BRPI0615861A2 - semente de arroz, planta, ou uma parte da mesma, mÉtodos para produzir plantas de arroz, para produzir semente de arroz, para produzir uma planta de arroz e para introduzir uma caracterÍstica desejada em cultivar de arroz, pàlen, àvulo, cultura de tecido, e, semente de arroz ou planta de arroz - Google Patents

Abstract

SEMENTES DE ARROZ, PLANTA, OU UMA PARTE DA MESMA, MÉTODOS PARA PRODUZIR PLANTAS DE ARROZ, PARA PRODUZIR SEMENTE DE ARROZ, PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE ARROZ E PARA INTRODUZIR UMA CARACTERÍSTICA DESEJADA EM CULTIVAR DE ARROZ, PàLEN, àVULO, CULTURA DE TECIDO, E, SEMENTE DE ARROZ OU PLANTA DE ARROZ. Um novo cultivar de arroz, designado "CL131", é descrito. A invenção refere-se às sementes de cultivar de arroz "CL131", às plantas de arroz "CL131", e aos métodos para produzir uma planta de arroz pelo cruzamento do cultivar "CL131" consigo memso ou com outra variedade de arroz, e às conversões de gene único de tais plantas. A invenção adicionalmente se refere às sementes de arroz híbrido e às plantas produzidas pelo cruzamento do cultivar "CL131" com outro cultivar de arroz. A invenção adicionalmente se refere aos outros derivados do cultivar "CL131".

Description

"SEMENTE DE ARROZ, PLANTA, OU UMA PARTE DA MESMA5 MÉTODOS PARA PRODUZIR PLANTAS DE ARROZ, PARA PRODUZIR SEMENTE DE ARROZ, PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE ARROZ E PARA INTRODUZIR UMA CARACTERÍSTICA DESEJADA EM CULTIVAR DE ARROZ, PÓLEN, ÓVULO, CULTURA DE TECIDO, E, SEMENTE DE ARROZ OU PLANTA DE ARROZ"

O benefício das datas de depósito do pedido provisório de No. Serial 60/715.690, depositado aos 9 de setembro de 2005, e do pedido não provisório de No. Serial 11/395.557, depositado aos 30 de março de 2006, são reivindicados sob 35 U.S.C. § 119(e) nos Estados Unidos, e são reivindicados sob tratados e convenções aplicáveis em todos os países. As descrições completas dos pedidos de prioridade são pode meio desta incorporadas como referências. CAMPO TÉCNICO

Esta invenção refere-se a um cultivar de arroz novo e distinto, designado 'CL131'.

TÉCNICA ANTERIOR

Arroz é uma colheita agrícola antiga, e é uma das principais colheitas de alimento do mundo. Há duas espécies de cultivares de arroz: Oryza sativa L., o arroz asiático, e O. glaberrima Steud., o arroz africano. Oryza sativa L. constitui virtualmente todo o arroz cultivado do mundo e é a espécie crescida nos Estados Unidos. Há nos Estados Unidos três maiores regiões produtoras: Delta do Mississipi (Arkansas, Mississipi, nordeste da Louisiana, sudeste do Missouri), a Costa do Golfo (sudoeste da Louisiana, sudeste do Texas); e o Vale Central da Califórnia. Veja geralmente Patente dos Estados Unidos de No. 6.911.589.

Arroz é uma colheita semi-aquática que se beneficia das condições de solo inundado durante parte da ou toda a estação de crescimento. Nos Estados Unidos, arroz é tipicamente crescido em solo inundado para otimizar os rendimentos de grãos. Solos argilosos pesados ou solos de marga lodosa com camadas recipientes cerca de 30 cm abaixo da superfície são solos produtores de arroz típicos, porque reduzem a perda de água da percolação do solo. Produção de arroz nos Estados Unidos pode ser amplamente categorizada quer por semeadura a seco quer por semeadura em água. No sistema de semeadura a seco, o arroz é semeado em um leito de semeadura bem preparado com uma semeadura de grãos em sulco ou por disseminação da semente e sua incorporação com um disco ou rastelo. Umidade para a germinação da semente provém da irrigação ou da chuva. Outro método de semeadura a seco é disseminação da semente por aeroplano em um campo inundado, e então imediata drenagem da água do campo. Para o sistema de semeadura a seco, quando as plantas têm alcançado tamanho suficiente (estágio de quatro a cinco folhas), uma inundação permanente rasa de água de 5 a 6 cm de profundidade é aplicada no campo para o restante da estação de colheita.

Um método de semeadura em água é embeber a semente de arroz por 12 a 36 horas para iniciar a germinação, e então disseminar a semente por aeroplano em um campo inundado. As plantas jovens emergem através de uma inundação rasa, ou a água pode ser drenada do campo por um período de tempo curto para intensificar o estabelecimento de muda. Uma inundação rasa é então mantida até que o arroz alcance maturidade. Para ambos os sistemas de produção por semeadura a seco e por semeadura em água, os campos são drenados quando a colheita está madura, e o arroz é colhido 2 a 3 semanas com colhedoras grandes.

Em programas de geração de arroz, cultivadores tipicamente usam os mesmos sistemas de produção que predominam na região. Assim, uma sementeira de geração semeada por sulcos é tipicamente usada pelos cultivadores em uma região onde o arroz é semeado por sulcos, e uma sementeira semeada em água é usada em regiões onde prevalece a semeadura em água. Arroz nos Estados Unidos é classificado em três tipos comerciais primários por tamanho de grão, forma de grão, e composição de endosperma: grão longo, grão médio, e grão curto. Cultivares de grão longo dos U.S. típicos cozinham a seco e estufam quando vaporizados ou fervidos, enquanto que cultivares de grão curto ou de grão médio cozinham úmidos e pegajosos. Cultivares de grão longo têm sido tradicionalmente crescidos nos estados sulinos e geralmente recebem preços comerciais maiores nos U.S.

Embora objetivos de geração específicos variem um pouco em regiões diferentes, rendimento crescente é um objetivo primário em todos os programas. Rendimento de grãos depende, em parte, do número de panículas por área unitária, do número de flósculos férteis por panícula, e do peso de grão por flósculo. Aumentos em qualquer um destes ou de todos estes componentes pode ajudar a melhorar os rendimentos. Variação hereditária existe em cada um destes componentes, e cultivadores podem direta ou indiretamente selecionar aumentos em qualquer um deles.

Há numerosas etapas no desenvolvimento de qualquer germoplasma de planta desejável, novo. Geração de planta inicia com a análise e a definição dos problemas e da debilidade do germoplasma corrente, o estabelecimento do programa de objetivos, e a definição de objetivos de geração. A etapa seguinte é seleção (ou geração) de germoplasma que possui as feições para atender aos objetivos do programa. O objetivo é muitas vezes combinar em uma única variedade uma combinação melhorada de feições desejáveis de duas ou mais linhagens parentais de germoplasma. Estas feições podem incluir coisas tais como maior rendimento de semente, maior resistência à doença ou a insetos, melhores caules e raízes, tolerância a temperaturas baixas, e melhores características agronômicas ou qualidade de grão.

A escolha de métodos de geração e seleção depende do modo W

de reprodução da planta, da hereditariedade da(s) feição(ões) sendo melhorada(s), e do tipo de semente que é usada comercialmente (e.g., híbrido Fb versus cultivares de linhagem pura ou endogâmica). Para feições elevadamente hereditárias, uma escolha de plantas individuais superiores avaliadas em uma única localização algumas vezes pode ser efetiva, enquanto que para feições com hereditariedade mais ou menos complexa, seleção é muitas vezes baseada em valores médios obtidos de avaliações replicadas de familiar de plantas relacionadas. Métodos de seleção incluem seleção de linhagem, seleção de linhagem modificada, seleção de massa, seleção recorrente, e combinações destes métodos.

A complexidade da hereditariedade influencia a escolha do método de geração. Geração por retrocruzamento é usada para transferir um ou uns poucos genes favoráveis para uma feição elevadamente hereditária em um cultivar desejável. Esta abordagem tem sido usada extensivamente para geração de cultivares resistentes à doença. Várias técnicas de seleção recorrente são usadas para melhorar feições quantitativamente herdadas controladas por numerosos genes. O uso de seleção recorrente em colheitas de auto-polinização depende da facilidade de polinização, da freqüência de híbridos bem sucedidos de cada polinização, e do número de descendência híbrida de cada cruzamento bem sucedido.

Linhagens de geração avançada promissoras são totalmente testadas e comparadas com padrões apropriados em ambientes representativos da(s) área(s) algo comercial(ais), tipicamente por três ou mais anos. As melhores linhagens tornam-se candidatas para poucos cultivares comerciais; aqueles ainda deficientes em umas poucas feições podem ser usados como pais para produzir populações novas para seleção adicional.

Estes processos, que acarretam finalmente comercialização e distribuição de híbridos ou cultivares novos, tipicamente demoram 8 a 12 anos desde o tempo de primeiro cruzamento; podem adicionalmente se basear V

no (e ser retardados pelo) desenvolvimento de linhagens de geração melhoradas como precursores. O desenvolvimento de híbridos e cultivares novos é um processo consumidor de tempo que requer planejamento direto preciso e uso eficiente de recursos. Nunca há garantias de um resultado bem sucedido.

Uma tarefa particularmente difícil é a identificação de plantas individuais que são, de fato, geneticamente superiores. Um genótipo de planta resulta de uma interação complexa de genética e ambiente. Um método para identificar uma planta geneticamente superior é observar seu desempenho em relação a outras plantas ambientais e a um cultivar padrão amplamente desenvolvido crescido em um ambiente idêntico. Observações repetidas de localizações múltiplas podem ajudar a proporcionar uma estimativa melhor de seu valor genético.

Objetivo de geração de arroz é desenvolver híbridos e cultivares de arroz superiores, únicos e novos. O cultivador inicialmente seleciona e cruza duas ou mais linhagens parentais, seguido por auto- polinização e seleção, produção de muitas combinações genéticas novas. O cultivador pode gerar bilhões de combinações genéticas diferentes via cruzamento, auto-polinização, e mutação de geração. O cultivador tradicional não tem controle direto em nível molecular. Portanto, dois cultivadores tradicionais trabalhando independentemente um do outro nunca desenvolverão a mesma linhagem, ou até mesmo linhagens muito similares, com as mesmas feições.

