BRPI0512611B1

BRPI0512611B1 - METHOD, KIT AND COMPOSITION FOR DETECTING A NUCLEIC ACID OR PROTEIN IN A SAMPLE

Info

Publication number: BRPI0512611B1
Application number: BRPI0512611-8A
Authority: BR
Inventors: Allen Bard; Wujiam Miao
Original assignee: Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date: 2004-06-23
Filing date: 2005-06-23
Publication date: 2023-07-11

Abstract

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A DETECÇÃO DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAS EMPREGANDO UM COMPLEXO DE DUAS PARTÍCULAS A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A MÉTODOS DE DETECÇÃO DE ANÁLITOS DE INTERESSE EM UMA AMOSTRA EMPREGANDO QUIMIOLUMINESCÊNCIA ELETROGERADA. A INVENÇÃO TAMBÉM FORNECE COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO PELO MENOS UM SUPORTE SÓLIDO QUE CAPTURA OU CONTÉM UMA PORÇÃO QUIMIOLUMINESCENTE ELETROGERADA.METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE DETECTION OF BIOLOGICAL MOLECULES USING A TWO-PARTICLE COMPLEX THE PRESENT INVENTION REFERS TO METHODS FOR DETECTING ANALYTES OF INTEREST IN A SAMPLE USING ELECTROGENERATED CHEMIOLUMINESCENCE. THE INVENTION ALSO PROVIDES COMPOSITIONS COMPRISING AT LEAST ONE SOLID SUPPORT THAT CAPTURES OR CONTAINS AN ELECTROGENERATED CHEMIOLUMINESCENT PORTION.

Description

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisional U.S. número 60/581.719, depositado em 23 de junho, de 2004, que está incorporado aqui por referência.[0001] This application claims the benefit of U.S. provisional application number 60/581,719, filed June 23, 2004, which is incorporated herein by reference.

Description of the Invention Field of Invention

[0002] A presente invenção refere-se geralmente a métodos e composições para detectar analitos de interesse em uma amostra. Um analito de interesse pode ser associado com uma doença ou condição a qual aflige organismos humanos ou outros organismos vivos. Os analitos de interesse incluem, toxinas,agentes de guerra biológicos ou químicos, e poluentes ambientais. Em certas modalidades, a invenção refere-se específicamente às composições compreendendo um primeiro e segundo veículo, um analito de interesse contido em uma amostra, uma porção quimioluminescente eletrogerada (ECL) capturada ou contida em todo o primeiro veículo e pelo menos um par de ligações específico do analito de interesse ligado a pelo menos um dos primeiro e segundo veículo. Em certas modalidades, a invenção refere-se aos métodos de uso dessas composições para detectar um analito de interesse em uma amostra.[0002] The present invention generally relates to methods and compositions for detecting analytes of interest in a sample. An analyte of interest may be associated with a disease or condition that afflicts human or other living organisms. Analytes of interest include toxins, biological or chemical warfare agents, and environmental pollutants. In certain embodiments, the invention specifically relates to compositions comprising a first and second carrier, an analyte of interest contained in a sample, an electrogenerated chemiluminescent (ECL) moiety captured or contained throughout the first carrier, and at least one pair of bonds specific analyte of interest bound to at least one of the first and second carriers. In certain embodiments, the invention relates to methods of using these compositions to detect an analyte of interest in a sample.

Background of the Invention

[0003] Há uma necessidade contínua e crescente de métodos altamente específicos, rápidos de detecção e quantificação de analitos, tal como substâncias químicas, bioquímicas e biológicas. Em particular, métodos para medir pequenas quantidades de farmacêuticos, metabólitos, marcadores biológicos, microorganismos, vírus e outros patógenos são desejados. A presença desses materiais pode geralmente ser determinada ligando-se os métodos que exploram o grau elevado de especificidade que caracteriza muitos sistemas biológicos. Os métodos conhecidos que contam com a ligação para detectar uma molécula de interesse presente em uma amostra incluem técnicas de hibridização de ácido nucléico e interações de proteína ligando tal como ligação de anticorpo-antígeno. Nesses métodos, a existência de um complexo de valor diagnóstico é tipicamente indicada pela presença/ativação ou ausência/desativação de um rótulo observável que tenha sido ligado a um ou mais dos materiais compreendendo o complexo.[0003] There is a continuous and growing need for highly specific, rapid methods of detection and quantification of analytes, such as chemical, biochemical and biological substances. In particular, methods for measuring small quantities of pharmaceuticals, metabolites, biological markers, microorganisms, viruses, and other pathogens are desired. The presence of these materials can generally be determined by linking to methods that exploit the high degree of specificity that characterizes many biological systems. Known methods that rely on binding to detect a molecule of interest present in a sample include nucleic acid hybridization techniques and protein-ligand interactions such as antibody-antigen binding. In these methods, the existence of a complex of diagnostic value is typically indicated by the presence/activation or absence/deactivation of an observable label that has been attached to one or more of the materials comprising the complex.

[0004] A sensibilidade e seletividade são ambas atributos desejáveis de qualquer sistema para detecção de moléculas específicas de interesse presentes em uma amostra compreendida de uma pluralidade de componentes. A sensibilidade, em hibridização de DNA e outros bioensaios para a detecção de moléculas biológicas de interesse, é importante em diagnósticos clínicos (Liron e Fisher Eds. Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays, Kluwer Academic/Plenum Publishers: Nova York, 2000; Kenton e outros 1992, CHn. Chem. 38:873; Chistodoulides e outros 2002, Anal. Chem. 74:3030), substância química forense (Heller, 2002, Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129; Nelson e outros 1996, J. Forensic Sci. 41 :557), investigações ambientais (Lucarelli e outros 2002, Talanta 56:949; Min e outros 2002, Anal. Biochem. 303:186), estudos farmacêuticos (Heller, 2002, Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129; Pollice e outros 1985, Clin. Lab. Med. 5:463), e detecção de agente de guerra biológico (Smith, 2002, Anal. Chem. 74:462A; Miao e Bard, 2003, Anal. Chem. 75:5825). Desse modo qualquer sistema que proveja a subsistência de detecção sensível e seletiva de moléculas de interesse terá aplicabilidade ampla em todos esses campos.[0004] Sensitivity and selectivity are both desirable attributes of any system for detecting specific molecules of interest present in a sample comprised of a plurality of components. Sensitivity, in DNA hybridization and other bioassays for the detection of biological molecules of interest, is important in clinical diagnostics (Liron and Fisher Eds. Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays, Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, 2000; Kenton et al. 1992, CHn. Chem. 38:873; Chistodoulides et al. 2002, Anal. Chem. 74:3030), forensic chemical (Heller, 2002, Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129; Nelson et al. 1996, J. Forensic Sci. 41:557), environmental investigations (Lucarelli et al. 2002, Talanta 56:949; Min et al. 2002, Anal. Biochem. 303:186), pharmaceutical studies (Heller, 2002, Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129; Pollice et al. 1985, Clin. Lab. Med. 5:463), and biological warfare agent detection (Smith, 2002, Anal. Chem. 74:462A; Miao and Bard, 2003, Anal Chem 75:5825). Thus, any system that provides the subsistence of sensitive and selective detection of molecules of interest will have broad applicability in all these fields.

[0005] Os métodos de eletroquimioluminescência (ECL) têm sido amplamente empregado em estudos de ligação, por causa de sua sensibilidade elevada, ampla faixa dinâmica e seletividade (Patente U.S. N° 6.316.607; Bard, A.J. Ed. Electrogenerated Chemiluminescence, Marcel Dekker Nova York, 2004). Por exemplo, uma variedade de técnicas está disponível para a detecção de DNA, onde os rótulos ativos de ECL, eletroquímicos e fluorescentes ligados a um DNA de filamento único alvo (t-ssDNA) produz o sinal mensurável no processo de análise (Liron e Fisher Eds. Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays, Kluwer Academic/Plenum Publishers: Nova York, 2000; Yang e Ngo Eds. Biosensors and Their Applications, Kluwer Academic/Plenum Publishers: Nova York, 2000; Cunningham, Introduction to Bioanalytical Sensors, J. Wiley & Sons, Inc.: Nova York, 1998). A sensibilidade desses métodos é geralmente limitada uma vez que a intensidade do sinal medido é geralmente proporcional à quantidade de t-ss-DNA, e tradicionalmente, somente um ou alguns rótulos pode ser ligado a um t-ssDNA. Várias abordagens têm sido desenvolvidas nas quais um DNA pode ser rotulado com um número maior de rótulos, para que uma sensibilidade mais elevada possa ser obtida (Wang e Merkoci, 2003, Langmuir 19:989; Zhao e outros. 2003, J. Am. Chem. Soc. 125:11474). Esses métodos não fornecem a sensibilidade requerida para detectar quantidades na faixa de fentomol (fmol). Também como eles não fornecem ligação não específica baixa, a capacidade de distinguir entre hibridização complementar e uma ligação imperfeita de 2 pares de base ou medições múltiplas.[0005] Electrochemiluminescence (ECL) methods have been widely used in binding studies because of their high sensitivity, wide dynamic range and selectivity (U.S. Patent No. 6,316,607; Bard, A.J. Ed. Electrogenerated Chemiluminescence, Marcel Dekker New York, 2004). For example, a variety of techniques are available for DNA detection, where active ECL, electrochemical, and fluorescent labels attached to a target single-stranded DNA (t-ssDNA) produce the measurable signal in the analysis process ( Liron and Fisher Eds. Novel Approaches in Biosensors and Rapid Diagnostic Assays, Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, 2000; Yang and Ngo Eds. Biosensors and Their Applications, Kluwer Academic/Plenum Publishers: New York, 2000; Cunningham, Introduction to Bioanalytical Sensors, J. Wiley & Sons, Inc.: New York, 1998). The sensitivity of these methods is generally limited since the intensity of the measured signal is generally proportional to the amount of t-ss-DNA, and traditionally, only one or a few labels can be linked to a t-ssDNA. Several approaches have been developed in which a DNA can be labeled with a greater number of labels so that higher sensitivity can be obtained (Wang and Merkoci, 2003, Langmuir 19:989; Zhao et al. 2003, J. Am. Chem Soc 125:11474). These methods do not provide the sensitivity required to detect quantities in the fentomol (fmol) range. Also as they do not provide low non-specific binding, the ability to distinguish between complementary hybridization and an imperfect 2 base pair binding or multiple measurements.

[0006] A necessidade permanece, portanto, de sistemas de detecção altamente sensíveis (por exemplo, na faixa de fmol) que forneçam seletividade elevada e ligação não específica baixa. O sistema deveria ter ampla aplicabilidade para que possa ser usado para detectar virtualmente qualquer molécula de interesse, desde que ela seja capaz de ligar-se ou interagir com pelo menos uma outra molécula (por exemplo, um par de ligações específico). Quando a molécula de interesse é um ácido nucléico, por exemplo, DNA, o sistema deveria ser capaz de distinguir entre cada das seguintes: hibridização complementar, hibridização de ligação imperfeita de pelo menos 2 pares de base, e hibridização de DNA não complementar.[0006] The need therefore remains for highly sensitive detection systems (e.g. in the fmol range) that provide high selectivity and low non-specific binding. The system should have broad applicability so that it can be used to detect virtually any molecule of interest, as long as it is capable of binding or interacting with at least one other molecule (e.g., a specific bond pair). When the molecule of interest is a nucleic acid, e.g., DNA, the system should be able to distinguish between each of the following: complementary hybridization, imperfect ligation hybridization of at least 2 base pairs, and noncomplementary DNA hybridization.

[0007] Idealmente, o sistema de detecção fornecerá igualmente um tratamento simples para eliminar a ligação não específica do rótulo de ECL e estabilidade elevada do rótulo de ECL desse modo permitindo a possibilidade de tomar múltiplas medições, sem uma perda de sinal. Cada dessas necessidades, pelo menos, é atendida por certas modalidades da invenção descrita.[0007] Ideally, the detection system will also provide a simple treatment to eliminate non-specific binding of the ECL label and high stability of the ECL label thereby allowing the possibility of taking multiple measurements without a loss of signal. Each of these needs, at least, is met by certain embodiments of the described invention.

Summary of the Invention

[0008] Em certas modalidades, a invenção fornece métodos e composições para detectar um analito de interesse em uma amostra que é rápida, sensível, e seletiva. A invenção, desse modo, refere-se a métodos e composições para precisamente detectar (por exemplo, com ocorrência baixa de sinais positivos falsos) pequenas quantidades (por exemplo, 1 fmol) de analitos de interesse que estejam contidos em uma amostra. Esta sensibilidade desejada é obtida, pelo menos em parte, fornecendo-se uma pluralidade de moléculas de ECL capturadas ou contidas em um primeiro veículo.[0008] In certain embodiments, the invention provides methods and compositions for detecting an analyte of interest in a sample that is rapid, sensitive, and selective. The invention thus relates to methods and compositions for accurately detecting (e.g., with low occurrence of false positive signals) small amounts (e.g., 1 fmol) of analytes of interest that are contained in a sample. This desired sensitivity is achieved, at least in part, by providing a plurality of ECL molecules captured or contained in a first carrier.

[0009] Em certas modalidades, a invenção fornece um método de detectar um analito de interesse em uma amostra que compreende: (a) formar uma composição que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é um primeiro veículo contendo A, e B está ou ligado ao analito de interesse ou ligado a um primeiro par de ligações específico do analito de interesse; C é uma amostra que pode conter o analito de interesse; e D é um segundo veículo que é ou ligado ao analito de interesse ou ligado a um segundo par de ligações específico do analito de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; (b) separar um complexo que compreende A, B, D e o analito de interesse de outros componentes da composição; (c) induzir a porção de ECL à repetidamente emitir radiação eletromagnética expondo-se a porção a energia eletroquímica; e (d) detectar a radiação eletromagnética emitida e desse modo detectar a presença do analito de interesse, desde que B e D não estejam ambos ligados ao analito de interesse.[0009] In certain embodiments, the invention provides a method of detecting an analyte of interest in a sample comprising: (a) forming a composition comprising: (A)k, (B)u, (C), (D) x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a first carrier containing A, and B is either linked to the analyte of interest or linked to a first bond pair specific to the analyte of interest; C is a sample that may contain the analyte of interest; and D is a second carrier that is either linked to the analyte of interest or linked to a second bond pair specific to the analyte of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; (b) separating a complex comprising A, B, D and the analyte of interest from other components of the composition; (c) inducing the ECL portion to repeatedly emit electromagnetic radiation by exposing the portion to electrochemical energy; and (d) detect the emitted electromagnetic radiation and thereby detect the presence of the analyte of interest, provided that B and D are not both bound to the analyte of interest.

[00010] Em certas modalidades, a invenção fornece um método de detectar uma molécula biológica de interesse em uma amostra, que compreende: (e) formar uma composição que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é um primeiro suporte sólido envolvendo ou contendo A, e B está ou ligado à molécula biológica de interesse ou ligado a um primeiro par de ligações específico da molécula biológica de interesse; C é a amostra que pode conter a molécula biológica de interesse; e D é um segundo suporte sólido que é ou ligado à molécula biológica de interesse ou ligado a um segundo par de ligações específico da molécula biológica de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; (f) separar um complexo compreendendo A, B, D e a molécula biológica de interesse de outros componentes da composição; (c)induzir a porção de ECL à repetidamente emitir radiação eletromagnética expondo-se diretamente a porção à energia eletroquímica; e (d) detectar a radiação eletromagnética emitida e desse modo determinar a presença da molécula biologia, desde que B e D não estejam ambos ligados à molécula biológica de interesse.[00010] In certain embodiments, the invention provides a method of detecting a biological molecule of interest in a sample, which comprises: (e) forming a composition comprising: (A)k, (B)u, (C), ( D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a first solid support surrounding or containing A, and B is either linked to the biological molecule of interest or linked to a first pair of bonds specific to the biological molecule of interest; C is the sample that may contain the biological molecule of interest; and D is a second solid support that is either linked to the biological molecule of interest or linked to a second pair of bonds specific to the biological molecule of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; (f) separating a complex comprising A, B, D and the biological molecule of interest from other components of the composition; (c) inducing the ECL portion to repeatedly emit electromagnetic radiation by directly exposing the portion to electrochemical energy; and (d) detect the emitted electromagnetic radiation and thereby determine the presence of the biological molecule, provided that B and D are not both linked to the biological molecule of interest.

[00011] Em algumas modalidades da invenção, a molécula biológica de interesse pode ser uma proteína. Em algumas modalidades da invenção, a molécula biológica de interesse pode ser um ácido nucléico.[00011] In some embodiments of the invention, the biological molecule of interest may be a protein. In some embodiments of the invention, the biological molecule of interest may be a nucleic acid.

[00012] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição útil para a detecção de um analito de interesse em uma amostra, que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é um primeiro veículo contendo A, e B está ou ligado ao analito de interesse ou ligado a um primeiro par de ligações específico do analito de interesse; C é a amostra que pode conter o analito de interesse; e D é um segundo veículo que é ou ligado ao analito de interesse ou ligado a um segundo par de ligações específico do analito de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; desde que B e D não estejam ambos ligados ao analito de interesse.[00012] In certain embodiments, the invention provides a composition useful for detecting an analyte of interest in a sample, which comprises: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a first carrier containing A, and B is either linked to the analyte of interest or linked to a first bond pair specific to the analyte of interest; C is the sample that may contain the analyte of interest; and D is a second carrier that is either linked to the analyte of interest or linked to a second bond pair specific to the analyte of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; as long as B and D are not both bound to the analyte of interest.

[00013] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição útil para a detecção de uma molécula biológica em uma amostra, que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é um primeiro suporte sólido contendo A, e B está ou ligado à molécula biológica de interesse ou ligado a um par de ligações específico da molécula biológica de interesse; C é a amostra que pode conter a molécula biológica; e D é um segundo suporte sólido que pode ser diretamente ligado à molécula biológica de interesse ou ligado a um segundo par de ligações específico da molécula biológica de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; desde que B e D não estejam ambos ligados à molécula biológica de interesse.[00013] In certain embodiments, the invention provides a composition useful for detecting a biological molecule in a sample, comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a first solid support containing A, and B is either linked to the biological molecule of interest or linked to a specific bond pair of the biological molecule of interest; C is the sample that may contain the biological molecule; and D is a second solid support that can be directly linked to the biological molecule of interest or linked to a second pair of bonds specific to the biological molecule of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; as long as B and D are not both linked to the biological molecule of interest.

[00014] Em algumas modalidades da invenção, a molécula biológica de interesse pode ser uma proteína. Em algumas modalidades da invenção, a molécula biológica de interesse pode ser um ácido nucléico.[00014] In some embodiments of the invention, the biological molecule of interest may be a protein. In some embodiments of the invention, the biological molecule of interest may be a nucleic acid.

[00015] Em certas modalidades, a invenção fornece um método de detectar uma molécula de ácido nucléico de interesse em uma amostra, que compreende: (g) formar uma composição que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; Bé uma conta que é solúvel em um solvente orgânico, por exemplo, uma conta de poliestireno, contendo A, e B está ou ligado à molécula de ácido nucléico de interesse ou ligado a um primeiro par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; C é a amostra que pode conter a molécula de ácido nucléico de interesse; e D é uma conta magnética que está ligada à molécula de ácido nucléico de interesse ou ligada a um segundo par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; (h) separar um complexo compreendendo A, B, D e a molécula de ácido nucléico de interesse de outros componentes da composição; (i) dissolver B em um solvente orgânico; (j) induzir a porção de ECL à repetidamente emitir radiação eletromagnética expondo-se diretamente a porção à energia eletroquímica; e (k) detectar a radiação eletromagnética emitida e desse modo detectar a presença da molécula de ácido nucléico de interesse, desde que B e D não estejam ambos ligados à molécula de ácido nucléico de interesse.[00015] In certain embodiments, the invention provides a method of detecting a nucleic acid molecule of interest in a sample, which comprises: (g) forming a composition comprising: (A)k, (B)u, (C) , (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a bead that is soluble in an organic solvent, for example a polystyrene bead, containing A, and B is either bonded to the nucleic acid molecule of interest or bonded to a first pair of bonds specific to the nucleic acid molecule of interest ; C is the sample that may contain the nucleic acid molecule of interest; and D is a magnetic bead that is linked to the nucleic acid molecule of interest or linked to a second pair of bonds specific to the nucleic acid molecule of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; (h) separating a complex comprising A, B, D and the nucleic acid molecule of interest from other components of the composition; (i) dissolve B in an organic solvent; (j) inducing the ECL portion to repeatedly emit electromagnetic radiation by directly exposing the portion to electrochemical energy; and (k) detecting the emitted electromagnetic radiation and thereby detecting the presence of the nucleic acid molecule of interest, provided that B and D are not both linked to the nucleic acid molecule of interest.

[00016] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucléico de interesse é um ácido deoxirribonucléico (DNA). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico de interesse é um ácido ribonucléico (RNA).[00016] In certain embodiments, the nucleic acid molecule of interest is a deoxyribonucleic acid (DNA). In some embodiments, the nucleic acid molecule of interest is a ribonucleic acid (RNA).

[00017] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição útil para detectar uma molécula de ácido nucléico de interesse em uma amostra que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é uma conta de poliestireno contendo A, e B está ou ligado à molécula de ácido nucléico de interesse ou ligado a um par de ligações da molécula de ácido nucléico de interesse; C é a amostra que pode conter a molécula de ácido nucléico de interesse; e D é uma conta magnética que está ou ligada à molécula de ácido nucléico de interesse ou ligada a um par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; desde que B e D não estejam ambos ligados à molécula de ácido nucléico de interesse.[00017] In certain embodiments, the invention provides a composition useful for detecting a nucleic acid molecule of interest in a sample comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a polystyrene bead containing A, and B is either linked to the nucleic acid molecule of interest or linked to a bond pair of the nucleic acid molecule of interest; C is the sample that may contain the nucleic acid molecule of interest; and D is a magnetic bead that is either linked to the nucleic acid molecule of interest or linked to a specific bond pair of the nucleic acid molecule of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; provided that B and D are not both linked to the nucleic acid molecule of interest.

[00018] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição para detectar uma molécula de ácido nucléico de interesse em uma amostra que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é uma conta de poliestireno contendo A, e B está ou ligado à molécula de ácido nucléico de interesse ou ligado a um primeiro par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; C é a amostra que pode conter a molécula de ácido nucléico de interesse; e D é uma conta magnética que está ou ligada à molécula de ácido nucléico de interesse ou ligada a um segundo par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; desde que B e D não estejam ambos ligados à molécula de ácido nucléico de interesse.[00018] In certain embodiments, the invention provides a composition for detecting a nucleic acid molecule of interest in a sample comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a polystyrene bead containing A, and B is either linked to the nucleic acid molecule of interest or linked to a first pair of bonds specific to the nucleic acid molecule of interest; C is the sample that may contain the nucleic acid molecule of interest; and D is a magnetic bead that is either linked to the nucleic acid molecule of interest or linked to a second pair of bonds specific to the nucleic acid molecule of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; provided that B and D are not both linked to the nucleic acid molecule of interest.

[00019] Em certas modalidades, a invenção fornece um método de detecção de uma proteína de interesse em uma amostra que compreende: (l) formar uma composição que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é uma conta de poliestireno contendo A, e B está ou ligado à proteína de interesse ou a um primeiro par de ligações específico que específicamente se liga à proteína de interesse; C é a amostra que pode conter a proteína de interesse; e D é uma conta magnética que está ligada à proteína de interesse ou ligada a um segundo par de ligações específico que específicamente se liga à proteína de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; (m) separar um complexo compreendendo A, B, D e a molécula de proteína de interesse de outros componentes da composição; (n) induzir a porção de ECL à repetidamente emitir radiação eletromagnética expondo-se diretamente a porção à energia eletroquímica; e (o) detectar a radiação eletromagnética emitida e desse modo detectar a presença da proteína de interesse, desde que B e D não estejam ambos ligados à proteína de interesse.[00019] In certain embodiments, the invention provides a method of detecting a protein of interest in a sample comprising: (l) forming a composition comprising: (A)k, (B)u, (C), (D )x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a polystyrene bead containing A, and B is either linked to the protein of interest or to a specific first bond pair that specifically binds to the protein of interest; C is the sample that may contain the protein of interest; and D is a magnetic bead that is linked to the protein of interest or linked to a second specific bond pair that specifically binds to the protein of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; (m) separating a complex comprising A, B, D and the protein molecule of interest from other components of the composition; (n) inducing the ECL portion to repeatedly emit electromagnetic radiation by directly exposing the portion to electrochemical energy; and (o) detecting the emitted electromagnetic radiation and thereby detecting the presence of the protein of interest, provided that B and D are not both bound to the protein of interest.

[00020] Em certas modalidades, a invenção fornece uma composição para detecção de uma proteína de interesse em uma amostra que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é uma conta de poliestireno, contendo A, e B está ou ligado à proteína de interesse ou ligado a um primeiro par de ligações específico da proteína de interesse; C é a amostra que pode conter a proteína de interesse; e D é uma conta magnetizável que está ou ligada à proteína de interesse ou ligada a um segundo par de ligações específico que específicamente se liga à molécula de proteína de interesse; e onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; desde que B e D não estejam ambos ligados à proteína de interesse.[00020] In certain embodiments, the invention provides a composition for detecting a protein of interest in a sample comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL which can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a polystyrene bead, containing A, and B is either linked to the protein of interest or linked to a first pair of bonds specific to the protein of interest; C is the sample that may contain the protein of interest; and D is a magnetizable bead that is either linked to the protein of interest or linked to a second specific bond pair that specifically binds to the protein molecule of interest; and where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; as long as B and D are not both bound to the protein of interest.

[00021] Em certas modalidades, o primeiro e/ou o segundo par de ligações da molécula de proteína de interesse pode ser um anticorpo ou uma proteína de ligação específica.[00021] In certain embodiments, the first and/or second pair of bonds of the protein molecule of interest may be an antibody or a specific binding protein.

[00022] A invenção também fornece métodos para realizar ensaios de ligação competitivos para detectar um analito de interesse. Em certas modalidades, a invenção fornece um método de detecção de um analito de interesse em uma amostra, que compreende: (p) formar uma composição que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é um primeiro veículo contendo A, e B está ou ligado a um análogo do analito de interesse ou ligado a um par de ligações específico do analito de interesse; C é a amostra que pode conter o analito de interesse; e D é um segundo veículo que está ou ligado a um análogo do analito de interesse ou ligado a um par de ligações específico do analito de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; (q) separar um complexo compreendendo A, B, D de outros componentes da composição; (r) induzir a porção de ECL no complexo à repetidamente emitir radiação eletromagnética expondo-se diretamente a porção à energia eletroquímica; e (s) detectar a radiação eletromagnética emitida e desse modo detectar a presença do analito de interesse, desde que somente um dos B e D esteja ligado ao análogo do analito de interesse e também desde que se B estiver ligado ao análogo do analito de interesse, então D estará ligado ao análogo do analito de interesse.[00022] The invention also provides methods for performing competitive binding assays to detect an analyte of interest. In certain embodiments, the invention provides a method of detecting an analyte of interest in a sample, which comprises: (p) forming a composition comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a first carrier containing A, and B is either linked to an analogue of the analyte of interest or linked to a specific bond pair of the analyte of interest; C is the sample that may contain the analyte of interest; and D is a second carrier that is either linked to an analogue of the analyte of interest or linked to a specific bond pair of the analyte of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; (q) separating a complex comprising A, B, D from other components of the composition; (r) inducing the ECL portion of the complex to repeatedly emit electromagnetic radiation by directly exposing the portion to electrochemical energy; and (s) detect the emitted electromagnetic radiation and thereby detect the presence of the analyte of interest, provided that only one of B and D is bound to the analogue of the analyte of interest and also provided that if B is bound to the analogue of the analyte of interest , then D will be bound to the analogue of the analyte of interest.

[00023] Em modalidades relacionadas, a invenção fornece um método de detectar uma molécula de ácido nucléico de interesse em uma amostra que compreende: (a)formar uma composição que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é uma conta de poliestireno contendo A, e B está ou ligado a um análogo do ácido nucléico de interesse ou ligado a um par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; C é a amostra que pode conter a molécula de ácido nucléico de interesse; e D é uma conta magnética que está ou ligada a um análogo do ácido nucléico de interesse ou ligada a um par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; (b) separar um complexo compreendendo A, B, D e a molécula de ácido nucléico de interesse de outros componentes da composição; (c) dissolver B em um solvente orgânico; (d) induzir a porção de ECL à repetidamente emitir radiação eletromagnética expondo-se diretamente a porção à energia eletroquímica; e (e) detectar a radiação eletromagnética emitida e desse modo detectar a presença da molécula de ácido nucléico de interesse, desde que somente um dos B e D esteja ligado ao análogo do ácido nucléico de interesse; e também desde que se B estiver ligado ao análogo do ácido nucléico de interesse, então D estará ligado a um par de ligações da molécula de ácido nucléico de interesse, e se B estiver ligado a um par de ligações da molécula de ácido nucléico de interesse, então D estará ligado ao análogo da molécula de ácido nucléico de interesse.[00023] In related embodiments, the invention provides a method of detecting a nucleic acid molecule of interest in a sample comprising: (a) forming a composition comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a polystyrene bead containing A, and B is either linked to an analogue of the nucleic acid of interest or linked to a specific bond pair of the nucleic acid molecule of interest; C is the sample that may contain the nucleic acid molecule of interest; and D is a magnetic bead that is either linked to an analogue of the nucleic acid of interest or linked to a specific bond pair of the nucleic acid molecule of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; (b) separating a complex comprising A, B, D and the nucleic acid molecule of interest from other components of the composition; (c) dissolving B in an organic solvent; (d) inducing the ECL portion to repeatedly emit electromagnetic radiation by directly exposing the portion to electrochemical energy; and (e) detect the emitted electromagnetic radiation and thereby detect the presence of the nucleic acid molecule of interest, provided that only one of B and D is linked to the nucleic acid analogue of interest; and also provided that if B is bonded to the nucleic acid analogue of interest, then D will be bonded to a bond pair of the nucleic acid molecule of interest, and if B is bonded to a bond pair of the nucleic acid molecule of interest , then D will be linked to the analogue of the nucleic acid molecule of interest.

