BRPI0505457B1

BRPI0505457B1 - SEED ENDOSPERE PROTEIN EXTRACTION PROCESS

Info

Publication number: BRPI0505457B1
Application number: BRPI0505457-5A
Authority: BR
Inventors: Alves Miranda Everson; Leite Adilson; Sanchez Farinas Cristiane
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Priority date: 2005-12-01
Filing date: 2005-12-01
Publication date: 2018-02-06
Also published as: BRPI0505457A

Abstract

processo de extração de proteínas de endosperma de sementes a presente invenção tem por objetivo um processo de extração de proteínas de sementes, preferencialmente a extração de proteínas com características hidrofóbicas, tal como a pró-insulina recombinante, que pode ser humana ou animal, de sementes de milho transgênico, como etapa inicial do processo de recuperação e purificação de pró-insulina. a pró-insulina é a molécula precursora do hormônio insulina, medicamento utilizado no tratamento da diabetes. as etapas de extração incluem a preparação da farinha, a extração da proteína com um solvente aquoso alcalino com a adição de um agente redutor e a remoção dos sólidos em suspensão através de filtração ou centrifugação. a produção de proteínas recombinantes em plantas é mais econômica do que os atuais processos de fermentação. um processo que utilize um tampão de extração simples, de baixo custo e eficiente pode reduzir os custos totais do processo de produção de fármacos, tais como a insulina a partir de plantas transgênicas.Seed Endosperm Protein Extraction Process The present invention is directed to a seed protein extraction process, preferably the extraction of proteins with hydrophobic characteristics, such as recombinant pro-insulin, which may be human or animal, from seeds. of transgenic corn as the initial stage of the proinsulin recovery and purification process. proinsulin is the precursor molecule of the hormone insulin, a medicine used to treat diabetes. Extraction steps include preparing the flour, extracting the protein with an alkaline aqueous solvent with the addition of a reducing agent and removing the suspended solids by filtration or centrifugation. The production of recombinant proteins in plants is more economical than current fermentation processes. A process that utilizes a simple, low cost and efficient extraction buffer can reduce the total costs of the drug production process, such as insulin from transgenic plants.

Description

(54) Título: PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE ENDOSPERMA DE SEMENTES (51) Int.CI.: C07K 1/14; C07K 14/62; A61P 3/10 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP (72) Inventor(es): EVERSON ALVES MIRANDA; ADILSON LEITE; CRISTIANE SANCHEZ FARINAS ·· · • · · «· ·(54) Title: SEED ENDOSPERMA PROTEIN EXTRACTION PROCESS (51) Int.CI .: C07K 1/14; C07K 14/62; A61P 3/10 (73) Holder (s): UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP (72) Inventor (s): EVERSON ALVES MIRANDA; ADILSON LEITE; CRISTIANE SANCHEZ FARINAS ·· · • · · · · · ·

1/12 ·«· · · · · · ···· ···· * ♦ · · • · · « · · ··· · · ·······* ···· proteínas sentido é1/12 · «· · · · · · ········ * ♦ · · • · ·« · · ··· · · ······· * ···· proteins sense is

Processo de extração de proteínas de endosperma de sementes Campo da InvençãoProcess of extraction of proteins from seed endosperm Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um processo de extração de proteínas de sementes, preferencialmente a extração de proteínas com características hidrofóbicas, tal como a próinsulina recombinante, que pode ser humana ou animal, de sementes de milho transgênico, como etapa inicial do processo de recuperação e purificação de pró-insulina. A pró-insulina é a molécula precursora do hormônio insulina, medicamento utilizado no tratamento da diabetes. A produção de proteínas recombinantes em plantas é mais econômica do que os atuais processos de fermentação. A vantagem do processo objeto deste pedido de patente é que um processo que utilize uma solução de extração simples, de baixo custo e eficiente pode reduzir os custos totais do processo de produção de fármacos a partir de plantas transgênicas, tais como a insulina. O processo descrito insere-se em área de ponta dentre da biotecnologia que é a utilização de organismos geneticamente modificados para a produção de proteínas de uso farmacêutico, agrícola ou industrial.The present invention relates to a process of extracting protein from seeds, preferably the extraction of proteins with hydrophobic characteristics, such as the recombinant proinsulin, which can be human or animal, from transgenic corn seeds, as an initial stage of the recovery process and purification of proinsulin. Proinsulin is the precursor molecule of the hormone insulin, a medicine used to treat diabetes. The production of recombinant proteins in plants is more economical than the current fermentation processes. The advantage of the process object of this patent application is that a process that uses a simple, low-cost and efficient extraction solution can reduce the total costs of the process of producing drugs from transgenic plants, such as insulin. The described process is part of a cutting edge area of biotechnology, which is the use of genetically modified organisms for the production of proteins for pharmaceutical, agricultural or industrial use.