Cada ano, o cultivador de planta seleciona germoplasma para avançar para a geração seguinte. Este germoplasma é crescido sob condições geográficas, climáticas, e de solo diferentes. Seleções adicionais são então feitas, durante e no final da estação de crescimento. Os cultivares (ou híbridos) resultantes e suas características são inerentemente imprevisíveis. Isto é porque a seleção tradicional do cultivador ocorre em ambientes únicos, ν-' sem controle em nível molecular, e com potencialmente bilhões de combinações genéticas possíveis diferentes sendo geradas. Um cultivador não pode predizer a linhagem resultante final, exceto possivelmente em um modo muito genérico e aproximado. Ademais, o mesmo cultivador pode não produzir o mesmo cultivar duas vezes, até mesmo partindo com as mesmas linhagens parentais, usando as mesmas técnicas de seleção. Esta variação incontrolável resulta em esforço e gastos substancias no desenvolvimento de cultivares (ou híbridos) de arroz novos superiores; e torna cada novo cultivar (ou híbrido) novo e imprevisível.

A seleção de cruzamentos de híbridos superiores é conduzida ligeiramente diferentemente. Semente híbrida é tipicamente produzida por cruzamentos manuais entre parentais férteis machos ou pelo uso de sistemas genéticos de esterilidade de macho. Estes híbridos são tipicamente selecionados para feições de gene únicas que claramente indicam que uma planta é de fato um híbrido Fi que tem herdado feições de ambos os parentais presumíveis, particularmente o parental macho (porque o arroz normalmente se auto-fertiliza). Tais feições podem incluir, por exemplo, um tipo de planta semi-anã, púbere, praganas, ou cor de apiculus. Dados adicionais sobre linhagens parentais, bem como o fenótipo do híbrido, influenciam a decisão do cultivador quer para continuar com um cruzamento de híbrido particular quer para realizar um cruzamento análogo, empregando linhagens parentais relacionadas.

Métodos de geração de linhagem e seleção recorrente são algumas vezes usados para desenvolver cultivares de populações de geração. Estes métodos de geração combinam feições desejáveis de dois ou mais cultivares ou outras fontes de germoplasma em coleções de geração das quais cultivares são desenvolvidos por auto-polinização e seleção de fenótipos desejados. Os cultivares novos são avaliados para determinar o potencial comercial. 7 !SX Geração de linhagem é muitas vezes usada para melhorar as colheitas de auto-polinização. Dois parentais possuindo feições complementares, favoráveis são cruzados para produzir plantas Fj. Uma população F2 é produzida por auto-polinização de um ou ais FjS. Seleção das plantas individuais superiores pode começar na geração de F2 (ou posterior). Então, iniciando em geração F3 (ou outra subseqüente), plantas individuais são selecionadas. Teste replicado de fileiras de panícula das plantas selecionadas pode iniciar na geração F4 (ou outra subseqüente), tanto para fixar as feições desejadas quanto para melhorar a efetividade de seleção para feições que possuem hereditariedade baixa. Em um estágio avançado de endogamia (e.g., F6 ou F7), as melhores linhagens ou misturas de linhagens fenotipicamente similares são testadas para liberação potencial como cultivares novos.

Métodos de seleção recorrente e de massa também podem ser usados para melhorar populações de colheitas de auto-polinização ou de polinização cruzada. Uma população geneticamente variável de indivíduos heterozigóticos é quer identificada quer criada por intercruzamento de vários parentais diferentes. As plantas de melhor descendência são selecionadas baseado na superioridade individual, na progênie notável, ou na capacidade de combinação excelente. As plantas selecionadas são intercruzadas para produzir uma população nova na qual outros ciclos de seleção são continuados.

Geração por retrocruzamento é muitas vezes usada para transferir genes para uma feição simplesmente herdada, elevadamente hereditária para dentro de uma linhagem endogâmica ou cultivar homozigótico, que é o parental recorrente. A fonte da feição a ser transferida é chamada de parental doador. A planta resultante deve idealmente possuir os atributos do parental recorrente (e.g., cultivar) e a feição nova desejada transferida do parental doador. Após o cruzamento inicial, indivíduos δ possuindo ο fenótipo do doador desejado (e.g., resistência à doença, resistência a inseto, tolerância a herbicida) são selecionados e repetidamente cruzados (retrocruzamento) para o parental recorrente.

O procedimento de descendente de semente única no senso estrito refere-se ao plantio de uma população de segregação, colheita de uma amostra de uma semente por planta, e uso de uma amostra de uma semente para plantar a geração seguinte. Quando a população tiver sido avançada da geração F2 para o nível desejado de endogamia, as plantas das quais linhagens são derivadas seguirão cada uma para os indivíduos F2 diferentes. O número de plantas em uma população declina cada geração devido à falha de algumas sementes em germinar ou de algumas plantas em produzir pelo menos uma semente. Como um resultado, nem todas as plantas F2 originalmente amostradas na população serão representadas por uma progênie quando avanço de geração estiver completado.

Em um procedimento de sementes múltiplas, o cultivador colhe uma ou mais sementes de cada planta em uma população e debulha-as juntas para formar um volume. Parte do volume é usada para plantar a geração seguinte e parte é posta em reserva. O procedimento tem sido referido como técnica de descendente de semente única ou de compartimento-volume. O procedimento de sementes múltiplas tem sido usado para economizar trabalho na colheita. É considerado mais rápido para debulhar panículas por máquina do que para remover uma semente de cada manualmente como no procedimento de semente única. O procedimento de sementes múltiplas também torna possível plantar o mesmo número de sementes de uma população para cada geração endogâmica. Sementes suficientes são colhidas para compensar as plantas que não germinaram ou produziram semente.

Outros métodos de geração comuns e menos comuns são conhecidos e usados na técnica. Veja, e.g., R.W. Allard, Principies of Plant Breeding (John Wiley and Sons, Inc., New York, New York, 1967); N.W. 9 5Η W

Simmonds, Principies of Crop Improvement (Longmans London, 1979); J. Sneep et al., Plant Breeding Perspectives (Pudoc, Wageningen, 1979); e W.R. Fehr5 Principies of Cultivar Development: Theory and Technique (Macmillan Pub., New York, New York5 1987).

Teste apropriado deve detectar falhas maiores e estabelecer o nível de superioridade ou melhoria em cultivares correntes. Em adição à exibição de desempenho superior, tem que haver uma demanda por um cultivar novo que é compatível com padrões industriais ou que cria um comércio novo. A introdução de um cultivar novo pode incorrer em custos adicionais para o produtor de sementes, o cultivador, o processador e o consumidor para tais coisas como propaganda especial e mercadologia, semente alterada e práticas de produção comercial, e utilização de produto novo. O teste precedendo a liberação de um cultivar novo deve levar em consideração custos de pesquisa e de desenvolvimento bem como superioridade técnica do cultivar final. Para os cultivares propagados de semente, tem que ser praticável produzir semente fácil e economicamente.

Em anos recentes, umas poucas variedades e híbridos de arroz tolerantes a herbicida têm sido introduzidas com sucesso no mercado. Veja Patentes U.S. de Nos. 5.545.822; 5.736.629; 5.773.703; 5.773.704; 5.952.553; 6.274.796; e 6.943.280. Pedidos de Patente Internacionais publicados WO 00/27182 e WO 01/85970. Estas plantas de arroz resistentes a herbicida são resistentes a ou tolerantes a herbicidas que normalmente inibem o crescimento de planta de arroz. Assim, cultivadores de arroz agora podem controlar ervas daninhas que previamente eram difíceis de controlar em campos de arroz, incluindo "arroz vermelho". "Arroz vermelho" é uma erva daninha parente do arroz cultivado, e tinha sido difícil de controlar porque realmente pertence à mesma espécie do arroz cultivado. Apenas recentemente, quando arroz tolerante a herbicida se tornou disponível, foi possível controlar arroz vermelho com herbicidas em campos onde arroz cultivado estava crescendo 10 Grf W

contemporaneamente. Há correntemente apenas um número limitado de híbridos e cultivares tolerantes a herbicida comercialmente disponíveis. Há uma necessidade contínua de novos híbridos e cultivares tolerantes a herbicida - isto é, plantas de arroz que não apenas expressam um fenótipo tolerante a herbicida desejado, mas que também possuem outras características agronomicamente desejáveis. Híbridos e cultivares tolerantes a herbicida adicionais proporcionarão aos cultivadores de arroz maior flexibilidade no plantio e no manejo de colheitas. DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Tenho descoberto um novo cultivar de arroz de grão longo, resistente a herbicida, possuindo características superiores de derrubamento, processamento, e rendimento de grãos, que demora cinco anos para desenvolver desde o tempo do primeiro cruzamento. Esta invenção proporciona um cultivar de arroz novo e distinto, designado iCLni'. Esta invenção também se refere às sementes de cultivar de arroz 'CL131', às plantas de arroz 'CL131', e aos métodos para produzir uma planta de arroz por cruzamento da variedade de arroz tCLBl' consigo mesma ou com outra linhagem de arroz. Assim quaisquer tais métodos usando a variedade de arroz 'CL131' são aspectos desta invenção, incluindo venda, retrocruzamento, produção de híbridos, cruzamentos para populações, e outros métodos de geração envolvendo 'CL131'. Plantas híbridas produzidas usando a variedade de arroz 4CLl3 Γ são um parental e também estão dentro do escopo desta invenção.

Em outra modalidade, esta invenção permite plantas convertidas de gene único de tCLOl'. O gene único transferido pode ser um alelo dominante ou recessivo. Preferivelmente, o gene único transferido confere uma feição tal como resistência a insetos, a uma ou mais doenças bacterianas, fungicas ou virais, esterilidade ou fertilidade masculina, qualidade nutricional aumentada, qualidades de processamento melhoradas, ou uma fonte adicional de resistência a herbicida. O gene único pode ser um gene de arroz naturalmente ocorrente ou um transgene introduzido através de técnicas de engenharia genética conhecidas na técnica. O gene único também pode ser introduzido através de técnicas de retrocruzamento tradicionais ou técnicas de transformação genética conhecidas na técnica.

Em outra modalidade, esta invenção proporciona células regeneráveis para uso em cultura de tecido de planta de arroz 'CL131'. A cultura de tecido pode permitir a regeneração de plantas possuindo características fisiológicas e morfológicas de planta de arroz 'CL131' e de plantas regeneradas possuindo substancialmente o mesmo genótipo que o da planta de arroz iCLDl'. Técnicas de cultura de tecido para arroz são conhecidas na técnica. As células regeneráveis em cultura de tecido podem ser derivadas de fontes tais como embriões, protoplastos, células meristemáticas, calo, pólen, folhas, anteras, pontas de raiz, flores, sementes, panículas, ou caules. Em adição, a invenção proporciona plantas de arroz regeneradas de tais culturas de tecido.

