (Roberts e outros, 1971, Plant Physiol. 48, 36-42) e que, se concen-trações relativamente altas estão presentes em células vegetais, ela é con-vertida em glicosamina 6-fosfato. Glicosamina 6-fosfato é também tóxicapara células vegetais (WO 98 35047, US 6.444.878). Além disso, sabe-seque proteínas que apresentam a atividade de uma GFAT podem ser regula-das de uma maneira inibitória por meio de metabólitos que são formados nocaminho metabólico adicional para a síntese de UDP-N-acetil-glicosamina.Proteínas que apresentam a atividade de uma GFAT, isoladas de eucariotes(tanto com organismos animais e vegetais) são inibidas, por exemplo, porUDP-N-acetil-glicosamina, que é um dos dois substratos para hialuronansintase (Kornfeld, 1967, J. Biol. Chem. 242(13), 3135-3141; Graack e outros,2001, Biochem. J. 360, 401-412; Mayer e outros, 1968, Plant Physiol. 43,1097-1107). Proteínas bacterianas que apresentam a atividade de umaGFAT são inibidas por glicosamina 6-fosfato, um produto de reação direta dareação catalisada por GFAT (Deng e outros, 2005, Metabolic Engineering 7,201-214).Não há indicações na literatura que poderão limitar a quantidadede hialuronan sintetizada em células vegetais.Overexpression in maize of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT transactionally fused to a plastid signal peptide resulted in an increase in the UDPP-glucosamine content, and cytosolic overexpression of a protein in maize shows activity ( Enzyme) of a GFAT resulted in an increase in glycosamine 1-phosphate content in ground endosperm tissue. However, UDP-glycosamine and glycosamine 1-phosphate are not starting materials for the synthesis of hyaluronan by hyaluronan synthase. In addition, it is known that glycosamine has a cytotoxic effect on plant cells (Roberts et al., 1971, Plant Physiol. 48, 36-42) and that if relatively high concentrations are present in plant cells, it is converted into plant cells. glycosamine 6-phosphate. Glycosamine 6-phosphate is also toxic to plant cells (WO 98 35047, US 6,444,878). Furthermore, it is known that proteins that exhibit GFAT activity can be inhibitively regulated by metabolites that are formed in the additional metabolic pathway for the synthesis of UDP-N-acetyl glycosamine. of a GFAT, isolated from eukaryotes (both with animal and plant organisms) are inhibited, for example, by UDP-N-acetyl glycosamine, which is one of two substrates for hyaluronansintase (Kornfeld, 1967, J. Biol. Chem. 242 ( 13), 3135-3141; Graack et al., 2001, Biochem. J. 360, 401-412; Mayer et al., 1968, Plant Physiol., 43, 1097-1107). Bacterial proteins that exhibit umaGFAT activity are inhibited by glycosamine 6-phosphate, a GFAT-catalyzed direct reaction product (Deng et al., 2005, Metabolic Engineering 7,201-214). There are no indications in the literature that could limit the amount of hyaluronan. synthesized in plant cells.

Conseqüentemente, verificou-se surpreendentemente, que célu-las vegetais geneticamente modificadas ou plantas geneticamente modifica-das que apresentam uma molécula de ácido nucléico que codifica um hialu-ronan sintase e que apresenta adicionalmente aumento na atividade deGFAT e aumento na atividade de UDP-GIc-DH comparado com células ge-neticamente modificadas ou plantas geneticamente modificadas que apre-sentam (apenas) atividade de hialuronan sintase produzem quantidades sig-nificativamente maiores de hialuronan.Consequently, it has been surprisingly found that genetically modified plant cells or genetically modified plants which have a nucleic acid molecule encoding a hyalu-ronan synthase and which additionally have increased GFAT activity and increased UDP-GIc activity. -DH compared to genetically modified cells or genetically modified plants that exhibit (only) hyaluronan synthase activity produce significantly higher amounts of hyaluronan.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se acélulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, em que elasproduzem um aumento na quantidade de hialuronan comparado com célulasvegetais geneticamente modificadas ou comparado com plantas genetica-mente modificadas que (apenas) apresentam a atividade de um hialuronansintase ou comparado com células vegetais geneticamente modificadas oucomparado com plantas geneticamente modificadas que apresentam a ativi-dade de um hialuronan sintase e nenhum aumento na atividade de uma pro-teína que apresenta a atividade de uma GFAT e nenhum aumento na ativi-dade de uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH.In a preferred embodiment, the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention, wherein they produce an increase in the amount of hyaluronan compared to genetically modified plant cells or compared to genetically modified plants. that (only) exhibit the activity of a hyaluronansynthase or compared to genetically modified plant cells or compared to genetically modified plants that exhibit the activity of a hyaluronan synthase and no increase in the activity of a protein that exhibits the activity of a GFAT and no increase in activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH.

Preferencialmente, a quantidade de hialuronan produzido comrelação à massa fresca do material vegetal nas células vegetais genetica-mente modificadas de acordo com a invenção ou nas plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção é pelo menos 1,5 vezes, preferenci-almente pelo menos 5 vezes, particular e preferencialmente pelo menos7,5 vezes e especialmente preferencialmente, pelo menos IOvezes maior,comparada com células vegetais geneticamente modificadas corresponden-tes ou comparada com plantas geneticamente modificadas correspondentesque (apenas) apresentam a atividade de um hialuronan sintase. Para deter-minar o aumento do teor de hialuronan com relação à massa fresca do mate-rial vegetal nas células vegetais geneticamente modificadas de acordo coma invenção ou nas plantas geneticamente modificadas de acordo com a in-venção, prefere-se comparar células vegetais geneticamente modificadas deacordo com a invenção ou plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção com células vegetais correspondentes ou plantas (apenas)que apresenta a atividade de hialuronan sintase, em que material equivalen-te (por exemplo folha, tubérculo) de células vegetais ou plantas deve sercomparado, as células vegetais ou plantas das quais esse material é tomadodevem ser cultivadas sob as mesmas condições e em que o teor de hialuro-nan de material vegetal que apresenta uma idade comparável (estágio dedesenvolvimento) deve ser comparado. Aquele versado na técnica não deve,por exemplo, comparar folhas novas de uma planta com folhas velhas deuma outra planta ou vegetais.Preferably, the amount of hyaluronan produced with respect to the fresh mass of plant material in genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention is at least 1.5 times, preferably at least 5 times. particularly and preferably at least 7.5 times and especially preferably at least 10 times larger compared with corresponding genetically modified plant cells or compared with corresponding genetically modified plants which (only) exhibit the activity of a hyaluronan synthase. In order to determine the increase in hyaluronan content with respect to the fresh mass of plant material in genetically modified plant cells according to the invention or in genetically modified plants according to the invention, it is preferred to compare genetically modified plant cells. according to the invention or genetically modified plants according to the invention with corresponding plant cells or plants (only) exhibiting the activity of hyaluronan synthase, where equivalent material (e.g. leaf, tuber) of plant cells or plants should be compared, Plant cells or plants from which this material is taken should be grown under the same conditions and where the hyaluro-nan content of plant material of comparable age (development stage) should be compared. One skilled in the art should not, for example, compare new leaves of one plant with old leaves of another plant or vegetables.

No contexto da presente invenção, o termo "célula vegetal ouplanta (apenas) que apresenta a atividade de uma hialuronan sintase" deve-se entender como significando uma célula vegetal geneticamente modificadaou uma planta geneticamente modificada em que a modificação genéticaconsiste pelo fato de ela compreenda uma molécula de ácido nucléico quecodifica uma hialuronan sintase, comparada a células vegetais do tipo selva-gem não geneticamente modificadas correspondentes ou plantas do tiposelvagem não geneticamente modificadas.In the context of the present invention, the term "plant cell or plant (only) which exhibits the activity of a hyaluronan synthase" shall be understood to mean a genetically modified plant cell or a genetically modified plant in which the genetic modification consists in the fact that it comprises a nucleic acid molecule that encodes a hyaluronan synthase compared to corresponding non-genetically modified jungle-like plant cells or non-genetically modified wild type plants.

Em particular, "células vegetais ou plantas (apenas) que apre-sentam a atividade de um hialuronan sintase" caracterizam-se pelo fato deque elas sintetizam hialuronan e que elas apresentam nenhuma modificaçãogenética adicional a não ser a introdução de uma molécula de ácido nucléicoque codifica uma hialuronan sintase em células vegetais do tipo selvagemnão geneticamente modificadas ou plantas do tipo selvagem não genetica-mente modificadas. Preferencialmente, essas plantas não apresentam umaumento na atividade de uma proteína que apresenta a atividade de umaGFAT e nenhum aumento na atividade de uma proteína que apresenta aatividade de uma UDP-GIc-DH.In particular, "plant or plant cells (only) that exhibit the activity of a hyaluronan synthase" are characterized by the fact that they synthesize hyaluronan and that they have no additional genetic modification other than the introduction of a nucleic acid molecule that encodes a hyaluronan synthase in non-genetically modified wild-type plant cells or non-genetically modified wild-type plants. Preferably, these plants do not show an increase in the activity of a protein that exhibits the activity of umaGFAT and no increase in the activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH.

A quantidade de hialuronan produzida por células vegetais ouplantas pode ser determinada com o auxílio dos métodos que já foram des-critos acima, por exemplo, usando um kit de teste comercial (por exemplo okit de teste ácido hialurônico (HA) de Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod.No. 029-001). Um método que é preferido no contexto da presente invençãopara determinar o teor de hialuronan em células vegetais ou plantas é des-crito sob Métodos Gerais, item 4.The amount of hyaluronan produced by plant cells or plants can be determined with the aid of the methods already described above, for example using a commercial test kit (eg Corgenix, Inc. hyaluronic acid (HA) test kit). , Colorado, USA, Prod. No. 029-001). A method which is preferred in the context of the present invention to determine the hyaluronan content in plant cells or plants is described under General Methods, item 4.

Em uma modalidade adicional da presente invenção, as célulasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção ou as plantas geneti-camente modificadas de acordo com a invenção são células vegetais deuma planta terrestre verde ou plantas terrestres verdes, respectivamente,que sintetizam hialuronan.In a further embodiment of the present invention, genetically modified cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention are plant cells of a green terrestrial plant or green terrestrial plants, respectively, which synthesize hyaluronan.

No contexto da presente invenção, o termo "planta terrestre ver-de (Embriófito)" deve-se entender conforme definido in Strasburger, uLehr-buch der Botanik' [Livro-texto de Botânica], 34-. edM Spektrum Akad. Verl.,1999, (ISBN 3-8274-0779-6).In the context of the present invention, the term "earth-green (Embryophyte) plant" is to be understood as defined in Strasburger, ULehr-buch der Botanik ', [34]. edM Spektrum Akad. Verl., 1999, (ISBN 3-8274-0779-6).

Uma modalidade preferida da presente invenção refere-se a cé-lulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção deplantas multicelulares ou plantas geneticamente modificadas de acordo coma invenção, as quais são organismos multicelulares. Conseqüentemente,essa modalidade refere-se a células vegetais ou plantas que não se origi-nam de células vegetais únicas (protistas) ou que não são protistas.A preferred embodiment of the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention of multicellular plants or genetically modified plants according to the invention which are multicellular organisms. Consequently, this modality refers to plant cells or plants that do not originate from single plant cells (protists) or that are not protists.

As células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou as plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção poderão, em princípio, ser células vegetais e plantas, respectivamente,de qualquer espécie de planta, isto é, tanto plantas monocotiledôneas quan- to dicotiledôneas. Elas são preferencialmente plantas de cultura, isto é, plan-tas cultivadas pelo homem para a finalidade de alimentar homem e animal,ou para produzir biomassa e/ou para preparar substâncias para finalidadestécnicas, industriais (por exemplo milho, arroz, trigo, alfafa, centeio, aveia,cevada, mandioca, batata, tomate, "switchgrass" (Panicum virgatum), sagu, feijões-mungo, ervilhas, sorgo, cenoura, aubergina, rabanete, óleo de se-mente de colza, sojas, amendoins, pepinos, abóboras, melões, alho-poró,alho, repolho, espinafre, batata-doce, aspargo, abobrinhas alface, alcacho-fras, milho verde, pastinaca, escorcioneira, alcachofra de Jerusalém, bana-na, beterraba açucareira, cana-de-açúcar, raiz de beterraba, brócolos, repo-lho, cebola, beterraba amarela, dente-de-leão, morango, maçã, damasco,ameixa, pêssego, videiras, couve-flor, aipo, pimentão, nabo, ruibarbo).Genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention may in principle be plant cells and plants, respectively, of any plant species, ie both monocotyledonous and dicotyledonous plants. . They are preferably crop plants, that is, plants grown by man for the purpose of feeding man and animal, or to produce biomass and / or to prepare substances for technical, industrial purposes (eg maize, rice, wheat, alfalfa, rye, oats, barley, cassava, potato, tomato, switchgrass (Panicum virgatum), sago, mung beans, peas, sorghum, carrot, aubergine, radish, rapeseed oil, soy, peanuts, cucumbers, pumpkins, melons, leek, garlic, cabbage, spinach, sweet potato, asparagus, zucchini lettuce, artichoke, green corn, flan, scorching, jerusalem artichoke, bana, sugar beet, sugar cane , beet root, broccoli, lamb, onion, yellow beet, dandelion, strawberry, apple, apricot, plum, peach, vines, cauliflower, celery, bell pepper, turnip, rhubarb).

Particularmente preferidas são plantas de tomate ou batata.Particularly preferred are tomato or potato plants.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se acélulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção em que a mo-lécula de ácido nucléico que codifica hialuronan sintase caracteriza-se pelofato de que ela codifica uma hialuronan sintase viral. A molécula de ácidonucléico que codifica hialuronan sintase, preferencialmente, codifica um hia-luronan sintase de um vírus infectante de algas.In a preferred embodiment, the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention wherein the hyaluronan synthase nucleic acid molecule is characterized by the phage of which it encodes a plant. hyaluronan viral synthase. The hyaluronan synthase encoding nucleic acid molecule preferably encodes a hyaluronan synthase of an algal infecting virus.

Com relação a um vírus infectante de algas, a molécula de ácidonucléico que codifica um hialuronan sintase, preferencialmente codifica umhialuronan sintase de um vírus infectante Chlorella, particular e preferencial-mente um hialuronan sintase de um vírus 1 Chlorella de Paramecium bursaria eespecial e preferencialmente um hialuronan sintase de um vírus Chlorella deParamecium bursaria de uma cepa H1.With respect to an algal infecting virus, the nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase preferably encodes a hyaluronan synthase of a Chlorella infecting virus, particularly preferably a hyaluronan synthase of a 1 Chlorella of Paramecium bursaria eespecial and preferably a hyaluronan synthase. synthase of a Chlorella deParamecium bursaria virus from an H1 strain.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, a presente in-venção refere-se a células vegetais geneticamente modificadas de acordocom a invenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a in-venção em que a molécula de ácido nucléico que codifica o hialuronan sinta-se caracteriza-se pelo fato de que códons da molécula de ácido nucléico quecodifica um hialuronan sintase são modificadas comparadas com os códonsda molécula de ácido nucléico que codifica o hialuronan sintase do organis-mo que o hialuronan sintase origina-se. Com preferência particular, os có-dons do hialuronan sintase têm de ser modificados de tal modo que eles se-jam adaptados para a freqüência do uso dos códons da célula vegetal ou daplanta em cujo genoma eles são integrados ou devem ser integrados.In a further preferred embodiment, the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention wherein the hyaluronan-encoding nucleic acid molecule is characterized by: The codons of the nucleic acid molecule that encodes a hyaluronan synthase are modified compared to the codons of the nucleic acid molecule encoding the hyaluronan synthase from which the hyaluronan synthase originates. With particular preference, the codons of hyaluronan synthase must be modified such that they are adapted to the frequency of use of the plant cell codons or plant in whose genome they are integrated or must be integrated.

Devido à degeneração do código genético, aminoácidos podemser codificados por um ou mais códons. Em diferentes organismos, os có-dons que codificam um aminoácido são usados sob diferentes freqüências.Adaptação dos códons de uma seqüência de codificação de ácido nucléico àfreqüência de seu uso na célula vegetal ou na planta em cujo genoma a se-qüência a ser expressa a ser integrada poderá contribuir para um aumento naquantidade de proteína traduzida e/ou à estabilidade do mRNA em questão nascélulas vegetais ou plantas particulares. A freqüência de uso de códons nascélulas vegetais ou plantas em questão pode ser determinada por aqueleversado na técnica examinando como muitas seqüências de codificação deácidos nucléicos do organismo em questão quanto possíveis para a freqüên-cia com que certos códons são usados para codificar um certo aminoácido.A freqüência do uso de códons de certos organismos é conhecida daqueleversado na técnica e pode ser determinada de uma maneira simples e rápidausando programas de computador. Programas de computador adequados sãopublicamente acessíveis e proporcionados livremente, entre outros, na Inter-net (por exemplo http://gcua.schoedl.deA http://www.kazusa.ou.jp/codonf,http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html).Due to the degeneration of the genetic code, amino acids may be encoded by one or more codons. In different organisms, codons encoding an amino acid are used at different frequencies. Codon adaptation of a nucleic acid coding sequence to the frequency of its use in the plant cell or plant in whose genome the sequence to be expressed is. Being integrated may contribute to an increase in the amount of translated protein and / or the stability of the mRNA in question in particular plant cells or plants. The frequency of use of the plant or plant cell codons in question can be determined by that in the art by examining as many nucleic acid coding sequences of the organism in question as possible for the frequency with which certain codons are used to encode a certain amino acid. The frequency of codon usage of certain organisms is known to those of skill in the art and can be determined simply and quickly using computer programs. Suitable computer programs are publicly accessible and freely provided, inter alia, on the Internet (eg http: //gcua.schoedl.deA http://www.kazusa.ou.jp/codonf,http://www.entelechon .com / eng / cutanalysis.html).

Adaptação dos códons de uma seqüência de codificação de áci-do nucléico à freqüência de seu uso na célula vegetal ou na planta em cujogenoma a seqüência a ser expressa é integrada pode ser realizada por mu·tagênese in vitro ou, preferencialmente, por síntese de novo da seqüênciagenética. Métodos para a síntese de novo de seqüências de ácidos nucléi-cos são conhecidos por aquele versado na técnica. Uma síntese de novopode ser realizada, por exemplo, inicialmente sintetizando oligonucleotídeosde ácidos nucléicos individuais, hibridizando estes com oligonucleotídeoscomplementares a estes, de tal modo que eles formem uma fita-dupla deDNA, e em seguida ligando os oligonucleotídeos individuais de fita-dupla demodo que a seqüência de ácido nucléico desejada seja obtida. A síntese denovo de seqüências de ácidos nucléicos, incluindo a adaptação da freqüên-cia com que os códons são usados para um certo organismo-alvo podemtambém ser originadas externamente de empresas que oferecem esse ser-viço (por exemplo, Entelechon GmbH, Regensburg, Alemanha).Adaptation of the codons of a nucleic acid coding sequence to the frequency of its use in the plant cell or plant in which the sequence to be expressed is integrated can be performed by in vitro mutagenesis or, preferably, by de novo synthesis. of the genetic sequence. Methods for de novo synthesis of nucleic acid sequences are known to those skilled in the art. A novel synthesis can be performed, for example, initially by synthesizing individual nucleic acid oligonucleotides, hybridizing them to complementary oligonucleotides, such that they form a double-stranded DNA strand, and then ligating the single-stranded single-stranded oligonucleotides. desired nucleic acid sequence is obtained. The new synthesis of nucleic acid sequences, including the adaptation of the frequency with which codons are used for a given target organism, may also originate externally from companies offering such a service (eg Entelechon GmbH, Regensburg, Germany). ).

A molécula de ácido nucléico que codifica o hialuronan sintasecaracteriza-se preferencialmente pelo fato de que ela codifica um hialuronansintase cuja seqüência de aminoácidos é pelo menos 70%, preferencialmentepelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especial e preferenci-almente pelo menos 95%, e mais preferencialmente, pelo menos 98% idênticaà seqüência de aminoácidos mostrada sob SEQ ID NO 2. Em uma modali-dade particularmente preferida, a molécula de ácido nucléico que codifica ohialuronan sintase caracteriza-se pelo fato de que ela codifica um hialuronansintase que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada sob SEQ ID NO. 2.The nucleic acid molecule encoding hyaluronan synthase is preferably characterized by the fact that it encodes a hyaluronan synthase whose amino acid sequence is at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 90%. 95%, and most preferably at least 98% identical to the amino acid sequence shown under SEQ ID NO 2. In a particularly preferred embodiment, the nucleic acid molecule encoding the hyaluronan synthase is characterized by the fact that it encodes a hyaluronansynthase. which shows the amino acid sequence shown under SEQ ID NO. 2.

Em uma modalidade adicional, a molécula de ácido nucléico quecodifica um hialuronan sintase é pelo menos 70%, preferencialmente pelomenos 80%, com preferência pelo menos 90%, especial e preferencialmentepelo menos 95% e, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à se-qüência de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO.1 ou SEQ ID NO. 3. Emuma modalidade particularmente preferida, a molécula de ácido nucléico quecodifica o hialuronan sintase caracteriza-se pelo fato de que ela apresenta aseqüência de ácidos nucléicos mostrada sob SEQ ID NO. 3.In a further embodiment, the nucleic acid molecule that encodes a hyaluronan synthase is at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95%, and most preferably at least 98% identical to the one below. nucleic acid frequency shown under SEQ ID NO.1 or SEQ ID NO. 3. In a particularly preferred embodiment, the nucleic acid molecule that encodes hyaluronan synthase is characterized by the fact that it has the nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO. 3

Em 25. 8. 2004, o plasmídeo IC 341-222, que compreende umacodificação de molécula de ácido nucléico sintético de uma hialuronan sinta-se de vírus Chlorella de Paramecium bursaría foi depositado rio DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg1b, 38124 Brunswick, Alemanha, sob o número DSM16664, de acordo como tratado de Budapeste. A seqüência de aminoácidos mostrada in SEQ IDNO. 2, pode-se derivar da região de codificação da seqüência de ácidos nu-cléicos integrados para o plasmídeo IC 341-222 e codifica uma hialuronansintase de vírus Chlorella de Paramecium bursaría.On 25. 8. 2004, plasmid IC 341-222, which comprises a coding of a synthetic nucleic acid molecule of a hyaluronan feel for Chlorella de Paramecium bursaria virus, was deposited with DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg1b, 38124 Brunswick , Germany, under number DSM16664, according to the Budapest treaty. The amino acid sequence shown in SEQ IDNO. 2, it can be derived from the coding region of the integrated nucleic acid sequence for plasmid IC 341-222 and encodes a Chlorella virus hyaluronansintase from Paramecium bursaría.

Conseqüentemente, a presente invenção também se refere acélulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com. a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção em que a mo-lécula de ácido nucléico que codifica o hialuronan sintase caracteriza-se pelofato de ela codifica uma proteína cuja seqüência de aminoácidos pode serderivada da região de codificação da seqüência de ácidos nucléicos inseridano plasmídeo DSM16664 ou que ela codifica uma proteína cuja seqüênciade aminoácidos é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%,com preferência pelo menos 90%, especial e preferencialmente pelo menos95% e, mais preferencialmente, pelo menos 98% idêntica à seqüência deaminoácidos que pode ser derivada da região de codificação da seqüênciade ácido nucléico inserida no plasmídeo DSM16664.Accordingly, the present invention also relates to genetically modified plant cells according to. The invention or genetically modified plants according to the invention wherein the nucleic acid molecule encoding the hyaluronan synthase is characterized by the fact that it encodes a protein whose amino acid sequence may be derived from the coding region of the nucleic acid sequence inserted into the plasmid. DSM16664 or which encodes a protein whose amino acid sequence is at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95%, and more preferably at least 98% identical to the amino acid sequence that can be derived from the nucleic acid sequence coding region inserted in plasmid DSM16664.

A presente invenção também se refere a células vegetais gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção em que a molécula de ácido nucléicoque codifica o hialuronan sintase caracteriza-se pelo fato de que ela é a se-qüência de ácido nucléico que codifica hialuronan sintase integrada noplasmídeo DSM16664 ou que ela é pelo menos 70%, preferencialmente pelomenos 80%, com preferência pelo menos 90%, especial e preferencialmentepelo menos 95% e, mais preferencialmente, pelo menos 98% idêntica à se-qüência de ácido nucléico integrada no plasmídeo DSM16664.The present invention also relates to genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention wherein the nucleic acid molecule encoding hyaluronan synthase is characterized by the fact that it is the sequence of nucleic acid encoding integrated hyaluronan synthase in DSM16664 or at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and more preferably at least 98% identical to nucleic acid sequence integrated into plasmid DSM16664.

A presente invenção adicionalmente refere-se a células vegetaisgeneticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção que se caracteriza pelo fatode que elas apresentam uma molécula de ácido nucléico estanha estavel-mente integrada em seu genoma ou uma pluralidade de moléculas de ácidonucléico estranhas estavelmente integrada em seu genoma, essa moléculade ácido nucléico estranha ou essas moléculas de ácido nucléico estranhasque aumentam a atividade de uma proteína que apresenta a atividade deuma GFAT e que aumenta a atividade de uma proteína que apresenta a ati-vidade de uma UDP-GIc-DH comparada com células vegetais do tipo selva-gem não geneticamente modificadas correspondentes ou plantas do tiposelvagem não geneticamente modificadas correspondentes.The present invention further relates to genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention characterized by the fact that they have a stably integrated nucleic acid molecule in their genome or a plurality of foreign nucleic acid molecules stably integrated into their genome, such foreign nucleic acid molecule or foreign nucleic acid molecules which increase the activity of a protein that exhibits the activity of a GFAT and that increases the activity of a protein that exhibits activity of a UDP-GIc-DH compared to corresponding non-genetically modified wild-type plant cells or corresponding non-genetically modified wild type plants.

Poderá ser uma única molécula de ácido nucléico estranha que,por meio de integração no genoma de células vegetais geneticamente modi-ficadas de acordo com a invenção ou plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção, aumenta a atividade de uma proteína que apresentaa atividade de uma GFAT e simultaneamente aumenta a atividade <Je umaproteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH comparada comcélulas vegetais do tipo selvagem correspondente ou com plantas do tiposelvagem correspondentes. Contudo, poderá também ser uma pluralidadede moléculas de ácido nucléico estranhas, uma molécula de ácido nucléicoestranha da qual aumenta a atividade de uma proteína que apresenta a ati-vidade de uma UDP-GIc-DH e uma outra molécula de ácido nucléico estra-nha que aumenta a atividade de uma proteína que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH comparada com as células vegetais do tipo selvagem cor-respondentes ou as plantas do tipo selvagem correspondentes. Se uma plu-ralidade de moléculas de ácido nucléico estranhas é integrada no genomade uma célula vegetal geneticamente modificada de acordo com a invençãoou uma planta geneticamente modificada de acordo com a invenção, ambasas moléculas de ácido nucléico estranhas juntamente poderão estar em umsítio no genoma da célula vegetal ou da planta, ou elas poderão ser localiza-das em diferentes sítios no genoma da célula vegetal ou da planta (por e-xemplo, em diferentes cromossomos ou diferentes seções cromossômicas).It may be a single foreign nucleic acid molecule which, by integration into the genome of genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention, enhances the activity of a protein that exhibits GFAT activity and simultaneously increases the activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH compared to corresponding wild type plant cells or corresponding wild type plants. However, it may also be a plurality of foreign nucleic acid molecules, a foreign nucleic acid molecule from which increases the activity of a protein having the activity of a UDP-GIc-DH and another foreign nucleic acid molecule that increases the activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH compared to corresponding wild type plant cells or corresponding wild type plants. If a plurality of foreign nucleic acid molecules are integrated into the genome a genetically modified plant cell according to the invention or a genetically modified plant according to the invention, both foreign nucleic acid molecules together may be in one site in the cell genome. plant or plant, or they may be located at different sites in the plant or plant cell genome (for example, on different chromosomes or different chromosomal sections).

Conseqüentemente, as moléculas de ácido nucléico estranhas poderão serherdadas como um local de ligação ou como locais (locí) acoplados de acor-do com regras de Mendel, ou elas poderão ser herdadas como locais sepa-rados independentemente um do outro de acordo com regras de Mendel.Consequently, foreign nucleic acid molecules may be inherited as a binding site or as coupled sites (loci) according to Mendel rules, or they may be inherited as separate sites independently of each other according to Mendel

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácidonucléico estranha" deve-se entender como significando uma molécula quenão naturalmente ocorre nas células vegetais do tipo selvagem correspon-dente ou que não naturalmente ocorre no arranjo espacial concreto em célu-las vegetais do tipo selvagem ou que é localizada em um sítio no genoma dacélula vegetal do tipo selvagem em que ela não naturalmente ocorre. Prefe-rencialmente, a molécula de ácido nucléico estranha é uma molécula recom-binante que compreende vários elementos cuja combinação ou arranjo es-pacial específico não naturalmente ocorre em células vegetais.In the context of the present invention, the term "foreign acid molecule" is to be understood to mean that a molecule does not naturally occur in the corresponding wild type plant cells or that does not naturally occur in the concrete spatial arrangement in plant type cells. wild or that is located at a site in the wild-type plant cell genome where it does not naturally occur. Preferably, the foreign nucleic acid molecule is a recombinant molecule comprising several elements whose specific combination or arrangement does not naturally occur in plant cells.

No contexto da presente invenção, o termo "molécula de ácidonucléico recombinante" deve-se entender como significando uma moléculade ácido nucléico que apresenta várias moléculas de ácido nucléico que nãoestão naturalmente presentes em uma combinação semelhante àquela pre-sente em uma molécula de ácido nucléico recombinante. Desse modo, mo-léculas de ácido nucléico recombinante poderão, além de moléculas de áci-do nucléico que codificam um hialuronán sintase e/ou uma proteína que a-presenta a atividade de uma GFAT e/ou uma proteína que apresenta a ativi-dade de uma UDP-GIc-DH, adicionalmente apresentam seqüências de áci-dos nucléicos que não estão naturalmente presentes em combinação comas moléculas de ácido nucléico mencionadas. As seqüências de ácidos nu-cléicos adicionais mencionadas que estão presentes em uma molécula deácido nucléico recombinante em combinação com uma molécula de ácidonucléico que codifica um hialuronan sintase ou uma proteína que apresentaa atividade de uma GFAT e/ou uma proteína que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH poderão ser quaisquer seqüências. Por exemplo, elas po-derão ser seqüências de ácidos nucléicos genômicas de vegetal. As se-qüências de ácidos nucléicos adicionais mencionadas são preferencialmenteseqüências regulatórias (promotores, sinais de terminação, acentuadores),particular e preferencialmente seqüências regulatórias que são ativas emtecido vegetal, especial e preferencialmente seqüências regulatórias especí-ficas a tecidos que são ativas em tecido vegetal. Métodos de geração de molé-culas de ácido nucléicos recombinantes são conhecidos daquele versado natécnica e compreendem métodos de engenharia genética, tal como, por exem-plo, ligação de moléculas de ácidos nucléicos por meio de ligação, recombi-nação genética ou a síntese de novo de moléculas de ácidos nucléicos (vide,por exemplo, Sambrok e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a·edição (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour,NY. ISBN: 0879695773, Ausubel e outros, Short Protocols in Molecular Bio-logy, John Wiley & Sons; 5a edição (2002), ISBN: 0471250929).In the context of the present invention, the term "recombinant nucleic acid molecule" is to be understood to mean a nucleic acid molecule having several non-naturally occurring nucleic acid molecules present in a combination similar to that present in a recombinant nucleic acid molecule. . Thus, recombinant nucleic acid molecules may, in addition to nucleic acid molecules encoding a hyaluronan synthase and / or a protein that exhibits the activity of a GFAT and / or a protein exhibiting the activity. of a UDP-GIc-DH additionally have nucleic acid sequences that are not naturally present in combination with the mentioned nucleic acid molecules. The aforementioned additional nucleic acid sequences that are present in a recombinant nucleic acid molecule in combination with a nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase or a protein that exhibits the activity of a GFAT and / or a protein that exhibits the activity of a UDP -GIc-DH could be any sequences. For example, they may be sequences of plant genomic nucleic acids. The additional nucleic acid sequences mentioned are preferably regulatory sequences (promoters, termination signals, enhancers), particularly and preferably regulatory sequences that are active in plant tissue, especially and preferably tissue-specific regulatory sequences that are active in plant tissue. Methods of generating recombinant nucleic acid molecules are known from that skilled artisan and comprise methods of genetic engineering, such as, for example, ligation of nucleic acid molecules by ligation, genetic recombination or synthesis of of nucleic acid molecules (see, for example, Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Bio-logy, John Wiley &Sons; 5th Edition (2002), ISBN: 0471250929).

