BRPI0611453A2 - método de ensaio da toleráncia herbicida em uma planta - Google Patents

Abstract

MéTODO DE ENSAIO DA TOLERáNCIA HERBICIDA EM UMA PLANTA.A presente invenção refere-se a um método de avaliação de tolerância herbicida em uma planta. O método de determinação de tolerância herbicida em plantas compreende a aplicação do herbicida a ser testado em conjunção com pelo menos um herbicida suplementar, a determinação da extensão de dano resultante, e correlação da extensão do dano com relação à tolerância herbicida da planta.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INTERAÇAODE GLIFOSATO COM HERBICIDAS DE INIBIDOR DE FOTO-SISTEMA IlCOMO UMA FERRAMENTA DE SELEÇÃO PARA EVENTOS DE ROUN-DUP READY".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se, de maneira genérica, à avaliaçãoda tolerância herbicida em plantas. Mais particularmente, a invenção refere-se à avaliação da tolerância a glifosato em plantas monocotiledôneas e dico-tiledôneas, tais como milho, arroz, trigo, algodão, soja, canola, amendoim,feijão, lentilha, alfafa e açafrão.

Antecedentes

Milho é uma cultura importante e é a fonte de alimentação primá-ria para seres humanos e animais domesticados em muitas áreas do mundo.

Os processos de biotecnologia têm sido aplicados ao milho para aperfeiço-amento das características agronômicas e da qualidade do produto. Uma talcaracterística agronômica é a tolerância herbicida, em particular, a tolerânciaao herbicida glifosato. Essa característica em milho pode ser conferida pelaexpressão de um transgene nas plantas de milho.

Sabe-se que expressão de genes exógenos em plantas é influ-enciada por sua posição cromossomial, talvez devido à estrutura de cromati-na (por exemplo, heterocromatina) ou à proximidade a elementos de regula-ção transcricional (por exemplo, intensificadores) próximos ao sítio de inte-gração. Weising et al., Ann. Rev. Genet (1988) 22, 421-477. Por essa razão,é freqüentemente necessário selecionar um grande número de eventos, afim de identificar um evento caracterizado por expressão ótima de um genede interesse introduzido. Por exemplo, foi observado, em plantas e em ou-tros organismos, que pode haver uma ampla variação em níveis de expres-são de um gene introduzido entre eventos. Também pode haver diferençasem padrões de expressão espaciais ou temporais, por exemplo, diferençasna expressão relativa de um transgene em vários tecidos de plantas, quepodem não corresponder aos padrões esperados a partir de elementos regu-ladores transcricionais presentes no construto de gene introduzido.Por essa razão, é comum produzir centenas a milhares de even-tos diferentes e selecionar aqueles eventos com relação a um evento únicoque desejou níveis e padrões de expressão transgênica para finalidadescomerciais. Um evento que desejou níveis e padrões de expressão transgê-nica é útil para introgressão do transgene em outros contextos antecedentesgenéticos por "outcrossing" sexual usando-se métodos de cultivo conven-cionais. A progenia de tais cruzamentos mantêm as características de ex-pressão de transgene do transformante original. Essa estratégia é usadapara assegurar expressão de gene confiável em inúmeras variedades queestejam bem-adaptadas às condições de crescimento local.

Composições herbicidas compreendendo o herbicida N-fosfo-nometil-glicina, ou seus derivados ("glifosato"), são úteis para suprimir ocrescimento de, ou matar, plantas indesejadas, tais como gramíneas, ervase as similares. O glifosato inibe a via de ácido shiquímico, que conduz à bi-ossíntese de compostos aromáticos, incluindo aminoácidos e vitaminas. Demaneira significativa, o glifosato inibe a conversão de ácido fosfoenolpirúvicoe ácido 3-fosfoshiquímico em ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico, por inibi-ção da enzima ácido 5-enolpiruvil-3- fosfoshiquímico sintase (EPSP sintaseou EPSPS). Isso conduz à depleção de aminoácidos chave, que são neces-sários para a síntese de proteína e o crescimento da planta. Tipicamente, oglifosato é aplicado a e é absorvido pela folhagem da planta alvo. O glifosatose transloca para cima no xilema e para baixo no floema, em geral, causan-do dano ao crescimento novo. A folhagem de planta tratada com glifosatoprimeiramente amarela (primeiro as folhas novas) e, então, se torna marrome morre dentro de 10 -14 dias, depois da aplicação do herbicida.

A resistência ao glifosato pode ser obtida em uma planta por in-trodução de um transgene que codifica EPSPS, especialmente quando otransgene codifica uma enzima de EPSPS insensível a glifosato. Portanto,uma vez que o herbicida glifosato funciona para matar a célula por interrup-ção da biossíntese de aminoácidos, particularmente no cloroplasto da célula,a expressão da seqüência de EPSPS, fundida a uma seqüência de peptídeode trânsito em cloroplasto, permite resistência aumentada ao herbicida, porconcentração de qual enzima de resistência a glifosato a célula expresse nocloroplasto, isto é, na organela alvo da célula. Exemplos de enzimas de re-sistência a herbicida incluem genes de EPSPS e de glifosato óxido-redutase(GOX) (ver Cornai, 1985, patente norte-americana de número 4.535.060,especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade).

A clorose em folhas recém-expandidas de plantas de RoundupReady pode ocorrer seguindo-se á aplicação de glifosato. Refere-se a issocomo "yellow flash", porque ele é expresso tipicamente de uma maneiratransitória. Esse fenômeno é especialmente pronunciado em folhas de soja,onde a clorose pode ocorrer no mais novo trifoliado que se expande e, al-gumas vezes, no trifoliado subseqüente, porém, então, normalmente desa-parece conforme a planta continua a crescer. Esses sintomas são vistosmuitíssimo freqüentemente no campo sob condições de crescimento eleva-do. Para soja, essa situação pode ser facilmente duplicada na estufa e a ex-pressão consistente em "yellow flash" é obtida seguindo-se a aplicação deglifosato.

O "yellow flash" ocorre muito menos freqüentemente e, histori-camente, tem sido mais difícil reproduzir em milho Roundup Ready. Inúme-ros estudos em estufa, com vários híbridos de milho Roundup Ready, falha-ram em mostrar essa sintomatologia em uma base consistente, ou, quandoela ocorre, em um nível de expressão elevado.

A seleção corrente de eventos em milho Roundup Ready exige atestagem no campo, a fim de discernir diferenças relativas de tolerância aglifosato. Isso é devido ao fato de que a tolerância vegetativa precoce desteseventos a glifosato é muito elevada e o dano à cultura não é visto de manei-ra freqüente até ou estágio V8 de crescimento ou mais tarde. Embora a mai-oria da tolerância da planta a herbicidas esteja, em geral, diretamente rela-cionada ao tamanho da planta (isto é, plantas grandes são mais difíceis dematar do que aquelas pequenas), sabe-se que a tolerância de milho a mui-tos herbicidas diminui com o tamanho da planta crescente. Isso pode estarligado a uma mudança rápida de propriedades de cutícula de folha de milhoa partir do estágio V5 a V8 (ver Hennig-Gizewski e Wirth, PflanzenschutzNachrichten Bayer (2000) 53, 105-125) (observando-se que o milho foi a Cí-nica espécie de planta estudada que teve essas mudanças rápidas de carac-terísticas de cutícula, e a resposta foi consistente com vários híbridos e complantas cultivadas no campo ou em estufas). O estágio "V" descreve o nú-mero de folhas o mais baixo possível com colares visíveis; por exemplo, emV4, há quatro folhas com colares visíveis. A iniciação de broto de espiga ede formação de franjas em milho são, usualmente, completados em torno doestágio V5. Essas estruturas reprodutivas são freqüentemente sensíveis aherbicidas.

A seleção de novos eventos em milho Roundup Ready, com ba-se em tolerância a glifosato tem sido difícil, devido ao fato de que examesem estufa/câmara de crescimento não têm sido eficazes em discernir váriosníveis de tolerância. Tipicamente, novos eventos em milho Roundup Readyexigem testagem no campo, onde a tolerância diferencial é observada so-mente no estágio de crescimento de folha 8 ou mais tarde. Por exemplo, sa-be-se que o híbrido de milho Roundup Ready NK 603, no estágio de 4 folhase de 6 folhas é altamente tolerante a taxas elevadas de glifosato, a taxaselevadas de glifosato com sulfato de amônio, a taxas elevadas de glifosatoaplicado a milho sob estresse com frio, e aplicações seqüenciais de eleva-das taxas de glifosato a milho, com nenhuma sintomatologia de dano, talcomo clorose ou necrose. Como tal, previamente, tem sido difícil usar ex-pressão de dano precoce como uma ferramenta de seleção para resistênciaa glifosato em milho.

Sumário da Invenção

Dentre os vários aspectos da presente invenção, está um exameque possa permitir a discriminação de tolerância a herbicida em diferenteseventos em plantas transgênicas em um estágio precoce, e, de preferência,em testagem em estufa/câmara de crescimento, com substanciais economi-as de custos e de tempo. O processo da presente invenção é particularmen-te vantajoso em conexão com discriminação de tolerância a glifosato. Esseexame pode atuar como uma ferramenta de seleção para discriminar dentrevários eventos de Roundup Ready sobre sintomatologia de dano consisten-te.

De maneira breve, portanto, a presente invenção é dirigida a umprocesso para avaliação da tolerância herbicida em uma planta. O processocompreende a aplicação de um herbicida em relação ao qual a tolerânciaesteja sendo testada em conjunção com pelo menos um herbicida suple-mentar a uma planta, determinando a extensão do dano resultante, e corre-lação da extensão de dano à tolerância da planta ao herbicida testado.

Em uma concretização, o herbicida testado é glifosato e pelomenos um herbicida suplementar é inibidor de fotossistema Il (PSII).

Em outra concretização, a planta sendo testada é uma monocoti-ledônea. Em ainda outra concretização, a planta sendo testada é uma dicoti-ledônea.

Outros objetivos e características serão em parte evidentes e emparte destacadas nas partes que se seguem.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um gráfico de barras mostrando a inibição de cres-cimento percentual 10 dias depois do tratamento de 2 híbridos de evento emmilho (híbrido DK 580 com o evento GA 21 e o híbrido DKC-53-33 com oevento NK 603) como uma função do tipo (Lorox ou Sencor) e concentração(56, 112 ou 224 g/ha) de inibidor de fotossistema Il em conjunção com apli-cação de 840 g/ha de glifosato. A metodologia é descrita no Exemplo 1.

A figura 2 é um gráfico de barras mostrando inibição de cresci-mento percentual 10 dias depois do tratamento de 2 híbridos de evento emmilho (híbrido DK 580 com o evento GA 21 e o híbrido DKC-53-33 com oevento NK 603) como uma função do tipo (Lorox ou Sencor) e concentração(56, 112 ou 224 g/ha) de inibidor de fotossistema Il em conjunção com apli-cação de 1.680 g/ha de glifosato. A metodologia é descrita no Exemplo 1.

