BRPI0611892B1

BRPI0611892B1 - A method for producing fatty acid alkyl esters of reduced phosphorus content by the combined transesterification and degumming

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Publication date: 2017-07-11

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“MÉTODO PARA PRODUZIR ALQUIL ESTERES DE ÁCIDOS GRAXOS DE TEOR DE FÓSFORO REDUZIDO PELA TRANSESTERIFICAÇÃO E DEGOMAÇÃO COMBINADAS” CAMPO DA INVENÇÃO A invenção presente refere-se a um método simplificado para produzir alquil ésteres de ácidos graxos degomados i.e. alquil ésteres de ácidos graxos onde o teor de impurezas como íosíolipídeus foi reduzido. O método compreende a conversão de gorduras e óleos para alquil ésteres de ácidos graxos pelo uso de uma ou mais enzimas lipolíticas e uma ou mais fosfolipases em uma solução.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a simplified method for producing alkyl fatty acid ester esters ie alkyl esters where fatty acid content is present. of impurities such as icosiolipedeus has been reduced. The method comprises converting fats and oils to alkyl fatty acid esters by the use of one or more lipolytic enzymes and one or more phospholipases in a solution.

ESTADO DA TÉCNICATECHNICAL STATE

Biodiesel, geralmente classificado como alquil ésteres de ácidos graxos originados de gorduras ou óleos animais ou vegetais, tornou-se recentemente mais atrativo devido aos seus benefícios ambientais. Apesar de o biodiesel ser no momento produzido quimicamente com sucesso por transesterificação (utilizando e.g. NaOH e/ou metóxido de sódio como catalisadores), existem diversos problemas associados para restringir seu desenvolvimento, como o pré-processamento de óleo devido ao alto teor e ácidos graxos livres, a remoção dos catalisadores químicos das fases éster e glicerol, a remoção de sais inorgânicos durante a recuperação do glicerol e redução do teor de fosfolipídcos que antecede a etapa de iransesterificação.Biodiesel, generally classified as alkyl esters of fatty acids from animal or vegetable fats or oils, has recently become more attractive due to its environmental benefits. Although biodiesel is currently successfully chemically produced by transesterification (using eg NaOH and / or sodium methoxide as catalysts), there are several associated problems to restrict its development, such as high oil pre-processing and fatty acids. free removal, removal of chemical catalysts from the ester and glycerol phases, removal of inorganic salts during glycerol recovery and reduction of phospholipid content prior to the iransesterification step.

As desvantagens causadas pelos catalisadores químicos são prevenidas usualmente pelo uso de enzimas lipolíticas com cata lis adoras c cm anos recentes desenvolveu-se interesse pelo uso de lipases com ou sem imobilização na transesterificaçao para a produção de biodiesel.Disadvantages caused by chemical catalysts are usually prevented by the use of catalytic lipolytic enzymes and in recent years there has been an interest in the use of lipases with or without transesterification immobilization for the production of biodiesel.

Este rases de fungos podem ser utilizadas na produção enzimática de ésteres, onde elas podem substituir catalisadores como ácidos minerais (e.g. ácido sulfúrico, ácido clorídrico, c ácido clorossulfônico), hidróxidos anfotéricos dos grupos metais L IL III, e IV, e outros, O uso de enzimas para a síntese de ésteres vem sido descrito no conhecimento precedente, em particular enzimas classificadas em EC 3.1.1 hidrolases de éster carboxílico de acordo com Nomenclatura de Enzimas (Recomendações do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular, 1992 ou depois). WO 88/02775 refere-se às lipases A e B de Candida antarctica. Esse documenta que a lipase B de C. antarctica (CALB) é mais efetiva para a síntese de ésteres.These fungal rases can be used in the enzymatic production of esters, where they can replace catalysts such as mineral acids (eg sulfuric acid, hydrochloric acid, and chlorosulfonic acid), amphoteric hydroxides of the L IL III, and IV metal groups, and others. Use of enzymes for ester synthesis has been described in the foregoing knowledge, in particular enzymes classified under EC 3.1.1 carboxylic ester hydrolases according to Enzyme Nomenclature (Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992 or later). WO 88/02775 refers to Candida antarctica lipases A and B. It documents that C. antarctica lipase B (CALB) is most effective for ester synthesis.

Cutinases são enzimas lipolíticas capazes de hidrolisar o substrato cutina. Cutinases são conhecidas de diversos fungos (P.E. Kolattukudy em “Lipases”, Ed. B. Bõrgstrom and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504). A seqüência de aminoácidos de uma cutinase de Humicola insolens foi publicada (US 5.827.719).Cutinases are lipolytic enzymes capable of hydrolyzing the cutin substrate. Cutinases are known from various fungi (P.E. Kolattukudy in "Lipases", Ed. B. Borgstrom and H.L. Brockman, Elsevier 1984, 471-504). The amino acid sequence of a Humicola insolens cutinase has been published (US 5,827,719).

Muitos pesquisadores relataram que um alto rendimento de alquil ésteres pode ser alcançado na presença de solventes orgânicos, porém devido à toxicidade e inflamabilidade de solventes orgânicos, a alcoólise catalisada por lipases em meio livre de solvente é mais desejada. Foi mostrado que a metanólise catalisada por lipases acontece em um sistema contendo água e livre de solventes orgânicos. Em tais sistemas, lipases que são menos sensíveis a metanol são vantajosas (Kaieda et al. J. Biosci. Bioeng. 2001, 91:12-15). É bem sabido que álcoois de cadeia curta em excesso, como o metanol, podem inativar a lipase seriamente. Entretanto, pelo menos três equivalentes molar são requeridos para a conversão completa do óleo para o seu metil éster. Du et al. (Biotechnol. Appl. Biochem. 2003, 38:103-106) estudaram o efeito da razão molar de óleo/metanol comparativamente durante operações em batelada contínuas e não contínuas.Many researchers have reported that a high alkyl ester yield can be achieved in the presence of organic solvents, but due to the toxicity and flammability of organic solvents, lipase catalyzed alcohololysis in solvent free medium is more desired. Lipase catalyzed methanolysis has been shown to occur in a system containing water and free from organic solvents. In such systems, lipases that are less sensitive to methanol are advantageous (Kaieda et al. J. Biosci. Bioeng. 2001, 91: 12-15). It is well known that excess short chain alcohols, such as methanol, can seriously inactivate lipase. However, at least three molar equivalents are required for complete conversion of the oil to its methyl ester. Du et al. (Biotechnol. Appl. Biochem. 2003, 38: 103-106) studied the effect of the oil / methanol molar ratio comparatively during continuous and non-continuous batch operations.

Para evitar a inativação de lipases, a concentração de metanol vem sida mantida baixa pela da adição de metanol durante a reação (Shimada et al. J. Mol. Ctalysis Enzymatic, 2002, 17:133-142; Xu et al. 2004, Biocat.To avoid lipase inactivation, methanol concentration has been kept low by the addition of methanol during the reaction (Shimada et al. J. Mol. Ctalysis Enzymatic, 2002, 17: 133-142; Xu et al. 2004, Biocat .

Biotransform. 22:45-48).Biotransform. 22: 45-48).

Lipases de fungo, como definidas em EC3.1.1.3, podem ser utilizadas em alcoólise de triglicerídeos e substituir catalisadores químicos alcalinos como metóxido de sódio ou hidróxido de potássio. Boutur et al. (J. Biotechnol. 1995, 42:23-33) relataram uma lipase de Candida deformam que é capaz de catalisar ambos a alcoólise de triglicerídeos (TG) e a esterifícaçao de ácidos graxos livres (FFA), mas não sob as mesmas condições de reação. Nas condições descritas por Boutur et al. apenas a esterifícaçao foi catalisada.Fungus lipases as defined in EC3.1.1.3 may be used for triglyceride alcohololysis and may replace alkaline chemical catalysts such as sodium methoxide or potassium hydroxide. Boutur et al. (J. Biotechnol. 1995, 42: 23-33) reported a deformed Candida lipase that is capable of catalyzing both triglyceride alcohol (TG) and free fatty acid esterification (FFA), but not under the same conditions of reaction. Under the conditions described by Boutur et al. Only the esterification was catalyzed.