DEFINIÇÕES

As seguintes definições aplicam-se a todo o relatório descritivo e às reivindicações, a não ser que o contexto indique claramente de outro modo:

"Dias para formação de cabeça de 50%". Número médio de dias da semeadura até o dia quando 50% de todas as panículas são exibidas pelo menos parcialmente através da bainha da folha. Uma medida de maturidade.

"Rendimento de grãos". Rendimento de grãos é medido em quilograma por acre, em umidade de 12,0%. Rendimento de grãos depende de numerosos fatores, incluindo o número de panículas por área unitária, o número de flósculos férteis por panículo, e peso de grãos por flósculo.

"Percentagem de derrubamento". Derrubamento é uma classificação subjetivamente medida, e é a percentagem de caules de planta inclinados ou completamente caídos no solo antes da colheita.

"Comprimento de grão (L)". Comprimento de um grão de arroz, ou comprimento médio, medido em milímetros.

"Largura de grão (W)". Largura de um grão de arroz, ou largura média, medida em milímetros.

"Razão de comprimento / largura (L/W)". Esta razão é determinada pela divisão do comprimento médio (L) pela largura média (W).

"Peso de 1.000 grãos". O peso de 1.000 grãos de arroz, medido

em gramas.

"Umidade de colheita". A umidade percentual no grão quando

colhido.

"Altura de planta". Altura de planta em centímetros, medida da superfície de solo até a ponta da panícula estendida na colheita.

"Percentual aparente de amilose". A percentagem do amido de endosperma de arroz moído que é amilose. A percentagem aparente de amilose é uma característica de grão importante que afeta o comportamento de cozimento. Grãos longos padrão contêm 20 a 23 por cento de amilose. Grãos longos tipo Rexmont contêm 24 a 25 por cento de amilose. Grãos curtos e médios contêm 13 a 19 por cento de amilose. Arroz ceroso contém zero por cento de amilose. Valores de amilose, como a maioria das características de arroz, dependem do ambiente. "Aparente" refere-se ao procedimento para determinar amilose, que também pode envolver medição de algumas moléculas de amilopectina de cadeia longa que se ligam em algumas moléculas de amilose. Estas moléculas de amilopectina realmente atuam similarmente à amilose na determinação de características de cozimento mole ou duro.

"Valor de difusão de álcali". Um índice que mede a extensão da desintegração de núcleo de grão de arroz moído quando em contato com 13 o? solução de álcali diluída. Um indicador de temperatura de gelatinização. Grãos longos padrão possuem um valor de difusão de álcali de 3 a 5 (temperatura de gelatinização intermediária).

"Viscosidade de pico". A viscosidade máxima alcançada durante o aquecimento quando um protocolo específico de instrumento, padronizado é aplicado em uma lama definida de lama - farinha de arroz.

"Viscosidade inferior A viscosidade mínima após o pico, normalmente ocorrendo quando a amostra começa a esfriar.

"Viscosidade final". Viscosidade no final do teste ou da pasta

fria.

• "Decomposição". A viscosidade de pico menos a viscosidade

de pasta quente.

"Setback?'. Setback 1 é a viscosidade final menos a viscosidade inferior. Setback 2 é a viscosidade final menos a viscosidade de pico.

"Viscosidade RVA". Viscosidade, conforme medida por um

Rapid Visco Analyzer, é um instrumento de laboratório novo mas amplamente usado para examinar viscosidade de pasta ou capacidade de espessamento de arroz moído durante o processo de cozimento.

"Viscosidade de pasta quente". Medição de viscosidade de

lama de água / farinha de arroz após ser aquecida para 95°C. Valores inferiores indicam tipos de cozimento mais mole e mais pegajoso de arroz.

"Viscosidade de pasta fria". Medição de viscosidade de lama de água / farinha de arroz após ser aquecida para 95°C e uniformemente esfriada para 50°C. Valores menores do que 200 indicam tipos de cozimentos

mais moles de arroz.

"Alelo". Uma alelo é qualquer uma de uma ou mais formas alternativas do mesmo gene. Em um organismo ou célula diplóide, os dois alelos de um dado gene ocupam Ioci correspondentes em um par de cromossomos homólogos. 14 oe> w

"Retrocruzamento". Retrocruzamento é iam processo no qual um cultivador repetidamente cruza progênie de híbrido de volta para um ou mais dos parentais, por exemplo, cruzamento de um híbrido de primeira geração Fi com um dos genótipos parentais do híbrido Fi9 e então cruzamento de um híbrido de segunda geração F2 com o mesmo genótipo parental, e assim por diante.

"Essencialmente todas as características fisiológicas e morfológicas". Uma planta possuindo "essencialmente todas as características fisiológicas e morfológicas" de uma planta especificada refere-se a uma planta possuindo as mesmas características fisiológicas e morfológicas gerais, exceto aquelas características derivadas de um gene convertido particular.

"Loci de feição quantitativa (QTL)". Loci de feição quantitativa (QTL) referem-se aos loci genéticos que em algum grau controlam feições numericamente mensuráveis, geralmente feições que estão continuamente distribuídas.

"Regeneração". Regeneração refere-se ao desenvolvimento de uma planta a partir da cultura de tecido.

"Gene único convertido (conversão)". Gene único convertido (conversão) inclui plantas desenvolvidas por retrocruzamento no qual essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas de uma variedade parental são recuperadas, ao mesmo tempo retendo um gene único transferido para a variedade via cruzamento e retrocruzamento. O termo também se refere à introdução de um gene único através de técnicas de engenharia genética conhecidas na técnica.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO

tCLlSl' é uma variedade de arroz de grão longo, tolerante a herbicida, de rendimento alto, de estatura semi-anã, de maturação muito precoce que foi desenvolvida na Louisiana Agricultural Experiment Station (Rice Research Station) em Crowley, Louisiana. 'CL131' é uma seleção 15 Go w

inicial designada 00CR387 de um cruzamento de linhagem CFX18//ARl 142/LA2031. Foi desenvolvida de um volume de geração F4. O parental feminino foi iCFXl8/ que havia sido liberado comercialmente como cultivar 'CL16T. Avariedade parental tolerante a herbicida 'CFXl8' também é conhecida como tPWC 16,' para a qual amostras estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC) como depósito de patente PTA- 904. O parental masculino foi uma linhagem experimental que não tem sido liberada como uma variedade comercial. A linhagem parental masculina foi desenvolvida do cruzamento ARl 142/LA2031. ARl 142 foi liberada Λ O comercialmente como o cultivar de grão longo 'Kaybonnet' pela Arkansas Agricultural Experiment Station em Fayetteville, Arkansas. LA2031 foi uma linhagem de grão longo avançada do programa de geração de arroz de Louisiana que não tem sido liberada como uma variedade comercial. Amostras de sementes de LA2031 experimental estão disponíveis no inventor ou no cessionário do presente pedido sem cobrança sob pedido por escrito, desde que estoques viáveis de semente permaneçam disponíveis. Contudo, tanto o inventor quanto o cessionário não se incubem de manter indefinidamente estoques viáveis de semente LA2031.

Após a realização do cruzamento inicial, a população foi inicialmente crescida como cinco plantas Fi, designadas como 01T034. Sementes destas plantas foram acumuladas e plantadas como lotes F2 em Puerto Rico Winter Nursery, designado como 01B268-300-PR. Cem panículas foram selecionadas da população F2 e crescidas como fileiras de panículas em Puerto Rico. Cinco panículas foram selecionadas da fileira F3, designada como 02P2056-PR, e plantadas como fileiras F4, designada como 0283305. Quinze panículas da fileira F4 foram selecionadas e colhidas como semente em volume. Esta colheita em volume foi a base da variedade iCLni'. Em gerações iniciais, as plantas ou linhagens foram selecionadas para superioridade de fenótipo para características tais como estatura curta, 16 GiL precocidade, arquitetura de planta, forma e uniformidade de semente, vigor de muda, número de brotos, e tamanho de grão. Em gerações posteriores (aumento de semente), a linhagem foi selecionada para uniformidade e pureza ambas dentro e entre as fileiras de panículas. Semente desta fileira acumulada foi introduzida em um programa de teste de linhagem experimental. Esta linhagem também foi testada em várias localizações na área de produção de arroz da Louisiana.

O teste de linhagem experimental verificou um rendimento de grãos médio de 2.957 kg/A para tCLlSl', comparado com 2.928 kg/A para 'CL161'. Os rendimentos de moagem médios (i.e., a razão de peso de grão moído para peso de grão não moído) em 120 g kg"1 de umidade foram de 67.2 % a 72,1 % para 'CL131', e 66,2 % a 70,8 % para 'CL161'. 'CL131' pareceu ser ligeiramente mais resistente à brusone e um pouco mas suscetível a "cabeça estéril" do que 'CL161'. Suscetibilidade à mela da bainha pareceu similar para as duas linhagens. O período de emergência para formação de cabeça de 50% para 'CL131' ocorreu um dia mais cedo. 'CL131' alcançou umidade de colheita dois a três dias mais cedo do que 'CLl61' (de formação de cabeça de 50% até umidade de nível de colheita). Assim, a linhagem nova foi quatro a cinco dias mais precoce em maturidade total. 'CL131' foi em média 7,6 centímetros mais curta em altura de plana, e exibiu resistência muito melhor ao derrubamento em comparação com 'CL161'.

Durante cada geração e seleção, fileiras de variantes foram removidas ou "solicitadas" do campo. Inspeções visuais de fileiras-cabeça, incluindo caracteres tais como data de formação de cabeça, altura da plana, tamanho e forma do grão, e cor da planta foram usados para confirmar a pureza do cultivar. A linhagem foi crescida em fileiras de panículas, e re- selecionada e purificada por dois anos consecutivos. Mil panículas foram selecionadas de uma população de 15 fileiras de panículas. O material foi plantado (como 4.000 fileiras de panículas) em Puerto Rico Winter Nursery, γη Óc^ localizada próxima de Lajas, Puerto Rico. Esta população foi selecionada como descrito acima antes da colheita (213 fileiras foram eliminadas), e a semente cultivadora acumulada foi retornada para a Rice Research Station em Crowley, Louisiana.

Esta semente foi usada para plantar um campo de cultivador / fundação de 8,2 acres. Uma porção da mesma semente foi designada como semente de fundação, e foi usada para semear 121 acres para começar o processo de produção registrada próxima a Danbury, Texas. Classes de semente 'CL131' incluem cultivador, fundação, registrado, e certificado. Semente fundação pode ser usada para produzir mais semente fundação, se necessária, sob os critérios do cultivador.