Células vegetais geneticamente modificadas e plantas geneti-camente modificadas que apresentam uma molécula de ácido nucléico es-tranha estavelmente integrada em seu genoma ou uma pluralidade de molé-cuias de ácido nucléico estranhas estavelmente integradas em seu genomaque codifica hialuronan sintase e que aumenta aumenta a atividade de umaproteína que apresenta a atividade de uma GFAT e aumenta a atividade deuma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH comparadacom células vegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas cor-respondentes ou plantas do tipo selvagem não geneticamente modificadaspodem-se distinguir dessas células vegetais do tipo selvagem e dessas plan-tas do tipo selvagem, respectivamente, entre outros, através do fato de queelas compreendem uma molécula de ácido nucléico estranha que não natu-ralmente ocorrem em células vegetais do tipo selvagem e plantas do tiposelvagem, respectivamente, ou que tal molécula é integrada em um sítio nogenoma da célula vegetal geneticamente modificada de acordo com a inven-ção ou no genoma da planta geneticamente modificada de acordo com ainvenção em que isso não ocorre em células vegetais do tipo selvagem eplantas do tipo selvagem, respectivamente, isto é, em um ambiente genômi-co diferente. Além disso, essas células vegetais geneticamente modificadasde acordo com a invenção e plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção podem-se distinguir de células vegetais do tipo selvagemnão geneticamente modificadas e plantas do tipo selvagem não genetica-mente modificadas, respectivamente, pelo fato de que elas compreendempelo menos uma cópia da molécula de ácido nucléico estranha estavelmenteintegrada em seu genoma, se apropriada, além das cópias de tal moléculanaturalmente presente nas células vegetais do tipo selvagem ou plantas dotipo selvagem. Se a(s) molécula(s) de ácidos nucléicos estranha(s) introdu-zida^) nas células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou as plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção são cópias adicionais de moléculas já naturalmente presentes nas célu-Ias vegetais do tipo selvagem ou nas plantas do tipo selvagem, as célulasvegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção e as plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção podem-se distinguirde células vegetais do tipo selvagem e plantas do tipo selvagem, respecti-vamente, em particular, pelo fato de que essa cópia adicional/essas cópiasadicionais é/são localizada(s) em sítios no genoma em que ela/elas não es-tá/estão presente(s) em células vegetais do tipo selvagem e plantas do tiposelvagem, respectivamente.A integração estável de uma molécula de ácido nucléico no ge-noma de uma célula vegetal ou uma planta pode ser demonstrada por méto-dos genéticos e/ou métodos de biologia molecular. Uma integração estávelde uma molécula de ácido nucléico no genoma de uma célula vegetal ou ogenoma de uma planta caracterizada pelo fato de que na progênie que temherdado essa molécula de ácido nucléico, a molécula de ácido nucléico és-tavelmente integrada está presente no mesmo ambiente genômico como nageração de origem. A presença de uma integração estável de uma seqüên-cia de ácido nucléico no genoma de uma célula vegetal ou no genoma deuma planta pode ser demonstrada usando métodos conhecidos daquele ver-sado na técnica, entre outros, com o auxílio de análise Southern blot da aná-lise de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Nam e outros,1989, The Plant Cell 1, 699-705; Leister e Dean, 1993, The Plant Journal 4(4), 745-750), com métodos baseados em PCR, tal como, por exemplo, aanálise de diferenças no comprimento no fragmento amplificado (AmplifiedFragment Length Polymorphism, AFLFf) (Castiglioni e outros, 1998, Genetics149, 2039-2056; Meksem e outros, 2001, Molecular Genetics and Genomics265, 207-214; Meyer e outros, 1998, Molecular and General Genetics 259,150-160) ou usando fragmentos amplificados clivados com o auxílio de en-donucleases de restrição (Cleaved Amplified Polymorphic Sequenees,CAPS) (Konieczny e Ausubel1 1993, The Plant Journal 4, 403-410; Jarvis eoutros, 1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687; Bachem e outros, 1996,The Plant Journal 9 (5), 745-753).Genetically modified plant cells and genetically modified plants that have a strangely integrated stranded nucleic acid molecule in their genome or a plurality of stably integrated stranded nucleic acid molecules in their genome which encodes hyaluronan synthase and which increases activity of a protein that exhibits the activity of a GFAT and enhances the activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH compared with corresponding non-genetically modified wild-type plant cells or non-genetically modified wild-type plants can be distinguished from these wild-type plant cells and these wild-type plants, respectively, among others, by the fact that they comprise a foreign nucleic acid molecule that does not naturally occur in wild-type plant cells and wild-type plants, respectively, or that such a molecule is integrated into one s genetically modified plant cell genome according to the invention or genetically modified plant genome according to the invention where this does not occur in wild-type plant cells and wild-type plants, respectively, ie in a genomic environment. - How different. Furthermore, such genetically modified plant cells according to the invention and genetically modified plants according to the invention can be distinguished from non-genetically modified wild-type plant cells and non-genetically modified wild-type plants, respectively, in that they comprise at least one copy of the foreign nucleic acid molecule stably integrated into its genome, if appropriate, in addition to copies of such a molecule naturally present in wild type plant cells or wild type plants. If the foreign nucleic acid molecule (s) introduced into the genetically modified plant cells according to the invention or the genetically modified plants according to the invention are additional copies of naturally occurring molecules In wild type plant cells or wild type plants, genetically modified plant cells according to the invention and genetically modified plants according to the invention can be distinguished from wild type plant cells and wild type plants, respectively. in particular, by the fact that this additional copy / additional copies are / are located at sites in the genome where they are not present in wild-type plant cells and plants of the wild. The stable integration of a nucleic acid molecule into the genome of a plant cell or plant can be demonstrated by genetic and / or genetic methods. molecular biology methods. A stable integration of a nucleic acid molecule into the genome of a plant cell or the genome of a plant characterized by the fact that in the progeny that has inherited this nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule is stably integrated is present in the same genomic environment as nageration of origin. The presence of stable integration of a nucleic acid sequence into the genome of a plant cell or the genome of a plant can be demonstrated using methods known in the art, among others, with the aid of Southern blot analysis of the analogue. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) -lysis (Nam et al., 1989, The Plant Cell 1, 699-705; Leister and Dean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750), with PCR-based methods , such as, for example, analysis of length differences in the AmplifiedFragment Length Polymorphism, AFLFf (Castiglioni et al., 1998, Genetics149, 2039-2056; Meksem et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics265, 207-214; Meyer et al., 1998, Molecular and General Genetics 259,150-160) or using Cleaved Amplified Polymorphic Sequenees (CAPS) cleaved amplified fragments (Konieczny and Ausubel1 1993, The Plant Journal 4, 403-410 ; Jarvis eoutr 1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687; Bachem et al., 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753).

Em princípio, a molécula de ácido nucléico estranha poderá serqualquer molécula de ácido nucléico que aumenta, na célula vegetal ou plan-ta, a atividade de uma proteína que apresenta a atividade de uma GFATe/ou a atividade de uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-Glc-DH.In principle, the foreign nucleic acid molecule may be any nucleic acid molecule that increases, in the plant or plant cell, the activity of a protein that exhibits the activity of a GFATe / or the activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-Glc-DH.

No contexto da presente invenção, células vegetais genetica-mente modificadas de acordo com a invenção e plantas geneticamente mo-dificadas de acordo com a invenção podem ser também preparadas usandomutagênese de inserção (revisão: Thorneycroft e outros, 2001, Journal ofexperimental Botany 52 (361), 1593-1601). No contexto da presente inven-ção, mutagênese de inserção deve-se entender como significando em parti-cular a inserção de transposons ou DNA de transferência (T-DNA) para umgene ou para os arredores de um gene que codifica uma proteína que apre-senta a atividade de uma GFAT e/ou que codifica uma proteína que apre-senta a atividade de uma UDP-GIc-DH, desse modo aumentando a atividadede uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT e/ou uma proteínaque apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH na célula em questão.In the context of the present invention, genetically modified plant cells according to the invention and genetically engineered plants according to the invention may also be prepared using random insertion genesis (review: Thorneycroft et al., 2001, Journal of Experimental Botany 52 (361 ), 1593-1601). In the context of the present invention, insertion mutagenesis is to be understood to mean in particular the insertion of transposons or transfer DNA (T-DNA) into or around a gene encoding a protein that has GFAT activity and / or encoding a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH, thereby increasing the activity of a protein that exhibits the activity of a GFAT and / or a protein exhibits the activity of UDP-GIc-DH in the cell in question.

Os transposons poderão ser transposons que ocorrem natural-mente na célula (transposons endógenos) ou aqueles que não estão natu-ralmente presentes nessa célula mas foram introduzidos na célula por meiode engenharia genética, tal como, por exemplo, transformação da célula(transposons heterólogos). A modificação da expressão de genes por meiode transposons é conhecida daquele versado na técnica. Uma revisão douso de transposons endógenos e heterólogos como ferramentas em biotec-nologia vegetal é dada in Ramachandran e Sundaresan (2001, Plant Physio-Iogy and Biochemistry 39, 234-252).Transposons may be transposons that occur naturally in the cell (endogenous transposons) or those that are not naturally present in the cell but have been introduced into the cell by genetic engineering, such as, for example, cell transformation (heterologous transposons). . Modification of gene expression by half transposons is known to one of skill in the art. A doubled review of endogenous and heterologous transposons as tools in plant biotechnology is given in Ramachandran and Sundaresan (2001, Plant Physio-Iogy and Biochemistry 39, 234-252).

Mutagênese de inserção de T-DNA baseia-se no fato de quecertas seções (T-DNA) de plasmídeos Ti de Agrobacterium podem ser inte-gradas no genoma de células vegetais. O sítio de integração no cromosso-mo vegetal não é fixo, integração pode ser em qualquer local. Se o T-DNA éintegrado em uma seção ou nos arredores de uma seção do cromossomoque representa uma função genética, este poderá resultar em um aumentona expressão gênica e desse modo também uma alteração na atividade deuma proteína codificada pelo gene em questão.T-DNA insertion mutagenesis is based on the fact that certain sections (T-DNA) of Agrobacterium Ti plasmids can be integrated into the plant cell genome. The integration site on the plant chromosome is not fixed, integration can be anywhere. If T-DNA is integrated into or around a section of the chromosomock represents a genetic function, it may result in increased gene expression and thus a change in the activity of a protein encoded by the gene in question.

As seqüências inseridas no genoma (em particular transposonsou T-DNA) são caracterizadas pelo fato de que elas compreendem seqüên-cias que resultam na ativação de seqüências regulatórias de um gene quecodifica uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT e/ou que co-difica uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH ("marca-ção por ativação"). Preferencialmente, as seqüências inseridas no genoma(em particular transposons ou T-DNA) são caracterizadas pelo fato de queelas são integradas nos arredores de moléculas de ácido nucléico endógenono genoma da célula vegetal ou da planta que codifica uma proteína queapresenta a atividade de uma GFAT e/ou uma proteína que apresenta a ati-vidade de uma UDP-GIc-DH.Sequences inserted into the genome (in particular transposons or T-DNA) are characterized by the fact that they comprise sequences that result in activation of regulatory sequences of a gene that encodes a protein that exhibits the activity of a GFAT and / or which co- differs a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH ("activation labeling"). Preferably, sequences inserted into the genome (in particular transposons or T-DNA) are characterized by the fact that they are integrated in the vicinity of endogenous nucleic acid molecules in the plant or plant genome encoding a protein that has the activity of a GFAT and / or a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH.

Células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção e plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãopodem ser geradas, por exemplo, usando o método de marcação por ativa-ção (vide, por exemplo, Walden e outros, Plant J. (1991), 281-288; Walden eoutros, Plant Moi Biol. 26 (1994), 1521-1528). Este método baseia-se naativação de promotores endógenos por meio de seqüências acentuadoras,tais como, por exemplo, o acentuador do promotor 35S RNA do vírus mosai-co da couve-flor ou o acentuador de octopina sintase.Genetically modified plant cells according to the invention and genetically modified plants according to the invention can be generated, for example, using the activation labeling method (see, for example, Walden et al., Plant J. (1991), 281 -288; Walden et al., Plant Moi Biol. 26 (1994), 1521-1528). This method is based on activating endogenous promoters by enhancer sequences, such as, for example, the cauliflower mosquito virus 35S RNA promoter enhancer or the octopin synthase enhancer.

No contexto da presente invenção, o termo "marcação por ativa-ção de T-DNA" deve-se entender como significando um fragmento de T-DNAque compreende seqüências acentuadoras e, mediante integração no ge-noma de uma célula vegetal, aumenta a atividade de uma proteína que a-presenta a atividade de uma GFAT e/ou uma proteína que apresenta a ativi-dade de uma UDP-GIc-DH.In the context of the present invention, the term "T-DNA activation labeling" is to be understood to mean a T-DNA fragment comprising enhancer sequences and, by integrating into the stem cell of a plant cell, increases the activity of a protein that exhibits the activity of a GFAT and / or a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH.

No contexto da presente invenção, o termo "marcação por ativa-ção de transposon" deve-se entender como significando um transposon quecompreende seqüências acentuadoras e, mediante integração no genomade uma célula vegetal, aumenta a atividade de uma proteína que apresentaa atividade de uma GFAT e/ou uma proteína que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH.In the context of the present invention, the term "transposon activation labeling" shall be understood to mean a transposon comprising enhancer sequences and, by integrating into the genome of a plant cell, increases the activity of a protein that exhibits GFAT activity and / or a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH.

Uma modalidade da presente invenção preferida refere-se a cé-lulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, as quais secaracterizam pelo fato de que pelo menos uma molécula de ácido nucléicoestranha codifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) deuma GFAT ou que pelo menos uma molécula de ácido nucléico estranhacodifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH.Uma modalidade da presente invenção particularmente preferidarefere-se a células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãoque se caracterizam pelo fato de que uma primeira molécula de ácido nu-cléico estranha codifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma GFAT e uma segunda molécula de ácido nucléico estranha codificauma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH.A preferred embodiment of the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention which are characterized by the fact that at least one foreign nucleic acid molecule encodes a protein having (enzymatic) activity of a GFAT or that at least one foreign nucleic acid molecule encodes a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH. One embodiment of the present invention is particularly preferred to genetically modified plant cells according to The invention or genetically modified plants according to the invention are characterized in that a first foreign nucleic acid molecule encodes a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT and a second foreign nucleic acid molecule encodes a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a U DP-GIc-DH.

De acordo com a invenção, a molécula de ácido nucléico estra-nha que codifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) deuma GFAT poderá originar-se de qualquer organismo; preferencialmente,essa molécula de ácido nucléico origina-se de bactérias, fungos, animais,plantas ou vírus, particular e preferencialmente de mamíferos ou bactérias eespecial e preferencialmente do camundongo ou de Escherichia coli.According to the invention, the foreign nucleic acid molecule encoding a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT may originate from any organism; preferably, such a nucleic acid molecule originates from bacteria, fungi, animals, plants or viruses, particularly and preferably from mammals or special bacteria and preferably from mouse or Escherichia coli.

Com relação a uma molécula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFATque se origina de organismos animais, uso preferencialmente deve ser feitode uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína que apresentaa atividade (enzimática) de uma GFAT-2; com preferência particular, a prote-ína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT-2 origina-se do camundongo.With respect to a foreign nucleic acid molecule encoding a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT that originates from animal organisms, use should preferably be made of a nucleic acid molecule encoding a protein that has the (enzymatic) activity of a GFAT. a GFAT-2; particularly preferably, the protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT-2 originates from the mouse.

Com relação a vírus, a molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFATpreferencialmente origina de um vírus infectante de algas, com preferênciade um vírus infectante de algas do gênero Chlorella, particular e preferenci- almente de um vírus Chlorella de Paramecium bursaria e especial e prefe-rencialmente, de um vírus Chlorella de Paramecium bursaria de uma cepaH1.With respect to viruses, the foreign nucleic acid molecule that encodes a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT preferably originates from an algal infecting virus, preferably a particular Chlorella algae infecting virus, preferably a Chlorella Paramecium bursaria virus and especially, preferably, a Chlorella Paramecium bursaria virus of a strain.

Em lugar de uma molécula de ácido nucléico que ocorre natu-ralmente que codifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma GFAT, é também possível que uma molécula de ácido nucléico ge-rada por mutagênese seja introduzida nas células vegetais geneticamentemodificadas de acordo com a invenção ou as plantas geneticamente modifi-cadas de acordo com a invenção, em que essa molécula de ácido nucléicoestranha mutagenizada caracteriza-se pelo fato de que ela codifica uma pro-teína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT com inibição re-duzida por metabólitos {por exemplo, do metabolismo de glicosamina). Apreparação de tais moléculas de ácido nucléico mutagenizadas é descrita deuma maneira exemplar de uma proteína que apresenta a atividade (enzimá-tica) de uma GFAT de Escherichia coli in Deng e outros (2005, MetabolicEngineering 7, 201-214; WO 04 003175). Mutantes de uma proteína que a-presenta a atividade de uma GFAT do camundongo são descritos, por e-xemplo, in Hu e outros"(2004, J. Biol Chem. 279 (29), 29988-29993).Instead of a naturally occurring nucleic acid molecule encoding a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT, it is also possible for a mutagenically generated nucleic acid molecule to be introduced into genetically modified plant cells accordingly. according to the invention or the genetically modified plants according to the invention, wherein such a mutagenized foreign nucleic acid molecule is characterized by the fact that it encodes a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a re-inhibiting GFAT. - induced by metabolites (e.g., from glycosamine metabolism). The preparation of such mutagenized nucleic acid molecules is described in an exemplary manner by a protein that exhibits the (enzymatic) activity of an Escherichia coli in Deng et al. (2005, MetabolicEngineering 7, 201-214; WO 04 003175). Mutants of a protein that exhibit the activity of a mouse GFAT are described, for example, in Hu et al. (2004, J. Biol Chem. 279 (29), 29988-29993).

De acordo com a invenção, a molécula de ácido nucléico estra-nha que codifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) deuma UDP-GIc-DH poderá originar-se de qualquer organismo; preferencial-mente, essa molécula de ácido nucléico origina-se de bactérias, fungos, a-nimais, vegetais ou vírus, particular e preferencialmente de bactérias, vege-tais ou vírus, especial e preferencialmente de vírus.According to the invention, the foreign nucleic acid molecule encoding a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH may originate from any organism; preferably, such a nucleic acid molecule originates from bacteria, fungi, animals, plants or viruses, particularly and preferably from bacteria, vegetables or viruses, especially and preferably from viruses.

Com relação a vírus, a molécula de ácido nucléico estranha quecodifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH preferencialmente origina-se de um vírus infectante de algas, compreferência de um vírus que infectam algas do gênero Chlorella, particular epreferencialmente de um vírus Chlorella de Paramecium bursaria e especiale preferencialmente de um vírus Chlorella de Paramecium bursaria de umacepaHI.With respect to viruses, the foreign nucleic acid molecule that encodes a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH preferably originates from an algal infecting virus, comprising a virus infecting the genus Chlorella, particularly preferably from a Chlorella Paramecium bursaria virus and especially preferably from a Chlorella Paramecium bursaria virus from an HepaHI.

Em lugar de uma molécula de ácido nucléico que ocorre natu-ralmente que codifica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma UDP-GIc-DH, é também possível que uma molécula de ácido nucléi-co gerada por mutagênese seja introduzida nas células vegetais genetica-mente modificadas de acordo com a invenção ou as plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção, em que essa molécula de ácido nu-cléico estranha mutagenizada caracteriza-se pelo fato de que ela codificauma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DHcom inibição reduzida por metabólitos (por exemplo, do metabolismo de áci-do glicurônico).Instead of a naturally occurring nucleic acid molecule encoding a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH, it is also possible for a mutagenically generated nucleic acid molecule to be introduced into cells. genetically modified plants according to the invention or genetically modified plants according to the invention, wherein such a mutagenized foreign nucleic acid molecule is characterized by the fact that it encodes a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH with reduced inhibition by metabolites (eg, from glucuronic acid metabolism).

Moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína queapresenta a atividade de uma GFAT são conhecidas daquele versado natécnica e descritas na literatura. Desse modo, moléculas de ácido nucléicoque codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT sãodescritas de vírus, por exemplo, do vírus Chlorella k2 (EMBL No. de ac.AB107976.1), de bactérias, por exemplo, de Escherichia coli (Dutka-Malen, 1988,Biochemie 70 (2), 287-290; EMBL No. de ac: L10328.1), de fungos, por exemplo,de Saecharomyces eerevisiae (EMBL No. de ac. AF334737.1, Watzele e outros,1989," J. Bioi Chem. 264, 8753-8758), Aspergillus niger (EMBL No. de ac.AY594332.1), Candida albieans (EMBL No. de ac. X94753.1), de insetos, porexemplo, de Aedes aegyti (Kato e outros, 2002, Inseet. Bioi 11 <3), 207, 216;EMBL No. de ac. AF399922.1), Drosophila melanogaster (GFAT-1: EMBLNo. de ac. Y18627.1, GFAT-2: NCBI No. de ac. NM_143360.2), de algas deVolvariella volvaeea (EMBL No. de ac. AY661466.1), de vertebrados, porexemplo, de Homo sapiens (GFAT-1: EMBL No. de ac. AF334737.1; GFAT-2:NCBI No. de ac. BC000012.2, Oki e outros, 1999, Genomies 57 (2), 227-34),Mus museulus (GFAT-1: EMBL No. de ac. AF334736.1; GFAT-2: EMBL No.de ac. AB016780.1), ou de vegetais, por exemplo, de Arabidopsis thaliana(EMBL No. de ac. AP001297.1; cds. NCBI No. de ac. BAB03027.1).Nucleic acid molecules encoding a protein that exhibit the activity of a GFAT are known from that skilled artisan and described in the literature. Thus, nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits the activity of a GFAT are described from viruses, eg from the Chlorella k2 virus (EMBL No. ac.AB107976.1), from bacteria, eg from Escherichia coli ( Dutka-Malen, 1988, Biochemie 70 (2), 287-290; EMBL Ac. No .: L10328.1), Fungi, for example, from Saecharomyces eerevisiae (EMBL, Ac. AF.3434737.1, Watzele et al. , 1989, "J. Bioi Chem. 264, 8753-8758), Aspergillus niger (EMBL ac.AY594332.1), Candida albieans (EMBL ac. No. X94753.1), insect, e.g. Aedes aegyti (Kato et al., 2002, Inseet. Bioi 11 <3), 207, 216; EMBL Ac. No. AF399922.1), Drosophila melanogaster (GFAT-1: EMBL.Ac. Y18627.1, GFAT- 2: NCBI Ac. No. NM_143360.2), from algae of Volvariella volvaeea (EMBL Ac. No. AY661466.1), for example, Homo sapiens vertebrates (GFAT-1: EMBL Ac. No. AF334737. 1; GFAT-2: NCBI Ac. No. BC000012.2, Oki et al., 1999, Genomies 57 (2), 227-34), Mus museulus ( GFAT-1: EMBL Ac. AF334736.1; GFAT-2: EMBL Ac. AB016780.1), or from vegetables, for example from Arabidopsis thaliana (EMBL Ac. No. AP001297.1; cds. NCBI Ac. No. BAB03027.1).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se acélulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção eplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção em que a mo-lécula de ácido nucléico estranho que codifica uma proteína que apresenta aatividade de uma GFAT é selecionada do grupo que consiste em:In a preferred embodiment, the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention and genetically modified plants according to the invention wherein the foreign nucleic acid molecule encoding a GFAT-activating protein is selected. of the group consisting of:

a) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína queapresenta a seqüência de aminoácidos dada sob SEQ ID NO. 8 ou uma pro-teína que apresenta a seqüência de aminoácidos dada sob SEQ ID NO. 10ou uma proteína que apresenta a seqüência de aminoácidos dada sob SEQ ID NO. 12;a) Nucleic acid molecules encoding a protein which has the amino acid sequence given under SEQ ID NO. 8 or a protein having the amino acid sequence given under SEQ ID NO. 10or a protein having the amino acid sequence given under SEQ ID NO. 12;

b) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína cujaseqüência é pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 80%, com pre-ferência pelo menos 90%, especial e preferencialmente pelo menos 95% e,mais preferencialmente pelo menos 98% idênticas à seqüência de aminoáci-dos dada sob SEQ ID NO. 8, sob SEQ ID NO. 10 ou sob SEQ ID NO. 12;b) nucleic acid molecules encoding a protein whose sequence is at least 60%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and more preferably at least 98% identical to the sequence. of amino acids given under SEQ ID NO. 8, under SEQ ID NO. 10 or under SEQ ID NO. 12;

c) moléculas de ácido nucléico compreendendo a seqüência denucleotídeos mostrada sob SEQ ID NO. 7 ou uma seqüência complementara esta, a seqüência de nucleotídeos mostrada sob SEQ ID NO. 9 ou umaseqüência complementar a esta, a seqüência de nucleotídeos mostrada sobSEQ ID NO. 11 ou uma seqüência complementar a esta ou a seqüência denucleotídeos mostrada sob SEQ ID NO. 13 ou uma seqüência complementar a esta;c) nucleic acid molecules comprising the denucleotide sequence shown under SEQ ID NO. 7 or a sequence will complement this, the nucleotide sequence shown under SEQ ID NO. 9 or a sequence complementary thereto, the nucleotide sequence shown under SEQ ID NO. 11 or a sequence complementary to this or the denucleotide sequence shown under SEQ ID NO. 13 or a sequence complementary to it;

d) moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 70%, prefe-rencialmente pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especial epreferencialmente pelo menos 95% e, mais preferencialmente pelo menos98% idênticas às seqüências de ácido nucléico descritas sob a) ou c);d) nucleic acid molecules which are at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and more preferably at least 98% identical to the nucleic acid sequences described below. ) or c);

e) moléculas de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesrigorosas com pelo menos uma fita das seqüências de ácido nucléico descri-tas sob a) ou c);e) nucleic acid molecules that hybridize under stringent conditions to at least one strand of the nucleic acid sequences described under a) or c);

f) moléculas de ácido nucléico cuja seqüência de nucleotídeosdifere da seqüência das moléculas de ácido nucléico mencionadas sob a) ouf) nucleic acid molecules whose nucleotide sequence differs from the sequence of nucleic acid molecules mentioned under a) or

c) devido à degeneração do código genético; ec) due to the degeneration of the genetic code; and

g) moléculas de ácido nucléico que são fragmentos, variantesalélicos e/ou derivados das moléculas de ácido nucléico mencionadas soba), b), c), d), e) ou f).g) nucleic acid molecules which are fragments, variantselelic and / or derived from the nucleic acid molecules mentioned under (a), (b), (c), (d), (e) or (f).

Moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH são descritas na literatura e co-nhecidas daquele versado na técnica. Desse modo, moléculas de ácido nu-cléico que codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH são descritas de vírus, por exemplo, do vírus Chlorella 1 (NCBI No.de ac. NC_000852.3), de bactérias, por exemplo, de Escherichia coli (EMBLNo. de ac.: AF176356.1), de fungos, por exemplo, de Aspergillus niger (EM-BL No. de ac. AY594332.1), Cryptococcus neoformans (EMBL No. de ac.AF405548.1), de insetos por exemplo, de Drosophila melanogaster (EMBL No.de ac. AF001310.1), de vertebrados, por exemplo, de Homo sapiens (EMBL No.de ac. AF061016.1), Mus musculus (EMBL No. de ac. AF061017.1), Bostaurus (EMBL No. de ac. AF095792.1), Xenopus Iaevis (EMBL No. de ac.AY762616.1) ou de vegetais por exemplo, de álamo (EMBL No. de ac.AF053973.1), Colocasia esculenta (EMBL No. de ac. AY222335.1), Dunaliel-Ia salina (EMBL No. de ac. AY795899.1), Glycine max (EMBL No. de ac.U53418.1).Nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH are described in the literature and known to those skilled in the art. Thus, nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH are described from viruses, for example Chlorella 1 virus (NCBI ac. NC_000852.3), from bacteria. eg Escherichia coli (EMBLNo Ac .: AF176356.1), fungus e.g. Aspergillus niger (EM-BL Ac. No. AY594332.1), Cryptococcus neoformans (EMBL Ac. AF405548.1), from insects eg from Drosophila melanogaster (EMBL Ac. No. AF001310.1), from vertebrates, for example from Homo sapiens (EMBL Ac. No. AF061016.1), Mus musculus ( EMBL Ac. No. AF061017.1), Bostaurus (EMBL Ac. No. AF095792.1), Xenopus Iaevis (EMBL Ac.AY762616.1) or from plants such as poplar (EMBL ac.AF053973.1), Colocasia esculenta (EMBL Ac. No. AY222335.1), Dunaliel-la Saline (EMBL Ac. No. AY795899.1), Glycine max (EMBL Ac.U53418.1) .

Em uma modalidade adicional preferida, a presente invençãorefere-se a células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção e plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção,em que a molécula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteínaque apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH é selecionada do grupo queconsiste em:In a further preferred embodiment, the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention and genetically modified plants according to the invention, wherein the foreign protein-encoding nucleic acid molecule exhibits the activity of a UDP-GIc -DH is selected from the group consisting of:

a) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína queapresenta a seqüência de aminoácidos dada sob SEQ ID NO 5;(a) nucleic acid molecules encoding a protein which has the amino acid sequence given under SEQ ID NO 5;

b) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína cujaseqüência é pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 80%, com pre-ferência pelo menos 90%, especial e preferencialmente pelo menos 95% e,mais preferencialmente, pelo menos 98% idênticas à seqüência de aminoá-cidos dada sob SEQ ID NO. 5;b) nucleic acid molecules encoding a protein whose sequence is at least 60%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and more preferably at least 98% identical to amino acid sequence given under SEQ ID NO. 5;

c) moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüênciade nucleotídeos mostrada sob SEQ ID NO. 4 ou uma seqüência complemen-tar a esta ou a seqüência de nucleotídeos mostrada sob SEQ ID NO. 6 ouuma seqüência complementar a esta;c) nucleic acid molecules comprising the nucleotide sequence shown under SEQ ID NO. 4 or a sequence complementary to this or the nucleotide sequence shown under SEQ ID NO. 6 or a sequence complementary to this;

d) moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 70%, prefe-rencialmente pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especial epreferencialmente pelo menos 95% e, mais preferencialmente pelo menos-98% idênticas às seqüências de ácido nucléico descritas sob a) ou c);d) nucleic acid molecules which are at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and more preferably at least-98% identical to the described nucleic acid sequences. under a) or c);

e) moléculas de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesrigorosas com pelo menos uma fita das seqüências de ácido nucléico descri-tas sob a) ou c);e) nucleic acid molecules that hybridize under stringent conditions to at least one strand of the nucleic acid sequences described under a) or c);

f) moléculas de ácido nucléico cuja seqüência de nucleotídeodifere da seqüência das moléculas de ácido nucléico mencionadas sob a) ouc) devido à degeneração do código genético; ef) nucleic acid molecules whose nucleotide sequence differs from the sequence of nucleic acid molecules mentioned under a) or c) due to degeneration of the genetic code; and

g) moléculas de ácido nucléico que são fragmentos, variantesalélicos e/ou derivados das moléculas de ácido nucléico mencionadas soba), b), c), d), e) ou f).g) nucleic acid molecules which are fragments, variantselelic and / or derived from the nucleic acid molecules mentioned under (a), (b), (c), (d), (e) or (f).

No contexto da presente invenção, o termo "hibridização" signifi-ca uma hibridização sob condições de hibridização convencionais, preferen-cialmente sob condições rigorosas, conforme descritas, por exemplo, ϊηSambrooke outros; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-. ed. (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI). Com prefe-rência particular, "hibridização" significa uma hibridização sob as seguintescondições:In the context of the present invention, the term "hybridization" means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as described, for example, ϊηSambrooke others; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-. ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). With particular preference, "hybridization" means hybridization under the following conditions:

Tampão de hibridização:Hybridization Buffer:

2 χ SSC; 10 χ solução de Denhardt (Fikoll 400 + PEG+BSA; ra-zão 1:1:1); 0,1% de SDS; 5 mM de EDTA; 50 mM de Na2HP04; 250 pg/mlde DNA de esperma de arenque; 50 pg/ml de tRNA; ou25 M de tampão fosfato de sódio pH 7,2; 1 mM de EDTA; 7% de2 χ SSC; 10 χ Denhardt's solution (Fikoll 400 + PEG + BSA; 1: 1: 1 ratio); 0.1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na 2 HPO 4; 250 pg / ml herring sperm DNA; 50 pg / ml tRNA; or 25 M sodium phosphate buffer pH 7.2; 1 mM EDTA; 7% of

SDSSDS

Temperatura de hibridização: T = 65 a 68°CTampão de lavagem: 0,1 χ SSC; 0, 1% de SDSTemperatura de lavagem: T = 65 a 68°C.Hybridization Temperature: T = 65 to 68 ° C Wash Buffer: 0.1 χ SSC; 0.1% SDST Washing temperature: T = 65 to 68 ° C.

Moléculas de ácido nucléico que hibridizam com moléculas deácido nucléico que codificam uma proteína que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH ou que apresenta a atividade de uma GFAT poderão ori-ginar-se de qualquer organismo; conseqüentemente, elas poderão originar-se de bactérias, fungos, animais, vegetais ou vírus.Nucleic acid molecules that hybridize to nucleic acid molecules that encode a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH or that exhibits GFAT activity may originate from any organism; consequently, they may originate from bacteria, fungi, animals, vegetables or viruses.

Moléculas de ácido nucléico que hibridizam com moléculas deácido nucléico que codificam uma proteína que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH preferencialmente originam de um vírus que infectam al-gas, com preferência um vírus que infectam algas do gênero Chlorella, parti-cular e preferencialmente um vírus Chlorella de Paramecium bursaria e es-pecial e preferencialmente de um vírus Chlorella de Paramecium bursaria deum cepa H1.Nucleic acid molecules that hybridize to nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH preferably originate from an al-gas-infecting virus, preferably a Chlorella, particulate, and algae-infecting virus. preferably a Chlorella virus of Paramecium bursaria and especially and preferably a Chlorella virus of Paramecium bursaria de a strain H1.

Moléculas de ácido nucléico que hibridizam com moléculas deácido nucléico que codificam uma proteína que apresenta a atividade deuma GFAT particular e preferencialmente originam de mamíferos, vegetais ou bactérias e especial e preferencialmente do çamundongo ou Escherichiacoli.Nucleic acid molecules that hybridize to nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits the activity of a particular GFAT and preferably originates from mammals, plants or bacteria, and especially preferably from mouse or Escherichiacoli.

Moléculas de ácido nucléico que hibridizam com moléculas deácido nucléico que codificam uma proteína que apresenta a atividade deuma GFAT-1 ou uma GFAT-2 preferencialmente originam de um organismo eucariótico particular e preferencialmente elas originam de um organismoanimal, especial e preferencialmente do çamundongo.Nucleic acid molecules that hybridize to nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits the activity of a GFAT-1 or a GFAT-2 preferably originates from a particular eukaryotic organism and preferably they originate from an animal organism, especially and preferably from the mouse.

Moléculas de ácido nucléico que hibridizam com as moléculasmencionadas poderão ser isoladas, por exemplo, de bibliotecas genômicasou de cDNA. Tais moléculas de ácido nucléico podem ser identificadas eisoladas usando as moléculas de ácido nucléico mencionadas ou partesdessas moléculas ou os complementos inversos dessas moléculas, por e-xemplo, através de hibridização de acordo com métodos padrões (vide, porexemplo, Sambrooke outros, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory ManuaI,2-. ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou pormeio de amplificação usando PCR.Nucleic acid molecules that hybridize to the mentioned molecules may be isolated, for example, from genomic or cDNA libraries. Such nucleic acid molecules may be identified by using the aforementioned nucleic acid molecules or parts thereof or the inverse complements of such molecules, for example, by hybridization according to standard methods (see, for example, Sambrooke et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2- Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) or by amplification using PCR.

Como amostra de hibridização para isolamento de uma seqüên-cia de ácido nucléico que codifica uma proteína que apresenta a atividade deuma UDP-GIc-DH, é possível usar, por exemplo, moléculas de ácido nucléi-co que apresentam exata ou essencialmente a seqüência de nucleotídeosdada sob SEQ ID NO. 4 ou SEQ ID NO. 6, ou partes dessas seqüências.As a hybridization sample for isolation of a nucleic acid sequence that encodes a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH, it is possible to use, for example, nucleic acid molecules that present exactly or essentially the sequence of a UDP-GIc-DH. nucleotides given under SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 6, or parts of these sequences.