De modo a obter uma produção mais econômica de alquil ésteres de ácidos graxos para biodiesel, há uma necessidade de um processo mais simples e integrado, resultando em uma conversão mais rápida de ácidos graxos e óleos nos seus metil e etil ésteres correspondentes e um maior rendimento na conversão e minimizando o investimento capital necessário para as unidades do processo. Além disso, gorduras e óleos obtidos de processos de produção usuais, através da compressão de materiais que liberam óleo ou extraindo óleo de materiais e removendo o solvente de extração, contém impurezas como lipídeos polares principalmente compostos por fosfolipídeos, assim com ácidos graxos, pigmentos, componentes de odor etc. É necessário remover essas impurezas por um processo de refinamento, o qual pode requerer uma etapa de degomação. Diversos métodos físicos e químicos são utilizados para degomar óleo (como descrito por Bochisch, M. em “Fats and Oils Handbook”, AOC Press, 1998, p428-433), nessa atividade o uso de fosfolipases para a degomação de óleos consumíveis é conhecido (US 5,264,367; JP-A2153997; e EP 622446) para reduzir o teor de fósforo nos óleos degomados em água. Condições enzimáticas de degomação são descritas por Clausen, K em Eur. J. Lipid Sei. Technol. 103 (2001), 333-340. As etapas chave são o tratamento com ácido cítrico, ajuste do pH para aproximadamente 5,0, a adição de enzima e mistura utilizando um misturador de alto cisalhamento.In order to achieve a more economical production of alkyl fatty acid esters for biodiesel, a simpler and more integrated process is required, resulting in faster conversion of fatty acids and oils to their corresponding methyl and ethyl esters and higher yield. conversion and minimizing the capital investment required for process units. In addition, fats and oils obtained from usual production processes, by compressing oil-releasing materials or extracting oil from materials and removing the extraction solvent, contain impurities such as polar lipids mainly composed of phospholipids, as well as fatty acids, pigments, odor components etc. These impurities must be removed by a refining process, which may require a degumming step. Several physical and chemical methods are used to burn oil (as described by Bochisch, M. in “Fats and Oils Handbook”, AOC Press, 1998, p428-433). In this activity the use of phospholipases for degumming consumable oils is known. (US 5,264,367; JP-A2153997; and EP 622446) to reduce the phosphorus content in the degummed oils in water. Enzymatic degumming conditions are described by Clausen, K in Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103 (2001), 333-340. Key steps are treatment with citric acid, pH adjustment to approximately 5.0, enzyme addition and mixing using a high shear mixer.

SllMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção em questão refere-se a um método para a produção de alquil ésteres de ácidos graxos, como metil ésteres de ácidos graxos (FAME) e etil ésteres de ácidos graxos com um baixo nível de impurezas como fosfolipídeos. O método da invenção é simplificado pela combinação de duas etapas do processo em um única etapa e é por conseqüência economicamente mais barato. O método inclui a mistura de água, álcool, triglicerídeo e/ou ácidos graxos livres, e uma ou mais enzima lipolíticas e uma ou mais fosfolipases selecionadas dos tipos Al, A2, B e liso-fosfolipases. Subsequentemente, a fase aquosa que contém glicerina, enzima residual e a maior parte dos fosfolipídeos hidrolisados, é separada da fase não aquosa, e então o teor de fosfolipídeos na fase não aquosa é reduzido. A combinação de enzimas lipolíticas e fosfolipases na mesma mistura permite um rendimento de produção de alquil ésteres de ácidos graxos com teor de fósforo reduzido a partir de triglicerídeos e/ou ácidos graxos livres rápido, simples e alto. A mistura do método da invenção em questão possui uma concentração de álcool relativamente alta na fase aquosa. Isso é vantajoso para a transesterificação executada pelas lípases, como descrito acima. Anteriormente nessa atividade, fosfolipases mícrobianas vem sido relatado serem relativamente instáveis em altas concentrações de solventes orgânicos (veja Song et al., Biochemica et Biophysica Acta, 1547 (2001) 370-378). Então é surpreendente que a etapa de degomação enzimática (hidrólise enzimática de fosfolipídeos por fosfolipases) no método da invenção em questão, acontece nas mesmas condições que na transesterficação executada pelas lipases.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a method for the production of alkyl fatty acid esters such as fatty acid methyl esters (FAME) and ethyl fatty acid esters with a low level of impurities such as phospholipids. The method of the invention is simplified by combining two process steps into one step and is therefore economically cheaper. The method includes mixing water, alcohol, triglyceride and / or free fatty acids, and one or more lipolytic enzymes and one or more selected phospholipases of types Al, A2, B and lyso phospholipases. Subsequently, the aqueous phase containing glycerine, residual enzyme and most hydrolysed phospholipids is separated from the non-aqueous phase, and then the phospholipid content in the non-aqueous phase is reduced. The combination of lipolytic enzymes and phospholipases in the same mixture allows for a production yield of reduced phosphorus fatty acid alkyl esters from fast, simple and high triglycerides and / or free fatty acids. The inventive method mixture has a relatively high alcohol concentration in the aqueous phase. This is advantageous for lipase transesterification, as described above. Earlier in this activity, microbial phospholipases have been reported to be relatively unstable at high concentrations of organic solvents (see Song et al., Biochemica et Biophysica Acta, 1547 (2001) 370-378). It is therefore surprising that the enzymatic degumming step (enzymatic hydrolysis of phospholipids by phospholipases) in the method of the present invention takes place under the same conditions as in the transesterification performed by lipases.

Além disso, a invenção refere-se a um processo em batelada ou um processo de estágios contínuos para produzir alquil ésteres de ácidos graxos de teor de fósforo reduzido utilizando enzimas lipolíticas e fosfolipases como descrito acima, onde o álcool é adicionado continuamente ou em etapas determinadas e onde as enzimas são recicladas e utilizadas somente uma vez. As enzimas podem também ser imobilizadas em esferas de sílica ou livres em solução. E enfatizado que os alquil ésteres de ácidos graxos produzidos pelo método da invenção não são exclusivamente para biodiesel, mas podem também ser utilizados com óleos-químicos básicos em processo subseqüentes na indústria óleo-química.In addition, the invention relates to a batch process or a continuous stage process for producing lower phosphorus fatty acid alkyl esters using lipolytic enzymes and phospholipases as described above, where alcohol is added continuously or at specified steps. and where enzymes are recycled and used only once. Enzymes may also be immobilized on silica spheres or free in solution. It is emphasized that the fatty acid alkyl esters produced by the method of the invention are not exclusively for biodiesel, but may also be used with subsequent process chemical oils in the oil industry.

Teor de fósforo reduzido A frase “teor de fósforo reduzido” significa que o teor de componentes que contém fósforo, como fosfolipídeos, foi reduzido. Fosfolipídeos não hidratáveis na fase não aquosa estão sendo hidrolisados pela fosfolipase e convertidos em fosfolipídeos hidratáveis, que são então extraídos da fase óleo para a fase aquosa. O teor de fósforo na fase de gordura é medido pelo método descrito em Clausen, K em Eur. J. Lipid Sei Technol. 103 (2001), 333-340. De acordo com o exemplo aqui citado esse é o valor de P depois de 24 horas de tempo de reação.Reduced phosphorus content The phrase “reduced phosphorus content” means that the content of phosphorus-containing components, such as phospholipids, has been reduced. Non-hydratable phospholipids in the non-aqueous phase are being hydrolyzed by phospholipase and converted to hydratable phospholipids, which are then extracted from the oil phase to the aqueous phase. Phosphorus content in the fat phase is measured by the method described in Clausen, K in Eur. J. Lipid Sci Technol. 103 (2001), 333-340. According to the example cited here this is the value of P after 24 hours of reaction time.