'CL131' tem sido observada em aumento de semente e de campos de produção por três gerações, onde tem sido observada que mantém uniformidade e estabilidade das feições descritas neste relatório descritivo.

Foi observado que cultivar de arroz tCLBl' possui características morfológicas e outras características (baseadas primariamente nos dados coletados em Crowley, Louisiana):

INFORMAÇÃO DE DESCRIÇÃO DE VARIEDADE MATURIDADE (Crowley, Louisiana a 165 kg N/ha): Dias para maturar (formação de cabeça de 50%): 86 1 dia antes de 'CL161'

Classe de maturidade (formação de cabeça de 50% - Louisiana): Início (86-95 dias) a formação de cabeça de 50%

COLMO: (Graus da perpendicular após floração) Ângulo: ereto (menos do que 30 graus)

Comprimento: 94 cm (nível do solo para topo de panícula estendida sobre caule principal)

Mais curto do que 'CLlól' em 7,6 cm Classe de altura: semi-anã 18 £3 Cor de internódio (após floração): creme Resistência (resistência ao derrubamento): forte FLOR APICAL: (após formação de cabeça) Comprimento: 31 cm Largura: 10 mm

Pubescência: glabra

Ângulo de folha (após formação de cabeça): ereto Cor de lâmina: verde Cor de bainha de folha basal: verde LÍNGULA:

Cor (estado vegetativo tardio): branca Forma: aguda a acuminada Cor do colar (estado vegetativo tardio): incolor Cor de aurícula (estado vegetativo tardio): incolor PANÍCULA:

Comprimento: 23 cm Tipo: intermediário Ramificação secundária: moderada Exerção (próxima à maturidade): >95% Eixo: recurvado

Despedaçamento: baixo (3%) Debulhabilidade: fácil GRÃO (espigueta):

Praganas (após formação de cabeça total): normalmente sem

praganas, algumas praganas curtas

Cor de apiculus (na maturidade): púrpura pálida Cor do estigma: branca

Pubescência de pálea e de glumela inferior: glabra Esterilidade de espigueta (na maturidade): elevadamente fértil GRÃO (semente):

Cor da capa da semente: marrom clara

Tipo de endosperma: não-glutinoso (não-ceroso)

Translucidez do endosperma: transparente

Gessamento do endosperma: baixo (menor do que 10% da

Perfume: não-perfumado

Classe de forma (razão de comprimento/largura): Arrozal — Longo (3,4:1 ou maior) Marrom — Longo (3,1:1 ou maior) Moído — Longo (3,0:1 ou maior)

Medições: ___

Grãos Compriment o(L) (mm) Largura (W) (mm) Razão de L/W Espessura (mm) 1000 (gramas) Arrozal 9,06 2,53 3,58 2,03 19,8 Marrom 7,14 2,22 3,22 1,72 17,1 Moído 6,62 2,18 3,04 1,67 16,8

Rendimento de moagem (% de arroz de núcleo de grão inteiro (cabeça) para arroz em casca): 67,2 % Proteína (NIR): 7,18 Amilose: 24,0

Valor de difusão de álcali: 3,9 (solução de KOH 1,5%) Tipo de temperatura de gelatinização: intermediário Viscosidade de pasta amilográfica (Rapid Visco Amylograph -

RVU)

Pico274,7

Pasta quente 163,3

Esfriada304,8

Dimensões de núcleo de grão e dados químicos preliminares de cereal indicaram que tCLl3 Γ possui as características de cozimento de

(>90%)

amostra) 20 &ό arroz de grão longo dos Estados Unidos.

RESISTÊNCIA À TEMPERATURA BAIXA: Germinação e vigor da muda: média Floração (fertilidade da espigueta): média VIGOR DA MUDA NÃO RELACIONADO COM TEMPERATURA BAIXA: Vigor: médio

RESISTÊNCIA À DOENÇA:

Queima da bainha (Rhizoctonia solani): suscetível

Brusone (Pyricularia grisea): moderadamente suscetível

Mancha parda estreita (Cercospora janseana): suscetível

Carvão das folhas {Entyloma oryzae): moderadamente

suscetível

Mancha parda (Cochiobolus miyabeanus): moderadamente

suscetível

DISTÚRBIO STRAIGHTHEAD: moderadamente suscetível RESISTÊNCIA A INSETO: gorgulho aquático do arroz (Lissorhoptrus oryzophilus): suscetível

A variedade é resistente aos herbicidas de imidazolinona. Esta resistência foi herdada do parental 'CLl61'. 'CL161' contém o gene para resistência de um programa de geração por mutação induzida. O gene permite que 'CL131' seja usado com herbicidas e tecnologia de arroz Clearfield™. Este sistema usa as variedades resistentes, juntamente com os herbicidas imazetapir e imazamox (ou outros herbicidas de imidazolinona ou sulfonil- uréia), para o controle seletivo de ervas daninhas, incluindo arroz vermelho. Veja, geralmente Patente U.S. de No. 6.943.280.

Tabela 1 mostra o desempenho de qualidade de grão e agronômico de 'CL131'durante testes em Crowley, Louisiana. Tabela 1.

ID Vigor1 Formação Alturaj Derruba Rendimento5 Inteiro6 Total de cabeça2 -mento4 'CL13 Γ 5 86 94 0 6520 67.2 72.1

1. Classificação subjetiva do vigor de muda - escala de 1-9, com números inferiores indicando níveis mais altos de vigor.

2. Dias de emergência para formação de cabeça de 50%.

3. Altura da planta (cm) da linha do solo até a ponta da panícula estendida sobre o caule principal.

4. Derrubamento - percentagem de plantas derrubadas na maturidade da colheita. ("0" = nenhuma foi observada derrubada)

5. Rendimento — em kg por acre, convertido para umidade de

grão de 12%.

6. Moagem — inteiro — (percentagem de arroz de núcleo de

grão inteiro (cabeça) para arroz em casca).

7. Moagem — total — (percentagem de arroz total para arroz

em casca).

Esta invenção também se refere aos métodos para produzir uma planta de arroz pelo cruzamento de uma primeira planta de arroz parental com uma segunda planta de arroz parental, no qual a primeira ou segunda planta de arroz é uma planta de arroz da linhagem 'CL131'. Ademais, ambas a primeira e segunda plantas de arroz parental podem ser do cultivar 'CL131\ Portanto, métodos usando o cultivar 'CL131' são parte desta invenção, incluindo cruzamento, venda, retrocruzamento, geração híbrida, cruzamento para populações, e outros métodos de geração discutidos no início deste relatório descritivo, e outros métodos de geração conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica. Quaisquer plantas usando cultivar 'CL13T como um parental ou ancestral estão dentro do escopo desta invenção. Por exemplo, esta invenção também se refere aos métodos

para produzir uma planta de arroz híbrida de primeira geração por cruzamento de uma primeira planta de arroz parental com uma segunda planta de arroz parental, no qual quer a primeira quer a segunda planta de arroz parental é 22 ÓT . W

4 CL13 Γ. Ademais, esta invenção também se refere aos métodos para produzir uma linhagem de arroz híbrido derivada de 'CL131' pelo cruzamento de 'CL131' com uma segunda planta de arroz, e crescimento da semente de progênie. As etapas de cruzamento e de crescimento podem ser repetidas quaisquer números de vezes. Métodos de geração usando a linhagem de arroz iCL 13 Γ são considerados parte desta invenção, não apenas retrocruzamento e produção de híbrido, mas também venda, cruzamentos para populações, e outros métodos de geração conhecidos na técnica.

Se desejado, qualquer um dos parentais em um tal cruzamento, .10 'CL131' ou o outro parental, através de técnicas conhecidas na técnica pode ser produzido em forma masculina estéril.

Outras modalidades da invenção

Como aqui usado, o termo "planta" inclui células de planta, protoplastos de planta, células de planta de cultura de tecido das quais plantas de arroz podem ser regeneradas, caules de planta, cepos de planta, e células de planta que estão intactos em plantas ou partes de planta, tais como pólen, flores, embriões, óvulos, sementes, vagens, folhas, caules, anteras e semelhantes. Assim, outro aspecto desta invenção é proporcionar células que, sob crescimento e diferenciação, produzem um cultivar possuindo essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas de 'CL131\

Técnicas para transformação com e expressando genes estruturais desejados e células cultivadas são conhecidas na técnica. Também, como conhecido na técnica, arroz pode ser transformado e regenerado de tal modo que são obtidas plantas inteiras contendo e expressando os genes desejados sob controle regulatório. Descrições gerais de repórter genes e vetores de expressão em planta e protocolos de transformação podem ser encontradas, por exemplo, em Gruber et ai, "Vectors for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology" 23 Ç>% em Glich et ai. (Eds. pp. 89-119, CRC Press, 1993). Por exemplo, cassetes de gene e vetores de expressão com o repórter GUS estão disponíveis na Clone Tech Laboratories, Inc. (Paio Alto, Calif.), e cassetes de gene e vetores de expressão com repórter luciferase estão disponíveis em Promega Corp. (Madison, Wis.). Métodos gerais de cultivar tecidos de planta são proporcionados, por exemplo, por Maki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" em Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich et al., (Eds. pp. 67-88 CRC Press, 1993); por Phillips et al., "Cell-Tissue Culture and In-Vitro Manipulation" em Corn & Corn ,10 Improvement, 3rd Edition; e por Sprague et al., (Eds. pp. 345-387) American Society of Agronomy Inc., 1988. Métodos de introduzir vetores de expressão em tecido de planta incluem a infecção direta ou a co-cultura de células de planta com Agrobacterium tumefaciens, Horsch et al., Science, 227:1229 (1985). Descrições de vetores de Agrobacterium e de métodos para transferência de gene mediada por Agrobacterium são proporcionadas por Gruber et al., supra.