[00024] Em algumas modalidades, a invenção fornece, um método de detecção de uma proteína de interesse em uma amostra, que compreende: (a) formar uma composição que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é uma conta de poliestireno contendo A, e B está ligado ou a um análogo da proteína de interesse ou a um par de ligações específico que específicamente se liga à proteína de interesse; C é a amostra que pode conter a proteína de interesse; Dé uma conta magnética que está ou ligada a um análogo da proteína de interesse ou a um par de ligações específico que específicamente se liga à proteína de interesse; onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; (b) separar um complexo compreendendo A, B, D e a proteína de interesse de outros componentes da composição; (c) induzir a porção de ECL à repetidamente emitir radiação eletromagnética expondo-se diretamente a porção à energia eletroquímica; e (d) detectar a radiação eletromagnética emitida e desse modo detectar a presença da proteína de interesse, desde que somente um dos B e D esteja ligado ao análogo da proteína de interesse; e também desde que se B estiver ligado ao análogo da proteína de interesse e se B estiver ligado a um par de ligações da proteína de interesse, então D estará ligado ao análogo da proteína de interesse.[00024] In some embodiments, the invention provides, a method of detecting a protein of interest in a sample, which comprises: (a) forming a composition comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a polystyrene bead containing A, and B is linked either to an analogue of the protein of interest or to a specific bond pair that specifically binds the protein of interest; C is the sample that may contain the protein of interest; It is a magnetic bead that is either linked to an analogue of the protein of interest or to a specific bond pair that specifically binds to the protein of interest; where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; (b) separating a complex comprising A, B, D and the protein of interest from other components of the composition; (c) inducing the ECL portion to repeatedly emit electromagnetic radiation by directly exposing the portion to electrochemical energy; and (d) detect the emitted electromagnetic radiation and thereby detect the presence of the protein of interest, provided that only one of B and D is linked to the analogue of the protein of interest; and also provided that if B is bound to the protein analogue of interest and if B is bound to a bond pair of the protein of interest, then D will be bound to the protein analogue of interest.

[00025] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições para realizar ensaios de ligação competitivos para a detecção de um analito de interesse. Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição para a detecção de um analito de interesse em uma amostra, que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é um primeiro veículo contendo A, e B está ou ligado a um análogo do analito de interesse ou ligado a um primeiro par de ligações específico do analito de interesse; C é a amostra que pode conter o analito de interesse; D é um segundo veículo que pode está ligado ao análogo do analito de interesse ou ligado a um segundo par de ligações específico do analito de interesse; e onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; desde que somente um dos B e D esteja ligado ao análogo do analito de interesse; e também desde que se B estiver ligado ao análogo do analito de interesse, então D estará ligado ao par de ligações específico da proteína de interesse e se B estiver ligado a um par de ligações da proteína de interesse, então D estará ligado ao análogo da proteína de interesse.[00025] In some embodiments, the invention provides compositions for performing competitive binding assays for the detection of an analyte of interest. In some embodiments, the invention provides a composition for detecting an analyte of interest in a sample, comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a first carrier containing A, and B is either linked to an analogue of the analyte of interest or linked to a first bond pair specific to the analyte of interest; C is the sample that may contain the analyte of interest; D is a second carrier that may be linked to the analogue of the analyte of interest or linked to a second pair of bonds specific to the analyte of interest; and where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; provided that only one of B and D is linked to the analogue of the analyte of interest; and also provided that if B is bound to the analogue of the analyte of interest, then D will be bound to the specific bond pair of the protein of interest and if B is bound to a bond pair of the protein of interest, then D will be bound to the analogue of the protein of interest.

[00026] Em certas modalidades da composição, o analito de interesse é um ácido nucléico. Em algumas modalidades da composição, o analito de interesse é uma proteína.[00026] In certain embodiments of the composition, the analyte of interest is a nucleic acid. In some embodiments of the composition, the analyte of interest is a protein.

[00027] Em uma modalidade relacionada, a invenção fornece uma composição para detectar uma molécula de ácido nucléico de interesse em uma amostra que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é uma conta de poliestireno contendo A, e B está ou ligado a um análogo da molécula de ácido nucléico de interesse ou ligado a um par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; Cé a amostra que pode conter a molécula de ácido nucléico de interesse; D é uma conta magnética que está ou ligada ao análogo da molécula de ácido nucléico de interesse ou ligada a um par de ligações específico da molécula de ácido nucléico de interesse; e onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; desde que somente um dos B e D esteja ligado ao análogo da molécula de ácido nucléico de interesse; e também desde que se B estiver ligado ao análogo da molécula de ácido nucléico de interesse, então D estará ligado ao par de ligações da molécula de ácido nucléico de interesse, e se B estiver ligado ao par de ligações da molécula de ácido nucléico de interesse, então D estará ligado ao análogo da molécula de ácido nucléico de interesse.[00027] In a related embodiment, the invention provides a composition for detecting a nucleic acid molecule of interest in a sample comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a polystyrene bead containing A, and B is either linked to an analogue of the nucleic acid molecule of interest or linked to a specific bond pair of the nucleic acid molecule of interest; This is the sample that may contain the nucleic acid molecule of interest; D is a magnetic bead that is either linked to the analogue of the nucleic acid molecule of interest or linked to a specific bond pair of the nucleic acid molecule of interest; and where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; provided that only one of B and D is linked to the analogue of the nucleic acid molecule of interest; and also provided that if B is bonded to the analogue of the nucleic acid molecule of interest, then D will be bonded to the bond pair of the nucleic acid molecule of interest, and if B is bonded to the bond pair of the nucleic acid molecule of interest , then D will be linked to the analogue of the nucleic acid molecule of interest.

[00028] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucléico de interesse é um ácido deoxirribonucléico (DNA). Em certas modalidades, a molécula de ácido nucléico de interesse é um ácido ribonucléico (RNA).[00028] In certain embodiments, the nucleic acid molecule of interest is a deoxyribonucleic acid (DNA). In certain embodiments, the nucleic acid molecule of interest is a ribonucleic acid (RNA).

[00029] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma composição para detectar uma proteína de interesse em uma amostra que compreende: (A)k, (B)u, (C), (D)x onde A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é uma conta de poliestireno contendo A, e B está ou ligado a um análogo da proteína de interesse ou ligado a um par de ligações específico da proteína de interesse; Cé a amostra que pode conter a proteína de interesse; D é uma conta magnética que está ou ligada ao análogo da proteína de interesse ou ligada ao par de ligações específico da proteína de interesse; e onde k, u e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; desde que somente um dos B e D esteja ligado ao análogo da proteína de interesse; e também desde que se B estiver ligado ao análogo da proteína de interesse, então D estará ligado ao par de ligações da proteína de interesse, e se B estiver ligado ao par de ligações da proteína de interesse, então D estará ligado ao análogo da proteína de interesse.[00029] In some embodiments, the invention provides a composition for detecting a protein of interest in a sample comprising: (A)k, (B)u, (C), (D)x where A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a polystyrene bead containing A, and B is either linked to an analogue of the protein of interest or linked to a specific bond pair of the protein of interest; This is the sample that may contain the protein of interest; D is a magnetic bead that is either linked to the protein analogue of interest or linked to the specific bond pair of the protein of interest; and where k, u and x are each an integer equal to or greater than 1; provided that only one of B and D is linked to the protein analogue of interest; and also provided that if B is bound to the protein analogue of interest, then D will be bound to the bond pair of the protein of interest, and if B is bound to the bond pair of the protein of interest, then D will be bound to the protein analogue of interest.

[00030] As modalidades adicionais fornecem kits úteis para realizar certos métodos e formar certas composições da invenção. Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit para detectar um analito de interesse em uma amostra, compreendendo uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; um primeiro veículo contendo a porção de ECL, onde o primeiro veículo está ou ligado a um análogo do analito de interesse ou ligado a um primeiro par de ligações específico do analito de interesse; e um segundo veículo que está ou ligado ao análogo do analito de interesse ou ligado a um segundo par de ligações específico do analito de interesse.[00030] Additional embodiments provide useful kits for carrying out certain methods and forming certain compositions of the invention. In some embodiments, the invention provides a kit for detecting an analyte of interest in a sample, comprising a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; a first carrier containing the ECL moiety, wherein the first carrier is either linked to an analogue of the analyte of interest or linked to a first bond pair specific to the analyte of interest; and a second carrier that is either linked to the analogue of the analyte of interest or linked to a second pair of bonds specific to the analyte of interest.

[00031] Um técnico versado entenderia que qualquer das modalidades, incluindo métodos, composições e kits, descritos acima, podem também incluir mais do que uma porção de ECL, desde que cada das porções de ECL emita luz em diferentes comprimentos de onda. As composições, métodos e kits compreendendo duas ou mais porções de ECL podem ser empregadas, por exemplo, para detectar mais do que um analito em uma amostra.[00031] A skilled artisan would understand that any of the embodiments, including methods, compositions and kits, described above, may also include more than one portion of ECL, provided that each of the portions of ECL emits light at different wavelengths. Compositions, methods and kits comprising two or more ECL moieties can be employed, for example, to detect more than one analyte in a sample.

[00032] Uma pessoa versada entenderia que qualquer das modalidades, incluindo métodos, composições e kits, descritos aqui, podem também incluir mais do que uma porção de ECL, desde que cada das porções de ECL emitam luz em diferentes comprimentos de onda. Mais do que uma porção de ECL é útil, por exemplo, quando mais do que um analito pode ser detectado.[00032] A skilled person would understand that any of the modalities, including methods, compositions and kits, described herein, may also include more than one portion of ECL, provided that each of the portions of ECL emits light at different wavelengths. More than one portion of ECL is useful, for example, when more than one analyte can be detected.

[00033] Os objetos e vantagens adicionais da invenção serão apresentados em parte na descrição que segue, e em parte será óbvio a partir da descrição, ou pode ser ensinado pela prática da invenção. Os objetivos e vantagens da invenção serão realizados e alcançados através dos elementos e combinações particularmente mostrados nas reivindicações anexas.[00033] Additional objects and advantages of the invention will be set forth in part in the description that follows, and in part will be obvious from the description, or can be taught by practicing the invention. The objectives and advantages of the invention will be realized and achieved through the elements and combinations particularly shown in the attached claims.

[00034] É para ser entendido que igualmente a descrição geral anterior e a seguinte descrição detalhada são exemplares e explanatórias somente e não são restritivas da invenção, quando reivindicado. Breve Descrição dos Desenhos[00034] It is to be understood that equally the previous general description and the following detailed description are exemplary and explanatory only and are not restrictive of the invention, when claimed. Brief Description of the Drawings

[00035] Figura 1 mostra um diagrama esquemático de uma certa modalidade da invenção onde o analito de interesse é uma molécula de DNA ligada a uma conta de poliestireno que também serve como um primeiro veículo contendo um rótulo de ECL. Também mostrada é uma segunda conta, que é magnética e serve como um segundo veículo ligado a uma molécula de DNA que é complementar à molécula de DNA ligada à conta de poliestireno. As duas moléculas de DNA se ligam para formar um complexo. A aplicação de um campo magnético do complexo fornece um meio de isolar o analito de interesse (por exemplo, DNA) e a detecção do rótulo de ECL fornece um meio de detecção do analito de interesse.[00035] Figure 1 shows a schematic diagram of a certain embodiment of the invention where the analyte of interest is a DNA molecule linked to a polystyrene bead that also serves as a first carrier containing an ECL label. Also shown is a second bead, which is magnetic and serves as a second carrier attached to a DNA molecule that is complementary to the DNA molecule attached to the polystyrene bead. The two DNA molecules link together to form a complex. Application of a magnetic field to the complex provides a means of isolating the analyte of interest (e.g., DNA) and detection of the ECL label provides a means of detecting the analyte of interest.

[00036] Figura 2 mostra as imagens fluorescentes de contas de poliestireno de carboxilato tendo um diâmetro de 10 µm. Figura 2(a) mostra as contas após a captura de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2, e Figura 2(b) mostra as contas após a ligação covalente de avidina sobre a superfície de contas carregadas de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2. Os tempos de exposição usados foram 30 segundos. Os espécimes foram excitados a Àex 490 nm.[00036] Figure 2 shows the fluorescent images of carboxylate polystyrene beads having a diameter of 10 µm. Figure 2(a) shows the beads after capture of Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2, and Figure 2(b) shows the beads after covalent binding of avidin onto the surface of Ru( bpy)3 [B(C6F5)4]2. The exposure times used were 30 seconds. Specimens were excited at Ex 490 nm.

[00037] Figura 3 é uma imagem de micrógrafo eletrônico de varredura (SEM) obtida após a hibridização entra o DNA de sonda- conjugado de conta magnética (DNA-MB) e o DNA complementar conjugado para uma conta de poliestireno revestida por avidina contendo Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 (representado como DNA-Ru(II) o PSB/Avidina). A concentração empregada para ambas moléculas de DNA foi 5 µm, e o tamanho do PSB e do MB foi 10 µm e 1,0 µm, respectivamente.[00037] Figure 3 is a scanning electron micrograph (SEM) image obtained after hybridization between probe DNA-magnetic bead conjugate (DNA-MB) and complementary DNA conjugated to an avidin-coated polystyrene bead containing Ru (bpy)3 [B(C6F5)4]2 (represented as DNA-Ru(II) or PSB/Avidin). The concentration used for both DNA molecules was 5 µm, and the size of the PSB and MB was 10 µm and 1.0 µm, respectively.

[00038] Figura 4 mostra respostas (a) voltamétricas cíclicas (CV) e (b) ECL obtidas de 0,10 µM de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 em acetonitrila (MeCN) contendo 0,10 M de eletrólito (TBA)BF4 - 0,10 M de co- reagente de tripropilamina (RPrA) em um eletrodo de Pt de 2,2 mm de diâmetro com uma taxa de varredura de 50 mV/s. Para comparação, CV de 1,0 mM de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 em MeCN contendo 0,10 M de (TBA)BF4 na ausência de TPrA está presente em (c). As condições experimentais em (c) foram como em (a) e (b), porém a corrente de CV foi multiplicada por 10.[00038] Figure 4 shows (a) cyclic voltammetric (CV) and (b) ECL responses obtained from 0.10 µM of Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 in acetonitrile (MeCN) containing 0.10 M of electrolyte (TBA)BF4 - 0.10 M tripropylamine co-reagent (RPrA) on a 2.2 mm diameter Pt electrode with a scan rate of 50 mV/s. For comparison, CV of 1.0 mM Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 in MeCN containing 0.10 M (TBA)BF4 in the absence of TPrA is present in (c). The experimental conditions in (c) were as in (a) and (b), but the CV current was multiplied by 10.

[00039] Figura 5 mostra o efeito da concentração de (a) TPrA e (b) ácido trifluoroacético de TPrA (TFAA) sobre a intensidade de ECL. Todas as amostras contiveram 0,10 µM de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 e 0,10 M de (TBA)BF4 em MeCN. O eletrodo em funcionamento foi um eletrodo de Pt tendo um diâmetro de 2,2 mm. A taxa de varredura foi 50 mV/s.[00039] Figure 5 shows the effect of the concentration of (a) TPrA and (b) TPrA trifluoroacetic acid (TFAA) on the intensity of ECL. All samples contained 0.10 µM Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 and 0.10 M (TBA)BF4 in MeCN. The operating electrode was a Pt electrode having a diameter of 2.2 mm. The scan rate was 50 mV/s.

[00040] Figura 6 mostra a eliminação do fundamento de ECL para o sistema de TPrA-MeCN. Em (a) 0,10 M de TPrA e 0,10 M de (TBA)BF4-MeCN foram empregados. Em (b), as mesmas condições como em (a) foram empregadas com a adição de 0,055 M de TFAA. Em (c) as mesmas condições como em (b) foram empregadas com a adição de 1,0% (volume/volume) de H2O. Em (d) 0,10 M de (TBA)BF4- MeCN foi empregado. Figura (6)(e) mostra as intensidades de ECL descritas em (a)-(d).[00040] Figure 6 shows the elimination of the ECL foundation for the TPrA-MeCN system. In (a) 0.10 M TPrA and 0.10 M (TBA)BF4-MeCN were employed. In (b), the same conditions as in (a) were employed with the addition of 0.055 M TFAA. In (c) the same conditions as in (b) were employed with the addition of 1.0% (volume/volume) of H2O. In (d) 0.10 M of (TBA)BF4- MeCN was employed. Figure (6)(e) shows the ECL intensities described in (a)-(d).

[00041] Figura 7 mostra a intensidade de ECL como uma função da concentração de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 (a) e o número de contas de poliestireno com 10 µm de diâmetro carregadas com Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 (b).[00041] Figure 7 shows the ECL intensity as a function of the concentration of Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 (a) and the number of 10 µm diameter polystyrene beads loaded with Ru(bpy) 3 [B(C6F5)4]2 (b).

[00042] Figura 8 mostra a detecção de ECL de hibridização de DNA. Figura 8(a) mostra que a hibridização de DNA entre o DNA-MB de sonda (1,0 µm) e o DNA-Ru(II) o PSB/Avidina alvo (10 µm) ocorreu em uma relação de MB/PSB = 29. A Figura 8(b) mostra que a hibridização de DNA ocorreu entre o DNA-MB de sonda (2,8 µm) e o DNA-Ru(II) o PSB/Avidina alvo (10 µm) em uma relação de MB/PSB = 4.[00042] Figure 8 shows the detection of DNA hybridization ECL. Figure 8(a) shows that DNA hybridization between probe DNA-MB (1.0 µm) and DNA-Ru(II) target PSB/Avidin (10 µm) occurred at a ratio of MB/PSB = 29. Figure 8(b) shows that DNA hybridization occurred between probe DNA-MB (2.8 µm) and DNA-Ru(II) target PSB/Avidin (10 µm) at a ratio of MB /PSB = 4.

[00043] Figura 9 mostra um teste de distribuição Poisson empregando MB revestido de estreptavidina de (a) 2,8 µm e (b) 1,0 µm de diâmetro reagido com PSB biotinilado de 10 µm de diâmetro. O "% de PSB ligado" foi calculado do número de PSB encontrado no sobrenadante após a separação magnética de conjugados de MB-PSB do meio de reação.[00043] Figure 9 shows a Poisson distribution test employing streptavidin-coated MB of (a) 2.8 µm and (b) 1.0 µm in diameter reacted with biotinylated PSB of 10 µm in diameter. The “% bound PSB” was calculated from the number of PSB found in the supernatant after magnetic separation of MB-PSB conjugates from the reaction medium.

[00044] Figura 10 mostra as capacidades de ligação de (a) contas de poliestireno revestidas com estreptavidina com 10 µm de diâmetro capturadas com Ru(bpt)32+, (b) contas magnéticas revestidas de estreptavidina de 1,0 µm de diâmetro, e (c) contas magnéticas revestidas de estreptavidina de 2,8 µm de diâmetro para um DNA 23- mer-ss biotinilado (p-ssDNA) obtido de experimentos de titulação de biotina de fluoresceína.[00044] Figure 10 shows the binding capabilities of (a) 10 µm diameter streptavidin-coated polystyrene beads captured with Ru(bpt)32+, (b) 1.0 µm diameter streptavidin-coated magnetic beads, and (c) 2.8 µm diameter streptavidin-coated magnetic beads for a biotinylated 23-mer-ss DNA (p-ssDNA) obtained from fluorescein biotin titration experiments.

[00045] Figura 11 mostra as estruturas moleculares de DPA (a) e RUB (b).[00045] Figure 11 shows the molecular structures of DPA (a) and RUB (b).

[00046] Figura 12 é um fluxograma descrevendo as etapas em um procedimento para carregar os hidrocarbonetos aromáticos em contas de poliestireno.[00046] Figure 12 is a flowchart describing the steps in a procedure for loading aromatic hydrocarbons into polystyrene beads.

[00047] Figura 13 mostra as imagens fluorescentes de (a) PSB carregado de DPA; (b) PSB carregado de RUB; e (c) PSB somente.[00047] Figure 13 shows the fluorescent images of (a) DPA-loaded PSB; (b) RUB-loaded PSB; and (c) PSB only.

[00048] Figura 14 mostra o comportamento de CV e ECL de (a) PSB carregado de DPA dissolvido em MeCN e (b) 0,25 mM de solução de acetonitrila de DPA empregando TPrA como um co-reagente.[00048] Figure 14 shows the CV and ECL behavior of (a) DPA-loaded PSB dissolved in MeCN and (b) 0.25 mM DPA acetonitrile solution employing TPrA as a co-reactant.

[00049] Figura 15 mostra o comportamento de CV e ECL de (a) PSB carregado de RUB dissolvido em MeCN e (b) 35 µm de solução de acetonitrila de RUB empregando TPrA como um co-reagente.[00049] Figure 15 shows the CV and ECL behavior of (a) RUB-loaded PSB dissolved in MeCN and (b) 35 µm RUB acetonitrile solution employing TPrA as a co-reactant.

[00050] Figura 16 mostra a relação entre o sinal de ECL e a concentração de proteína reativa C (CRP).[00050] Figure 16 shows the relationship between the ECL signal and the concentration of C-reactive protein (CRP).

Description of Modalities A. Definitions

[00051] O termo "anticorpo", como empregado aqui, significa uma imunoglobulina ou uma parte desta, e abrange qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação de antígeno independente da fonte, método de produção, ou outras características. O termo inclui, por exemplo, anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecíficos, poliespecíficos, humanizados, de cadeia única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados e enxertados com CDR. Uma parte de um anticorpo pode incluir qualquer fragmento que pode ligar antígeno, por exemplo, um Fab, F(ab’)2, Fv, scFv.[00051] The term "antibody", as used herein, means an immunoglobulin or a part thereof, and encompasses any polypeptide comprising an antigen-binding site regardless of the source, method of production, or other characteristics. The term includes, for example, polyclonal, monoclonal, monospecific, polyspecific, humanized, single chain, chimeric, synthetic, recombinant, hybrid, mutated and CDR-grafted antibodies. A part of an antibody can include any fragment that can bind antigen, for example, a Fab, F(ab')2, Fv, scFv.

[00052] O termo "analito de interesse", como empregado aqui, significa qualquer molécula, ou agregado de moléculas, incluindo uma célula ou um componente celular de um vírus, encontrado em uma amostra. Também incluídos estão os fragmentos de qualquer molécula encontrada em uma amostra. Um analito de interesse pode ser um composto orgânico, um composto organometálico ou um composto inorgânico. Um analito de interesse pode ser um ácido nucléico (por exemplo, DNA, RNA, um plasmídeo, um vetor, ou um oligonucleotídeo), uma proteína (por exemplo, um anticorpo, um antígeno, um receptor, um ligando receptor, ou um peptídeo), uma lipoproteína, uma glicoproteína, uma ribo- ou deoxirribonucleoproteína, um peptídeo, um polissacarídeo, um lipopolissacarídeo, um lipídeo, um ácido graxo, uma vitamina, um aminoácido, um composto farmacêutico (por exemplo, tranqüilizantes, barbituratos, opiatos, álcoois, antidepressivos tricíclicos, benzodia- zepinas, antivirais, antibióticos antifúngicos, esteróides, glicosídeos cardíacos, ou um metabólito de qualquer dos anteriores), um hormônio, um fator de crescimento, uma enzima, uma co-enzima, uma apo-enzima, haptenos, lecitinas, um substrato, um metabólito celular, um organelo ou componente celular (por exemplo, uma membrana, uma parede celular, um ribossoma, um cromossoma, uma mitocôndria, ou um componente de citoesqueleto). Também incluídos na definição estão toxinas, herbicidas, e poluentes ambientais. A definição também inclui complexos que compreendem um ou mais de qualquer dos exemplos apresentados desta definição.[00052] The term "analyte of interest", as used herein, means any molecule, or aggregate of molecules, including a cell or a cellular component of a virus, found in a sample. Also included are fragments of any molecule found in a sample. An analyte of interest may be an organic compound, an organometallic compound, or an inorganic compound. An analyte of interest may be a nucleic acid (e.g., DNA, RNA, a plasmid, a vector, or an oligonucleotide), a protein (e.g., an antibody, an antigen, a receptor, a receptor ligand, or a peptide ), a lipoprotein, a glycoprotein, a ribo- or deoxyribonucleoprotein, a peptide, a polysaccharide, a lipopolysaccharide, a lipid, a fatty acid, a vitamin, an amino acid, a pharmaceutical compound (e.g., tranquilizers, barbiturates, opiates, alcohols , tricyclic antidepressants, benzodiazepines, antivirals, antifungal antibiotics, steroids, cardiac glycosides, or a metabolite of any of the foregoing), a hormone, a growth factor, an enzyme, a coenzyme, an apoenzyme, haptens, lecithins, a substrate, a cellular metabolite, an organelle or cellular component (e.g., a membrane, a cell wall, a ribosome, a chromosome, a mitochondria, or a cytoskeletal component). Also included in the definition are toxins, herbicides, and environmental pollutants. The definition also includes complexes comprising one or more of any of the examples given of this definition.

[00053] O termo "análogo do analito de interesse", como empregado aqui, significa uma substância que compete com o analito de interesse para ligar-se a um par de ligações específico. Um análogo do analito de interesse pode ser uma quantidade conhecida do analito de interesse propriamente dito que é adicionada para competir com a ligação a um par de ligações específico com o analito de interesse presente em uma amostra.[00053] The term "analog of the analyte of interest", as used here, means a substance that competes with the analyte of interest to bind to a specific bond pair. An analogue of the analyte of interest may be a known quantity of the analyte of interest itself that is added to compete for binding to a specific bond pair with the analyte of interest present in a sample.

[00054] O termo "veículo", como empregado aqui, significa uma ou mais substâncias de encapsulação sólidas ou líquidas. Um veículo pode compreender compostos orgânicos ou inorgânicos e pode ser empregado para pelo menos um dos seguintes: apresentar uma amostra, apresentar um par de ligações específico, ou conter ou capturar uma porção de ECL. Os veículos são descritos em detalhes adicionais infra.[00054] The term "vehicle", as used herein, means one or more solid or liquid encapsulating substances. A carrier may comprise organic or inorganic compounds and may be employed for at least one of the following: presenting a sample, presenting a specific bond pair, or containing or capturing a portion of ECL. The vehicles are described in further detail below.

[00055] Os termos "contendo" ou "contido", como empregados aqui, referem-se à associação não específica entre o interior de um veículo e uma porção de ECL, tal que a porção de ECL e o veículo estejam em contato físico com um outro, porém não estejam necessariamente ligados a cada outro. Em certas modalidades da invenção, uma porção de ECL contida em um veículo pode estar ligada ao veículo. Em certas modalidades, a porção de ECL contida em um veículo não está ligada ao veículo. Os termos contendo/contido são empregados alternadamente com os termos "envolvido/envolvendo", e "capturado/capturando".[00055] The terms "containing" or "contained", as used herein, refer to the non-specific association between the interior of a vehicle and an ECL portion, such that the ECL portion and the vehicle are in physical contact with one another, but are not necessarily linked to each other. In certain embodiments of the invention, a portion of ECL contained in a vehicle may be linked to the vehicle. In certain embodiments, the portion of ECL contained in a vehicle is not attached to the vehicle. The terms containing/contained are used interchangeably with the terms "involved/involving", and "captured/capturing".

[00056] O termo "hibridização", como empregado aqui, refere-se à formação de dúplexes entre uma seqüência de nucleotídeo e uma segunda seqüência de nucleotídeo sob condições apropriadas. Em algumas modalidades, as condições apropriadas podem ser condições rigorosas. As condições rigorosas são dependentes da seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As seqüências mais longas hibridizam específicamente em temperaturas mais elevadas (veja, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. e Ausubel e outros 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). Geralmente, as condições rígidas são selecionadas para estarem a cerca de 5oC, menor do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a seqüência específica em uma força iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura (sob força iônica definida, pH, e concentração de ácido nucléico) na qual 50% dos polinucleotídeos complementares para a seqüência alvo hibridizar para a seqüência alvo em equilíbrio. Tipicamente, as condições rígidas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que cerca de 1,0 M de íon de sódio, tipicamente cerca de 0,05 a 1,0 M de concentração de íon de sódio (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30oC para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60oC para sondas longas (por exemplo, mais do que 50 nucleotídeos). As condições rígidas podem também ser obtida com a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida. Cada aumento de 1% na concentração de formamida de uma solução reduz o Tm de um duplex de DNA em cerca de 0,7oC.[00056] The term "hybridization", as used herein, refers to the formation of duplexes between a nucleotide sequence and a second nucleotide sequence under appropriate conditions. In some embodiments, the appropriate conditions may be stringent conditions. The stringent conditions are sequence dependent and will be different in different circumstances. Longer sequences hybridize specifically at higher temperatures (see, e.g., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). Generally, stringent conditions are selected to be about 5oC, lower than the thermal melting point (Tm) for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. The Tm is the temperature (under defined ionic strength, pH, and nucleic acid concentration) at which 50% of the polynucleotides complementary to the target sequence hybridize to the target sequence at equilibrium. Typically, strict conditions will be those in which the salt concentration is less than about 1.0 M sodium ion, typically about 0.05 to 1.0 M sodium ion concentration (or other salts). at pH 7.0 to 8.3 and the temperature is at least about 30oC for short probes (e.g., 10 to 50 nucleotides) and at least about 60oC for long probes (e.g., more than 50 nucleotides). Rigid conditions can also be obtained with the addition of destabilizing agents such as formamide. Each 1% increase in the formamide concentration of a solution reduces the Tm of a DNA duplex by about 0.7oC.