Em acordo, os alquil ésteres de ácidos graxos de teor de fósforo reduzido da invenção em questão contém não mais que 500 ppm de fósforo, de preferência não mais que 200 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 100 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 75 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 50 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 40 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 30 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 25 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 20 ppm de fósforo mais de preferência não mais que 15 ppm de fósforo, mais de preferência não mais que 10 ppm de fósforo, ainda mais de preferência não mais que 5 ppm de fósforo, a maior preferência não mais que 1 ppm de fósforo.Accordingly, the lower phosphorus fatty acid alkyl esters of the present invention contain no more than 500 ppm phosphorus, preferably no more than 200 ppm phosphorus, more preferably no more than 100 ppm phosphorus, more than preferably no more than 75 ppm phosphorus, more preferably no more than 50 ppm phosphorus, more preferably no more than 40 ppm phosphorus, more preferably no more than 30 ppm phosphorus, more preferably no more than 25 ppm phosphorus, more preferably no more than 20 ppm phosphorus, more preferably no more than 15 ppm phosphorus, more preferably no more than 10 ppm phosphorus, most preferably no more than 5 ppm phosphorus, most preferably no more than 1 ppm phosphorus.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção em questão refere-se a um método para a produção de alquil ésteres de ácidos graxos, como metil ésteres de ácidos graxos (FAME) e etil ésteres de ácidos graxos com um baixo nível de impurezas como fosfolipídeos. O método da invenção é simplificado pela combinação de duas etapas do processo em uma única etapa e é por conseqüêneia economicamente mais barato. O método inclui a mistura de água, álcool, triglicerídeo e/ou ácidos graxos livres, e uma ou mais enzimas lipolíticas e uma ou mais fosfolipases selecionadas dos tipos Al, A2, B e liso-fosfolipases. Subseqüentemente, a fase aquosa que contém glicerina, enzima residual e a maior parte dos fosfolipídeos hidrolisados, é separada da fase não aquosa através de sedimentação, filtração ou centrifugação, e então o teor de fosfolipídeos na fase não aquosa é reduzido.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for the production of alkyl fatty acid esters such as fatty acid methyl esters (FAME) and ethyl fatty acid esters with a low level of impurities such as phospholipids. The method of the invention is simplified by combining two process steps into one step and is therefore economically cheaper. The method includes mixing water, alcohol, triglyceride and / or free fatty acids, and one or more lipolytic enzymes and one or more selected phospholipases of types Al, A2, B and lyso phospholipases. Subsequently, the aqueous phase containing glycerine, residual enzyme and most hydrolysed phospholipids is separated from the non-aqueous phase by sedimentation, filtration or centrifugation, and then the phospholipid content in the non-aqueous phase is reduced.

Substratos Substratos utilizáveis para a produção de alquíl ésteres de ácidos graxos de acordo com a invenção em questão são uma ampla variedade de óleos e gorduras vegetais, óleos de colza e soja são mais comumente utilizados, apesar de outras plantas como mostarda, girassol, canola, coco, erva, óleo de palmeira e até algas mostram promessa. O substrato pode ser de qualidade crua ou degomada em água ou ainda mais processado (refinado, alvejado e desodorizado). Também gorduras animais incluindo sebo, banha, óleos marinhos, de aves domésticos, assim como óleos vegetais e animais de descarte, comumente conhecidos como graxa amarela e marrom podem ser utilizadas. As gorduras e óleos adequados podem ser triglicerídeos puros ou uma mistura de triglicerídeos e ácidos graxos livres, comumente vistos em gorduras animais e óleo vegetal de descarte. O substrato pode ser obtido de destilados desodorantes de óleos vegetais. O tipo de ácidos graxos no substrato abrange aqueles que ocorrem naturalmente como glicerídeos em gorduras e óleos vegetais e animais. Esses incluem o ácido oléico, o ácido linoleico, ácido linolênico, ácido palmítico e ácido láurico para citar alguns. Constituintes minoritários em óleos vegetais crus são tipicamente fosfolipídeos, ácidos graxos livres, e glicerídeos parciais i. e. mono e diglicerídeos. Quando utilizada aqui, a frase '‘resíduos de ácidos graxos” refere-se a ácidos graxos, tanto livres ou esterificados como em triglicerídeos, diglicerídeos, monoglicerídeos ou alquíl ésteres de ácidos graxos. O teor de fosfatídeo em um óleo cru pode variar de 0,5-3% peso/peso correspondendo ao teor de fósforo na faixa de 200-10000 ppm, mais preferencialmente na faixa de 250-1200 ppm. Fora os fosfatídeos, o óleo cru também contém concentrações pequenas de carboidratos, compostos de açúcar e complexos ácidos meta/fosfatídeo de CA, Mg e Fe.Substrates Substrates usable for the production of alkyl fatty acid esters according to the present invention are a wide variety of vegetable oils and fats, rapeseed and soybean oils are most commonly used, although other plants such as mustard, sunflower, canola, coconut, grass, palm oil and even seaweed show promise. The substrate may be of raw or water-degummed quality or further processed (refined, bleached and deodorized). Also animal fats including tallow, lard, marine, poultry oils, as well as vegetable and animal waste oils, commonly known as yellow and brown grease can be used. Suitable fats and oils may be pure triglycerides or a mixture of triglycerides and free fatty acids commonly seen in animal fats and waste vegetable oil. The substrate may be obtained from vegetable oil deodorant distillates. The type of fatty acids in the substrate covers those that occur naturally as glycerides in vegetable and animal fats and oils. These include oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, palmitic acid and lauric acid to name a few. Minority constituents in crude vegetable oils are typically phospholipids, free fatty acids, and partial glycerides i. and. mono and diglycerides. As used herein, the phrase 'fatty acid residues' refers to fatty acids, either free or esterified, or to triglycerides, diglycerides, monoglycerides or alkyl esters of fatty acids. The phosphatide content in a crude oil may range from 0.5-3% w / w corresponding to the phosphorus content in the range 200-10000 ppm, more preferably in the range 250-1200 ppm. Apart from phosphatides, crude oil also contains small concentrations of carbohydrates, sugar compounds, and CA / Mg / Fe meta / phosphatide acid complexes.

Biodiesel Alquil ésteres de ácidos graxos, como os metil ésteres de ácidos graxos (FAME) e etil ésteres de ácidos graxos são também chamados biodiesel, porque são utilizados como aditivo em diesel fóssil. Biodiesel constitui um aditivo cada vez mais importante ou substituto para combustíveis diesel baseados em óleo fóssil por ser produzido de fontes renováveis. r Álcool O álcool utilizado no método do invento é preferencialmente um álcool menor possuindo 1 a 5 átomos de carbono (Cr C5). Os álcoois preferidos são metanol e etanol.Biodiesel Alkyl fatty acid esters such as methyl fatty acid esters (FAME) and ethyl fatty acid esters are also called biodiesel because they are used as an additive in fossil diesel. Biodiesel is an increasingly important additive or substitute for fossil oil-based diesel fuels because it is produced from renewable sources. Alcohol The alcohol used in the method of the invention is preferably a smaller alcohol having 1 to 5 carbon atoms (C1 -C5). Preferred alcohols are methanol and ethanol.

Enzima lipolítica A enzima lipolítica do método da invenção em questão pode ser uma escolhida do grupo de enzimas lipolíticas e variantes de enzimas lipolíticas de Candida Antarctica, Hyphozyma sp. Candida parapsilosis, Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotricum candidum, Rhizomucur miehei, Crytococcus spp. S-2, Candida parapsilosis, Humicola insolens e Thermomyces lanuginosus (originalmente Humicola). As ditas enzimas lipolíticas incluem lipases, cutinases e acil transferases e podem ser 60% idênticas a uma enzima lipolítica selecionada do grupo das espécies citadas acima. Preferencialmente, a enzima lipolítica do método da invenção em questão é 70% idêntica a uma enzima lipolítica selecionada do grupo das espécies citadas acima, mais preferencialmente 75% idêntica, mais preferencialmente 80% idêntica, mais preferencial mente 85% idêntica, mais preferencialmente 90% idêntica, mais preferencial mente 95% idêntica, ainda mais preferencialmente 97 ou 98% idêntica ou mais preferencialmente 99% idêntica a uma enzima lipolítica selecionada do grupo das espécies citadas acima. As enzimas lipolíticas preferidas são variantes de lípases de Thermomyces lanuginosus (originalmente Humicola) de acordo com WO 00/60063, a lipase do parente Thermomyces lanuginosus e a Lipase B de Candida Antarctica.Lipolytic Enzyme The lipolytic enzyme of the method of the present invention may be one chosen from the group of lipolytic enzymes and lipolytic enzyme variants of Candida Antarctica, Hyphozyma sp. Candida parapsilosis, Candida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotricum candidum, Rhizomucur miehei, Crytococcus spp. S-2, Candida parapsilosis, Humicola insolens and Thermomyces lanuginosus (originally Humicola). Said lipolytic enzymes include lipases, cutinases and acyl transferases and may be 60% identical to a lipolytic enzyme selected from the group of species cited above. Preferably, the lipolytic enzyme of the method of the invention in question is 70% identical to a lipolytic enzyme selected from the group of species cited above, more preferably 75% identical, more preferably 80% identical, more preferably 85% identical, more preferably 90%. identical, more preferably 95% identical, even more preferably 97 or 98% identical or more preferably 99% identical to a lipolytic enzyme selected from the group of species cited above. Preferred lipolytic enzymes are variants of Thermomyces lanuginosus (originally Humicola) lipases according to WO 00/60063, relative Thermomyces lanuginosus lipase and Candida Antarctica Lipase B.

