BRPI0600263B1 - Uso da luciferase de macrolampis sp como gene reporter dual em biosensores simultaneos de expressão gênica e variações intracelulares de ph, concentrações de fosfato e cátions divalentes de metais pesados - Google Patents

Abstract

luciferase de macrolampis sp como gene repórter dual em biosensores simultâneos de expressão gênica e variações de intracelulares de ph, concentrações de fosfato e cátions divalentes de metais pesados. trata-se a presente invenção de um produto da área de biotecnologia constituído de luciferase de microlampis sp recombinante apresenta espectro de bioluminescência bimodal e sensibilidade elevada a mudanças de ph- e temperatura, como gene repórter dual que codifica uma proteína bioluminosa para uso em biosensores simultâneos de expressão gênica e variações de intracelulares de ph, com concentrações de fosfato e cátions divalentes de metais pesados, e presença de atp e como biosensor intracelular de mudanças de ph e outras condições homeostáticas.

Description

(0001) Refere-se a presente invenção de um produto da área de biotecnologia constituído de Luciferase de Microlampis SP como gene repórter dual que codifica uma proteína dotada de bioluminescência para uso em biosensores simultâneos de expressão gênica e variações de intracelulares de PH, com concentrações de F os fato e Cátions divalentes de metais pesados, e como gene repórter para estudos de expressão gênica em células e tecidos.

(0002) A Luciferase recombinante apresenta espectro de bioluminescência bimodal e sensibilidade elevada a mudanças de pH- e temperatura. Por causa destas características de sensibilidade ao pH e temperatura, esta Luciferase é objeto de patente como gene repórter dual para análises simultâneas de expressão gênica e presença de A TP e como biosensor intracelular de mudanças de pH e outras condições homeostáticas.

(0003) As luciferases são as enzimas que catalisam a produção de bioluminescência em diferentes organismos. Elas catalisam a oxidação de moléculas genericamente conhecidas por luciferinas produzindo um fóton de luz visível com alta eficiência (Viviani, 2002). As luciferases de vagalumes e outros besouros catalisam a oxidação de uma luciferina benzotiazólica ativada por ATP.

(0004) Numa primeira etapa estas luciferases catalisam a ativação da luciferina as custas de ATP, produzindo adenilato de luciferina. Na segunda etapa, o adenilato de luciferina é oxidadopor oxigênio molecular produzindo oxiluciferina, dióxido de carbono e um fóton de luz na faixa verde-amarela do espectro com uma eficiência quântica de 90%.

(0005) Devido à sensibilidade do sistema luciferina-luciferase de vagalumes ao ATP, este sistema tem sido utilizado para fins de detecção luminométrica de ATP em amostras biológicas e ensaios enzimáticos (Campbell, 1988). Mais recentemente, com a clonagem do cDNA que codificam a luciferase de vaga- lumes, o gene que codifica a luciferase tem sido utilizado como um dos mais versáteis e eficientes genes repórter para estudo de expressão gênica em bactérias, leveduras, plantas e mamíferos (Greer and Szalay, 2002; Contag and Bachmann, 2002). Baseado neste princípio, os genes de luciferases são utilizados para analisar e quantificar a ativação de promotores em diferentes tipos celulares, como marcadores da transformação e transfecção de células por vetores plasmidiais e virais, como marcadores da progressão e regressão de infecções bacterianas, micóticas e virais (Contag and Bashmann, 2002) em estudos clínicos e testes para drogas antimicrobicidas, em estudos de progressão e regressão de câncer (Yu et al., 2003), como biosensores de agentes tóxicos tais quais agrotóxicos e metais pesados no meio ambiente (Greer and Szalay, 2002), entre muitas outras aplicações biotecnológicas e biomédicas. Entretanto, toda essa variada gama de aplicações tem utilizado principalmente o gene da luciferase do vaga-lume norte-americano Photinus pyralis que produz luz verde amarelada em condições fisiológicas, e algumas variações, produzidas por engenharia genética.

(0006) Embora compartilhe alto grau de identidade com a luciferase de Photinus pyralis, a luciferase de Macrolampis é única em sua sequência de DNA (Seq ID no 1) e de aminoácidos (Seq ID no 2) e por apresentar propriedades espectrais diferenciais que a tornam potencialmente útil como gene repórter em biosensores para mudanças fisico-químicas intracelulares como mudanças de pH, concentração de fosfato e metais pesados, utilizando o parâmetro espectral além do parâmetro de intensidade.

(0007) Embora, as luciferases de vagalumes já sejam amplamente empregadas como genes repórter da expressão gênica. Utilizando o parâmetro intensidade de luz para quantificação, nenhuma destas luciferases até o momento utilizou a propriedade da sensibilidade espectral ao pH e outras condições físico-químicas para analisar mudanças homeostáticas intracelulares.