Como amostra de hibridização para isolamento de uma seqüên-cia de ácido nucléico que codifica uma proteína que apresenta a atividade deuma GFAT, é possível usar, por exemplo, moléculas de ácido nucléico queapresentam exata ou essencialmente a seqüência de nucleotídeos dada sobSEQ ID NO. 7 ou sob SEQ ID NO. 9 ou sob SEQ ID NO. 11 ou sob SEQ IDNO. 13, ou partes dessas seqüências.As a hybridization sample for isolation of a nucleic acid sequence encoding a protein that exhibits the activity of a GFAT, it is possible to use, for example, nucleic acid molecules that accurately or essentially present the nucleotide sequence given under SEQ ID NO. 7 or under SEQ ID NO. 9 or under SEQ ID NO. 11 or under SEQ IDNO. 13, or parts of these sequences.

Os fragmentos usados como amostras de hibridização poderãotambém ser fragmentos sintéticos ou oligonucleotídeos preparados usandoas técnicas habituais de síntese, cuja seqüência é essencialmente idêntica àmolécula de ácido nucléico descrita no contexto da presente invenção. Umavez que, genes que hibridizam com as seqüências de ácidos nucléicos des-critas no contexto da presente invenção are identificados e isolados, a se-qüência deve ser determinada e as propriedades das proteínas codificadasem relação a essa seqüência devem ser analisadas para determinar se elassão proteínas que apresentam a atividade de uma GFAT, uma GFAT-1 ouuma GFAT-2 ou a atividade de uma UDP-GIc-DH. Métodos de como deter-minar se uma proteína tem a atividade de uma proteína que apresenta a ati-vidade de uma GFAT (por exemplo, Mayer e outros, 1968, Plant PhysioL 43,1097-1107; Deng e outros, 2005, Metabolic Engineering 7, 201-214), umaGFAT-1 ou uma GFAT-2 (por exemplo Hu e outros, 2004, J. Biol Chem. 279.(29), 29988-29993) ou uma UDP-GIc-DH (por exemplo De Luca e outros,1976, Connective Tissue Research 4, 247-254; Bar-Peled e outros, 2004,Biochem. J. 381, 131-136; Turner e Botha, 2002, Archives Biochem. Bio-phys. 407, 209-216) são conhecidas daquele versado na técnica e descritas,entre outros, na literatura descrita.Fragments used as hybridization samples may also be synthetic fragments or oligonucleotides prepared using standard synthesis techniques, the sequence of which is essentially identical to the nucleic acid molecule described in the context of the present invention. Since genes that hybridize to the nucleic acid sequences described in the context of the present invention are identified and isolated, the sequence must be determined and the properties of the proteins encoded with respect to this sequence must be analyzed to determine whether they are proteins. which show the activity of a GFAT, a GFAT-1 or a GFAT-2 or the activity of a UDP-GIc-DH. Methods of determining whether a protein has the activity of a protein that exhibits GFAT activity (eg, Mayer et al., 1968, Plant Physio 43, 1097-1107; Deng et al., 2005, Metabolic Engineering 7, 201-214), a GFAT-1 or a GFAT-2 (e.g. Hu et al., 2004, J. Biol Chem. 279. (29), 29988-29993) or a UDP-GIc-DH (e.g. De Luca et al., 1976, Connective Tissue Research 4, 247-254, Bar-Peled et al., 2004, Biochem J. 381, 131-136; Turner and Botha, 2002, Archives Biochem. 216) are known to those skilled in the art and described, among others, in the described literature.

As moléculas que hibridizam com as moléculas de ácido nucléi-co descritas no contexto da presente invenção compreendem, em particular,fragmentos, derivados e variantes alélicos das moléculas de ácido nucléicomencionadas. No contexto da presente invenção, o termo "derivado" signifi-ca que as seqüências dessas moléculas diferem em uma ou mais posiçõesdas seqüências das moléculas de ácido nucléico descritas acima e são al-tamente idênticas a essas seqüências. As diferenças para as moléculas deácido nucléico descritas acima poderão, por exemplo, ser devido a deleção,adição, substituição, inserção ou recombinação.Molecules which hybridize to the nucleic acid molecules described in the context of the present invention comprise in particular fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid molecules mentioned. In the context of the present invention, the term "derivative" means that the sequences of these molecules differ at one or more positions from the sequences of the nucleic acid molecules described above and are highly identical to those sequences. Differences to the nucleic acid molecules described above may, for example, be due to deletion, addition, substitution, insertion or recombination.

No contexto da presente invenção, o termo "identidade" significauma seqüência de identidade sobre o comprimento total da região de codifi-cação de uma molécula de ácido nucléico ou o comprimento total de umaseqüência de aminoácidos que codifica uma proteína de pelo menos 60%,em particular uma identidade de pelo menos 70%, preferencialmente de pelomenos 80%, particular e preferencialmente de pelo menos 90% e especial epreferencialmente de pelo menos 95%. No contexto da presente invenção, otermo "identidade" deve-se entender como significando o número de amino-ácidos/nucleotídeos idênticos (identidade) com outras proteínas/outros áci-dos nucléicos, expressos em porcentagem. Preferencialmente, a identidadecom relação a uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DHé determinada por comparação com a seqüência de aminoácidos dada sobSEQ ID NO. 5, a identidade com relação a uma molécula de ácido nucléicoque codifica uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH édeterminada por meio de comparação com a seqüência de ácido nucléicodada sob SEQ ID NO. 4 ou SEQ ID NO. 6, a identidade com relação a umaproteína que apresenta a atividade de uma GFAT é determinada por compa-ração com a seqüência de aminoácidos dada sob SEQ ID NO. 8 ou SEQ IDNO. 10 ou SEQ ID NO. 12 e a identidade com relação a uma molécula deácido nucléico que codifica uma proteína que apresenta a atividade de umaGFAT é determinada por comparação com a seqüência de ácido nucléicodada sob SEQ ID NO. 7 ou SEQ ID NO. 9 ou SEQ ID NO. 11 ou SEQ ID NO.13 com outras proteínas/outros ácidos nucléicos com o auxílio de programasde computadores. Se seqüências são comparadas umas com as outras sãode diferentes comprimentos, a identidade deve ser determinada por meio dedeterminação da identidade em porcentagem do número de aminoácidosque as seqüências mais curtas compartilham com a seqüência mais longa.In the context of the present invention, the term "identity" means an identity sequence over the total length of the coding region of a nucleic acid molecule or the total length of an amino acid sequence encoding a protein of at least 60% by weight. particularly an identity of at least 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% and especially preferably at least 95%. In the context of the present invention, the term "identity" shall be understood to mean the number of identical amino acids / nucleotides (identity) with other proteins / other nucleic acids, expressed as a percentage. Preferably, the identity with respect to a protein displaying UDP-GIc-DH activity is determined by comparison with the amino acid sequence given under SEQ ID NO. 5, identity with respect to a nucleic acid molecule encoding a protein displaying UDP-GIc-DH activity is determined by comparison with the nucleic acid sequence under SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. 6, identity with respect to a protein that exhibits GFAT activity is determined by comparison with the amino acid sequence given under SEQ ID NO. 8 or SEQ IDNO. 10 or SEQ ID NO. 12 and identity with respect to a nucleic acid molecule encoding a protein that exhibits umaGFAT activity is determined by comparison with the nucleic acid sequence coded under SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 9 or SEQ ID NO. 11 or SEQ ID NO.13 with other proteins / other nucleic acids with the aid of computer programs. If sequences are compared to each other at different lengths, identity must be determined by determining identity in percent of the amino acid number that the shorter sequences share with the longer sequence.

Preferencialmente, a identidade é determinada usando o programa de com-putador conhecido e publicamente disponível CIustaIW (Thompson e outros,Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). CIustaIW é tornado publica-mente disponível por Julie Thompson (Thompson@EMBL-HeideIberg DE) eToby Gibson (Gibson© EMBL-HeideIberg DE), European Molecular BiologyLaboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Alemanha. CIustaIWpode também ser transferido (down-loaded) de várias páginas da Internet,entre outros, de IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire etCellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, França; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pubή e de EBI {ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) e todas as páginasalternativas (mirrored) da Internet do EBI (European Bioinformatics Institute,Wellcome TrustGenome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK).Preferably, identity is determined using the known and publicly available computer program CIustaIW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). CIustaIW is made publicly available by Julie Thompson (Thompson @ EMBL-HeideIberg DE) and Toby Gibson (Gibson © EMBL-HeideIberg DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany. CIustaIW may also be downloaded from various websites, inter alia, from IGBMC (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulire, BP163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp: //ftp-igbmc.u-strasbg .fr / pubή and EBI {ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) and all European Bioinformatics Institute, Wellcome TrustGenome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD , UK).

Preferencialmente, faz-se uso do programa de computador Clus-talW de versão 1.8 para determinar a identidade entre as proteínas descritas nocontexto da presente invenção e outras proteínas. Aqui, os parâmetros têm deser ajustados como seguem: KTUPLE=I, TOPDIAG=5, WINDOW=5, PAIR-GAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40,MATRIX=GONNET, ENDGAPS (OFF), NOPGAP, NOHGAP.Preferably, the Clus-talW version 1.8 computer program is used to determine the identity between the described proteins in the context of the present invention and other proteins. Here, the parameters have to be adjusted as follows: KTUPLE = I, TOPDIAG = 5, WINDOW = 5, PAIR-GAP = 3, GAPOPEN = 10, GAPEXTEND = 0.05, GAPDIST = 8, MAXDIV = 40, MATRIX = GONNET, ENDGAPS ( OFF), NOPGAP, NOHGAP.

Preferencialmente, faz-se uso do programa de computador Clus- talW de versão 1.8 para determinar a identidade, por exemplo, entre a se-qüência de nucleotídeos das moléculas de ácido nucléico descritas, no con-texto da presente invenção, e a seqüência de nucleotídeos de outras moléculasde ácido nucléico. Aqui, os parâmetros têm de ser ajustados como seguem:KTUPLE=2, T0PDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=1(), GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: não-ponderadas.Preferably, the ClusterW version 1.8 computer program is used to determine the identity, for example, between the nucleotide sequence of the nucleic acid molecules described in the context of the present invention and the sequence of nucleotides of other nucleic acid molecules. Here the parameters must be adjusted as follows: KTUPLE = 2, T0PDIAGS = 4, PAIRGAP = 5, DNAMATRIX: IUB, GAPOPEN = 1 (), GAPEXT = 5, MAXDIV = 40, TRANSITIONS: Unweighted.

Identidade, além disso, entende-se que há uma equivalênciafuncional e/ou estrutural entre as moléculas de ácido nucléico em questão ouas proteínas que as codificam. As moléculas de ácido nucléico que são ho-mólogas às moléculas descritas acima e que representam derivados dessasmoléculas são geralmente variações dessas moléculas que representammodificações apresentando a mesma função biológica. Elas poderão servariações que ocorrem naturalmente, por exemplo, seqüências de outrasespécies, ou mutações, em que essas mutações poderão ter ocorrido deuma maneira natural ou foram introduzidas por mutagênese direcionada.Além disso, as variações poderão ser seqüências sinteticamente produzidas.Os variantes alélicos poderão ser variantes que ocorrem naturalmente ouvariantes sinteticamente produzidas ou variantes geradas por técnicas deDNA recombinaníe. Uma forma especial de derivados é, por exemplo, molé-culas de ácido nucléico que diferem das moléculas de ácido nucléico descri- tas no contexto da presente invenção devido à degeneração do código gené-tico.Identity, moreover, is understood to be that there is a functional and / or structural equivalence between the nucleic acid molecules in question or the proteins that encode them. Nucleic acid molecules that are homologous to the molecules described above and which represent derivatives of these molecules are generally variations of these molecules that represent modifications having the same biological function. They may be naturally occurring servariations, for example sequences from other species, or mutations, where these mutations may have occurred naturally or were introduced by directed mutagenesis. In addition, variations may be synthetically produced sequences. Allelic variants may be naturally occurring variants synthetically produced listeners or variants generated by recombinant DNA techniques. A special form of derivatives is, for example, nucleic acid molecules that differ from the nucleic acid molecules described in the context of the present invention due to the degeneration of the genetic code.

Os vários derivados das moléculas de ácido nucléico que codifi-cam uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT ou uma UDP-GIc-DH apresentam certas características comuns.The various derivatives of nucleic acid molecules that encode a protein that exhibits the activity of a GFAT or a UDP-GIc-DH have certain common characteristics.

Essas poderão, por exemplo, ser atividade biológica ou enzimá-tica, especificidade de substrato, peso molecular, reatividade imunológica,conformação, etc., e também propriedades físicas, tais como, por exemplo,as propriedades de processamento em eletroforese em gel, comportamentocromatográfico, coeficientes de sedimentação, solubilidade, propriedadesespectroscópicas, estabilidade, pH ótimo, temperatura ótima, etc. Proprieda-des de proteínas preferidas que apresentam a atividade de uma GFAT ouuma~UDP-Glc-DH são conhecidas daquele versado na técnica, foram jámencionadas acima e são para aplicá-las aqui de maneira análoga.These may for example be biological or enzymatic activity, substrate specificity, molecular weight, immunological reactivity, conformation, etc., as well as physical properties such as, for example, gel electrophoresis processing, chromatographic behavior , sedimentation coefficients, solubility, spectroscopic properties, stability, optimal pH, optimal temperature, etc. Preferred protein properties which exhibit the activity of a GFAT or a-UDP-Glc-DH are known to those skilled in the art, have already been mentioned above and are to be applied here analogously.

Em uma modalidade adicional preferida, a presente invençãorefere-se a células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invençãoem que as moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína que a-presenta a atividade (enzimática) de uma GFAT e/ou que codifica uma prote-ína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH caracteri-zam-se pelo fato de que os códons dessas moléculas de ácido nucléico sãodiferentes dos códons das moléculas de ácido nucléico que codificam essaproteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT ou codificamuma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DHdo organismo de origem. Particular e preferencialmente, os códons das mo-léculas de ácido nucléico que codificam uma proteína que apresenta a ativi-dade (enzimática) de uma GFAT ou que codifica uma proteína que apresen-ta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH são alterados assim queeles são adaptados à freqüência de uso dos códons da célula vegetal ou daplanta em cujo genoma eles são integrados ou devem ser integrados.In a further preferred embodiment, the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention wherein nucleic acid molecules encoding a protein that has the (enzymatic) activity of a GFAT and / or encoding a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH is characterized by the fact that the codons of these nucleic acid molecules are different from the codons of the nucleic acid molecules encoding this protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT or encodes a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH from the source organism. Particularly and preferably, the nucleic acid molecule codons that encode a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT or that encodes a protein that exhibits (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH they are altered as soon as they are adapted to the frequency of use of plant cell or plant codons in whose genome they are or should be integrated.

A presente invenção adicionalmente proporciona células vege-tais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou plantas gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção em que as moléculas deácido nucléico estranhas estavelmente integradas no genoma da célula ve-getal ou da planta que codifica um hialuronan sintase e/ou que codifica umaproteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT e/ou que co-difica uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH são ligadas a elementos reguladores iniciando a transcrição em célulasvegetais (promotores). Esses poderão ser promotores homólogos ou heteró-logos. Os promotores podem ser constitutivos, específicos a tecido, específi-cos a desenvolvimento ou regulados por fatores externos (por exemplo apósaplicação de substâncias químicas, por ação de fatores abióticos, tal comocalor e/ou frio, estiagem, doença, etc.). Aqui, moléculas de ácido nucléicoque codificam um hialuronan sintase ou uma proteína que apresenta a ativi-dade (enzimática) de uma GFAT ou uma proteína que apresenta a atividade(enzimática) de uma UDP-GIc-DH, moléculas de ácido nucléico estas quesão integradas no genoma de uma célula vegetal geneticamente modificadade acordo com a invenção ou uma planta geneticamente modificada de a-cordo com a invenção, poderão em cada caso ser ligadas ao mesmo promo-tor, ou a seqüências individuais, poderão ser ligados a diferentes promoto-res. Aqui, dois ou três diferentes promotores em qualquer combinação pode-rão em cada caso ser ligados a uma molécula de ácido nucléico estranharelevante que codifica um hialuronan sintase ou uma proteína que apresentaa atividade (enzimática) de uma GFAT ou uma proteína que apresenta a ati-vidade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH em uma célula vegetal genetica-mente modificada de acordo com a invenção ou uma planta geneticamentemodificada de acordo com a invenção.The present invention further provides genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention wherein the foreign nucleic acid molecules stably integrated into the genome of the hyaluronan-encoding plant or plant cell synthase and / or encoding a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT and / or that co-complicates a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH are linked to regulatory elements initiating transcription in vegetable cells (promoters). These may be homologous or heterologous promoters. Promoters may be constitutive, tissue-specific, development-specific, or regulated by external factors (for example after chemical application, abiotic factors such as heat and / or cold, drought, disease, etc.). Here, nucleic acid molecules that encode a hyaluronan synthase or a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT or a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH, nucleic acid molecules that are integrated as such. in the genome of a genetically modified plant cell according to the invention or a genetically modified plant according to the invention may in each case be linked to the same promoter, or to individual sequences, may be linked to different promoters. . Here, two or three different promoters in any combination may in each case be linked to an extraneous stranded nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase or a protein that exhibits (enzymatic) activity of a GFAT or a protein that exhibits activity. (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH in a genetically modified plant cell according to the invention or a genetically modified plant according to the invention.

Uma modalidade preferida da presente invenção refere-se a cé-lulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo nom a invenção em que pelomenos uma molécula de ácido nucléico estranha, particular e preferencial-mente pelo menos duas moléculas de ácidos nucléicos estranhas, especial epreferencialmente três moléculas de ácidos nucléico estranhas selecionadasdo grupo que consiste em moléculas de ácido nucléico que codificam umhialuronan sintase ou uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma GFAT ou uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) deuma UDP-GIc-DH é (são) ligadas a um promotor específico a tecido. Promo-tores específicos a tecido preferidos são promotores que iniciam transcriçãoespecificamente em células ou folhas de tubérculo, frutos ou sementes devegetais.A preferred embodiment of the present invention relates to genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention wherein at least one foreign nucleic acid molecule, particularly preferably at least two acidic molecules. foreign nucleic acids, especially preferably three foreign nucleic acid molecules selected from the group consisting of nucleic acid molecules encoding a hyaluronan synthase or a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT or a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP- GIc-DH is (are) bound to a tissue specific promoter. Preferred tissue-specific promoters are promoters that initiate transcription specifically in tuber cells or leaves, fruit or vegetable seeds.

Para expressar moléculas de ácido nucléico que codificam umhialuronan sintase ou uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma GFAT ou uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) deuma UDP-GIc-DH, essas são preferencialmente ligadas a seqüências regu-ladoras de DNA assegurando a transcrição em células vegetais. Essas in-cluem em particular, promotores. E geral, qualquer promotor ativo em célulasvegetais é aquedado para a expressão.To express nucleic acid molecules encoding a hyaluronan synthase or a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT or a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH, these are preferably linked to regulatory sequences of a DNA ensuring transcription in plant cells. These include in particular promoters. And generally, any active promoter in vegetable cells is heated for expression.

Aqui, o promotor poderá ser escolhido de tal modo que a ex-pressão seja constitutivamente ou apenas em um certo tecido, sob um certoponto do desenvolvimento da planta ou sob um ponto de tempo determinadopor fatores externos. Tanto em relação do vegetal quanto em relação à mo·lécula de ácido nucléico que deve ser expresso, o promotor poderá ser ho-mólogo ou heterólogo.Here, the promoter may be chosen such that the expression is constitutively or only in a certain tissue, under a certain point of plant development or at a time point determined by external factors. Both in relation to the plant and in relation to the nucleic acid molecule to be expressed, the promoter may be homologous or heterologous.

Promotores adequados são, for exemplo, o promotor 35S RNAdo vírus mosaico da couve-flor ou o promotor de ubiquitina de milho ou oCestrum YLCV (Yellow Leaf Curling Vírus\ WO 01 73087; Stavolone e ou-tros, 2003, Plant Moi Biol. 53, 703-713) de uma expressão constitutiva, opromotor de patatingen B33 (Rocha-Sosa e outros, EMBO J. 8 (1989), 23-29) de uma expressão específica a tubérculo em batatas ou um promotorespecífico a fruto de tomate, tal como, por exemplo, o promotor poligalactu-ronase de tomate (Montgomery e outros, 1993, Plant Cell 5, 1049-1062) ou opromotor E8 de tomate (Metha e outros, 2002, Nature Biotechnol. 20(6), 613-618) ou o promotor ACC oxidase de pêssego (Moon e Callahan, 2004, J.Experimental Botany 55 (402), 1519-1528) ou um promotor que garante ex-pressão apenas em tecidos fotossinteticamente ativos, por exemplo o pro-motor ST-LS1 (Stockhaus e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987),7943-7947; Stockhaus e outros, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) ou de umaexpressão específica a endosperma, o promotor HMWG de trigo, o promotorUSP, o promotor de faseolina, promotores de genes zeína de milho (Peder-sen e outros, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio e outros, Plant Mol. Biol.15 (1990), 81-93), o promotor glutelina (Leisy e outros, Plant Moi Biol. 14(1990), 41-50; Zheng e outros, Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara e ou-tros, FEBS Lett. 383 (1996), 213-218) ou o promotor de shrunken-1 (Werr eoutros, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380), um promotor globulina (Nakase eoutros, 1996, Gene 170(2), 223-226) ou um promotor prolamina (Qu und Ta-kaiwa, 2004, Plant Biotêchnology Journal2(2), 113-125). Contudo, é tambémpossível usar promotores que são apenas ativos em um ponto em tempodeterminado por fatores externos (vide, por exemplo, WO 9307279). De inte-resse particular neste relatório poderão ser promotores de proteínas de cho-que térmico que permitem uma simples indução. É, além disso, possível u-sar promotores específicos a sementes, tal como, por exemplo, o promotorUSP de Vicia faba que assegura uma expressão específica a sementes emVicia faba e outros vegetais (Fiedler e outros, Plant Moi Biol. 22 (1993), 669-679; Baumlein e outros, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).Suitable promoters are, for example, the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter or maize ubiquitin promoter or OCTestrum YLCV (Yellow Leaf Curling Virus \ WO 01 73087; Stavolone et al., 2003, Plant Moi Biol. 53 703-713) of a constitutive expression, patatingen B33 opromotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) of a tuber-specific expression in potatoes or a tomato-specific promoter such as such as the tomato polygalacturonase promoter (Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5, 1049-1062) or tomato E8 opromotor (Metha et al., 2002, Nature Biotechnol. 20 (6), 613-618 ) or the peach ACC oxidase promoter (Moon and Callahan, 2004, J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528) or a promoter that guarantees expression only in photosynthetically active tissues, for example the ST- LS1 (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) or from an expr endosperm-specific species, the wheat HMWG promoter, the USP promoter, the phaseolin promoter, maize zein gene promoters (Peder-sen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol.15 (1990), 81-93), the glutelin promoter (Leisy et al., Plant Moi Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993). ), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218) or the shrunken-1 promoter (Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380), a promoter globulin (Nakase et al., 1996, Gene 170 (2), 223-226) or a prolamine promoter (Qu und Ta-kaiwa, 2004, Plant Biotechnology Journal2 (2), 113-125). However, it is also possible to use promoters that are only active at a point in time determined by external factors (see, for example, WO 9307279). Of particular interest in this report may be promoters of thermal shock proteins that allow simple induction. It is furthermore possible to use seed-specific promoters, such as, for example, the Vicia fabaUSP promoter which ensures seed-specific expression in Vicia faba and other vegetables (Fiedler et al., Plant Moi Biol. 22 (1993)). , 669-679; Baumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).

O uso de promotores presentes no genoma de vírus que infec-tam algas é também adequado para expressar seqüências de ácidos nucléi-cos em vegetais (Mitra e outros, 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun204(1), 187-194; Mitra e Higgins, 1994, PIantMoIBioI. 26(1), 85-93, Van Et-ten e outros, 2002, Arch. Virol. 147, 1479-1516).The use of promoters present in the genome of algal-infecting viruses is also suitable for expressing nucleic acid sequences in plants (Mitra et al., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun204 (1), 187-194; Mitra and Higgins, 1994, PIantMoIBioI 26 (1), 85-93, Van Etten et al., 2002, Arch. Virol. 147, 1479-1516).

No contexto da presente invenção, o termo "específico a tecido"deve-se entender como significando a limitação substancial de uma manifes-tação (por exemplo, iniciação de transcrição) para um certo tecido.In the context of the present invention, the term "tissue specific" is to be understood to mean the substantial limitation of a manifestation (e.g., transcriptional initiation) to a certain tissue.

No contexto da presente invenção, os termos "célula de tubércu-lo, fruto ou sementes" devem ser entendidos como significando todas as cé-lulas presentes em um tubérculo, um fruto ou em sementes.In the context of the present invention, the terms "tuber cell, fruit or seed" shall be understood to mean all cells present in a tuber, fruit or seed.

No contexto da presente invenção, o termo "promotor homólogo"deve-se entender como significando um promotor que está naturalmentepresente em células vegetais ou vegetais usados para a preparação de célu-las vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção (homólogo comrelação à célula vegetal ou à planta) ou como significando um promotor queajusta a regulação da expressão de um gene no organismo do qual a se-qüência foi isolada (homólogo com relação à molécula de ácido nucléico queé expressa).In the context of the present invention, the term "homologous promoter" is understood to mean a promoter that is naturally present in plant or plant cells used for the preparation of genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants. according to the invention (homologous to plant or plant cell) or as meaning a promoter that adjusts the expression of a gene in the organism from which the sequence has been isolated (homologous to the expressed nucleic acid molecule) .

No contexto da presente invenção, o termo "promotor heterólo-go" deve-se entender como significando um promotor que não está natural-mente presente em células vegetais ou plantas, usado para a preparação decélulas vegetais geneticamente modificadas de-acordo com a invenção ouplantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção (heterólogocom relação à célula vegetal ou planta) ou como significando um promotorque está, no organismo a partir do qual uma seqüência de ácido nucléicoque é expressa foi isolada, não naturalmente presente para regular a ex-pressão dessa seqüência de ácido nucléico (heterólogo com relação à molé-cula de ácido nucléico que é expressa).In the context of the present invention, the term "hetero-go promoter" is understood to mean a promoter that is not naturally present in plant cells or plants used for the preparation of genetically modified plant cells according to the invention or plants. genetically modified according to the invention (heterologous to plant cell or plant) or as meaning a promotor is in the organism from which a nucleic acid sequence that is expressed has been isolated, not naturally present to regulate the expression of that sequence. nucleic acid (heterologous to the expressed nucleic acid molecule).

Também presente poderá ser uma seqüência de terminação(sinal de poliadenilação) que funciona para adicionar uma cauda poli-A aotranscrito. Pensa-se que a cauda poli-A age na estabilização dos transcritos.Esses elementos são descritos na literatura (conforme Gielen e outros, EM-BO J. 8 (1989), 23-29) e podem ser alterados conforme desejado.Also present may be a termination sequence (polyadenylation signal) that functions to add a transcribed poly-A tail. The poly-A tail is thought to act in stabilizing transcripts. These elements are described in the literature (as per Gielen et al., EM-BO J. 8 (1989), 23-29) and may be altered as desired.

É também possível de seqüências íntrons estar presente entre opromotor e a região de codificação. Essas seqüências íntrons poderão levarà estabilidade de expressão e um aumento na expressão em vegetais (Callise outros, 1987, Genes Devei. 1, 1183-1200; Luehrsen e Walbot, 1991, MoiGen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier e outros, 1997; Plant Journan2(4), 895-899; Rose e Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil e outros,1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU e outros, 2003, Science in China;.Série C Vol. 46 No. 6, 561-569). Seqüências íntrons adequadas são, por e-xemplo, o primeiro íntron do gene sh1 de milho, o primeiro íntron do genepoliubiquitina 1 de milho, o primeiro íntron do gene EPSPS de arroz ou aque-le dos primeiros dois íntrons do gene PAT1 de Arabidopsis.It is also possible for intron sequences to be present between the engine and the coding region. Such intron sequences may lead to stability of expression and increased expression in vegetables (Callise et al., 1987, Genes Devi. 1, 1183-1200; Luehrsen and Walbot, 1991, MoiGen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier et al. 1997; Plant Journan (4), 895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU et al., 2003 , Science in China; Series C Vol. 46 No. 6, 561-569). Suitable intron sequences are, for example, the first intron of the maize sh1 gene, the first intron of the maize genepoliubiquitin 1, the first intron of the rice EPSPS gene, or that of the first two introns of the Arabidopsis PAT1 gene.

A presente invenção também se refere a vegetais que compre-endem células vegetais geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção. Esses vegetais poderão ser produzidos por meio de regeneração decélulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção.The present invention also relates to plants comprising genetically modified plant cells according to the invention. Such plants may be produced by regenerating genetically modified plant cells according to the invention.

A presente invenção também se refere a partes processáveis ouconsumíveis de vegetais geneticamente modificados de acordo com a in-venção que compreende células vegetais geneticamente modificadas deacordo com a invenção.The present invention also relates to processable or consumable parts of genetically modified plants according to the invention comprising genetically modified plant cells according to the invention.

No contexto da presente invenção, o termo "partes processá-veis" deve-se entender como significando partes de vegetais que são usa-das para preparar gêneros alimentícios ou alimentos para animais, que sãousados como uma fonte de matéria-prima para processos industriais, comouma fonte de matéria-prima para a preparação de produtos farmacêuticos oucomo uma fonte de matéria-prima para a preparação de produtos cosméti-cos.In the context of the present invention, the term "processable parts" shall be understood to mean parts of vegetables that are used to prepare food or feed, which are used as a source of raw material for industrial processes, as a source of raw material for the preparation of pharmaceuticals or as a source of raw material for the preparation of cosmetic products.

No contexto da presente invenção, o termo "partes consumíveis"deve-se entender como significando partes vegetais que servem como ali-mento para o homem ou são usadas como alimento para animal.In the context of the present invention, the term "consumable parts" is to be understood to mean plant parts that serve as food for man or are used as animal feed.

A presente invenção também se refere a um material de propa-gação de vegetais geneticamente modificados de acordo com a invenção- que compreende uma célula vegetal geneticamente modificada de acordocom a invenção.The present invention also relates to a genetically modified plant propagation material according to the invention comprising a genetically modified plant cell according to the invention.

Aqui, o termo "material de propagação" compreende aquelescomponentes da planta que são adequados para gerar progênie via à rotavegetativa ou generativa|. Adequados para propragação vegetativa são, porexemplo, cortes, culturas de calos, rizomas ou tubérculos. Outro material depropagação inclui, por exemplo, frutos, sementes, mudas, protoplastos, cul-turas de células, etc. O material de propagação preferencialmente toma aforma de tubérculos, frutos ou sementes.Here, the term "propagating material" includes those plant components that are suitable for generating progeny via rotavegetative or generative. Suitable for vegetative propagation are, for example, cuts, corns, rhizomes or tubers. Other payment material includes, for example, fruits, seeds, seedlings, protoplasts, cell cultures, etc. The propagating material preferably takes the form of tubers, fruits or seeds.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se apartes do vegetal passíveis de colheita de plantas geneticamente modifica-das de acordo com a invenção, tais como frutos, armazenagem e outras raí-zes, flores, botões, brotos, folhas ou caules, preferencialmente sementes,frutos ou tubérculos, essas partes passíveis de colheita que compreendemcélulas vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção.Preferencialmente, a presente invenção refere-se a material depropagação de acordo com a invenção ou partes passíveis de colheita deplantas de acordo com a invenção que compreendem hialuronan. Particu-larmente preferido é material de propagação de acordo com a invenção oupartes passíveis de colheita de vegetais de acordo com a invenção que sin-tetizam hialuronan.In a further embodiment, the present invention relates to harvestable plant parts of genetically modified plants according to the invention, such as fruits, storage and other roots, flowers, buds, buds, leaves or stems, preferably seeds, fruits or tubers, such harvestable parts comprising genetically modified plant cells according to the invention. Preferably, the present invention relates to crop material according to the invention or harvestable parts according to the invention. which comprise hyaluronan. Particularly preferred is propagating material according to the invention or harvestable vegetable parts according to the invention which synthesize hyaluronan.

No contexto da presente invenção, o termo "planta de batata" ou"batata" deve-se entender como significando espécies vegetais do gêneroSolanum, particularmente espécies que produzem tubérculo do gênero So-lanum e, em particular Solanum tuberosum.In the context of the present invention, the term "potato plant" or "potato" is to be understood to mean plant species of the genus Solanum, particularly species producing tubers of the genus So-lanum, and in particular Solanum tuberosum.

No contexto da presente invenção, o termo "planta de tomate"ou "tomate" deve-se entender como significando espécies vegetais do gêne-ro Lycopersicon, em particular, Lycopersicon esculentum.In the context of the present invention, the term "tomato plant" or "tomato" is to be understood to mean plant species of the genus Lycopersicon, in particular Lycopersicon esculentum.

Uma vantagem adicional da presente invenção é que partespassíveis de colheita, material de propagação, partes processáveis ou partesconsumíveis de plantas geneticamente modificadas de acordo com a inven-ção compreende mais hialuronan que plantas transgênicas que sintetizamhialuronan descritas na literatura. Conseqüentemente, vegetais genetica-mente modificados de acordo com a invenção não são apenas particular-mente adequados para uso como matéria-prima do qual hialuronan poderáser isolado mas pode também ser usado diretamente como gêneros alimen-tícios/alimento para animais ou para preparar gêneros alimentícios/raçãopara animais que apresentam um caráter profilático ou terapêutico (por e-xemplo, para profilaxia de osteoartrite, US 6.607.745). Desde que plantasgeneticamente modificadas de acordo cçrn a invenção apresentem um teormaior de hialuronan do que os vegetais descritos na literatura, a preparaçãode tais gêneros alimentícios/alimento para animais exige quantidades meno-res de partes passíveis de colheita, material de propagação, partes proces-sáveis ou partes consumíveis de plantas geneticamente modificadas de a-cordo com a invenção. Se, partes consumíveis de vegetais geneticamentemodificados de acordo com a invenção são consumidas, por exemplo, dire-tamente como um suposto "nutracêutico", é possível obter um efeito positivomesmo por meio de ingestão de quantidades relativamente pequenas desubstância. Isso poderá ser, de particular significância, entre outros, na pro-dução de alimento para animais, desde que o alimento para animais queapresenta também alto teor de componentes vegetais seja inadequado como ração para animais de várias espécies animais.A further advantage of the present invention is that harvestable parts, propagating material, processable parts or consumable parts of genetically modified plants according to the invention comprise more hyaluronan than transgenic plants synthesizing hyaluronan described in the literature. Accordingly, genetically modified vegetables according to the invention are not only particularly suited for use as raw material from which hyaluronan may be isolated but may also be used directly as food / feed or for preparing foodstuffs. / ration for animals that have a prophylactic or therapeutic character (eg for osteoarthritis prophylaxis, US 6,607,745). Provided that genetically modified plants according to the invention have a higher hyaluronan content than the plants described in the literature, the preparation of such food / feed requires lesser quantities of harvestable parts, propagating material, processable parts. or consumable parts of genetically modified plants according to the invention. If consumable parts of genetically modified vegetables according to the invention are consumed, for example, directly as an alleged "nutraceutical", a positive effect can be obtained by ingesting relatively small amounts of sub-substance. This may be of particular significance, among others, in the production of feed, provided that feed which also has a high content of plant components is inadequate as animal feed of various animal species.