Em outro aspecto, a invenção em questão inclui duas diferentes enzimas lipolíticas onde a primeira enzima lipolítica é caracterizada em exibir atividade contra triglicerídeos mais alta do que contra ácidos graxos livres, enquanto a segunda enzima lipolítica exibe atividade mais alta contra ácidos graxos livres que contra triglicerídeos. Em acordo, a primeira enzima lipolítica é definida como uma tendo uma proporção de atividade sobre triglicerídeo (medida como conversão de triglicerídeos para ácidos graxos alquil éster) pela atividade sobre FFA (medida como conversão de FFA para alquil ésteres de ácidos graxos) abaixo de 0,2. A segunda enzima lipolítica é definida como uma tendo uma proporção de atividade sobre triglicerídeo (medida como conversão de triglicerídeos para ácidos graxos alquil éster) pela atividade sobre FFA (medida como conversão de FFA para alquil ésteres de ácidos graxos) acima de 0,5.In another aspect, the present invention includes two different lipolytic enzymes wherein the first lipolytic enzyme is characterized in exhibiting higher activity against triglycerides than against free fatty acids, while the second lipolytic enzyme exhibits higher activity against free fatty acids than against triglycerides. . Accordingly, the first lipolytic enzyme is defined as having a ratio of activity on triglyceride (measured as conversion of triglycerides to alkyl ester fatty acids) by activity on FFA (measured as conversion of FFA to alkyl fatty acid esters) below 0 ,2. The second lipolytic enzyme is defined as having a ratio of activity on triglyceride (measured as conversion of triglycerides to alkyl ester fatty acids) by activity on FFA (measured as conversion of FFA to alkyl fatty acid esters) above 0.5.

Fosfolipases Preferencialmente, uma fosfolipase (PL) utilizada no método da invenção é uma fosfolipase obtida de um microorganismo, preferencialmente um fungo filamentoso, uma levedura, ou uma bactéria e selecionada dos tipos de fosfolipase A], A2, B e liso-fosfolipases.Phospholipases Preferably, a phospholipase (PL) used in the method of the invention is a phospholipase obtained from a microorganism, preferably a filamentous fungus, yeast, or bacteria and selected from the phospholipase A], A2, B and lyso phospholipase types.

Para o propósito da invenção em questão o termo “obtido de”, como utilizado aqui em conexão com uma fonte microbiana específica, significa que a enzima e consequentemente a seqüência de DNA codificando a dita enzima é produzida pela fonte específica. A enzima é obtida da dita fonte específica por métodos padrão conhecidos, possibilitando a pessoa com habilidades obter uma amostra compreendendo a enzima capaz de ser utilizada em um processo da invenção. Os ditos métodos padrão podem ser a purificação direta das ditas fontes específicas ou clonagem da seqüência de DNA codificando a enzima seguida da expressão recombinante tanto na mesma fonte (expressão por recombinação homóloga) ou em uma fonte diferente (expressão por recombinação heteróloga).For the purpose of the present invention the term "obtained from" as used herein in connection with a specific microbial source means that the enzyme and hence the DNA sequence encoding said enzyme is produced by the specific source. The enzyme is obtained from said specific source by known standard methods, enabling the skilled person to obtain a sample comprising the enzyme capable of being used in a process of the invention. Said standard methods may be direct purification of said specific sources or cloning of the DNA sequence encoding the enzyme followed by recombinant expression either at the same source (homologous recombination expression) or at a different source (heterologous recombination expression).

Mais preferencialmente, uma fosfolipase utilizada em um processo da invenção é obtida de uma espécie de fungo filamentoso dentro do gênero Fusarium, como uma cepa de F. culmorum, F.heterosporum, F. solani, ou em particular uma cepa de F. oxysporum; ou uma espécie de fungo filamentoso dentro do gênero Aspergillus, como uma cepa de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger ou em particular Aspergillus oryzae.More preferably, a phospholipase used in a process of the invention is obtained from a filamentous fungus species within the genus Fusarium, such as a strain of F. culmorum, F.heterosporum, F. solani, or in particular a strain of F. oxysporum; or a species of filamentous fungus within the genus Aspergillus, such as a strain of Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger or in particular Aspergillus oryzae.

Exemplos de fosfolipases de Fusarium adequadas são descritas em: 1) Tsun-Che et al. (Phytopathological notes 58:1437-38 (1968)) (uma fosfolipase de Fusarium solani); e 2) Pedido de patente EP No. 97610056.0 descrevendo uma PL de F. culmorum adequada (veja exemplo 18 no dito doc.) e uma PL de F. oxysporum adequada (veja exemplo 1-17).Examples of suitable Fusarium phospholipases are described in: 1) Tsun-Che et al. (Phytopathological notes 58: 1437-38 (1968)) (a Fusarium solani phospholipase); and 2) EP Patent Application No. 97610056.0 describing a suitable F. culmorum LP (see example 18 in said doc.) and a suitable F. oxysporum LP (see example 1-17).

Fosfolipases de Aspergillus adequadas são descritas em 3) EP 575133 descrevendo fosfolipases de numerosos diferentes Aspergillus (veja reivindicação 14) e em particular a PL de A. oryzae (reivindicação 17 ou 18) e a PL de A. niger (reivindicação 19); e 4) DE 19527274 Al descreve uma preparação adequada (veja exemplos). Além disso, a preparação comercialmente disponível Degomma VOD (Roehm, Alemanha), que se acredita ser uma fosfolípase de Aspergillus é adequada para ser utilizada em um processo da invenção. As fosfolipases preferidas são as variações de fosfolipases de Thermomyces lanuginosus como descritas em WO 00/327558, Exemplo 5, e o produto comercial Lecitase* Ultra (Novozymes A/S, Dinamarca).Suitable Aspergillus phospholipases are described in 3) EP 575133 describing phospholipases of numerous different Aspergillus (see claim 14) and in particular A. oryzae PL (claim 17 or 18) and A. niger PL (claim 19); and 4) DE 19527274 A1 describes a suitable preparation (see examples). In addition, the commercially available preparation Degomma VOD (Roehm, Germany) believed to be an Aspergillus phospholipase is suitable for use in a process of the invention. Preferred phospholipases are variations of Thermomyces lanuginosus phospholipases as described in WO 00/327558, Example 5, and the commercial product Lecitase * Ultra (Novozymes A / S, Denmark).

As enzimas podem ser aplicadas como pó liofilizado, imobilizadas ou em solução aquosa.Enzymes may be applied as a lyophilized powder, immobilized or in aqueous solution.

Para propósitos da invenção em questão, o grau de identidade pode ser adequadamente determinado de acordo com o método descrito em Needleman, S.B. e Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Bíology, 48, 443-45, com as seguintes calibrações para comparação de seqüência de polipeptídeos: penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,1. A determinação pode ser feita por meios de um programa de computador conhecido como GAP fornecido no pacote de programas GCG (Manual de programas para o pacote Wisconsin, Versão 8, Agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Winsconsin, EUA 5371 1).For purposes of the present invention, the degree of identity may be suitably determined according to the method described in Needleman, S.B. and Wunsch, CD, (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45, with the following calibrations for polypeptide sequence comparison: 3.0 GAP breeding penalty and 0.1 GAP extension penalty . Determination can be made by a computer program known as GAP provided in the GCG program package (Wisconsin Package Program Manual, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). 5,371 1).

Duas dadas seqüências podem ser alinhadas de acordo com o método descrito em Neddleman (acima citado) utilizando-se os mesmos parâmetros. Isso pode ser feito por meios do programa GAP (acima citado).Two given sequences can be aligned according to the method described in Neddleman (above) using the same parameters. This can be done by means of the GAP program (above).