Fundamentos da InvençãoFundamentals of the Invention

As recentes descobertas no campo da genômica têm despertado interesse na busca de novos sistemas de produção de terapêuticas e um progresso significante neste o uso de plantas transgênicas como biorreatores, também conhecido como molecular farming. A lista de proteínas, bastante complexas, produzidas com sucesso em plantas tem crescido consideravelmente, sendo que nos últimos dez anos mais de 100 proteínas recombinantes foram produzidas em diferentes espécies de plantas. Entre as principais vantagens do uso de plantas para a produção de proteínas recombinantes incluem a capacidade de produzir proteínas com estrutura e das proteínas nativas, pois plantas de modificação e processamento pósfunção idênticas as apresentam sistemas traducionais, baixo custo de cultivo, facilidade de aumento deRecent discoveries in the field of genomics have aroused interest in the search for new therapeutic production systems and significant progress has been made in the use of transgenic plants as bioreactors, also known as molecular farming. The list of proteins, quite complex, successfully produced in plants has grown considerably, and in the last ten years more than 100 recombinant proteins have been produced in different plant species. Among the main advantages of using plants for the production of recombinant proteins include the ability to produce proteins with structure and native proteins, since plants of modification and post-function processing identical to those present in translation systems, low cost of cultivation, ease of increase of

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«·* *·· escala, presença de órgãos naturais de estoque (sementes) e práticas já estabelecidas de colheita, armazenagem e processamento (Daniel1 et al., 2001; Jilka et al., 1999) . Além disso, o risco de contaminação associado a microrganismos patogênicos é minimizado em relação a outros sistemas de produção de proteínas, pois as plantas não atuam como hospedeiras de agentes infecciosos ao homem (Commandeur et al., 2003).«· * * ·· scale, presence of natural stock organs (seeds) and already established practices of harvesting, storage and processing (Daniel1 et al., 2001; Jilka et al., 1999). In addition, the risk of contamination associated with pathogenic microorganisms is minimized in relation to other protein production systems, as plants do not act as hosts for human infectious agents (Commandeur et al., 2003).

A primeira proteína de aplicação farmacêutica produzida em planta foi o hormônio de crescimento humano (hGH), expressado em tabaco transgênico em 1986 (Barta et al., 1986). A partir de então a expressão de proteínas recombinantes em plantas inclui desde enzimas de aplicação industrial até anticorpos e vacinas contra o vírus da hepatite B e do HIV (vírus da imunodeficiência humana). Segundo Horn et al. (2004), não restam dúvidas de que o uso de plantas como biorreatores está se afirmando mundialmente como um novo ramo industrial. Conforme a produção industrial se desenvolve, cresce a demanda por estudos relacionados ao desenvolvimento de processo, complementando, assim, o trabalho fundamental realizado pelos biologistas moleculares visando à otimização da expressão de proteínas.The first protein for pharmaceutical application produced in plants was the human growth hormone (hGH), expressed in transgenic tobacco in 1986 (Barta et al., 1986). Since then, the expression of recombinant proteins in plants includes from enzymes for industrial application to antibodies and vaccines against the hepatitis B virus and HIV (human immunodeficiency virus). According to Horn et al. (2004), there is no doubt that the use of plants as bioreactors is asserting itself worldwide as a new industrial branch. As industrial production develops, the demand for studies related to process development grows, thus complementing the fundamental work carried out by molecular biologists aiming at the optimization of protein expression.

Ao contrário do uso de plantas para a produção de vacinas comestíveis ou enzimas industriais, nas quais a purificação não é um requerimento essencial, as proteínas recombinantes para outras aplicações farmacêuticas requerem a purificação. E apesar de todos os avanços direcionados às estratégias de expressão de proteínas em plantas, pouca informação está disponível sobre o processo de recuperação e purificação destas biomoléculas (RPB). As etapas de processo de RPB são efetivamente as responsáveis pela maior parte dos custos de produção de proteínas terapêuticas a partir de plantas transgênicas, uma vez que a obtenção da biomassa vegetal só depende da existência de uma infra-estrutura agronômica. Portanto, os custos envolvidos na RPB são fundamentais para « · · * t · * · *Unlike the use of plants for the production of edible vaccines or industrial enzymes, in which purification is not an essential requirement, recombinant proteins for other pharmaceutical applications require purification. And in spite of all the advances directed to the strategies of expression of proteins in plants, little information is available on the process of recovery and purification of these biomolecules (RPB). The RPB process steps are effectively responsible for most of the costs of producing therapeutic proteins from transgenic plants, since obtaining plant biomass only depends on the existence of an agronomic infrastructure. Therefore, the costs involved in RPB are fundamental for «· · * t · * · *