A figura 3 é um gráfico de barras mostrando inibição de cresci-mento percentual 10 dias depois do tratamento de 2 híbridos de evento emmilho (híbrido DK 580 com o evento GA 21 e o híbrido DKC-53-33 com oevento NK 603) como uma função do tipo (Lorox ou Sencor) e concentração(56, 112 ou 224 g/ha) de inibidor de fotossistema Il em conjunção com apli-cação de 3.360 g/ha de glifosato. A metodologia é descrita no Exemplo 1.

A figura 4 é um gráfico de barras mostrando inibição de cresci-mento percentual 11 dias depois do tratamento de 2 híbridos de evento emmilho (híbrido RX686 Roundup Ready com o evento GA 21 e o híbrido DKC-53-33 com o evento NK 603) como uma função do tipo (Lorox ou Sencor) econcentração (56, 112 ou 224 g/ha) de inibidor de fotossistema Il em conjun-ção com aplicação de 1.680 g/ha de glifosato. A metodologia é descrita noExemplo 2.

A figura 5 é um gráfico de barras mostrando inibição de cresci-mento percentual 11 dias depois do tratamento de 2 híbridos de evento emmilho (híbrido RX686 Roundup Ready com o evento GA 21 e o híbrido DKC-53-33 com o evento NK 603) como uma função do tipo (Lorox ou Sencor) econcentração (56, 112 ou 224 g/ha) de inibidor de fotossistema Il em conjun-ção com aplicação de 2.520 g/ha de glifosato. A metodologia é descrita noExemplo 2.

A figura 6 é um gráfico de barras mostrando inibição de cresci-mento percentual 11 dias depois do tratamento de 2 híbridos de evento emmilho (híbrido RX686 Roundup Ready com o evento GA 21 e o híbrido DKC-53-33 com o evento NK 603) como uma função do tipo (Lorox ou Sencor) econcentração (56, 112 ou 224 g/ha) de inibidor de fotossistema Il em conjun-ção com aplicação de 3.360 g/ha de glifosato. A metodologia é descrita noExemplo 2.

Abreviações e Definições

As seguintes definições e métodos são fornecidos para melhordefinir a presente invenção e para guiar aqueles versados na técnica na prá-tica da presente invenção. A menos se observado de maneira diferente, ostermos devem ser entendidos de acordo com o emprego convencional pelosversados na técnica.

"Glifosato" se refere a N-fosfonometilglicina e seus sais. Glifosa-to é o ingrediente ativo do herbicida Roundup® (Monsanto Co., St. Louis,MO). Tratamentos com "herbicida glifosato" se referem a tratamentos comos herbicidas Roundup®, Roundup Ultra® ou Roundup UltraMAX® ou qual-quer outra formulação contendo glifosato. Para as finalidades da presenteinvenção, o termo "glifosato" inclui qualquer forma herbicidamente ativa N-fosfonometilglicina (incluindo qualquer sal do mesmo) e outras formas queresultem na produção do ânion glifosato em plantas. Os tratamentos com"glifosato" se referem a tratamentos com a formulação de herbicida Roun-dup® ou Roundup Ultra®, a menos se afirmado de maneira diferente. For-mulações adicionais com atividade herbicida, que contenham N-fosfonometilglicina ou qualquer de seus sais, são aqui incluídas como umherbicida glifosato.

Tolerância a herbicida se refere à capacidade de uma fração deplantas transformadas, isto é, plantas com pelo menos um evento selecioná-vel, em sobreviverem a uma concentração do herbicida que mate essenci-almente todas as plantas não transformadas da mesma espécie sob asmesmas condições.

Conforme usado aqui, um evento de Roundup Ready confereum grau substancial de resistência a glifosato (isto é, tolerância a glifosato)em uma planta, se ela permite que uma fração selecionável de plantas trans-formadas sobrevivam a uma concentração de glifosato que mate essencial-mente todas as plantas não transformadas sob as mesmas condições.

Um "evento" é a inserção de um transgene particular em um lo-cal específico em um cromossoma. Os três fatores que diferenciam eventossão: (i) a identidade do transgene inserido; (ii) o Iocus de inserção e (iii) onúmero de cópias inseridas naquele locus. Um evento em milho transgênicoé produzido por transformação de uma célula de planta de milho com DNAheterólogo, isto é, um construto de ácido nucléico que inclua um transgenede interesse, perpetuação do evento de célula para célula quando o cromos-soma se replicar e as células se dividirem, regeneração de uma populaçãode plantas resultando da inserção do transgene no genoma da planta, e se-leção de uma planta particular caracterizada por inserção em um local parti-cular do genoma. Um evento no contexto de um evento em milho transgêni-co se refere a DNA a partir do transformante original e da sua progenia com-preendendo o DNA inserido e a seqüência genômica flanqueante, imediata-mente adjacente ao DNA inserido, que esperar-se-ia fossem transferidos auma progenia que recebe DNA inserido, incluindo o transgene de interessecomo o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental, queinclua o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a progeniaresultante de autofecundação) e uma linhagem parental que não contenha oDNA inserido. Mesmo depois de retro-cruzamento repetido com um parenterecorrente, o DNA inserido e o DNA flanqueante a partir do parente trans-formado está presente na progenia do cruzamento no mesmo local cromos-somial.

Descrição Detalhada da Invenção

Os inventores observaram que a aplicação de glifosato em con-junção com um inibidor de fotossistema Il (PSII) resulta em um grau de danoque se correlaciona com tolerância a glifosato em plantas de milho. Emboratais exames com glifosato/inibidor de PSII possam, em geral, ser usadospara determinar a tolerância a glifosato de uma variedade de espécies im-portantes em agricultura, eles oferecem vantagem particular na determina-ção da tolerância a glifosato de eventos em milho, nos quais ali tente a havermaior dificuldade na avaliação em plantas jovens.

A presente invenção fornece um método de avaliação da tole-rância herbicida em uma planta por cultivo da planta até uma idade de de-senvolvimento predeterminado ou durante um intervalo de tempo predeter-minado, aplicação de um herbicida para o qual a tolerância estiver sendotestada com relação à planta, aplicação de pelo menos um herbicida suple-mentar para o qual a tolerância não estiver sendo testada com relação àplanta, determinação da extensão do dano à planta, e correlação da exten-são de dano à tolerância da planta com relação ao herbicida testado. Emvárias concretizações da invenção, nenhum dano significativo é observadocom a aplicação do herbicida testado ou do herbicida suplementar isolada-mente; entretanto, a aplicação desses herbicidas em conjunto demonstrauma interação incitando dano na planto. Em outras concretizações, a aplica-ção do herbicida testado ou do herbicida suplementar resulta em algumaquantidade mensurável de dano, quando aplicado independentemente, e,além disso, a aplicação desses herbicidas em conjunto aumenta o danomensurável da planta. A resposta de dano diferencial é correlacionada à to-lerância da planta ao herbicida testado.

Em adição à testagem de tolerância da planta ao glifosato, opresente método também permite a determinação da tolerância da planta aoutros herbicidas. Já que um herbicida, em relação ao qual a tolerância esti-ver sendo testada, é selecionado, um versado na técnica pode selecionarum herbicida-Suplementar_com base em seu modo de ação. O herbicida su-plementar é selecionado de maneira tal de modo a intensificar o efeito doherbicida testado, de maneira que uma planta tratada com esses herbicidasexiba dano pronunciado, que possa estar correlacionado à tolerância daplanta ao herbicida testado. Inúmeras combinações diferentes de um herbi-cida testado e de um herbicida complementar para uso no método da pre-sente invenção são mostradas na Tabela 1.

Tabela 1

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Em várias das concretizações acima, o herbicida testado é glifo-sato. Conforme mencionado previamente, glifosato pode ser, por exemplo,N-fosfonometilglicina, um seu sal ou aduto, ou um composto que seja con-vertido em glifosato em tecidos de planta ou que, de outra maneira, forneçaíon glifosato. Nesse respeito, deve ser observado que o termo "glifosato",quando usado aqui, deve ser entendido para englobar tais derivados, a me-nos que o contexto exija de maneira diferente.

Sais de glifosato que podem ser usados de acordo com essainvenção incluem, mas, não estão restritos a, por exemplo, sais de metaisálcali (por exemplo, sais de sódio e de potássio), sais de amônio, sais dealquil-amônio (por exemplo, Ci-i6-alquil-amônio), sais de aleanolamônio (porexemplo, Ci-i6-alcanolamônio), sais de diamônio (por exemplo, dimetil-amônio), sais de alquilamina (por exemplo, sais de dimetilamina e isopropi-lamina), sais de alcanolamina (por exemplo, sais de etanolamina), sais dealquil-sulfônio (por exemplo, Ci-i6-alquil-sulfônio, por exemplo, sais de trime-il-sulfônio), sais de sulfoxônio, e suas misturas e combinações. Para algu-mas concretizações, sais de glifosato preferidos incluem, por exemplo, o salde potássio, o sal isopropilamina, o sal de amônio, o sal de diamônio, o salde sódio, o sal de monoetanolamina e o sal de trimetil-sulfônio.

Glifosato comercialmente disponível adequado inclui glifosato(Touchdown, Touchdown CF, Touchdown Pro), glifosato de isopropilamina(Accord, Accord XRT, AquaMaster, Backdraft SL, Campaign, Credit Duo,Credit Duo Extra, Credit Master, Credit Systemic, Credit Systemic Extra, Du-rango, Expert, Extra Credit 5, Extreme, Field Master, Forza, Glyfos, GlyfoaAquatic, Glyfos X-tra, Glyfos Pro, GIyKamba Broad Spectrum, Glyphomax,Glyphomax Plus, Glyphomax XRT, Glypro, Glypro Plus, Honcho, HonchoPlus, Imitator Plus, Journey, Landmaster BW, Landmaster II, OneStep, Pola-do L, Ranger PRO, Rattler, Rattler Plus, RazorBurn, Recoil, Riverdale AquaNeat, Riverdale Foresters, Riverdale Razor, Riverdale Razor Pro, Rodeo,RoundUp Original, RoundUp Original II, RoundUp Pro, RoundUp UItraMAX1RoundUp UItraMAX RT, RT Master), glifosato de monoamônio (Credit Duo,Credit Duo Extra, QuikPRO, RoundUp Pro Dry, RoundUp Ultra Dry) e glifo-sato de potássio (RoundUp Original MAX, RoundUp UItraMAX II, RoundUpWeatherMAX, RT Master II, Touchdown CT, Touchdown HiTech).

As propriedades herbicidas de N-fosfonometilglicina e seus deri-vados foram, primeiro, desenvolvidos por Franz, então, descritos e patente-ados pela patente norte-americana de número 3.799.758. Inúmeros sais her-bicidas de N-fosfonometilglicina foram patenteados por Franz, na patentenorte-americana de número 4.405.531. As descrições de ambas essas pa-tentes são aqui incorporadas por referência.