Ainda, a invenção refere-se a um processo em batelada e/ou um processo contínuo, dividido em estágios para produzir alquil ésteres de ácidos graxos utilizando uma primeira e uma segunda enzima lipolítica como descrito acima, onde um álcool é adicionado continuamente ou dividido em estágios, e onde as enzimas são recicladas e utilizadas apenas uma vez. Se as enzimas são utilizadas em uma fase aquosa, essa fase pode ser separada da fase graxa por um decantador, um sedimentador ou por centrifugação. No processo contínuo as duas fases, oleosa e aquosa, respectivamente, podem ser processadas em contra-corrente. Kosugi, Y.; Tanaka, H. e Tomizuka, (1990), Biotechnology and Bioengineering, vol 36, 617-622, descrevem um processo contínuo, que utiliza contra-corrente para hidrolisar óleos vegetais por uma lipase imobilizada.Further, the invention relates to a batch process and / or a continuous, stepwise process for producing fatty acid alkyl esters using a first and a second lipolytic enzyme as described above, where an alcohol is added continuously or divided into stages, and where enzymes are recycled and used only once. If enzymes are used in an aqueous phase, this phase may be separated from the grease phase by a decanter, a sedimenter or by centrifugation. In the continuous process the two phases, oily and aqueous, respectively, can be counter-processed. Kosugi, Y .; Tanaka, H. and Tomizuka (1990), Biotechnology and Bioengineering, vol 36, 617-622, describe a continuous process that uses countercurrent to hydrolyze vegetable oils by an immobilized lipase.

Descrição geral da preparação de ácidos graxos alquil éster de teor de fósforo reduzido O substrato compreendendo triglicerídeo e/ou ácidos graxos é misturado com álcool, preferencialmente metanol ou etanol e aquecido a 30-70°C, preferencialmente aproximadamente 50°C em um banho agitador recíproco de água (200 rpm). De preferência a água é adicionada e a solução é misturada vigorosamente e deixada no banho agitador recíproco de água na temperatura desejada, preferencialmente 50°C e 200 rpm para reagir. As fases da mistura da reação podem ser misturadas pelo uso de misturadores de alto cisalhamento, como os tipos da Silverson ou IKA Labortechnik, como utilizado na degomação enzimática de óleos vegetais (Clausen, K. (2001), European Journal of Lipid Science and Technology, vol. 103, 333-340).General Description of the Preparation of Lower Phosphorus Alkyl Fatty Acid Substrate The substrate comprising triglyceride and / or fatty acids is mixed with alcohol, preferably methanol or ethanol and heated to 30-70 ° C, preferably approximately 50 ° C in a shaker bath reciprocal water (200 rpm). Preferably water is added and the solution is mixed vigorously and left in the reciprocal water shaker bath at the desired temperature, preferably 50 ° C and 200 rpm to react. The reaction mixing phases can be mixed by the use of high shear mixers such as Silverson or IKA Labortechnik types as used in enzymatic degumming of vegetable oils (Clausen, K. (2001), European Journal of Lipid Science and Technology , vol. 103, 333-340).

Tipicamente uma degomação enzimática acontece a pH 3-7. Na intenção de otimizar o processo, o pH usualmente necessita ser ajustado para se adequar às outras condições do processo, incluindo o tipo de substrato e a concentração dos reagentes quelantes. Preferencialmente o pH é 4-5. A razão molar [metanol]/[resíduo de ácido graxo] deve ser pelo menos 0,1 e no máximo 10, preferencialmente entre 0,3-5, mais preferencialmente 0,4-2. O álcool pode ser adicionado em estágios definidos à reação ao longo do tempo. A água pode ser adicionada separadamente ou em uma solução aquosa de enzima. A concentração final de água na mistura de reação pode ser 0-50% (peso/peso), preferencialmente 5-40%, mais preferencialmente 5-30%. O substrato compreende 1-99% (peso/peso) de triglicerídeo, preferencialmente na faixa de 70-95%. Além disso, o substrato pode possuir ácidos graxos livres chegando a 0,01-95% (peso/peso), preferencialmente na faixa de 0,01-30%. Também, mono e diglicerídeos e fosfolipídeos podem estar presentes. O curso da reação pode ser seguido pela remoção de amostras da mistura de reação após um certo período do tempo de reação. As amostras são centrifugadas por 14 minutos a 14000 rpm. A camada superior consiste em material graxo insolúvel na fase aquosa e essa é analisada por 'H RMN (utilizando-se CDCl^ como solvente). O tratamento enzimático é seguido pela separação da fase aquosa e a fase oleosa. Essa separação pode ser realizada por meios convencionais, e.g. centrifugação, decantação ou sedimentação. O montante de enzima lipolítica adicionado pode ser determinado nos termos de atividade lipolítica sobre tributirina (LU). Um substrato para enzimas lipolíticas é preparadas pela emulsifícação de tributirina (tributirato de glicerina) utilizando goma Arábica como emulsificador. A hídrólise de tributirina a 30°C a pH 7 é seguida por um experimento “titulação em pH-stat”. Uma unidade de atividade de lípase (1 LU) é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ácido butírico/mín em condições padrão. O teor de fósforo na fase graxa após 24 h de tempo de reação é determinado como descrito por Clausen, K. Eur. J. Lipid Sei. Technol. 103 (2001), 333-340. O método da presente invenção pode ser ainda mais otimizado pela adição de agentes quelantes, que quelam componentes metálicos na mistura de reação assim aumentando a quantidade de fosfolipídeos hidratáveis na fase aquosa. Agentes quelantes com ácido cítrico ou ácido etilenodiaminatetracético (EDTA) podem ser adicionados numa faixa de 0,011% peso/peso baseados no teor de óleo. Quantidades preferidas são 0,040,1%.Typically an enzymatic degumming takes place at pH 3-7. In order to optimize the process, the pH usually needs to be adjusted to suit other process conditions, including substrate type and chelating reagent concentration. Preferably the pH is 4-5. The molar ratio [methanol] / [fatty acid residue] should be at least 0.1 and at most 10, preferably between 0.3-5, more preferably 0.4-2. Alcohol may be added at defined stages to the reaction over time. Water may be added separately or in an aqueous enzyme solution. The final concentration of water in the reaction mixture may be 0-50% (w / w), preferably 5-40%, more preferably 5-30%. The substrate comprises 1-99% (weight / weight) triglyceride, preferably in the range 70-95%. In addition, the substrate may have free fatty acids up to 0.01-95% (weight / weight), preferably in the range 0.01-30%. Also, mono and diglycerides and phospholipids may be present. The reaction course may be followed by removing samples from the reaction mixture after a certain period of reaction time. Samples are centrifuged for 14 minutes at 14000 rpm. The upper layer consists of aqueous-insoluble fatty material and is analyzed by1 H NMR (using CDCl3 as solvent). Enzymatic treatment is followed by separation of the aqueous phase and the oil phase. Such separation may be accomplished by conventional means, e.g. centrifugation, decantation or sedimentation. The amount of lipolytic enzyme added may be determined in terms of lipolytic activity on tributyrin (LU). A substrate for lipolytic enzymes is prepared by the emulsification of tributyrin (glycerine tributyrate) using gum Arabic as an emulsifier. Tributyrin hydrolysis at 30 ° C at pH 7 is followed by a pH-stat titration experiment. One unit of lipase activity (1 LU) is equal to the amount of enzyme capable of releasing 1 pmol of butyric acid / min under standard conditions. The phosphorus content in the grease phase after 24 h reaction time is determined as described by Clausen, K. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103 (2001), 333-340. The method of the present invention can be further optimized by the addition of chelating agents, which chelate metal components in the reaction mixture thereby increasing the amount of hydratable phospholipids in the aqueous phase. Citric acid or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) chelating agents may be added in a range of 0.011 wt.% Based on oil content. Preferred amounts are 0.040.1%.

Após a remoção de compostos contendo fósforo da fase aquosa descarregada, as enzimas presentes na fase aquosa podem ser completamente ou parcialmente recicladas misturando-se novamente a fase aquosa na mistura de reação incluindo substrato novo. O teor de componentes contendo fósforo na fase graxa da mistura de reação pode ser ainda reduzido por tratamento com sílica, que absorve os fosfolipídeos entre outros.After removal of phosphorus-containing compounds from the discharged aqueous phase, the enzymes present in the aqueous phase may be completely or partially recycled by re-mixing the aqueous phase into the reaction mixture including fresh substrate. The content of phosphorus-containing components in the grease phase of the reaction mixture can be further reduced by treatment with silica, which absorbs phospholipids among others.