[00057] A hibridização pode ocorrer entre polinucleotídeos que sejam 100% complementares, isto é, quando não há nenhuma ligação imperfeita entre os dois filamentos de um ácido nucléico de filamento duplo. A hibridização pode também ocorrer quando há ligações imperfeitas entre os dois filamentos de um ácido nucléico de filamento duplo. A hibridização complementar, quando empregada aqui, refere- se à hibridização entre os dois filamentos de ácido nucléico onde não há mais do que uma ligação imperfeita entre os dois filamentos hibridizados de um ácido nucléico de filamento duplo.[00057] Hybridization can occur between polynucleotides that are 100% complementary, that is, when there is no imperfect bond between the two strands of a double-stranded nucleic acid. Hybridization can also occur when there are imperfect bonds between the two strands of a double-stranded nucleic acid. Complementary hybridization, as used herein, refers to hybridization between the two strands of nucleic acid where there is no more than an imperfect bond between the two hybridized strands of a double-stranded nucleic acid.

[00058] O termo "ligado" como empregado aqui abrange ambas conexões covalentes diretas entre duas porções, conexões não covalentes diretas entre duas porções, e conexões indiretas entre duas porções que são mediadas por uma ou mais porções adicionais. Por exemplo, uma conexão covalente direta entre duas porções pode incluir uma ligação de amida entre os dois aminoácidos, uma conexão monovalente direta entre duas porções pode incluir uma interação iônica entre um metal e uma base para formar um sal, ou uma ligação de hidrogênio entre duas moléculas de água. As conexões indiretas entre as duas porções que são mediadas por uma ou mais porções adicionais podem incluir uma proteína de fusão, tal como uma proteína de fusão Ig e um receptor, tal como um receptor de TNF, onde a ligação entre o Ig e o receptor de TNF é mediada por um ligador, tal como seqüência de aminoácido curta que não seja nativa para ou o receptor Ig ou TNF.[00058] The term "linked" as used herein encompasses both direct covalent connections between two moieties, direct non-covalent connections between two moieties, and indirect connections between two moieties that are mediated by one or more additional moieties. For example, a direct covalent connection between two moieties may include an amide bond between the two amino acids, a direct monovalent connection between two moieties may include an ionic interaction between a metal and a base to form a salt, or a hydrogen bond between two water molecules. Indirect connections between the two moieties that are mediated by one or more additional moieties may include a fusion protein, such as an Ig fusion protein, and a receptor, such as a TNF receptor, where the link between the Ig and the receptor of TNF is mediated by a linker, such as a short amino acid sequence that is not native to either the Ig or TNF receptor.

[00059] O termo "ligado" não abrange as conexões que são mediadas por um analito de interesse.[00059] The term "linked" does not encompass connections that are mediated by an analyte of interest.

[00060] O termo "magnetizável" como empregado aqui refere-se a uma propriedade da matéria onde a permeabilidade da matéria difere daquela de espaço livre. O termo inclui paramagnetizável e superparamagnetizável.[00060] The term "magnetizable" as used here refers to a property of matter where the permeability of matter differs from that of free space. The term includes paramagnetizable and superparamagnetizable.

[00061] O termo "ácido nucléico", como empregado aqui, refere-se a polímeros compreendidos de deoxirribonucleotídeos ou ribonucleo- tídeos na forma ou de filamento único ou filamento duplo. Tipicamente o ácido nucléico de filamento único compreenderá mais do que 100 pares de base. O termo "ácido nucléico" abrange ácidos nucléicos contendo nucleotídeos de ocorrência natural bem como análogos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucléico de referência. O termo ácido nucléico também inclui cDNA ou um mRNA codificado por um gene. Um ácido nucléico será capaz de hibridizar seu complemento através de pareamento de bases complementar, por exemplo, através de uma ligação de hidrogênio.[00061] The term "nucleic acid", as used here, refers to polymers comprised of deoxyribonucleotides or ribonucleotides in either single-stranded or double-stranded form. Typically the single-stranded nucleic acid will comprise more than 100 base pairs. The term "nucleic acid" encompasses nucleic acids containing naturally occurring nucleotides as well as natural nucleotide analogs that have binding properties similar to the reference nucleic acid. The term nucleic acid also includes cDNA or an mRNA encoded by a gene. A nucleic acid will be able to hybridize its complement through complementary base pairing, for example through a hydrogen bond.

[00062] O termo "oligonucleotídeo", como empregado aqui, refere- se a um ácido nucléico de filamento único que tipicamente é menor do que ou igual a 100 bases longas. Certamente, os oligonucleotídeos complementares podem ser anelados para formar um polinucleotídeo de filamento duplo. Como empregado aqui, um oligonucleotídeo pode incluir bases naturais (isto é, A, G, C, T ou U) ou modificadas. Além disso, as bases em um oligonucleotídeo podem ser unidas por uma ligação exceto uma ligação de fosfodiéster, contanto que não interfira com o pareamento de base entrefilamento. Desse modo, por exemplo, os oligonucleotídeos podem ser peptídeo-ácidos nucléicos nos quais as bases constituintes são unidas por ligações de peptídeo exceto ligações de fosfodiéster. (veja, por exemplo, Nielson, 2001 , Current Opinion in Biotechnoiogy 12:16). Será entendido por alguém de experiência na técnica que os oligonucleotídeos podem hibridizar com seqüências necessitando de complementariedade completa com a seqüência de sonda e os métodos descritos aqui podem ser empregados para distinguir entre a ligação que é completamente complementar e aquela que pe menos do que completamente complementar. Opcionalmente, os oligonucleotídeos podem ser diretamente rotulados com radioisótopos, cromóforos, lumiforos, cromógenos, ou porções de ECL ou podem ser diretamente rotulados, por exemplo, com biotina a qual um complexo de estreptavidina ou avidina pode posteriormente se ligar.[00062] The term "oligonucleotide", as used herein, refers to a single-stranded nucleic acid that is typically less than or equal to 100 bases long. Of course, complementary oligonucleotides can be annealed to form a double-stranded polynucleotide. As used herein, an oligonucleotide may include natural (i.e., A, G, C, T, or U) or modified bases. Furthermore, the bases in an oligonucleotide may be joined by any bond other than a phosphodiester bond, as long as it does not interfere with interstrand base pairing. Thus, for example, oligonucleotides may be peptide-nucleic acids in which the constituent bases are joined by peptide bonds other than phosphodiester bonds. (see, for example, Nielson, 2001, Current Opinion in Biotechnology 12:16). It will be understood by one of skill in the art that oligonucleotides can hybridize to sequences requiring complete complementarity with the probe sequence and the methods described herein can be employed to distinguish between binding that is completely complementary and that which is less than completely complementary. . Optionally, the oligonucleotides can be directly labeled with radioisotopes, chromophores, lumiphores, chromogens, or ECL moieties or can be directly labeled, for example, with biotin to which a streptavidin or avidin complex can subsequently bind.

[00063] O termo "polinucleotídeo", como empregado aqui, refere-se a um polímero compreendido de mais do que 2 nucleotídeos, e menos do que 100 nucleotídeos.[00063] The term "polynucleotide", as used herein, refers to a polymer comprised of more than 2 nucleotides, and less than 100 nucleotides.

[00064] O termo "amostra", como empregado aqui, significa qualquer espécime derivada de, ou originando em, um sistema biológico. Os sistemas biológicos incluem sistemas ecológicos (por exemplo, um espécime de água, ar ou solo) ou, organismos (por exemplo, uma planta, um animal, fungos, bactérias, outros eucariotas ou procariotas), ou vírus ou priônios. A amostra pode conter um analito de interesse. O termo amostra pode também incluir um analito isolado, por exemplo, analito purificado de interesse.[00064] The term "sample", as used herein, means any specimen derived from, or originating in, a biological system. Biological systems include ecological systems (e.g., a specimen of water, air, or soil) or, organisms (e.g., a plant, an animal, fungi, bacteria, other eukaryotes, or prokaryotes), or viruses or prions. The sample may contain an analyte of interest. The term sample may also include an isolated analyte, e.g., purified analyte of interest.

[00065] O termo "par de ligações específico", como empregado aqui, refere-se a uma primeira molécula que pode formar um complexo relativamente estável com uma segunda molécula sob condições fisiológicas. Em geral, a ligação específica é caracterizada por uma afinidade relativamente elevada e uma capacidade relativamente baixa a moderada. A ligação não específica geralmente tem uma afinidade baixa com uma capacidade moderada a elevada. Tipicamente, a ligação é considerada específica quando a constante de afinidade Ka é mais elevada do que cerca de 106 M-1, ou é mais elevada do cerca de 108 M1. Uma constante de afinidade mais elevada indica maior afinidade, e desse modo maior especificidade. Os anticorpos tipicamente ligam antígenos com uma constante de afinidade na faixa de 106 M-1 a 109 M-1 ou mais. Se desejado, a ligação não específica pode ser reduzida sem substancialmente afetar a ligação específica variando-se as condições de ligação. Tais condições são conhecidas na técnica, e um técnico versado usando técnicas rotineiras pode selecionar condições apropriadas. A condição pode ser definida, por exemplo, em termos de concentração molecular, força iônica da solução, temperatura, tempo permitido para ligação, concentração de moléculas não relacionadas (por exemplo, soro, albumina, caseína de leite), etc.[00065] The term "specific bond pair", as used here, refers to a first molecule that can form a relatively stable complex with a second molecule under physiological conditions. In general, specific binding is characterized by relatively high affinity and relatively low to moderate capacity. Nonspecific binding generally has a low affinity with a moderate to high capacity. Typically, binding is considered specific when the affinity constant Ka is higher than about 106 M-1, or is higher than about 108 M1. A higher affinity constant indicates greater affinity, and thus greater specificity. Antibodies typically bind antigens with an affinity constant in the range of 106 M-1 to 109 M-1 or more. If desired, non-specific binding can be reduced without substantially affecting specific binding by varying binding conditions. Such conditions are known in the art, and one skilled in the art using routine techniques can select appropriate conditions. The condition can be defined, for example, in terms of molecular concentration, ionic strength of the solution, temperature, time allowed for binding, concentration of unrelated molecules (e.g. serum, albumin, milk casein), etc.

[00066] Os exemplos de pares de ligações específicos incluem seqüências de ácido nucléico complementar (por exemplo, duas seqüências de DNA que hibridizam para cada outra; duas seqüências de RNA que hibridizam para cada outra; ou uma seqüência de DNA e uma de RNA que hibridizam para cada outra), um anticorpo e um antígeno, um receptor e um ligando (por exemplo, TNF e TNFr-I, CD142 e Fator VIIa, B7-2 e CD28, HIV-1 e CD4, ATR/TEM8 ou CMG e a porção de antígeno protetor de toxina de antrax), uma enzima e um substrato, ou uma molécula e uma proteína de ligação (por exemplo, vitamina B12 e fator intrínseco, folato e proteína de ligação de folato). Um par de ligações específico pode também ser um análogo de um par de ligações específico de ocorrência natural. Os exemplos de análogos incluem azidotimidina (AZT), um análogo de um nucleotídeo que se liga a HIV reverso transcriptase, puromicina, um análogo da parte aminoacil-adenosina terminal de aminoacil-tRNA, e metotrexato, um análogo de tetraidrofolato. Outros análogos podem ser derivados do analito de interesse.[00066] Examples of specific bond pairs include complementary nucleic acid sequences (e.g., two DNA sequences that hybridize to each other; two RNA sequences that hybridize to each other; or a DNA and an RNA sequence that hybridize to each other), an antibody and an antigen, a receptor and a ligand (e.g., TNF and TNFr-I, CD142 and Factor VIIa, B7-2 and CD28, HIV-1 and CD4, ATR/TEM8 or CMG and the anthrax toxin protective antigen portion), an enzyme and a substrate, or a molecule and a binding protein (e.g., vitamin B12 and intrinsic factor, folate and folate binding protein). A specific bond pair may also be an analogue of a specific naturally occurring bond pair. Examples of analogs include azidothymidine (AZT), a one-nucleotide analog that binds to HIV reverse transcriptase, puromycin, an analog of the terminal aminoacyl-adenosine part of aminoacyl-tRNA, and methotrexate, a tetrahydrofolate analog. Other analogues may be derived from the analyte of interest.

B. Electrogenerated Chemiluminescent Substances

[00067] Em certas modalidades, a invenção prover a subsistência da detecção de um analito de interesse em uma amostra empregando ECL. A porção de ECL pode ser qualquer composto que possa ser induzido a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica. Em algumas modalidades, a porção de ECL pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética na presença de um co-reagente. Em algumas modalidades, a porção de ECL pode compreender um composto orgânico contendo metal onde o metal é escolhido, por exemplo, de rutênio, ósmio, rênio, irídio, ródio, platino, paládio, molibdênio, e tecnécio. Em algumas modalidades da invenção, o metal é rutênio ou ósmio. O metal pode também ser escolhido, por exemplo, de metais de terra rara, incluindo porém não limitado a cério, disprósio, érbio, európio, gadolínio, hólmio, lantânio, lutécio, neodímio, praseodímio, promécio, térbio, túlio, e itérbio. Em algumas modalidades da invenção, o metal é cério, európio, térbio ou itérbio.[00067] In certain embodiments, the invention provides for the detection of an analyte of interest in a sample using ECL. The ECL moiety can be any compound that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source. In some embodiments, the ECL portion can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation in the presence of a co-reactant. In some embodiments, the ECL portion may comprise a metal-containing organic compound where the metal is chosen, for example, from ruthenium, osmium, rhenium, iridium, rhodium, platinum, palladium, molybdenum, and technetium. In some embodiments of the invention, the metal is ruthenium or osmium. The metal may also be chosen, for example, from rare earth metals, including but not limited to cerium, dysprosium, erbium, europium, gadolinium, holmium, lanthanum, lutetium, neodymium, praseodymium, promethium, terbium, thulium, and ytterbium. In some embodiments of the invention, the metal is cerium, europium, terbium or ytterbium.

[00068] De acordo com certas modalidades da invenção, uma porção de ECL contendo metal de acordo com a invenção tem a fórmula M(P)m (L1)n(L2)o (L3)p (L4)q (L5)r (L6)s onde M é metal; P é um ligando polidentado de M; L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são ligando se M, cada dos quais pode ser igual, ou diferente de, cada outro ligando; m é um número inteiro igual ou maior do que 1; cada de n, o, p, q, r e s é um número inteiro igual ou maior do que zero; e P, L1, L2, L3, L4, L5 e L6 são de tal composição e número que a porção de ECL pode ser induzida a emitir radiação eletromagnética e o número total de ligações a M fornecido pelos ligando de M iguais ao número de coordenação de M.[00068] According to certain embodiments of the invention, a portion of metal-containing ECL according to the invention has the formula M(P)m (L1)n(L2)o (L3)p (L4)q (L5)r (L6)s where M is metal; P is a polydentate ligand of M; L1, L2, L3, L4, L5 and L6 are M ligands, each of which may be the same as, or different from, each other ligand; m is an integer equal to or greater than 1; each of n, o, p, q, r and s is an integer equal to or greater than zero; and P, L1, L2, L3, L4, L5 and L6 are of such composition and number that the ECL moiety can be induced to emit electromagnetic radiation and the total number of bonds to M provided by the ligands of M equal to the coordination number by M.

[00069] Em algumas modalidades da invenção M é rutênio. Em algumas modalidades da invenção, M é ósmio.[00069] In some embodiments of the invention M is ruthenium. In some embodiments of the invention, M is osmium.

[00070] Em certas modalidades da invenção, a porção de ECL tem um ligando polidentado de M. Em algumas modalidades, a porção de ECL tem mais do que um ligando polidentado. Em modalidades compreendendo mais do que um ligando polidentado de M, os ligandos polidentados podem ser iguais ou diferentes. Os ligandos polidentados incluem ligandos aromáticos e alifáticos. Os ligandos polidentados aromáticos adequados incluem ligandos heterocíclicos adequados e podem ser contendo nitrogênio, tal como, por exemplo, bipiridila, bipirazila, terpiridila, 1,10 fenantrolina, e porfirinas.[00070] In certain embodiments of the invention, the ECL portion has a polydentate ligand of M. In some embodiments, the ECL portion has more than one polydentate ligand. In embodiments comprising more than one polydentate ligand of M, the polydentate ligands may be the same or different. Polydentate ligands include aromatic and aliphatic ligands. Suitable aromatic polydentate ligands include suitable heterocyclic ligands and may be nitrogen-containing, such as, for example, bipyridyl, bipyrazyl, terpyridyl, 1,10 phenanthroline, and porphyrins.

[00071] Os ligandos polidentados adequados podem ser não substituídos, ou substituídos pó qualquer de um grande número de substituintes conhecidos na técnica. Os substituintes adequados incluem, por exemplo, alquila, alquila substituído, arila, arila substituída, aralquila, aralquila substituída, carboxilato, carboxaldeído, carboxamida, ciano, amino, hidróxi, imino, hidroxicarbonila, aminocarbonila, amidina, guanidínio, ureído, grupos contendo súlfur de maleimida, grupos contendo fósforo, e o éster de carboxilato de N-hidroxissucinimida.[00071] Suitable polydentate ligands may be unsubstituted, or substituted by any of a large number of substituents known in the art. Suitable substituents include, for example, alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, aralkyl, substituted aralkyl, carboxylate, carboxaldehyde, carboxamide, cyano, amino, hydroxy, imino, hydroxycarbonyl, aminocarbonyl, amidine, guanidinium, ureido, sulfur-containing groups of maleimide, phosphorus-containing groups, and the carboxylate ester of N-hydroxysuccinimide.

[00072] Adicionalmente, pelo menos um dos L1, L2, L3, L4, L5 e L6 podem ser um ligando heterocíclico aromático polidentado. Além disso, pelo menos um desses ligandos heterocíclicos aromáticos polidentados pode conter nitrogênio. Os ligandos polidentados adequados incluem, porém não estão limitados a, bipiridila, bipirazila, terpiridila, 1,10 fenantrolina, uma porfirina, bipiridila substituída, bipirazila substituída, terpiridila substituída, 1,10 fenantrolina substituída ou uma porfirina substituída. Esses ligandos polidentados substituídos podem ser substituídos com uma alquila, alquila substituída, arila, arila substituída, aralquila, aralquila substituída, carboxilato, carboxaldeído, carboxamida, ciano, amino, hidróxi, imino, hidroxicarbonila, aminocarbonila, amidina, guanidínio, ureído, grupos contendo súlfur e maleimida, grupos contendo fósforo, e o éster de carboxilato de N-hidroxissucinimida.[00072] Additionally, at least one of L1, L2, L3, L4, L5 and L6 may be a polydentate aromatic heterocyclic ligand. Furthermore, at least one of these polydentate aromatic heterocyclic ligands may contain nitrogen. Suitable polydentate ligands include, but are not limited to, bipyridyl, bipyrazyl, terpyridyl, 1,10 phenanthroline, a porphyrin, substituted bipyridyl, substituted bipyrazyl, substituted terpyridyl, 1,10 substituted phenanthroline or a substituted porphyrin. These substituted polydentate ligands may be substituted with an alkyl, substituted alkyl, aryl, substituted aryl, aralkyl, substituted aralkyl, carboxylate, carboxaldehyde, carboxamide, cyano, amino, hydroxy, imino, hydroxycarbonyl, aminocarbonyl, amidine, guanidinium, ureido, groups containing sulfur and maleimide, phosphorus-containing groups, and the carboxylate ester of N-hydroxysuccinimide.

[00073] Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL pode conter dois ligandos bidentados, cada dos quais pode ser bipiridila, bipirazila, terpiridila, 1,10 fenantrolina, bipiridila substituída, bipirazila substituída, terpiridila substituída ou 1,10 fenantrolina substituída.[00073] In some embodiments of the invention, the ECL moiety may contain two bidentate ligands, each of which may be bipyridyl, bipyrazyl, terpyridyl, 1,10 phenanthroline, substituted bipyridyl, substituted bipyrazyl, substituted terpyridyl or substituted 1,10 phenanthroline.

[00074] Em certas modalidades da invenção, a porção de ECL pode conter três ligandos bidentados, cada dos quais pode ser bipiridila, bipirazila, terpiridila, 1,10 fenantrolina, bipiridila substituída, bipirazila substituída, terpiridila substituída ou 1,10 fenantrolina substituída. A porção de ECL pode compreender rutênio. Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL pode compreender rutênio, dois ligandos de bipiridila bidentados, e um ligando de bipiridila bidentado substituído.[00074] In certain embodiments of the invention, the ECL moiety may contain three bidentate ligands, each of which may be bipyridyl, bipyrazyl, terpyridyl, 1,10 phenanthroline, substituted bipyridyl, substituted bipyrazyl, substituted terpyridyl or substituted 1,10 phenanthroline. The ECL portion may comprise ruthenium. In some embodiments of the invention, the ECL moiety may comprise ruthenium, two bidentate bipyridyl ligands, and a substituted bidentate bipyridyl ligand.

[00075] Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL pode conter um ligando tetradentado tal como porfirina ou porfirina substituída.[00075] In some embodiments of the invention, the ECL portion may contain a tetradentate ligand such as porphyrin or substituted porphyrin.

[00076] A porção de ECL pode ter um ou mais ligandos monodentados, uma ampla variedade dos quais é conhecida pela técnica. Os ligandos monodentados adequados incluem, por exemplo, monóxido de carbono, cianetos, isocianetos, haletos, e arsinas, estibinas, aminas e fosfinas alifáticas, aromáticas e heterocíclicas.[00076] The ECL moiety may have one or more monodentate ligands, a wide variety of which are known in the art. Suitable monodentate ligands include, for example, carbon monoxide, cyanides, isocyanides, halides, and aliphatic, aromatic and heterocyclic arsines, stibines, amines and phosphines.

[00077] Certas modalidades desta porção de ECL compreendem bis(2,2'- bipiridil)rutênio(II) e tris(2,2'-bipiridil)rutênio(II).[00077] Certain modalities of this portion of ECL comprise bis(2,2'-bipyridyl) ruthenium(II) and tris(2,2'-bipyridyl) ruthenium(II).

[00078] Está no escopo da invenção para um ou mais dos ligandos de M a ser unido aos rótulos químicos adicionais, tal como, por exemplo, isótopos radioativos, componentes fluorescentes, ou centros contendo ósmio ou rutênio luminescente adicional.[00078] It is within the scope of the invention for one or more of M's ligands to be attached to additional chemical labels, such as, for example, radioactive isotopes, fluorescent components, or centers containing additional luminescent osmium or ruthenium.

[00079] Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL é tetracis(pentafluorofenil)borato de tris(2,2'- bipiridil)rutênio(II). Em algumas modalidades da invenção a porção de ECL é rutênio (II) de bis [(4,4'-carbometóxi)-2,2'-bipiridina] 2- [3-(4-metil-2,2'-bipiridina-4- il)propil]-1,3-dioxolano. Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL é bis(2,2'bipiridina) [4-(butan-1-al)- 4’-metil-2,2'- bipiridina]rutênio (II). Em uma outra modalidade da invenção, a porção de ECL é bis(2,2'-bipiridina) [ácido 4-(4'-metil-2,2'-bipiridina-4'-il)- butírico]rutênio (II). Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL é (2,2'- bipiridina) [cis-bis(1 ,2-difenilfosfino)etilenol]{2- [3-(4- metil- 2,2'-bipiridina- 4'-il)propil]-1 ,3-dioxolano}ósmio (II). Em ainda uma outra modalidade da invenção, a porção de ECL é bis(2,2'- bipiridina) [4-(4'-metil-2,2'-bipiridina)- butilamina]rutênio (II). Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL é bis(2,2'- bipiridina) [1-bromo-4(4'-metil-2,2'-bipiridina-4-il)butano]rutênio (II). Em ainda uma outra modalidade da invenção, a porção de ECL é acido bis(2,2'- bipiridina)maleimidoexanóico, rutênio (II) de 4-metil-2,2'- bipiridina-4'-butilamida.[00079] In some embodiments of the invention, the ECL moiety is tris(2,2'-bipyridyl) ruthenium(II) tetracis(pentafluorophenyl)borate. In some embodiments of the invention the ECL moiety is ruthenium (II) bis [(4,4'-carbomethoxy)-2,2'-bipyridine] 2- [3-(4-methyl-2,2'-bipyridine- 4-yl)propyl]-1,3-dioxolane. In some embodiments of the invention, the ECL moiety is bis(2,2'bipyridine) [4-(butan-1-al)-4'-methyl-2,2'-bipyridine] ruthenium (II). In another embodiment of the invention, the ECL moiety is bis(2,2'-bipyridine) [4-(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4'-yl)-butyric acid] ruthenium (II) . In some embodiments of the invention, the ECL moiety is (2,2'-bipyridine) [cis-bis(1,2-diphenylphosphine)ethylenel]{2-[3-(4-methyl-2,2'-bipyridine- 4'-yl)propyl]-1,3-dioxolane}osmium (II). In yet another embodiment of the invention, the ECL moiety is bis(2,2'-bipyridine) [4-(4'-methyl-2,2'-bipyridine)-butylamine] ruthenium (II). In some embodiments of the invention, the ECL moiety is bis(2,2'-bipyridine) [1-bromo-4(4'-methyl-2,2'-bipyridin-4-yl)butane]ruthenium (II). In yet another embodiment of the invention, the ECL moiety is bis(2,2'-bipyridine)maleimidohexanoic acid, ruthenium (II) of 4-methyl-2,2'-bipyridine-4'-butylamide.

[00080] Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL não compreende um metal e pode ser, por exemplo, rubreno ou 9,10- difenilantraceno.[00080] In some embodiments of the invention, the ECL portion does not comprise a metal and may be, for example, rubrene or 9,10-diphenylanthracene.

[00081] Em algumas modalidades, a porção de ECL pode estar contida ou envolvida em um veículo. O número de moléculas de ECL envolvidas em ou absorvidas pelo veículo dependerá do tamanho da molécula de ECL e do tamanho do veículo. O veículo pode conter 1x102-1x1020, 1x102-1x1015, 1x104-1x1012, 1x102-1x1010, 1x106-1x1010, ou 1x106-1x109 moléculas de ECL. Em algumas modalidades, a porção de ECL pode estar contida ou envolvida em um veículo e ligada à superfície do veículo, por exemplo, por uma ligação covalente ou uma interação não covalente.[00081] In some embodiments, the ECL portion may be contained or enclosed in a vehicle. The number of ECL molecules involved in or absorbed by the vehicle will depend on the size of the ECL molecule and the size of the vehicle. The vehicle may contain 1x102-1x1020, 1x102-1x1015, 1x104-1x1012, 1x102-1x1010, 1x106-1x1010, or 1x106-1x109 ECL molecules. In some embodiments, the ECL portion may be contained or enclosed in a carrier and attached to the surface of the carrier, for example, by a covalent bond or a non-covalent interaction.

[00082] O termo "co-reagente de ECL", como empregado aqui, pertence a um composto químico que ou por si próprio ou através de seu produto(s) de oxidação de redução eletroquímica, exibe uma função na seqüência de reação de ECL.[00082] The term "ECL co-reactant", as used herein, pertains to a chemical compound that either by itself or through its electrochemical reduction oxidation product(s), exhibits a function in the ECL reaction sequence. .

[00083] Geralmente, os co-reagentes de ECL podem permitir o uso de meios mais simples de gerar ECL (por exemplo, o uso de somente metade do ciclo de oxidação-redução de etapa dupla) e/ou intensidade de ECL melhorada. Em algumas modalidades, os co-reagentes podem ser compostos químicos que, sob oxidação/redução eletroquímica, produzem, ou diretamente ou sob outra reação, espécies fortes de oxidação ou redução na solução. Um co-reagente pode ser peroxodissulfato (isto é, S2O82-, persulfato) que é irreversivelmente eletrorreduzido para formar ions de SO4^' de oxidantes. Os co- reagentes podem também ser oxalato (isto é, C2O42-) que é irreversivelmente eletrooxidado para formar íons de CO2^' de redução. Uma classe de co-reagentes que pode atuar como agentes de redução é a classe de aminas ou compostos contendo grupos de aminas, incluindo, por exemplo, tri-n-propilamina (isto é, N(CH2CH2CH2)3, TPrA). Em algumas modalidades, as aminas terciárias podem ser melhores co-reagentes do que as aminas secundárias. Em algumas modalidades, as aminas secundárias podem ser melhores co- reagentes do que as aminas primárias.[00083] Generally, ECL coreactants can allow the use of simpler means of generating ECL (e.g., the use of only half of the double-step oxidation-reduction cycle) and/or improved ECL intensity. In some embodiments, the co-reactants may be chemical compounds that, upon electrochemical oxidation/reduction, produce, either directly or under another reaction, strong oxidation or reduction species in the solution. A co-reactant may be peroxodisulfate (i.e., S2O82-, persulfate) which is irreversibly electroreduced to form oxidant SO4^' ions. The co-reactants may also be oxalate (i.e., C2O42-) which is irreversibly electrooxidized to form reducing CO2^' ions. One class of coreactants that can act as reducing agents is the class of amines or compounds containing amine groups, including, for example, tri-n-propylamine (i.e., N(CH2CH2CH2)3, TPrA). In some embodiments, tertiary amines may be better co-reactants than secondary amines. In some embodiments, secondary amines may be better co-reactants than primary amines.