Em virtude da alta capacidade de hialuronan ligar-se a água,partes passíveis de colheita, material de propagação, partes processáveis oupartes consumíveis de vegetais geneticamente modificados de acordo com ainvenção além disso têm a vantagem que menos espessantes são exigidos quando gêneros alimentícios/ração para animais solidificados são produzi-dos. Desse modo, por exemplo, a produção de geléias exige menos açúcar,a qual associa-se a um efeito positivo adicional na saúde. Na produção degêneros alimentícios/rações para animais que exigem a desidratação do ma-terial vegetal bruto, a vantagem de usar partes passíveis de colheita, materi- al de propagação, partes processáveis ou partes consumíveis de plantasgeneticamente modificadas de acordo com a invenção consiste no fato quemenos água tem de ser removida do material vegetal em questão, resultan-do em custos menores de produção e, devido a métodos de preparaçãomais suaves (por exemplo, entrada térmica mais baixa e/ou mais limitada, um valor nutricional elevado do gênero alimentício/ração para animais emquestão. Desse modo, por exemplo, na produção de molho de tomate con-dimentado (ketchup) menos energia tem de ser introduzida a fim de obter aconsistência desejada.Because of the high ability of hyaluronan to bind to water, harvestable parts, propagating material, processable parts or consumable parts of genetically modified vegetables according to the invention further have the advantage that less thickeners are required when food / feed for solidified animals are produced. Thus, for example, jelly production requires less sugar, which is associated with an additional positive effect on health. In the production of food / feed requiring the dehydration of raw vegetable material, the advantage of using harvestable parts, propagating material, processable parts or consumable parts of genetically modified plants according to the invention is that water has to be removed from the plant material in question, resulting in lower production costs and, due to smoother preparation methods (eg lower and / or more limited thermal input, high nutritional value of the foodstuff / Thus, for example, in the production of ketchup, less energy has to be introduced in order to obtain the desired advice.

A presente invenção além disso proporciona um processo de preparação de um vegetal que sintetiza hialuronan, processo este que com-preendeThe present invention further provides a process for preparing a vegetable which synthesizes hyaluronan, which process comprises

a) geneticamente modificar uma célula vegetal, em que a modi-ficação genética compreende etapas i a iii abaixoa) genetically modifying a plant cell, wherein the genetic modification comprises steps i to iii below

i) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha que codifica um hialuronan sintase na célula vegetali) introduction of a foreign nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase into the plant cell

ii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, amodificação genética resultando em um aumento da atividade de uma prote-ína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT comparada comcélulas vegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas corres-pondentesii) introduction of a genetic modification in the plant cell, genetic amodification resulting in an increased activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT compared to corresponding non-genetically modified wild-type plant cells.

iii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, amodificação genética resultando em um aumento da atividade de uma prote-ína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH comparadacom células vegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas cor-respondentes em que as etapas i a iii podem ser realizadas em qualquerordem, individualmente, ou quaisquer combinações de etapas i a iii podemser realizadas simultaneamenteiii) introduction of a genetic modification in the plant cell, genetic amodification resulting in an increased activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH compared to non-genetically modified wild-type plant cells corresponding wherein steps ia iii may be performed in any order individually, or any combinations of steps ia iii may be performed simultaneously

b) regenerar uma planta a partir de células vegetais de etapa a);b) regenerate a plant from plant cells of step a);

c) gerar, se apropriado, plantas adicionais usando as plantas deacordo com a etapa b), em que, se apropriadas, células vegetais são isola-das de plantas de acordo com as etapas b) ou c) e as etapas de processo a)a c) são repetidas até que uma planta seja gerada, a qual apresenta umamolécula de ácido nucléico estranha que codifica um hialuronan sintase eapresenta um aumento na atividade de uma proteína que apresenta a ativi-dade (enzimática) de uma GFAT comparada com células vegetais do tiposelvagem não geneticamente modificadas correspondentes e um aumentona atividade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de umaUDP-GIc-DH comparada com células vegetais do tipo selvagem não geneti-camente modificadas correspondentes.c) generating, if appropriate, additional plants using plants according to step b), wherein, if appropriate, plant cells are isolated from plants according to steps b) or c) and process steps a) c) are repeated until a plant is generated which has a foreign nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase and an increase in activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT compared to plant-type cells. corresponding non-genetically modified and increased activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH compared to corresponding non-genetically modified wild-type plant cells.

A presente invenção preferencialmente refere-se a processos depreparação de um vegetal que sintetiza hialuronan, processo este que com-preendeThe present invention preferably relates to processes for preparing a vegetable which synthesizes hyaluronan, which process comprises

a) geneticamente modificar uma célula vegetal, em que a modi-ficação genética compreende etapas i a iii abaixo em qualquer ordem, ouquaisquer combinações de etapas i a iii poderão ser realizadas individual ousimultaneamente,(a) genetically modifying a plant cell, wherein the genetic modification comprises steps i to iii below in any order, or any combination of steps i to iii may be performed individually or simultaneously;

i) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha quecodifica um hialuronan sintase na célula vegetali) introduction of a foreign nucleic acid molecule that encodes a hyaluronan synthase into the plant cell

ii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, amodificação genética resultando em um aumento da atividade de uma prote-ína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT comparada comcélulas vegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas corres-pondentesii) introduction of a genetic modification in the plant cell, genetic amodification resulting in an increased activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT compared to corresponding non-genetically modified wild-type plant cells.

iii) introdução de uma modificação genética na célula vegetal, amodificação genética resultando em um aumento da atividade de uma prote-ína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH comparadacom células vegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas cor-respondentesiii) introduction of a genetic modification in the plant cell, genetic amodification resulting in an increased activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH compared to non-genetically modified wild-type plant cells corresponding

b) regenerar uma planta a partir de células vegetais que com-preendem a modificação genética de acordo com as etapasb) regenerate a plant from plant cells that comprise genetic modification according to the steps

i) a) ii) a) i

ii) a) iiii) a) ii

iii) a) iiiiii) a) iii

iv) a) i e a) ii,iv) a) i and a) ii,

v) a) i e a) iii,v) a) i and a) iii,

vi) a) ii e a) iii, ouvi) a) ii and a) iii, or

vii) a) i e a) ii e a) iiivii) a) i and a) ii and a) iii

c) introduzir nas células vegetais de plantas de acordo com aetapac) introduce into plant plant cells according to step

i) b) i uma modificação genética de acordo com a etapa a) ii,i) b) i a genetic modification according to step a) ii,

ii) b) i uma modificação genética de acordo com a etapa a) iii,ii) b) i a genetic modification according to step a) iii,

iii) b) i uma modificação genética de acordo com a etapa a) iie simultaneamente uma modificação genética, de acordo com a etapa a) iii,(iii) (b) a genetic modification according to step (a) and simultaneously a genetic modification according to step (a) iii;

iv) b) ii uma modificação genética, de acordo com a et&pa a) i,(iv) (b) (ii) a genetic modification according to step (a) (i);

v) b) ii uma modificação genética, de acordo com a etapa a)iii,v) b) ii a genetic modification according to step a) iii,

vi) b) ii uma modificação genética, de acordo com a etapa a) ie simultaneamente uma modificação genética, de acordo com a etapa a) iii,vi) b) ii a genetic modification according to step a) ie simultaneously a genetic modification according to step a) iii,

vii) b) iii uma modificação genética, de acordo com a etapa a) i,vii) b) iii a genetic modification according to step a) i,

viii) b) iii uma modificação genética, de acordo com a etapa a)ix) b) iii uma modificação genética, de acordo com a etapa a) ie simultaneamente uma modificação genética, de acordo com a etapa a) ii,viii) b) iii a genetic modification according to step a) ix) b) iii a genetic modification according to step a) ie simultaneously a genetic modification according to step a) ii,

x) b) iv uma modificação genética, de acordo com a etapa a) iii,x) b) iv a genetic modification according to step a) iii,

xi) b) ν uma modificação genética, de acordo com a etapa a) ii, ouxi) b) ν a genetic modification according to step a) ii, or

xii) b) vi uma modificação genética, de apordo com a etapa a) ie regenerar uma plantaxii) b) saw a genetic modification as per step a) ie regenerate a plant

d) introduzir nas células vegetais de plantas, de acordo com a etapa(d) introduce into plant plant cells according to step

i) c) i uma modificação genética, de acordo com a etapa a) iii,i) c) i a genetic modification according to step a) iii,

ii) c) ii uma modificação genética, de acordo com a etapa a) ii,ii) c) ii a genetic modification according to step a) ii,

iii) c) iv uma modificação genética, de acordo com a etapa a) iii,(iii) c) iv a genetic modification according to step a) iii,

iv) c) ν uma modificação genética, de acordo com a etapa a) ii,iv) c) ν a genetic modification according to step a) ii,

v) c) vii uma modificação genética, de acordo com a etapa a) ii,(v) c) vii a genetic modification according to step a) ii,

vi) c) vii uma modificação genética, de acordo com a etapa-a) i, ouvi) c) vii a genetic modification according to step-a) i, or

vii) c) ix uma modificação genética, de acordo com a etapa a) iie regenerar uma plantavii) c) ix a genetic modification according to step a) i regenerate a plant

e) gerar, se apropriadas, plantas adicionais com o auxílio dosvegetais, de acordo com qualquer uma das etapas b) vii, c) iii, c) vi, c) x, c)xi, c) xii ou de acordo com qualquer uma das etapas d) i a d) vii.(e) generate, as appropriate, additional plants with the aid of vegetables in accordance with any of steps b) vii, c) iii, c) vi, c) x, c) xi, c) xii or any of the following of steps d) iad) vii.

As modificações genéticas introduzidas/fie acordo com a etapaa) para a célula vegetal poderá, em princípio, ser qualquer tipo de modifica-ção resultando em um aumento na atividade de uma proteína que apresentaa atividade (enzimática) de uma GFAT e um aumento na atividade de umaproteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-glicose desi-drogenase.The genetic modifications introduced (according to step a) to the plant cell could, in principle, be any kind of modification resulting in an increase in the activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a GFAT and an increase in activity. of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-glucose dehydrogenase.

A regeneração das plantas de acordo com a etapa b) e, se a-propriada, etapa c) e d) dos processos de acordo com a invenção pode serrealizada usando métodos conhecidos daquele versado na técnica (descrito,por exemplo, in "Plant Cell Culture Protocols!', 1999, editado por R. D. Hall,Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).Regeneration of plants according to step b) and, if appropriate, step c) and d) of the processes according to the invention may be carried out using methods known to one skilled in the art (described, for example, in "Plant Cell Culture"). Protocols, 1999, edited by RD Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2).

A geração de plantas adicionais (dependendo do processo deacordo com etapa c) ou etapa e)) dos processos de acordo com a invençãopode ser realizada, por exemplo, por meio de propagação vegetativa (porexemplo via cortes, tubérculos ou via cultura de calos e regeneração deplantas intactas) ou via propagação generativa. Nesse contexto, propagaçãogenerativa geralmente ocorre sob condições controladas, isto é, plantas se-lecionadas com características específicas são hibridizadas umas com asoutras e multiplicadas. A seleção preferencialmente ocorre de tal maneiraque as plantas adicionais (dependendo do processo gerado de acordo com aetapa c) ou etapa e)) compreendem as modificações introduzidas nas etapasprecedentes.The generation of additional plants (depending on the process according to step c) or step e)) of the processes according to the invention may be carried out, for example, by vegetative propagation (eg via cuts, tubers or callus culture and regeneration). deplants intact) or via generative propagation. In this context, generative propagation usually occurs under controlled conditions, that is, selected plants with specific characteristics are hybridized to each other and multiplied. Selection preferably takes place such that additional plants (depending on the process generated according to step c) or step e)) comprise the modifications introduced in the preceding steps.

Em processos de acordo com a invenção para preparar plantasque sintetizam hialuronan, as modificações genéticas para gerar as célulasvegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção podem serrealizadas simultaneamente ou em etapas sucessivas e em qualquer combi-nação. Tanto plantas do tipo selvagem quanto células vegetais do tipo sel-vagem poderão ser usadas como um ponto de partida para as quais umamolécula de ácido nucléico estranha que codifica um hialuronan sintase nãofoi ainda introduzida e para as quais uma modificação genética que aumentaa atividade de uma proteína apresentando a atividade (enzimática) de umaGFAT comparada com células vegetais do tipo selvagem não geneticamentemodificadas correspondentes não «foi ainda introduzida e para as quais umamodificação genética que aumenta a atividade de uma proteína que apre-senta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH comparada com célulasvegetais do tipo selvagem não geneticamente modificadas correspondentesnão foi ainda introduzida, ou células vegetais ou plantas que foram já geneti-camente modificadas e e para as quais uma molécula de ácido nucléico quecodifica um hialuronan sintase foi já introduzida e/ou para as quais uma mo-dificação genética para aumentar a atividade de uma proteína que apresentaa atividade (enzimática) de uma GFAT comparada com células vegetais dotipo selvagem não geneticamente modificadas correspondentes que foram jáintroduzidas e/ou para as quais uma modificação genética para aumentar aatividade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de umaGFAT comparada com células vegetais do tipo selvagem não geneticamentemodificadas correspondentes que foram já introduzidas. Aqui, é imaterial seo mesmo método quanto à modificação genética que jesuíta em um aumen-to na atividade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) deuma UDP-GIc-DH é usado para modificações genéticas sucessivas resul- tando em um aumento na atividade de uma proteína que apresenta a ativi-dade (enzimática) de uma GFAT, contanto que ambas as modificações ge-néticas juntamente resultam em um aumento na atividade de uma proteínaque apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT e uma proteína queapresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH na mesma célula vegetal. É também imaterial que se usa método para introduzir uma molécu-la de ácido nucléico estranha que codifica um hialuronan sintase na célulavegetal.In processes according to the invention for preparing hyaluronan synthesizing plants, genetic modifications to generate the genetically modified vegetable cells according to the invention may be carried out simultaneously or in successive steps and in any combination. Both wild-type plants and wild-type plant cells could be used as a starting point for which a foreign nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase has not yet been introduced and for which a genetic modification that increases protein activity presenting the (enzymatic) activity of a GFAT compared to corresponding non-genetically modified wild-type plant cells has not yet been introduced and for which a genetic modification that increases the activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc -DH compared to corresponding non-genetically modified wild-type vegetable cells has not yet been introduced, or plant cells or plants that have already been genetically modified and for which a nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase has already been introduced and / or a genetic modification to increase the activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a GFAT compared to corresponding non-genetically modified wild-type plant cells that have already been introduced and / or for which a genetic modification to increase the activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a GFAT compared to corresponding non-genetically modified wild-type plant cells that have already been introduced. Here, it is immaterial that the same method as for the genetic modification that Jesuits increase in the activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH is used for successive genetic modifications resulting in an increase in activity. of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT, provided that both genetic modifications together result in an increase in activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT and a protein that exhibits the activity ( UDP-GIc-DH in the same plant cell. It is also immaterial that a method is used to introduce a foreign nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase into the cellvegetal.

Em uma modalidade adicional de processos de acordo com ainvenção para preparar uma planta que sintetiza hialuronan, a modificação genética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nu-cléico estranha no genoma da célula vegetal, em que a presença ou a ex-pressão da(s) molécula(s) de ácidos nucléicos estranha(s) resulta em umaumento na atividade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimáti-ca) de uma GFAT e uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH na mesma célula vegetal.In a further embodiment of the invention according to the invention for preparing a plant which synthesizes hyaluronan, the genetic modification consists of introducing at least one foreign nucleic acid molecule into the plant cell genome, wherein the presence or expression of of the foreign nucleic acid molecule (s) results in an increase in the activity of a protein that exhibits the activity (enzymatic) of a GFAT and a protein that exhibits the activity (enzymatic) of a UDP-GIc -DH in the same plant cell.

Em uma modalidade adicional de processos de acordo com ainvenção para preparar uma planta que sintetiza hialuronan, a modificaçãogenética consiste na introdução de pelo menos uma molécula de ácido nu-cléico estranha ou de uma pluralidade de moléculas de ácido nucléico estra- nhas no genoma da célula vegetal, em que a(s) molécula(s) de ácidos nu-cléicos estranha(s) compreende/compreendem uma seqüência de codifica-ção de um hialuronan sintase e uma seqüência de codificação de uma prote-ína que apresenta a atividade (enzimática) de uma GFAT e uma seqüênciade codificação de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) deuma UDP-GIc-DH.In a further embodiment of the invention according to the invention for preparing a hyaluronan synthesizing plant, the genetic modification consists of introducing at least one foreign nucleic acid molecule or a plurality of foreign nucleic acid molecules into the cell genome. in which the foreign nucleic acid molecule (s) comprises / comprises a coding sequence for a hyaluronan synthase and a coding sequence for a protein (enzymatic) ) of a GFAT and a protein coding sequence that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH.

Conforme já descrito acima em relação à molécula de ácido nu-cléico estranha introduzida de modificação genética na célula vegetal ouplanta, a qual é introduzida na etapa a) dos processos de acordo com a in-venção para preparação de uma planta que sintetiza hialuronan poderá seruma molécula de ácido nucléico individual ou uma pluralidade de moléculasde ácido nucléico. Desse modo, as moléculas de ácido nucléico estranhasque codifica um hialuronan sintase e/ou que codifica uma proteína que apre-senta a atividade (enzimática) de uma GFAT e/ou que codifica uma proteínaque apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH poderão estarpresentes juntamente em uma única molécula de ácido nucléico, ou duasdas moléculas de ácido nucléico estranhas mencionadas poderão estar pre- sentes juntamente em uma única molécula de ácido nucléico e a terceiramolécula de ácido nucléico estranha poderá estar presente em uma outramolécula de ácido nucléico, em qualquer combinação possível, ou todas astrês das moléculas de ácido nucléico estranhas mencionadas poderão emcada caso estar presentes em moléculas individuais separadas de ácido nu-cléico.As already described above with respect to the genetically modified foreign introduced nu-clicic acid molecule into the plant cell or plant which is introduced in step a) of the processes according to the invention for the preparation of a hyaluronan synthesizing plant may be a individual nucleic acid molecule or a plurality of nucleic acid molecules. Thus, foreign nucleic acid molecules that encode a hyaluronan synthase and / or encode a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT and / or that encodes a protein exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc. -DH may be present together in a single nucleic acid molecule, or two of the mentioned foreign nucleic acid molecules may be present together in a single nucleic acid molecule and the third foreign nucleic acid molecule may be present in another nucleic acid molecule. in any possible combination, or all of the above mentioned foreign nucleic acid molecules, may be present if present in separate individual nucleic acid molecules.

Além disso, para introduzir uma molécula de ácido nucléico es-tranha na prática de processos de acordo com a invenção para prepararuma planta que sintetiza hialuronan, é possível usar, em lugar de uma célulavegetal do tipo selvagem ou planta do tipo selvagem, células mutantes ou v mutantes que se distinguem pelo fato de que elas já apresentam um aumen-to na atividade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática) deuma GFAT e/ou um aumento na atividade de uma proteína que apresenta aatividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH. Se a célula mutante ou o mu-tante já apresenta um aumento na atividade de uma proteína que apresentaa atividade (enzimática) de uma GFAT ou um aumento na atividade de umaproteína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH com-parada com as células vegetais cio tipo selvagem ou plantas do tipo selva-gem correspondentes, é suficiente realizar um processo de acordo com ainvenção para preparar uma planta que sintetiza hialuronan tal que uma mo-lécula de ácido nucléico estranha que codifica um hialuronan sintase e umamodificação genética resultando em um aumento na atividade de uma prote-ína que apresenta a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH ou um au-mento na atividade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma GFAT, comparada com células vegetais do tipo selvagem não gene-ticamente modificadas correspondentes, é introduzida nessa célula de mu-tante ou mutante. Se a célula de mutante ou o mutante já apresenta um au-mento na atividade de uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma GFAT e um aumento na atividade de uma proteína que apresenta aatividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH comparada com células vegetaisdo tipo selvagem correspondente ou uma planta do tipo selvagem corres-pondente, uma molécula de ácido nucléico estranha que codifica um hialuro-nan sintase poderá ser introduzida nessa célula de mutante ou mutante pararealizar um processo de acordo com a invenção para preparar uma plantaque sintetiza hialuronan.In addition, to introduce a foreign nucleic acid molecule in the practice of processes according to the invention for preparing a plant which synthesizes hyaluronan, it is possible to use, instead of a wild-type cell or wild-type plant, mutant cells or v mutants that are distinguished by the fact that they already show an increase in the activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT and / or an increase in the activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a UDP- GIc-DH. If the mutant cell or mutant already shows an increase in activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a GFAT or an increase in activity of a protein that exhibits (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH With the corresponding wild-type plant cells or jungle-like plants, a process according to the invention is sufficient to prepare a plant which synthesizes hyaluronan such that a foreign nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase and a modification genetics resulting in an increase in the activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH or an increase in the activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT compared to cells corresponding non-genetically modified wild-type plant is introduced into that mutant or mutant cell. If the mutant cell or mutant already shows an increase in the activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a GFAT and an increase in the activity of a protein that exhibits the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH Compared to corresponding wild-type plant cells or a corresponding wild-type plant, a foreign nucleic acid molecule encoding a hyaluro nan synthase may be introduced into that mutant or mutant cell to carry out a process according to the invention for preparing a mutant. plant that synthesizes hyaluronan.

Todos esses acima adicionais com referência a uso de mutantespara a preparação de células vegetais geneticamente modificadas de acordocom a invenção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a in-venção aplicam-se neste relatório de uma maneira análoga.All of the above with reference to the use of mutants for the preparation of genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention apply in a similar manner in this report.

Em modalidades preferidas, a presente invenção refere-se aprocessos de acordo com a invenção para a preparação de uma planta quesintetiza hialuronan, nas quais a molécula de ácido nucléico que codifica umhialuronan sintase na etapa a) é selecionada do grupo que consiste em:In preferred embodiments, the present invention relates to processes according to the invention for the preparation of a hyaluronan synthesizing plant, wherein the nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase in step a) is selected from the group consisting of:

a) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam um hialurano sintase viral,(a) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a viral hyalurane synthase,

b) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam um hialuronan sintase de um vírus infectante Chlorellalb) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a hyaluronan synthase of an infectious virus Chlorellal

c) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam um hialuronan sintase de um vírus Chlorella 1 Parameciumbursaria,d) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam um hialuronan sintase de um vírus Chlorella 1 Parameciumbursaria de cepa H1,c) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a hyaluronan synthase of a Chlorella 1 Parameciumbursaria virus, d) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a Chlorella 1 Parameciumbursaria strain H1 virus,

e) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da molécula de ácido nucléico que codifica um hialuronan sintasesão modificados comparados com os códons da molécula de ácido nucléicoque codifica o hialuronan sintase no organismo de origem da hialuronan sin-tase,e) nucleic acid molecules characterized in that the codons of the nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase are modified compared to the codons of the nucleic acid molecule encoding hialuronan synthase in the source organism of hyaluronan synthase,

f) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons do hialuronan sintase são modificados assim que eles são adap-tados à freqüência do uso dos códons da célula vegetal ou da planta paracujo genoma eles devem ser integrados ou são integrados,f) Nucleic acid molecules characterized by the fact that the hyaluronan synthase codons are modified as soon as they are adapted to the frequency of use of the plant cell or plant codons so that they must be integrated or integrated,

g) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam um hialuronan sintase que apresenta a seqüência de aminoá-cidos mostrada sob SEQ ID NO. 2 ou que elas codificam um hialuronan sin-tase cuja seqüência de aminoácidos é pelo menos 70%, preferencialmentepelo menos 80%, particular e preferencialmente pelo menos 90%, especial epreferencialmente pelo menos 95% e mais preferencialmente pelo menos98% idêntica à seqüência de aminoácidos mostrada sob SEQ ID NO. 2,g) Nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a hyaluronan synthase having the amino acid sequence shown under SEQ ID NO. 2 or that they encode a hyaluronan synthase whose amino acid sequence is at least 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and most preferably at least 98% identical to the amino acid sequence shown under SEQ ID NO. 2,

h) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam de uma proteína cuja seqüência de aminoácidos pode serderivada da região de codificação da seqüência de ácidos nucléicos inseridano plasmídeo DSM16664 ou que elas se codificam de uma proteína cujaseqüência de aminoácidos é pelo menos 70%, preferencialmente pelo me-nos 80%, particular e preferencialmente pelo menos 90%, especial e prefe-rencialmente pelo menos 95% e mais preferencialmente pelo menos 98%idêntica à seqüência de aminoácidos que pode ser derivada da região decodificação da seqüência de ácido nucléico inserida no plasmídeoDSM16664,(h) nucleic acid molecules characterized in that they encode for a protein whose amino acid sequence may be derived from the coding region for the nucleic acid sequence inserted in plasmid DSM16664 or that they are encoded with a protein whose amino acid sequence is at least 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and more preferably at least 98% identical to the amino acid sequence which may be derived from the decoding region of the inserted nucleic acid sequence. on plasmidDSM16664,

i) moléculas de ácido nucléico que compreendem uma seqüên-cia de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 3 ou queé pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, com preferênciapelo menos 90%, especial e preferencialmente pelo menos 95% e, mais pre-ferencialmente pelo menos 98% idêntica à seqüência de ácido nucléico mos-trada sob SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID NO. 3,(i) nucleic acid molecules comprising a nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO. 1 or SEQ ID NO. Or at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and more preferably at least 98% identical to the nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO. . 1 or SEQ ID NO. 3,

j) moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüênciade ácidos nucléicos inserida no plasmídeo DSM16664 ou que é pelo menos70%, preferencialmente pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%,especial e preferencialmente pelo menos 95% e, npais preferencialmentepelo menos 98% idêntica à seqüência de ácido nucléico inserida no plasmí-deo DSM16664,j) nucleic acid molecules that comprise the nucleic acid sequence inserted into plasmid DSM16664 or which is at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and preferably at least 98%. identical to the nucleic acid sequence inserted into plasmid DSM16664,

k) moléculas de ácido nucléico que codificam um hialuronan sin-tase, em que as seqüências de ácidos nucléicos que codificam o hialuronansintase são ligadas a elementos reguladores (promotores) que iniciam atranscrição nas células vegetais ouk) nucleic acid molecules encoding a hyaluronan synthase, wherein the nucleic acid sequences encoding the hyaluronansynthase are linked to regulatory elements (promoters) that initiate transcription in plant cells or

I) moléculas de ácido nucléico de acordo com k) em que os pro-motores são promotores específicos a tecidos, particular e preferencialmentepromotores que iniciam a iniciação de transcrição especificamente em célu-las de tubérculo, fruto ou sementes de vegetal.I) nucleic acid molecules according to k) wherein the promoters are tissue-specific promoters, particularly and preferably promoters that initiate transcription initiation specifically in tuber, fruit or vegetable seed cells.

Em modalidades preferidas, a presente invenção refere-se aprocessos de acordo com a invenção para preparar uma planta que sintetizahialuronan, em que a molécula de ácido nucléico que codifica uma proteínaque apresenta a atividade de uma GFAT é selecionada do grupo que consis-te em:In preferred embodiments, the present invention relates to processes according to the invention for preparing a plant synthesizing hyaluronan, wherein the protein-encoding nucleic acid molecule exhibits the activity of a GFAT is selected from the group consisting of:

a) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT que seorigina de bactérias, animajs ou vegetais, preferèncialmente de Escherichiacoliou o camundongo,(a) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a protein which exhibits the activity of a GFAT which is derived from bacteria, animals or plants, preferably from Escherichiacoliou mouse,

b) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT de umvírus infectante Chlorella,b) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a protein that exhibits the activity of a Chlorella infecting virus GFAT;

c) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT de umvírus Chlorella Paramecium bursaria,d) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da molécula de ácido nucléico que codificam uma proteína queapresenta a atividade de uma GFAT são modificados comparados com oscódons da molécula de ácido nucléico que codificam a proteína correspon- dente que apresenta a atividade de uma GFAT do organismo de origem,c) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a protein that exhibits the activity of a Chlorella Paramecium bursaria GFAT, d) nucleic acid molecules characterized by the fact that the codons of the nucleic acid molecule encoding a protein that has the activity of a GFAT are modified compared to nucleic acid molecule codons encoding the corresponding protein that exhibits the activity of a GFAT from the source organism,

e) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da proteína que apresenta a atividade de uma GFAT são modifi-cados de tal modo que elas sejam adaptadas à freqüência do uso dos có-dons da célula vegetal ou da planta em cujo genoma elas devem ser inte- gradas ou são integradas,e) nucleic acid molecules characterized by the fact that the codons of the protein displaying the activity of a GFAT are modified in such a way that they are adapted to the frequency of use of the codons of the plant cell or plant in whose genome they are. must be integrated or integrated,

f) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína queapresenta a seqüência de aminoácidos mostradas sob SEQ ID NO. 8 ou deuma proteína que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada sob SEQID NO. 10 ou de uma proteína que apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada sob SEQ ID NO. 12;f) nucleic acid molecules encoding a protein which has the amino acid sequence shown under SEQ ID NO. 8 or a protein having the amino acid sequence shown under SEQID NO. 10 or a protein having the amino acid sequence shown under SEQ ID NO. 12;

g) moléculas de ácido nucléico que codificam de uma proteína cujaseqüência é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, com prefe-rência pelo menos 90%, especial e preferencialmente pelo menos 95% e, maispreferencialmente pelo menos 98% idêntica à seqüência de aminoácidos mos-trada sob SEQ ID NO. 8 ou sob SEQ ID NO. 10 ou sob SEQ ID NO. 12;g) Nucleic acid molecules encoding a protein whose sequence is at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95%, and most preferably at least 98% identical to the sequence. of amino acids shown under SEQ ID NO. 8 or under SEQ ID NO. 10 or under SEQ ID NO. 12;

h) moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüênciade ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO. 7 ou uma seqüência comple-mentar a esta ou a seqüência de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO. 9ou uma seqüência complementar a esta ou a seqüência de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO. 11 ou uma seqüência complementar a esta ou aseqüência de ácido nucléico mostrada sob SEQ ID NO. 13 ou uma seqüên-cia complementar a esta;h) nucleic acid molecules comprising the nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO. 7 or a sequence complementary to this or the nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO. 9or a sequence complementary to this or the nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO. 11 or a sequence complementary to this or nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO. 13 or a sequence complementary to it;

i) moléculas de ácico nucléico que são pelo menos 70%, prefe-rencialmente pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especial e preferencialmente pelo menos 95% e, mais preferencialmente pelo menos98% idêntica às seqüências de ácido nucléico descritas sob h);(i) nucleic acid molecules which are at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95% and more preferably at least 98% identical to the nucleic acid sequences described below. H);

j) moléculas de ácico nucléico que hibridizam sob condições ri-gorosas com pelo menos uma fita das seqüências de ácido nucléico descri-tas sob f) ou h);j) nucleic acid molecules that hybridize under stringent conditions to at least one strand of the nucleic acid sequences described under f) or h);

k) moléculas de ácico nucléico cuja seqüência de nucleotídeosdifere da seqüência das moléculas de ácido nucléico mencionadas sob f) ouh) devido à degeneração do código genético; ek) nucleic acid molecules whose nucleotide sequence differs from the sequence of nucleic acid molecules mentioned under f) or h) due to the degeneration of the genetic code; and

I) moléculas de ácico nucléico que são fragmentos, variantesalélicos e/ou derivados das moléculas de ácido nucléico mencionadas soba), b), c), d), e), f) ou h),(I) nucleic acid molecules which are fragments, variantsalelic and / or derived from the nucleic acid molecules mentioned above (b), (c), (d), (e), (f) or (h);

m) moléculas de ácico nucléico que codificam uma proteína queapresenta a atividade de uma GFAT, em que as seqüências de ácido nucléi-co que codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma GFAT sãoligadas a elementos reguladores (promotores) que iniciam a transcrição emcélulas vegetais oum) Nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits GFAT activity, wherein the nucleic acid sequences encoding a GFAT protein are linked to regulatory elements (promoters) that initiate transcription in plant cells. or

n) moléculas de ácico nucléico de acordo com m), em que ospromotores são promotores específicos a tecidos, particular e preferencial-mente promotores que iniciam a iniciação de transcrição especificamente emcélulas de tubérculo, folha, fruto ou sementes de plantas.n) nucleic acid molecules according to m), wherein the promoters are tissue-specific promoters, particularly and preferably promoters that initiate transcription initiation specifically into plant tuber, leaf, fruit or seed cells.