Composições de glifosato úteis para a invenção podem ser for-muladas com um ou mais tensoativos, para intensificar a sua eficácia paraaplicação foliar. Quando a água for adicionada a uma composição formuladacom tensoativos, a composição aspersível resultante cobre a folhagem demaneira mais fácil e eficaz (por exemplo, as folhas de outros órgãos fotos-sintetizantes) de plantas. Sais de glifosato, por exemplo, têm sido formula-dos com tensoativos, tais como tensoativos do tipo polioxialquileno, incluin-do, dentre outros tensoativos, polioxialquileno alquilaminas. Formulaçõescomerciais de herbicida glifosato comercializados sob o nome comercialRoundup® têm sido comercializadas pela Monsanto com uma tal polioxial-quileno alquilamina, em particular, uma polioxialquileno sebo-amina

Em várias das concretizações acima, o herbicida suplementar éum inibidor de fotossistema Il (PSII). Em geral, inibidores de PSII bloqueiamo transporte de elétrons e a transferência de luz através de ligação à proteí-na de quinona D1 do transporte de elétrons fotossintético. Herbicidas de ini-bidor de PSII provocam dano por meio de reações fotooxidativas e de fotor-radicais livres em cloroplastos, resultando na ruptura de membrana.

Exemplos de classes úteis de inibidores de PSII incluem uréiassubstituídas, triazinas, uracilas, fenil-carbamatos, piridazinonas, benzotiadia-zóis (bentazona), nitrilas (bromoxinila) e fenil-piridazinas (piridato).

Exemplos de triazinas incluem metribuzina (Sencor 4, Sencor75DF1, Lexone, Axiom, Axiom AT, Axiom DF, Boundary, Canopy, Domain,Metribuzina 4, Metribuzina 75DF, Turbo), atrazina (Aatrex, Atra-5, Atrazine4L, Atrazine 90DF, Atrazine 90WSP, Axiom AT, Basis Gold, Banvel K+ atra-zine, Bicep group, Buctril+atrazina, Bullet, Cinch, Contour, Cy-Pro AT, De-gree Xtra, Double Team, Expert, Extrazine II, Field Master, FuITime,Guardsman, Hamess Xtra, Keystone, Laddok S-12, Lariat1Lexar, LeadOff,Liberty ATZ, Lumax, Marksman, Parallel Plus, Pro-mate atrazine, Simazat4L, Ready Master ATZ, Stalwart Xtra, Steadfast ATZ, Shotgun, Surpass 100,Trizmet II), cianazina (Bladex, Cy-Pro, Cy-Pro AT, Extrazine II), hexazinona(Velpar, Velpar AIfaMax MP, Oustar, Westar), prometrina (Caparol, Gesa-gard, Cotton pro, Suprend), ametrina (Evik), e simazina (Simazat, Simazine90DF, Simadex, Princep, Princep Caliber, Princep Liquid, SIM-TROL 4L,SIM-TROL 90DF). Uma triazina preferível é metribuzina. Translocação portriazinas ocorre somente para cima no xilema. Inibidores de fotossíntese,usualmente, não impedem que as sementes germinem ou emerjam. Sinto-mas dedano de triazinas ocorrem depois que os cotilédones e as primeirasfolhas verdadeiras emerjam. Sintomas de dano incluem clorose e necrosenas pontas e margens das folhas primeiro em folhas mais velhas (folhasmais baixas), seguidas por clorose intervenal e queda de folhas mais baixas.Folhas mais velhas e maiores serão afetadas primeiro, porque elas absor-vem mais do herbicida a partir da solução aquosa e elas são o tecido fotos-sintético primário da planta. Tecido de folha danificado, finalmente, tornar-se-á necrótico. Devido à natureza química do relacionamento herbicida - solo,provavelmente os sintomas de dano aumentarão, conforme o pH do soloaumente (acima de 7,2).

Exemplos de uréias substituídas incluem Iinurona (Afolan, Lorox,Layby pro, Linex 4L), diurona (Dibro 4+4, Direx, Diurona 4L, Diurona 80DF,Ginstar EC, Krovar I DF, Riverdale Dibro 2+2, Riverdale Dibro 4+2, Karmex,Sahara DG, Thidiazuron-Diurona EC, Velpar Alfamax MP), metobromuron(Patoran), fluometuron (Cotoran, Lanex), tebutiurona (Graslan, Spike) e mo-nolinurona (Afesin). Uma uréia substituída preferida é linurona. Uréias substi-tuídas e uracilas são móveis em xilema, se ligam à proteína de quinona D1do transporte de elétrons fotossintético, e têm sintomas similares que emrelação às triazinas.

Exemplos de fenil-carbamatos incluem desmedifam (Betamix,Betamix beta, Betanex, Betanex beta, Progress, Progress beta) e fenmedi-fam (Spin-Aid, Betamix, Betamix beta, Betanex, Betanex beta, Progress,Progress beta). Um exemplo de uma piridazinona é pirazona (Pyramin). E-xemplos de uracilas incluem bromacila (Hyvar, Krovar, Riverdale Dibro 2+2,Riverdale Dibro 4+2, Dibro 4+4) e terbacila (Sinbar). Um exemplo de umbenzotiadiazol é bentazona (Basagran, Conclude Xact1 Laddok S-12, RezultB). Um exemplo de uma nitrila é bromoxinila (Bromox MCPA 2-2, Bronate1Bronate Advanced, Brominal, Buctril, Buctril 4 Cereais, Buctril 4EC, Buetril +atrazina, Conneet 20 WSP, Double Up B+D, Maestro D, Maestro MA, Stara-ne NXTcp, Pardner, Wildeat Xtra). Um exemplo de uma fenil-piridazina é pi-ridato (Lentagran, Tough).

Com alguns inibidores de PSII, tais como bentazona, bromoxinilae piridato (contato), o dano é confinado à folhagem que tenha entrado emcontato com o herbicida (isto é, em folhas que tenham emergido no momen-to do tratamento, mas, não em folhas novas emergindo depois do tratamen-to). Folhas afetadas tornar-se-ão de cor amarela ou bronze, ocasionalmente,têm veias médias marrons, e, finalmente, tornar-se-ão necróticas. Baixasdoses desses herbicidas mimetizam inibidores de fotossíntese clássicos.Doses elevadas mimetizam rompedores de membrana celular. Concentra-dos de óleo de culturas, outros aditivos e clima quente podem intensificar ossintomas de dano à cultura. Plantas gramíneas são, em geral, tolerantes aosinibidores de fotossíntese não sistêmicos.

Inibidores adequados de acetil-CoA-carboxilase (ACCase) inclu-em arilóxi-fenóxis (clodinafop), propionatos (cihalofop-butílico, diclofop, feno-xaprop, fluazifop-P, haloxifop, propaquizafop ou quizalofop-P) e ciclohexano-dionas (aloxidim, butroxidim, cletodim, cicloxidim, setoxidim ou tralcoxidim).

Inibidores de acetolactato sintase (ALS), que são adequados,incluem imidazolinonas (imazametabenz, imazamox, imazapic, imazapir,imazaquin ou imazetapir), pirimidiniltio-benzoatos (bispiribac-sódico, piritio-bac ou piribenzoxim), sulfonil-aminocarbonil-triazolinonas (flucarbazona- só-dico ou propóxi-carbazona), sulfonil-uréias (amidossulfuron, azimsulfuron,bensulfuron, clorimuron, clorsulfuron, cinossulfuron, ciclossulfamuron, eta-metsulfuron, etoxissulfuron, flazassulfuron, flupirsulfuron-metílico, foramsul-furon, halossulfuron, iodossulfuron, metsulfuron, nicossulfuron, primissulfu-ron, prossulfuron, pirazossulfuron-etílico, rimsulfuron, sulfometuron, sulfos-sulfuron, tifensulfuron, triassulfuron, tribenuron, trifloxissulfuron sódico outriflussulfuron) e triazolopirimidinas (cloransulam-metílico, diclossulam, fio-rassulam ou flumetsulam).

Inibidores de montagem de microtúbulos, úteis nos métodos dainvenção, incluem dinitroanilinas (benefin, etalfluralina, orizalina, pendimeta-lina, prodiamina ou trifluralina), piridinas (ditiopir ou tiazopir) e DCPA.

Auxinas sintéticas adequadas incluem fenóxis (2,4-D, 2,4-DB,diclorpropr, 2,4-DP, MCPA, MCPB ou mecoprop, PP), ácidos benzóicos (di-camba), ácidos carboxílicos (clopiralid, fluroxipir, picloram ou triclopir) e áci-dos quinalino-carboxílicos (quinclorac).

Tiocarbonatos, que são adequados, incluem butilato, cicloato,EPTC, esprocarb, molinato, pebulato, prossulfocarb, tiobencarb, trialato evernolato.

Inibidores de biossíntese de carotenóides, para uso nos métodosda invenção, incluem triazóis (amitrol ou aclonifen), assim como beflubtia-mid, fluridona, flurocloridona, flurtamona, piridazinonas (norflurazon) e pirini-na-carboxamidas (diflufenican ou picolinafeno).

Inibidores de protoporfirinogênio oxidase (PPO) adequados in-cluem difenil-éteres (acifluorfeno, bifenox, fomessafeno, fluroglicofeno, Iacto-feno ou oxifluorfeno), N-fenil-ftalimidas (flutiacet, flumiclorac ou flumioxazi-na), assim como flufenpir-etílico, oxadiazóis (oxadiazona, oxadiargila ou sul-fentrazona), fenil-pirazóis (pirafllufen-etílico), pirimidindionas (butafenacila),tiadiazóis (flutiacet-metílico) e triazolinonas (azafenidina ou carfentrazona-etílico).

Acetamidas, que são adequadas, incluem napropamida, cloroa-cetamidas (acetoclor, alaclor, butaclor, dimethenamid, metolaclor, metaza-clor, pretilaclor, propaclor ou tenilclor) e oxiacetamidas (mefenacet ou flufe-nacet).

Inibidores de fotossistema I adequados incluem bipiridilíos, taiscomo diquat ou paraquat.

Inibidores de 4-hidróxi-fenil-piruvato-dioxigenase (4-HPPD), parauso nos métodos da invenção, incluem calistemonas (mesotriona), isoxazóis(isoxaflutol), pirazóis (benzofenap, pirazolinato ou pirazoxifen) e tricetonas(sulcotriona).Demonstrou-se que, em algumas plantas, feijão ou ervilha, porexemplo, tratamento com doses subletais de glifosato provocam clorose in-tervenal pronunciada nas folhas mais jovens. Os pesquisadores sugeriramque a clorose induzida por glifosato está ligada a efeitos prejudiciais sobre asíntese de ácido aminolevulínico (ALA), um precursor na síntese de clorofila.Ver Grossbard e Atkinson (1985) The Herbicide Glyphosate, Butterworth &Co., p. 36. O glifosato inibe fortemente a síntese de clorofila e de seu pre-cursor.ácido aminolevulínico (ALA) por meio de inibição da incorporação deglutamato, 2-cetoglutarato e glicina em ALA. Kitchen, Witt e Reick (1981)Weed Sci., 29, 513-516.

Ao contrário, inibidores de PSII bloqueiam o transporte de elé-trons, impedindo a redução de plastoquinona, e, como resultado, a energiade excitação absorvida não pode ser disposta da maneira usual. Nessa situ-ação, a clorofila se acumula no estado de triplete mais estável. O pigmentoacessório β-caroteno pode dragar alguma clorofila de triplete excitada e re-emitir a energia absorvida de uma maneira não radiante. Ver, em geral, Sie-fermann-Harms, Physiol. Piant. (1987) 69, 561-568. Embora essa e outrasvias de rompimento sejam eficientes e adequadas sob condições normais, acapacidade de rompimento de energia é sobrecarregada em folhas herbici-damente inibidas, permitindo que a clorofila de triplete em excesso reaja comoxigênio para formar espécies reativas com oxigênio. Essas espécies reati-vas com oxigênio podem induzir alvejamento de pigmento e peroxidação delipídio. Know and Dodge Phytochemistry (1985) 24, 889-896. Dano visualinicial é manifestado como clorose e, com uma dose subletal de um inibidorde fotossistema II, isso pode ser a única sintomatologia evidente.