Clonando uma seqüência de DNA codificando uma enzima li política ou uma fosfolipase A seqüência de DNA codificando uma enzima lipolítica parente ou uma fosfolipase pode ser isolada de qualquer célula ou microorganismo produzindo a enzima em questão, utilizando diversos métodos bem conhecidos no meio. Primeiro, um DNA genômico e/ou uma biblioteca de cDNA pode ser construída utilizando DNA cromossômico ou RNA mensageiro do organismo que produz a enzima a ser estudada. Então, se a seqüência de aminoácidos da enzima lipolítica ou fosfolipase é conhecida, sondas marcadas de oligonucleotídeos podem ser sintetizadas e utilizadas para identificar clones codificando enzimas lipolíticas ou fosfolipases de uma biblioteca genômica preparada do organismo em questão. Altemativamente, uma sonda marcada de oligonucleotídeo contendo seqüências homólogas a outros genes de enzimas lipolíticas ou fosfolipases conhecidos pode ser utilizada como sonda para identificar clones codificando enzimas relevantes, utilizando hibridização e condições de lavagem de menor estringência.Cloning a DNA sequence encoding a lytic enzyme or a phospholipase The DNA sequence encoding a parent lipolytic enzyme or a phospholipase can be isolated from any cell or microorganism producing the enzyme in question using various methods well known in the art. First, a genomic DNA and / or cDNA library can be constructed using chromosomal DNA or messenger RNA from the organism that produces the enzyme being studied. Thus, if the amino acid sequence of the lipolytic enzyme or phospholipase is known, labeled oligonucleotide probes can be synthesized and used to identify clones encoding lipolytic enzymes or phospholipases from a prepared genomic library of the organism in question. Alternatively, a labeled oligonucleotide probe containing sequences homologous to other known lipolytic enzyme genes or phospholipases may be used as a probe to identify clones encoding relevant enzymes using hybridization and lower stringency wash conditions.

Ainda outro método para identificar clones codificando enzimas lipolíticas ou fosfolipases pode envolver inserir fragmentos de DNA genômico em um vetor de expressão, como um plasmídeo, transformando bactérias cutinase negativas com a biblioteca de DNA genômico resultante, e então plaqueando a bactéria transformada em Agar contendo um substrato para enzimas lipolíticas ou fosfolipases (i.e. triglicerídeo), assim permitindo os clones a expressarem a enzima lipolítica a ser identificada.Still another method for identifying clones encoding lipolytic enzymes or phospholipases may involve inserting genomic DNA fragments into an expression vector, such as a plasmid, transforming negative cutinase bacteria with the resulting genomic DNA library, and then plating the agar-transformed bacterium containing a substrate for lipolytic enzymes or phospholipases (ie triglyceride), thus allowing clones to express the lipolytic enzyme to be identified.

Altemativamente, a seqüência de DNA codificando a enzima pode ser preparada sinteticamente por métodos padrões estabelecidos, e.g. o método “ibsforoamidita" descrito por S.L. Beaucage and M.H. Caruthers (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859* 1869, ou o método descrito por Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p.801-805. No método “fosforoamidita”, oligonucleotídeos sào sintetizados, e.g. em um sintetizador automático de DNA, purificado, anelado, ligado e clonado em vetores apropriados.Alternatively, the enzyme-encoding DNA sequence may be synthetically prepared by established standard methods, eg the ibsforoamidite method described by SL Beaucage and MH Caruthers (1981), Tetrahedron Letters 22, p. 1859 * 1869, or the method described by Matthes et al., (1984), EMBO J. 3, p.801-805 In the phosphoramidite method, oligonucleotides are synthesized, eg in a purified, annealed, ligated, and cloned automated DNA synthesizer in appropriate vectors.

Finalmente, a seqüência de DNA pode ser de origem misturada genômica e sintética, origem misturada sintética e de cDNA ou origem misturada genômica e cDNA, preparados por fragmentos se ligantes de origem sintética, genômica ou cDNA (como apropriado, os fragmentos correspondendo a várias partes da seqüência de DNA inteira), em acordo com técnicas padrão. A seqüência de DNA pode também ser preparada por reação de polimerização de múltiplas cadeias (PCR) utilizando iniciadores específicos, por exemplo, como descrito em US 4,683,202 ou R.K. Saiki et al., (1988), Science 239, 1988, p. 487-491.Finally, the DNA sequence may be of genomic and synthetic mixed origin, synthetic and cDNA mixed origin, or genomic and cDNA mixed origin prepared by ligand and synthetic fragments of genomic or cDNA origin (as appropriate, fragments corresponding to several parts). of the entire DNA sequence) according to standard techniques. The DNA sequence may also be prepared by multi-chain polymerization (PCR) reaction using specific primers, for example as described in US 4,683,202 or R.K. Saiki et al. (1988), Science 239, 1988, p. 487-491.

Vetor de expressão O vetor recombinante de expressão carreando a seqüência de DNA que codifica uma enzima lipolítica ou uma fosfolipase do método da invenção pode ser qualquer vetor que possa ser convenientemente ser submetido a procedimentos de recombinação de DNA, e a escolha do vetor vai também depender da célula hospedeira no qual este vai ser introduzido. O vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) no qual ele foi integrado. Exemplos de vetores de expressão adequados incluem pMT838. O vetor de expressão da invenção pode também conter um terminador de transcrição adequado e, em eucariotos, seqüências de poliadenilação operáveis conectadas a seqüência de DNA codificando a enzima lipolítica ou fosfolipase do método da invenção. Seqüências de terminação e poliadenilação podem ser adequadamente serem derivadas das mesmas fontes do promotor. O vetor pode conter uma seqüência de DNA que permita o vetor a replicar na célula hospedeira em questão. Exemplos de tais seqüências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19, pACYC177, pUBllO, pE194, pAMBl e pIJ702. O vetor pode ter ainda um marcador selecionável, e.g. um gene cujo produto complemente um defeito na célula hospedeira, como os genes dal de B, subtilis ou B. licheniformis, ou um que confira resistência a antibióticos como resistência a ampicílina, canamicina, clorofenicol ou tetraciclina. Ainda mais, o vetor pode conter marcadores selecionáveis de Aspergülus como amdS, ergB, niaD e sC, um marcador dando origem à resistência à higromicína, ou a seleção pode ser feita por co-transformação, e.g. como descrito em WO 91/17243.Expression Vector The recombinant expression vector carrying the DNA sequence encoding a lipolytic enzyme or a phospholipase of the method of the invention may be any vector that may conveniently be subjected to DNA recombination procedures, and the choice of vector will also depend upon. of the host cell into which it will be introduced. The vector may be one which, when introduced into a host cell, is integrated into the host cell genome and replicated together with the chromosome (s) into which it has been integrated. Examples of suitable expression vectors include pMT838. The expression vector of the invention may also contain a suitable transcription terminator and, in eukaryotes, operable polyadenylation sequences connected to the DNA sequence encoding the lipolytic enzyme or phospholipase of the method of the invention. Termination and polyadenylation sequences may suitably be derived from the same promoter sources. The vector may contain a DNA sequence that allows the vector to replicate in the host cell in question. Examples of such sequences are the origins of replication of plasmids pUC19, pACYC177, pUB10, pE194, pAMB1 and pIJ702. The vector may also have a selectable marker, eg a gene whose product complements a host cell defect, such as the dal of B, subtilis or B. licheniformis, or one that confers antibiotic resistance such as ampicillin, kanamycin, chlorophenicol or tetracycline. Further, the vector may contain selectable Aspergülus markers such as amdS, ergB, niaD and sC, a marker giving rise to hygromycin resistance, or selection may be made by co-transformation, e.g. as described in WO 91/17243.

Os procedimentos utilizados para ligar o construto de DNA da invenção codificando uma variante de cutinase, o promotor, terminador e outros elementos, respectivamente, e inseri-los em vetores adequados contendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos por pessoas treinadas na área (cf., como exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).Procedures used to ligate the DNA construct of the invention encoding a cutinase variant, promoter, terminator and other elements, respectively, and inserting them into suitable vectors containing the information necessary for replication, are well known to those of ordinary skill in the art ( see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989).