Em modalidades preferidas, a presente invenção refere-se aprocessos de acordo com a invenção para preparar uma planta que sintetizahialuronan, em que a molécula de ácido nucléico estranha que codifica umaproteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH é selecionada dogrupo que consiste em:In preferred embodiments, the present invention relates to processes according to the invention for preparing a plant synthesizing hyaluronan, wherein the foreign nucleic acid molecule encoding a protein displaying UDP-GIc-DH activity is selected from the group consisting of in:

a) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DHque se origina de vírus, bactérias, animais ou vegetais,(a) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH originating from viruses, bacteria, animals or plants;

b) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DHde um vírus infectante Chlorella,b) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH of an Chlorella infecting virus;

c) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queelas codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DHde um vírus Chlorella de Paramecium bursaria,c) nucleic acid molecules characterized by the fact that they encode a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH of a Chlorella virus of Paramecium bursaria,

d) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da molécula de ácido nucléico que codificam uma proteína queapresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH são modificados comparadoscom os códons da molécula de ácido nucléico que codifica a proteína cor-respondente que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH do organismode origem,d) Nucleic acid molecules characterized in that the codons of the nucleic acid molecule encoding a protein that has the activity of a UDP-GIc-DH are modified compared to the codons of the nucleic acid molecule encoding the corresponding protein that presents the activity of a UDP-GIc-DH from the source organism,

e) moléculas de ácido nucléico caracterizadas pelo fato de queos códons da proteína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH sãomodificados de tal modo que eles sejam adaptados à freqüência do uso doscódons da célula vegetal ou da planta em cujo genoma eles devem ser inte-grados ou são integrados,e) Nucleic acid molecules characterized by the fact that the codons of the protein displaying the activity of a UDP-GIc-DH are modified in such a way that they are adapted to the frequency of use of the codons of the plant cell or plant in whose genome they should be. integrated or integrated,

f) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína queapresenta a seqüência de aminoácidos mostrada sob SEQ ID NO. 5;f) nucleic acid molecules encoding a protein which has the amino acid sequence shown under SEQ ID NO. 5;

g) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína cujaseqüência é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, com pre-ferência pelo menos 90%, especial e preferencialmente pelo menos 95% e,mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a seqüência de aminoáci-dos mostrada sob SEQ ID NO. 5;g) nucleic acid molecules encoding a protein whose sequence is at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably at least 95%, and most preferably at least 98% identical to the sequence. of amino acids shown under SEQ ID NO. 5;

h) moléculas de ácido nucléico que compreendem a seqüênciade nucleotídeos mostrada sob SEQ ID NO. 4 ou uma seqüência complemen-tar a esta ou a seqüência de nucleotídeos mostrada sob SEQ ID NO. 6 ouuma seqüência complementar a esta;h) nucleic acid molecules comprising the nucleotide sequence shown under SEQ ID NO. 4 or a sequence complementary to this or the nucleotide sequence shown under SEQ ID NO. 6 or a sequence complementary to this;

i) moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 70%, prefe-rencialmente pelo menos 80%, com preferência pelo menos 90%, especial epreferencialmente 95% e, mais preferencialmente pelo menos 98% idênticaàs seqüências de ácido nucléico descritas sob h);i) nucleic acid molecules which are at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 90%, especially preferably 95% and more preferably at least 98% identical to the nucleic acid sequences described under h);

j) moléculas de ácido nucléico que hibridizam sob condiçõesrigorosas com pelo menos uma fita das moléculas de ácido nucléico descri-tas sob f) ou h);j) nucleic acid molecules that hybridize under stringent conditions to at least one strand of the nucleic acid molecules described under f) or h);

k) moléculas de ácido nucléico cuja seqüência de nucleotídeosdifere da seqüência das moléculas de ácido, nucléico mencionadas sob f) ouh) devido à degeneração do código genético; ek) nucleic acid molecules whose nucleotide sequence differs from the sequence of nucleic acid molecules mentioned under f) or h) due to the degeneration of the genetic code; and

I) moléculas de ácido nucléico que são fragmentos, variantesalélicos e/ou derivados das moléculas de ácido nucléico mencionadas soba), b), c), d), e), f) ou h),I) nucleic acid molecules which are fragments, variantselelic and / or derived from the nucleic acid molecules mentioned above), b), c), d), e), f) or h),

m) moléculas de ácido nucléico que codificam uma proteína queapresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH em que as seqüências de ácidonucléico que codificam uma proteína que apresenta a atividade de umaUDP-GIc-DH são ligadas a elementos reguladores (promotores) que iniciama transcrição em células vegetais oum) Nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH wherein the nucleic acid sequences encoding a protein that exhibits the activity of aUDP-GIc-DH are linked to regulatory elements (promoters) that initiate transcription in plant cells or

n) moléculas de ácido nucléico de acordo com m), em que ospromotores são específicos a tecido, particular e preferencialmente promoto-res que iniciam a iniciação de transcrição especificamente em células detubérculo, folha, fruto ou sementes de planta.n) nucleic acid molecules according to m), wherein the promoters are tissue specific, particularly and preferably promoters, that initiate transcription initiation specifically in plant cells, leaf, fruit or plant seeds.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, os proces-sos de preparação de uma planta que sintetiza hialuronan refere-se a pro-cessos de preparação de uma planta que sintetiza pelo menos 100, prefe-rencialmente pelo menos 600, particular e preferencialmente pelo menos1.000, especial e preferencialmente pelo menos 1.500, pg de hialuronan porg de massa fresca (MF) de material vegetal.In a preferred embodiment of the present invention, the processes for preparing a hyaluronan synthesizing plant refer to processes for preparing a plant which synthesizes at least 100, preferably at least 600, particularly and preferably at least 1. .000, especially and preferably at least 1,500 pg of hyaluronan per g of fresh pasta (MF) of plant material.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, processos deacordo com a invenção para preparação de uma planta que sintetiza hialu-ronan são usados para preparar plantas geneticamente modificadas de a-cordo com a invenção.In a further preferred embodiment, processes according to the invention for preparing a hyaluronon synthesizing plant are used to prepare genetically modified plants in accordance with the invention.

A presente invenção também proporciona plantas obteníveis porum processo de acordo com a invenção para preparar uma planta que sinte-tiza hialuronan.The present invention also provides plants obtainable by a process according to the invention for preparing a hyaluronan synthesizing plant.

A presente invenção além disso refere-se a um processo depreparação de hialuronan que compreende a etapa de extração de hialuro-nan a partir de células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção, de plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção,de material de propagação de acordo com a invençãon, a partir de partes daplanta passíveis de colheita de acordo com a invenção ou de plantas ou par-tes dessas plantas obteníveis por um processo de acordo com a invençãopara preparação de plantas que sintetizam hialuronan.Preferencialmente, esse processo também compreende a etapade colheita das células vegetais cultivadas geneticamente modificadas deacordo com a invenção, as plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção, o material de propagação de acordo com á invenção, aspartes da planta passíveis de colheita de acordo com a invenção, as partesda planta processáveis de acordo com a invenção antes de extração do hia-luronan, e particular e preferencialmente além disso a etapa de cultivar célu-las vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção ou plan-tas geneticamente modificadas de acordo com a invenção antes de colheita.The present invention further relates to a hyaluronan preparation process comprising the step of extracting hyaluro-nan from genetically modified plant cells according to the invention, from genetically modified plants according to the invention, from propagating material. according to the invention, from harvestable plant parts according to the invention or from plants or parts thereof obtainable by a process according to the invention for preparing hyaluronan synthesizing plants. Preferably, this process also comprises harvesting of genetically modified plant cells according to the invention, genetically modified plants according to the invention, propagating material according to the invention, harvestable plant parts according to the invention, processable plant parts of according to the invention prior to extraction of hia-luronan, and particularly preferably preferably the step of cultivating genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention prior to harvesting.

Em contraste com tecidos bacterianos ou animais, tecidos vege-tais apresentam nenhuma hialuronidases e não contêm quaisquer hialaderi-nas. Conseqüentemente, conforme já descrita acima, extração de hialuronana partir de tecidos vegetais é possível usar métodos relativamente simples.Se exigidos, os extratos aquosos, descritos acima, de células vegetais outecidos contendo hialuronan podem ser purificados adicionalmente usandométodos conhecidos daquele versado na técnica, tal como, por exemplo,precipitação repetida com etanol. Um método preferido para purificação dehialuronan é descrito sob Métodos Gerais item 3.In contrast to bacterial or animal tissues, plant tissues have no hyaluronidases and do not contain any hyaladerins. Accordingly, as already described above, extraction of hyaluronan from plant tissues is possible using relatively simple methods. If required, the aqueous extracts described above of decayed hyaluronan-containing plant cells can be further purified using methods known to those skilled in the art, such as for example repeated precipitation with ethanol. A preferred method for purifying dehyaluronan is described under General Methods item 3.

Os processos já descritos para extração de hialuronan a partirde células vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invençãoou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção são tam-bém adequados para isolar hialuronan de material de propagação de acordocom a invenção, de partes da planta passíveis de colheita de acordo com ainvenção ou de plantas ou partes dessas plantas obteníveis por um processode acordo com a invenção para preparar plantas que sintetizam hialuronan.The processes already described for extracting hyaluronan from genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention are also suitable for isolating hyaluronan from propagating material according to the invention from plant parts capable of harvesting according to the invention or from plants or parts thereof obtained by a process according to the invention to prepare hyaluronan synthesizing plants.

A presente invenção também proporciona o uso de células ve-getais geneticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção, material de propagaçãode acordo com a invenção, partes da planta passíveis de colheita de acordocom a invenção, partes da planta processáveis de acordo com a invenção ouplantas obteníveis por um processo de acordo com a invenção para prepa-ração de hialuronan.A presente invenção além disso, refere-se a composições quecompreendem células vegetais geneticamente modificadas de acordo com ainvenção. Aqui, é imaterial se as células vegetais sejam intactas ou não maisintactas porque elas foram destruídas, por exemplo, por meio de processa-mento. As composições são preferencialmente gêneros alimentícios ou ra-ções para animais, produtos farmacêuticos ou cosméticos.The present invention also provides for the use of genetically modified plant cells according to the invention, genetically modified plants according to the invention, propagation material according to the invention, harvestable plant parts according to the invention, Processable plant parts according to the invention or plants obtainable by a process according to the invention for preparing hyaluronan. The present invention furthermore relates to compositions comprising genetically modified plant cells according to the invention. Here it is immaterial whether plant cells are intact or no longer intact because they have been destroyed, for example by processing. The compositions are preferably animal food or feed, pharmaceuticals or cosmetics.

A presente invenção preferencialmente -proporciona composi-ções que compreendem componentes de células vegetais geneticamentemodificadas de acordo com a invenção, de plantas geneticamente modifica-das de acordo com a invenção, de material de propagação de acordo com ainvenção, de partes da planta passíveis de colheita de acordo com a invençãoou de plantas obteníveis por um processo de acordo com a invenção e quecompreendem moléculas de ácido nucléico recombinantes, em que as molécu-las de ácido nucléico recombinantes são caracterizadas pelo fato de que elascompreendem moléculas de ácido nucléico que codificam um hialuronansintase e proteínas que apresentam a atividade (enzimática) de uma GFAT eproteínas que apresentam a atividade (enzimática) de uma UDP-GIc-DH.The present invention preferably provides compositions comprising genetically modified plant cell components according to the invention, genetically modified plants according to the invention, propagating material according to the invention, harvestable plant parts according to the invention or from plants obtainable by a process according to the invention comprising recombinant nucleic acid molecules, wherein the recombinant nucleic acid molecules are characterized in that they comprise nucleic acid molecules encoding a hyaluronansintase and proteins that exhibit (enzymatic) activity of a GFAT and proteins that exhibit (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH.

Uma integração estável de moléculas de ácido nucléico estra-nhas no genoma de uma célula vegetal ou planta resulta nas moléculas deácido nucléico estranhas que são flanqueadas após integração no genomada célula vegetal ou planta por meio de seqüências genômicas de ácido nu-cléico vegetais.A stable integration of foreign nucleic acid molecules into the genome of a plant or plant cell results in foreign nucleic acid molecules that are flanked after integration into the genome plant or plant cell via plant nucleic acid genomic sequences.

Conseqüentemente, em uma modalidade preferida, composi-ções de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que as mo-léculas de ácido nucléico recombinantes presentes na composição de acor-do com a invenção são flanqueadas por meio de seqüências genômicas deácido nucléico vegetais.Accordingly, in a preferred embodiment, compositions according to the invention are characterized in that the recombinant nucleic acid molecules present in the composition according to the invention are flanked by plant nucleic acid genomic sequences.

Aqui, as seqüências genômicas de ácido nucléico vegetais po-derão ser quaisquer seqüências naturalmente presentes no genoma da célu-la vegetal ou planta usada para preparar a composição.Here the plant nucleic acid genomic sequences may be any sequences naturally present in the plant cell or plant genome used to prepare the composition.

As moléculas de ácido nucléico recombinantes presentes nascomposições de acordo com a invenção poderão ser individuais ou váriasmoléculas de ácido nucléico recombinantes em que moléculas de ácido nu-cléico que codificam um hialuronan sintase e proteínas que apresentam aatividade (enzimática) de uma GFAT e proteínas que apresentam a atividade(enzimática) de uma UDP-GIc-DH estão presentes em uma molécula de áci-do nucléico, ou aquelas em que as moléculas de ácido nucléico menciona-das poderão estar presentes em moléculas de ácido nucléico separadas re-combinantes. Moléculas de ácido nucléico que codificam um hialuronan sin-tase ou que codificam uma proteína que apresenta a atividade (enzimática)de uma GFAT ou que codificam uma proteína que apresenta a atividade(enzimática) de uma UDP-GIc-DH poderão estar presentes juntamente emuma única molécula de ácido nucléico recombinante, ou duas das moléculasde ácido nucléico mencionadas poderão estar presentes juntamente em umaúnica molécula de ácido nucléico recombinante e a terceira molécula de áci-do nucléico poderá estar presente em uma outra molécula de ácido nucléicorecombinante em qualquer combinação possível, ou todas as três moléculasde ácido nucléico mencionadas poderão em cada caso estar presentes emmoléculas de ácido nucléico individuais separadas recombinantes. Depen-dendo em como as moléculas de ácido nucléico que codificam um hialuranosintase ou que codificam uma proteína apresentando a atividade (enzimáti-ca) de uma GFAT ou que codifica uma proteína apresentando a atividade(enzimática) de uma UDP-GIc-DH estão presentes em uma composição deacordo com a invenção, elas poderão ser flanqueadas por meio de seqüên-cias genômicas vegetais de ácido nucléico idênticas ou diferentes.Recombinant nucleic acid molecules present in the compositions according to the invention may be single or multiple recombinant nucleic acid molecules wherein nu-cyclic acid molecules encoding a hyaluronan synthase and proteins displaying (enzymatic) activity of a GFAT and proteins exhibiting The (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH is present in a nucleic acid molecule, or those in which the mentioned nucleic acid molecules may be present in separate recombinant nucleic acid molecules. Nucleic acid molecules encoding a hyaluronan synthase or encoding a protein that exhibits (enzymatic) activity of a GFAT or encoding a protein that exhibits (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH may be present together in one a single recombinant nucleic acid molecule, or two of the mentioned nucleic acid molecules may be present together in a single recombinant nucleic acid molecule and the third nucleic acid molecule may be present in another recombinant nucleic acid molecule in any possible combination, or all three mentioned nucleic acid molecules may in each case be present in separate separate recombinant nucleic acid molecules. Depending on how nucleic acid molecules encoding a hyaluranosynthase or encoding a protein displaying the (enzymatic) activity of a GFAT or encoding a protein displaying the (enzymatic) activity of a UDP-GIc-DH are present. in a composition according to the invention, they may be flanked by identical or different nucleic acid plant genomic sequences.

Tais composições de acordo com a invenção que compreendemmoléculas de ácido nucléico recombinantes poderão ser demonstradas u-sando métodos conhecidos daquele versado na técnica, tal como, por e-xemplo, métodos baseados em hibridização ou, preferencialmente, usandométodos baseados em PCR (reação em cadeia de polimerase).Such compositions according to the invention which comprise recombinant nucleic acid molecules may be demonstrated using methods known to one of skill in the art, such as, for example, hybridization based methods or, preferably, PCR (chain reaction) based methods. polymerase).

Preferencialmente, composições de acordo com a invençãocompreendem pelo menos 0,005%, com preferência pelo menos 0,01%, par-ticular e preferencialmente pelo menos 0,05% e especial e preferencialmentepelo menos 0,1 % de hialuronan.Preferencialmente, composições de acordo com a invençãocompreendem no máximo 5%, com preferência no máximo 2%, particular epreferencialmente, no máximo 1% e especial e preferencialmente pelo me-nos 0,5% de hialuronan.Preferably compositions according to the invention comprise at least 0.005%, preferably at least 0.01%, particularly preferably at least 0.05% and especially preferably at least 0.1% hyaluronan. Preferably compositions according to the invention. with the invention comprise at most 5%, preferably at most 2%, particularly preferably at most 1% and especially at least 0.5% hyaluronan.

Como já mencionado acima, é possível utilizar células vegetaisgeneticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção, material de propagação deacordo com a invenção, partes da planta passíveis de colheita de acordocom a invenção, partes da planta processáveis de acordo com a invenção,partes da planta consumíveis de acordo com a invenção ou plantas obtení-veis por um processo de acordo com a invenção para preparar gêneros ali-mentícios ou rações para animais. Contudo, uso como matérias-primas deaplicações industriais é também possível, sem hialuronan que tem de serisolado. Desse modo, por exemplo, plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção ou partes de plantas geneticamente modificadas deacordo com a invenção podem ser aplicadas a áreas sob cultivo agrícolapara obter aumento de água na ligação do solo. Além disso, plantas geneti-camente modificadas de acordo com a invenção ou células vegetais geneti-camente modificadas de acordo com a invenção podem ser usadas parapreparar agentes de secagem (por exemplo, para uso quando artigos sensí-veis à umidade) ou como absorvedores de líquidos (por exemplo, em fraldasou para absorção de líquidos aquosos derramados). Para tais aplicações, épossível usar plantas inteiras geneticamente modificadas de acordo com ainvenção, partes de plantas geneticamente modificadas de acordo com ainvenção ou plantas fragmentadas (por exemplo:/ moídas) plantas genetica-mente modificadas de acordo com a invenção ou partes da planta de acordocom a invenção, conforme exigidas. Adequadas para aplicações em queplantas moídas ou partes da planta são usadas são em particular, partes daplanta contendo hialuronan, mas apenas uma baixa proporção de água. Es-sas são preferencialmente grãos de plantas cereais (milho, arroz, trigo, cen-teio, aveia, cevada, sago ou sorgo). Uma vez que células vegetais geneti-camente modificadas de acordo com a invenção e plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção apresentem um maior teor de hialu-ronan do que plantas transgênicas descritas na literatura, comparadas a es-sas, menos material tem de ser usado para aplicações industriais quando sefaz uso de células vegetais geneticamente modificadas de acordo com a in-venção ou plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção.As already mentioned above, genetically modified plant cells according to the invention, genetically modified plants according to the invention, propagating material according to the invention, harvestable plant parts according to the invention, plant parts may be used. processable according to the invention, consumable plant parts according to the invention or plants obtainable by a process according to the invention for preparing foodstuffs or animal feed. However, use as raw materials for industrial applications is also possible, without hyaluronan having to be isolated. Thus, for example, genetically modified plants according to the invention or parts of genetically modified plants according to the invention may be applied to areas under agricultural cultivation to achieve increased soil binding water. In addition, genetically modified plants according to the invention or genetically modified plant cells according to the invention may be used to prepare drying agents (e.g. for use when moisture sensitive articles) or as water absorbers. liquids (eg in diapers or for absorption of spilled aqueous liquids). For such applications, genetically modified whole plants according to the invention, parts of genetically modified plants according to the invention or fragmented plants (e.g., ground) genetically modified plants according to the invention or parts of the plant according to the invention may be used. the invention as required. Suitable for applications where ground plants or plant parts are used are in particular parts of the plant containing hyaluronan, but only a low proportion of water. These are preferably cereal plant grains (maize, rice, wheat, cenote, oats, barley, sago or sorghum). Since genetically modified plant cells according to the invention and genetically modified plants according to the invention have a higher hyaluronan content than transgenic plants described in the literature compared to these, less material has to be used. for industrial applications when genetically modified plant cells according to the invention or genetically modified plants according to the invention are used.

A presente invenção também proporciona processos para pre-paração de uma composição de acordo com a invenção, em que se usam.células vegetais geneticamente modificadas de acordo com a invenção,plantas geneticamente modificadas de acordo com a invenção, material depropagação de acordo com a invenção, partes da planta passíveis de colhei-ta de acordo com a invenção, partes da planta processáveis de acordo coma invenção, partes da planta consumíveis de acordo com a invenção ouplantas obteníveis por um processo de acordo com a invenção para prepa-ração de uma planta que sintetiza hialuronan. Os processos de preparaçãode uma composição de acordo com a invenção são preferencialmente pro-cessos para preparação de gêneros alimentícios ou rações para animais,processos para preparação de um produto farmacêutico ou processos parapreparação de um produto cosmético.The present invention also provides processes for preparing a composition according to the invention using genetically modified plant cells according to the invention, genetically modified plants according to the invention, propagation material according to the invention harvestable plant parts according to the invention, processable plant parts according to the invention, consumable plant parts according to the invention or plants obtainable by a process according to the invention for preparing a plant which synthesizes hyaluronan. Processes for preparing a composition according to the invention are preferably processes for preparing food or animal feed, processes for preparing a pharmaceutical product or processes for preparing a cosmetic product.

Processos para preparação de gêneros alimentícios ou raçõespara animais são conhecidos daquele versados no estado da técnica. Pro-cessos para usar plantas geneticamente modificadas de acordo com a in-venção ou partes da planta de acordo com a invenção em áreas industriaissão também conhecidas daquele versado na técnica e incluem, entre outros,cominuiçáo ou moagem de plantas geneticamente modificadas de acordocom a invenção ou partes da, planta de acordo com a invenção; contudo,eles não são exclusivamente limitados a esta. Algumas das vantagens resul-tantes de utilização de assuntos de acordo com a invenção para preparaçãode gêneros alimentícios/rações para animais ou para uso em áreas industri-ais foram já descritas acima.Processes for preparing food or animal feed are well known to those skilled in the art. Processes for using genetically modified plants according to the invention or parts of the plant according to the invention in industrial areas are also known to those skilled in the art and include, but are not limited to, comminution or milling of genetically modified plants according to the invention. or parts of the plant according to the invention; however, they are not exclusively limited to this. Some of the advantages of using subject matter according to the invention for the preparation of food / feed or for use in industrial areas have already been described above.

Um processo de acordo com a invenção para preparação deuma composição é particular e preferencialmente um processo para prepa-ração de uma composição que compreende hialuronan.Composições obteníveis por um processo para preparação deuma composição de acordo com a invenção são também proporcionadaspela presente invenção.A process according to the invention for preparing a composition is particularly preferably a process for preparing a composition comprising hyaluronan. Compositions obtainable by a process for preparing a composition according to the invention are also provided by the present invention.

A presente invenção também se refere ao uso de células vege-tais geneticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas geneti-camente modificadas de acordo com a invenção, material de propagação deacordo com a invenção, partes da planta passíveis .de colheita de acordocom a invenção, partes da planta processáveis de acordo com a invenção,partes da planta consumíveis de acordo com a invenção ou plantas obtení-veis por um processo de acordo com a invenção para preparação de umaplanta que sintetiza hialuronan para preparação de uma composição de a-cordo com a invenção. Preferência é dada ao uso de células vegetais gene-ticamente modificadas de acordo com a invenção, plantas geneticamentemodificadas de acordo com a invenção, material de propagação de acordocom a invenção, partes da planta passíveis de colheita de acordo com a in-venção, partes da planta processáveis de acordo com a invenção, partes daplanta consumíveis de acordo com a invenção ou de plantas obteníveis porum processo de acordo com a invenção para preparação de uma planta quesintetiza hialuronan para preparação de gêneros alimentícios ou rações paraanimais, para preparação de um produto farmacêutico ou para preparaçãode um produto cosmético.Descrição das SeqüênciasThe present invention also relates to the use of genetically modified plant cells according to the invention, genetically modified plants according to the invention, propagating material according to the invention, harvestable plant parts according to the invention. invention, processable plant parts according to the invention, consumable plant parts according to the invention or plants obtainable by a process according to the invention for the preparation of a hyaluronan synthesizing plant for the preparation of a color composition with the invention. Preference is given to the use of genetically modified plant cells according to the invention, genetically modified plants according to the invention, propagation material according to the invention, plant parts harvestable according to the invention, parts of the processable plants according to the invention, consumable plant parts according to the invention or plants obtainable by a process according to the invention for preparing a hyaluronan synthesizing plant for preparing food or para-animal feed, for preparing a pharmaceutical or for the preparation of a cosmetic product.

SEQ ID NO. 1: Seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma hialuronanSEQ ID NO. 1: Sequence of nucleic acids encoding a hyaluronan

sintase de vírus Chlorella 1 de Paramecium bursaria.SEQ ID NO. 2; Seqüência de aminoácidos de um hialuronan sintase do vírusChlorella 1 Paramecium bursaria. A seqüência de aminoáci-dos mostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 1.SEQ ID NO 3: Seqüência de ácido nucléico sintético que codifica um hialu-ronan sintase de vírus Chlorella 1 de Paramecium bursaria. Asíntese dos códons da seqüência mostrada foi realizada detal modo que seja adaptada ao uso de códons em célulasvegetais. A seqüência de ácido nucléico mostrada codificauma proteína que apresenta a seqüência de aminoácidomostrada sob SEQ ID NO 2.Chlorella 1 synthase from Paramecium bursaria.SEQ ID NO. 2; Amino acid sequence of a hyaluronan synthase of the Chlorella 1 Paramecium bursaria virus. The amino acid sequence shown may be derived from SEQ ID NO 1.SEQ ID NO 3: Synthetic nucleic acid sequence encoding a Paramecium bursaria Chlorella 1 virus hyaluronan synthase. The codon synthesis of the sequence shown was performed in detail to be adapted to the use of codons in vegetable cells. The nucleic acid sequence shown encodes a protein that has the amino acid sequence shown under SEQ ID NO 2.

SEQ ID NO 4: Seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína queapresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH de vírus ChlorellaSEQ ID NO 4: Nucleic acid sequence encoding a protein that has the activity of a Chlorella virus UDP-GIc-DH

1 Paramecium bursaria.1 Paramecium bursaria.

SEQ ID NO 5: Seqüência de aminoácidos de uma proteína que apresenta aatividade de uma UDP-GIc-DH de vírus Chlorella 1 Parame-cium bursaria. A seqüência de aminoácidos mostrada podeser derivada de SEQ ID NO 4.SEQ ID NO 5: Amino acid sequence of a protein that has the activity of a Chlorella 1 Parame-cium bursaria virus UDP-GIc-DH. The amino acid sequence shown may be derived from SEQ ID NO 4.

SEQ ID NO 6: Seqüência de ácido nucléico sintético que codifica uma prote-ína que apresenta a atividade de uma UDP-GIc-DH de vírusChIoreIIa 1 Paramecium bursaria. A síntese dos codons daseqüência mostrada foi realizada de tal modo que fosseadaptada ao uso de codons em células vegetais. A se-qüência de ácido nucléico mostrada codifica uma proteínaque apresenta a seqüência de aminoácidos mostrada sobSEQ ID NO 5.SEQ ID NO 6: Synthetic nucleic acid sequence encoding a protein that has the activity of a ChecoreIIa 1 Paramecium bursaria UDP-GIc-DH. The codon synthesis of the sequence shown was performed in such a way that it was adapted to the use of codons in plant cells. The nucleic acid sequence shown encodes a protein having the amino acid sequence shown under SEQ ID NO 5.

SEQ ID NO 7: .. Seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína queapresenta a atividade de uma GFAT-1 do camundongo.ID ID NO 8: Seqüência de aminoácidos de uma proteína que apresentaSEQ ID NO. 7: Nucleic acid sequence encoding a protein that has the activity of a mouse GFAT-1. ID ID NO 8: Amino acid sequence of a protein that has

a atividade de uma GFAT-1 do camundongo. A seqüência deaminoácidos mostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 7.the activity of a mouse GFAT-1. The amino acid sequence shown may be derived from SEQ ID NO 7.

SEQ ID NO 9: Seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína queapresenta a atividade de uma GFAT-2 do camundongo.SEQ ID NO 9: Nucleic acid sequence encoding a protein that has the activity of a mouse GFAT-2.

SEQ ID NO 10: ' Seqüência de aminoácidos de uma proteína que apresenta a λatividade de uma GFAT-2 do camundongo. A seqüência deaminoácidos mostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 9.SEQ ID NO 10: 'Amino acid sequence of a protein that has the λactivity of a mouse GFAT-2. The amino acid sequence shown may be derived from SEQ ID NO 9.

SEQ ID NO 11: Seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína queapresenta a atividade de uma GFAT de Escherichia coli.SEQ ID NO 11: Nucleic acid sequence encoding a protein that has the activity of an Escherichia coli GFAT.

SEQ ID NO 12: Seqüência de aminoácidos de uma proteína que apresenta aatividade de uma GFAT de Escherichia coli. A seqüência deaminoácidos mostrada pode ser derivada de SEQ ID NO 11.SEQ ID NO 13: Seqüência de ácido nucléico sintético que codifica uma prote-ína que apresenta a atividade de uma GFAT de Escherichiacoli. A síntese dos codons da seqüência mostrada foi realiza-da tal que fosse adaptada ao uso de codons em células ve-getais. A seqüência de ácido nucléico mostrada codifica umaproteína que apresenta a seqüência de aminoácidos mostra-da sob SEQ ID NO 12.SEQ ID NO 12: Amino acid sequence of a protein displaying the activity of an Escherichia coli GFAT. The amino acid sequence shown may be derived from SEQ ID NO 11. SEQ ID NO 13: Synthetic nucleic acid sequence encoding a protein that exhibits the activity of an Escherichiacoli GFAT. The codon synthesis of the sequence shown was performed in such a way that it was adapted to the use of codons in plant cells. The nucleic acid sequence shown encodes a protein that has the amino acid sequence shown under SEQ ID NO 12.

SEQ ID NO 14: Oligonucleotídeo sintético usado como primer no Exemplo 1.SEQ ID NO 14: Synthetic oligonucleotide used as primer in Example 1.

SEQ ID NO 15: Oligonucleotídeo sintético usado como primer no Exemplo 1.SEQ ID NO 15: Synthetic oligonucleotide used as primer in Example 1.

Descrição das FigurasDescription of the Figures

Figura 1: Mostra uma curva de calibração e a equação corres-pondente da linha de regressão usada para calcular o teor de hialuronan emtecido vegetal. A curva de calibração foi estabelecida com o auxílio do kit deteste comercial (kit de teste ácido hialurônico (HA) de Corgenix, inc., Colora-do, USA, Prod. No. 029-001) e as soluções padrões supridas com este.Figure 1: Shows a calibration curve and the corresponding regression line equation used to calculate the vegetable tissue hyaluronan content. The calibration curve was established with the aid of the commercial test kit (Corgenix Hyaluronic Acid (HA) Test Kit, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001) and the standard solutions supplied with it.

Toda literatura citada incluindo, mas sem se limitar a númerosde acesso de seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos são incorpora-dos na descrição por meio de referência.All literature cited including, but not limited to accession numbers of nucleic acid and amino acid sequences are incorporated in the description by reference.

Métodos GeraisGeneral Methods

Métodos que podem ser usados em relação à presente invençãosão descritos abaixo. Esses métodos são modalidades específicas; contudo,a presente invenção não se limita a esses métodos. Sabe-se aquele versadona técnica que a invenção pode ser realizada da mesma maneira por meiode modificação dos métodos descritos e/ou por substituição de métodos in-dividuais ou partes de métodos por métodos alternativos ou.partes alternati-vas de métodos.Methods that may be used in connection with the present invention are described below. These methods are specific modalities; however, the present invention is not limited to such methods. It is well known in the art that the invention may be carried out in the same manner by modifying the methods described and / or by substituting individual methods or parts of methods for alternative methods or alternative parts of methods.

1. Transformação de plantas de batata1. Potato Plant Transformation

Plantas de batata foram transformadas com o auxílio de Agrobacte-rium, conforme descrito in Rocha-Sosa e outros (EMBO J. 8, (1989), 23-29).Potato plants were transformed with the aid of Agrobacterium as described in Rocha-Sosa et al. (EMBO J. 8, (1989), 23-29).

2. Isolamento de hialuronan a partir de tecido vegetal2. Isolation of hyaluronan from plant tissue

Para detectar a presença de hialuronan e para determinar o teorde hialuronan em tecido vegetal, material planta foi processado como segue:200 μl de água (desmineralizada, condutividade = 18 M Ω) foram adiciona-dos a cerca de 0,3 g de material tubérculo, e a mistura foi cominutada emum moinho de esferas oscilantes de laboratório (MM200, de Retsch, Alema-nha) (30 segundos sob 30 Hz). Um adicional de 800 μΙ de água (desminera-lizada, condutividade = 18 ΜΩ) foi em seguida adicionada, e a mistura foimisturada bem (usando, por exemplo, um misturador Vortex). Detritos celula-res e componentes insòlúveis foram separados do sobrenadante por meiode centrifugação sob 16 000 xg por 5 minutos.To detect the presence of hyaluronan and to determine the hyaluronan content in plant tissue, plant material was processed as follows: 200 μl of water (demineralized, conductivity = 18 M Ω) was added to about 0.3 g of tuber material. , and the mixture was comminuted in a laboratory oscillating ball mill (MM200, from Retsch, Germany) (30 seconds under 30 Hz). An additional 800 μΙ of water (demineralised, conductivity = 18 ΜΩ) was then added, and the mixture mixed well (using, for example, a Vortex mixer). Cell debris and insoluble components were separated from the supernatant by centrifugation under 16,000 xg for 5 minutes.

3. Purificação de hialuronan3. Hyaluronan Purification

Aproximadamente 100 gramas de tubérculos foram descasca-dos, cortados em pedaços de um tamanho de aproximadamente 1 cm3 e,após adição de 100 ml de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ),cominutados em misturador Warring sob velocidade máxima por aproxima-damente 30 segundos. Os detritos celulares foram em seguida removidosusando uma peneira de chá. Os detritos celulares que tinham sido removi-dos foram ressuspensos em 300 ml de água (desmineralizada, condutivida-de = 18 ΜΩ) e novamente removidos usando uma peneira de chá. As duassuspensões obtidas (100 ml + 300 ml) foram combinadas e centrifugadas em13 000 xg por 15 minutos. NaCI foi adicionado ao sobrenadante de centrifu-gação obtido até que uma concentração final de 1 % fosse atingida. Após oNaCI ter penetrado na solução, precipitação foi realizada por adição de duasvezes o volume de etanol seguido por mistura completa e incubação a -20°Cda noite para o dia. A mistura foi em seguida centrifugada a 13 000 xg por 15minutos. O precipitado sedimentado obtido após essa centrifugação foi dis-solvido em 100 ml de tampão (50 mM de JrisHCI, pH 8, 1 mM de CaCI2) e Kproteinase foi em seguida adicionado até uma concentração final de 100μg/ml e a solução foi incubada a 42°C por 2 horas. Isso foi seguido por 10minutos de incubação a 95°C. Uma vez mais, NaCI foi adicionado a essasolução até uma concentração final de 1 % ter sido atingida. Após a soluçãode NaCl ter penetrado na solução, uma outra precipitação foi realizada pormeio de adição de duas vezes o volume de etanol, mistura completa e incu-bação a -20°C por aproximadamente 96 horas. Isso foi seguido por 15 minu-tos de centrifugação a 13 000 xg. O precipitado sedimentado obtido apósessa centrifugação foi dissolvido em 30 ml de água (desmineralizada, condu-tividade = 18 ΜΩ), e uma vez mais, NaCI foi adicionado até uma concentraçãofinal de 1%. Ao adicionar duas vezes o volume de etanol, mistura completa eincubação a -20°C da noite para o dia, uma outra precipitação foi realizada. Oprecipitado obtido após centrifugação subseqüente a 13 000 xg por 15 minutosfoi dissolvido em 20 ml de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ).Approximately 100 grams of tubers were peeled, cut into pieces of a size of approximately 1 cm3 and, after addition of 100 ml of water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ), comminuted in Warring mixer at full speed for approximately 30 seconds Cell debris was then removed using a tea sieve. Cell debris that had been removed was resuspended in 300 ml water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ) and removed again using a tea sieve. The obtained two suspensions (100 ml + 300 ml) were combined and centrifuged at 13000 xg for 15 minutes. NaCl was added to the centrifugation supernatant obtained until a final concentration of 1% was reached. After NaCl had penetrated the solution, precipitation was performed by adding twice the volume of ethanol followed by complete mixing and incubation at -20 ° C overnight. The mixture was then centrifuged at 13,000 xg for 15 minutes. The pelleted precipitate obtained after such centrifugation was dissolved in 100 ml buffer (50 mM JrisHCI, pH 8, 1 mM CaCl 2) and Kproteinase was then added to a final concentration of 100μg / ml and the solution was incubated at 42 ° C for 2 hours. This was followed by 10 minutes of incubation at 95 ° C. Once again, NaCl was added to this solution until a final concentration of 1% was reached. After the NaCl solution had entered the solution, further precipitation was performed by adding twice the volume of ethanol, complete mixing and incubation at -20 ° C for approximately 96 hours. This was followed by 15 minutes of centrifugation at 13,000 xg. The pelleted precipitate obtained after this centrifugation was dissolved in 30 ml of water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ), and once again NaCl was added to a final concentration of 1%. By adding twice the volume of ethanol, complete mixing and incubation at -20 ° C overnight, another precipitation was performed. The precipitate obtained after subsequent centrifugation at 13,000 xg for 15 minutes was dissolved in 20 ml of water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ).