[00084] Os co-reagentes incluem, porém não estão limitados a, lincomicina; clindamicina-2-fosfato; eritromicina; 1-metilpirrolidona; difenidol; atropina; trazodona; hidroflumetiazida; hidroclorotiazida; clindamicina; tetraciclina; estreptomicina; gentamicina; reserpina; trimetilamina; tri-n-butilfosfina; piperidina; N,N-dimetilanilina; feniramina; bromofeniramina; clorofeniramina; difenilidramina; 2-dimetilaminopiridina; pirilamina; 2-benzilaminopiridina; leucina; valina; ácido glutâmico; fenilalanina; alanina; arginina; histidina; cisteína; triptofano; tirosina; hidroxiprolina; asparagina; metionina; treonina; serina; ciclotiazida; triclormetiazida; 1,3-diaminopropano; piperazina; clorotiazida; hidrazinotalazina; ácido barbitúrico; persulfato; penicilina; etanol de 1- piperidinila; 1,4-diaminobutano; 1,5-diaminopentano; 1,6-diaminoexano; etilenodiamina; benzenossulfonamida; tetrametilsulfona; etilamina; di- etilamina; tri-etilamina; tri-iso-propilamina; di-n-propilamina; di-iso- propilamina; di-n-butilamina; tri-n-butilamina; tri-iso-butilamina; bi-iso- butilamina; s-butilamina; t-butilamina; di-n-pentilamina; tri-n-pentilamina; n-hexilamina; sulfato de hidrazina; glicose; n-metilacetamida; ácido fosfonoacético; e/ou sais destes.[00084] Coreactants include, but are not limited to, lincomycin; clindamycin-2-phosphate; erythromycin; 1-methylpyrrolidone; diphenidol; atropine; Trazodone; hydroflumethiazide; hydrochlorothiazide; clindamycin; tetracycline; streptomycin; gentamicin; reserpine; trimethylamine; tri-n-butylphosphine; piperidine; N,N-dimethylaniline; pheniramine; brompheniramine; chlorpheniramine; diphenylhydramine; 2-dimethylaminopyridine; pyrilamine; 2-benzylaminopyridine; leucine; valine; glutamic acid; phenylalanine; alanine; arginine; histidine; cysteine; tryptophan; tyrosine; hydroxyproline; asparagine; methionine; threonine; serine; cyclothiazide; trichlormethiazide; 1,3-diaminopropane; piperazine; chlorothiazide; hydrazinothalazine; barbituric acid; persulfate; penicillin; 1-piperidinyl ethanol; 1,4-diaminobutane; 1,5-diaminopentane; 1,6-diaminohexane; ethylenediamine; benzenesulfonamide; tetramethylsulfone; ethylamine; diethylamine; triethylamine; triiso-propylamine; di-n-propylamine; diisopropylamine; di-n-butylamine; tri-n-butylamine; tri-iso-butylamine; bi-isobutylamine; s-butylamine; t-butylamine; di-n-pentylamine; tri-n-pentylamine; n-hexylamine; hydrazine sulfate; glucose; n-methylacetamide; phosphonoacetic acid; and/or salts thereof.

[00085] Os co-reagentes também incluem, porém não estão limitados a, N-etilmorfolina; esparteína; tri-n-butilamina; piperazina-1,4-bis(ácido 2- etanossulfônico) (PIPES); trietanolamina; dinucleotídeo de adenina de diidronicotinamida; 1,4-diazobiciclo(2.2.2)octano; ácido tetraacético de etilenodiamina; ácido oxálico; 1-etilpiperidina; di-n-propilamina; N,N,N’,N’- Tetrapropil-1,3-diaminopropano; DAB-AM-4, Dendrímero de tetraamina de Polipropilenimina; DAB-AM-8, Dendrímero de octaamina de Polipropilenimina; DAB-AM-16, Dendrímero de hexadecaamina de Polipropilenimina; DAB-AM-32, Dendrímero de dotriacontaamina de Polipropilenimina; DAB-AM-64, Dendrímero de tetraexacontaamina de Polipropilenimina; ácido 3-(N-Morfolino)propanossulfônico; ácido 3- Morfolino-2-hidroxipropanossulfônico; Glicil-glicina; ácido 2- Morfolinoetanossulfônico; 2,2-Bis(hidroximetil)-2,2',2"- nitrilotrietanol; ácido N-(2-Acetamido)iminodiacético; N,N-Bis(2-hidroxietil)taurina; N-(2- Hidroxietil) piperazina-N'-( ácido 2-etanossulfônico); ácido N,N-Bis(2- hidroxietil)-3-amino-2-hidroxipropanossulfônico; ácido 4-(N-Morfolino)bu- tanossulfônico; Hidrato de 4-(2- Hidroiyetil)piperazina-1-(ácido 2- hidroxipropanossulfônico); diidrato de Piperazina-1 ,4-bis(ácido 2- hidroxipropanossulfônico); ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1- propanos- sulfônico; N,N-Bis(2-hidroxietil)glicina; N-(2- hidroxietil)piperazina-N'- (ácido 4-butanossulfônico).; e/ou sais destes.[00085] Coreactants also include, but are not limited to, N-ethylmorpholine; sparteine; tri-n-butylamine; piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES); triethanolamine; dihydronicotinamide adenine dinucleotide; 1,4-diazobicyclo(2.2.2)octane; ethylenediamine tetraacetic acid; oxalic acid; 1-ethylpiperidine; di-n-propylamine; N,N,N’,N’-Tetrapropyl-1,3-diaminopropane; DAB-AM-4, Polypropylenimine Tetraamine Dendrimer; DAB-AM-8, Polypropylenimine octaamine dendrimer; DAB-AM-16, Polypropylenimine Hexadecaamine Dendrimer; DAB-AM-32, Polypropylenimine Dotriacontaamine Dendrimer; DAB-AM-64, Polypropylenimine tetrahexacontaamine dendrimer; 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid; 3- Morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid; Glycyl-glycine; 2- Morpholinoethanesulfonic acid; 2,2-Bis(hydroxymethyl)-2,2',2"- nitrilotriethanol; N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid; N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine; N-(2-Hydroxyethyl) piperazine- N'-(2-ethanesulfonic acid); N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-3-amino-2-hydroxypropanesulfonic acid; 4-(N-Morpholino)butanesulfonic acid; 4-(2-Hydroxyethyl hydrate )piperazine-1-(2-hydroxypropanesulfonic acid); Piperazine-1,4-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid) dihydrate; 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-propanesulfonic acid; N,N-Bis( 2-hydroxyethyl)glycine; N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'- (4-butanesulfonic acid).; and/or salts thereof.

[00086] As medições de ECL de acordo com a invenção podem ser feitas em solventes orgânicos tal como acetonitrila, em sistemas parcialmente aquosos, ou em sistemas aquosos. Um eletrodo adequado para a redução eletroquímica de uma porção de ECL pode ser, por exemplo, um eletrodo de Pt ou um eletrodo compreendido de uma liga de Pt e Ir.[00086] ECL measurements according to the invention can be made in organic solvents such as acetonitrile, in partially aqueous systems, or in aqueous systems. A suitable electrode for the electrochemical reduction of a portion of ECL may be, for example, a Pt electrode or an electrode comprised of an alloy of Pt and Ir.

C. Vehicles

[00087] Em certas modalidades, a invenção prover a subsistência de um primeiro e segundo veículo os quais podem ser empregados na detecção de um analito de interesse. Os primeiro e segundo veículos podem exercer pelo menos uma das várias funções, incluindo apresentação de uma amostra, a apresentação de um par de ligações específico, detenção ou captura de uma porção de ECL, e fornecimento de um meio para separar um complexo formado entre um analito de interesse e um par de ligações específico de outros componentes da composição.[00087] In certain embodiments, the invention provides the subsistence of a first and second vehicle which can be used in the detection of an analyte of interest. The first and second carriers may perform at least one of several functions, including presenting a sample, presenting a specific bond pair, detaining or capturing a portion of ECL, and providing a means for separating a complex formed between a analyte of interest and a specific bond pair from other components of the composition.

[00088] Qualquer um do primeiro e segundo veículo pode compreender uma porção de ECL. Em certas modalidades, a porção de ECL pode estar contida no veículo. Devido à porção de ECL está contida em um veículo, a invenção prover a subsistência de facilmente liberar a porção de ECL do veículo, por exemplo, alterando-se certas condições tal como a natureza do solvente. Em certas modalidades, por exemplo, onde o veículo é um suporte sólido compreendido de um material tal como plástico, a porção de ECL não é misturada no veículo. Em algumas modalidades, a porção de ECL pode ser covalentemente ligada à superfície do veículo e contida no veículo. Em algumas modalidades, a porção de ECL pode estar contida no veículo e absorvida pela superfície do veículo. O primeiro veículo pode opcionalmente ser compreendido da amostra contendo o analito de interesse. Em certas modalidades, a amostra pode estar ligada à superfície do primeiro veículo, desse modo tornando disponível a ligação com um par de ligações específico. Em certas modalidades, entretanto, a amostra pode estar ligada a nenhum do primeiro ou segundo veículo. Nesta modalidade, a amostra pode estar na solução.[00088] Either of the first and second vehicles may comprise a portion of ECL. In certain embodiments, the ECL portion may be contained in the vehicle. Because the ECL portion is contained in a vehicle, the invention provides the means to easily release the ECL portion from the vehicle, for example, by changing certain conditions such as the nature of the solvent. In certain embodiments, for example, where the carrier is a solid support comprised of a material such as plastic, the ECL portion is not mixed into the carrier. In some embodiments, the ECL portion may be covalently linked to the surface of the vehicle and contained within the vehicle. In some embodiments, the ECL portion may be contained in the vehicle and absorbed by the surface of the vehicle. The first carrier may optionally be comprised of the sample containing the analyte of interest. In certain embodiments, the sample may be bonded to the surface of the first carrier, thereby making bonding with a specific bond pair available. In certain embodiments, however, the sample may be linked to neither the first or second vehicle. In this embodiment, the sample can be in the solution.

[00089] Em certas modalidades, ou o primeiro veículo ou o segundo veículo pode compreender um par de ligações específico do analito de interesse. O par de ligações específico pode ser ligado à superfície do primeiro veículo desse modo tornando-o acessível para ligação ao analito de interesse.[00089] In certain embodiments, either the first carrier or the second carrier may comprise a bond pair specific to the analyte of interest. The specific bond pair can be attached to the surface of the first carrier thereby making it accessible for binding to the analyte of interest.

[00090] Nas modalidades da invenção compreendendo um segundo veículo, o segundo veículo pode compreender um par de ligações específico do analito de interesse. O par de ligações específico pode ser ligado à superfície do segundo veículo desse modo tornando-o acessível para ligação ao analito de interesse. O segundo veículo pode compreender um meio de separar o complexo formado entre o analito de interesse e o par de ligações específico. Em certas modalidades, o segundo veículo pode fornecer um meio de separar o complexo formado entre o analito de interesse e o par de ligações específico de outros componentes da composição. Por exemplo, o segundo veículo pode ser magnetizável permitindo o complexo formado entre o analito de interesse e o par de ligações específico ser separado de outros componentes da composição empregando um magneto. Em certas modalidades da invenção, o magneto empregado para separar o complexo de outros componentes da composição pode estar localizado próximo a um eletrodo que pode ser empregado para introduzir a energia eletroquímica no sistema como descrito, por exemplo, nas Patentes dos estados Unidos Nos. 5.935.779 e 6.325.973.[00090] In embodiments of the invention comprising a second carrier, the second carrier may comprise a bond pair specific to the analyte of interest. The specific bond pair can be attached to the surface of the second carrier thereby making it accessible for binding to the analyte of interest. The second carrier may comprise a means of separating the complex formed between the analyte of interest and the specific bond pair. In certain embodiments, the second carrier may provide a means of separating the complex formed between the analyte of interest and the specific bond pair of other components of the composition. For example, the second carrier may be magnetizable allowing the complex formed between the analyte of interest and the specific bond pair to be separated from other components of the composition using a magnet. In certain embodiments of the invention, the magnet employed to separate the complex from other components of the composition may be located proximate an electrode that may be employed to introduce electrochemical energy into the system as described, for example, in United States Patent Nos. 5,935,779 and 6,325,973.

[00091] Em certas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo veículo pode ser um suporte sólido. Em algumas modalidades ambos o primeiro e segundo veículos são suportes sólidos. O suporte sólido pode compreender uma partícula, isto é, um polímero tendo um comprimento maior do que 1000 micrômetros em pelo menos uma dimensão, uma nanopartícula, isto é, um polímero tendo um comprimento na faixa de 1-1000 nanômetros em pelo menos uma dimensão, ou uma micropartícula, isto é um polímero tendo um comprimento maior do que 1000 nanômetros, porém menos do que ou igual a 1000 micrômetros em pelo menos uma dimensão. Em certas modalidades o suporte sólido pode ter uma forma tridimensional incluindo ambas formas irregulares ou regulares, por exemplo, esférica, cúbica, cônica.[00091] In certain embodiments, at least one of the first and second vehicles may be a solid support. In some embodiments both the first and second vehicles are solid supports. The solid support may comprise a particle, i.e., a polymer having a length greater than 1000 micrometers in at least one dimension, a nanoparticle, i.e., a polymer having a length in the range of 1-1000 nanometers in at least one dimension. , or a microparticle, that is, a polymer having a length greater than 1000 nanometers, but less than or equal to 1000 micrometers in at least one dimension. In certain embodiments the solid support may have a three-dimensional shape including both irregular and regular shapes, e.g., spherical, cubic, conical.

[00092] Os suportes sólidos podem compreender uma conta, um gel, ou uma membrana. Uma membrana pode compreender, por exemplo, nitrocelulose, náilon, fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou polivinilideno carboxilado (Patente U.S. N°: 6.037.124). A membrana pode ser revestida com cloreto de amônio de hidroxietila de dimetila de benzila de polivinila, cloreto de amônio de dimetila de aminoetila de benzoíla de benzila de polivinila, cloreto de amônio de tributila de benzila de polivinila, cloreto de amônio de triexila de benzila de polivinila e cloreto de amônio de tributila de benzila de polivinila, copolímeros de cloreto de amônio de dimetila de benzila de benzila de polivinila e cloreto de amônio de dimetila de aminoetila de polivinila e copolímeros de cloreto de amônio de dimetila ureidoetila de fenila de benzila de polivinila e cloreto de amônio de dimetila de benzila de benzila de polivinila (Patente U.S. N°: 5.336.596). O suporte sólido pode compreender qualquer material que possa ser ligado a um par de ligações específico do analito de interesse e/ou a amostra (por exemplo, poliestireno, sefarose, sefadex) e/ou que pode conter ou capturar uma porção de ECL. Os suportes sólidos podem compreender qualquer polímero orgânico sintético tal como poliacrílicos, polímeros de vinila, acrilato, polimetacrilato, poliacrilamida, poliacrilonitrilas, e poliolefinas. Os suportes sólidos podem também compreender um polímero de carboiidrato, por exemplo, agarose, celulose, ácido hialurônico, quitina, acil gelan, dextran, carboximetilcelulose, amido de carboximetilcelulose, quitina de carboximetila, poli(lactídeo-co-etileno glicol). Os suportes sólidos podem compreender óxidos inorgânicos, tal como sílica, zircônia, por exemplo, zircônia blindada de carbono (Patente U.S. N°: 5.182.016), titânia, cério, alumina, manganês, magnésia (isto é, óxido de magnésio), óxido de cálcio, poro de vidro controlado (CPG). Os suportes sólidos podem também compreender combinações de alguns dos suportes mencionados acima incluindo, porém não limitado a, dextran-acrilamida. Um suporte sólido pode ser preparado para minimizar as interações não específicas com o par de ligações específico e/ou o analito de interesse.[00092] Solid supports may comprise a bead, a gel, or a membrane. A membrane may comprise, for example, nitrocellulose, nylon, polyvinylidene fluoride (PVDF) or carboxylated polyvinylidene (U.S. Patent No.: 6,037,124). The membrane can be coated with polyvinyl benzyl dimethyl hydroxyethyl ammonium chloride, polyvinyl benzyl benzoyl aminoethyl dimethyl ammonium chloride, polyvinyl benzyl trihexyl ammonium chloride, polyvinyl benzyl trihexyl ammonium chloride, polyvinyl and polyvinyl benzyl tributyl ammonium chloride, polyvinyl benzyl benzyl dimethyl ammonium chloride copolymers and polyvinyl benzyl aminoethyl dimethyl ammonium chloride copolymers and polyvinyl benzyl phenyl ureidoethyl dimethyl ammonium chloride copolymers and polyvinyl benzyl benzyl dimethyl ammonium chloride (U.S. Patent No.: 5,336,596). The solid support can comprise any material that can be linked to a specific bond pair of the analyte of interest and/or the sample (e.g., polystyrene, sepharose, sefadex) and/or that can contain or capture a portion of ECL. Solid supports may comprise any synthetic organic polymer such as polyacrylics, vinyl polymers, acrylate, polymethacrylate, polyacrylamide, polyacrylonitrile, and polyolefins. Solid supports may also comprise a carbohydrate polymer, for example, agarose, cellulose, hyaluronic acid, chitin, acyl gelan, dextran, carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose starch, carboxymethyl chitin, poly(lactide-co-ethylene glycol). The solid supports may comprise inorganic oxides, such as silica, zirconia, e.g., carbon-shielded zirconia (U.S. Patent No.: 5,182,016), titania, cerium, alumina, manganese, magnesia (i.e., magnesium oxide), calcium oxide, controlled pore glass (CPG). Solid supports may also comprise combinations of some of the above-mentioned supports including, but not limited to, dextran acrylamide. A solid support can be prepared to minimize nonspecific interactions with the specific bond pair and/or analyte of interest.

[00093] Em certas modalidades onde pelo menos um dos primeiro ou segundo veículos é um suporte sólido, o suporte sólido pode ser insolúvel em um ambiente aquoso, porém solúvel em um ambiente orgânico, por exemplo, acetonitrila, éter, clorofórmio, benzeno. Para modalidades em que uma porção de ECL é capturada ou de outra maneira associada com um tal suporte sólido, a porção de ECL pode ser liberada colocando-se o suporte sólido em um ambiente orgânico, desse modo facilitando a detecção da porção de ECL. Um ambiente orgânico pode incluir um solvente que seja 70-100%, 80-100%, 90-99%, 99-99,99% de solução orgânico (volume/volume).[00093] In certain embodiments where at least one of the first or second carriers is a solid support, the solid support may be insoluble in an aqueous environment, but soluble in an organic environment, for example, acetonitrile, ether, chloroform, benzene. For embodiments in which an ECL portion is captured or otherwise associated with such a solid support, the ECL portion can be released by placing the solid support in an organic environment, thereby facilitating detection of the ECL portion. An organic environment may include a solvent that is 70-100%, 80-100%, 90-99%, 99-99.99% organic solution (volume/volume).

[00094] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos um dos primeiro ou segundo veículos é um gel tendo um ponto de fusão na faixa de 30oC-60oC, por exemplo, agarose de baixa temperatura de fusão. Nestas modalidades, o aquecimento do complexo acima do ponto de fusão do veículo contendo a porção de ECL liberará a porção de ECL e desse modo facilitará a detecção.[00094] In some embodiments of the invention, at least one of the first or second carriers is a gel having a melting point in the range of 30oC-60oC, for example, low melting temperature agarose. In these embodiments, heating the complex above the melting point of the vehicle containing the ECL portion will release the ECL portion and thereby facilitate detection.

[00095] Em certas modalidades, o suporte sólido é uma conta, por exemplo, uma conta de poliestireno. Em modalidades onde ambos primeiro e segundo veículos são contas, o primeiro veículo pode ter uma porção de ECL contida ou capturada dentro dele, e o segundo veículo pode ser uma conta magnetizável. Ambas contas contendo ECL e as contas magnetizáveis podem ter um diâmetro na faixa de 0,1 µm-100 µm, 0,5 µm-50 µm, 1 µm- 20 µm, ou 0,5 µm-10 µm. Em algumas modalidades, o primeiro veículo pode ter um diâmetro de 10 µm e o segundo veículo pode ter um diâmetro de 1 µm. Em algumas modalidades, o primeiro veículo pode ter um diâmetro de 10 µm e o segundo veículo pode ter um diâmetro de 2,8 µm.[00095] In certain embodiments, the solid support is a bead, for example, a polystyrene bead. In embodiments where both the first and second vehicles are beads, the first vehicle may have a portion of ECL contained or captured within it, and the second vehicle may be a magnetizable bead. Both ECL-containing beads and magnetizable beads can have a diameter in the range of 0.1 µm-100 µm, 0.5 µm-50 µm, 1 µm-20 µm, or 0.5 µm-10 µm. In some embodiments, the first carrier may have a diameter of 10 µm and the second carrier may have a diameter of 1 µm. In some embodiments, the first carrier may have a diameter of 10 µm and the second carrier may have a diameter of 2.8 µm.

[00096] Em certas modalidades da invenção, pelo menos um dos veículos pode compreender um líquido. O líquido pode compreender pelo menos uma molécula anfifílica. Uma molécula anfifílica é uma tendo ambas porções polares e não polares e que pode formar agregados, por exemplo, micelas, em um meio ambiente aquoso. Desse modo uma micela pode ser compreendida de qualquer íon de ácido graxo tal como palmitato ou oleato. Uma micela pode compreender um ou mais detergentes não iônicos, por exemplo, Triton X-100, ou Octil-ß-D-glicosideo. Uma micela pode compreender um ou mais detergentes iônicos, por exemplo, sulfato de dodecils de sódio, deoxicolato, lisolecitina. Em algumas modalidades, uma micela pode compreender ambos detergentes não iônicos e iônicos.[00096] In certain embodiments of the invention, at least one of the vehicles may comprise a liquid. The liquid may comprise at least one amphiphilic molecule. An amphiphilic molecule is one having both polar and non-polar portions and which can form aggregates, e.g. micelles, in an aqueous environment. Thus a micelle can be comprised of any fatty acid ion such as palmitate or oleate. A micelle may comprise one or more non-ionic detergents, for example, Triton X-100, or Octyl-ß-D-glucoside. A micelle may comprise one or more ionic detergents, for example, sodium dodecyl sulfate, deoxycholate, lysolecithin. In some embodiments, a micelle may comprise both non-ionic and ionic detergents.

[00097] Desse modo em certas modalidades, pelo menos um dos primeiro ou segundo veículos pode ser uma micela. A micela pode estar ligada à amostra, de modo que o analito de interesse seja exibido sobre a superfície da micela, desse modo permitindo o par de ligações específico contatar o analito de interesse. A porção de ECL pode estar contida no interior da micela. O rompimento da micela, por exemplo, através de agitação ou sonicação, ou oxidação ou redução, desse modo fornecerá um meio de liberar o ECL e facilitará a detecção do analito de interesse.[00097] Thus in certain embodiments, at least one of the first or second vehicles may be a micelle. The micelle may be linked to the sample so that the analyte of interest is displayed on the surface of the micelle, thereby allowing the specific bond pair to contact the analyte of interest. The ECL portion may be contained within the micelle. Disruption of the micelle, for example, through stirring or sonication, or oxidation or reduction, will thereby provide a means of releasing the ECL and facilitate detection of the analyte of interest.

[00098] Em certas modalidades, o veículo pode ser um lipossoma. Os lipossomas são vesículas esféricas microscópicas que se formam quando os fosfolipídios são hidratados. Quando misturados em água sob condições de cisalhamento baixo, os fosfolipídios se dispõem em folhas, as moléculas alinham-se lado a lado na mesma orientação, "cabeça" para cima e "cauda" para baixo. Estas folhas então juntam cauda com cauda para formar uma membrana em bicamada em uma esfera de fosfolipídio com um centro aquoso. Os lipossomas podem ser de tamanho uniforme, por exemplo, 200 nm em diâmetro. Os lipossomas permitem os materiais insolúveis em água e solúveis em água serem empregados juntos em uma formulação sem o uso de tensoativo ou outros emulsificantes. Os materiais solúveis em água são dissolvidos na água em que os fosfolipídios são hidratados, e quando os lipossomas se formam, estes materiais são capturados no centro aquoso. A parede de lipossoma, sendo uma membrana de fosfolipídio, detém os materiais solúveis em gordura tal como óleos. Os lipossomas podem ser compreendidos de misturas de fosfolipídios naturais estabilizados, fosfolipídios de cadeias idênticas sintéticos, lipossomas contendo glicolipídios, ácidos graxos bipolares, ligados por metil/metileno X, cobertos de lipoproteína, ou cobertos de carboidrato. A amostra pode ser apresentada sobre a superfície do lipossoma para facilitar a ligação do par de ligações específico ou da amostra. O lipossoma pode conter dentro dele (isto é, no centro aquoso ou no lipídio circundante) uma porção de ECL, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 6.706.861.[00098] In certain embodiments, the vehicle may be a liposome. Liposomes are microscopic spherical vesicles that form when phospholipids are hydrated. When mixed in water under low shear conditions, phospholipids arrange themselves into sheets, the molecules align side by side in the same orientation, "head" up and "tail" down. These sheets then join tail to tail to form a bilayer membrane on a phospholipid sphere with an aqueous center. Liposomes can be of uniform size, for example, 200 nm in diameter. Liposomes allow water-insoluble and water-soluble materials to be used together in a formulation without the use of surfactants or other emulsifiers. Water-soluble materials are dissolved in the water in which phospholipids are hydrated, and when liposomes form, these materials are captured in the aqueous center. The liposome wall, being a phospholipid membrane, holds fat-soluble materials such as oils. Liposomes can be comprised of mixtures of stabilized natural phospholipids, synthetic identical chain phospholipids, liposomes containing glycolipids, bipolar fatty acids, methyl/methylene X-linked, lipoprotein-coated, or carbohydrate-coated. The sample may be presented on the surface of the liposome to facilitate binding of the specific bond pair or sample. The liposome may contain within it (i.e., in the aqueous center or in the surrounding lipid) a portion of ECL, see, for example, U.S. Patent No. 6,706,861.

D. Methods of Attaching a Specific Sample or Bond Pair to a Vehicle

[00099] A amostra contendo o analito de interesse ou o par de ligações específico pode ser ligado a um veículo por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, os reagentes de reticulação podem ser empregados para proteínas e ácidos nucléicos (Lund e outros, 1988, Nucleic Acids Res. 16:10861). Similarmente, os reagentes de reticulação fotorreativos têm sido empregados para ambos ácidos nucléicos e proteínas (Penchovsky e outros, 2000, Nucleic Acids Res. 28(22):98; Harrison e outros, Biochemistry 28:6023). A seleção dos meios apropriados dependerá da natureza da amostra e da natureza do veículo. A ligação pode ser, por exemplo, por uma ligação covalente, uma interação não covalente tal como uma interação eletrostática, uma interação hidrofóbica, uma interação hidrofílica, uma iteração van der Waals, ou uma ligação de hidrogênio. A seleção de um método de ligação de uma amostra a um veículo está bem na experiência ordinária na técnica.[00099] The sample containing the analyte of interest or the specific bond pair can be linked to a vehicle by any means known in the art. For example, cross-linking reagents can be used for proteins and nucleic acids (Lund et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16:10861). Similarly, photoreactive cross-linking reagents have been employed for both nucleic acids and proteins (Penchovsky et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28(22):98; Harrison et al., Biochemistry 28:6023). Selection of appropriate media will depend on the nature of the sample and the nature of the vehicle. The bond may be, for example, by a covalent bond, a non-covalent interaction such as an electrostatic interaction, a hydrophobic interaction, a hydrophilic interaction, a van der Waals iteration, or a hydrogen bond. The selection of a method of attaching a sample to a vehicle is well within the ordinary skill in the art.

[000100] Em certas modalidades, os ligandos são imobilizados ou "ligados" diretamente a um veículo formando-se ligações químicas covalentes entre grupos funcionais particulares sobre o ligando (por exemplo, aminas primárias, sulfidrilas, ácidos carboxílicos, aldeídos) e grupos reativos sobre o veículo.[000100] In certain embodiments, ligands are immobilized or "attached" directly to a carrier by forming covalent chemical bonds between particular functional groups on the ligand (e.g., primary amines, sulfhydryls, carboxylic acids, aldehydes) and reactive groups on the vehicle.

[000101] Outras abordagens de ligação são também possíveis, não incluído porém não limitadas ao uso de biotina com avidina ou estreptavidina como um ligador. Os métodos de uso de estreptavidina de biotina/avidina como ligadores são conhecidos na técnica (veja, Wilchek e Bayer, Eds. Methods in Enzymology vol. 184, Academic Press, San Diego 1990). Em certas modalidades, N-hidroxissucinimida (NHS) pode ser usado para formar um éster de NHS de biotina. O resíduo de biotina pode ser ligado a uma variedade de grupos funcionais incluindo porém não limitados a aminas primárias em resíduos de lisina, porções de carboxila em resíduos de glutamato ou aspartato, ou porções de sulfidrila sobre resíduos de cisteína. A avidina pode ser covalentemente ligada a um veículo através de um grupo de amino sobre lisina após ativação do veículo como brometo de cianogênio (CNBr).[000101] Other ligation approaches are also possible, not including but not limited to the use of biotin with avidin or streptavidin as a linker. Methods of using biotin/avidin streptavidin as linkers are known in the art (see, Wilchek and Bayer, Eds. Methods in Enzymology vol. 184, Academic Press, San Diego 1990). In certain embodiments, N-hydroxysuccinimide (NHS) can be used to form a biotin NHS ester. The biotin residue can be linked to a variety of functional groups including but not limited to primary amines on lysine residues, carboxyl moieties on glutamate or aspartate residues, or sulfhydryl moieties on cysteine residues. Avidin can be covalently linked to a carrier via an amino group on lysine after activation of the carrier as cyanogen bromide (CNBr).