(0008) A Luciferase de Macrolampis sp é utilizada para fins bioanalíticos de detecção e quantificação de A TP e contaminação microbiológica de amostras várias, através da medida luminométrica ou fotográfica da bioluminescência.

DESCRIÇÃO DO INVENTO

(0009) A clonagem do cDNA para a luciferase de Macrolampis, para que se pudesse analisar suas aplicabilidades se deu conforme descrito a seguir.

(0010) O RNA total foi extraído de 06 lanternas de Macrolampis adulto com Trizol. Em seguida, o RNAm foi isolado utilizando resina de oligodT. O RNAm foi utilizado para a construção da primeira e segunda fita de cDNA utilizando kit Time Saver cDNAsynthesis kit da Amersham. O cDNA foi então ligado ao vetor lambda ZAP, gerando uma biblioteca de cDNA. Esta biblioteca na forma fago foi amplificada a seguir utilizada para produzir uma biblioteca na forma de plasmídeo através de um processo de excisão in vivo, conforme descrito no manual do manufaturador (STRATAGENE). A biblioteca na forma de plasmídeo foi transformada em bactérias SOLR. As colônias de bactérias foram crescidas durante a noite a 37oC em placas com meio LB e Ampicilina e no dia seguinte réplicas foram obtidas em membranas de nitrocelulose e transferidas para placas LB/ampicilina contendo IPTG para expressão de proteínas durante 12 h a temperatura ambiente. As placas foram então borrifadas com solução de luciferina ácida para a indução de bioluminescência. As colônias brilhantes foram então selecionadas por foto detecção visual.

(0011) A colônia brilhante foi isolada e repicada e então o plasmídeo extraído, conforme técnicas descritas e submetido ao sequenciamento do cDNA para a luciferase de macrolampis sp2. (Seq ID no 1), conforme técnicas descritas. Além disso, a invenção apresenta a sequência de aminoácidos da luciferase de Macrolampis sp2: MEDEKNIIHGPEPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVNITYA EYFEMSCRLAEAMXRYGLGLKHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVALAPANDI YNERELLNSMTISQPTIVFCSKKGLQKILNVQKKLPVIQKIVIMDSKPDYQGFQS MYTFIESHLPQGFNEYDFVPDSFDRDATIALIMNSSGSTGLPKGVALPHKNAC VRFSHARDPIYGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVILMYRFEEE LFLRCLQDYKIQSAILVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAV KRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPNGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTL GCNQRGELCVRGPMLMHSYVNNPEATSALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFI VDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPCIFDAGVAGIPDEDAGELPAAVVVLE QGKTLTEKEIMDYVAGMVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILVK AKIGGKSKL

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

(0012) Os exemplos que se seguem ilustram a invenção em maiores detalhes. - Figura 1: mostra o efeito do pH e tampão fosfato no espectro de bioluminescência in vitro da luciferase de Macrolampis: (a) Tris-HCl 0.1 M pH 8; (b) fosfato O.lM pH 8; (c) fosfato 0.1 M pH 7 e (d) fosfato 0.1 M pH 6. - Figura 2: apresenta o efeito da temperatura nos espectros de bioluminescência in vitro. (Painel direito) colônias de bactérias E.coli SOLR transformadas com o plasmídeo pBluescript SK-Macroluc expressando a luciferase de Macrolampis e bioluminescência de tromaticidade termosensitiva quando expostas a diferentes temperaturas após a indução por IPTG e borrifamento de luciferina (tampão citrato pH 5). - Figura 3: mostra a razão entre as intensidades de luminescência em 620 nm e 540 nm em função do pH em diferentes luciferases pH-sensitivas.

(0013) A comparação das estruturas primárias de Macrolampis e Photinus pyralis associada a estudos de mutagênese sítio-dirigida revelou que a os resíduos N354, H31 O, E311 e Y227, constituem parte importante do sensor de pH e temperatura (Viviani et al., 2005 no prelo). Estes dados podem servir como base para a futura engenharia desta e outras luciferases para produzir mutantes com diferentes sensibilidades às mudanças de pH, fosfato e concentrações de cátions de metais divalentes pesados.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(0014) A invenção apresenta uma sequência importante para o entendimento da mesma, sendo elas: ✓ Seq ID no 1: sequenciamento do cDNA para a luciferase de Macrolampis sp2 CARACTERÍSTICAS DO INVENTO.

(0015) A luciferase de Macrolampis, uma vez expressa sob condições apropriadas em células de bactérias, extraída e purificada, é cataliticamente ativa produzindo bioluminescência em presença de luciferina, ATP, magnésio e oxigênio. O espectro de bioluminescência da luciferase é naturalmente bimodal em pH 8 e apresenta sensibilidade pronunciada ao pH e outras condições (Figura 3). A Fig. 4 mostra o efeito da temperatura no espectro de bioluminescência desta luciferase. Os máximos de emissão do espectro de bioluminescência desta luciferase e algumas propriedades são apresentados na Tabela 1. Tabela 1.