Purificação adicional foi realizada por meio de filtração centrífu-ga. Para essa finalidade, em cada caso 5 ml do precipitado dissolvido foramaplicados a um filtro de membrana (CentriconAmicon, largura do poro 10 000NMWL, Prod. No. UCF8 010 96), e a amostra foi centrifugada a 2200 xg atésomente cerca de 3 ml da solução acima permanecer no filtro. Duas vezesmais, em cada caso 3 ml de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ)foram em seguida adicionados à solução acima da membrana e em cadacaso recentrifugada sob condições idênticas até, no final, apenas cerca de3 ml da solução acima permaneceu no filtro. As soluções ainda presentesacima da membrana após filtração centrífuga foram removidas, e a membra-na foi enxaguada repetidamente (três a cinco, vezes) com aproximadamente1,5 ml de água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ). Todas as solu-ções que estavam ainda presentes acima da membrana e as soluções obti-das de enxágüe foram combinadas, NaCI foi adicionado até uma concentra-ção final de 1%, após o NaCI ter entrado na solução, duas vezes o volume deetanol foi adicionado, a amostra foi misturada e um precipitado foi obtido pormeio de armazenagem a -20°C da noite para o dia. O precipitado obtido apóscentrifugação subseqüente a 13 000 xg por 15 minutos foi dissolvido em 4 mlde água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ) e em seguida seca porcongelação (24 horas sob uma pressão de 37 Pa (0,37 mbar), aparelho desecagem por congelação ChristAIpha 1-4 de Christ, Osterode, Alemanha).Further purification was performed by centrifugal filtration. For this purpose, in each case 5 ml of the dissolved precipitate was applied to a membrane filter (CentriconAmicon, pore width 10,000 NMWL, Prod. No. UCF8 010 96), and the sample was centrifuged at 2200 xg until about 3 ml of the membrane. solution above remain in the filter. Twice more, in each case 3 ml of water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ) was then added to the above membrane solution and in freshly centrifuged under identical conditions until only about 3 ml of the above solution remained in the filter at the end. Solutions still present above the membrane after centrifugal filtration were removed, and the membrane was rinsed repeatedly (three to five times) with approximately 1.5 ml of water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ). All solutions that were still present above the membrane and the obtained rinse solutions were combined, NaCl was added to a final concentration of 1%, after NaCl had entered the solution, twice the volume of ethanol was added. In addition, the sample was mixed and a precipitate was obtained by storage at -20 ° C overnight. The precipitate obtained after subsequent centrifugation at 13,000 xg for 15 minutes was dissolved in 4 ml of water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ) and then freeze-dried (24 hours under a pressure of 37 Pa (0.37 mbar). ChristAIpha 1-4 freezing of Christ, Osterode, Germany).

4. Detecção de hialuronan e determinação do teor de hialuronan4. Hyaluronan detection and determination of hyaluronan content

Hialuronan foi detectado usando um teste comercial (kit de testeácido hialurônico (HA) de Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001)de acordo com as instruções do fabricante que são por meio deste incorpo-radas na descrição à guisa de referência. O princípio de teste baseia-se nabiodisponibilidade de uma proteína que se liga especificamente a hialuronan(HABP) e é realizado similarmente a um ELISA, no qual a reação de cor in-dica o teor de hialuronan na amostra examinada. Conseqüentemente, para adeterminação quantitativa de hialuronan, as amostras a ser medidas devemser empregadas em uma concentração tal que elas estejam dentro dos limi-tes estabelecidos (por exemplo: diluição da amostra em questão ou uso demenos água para extração de hialuronan de tecido vegetal, dependendoquer um limite fosse excedido ou quer não atingido).Hialuronan was detected using a commercial assay (Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001) Hyaluronic Acid (HA) Test Kit according to the manufacturer's instructions which are hereby incorporated in the description. by way of reference. The test principle is based on the availability of a protein that specifically binds to hyaluronan (HABP) and is performed similarly to an ELISA, in which the color reaction indicates the content of hyaluronan in the sample examined. Consequently, for quantitative determination of hyaluronan, the samples to be measured should be employed at a concentration such that they are within the established limits (eg dilution of the sample in question or use of water to extract hyaluronan from plant tissue, depending on whether a limit was exceeded or not reached).

Em bateladas paralelas, alíquotas das amostras a ser determi-nadas foram inicialmente submetidas à digestão de hialuronidase e em se-guida medidas usando o teste comercial (kit de teste ácido hialurônico (HA)de Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001). Digestão de hialuro-nidase foi realizada usando 400 μΙ de extrato de tubérculo de batata emtampão hialuronidase (0,1 M de tampão fosfato de potássio, pH 5,3; 150 mMde NaCI) por meio de adição de 5 pg (~3 unidades) de hialuronidase (hialu-ronidase tipo Ill de Sigma, Prod. No. H 2251) e incubação a 37°C por 30 mi-nutos.In parallel batches, aliquots of samples to be determined were initially subjected to hyaluronidase digestion and then measured using the commercial test (Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029-001). Hyaluro-nidase digestion was performed using 400 μΙ of potato tuber extract in hyaluronidase buffer (0.1 M potassium phosphate buffer, pH 5.3; 150 mM NaCl) by addition of 5 pg (~ 3 units) hyaluronidase (Sigma hyaluronidase type III, Prod. No. H 2251) and incubation at 37 ° C for 30 minutes.

Em cada caso em uma diluição de 1:10, todas as amostras fo-ram em seguida usadas para determinar o teor de hialuronan.In each case at a 1:10 dilution, all samples were then used to determine the hyaluronan content.

5. Cálculo de desvios padrões5. Calculation of standard deviations

Os desvios padrões estabelecidos foram calculados usando afórmula abaixo: raiz quadrada [nXx2-(£x)2/n(n-1)] em que χ é o valor de valo-res individuais medidos enéa soma de todos os valores medidos usadospara determinar o desvio padrão em questão.The established standard deviations were calculated using the formula below: square root [nXx2- (£ x) 2 / n (n-1)] where χ is the value of measured individual values and is the sum of all measured values used to determine the standard deviation in question.

6. Determinação da atividade de uma GFAT6. Determining the Activity of a GFAT

A atividade de uma proteína que apresenta a atividade de umaGFAT é determinada conforme descrita in Rachel e outros (1996, J. Bacteri-Ol 178 (8), 2320-2327).The activity of a protein that exhibits umaGFAT activity is determined as described in Rachel et al. (1996, J. Bacteri-Ol 178 (8), 2320-2327).

Para distinguir se uma proteína apresenta a atividade de umaGFAT-1 ou GFAT-2, usa-se o método descrito in Hu e outros (2004, J. Biol.Chem. 279 (29), 29988-29993).7. Determinação da atividade de uma UDP-GIc-DHTo distinguish whether a protein has the activity of umaGFAT-1 or GFAT-2, the method described in Hu et al. (2004, J. Biol. Chem. 279 (29), 29988-29993) .7 is used. Determination of activity of a UDP-GIc-DH

A atividade de uma proteína que apresenta a atividade de umaUDP-GIc-DH é determinada conforme descrita in Spicerl e outros (1998, J.Bacteríoí. 273 (39), 25117-25124).The activity of a protein that exhibits the activity of a UUDP-GIc-DH is determined as described in Spicerl et al. (1998, J. Bacterioi. 273 (39), 25117-25124).

8. Transformação de plantas de tomate8. Transformation of tomato plants

Plantas de tomate foram transformadas com o auxílio de Agro-bacterium usando o método descrito in US 5.565.347. .Tomato plants were transformed with the aid of Agro-bacterium using the method described in US 5,565,347. .

ExemplosExamples

1. Preparação do vetor de expressão em vegetal IR 47-71O plasmídeo pBinAR é um derivado do plasmídeo de vetor biná-rio pBin19 (Bevan, 1984, NucI Acids Res 12: 8.711-8.721) que foi construídocomo segue:1. Preparation of the IR 47-71 Plant Expression Vector Plasmid pBinAR is a derivative of the binary vector plasmid pBin19 (Bevan, 1984, NucI Acids Res 12: 8.711-8.721) which was constructed as follows:

um fragmento de comprimento 529 paus de base (pb) que com-preendia os nucleotídeos 6.909-7.437 do promotor 35S do vírus do mosaicoda couve-flor foi isolado como fragmento EcoR UKpn I do plasmídeo pDH51(Pietrzak e outros, 1986, Nucleie Aeids Res. 14, 5.858) e ligado entre os sí-tios de restrição EcoR I e Kpn I do poliligante de pUC18. Dessa maneira, oplasmídeo pUC18-35S foi formado. Usando as endonucleases de restriçãoHind Ill e Pvu II, um fragmento de comprimento 192 pb que incluía o sinal depoliadenilação (término 3') do gene para Oetopina Sintase (gene 3) do T-DNA do plasmídeo Ti pTiACH5 (Gielen e outros, 1984, EMBO Journal 3,835-846) (nucleotídeos 11 749-11 939) foi isolado do plasmídeo pAGV40(Herrera-Estrella e outros, 1983, Nature, 303, 209-213). Após adição de Ii-gantes Sph I ao sítio de restrição Pvu II, o fragmento foi ligado entre os sítiosde restrição Sph I e HindlW de pUC18-35S. Isso forneceu o plasmídeo,pA7.Aqui, todo o poliligante compreendendo o promotor 35S e o terminador Ocsfoi removido usando EcoR I e Hind Ille ligado ao vetor apropriadamente cli-vado pBin19. Isso forneceu o vetor de expressão em vegetal pBinAR(Hõfgen e Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230).a 529 base-length (bp) fragment that comprised nucleotides 6,909-7,437 of the cauliflower mosaic virus 35S promoter was isolated as the EcoR UKpn I fragment of plasmid pDH51 (Pietrzak et al., 1986, Nucleie Aeids Res 14, 5,858) and linked between the Eco R I and Kpn I restriction sites of the pUC18 polylinker. In this way, pUC18-35S oplasmid was formed. Using the restriction endonucleases Hind III and Pvu II, a 192 bp length fragment that included the signaling-degeneration signal (3 'terminus) of the gene for Oetopine Synthase (gene 3) from the Ti pTiACH5 T-DNA plasmid (Gielen et al, 1984, EMBO Journal 3,835-846) (nucleotides 11,749-11,939) was isolated from plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nature, 303, 209-213). After addition of Sph I ligands to the Pvu II restriction site, the fragment was ligated between the pUC18-35S Sph I and HindIII restriction sites. This provided the plasmid, pA7. Here, all polylinker comprising the 35S promoter and Ocs terminator was removed using EcoR I and Hind Ille linked to the appropriately cleaved vector pBin19. This provided the pBinAR vegetable expression vector (Höfgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230).

O promotor do gene B33 para patatina de Solanum tuberosum(Rocha-Sosa e outros, 1989, EMBO J. 8, 23-29) foi, como fragmento Dra I(nucleotídeos -1.512 - +14), ligado ao vetor clivado em Sst I pUC19 cujasextremidades haviam sido embotadas usando T4-DNA polimerase. Isso for-neceu o plasmídeo pUC19-B33. A partir desse plasmídeo, o promotor B33foi removido usando EeoR I e Sma I e ligado ao vetor apropriadamente res-tringido pBinAR. Isso forneceu o vetor de expressão em vegetal pBinB33.The Solanum tuberosum patatin B33 gene promoter (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29) was, as a Dra I fragment (nucleotides -1.512 - +14), ligated to the Sst I cleaved vector. pUC19 whose ends had been blunted using T4-DNA polymerase. This provided plasmid pUC19-B33. From this plasmid, the B33 promoter was removed using EeoR I and Sma I and ligated to the appropriately restricted pBinAR vector. This provided the pBinB33 vegetable expression vector.

Para facilitar etapas adicionais de clonagem, o MCS (Sítio deClonagem Múltipla) foi estendido. Com esse fim, dois oligonucleotídeoscomplementares foram sintetizados, aquecidos a 95°C por 5 minutos, lenta-mente resfriados a temperatura ambiente para permitir boa fixação (recozi-mento) e clonados nos sítios de restrição Sal I e Kpn I de pBinB33. Os oligo-nucleotídeos usados para esse fim tinham a seguinte seqüência:5'-TCg ACA ggC CTg gAT CCT TAA TTA AAC TAg TCT CgA ggA gCT Cgg TAC-3'5'-CgA gCT CCT CgA gAC TAg TTT AAT TAA ggA TCC Agg CCT g-3'To facilitate additional cloning steps, the Multiple Cloning Site (MCS) has been extended. To this end, two complementary oligonucleotides were synthesized, heated at 95 ° C for 5 minutes, slowly cooled to room temperature to allow good fixation (annealing) and cloned into pBinB33 Sal I and Kpn I restriction sites. The oligonucleotides used for this purpose were as follows: 5'-TCg ACA ggC CTg gAT CCT TAA TTA AAC TAg TCT CgA ggA gCT Cgg TAC-3'5'-CgA gCT CCT CgA gAC TAg TTT AAT TAA ggA TCC Agg CCT g-3 '

O plasmídeo obtido foi denominado IR 47-71.The plasmid obtained was named IR 47-71.

2. Preparação do vetor de expressão em vegetal pBinARHyg2. Preparation of pBinARHyg Vegetable Expression Vector

O fragmento compreendendo o promotor 35S, o terminador Ocse o Sítio de Clonagem Múltipla foi removido de pA7 usando as endonuclea-ses de restrição EcoR I e Hind Ill e clonado no vetor pBIBHyg (Becker, 1990,Nucleic Acids Res. 18, 203) que tinha sido cortado usando as mesmas en-donucleases de restrição. O plasmídeo obtido foi denominado pBinARHyg.The fragment comprising the 35S promoter, the Ocse Multiple Cloning Site terminator was removed from pA7 using the EcoR I and Hind III restriction endonucleases and cloned into the pBIBHyg vector (Becker, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 203). had been cut using the same restriction en-donucleases. The plasmid obtained was named pBinARHyg.

3. Preparação do vetor de clonagem IC 317-2043. Preparation of IC 317-204 cloning vector

Fragmentos de ácidos nucléicos compreendendo o terminadorOCS foram isolados do plasmídeo IR 47-71 usando as endonucleases derestrição Xho I e Hind Ill e clonados no vetor pBlueScript KS (de Stratagene,Prod. No. 212207) que tinha sido cortado com as mesmas endonucleases derestrição. O plasmídeo obtido foi denominado IC 306-204.Nucleic acid fragments comprising the OCS terminator were isolated from plasmid IR 47-71 using the Xho I and Hind III restriction endonucleases and cloned into the pBlueScript KS vector (from Stratagene, Prod. No. 212207) which had been cut with the same restriction endonucleases. The plasmid obtained was named IC 306-204.

Fragmentos de ácidos nucléicos compreendendo o promotorB33 foram isolados do plasmídeo IR 47-71 usando as endonucleases derestrição Bam Hl e Eco Rl e clonados no vetor pBlueScript KS {de Stratage-ne, Prod. No. 212 207) que tinha sido cortado com as mesmas endonuclea-ses de restrição. O plasmídeo obtido foi denominado IC 314-204.Nucleic acid fragments comprising the B33 promoter were isolated from plasmid IR 47-71 using the restriction endonucleases Bam H1 and Eco R1 and cloned into the pBlueScript KS vector (from Stratage-ne, Prod. No. 212,207) which had been cut with the same restriction endonucleases. The plasmid obtained was named IC 314-204.

O terminador OCS foi isolado de IC 306-204 usando a endonu-clease de restrição Bam Hl e clonado no plasmídeo IC 314-204 que tinhasido cortado com a mesma endonuclease de restrição. O plasmídeo obtidofoi denominado IC 317-204.The OCS terminator was isolated from IC 306-204 using the Bam H1 restriction endonuclease and cloned into plasmid IC 314-204 which had been cut with the same restriction endonuclease. The obtained plasmid was called IC 317-204.

4. Síntese de moléculas de ácidos nucléicos4. Synthesis of nucleic acid molecules

a) Síntese de moléculas de ácidos nucléicos que codificam umahialuronan sintase de vírus 1 Chlorella de Paramecium bursaria(a) Synthesis of nucleic acid molecules encoding a virus hyaluronan synthase 1 Chlorella de Paramecium bursaria

A seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma hialuronansintase (HAS) de vírus 1 Chlorella de Paramecium bursaria foi sintetizada porMedigenomix GmbH (Munique, Alemanha) e clonada no vetor pCR2.1 de Invi-trogen (Prod. No. K2000-01). O plasmídeo obtido foi denominado IC 323-215. Aseqüência sintética de ácidos nucléicos que codifica a proteína HAS de vírus 1Chlorella de Paramecium bursaria é mostrada sob SEQ ID NO 3. A seqüên-cia de ácidos nucléicos correspondente originalmente isolada do vírus 1 C-hlorella de Parameeium bursaria é mostrada sob SEQ ID NO 1.The nucleic acid sequence encoding a Chlorella Paramecium bursaria virus 1 hyaluronansynthase (HAS) was synthesized by Medigenomix GmbH (Munich, Germany) and cloned into Invi-trogen vector pCR2.1 (Prod. No. K2000-01). The plasmid obtained was named IC 323-215. Synthetic sequence of nucleic acids encoding Paramecium bursaria 1Chlorella virus HAS protein is shown under SEQ ID NO 3. The corresponding nucleic acid sequence originally isolated from Parameeium bursaria 1 C-hlorella virus is shown under SEQ ID NO 1. .

b) Síntese de moléculas de ácidos nucléicos que codificam umaproteína que apresenta a atividade de um UDP-GIc-DH de vírus 1 Chlorellade Paramecium bursariab) Synthesis of nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits the activity of a virus UDP-GIc-DH 1 Chlorellade Paramecium bursaria

A seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína queapresenta a atividade de um UDP-GIc-DH de vírus 1 Chlorella de Parameei-um bursaria foi sintetizada por Enteleehon GmbH e clonada no vetor p-CR4Topo de Invitrogen (Prod. No. K4510-20). O plasmídeo obtido foi deno-minado IC 339-222. A seqüência sintética de ácidos nucléicos que codifica aproteína UDP-GIc-DH do vírus 1 Chlorella de Parameeium bursaria é mos-trada sob SEQ ID NO 6. A seqüência de ácidos nucléicos correspondenteoriginalmente isolada do vírus 1 Chlorella de Parameeium bursaria é mostra-da sob SEQ ID NO 4.The sequence of nucleic acids encoding a protein that shows the activity of a Chlorella de Parameei-a bursaria 1 UDP-GIc-DH was synthesized by Enteleehon GmbH and cloned into the p-CR4Type Invitrogen vector (Prod. No. K4510-20 ). The obtained plasmid was called IC 339-222. The synthetic nucleic acid sequence encoding the UDP-GIc-DH protein of Parameeium bursaria 1 Chlorella virus is shown under SEQ ID NO 6. The correspondingly isolated nucleic acid sequence of Parameeium bursaria 1 Chlorella virus is shown under SEQ ID NO. 4.

c) Síntese de moléculas de ácidos nucléicos que codificam umaproteína que apresenta a atividade de um GFAT de Eseheriehia eolic) Synthesis of nucleic acid molecules encoding a protein that exhibits Eseheriehia eoli GFAT activity

A seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína queapresenta a atividade de um GFAT de Eseheriehia eoli foi sintetizada porEnteleehon GmbH e clonada no vetor pCR4Topo de Invitrogen (Prod.No. K4510-20). O plasmídeo obtido foi denominado IC 373-256. A seqüênciasintética de ácidos nucléicos que codifica a proteína que apresenta a ativi-dade de um GFAT de Escherichia colié mostrada sob SEQ ID NO 13. A se-qüência de ácidos nucléicos correspondente originalmente isolada de Esche-richia colié mostrada sob SEQ ID NO 11.The nucleic acid sequence encoding a protein that exhibits the activity of an Eseheriehia eoli GFAT has been synthesized by Enteleehon GmbH and cloned into the pCR4Tope Invitrogen vector (Prod.No. K4510-20). The plasmid obtained was named IC 373-256. The nucleic acid sequence encoding the protein displaying the activity of an Escherichia coli GFAT is shown under SEQ ID NO 13. The corresponding nucleic acid sequence originally isolated from Esche-richia coli shown under SEQ ID NO 11.

5. Origem de moléculas adicionais de ácidos nucléicos5. Origin of additional nucleic acid molecules

a) Moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteínaque apresenta a atividade de um GFAT-1 do camundongoa) Nucleic acid molecules encoding a protein exhibit the activity of a mouse GFAT-1

A seqüência de ácidos nucléicos que codifica uma proteína queapresenta a atividade de um GFAT-1 foi adquirida de BioCat GmbH, Heidelberg(Art. No. MMM1013-65346, clone MGC:58262 de cDNA, IMAGE:6742987).Esse é um clone produzido por I.M.A.G.E. Konsortium (http://image.llnl.gov)e distribuído por BioCat GmbH. Aqui, o cDNA que codifica uma proteína queapresenta a atividade de um GFAT-1 foi clonado no vetor pCMV Sport 6 deInvitrogen. O plasmídeo obtido foi denominado IC 365-256. A seqüência deácidos nucléicos, inserida em IC 365-256, que codifica uma proteína queapresenta a atividade de um GFAT-1 de Mus musculus apresenta, em com-paração com a seqüência de ácidos nucléicos mostrada sob SEQ ID NO 7,uma troca de bases de T em C na posição 1.090 e uma troca de bases de Gem A na posição 2.027. Essas trocas.de bases não resultam em trocas deaminoácidos das seqüências de aminoácidos codificadas pelas duas molé-culas de ácidos nucléicos diferentes.The nucleic acid sequence encoding a protein that exhibits the activity of a GFAT-1 was purchased from BioCat GmbH, Heidelberg (Art. No. MMM1013-65346, cDNA clone MGC: 58262, IMAGE: 6742987). This is a clone produced by IMAGE Konsortium (http://image.llnl.gov) and distributed by BioCat GmbH. Here, the cDNA encoding a protein that exhibits the activity of a GFAT-1 has been cloned into the pCMV Sport 6 vector from Invitrogen. The plasmid obtained was named IC 365-256. The nucleic acid sequence, inserted in IC 365-256, which encodes a protein that shows the activity of a Mus musculus GFAT-1 presents, in comparison with the nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO 7, a base exchange. from T to C at position 1,090 and a base change from Gem A to position 2,027 These base exchanges do not result in amino acid exchanges of the amino acid sequences encoded by the two different nucleic acid molecules.

A seqüência de ácidos nucléicos que codifica a proteína queapresenta a atividade de um GFAT-1 do camundongo é mostrada em SEQID NO 8.The sequence of nucleic acids encoding the protein that shows the activity of a mouse GFAT-1 is shown in SEQID NO 8.

Para facilitar etapas de clonagem subseqüentes, a seqüênciaque codifica uma proteína que apresenta a atividade de um GFAT-1 foi iso-lada usando as endonucleases de restrição Xho I e Eco RV de IC 365-256 eclonada no plasmídeo pME9 (vetor pBlueSkript de Stratagene, Prod. No. 212207) que apresenta um sítio de clonagem múltipla modificado que adicio-nalmente apresenta um sítio de restrição Pac I nas extremidades, plasmídeoeste que tinha sido cortado com as mesmas endonucleases de restrição. Oplasmídeo obtido foi denominado IC 367-256.To facilitate subsequent cloning steps, the sequence encoding a protein displaying GFAT-1 activity was isolated using the Xho I and Eco RV restriction endonucleases of IC 365-256 cloned into plasmid pME9 (Stratagene pBlueSkript vector, Prod. No. 212207) which has a modified multiple cloning site which additionally has a Pac I restriction site at the ends, which plasmid had been cut with the same restriction endonucleases. The obtained plasmid was named IC 367-256.

b) Moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteínaque apresenta a atividade de um GFAT-2 do camundongob) Nucleic acid molecules encoding a protein exhibit the activity of a mouse GFAT-2

Moléculas de ácidos nucléicos que codificam uma proteína que a-presenta a atividade de um GFAT-2 do camundongo foram adquiridas de Invitro-gen (Clone ID 4167189, clone MGC:18324 de cDNA, IMAGE:4167189). Esse éum clone que é produzido por I.M.A.G.E. Konsortium (http://image.llnl.gov) edistribuído por Invitrogen. Aqui, o cDNA que codifica uma proteína que apre-senta a atividade de um GFAT-2 é clonado no vetor pCMV Sport 6 de Invi-trogen. O plasmídeo foi denominado IC 369-256. A seqüência de ácidos nu-cléicos que codifica a proteína que apresenta a atividade de um GFAT-2 deMus musculus é mostrada sob SEQ ID NO 9.Nucleic acid molecules encoding a protein that exhibit the activity of a mouse GFAT-2 were purchased from Invitro-gen (Clone ID 4167189, cDNA clone MGC: 18324, IMAGE: 4167189). This is a clone that is produced by I.M.A.G.E. Konsortium (http://image.llnl.gov) and distributed by Invitrogen. Here, cDNA encoding a protein that exhibits the activity of a GFAT-2 is cloned into Invi-trogen's pCMV Sport 6 vector. The plasmid was named IC 369-256. The sequence of nu-clicic acids encoding the protein displaying the activity of a GFAT-2 deMus musculus is shown under SEQ ID NO 9.

6. Preparação do vetor de expressão em vegetal IC 341-222 quecompreende uma seqüência de codificação de ácidos nucléicos para umahialuronan sintase de vírus 1 Chlorella de Paramecium bursaria.6. Preparation of Plant Expression Vector IC 341-222 which comprises a nucleic acid coding sequence for a Chlorella de Paramecium bursaria 1 hyaluronan synthase.

Usando digestão por restrição com BamH I e Xho I, moléculasde ácidos nucléicos que compreendem a seqüência de codificação de hialu-ronan sintase foram isoladas do plasmídeo IC 323-215 e clonadas nos sítiosde restrição BamH I e Xho I do plasmídeo IR 47-71. O vetor de expressãoem vegetal obtido foi. denominado IC 341 -222.Using restriction digestion with BamH I and Xho I, nucleic acid molecules comprising the hyaluronon synthase coding sequence were isolated from plasmid IC 323-215 and cloned into the BamH I and Xho I restriction sites of plasmid IR 47-71. The vegetable expression vector obtained was. called IC 341 -222.

7. Preparação dos vetores de expressão em vegetal IC 370-256e IC 376-256 que compreendem seqüências de codificação de ácidos nu-cléicos de uma proteína que apresenta a atividade de um GFAT-1 do ca-mundongo e de uma proteína que apresenta a atividade de um UDP-GIc-DHde vírus 1 Chlorella de Paramecium bursaria.7. Preparation of the plant-expression vectors IC 370-256 and IC 376-256 which comprise nucleic acid coding sequences of a protein that exhibits the activity of a mouse GFAT-1 and a protein that has the activity of a UDP-GIc-DH virus 1 Chlorella of Paramecium bursaria.

Usando digestão por restrição com BamH I e Kpn I, moléculasde ácidos nucléicos que compreendem a seqüência de codificação de umaproteína que apresenta a atividade de um UDP-GIc-DH de vírus 1 Chlorellade Paramecium bursaria foram isoladas do plasmídeo IC 339-222 e clona-das no plasmídeo pA7 que tinha sido cortado com as mesmas endonuclea-ses de restrição. O plasmídeo obtido foi denominado IC 342-222.Using restriction digestion with BamH I and Kpn I, nucleic acid molecules that comprise the coding sequence of a protein displaying the activity of a Chlorellade Paramecium bursaria virus 1 UDP-GIc-DH were isolated from plasmid IC 339-222 and clone- plasmid pA7 which had been cut with the same restriction endonucleases. The plasmid obtained was named IC 342-222.

Por meio de digestão por restrição com Xba I e Kpn I, moléculasde ácidos nucléicos que compreendem a seqüência de codificação de umaproteína que apresenta a atividade de um UDP-GIc-DH de vírus 1 Chlorellade Paramecium bursaria foram isoladas do plasmídeo IC 342-222 e clona-das no vetor de expressão pBinAR Hyg que tinha sido restriingido com Xba Ie Kpn I. O plasmídeo obtido foi denominado IC 349-222.By restriction digestion with Xba I and Kpn I, nucleic acid molecules comprising the coding sequence of a protein displaying the activity of a Chlorellade Paramecium bursaria virus 1 UDP-GIc-DH were isolated from plasmid IC 342-222 and cloned into the pBinAR Hyg expression vector which had been restricted with Xba Ie Kpn I. The obtained plasmid was named IC 349-222.

Na etapa seguinte, um fragmento de ácido nucléico que com-preende o promotor B33 e o terminador OCS, fragmento este que tinha sidoisolado de IC 317-204 por digestão por restrição usando Eco IR, foi clonadono sítio de restrição Eco IR de IC 349-222. Aqui, assegurou-se de que ospromotores (35S and B33) eram orientados cabeça a cabeça. O vetor obtidofoi denominado IC 354-222.In the next step, a nucleic acid fragment comprising the B33 promoter and OCS terminator, which fragment had been isolated from IC 317-204 by restriction digestion using Eco IR, was cloned into the IC 349- Eco IR restriction site. 222 Here, he ensured that the engines (35S and B33) were oriented head to head. The obtained vector was called IC 354-222.

Em uma etapa adicional de clonagem, um fragmento de ácidonucléico que compreende a seqüência de codificação da proteína que apresen-ta a atividade de um GFAT-1 do camundongo foi isolado por digestão por restri-ção com Xho I e Eco RV de IC 367-256 e clonado no plasmídeo IC 354-222, quetinha sido restringido com Xho I e Ec/136 II. O vetor de expressão em vege-tal obtido foi denominado IC 370-256.In an additional cloning step, a nucleic acid fragment comprising the protein coding sequence that exhibits the activity of a mouse GFAT-1 was isolated by restriction digestion with IC 367- Xho I and Eco RV. 256 and cloned into plasmid IC 354-222, which had been restricted with Xho I and Ec / 136 II. The expression vector obtained in vegetation was called IC 370-256.

Após uma análise de seqüência do plasmídeo IC 370-256, veri-ficou-se que a seqüência de codificação de ácidos nucléicos da proteína queapresenta a atividade de um GFAT-1 do camundongo apresentava modifica-ções em duas posições em comparação com a seqüência de ácidos nucléi-cos inserida no plasmídeo IC 365-256. Comparado com a seqüência de áci-dos nucléicos mostrada sob SEQ ID NO 7, a seqüência de ácidos nucléicosque codifica a proteína que apresenta a atividade de um GFAT-1 do camun-dongo contido no plasmídeo IC 370-256 apresenta uma troca de bases de Gem A na posição 1.160, uma troca de bases de T em C na posição 1.190,uma troca de bases de T em C na posição 1.245 e de G em/A na posição2027. Essa seqüência de ácidos nucléicos modificada codifica uma proteínaque, com relação à seqüência de aminoácidos mostrada sob SEQ ID NO 8,apresenta uma modificação dos aminoácidos na posição 304 de R em Q ena posição 366 de C em R.Following a sequence analysis of plasmid IC 370-256, it was found that the nucleic acid coding sequence of the protein which has the activity of a mouse GFAT-1 was modified in two positions compared to the sequence of nucleic acids inserted into plasmid IC 365-256. Compared to the nucleic acid sequence shown under SEQ ID NO 7, the nucleic acid sequence that encodes the protein that exhibits the activity of a mouse GFAT-1 contained in plasmid IC 370-256 exhibits a base exchange. Gem A at position 1.160, a base change from T to C at position 1.190, a base change from T to C at position 1.245 and from G to / A at position2027. This modified nucleic acid sequence encodes a protein with respect to the amino acid sequence shown under SEQ ID NO 8, has an amino acid modification at position 304 of R in Q and position 366 of C in R.

Para obter um vetor de expressão em vegetal que compreendea seqüência correta de ácidos nucléicos que codifica uma proteína que apre-senta a atividade de um GFAT-1 do camundongo, a seqüência de codificaçãoda proteína que apresenta a atividade de um GFAT-1 do camundongo foi no-vamente isolada de IC 365-256 por digestão por restrição com Xho I e EcoRV e clonada no plasmídeo IC 354-222, restriingida com Xho I e Ec/136 II. Ovetor de expressão em vegetal obtido foi denominado IC 376-256.To obtain a vegetable expression vector that comprises the correct nucleic acid sequence that encodes a protein that exhibits the activity of a mouse GFAT-1, the protein coding sequence that exhibits the activity of a mouse GFAT-1 was isolated from IC 365-256 by restriction digestion with Xho I and EcoRV and cloned into plasmid IC 354-222, restricted with Xho I and Ec / 136 II. Vegetable expression ovator obtained was named IC 376-256.

A seqüência de ácidos nucléicos que codifica a proteína queapresenta a atividade de um GFAT-1 do camundongo que é contido noplasmídeo IC 376-256 é idêntica à seqüência de codificação de uma proteí-na que apresenta a atividade de um GFAT-1 do camundongo inserida noplasmídeo 365-256. A seqüência de aminoácidos codificada por essa molé-cula de ácido nucléico é mostrada sob SEQ ID NO 8.The protein-encoding nucleic acid sequence that shows the activity of a mouse GFAT-1 contained in IC 376-256 is identical to the protein-encoding sequence of a mouse GFAT-1 inserted activity. noplasmid 365-256. The amino acid sequence encoded by this nucleic acid molecule is shown under SEQ ID NO 8.

8. Preparação do vetor de expressão em vegetal IC 372-256 quecompreende seqüências de codificação de ácidos nucléicos de uma proteínaque apresenta a atividade de um GFAT-2 do camundongo e uma proteínaque apresenta a atividade de um UDP-GIc-DH de vírus 1 Chlorella de Para-mecium bursaria.8. Preparation of Plant Expression Vector IC 372-256 comprising Nucleic Acid Coding Sequences for a Protein has the activity of a mouse GFAT-2 and a Protein for the activity of a Chlorella virus UDP-GIc-DH Para-mecium bursaria.