[000102] Em certas modalidades, a amostra ou o par de ligações pode ser simplesmente adsorvido sobre a superfície do veículo. Por exemplo, os anticorpos podem ser adsorvidos pela superfície de microesferas de poliestireno. Para cobertura de superfície máxima (até uma monocamada) em modalidades em que é desejado adsorver uma proteína pela superfície de um veículo, o pH da solução pode ser ajustado a, ou ligeiramente mais básico do que, o ponto isoelétrico da proteína. O uso de uma suspensão de microesfera diluída (cerca de 1% de sólidos) garante o revestimento de microesferas únicas. Ao mesmo tempo em que uma concentração da proteína final de cerca de 0,1 mg/ml é geralmente suficiente para obter uma monocamada de proteína, adicionando cerca de 3 a cerca de 10 vezes esta quantidade garante estequiometria favorável e uma boa força propulsora para ligação.[000102] In certain embodiments, the sample or bond pair can simply be adsorbed onto the surface of the vehicle. For example, antibodies can be adsorbed onto the surface of polystyrene microspheres. For maximum surface coverage (up to a monolayer) in embodiments where it is desired to adsorb a protein onto the surface of a vehicle, the pH of the solution can be adjusted to, or slightly more basic than, the isoelectric point of the protein. Using a diluted microsphere suspension (about 1% solids) ensures single microsphere coating. While a final protein concentration of about 0.1 mg/ml is generally sufficient to obtain a protein monolayer, adding about 3 to about 10 times this amount ensures favorable stoichiometry and a good driving force for binding. .

[000103] A superfície de um veículo pode ser modificada para facilitar a ligação covalente da amostra ou o par de ligações específico. As microesferas poliméricas modificadas pela superfície são freqüentemente feitas por copolimerização de estireno com uma pequena quantidade (menor do que cerca de 5%) de um monômero funcional, tal como ácidos acrílicos, que produz microesferas cobertas com grupos -COOH. Outros monômeros podem ser empregados para preparar microesferas com substâncias químicas de superfície diferentes, veja, por exemplo, a Patente U.S. N°: 5.599.889.[000103] The surface of a carrier can be modified to facilitate the covalent bonding of the sample or the specific bond pair. Surface-modified polymeric microspheres are often made by copolymerizing styrene with a small amount (less than about 5%) of a functional monomer, such as acrylic acids, which produces microspheres covered with -COOH groups. Other monomers can be used to prepare microspheres with different surface chemistries, see, for example, U.S. Patent No.: 5,599,889.

[000104] Os grupos de silanol nativos sobre a superfície de microesferas de sílica podem ser reagidos com agentes de ligação de silano cm base em solvente ou aquoso para produzir microesferas de sílica pré-ativadas com uma variedade grande de grupos funcionais de superfície. Os exemplos incluem grupos de clorometila, carboxila, e amino. DNA e RNA podem ser adsorvidos em sílica na presença de agentes caotrópicos. Os oligonucleotídeos podem ser covalentemente ligados à sílica modificada pela superfície através da terminação de 5’- amino. Os lipídios podem ser ligados através do grupo de carboxila sobre a cadeia de ácido graxo e grupos de superfície de propilamina sobre a sílica como descrito por Boom e outros., 1990, J. Clin. Microbiol., 28:495).[000104] Native silanol groups on the surface of silica microspheres can be reacted with solvent-based or aqueous silane binding agents to produce pre-activated silica microspheres with a wide variety of surface functional groups. Examples include chloromethyl, carboxyl, and amino groups. DNA and RNA can be adsorbed on silica in the presence of chaotropic agents. Oligonucleotides can be covalently linked to surface-modified silica through the 5'-amino terminus. Lipids can be linked through the carboxyl group on the fatty acid chain and propylamine surface groups on the silica as described by Boom et al., 1990, J. Clin. Microbiol., 28:495).

[000105] Um analito de interesse ou um par de ligações específico pode ser incorporado em uma micela, veja, por exemplo, Savic e outros., 2003, Science 300:615; Maysinger e outros., 2001, Biochim. Biophys. Acta. 1539 (3):205). A solubilização e reconstituição de uma proteína em micelas detergentes podem ser realizadas, por exemplo, diluindo-se vagarosamente a solução de proteína em 6M de cloridrato de de guanidina (Gdn-HCl) em um excesso de tampão de reduplicagem (por exemplo, 3% de fosfatidilcolina de diexanoíla 20mM de Tris-HCl/5 mM de EDTA/0,6 M de L-arginina, pH 8,5). Após a remoção do Gdn-HCl residual, por exemplo, por diálise, a solução pode ser concentrada por uma variedade das técnicas, incluindo ultrafiltração. Veja, por exemplo., Fernandez e outros. 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 08:2358).[000105] An analyte of interest or a specific bond pair can be incorporated into a micelle, see, for example, Savic et al., 2003, Science 300:615; Maysinger et al., 2001, Biochim. Biophys. Minutes. 1539 (3):205). Solubilization and reconstitution of a protein in detergent micelles can be accomplished, for example, by slowly diluting the protein solution in 6M guanidine hydrochloride (Gdn-HCl) in an excess of reduplication buffer (e.g., 3% dihexanoyl phosphatidylcholine 20mM Tris-HCl/5mM EDTA/0.6M L-arginine, pH 8.5). After removal of residual Gdn-HCl, for example by dialysis, the solution can be concentrated by a variety of techniques, including ultrafiltration. See, e.g., Fernandez et al. 2001, Proc. Natl. academic Sci. USA 08:2358).

[000106] Um analito de interesse, ou um par de ligações específico pode ser incorporado em um lipossoma. Muitos métodos de incorporação de proteína em lipossoma são conhecidos (veja, por exemplo., Rigaud., e outros "Liposomes as Tools for the Reconstitution of Biological Systems," p. 71-88, Liposomes as Tools in Basic Research eand Industry, ed. Philippot, J. R. and Schuber, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1995)). Como um exemplo, meios mecânicos, tal como um sonicator ou prensa Francesa, podem ser empregados para produzi vesículas unilamelares dilatando-se e secando-se as películas de fosfolipídios em tampão de excesso (Lelkes e outros., 1985, J. Biol. Chem. 260:1796). Alternativamente, as proteínas podem ser espontaneamente incorporadas em lipossomas preformados catalisados por concentrações de colato ou lisolecitina baixas (Wrigglesworth e outros, 1987, Biochem J. 246(3):737). As proteínas podem também ser co- solubilizadas na presença de fosfolipídios e detergentes, para formar micelas seguidas pela remoção subseqüente do detergente. Os lipossomas grandes podem ser preparados por evaporação de fase reversa e tratados com várias quantidades dos detergentes tal como Triton X-100, glicosídeo de octila, ou colato de sódio. Em cada etapa do processo de solubilização, a proteína pode ser adicionada. As misturas de detergente de proteína-fosfolipídio podem então ser submetidas aos tratamentos SM2 Bio-Beads para remover o detergente (Rigaud e outros., 1988, Biochemistry 27(8):2677). As proteínas de membrana podem ser incorporadas em lipossomas fornecendo-se a proteína de membrana em solução; fornecendo-se uma solução de lipossomas preformados; e incubando-se a mistura. Antes da etapa de fornecer uma solução de lipossomas preformados, os lipossomas são formados combinando-se uma mistura de fosfolipídios com uma solução de pelo menos um tipo de ácido graxo não saturado (Patente U.S. N°: 6.706.861). O técnico versado reconhecerá que existem muitos modos adicionais de unir a amostra a um veículo.[000106] An analyte of interest, or a specific bond pair can be incorporated into a liposome. Many methods of protein incorporation into liposomes are known (see, e.g., Rigaud., et al. "Liposomes as Tools for the Reconstitution of Biological Systems," pp. 71-88, Liposomes as Tools in Basic Research and Industry, ed. Philippot, J. R. and Schuber, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1995)). As an example, mechanical means, such as a sonicator or French press, can be employed to produce unilamellar vesicles by swelling and drying the phospholipid films in excess buffer (Lelkes et al., 1985, J. Biol. Chem 260:1796). Alternatively, proteins can be spontaneously incorporated into preformed liposomes catalyzed by low cholate or lysolecithin concentrations (Wrigglesworth et al., 1987, Biochem J. 246(3):737). Proteins can also be co-solubilized in the presence of phospholipids and detergents to form micelles followed by subsequent removal of the detergent. Large liposomes can be prepared by reverse phase evaporation and treated with various amounts of detergents such as Triton X-100, octyl glycoside, or sodium cholate. At each step of the solubilization process, protein can be added. The protein-phospholipid detergent mixtures can then be subjected to SM2 Bio-Beads treatments to remove the detergent (Rigaud et al., 1988, Biochemistry 27(8):2677). Membrane proteins can be incorporated into liposomes by providing the membrane protein in solution; providing a solution of preformed liposomes; and incubating the mixture. Prior to the step of providing a solution of preformed liposomes, liposomes are formed by combining a mixture of phospholipids with a solution of at least one type of unsaturated fatty acid (U.S. Patent No.: 6,706,861). The skilled artisan will recognize that there are many additional ways of attaching the sample to a vehicle.

E. Methods of Loading a Portion of ECL into a Vehicle

[000107] Em certas modalidades, a porção de ECL pode ser ligada à superfície de um veículo. Os métodos descritos acima com respeito à ligação de uma amostra a um veículo podem ser similarmente empregados para unir uma porção de ECL a um veículo. Onde o veículo é um suporte sólido, por exemplo, uma conta, a porção de ECL pode ser ligada à superfície do veículo, por exemplo, através de uma ligação covalente, uma interação não-covalente, uma interação eletrostática, uma interação hidrofóbica, uma interação hidrofílica, uma interação van der Waals, ou uma ligação de hidrogênio.[000107] In certain embodiments, the ECL portion can be attached to the surface of a vehicle. The methods described above with respect to attaching a sample to a carrier can similarly be employed to attach an ECL portion to a carrier. Where the carrier is a solid support, for example, a bead, the ECL portion may be attached to the surface of the carrier, for example, through a covalent bond, a non-covalent interaction, an electrostatic interaction, a hydrophobic interaction, a hydrophilic interaction, a van der Waals interaction, or a hydrogen bond.

[000108] Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL é solúvel em solventes orgânicos, porém insolúvel em solventes aquosos. A porção de ECL pode ser dissolvida em um solvente orgânico e então misturada com uma pluralidade de partículas do veículo, por exemplo, uma conta compreendida de um material hidrofóbico tal como poliestireno. O solvente orgânico contendo a porção de ECL penetra os poros do veículo e, sob evaporação do solvente orgânico, a porção de ECL torna-se capturado ou envolvida no interior do veículo. Quando a conta é solvatada em uma solvente aquoso, a maioria ou toda a porção de ECL permanece envolvida no veículo. Em certas modalidades, o veículo é uma conta de poliestireno. Em algumas modalidades, a porção de ECL pode ser incorporada em um gel formando-se o gel em uma solução compreendendo a porção de ECL. Em algumas modalidades, a porção de ECL pode ser incorporada em uma micela por formação da micela em uma solução compreendendo a porção de ECL. Em algumas modalidades, a porção de ECL pode ser incorporada em um lipossoma formando-se o lipossoma em uma solução compreendendo a porção de ECL.[000108] In some embodiments of the invention, the ECL portion is soluble in organic solvents, but insoluble in aqueous solvents. The ECL portion may be dissolved in an organic solvent and then mixed with a plurality of carrier particles, for example, a bead comprised of a hydrophobic material such as polystyrene. The organic solvent containing the ECL portion penetrates the pores of the vehicle and, upon evaporation of the organic solvent, the ECL portion becomes captured or enveloped within the vehicle. When the bead is solvated in an aqueous solvent, most or all of the ECL portion remains enclosed in the vehicle. In certain embodiments, the vehicle is a polystyrene bead. In some embodiments, the ECL portion can be incorporated into a gel by forming the gel in a solution comprising the ECL portion. In some embodiments, the ECL moiety may be incorporated into a micelle by forming the micelle in a solution comprising the ECL moiety. In some embodiments, the ECL portion can be incorporated into a liposome by forming the liposome in a solution comprising the ECL portion.

[000109] Em algumas modalidades, a porção de ECL pode ser capturada dentro de um veículo sem perda substancial no meio circundante. A perda de porção de ECL para a fase líquida circundante pode ser indesejada durante preparação e uso. A capacidade do veículo de capturar a porção de ECL pode ser fundamentalmente descrita por uma constante física importante chamada de um coeficiente de divisão. O coeficiente de divisão é K= veículo C /líquido C, onde veículo C é a concentração da porção embebida com o veículo, e líquido C é a concentração de porção não embebida.[000109] In some embodiments, the ECL portion can be captured within a vehicle without substantial loss to the surrounding environment. Loss of portion of ECL to the surrounding liquid phase may be undesirable during preparation and use. The vehicle's ability to capture the ECL portion can be fundamentally described by an important physical constant called a division coefficient. The division coefficient is K= vehicle C /liquid C, where vehicle C is the concentration of the portion soaked with the vehicle, and liquid C is the concentration of the non-soaked portion.

[000110] Em um sistema de duas fases (veículo e líquido), uma porção com um coeficiente de divisão maior do que um mostra uma preferência pela fase do veículo. Os valores elevados de coeficiente de divisão indicam uma forte preferência para a fase do veículo. Ao contrário, uma porção com um coeficiente de divisão menor do que um preferiria a fase líquida. Um sistema de coeficiente de divisão baixo que inicialmente teve níveis elevados de porções de ECL dentro do veículo perderia porções para a fase líquida circundante.[000110] In a two-phase system (vehicle and liquid), a portion with a division coefficient greater than one shows a preference for the vehicle phase. High split coefficient values indicate a strong preference for the vehicle phase. Conversely, a portion with a partition coefficient less than one would prefer the liquid phase. A low split coefficient system that initially had high levels of ECL portions within the vehicle would lose portions to the surrounding liquid phase.

[000111] Em algumas modalidades, o coeficiente de divisão entre o veículo e um solvente aquoso é maior do que cerca de 2. em algumas modalidades, o coeficiente de divisão entre o veículo e um solvente aquoso é maior do que cerca de 10. Em algumas modalidades, o coeficiente de divisão entre o veículo e um solvente aquoso é maior do que cerca 100. Há vários projetos químicos e físicos para obter um coeficiente de divisão elevado. (1) A porção pode ser mantida pelo veículo por atração coulômbica. Em tal coso, a porção de ECL pode ter uma carga positiva líquida e o veículo tem uma carga negativa líquida. (2) Em algumas modalidades, a solubilidade da porção de ECL pode ser muito maior na fase do veículo. Por exemplo, a porção de ECL não é solúvel em água e é solúvel em um veículo de poliestireno lipofílico. (3) Em algumas modalidades, a porção de ECL pode ser capturada dentro do veículo por que a porosidade microscópica do veículo é menor do que o diâmetro da porção. (4) em algumas modalidades, a porção pode ser ligada ao veículo através de ligações covalentes.[000111] In some embodiments, the partition coefficient between the vehicle and an aqueous solvent is greater than about 2. In some embodiments, the partition coefficient between the vehicle and an aqueous solvent is greater than about 10. In In some embodiments, the partition coefficient between the vehicle and an aqueous solvent is greater than about 100. There are various chemical and physical designs to obtain a high partition coefficient. (1) The portion can be held by the vehicle by Coulombic attraction. In such a case, the ECL portion may have a net positive charge and the vehicle has a net negative charge. (2) In some embodiments, the solubility of the ECL moiety may be much greater in the carrier phase. For example, the ECL portion is not soluble in water and is soluble in a lipophilic polystyrene vehicle. (3) In some embodiments, the ECL portion can be captured within the vehicle because the microscopic porosity of the vehicle is smaller than the diameter of the portion. (4) in some embodiments, the moiety can be linked to the carrier through covalent bonds.

F. Methods for Detecting an Analyte of Interest.

[000112] A invenção fornece vários métodos de detecção de um analito de interesse contido dentro de uma amostra. Em algumas modalidades da invenção, o analito de interesse pode ser ligado a um veículo, por exemplo, um primeiro veículo. O analito de interesse pode estar presente na superfície do veículo desse modo facilitando seu acesso a um par de ligações específico. Em algumas modalidades, o analito de interesse não pode estar ligado a qualquer veículo. Em algumas modalidades, o analito de interesse pode estar presente na solução.[000112] The invention provides various methods of detecting an analyte of interest contained within a sample. In some embodiments of the invention, the analyte of interest may be linked to a carrier, e.g., a first carrier. The analyte of interest may be present on the surface of the vehicle, thereby facilitating its access to a specific bond pair. In some embodiments, the analyte of interest may not be bound to any vehicle. In some embodiments, the analyte of interest may be present in the solution.

[000113] Os métodos da invenção provêm a subsistência de pelo menos um par de ligações específico capaz de se ligar específicamente ao analito de interesse. Em algumas modalidades, pelo menos um par de ligações específico pode ser ligado a um portado. Nesta modalidade a amostra pode ser ligada a um segundo veículo.[000113] The methods of the invention provide for the existence of at least one specific pair of bonds capable of specifically binding to the analyte of interest. In some embodiments, at least one specific bond pair may be linked to a portage. In this embodiment, the sample can be connected to a second vehicle.

[000114] Em algumas modalidades, pelo menos um par de ligações específico pode ser uma proteína de ligação capaz de específicamente se ligar à molécula de interesse. O par de ligações pode ser ligado a um veículo. Nesta modalidade a amostra pode ser ligada a um segundo veículo.[000114] In some embodiments, at least one specific bond pair may be a binding protein capable of specifically binding to the molecule of interest. The connection pair can be connected to a vehicle. In this embodiment, the sample can be connected to a second vehicle.

[000115] Em algumas modalidades, pelo menos um par de ligações específico pode ser um oligonucleotídeo ou um ácido nucléico capaz de se ligar específicamente ao analito de interesse. O par de ligações pode estar ligado a um veículo. Nesta modalidade a amostra pode ser ligada a um segundo veículo.[000115] In some embodiments, at least one specific bond pair may be an oligonucleotide or nucleic acid capable of specifically binding to the analyte of interest. The bond pair may be connected to a vehicle. In this embodiment, the sample can be connected to a second vehicle.

[000116] Em algumas modalidades, a invenção prover a subsistência de dois pares de ligações específicos, isto é, um primeiro e um segundo par de ligações específico, ambos dos quais específicamente se ligam ao analito de interesse. Os dois pares de ligações específicos podem ambos estar ligado a um veículo. Desse modo, em certas modalidades, um primeiro par de ligações específico pode ser ligado a um primeiro veículo, e um segundo par de ligações específico pode ser ligado a um segundo veículo. Nesta modalidade, a amostra não pode ser ligada a qualquer veículo. É também contemplados que o mesmo par de ligações específico possa ser ligado a ambos os primeiro e segundo veículos. Em algumas modalidades, um anticorpo policlonal que se ligado específicamente o analito de interesse pode ser ligado a ambos os primeiro e segundo veículos. Em algumas modalidades, o analito de interesse pode conter cópias múltiplas de um epítopo reconhecido por um anticorpo monoclonal ou, onde o analito é um ácido nucléico, pode conter repetições múltiplas de uma seqüência reconhecida por uma sonda ligada a ambos primeiro e segundo veículos. Em certas modalidades, pelo menos um dos pares de ligações específico pode ser um anticorpo. É também contemplado que ambos os pares de ligação específicos possam ser anticorpos. A invenção também abrange modalidades em que um par de ligações específico pode ser um anticorpo e um segundo par de ligações específico pode ser uma proteína de ligação específica.[000116] In some embodiments, the invention provides for the subsistence of two specific bond pairs, that is, a first and a second specific bond pair, both of which specifically bind to the analyte of interest. The two specific connection pairs can both be connected to a vehicle. Thus, in certain embodiments, a specific first bond pair may be attached to a first carrier, and a specific second bond pair may be bonded to a second carrier. In this modality, the sample cannot be connected to any vehicle. It is also contemplated that the same specific connection pair may be connected to both the first and second vehicles. In some embodiments, a polyclonal antibody that specifically binds the analyte of interest can be linked to both the first and second carriers. In some embodiments, the analyte of interest may contain multiple copies of an epitope recognized by a monoclonal antibody or, where the analyte is a nucleic acid, may contain multiple repeats of a sequence recognized by a probe linked to both the first and second carriers. In certain embodiments, at least one of the specific binding pairs may be an antibody. It is also contemplated that both specific binding pairs may be antibodies. The invention also encompasses embodiments in which a specific binding pair may be an antibody and a second specific binding pair may be a specific binding protein.

[000117] Em algumas modalidades, pelo menos um par de ligações específico pode ser um oligonucleotídeo que hibridiza com a molécula de interesse na amostra. Como com os anticorpos, é contemplado que ambos pares de ligações específicos podem ser oligonucleotídeos ou outros ácidos nucléicos que hibridizam com a molécula de interesse na amostra.[000117] In some embodiments, at least one specific bond pair may be an oligonucleotide that hybridizes to the molecule of interest in the sample. As with antibodies, it is contemplated that both specific bond pairs may be oligonucleotides or other nucleic acids that hybridize to the molecule of interest in the sample.

[000118] As porções de ECL podem ser detectadas por métodos bem conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, espectroscopia de emissão e absorção, por exemplo, absorção ultravioleta, absorção infravermelha, e emissões de fluorescência; absorção atômica, eletroquímica, por exemplo, voltametria de extração anódica; ativação de nêutron e métodos químicos. Em certas modalidades, os métodos de fotoluminescência, quimioluminescência e eletroquimiolumines- cência são empregados. Em algumas modalidades da invenção, a presença da porção química pode ser determinada por indução da porção de ECL para emitir radiação eletromagnética e detectar a radiação emitida. Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL pode ser induzida a emitir radiação eletromagnética expondo-se a mistura de reagente à energia química, eletroquímica ou eletromagnética. Em algumas modalidades da invenção, a porção de ECL pode ser induzida a emitir radiação eletromagnética expondo-se a mistura de reagente à energia química ou eletroquímica. Em certas modalidades um co-reagente é adicionado para auxiliar na detecção da porção de ECL, por exemplo, TprA.[000118] ECL portions can be detected by methods well known in the art including, for example, emission and absorption spectroscopy, for example, ultraviolet absorption, infrared absorption, and fluorescence emissions; atomic absorption, electrochemistry, e.g. anodic extraction voltammetry; neutron activation and chemical methods. In certain embodiments, photoluminescence, chemiluminescence and electrochemiluminescence methods are employed. In some embodiments of the invention, the presence of the chemical moiety can be determined by inducing the ECL moiety to emit electromagnetic radiation and detecting the emitted radiation. In some embodiments of the invention, the ECL portion can be induced to emit electromagnetic radiation by exposing the reactant mixture to chemical, electrochemical or electromagnetic energy. In some embodiments of the invention, the ECL portion can be induced to emit electromagnetic radiation by exposing the reactant mixture to chemical or electrochemical energy. In certain embodiments a coreactant is added to aid in the detection of the ECL moiety, e.g., TprA.

[000119] Ru(bpy)32+ pode ser determinado em concentrações muito baixas empregando técnicas de luminescência. Empregando o método de redução oxidativa, é possível detectar Ru(bpy)32+ em concentrações de 5 x 10-8 M. O oxalato de sódio (1 mM) em tampão de fosfato pH 5,0, pode ser empregado com um potencial pulsado em 0 a +1,4 voltes versus um eletrodo de referência calomel saturado durante intervalos de 5 a 10 segundos. Empregando 18 mM de Na2S2O8 e 0,1 M de tetrafluoroborato de amônio de tetra-n-butila em CH3CN: H2O (1:1 volume/volume), concentrações de Ru(bpy)32+ tão baixas quanto 10-13 M podem ser detectadas (veja, por exemplo, Patente U.S. N°s. 6.140.138; 5.731.089; 5.714.089).[000119] Ru(bpy)32+ can be determined at very low concentrations using luminescence techniques. Using the oxidative reduction method, it is possible to detect Ru(bpy)32+ in concentrations of 5 x 10-8 M. Sodium oxalate (1 mM) in phosphate buffer pH 5.0 can be used with a pulsed potential at 0 to +1.4 volts versus a saturated calomel reference electrode for 5 to 10 second intervals. By employing 18 mM Na2S2O8 and 0.1 M tetra-n-butyl ammonium tetrafluoroborate in CH3CN:H2O (1:1 volume/volume), Ru(bpy)32+ concentrations as low as 10-13 M can be detected (see, for example, U.S. Patent Nos. 6,140,138; 5,731,089; 5,714,089).

[000120] A presente invenção também fornece métodos para empregar porções de ECL em ensaios para detectar um analito de interesse que compreende: (a) formar um complexo tendo a formula: (A)K, (B)u, (C), (D)x onde, em certas modalidades, A é uma porção de ECL que pode ser induzida a repetidamente emitir radiação eletromagnética por exposição direta a uma fonte de energia eletroquímica; B é um primeiro veículo (ligado a uma par de ligações específico do analito de interesse) que está associado com A; C é uma amostra que pode conter o analito de interesse, B sendo ligado ao analito de interesse através do par de ligações do analito de interesse; e D é um segundo veículo que pode ser diretamente ligado ao analito de interesse ou ligado ao analito de interesse através de um segundo par de ligações específico do analito de interesse; k, u, e x são cada um número inteiro igual a ou maior do que 1; (b) separar o complexo formado em (a) de outros componentes da composição; (c)induzir a porção de ECL à repetidamente emitir radiação eletromagnética diretamente expondo-se a porção à energia eletroquímica; e (d) detectar a radiação eletromagnética emitida e desse modo determinar a presença do analito de interesse.[000120] The present invention also provides methods for employing ECL moieties in assays to detect an analyte of interest comprising: (a) forming a complex having the formula: (A)K, (B)u, (C), ( D)x where, in certain embodiments, A is a portion of ECL that can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; B is a first vehicle (linked to a specific bond pair of the analyte of interest) that is associated with A; C is a sample that may contain the analyte of interest, B being linked to the analyte of interest through the bond pair of the analyte of interest; and D is a second carrier that can be directly linked to the analyte of interest or linked to the analyte of interest through a second pair of bonds specific to the analyte of interest; k, u, and x are each an integer equal to or greater than 1; (b) separate the complex formed in (a) from other components of the composition; (c) inducing the ECL portion to repeatedly emit electromagnetic radiation directly by exposing the portion to electrochemical energy; and (d) detect the emitted electromagnetic radiation and thereby determine the presence of the analyte of interest.

[000121] Em certas modalidades, o método da invenção pode ser um ensaio de ligação competitivo, por exemplo, um ensaio de inibição competitivo (veja, por exemplo, Janeway e outros, Immunobiology, Garland Publishing, Nova York 2001). Em algumas modalidades deste ensaio, uma quantidade conhecida do analito de interesse ou um análogo do analito de interesse pode ser ligado (o termo "ligado" compreende ambas ligações covalente e não covalentes) a um veículo que não compreende uma porção de ECL, por exemplo, uma conta magnética. Um par de ligações para o analito de interesse pode ser ligado a um segundo veículo, por exemplo, uma conta de poliestireno, que compreende uma porção de ECL. Na ausência de analito adicionado de interesse, um complexo se formará entre o analito de interesse ligado ao primeiro veículo e o par de ligações para o analito de interesse ligado ao segundo veículo, efetivamente ligando o primeiro veículo ao segundo veículo. A quantidade de porção de ECL associada com este complexo pode ser medida por técnicas conhecidas na técnica. A presença do analito de interesse em uma amostra pode então ser detectada por sua capacidade de diminuir a quantidade de complexo formado por competição com a molécula ligado ao veículo de interesse para ligação ao par de ligações ligado ao segundo veículo. Em certas modalidades, a quantidade do analito de interesse em uma amostra pode ser quantificada por comparação com curvas padrões empregando amostras compreendendo quantidades conhecidas da molécula de interesse.[000121] In certain embodiments, the method of the invention may be a competitive binding assay, for example, a competitive inhibition assay (see, for example, Janeway et al., Immunobiology, Garland Publishing, New York 2001). In some embodiments of this assay, a known amount of the analyte of interest or an analogue of the analyte of interest may be bound (the term "bound" includes both covalent and noncovalent bonds) to a carrier that does not comprise an ECL moiety, e.g. , a magnetic bead. A pair of bonds for the analyte of interest can be linked to a second carrier, for example, a polystyrene bead, which comprises a portion of ECL. In the absence of added analyte of interest, a complex will form between the analyte of interest bound to the first vehicle and the bond pair for the analyte of interest bound to the second vehicle, effectively linking the first vehicle to the second vehicle. The amount of ECL moiety associated with this complex can be measured by techniques known in the art. The presence of the analyte of interest in a sample can then be detected by its ability to decrease the amount of complex formed by competition with the molecule bound to the vehicle of interest for binding to the bond pair attached to the second vehicle. In certain embodiments, the amount of the analyte of interest in a sample can be quantified by comparison with standard curves employing samples comprising known amounts of the molecule of interest.