Promotor No vetor, a seqüência de DNA pode ser operaveImente conectada a uma seqüência promotora adequada. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que mostre atividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivada de genes codificando proteínas ambas homólogas ou heterólogas à célula hospedeira.Promoter In the vector, the DNA sequence can be operably linked to a suitable promoter sequence. The promoter may be any DNA sequence that shows transcriptional activity in the host cell of choice and may be derived from genes encoding proteins either homologous or heterologous to the host cell.

Exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição da seqüência de DNA codificando uma enzima lipolítica ou fosfolipase, especialmente em hospedeiro bacteriano, são os promotores do operon lac de E.coli, os promotores do gene de agarase dagA de Streptomyces coeliclolor, os promotores do gene de alfa-amilase (amyL) do Bacillus licheniformis, os promotores do gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, os promotores do gene da alfa amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtilis etc. Para transcrição em um hospedeiro fungico, exemplos de promotores úteis são aqueles derivados do gene que codifica a TAK amilase de A. oiyzae, o promotor TPI (triose fosfato isomerase) de 5. cerevisae (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1, p.419-434), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de A. niger, alfa-amilase estável de A. niger, glicoaminase de A, niger, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A oryzae, ou acetamidase de A. nidulans. Células hospedeiras Uma célula hospedeira para a produção de enzimas utilizadas no método da invenção, tanto contendo um construto de DNA ou um vetor de expressão da invenção como definido acima, é vantajosamente utilizada como célula hospedeira na produção recombinante de uma enzima lipolítica ou uma fosfolipase. A célula pode ser transformada com um construto de DNA codificando uma enzima lipolítica ou uma fosfolipase, convenientemente pela integração do construto de DNA (em uma ou mais cópias) no cromossomo do hospedeiro. Esta integração é geralmente considerada ser uma vantagem já que a seqüência de DNA é mais provavelmente mantida de forma estável na célula. A integração de construtos de DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodos convencionais, e.g. por recombinação homóloga ou heteróloga. Altemativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressão como descrito acima em conexão com diferentes tipos de células hospedeiras. A célula hospedeira pode ser uma célula de um organismo superior como um mamífero ou um inseto, particularmente uma célula microbiana e.g. uma célula bacteriana ou tüngica (incluindo leveduras).Examples of suitable promoters for directing DNA sequence transcription encoding a lipolytic enzyme or phospholipase, especially in bacterial host, are E. coli operon lac promoters, Streptomyces coeliclolor dagA agarase gene promoters, gene promoters. licheniformis alpha-amylase (amyL) promoters, Bacillus stearothermophilus amylase (amyM) gene promoters, Bacillus amyloliquefaciens alpha amylase (amyQ) gene promoters, Bacillus subylis xylA and xylB gene promoters . For transcription in a fungal host, examples of useful promoters are those derived from the A. oiyzae TAK amylase encoding gene, the 5. cerevisae TPI (triose phosphate isomerase) promoter (Alber et al. (1982), J. Mol. Appl Genet 1, p.419-434), Rhizomucor miehei aspartic proteinase, neutral A. niger alpha-amylase, stable A. niger alpha-amylase, A, niger glycoaminase, Rhizomucor miehei lipase, protease oryzae alkaline, A. oryzae triose phosphate isomerase, or A. nidulans acetamidase. Host Cells An enzyme producing host cell used in the method of the invention, whether containing a DNA construct or an expression vector of the invention as defined above, is advantageously used as a host cell in the recombinant production of a lipolytic enzyme or a phospholipase. The cell may be transformed with a DNA construct encoding a lipolytic enzyme or a phospholipase, conveniently by integrating the DNA construct (into one or more copies) into the host chromosome. This integration is generally considered to be an advantage as the DNA sequence is most likely to be stable in the cell. Integration of DNA constructs into the host chromosome may be performed according to conventional methods, e.g. by homologous or heterologous recombination. Alternatively, the cell may be transformed with an expression vector as described above in connection with different host cell types. The host cell may be a cell of a higher organism such as a mammal or an insect, particularly a microbial cell e.g. a bacterial or tungsten cell (including yeast).

Exemplos de bactérias utilizáveis são bactérias Gram positivas como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacllus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulam, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, ou Streptomyces lividans ou Streptomyces murinus, ou bactérias Gram negativas como E. coli. A transformação da bactéria pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto ou utilizando células competentes de maneira conhecida per se. A levedura pode ser selecionada favoravelmente de uma espécie de Saccharomyces ou Schizosaccharomyces, e.g. Saccharomyces cerevisiae, A célula hospedeira pode também ser um fungo filamentoso e.g. uma cepa pertencendo a uma espécie de Aspergillus, particularmente Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger, ou uma cepa de Fusarium, como uma cepa de Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum (em estado perfeito chamado de Gibberella zeae, previamente Sphaeria zeae, sinônimo de Giberella roseum e Gibberella roseum f. sp. cerealis), ou Fusarium sulphureum (em estado perfeito chamado Gibberella puricaris, sinônimo com Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucinum, Fusarium roseum, e Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinônimo com Fusarium crokkwellense), ou Fusarium venenatum.Examples of usable bacteria are Gram positive bacteria such as Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacllus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulate, Bacillus lautus, Bacillus megidomythus or Bacillus thymus, Bacillus murinus, or Gram negative bacteria such as E. coli. Transformation of the bacteria may, for example, be effected by protoplast transformation or using competent cells in a manner known per se. Yeast may be favorably selected from a species of Saccharomyces or Schizosaccharomyces, eg Saccharomyces cerevisiae. The host cell may also be a filamentous fungus eg a strain belonging to a species of Aspergillus, particularly Aspergillus oryzae or Aspergillus niger, or a Fusarium strain. as a strain of Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum (in perfect state called Gibberella zeae, previously Sphaeria zeae, synonymous with Giberella roseum and Gibberella roseum f. cerealis), or Fusarium sulphureum (in perfect state called Gibberella puricaris, synonymous with Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusarium sambucinum, Fusarium roseum, and Fusarium roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (synonym with Fusarium crokkenseense), or Fusarium venenatum.

Em um exemplo concreto particular a célula hospedeira é cepa deficiente de protease ou de menos protease. Esta pode, por exemplo, ser a cepa deficiente em protease de Aspergillus oryzae Jal 125 tendo o gene de protease alcalina chamado “alp” deletado. Essa cepa é descrita em WO 97/35956 (Novo Nordisk). Células de fungo filamentoso podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplasto e transformação do proioplasio seguida pela regeneração da parede celular em uma maneira conhecida per se, O uso de Aspergiiius como microorganismo hospedeiro é descrito em EP 238 023 (Novo Nordisk A/S), o teor do qual é aqui incorporado como referência.In a particular concrete example the host cell is a protease or minus protease deficient strain. This may, for example, be the protease-deficient strain of Aspergillus oryzae Jal 125 having the alkaline protease gene called "alp" deleted. Such a strain is described in WO 97/35956 (Novo Nordisk). Filamentous fungus cells can be transformed by a process involving protoplast formation and proioplasm transformation followed by cell wall regeneration in a manner known per se. The use of Aspergiiius as a host microorganism is described in EP 238 023 (Novo Nordisk A / S), the content of which is incorporated herein by reference.

Produção de enzimas lípolfticas ou fosfolipases pelo cultivo do transformante As enzimas utilizadas no método da invenção podem ser produzidas por um método compreendendo cultivar uma célula hospedeira sob condições que conduzam à produção das enzimas e recuperação das enzimas das células ou do meio de cultura. O meio utilizado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequa ve I para crescer a célula hospedeira em questão e obter expressão da enzima lipolítica da invenção. Meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (e.g. como descrito em catálogos da American Type Culture Collectíon). As enzimas lípolfticas e fosfolipases secretadas das células hospedeiras podem ser conveniente mente recuperadas do meio de cultura por procedimentos bem conhecidos, incluindo separação das células do meio por centrifugação ou filtração, c precipitando os componentes protéicos do meio por meio de saís como sulfato de amônio. seguido de procedimentos cromaiográficos como cromaiograíia de troca iôníca, cromaiografia de afinidade, ou similares.Production of lipolytic enzymes or phospholipases by culturing the transformant The enzymes used in the method of the invention may be produced by a method comprising culturing a host cell under conditions that lead to enzyme production and enzyme recovery from the cells or culture medium. The medium used to grow the cells may be any suitable conventional means for growing the host cell in question and obtaining expression of the lipolytic enzyme of the invention. Suitable media are available from commercial suppliers or may be prepared according to published recipes (e.g. as described in American Type Culture Collecton catalogs). Host cell secreted lipolytic enzymes and phospholipases may conveniently be recovered from the culture medium by well-known procedures, including separation of the cells from the medium by centrifugation or filtration, and precipitating the protein components of the medium by means such as ammonium sulfate. followed by chromatographic procedures such as ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like.