Um fragmento de ácido nucléico que compreende a seqüênciade codificação da proteína a atividade de um GFAT-2 do camundongo foiisolado de IC 369-256 por digestão por restrição com Xho I e Eco RV e clo-nado no plasmídeo IC 354-222, restringido com Xho I e Ec/136 II. O vetor deexpressão em vegetal obtido foi denominado IC 372-256.A nucleic acid fragment comprising the protein coding sequence the activity of a mouse GFAT-2 was isolated from IC 369-256 by restriction digestion with Xho I and Eco RV and cloned into plasmid IC 354-222, restricted with Xho I and Ec / 136 II. The vegetable expression vector obtained was called IC 372-256.

9. Preparação do vetor de expressão em vegetal IC 375-271 quecompreende seqüências de codificação de ácidos nucléicos de uma proteínaque apresenta a atividade de um GFAT de Escherichia coli e uma proteínaque apresenta a atividade de um UDP-GIc-DH de vírus 1 Chlorella de Para-mecium bursaria.9. Preparation of Vegetable Expression Vector IC 375-271 which comprises nucleic acid coding sequences for a protein has the activity of an Escherichia coli GFAT and a protein has the activity of a 1 Chlorella virus UDP-GIc-DH Para-mecium bursaria.

Um fragmento de ácido nucléico que compreende a seqüênciade codificação da proteína que apresenta a atividade de um GFAT de Es-cherichia coli foi isolado de IC 373-256 por digestão por restrição com Xho Ie Eco RV e clonado no plasmídeo IC 354-222, restringido por Xho I e Ec/136II. O vetor de expressão em vegetal obtido foi denominado IC 375-271.A nucleic acid fragment comprising the coding sequence of the protein displaying the activity of an Es-cherichia coli GFAT was isolated from IC 373-256 by restriction digestion with Xho Ie Eco RV and cloned into restricted plasmid IC 354-222. by Xho I and Ec / 136II. The vegetable expression vector obtained was called IC 375-271.

10. Transformação de plantas de batata com vetores de expres-são em vegetais que compreendem moléculas de ácidos nucléicos que codi-ficam uma hialuronan sintase.10. Transformation of potato plants with expression vectors into vegetables comprising nucleic acid molecules encoding a hyaluronan synthase.

Plantas de batata foram transformadas usando o vetor de ex-pressão em vegetal IC 341-222, que compreende uma seqüência de codifi-cação de ácidos nucléicos de uma hialuronan sintase de vírus 1 Chlorella deParamecium bursaria sob o controle do promotor do gene B33 para patatinade Solanum tuberosum (Rocha-Sosa e outros., 1989, EMBO J. 8, 23-29)usando o método fornecido sob Métodos Gerais, item 1. As plantas de bata-ta transgênica obtidas, que foram transformadas com o plasmídeo IC 341-222, foram denominadas 365 ES.Potato plants were transformed using vegetable expression vector IC 341-222, which comprises a nucleic acid coding sequence of a Chlorella deParamecium bursaria 1 hyaluronan synthase under the control of the patatinade B33 gene promoter Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29) using the method provided under General Methods, item 1. The obtained transgenic potato plants, which were transformed with plasmid IC 341- 222, were named 365 ES.

11. Análise das plantas transgênicas transformadas com vetoresde expressão em vegetais que compreendem moléculas de ácidos nucléicosque codificam uma hialuronan sintase.11. Analysis of transgenic plants transformed with expression vectors in plants comprising nucleic acid molecules encoding a hyaluronan synthase.

a) Construção de uma curva de calibraçãoUma curva de calibração foi construída usando as soluções pa-drões fornecidas com o kit de teste comercial (kit de teste ácido hialurônico(HA) de Corgenix, Inc., Colorado, EUA, Prod. No. 029-001), de acordo comos métodos descritos pelo fabricante. Para determinar a extinção sob 1.600ng/ml de hialuronan, o dobro da quantidade, com base na quantidade depadrão fornecido indicado pelo fabricante, compreendendo 800 ng/ml de hia-luronan foi usada. Em cada caso, três séries de medições independentesforam realizadas e a média correspondente determinada. Isso forneceu aseguinte curva de calibração:a) Constructing a calibration curve A calibration curve was constructed using the standard solutions provided with the commercial test kit (Hygenic Acid Test Kit (HA) from Corgenix, Inc., Colorado, USA, Prod. No. 029 -001) according to the methods described by the manufacturer. To determine extinction under 1,600ng / ml hyaluronan, twice the amount, based on the manufacturer's supplied standard amount, comprising 800 ng / ml hia-luronan was used. In each case, three independent measurement series were performed and the corresponding average determined. This provided the following calibration curve:

<table>table see original document page 90</column></row><table>Tabela 1: Valores para construir uma curva de calibração para a determina-ção quantitativa do teor de hialuronan em tecido vegetal. Com a ajuda desoftware (Microsoft Office Excel 2002, SP2), os valores medidos obtidos fo-ram entrados em um diagrama e a equação da função da linha de tendênciafoi determinada (vide Fig 1). E4SOnm refere-se à extinção em um comprimentode onda de 450 nm, d.p. é o desvio padrão da média calculada dos valoresindividuais. ι<table> table see original document page 90 </column> </row> <table> Table 1: Values for constructing a calibration curve for the quantitative determination of hyaluronan content in plant tissue. With the help of software (Microsoft Office Excel 2002, SP2), the measured values obtained were entered into a diagram and the trend line function equation was determined (see Fig 1). E4SOnm refers to extinction at a wavelength of 450 nm, d.p. is the standard deviation of the calculated mean of the individual values. ι

b) Análise de tubérculos de batata de linhagens 365 ESEm uma estufa, plantas individuais da linhagem 365 ES foramcultivadas em solo em potes de 6 cm. Em cada caso, cerca de 0,3 g de ma-terial de tubérculos de batata das plantas individuais foi processado de acor-do com o método descrito sob Métodos Gerais, item 2. Usando o métododescrito sob Métodos Gerais, item 4, a quantidade de hialuronan presentenos respectivos extratos vegetais foi determinada, com a ajuda da curva decalibração mostrada no Exemplo 10a) e figura 1. Aqui, o sobrenadante obti-do após centrifugação foi usado em uma diluição de 1:10 para determinar oteor de hialuronan. Os seguintes resultados foram obtidos para plantas sele-cionadas:b) Analysis of potato tubers from 365 ES strains In a greenhouse, individual plants of 365 ES strains were grown in soil in 6 cm pots. In each case, about 0.3 g of potato tuber material from the individual plants was processed according to the method described under General Methods, item 2. Using the method described under General Methods, item 4, the amount of hyaluronan present in the respective plant extracts was determined with the aid of the calibration curve shown in Example 10a) and Figure 1. Here, the supernatant obtained after centrifugation was used at a 1:10 dilution to determine the hyaluronan potent. The following results were obtained for selected plants:

Nome da planta Peso do mate- rial da planta empregado [g] Extinção E450 Quantidade de hialuro- nan [ng/ml] Hialuronan com base na massa fresca do material da planta [pq/ql365 ES 13 0,297 2,746 14.038 47365 ES 74 0,306 4,000 20.816 68Tipo selvagem 0,305 0,111 n.d. n.d.Plant name Weight of plant material employed [g] Extinction E450 Amount of hyalurane [ng / ml] Hialuronan based on fresh mass of plant material [pq / ql365 ES 13 0.297 2,746 14,038 47365 ES 74 0,306 4,000 20,816 68Wild type 0.305 0.111 ndnd

Tabela 2: "Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido por plantas transgênicas independentes selecionadas dalinhagem 365 ES. A coluna 1 refere-se à planta de que material de tubércu-los foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plantas não-transformadasque, entretanto, apresentam o genótipo usado como material de partida paraa transformação). A coluna 2 indica a quantidade de material de tubérculosda planta em questão usado para determinar o teor de hialuronan. A coluna3 contém a extinção medida de uma diluição 1:10 do respectivo extrato ve-getal. A coluna 4 foi calculada com a ajuda da equação de regressão linear(vide figura 1) levando em conta o fator de diluição, como segue: ((valor dacoluna 3 - 0,149)/0,00185) χ 10. A coluna 5 indica a quantidade de hialuro-nan com base na massa fresca usada e foi calculada como segue: (valor dacoluna 4/valor da coluna 2)/1.000. "n.d." significa não detectável.Table 2: "Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced by selected independent transgenic plants from 365 ES. Column 1 refers to the plant from which tubers material was harvested (here," wild type "refers to unprocessed plants which, however, have the genotype used as the starting material for the transformation). Column 2 indicates the amount of tuber material from the plant in question used to determine the content of hyaluronan. Column 3 contains the extinction. measured as a 1:10 dilution of the respective plant extract Column 4 was calculated using the linear regression equation (see Figure 1) taking into account the dilution factor as follows: ((value 3 - 0.149 ) / 0.00185) χ 10. Column 5 indicates the amount of hyaluro-nan based on the fresh mass used and was calculated as follows: (column value 4 / column 2 value) / 1,000. "Nd" means undetectable .

12. Transformação de plantas que sintetizam hialuronan comvetores de expressão em vegetais que compreendem seqüências de codifi-cação de ácidos nucléicos de uma proteína que apresenta a atividade de umGFAT e de uma proteína que apresenta a atividade de um UDP-GIc-DH.12. Transformation of plants that synthesize hyaluronan expression vectors in plants comprising nucleic acid coding sequences of a protein that exhibits the activity of aGFAT and a protein that exhibits the activity of a UDP-GIc-DH.

Plantas de batata das linhagens 365 ES 13 e 365 ES 74 foramem cada caso transformadas com os vetores de expressão em vegetais IC370-256, IC 376-256, IC 372-256 e IC 375-271 usando o método fornecidosob Métodos Gerais, item 1.Potato plants of lines 365 ES 13 and 365 ES 74 were each case transformed with the vegetable expression vectors IC370-256, IC 376-256, IC 372-256 and IC 375-271 using the method provided under General Methods, item 1. .

As plantas de batata transgênicas obtidas da linhagem 365 ES13 que foram transformadas com o plasmídeo IC 370-256 foram denomina-das 393 ES.The transgenic potato plants obtained from strain 365 ES13 that were transformed with plasmid IC 370-256 were named 393 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas da linhagem 365 ES74 que foram transformadas com o plasmídeo IC 370-256 foram denomina-das 394 ES.Transgenic potato plants obtained from strain 365 ES74 that were transformed with plasmid IC 370-256 were named 394 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas da linhagem 365 ES13 que foram transformadas com o plasmídeo IC 372-256 foram denomina-das 395 ES.The transgenic potato plants obtained from strain 365 ES13 that were transformed with plasmid IC 372-256 were named 395 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas da linhagem 365 ES74 que foram transformadas com o plasmídeo IC 372-256 foram denomina-das 396 ES.The transgenic potato plants obtained from strain 365 ES74 that were transformed with plasmid IC 372-256 were named 396 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas da linhagem 365 ES13 que foram transformadas com o plasmídeo IC 375-271 foram denomina-das 403 ES.Transgenic potato plants obtained from strain 365 ES13 that were transformed with plasmid IC 375-271 were named 403 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas da linhagem 365 ES74 que foram transformadas com o plasmídeo IC 375-271 foram denomina-das 404 ES.The transgenic potato plants obtained from strain 365 ES74 that were transformed with plasmid IC 375-271 were named 404 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas da linhagem 365 ES13 que foram transformadas com o plasmídeo IC 376-256 foram denomina-das 408 ES.The transgenic potato plants obtained from strain 365 ES13 that were transformed with plasmid IC 376-256 were named 408 ES.

As plantas de batata transgênicas obtidas da linhagem 365 ES74 que foram transformadas com o plasmídeo IC 376-256 foram denomina-das 409 ES.The transgenic potato plants obtained from strain 365 ES74 that were transformed with plasmid IC 376-256 were named 409 ES.

13. Análise de plantas de batata transgênicas que sintetizamhialuronan adicionalmente transformadas com vetores de expressão em ve-getais que compreendem seqüências de codificação de ácidos nucléicos deuma proteína que apresenta a atividade de um GFAT e de uma proteína queapresenta a atividade de um UDP-GIc-DH.13. Analysis of transgenic potato plants synthesizing hyaluronan further transformed with vector expression vectors comprising nucleic acid coding sequences of a protein that exhibits the activity of a GFAT and a protein that has the activity of a UDP-GIc- DH.

Em uma estufa, plantas individuais das linhagens 393 ES1 394ES, 395 ES, 396 ES, 403 ES, 404 ES e 409 ES foram cultivadas em solo empotes de 6 cm. Em cada caso, cerca de 0,3 g de material de tubérculos debatata ou folhas das plantas individuais foi processado de acordo com o mé-todo descrito sob Métodos Gerais, item 2. Usando o método descrito sobMétodos Gerais, item 4, a quantidade de hialuronan contido nos respectivosextratos vegetais foi determinada, com a ajuda de uma curva de calibraçãogerada de acordo com o Exemplo 10a), curva de calibração esta gerada no-va para cada série de medições individuais. Aqui, para determinar o teor dehialuronan, o sobrenadante obtido após centrifugação foi em cada caso dilu-ído com água (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ) tal que os valoresde extinção medidos das amostras individuais se situassem na faixa linearda curva de calibração. Os resultados para plantas que se originam de trans-formações originais com vários plasmídeos são mostrados abaixo.In a greenhouse, individual plants of the 393 ES1 394ES, 395 ES, 396 ES, 403 ES, 404 ES and 409 ES strains were grown in soil with 6 cm pots. In each case, about 0.3 g of debatata tuber material or individual plant leaves was processed according to the method described under General Methods, item 2. Using the method described under General Methods, item 4, the amount of The hyaluronan contained in the respective plant extracts was determined with the aid of a calibration curve generated according to Example 10a), a calibration curve generated for each series of individual measurements. Here, to determine the hyaluronan content, the supernatant obtained after centrifugation was in each case diluted with water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ) such that the measured extinction values of the individual samples were within the linear range of the calibration curve. Results for plants originating from original multi-plasmid transformations are shown below.

a) Análise de tubérculos da linhagem 393 ES7a) Analysis of tubers of strain 393 ES7

Para cada tubérculo de plantas transgênicas individuais das li-nhagens denominadas 393 ES, duas amostras independentes foram toma-das e o teor de hialuronan em cada caso determinado separadamente. Amédia e o desvio padrão dos valores obtidos para as medições individuaisde cada tubérculo foram então calculados usando a fórmula dada sob Méto-dos Gerais, item 5. As médias e desvios padrões estabelecidos para plantasdenominadas tipo selvagem e plantas denominadas 365 ES 13 foram calcu-lados mediante cálculo da quantidade de hialuronan em tubérculos de, emcada caso, dez plantas diferentes que são progênies vegetativas do tipo sel-vagem (Solanum tuberosum cv. Désirée) e da linhagem 365 ES 13, respecti-vamente. Os seguintes resultados foram obtidos para plantas selecionadas:For each tuber of individual transgenic plants of the lines named 393 ES, two independent samples were taken and the hyaluronan content in each case determined separately. The mean and standard deviation of the values obtained for the individual measurements of each tuber were then calculated using the formula given under General Method, item 5. The means and standard deviations established for wild-type plants and plants named 365 ES 13 were calculated. by calculating the amount of hyaluronan in tubers of, in each case, ten different plants which are vegetative progenies of the wild type (Solanum tuberosum cv. Désirée) and of the strain 365 ES 13, respectively. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 94</column></row><table><table> table see original document page 94 </column> </row> <table>

Tabela 3: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em tubérculos de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 393 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material de tubérculos foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plan-tas que não foram transformadas; 365 ES 13 refere-se a plantas que ex-pressam uma hialuronan sintase e foram usadas como material de partidapara a transformação com o vetor de expressão em vegetal IC 370-256 paragerar as linhagens 393 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade dehialuronan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra odesvio padrão das médias determinadas.Table 3: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic tubers of the 393 ES strain. Column 1 contains the name of the plant from which tuber material was harvested (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 13 refers to plants that express a hyaluronan synthase and have been used as starting material for transformation with the vegetable expression vector IC 370-256 (to 393 ES lines). Column 2 shows the average amount of hyaluronan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means.

b) Análise de tubérculos da linhagem 394 ESb) Analysis of tubers of strain 394 ES

Para cada tubérculo de plantas transgênicas individuais das Ii-nhagens denominadas 394 ES, duas amostras independentes foram toma-das e o teor de hialuronan em cada caso determinado separadamente. Amédia e o desvio padrão dos valores obtidos para as medições individuaisde cada tubérculo foram então calculados usando a fórmula dada sob Méto-dos Gerais, item 5. As médias e desvios padrões estabelecidos para plantasdenominadas tipo selvagem e plantas denominadas 365 ES foram calcula-dos mediante cálculo da quantidade de hialuronan }em tubérculos de, emcada caso, 18 plantas do tipo selvagem diferentes e 26 plantas da linhagem365 ES 74 diferentes que são progênies vegetativas do tipo selvagem (Sola-num tuberosum cv. Désirée) e da linhagem 365 ES 74, respectivamente. Osseguintes resultados foram obtidos para plantas selecionadas:For each tuber of individual transgenic plants from the 394 ES strains, two independent samples were taken and the hyaluronan content in each case determined separately. The mean and standard deviation of the values obtained for the individual measurements of each tuber were then calculated using the formula given under General Method, item 5. The means and standard deviations established for wild-type plants and plants named 365 ES were calculated using calculating the amount of hyaluronan} in tubers of in each case 18 different wild-type plants and 26 different plants of the 365 ES 74 strain which are wild-type (Sola-num tuberosum cv. Désirée) and 365 ES 74 strain respectively. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 95</column></row><table><table> table see original document page 95 </column> </row> <table>

Tabela 4: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em tubérculos de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 394 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material de tubérculos foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plan-tas que não foram transformadas; 365 ES 74 refere-se a plantas que ex-pressam uma hialuronan sintase e foram usadas como material de partidapara a transformação com o vetor de expressão em vegetal IC 370-256 paragerar as linhagens 394 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade dehialuronan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra odesvio padrão das médias determinadas.Table 4: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic tubers of the 394 ES strain. Column 1 contains the name of the plant from which tuber material was harvested (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 74 refers to plants that express a hyaluronan synthase and have been used as starting material for transformation with the plant expression vector IC 370-256 to parade strains 394 ES). Column 2 shows the average amount of hyaluronan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means.

c) Análise de tubérculos da linhagem 395 ESc) Analysis of tubers of strain 395 ES

Para cada tubérculo de plantas transgênicas individuais das li-nhagens denominadas 395 ES, se possível, duas amostras independentesforam tomadas e o teor de hialuronan em cada caso determinado separa-damente. A média e o desvio padrão dos valores obtidos para as mediçõesindividuais de cada tubérculo foram então calculados usando a fórmula dadasob Métodos Gerais, item 5. As médias e desvios padrões estabelecidospara plantas denominadas tipo selvagem e plantas denominadas 365 ESforam calculados mediante cálculo da quantidade de hialuronan em tubércu-los de, em cada caso, 10 plantas do tipo selvagem diferentes e 18 plantas dalinhagem 365 ES 13 diferentes que são progênies vegetativas do tipo selva-gem (Solanum tuberosum cv. Désirée) e da linhagem 365 ES 13, respecti-vamente. Os seguintes resultados foram obtidos para plantas selecionadas:For each tuber of individual transgenic plants of the 395 ES lines, if possible, two independent samples were taken and the hyaluronan content in each case determined separately. The mean and standard deviation of the values obtained for individual measurements of each tuber were then calculated using the formula given under General Methods, item 5. The means and standard deviations established for wild-type plants and 365-ES plants were calculated by calculating the amount of hyaluronan. in each case 10 different wild type plants and 18 different 365 ES 13 seedlings which are vegetative progenies of the jungle-type (Solanum tuberosum cv. Désirée) and of the 365 ES 13 strain, respectively. . The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 96</column></row><table>Tabela 5: Quantidade de hialuronan (em μρ de hialuronan por g de massafresca) produzido em tubérculos de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 395 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material de tubérculos foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plan-tas que não foram transformadas; 365 ES 13 refere-se a plantas que ex-pressam uma hialuronan sintase e foram usadas como material de partidapara a transformação com o vetor de expressão em vegetal IC 372-256 paragerar as linhagens 395 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade dehialuronan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra odesvio padrão das médias determinadas. No caso de plantas em que ne-nhum desvio padrão é estabelecido, o teor de hialuronan de apenas umaamostra de tubérculo foi determinado.<table> table see original document page 96 </column> </row> <table> Table 5: Amount of hyaluronan (in μρ of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic plant tubers of the 395 ES line. Column 1 contains the name of the plant from which tuber material was harvested (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 13 refers to plants that express a hyaluronan synthase and have been used as starting material for transformation with the vegetable expression vector IC 372-256 (to 395 strains ES). Column 2 shows the average amount of hyaluronan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means. In the case of plants in which no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one tuber sample was determined.

d) Análise de folhas da linhagem 395 ESd) Analysis of leaves of strain 395 ES

O teor de hialuronan de folhas individuais de plantas das Iinha-gens que apresentam o nome 395 ES foi determinado. As médias e desviospadrões estabelecidos para plantas que apresentam o nome tipo selvagem eplantas que apresentam o nome 365 ES foram calculados mediante cálculo,em cada caso, da quantidade de hialuronan em folhas de 4 plantas do tiposelvagem diferentes e 9 plantas da linhagem 365 ES 13 diferentes, que sãoprogênies vegetativas do tipo selvagem (Solanum tuberosum cv. Désirée) eda linhagem 365 ES 13, respectivamente. Os seguintes resultados foramobtidos para plantas selecionadas:The hyaluronan content of individual plant leaves of the lines bearing the name 395 ES was determined. The averages and standard deviations established for plants bearing the name wild type and plants bearing the name 365 ES were calculated by calculating, in each case, the amount of hyaluronan in leaves of 4 different wild type and 9 different 365 ES 13 strain. , which are wild type vegetative progenies (Solanum tuberosum cv. Désirée) and strain 365 ES 13, respectively. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 97</column></row><table><table>table see original document page 98</column></row><table><table> table see original document page 97 </column> </row> <table> <table> table see original document page 98 </column> </row> <table>

Tabela 6: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em folhas de plantas transgênicas independentementeselecionadas dajinhagem 395 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material de tubérculos foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plan-tas que não foram transformadas; 365 ES 13 refere-se a plantas que ex-pressam uma hialuronan sintase e foram usadas como material de partidapara a transformação com o vetor de expressão em vegetal IC 372-256 paragerar as linhagens 395 ES). A coluna 2 mostrada média da quantidade dehialuronan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra odesvio padrão das médias determinadas. No caso de plantas em que ne-nhum desvio padrão é estabelecido, o teor de hialuronan de apenas umaamostra de folha foi determinado.Table 6: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in leaves of transgenic plants independently selected from the 395 ES. Column 1 contains the name of the plant from which tuber material was harvested (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 13 refers to plants that express a hyaluronan synthase and have been used as starting material for transformation with the vegetable expression vector IC 372-256 (to 395 strains ES). Column 2 shows the average amount of hyaluronan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means. In the case of plants in which no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one leaf sample was determined.

e) Análise de tubérculos da linhagem 396 ESe) Analysis of tubers of strain 396 ES

Para cada tubérculo de plantas transgênicas individuais das Ii-nhagens denominadas 396, duas amostras independentes foram tomadas eo teor de hialuronan em cada caso determinado separadamente. A média eo desvio padrão dos valores obtidos para as medições individuais de cadatubérculo foram então calculados usando a fórmula dada sob Métodos Ge-rais, item 5. As médias e desvios padrões estabelecidos para plantas deno-minadas tipo selvagem e plantas denominadas 365 ES foram calculadosmediante cálculo da quantidade de hialuronan em tubérculos de, em cadacaso, 12 plantas do tipo selvagem diferentes e 14 plantas da linhagem 365ES 74 diferentes que são progênies vegetativas do tipo selvagem (Sòlanumtuberosum cv. Désirée) e da linhagem 365 ES 74, respectivamente. Os se-guintes resultados foram obtidos para plantas selecionadas:For each tuber of individual transgenic plants of the 396 strains, two independent samples were taken and the hyaluronan content in each case determined separately. The mean and standard deviation of the values obtained for the individual measurements of each body were then calculated using the formula given under General Methods, item 5. The averages and standard deviations established for wild type denominated plants and plants named 365 ES were calculated using Calculation of the amount of hyaluronan in tubers of 12 different wild type plants and 14 different 365ES 74 lineage plants which are wild type (Sòlanumtuberosum cv. Désirée) and 365 ES 74 lineages, respectively. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 99</column></row><table><table> table see original document page 99 </column> </row> <table>

Tabela 7: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em tubérculos de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 396 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material de tubérculos foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plan-tas que não foram transformadas; 365 ES 74 refere-se a plantas que ex-pressam uma hialuronan sintase e foram usadas como material de partidapara a transformação com o vetor de expressão em vegetal IC 372-256 paragerar as linhagens 396 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade dehialuronan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra odesvio padrão das médias determinadas.Table 7: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic tubers of the 396 ES strain. Column 1 contains the name of the plant from which tuber material was harvested (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 74 refers to plants that express a hyaluronan synthase and have been used as starting material for transformation with the plant expression vector IC 372-256 to parade strains 396 ES). Column 2 shows the average amount of hyaluronan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means.

f) Análise de folhas da linhagem 396 ESf) Analysis of leaves of strain 396 ES

O teor de hialuronan de folhas individuais de plantas das linha-gens que apresentam o nome 396 ES foi determinado. As médias e desviospadrões estabelecidos para plantas que apresentam o nome tipo selvagem eplantas que apresentam o nome 365 ES foram calculados mediante cálculo,em cada caso, da quantidade de hialuronan em folhas de 4 plantas do tiposelvagem diferentes e 6 plantas da linhagem 365 ES 13 diferentes, que sãoprogênies vegetativas do tipo selvagem (Solanum tuberosum cv. Désirée) eda linhagem 365 ES 13, respectivamente. Os seguintes resultados foramobtidos para plantas selecionadas:The hyaluronan content of individual leaves of the plant lines bearing the name 396 ES was determined. The averages and standard deviations established for plants bearing the name wild type and plants bearing the name 365 ES were calculated by calculating, in each case, the amount of hyaluronan in leaves of 4 different wild type and 6 plants of 365 ES 13. , which are wild type vegetative progenies (Solanum tuberosum cv. Désirée) and strain 365 ES 13, respectively. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table><table> table see original document page 100 </column> </row> <table> <table> table see original document page 101 </column> </row> <table>

Tabela 8: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em folhas de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 396 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material foliar foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plantas quenão foram transformadas; 365 ES 74 refere-se a plantas que expressamuma hialuronan sintase e foram usadas como material de partida para atransformação com o vetor de expressão em vegetal IC 372-256 para geraras linhagens 396 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade de hialuro-nan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra o desviopadrão das médias determinadas. No caso de plantas em que nenhum des-vio padrão é estabelecido, o teor de hialuronan de apenas uma amostra defolha foi determinado.Table 8: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic plant leaves 396 ES. Column 1 contains the name of the plant from which leaf material was collected (here, "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 74 refers to plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation). with the vegetable expression vector IC 372-256 to generate strains 396 ES). Column 2 shows the average amount of hyaluro-nan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means. In the case of plants in which no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one leaf sample was determined.

g) Análise de tubérculos da linhagem 403 ESg) Analysis of tubers of strain 403 ES

Para cada tubérculo de plantas transgênicas individuais das li-nhagens denominadas 403 ES, duas amostras independentes foram toma-das, se possível, e o teor de hialuronan em cada caso determinado separa-damente. A média e o desvio padrão dos valores obtidos para as mediçõesindividuais de cada tubérculo foram então calculados usando a fórmula dadasob Métodos Gerais, item 5. As médias e desvios padrões estabelecidospara plantas denominadas tipo selvagem e plantas denominadas 365 ESforam calculados mediante cálculo da quantidade de hialuronan em tubércu-los de, em cada caso, 10 plantas do tipo selvagem diferentes e 10 plantas dalinhagem 365 ES 13 diferentes que são progênies vegetativas do tipo selva-gem (Solanum tuberosum cv. Désirée) e da linhagem 365 ES 13, respecti-vamente. Os seguintes resultados foram obtidos para plantas selecionadas:<table>table see original document page 102</column></row><table>For each tuber of individual transgenic plants of the lines named 403 ES, two independent samples were taken, if possible, and the hyaluronan content in each case determined separately. The mean and standard deviation of the values obtained for individual measurements of each tuber were then calculated using the formula given under General Methods, item 5. The means and standard deviations established for wild-type plants and 365-ES plants were calculated by calculating the amount of hyaluronan. in each case 10 different wild-type plants and 10 different 365 ES 13 seedlings which are vegetative progenies of the jungle-type (Solanum tuberosum cv. Désirée) and of the 365 ES 13 strain, respectively. . The following results were obtained for selected plants: <table> table see original document page 102 </column> </row> <table>

Tabela 9: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em tubérculos de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 403 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material de tubérculos foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plan-tas que não foram transformadas; 365 ES 13 refere-se a plantas que ex-pressam uma hialuronan sintase e foram usadas como material de partidapara a transformação com o vetor de expressão em vegetal IC 375-271 paragerar as linhagens 403 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade dehialuronan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra odesvio padrão das médias determinadas, "n.d." significa que não foi possíveldetectar hialuronan nos tubérculos. No caso de plantas em que nenhumdesvio padrão é estabelecido, o teor de hialuronan de apenas uma amostrade tubérculo foi determinado.Table 9: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic plant tubers of the 403 ES strain. Column 1 contains the name of the plant from which tuber material was harvested (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 13 refers to plants that express a hyaluronan synthase and have been used as starting material for transformation with the vegetable expression vector IC 375-271 (403 ES). Column 2 shows the average amount of hyaluronan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means, "n.d." This means that it was not possible to detect hyaluronan in the tubers. In the case of plants where no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one tuber sample was determined.

h) Análise de folhas da linhagem 403 ESh) Leaf analysis of 403 ES strain

O teor de hialuronan de folhas individuais de plantas das linha-gens que apresentam o nome 403 ES foi determinado. As médias e desviospadrões estabelecidos para plantas que apresentam o nome tipo selvagem eplantas que apresentam o nome 365 ES foram calculados mediante cálculo,em cada caso, da quantidade de hialuronan em folhas de 5 plantas do tiposelvagem diferentes e 5 plantas da linhagem 365 ES 13 diferentes, que sãoprogênies vegetativas do tipo selvagem (Solanum tuberosum cv. Désirée) eda linhagem 365 ES 13, respectivamente. Os seguintes resultados foramobtidos para plantas selecionadas:The hyaluronan content of individual leaves of the plant lines bearing the name 403 ES was determined. The averages and standard deviations established for plants bearing the name wild type and plants bearing the name 365 ES were calculated by calculating, in each case, the amount of hyaluronan in leaves of 5 different wild type and 5 365 ES 13 strain. , which are wild type vegetative progenies (Solanum tuberosum cv. Désirée) and strain 365 ES 13, respectively. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 103</column></row><table><table> table see original document page 103 </column> </row> <table>

Tabela 10: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em folhas de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 403 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material foliar foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plantas quenão foram transformadas; 365 ES 13 refere-se a plantas que expressamuma hialuronan sintase e foram usadas como material de partida para atransformação com o vetor de expressão em vegetal IC 375-271 para geraras linhagens 403 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade de hialuro-nan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra o desviopadrão das médias determinadas. No caso de plantas em que nenhum des-vio padrão é estabelecido, o teor de hialuronan de apenas uma amostra defolha foi determinado.Table 10: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in leaves of independently selected transgenic plants of 403 ES. Column 1 contains the name of the plant from which leaf material was collected (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 13 refers to plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation). with the vegetable expression vector IC 375-271 to generate the 403 ES strains). Column 2 shows the average amount of hyaluro-nan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means. In the case of plants in which no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one leaf sample was determined.

i) Análise de tubérculos da linhagem 404 ES(i) Analysis of tubers of strain 404 ES

Para cada tubérculo de plantas transgênicas individuais das li-nhagens denominadas 404 ES1 duas amostras independentes foram toma-das, se possível, e o teor de hialuronan em cada caso determinado separa-damente. A média e o desvio padrão dos valores obtidos para as mediçõesindividuais de cada tubérculo foram então calculados usando a fórmula dadasob Métodos Gerais, item 5. As médias e desvios padrões estabelecidospara plantas denominadas tipo selvagem e plantas denominadas 365 ESforam calculados mediante cálculo da quantidade de hialuronan em tubércu-los de, em cada caso, 10 plantas do tipo selvagem diferentes e 12 plantas dalinhagem 365 ES 74 diferentes que são progênies vegetativas do tipo selva-gem (Solanum tuberosum cv. Désirée) e da linhagem 365 ES 74, respecti-vamente. Os seguintes resultados foram obtidos para plantas selecionadas:For each tuber of individual transgenic plants of the so-called 404 ES1 lines two independent samples were taken, if possible, and the hyaluronan content in each case determined separately. The mean and standard deviation of the values obtained for individual measurements of each tuber were then calculated using the formula given under General Methods, item 5. The means and standard deviations established for wild-type plants and 365-ES plants were calculated by calculating the amount of hyaluronan. in each case 10 different wild-type plants and 12 different 365 ES 74 outlining plants which are vegetative progenies of the jungle-type (Solanum tuberosum cv. Désirée) and of the 365 ES 74 lineage, respectively. . The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 104</column></row><table><table> table see original document page 104 </column> </row> <table>

Tabela 11: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em tubérculos de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 404 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material de tubérculos foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plan-tas que não foram transformadas; 365 ES 74 refere-se a plantas que ex-pressam uma hialuronan sintase e foram usadas como material de partidapara a transformação com o vetor de expressão em vegetal IC 375-271 paragerar as linhagens 404 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade dehialuronan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra odesvio padrão das médias determinadas, "n.d." significa que não foi possíveldetectar hialuronan nos tubérculos. No caso de plantas em que nenhumdesvio padrão é estabelecido, o teor de hialuronan de apenas uma amostrade tubérculo foi determinado.Table 11: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic tubers of the 404 ES strain. Column 1 contains the name of the plant from which tuber material was harvested (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 74 refers to plants that express a hyaluronan synthase and have been used as starting material for transformation with the vegetable expression vector IC 375-271 to parade 404 ES strains). Column 2 shows the average amount of hyaluronan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means, "n.d." This means that it was not possible to detect hyaluronan in the tubers. In the case of plants where no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one tuber sample was determined.

j) Análise de folhas da linhagem 404 ESj) Leaf analysis of 404 ES strain

O teor de hialuronan de folhas individuais de plantas das linha-gens que apresentam o nome 404 ES foi determinado. As médias e desviospadrões estabelecidos para plantas que apresentam o nome tipo selvagem eplantas que apresentam o nome 365 ES foram calculados mediante cálculo,em cada caso, da quantidade de hialuronan em folhas de 7 plantas do tiposelvagem diferentes e 9 plantas da linhagem 365 ES 74 diferentes, que sãoprogênies vegetativas do tipo selvagem (Solanum tuberosum cv. Désirée) eda linhagem 365 ES 74, respectivamente. Os seguintes resultados foramobtidos para plantas selecionadas:The hyaluronan content of individual leaves of the plant lines bearing the name 404 ES was determined. The averages and standard deviations established for plants bearing the name wild type and plants bearing the name 365 ES were calculated by calculating, in each case, the amount of hyaluronan in leaves of 7 different wild type plants and 9 365 ES 74 different lineage plants. , which are wild type vegetative progenies (Solanum tuberosum cv. Désirée) and strain 365 ES 74, respectively. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table><table> table see original document page 105 </column> </row> <table> <table> table see original document page 106 </column> </row> <table>

Tabela 12: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em folhas de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 404 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material foliar foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plantas quenão foram transformadas; 365 ES 74 refere-se a plantas que expressamuma hialuronan sintase e foram usadas como material de partida para atransformação com o vetor de expressão em vegetal IC 375-271 para geraras linhagens 404 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade de hialuro-nan determinada para as folhas em questão. A coluna 3 mostra o desvio pa-drão das médias determinadas. No caso de plantas em que nenhum desviopadrão é estabelecido, o teor de hialuronan de apenas uma amostra de folhafoi determinado.Table 12: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic leaves of the 404 ES strain. Column 1 contains the name of the plant from which leaf material was collected (here, "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 74 refers to plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation). with the vegetable expression vector IC 375-271 to generate the 404 ES strains). Column 2 shows the average amount of hyaluro-nan determined for the leaves in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means. In the case of plants where no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one leaf sample has been determined.

k) Análise de tubérculos da linhagem 409 ESk) Analysis of tubers of strain 409 ES

Para cada tubérculo de plantas transgênicas individuais das li-nhagens denominadas 409 ES, amostras foram tomadas e o teor de hialuro-nan em cada caso determinado. As médias e desvios padrões estabelecidospara plantas denominadas tipo selvagem e plantas denominadas 365 ES foramcalculados mediante cálculo da quantidade de hialuronan em tubérculos de, emcada caso, 4 plantas do tipo selvagem diferentes e 6 plantas da linhagem 365ES 74 diferentes que são progênies vegetativas do tipo selvagem (Solanumtuberosum cv. Désirée) e da linhagem 365 ES 74, respectivamente. A média eo desvio padrão dos valores obtidos para as medições individuais de cadatubérculo foram calculados usando a fórmula dada sob Métodos Gerais, itemFor each tuber of individual transgenic plants of the lines named 409 ES, samples were taken and the hyaluro-nan content in each case determined. The means and standard deviations established for wild-type plants and 365-ES plants were calculated by calculating the amount of hyaluronan in tubers of in each case 4 different wild-type plants and 6 365ES 74-different plants which are wild-type vegetative progenies. (Solanumtuberosum cv. Désirée) and 365 ES 74, respectively. The mean and standard deviation of the values obtained for the individual measurements of each body were calculated using the formula given under General Methods, item

5. Os seguintes resultados foram obtidos para plantas selecionadas:5. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 107</column></row><table>Tabela 13: Quantidade de hialuronan (em μς de hialüronan por g de massafresca) produzido em tubérculos de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 409 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material de tubérculos foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plan-tas que não foram transformadas; 365 ES 74 refere-se a plantas que ex-pressam uma hialuronan sintase e foram usadas como material de partidapara a transformação com o vetor de expressão em vegetal IC 375-271 paragerar as linhagens 409 ES). A coluna 2 mostra a média da quantidade dehialuronan determinada para os tubérculos em questão. A coluna 3 mostra odesvio padrão das médias determinadas, "n.d." significa que não foi possíveldetectar hialuronan nos tubérculos. No caso de plantas em que nenhumdesvio padrão é estabelecido, o teor de hialuronan de apenas uma amostrade tubérculo foi determinado.<table> table see original document page 107 </column> </row> <table> Table 13: Amount of hyaluronan (in μς of hialüronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic plant tubers of the 409 ES line. Column 1 contains the name of the plant from which tuber material was harvested (here "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 74 refers to plants that express a hyaluronan synthase and have been used as starting material for transformation with the vegetable expression vector IC 375-271 (409 ES). Column 2 shows the average amount of hyaluronan determined for the tubers in question. Column 3 shows the standard deviation of the determined means, "n.d." This means that it was not possible to detect hyaluronan in the tubers. In the case of plants where no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one tuber sample was determined.