Embora não se esteja ligado a qualquer mecanismo em particu-lar, concebe-se que a combinação de um inibidor de PSII e glifosato, emuma cultura tolerante a glifosato, tal como milho, causaria impacto em cloro-fila a partir de duas direções diferentes. Uma conduziria a dano a clorofila ea outra inibiria a síntese de clorofila. Embora nenhum herbicida sozinho cau-saria, necessariamente, sintomas de dano visual, a combinação dos doisseria capaz de induzir dano suficiente para produzir sintomatologia cloróticadependente de taxa.

Será evidente a um versado na técnica que um grande númerode diferentes combinações de glifosato e inibidor de PSII podem ser feitas.Por meio de exemplo, metribuzina pode ser usada como um herbicida su-plementar em combinação com glifosato. Similarmente, Iinurona pode serusado para suplementar glifosato no presente método. A tabela 2 lista inú-meras combinações de glifosato/inibidor de PSII, que podem ser usadas nopresente método.

Tabela 2

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Dois ou mais inibidores de PSII podem ser usados para suple-mentar o glifosato no presente método. Por exemplo, Iinurona e metribuzina,metribuzina e atrazina, Iinurona e diurona, diurona, atrazina e cianazina sãoalguns dos exemplos de combinações de inibidores de PSII que podem serusados.

Composições herbicidas úteis na invenção podem ser prepara-das simplesmente diluindo-se uma composição herbicida concentrada emágua. As composições de aspersão herbicidas, incluídas na presente inven-ção, podem ser aplicadas à folhagem das plantas a serem tratadas por meiode quaisquer métodos apropriados que sejam bem-conhecidos pelos versa-dos na técnica. A aplicação de soluções de tratamento herbicida à folhagempode ser realizada, por exemplo, por aspersão por qualquer meio conven-cional de aspersão de líquidos, tais como bocais, atomizadores ou similares.

Além disso, as combinações de acordo com a invenção podemser empregadas em conjunto com outros compostos ativos, por exemplo, apartir do grupo de protetores, fungicidas, inseticidas e reguladores do cres-cimento de plantas, ou a partir do grupo dos aditivos e auxiliares de formula-ção, que sejam habituais em proteção de culturas.

Um herbicida testado e um herbicida suplementar, tais como Qli-fosato e o inibidor de PSII, são aplicados a uma planta em conjunto ou se-qüencialmente. Um exemplo de aplicação em conjunto é aplicação por meiode um tanque de mistura. Em outra concretização, os dois herbicidas sãoaplicados em momentos diferentes (por exemplo, em separado). Em umaconcretização adicional, os herbicidas, tais como glifosato e o inibidor dePSII, são aplicados em uma pluralidade de porções (por exemplo, aplicaçãoseqüencial).Em uma concretização, ambos os herbicidas são aplicados emuma concentração não suficiente para danificar a planta, se cada um fosseaplicado isoladamente. Em outra concretização, os herbicidas testado e su-plementar são aplicados em uma concentração suficiente para danificar aplanta se cada um fosse aplicado isoladamente. Em uma concretização adi-cional, o herbicida testado é aplicado em uma concentração não suficientepara danificar a planta se aplicado isoladamente, enquanto que o herbicidasuplementar é aplicado em uma concentração suficiente para danificar aplanta se aplicado isoladamente. Em ainda outra concretização, o herbicidatestado é aplicado em uma concentração suficiente para danificar a plantase aplicado isoladamente, enquanto que o herbicida suplementar é aplicadoem uma concentração não suficiente para danificar a planta se aplicado iso-ladamente. De preferência, o herbicida testado é glifosato e o herbicida su-plementar é um inibidor de PSII.

Em várias concretizações da invenção, nenhum dano significati-vo é observado com a aplicação de glifosato ou do inibidor de PSII isolada-mente; entretanto, a aplicação desses compostos em conjunto demonstrauma interação incitando dano em uma planta, tal como milho Roundup Re-ady. Em outras concretizações, a aplicação de glifosato ou de inibidor dePSII resulta em alguma quantidade mensurável de dano quando aplicadosde maneira independente, e, além disso, a aplicação desses compostos emconjunto aumenta o dano mensurável da planta. A resposta de dano diferen-cial é, então, correlacionada à tolerância da planta ao glifosato. Em umaconcretização preferida, o nível de dano a planta está correlacionado de ma·neira inversa com a tolerância a glifosato.

O presente método de avaliação de tolerância a um herbicida éaplicável a inúmeras plantas diferentes, tais como monocotiledôneas e dico-tiledôneas. Em uma concretização, as plantas monocotiledôneas são sele-cionadas a partir de milho, arroz, trigo, cevada, aveia, centeio, trigo negro,cana de açúcar, cebola, banana, tâmara e abacaxi. De preferência, a plantamonocotiledônea é selecionada a partir de milho, arroz e trigo. Em outraconcretização preferida, a planta monocotiledônea é milho. Alternativamente,as plantas dicotiledôneas são selecionadas a partir do grupo consistindo emalgodão, sojas, canola, feijões, lentilhas, amendoins, açafrão, brócolis, alfafa,trevo, cenouras, morangos, framboesas, laranjas, maçãs, cerejas, ameixas,salas, coentro, aneto e erva-doce. De preferência, as dicotiledôneas são se-lecionadas a partir de algodão, sojas, feijões, lentilhas, amendoins, alfafa eaçafrão. Mais preferivelmente, as plantas dicotiledôneas são selecionadas apartir de algodão e sojas.

Embora qualquer planta possa ser avaliada de acordo com osmétodos descritos aqui, esses métodos são especialmente úteis para a ava-liação de plantas com potencial tolerância a glifosato devido à inserção deum evento de tolerância a glifosato no genoma da planta ou no genoma deseus progenitores. Conseqüentemente, em algumas das concretizações, aplanta compreende eventos de Roundup Ready ou é uma sua progenia. Porexemplo, a planta Roundup Ready é selecionada a partir de milho RoundupReady, sojas Roundup Ready, algodão Roundup Ready, trigo Roundup Re-ady e alfafa Roundup Ready. De preferência, a planta é um milho RoundupReady. A geração, seleção e testagem genotípica/fenotípica de tais eventosem milho Roundup Ready é adicionalmente descrita em, por exemplo, napatente norte-americana de número 5.554.798, comumente designada, inti-tulada "Fertile glyphosate- resistant transgenic com plants", a descrição daqual é especificamente aqui incorporada por referência.

De acordo com várias concretizações da presente invenção,uma planta, que estiver sendo tratada para tolerância com relação a um her-bicida em particular, é plantada e cultivada em uma estufa, câmara de cultivoou campo, e tratada com uma quantidade suficiente de um herbicida testadoe um herbicida suplementar, para resultar em dano mensurável. Em umaconcretização, semente de milho compreendendo eventos de Roundup Re-ady, ou sua progenia, são plantadas e tratadas conforme descrito. Em outraconcretização, o herbicida testado é glifosato e o herbicida suplementar éum inibidor de PSII. O dano mensurável resultante a partir da aplicação deherbicidas é, então, correlacionado com a tolerância do evento na plantacom respeito ao herbicida testado.De acordo com várias concretizações do exame, depois do plan-tio da semente de interesse, a planta resultante é cultivada durante um tem-po predeterminado ou até uma idade predeterminada antes da aplicação deum herbicida testado de um herbicida suplementar. Em uma concretização,a planta é uma planta de milho, o herbicida testado é glifosato e o herbicidasuplementar é um inibidor de PSII. Depois da aplicação do herbicida suple-mentar, a planta tratada é deixada crescer durante um tempo predetermina-do adicional ou até uma segunda idade predeterminada. Várias combina-ções de idade de desenvolvimento e tempo cronológico são úteis para a in-venção.

Em alguma extensão, a escolha de quanto tempo se permite aplanta crescer dependerá das condições de cultivo, do híbrido em particularsendo avaliado, da formulação de herbicida testado usada, do herbicida su-plementar usado, do sintoma de dano sendo avaliado e de outros fatoresconforme comumente entendidos pelo versado na técnica. Em uma concreti-zação, quando se correlaciona a inibição de crescimento à tolerância ao gli-fosato, uma planta de milho pode ser cultivada até cerca do estágio 11 decrescimento (cerca de uma folha desdobrada) ou cerca do estágio de cres-cimento 12 (cerca de duas folhas desdobradas) antes da aplicação de glifo-sato e de inibidor(es) de PSII, e, então, cultivada durante cerca de 2 a cercade 15 dias depois da aplicação. Por exemplo, uma planta de milho pode sercultivada cerca de 5 a cerca de 10 dias depois da aplicação de glifosato e deinibidor de PSII. Como outro exemplo, uma planta de milho pode ser cultiva-da cerca de 8 dias depois da aplicação de glifosato e de inibidor de PSII.

Períodos de tempo similares podem ser usados para cultivo de sojas, algo-dão, canola e outras culturas. Em adição, um versado na técnica pode de-terminar prontamente os períodos de tempo adequados durante os quaisplantas particulares devem ser cultivadas.

Como é conhecido na técnica, uma variedade de índices de de-senvolvimento de plantas são úteis para se avaliar a idade de desenvolvi-mento da planta. Exemplos de tais índices, úteis para monocotiledôneas,incluem, mas, não estão limitados a, o Método de Colar de Folha, o métododa folha "inclinada para baixo" e a escala BBCH Extendida. Em milho, o Mé-todo de Colar de Folha determina o estágio da folha pela contagem do nú-mero de folhas em uma planta com colares de folha visíveis, iniciando com afolha verdadeira a mais baixa possível, curta, de ponta arredondada, e ter-minando com a folha a mais elevada possível com um colar de folha visível.O colar de folha é a "faixa" semelhante a colar de cor clara localizada na ba-se de uma lâmina de folha exposta, próxima ao ponto onde a lâmina de folhaentra em contato com o caule da planta. Folhas dentro do verticilo, não aindacompletamente expandidas e sem qualquer colar de folha visível, em geral,não são incluídas neste método de classificação de estágio de folha. Usual-mente, estágios de folhas são descritos como estágios "V", por exemplo, V2 =duas folhas com colares de folha visíveis. O método do colar de folha é ummétodo de agronomia amplamente usado, especialmente nos Estados Uni-dos. Ver, em geral, Ritchie et al. 1992, How a com plant develops, Sp. Rpt.N9 48, Iowa State University of Science and Technology, Cooperative Exten-sion Service, Ames, IA.