[000122] Em algumas modalidades, a invenção fornece um ensaio de ligação do tipo sanduíche para detectar um analito de interesse. Em algumas modalidades deste ensaio, um primeiro par de ligações do analito de interesse pode ser ligado a um primeiro veículo, por exemplo, uma conta magnética. Um segundo par de ligações do analito de interesse pode ser ligado a um segundo veículo, por exemplo, uma conta poliestireno, que pode compreender uma porção de ECL. Na presença de uma amostra contendo o analito de interesse, os complexos compreendendo ambos o primeiro veículo e o segundo veículo podem se formar. A quantidade de porção de ECL associada com este complexo, que é proporcional a quantidade do material biológico de interesse na amostra, pode ser medida por técnicas conhecidas na técnica. Em certas modalidades, a quantidade do analito de interesse em uma amostra pode ser quantificada por comparação com curvas padrões empregando amostras compreendendo quantidades conhecidas da molécula de interesse.[000122] In some embodiments, the invention provides a sandwich-type binding assay to detect an analyte of interest. In some embodiments of this assay, a first bond pair of the analyte of interest may be attached to a first carrier, e.g., a magnetic bead. A second bond pair of the analyte of interest may be linked to a second carrier, for example, a polystyrene bead, which may comprise a portion of ECL. In the presence of a sample containing the analyte of interest, complexes comprising both the first vehicle and the second vehicle can form. The amount of ECL portion associated with this complex, which is proportional to the amount of biological material of interest in the sample, can be measured by techniques known in the art. In certain embodiments, the amount of the analyte of interest in a sample can be quantified by comparison with standard curves employing samples comprising known amounts of the molecule of interest.

[000123] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de ligação direta para detectando um analito de interesse em uma amostra. Em algumas modalidades deste método, as moléculas na amostra podem ser ligadas a um primeiro veículo, por exemplo, uma conta magnética. Um par de ligações do analito de interesse pode ser ligado a um segundo veículo, por exemplo, uma conta poliestireno, que pode compreende uma porção de ECL. Se uma amostra contém o analito de interesse, os complexos compreendendo ambos primeiro veículo e segundo veículo podem se formar. A quantidade de porção de ECL associada com este complexo, que é proporcional à quantidade do material biológico de interesse na amostra, pode ser medida por técnicas conhecidas na técnica. Em certas modalidades, a quantidade do analito de interesse em uma amostra pode ser quantificada por comparação com curvas padrões empregando amostras compreendendo quantidades conhecidas da molécula de interesse.[000123] In some embodiments, the invention provides a direct binding method for detecting an analyte of interest in a sample. In some embodiments of this method, molecules in the sample may be attached to a first carrier, e.g., a magnetic bead. A bond pair of the analyte of interest may be linked to a second carrier, for example, a polystyrene bead, which may comprise a portion of ECL. If a sample contains the analyte of interest, complexes comprising both first vehicle and second vehicle can form. The amount of ECL portion associated with this complex, which is proportional to the amount of biological material of interest in the sample, can be measured by techniques known in the art. In certain embodiments, the amount of the analyte of interest in a sample can be quantified by comparison with standard curves employing samples comprising known amounts of the molecule of interest.

[000124] Muitas variações destes tipos de ensaios de ligação são conhecidas por aqueles versados na técnica e são compatíveis com os métodos da invenção.[000124] Many variations of these types of binding assays are known to those skilled in the art and are compatible with the methods of the invention.

[000125] Existem muitos métodos para quantificar a quantidade de porção de ECL presente. A taxa de consumo de energia no sistema pode fornecer uma medida da porção de ECL. As medições adequadas incluem, por exemplo, medições de correntes elétricas onde a porção de ECL é eletroquimicamente excitada, a taxa de utilização do oxidante ou redutor quando a porção de ECL é quimicamente excitada, ou medições da absorção de energia eletromagnética em técnicas fotoluminescentes. A porção de ECL pode também ser detectada medindo-se a radiação eletromagnética emitida. Todas estas medições podem ser feitas ou como medições com base na taxa, contínuas, ou como métodos cumulativos que acumulam o sinal durante um período longo de tempo. As medições com base na taxa podem ser feitas empregando tubos fotomultiplicadores, fotodíodos, ou fototransistores que produzem correntes elétricas proporcionais em magnitude à intensidade de luz incidente. Os métodos acumulativos podem envolver a integração de dados com base em taxa ou o uso de filme fotográfico para fornecer diretamente os dados acumulativos.[000125] There are many methods to quantify the amount of ECL portion present. The power consumption rate in the system can provide a measure of the ECL portion. Suitable measurements include, for example, measurements of electrical currents where the ECL portion is electrochemically excited, the rate of oxidant or reductant utilization when the ECL portion is chemically excited, or measurements of the absorption of electromagnetic energy in photoluminescent techniques. The ECL portion can also be detected by measuring the emitted electromagnetic radiation. All of these measurements can be made either as continuous, rate-based measurements, or as cumulative methods that accumulate the signal over a long period of time. Rate-based measurements can be made employing photomultiplier tubes, photodiodes, or phototransistors that produce electrical currents proportional in magnitude to the incident light intensity. Cumulative methods may involve rate-based data integration or the use of photographic film to directly provide cumulative data.

[000126] A invenção também prover a subsistência da isolação de um complexo compreendendo a analito de interesse, pelo menos um veículo, e uma porção de ECL. Em algumas modalidades, um campo magnético pode ser empregado para separa o complexo, por exemplo, quando o pelo menos um veículo é uma conta magnética. Em algumas modalidades, a separação do complexo pode ser obtida por precipitação, por exemplo, pela força da gravidade quando a massa do complexo é maior do que a massa dos componentes individuais. Em algumas modalidades, um filtro pode ser empregado para separar o complexo de outros componentes da composição. O filtro pode, por exemplo, ter um tamanho de poro pequeno o suficiente para manter o complexo, porém grande o suficiente para permitir material não complexo passar através dele. Em algumas modalidades, uma coluna de exclusão de tamanho pode ser empregada para separar o complexo. Outras propriedades que distinguem o complexo de outros componentes da composição podem também ser empregadas, por exemplo, hidrofobicidade ou afinidade para outros pares de ligações.[000126] The invention also provides for the subsistence of the isolation of a complex comprising the analyte of interest, at least one vehicle, and a portion of ECL. In some embodiments, a magnetic field may be employed to separate the complex, for example, when the at least one vehicle is a magnetic bead. In some embodiments, separation of the complex can be achieved by precipitation, for example, by the force of gravity when the mass of the complex is greater than the mass of the individual components. In some embodiments, a filter may be employed to separate the complex from other components of the composition. The filter may, for example, have a pore size small enough to hold the complex, but large enough to allow non-complex material to pass through. In some embodiments, a size exclusion column may be employed to separate the complex. Other properties that distinguish the complex from other components of the composition may also be employed, for example, hydrophobicity or affinity for other bond pairs.

G. Diseases and Conditions

[000127] Em certas modalidades o analito de interesse pode ser um marcador associado com uma doença ou condição. A invenção desse modo fornece um método de detectar um marcador associado com uma doença ou condição e desse modo diagnosticar um indivíduo tendo uma doença ou condição. Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para monitorar a progressão de uma doença ou condição monitorando-se a presença ou quantidade de um marcador associado com uma doença ou condição. Em algumas modalidades a invenção fornece um método para monitorar a eficácia da terapia empregada para tratar uma doença ou condição monitorando-se a presença ou quantidade de um marcador associado com uma doença ou condição.[000127] In certain embodiments the analyte of interest may be a marker associated with a disease or condition. The invention thus provides a method of detecting a marker associated with a disease or condition and thereby diagnosing an individual having a disease or condition. In some embodiments, the invention provides a method for monitoring the progression of a disease or condition by monitoring the presence or amount of a marker associated with a disease or condition. In some embodiments the invention provides a method for monitoring the effectiveness of therapy employed to treat a disease or condition by monitoring the presence or amount of a marker associated with a disease or condition.

[000128] A doença ou condição pode incluir uma doença infecciosa causada por um agente infeccioso, por exemplo, bactérias, fungos, parasitas, vírus, ou priônios. Os exemplos de patógenos bacterianos incluem B. anthracis, E. Coli, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. bovis, S. agalactiae, S. aureus, S. epidermidis N. meningitidis, M. tuberculosis. Os exemplos de infecções virais incluem varíola, síndrome respiratória aguda grave (SARS), vírus a imunodeficiência humana (HIV), vírus Epstein-Barr (EBV), hepatite B, hepatite C, rinovírus, gripe, vírus sincicial respiratório (RSV), sarampo, pólio, vírus do herpes simples-1 (HSV-1) e vírus do herpes simples- 2 (HSV-2). Os exemplos de parasitas incluem Plasmodium falparun, P. vivax, P. malaria, Toxoplasma gondii. Trypanosoma cruzi, e Giardia lamblia.[000128] The disease or condition may include an infectious disease caused by an infectious agent, for example, bacteria, fungi, parasites, viruses, or prions. Examples of bacterial pathogens include B. anthracis, E. Coli, S. pneumoniae, S. pyogenes, S. bovis, S. agalactiae, S. aureus, S. epidermidis, N. meningitidis, M. tuberculosis. Examples of viral infections include smallpox, severe acute respiratory syndrome (SARS), human immunodeficiency virus (HIV), Epstein-Barr virus (EBV), hepatitis B, hepatitis C, rhinovirus, influenza, respiratory syncytial virus (RSV), measles , polio, herpes simplex virus-1 (HSV-1) and herpes simplex virus-2 (HSV-2). Examples of parasites include Plasmodium falparun, P. vivax, P. malaria, Toxoplasma gondii. Trypanosoma cruzi, and Giardia lamblia.

[000129] A doença pode ser câncer ou uma doença auto-imune. Os marcadores associados com vários cânceres que podem ser analitos de interesse, incluem cinase dependente de ciclina mutante 4 de melanoma; proteína p 17 de melanoma; gp 100 de melanoma; antígeno-1 associado ao melanoma (MART-1) (Melan-A) de melanoma (publicação PCT WO 94/21126); proteína p 15 de melanoma; tirosinase de melanoma (publicação PCT WO 94/14459); antígeno associado ao melanoma (MAGE) 1, 2 e 3 de melanoma, câncer pulmonar de pequenas células, medular tireóide, câncer de células escamosa bronquial e/ou do colón (PCT/US92/04354); antígeno-Xp associado ao melanoma (MAGE-Xp) (Patente U.S. N° 5.587.289); antígeno de melanoma B (BAGE) de bexiga, melanoma, carcinoma de células escamosas e do seio (Patente U.S. N° 5.571.711 e pedido PCT WO 95/00159); antígeno G (GAGE) (Patente U.S. N° 5.610.013 e pedido PCT WO 95/03422); família de antígeno de tumor renal (RAGE) (Patente U.S. N° 5.939.526); antígeno preferencialmente expressado em melanoma (PRAME) (anteriormente DAGE; PCT pedido WO 96/10577); proteína mutada ubíqua de melanoma (MUM- 1/LB-33B) (Patente U.S. N° 5.589.334); proteína amplificada de neuroblastoma (NAG) (Patente U.S. N° 5.821.122); FB5 (endosialin) (Patente U.S. N° 6.217.868); PSMA (antígeno de membrana específica de próstata) (Patente U.S. N° 5.935.818); gp75 de melanoma; antígeno oncofetal de melanoma; carboidrato/lipídios tal como mucina de câncer de mama, pâncreas, e ovariano; gangliosídeos GM2 e GD2 de melanoma; oncogenes tal como mutante p53 de carcinoma; mutante ras de câncer de cólon; protooncogene de homólogo de oncogene viral de leucemia eritroblástica 2 (HER2/neu) de carcinoma de mama; e produtos virais tal como proteínas humanas de papilomavírus de cânceres de célula escamosa da cerviz e esôfago. Os marcadores associados com doenças autoimunes incluem anticorpos que específicamente ligam a cromatina associada com o lúpus eritematoso sistêmico, a presença de antígeno leucócito humano (HLA) alelo DR2 (associado com esclerose múltipla), DR3 (associado com doenças de Graves) ou DR4 associado com artrite reumatóide (Janeway e outros, Immunobiology, Garland Pedido, Nova York 2001).[000129] The disease may be cancer or an autoimmune disease. Markers associated with several cancers that may be analytes of interest include melanoma mutant cyclin-dependent kinase 4; melanoma p17 protein; melanoma gp 100; melanoma-associated antigen-1 (MART-1) (Melan-A) of melanoma (PCT publication WO 94/21126); melanoma p15 protein; melanoma tyrosinase (PCT publication WO 94/14459); melanoma-associated antigen (MAGE) 1, 2 and 3 of melanoma, small cell lung cancer, medullary thyroid cancer, bronchial and/or colon squamous cell cancer (PCT/US92/04354); melanoma-associated antigen-Xp (MAGE-Xp) (U.S. Patent No. 5,587,289); B melanoma antigen (BAGE) of bladder, melanoma, squamous cell and breast carcinoma (U.S. Patent No. 5,571,711 and PCT application WO 95/00159); G antigen (GAGE) (U.S. Patent No. 5,610,013 and PCT application WO 95/03422); renal tumor antigen (RAGE) family (U.S. Patent No. 5,939,526); preferentially expressed antigen in melanoma (PRAME) (formerly DAGE; PCT application WO 96/10577); melanoma ubiquitous mutated protein (MUM-1/LB-33B) (U.S. Patent No. 5,589,334); amplified neuroblastoma protein (NAG) (U.S. Patent No. 5,821,122); FB5 (endosialin) (U.S. Patent No. 6,217,868); PSMA (prostate-specific membrane antigen) (U.S. Patent No. 5,935,818); melanoma gp75; melanoma oncofetal antigen; carbohydrate/lipids such as mucin from breast, pancreatic, and ovarian cancer; melanoma GM2 and GD2 gangliosides; oncogenes such as carcinoma mutant p53; colon cancer ras mutant; breast carcinoma erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (HER2/neu) protooncogene; and viral products such as human papillomavirus proteins from squamous cell cancers of the cervix and esophagus. Markers associated with autoimmune diseases include antibodies that specifically bind to chromatin associated with systemic lupus erythematosus, the presence of human leukocyte antigen (HLA) allele DR2 (associated with multiple sclerosis), DR3 (associated with Graves' disease), or DR4 associated with rheumatoid arthritis (Janeway et al., Immunobiology, Garland Order, New York 2001).

H. Kits

[000130] Em certas modalidades, a invenção fornece um kit para detectar um analito de interesse em uma amostra. O kit pode compreender um primeiro veículo compreendendo pelo menos uma porção de ECL. Um segundo veículo, pelo menos um par de ligações específicas do analito de interesse ligado à pelo menos um dos primeiro e segundo veículos, pelo menos um recipiente, e, opcionalmente instruções. Em certas modalidades o kit pode compreender 2 ou mais porções de ECL.[000130] In certain embodiments, the invention provides a kit for detecting an analyte of interest in a sample. The kit may comprise a first vehicle comprising at least a portion of ECL. A second carrier, at least one pair of analyte-specific bonds of interest attached to at least one of the first and second carriers, at least one container, and optionally instructions. In certain embodiments the kit may comprise 2 or more portions of ECL.

Examples

[000131] Substâncias Químicas e Materiais: Hexaidrato de cloreto de tris(2,2'-bipiridil)rutênio(II) (Ru(bpy)sCl2^6H2O), ácido trifluoroacético (TFAA, 99%), tetrafluoroborato de prata (AgBF4, 98%), e tri-n- propilamina (TPrA, 99+%) obtidos de Aldrich (Milwaukee, Wl); lítio tetracis (pentafluorofenil)borato (Li [(B(C6F5>4)]^n Et2O, n = 23) obtidos de Boulder Scientific Co. (Mead, CO); tetrafluoroborato de tetrabutilamônio ((TBA)BF4, grau eletroquímico) obtido de Fluka (Milwaukee, Wl); tris(hidroximetil)aminometano (Tris, ultrapuro) de Life Technologies (Rockville, MD); cloridrato de carbodiimida de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) (EDAC, SigmaUltra), N-hidroxissucinimida (NHS), biotina de fluoresceína (90%), 1-metilimidazol, e tampão de hibridização de DNA (PerfectHyb(TM) plus) obtido de Sigma (St. Louis, MO); hidróxido de sódio (GR), ácido clorídrico (GR), cloreto de sódio (GR), éter de etila (anidroso), acetonitrila (HPLC), tetraidrofurano (THF, GR), e ácido etilenodinitrilotetraacético (EDTA) obtido de EM (Gibbstown, NJ); avidina (NeutrAvidin), D-biotina (ImmunoPure®), e biotin-PEO-LC-amina obtida de Pierce (Rockford, IL); e metanol (grau espectroanalizado) obtido de Fisher (Fairlawn, NJ) foram empregados sem outra purificação a menos que de outro modo declarado. As microesferas/contas de poliestireno de carboxilato (PSB, 10 µm em diâmetro, 2,6% (peso/peso) de suspensão aquosa com 6,5x104 contas/µL) e contas de poliestireno superparamagnéticas revestidas de estreptavidina (referidas como contas magnéticas ou MB, (a) 1,0 µm em diâmetro, 10 mg/mL de suspensão aquosa com ~9,5xl06 contas/µL; (b) 2,8 µm em diâmetro, 10 mg/mL de suspensão aquosa com ~6,5x105 contas/µL) foram adquiridos de PolySciences Inc. (Warington, PA) e Dynal Biotech Inc. (Lake Success, NY), respectivamente. Os oligonucleotídeos de DNA de filamento único 23- mer sintético (ssDNA) derivados do Bacillus anthacis (Ba813) foram obtidos de Qiagen Operon (Alameda, CA) e tiveram as seguintes seqüências: (a) sonda, 5'- [biotin-TEG]-AACGA TAGCT CCTAC ATTTG GAG-3' (p-ss-DNA, M.W. = 7617 g/mol; SEQ ID NO: 1 ); (b) alvo ou complementar, 5'- [biotin-TEG]-CTCCA AATGT AGGAG CTATC GTT-3' (t-ssDNA, M.W. = 7608 g/mol; SEQ ID NO: 2); (c) não complementar, 5'- [biotin-TEG]- TTAAC ACCTT AGCGA CGGCT AGT-3' (nc-ssDNA, M.W. = 7593 g/mol; SEQ ID NO: 3); e (d) seqüência de oligômero de ligação imperfeita de 2 pares de base, 5'- [biotin-TEG]- CTCCA AACGT AGGAG TTATC GTT-3' (2-bp-m-ssDNA; SEQ ID NO: 4), nas quais biotin-TEG continha um espaçador de polaridade misturado de 16 átomos com base em um trietileno glicol e empregado para reduzir o bloqueio estérico entre o DNA biotinilado e as interação de avidina/estreptavidina confinadas de superfície. A menos que de outro modo declarado, todas as soluções foram recentemente preparadas com 18 M [Omega]-cm deionizado MiIIi-Q water (Millipore Corp., Bedford, MA).[000131] Chemicals and Materials: Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) chloride hexahydrate (Ru(bpy)sCl2^6H2O), trifluoroacetic acid (TFAA, 99%), silver tetrafluoroborate (AgBF4, 98%), and tri-n-propylamine (TPrA, 99+%) obtained from Aldrich (Milwaukee, WI); lithium tetracis (pentafluorophenyl)borate (Li[(B(C6F5>4)]^n Et2O, n = 23) obtained from Boulder Scientific Co. (Mead, CO); tetrabutylammonium tetrafluoroborate ((TBA)BF4, electrochemical grade) obtained from Fluka (Milwaukee, WI); tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris, ultrapure) from Life Technologies (Rockville, MD); 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDAC, SigmaUltra), N- hydroxysuccinimide (NHS), fluorescein biotin (90%), 1-methylimidazole, and DNA hybridization buffer (PerfectHyb(TM) plus) obtained from Sigma (St. Louis, MO); sodium hydroxide (GR), hydrochloric acid (GR), sodium chloride (GR), ethyl ether (anhydrous), acetonitrile (HPLC), tetrahydrofuran (THF, GR), and ethylenedinitrilotetraacetic acid (EDTA) obtained from EM (Gibbstown, NJ); avidin (NeutrAvidin), D-biotin (ImmunoPure®), and biotin-PEO-LC-amine obtained from Pierce (Rockford, IL); and methanol (spectroanalyzed grade) obtained from Fisher (Fairlawn, NJ) were used without further purification unless otherwise noted. declared. Carboxylate polystyrene microspheres/beads (PSB, 10 µm in diameter, 2.6% (w/w) aqueous suspension with 6.5x10 beads/µL) and streptavidin-coated superparamagnetic polystyrene beads (referred to as magnetic beads or MB, (a) 1.0 µm in diameter, 10 mg/mL aqueous suspension with ~9.5xl06 beads/µL; (b) 2.8 µm in diameter, 10 mg/mL aqueous suspension with ~6.5x105 beads/μL) were purchased from PolySciences Inc. (Warington, PA) and Dynal Biotech Inc. (Lake Success, NY), respectively. Synthetic 23-mer single-stranded DNA (ssDNA) oligonucleotides derived from Bacillus anthacis (Ba813) were obtained from Qiagen Operon (Alameda, CA) and had the following sequences: (a) probe, 5'-[biotin-TEG] -AACGA TAGCT CCTAC ATTTG GAG-3' (p-ss-DNA, M.W. = 7617 g/mol; SEQ ID NO: 1 ); (b) target or complementary, 5'-[biotin-TEG]-CTCCA AATGT AGGAG CTATC GTT-3' (t-ssDNA, M.W. = 7608 g/mol; SEQ ID NO: 2); (c) non-complementary, 5'- [biotin-TEG]- TTAAC ACCTT AGCGA CGGCT AGT-3' (nc-ssDNA, M.W. = 7593 g/mol; SEQ ID NO: 3); and (d) 2 base pair imperfect binding oligomer sequence, 5'-[biotin-TEG]-CTCCA AACGT AGGAG TTATC GTT-3' (2-bp-m-ssDNA; SEQ ID NO: 4), in which biotin-TEG contained a 16-atom mixed polarity spacer based on a triethylene glycol and employed to reduce steric hindrance between biotinylated DNA and surface-confined avidin/streptavidin interactions. Unless otherwise stated, all solutions were freshly prepared with 18 M [Omega]-cm deionized MiIIIi-Q water (Millipore Corp., Bedford, MA).

[000132] Medições Eletroquímicas e de ECL. Um sistema de célula de três eletrodos foi usado, com um disco de Pt de 2,2 mm de diâmetro, disco de carbono vítreo (GC) de 3,0 mm de diâmetro como o eletrodo de funcionamento, um arame de Pt como o contra-eletrodo e um Ag/Ag+ (10 mM de AgBF4 e 50 mM de TBABF4 em MeCN) como o eletrodo de referência. Todos os eletrodos foram cuidadosamente limpos antes de cada experimento. As etapas de limpeza incluíram: imergir os eletrodos de funcionamento em uma solução de ácido cômico , polir com uma pasta fluida de alumina de 0,05 µm (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL), lavar com quantidades abundantes de água, enxaguar com MeCN, e substituir a ponta de Vycor porosa e o tubo de vidro para o eletrodo de referência. Um frasco de vidro descartável de 5 mL funcionou como a célula eletroquímica. Para excluir a possibilidade do sinal de ECL ser gerado de um sistema contaminado por Ru(bpy)32+, artigos de vidro virgem e eletrodos foram empregados assim que necessário. As intensidades de ECL, junto com os voltamogramas cíclicos (CV), foram medidas simultaneamente com um potencioestato home-built combinado com um tubo fotomultiplicador (PMT, Hamamatsu R4220p, Japão) instalado sob a célula eletroquímica. Uma voltagem de -750 V foi fornecida ao PMT com um fornecimento de força de alta voltagem (Bertan High Voltage Corp., Series 225, Hicksville, NY).[000132] Electrochemical and ECL measurements. A three-electrode cell system was used, with a 2.2 mm diameter Pt disk, 3.0 mm diameter glassy carbon (GC) disk as the working electrode, a Pt wire as the counter -electrode and an Ag/Ag+ (10 mM AgBF4 and 50 mM TBABF4 in MeCN) as the reference electrode. All electrodes were carefully cleaned before each experiment. Cleaning steps included: immersing the working electrodes in a comic acid solution, polishing with a 0.05 µm alumina slurry (Buehler Ltd., Lake Bluff, IL), washing with copious amounts of water, rinsing with MeCN, and replace the porous Vycor tip and glass tube for the reference electrode. A 5 mL disposable glass vial served as the electrochemical cell. To exclude the possibility of the ECL signal being generated from a Ru(bpy)32+ contaminated system, virgin glassware and electrodes were employed as soon as necessary. ECL intensities, along with cyclic voltammograms (CV), were measured simultaneously with a home-built potentiostat combined with a photomultiplier tube (PMT, Hamamatsu R4220p, Japan) installed under the electrochemical cell. A voltage of -750 V was supplied to the PMT with a high voltage power supply (Bertan High Voltage Corp., Series 225, Hicksville, NY).

[000133] Todas as medições foram conduzidas a uma temperatura de 20 + 2oC, a menos que de outro modo declarado.[000133] All measurements were conducted at a temperature of 20 + 2oC unless otherwise stated.

Example 1: Synthesis of ECL Labels containing Ru(bpy)32+

[000134] Tetracis(pentafluorofenil)borato de tris(2,2'-bipiridil)rutênio(II) (Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2) foi empregado como o rótulo de ECL no presente estudo, por que, como mostrado nas seguintes seções, este complexo pode ser efetivamente carregado em contas de poliestireno empregando uma solução orgânica adequada e mantido capturado nas contas durante uma série de modificações das contas em soluções aquosas. Em outras palavras, Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 é suficientemente solúvel em solventes orgânicos porém completamente insolúvel em soluções aquosas. Outra razão para escolher Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 como o rótulo de ECL foi o fato de que a porção de Ru(bpy)32+ do complexo tem uma eficácia de ECL muito elevada. Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 foi preparado por uma reação de metátese entre Ru(bpy)3Ch e Li [B(C6F5^ n Et2O (n = 2-3) em água. O precipitado foi lavado com água, recristalizado de uma solução de acetonitrila/água, e secado sob vácuo.[000134] Tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) tetracis(pentafluorophenyl)borate (Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2) was used as the ECL label in the present study, because , as shown in the following sections, this complex can be effectively loaded into polystyrene beads employing a suitable organic solution and kept captured in the beads during a series of modifications of the beads in aqueous solutions. In other words, Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 is sufficiently soluble in organic solvents but completely insoluble in aqueous solutions. Another reason for choosing Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 as the ECL label was the fact that the Ru(bpy)32+ portion of the complex has a very high ECL efficacy. Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 was prepared by a metathesis reaction between Ru(bpy)3Ch and Li [B(C6F5^ n Et2O (n = 2-3) in water. The precipitate was washed with water, recrystallized from an acetonitrile/water solution, and dried under vacuum.

Example 2: ECL and Electrochemical Behavior of Rub(bpy)32+ in MeCN Employing TPrA as a Co-reactant.

[000135] As respostas de ECL e voltamétricas cíclicas de 0,10 µM de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 em MeCN contendo 0,10 M de eletrólito (TBA)BF4 -0,10 M de co-reagente TPrA em um eletrodo de Pt em uma taxa de varredura de 50 mV/s são mostradas na Figura 4. O TPrA começa a oxidar em potenciais por cerca de 0,5 V vs Ag/Ag+, e mostra um pico de oxidação máxima em cerca de 0,75 V vs Ag/Ag+ (Figura 4a). Quando o eletrodo é varrido para um potencial mais positivo do que 1,1 V vs Ag/Ag+ onde o Ru(bpy)32+ é oxidado para Ru(bpy)3+ (Figura 4c), o ECL é produzido (Figura 4b). A intensidade de ECL continuamente aumenta com o potencial em crescimento, finalmente formando um amplo pico com uma largura de meia-onda de cerca de 700 mV e um potencial de pico em cerca de 1,6 V vs Ag/Ag+. Na varredura reversa, uma intensidade de ECL maior e posição de pico similar são observadas. Notado é que o potencial de oxidação de Ru(bpy)32+ pode ligeiramente alterar positivamente na presença de TPrA, uma vez que os potenciais de pico de ECL são mais positivos em comparação com o potencial de oxidação de Ru(bpy)32+ na ausência de TPrA (Figuras 4b e c). Como esperado, uma alteração nos contra-íons dos complexos de Ru(bpy)32+, por exemplo, de B(C6F5)4- para ClO4-, não altera o comportamento de ECL. Em contraste ao caso na solução aquosa, onde um ECL de pré-onda apareceu na região potencial de oxidação de TPrA devido à formação de Ru(bpy)32+* em estado excitado em reação de TPrA*+ com Ru(bpy)3+ (formado por reação de Ru(bpy)32+ com TPrA') quando um µM de Ru(bpy)32+ foi empregado, (Miao, Choi e Bard, 2002, J. Am. Chen). Soc. 124:14478) nenhum sinal de ECL correspondente notável foi encontrado em MeCN. Isto sugere que sob as condições experimentais presentes, ou TPrA+ não é energicamente poderoso o suficiente para oxidar Ru(bpy)3+ para Ru(bpy)32+*. À parte disto, foi concluído que o mecanismo de ECL desenvolvido em soluções aquosas usando TPrA como um co-reagente é operativo em MeCN.[000135] The ECL and cyclic voltammetric responses of 0.10 µM Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 in MeCN containing 0.10 M electrolyte (TBA)BF4 -0.10 M co- TPrA reagent on a Pt electrode at a scan rate of 50 mV/s are shown in Figure 4. TPrA begins to oxidize at potentials for about 0.5 V vs Ag/Ag+, and shows a maximum oxidation peak at about 0.75 V vs Ag/Ag+ (Figure 4a). When the electrode is swept to a potential more positive than 1.1 V vs Ag/Ag+ where Ru(bpy)32+ is oxidized to Ru(bpy)3+ (Figure 4c), ECL is produced (Figure 4b) . The ECL intensity continuously increases with the growing potential, finally forming a broad peak with a half-wave width of about 700 mV and a peak potential at about 1.6 V vs Ag/Ag+. In the reverse scan, a higher ECL intensity and similar peak position are observed. Note that the oxidation potential of Ru(bpy)32+ may slightly change positively in the presence of TPrA, since the ECL peak potentials are more positive compared to the oxidation potential of Ru(bpy)32+ in absence of TPrA (Figures 4b and c). As expected, a change in the counterions of the Ru(bpy)32+ complexes, for example, from B(C6F5)4- to ClO4-, does not change the ECL behavior. In contrast to the case in aqueous solution, where a pre-wave ECL appeared in the oxidation potential region of TPrA due to the formation of Ru(bpy)32+* in an excited state in reaction of TPrA*+ with Ru(bpy)3+ (formed by reaction of Ru(bpy)32+ with TPrA') when one µM of Ru(bpy)32+ was used, (Miao, Choi and Bard, 2002, J. Am. Chen). Soc. 124:14478) no notable corresponding ECL signal was found in MeCN. This suggests that under the present experimental conditions, either TPrA+ is not energetically powerful enough to oxidize Ru(bpy)3+ to Ru(bpy)32+*. Apart from this, it was concluded that the ECL mechanism developed in aqueous solutions using TPrA as a co-reactant is operative in MeCN.