Métodos úteis incluem mas não são limitados aos vetores de expressão introduzido em tecidos de planta usando um método de transferência de gene direta tal como liberação mediada por projétil, injeção de DNA, eletroporação e semelhantes. Mais preferivelmente vetores de expressão são introduzidos em tecidos de planta usando liberação de meio de microprojétil cm transformação mediada por Agrobacterium ou por dispositivo biolítico. Plantas transformadas obtidas com o germoplasma de 'CL131' são intencionadas para estarem dentro do escopo desta invenção. A presente invenção também proporciona plantas de arroz

regeneradas de uma cultura de tecido da planta híbrida ou variedade iCL 13 Γ. Como é conhecido na técnica, cultura de tecido pode ser usada para a regeneração in vitro de uma planta de arroz. Por exemplo, veja Chu, Q. R. et al. (1999) "Use of bridging parents with high another culturability to improve 24 Íof> plant regeneration and breeding value in rice", Rice Biotechnology Quarterly, 38:25-26; Chu, Q. R. et aL, ttA novel plant regeneration médium for rice anther culture of Southern U.S. crosses", Rice Biotechnology Quarterly, 35:15-16 (1998); Chu, Q. R. et al.? "A novel basal médium for embryogenic callus induction of Southern US crosses", Rice Biotechnology Quarterly, 32:1920 (1997); e Oono, K., "Broadening the Genetic Variability By Tissue Culture Methods", Jap. .1 Breed., 33 (Supp. 2), 306-307 (1983). Assim, outro aspecto desta invenção é proporcionar células que, sob crescimento e diferenciação, produzem plantas de arroz possuindo todas, ou essencialmente todas, as características fisiológicas morfológicas da variedade 'CL131\

A não ser que o contexto indique de outro modo, referências no relatório descritivo e nas reivindicações a 4CLl3 Γ devem ser entendida para incluírem conversões de gene único de tCLHl', esterilidade masculina, outras fontes de resistência a herbicida, resistência a doença bacteriana, fungica ou viral, resistência a inseto, fertilidade masculina, qualidade nutricional melhorada, uso industrial, estabilidade de rendimento e aumento de rendimento.

Duncan et ai, Planta, 165:322-332 (1985) reflete que 97 % das plantas cultivadas que produziram calo foram capazes de regeneração de planta. Experimentos subseqüentes com ambos híbridos e endogâmicos produziram 91% de calo regenerável que produziu plantas. Em um outro estudo, Songstad et al., Plant Cell Reports, 7:262-265 (1988) relataram adições de vários meios que intensificaram a regenerabilidade do calo de duas linhagens endogâmicas. Outros relatórios publicados também indicam que tecidos "não-tradicionais" são capazes de produzir embriogênese somática e regeneração de planta. Κ. P. Rao et aL, Maize Genetics Cooperation Newsletter, 60:64-65 (1986), refere-se à embriogênese somática de culturas de calo de gluma e Β. V. Conger et al, Plant Cell Reports, 6:345-347 (1987) relataram embriogênese somática de culturas de tecido de segmentos de folha 25 ><9 de milho. Estes métodos de obtenção de plantas são rotineiramente usados com uma taxa alta de sucesso.

Cultura de tecido de milho é descrita em Pedido de Patente Européia de No. 1.60.390. Procedimentos de cultura de tecido de milho, que podem ser adaptados para uso com arroz, também são descritos em Green et ai, "Plant Regeneration in Tissue Culture of Maize", Maize for Biological Research (Plant Molecular Biology Association, Charlottesville, Va., pp. 367- 372, 1982) e em Duncan et al., ttThe Production of Callus Capable of Plant Regeneration from Immature Embryos of Numerous Zea Mays Genotypes", 165 Planta, 322:332 (1985). Assim, outro aspecto desta invenção é proporcionar células que, sob crescimento e diferenciação, produzem plantas de arroz possuindo todas, ou essencialmente todas, as características fisiológicas e morfológicas de linhagem de arroz híbrido 'CLl31'. Veja T.P. Croughan et al., (Springer-Verlag, Berlin, 1991) Rice (Oryza sativa. L): ttEstablishment of Callus Culture and the regeneration of Plants", em Biotechnology in Agriculture and Forestry (19-37).

Com o advento das técnicas de biologia molecular que permitem o isolamento e a caracterização de genes que codificam produtos de proteína específicos, agora é possível rotineiramente engenhar genomas de planta para incorporar e expressar genes estranhos, ou versões adicionais ou modificadas de genes nativos, ou endógenos (talvez dirigidos por promotores diferentes) com o objetivo de alterar as feições de uma planta em uma maneira específica. Tais genes estranhos, adicionais, e modificados são aqui referidos coletivamente como "transgenes." Durante os últimos 15 a 20 anos, vários métodos para produzir plantas transgênicas têm sido desenvolvidos, e a presente invenção, em modalidades particulares, também se refere às versões transformadas de tCLHl'.

É construído um vetor de expressão que funcionará em células de planta. Um tal vetor compreende uma seqüência codificadora de DNA sob o controle de ou operacionalmente ligado em um elemento regulatório (e.g., um promotor). 0 vetor de expressão pode conter uma ou mais tais combinações de elemento regulatório / seqüência codificadora operacionalmente ligado. O(s) vetor(es) pode(m) estar na forma de um plasmídeo, e pode(m) ser usado(s) sozinho(s) ou em combinação com outros plasmídeos para proporcionar plantas de arroz transformadas.

Vetores de expressão

Vetores de expressão comumente incluem pelo menos um "marcador" genético, operacionalmente ligado em um elemento regulatório (e.g., um promotor) que permite que células transformadas contendo o marcador sejam recuperadas quer por seleção negativa, Le., inibição de crescimento das células que não contém o gene marcador selecionável, quer por seleção positiva, i.e., triagem do produto codificado pelo marcador genético. Muitos genes marcadores selecionáveis comumente usados para transformação de planta são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, genes que codificam enzimas que metabolicamente desintoxicam um inibidor químico seletivo tal como um antibiótico ou um herbicida, ou genes que codificam um alvo alterado que é insensível a um tal inibidor. Métodos de seleção positiva também são conhecidos na técnica.

Por exemplo, um gene marcador selecionável comumente usado para transformação de planta é aqueles para neomicina fosfotransferase II (nptll), isolado de transposon Tn5, cuja expressão confere resistência à canamicina. Veja Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80:4803 (1983). Outro gene marcador selecionável comumente usado é o gene de higromicina fosfotransferase, que confere resistência ao antibiótico higromicina. Veja Vanden Elzen et al., Plant MoL Biol., 5:299 (1985).

Genes marcadores selecionáveis adicionais de origem bacteriana que conferem resistência a um ou mais antibióticos incluem gentamicina acetil-transferase, estreptomicina fosfotransferase, 27 rKL aminoglicosídeo-3 '-adenil transferase, e o determinante de resistência à bleomicina. Hayford et al, Plant Physiol, 86:1216 (1988), Jones et aL, MoL Gen. Genet., 210:86 (1987), Svab et al., Plant MoL BioLs 14:197 (1990); Plant MoL BioLs 7:171 (1986). Outros genes marcadores selecionáveis conferem resistência a herbicidas tais como glifosato, glufosinato, ou broxinil. Comai et al.s Nature, 317:741-744 (1985); Gordon-Kamm et aL, Plant Cells 2:603-618 (1990); e Stalker et al., Science, 242:419-423 (1988).

Genes marcadores selecionáveis para transformação de planta de origem não bacteriana incluem, por exemplo, di-hidrofolato redutase de camundongo, 5-enol-piruvil-shikimato-3-fosfato-sintase de planta, e aceto- lactato-sintase de planta. Eichholtz et aL, Somatic Cell MoL Genet. 13:67 (1987); Shah et al., Science, 233:478 (1986); e Charest et aL, Plant Cell Rep., 8:643 (1990).

Outra classe de genes marcadores para transformação de planta emprega triagem de células de planta presumivelmente transformadas, em vez de seleção para resistência a uma substância tóxica tal como antibiótico. Estes genes marcadores são particularmente úteis para quantificar ou visualizar o padrão espacial de expressão de um gene em tecidos específicos, e são função respiratória enfraquecida referidos como genes repórter porque podem ser fusionados no gene alvo ou na seqüência regulatória. Genes repórter comumente usados incluem glicuronidase (GUS), galactosidase, luciferase, cloranfenicol, e acetil-transferase. Veja Jeffersonj R. A, Plant MoL Biol. Rep., 5:387 (1987); Teeri et al, EMBO J, 8:343 (1989); Koncz et aL, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 84:131 (1987); e DeBlock et al, EMBO J, 3:1681 (1984). Outra abordagem para identificar eventos de transformação relativamente raros tem sido o uso de um gene que codifica um regulador constitutivo dominante da rota de pigmentação de antocianina de Zea mays. Ludwig et al, Science, 247:449 (1990).

O gene da Proteína Fluorescente Verde (GFP) tem sido usado 'W

como um marcador para expressão de gene em células procarióticas e eucarióticas. Veja Chalfie et aL, Science, 263:802 (1994). GFP e mutantes de GFP podem ser usados como marcadores selecionáveis.

Genes incluídos em vetores de expressão são dirigidos por uma seqüência de nucleotídeos compreendendo um elemento regulatório, por exemplo, um promotor. Muitos promotores adequados são conhecidos na técnica, como o são outros elementos regulatórios que podem ser usados quer sozinhos quer em combinação com promotores.

Como aqui usado, "promotor" refere-se a uma região de DNA a montante do sítio de iniciação de transcrição, uma região que está envolvida no reconhecimento e na ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um "promotor de planta" é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de planta. Exemplos de promotores sob o controle desenvolvimental incluem promotores que preferivelmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos de xilema, traqueóides, ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "tecido-preferidos". Promotores que iniciam a transcrição apenas em certo tecido são referidos como "tecido-específicos" Um promotor específico para "tipo de célula" primariamente dirige a expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" é um promotor que está sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem induzir a transcrição pelos promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Promotores tecido-específicos, tecido-preferidos, específicos para tipo de célula, e induzíveis são exemplos de promotores "não- constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor quantidade efetiva é geralmente ativo sob a maioria das condições ambientais.

A.Promotores induzíveis

Um promotor induzível é operacionalmente ligado em um W

gene para expressão em arroz. Opcionalmente, o promotor induzível é operacionalmente ligado em uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma seqüência de sinal que é operacionalmente ligada em um gene para expressão em arroz. Com um promotor induzível a velocidade de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor.

Qualquer promotor induzível adequado pode ser usado na presente invenção. Veja Ward et ai., Plant MoL BioLs 22:361-366 (1993). Exemplos incluem aqueles do sistema ACEI, que responde ao cobre, Mefl et aL, PNAS, 90:4567-4571 (1993); gene In2 de milho, que responde aos protetores contra herbicida de benzeno-sulfonamida, Hershey et aL, MoL Gen

I

Genetics, 227:229-237 (1991); Gatz et aL, Mol. Gen. Genetics, 243:32-38 (1994); e repressor Tet de TnlO, Gatzs Mol. Gen. Genetics, 227:229-237 (1991). Um promotor induzível preferido é um que responde a um agente indutor ao qual plantas normalmente não respondem, por exemplo, o promotor induzível de um gene de hormônio esteroidal, cuja atividade de transcrição é induzida por um hormônio glicocorticosteroidal. Veja Schena et aL, Proc. NatL Acad. Sci., U.S.A. 88:0421 (1991).