A escala BBCH Extendida é uma sistema para a codificação uni-forme de estágios fenomenologicamente idênticos de espécies de plantasmonocotiledôneas. O código decimal, que é dividido em estágios de cresci-mento (GS) principal e secundário, é baseado no código para cereal bem-conhecido desenvolvido por Zadoks et al. (1974), um código decimal para osestágios de crescimento de cereais. Weed Res. 14:415-421. O estágio decrescimento principal O (00-09) descreve os estágios de germinação. O es-tágio de crescimento principal 1 (10-19) descreve o desenvolvimento de fo-lhas. Por exemplo, no GS 11, existe uma folha desdobrada, enquanto que,no GS 12, existem duas folhas desdobradas. Estágios de crescimento prin-cipais 2-9 descrevem perfilhamento, alongamento de caule, emborracha-mento, desenvolvimento da espiga, floração, frutificação, maturação e se-nescência, respectivamente. A Escala BBCH Extendida é adicionalmentedescrita em Stauss 1994, Compendium of Growth Stage Identification Keysfor Mono- and Dicotyledenous Plants, Ciba-Geigy AG, ISBN 3-9520749-0-X.Application.Várias concretizações da invenção são, em geral, dirigidas à se-leção de plantas com relação à resistência a glifosato. Devido ao fato de quemuitas das plantas selecionadas têm pelo menos alguma resistência a glifo-sato, freqüentemente, glifosato aplicado isoladamente, em quantidades her-bicidamente eficazes, será insuficiente para danificar de maneira significativaa planta avaliada. No entanto, de acordo com os métodos da invenção, aaplicação de glifosato em conjunção com um inibidor de PSII, pode propor-cionar sintomas de dano herbicida na planta avaliada. Essa expressão dedano pode, então, ser correlacionada à tolerância a glifosato da planta avali-ada.

Em várias concretizações, o glifosato é aplicado em uma taxaherbicidamente eficaz. Geralmente, uma taxa herbicidamente eficaz é sufici-ente para propiciar sintomas visuais de tratamento com glifosato em plantasnão tolerantes a glifosato dentro de dois a sete dias depois do tratamento.

Dependendo da tolerância a glifosato da planta avaliada, uma taxa herbici-damente eficaz de glifosato aplicado sem um inibidor de PSII pode ou nãopropiciar sintomas visuais na planta avaliada.

A seleção de taxas de aplicação, que sejam herbicidamente efi-cazes, para um herbicida testado ou herbicida suplementar da invenção, es-tá dentro da capacidade do cientista agrícola ordinário. Os versados na téc-nica igualmente reconhecerão que condições de plantas, clima e condiçõesde crescimento individuais, assim como os ingredientes ativos específicos esua razão em peso na composição, influenciarão o grau de eficácia herbicidaalcançado na prática desta invenção. Com respeito ao uso de composiçõesde glifosato, muita informação é conhecida sobre taxas de aplicação apro-priadas. Durante duas décadas de uso de glifosato e de estudos publicadoscom relação a tal uso forneceram informação abundante a partir da qual a-quele que exerce a profissão pode selecionar taxas de aplicação de glifosa-to, que sejam herbicidamente eficazes em espécies particulares, em está-gios de crescimento particulares, em condições ambientais particulares.

Em várias concretizações, o glifosato pode ser aplicado a partirde cerca de 1x a cerca de 4x das taxas de campo sugeridas. Essas taxas deaplicação são usualmente expressas como quantidade de glifosato por uni-dade de área tratada, por exemplo, gramas por hectare (g/ha). Em uma con-cretização, o glifosato é aplicado em uma concentração de cerca de 840g/ha a cerca 3.360 g/ha. Por exemplo, o glifosato pode ser aplicado em umaconcentração de cerca de 840 g/ha. Como outro exemplo, o glifosato podeser aplicado em uma concentração de cerca de 1.680 g/ha. Como um exem-plo adicional, o glifosato pode ser aplicado em uma concentração de cercade 2.520 g/ha. Como ainda outro exemplo, o glifosato pode ser aplicado emuma concentração de cerca de 3.360 g/ha.

De acordo com várias concretizações da invenção, um inibidorde PSII é aplicado em conjunção com glifosato, resultando em dano mensu-rável, que pode, então, ser correlacionado à resistência a glifosato. Em vá-rias concretizações, o inibidor de PSII é aplicado em uma concentração nãosuficiente para danificar de maneira significativa a planta quando aplicado demaneira independente. Como um exemplo, um inibidor de PSII pode ser a-plicado em 1/4x a taxa de campo para milho. Como outro exemplo, um inibi-dor de PSII pode ser aplicado em 1/2x a taxa de campo. Em uma concreti-zação, o inibidor de PSII é aplicado em uma concentração de cerca de 56g/ha a cerca de 224 g/ha. Como um exemplo, o inibidor de PSII pode seraplicado em uma concentração de cerca de 56 g/ha. Como outro exemplo, oinibidor de PSII pode ser aplicado em uma concentração de cerca de 112g/ha. Como um exemplo adicional, o inibidor de PSII pode ser aplicado emuma concentração de cerca de 224 g/ha.

Com respeito às combinações herbicidas diferentes de glifosatoe de inibidor de PSII, os herbicidas testado e suplementar podem ser aplica-dos nas taxas similares àquelas de glifosato e de inibidor de PSII. Por exem-plo, quando o herbicida testado for um inibidor de ALS, ele pode ser aplicadoem uma taxa de campo desde cerca de 1x a cerca de 4x, enquanto que oherbicida suplementar (por exemplo, glifosato) pode ser aplicado em umataxa de campo de desde cerca de 1/4x a cerca de 1/2x. Taxas de campoadequadas para combinações particulares do herbicida testado e do herbici-da suplementar podem ser prontamente determinadas por um versado natécnica.

De acordo com várias concretizações da invenção, vários sinto-mas de estresse fisiológico ou de desenvolvimento, resultantes da aplicaçãodo herbicida testado (por exemplo, glifosato) e do herbicida suplementar (porexemplo, um inibidor de PSII), podem ser medidos, e esse valor correlacio-nado à tolerância ao herbicida testado (por exemplo, tolerância a glifosato)da planta. Assim, por exemplo, depois de cultivo da planta a ser avaliada, aaplicação dos herbicidas testado e suplementar (por exemplo, glifosato einibidor de PSII), e permitindo-se crescimento ulterior depois de tal tratamen-to, a planta testada pode ser avaliada com relação aos sintomas de danoresultantes. A extensão em que a planta é deixada crescer depois do trata-mento com inibidor é, em alguma parte, dependente do quadro de tempo deexpressão de sintomas de dano.

Sintomas de dano resultantes do tratamento com herbicidascombinados podem ser medidos por vários métodos comumente entendidosna técnica. Por exemplo, sintomas de dano podem ser medidos como impac-to de tratamento sobre: clorose, necrose, redução de crescimento, nanismomorfológico, troca de gás, eficiência fotossintética, propriedades ópticas defolhas ou outros parâmetros fisiológicos fisiológicos de estresses conhecidosna técnica.

Em geral, uma taxa subletal de glifosato produzirá o sintoma vi-sual de clorose na maioria das plantas. Se a taxa de aplicação for baixa obastante, essa sintomatologia será transiente e a planta recuperar-se-á.Concebe-se que taxas elevadas de glifosato criam estresse em plantas deRoundup Ready, com o nível de estresse estando inversamente relacionadoao nível de tolerância. Os inibidores de PSII também causariam clorose emtaxas subletais. Quando aplicado em conjunção com taxas de aplicação sub-Ietais de glifosato, um inibidor de PSII acentuariam clorose a um grau maiorem plantas com níveis mais baixos de tolerância a glifosato.

Em uma concretização, a clorose é tipicamente observada a par-tir de cerca de 3 a cerca de 5 dias depois do tratamento em plantas, tal comomilho. Esse dano é transiente e um versado na técnica reconhecerá que talavaliação pode ser quantificada no tempo para expressão máxima. A clorosepode ser medida de várias maneiras. Em um exemplo, uma estimativa visualpode ser feita em comparação à verificação não tratada. Dano pode ser ob-servado como clorose % (0 = nenhuma clorose, 100 = clorose completa).

Cem por cento de clorose corresponderia à planta inteira exibindo um ama-relamento completo de todo o tecido. Como outro exemplo, a clorose podeser medida diretamente com um medidor de clorofila. Um instrumento dessetipo mede a fluorescência de clorofila e é, portanto, um meio mais direto demedição de clorose. Como um exemplo adicional, a clorose pode ser medidapor extração de clorofila do tecido da folha e quantificando-se espectrofoto-metricamente a quantidade presente, com base em área de superfície defolha ou de peso fresco.

Em geral, uma taxa subletal de glifosato produzirá uma inibiçãode taxa de crescimento na maioria das plantas. Em uma concretização, ainibição de crescimento é tipicamente observada desde cerca de 5 a cercade 10 dias depois do tratamento em plantas de milho. Em uma concretizaçãoadicional, a inibição de crescimento atinge expressão de pico em cerca de 8dias depois do tratamento, e em 15 dias depois do tratamento, o dano é di-minuído de maneira substancial. O dano medido como inibição de tratamen-to se beneficia de ser facilmente quantificado. A redução de crescimento po-de ser observada como redução de crescimento % por estimativa visual ver-sus planta não tratada (0 = nenhuma redução de crescimento, 100 = redu-ção de crescimento completa). Um meio mais direto é medir a altura de plan-tas de milho. A redução de tamanho pode ser, então, expressa como per-centagem de crescimento com relação à verificação não tratada (a altura deplanta afetada/altura de verificação não tratada) ou simplesmente compa-rando as alturas diretamente.

Outros métodos de caracterização do início, da progressão e daseveridade de sintomas de estresse fisiológico associados com a aplicaçãode herbicidas da presente invenção, tais como glifosato e inibidor de PSII,serão evidentes para o versado na técnica.

Várias concretizações da invenção são capazes de determinar atolerância a herbicida (por exemplo, tolerância a glifosato) de uma plantacorrelacionando-se a tolerância com níveis diferenciais de dano. Conformemostrado pelos exemplos fornecidos, a metodologia de avaliação da inven-ção é capaz de reproduzir a tolerância a glifosato relativa historicamente ob-servada das plantas de milho híbridas.

Uma correlação em biologia é a extensão, na qual duas variá-veis estatísticas variam em conjunto ou a interdependência entre duas variá-veis. Ver, por exemplo, Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, 2d.ed. John Wiley & Sons, 1989. A determinação de relacionamentos em exa-mes biológicos por meio de correlação é bem-conhecida pelos versados natécnica.

Antes dessa invenção, a seleção de eventos ocorria nos testesde campo por observação de dano a partir de herbicida (por exemplo, glifo-sato), usualmente, com tratamentos feitos mais tarde na estação, e compa-rando-se os rendimentos de cultura. A desvantagem de uma tal abordagemera que exames de campo foram conduzidos em plantas de milho relativa-mente desenvolvidos, portanto, exigindo tempo substancial para os experi-mentos. O método da invenção fornece um exame adequado para determi-nação de tolerância a herbicida, e, em particular, tolerância a glifosato, deuma planta em uma idade mais prematura foi historicamente possível, assimcomo a conveniência de se realizar o exame em uma estufa ou câmara decrescimento. A presente invenção se beneficia de métodos históricos de ca-racterização de tolerância a glifosato pelo fato de que dados a partir destestipos de experimentos podem servir para verificar a correlação descrita peloexame da invenção. Por exemplo, comparar os Exemplos 1 e 2 com o E-xemplo 5. Além disso, plantas com tolerância a glifosato caracterizada po-dem servir como padrões contra os quais a tolerância a glifosato relativa deeventos previamente não caracterizados possa ser determinada. Ver os E-xemplos 3 e 4.