[000136] A intensidade de ECL como uma função da concentração de TPrA é mostrada na Figura 5a, onde a região de intensidade de ECL superior corresponde a uma concentração de TPrA de 30 mM. Como seria esperado, com base no estudo de dependência de pH do ECL em solução aquosa, (Leland e outros 1990, J. Electrochem. Soc. 137:3127) adicionando-se ácido trifluoroacético (TFAA) em uma solução de Ru(bpy)32+/TPrA/MeCN, portanto alterando-se a acidez da solução, a intensidade de ECL é alterada (Figura 5b). Uma combinação de 100 mM de TPrA com 55 mM de TFAA determinou a resposta de ECL mais ampla.[000136] ECL intensity as a function of TPrA concentration is shown in Figure 5a, where the region of higher ECL intensity corresponds to a TPrA concentration of 30 mM. As would be expected, based on the pH dependence study of ECL in aqueous solution, (Leland et al. 1990, J. Electrochem. Soc. 137:3127) adding trifluoroacetic acid (TFAA) to a solution of Ru(bpy) 32+/TPrA/MeCN, therefore, by changing the acidity of the solution, the ECL intensity is changed (Figure 5b). A combination of 100 mM TPrA with 55 mM TFAA determined the broadest ECL response.

[000137] A intensidade e estabilidade de ECL foram também afetadas pelo material de eletrodo empregado. Os eletrodos de Pt e Au mostraram respostas similares; o ECL foi estável durante vários ciclos potenciais, com uma densidade de fotocorrente ligeiramente menor em um eletrodo de Pt comparado com um eletrodo de Au. Em um eletrodo de GC, entretanto, somente a varredura dianteira do primeiro ciclo potencial produziu luz. Após o polimento do eletrodo de GC, a luz surgiu novamente, sugerindo que a superfície do eletrodo foi bloqueada por uma película de algum tipo. A intensidade de ECL relativa, obtida de uma solução de MeCN contendo 0,10 µM de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2-0,10 M de TPrA-0,055 M de TFAA-0,10 M de (TBA)BF4 durante o primeiro ciclo potencial entre 0 e 3,0 V vs Ag/Ag+ em uma taxa de varredura de 50 mV/s, em eletrodo Au, Pt e CG, teve uma relação de 100:93:61.[000137] The intensity and stability of ECL were also affected by the electrode material used. Pt and Au electrodes showed similar responses; the ECL was stable over several potential cycles, with a slightly lower photocurrent density on a Pt electrode compared to an Au electrode. At a GC electrode, however, only the forward sweep of the first potential cycle produced light. After polishing the GC electrode, light appeared again, suggesting that the electrode surface was blocked by a film of some kind. The relative ECL intensity obtained from a MeCN solution containing 0.10 µM Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2-0.10 M TPrA-0.055 M TFAA-0.10 M ( TBA)BF4 during the first potential cycle between 0 and 3.0 V vs Ag/Ag+ at a scan rate of 50 mV/s, on Au, Pt and CG electrode, had a ratio of 100:93:61.

[000138] De modo interessante, mesmo na ausência de Ru(bpy)32+, um TPrA em solução de acetonitrila com 0,10 M de (TBA)BF4 pode também produzir um sinal de ECL (Figura 6a). A purificação do TPrA e MeCN por destilação, alterando o eletrólito de (TBA)BF4 para (TBA)CIO4 ou empregando um eletrólito de grau eletroquímico recentemente aberto, empregando utensílio de vidro virgem e eletrodos, e cobrindo o contra-eletrodo de Pt com um tubo de vidro coberto com ou sem uma camada de plástico preto, não alterou o resultado. O ECL teve um valor potencial de pico de 2,1 V vs Ag/Ag+, que é uma alteração de 500 mV comparada com aquela obtida na presença de 0,10 µM de Ru(bpy)32+ (figura 4b). Como mostrado previamente na Figura 5a, na ausência de TPrA, um Ru(bpy)32+ em solução de MeCN com 0,10 M de (TBA)BF4 não produziu uma resposta de ECL observável na mesma escala de intensidade com uma varredura somente para potenciais positivos. Desse modo, os sinais de ECL mostrados na Figura 6a devem originar de TPrA, e são provavelmente devido à fotoemissão inversa de reação de transferência de carga (CTRIP) associada com radicais livres de TPrA* (Murakoshi e outros 1992, J. Phys. Chem. 96:4593; Uosaki e outros 1991 , J. Phys. Chem. 95:779; Uosaki e outros 1990, Chem. Lett. 7; 1159; Mclntyre e outros 1987, J. Electroanal. Chem. Interfac. Electrochem. 228:293; McIntyre e outros 1986, Phys Rev Lett. 56:651 ; McIntyre e outros 1985, J. Electroanal. Chem. Interfac. Electrochem 196:199; Murakoshi e outros 1993, Conden Mar Mater. Phys. 47:2278; Ouyang e Bard 1988, J. Phys. Chem. 92:5201; Ouyang e Bard 1987, J. Phys. Chem. 91 :4058). A intensidade de ECL integrada obtida da Figura 6a, que é cerca de 12% daquela obtida da Figura 4b, é significante, uma vez que na ausência de TPrA, a fotocorrente residual medida de uma solução de 0,10 M de (TBA)BF4/MeCN é significantemente menor (Figura 6d). Os sinais de ECL relacionados com TPrA de base foram suprimidos dramaticamente adicionando-se TFAA à solução (Figura 6a), e uma outra eliminação dos sinais "indesejados" foi obtida por uma adição de 1% (volume/volume) de H2O na solução de 0,10 M de TPrA-0,055 M de TFAA-0,I0 M de (TBA)BF4 MeCN (Figura 6c). A Figura 6e exibe as intensidades de ECL relativas obtidas da Figura 6a a d.[000138] Interestingly, even in the absence of Ru(bpy)32+, a TPrA in acetonitrile solution with 0.10 M (TBA)BF4 can also produce an ECL signal (Figure 6a). Purification of TPrA and MeCN by distillation, changing the electrolyte from (TBA)BF4 to (TBA)CIO4 or employing a freshly opened electrochemical grade electrolyte, employing virgin glassware and electrodes, and covering the Pt counter electrode with a glass tube covered with or without a layer of black plastic, did not change the result. The ECL had a peak potential value of 2.1 V vs Ag/Ag+, which is a change of 500 mV compared to that obtained in the presence of 0.10 µM Ru(bpy)32+ (figure 4b). As previously shown in Figure 5a, in the absence of TPrA, a Ru(bpy)32+ in MeCN solution with 0.10 M (TBA)BF4 did not produce an observable ECL response on the same intensity scale with a scan only for positive potentials. Therefore, the ECL signals shown in Figure 6a must originate from TPrA, and are likely due to reverse charge transfer reaction (CTRIP) photoemission associated with TPrA* free radicals (Murakoshi et al. 1992, J. Phys. Chem 96:4593; Uosaki et al. 1991, J. Phys. Chem. 95:779; Uosaki et al. 1990, Chem. Lett. 7; 1159; McIntyre et al. 1987, J. Electroanal. Chem. Interfac. Electrochem. 228: 293; McIntyre et al. 1986, Phys Rev Lett. 56:651; McIntyre et al. 1985, J. Electroanal. Chem. Interfac. Electrochem 196:199; Murakoshi et al. 1993, Conden Mar Mater. Phys. 47:2278; Ouyang and Bard 1988, J. Phys. Chem. 92:5201; Ouyang and Bard 1987, J. Phys. Chem. 91:4058). The integrated ECL intensity obtained from Figure 6a, which is about 12% of that obtained from Figure 4b, is significant, since in the absence of TPrA, the residual photocurrent measured from a 0.10 M solution of (TBA)BF4 /MeCN is significantly lower (Figure 6d). Baseline TPrA-related ECL signals were dramatically suppressed by adding TFAA to the solution (Figure 6a), and further elimination of the "unwanted" signals was achieved by an addition of 1% (vol/vol) H2O to the background solution. 0.10 M TPrA-0.055 M TFAA-0.10 M (TBA)BF4 MeCN (Figure 6c). Figure 6e displays the relative ECL intensities obtained from Figure 6a to d.

Example 3: Loading ECL Labels onto Polystyrene Beads

[000139] As contas de poliestireno de carboxilato tendo um diâmetro de 10 µm foram separadas de um volume apropriado (0,10-1,0 mL) de 2,6% (peso/peso) de suspensão de contas de poliestireno com uma centrífuga Eppendorf 5415D (Brinkmann Instruments, Inc. Westbury, NY) a 10 k rpm durante 5 minutos, e em seguida lavadas uma vez com 1 mL de água.[000139] Carboxylate polystyrene beads having a diameter of 10 µm were separated from an appropriate volume (0.10-1.0 mL) of 2.6% (w/w) polystyrene bead suspension with a centrifuge Eppendorf 5415D (Brinkmann Instruments, Inc. Westbury, NY) at 10 k rpm for 5 minutes, and then washed once with 1 mL of water.

[000140] As contas foram secadas em vácuo a 60oC durante 1 hora, seguido por adição de 1,5 mL da solução Ru (bpy)3 [B(C6F5)4]2- (0,7 mM) 5% de THF saturado- 95% de MeOH (volume/volume) de rótulo de ECL em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo o PSB. A mistura foi girada com um misturador de amostra Dynal (Dynal Biotech Inc.) a 20 rpm durante 2 horas, seguido por centrifugação e lavagem com 50% de MeOH-50% de H2O (volume/volume) duas vezes. As contas de poliestireno amareladas contendo rótulo de ECL resultantes, designadas como Ru(II)oPSB, foram também secadas sob vácuo a 60oC durante 1 hora. Durante o curso dos tratamentos acima, as contas de poliestireno foram primeiro dilatadas na solução orgânica 5% de THF-95% de MeOH contendo rótulo de ECL, permitindo os rótulos de ECL insolúveis em água difundirem-se na matriz de polímero, onde eles foram capturados quando os solventes orgânicos foram removidos das contas por evaporação a vácuo. O carregamento efetivo das contas de ECL nas contas de poliestireno pode ser visualmente verificado através da imagem fluorescente (Figura 2a) tomada com um microscópio invertido Nikon Eclipse TE 300 (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) acoplado com uma câmera Magnafire- Model S99806 Olympus America CCD (Olympus America, Melville, NY). Uma capacidade de carregamento típica de 7,5x109 moléculas de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 por conta foi estimada com base nos dados de ECL obtidos de Ru(II)o PSB dissolvido em MeCN e uma solução de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 padrão empregando TPrA como um co-reagente.[000140] The beads were dried in vacuum at 60oC for 1 hour, followed by addition of 1.5 mL of Ru (bpy)3 [B(C6F5)4]2- (0.7 mM) 5% saturated THF solution - 95% MeOH (vol/vol) of ECL label in a 2 mL microcentrifuge tube containing the PSB. The mixture was spun with a Dynal sample mixer (Dynal Biotech Inc.) at 20 rpm for 2 hours, followed by centrifugation and washing with 50% MeOH-50% H2O (vol/volume) twice. The resulting ECL-labeled yellowish polystyrene beads, designated as Ru(II)oPSB, were also dried under vacuum at 60°C for 1 hour. During the course of the above treatments, the polystyrene beads were first swollen in the organic 5% THF-95% MeOH solution containing ECL label, allowing the water-insoluble ECL labels to diffuse into the polymer matrix where they were captured when organic solvents were removed from the beads by vacuum evaporation. The effective loading of the ECL beads onto the polystyrene beads can be visually verified through the fluorescent image (Figure 2a) taken with a Nikon Eclipse TE 300 inverted microscope (Nikon Instruments Inc., Melville, NY) coupled with a Magnafire-Model S99806 camera. Olympus America CCD (Olympus America, Melville, NY). A typical loading capacity of 7.5x109 Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 molecules per bead was estimated based on ECL data obtained from Ru(II)o PSB dissolved in MeCN and a Ru solution (bpy)3 [B(C6F5)4]2 standard employing TPrA as a co-reactant.

Example 4: Immobilization of Avidin on the Surface of Ru(II)o PSB.

[000141] Uma camada de avidina foi covalentemente ligada à superfície de Ru(II)o PSB através da formação de Ru(II)o PSB -CO- NH-avidina, imergindo-se as contas em 1,5 mL de 25 µm de avidina recentemente preparada em 0,10 M de tampão de 1-metil-imidazol (pH 7) contendo 0,10 M de EDAC e 0,10 M de NHS, e girando a mistura Em resposta ~40 rpm durante 1 hora. Os Ru(II)o PSB cobertos de avidina recentemente formada, designados como Ru(II)o PSB/Avidina, foram centrifugados da solução de reação em 5-10k rpm durante 5 minutos, e lavados com 1 mL de "tampão 1X B&Wr" (1X de buffer & solução de lavagem, 5 mM de Tris-HCI (pH 7,5) + 0,5 mM de EDTA + 1,0 M de NaCI) três vezes. O produto de Ru(II)o PSB/Avidina final foi novamente suspenso em solução de tampão de IX B&W que teve o mesmo volume como a suspensão de PSB inicial (0,10-1,0 mL) e se manteve a ~4oC até o uso. Aproximadamente, 6,5x104 contas de Ru(II)o PSB / Avidina/µL podem desse modo ser estimadas, com uma suposição de nenhuma perda das contas durante a preparação de Ru(II)o PSB/Avidina. A Figura 2b mostra uma imagem fluorescente verde brilhante de Ru(II)o PSB/Avidina após as contas terem reagido com biotina de fluoresceína, sugerindo que uma camada de qualidade elevada de avidina foi formada sobre a superfície de Ru(II)o PSB. Em contraste, a biotina de fluoresceína não específicamente absorvida em Ru(II)o PSB "nu" somente gera uma imagem fluoresecente muito fraca. A capacidade de ligação de Ru(II)o PSB/Avidina para um ssDNA 23-mer biotinilado (p-ssDNA) foi constatada ter um valor de 0,565 nmóis (p-ssDNA)/mg de PSB ou 1,4x 108 moléculas de p- ssDNA/ conta, com base nos experimentos de titulação de biotina de fluoresceína (veja, Figura 10 e Tabela 1, abaixo).[000141] An avidin layer was covalently linked to the surface of Ru(II)o PSB through the formation of Ru(II)o PSB -CO- NH-avidin, by immersing the beads in 1.5 mL of 25 µm freshly prepared avidin in 0.10 M 1-methyl-imidazole buffer (pH 7) containing 0.10 M EDAC and 0.10 M NHS, and spinning the mixture at ~40 rpm for 1 hour. The newly formed avidin-covered Ru(II)o PSBs, designated as Ru(II)o PSB/Avidin, were centrifuged from the reaction solution at 5-10k rpm for 5 minutes, and washed with 1 mL of "1X B&Wr buffer." (1X buffer & wash solution, 5 mM Tris-HCI (pH 7.5) + 0.5 mM EDTA + 1.0 M NaCl) three times. The final Ru(II) PSB/Avidin product was resuspended in IX B&W buffer solution that had the same volume as the initial PSB suspension (0.10-1.0 mL) and kept at ~4oC until the use. Approximately, 6.5x104 Ru(II)o PSB/Avidin/µL beads can thus be estimated, with an assumption of no loss of beads during the Ru(II)o PSB/Avidin preparation. Figure 2b shows a bright green fluorescent image of Ru(II)o PSB/Avidin after the beads were reacted with fluorescein biotin, suggesting that a high quality layer of avidin was formed on the surface of Ru(II)o PSB. In contrast, non-specifically absorbed fluorescein biotin on "naked" Ru(II) PSB only generates a very weak fluorescent image. The binding capacity of Ru(II)o PSB/Avidin to a biotinylated 23-mer ssDNA (p-ssDNA) was found to have a value of 0.565 nmols (p-ssDNA)/mg of PSB or 1.4x 108 molecules of p - ssDNA/count, based on fluorescein biotin titration experiments (see, Figure 10 and Table 1, below).

Example 5: Binding of ssDNA to the MB Surface and Ru(II)o PSB/Avidin Beads

[000142] Conjugados de MB- DNA de sonda. As contas magnéticas cobertas de estreptavidina (MB), tendo um diâmetro ou de 1,0 µm ou de 2,8 µm, foram empregadas como o veículo de DNA de sonda. Para formar os conjugados de MB- DNA de sonda, 5,0 µl de 1 µm de MB, ou 10,0 µL de 2,8 µm de MB, foram primeiramente transferidos em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, em seguida separados da suspensão original com um magneto (Dynal MPC®-S), seguido lavando-se uma vez com 200 µL de "2X de tampão B&W " (tampão & solução de lavagem: 10 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 1,0 mM de EDTA, 2,0 M de NaCI) e duas vezes com 200 µL de tampão 1X B&W antes de imergir as contas em 100 µL de 2,5 µM de p-ssDNA biotinilado e incubando-se durante 30 a 60 minutos com rotação suave a 40 rpm. Os conjugados de MB- DNA de sonda formados foram subseqüentemente separados e lavados com 200 µL^ de tampão 1X B&W três vezes, transferidos para um novo tubo de microcentrífuga de 2 ml para evitar a possível absorção de DNA de sonda na parede do tubo anterior, e novamente suspensos em 20 µL de tampão de hibridização. Os conjugados produzidos deste modo tiveram uma cobertura de DNA de sonda saturada de cerca de 2,53 e 1,11 mmoles (p-ssDNA)/mg (contas), ou 1,6 X106 e 1,0x107 moléculas de p-ssDNA por conta, para MB de 1,0 µm e 2,8 µm de diâmetro, respectivamente (veja Figura 10 e Tabela 1). Tabela 1 [000142] MB-DNA probe conjugates. Streptavidin (MB)-coated magnetic beads, having a diameter of either 1.0 µm or 2.8 µm, were employed as the probe DNA carrier. To form the MB-probe DNA conjugates, 5.0 µl of 1 µm MB, or 10.0 µL of 2.8 µm MB, were first transferred into a 2 mL microcentrifuge tube, then separated from the original suspension with a magnet (Dynal MPC®-S), followed by washing once with 200 µL of "2X B&W buffer" (buffer & wash solution: 10 mM Tris-HCI (pH 7.5), 1 .0 mM EDTA, 2.0 M NaCl) and twice with 200 µL of 1X B&W buffer before immersing the beads in 100 µL of 2.5 µM biotinylated p-ssDNA and incubating for 30 to 60 minutes with smooth rotation at 40 rpm. The formed MB-probe DNA conjugates were subsequently separated and washed with 200 µL^ of 1X B&W buffer three times, transferred to a new 2 ml microcentrifuge tube to avoid possible absorption of probe DNA into the wall of the previous tube, and resuspended in 20 µL of hybridization buffer. The conjugates produced in this way had a saturated probe DNA coverage of about 2.53 and 1.11 mmoles (p-ssDNA)/mg (beads), or 1.6x106 and 1.0x107 p-ssDNA molecules per account, for MB of 1.0 µm and 2.8 µm in diameter, respectively (see Figure 10 and Table 1). Table 1

[000143] Conjugados de DNA alvo- Ru(II)o PSB/Avidina. 100 µL de uma concentração apropriada de t-ssDNA biotinilado (1,0x10-8 a 1,0x10-15 M), ou 1,0x10-9 M de ssDNA não complementar (nc-ssDNA) e ssDNA de 2 pares de base de ligação imperfeita (2-bp-m-ssDNA), foram adicionados a 25 µL de ~6,5x104 contas/µL de Ru(II)C PSB/Avidina em tampão 1X B&W e incubados durante 1 hora com mistura suave em uma taxa de rotação de 20 rpm, lavados duas vezes com 200 µL de tampão 1X B&W, centrifugados em 3k-5k-I0k rpm durante 5 minutos, e novamente suspensos em 50 µL do tampão de hibridização.[000143] Target DNA conjugates - Ru(II)o PSB/Avidin. 100 µL of an appropriate concentration of biotinylated t-ssDNA (1.0x10-8 to 1.0x10-15 M), or 1.0x10-9 M of non-complementary ssDNA (nc-ssDNA) and 2 base pair ssDNA of imperfectly bound (2-bp-m-ssDNA), were added to 25 µL of ~6.5x104 beads/µL Ru(II)C PSB/Avidin in 1X B&W buffer and incubated for 1 hour with gentle mixing at a rate of rotation at 20 rpm, washed twice with 200 µL of 1X B&W buffer, centrifuged at 3k-5k-10k rpm for 5 minutes, and resuspended in 50 µL of hybridization buffer.

Example 6: DNA Hybridization and ECL Detection

[000144] Os conjugados de DNA alvo- Ru(II)o PSB/Avidina recentemente preparados (Exemplo 5) foram transferidos em tubos centrífugos de 2 mL contendo os conjugados de MB- DNA de sonda previamente formados (Exemplo 5). Um volume apropriado do tampão de hibridização foi adicionado nos tubos para fazer um volume de solução de hibridização total de 200 µL. Após mistura suave a 200 rpm durante 1 hora, os agregados de DNA de sonda- MB ? DNA alvo- Ru(II)o PSB/Avidina fora magneticamente separados da "solução" contendo contas de Ru(II)o PSB/Avidina não ligadas livres, lavados suavemente com 200 µL de tampão 1 X B&W três vezes, e cuidadosamente transferidos em um novo tubo centrífugo para minimizar a possível adsorção de contas de Ru(II)o PSB/Avidina livres na parede do tubo. Este tipo de adsorção não específica pode produzir um nível significantemente elevado de ECL de base, uma vez que, junto com os agregados de hibridização de DNA, as contas de Ru(II)o PSB/Avidina livres na parede podem também ser dissolvidas em MeCN. Os agregados foram finalmente lavados com 200 µl de água, e dissolvidos em uma solução de 0,50 mL de 0,10 M de TPrA-0,055 M de TFAA-0,10 M de (TBA)BF4 MeCN para as medições de ECL posteriores. A formação de agregados de DNA de sonda -MB ?DNA alvo- Ru(II)o PSB/Avidina após a hibridização de DNA podem ser claramente verificados através da imagem de SEM mostrada na Figura 3, na qual igualmente o DNA de sonda e o DNA complementar tiveram uma concentração de 5 µm, a relação inicial de MB-PSB = 29, e o tamanho do MB e do PSB foi 1,0 µm e 10 µm, respectivamente.[000144] The newly prepared target DNA-Ru(II)o PSB/Avidin conjugates (Example 5) were transferred into 2 mL centrifuge tubes containing the previously formed MB-probe DNA conjugates (Example 5). An appropriate volume of hybridization buffer was added to the tubes to make a total hybridization solution volume of 200 µL. After gentle mixing at 200 rpm for 1 hour, the MB? Target DNA-Ru(II)o PSB/Avidin was magnetically separated from the "solution" containing free unbound Ru(II)o PSB/Avidin beads, gently washed with 200 µL of 1X B&W buffer three times, and carefully transferred into a new centrifugal tube to minimize the possible adsorption of free Ru(II)o PSB/Avidin beads on the tube wall. This type of non-specific adsorption can produce a significantly high level of base ECL, since, together with the DNA hybridization aggregates, the wall-free Ru(II)o PSB/Avidin beads can also be dissolved in MeCN. . The aggregates were finally washed with 200 µl of water, and dissolved in a 0.50 mL solution of 0.10 M TPrA-0.055 M TFAA-0.10 M (TBA)BF4 MeCN for subsequent ECL measurements. . The formation of probe DNA -MB ?target DNA -Ru(II)o PSB/Avidin aggregates after DNA hybridization can be clearly verified through the SEM image shown in Figure 3, in which both the probe DNA and the Complementary DNA had a concentration of 5 µm, the initial MB-PSB ratio = 29, and the size of MB and PSB was 1.0 µm and 10 µm, respectively.

[000145] Uma relação linear entre a intensidade de ECL e a concentração de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 em uma faixa de 0,10 nM a 1,0 µM foi constatada em 0,10 M de TPrA-0,055 M de TFAA-0,10 (TBA)BF4 MeCN com a adição de 1% de água (Figura 7a). Sob as mesmas condições experimentais, uma boa correlação entre a intensidade de ECL e o número de contas de poliestireno de 10 µm carregadas com Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 foi também observada (Figura 7b). As contas foram dissolvidas em uma solução de eletrólito de 0,50 mL, para demonstrar que o poliestireno não produz ou afeta o sinal de ECL. Comparando-se a Figura 7b com 7a, é claro que a intensidade da luz gerada de 20 contas carregadas de Ru(bpy)32+ é equivalente àquela de 0,5 nM de Ru(bpy)32+. A capacidade de carregamento das contas foi desse modo, determinada ser 7,5 x 109 moléculas de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 por conta. Este resultado é de acordo com os dados obtidos com base nas medições de ECL das "contas de volume".[000145] A linear relationship between ECL intensity and Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 concentration in a range of 0.10 nM to 1.0 µM was found in 0.10 M TPrA -0.055 M TFAA-0.10 (TBA)BF4 MeCN with the addition of 1% water (Figure 7a). Under the same experimental conditions, a good correlation between the ECL intensity and the number of 10 µm polystyrene beads loaded with Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 was also observed (Figure 7b). The beads were dissolved in a 0.50 mL electrolyte solution to demonstrate that polystyrene does not produce or affect the ECL signal. Comparing Figure 7b with 7a, it is clear that the light intensity generated from 20 Ru(bpy)32+ loaded beads is equivalent to that from 0.5 nM Ru(bpy)32+. The loading capacity of the beads was therefore determined to be 7.5 x 109 Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 molecules per bead. This result is in agreement with the data obtained based on ECL measurements of the "volume beads".

[000146] Dois grupos de experimentos foram designados para a detecção de ECL de hibridização de DNA. No primeiro, MB de 1,0 µm de diâmetro com uma relação de contas de MB para PSB de 20, foi empregado. Como mostrado na Figura 8a, neste caso, a intensidade de ECL foi proporcional à concentração de DNA alvo sobre uma faixa de 10 pM a 10 nM, e o 2-bp-ssDNA de duas bases de ligação imperfeita e nc-ssDNA não complementar podem ser facilmente distinguidos da hibridização de DNA complementar. Note que diferente dos exemplos mostrados na Figura 7, nenhuma água foi adicionada à solução de eletrólito por causa dos conjugados de MB-PSB recentemente formados e o tubo de microcentrífuga já continha água suficiente. Note também que nenhuma subtração de fundamento foi feita para a intensidade de ECL mostrada na Figura 8. Reduzindo-se a relação de MB para PSB, e em conseqüência aumentando o fato de amplificação de Ru(bpy)32+ para t-ssDNA, as hibridizações de DNA em concentrações muito menores de DNA alvo devem ser detectáveis. Como demonstrado infra, estatisticamente, um PSB de 10 µm de diâmetro pode ser arrancado com um MB de 2,8 µm de diâmetro. Como um resultado, os sinais de ECL relacionados com a hibridização de DNA ocorreram em uma concentração muito baixa de DNA alvo e desse modo puderam ser detectáveis quando o MB de 2,8 µm e PSb de 10 µm estão presentes em uma relação baixa. A Figura 8b mostra os resultados de um tal exemplo, no qual a relação de 2,8 µm de MB/10 µm de PSB = 4. O t-ssDNA pode ser detectado em uma concentração tão baixa quanto 1,0 fmol. Ainda sob essas condições, a intensidade de ECL obtida é maior do que, e desse modo distinguível daquela obtida da hibridização de DNA de 2-bp-m-ssDNA e nc-ssDNA quando 1,0 nM de cada espécie foi empregado.[000146] Two groups of experiments were designed for the detection of DNA hybridization ECL. In the first, MB of 1.0 µm in diameter with a ratio of MB to PSB beads of 20 was employed. As shown in Figure 8a, in this case, the ECL intensity was proportional to the concentration of target DNA over a range of 10 pM to 10 nM, and the imperfectly bound two-base 2-bp-ssDNA and non-complementary nc-ssDNA could be easily distinguished from complementary DNA hybridization. Note that unlike the examples shown in Figure 7, no water was added to the electrolyte solution because of the newly formed MB-PSB conjugates and the microcentrifuge tube already contained sufficient water. Note also that no fundamental subtraction was made for the ECL intensity shown in Figure 8. By reducing the ratio of MB to PSB, and consequently increasing the fact of amplification of Ru(bpy)32+ to t-ssDNA, the DNA hybridizations at much lower concentrations of target DNA should be detectable. As shown below, statistically, a 10 µm diameter PSB can be torn off with a 2.8 µm diameter MB. As a result, ECL signals related to DNA hybridization occurred at a very low concentration of target DNA and thus could be detectable when 2.8 µm MB and 10 µm PSb are present in a low ratio. Figure 8b shows the results of one such example, in which the ratio of 2.8 µm MB/10 µm PSB = 4. t-ssDNA can be detected at a concentration as low as 1.0 fmol. Still under these conditions, the ECL intensity obtained is greater than, and thus distinguishable from, that obtained from DNA hybridization of 2-bp-m-ssDNA and nc-ssDNA when 1.0 nM of each species was used.