B.Promotores constitutivos

Um promotor constitutivo é operacionalmente ligado em um gene para expressão em arroz, ou o promotor constitutivo é operacionalmente ligado em uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma seqüência de sinal que é operacionalmente ligada em um gene para expressão em arroz.

Promotores constitutivos também podem ser usados na presente invenção, Exemplos incluem promotores de vírus de planta tal como o promotor 35S do vírus do mosaico do tabaco, Odell et aL, Nature, 313:810- 812 (1985), e os promotores do gene de actina do arroz, McElroy et aL, Plant Cells 2:163-171 (1990); de ubiquitina, Christensen et aL, Plant Mol. BioLs 12:619-632 (1989) e Christensen et aL, Plant Mol. BioL 18:675-689 (1992); pEMU, Last et ai, Theor. AppL Genets 81:581-588 (1991); MAS, Velten et al., EMBO J., 3:2723-2730 (1984); e de histona H3 de milho, Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics, 231:276-285 (1992) e Atanassova et al., Plant Journal, 2

(3): 291-300(1992).

Um promotor ALS (AHAS), tal como o fragmento 5' de Xbal/Ncol do gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma seqüência de nucleotídeos similar ao citado fragmento de Xbal/Ncol), pode ser usado como um promotor constitutivo. Veja Pedido PCT WO 96/30530. O promotor de um gene ALS (AHAS) de arroz também pode ser usado. Veja as seqüências descritas em Pedido PCT WO 01/85970; e Patente U.S. de No. 6.943.280.

C- Promotores tecido-específicos ou tecido-preferidos

Um promotor tecido-específico é operacionalmente ligado em um gene para expressão em arroz. Opcionalmente, o promotor tecido- específico é operacionalmente ligado em uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma seqüência de sinal que é operacionalmente ligada em um gene para expressão em arroz. Plantas transformadas produzem o produto de expressão do transgene exclusiva, ou preferencialmente, em tecido(s) específíco(s).

Qualquer promotor tecido-específico ou tecido-preferido pode ser usado na presente invenção. Exemplos de promotores tecido-específicos ou tecido-preferidos incluem aqueles do gene de faseolina, Murai et al., Science, 23:476-482 (1983), e Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82:3320-3324 (1985); um promotor induzido por luz e folha- específico tal como aquele de cab ou rubisco, Simpson et al., EMBO J., 4(ll):2723-2729 (1985) e Timko et al., Nature, 318:579-582 (1985); e um promotor antera-específico tal como aquele de LAT52, Twell et al., Mol. Gen. Genetics, 217:240-245 (1989); um promotor pólen-específico tal como aquele de Zml3, Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics, 244:161-168 (1993); ou um promotor microesporo-específico tal como aquele de apg, Twell et al., Sex. Plant Reprod., 6:217-224 (1993). 31 % Seqüências de sinal para seleção de proteínas em compartimentos subcelulares

Transporte de moléculas de proteína ou de peptídeo produzidas por transgenes em um compartimento subcelular tal como cloroplasto, vacúolo, peroxissomo, glioxissomo, parede celular, ou mitocôndria, ou para secreção para dentro de um apoplasto, é realizado pela ligação operacional de uma seqüência de nucleotídeos codificadora de uma seqüência de sinal na extremidade 5' ou 3' de um gene codificador de proteína ou peptídeo de interesse. Seleção de seqüências na extremidade 5' e 3' do gene estrutural pode determinar, durante a síntese e o processamento de proteína, onde a proteína codificada é finalmente compartimentalizada.

Muitas seqüências de sinal são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Becker et ai., Plant Mol. Biol., 20:49 (1992); Close, P. S., Master's Thesis, Iowa State University (1993); Knox, C. et ai, "Structure and Organization of Two Divergent Alpha-Amylase Genes from Barley", Plant Mol. Biol., 9:3-17 (1987); Lerner et aL, Plant Physiol., 91:124-129 (1989); Fontes et aL, Plant Cell, 3:483-496 (1991); Matsuoka et aL, Proc. NatL Acad. Sci., 88:834 (1991); Gould et aL, J. Cell. Biol, 108:1657 (1989); Creissen et aL, Plant J., 2:129 (1991); Kalderon et aL, "A short amino acid sequence able to specify nuclear location", Cell, 39:499-509 (1984); e Steifel et aL, tiExpression of a maize cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in early Ieaf and root vascular differentiation", Plant Cell, 2:785-793 (1990). Genes agronômicos e genes de proteína estranha Genes agronomicamente significativos que podem ser transformados em plantas de arroz de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, os seguintes:

1 .Genes que conferem resistência às pestes ou à doença: A.Genes de resistência à doença de planta. Defesas da planta são muitas vezes ativadas por interação específica entre o produto de um gene W

de resistência à doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma planta pode ser transformada. Uma planta pode ser transformada com um gene de resistência clonado em plantas engenhadas que são resistentes às cepas de patógenos específicas. Veja, e.g., Jones et al., Science 266:789 (1994) (clonagem de gene Cf-9 de tomateiro para resistência a Cladosporium fulvum"); Martin et ai., Science 262:1432

(1993) (gene Pto de tomateiro para resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomato codifica uma proteína quinase); e Mindrinos et al., Cell 78:1089

(1994) (gene RSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae). B.Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um seu derivado, ou

um seu polipeptídeo sintético modelado sobre a mesma. Veja, e.g., Geiser et al., Gene 48:109 (1986), descrevendo a clonagem e a seqüência de nucleotídeos de um gene de Bt-endotoxina. DNA Moléculas de DNA codificadoras de genes de endotoxina podem ser obtidas da American Type Culture Collection, Manassas, Va., e.g., sob os Nos. de acesso de ATCC de 40098, 67136, 31995, e 31998.

C.Uma lectina. Veja, por exemplo, Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994), descrevendo as seqüências de nucleotídeos de vários genes de lectina ligante de manose de Clivia miniata. D.Uma proteína ligante de vitamina tal como avidina. Veja

Pedido PCT US93/06487. Esta descrição ensina o uso de abidina e de homólogos de avidina como larvicidas contra pestes de inseto.

E.Um inibidor de enzima, e.g., um inibidor de protease ou de proteinase ou um inibidor de amilase. Veja, e.g., Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987) (seqüência de nucleotídeos de inibidor de cisteína proteinase de arroz); Huub et al., Plant Molec. Biol. 21:985 (1993) (seqüência de nucleotídeos de cDNA codificadora de inibidor 1 de proteinase de tabaco); e Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993) (seqüência de nucleotídeos de inibidor de amilase de Streptomyces nitrosporeus). 33 Ί-% F.Um hormônio ou feromônio inseto-específico tal como um ecdisteróide e hormônio juvenil, uma sua variante, um mimético baseado no mesmo, ou um seu antagonista ou agonista. Vejaj e.g., Hammock et ai., Nature, 344:458 (1990), descrevendo expressão em baculovírus de hormônio

juvenil esterase clonada, um inativador de hormônio juvenil.

G.Um neuropeptídeo ou peptídeo inseto-específico que, sob expressão, interrompe a fisiologia da peste afetada. Veja, e.g., Regan, J. Biol. Chen. 269:9 (1994) (clonagem de expressão dá DNA codificador de receptor de hormônio diurético de inseto); e Pratt et ai., Biochem. Biophys. Res.

Comm., 163:1243 (1989) (uma alostatina em Diploptera puntata). Veja também Pat. U.S. de No. 5.266.317 de Tomalski et al., descrevendo genes codificadores de neurotoxinas paralíticas inseto-específicas.

H.Um veneno inseto-específico produzido na natureza por uma serpente, uma vespa, etc. Por exemplo, veja Pang et al., Gene, 116:165

(1992), concernente à expressão heteróloga em plantas de um gene codificador de um peptídeo inseto-tóxico de escorpião. Uma enzima responsável pelo hiper-acúmulo de um monoterpeno, um esteróide, ácido hidroxâmico, um derivado fenil-propanóide ou outra molécula de não- proteína com atividade inseticida.

J.Uma enzima envolvida em modificação, incluindo

modificação de pós-tradução, de uma molécula biologicamente ativa; e.g., uma enzima glicolítica; uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma

quitinase, ou uma glicanase, quer natural quer sintética. Veja Pedido PCT WO 9302197 de Scott et al., que descreve a seqüência de nucleotídeos de um gene de calase. Moléculas de DNA que contêm seqüências codificadoras de quitinase podem ser obtidas, por exemplo, da American Type Culture Collection sob os Nos. de acesso de 39637 e 67152. Veja também Kramer et 34 rVS al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993), que descreve a seqüência de nucleotídeos de um cDNA codificador de quitinase de lagarta do tabaco; e Kawalleck et al., Plant Molec. Biol., 21:673 (1993), que descreve a seqüência de nucleotídeos do gene de poliubiquitina ubi4-2 de salsa.

K.Uma molécula que estimula transdução de sinal. Veja, e.g.,

Botella et al, Plant Molec. Biol., 24:757 (1994), que descreve seqüências de nucleotídeos para clones de cDNA de calmodulina de feijão de faséolo; e Griess et al., Plant Physiol., 104:1467 (1994), que descreve a seqüência de nucleotídeos de um clone de cDNA de calmodulina de milho.

L.Um peptídeo antimicrobiano ou anfipático. Veja Pedido

PCT WO 9516776 (descrevendo derivados de peptídeo de taquiplesina que inibem patógenos fungicos de planta); e Pedido PCT WO 9518855 (descrevendo peptídeos sintéticos antimicrobianos que conferem resistência à doença).

M.Uma permease de membrana, uma formadora de canal ou

uma bloqueadora de canal. Veja, e.g., Jaynes et al., Plant Sci., 89:43 (1993), que descreve expressão heteróloga de um análogo de peptídeo lítico de cecropina para tornar as plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

N.Uma proteína viral-invasiva ou uma toxina complexa

derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de capa viral em células de planta transformadas induz resistência à infecção viral ou ao desenvolvimento de doença causada(o) pelo vírus do qual o gene de proteína de capa é derivado, bem como por vírus relacionados. Resistência mediada

por proteína de capa tem sido conferida às plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepineiro, vírus das estrias do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus da queima do tabaco, tobacco rattle virus, e vírus do mosaico do tabaco. Veja Beachy et al., Ann. Rev. Phytopathol., 28:451 (1990). W

O.Um anticorpo inseto-específico ou uma imunotoxina derivado do mesmo. Assim, um anticorpo selecionado para uma função metabólica crítica no intestino de inseto inativa uma enzima afetada, matando o inseto. Veja Taylor et aL, Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgo, Escócia, 1994) (inativação enzimática em tabaco transgênico via produção de fragmentos de anticorpo de cadeia única).