Plantas examinadas, por exemplo, plantas híbridas de milho,podem ter tolerância a glifosato conhecida ou desconhecida. Além disso,plantas examinadas podem ser comparadas a plantas com tolerância a glifo-sato conhecida ou desconhecida. Para as finalidades da presente invenção,uma planta padrão é uma planta com uma tolerância a herbicida caracteri-zada, e, em particular, tolerância a glifosato. A tolerância a glifosato relativade uma planta padrão pode ser determinada por resultados fenotípicos deexpressão de eventos. Exames para se caracterizar a tolerância a glifosatofenotípica de plantas padrão podem assumir muitas formas, incluindo, mas,não limitadas a, análise de mudanças na composição química, morfologia oupropriedades fisiológicas da planta. Exemplos de dados de campo que ca-racterizam a tolerância a glifosato de dois eventos em milho de RoundupReady, GA21 e NK 603, são fornecidos no Exemplo 5. Tais técnicas, e ou-tras conhecidas pelo versado na técnica, podem ser empregadas para ca-racterizar a tolerância a glifosato de uma planta, de modo a usar aquelaplanta como um padrão contra o qual se determina a tolerância a glifosatorelativa de uma planta avaliada de acordo com os métodos da invenção. Asmesmas técnicas podem ser adaptadas para determinação da tolerância deuma planta também a outros herbicidas.

Métodos de caracterização do fenótipo tolerante a glifosato dediferentes híbridos de evento em milho são descritos, por exemplo, nas pa-tentes norte-americanas, comumente designadas, de números 5.633.435intitulada "Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate syntha-ses"; 5.804.425 intitulada "Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases"; 4.940.835 intitulada "Glyphosate-resistant plants";5.188.642 intitulada "Glyphosate-resistant plants"; e 6.040.497 intitulada"Glyphosate resistant com Unes"; as descrições das quais são, cada uma,especificamente incorporadas aqui por referência. Esses métodos de carac-terização podem ser usados nessa invenção como uma escala relativa detolerância a glifosato de plantas padrão contras as quais se compara a tole-rância a glifosato de plantas que não tenham sido previamente caracterizadas.

Plantas úteis como plantas padrão da invenção incluem, mas,não estão limitadas a, aquelas plantas geneticamente transformadas ou se-lecionadas para tolerar um herbicida, tal como glifosato. Plantas genetica-mente transformadas ou selecionadas para tolerar glifosato incluem, mas,não estão limitadas a, aquelas cujas sementes são vendidas pela MonsantoCompany ou sob a licença a partir de Monsanto Company portando a marcacomercial Roundup Ready®. Exemplos de plantas resistentes a glifosatocomercialmente disponíveis úteis para a invenção como plantas de milhopadrão incluem qualquer híbrido com os eventos GA 21 e/ou NK 603.

Usualmente, uma planta padrão (conforme o termo é aqui usa-do) será uma planta híbrida com uma capacidade conhecida de destoxificarglifosato e, por meio disso, resistir a dano induzido por glifosato. Em váriasconcretizações, a planta padrão recebe substancialmente o mesmo regimede tratamento que a planta examinada com relação a tolerância a glifosato(ver, por exemplo, os Exemplos 4 e 5). Conforme usado aqui, regime de tra-tamento engloba aquelas variáveis, que possam afetar a expressão de sin-tomas de dano em resposta à aplicação de glifosato e de inibidor de PSII.Exemplos de variáveis incluídas dentro de regime de tratamento incluemcondições de crescimento, idade de desenvolvimento ou cronológica deplantas em tratamento, idade de desenvolvimento ou cronológica de plantasna avaliação de dano, e métodos e taxas de aplicação para glifosato e inibi-dor de PSII. Exemplos de condições de crescimento incluem umidade relati-va, intensidade de luz, comprimento do dia, programa de rega, suprimentode nutrientes e meios de plantio.

Em uma concretização, o nível de dano relativo de uma plantaexaminada com tolerância a herbicida desconhecida é comparada ao nívelde dano relativo de outra planta examinada da mesma espécie com tolerân-cia a herbicida desconhecida. Alternativamente, a planta examinada podeser comparada a outra planta da mesma espécie com tolerância a herbicidaconhecida. Em uma concretização preferida, o nível de dano relativo de umaplanta de milho híbrida examinada com tolerância a glifosato desconhecida écomparado ao nível de dano relativo de outra planta de milho híbrido exami-nada com tolerância a glifosato desconhecida. Ainda em outra concretizaçãopreferida, o nível de dano relativo de uma planta de milho híbrida examinadacom tolerância a glifosato desconhecida é comparada ao nível de dano rela-tivo de outra planta de milho híbrida examinada com tolerância a glifosatoconhecida (isto é, uma planta de milho padrão).

Em várias concretizações, a planta examinada pode ser compa-rada a uma, duas, três, quatro ou mais plantas com tolerância a herbicidaconhecida, e, em particular, tolerância a glifosato. Tal comparação forneceuma escala de tolerância. Em uma concretização, o nível de dano relativo deuma planta de milho híbrido examinada é comparado à tolerância conhecidade um híbrido de planta de milho conhecido como sendo altamente tolerantea glifosato. Como um exemplo, o evento NK 603 (como contido em, por e-xemplo, o híbrido DKC 53-33) é altamente tolerante a glifosato e, tipicamen-te, não exibe dano a partir de aplicações de glifosato de até 3.360 g/ha,mesmo aplicado seqüencialmente (ver, por exemplo, o Exemplo 5).

Em uma concretização adicional, o nível de dano relativo de umaplanta de milho híbrida examinada é comparado à tolerância conhecida deum híbrido de milho medianamente tolerante a glifosato. Um exemplo deuma planta de milho medianamente tolerante a glifosato é o híbrido de even-to GA 21 (Número de acesso do ATCC 209033, depositado em 14 de maiode 1997). O fenótipo de tolerância a glifosato do evento GA 21 é descrito napatente norte-americana de número 6.040.497 intitulada "GIyphosate resis-tant corri Unes", as descrições da qual são aqui especificamente incorpora-das por referência. Além disso, a tolerância a glifosato de GA 21 é caracteri-zada, por exemplo, no Exemplo 5.

Em outra concretização, o nível de dano relativo de uma plantade milho híbrida examinada é comparado à tolerância conhecida de um hí-brido de milho de baixa tolerância a glifosato. Um híbrido de milho de baixatolerância a glifosato pode ser, por exemplo, um híbrido de milho com menostolerância a glifosato do que mesmo um evento de GA 21.

Em ainda outra concretização, o nível de dano relativo de umaplanta de milho híbrida examinada é comparado com uma planta de milhohíbrida que não seja Roundup Ready (isto é, que expresse somente resis-tência relativa a glifosato).

Várias combinações e números desses padrões de tolerânciaalta, média, baixa ou não tolerantes são possíveis. Em uma concretização, eplanta de milho examinada é comparada a híbridos de plantas de milho comtolerâncias a glifosato elevada e baixa. Em outra concretização, a planta demilho examinada é comparada a híbridos de plantas de milho com tolerân-cias a glifosato alta, média e baixa (ver, por exemplo, o Exemplo 4). Em umaoutra concretização, a planta de milho examinada é comparada a híbridos deplantas de milho com tolerâncias a glifosato alta, média, baixa e não toleran-tes a glifosato. É evidente que as várias iterações de possíveis combinaçõessão numerosas.

Tendo-se descrito a invenção em detalhes, será evidente quemodificações e variações são possíveis sem se desviar do escopo da inven-ção definido nas reivindicações apensas. Além disso, deve ser apreciadoque todos os exemplos na presente descrição são fornecidos como exem-plos não limitantes.

Exemplos

Os seguintes exemplos não limitantes são fornecidos para ilus-trar adicionalmente a presente invenção. Deve ser apreciado pelos técnicosespecializados no assunto que as técnicas reveladas nos exemplos que seseguem representam abordagens dos inventores constataram funcionarembem na prática da invenção, e, portanto, podem ser considerados a constitu-írem exemplos de modos para sua prática. No entanto, os técnicos especia-lizados no assunto, à luz da presente descrição, apreciam que muitas mu-danças podem ser feitas nas concretizações específicas que são reveladase ainda obter um resultante igual ou similar, sem se desviar do espírito e es-copo da invenção.

Exemplo 1

A interação de glifosato e de inibidores de PSII em milho Roun-dup Ready foi investigada com relação à utilidade de uso em um exame comrelação à tolerância a glifosato. Híbridos de milho Roundup Ready testadoseram DK 580 (evento GA 21, número de acesso do ATCC 209033) e DCK53-33 (evento NK 603). Sabe-se que o evento NK 603 exibe maior tolerânciaa glifosato sob condições de campo do que o evento GA 21.Duas sementes de milho foram plantadas em pote de plástico de2,54 cm (uma polegada) de profundidade por 8,89 χ 8,89 cm (3,5 χ 3,5 pole-gadas) enchido com mistura de plantio em vaso comercial (terra Redi). Amistura de plantio em vaso foi suplementada com fertilizante de liberaçãolenta Osmacote TM 14-14-14 em 3,28 g/cm (100 g/pé) cúbico para otimizar ocrescimento. Os potes foram, então, colocados em uma estufa (25°C de di-a/19°C de noite, dia de 14 horas) e água foi fornecida por meio de subirriga-ção. As plantas foram deixadas crescer para o estágio em que 3 folhas esti-vessem desdobradas (6 - 9 dias depois do plantio, estágio de crescimentoaproximado de GS 13) antes da aplicação de glifosato e de inibidor de fotos-sistema II.

Os tratamentos com herbicida consistiram em aplicação de glifo-sato e de inibidor de PSII. As taxas de aplicação para glifosato (RoundupUltraMAX, Monsanto, St. Louis) incluíram: 840 g/ha; 1.680 g/ha e 3.360 g/ha(isto é, 0,34 kg/A; 0,79 kg/A e 1,36 kg/A (0,75 Ib/A; 1,5 Ib/A e 3,0 Ib/A)). Ta-xas de aplicação para Iinurona (Lorox, DuPont) incluíram: 56 g/ha; 112 g/hae 224 g/ha. Taxas de aplicação para metribuzina (Sencor, Bayer) incluíram:56 g/ha; 112 g/ha e 224 g/ha. Os tratamentos foram aplicados de maneiraespalhada em um atomizador tipo "research track" utilizando uma ponta deatomização em leque plana uniforme. As plantas foram retornadas para aestufa seguindo-se as aplicações. A inibição de crescimento foi medida 10dias depois do tratamento (DAT). As plantas suscetíveis exibiram clorosetransiente 2 - 4 dias depois do tratamento (DAT), que subseqüentementeresultou em crescimento reduzido com relação às plantas não tratadas. Aredução de crescimento pode ser medida cerca de 7 -10 DAT por estimativadireta ou visual (0 = nenhuma redução de crescimento, 100 = redução decrescimento completa).