EXEMPLOEXAMPLE

Transesteri íicação e degomação de óleo cru de colza A formação de metil ésteres de ácidos graxos de teor de fósforo reduzido de óleo de colza cru utiliza uma enzima lipolítica e uma fosfolipase.Transesterification and degumming of rapeseed crude oil The formation of reduced phosphorous methyl fatty acid esters in crude rapeseed utilizes a lipolytic enzyme and a phospholipase.

Enzima lipolítica: variante de lípase de Thermomyces lanuginosus dc acordo com WO 00/60063, dosagem: 4.000 LU/8 gramas dc óleo. Fosfolipase: variante da fosfolipase de Thermomyces lanuginosus de acordo com WO 00/32758, Exemplo 5 (atividade 10.000 LU/g), dosando: 30 ppm ou 100 ppm (correspondendo a 300 e 1000 LU/kg de óleo, respectivamente). Substrato: Oleo de colza 100% cru, 8 gramas. Teor de metanol: 1,5 equivalente molar baseado em óleo, 1,72 ml. 30% de H20 baseado no peso de óleo. Tempo de amostragem: 3 e 24 horas. Temperatura de reação: 50°C. A mistura substrato-metanol é aquecida a 50°C em um banho agitador recíproco (200 rpm). Agua desmineralizada é adicionada (o volume dependendo do volume de enzima adicionado; quantidade total de água: 2,40 ml incluindo a água da adição de enzima), correspondendo a 30% peso/peso do óleo. A mistura é aquecida a 50°C. Então as enzimas (lípase e fosfolipase) são adicionadas à mistura e misturadas em um misturador de alto cisalhamento (Ultra Turrax® T25, IKA Janke e Kunkel, Alemanha) por 30 segundos, e deixadas em um banho agitador de água por 24 horas (agitamento recíproco, 50°C e 200 rpm).Lipolytic Enzyme: Thermomyces lanuginosus lipase variant according to WO 00/60063, dosage: 4,000 LU / 8 grams of oil. Phospholipase: Phospholipase variant of Thermomyces lanuginosus according to WO 00/32758, Example 5 (activity 10,000 LU / g), dosing: 30 ppm or 100 ppm (corresponding to 300 and 1000 LU / kg oil, respectively). Substrate: 100% raw rapeseed oil, 8 grams. Methanol content: 1.5 oil-based molar equivalent, 1.72 ml. 30% H20 based on oil weight. Sampling time: 3 and 24 hours. Reaction temperature: 50 ° C. The substrate-methanol mixture is heated to 50 ° C in a reciprocal shaker bath (200 rpm). Demineralized water is added (volume depending on volume of enzyme added; total amount of water: 2.40 ml including water of enzyme addition), corresponding to 30 wt% oil. The mixture is heated to 50 ° C. Then the enzymes (lipase and phospholipase) are added to the mixture and mixed in a high shear mixer (Ultra Turrax® T25, IKA Janke and Kunkel, Germany) for 30 seconds, and left in a water shaker bath for 24 hours (shaking reciprocal, 50 ° C and 200 rpm).

Amostras são removidas da mistura de reação após 3 e 24 horas de tempo de reação, respectivamente e centrifugadas por 14 minutos a 14000 rpm. A camada superior consiste de material graxo não solúvel na fase aquosa e essa é analisada por 'H RMN (utilizando CDCI3 como solvente) espectrômetro Varian 400 MHz (Varian Inc. CA, EUA). A conversão dos resíduos de ácidos graxos em ácido graxo metil éster é determinada pela razão de sinais de metil dos metil ésteres de ácidos graxos, -COOCH3 (3,70 ppm) e CH3CH2- (1,0-0,9 ppm) dos resíduos de ácidos graxos.Samples are removed from the reaction mixture after 3 and 24 hours of reaction time respectively and centrifuged for 14 minutes at 14000 rpm. The upper layer consists of non-soluble fatty material in the aqueous phase and is analyzed by1 H NMR (using CDCl3 as solvent) Varian 400 MHz spectrometer (Varian Inc. CA, USA). The conversion of fatty acid residues to fatty acid methyl ester is determined by the ratio of methyl signals of the fatty acid methyl esters, -COOCH3 (3.70 ppm) and CH3CH2- (1.0-0.9 ppm) of the residues. of fatty acids.

Nenhuma formação de metil éster foi encontrada nos experimentos sem lípase e fosfolipase nem nos experimentos com somente fosfolipase. O teor de fósforo na fase graxa após 24 h de tempo de reação foi determinado como descrito em Clausen, K. Eur. J. Lipid Sei. Technol. 103 (2001), 333-340.No methyl ester formation was found in the experiments without lipase and phospholipase or in experiments with only phospholipase. The phosphorus content in the grease phase after 24 h reaction time was determined as described in Clausen, K. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 103 (2001), 333-340.

Tabela 1. Teor de fósforo e formação de metil éster após tratamentc enzimático Está evidente que a combinação de uma enzima lipolítica e uma fosfolipase resulta em uma alta conversão de triglicerídeo para metil ésteres e em um teor baixo de componentes contendo fósforo em um métodc de única etapa.Table 1. Phosphorus content and methyl ester formation after enzymatic treatment It is evident that the combination of a lipolytic enzyme and a phospholipase results in a high conversion of triglyceride to methyl esters and a low content of phosphorus-containing components in a single method. stage.

REIVINDICAÇÕES

Claims

A method for producing reduced phosphorus alkyl fatty acid esters by combined transesterification and degumming, comprising mixing an alcohol, a substrate comprising triglyceride and / or fatty acids, with one or more lipases, and one or more phospholipases and water, where the molar ratio of alcohol to fatty acid residues is at least 0,1 and at most 10.

A method according to claim 1, characterized in that the phosphorus content of alkyl fatty acid esters is reduced to no more than 50 ppm.

Method according to claim 1, characterized in that the phosphorus content of alkyl fatty acid esters is reduced to no more than 20 ppm.

Method according to any one of Claims 1 to 3, characterized in that the substrate further comprises free fatty acids in the range 0.01-95% by weight of free fatty acids.

A method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the triglyceride is derived from one or more feedstock of vegetable oil, eolza oil, soybean oil, mustard oil, sunflower oil, canola oil, coconut oil, hemp oil, palm oil, talole, animal fats including tallow, lard, fish and poultry oil, in which the oils and fats may be crude, degummed in water, refined quality. or disposal,

Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the molar ratio of alcohol to fatty acid residues is in the range 0.3-5.

Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the molar ratio of alcohol to fatty acid residues is in the range 0.4-2.

Method according to any one of claims 1-7, characterized in that the alcohol is methanol or ethanol.

Method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the reaction mixture comprises water up to 509% (weight / weight).

A method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that the temperature is 30-100 ° C.

A method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the phospholipase is selected from a group consisting of the phospholipases of a Fusa strain, a cuimorum, Fusarium heterospomm, Fusarium sohmi, Fusarium axysporum, Aspergius awamori, Aspergillus foetidm, Aspergius japonicus, Aspergiusus niger, Aspergiusus oryzae and Thermomyce.s kuutginosus.

Method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that the chelating agent is added in the range of 0.01 -1% w / w, based on the oil content.

Method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that the process is carried out in a beat mode.

Method according to any one of Claims 1 to 13, characterized in that the method is carried out continuously.

Method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the solution phases of the reaction mixture are mixed in a high shear mixer.

Method according to any one of Claims 1 to 15, characterized in that the method is conducted in a counter current mode.

A method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that the aqueous phase including the enzymes is wholly or partially recycled into the reaction mixture, wherein the reaction mixture also contains new substrate.