Example 7: Binding of Biotin-PEO-LC-Amine to Carboxylate Polystyrene Beads and the Poisson Distribution Test

[000147] Biotin-PEO-LC-amina (M.W. = 418,6 g/mol) é um reticulador solúvel em água com um óxido de polietileno de 22,9 Â (PEO) com base no braço espaçador empregado para reduzir o bloqueio estérico de interações de biotina e avidina (2003-2004 Applications Handbook & Catalog; Pierce Biotechnology, Inc. 2003). As moléculas de biotin- PEO- LC-amina foram covalentemente ligadas à superfície de contas de poliestireno de carboxilato através da formação de ligação de amida entre o grupo de amina primário do reticulador e o grupo de carboxila das contas na presença de 0,10 M de EDAC-0,10 M de NHS em 0,10 M de tampão de 1-metil-imidazol (pH 7). Um mL de 5 mM de biotin-PEO-LC-amina foi usado para reagir com o PSB, separado de 250 µL de 2,6% de suspensão de PSB. A reação foi realizada durante 2 horas com uma taxa de rotação de 40 rpm. O PSb modificado pelo reticulador, designado como PSB-CO- NH-LC-PEO- biotina, foi subseqüentemente separado e lavado com 400 µl de tampão 1X B&W 3 vezes, re-suspenso em 250 µL de tampão 1X B&W, e em seguida mantido a 4oC até o uso.[000147] Biotin-PEO-LC-amine (M.W. = 418.6 g/mol) is a water-soluble crosslinker with a 22.9 Å polyethylene oxide (PEO) based on the spacer arm employed to reduce steric hindrance of biotin and avidin interactions (2003-2004 Applications Handbook &Catalog; Pierce Biotechnology, Inc. 2003). Biotin-PEO-LC-amine molecules were covalently linked to the surface of carboxylate polystyrene beads through amide bond formation between the primary amine group of the crosslinker and the carboxyl group of the beads in the presence of 0.10 M of EDAC-0.10 M NHS in 0.10 M 1-methyl-imidazole buffer (pH 7). One mL of 5 mM biotin-PEO-LC-amine was used to react with PSB, separated from 250 µL of 2.6% PSB suspension. The reaction was carried out for 2 hours with a rotation rate of 40 rpm. The crosslinker-modified PSb, designated as PSB-CO-NH-LC-PEO-biotin, was subsequently separated and washed with 400 µL of 1X B&W buffer 3 times, resuspended in 250 µL of 1X B&W buffer, and then kept at 4oC until use.

[000148] As medições de distribuição Poisson foram realizadas empregando contas de PSB-CO-NH-LC-PEO-biotina de 10 µm de diâmetro, com dois tamanhos diferentes de contas magnéticas cobertas de estreptavidina/poliestireno (contas Dynal de 1,0 e 2,8 µm de diâmetro). Quando dez das mil contas de PSB-CO-NH-LC-PEO- biotina são misturadas suficientemente na solução, com o mesmo número, ou um número maior, de contas magnéticas de ou 1,0 ou 2,8 µm, a probabilidade das contas PSB-CO-NH-LC-PEO-biotina se aderirem, através da reação irreversível entre a biotina do PSB e a estreptavidina do MB, pode ser observada e comparada com aquela predita para uma distribuição Poisson. Experimentalmente, 50 µL de ~6,5x104 contas/µL de contas de PSB-CO-NH-LC-PEO- biotina (3,3x106 PSB no total) foram diluídos com 175 µL de tampão 1X B&W, e transferidos para um tubo microcentrífugo contendo um número conhecido de contas magnéticas cobertas de estreptavidina (1,0 µm em diâmetro) que foram separadas magneticamente da suspensão original do fabricante e lavadas uma vez com 200 µL de tampão 2X B&W. A mistura foi imediatamente agitada e girada em 40 rpm durante 1 hora antes dos agregados de PSB-MB terem sido magneticamente separados da mistura. O sobrenadante resultante conteve contas de PSB-CO-NH-LC- PEO-biotina livres não ligadas, e o número de PSB no sobrenadante foi determinado por exame óptico com um microscópio invertido. Procedimentos similares foram empregados para estudar a distribuição Poisson de 2,8 µm de MB. Entretanto, neste caso, somente metade da quantidade das contas de PSB-CO- NH-LC-PEO-biotina, isto é, 16x106 contas, foram empregadas para reagir com uma quantidade conhecida de MB.[000148] Poisson distribution measurements were performed using 10 µm diameter PSB-CO-NH-LC-PEO-biotin beads, with two different sizes of streptavidin/polystyrene covered magnetic beads (Dynal beads of 1.0 and 2.8 µm in diameter). When ten of the thousand PSB-CO-NH-LC-PEO-biotin beads are sufficiently mixed in the solution, with the same number, or a greater number, of either 1.0 or 2.8 µm magnetic beads, the probability of PSB-CO-NH-LC-PEO-biotin beads adhering, through the irreversible reaction between biotin from PSB and streptavidin from MB, can be observed and compared with that predicted for a Poisson distribution. Experimentally, 50 µL of ~6.5x104 beads/µL of PSB-CO-NH-LC-PEO-biotin beads (3.3x106 PSB in total) were diluted with 175 µL of 1X B&W buffer, and transferred to a microcentrifuge tube containing a known number of streptavidin-coated magnetic beads (1.0 µm in diameter) that were magnetically separated from the manufacturer's original suspension and washed once with 200 µL of 2X B&W buffer. The mixture was immediately stirred and rotated at 40 rpm for 1 hour before the PSB-MB aggregates were magnetically separated from the mixture. The resulting supernatant contained free unbound PSB-CO-NH-LC-PEO-biotin beads, and the number of PSB in the supernatant was determined by optical examination with an inverted microscope. Similar procedures were employed to study the Poisson distribution of 2.8 µm MB. However, in this case, only half the quantity of PSB-CO-NH-LC-PEO-biotin beads, that is, 16x106 beads, were used to react with a known amount of MB.

[000149] Quando um número muito grande de contas magnéticas e contas de poliestireno são misturados juntos, a probabilidade P(m, n) desses dois tipos de contas colidir e reagir irreversivelmente deve seguir uma distribuição Poisson e depende dos dois seguintes parâmetros: (a) a relação inicial de contas magnéticas para contas de poliestireno m, e (b) o número de contas magnéticas ligadas a cada conta de poliestireno n. Por exemplo, se um número igual de contas de MB e PS foram misturados (m= 1), o número médio de MB ligado a OS deve ser um. Entretanto, haverá uma distribuição, com n = 0, 1, 2... para induzir a este valor médio. A relação entre P(m, n), m, e n pode ser descrita pela distribuição Poisson como segue: (Veja, Haight, Handbook of the Poisson Distribution; John Willey & Sons, Inc.: Nova York, 1967.)[000149] When a very large number of magnetic beads and polystyrene beads are mixed together, the probability P(m, n) of these two types of beads colliding and reacting irreversibly must follow a Poisson distribution and depends on the following two parameters: (a ) the initial ratio of magnetic beads to polystyrene beads m, and (b) the number of magnetic beads attached to each polystyrene bead n. For example, if an equal number of MB and PS accounts were mixed (m= 1), the average number of MB linked to OS should be one. However, there will be a distribution, with n = 0, 1, 2... to induce this average value. The relationship between P(m, n), m, and n can be described by the Poisson distribution as follows: (See, Haight, Handbook of the Poisson Distribution; John Willey & Sons, Inc.: New York, 1967.)

[000150] A Tabela 2 lista os valores de P(m, n) para diferentes valores de m e n. Com esta tabela e os dados do teste de distribuição Poisson (fornecidos acima), alguém pode estimar o número mínimo de contas magnéticas requeridas para ligar e arrancar uma única conta de poliestireno da solução de reação. Por exemplo, do número de PSB coletado do sobrenadante, o percentual do PSB ligado com MB e arrancado magneticamente da mistura de reação pode ser calculado. Um grupo de dados de "% de PSB ligado" com um número de valores m conhecidos, por exemplo, m= 1, 2, 3, 4, 5..., pode então ser obtido experimentalmente. Se os dados se ajustam aos valores teóricos de, onde m é conhecido dos experimentos conduzidos, j= 0, 1, 2, 3..., e P(m,n>j) = (copiar a fórmula da página 50) então o número mínimo de contas magnéticas requeridas para ligar e afastar uma única conta de poliestireno deve ser j+1. Tabela 2 Tabela 2 n m 1 2 3 4 5 6 8 10 12 0 0,036788 0,12534 0,049787 0,018316 0,0067379 0,0024788 0,00033546 4,5400e-05 6,1442e-06 1 0,36788 0,27067 0,14936 0,073263 0,033690 0,014873 0,0026837 0,00045400 7,3731e-05 2 0,18394 0,27067 0,22404 0,14653 0,084224 0,044618 0,010735 0,0022700 0,00044238 3 0,061313 0,18045 0,22404 0,19537 0,14037 0,089235 0,028626 0,0075667 0,0017695 4 0,015328 0,090224 0,16803 0,19537 0,17547 0,13385 0,057252 0,018917 0,0053086 5 0,0030657 0,036089 0,0082 0,15629 0,17547 0,16062 0,091604 0,037833 0,012741 ... soma ... ... 1 ... 1 ... 1 ... 1 ... 1 ... 1 ... 1 ... 1[000150] Table 2 lists the values of P(m, n) for different values of m and n. With this table and the data from the Poisson distribution test (given above), one can estimate the minimum number of magnetic beads required to turn on and pluck a single polystyrene bead from the reaction solution. For example, from the number of PSB collected from the supernatant, the percentage of PSB bound with MB and magnetically pulled out of the reaction mixture can be calculated. A data set of "% PSB bound" with a number of known values m, for example, m= 1, 2, 3, 4, 5..., can then be obtained experimentally. If the data fits the theoretical values of , where m is known from the experiments conducted, j= 0, 1, 2, 3..., and P(m,n>j) = (copy the formula from page 50) then the minimum number of magnetic beads required to connect and moving away a single polystyrene bead should be j+1. Table 2 Table 2 nm 1 2 3 4 5 6 8 10 12 0 0.036788 0.12534 0.049787 0.018316 0.0067379 0.0024788 0.00033546 4.5400e-05 6.1442e-06 1 0.36 788 0, 27067 0.14936 0.073263 0.033690 0.014873 0.0026837 0.00045400 7.3731e-05 2 0.18394 0.27067 0.22404 0.14653 0.084224 0.044 618 0.010735 0.0022700 0 .00044238 3 0.061313 0.18045 0.22404 0.19537 0.14037 0.089235 0.028626 0.0075667 0.0017695 4 0.015328 0.090224 0.16803 19537 0.17547 0.13385 0 .057252 0.018917 0.0053086 5 0.0030657 0.036089 0.0082 0.15629 0.17547 0.16062 0.091604 0.037833 0.012741 ... sum ... ... 1 ... 1...1...1...1...1...1...1

[000151] Figura 9 mostra dois exemplos de um tal teste. No primeiro exemplo (Figura 9a), 2,8 µm de MB e 10 µm de PSB foram empregados, e uma relação de ligação mínima e MB/PSB = 1 pode ser deduzida. No segundo exemplo (Figura 9b), ao invés de 2,8 µm de MB, 1,0 µm de MB foi empregado para reagir com 10 µM de PSB. Neste caso uma relação de ligação de MB para PSB mínima mais elevada de 3 foi obtida. Essas relações de ligação podem ser utilizadas para otimizar as condições experimentais para a hibridização de DNA entre MB e PSB, a fim de que uma concentração de DNA alvo mínima possa ser detectada.[000151] Figure 9 shows two examples of such a test. In the first example (Figure 9a), 2.8 µm of MB and 10 µm of PSB were employed, and a minimum bond ratio of MB/PSB = 1 can be deduced. In the second example (Figure 9b), instead of 2.8 µm of MB, 1.0 µm of MB was used to react with 10 µM of PSB. In this case a higher minimum MB to PSB bond ratio of 3 was obtained. These binding relationships can be used to optimize experimental conditions for DNA hybridization between MB and PSB so that a minimum target DNA concentration can be detected.

Example 8: Loading of Two Aromatic Hydrocarbons, DPA and Rubrene, into Polystyrene Beads

[000152] Além de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2, os hidrocarbonetos aromáticos, por exemplo, 9,10-difenillantraceno (DPA, Figura 11a) e rubreno (RUB, Figura 11b), foram também carregados em contas de poliestireno (PSB). Como um resultado, os rótulos de ECL com comprimentos de onda de emissão diferentes foram obtidos. Os procedimentos de carregamento foram similares àqueles empregados para captura de Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2, exceto que 5% de THF-95% de MeOH de "solvente de dilatação" foi substituído por 5% de benzeno- 95% de MeOH a fim de que os dois hidrocarbonetos aromáticos sejam suficientemente solúveis em benzeno contido no solvente. A Figura 12 sumariza os procedimentos de carregamento.[000152] In addition to Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2, aromatic hydrocarbons, for example, 9,10-diphenylanthracene (DPA, Figure 11a) and rubrene (RUB, Figure 11b), were also loaded into polystyrene beads (PSB). As a result, ECL labels with different emission wavelengths were obtained. Loading procedures were similar to those employed for Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2 capture, except that 5% THF-95% MeOH "swelling solvent" was replaced by 5% benzene- 95% MeOH so that the two aromatic hydrocarbons are sufficiently soluble in benzene contained in the solvent. Figure 12 summarizes the loading procedures.

[000153] A captura de DPA e RUB em PSB foi visualmente verificada empregando imageamento fluorescente com excitações de luz UV. Como mostrado na Figura 13a e b, as imagens fluorescentes azul escuro e amarelo para laranja são observadas para PSB carregado de DPA e RUB, respectivamente. Em contraste, PSB com nenhum hidrocarboneto aromático mostrou fluorescência verde fraca (Figura 13c).[000153] The capture of DPA and RUB in PSB was visually verified using fluorescent imaging with UV light excitations. As shown in Figure 13a and b, dark blue and yellow to orange fluorescent images are observed for DPA- and RUB-loaded PSB, respectively. In contrast, PSB with no aromatic hydrocarbons showed weak green fluorescence (Figure 13c).

[000154] Uma capacidade de carregamento de 7,5x109 moléculas de DPA por conta ou 4,0 x 108 moléculas RUB por conta foi estimada com base nos dados de ECL obtidos do PSB carregado de DPA e RUB dissolvido em MeCN e solução de DPA ou RUB padrão empregando tripropilamina (TPrA) como um co-reagente. Figura 14 mostra o comportamento de CV e ECL de (a) PSB carregado de DPA dissolvido em MeCN e (b) 0,25 mM de solução de acetonitrila de DPA empregando TPrA como um co-reagente. O comportamento de CV e ECL de PSB carregado de RUB dissolvido em MeCN e 35 µM de solução de acetonitrila de RUB empregando TPrA como um co- reagente é mostrado na Figura 15a e 15b, respectivamente.[000154] A loading capacity of 7.5x109 DPA molecules per bead or 4.0 x 108 RUB molecules per bead was estimated based on ECL data obtained from DPA and RUB loaded PSB dissolved in MeCN and DPA solution or Standard RUB employing tripropylamine (TPrA) as a co-reactant. Figure 14 shows the CV and ECL behavior of (a) DPA-loaded PSB dissolved in MeCN and (b) 0.25 mM DPA acetonitrile solution employing TPrA as a coreactant. The CV and ECL behavior of RUB-loaded PSB dissolved in MeCN and 35 µM RUB acetonitrile solution employing TPrA as a co-reactant is shown in Figure 15a and 15b, respectively.

Example 9: C-Reactive Protein (CRP) ECL Detection

[000155] Os conjugados Ru(II)o PSB/Avidina ^ Anti-CRP foram preparados como segue: 0,100-0,500 mL de Ru(II)o PSB/Avidina (6,5 c 104 contas/µL) (veja, Exemplo 4) foram misturados com 1 mL de 2,0 mg/mL de anti-CRP biotinilado (Miao e Bard, 2003, Anal. Chem. 75:5825) em 0,10 M de tampão de PBS (0,1 M de fosfato de sódio, 0,15 M de cloreto de sódio) (pH 7,2) (Pierce, Rockford, IL) com uma taxa de rotação de 25 rpm em temperatura ambiente durante 1 hora. Os conjugados recentemente formados foram coletados por centrifugação, lavados com tampão 1X B&W três vezes (veja, Exemplo 4), e novamente suspensos em 1 mL de 2% de albumina de soro bovino (BSA)/0,10 M de solução de PBS (pH 7,2) durante 30 minutos. Após a centrifugação e lavagem (como acima), os conjugados foram suspensos em um volume adequado (0,100-0,500 mL) de 0,10 M de solução de tampão de PBS (pH 7,2) e mantidos a 4oC até o uso.[000155] Ru(II)o PSB/Avidin ^ Anti-CRP conjugates were prepared as follows: 0.100-0.500 mL of Ru(II)o PSB/Avidin (6.5 and 104 beads/µL) (see, Example 4 ) were mixed with 1 mL of 2.0 mg/mL biotinylated anti-CRP (Miao and Bard, 2003, Anal. Chem. 75:5825) in 0.10 M PBS buffer (0.1 M phosphate sodium, 0.15 M sodium chloride) (pH 7.2) (Pierce, Rockford, IL) with a rotation rate of 25 rpm at room temperature for 1 hour. The newly formed conjugates were collected by centrifugation, washed with 1X B&W buffer three times (see, Example 4), and resuspended in 1 mL of 2% bovine serum albumin (BSA)/0.10 M PBS solution ( pH 7.2) for 30 minutes. After centrifugation and washing (as above), conjugates were suspended in an appropriate volume (0.100-0.500 mL) of 0.10 M PBS buffer solution (pH 7.2) and kept at 4oC until use.

[000156] Os conjugados de MB ^Anti-CRP foram preparados como segue: 0,100 -0,500 mL de contas magnéticas cobertas de estreptavidina de 2,8 µm de diâmetro (MB, 6,5x105 contas/µL) foram magneticamente separados e lavados uma vez com 1 mL de tampão 2X B%W e duas vezes com 1 mL de tampão 1X B&W, seguido por mistura com 1,5 mL de 2,0 mg/mL de anti-CRP biotinilado em 0,10 M de tampão de PBS (pH 7,2) em uma taxa de rotação de 25 rpm em temperatura ambiente durante 1 hora. Os conjugados de MB ^Anti- CRP recentemente formados foram lavados com 1 mL de tampão 1X B&W 3 vezes, novamente suspensos em um volume adequado (0,1000,500 mL) de 0,10 M de solução de tampão de PBS (pH 7,2), e armazenados a 4oC até o uso.[000156] MB^Anti-CRP conjugates were prepared as follows: 0.100 -0.500 mL of 2.8 µm diameter streptavidin-coated magnetic beads (MB, 6.5x105 beads/µL) were magnetically separated and washed once with 1 mL of 2X B%W buffer and twice with 1 mL of 1X B&W buffer, followed by mixing with 1.5 mL of 2.0 mg/mL biotinylated anti-CRP in 0.10 M PBS buffer ( pH 7.2) at a rotation rate of 25 rpm at room temperature for 1 hour. The newly formed MB^Anti-CRP conjugates were washed with 1 mL of 1X B&W buffer 3 times, resuspended in an appropriate volume (0.1000.500 mL) of 0.10 M PBS buffer solution (pH 7 ,2), and stored at 4oC until use.

[000157] Os conjugados Ru(II)o PSB/Avidina ^ Anti-CRP<CRP>MB ^ Anti-CRP tipo sanduíche foram formados como segue: 20 µL de conjugados de Ru(II)c PSB/Avidina ^ Anti-CRP (1,3 x 106 PSB no total) e 20 µL de conjugados de MB ^ Anti-CRP (1,3 x 107 de MB no total) foram gentilmente misturados com uma amostra de CRP em 200 µL de 0,10 M de solução de tampão de PBS (pH 7,2) em temperatura ambiente durante 2 horas. Os conjugados tipo sanduíche foram magneticamente separados da solução de mistura e lavados 3 vezes com 200 µL de tampão 1X B&W. Os conjugados foram então transferidos, com um volume pequeno de tampão PBS, para um novo tubo centrífugo de 2 mL, a fim de que possível adsorção de Ru(II)o PSB/Avidina ^ Anti-CRP livre na parede do tubo antigo fosse minimizada (cf. Exemplo 6). Finalmente, os "conjugados magnéticos" foram separados da solução com um magneto.[000157] Ru(II)o PSB/Avidin ^ Anti-CRP<CRP>MB ^ Anti-CRP sandwich-type conjugates were formed as follows: 20 µL of Ru(II)c PSB/Avidin ^ Anti-CRP conjugates ( 1.3 x 106 PSB in total) and 20 µL of MB ^ Anti-CRP conjugates (1.3 x 107 of MB in total) were gently mixed with a CRP sample in 200 µL of 0.10 M PSB solution. PBS buffer (pH 7.2) at room temperature for 2 hours. The sandwich conjugates were magnetically separated from the mixing solution and washed 3 times with 200 µL of 1X B&W buffer. The conjugates were then transferred, with a small volume of PBS buffer, to a new 2 mL centrifuge tube, so that possible adsorption of free Ru(II) PSB/Avidin ^ Anti-CRP on the wall of the old tube was minimized. (cf. Example 6). Finally, the "magnetic conjugates" were separated from the solution with a magnet.

[000158] CRP foi detectado por ECL. Os conjugados tipo sanduíche obtidos foram dissolvidos em 0,500 mL de solução de 0,10 M de TPrA- 0,055 TFAA-0,10 M de (TBA)BF4 MeCN, e os experimentos de ECL foram realizados em um eletrodo de Pt de 2,2 mm de diâmetro empregando voltametria cíclica com uma janela de potencial de varredura entre 0 e 2,8 V vs. Ag/Ag+ (10 mM de AgBF4 em 0,10 M de (TBA)BF4 MeCN) em uma taxa de varredura de 50 mV/s. Como esperado, os perfis de CV e ECL obtidos dos conjugados tipo sanduíche foram muito similares àqueles mostrados na Figura 4a e c, uma vez que, em ambos os casos, as "espécies reativas", Ru(bpy)32+ e TPrA, foram os mesmos. Como mostrado na Figura 16, a intensidade de ECL (a média da intensidade do pico de varredura dianteiro e a intensidade do pico de varredura reverso) é linearmente proporcional à concentração de CRP sobre a faixa de 0,010-10 µg/mL.[000158] CRP was detected by ECL. The obtained sandwich conjugates were dissolved in 0.500 mL of 0.10 M TPrA- 0.055 TFAA-0.10 M (TBA)BF4 MeCN solution, and the ECL experiments were carried out on a 2.2 Pt electrode. mm in diameter employing cyclic voltammetry with a sweep potential window between 0 and 2.8 V vs. Ag/Ag+ (10 mM AgBF4 in 0.10 M (TBA)BF4 MeCN) at a scan rate of 50 mV/s. As expected, the CV and ECL profiles obtained from the sandwich conjugates were very similar to those shown in Figure 4a and c, since, in both cases, the "reactive species", Ru(bpy)32+ and TPrA, were the same. As shown in Figure 16, the ECL intensity (the average of the forward scan peak intensity and the reverse scan peak intensity) is linearly proportional to the CRP concentration over the range of 0.010-10 µg/mL.

[000159] Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Na medida em que as publicações e patentes ou pedidos de patentes incorporados por referência contradizem a descrição contida na específicação, a específicação é pretendida superceder e/ou tomar precedência sobre qualquer tal material contraditório.[000159] All references cited here are incorporated herein by reference in their entirety. To the extent that publications and patents or patent applications incorporated by reference contradict the description contained in the specification, the specification is intended to supersede and/or take precedence over any such contradictory material.

[000160] Todos os números expressando quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante empregados na específicação e reivindicações são para serem entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Conseqüentemente, a menos que de outro modo indicado ao contrário, os parâmetros numéricos apresen-tados na específicação e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas consideradas serem obtidas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar o pedido da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser considerado levando em consideração o número de dígitos e abordagens completas ordinárias.[000160] All numbers expressing amounts of ingredients, reaction conditions, and so on employed in the specification and claims are to be understood as being modified in all cases by the term "about". Accordingly, unless otherwise indicated to the contrary, the numerical parameters presented in the specification and appended claims are approximations that may vary depending on the desired properties considered to be obtained by the present invention. At a minimum, and not as an attempt to limit the doctrine's claim to equivalents to the scope of the claims, each numerical parameter should be considered taking into account the number of digits and ordinary complete approaches.

[000161] Muitas modificações e variações desta invenção podem ser feitas sem afastar-se de seu espírito e escopo, como será evidente àqueles versados na técnica. As modalidades específicas descritas aqui são oferecidas através de exemplo somente e não é pretendido ser limitante de modo algum. É pretendido que a específicação e exemplos sejam considerados como exemplares somente, com um escopo e espírito verdadeiros da invenção sendo indicados pelas seguintes reivindicações.[000161] Many modifications and variations of this invention can be made without departing from its spirit and scope, as will be evident to those skilled in the art. The specific embodiments described here are offered by way of example only and are not intended to be limiting in any way. It is intended that the specification and examples be considered as exemplary only, with a true scope and spirit of the invention being indicated by the following claims.

Claims

1. Method for detecting a nucleic acid or protein in a sample, characterized by the fact that it comprises: (a) forming a composition comprising: (B)u, (C), (D)x wherein B is a first vehicle in the form of a polystyrene sphere comprising at least 104 and up to 1012 ECL (electrochemiluminescence) moieties entrapped within it, and B is either linked to the nucleic acid or protein, or linked to a first binding pair specific to the nucleic acid or protein; wherein each of the ECL (electrochemiluminescence) portions can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; and each ECL (electrochemiluminescence) moiety comprises a ruthenium polydendate complex, which includes three bipyridyl and/or substituted bipyridyl ligands and is soluble in an organic solvent and insoluble in an aqueous solvent; C is the sample that may contain the nucleic acid or protein; and D is a second carrier that is either linked to the nucleic acid or protein, or linked to a second binding pair specific to the nucleic acid or protein; where u and x are each an integer equal to or greater than 1; (b) separating a complex comprising B and D from other components of the composition; (c) inducing the ECL (electrochemiluminescence) moieties in the complex to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure of the moiety to electrochemical energy; and (d) detect the emitted electromagnetic radiation and thereby detect the presence of the nucleic acid or protein; provided that if B is bound to the nucleic acid or protein, then D is bound to the second specific binding pair.

2. Kit for detecting a nucleic acid or protein in a sample, characterized in that it comprises: a first vehicle comprising a polystyrene sphere containing at least 104 and up to 1012 ECL (electrochemiluminescence) moieties entrapped within it, wherein the first carrier is either linked to the nucleic acid or protein, or linked to a specific first binding pair of the nucleic acid or protein; and a second carrier, which is a magnetic bead and which is either linked to the nucleic acid or protein, or linked to a second binding pair specific to the nucleic acid or protein; wherein the ECL (electrochemiluminescence) moieties comprise a ruthenium polydendate complex, which includes three bipyridyl and/or substituted bipyridyl ligands, and are soluble in an organic solvent and insoluble in an aqueous solvent; and the ECL (electrochemiluminescence) portions can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; and the first and second carriers are not both linked to the nucleic acid or protein.

3. Kit according to claim 2, characterized by the fact that the ECL (electrochemiluminescence) portions comprise Ru(bpy)3(B(C6F5)4)2.

4. Kit according to claim 2, characterized in that a nucleic acid is detected.

5. Kit according to claim 4, characterized by the fact that the first and second binding pairs of the nucleic acid are oligonucleotides.

6. Kit according to claim 2, characterized in that a protein is detected.

7. Kit according to claim 6, characterized in that the first and second binding pairs are antibodies, parts of antibodies, or specific binding proteins.

8. Kit according to claim 2, characterized by the fact that it further comprises an ECL (electrochemiluminescence) co-reagent.

9. Kit according to claim 8, characterized by the fact that the ECL (electrochemiluminescence) co-reagent comprises tri-n-propylamine.

10. Kit according to claim 2, characterized in that a nucleic acid is detected and the first specific binding pair is an oligonucleotide.

11. Kit according to claim 2, characterized in that an antigen is detected and the first specific binding partner is an antibody or a part of an antibody.

12. Kit according to claim 2, characterized by the fact that the ECL (electrochemiluminescence) portions comprise Ru(bpy)3(B(C6F5)4)2.

13. Composition for use in detecting a nucleic acid or protein, characterized in that it comprises: a polystyrene sphere comprising at least 104 and up to 1012 ECL (electrochemiluminescence) portions entrapped therein, wherein the polystyrene sphere is or bound to the nucleic acid or protein, or bound to a specific binding pair of the nucleic acid or protein; and the ECL (electrochemiluminescence) portions can be induced to repeatedly emit electromagnetic radiation by direct exposure to an electrochemical energy source; and the ECL (electrochemiluminescence) moieties are soluble in an organic solvent and insoluble in an aqueous solvent and are a ruthenium polydendate complex, which includes three bipyridyl and/or substituted bipyridyl ligands.

14. Composition according to claim 13, characterized by the fact that the ruthenium polydendate complex comprises Ru(bpy)3 [B(C6F5)4]2.

15. Composition according to claim 13, characterized by the fact that the ECL (electrochemiluminescence) moieties comprise bis (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II) or tris (2,2'-bipyridyl) ruthenium (II).

16. Composition according to claim 13, characterized in that a protein is detected; the specific binding pair is an antibody or a part of an antibody.

17. Composition according to claim 13, characterized in that a nucleic acid is detected; the specific binding pair is a nucleic acid.

18. Composition according to claim 13, characterized in that an antigen is detected; and the specific binding pair is an antibody, a part of an antibody or a specific binding protein.