P.Um anticorpo vírus-específlco. Veja, e.g., Tavladoraki et al., Nature, 366:469 (1993), mostrando proteção de plantas transgênicas expressando genes de anticorpo recombinante do ataque do vírus.

Q.Uma proteína de parada desenvolvimental produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Por exemplo, endo-l,4-D- poligalacturonases fungicas facilitam a colonização fungica e a liberação de nutriente de planta pela solubilização de homo-l,4-D-galacturonase de parede celular de planta. Veja Lamb et al., Bio/Technology, 10:1436 (1992). A clonagem e caracterização de um gene que codifica proteína inibidora de endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart et al., Plant J., 2:367(1992).

R.Uma proteína de parada desenvolvimental produzida na natureza por uma planta. Por exemplo, Logemann et al., Bio/Technology, 10:305 (1992) relataram que plantas transgênicas expressando o gene inativador de ribossomo de cevada possuem uma resistência aumentada à doença fungica.

2.Genes que conferem resistência adicional a um herbicida, além daquele que é inerente em 'CLl3 V9 por exemplo:

A.Um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazolinona ou uma sulfonil-uréia. Genes exemplares nesta categoria codificam enzimas mutantes ALS e AHAS como descrito, por exemplo, por Lee et al., EMBO J.., 7:1241 (1988); e Mild et al., W

Theor. Appl. Genet., 80:449 (1990), respectivamente. Vejas adicionalmente, Patentes U.S. de Nos. 5.545.822; 5.736.629; 5.773.703; 5.773.704; 5.952.553; e 6.274.796; e Pedidos de Patente Internacional Publicados WO 00/27182 e WO 01/85970. Resistência aos herbicidas AHAS-atuantes pode ser através de um mecanismo diferente de uma enzima AHAS resistente. Veja, e.g., Patente

U.S. de No. 5.545.822.

B.Glifosato. Resistência pode ser conferida pelos genes AroA e de 5-enolpiruvil-3-fosfocimato-sintase (EPSP) mutantes. Outros fosfono- compostos tal como glufosinato. Resistência pode ser conferida por genes bar, de fosfmotricina-acetil-transferase, PAT e fosfmotricina-acetil-transferase de Streptomyces hygroscopicuss. ácidos Piridinóxi ou fenóxi propiônicos e ciclo- hexonas. Resistência pode ser conferida pelos genes codificadores de inibidor de ACCase. Veja5 e.g., Pat. U.S. de No. 4.940.835 de Shah et al., que descreve a seqüência de nucleotídeos de uma forma de EPSP que confere resistência a glifosato. Uma molécula de DNA codificadora de um gene AroA mutante pode ser obtida sob o número de acesso de ATCC de 39256, e a seqüência de nucleotídeos do gene mutante é descrita em Pat. U.S. de No. 4.769.061 de Cornai. Pedido de Patente Européia de No. 0333033 de Kumada et al.; e Pat. U.S. de No. 4.975.374 de Goodman et al., descrevem seqüência de nucleotídeos de genes de glutamina-sintase que conferem resistência a herbicidastal como L-fosfinotricina. A seqüência de nucleotídeos de um gene de fosfinotricina-acetil-transferase é proporcionado em Pedido Europeu de No. 0242246 de Leemans et al. e DeGreef et al., Bio/Technology, 7:61 (1989), descrevendo a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificadores de atividade de fosfmotricina-acetil-transferase. Exemplos de genes conferindo resistência aos ácidos fenóxido-propiônicos e ciclo-hexonas, tais como setoxidim e haloxifop, são os genes Accl-S 1, Accl- S2, e Accl-S3 descritos por Marshall et al., Theor. Appl. Genet., 83:435 (1992). 'W

C.Um herbicida que inibe fotossíntese, tal como um triazina (genes psbA e gs+) ou uma benzonitrila (gene de nitrilase). Przibilla et al, Plant Cell, 3:169 (1991), descrevem a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos codificadores de genes psbA. Seqüências de nucleotídeos para

genes de nitrilase são descritos em Pat. U.S. de No. 4.810.648 de Stalker, e moléculas de DNA contendo estes genes estão disponíveis sob os números de acesso de ATCC de 53435, 67441, e 67442. Clonagem e expressão de DNA para uma glutationa-S-transferase são descritas por Hayes et al., Biochem. J., 285:173 (1992).

3.Genes que conferem ou contribuem para uma feição de valor

adicional, tais como:

A-Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, por transformação de uma planta com uma seqüência de anti-senso à estearil- ACP-desaturase, para aumentar o conteúdo de ácido esteárico da planta. Veja

Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:2624 (1992).

B.Conteúdo de fitato diminuído:

1) Introdução de um gene codificador de fitase intensificaria a degradação de fitato, adicionando mais fosfato livre na planta transformada. Veja, e.g, Van Hartingsveldt et al. Gene, 127:87 (1993), que descreve a

seqüência de nucleotídeos de um gene de fitase de Aspergillus niger.

2) Um gene pode ser introduzido para reduzir o conteúdo de fitato. Por exemplo, isto pode ser realizado por clonagem, e então reintrodução de DNA associado com um alelo que é responsável por mutantes de milho caracterizados por níveis baixos de ácido fitico, ou uma mutação

homóloga ou análoga em arroz pode ser usada. Veja Raboy et al, Maydica, 35:383 (1990).

C. Composição de carboidrato pode ser modificada, por exemplo, pela transformação de plantas com um gene codificador de uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido. Veja Shiroza et al, J. Bacteol., 170:810 (1988) (seqüência de nucleotídeos de gene mutante de frutosiltransferase de Streptococcus); Steinmetz et aL, MoL Gen. Genet., 20:220 (1985) (seqüência de nucleotídeos de gene de levansucrase de Bacillus subtilis); Pen et aL, Bio/Technology, 10:292 (1992) (produção de plantas transgênicas que expressam amilase de Bacillus liehenifonnis); Elliot et aL, Plant Molec. BioL, 21:515 (1993) (seqüências de nucleotídeos de genes de invertase de tomateiro); Sogaard et aL, J. BioL Chun., 268:22480 (1993) (mutagênese sítio-direcionada de gene de amilase de cevada); e Fisher et aL, Plant PhysioL, 102:1045 (1993) (enzima 11 ramificadora de amido de

endosperma de milho).

Métodos de transformação de arroz

São conhecidos na técnica numerosos métodos para transformação de planta, incluindo ambos os protocolos de transformação física e biológica. Veja, e.g., Mild, et aL, "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology; Glick B. R. e Thompson, J. E. (Eds.) (CRC Press, Inc, Boca Raton, 1993), pp. 67-88. Em adição, vetores de expressão e métodos de cultura in vitro para transformação de tecido ou de célula de planta e regeneração de planta são conhecidos na técnica. Veja, e.g., Gruber et aL, "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick B. R. e Thompson, J. E. (Eds.) (CRC Press, Inc.,

BocaRaton, 1993), pp. 89-119.

A.Transformação mediada por Agrobaeterium

Um método para introduzir um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobaeterium. Veja, e.g., Horsch et aL, Science, 227:1229 (1985). A. tumefaeiens e A. rhizogenes são bactérias de solo patogênicas para planta que geneticamente transportam células de planta. Plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaeiens e de A. rhizogenes, respectivamente, transportam genes responsáveis pela transformação genética 39 SM de plantas. Veja, e.g, Kado, C. I, Grit. Rev. Plant Sci., 10:1 (1991). Descrições de sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência de gene mediada por Agrobaeterium são proporcionados por Gruber et al., supra; Mild et al, supra; e Moloney, et al., Plant Cell Reports, 8:238 (1989). Veja também Pat. U.S. de No. 5.591.616.

B.Transferência direta de gene

Não obstante o fato de que a transformação mediada por Agrobaeterium se ampla, ela é mais difícil para transformar certas gimnospermas e espécies de colheita de cereal via este modo de transferência de gene, embora sucesso tenha sido alcançado em ambos arroz e milho. Veja Hiei et al, The Plant Journal, 6:271-282 (1994); e Pat. U.S. de No. 5.591.616. Outros métodos de transformação de planta existem como alternativas à transformação mediada por Agrobaeterium.

Um método geralmente aplicável de transformação de planta é a transformação mediada por microprojétil (denominada "pistola de gene"), no qual DNA é transportado sobre a superfície de microprojéteis, tipicamente de 1 a 4 μηι em diâmetro. O vetor de expressão é introduzido em tecidos de planta com dispositivo biolístico que acelera os microprojéteis em velocidades típicas de 300 a 600 m/s, suficientes para penetrarem na membranas e paredes celulares. Sanford et al, Part. Sei. Technol, 5:27 (1987); Sanford, J. C, Trends Biotech, 6:299 (1988); Klein et al, Bio/Technology, 6:559-563 (1988); Sanford, J. C, Physiol Plant, 7:206 (1990); e Klein et al, Biotechnology, 10:268 (1992). Vários tecidos alvo podem ser bombardeados com microprojéteis revestidos de DNA para produzir plantas transgênicas, incluindo, por exemplo, calo (Tipo I ou Tipo II), embriões imaturos, e tecido meristemático.

Outro método para liberação física de DNA em plantas é sonicação de células alvo. Zhang et al, Bio/Technology, 9:996 (1991). Alternativamente, fusão de lipossomo ou de esferoplasto tem sido usada para W

introduzir vetores de expressão em plantas. Deshayes et ai., EMBO J., 4:2731 (1985); e Christou et al., Proc NatL Acad. Sei. U.S.A, 84:3962 (1987). Captação direta de DNA para dentro de protoplastos, usando precipitação por CaCl2, poli(vinil-álcool) ou poli-L-ornitina, também tem sido relatada. Hain et al., MoL Gen. Genet., 199:161 (1985); e Draper et al., Plant Cell Physiol., 23:451 (1982). Eletroporação de protoplastos e de células inteiras e tecidos também tem sido descrita. Donn et al., em Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC5 A2-38, p. 53 (1990); DiHalluin et al., Plant Cell, 4:1495-1505 (1992); e Spencer et al, Plant MoL Biol., 24:51-61 (1994).