Os resultados mostraram que aplicações únicas de glifosato,metribuzina ou Iinurona forneceram dano mínimo (< 3%) a nenhum dano emcada um do evento de GA 21 ou do evento de NK 603. Combinações de gli-fosato com cada um de Iinurona ou de metribuzina, contudo, produziram da-no significativo e estava claramente relacionado à taxa. A sintomatologia dedano expressa como baixos níveis de clorose discernível, um menor grau denecrose de folha (somente taxas de combinação elevadas), e uma reduçãode crescimento. Os dados mostraram uma clara resposta de taxa tanto comIinurona (Lerox) quanto com metribuzina (Sencor), com o dano aumentandoconforme as taxas aumentaram. Igualmente, os dados mostraram que o da-no por glifosato aumentou conforme as taxas aumentaram. O evento de GA21 demonstrou, de maneira consistente, mais dano em resposta a essascombinações do que o. evento de NK 603, sugerindo que o evento de NK603 tem um grau mais elevado de tolerância a glifosato (ver, por exemplo, afigura 3). Sintomas de dano eram evidentes em 10 dias depois do tratamen-to. O dano pareceu atingir um pico em cerca de 8 dias depois do tratamento.Em 13 dias depois do tratamento, plantas de milho tinham se recuperado demaneira significativa.

Conforme esses resultados demonstram, maior tolerância a gli-fosato sob condições de campo estava correlacionada com sintomatologiade dano de combinações de glifosato com baixas taxas de inibidores de PSI-I. Portanto, a sintomatologia de dano de combinações de glifosato com bai-xas taxas de inibidores de PSII em milho Roundup Ready pode ser usadacomo uma ferramenta eficaz para seleção de eventos em milho RoundupReady em um estágio inicial, com base em tolerância a glifosato.

Exemplo 2

A interação de glifosato e de inibidores de PSII em milho Roun-dup Ready foi demonstrada em dois híbridos de milho, para mostra a utilida-de de uso em um exame com relação à tolerância a glifosato.

Híbridos de milho Roundup Ready testados eram RX686Roundup Ready (evento de GA 21) e DKC 53-33 (evento de NK 603). Ocrescimento de material de planta e o regime de tratamento eram conformedescrito no Exemplo 1, exceto que as plantas foram deixadas crescer aoestágio em que 2 folhas estivessem desdobradas (aproximadamente GS 12)antes da aplicação de glifosato e de inibidor de PSII. A inibição de cresci-mento foi medida 10 dias depois do tratamento (DAT).

Os resultados mostraram que aplicações únicas de glifosato,metribuzina ou Iinurona não produziram qualquer dano de cultura discernívelem cada um dos híbridos de milho. Combinações de glifosato com cada umde linurona ou metribuzina, entretanto, não forneceram dano de cultura signi-ficativo que fosse relacionado à taxa. Clorose e necrose foram observadasnos tratamentos de combinação. Dados de redução de crescimento estãorelatados nas figuras 4 - 6. Os dois eventos de milho testados, GA 21 (nohíbrido de RX 686Roundup Ready) e NK 603 (no híbrido de DKC 53-33),demonstraram uma resposta diferencial com níveis mais elevados de danovistos em RX 686Roundup Ready. Diferenças entre híbridos são muitíssimoclaramente observadas na taxa de aplicação mais elevada de glifosato emconjunção com cada um de Iinurona ou de metribuzina (ver, por exemplo, afigura 6).

E, assim, combinações de glifosato com baixas taxas de inibido-res de PSII induzem dano em híbridos de milho Roundup Ready e diferen-ças em dano entre híbridos contendo o evento de NK 603 e o evento de GA21 estão correlacionadas à tolerância a glifosato.

Exemplo 3

A interação de glifosato e de inibidores de PSII em milho Roun-dup Ready pode ser demonstrada em vários híbridos de milho e o dano re-sultante comparado ao dano inflingido a plantas de milho com níveis conhe-cidos de tolerância a glifosato (isto é, plantas de milho padrão). Com efeito,essa abordagem usa plantas de milho padrão para estabelecer uma curvapadrão de resistência a glifosato relativa, onde essa curva possa ser usadapara avaliar a tolerância a glifosato relativa de plantas de milho com tolerân-cia a glifosato desconhecida.

Híbridos de milho Roundup Ready testados conterão eventos deresistência a glifosato. Plantas de milho com os eventos de NK 603 e de GA21 serão selecionadas como plantas de milho padrão. Outro híbrido conten-do evento que tenha baixa tolerância a glifosato será escolhido como umaterceira planta padrão. Baixa tolerância a glifosato para as finalidades desseexemplo constitui uma tolerância entre tolerância zero e aquela tolerância aglifosato exibida pelo evento de GA 21. A terceira planta padrão será carac-terizada com relação à tolerância a glifosato através de métodos esboçadosno Exemplo 5. Crescimento de material de planta e regime de tratamentoserão conforme descrito no Exemplo 1, exceto que as plantas serão deixa-das crescerem ao estágio, em que 2 folhas estivessem desenroladas (apro-ximadamente GS 12) antes da aplicação de glifosato e de inibidor de PSII.No momento de aplicação, plantas de tamanho igual serão selecionadaspara cada híbrido ou natural. A inibição de crescimento será medida 10 diasdepois do tratamento (DAT).

Tipicamente, resultados a partir de experimentos delineados a-cima mostraram uma gama de graus de dano a partir de aplicações somentede glifosato, a partir de essencialmente nenhum dano em NK 603 e em GA21 a dano moderado a severo no terceiro híbrido selecionado com o eventode não tolerância. A separação muitíssimo aparente entre os vários eventosem milho foi vista a partir de combinações de glifosato com a taxa de Iinuro-na de 112 g/ha. A combinação de glifosato mais Iinurona tem sido observadaa causar um gradiente de dano visível, com o menor dano ao evento de NK603, dano moderado ao evento de GA 21, e dano severo à terceira plantapadrão, selecionada com relação à sua conhecida baixa tolerância a glifosato.

Portanto, a seleção de três plantas padrão pode ser realizada talque a aplicação conjunta de glifosato e de Iinurona produz um gradiente dedano que pode servir como uma escala relativa de referência com relação atolerância a glifosato de plantas examinadas com tolerância a glifosato des-conhecida.

Exemplo 4

Esse exemplo descreve como conduzir uma comparação de vá-rios eventos em milho para sua tolerância a glifosato com relação aos even-tos NK 603, GA 21 e uma terceira planta padrão selecionada pela sua co-nhecida baixa tolerância a glifosato (ver o Exemplo 3).

Vários híbridos de milho contendo um evento de resistência aglifosato será selecionado por exame de tolerância a glifosato. O crescimen-to de material de planta e o regime de tratamento será conforme descrito noExemplo 1, exceto: plantas serão cultivadas ao estágio em que somenteuma folha está desdobrada (aproximadamente, GS 11) antes da aplicaçãode glifosato e de inibidor de fotossistema II, taxas de aplicação para glifosato(Roundup UItraMax, Monsanto, St. Louis) serão de 1.680 g/ha e de 3.360g/ha; taxa de aplicação para Iinurona (Lorox) será de 112 g/ha; e a inibiçãode crescimento será medida 6 dias depois do tratamento (DAT).

Espera-se que os resultados para os eventos padrão NK 603 eGA 21 mostrem níveis relativos similares de tolerância a glifosato, conformedescrito nos exemplos acima (ver os Exemplos 1 - 2). Espera-se que os re-sultados para o terceiro evento padrão mostrem resultados consistentes comsua conhecida baixa tolerância por glifosato. Consistente com efeitos de da-no observados descritos acima, os eventos de teste devem exibir níveis dedano, como um resultado da aplicação combinada de glifosato e linurona.Esse nível de dano será correlacionado à tolerância ao glifosato, permitindocomparação direta dos eventos testados. Além disso, o nível de dano doseventos testados será comparado aos níveis de dano das plantas padrão doexame. A tolerância a glifosato dos eventos testados será determinada porcorrelação ao relacionamento dano/tolerância demonstrado pelas plantaspadrão. Essa comparação fornecerá uma avaliação da tolerância a glifosatorelativa dos eventos testados ao longo de um gradiente de tolerância a glifo-sato representado pelas plantas padrão. Com base nesses dados, os even-tos em milho Roundup Ready podem ser agrupados da seguinte maneiracom respeito à tolerância a glifosato: Muitíssimo tolerante - aquela similar aNK 603; Tolerância intermediária - aquela similar a GA 21; Pouquíssimo tole-rante - aquela similar à terceira planta padrão selecionada pela baixa tole-rância.

Portanto, dano diferencial a partir da combinação de glifosato ede inibidor de PSII pode ser usado como um determinante para a resistênciaa glifosato de eventos em plantas de milho.

Exemplo 5

Seleção de eventos historicamente tem sido feita em testes decampo, por observação de dano a partir de glifosato, usualmente, com tra-tamentos feitos mais tarde na estação, e por comparação de rendimentos decultura. Esses tipos de experimentos, e os dados resultantes, são úteis paraverificar a correlação descrita pelo exame com glifosato/inibidor de PSII dainvenção.

A tolerância a glifosato de eventos em milho Roundup Ready deNK 603 e GA 21 foram caracterizados em testes de campo. Milho foi planta-do em filas de 91,44 cm (36 polegadas) em pontos de 4 filas por 9,14 cm(30 pés) com as duas filas de centro sendo colhidas. O estudo compreendeu22 locais com 4 replicatas de cada experimento por local e os dados foramreunidos através dos locais. Plantas de milho foram tratadas com glifosatoem duas idades de desenvolvimento consecutivas de V4 e de V8. Taxas deaplicação de glifosato foram de 0,34, 0,68 e 1,06 kg (0,75, 1,5 e 2,23 libras)por acre (Ib/A). O volume de aplicação foi de (10 galões)/acre. Em 10 diasdepois do tratamento (DAT), foram determinados a percentagem de plantasexibindo clorose (% de clorose), folhas mal-formadas (% de mal-formação) eredução de crescimento (% G.R.). Em 30 DAT, a percentagem de plantasexibindo redução de crescimento foi novamente determinada. Os dados fo-ram expressos como o número de locais exibindo dano maior do que 9%,seguido pela faixa de percentagem de dano observado. Dados para clorose,folhas mal-formadas e redução de crescimento foram coletados em 22 lo-cais. Além disso, na colheita de plantas de milho maduras, a percentagemde rendimento e percentagem de umidade em grão foram avaliadas. Dadospara rendimento e umidade de grão foram coletados em colheita em 19 lo-cais e expressos como o rendimento ou umidade percentual média com res-peito aos controles.

Exemplos de resultados mostraram que nem os eventos em mi-lho de NK 603 ou de GA 21 exibiram clorose elevada em 10 DAT em 0,34kg/A (0,75 Ib/A) (ver, por exemplo, a Tabela 5). No entanto, em 0,68 kg/A(1,5 Ib/A), o evento de GA 21 exibiu clorose elevada, enquanto que o de NK603 não o fez. Uma tendência de dados similares foi observada para redu-ção de crescimento tanto em 10 DAT quanto em 30 DAT. Tanto GA 21 quan-to Nk 603 tiveram percentagens de rendimento significativamente reduzidas,entretanto, o evento de NK 603 foi menos afetado (ver, por exemplo, a Tabe-la 6). Tomados em conjunto, esses dados mostram que, enquanto que am-bos os eventos testados exibiram tolerância a glifosato, NK 603 é relativa-mente mais tolerante a glifosato, quando comparado ao evento de GA 21.