(0016) Propriedades espectrais da luciferase de Macrolampis e seus mutantes. Luciferase [Half-Bandwidth] pH8 pH6

(0017) O plasmídeo pBluescript contendo o cDNA para a luciferase de Macrolampis foi utilizado para transformar as células E.coli Xll-Blue (Stratagene), as quais foram cultivadas em meio LB contendo ampicilina a 37°C durante a noite e então induzidas a 25°C durante 6h em placas contendo meio LB/Amp complementado com IPTG (Isopropiltiogalactosídeo) 1 mM para a expressão de luciferase.

(0018) As colônias vivas expressando luciferases foram então borrifadas com luciferina 1 mM em tampão citrato pH 5.0 para indução de bioluminescência in vivo. A bioluminescência das colônias bacterianas induzidas pode ser detectada visualmente, luminometricamente, com câmaras de fotodetecção, e em filmes fotográficos.

(0019) As luciferases também podem ser expressas nas bactérias em culturas líquidas para posterior extração e purificação na forma ativa (produz bioluminescência na presença dos substratos MgATP, luciferina em meio aeróbico) conforme protocolos descritos (Viviani et ai., 1999a, b,c). Osespectros de bioluminescência foram registrados em espectrofluormetro Spex Fluoromax conforme descrito (Viviani et al., 1999a).

(0020) Até o momento as luciferases de lampirídeos tem sido utilizadas unicamente para análises de intensidade de luminescência. A quantificação de dois eventos simultâneos regulados geneticamente, por exemplo, tem sido feita através da utilização de dois genes repórter de luciferases que emitem em diferentes comprimentos de onda associados a diferentes promotores (Wood; Nakajima et al., 2004).

(0021) Notavelmente, embora a sensibilidade ao pH e outros fatores nas luciferases de lampirídeos seja conhecida a um bom tempo (Seliger, 1964), até o momento não se utilizou esta propriedade dinâmica para finalidades analíticas.

(0022) Existe uma relação quantificável entre a razão das intensidades de bioluminescência em 620 nm e 540 nm em função do pH (Fig. 5) e de outras variantes fisico-químicas como a concentração de certos cátions de metais divalentes (mercúrio, zinco, cobre). Esta razão depende da luciferase (Viviani et al., 2005 no prelo) e ela é mais alta quanto mais sensível for a luciferase, como no caso da luciferase do Macrolampis sp2.

(0023) Assim sendo, utilizando equipamentos de fotodetecção altamente sensíveis com filtros de corte, como o luminômetro recentemente desenvolvido pela empresa ATTO (Tókio, Japão; http://www.atto.co.jp/englishtop.html) para detecção simultânea da bioluminescência verde e vermelha das luciferases do Phrixotrix em células vivas, pretendemos introduzir a luciferase do Macrolampis como o primeiro gene repórter dual para análises simultâneas de intensidade de luminescência (como mas não limitada à expressão gênica, quantificação de ATP) e variação espectral (em 620 e 540 nm) em função do pH e outras mudanças homeostáticas intracelulares para finalidades bioanalíticas.

(0024) A pedido de patente incorpora características inovadoras, por essas vantagens reúne as condições necessárias para alcançar o privilégio pleiteado.

Claims (8)

1) Uso da luciferase de Macrolampis sp de SEQ ID No 1 caracterizado pelo fato da luciferase atuar como um biossensor dual simultâneo para gene repórter e variações intracelulares de pH e de concentrações de fosfato e cátions divalentes de metais pesados.

2) Uso da luciferase de Macrolampis sp de SEQ ID No 1, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da luciferase ser obtida através do processo de clonagem do cDNA de Macrolampis.

3) Uso da luciferase de Macrolampis sp de SEQ ID No 1, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato de ter aplicação na detecção e quantificação de ATP.

4) Uso da luciferase de Macrolampis sp de SEQ ID No 1, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato de atuar como biossensor de contaminação microbiológica em meio de cultivo.

5) Uso da luciferase de Macrolampis sp de SEQ ID No 1, de acordo com a reivindicação 1 a 4, caracterizado pelo fato de ter aplicação em células de bactérias, leveduras, plantas, insetos e/ou mamíferos.

6) Uso da luciferase de Macrolampis sp de SEQ ID No 1, de acordo com a reivindicação 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser mensurado a medida luminométrica ou fotográfica da bioluminescência.

7) Uso da luciferase de Macrolampis sp de SEQ ID No 1, de acordo com a reivindicação 1 e 6, caracterizado pelo fato de da intensidade de luminescência estar entre 620 e 540 nm.

8) Uso da luciferase de Macrolampis sp de SEQ ID No 1, de acordo com a reivindicação 1 a 7, caracterizada pelo fato da luciferase ser cataliticamente ativa, produtora de bioluminescência amarela com espectro de bioluminescência bimodal.

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