Após a transformação de tecidos alvo de arroz, expressão de um gene marcador selecionável permite seleção preferencial de células, tecidos, ou plantas transformadas, usando métodos de regeneração ou de seleção conhecidos na técnica. Estes métodos de transformação podem ser usados para

produzir uma linhagem endogâmica transgênica. A linhagem endogâmica transgênica pode ser então cruzada com outra linhagem endogâmica (a própria quer transformada quer não-transformada), para produzir uma nova linhagem endogâmica transgênica. Alternativamente, uma feição genética que tem sido engenhada para dentro de uma linhagem de arroz particular pode ser movida para dentro de outra linhagem usando técnicas tradicionais de cruzamento e de retrocruzamento. Por exemplo, retrocruzamento pode ser usado para mover uma feição engenhada de uma linhagem endogâmica de não-elite, pública, em uma linhagem endogâmica de elite, ou de uma linhagem endogâmica contendo um gene estranho em uma linhagem endogâmica ou linhagens endogâmicas que não contêm gene.

O termo "planta de arroz endogâmica" deve ser também entendida para incluir conversões de gene único de uma linhagem endogâmica. Métodos de retrocruzamento podem ser usados com a presente invenção para melhorar ou introduzir uma característica em uma linhagem endogâmica.

Têm sido identificadas muitas feições de gene único que não são regularmente selecionadas para desenvolvimento de uma nova linhagem endogâmica, mas que podem ser melhoradas por cruzamento e retrocruzamento. Feições de gene único podem ou não ser transgênicas. Exemplos de tais feições incluem esterilidade masculina, amido ceroso, resistência a herbicida, resistência à doença bacteriana ou fungica ou viral, resistência a inseto, fertilidade masculina, qualidade nutricional aumentada, estabilidade de rendimento, e aumento de rendimento. Estes genes são geralmente herdados através do núcleo. Exceções conhecidas aos genes de núcleo incluem alguns genes para esterilidade masculina que são citoplasmicamente herdados, mas que ainda atuam funcionalmente como feições de gene único. Várias feições de gene único são descritas em Patentes U.S. de Nos. 5.777.196; 5.948.957; e 5.969.212.

INFORMAÇÃO DE DEPÓSITO

Uma amostra do cultivar de arroz designado 'CL131' foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209 aos 30 de junho de 2005, e foi designada com o No. de acesso de ATCC de PTA-6824. O depósito foi feito conforme um contrato entre ATCC e o cessionário deste pedido de patente, Board of Supervisors of Louisiana State University e Agricultural and Mechanical College. O contrato com ATCC proporciona disponibilidade permanente e irrestrita destas sementes ou da progênie destas sementes ao público na emissão da Patente U.S. descrevendo e identificando o depósito ou a publicação ou a exposição ao público de qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeira, independente de qual ocorre primeiro, e para a disponibilidade destas sementes a um determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks (ou por qualquer contra-parte do Commissioner em qualquer escritório de registro de patentes em qualquer outro país) a ser intitulado sob estatutos e regulamentos pertinentes. O cessionário do presente pedido tem concordado com o fato de que se qualquer uma das sementes sob depósito se tornar inviável ou ser perdida ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, elas serão prontamente substituídas sob notificação por uma amostra viável das mesmas sementes.

MISCELÃNEA

As descrições completas de todas as referências citadas neste relatório descritivo são por esta incorporadas como referências. Contudo, no caso de um conflito de outro modo irreconciliável, o presente relatório descritivo deve controlar.

Claims (42)

1. Semente de arroz da variedade 'CL131\ caracterizada pelo fato de que uma amostra representativa de citada semente tem sido depositada sob o No. de acesso em ATCC de PTA-6824.

2. Planta, ou uma parte da mesma, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo crescimento da semente da reivindicação 1.

3. Método para produzir plantas de arroz, caracterizado pelo fato de compreender plantar uma pluralidade de sementes de arroz como definidas na reivindicação 1 sob condições favoráveis para o crescimento de plantas de arroz.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de colher semente de arroz produzida pelas plantas de arroz resultantes.

5. Semente de arroz, caracterizada pelo fato de ser colhida pelo método como definido na reivindicação 4.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de aplicar herbicida na vizinhança das plantas de arroz para controlar ervas daninhas, no qual o herbicida normalmente inibe aceto-hidróxi-ácido-sintase, em níveis do herbicida que normalmente inibiriam o crescimento de uma planta de arroz.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende uma sulfonil-uréia herbicidamente efetiva.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende uma imidazolinona herbicidamente efetiva.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende imazetapir ou imazamox.

10. Pólen, caracterizado pelo fato de ser da planta como eo definida na reivindicação 2.

11. Óvulo, caracterizado pelo fato de da planta como definida na reivindicação 2.

12. Planta de arroz, ou uma parte da mesma, caracterizada pelo fato de possuir todas ou essencialmente todas as características fisiológicas e morfológicas da planta de arroz como definida na reivindicação 2.

13. Cultura de tecido, caracterizada pelo fato de ser de células ou protoplastos regeneráveis produzidos da planta de arroz como definida na reivindicação 2.

14. Cultura de tecido de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que as citadas células ou protoplastos são produzidos de um tecido selecionado do grupo consistindo de embriões, células meristemáticas, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, flores, sementes, e troncos.

15. Planta de arroz, caracterizada pelo fato de ser regenerada da cultura de tecido como definida na reivindicação 14, e de possuir todas ou essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas de 'CL13 Γ.

16. Método para produzir semente de arroz, caracterizado pelo fato de compreender cruzar uma primeira planta de arroz parental com uma segunda planta de arroz parental, e colher a semente de arroz híbrido resultante, no qual a primeira planta de arroz parental ou a segunda planta de arroz parental é a planta de arroz como definida na reivindicação 2.

17. Semente de arroz, caracterizada pelo fato de ser colhida pelo método como definido na reivindicação 16.

18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de plantar uma pluralidade de sementes de arroz híbrido sob condições favoráveis para o crescimento de plantas de arroz.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de colher semente de arroz produzida pelas plantas de arroz resultantes.

20. Semente de arroz, caracterizada pelo fato de ser colhida pelo método como definida na reivindicação 19.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de aplicar herbicida na vizinhança das plantas de arroz para controlar ervas daninhas, no qual o herbicida normalmente inibe aceto-hidróxi-ácido-sintase, em níveis do herbicida que normalmente inibiriam o crescimento de uma planta de arroz.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende uma sulfonil-uréia herbicidamente efetiva.

23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende uma imidazolinona herbicidamente efetiva.

24. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende imazetapir ou imazamox.

25. Método para produzir uma planta de arroz com resistência a herbicida aumentada, caracterizado pelo fato de compreender transformar a planta de arroz como definida na reivindicação 2 com um transgene que confere resistência à herbicida, em adição à resistência a herbicida que é inerente ao arroz 'CL131\

26. Semente de arroz ou planta de arroz resistente a herbicida, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método como definido na reivindicação 25.

27. Método para produzir uma planta de arroz resistente a inseto, caracterizado pelo fato de compreender transformar a planta de arroz como definida na reivindicação 2, com um transgene que confere resistência a inseto.

28. Semente de arroz ou planta de arroz resistente a inseto, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método como definido na reivindicação 27.

29. Método de produzir uma planta de arroz resistente à doença, caracterizado pelo fato de compreender transformar a planta de arroz como definida na reivindicação 2 com um transgene que confere resistência à doença.

30. Semente de arroz ou planta de arroz resistente à doença, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método como definido na reivindicação 29.

31. Método para produzir uma planta de arroz com metabolismo de carboidrato ou de ácido graxo modificado, caracterizado pelo fato de compreender transformar a planta de arroz como definida na reivindicação 2 com pelo menos um transgene codificador de uma proteína selecionada do grupo consistindo de frutosiltransferase, levansucrase, alfa- amilase, invertase, e enzima ramificadora de amido; ou codificador de uma seqüência de anti-senso à estearil-ACP dessaturase.

32. Semente de arroz ou planta de arroz, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método como definido na reivindicação 31.

33. Método para introduzir uma característica desejada em cultivar de arroz tCLDl,' caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) cruzar plantas como definidas na reivindicação 2 com plantas de outra linhagem de arroz expressando a característica desejada, para produzir plantas de progênie; (b) selecionar plantas de progênie que expressam a característica desejada, para produzir plantas de progênie selecionadas; (c) cruzas as plantas de progênie selecionadas com plantas como definidas na reivindicação 2 para produzir novas plantas de progênie; (d) selecionar novas plantas de progênie que expressam ambas a característica desejada e algumas das ou todas as características fisiológicas e morfológicas de cultivar de arroz 1CL131,' para produzir novas plantas de progênie selecionadas; e (e) repetir as etapas (c) e (d) três ou mais vezes em sucessão, para produzir plantas de progênie de retro-cruzamento de geração superior que expressam ambas a característica desejada e essencialmente todas as características fisiológicas e morfológicas do cultivar de arroz fCL 131/ como descritas na INFORMAÇÃO DE DESCRIÇÃO DE VARIEDADES do relatório descritivo, determinadas em um nível de significância de 5%, quando crescidas nas mesmas condições ambientais.

34. Semente de arroz, caracterizada pelo fato de ser colhida de plantas de progênie de retro-cruzamento de geração superior selecionadas produzidas pelo método como definido na reivindicação 33.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de plantar, sob condições favoráveis para o crescimento de plantas de arroz, uma pluralidade de sementes de arroz colhidas de plantas de progênie de retro-cruzamento de geração superior selecionadas.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de colher semente de arroz produzida pelas plantas de arroz resultantes.

37. Semente de arroz, caracterizado pelo fato de ser colhida pelo método como definido na reivindicação 36.

38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de aplicar herbicida na vizinhança das plantas de arroz para controlar ervas daninhas, no qual o herbicida normalmente inibe aceto-hidróxi-ácido-sintase, em níveis do herbicida que normalmente inibiriam o crescimento de uma planta de arroz.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado ^^ pelo fato de que o herbicida compreende uma sulfonil-uréia herbicidamente efetiva.

40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende uma imidazolinona herbicidamente efetiva.

41. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o herbicida compreende imazetapir ou imazamox.

42. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a característica desejada é selecionada do grupo consistindo de esterilidade masculina; resistência a herbicida; resistência a inseto; e resistência à doença bacteriana, fungica, ou viral.