I) Análise de folhas da linhagem 409 ESI) Leaf analysis of 409 ES strain

O teor de hialuronan de folhas individuais de plantas das linha-gens que apresentam o nome 409 ES foi determinado. As médias e desviospadrões estabelecidos para pianías que apresentam o nome tipo selvagem eplantas que apresentam o nome 365 ES foram calculados mediante cálculo,em cada caso, da quantidade de hialuronan em folhas de 4 plantas do tiposelvagem diferentes e 6 plantas da linhagem 365 ES 74 diferentes, que sãoprogênies vegetativas do tipo selvagem (Solanum tuberosum cv. Désirée) eda linhagem 365 ES 74, respectivamente. Os seguintes resultados foramobtidos para plantas selecionadas:The hyaluronan content of individual leaves of the plant lines bearing the name 409 ES was determined. The averages and standard deviations established for pianias bearing the name wild type and plants bearing the name 365 ES were calculated by calculating, in each case, the amount of hyaluronan in leaves of 4 different wild type and 6 plants of 365 ES 74. , which are wild type vegetative progenies (Solanum tuberosum cv. Désirée) and strain 365 ES 74, respectively. The following results were obtained for selected plants:

<table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table><table> table see original document page 108 </column> </row> <table> <table> table see original document page 109 </column> </row> <table>

Tabela 14: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em folhas de plantas transgênicas independentementeselecionadas da linhagem 409 ES. A coluna 1 contém o nome da planta deque material foliar foi colhido (aqui, "tipo selvagem" refere-se a plantas quenão foram transformadas; 365 ES 74 refere-se a plantas que expressamuma hialuronan sintase e foram usadas como material de partida para atransformação com o vetor de expressão em vegetal IC 376-256 para geraras linhagens 409 ES). A coluna 2 mostra a quantidade de hialuronan deter-minada para as folhas em questão. A coluna 3 mostra o desvio padrão dasmédias determinadas, "n.d." significa que hialuronan não pôde ser detectadonos tubérculos. No caso de plantas em que nenhum desvio padrão é estabele-cido, o teor de hialuronan de apenas uma amostra de folha foi determinado.Table 14: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in leaves of independently selected transgenic plants from the 409 ES line. Column 1 contains the name of the plant from which leaf material was collected (here, "wild type" refers to plants that have not been transformed; 365 ES 74 refers to plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation). with the vegetable expression vector IC 376-256 to generate the 409 ES strains). Column 2 shows the amount of hyaluronan determined for the leaves concerned. Column 3 shows the standard deviation of the averages given, "n.d." means that hyaluronan could not be detected in tubers. In the case of plants where no standard deviation is established, the hyaluronan content of only one leaf sample has been determined.

m) Determinação do teor de hialuronan com relação à massafresca e com relação à massa $eca(m) Determination of hyaluronan content in relation to fresh mass and mass $ eca

Folhas individuais de plantas de linhagens 395 ES e 396 ES fo-ram, antes de colheita dos tubérculos das plantas em questão, removidasdas plantas e divididas ao meio. Metade de cada folha individual foi em cadacaso congelada ψη nitrogênio líquido, a outra metade correspondente foisecada por congelação da noite para o dia.Individual leaves of plants from 395 ES and 396 ES strains were removed before harvesting the tubers of the plants in question, removed from the plants and split in half. Half of each individual leaf was frozen frozen in liquid nitrogen, the other half was frozen by overnight freezing.

Cerca de 0,3 g de material foliar das amostras foliares congela-das ou cerca de 0,02 das amostras foliares secadas por congelação foifragmentado com um moinho de esferas oscilante de laboratório (MM200, deRetsch, Alemanha) (30 s a 30 HZ). 300 μl de água (desmineralizada, condu-tividade = 18 ΜΩ) foram então adicionados a cada amostra individual frag-mentada, que foi por conseguinte misturada totalmente utilizando um mistu-rador de vórtice, e fragmentos celulares e componentes insolúveis foramentão separados do sobrenadante por centrifugação (5 minutos a 16.000 χg). O sobrenadante foi removido e cada amostra completada até 500 μl comágua (desmineralizada, condutividade = 18 ΜΩ). Alíquotas das amostraspreparadas dessa maneira foram usadas para determinar o teor de hialuro-nan usando o método descrito sob Métodos Gerais, item 4. A média e o des-vio padrão foram calculados usando a fórmula dada sob Métodos Gerais,item 5. Para plantas selecionadas, os seguintes resultados foram obtidos:About 0.3 g of leaf material from the frozen leaf samples or about 0.02 of the freeze-dried leaf samples was flushed with a laboratory oscillating ball mill (MM200, deRetsch, Germany) (30 s to 30 HZ). 300 μl of water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ) was then added to each individual fragment sample, which was therefore mixed thoroughly using a vortex mixer, and cell fragments and insoluble components were then separated from the supernatant by centrifugation (5 minutes at 16,000 χg). The supernatant was removed and each sample completed to 500 μl with water (demineralized, conductivity = 18 ΜΩ). Aliquots of samples prepared in this manner were used to determine hyaluro-nan content using the method described under General Methods, item 4. Mean and standard deviation were calculated using the formula given under General Methods, item 5. For selected plants , the following results were obtained:

<table>table see original document page 110</column></row><table>Tabela 15: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em folhas de plantas transgênicas independentementeselecionadas de linhagens 395 ES e 396 ES. A coluna 1 nomeia a planta deque material foliar foi colhido. 365 ES 13 refere-se a plantas que expressamuma hialuronan sintase e foram usadas como material de partida para atransformação com o vetor de expressão em vegetal IC 372-256 para geraras linhagens 395 ES. 365 ES 74 refere-se a plantas que expressam umahialuronan sintase e foram usadas como material de partida para a transfor-mação com o vetor de expressão em vegetal IC 372-256 para gerar Iinha-gens 396 ES. A coluna 2 estabelece a quantidade de hialuronan determina-da para diferentes folhas das plantas em questão. A coluna 3 estabelece amédia das quantidades de hialuronan medidas em diferentes folhas de umaplanta. A coluna 4 estabelece o desvio padrão para as médias determinadas.<table> table see original document page 110 </column> </row> <table> Table 15: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic plant leaves from 395 ES and 396 ES strains . Column 1 names the plant from which leaf material was harvested. 365 ES 13 refers to plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation with the plant expression vector IC 372-256 to generate the 395 ES strains. 365 ES 74 refers to plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation with the plant expression vector IC 372-256 to generate 396 ES lines. Column 2 sets out the amount of hyaluronan determined for different leaves of the plants concerned. Column 3 gives an average of the amounts of hyaluronan measured on different leaves of a plant. Column 4 establishes the standard deviation for the determined means.

<table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table><table> table see original document page 111 </column> </row> <table> <table> table see original document page 112 </column> </row> <table>

Tabela 16: Quantidade de hialuronan (em μς de hialuronan por g de massaseca) produzido em folhas de plantas transgênicas independentemente se-lecionadas de linhagens 395 ES e 396 ES. A coluna 1 nomeia a planta deque material foliar foi colhido. 365 ES 13 refere-se a plantas que expressamuma hialuronan sintase e foram usadas como material de partida para atransformação com o vetor de expressão em vegetal IC 372-256 para geraras linhagens 395 ES. 365 ES 74 refere-se a plantas que expressam umahialuronan sintase e foram usadas como material de partida para a transfor-mação com o vetor de expressão em vegetal IC 372-256 para gerar linha-gens 396 ES. A coluna 2 estabelece a quantidade de hialuronan determina-da para diferentes folhas das plantas em questão. A coluna 3 estabelece amédia das quantidades de hialuronan medidas em diferentes folhas de umaplanta. A coluna 4 estabelece o desvio padrão para as médias determinadas.Table 16: Amount of hyaluronan (in μς of hyaluronan per g of massa -eca) produced in independently selected transgenic plant leaves from 395 ES and 396 ES strains. Column 1 names the plant from which leaf material was harvested. 365 ES 13 refers to plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation with the plant expression vector IC 372-256 to generate the 395 ES strains. 365 ES 74 refers to plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation with the plant expression vector IC 372-256 to generate 396 ES line-genes. Column 2 sets out the amount of hyaluronan determined for different leaves of the plants concerned. Column 3 gives an average of the amounts of hyaluronan measured on different leaves of a plant. Column 4 establishes the standard deviation for the determined means.

14. Transformação de plantas de tomate com vetor de expres-são em vegetais que compreende moléculas de ácidos nucléicos que codifi-cam uma hialuronan sintase.14. Transformation of tomato plants with expression vector into vegetables comprising nucleic acid molecules encoding a hyaluronan synthase.

Plantas de tomate foram inicialmente transformadas usando ovetor de expressão em vegetal IC 341-222 qiie compreende uma seqüênciade codificação de ácidos nucléicos para uma proteína HAS de vírus 1 Chlo-rella de Paramecium bursaria sob o controle do promotor do gene para pata-tina B33 de Solanum tuberosum (Rocha-Sosa e outros., 1989, EMBO J. 8,23-29) usando o método fornecido sob Métodos Gerais, item 8. As plantasde tomate transgênicas obtidas, que foram transformadas com o plasmídeoIC 341-222, foram denominadas 367 ES.Tomato plants were initially transformed using the IC 341-222 vegetable expression ovator which comprises a nucleic acid coding sequence for a Paramecium bursaria Chlo-rella virus HAS 1 protein under the control of the B33 pathogen gene promoter. Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8,23-29) using the method provided under General Methods, item 8. The obtained transgenic tomato plants, which were transformed with plasmid IC 341-222, were named 367 ES.

Plantas de tomate das linhagens 367 ES 25 e 367 ES 42 foramentão transformadas com o vetor de expressão em vegetal IC 341-222 u-sando o método fornecido sob Métodos Gerais, item 8. As plantas de tomatetransgênicas obtidas da linhagem 367 ES 25, que foram transformadas como plasmídeo IC 341-222, foram denominadas 399 ES. As plantas de tomatetransgênicas obtidas da linhagem 367 ES 42, que foram transformadas como plasmídeo IC 341-222, foram denominadas 400 ES.Tomato plants of 367 ES 25 and 367 ES 42 lines were then transformed with the vegetable expression vector IC 341-222 using the method provided under General Methods, item 8. Tomato plants obtained from 367 ES 25, which were transformed as plasmid IC 341-222, were named 399 ES. The tomatetransgenic plants obtained from strain 367 ES 42, which were transformed into plasmid IC 341-222, were named 400 ES.

Plantas de tomate de linhagens 367 ES ,25 foram então trans-formadas com o vetor de expressão em vegetal IC 375-271 usando o méto-do fornecido sob Métodos Gerais, item 8. As plantas de tomate transgênicasobtidas da linhagem 367 ES 25, que foram transformadas com o plasmídeoIC 375-271, foram denominadas 405 ES.Tomato plants from 367 ES, 25 strains were then transformed with the vegetable expression vector IC 375-271 using the method provided under General Methods, item 8. Transgenic tomato plants obtained from 367 ES 25 strain, which were transformed with plasmid IC 375-271, were named 405 ES.

15. Análise de plantas de tomate transgênicas que sintetizamhialuronan adicionalmente transformadas com vetores de expressão em ve-getais que compreendem seqüências de codificação de ácidos nucléicos deuma proteína que apresenta a atividade de um GFAT e de uma proteína queapresenta a atividade de um UDP-GIc-DH.15. Analysis of transgenic tomato plants synthesizing hyaluronan further transformed with expression vectors in plants comprising nucleic acid coding sequences of a protein that exhibits the activity of a GFAT and a protein that has the activity of a UDP-GIc- DH.

a) Folhas de pianias ue lOniciifc! UB umiIayerib o»» co e ^fUU toa) Leaves of pianias u and lOniciifc! UB umiIayerib o »» co e ^ fUU to

A partir de diferentes plantas de tomate selecionadas de linha-gens 399 ES e 400 ES, que foram cultivadas em solo em uma estufa, emcada caso 1 folha foi colhida e congelada em nitrogênio líquido. Processa-mento adicional e a determinação do teor de hialuronan foram realizadoscomo descrito sob Exemplo 11b) para folhas de plantas de batata. Os se-guintes resultados foram obtidos:From different tomato plants selected from 399 ES and 400 ES genotypes, which were grown in soil in a greenhouse, each case 1 leaf was harvested and frozen in liquid nitrogen. Further processing and determination of hyaluronan content were performed as described under Example 11b) for potato plant leaves. The following results were obtained:

<table>table see original document page 113</column></row><table><table> table see original document page 113 </column> </row> <table>

Tabela 17: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em folhas de plantas transgênicas independentementeselecionadas de linhagens 399 ES e 400 ES. A coluna 1 refere-se à plantade que material foliar foi colhido. 367 ES 25 e 367 ES 42 referem-se a dife-rentes plantas que expressam uma hialuronan sintase e foram usadas comomaterial de partida para a transformação com o vetor de expressão em ve-getal IC 372-256 para gerar as linhagens 399 ES e 400 ES, respectivamen-te. A coluna 2 estabelece o valor da quantidade de hialuronan determinadanas folhas das plantas em questão. Tipo selvagem refere-se a plantas quenão foram transformadas.Table 17: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected transgenic plant leaves from 399 ES and 400 ES strains. Column 1 refers to the plantation from which leaf material was harvested. 367 ES 25 and 367 ES 42 refer to different plants expressing a hyaluronan synthase and were used as starting material for transformation with the IC 372-256 expression vector to generate strains 399 ES and 400. ES, respectively. Column 2 sets the value of the amount of hyaluronan determined in the leaves of the plants concerned. Wild type refers to plants that have not been transformed.

b) Frutos de plantas de tomate de linhagens 399 ES e 400 ESA partir de diferentes plantas de tomate selecionadas de linha-gens 399 ES e 400 ES, que foram cultivadas em solo em uma estufa, emcada caso frutos maduros foram colhidos, fragmentados, centrifugados e osobrenadante, após centrifugação, filtrado. Processamento adicional do fil-trado e a determinação do teor de hialuronan foram realizados como descritosob Exemplo 11 b) para folhas de plantas de batata. Os seguintes resultadosforam obtidos:(b) Fruits of tomato plants of 399 ES and 400 ESA strains from different tomato plants selected from 399 ES and 400 ES strain lines, which were grown in soil in a greenhouse, but in case ripe fruits were harvested, fragmented, centrifuged and the supernatant, after centrifugation, filtered. Further filtration processing and determination of hyaluronan content were performed as described under Example 11 b) for potato plant leaves. The following results were obtained:

<table>table see original document page 114</column></row><table><table> table see original document page 114 </column> </row> <table>

Tabela 18: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em frutos maduros de plantas transgênicas independen-temente selecionadas de linhagens 399 ES and 400 ES. A coluna 1 refere-se à planta de que material foliar foi colhido. 367 ES 25-1 e 267 ES-2 refe-rem-se a progênie clonal diferente da planta 367 ES 25 e 367 ES 42-1 e 267ES 42-2 referem-se a progênie clonal diferente da planta 367 ES 42. A colu-na 2 estabelece a média das quantidades de hialuronan determinadas emfrutos das plantas em questão. Com essa finalidade, o teor de hialuronan emcada caso 3 (linhagens 399 ES-1, 400 ES 3), 5 (linhagens 367 ES-25-1, 325ES-2, 367 ES 42-1, 367 ES 42-2) ou 6 (linhagem 39'9jES-11), diferentes fru-tos das linhagens em questão, foi determinado. A coluna 3 estabelece odesvio padrão das médias determinadas.Table 18: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in independently selected mature fruits of transgenic plants 399 ES and 400 ES. Column 1 refers to the plant from which leaf material was harvested. 367 ES 25-1 and 267 ES-2 refer to different clonal progeny of the plant 367 ES 25 and 367 ES 42-1 and 267ES 42-2 refer to different clonal progeny of the 367 ES 42 plant. -in 2 establishes the average quantities of hyaluronan determined from fruit of the plants concerned. For this purpose, the hyaluronan content in each case 3 (strains 399 ES-1, 400 ES 3), 5 (strains 367 ES-25-1, 325ES-2, 367 ES 42-1, 367 ES 42-2) or 6 (lineage 39'9jES-11), different fruits of the lineages in question, was determined. Column 3 establishes the standard deviation of the determined means.

c) Frutos de plantas de tomate de linhagens 405 ESc) Fruits of tomato plants from 405 ES strains

A partir de diferentes plantas de tomate selecionadas de linha-gens 405 ES, que foram cultivadas em solo em uma estufa, em cada casofrutos maduros foram colhidos, fragmentados, centrifugados e o sobrenadan-te, após centrifugação, filtrado. Processamento adicional do filtrado e a de-terminação do teor de hialuronan foram realizados como descrito sob Exem-plo 11 b) para folhas de plantas de batata. Os seguintes resultados foramobtidos:From different tomato plants selected from 405 ES row-lines, which were grown in soil in a greenhouse, each mature castrate was harvested, fragmented, centrifuged and the supernatant, after centrifugation, filtered. Further processing of the filtrate and determination of hyaluronan content was performed as described under Example 11 b) for potato plant leaves. The following results were obtained:

<table>table see original document page 115</column></row><table><table> table see original document page 115 </column> </row> <table>

Tabela 19: Quantidade de hialuronan (em pg de hialuronan por g de massafresca) produzido em frutos maduros de plantas transgênicas independen-temente selecionadas de linhagens 405 ES. A coluna 1 refere-se à planta deque material foliar foi colhido. 367 ES 25-8 and 367 ES 25-9 referem-se aprogênie clonal diferente da planta 367 ES 25. Extensões em números lati-nos referem-se a diferentes frutos da respectiva planta, ("peso" refere-se aplantas que não foram transformadas). A coluna 2 estabelece a média dasquantidades de hialuronan determinadas em diferentes frutos das plantasem questão. A coluna 3 estabelece o desvio padrão das médias determinadas.Table 19: Amount of hyaluronan (in pg of hyaluronan per g of fresh mass) produced in mature fruits of independently selected transgenic plants from 405 ES strains. Column 1 refers to the plant from which leaf material was harvested. 367 ES 25-8 and 367 ES 25-9 refer to different clonal progeny of the plant 367 ES 25. Extensions in Latin numbers refer to different fruits of the respective plant, ("weight" refers to plants that were not transformed). Column 2 sets out the average quantities of hyaluronan determined on different fruits of the plants concerned. Column 3 establishes the standard deviation of the determined means.

16) Nota de conclusão16) Concluding note

Quando o teor de hialuronan de diferentes folhas de uma plantafoi determinado, verificou-se que folhas mais velhas da mesma planta ge-ralmente continham mais hialuronan do que folhas mais jovens da mesmaplanta. Conseqüentemente, o teor de hialuronan em folhas parece aumentarcom a elevação de idade da folha, de modo que poderá admitir-se que hialu-ronan acumula-se com o tempo. Esse fenômeno poderá explicar as diferen-tes quantidades de hialuronan encontradas ern medições independentespara progênie da mesma linhagem.FORMATO INTERNACIONALWhen the hyaluronan content of different leaves of a plant was determined, older leaves of the same plant were generally found to contain more hyaluronan than younger leaves of the same plant. Consequently, the hyaluronan content in leaves seems to increase with increasing leaf age, so it may be assumed that hyalu-ronan accumulates over time. This phenomenon may explain the different amounts of hyaluronan found in independent measurements for progeny of the same lineage. INTERNATIONAL FORMAT

Bayer CropScience GmbHBrüningstr. 50Bayer CropScience GmbHBrüningstr. 50

65929 Frankfurt65929 Frankfurt

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADEEmitido por força da regra 10.2 pelaAUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITOFEASIBILITY STATEMENT Issued under Rule 10.2 by the INTERNATIONAL DEPOSIT AUTHORITY

identificada abaixoidentified below

<table>table see original document page 117</column></row><table><table> table see original document page 117 </column> </row> <table>

1 Indica a data de depósito original ou, quando um novo depósito ou transferência é feito, a data1 Indicates the original filing date or, when a new deposit or transfer is made, the date

relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferênciarelevant date (new deposit date or transfer date

2 Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente.2 In cases related to Rule 10.2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent feasibility test.

3 Marcar com um X o campo aplicável3 X mark the applicable field

4 Preencher se a informação for requerida e se os resultados do teste foram negativos4 Fill in if required and negative test results.

Formato DSMZ-BP/9 (única página) 0196FORMATO INTERNACIONALDSMZ-BP / 9 Format (Single Page) 0196 INTERNATIONAL FORMAT

<table>table see original document page 118</column></row><table><table> table see original document page 118 </column> </row> <table>

Claims (13)

1. Célula vegetal geneticamente modificada que apresenta umamolécula de ácido nucléico que codifica uma hialuronan sintase estavelmen-te integrado em seu genoma, em que essa célula vegetal adicionalmenteapresenta um aumento na atividade de uma proteína que apresenta a ativi-dade de uma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) e umaumento na atividade de uma proteína que apresenta a atividade de umaUDP-glicose desidrogenase (UDP-GIc-DH) comparada com células vegetaisdo tipo selvagem não geneticamente modificadas correspondentes.1. Genetically modified plant cell that has a nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase stably integrated into its genome, where this plant cell additionally exhibits increased activity of a protein that exhibits glutamine activity: fructose 6 -phosphate amidotransferase (GFAT) and an increase in activity of a protein that exhibits the activity of a UDP-glucose dehydrogenase (UDP-GIc-DH) compared to corresponding non-genetically modified wild-type plant cells. 2. Célula vegetal geneticamente modificada, de acordo com areivindicação 1, a qual apresenta uma molécula de ácido nucléico estranhaestavelmente integrada em seu genoma ou uma pluralidade de moléculas deácidos nucléicos estranhas estavelmente integradas em seu genoma, emque essa molécula de ácido nucléico estranha ou essas moléculas de ácidosnucléicos estranhas aumentam a atividade de uma proteína que apresenta aatividade de uma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransfe rase (GFAT) eaumentam a atividade de uma proteína que apresenta a atividade de umaUDP-glicose desidrogenase (UDP-GIc-DH) comparada com células vegetaisdo tipo selvagem não geneticamente modificadas correspondentes.Genetically modified plant cell according to claim 1, which has a strangely integrated nucleic acid molecule in its genome or a plurality of stably integrated stranded nucleic acid molecules in its genome, wherein such a foreign nucleic acid molecule or these molecules of foreign nucleic acids increase the activity of a protein that exhibits glutamine activity: fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT) increases the activity of a protein that presents activity of a UDP-glucose dehydrogenase (UDP-GIc-DH) compared to cells corresponding non-genetically modified wild-type vegetables. 3. Célula vegetal geneticamente modificada, de acordo com areivindicação 2, na qual uma primeira molécula de ácido nucléico estranhacodifica uma proteína que apresenta a atividade de uma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) e uma segunda molécula de ácido nucléicoestranha codificam uma proteína que apresenta a atividade de uma UDP-glicose desidrogenase (UDP-Gluc-DH).Genetically modified plant cell according to claim 2, wherein a first foreign nucleic acid molecule encodes a protein that exhibits glutamine activity: fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT) and a second nucleic acid molecule encode a protein. which presents the activity of a UDP-glucose dehydrogenase (UDP-Gluc-DH). 4. Célula vegetal geneticamente modificada, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3 que sintetiza um aumento naquantidade de hialuronan comparado com células vegetais que apresentama atividade de uma hialuronan sintase e nenhum aumento na atividade deuma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) e nenhum aumen-to na atividade de uma UDP-glicose desidrogenase.Genetically modified plant cell according to any one of claims 1, 2 or 3 which synthesizes an increase in the amount of hyaluronan compared to plant cells that exhibit activity of a hyaluronan synthase and no increase in glutamine activity: fructose 6-phosphate amidotransferase ( GFAT) and no increase in the activity of a UDP-glucose dehydrogenase. 5. Planta que compreende células vegetais geneticamente modi-ficadas, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.Plant comprising genetically modified plant cells as defined in any one of claims 1 to 4. 6. Material de propagação de um vegetal, como definido na rei-vindicação 5, o qual compreende células vegetais geneticamente modifica-das, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.Plant propagating material as defined in claim 5 which comprises genetically modified plant cells as defined in any one of claims 1 to 4. 7. Parte de um vegetal passível de colheita de uma planta, comodefinido na reivindicação 5, a qual compreende células vegetais geneticamentemodificadas, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.Part of a plant harvestable plant as defined in claim 5 which comprises genetically modified plant cells as defined in any one of claims 1 to 4. 8. Processo para preparação de uma planta que sintetiza hialu-ronan, processo este que compreendea) geneticamente modificar uma célula vegetal, em que a modi-ficação genética compreende etapas i a iii abaixoi) introdução de uma molécula de ácido nucléico estranhaque codifica uma hialuronan sintase na célula vegetalii) introdução de uma modificação genética na célula vege-tal, a modificação genética resultando em um aumento da atividade de umaproteína que apresenta a atividade de uma glutamina:frutose 6-fosfato ami-dotransferase (GFAT) comparada com células vegetais do tipo selvagemnão geneticamente, modificadas correspondentesiii) introdução de uma modificação genética na célula vege-tal, a modificação genética resultando em um aumento da atividade de umaproteína que apresenta a atividade de uma glutamina:frutose 6-fosfatoUDP-glicose desidrogenase comparada com células vegetais do tipo selva-gem não, geneticamente, modificadas correspondentes em que etapas i a iiipodem ser realizadas em qualquer ordem, individualmente, ou quaisquercombinações de etapas i a iii podem ser realizadas simultaneamenteb) regenerar uma planta de células vegetais a partir da eta-pa a);c) gerar, se apropriado, plantas adicionais usando as plantasde acordo com a etapa b), em que, se apropriado, as células vegetais sãoisoladas de plantas de acordo com etapas b) ou c) e as etapas de proces-so a) a c) são repetidas até que uma planta seja gerada, a qual apresentauma molécula de ácido nucléico estranha que codifica uma hialuronan sinta-se e apresenta um aumento na atividade de uma proteína que apresenta aatividade de uma glutamina:frutose 6-fosfato amidotransferase (GFAT) com-parada com células vegetais do tipo selvagem não geneticamente, modifica-das correspondentes e um aumento na atividade de uma proteína que apre-senta a atividade de uma glutamina:frutose 6-fosfato UDP-glicose desidro-genase comparada com células vegetais do tipo selvagem não geneticamen-te modificadas correspondentes.A process for preparing a plant which synthesizes hyalu-ronan, which process comprises) genetically modifying a plant cell, wherein the genetic modification comprises steps ia iii below (i) introducing a foreign nucleic acid molecule encoding a hyaluronan synthase. introduction of a genetic modification in the plant cell, the genetic modification resulting in an increase in the activity of a glutamine-like protein: fructose 6-phosphate ami-dotransferase (GFAT) compared with plant-type cells non-genetically modified, wild-type (iiii) introduction of a genetic modification in the plant cell, the genetic modification resulting in an increase in the activity of a protein that exhibits glutamine activity: fructose 6-phosphateUDP-glucose dehydrogenase compared to jungle-type plant cells corresponding genetically modified non-genetically modified steps ia ii may be performed in any order individually, or any combinations of steps ia iii may be performed simultaneously b) regenerate a plant of plant cells from step a) c) generate, if appropriate, additional plants using the plants according to according to step b), wherein, if appropriate, plant cells are isolated from plants according to steps b) or c) and process steps a) to c) are repeated until a plant is generated which has a A foreign nucleic acid molecule encoding a hyaluronan feels and exhibits an increase in the activity of a glutamine activating protein: fructose 6-phosphate amidotransferase (GFAT) with non-genetically modified, wild-type plant cells and an increase in the activity of a protein presenting glutamine activity: fructose 6-phosphate UDP-glucose dehydrogenase compared to non-wild type plant cells the corresponding genetically modified. 9. Processo para preparação de hialuronan, o qual compreendea etapa de extração de hialuronan de células vegetais geneticamente modifi-cadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, a partir deplantas, como definidas na reivindicação 5, a partir de material de propaga-ção, como definido na reivindicação 6, a partir de partes da planta passívelde colheita, como definida na reivindicação 7, ou a partir de plantas obtení-veis por um processo, de acordo com a reivindicação 8.A process for the preparation of hyaluronan which comprises the step of extracting hyaluronan from genetically modified plant cells as defined in any one of claims 1 to 4 from plants as defined in claim 5 from material of propagation as defined in claim 6 from harvestable plant parts as defined in claim 7 or from plants obtainable by a process according to claim 8. 10. Uso de uma célula vegetal geneticamente modificada, comodefinida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, uma planta, como defi-nida na reivindicação 5, material de propagação, como definida na reivindi-cação 6, partes da planta passível de colheita, como definida na reivindica-ção 7, ou de plantas obteníveis por um processo, como definido na reivindi-cação 8 para preparação de hialuronan.Use of a genetically modified plant cell as defined in any one of claims 1 to 4, a plant as defined in claim 5, propagating material as defined in claim 6, harvestable plant parts, as defined in claim 7, or from plants obtainable by a process as defined in claim 8 for preparing hyaluronan. 11. Composição que compreende células vegetais geneticamen-te modificadas, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.A composition comprising genetically modified plant cells as defined in any one of claims 1 to 4. 12. Processo para preparação de uma composição que compre-ende hialuronan, no qual células vegetais geneticamente modificadas, comodefinidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, plantas como definidasna reivindicação 5, material de propagação como definido na reivindicação 6,partes da planta passível de colheita, de acordo com a reivindicação 7 ouplantas obteníveis por um processo, de acordo com a reivindicação 8 sãousadas.A process for preparing a composition comprising hyaluronan, in which genetically modified plant cells as defined in any one of claims 1 to 4, plants as defined in claim 5, propagating material as defined in claim 6, parts of the plant subject to Harvesting plants according to claim 7 or plants obtainable by a process according to claim 8 are used. 13. Uso de células vegetais geneticamente modificadas, comodefinidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, de plantas como defini-das na reivindicação 5, de material de propagação, como definido na reivin-dicação 6, de partes da planta passíveis de colheita, de acordo com a reivin-dicação 7 ou de plantas obteníveis por um processo, como definido na rei-vindicação 8 para preparação de uma composição, como definido na reivin-dicação 11.Use of genetically modified plant cells as defined in any one of claims 1 to 4 of plants as defined in claim 5 of propagating material as defined in claim 6 of harvestable plant parts; according to claim 7 or plants obtainable by a process as defined in claim 8 for preparing a composition as defined in claim 11.
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