Essas dados são úteis para o fornecimento de um padrão relati-vo de resistência a glifosato, contra o qual se correlacionar o nível de danoobservado em conexão com a metodologia de exame aqui descrita.

TABELA 5: Testes em Milho Roundup Ready

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TABELA 6: Testes em Milho Roundup Ready

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Exemplo 6

A interação de glifosato e de inibidor de PSII em algodão Roun-dup Ready pode ser demonstrada em vários híbridos de algodão e o danoresultante comparado ao dano inflingido a plantas de algodão com níveisconhecidos de tolerância a glifosato (isto é, plantas de algodão padrão).Com efeito, essa abordagem usa as plantas de algodão padrão para estabe-lecer uma curva padrão de resistência a glifosato relativa, onde esta curvapossa ser usada para avaliar a tolerância a glifosato relativa de plantas dealgodão com tolerância a glifosato desconhecida.

Híbridos de algodão, que são testados, conterão eventos de re-sistência a glifosato. Plantas de algodão com os eventos de 1445 ou de88913 serão selecionadas como plantas de algodão padrão. Outro híbridocontendo evento, que tem baixa tolerância a glifosato, será escolhido comouma terceira planta padrão. Baixa tolerância a glifosato, para as finalidadesdeste exemplo, constitui uma tolerância entre tolerância zero e aquela tole-rância a glifosato exibida pelos eventos acima. A terceira planta padrão serácaracterizada com relação à tolerância a glifosato por meio de métodos simi-lares àqueles descritos no Exemplo 5 para milho. Crescimento de materialde planta e regime de tratamento serão conforme descritos no Exemplo 1,exceto que plantas serão deixadas crescer ao estágio, em que 4 folhas esti-vessem desdobradas (aproximadamente GS 14) antes da aplicação de glifo-sato e de inibidor de fotossistema II. No momento da aplicação, plantas deigual tamanho serão selecionadas para cada híbrido ou natural. A inibição decrescimento será medida 10 dias depois do crescimento (DAT).

Espera-se que os resultados a partir de experimentos descritosacima mostrarão uma faixa de graus de dano a partir de aplicações somentede glifosato, a partir de essencialmente nenhum dano em eventos de 1445ou 88913 a dano moderado ou severo no terceiro híbrido selecionado com oevento de baixa tolerância.

Portanto, a seleção de três plantas padrão pode se realizada talque a aplicação conjunta de glifosato e de inibidor de PSII produza um gra-diente de dano que possa servir como uma escala relativa de referência paratolerância a glifosato de plantas examinadas com tolerância a glifosato des-conhecida. A tolerância a glifosato é determinada por exame com relação a,por exemplo, a percentagem de plantas exibindo clorose, folhas mal-formadas e redução de crescimento.

Exemplo 7

A interação de glifosato e de inibidores de PSII em soja RoundupReady pode ser demonstrado em vários híbridos de soja e o dano resultantecomparado ao dano inflingido a plantas de soja com níveis conhecidos detolerância a glifosato (isto é, plantas de soja padrão). Com efeito, essa abor-dagem usa as plantas de soja padrão para estabelecer uma curva padrão deresistência a glifosato relativa, onde esta curva possa ser usada para avaliara tolerância a glifosato relativa de plantas de soja com tolerância a glifosatodesconhecida.

Híbridos de soja, que são testados, conterão eventos de resis-tência a glifosato. Plantas de soja com o evento de GM A19788 serão sele-cionadas como plantas de soja padrão. Outro híbrido contendo evento, quetem baixa tolerância a glifosato, será escolhido como uma terceira plantapadrão. Baixa tolerância a glifosato, para as finalidades deste exemplo,constitui uma tolerância entre tolerância zero e aquela tolerância a glifosatoexibida pelo evento de GM A19788. A terceira planta padrão será caracteri-zada com relação à tolerância a glifosato por meio de métodos similares à-queles descritos no Exemplo 5 para milho. Crescimento de material de plan-ta e regime de tratamento serão conforme descritos no Exemplo 1, excetoque plantas serão deixadas crescer ao estágio, em que 4 folhas estivessemdesdobradas (aproximadamente GS 14) antes da aplicação de glifosato e deinibidor de fotossistema II. No momento da aplicação, plantas de igual tama-nho serão selecionadas para cada híbrido ou natural. A inibição de cresci-mento será medida 10 dias depois do crescimento (DAT).

Espera-se que os resultados a partir de experimentos descritosacima mostrarão uma faixa de graus de dano a partir de aplicações somentede glifosato, a partir de essencialmente nenhum dano em evento GMA19788 a dano moderado ou severo no terceiro híbrido selecionado com oevento de baixa tolerância.

Portanto, a seleção de três plantas padrão pode se realizada talque a aplicação conjunta de glifosato e de inibidor de PSII produza um gra-diente de dano que possa servir como uma escala relativa de referência paratolerância a glifosato de plantas examinadas com tolerância a glifosato des-conhecida. A tolerância a glifosato é determinada por exame com relação a,por exemplo, a percentagem de plantas exibindo clorose, folhas mal-formadas e redução de crescimento.

Quando se introduz elementos da presente invenção, ou de su-ais) concretização(ões) preferida(s), os artigos "um(a)", "uns(umas)", "o(a)" e"os(as)" devem pretender significar que há um ou mais dos elementos. Ostermos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" pretendem ser inclusivos esignificar que pode haver elementos adicionais diferentes dos elementoslistados.

Em vista do exposto, será visto que os vários objetos da inven-ção são alcançados e que outros resultados vantajosos são atingidos. Comovárias mudanças poderiam ser feitas nos métodos acima sem se desviar doescopo da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descriçãoacima e mostrada em qualquer das figuras acompanhantes será interpretadacomo ilustrativa e não em um sentido limitante.

Claims (42)

1. Método de ensaio da tolerância herbicida em uma plantacompreendendo:cultivo da planta até uma idade de desenvolvimento predetermi-nada ou durante um intervalo de tempo predeterminado;aplicação de um herbicida, para o qual a tolerância está sendotestada com relação à planta;aplicação de pelo menos um herbicida suplementar, para o quala tolerância não está sendo testada com relação à planta;determinação da extensão do dano à planta; ecorrelação da extensão do dano à tolerância da planta com rela-ção ao herbicida testado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o herbicidatestado é glifosato.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o her-bicida suplementar é um inibidor do Fotossistema Il (PSII).

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que o inibidorde PSII é selecionado a partir do grupo consistindo em uréia substituída, tri-azina, uracila, fenil-carbamato, piridazona, benzotiadiazol, nitrila e fenil-piridazina.

5. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que o inibidorde PSII é selecionado a partir do grupo consistindo em linurona, diurona,metobromurona, fluometurona, tebutiurona e monolinurona.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que o inibidorde PSII de uréia substituída é linurona.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3, em que o inibidorde PSII é selecionado a partir do grupo consistindo em metribuzina, atrazina,cianazina, hexazinona, prometrina e simazina.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, em que o inibidorde PSII é metribuzina.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-8, em que a planta é monocotiledônea.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que a plantamonocotiledônea é selecionada a partir do grupo consistindo em milho, ar-roz, trigo, cevada, aveia, centeio, trigo negro, cana-de-açúcar, cebola, bana-na, tâmara e abacaxi.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a plantamonocotiledônea é milho.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a plantamonocotiledônea é arroz.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que a plantamonocotiledônea é trigo.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a planta é uma dicotiledônea.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que a plantadicotiledônea é selecionada a partir do grupo consistindo em algodão, soja,canola, soja, lentilha, amendoim, açafrão, brócolis, alfafa, trevo, cenoura,morango, framboesa, laranja, maça, cereja, ameixa, salsa, coentro, aneto eerva-doce.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que a plantadicotiledônea é selecionada a partir do grupo consistindo em algodão, soja,lentilha, amendoim, alfafa e açafrão.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o herbicida testado e o herbicida suplementar são aplicados emcombinação.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o herbicida testado e o herbicida suplementar são aplicados emmomentos diferentes.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, compreendendo adicionalmente a etapa de comparação da extensão dodano à planta com pelo menos uma planta padrão com uma tolerância co-nhecida com relação ao herbicida testado, sendo que a planta padrão rece-be um regime de tratamento substancialmente similar à planta.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que existempelo menos duas plantas padrão.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que existempelo menos três plantas padrão.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que existempelo menos quatro plantas padrão.

23. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que pelo me-nos uma planta padrão é uma planta de milho compreendendo um evento demilho independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em NK-603 e GA 21.

24. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que pelo me-nos uma planta padrão é uma planta de milho padrão com uma resistência aglifosato substancialmente similar a eventos de milho independentementeselecionados a partir do grupo consistindo em NK 603 e GA 21.

25. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que pelo me-nos uma planta padrão não compreende um evento que forneça tolerância àglifosato.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-25, em que o herbicida testado é aplicado em uma taxa herbicidamente efi-caz.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que o herbi-cida testado é aplicado em cerca de 1 χ a cerca de 4x a taxa de aplicação nocampo.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que o herbi-cida testado é glifosato e o glifosato é aplicado em uma concentração decerca de 840 gramas por hectare (g/ha) a cerca de 3.360 g/ha.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que o herbi-cida testado é glifosato e o glifosato é aplicado em uma concentração decerca de 1.680 a cerca de 2.520 g/ha.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-29, em que pelo menos um herbicida suplementar é aplicado em uma con-centração não suficiente para prejudicar de maneira significativa a plantaquando aplicado de maneira independente.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que pelo me-nos um herbicida suplementar é aplicado em cerca de 1/4x a cerca de 1x ataxa de aplicação no campo.

32. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que pelo me-nos um herbicida suplementar é um inibidor de PSII e o inibidor de PSII éaplicado em uma concentração de cerca de 56 g/ha a cerca de 224 g/ha.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em que a planta é cultivada até uma idade de desenvolvimento prede-terminada antes da aplicação do herbicida testado e do herbicida suplementar.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, em que a plantaé uma planta de milho cultivada até uma idade de desenvolvimento de cercade estágio de crescimento (GS) 11 a cerca de GS 12, antes da aplicação doherbicida testado e do herbicida suplementar.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, em que a planta é cultivada durante um intervalo de tempo predetermi-nado, antes da aplicação do herbicida testado e do herbicida suplementar.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que a plantaé uma planta de milho cultivada durante cerca de 14 dias a cerca de 21 dias,antes da aplicação do herbicida testado e do herbicida suplementar.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, em que a planta é cultivada durante cerca de 2 a cerca de 15 dias depoisda aplicação do herbicida testado e do herbicida suplementar.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, em que a plantaé uma planta de milho cultivada durante cerca de 5 a cerca de 10 dias de-pois da aplicação do herbicida testado e do herbicida suplementar.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, em que a plantade milho é cultivada durante cerca de 8 dias depois da aplicação do herbici-da testado e do herbicida suplementar.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, em que a extensão do dano é medida como inibição do crescimento.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-39, em que a extensão do dano é medida como clorose.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-39, em que a extensão do dano é medida como necrose.