3/12 avaliar se um novo sistema de expressão é competitivo ou não com os sistemas tradicionais, tais como culturas de células de mamíferos,, bactérias e leveduras. Sendo a extração a primeira operação do processo de RPB, ela é de suma importância, pois é esta operação que define qual será a composição da alimentação de todo o restante do processo. A etapa de extração deve proporcionar uma concentração eficiente da proteína recombinante, minimizando a presença de impurezas (proteínas, compostos fenólicos, carboidratos, óleo, etc.) no restante do processo.3/12 evaluate whether a new expression system is competitive or not with traditional systems, such as cultures of mammalian cells, bacteria and yeasts. Since extraction is the first operation in the RPB process, it is of paramount importance, as it is this operation that defines what the composition of the feed will be for the rest of the process. The extraction step must provide an efficient concentration of the recombinant protein, minimizing the presence of impurities (proteins, phenolic compounds, carbohydrates, oil, etc.) in the rest of the process.

A otimização das etapas de RPB é fundamental para a viabilidade comercial desta nova tecnologia. Já são conhecidos outros processos de extração de proteínas recombinantes de plantas transgênicas. No entanto, na maioria dos trabalhos publicados, as proteínas recombinantes são extraídas juntamente com outras proteínas presentes nos tecidos vegetais especificamente para a determinação do nível de acúmulo alcançado, para estabelecer a funcionalidade da proteína, ou para a confirmação da seqüência de aminoácidos. Dependendo da planta transgênica e da natureza da proteína recombinante, diferentes soluções de extração são utilizadas. Além do controle do pH e da força iônica, diferentes aditivos têm sido utilizados, tais como: detergentes, agentes redutores e inibidores de proteases (Kusnadi et al., 1997). Entretanto, a maioria dos procedimentos desenvolvidos em escala de bancada não podem ser diretamente escalonado devido, principalmente, ao alto custo dos reagentes utilizados.The optimization of the RPB stages is fundamental for the commercial viability of this new technology. Other processes for extracting recombinant proteins from transgenic plants are already known. However, in most published works, recombinant proteins are extracted together with other proteins present in plant tissues specifically to determine the level of accumulation achieved, to establish the functionality of the protein, or to confirm the sequence of amino acids. Depending on the transgenic plant and the nature of the recombinant protein, different extraction solutions are used. In addition to controlling pH and ionic strength, different additives have been used, such as: detergents, reducing agents and protease inhibitors (Kusnadi et al., 1997). However, most of the procedures developed on a bench scale cannot be directly scaled due, mainly, to the high cost of the reagents used.

Larrick et al. (2001) avaliaram o uso de água na extração de fragmentos de anticorpos de tabaco transgênico em comparação com o uso de um tampão a um pH específico, contendo seis aditivos responsáveis por diferentes ações bioquímicas. Nesse estudo, constatou-se que a quantidade de IgG extraída em água foi 70% desta proteína extraída em tampão, sugerindo que nem todos os aditivos usualmente recomendados são vitalmente importantes. Com isso, a simplificação do tampão de extração aLarrick et al. (2001) evaluated the use of water in the extraction of fragments of antibodies from transgenic tobacco compared to the use of a buffer at a specific pH, containing six additives responsible for different biochemical actions. In that study, it was found that the amount of IgG extracted in water was 70% of this protein extracted in buffer, suggesting that not all the additives usually recommended are vitally important. Thus, the simplification of the extraction buffer to

4/12 «·· · ··· » **· · ··· *»< * * · · ··· · · · « 4 4 »· » * »♦ · · * • · · » · « · ··' « * « ·*·««*·· -»··· ··« 4 · · ·»· dois componentes e um pH específico pode reduzir os custos, mantendo-se ainda uma alta eficiência de extração.4/12 «·· · ···» ** · · ··· * »<* * · ··· · · · · 4 4» · »*» ♦ · · * • · · »· · · ·· '«*« · * · «« * ·· - »··· ··« 4 · · · »· two components and a specific pH can reduce costs while still maintaining high extraction efficiency.

Estudos de extração semelhantes foram realizados por Menkhaus et al. (2004). O pH e a solução extratora (água, tampão fosfato de sódio ou solução de NaCl) foram avaliados na determinação da condição ótima para a extração de βglucuronidase produzida em ervilhas transgênicas. E também neste trabalho, a extração da proteína recombinante em água, a um pH controlado, foi tão eficiente quanto à extração realizada utilizando o tampão.Similar extraction studies were carried out by Menkhaus et al. (2004). The pH and the extracting solution (water, sodium phosphate buffer or NaCl solution) were evaluated to determine the optimal condition for the extraction of βglucuronidase produced in transgenic peas. And also in this work, the extraction of the recombinant protein in water, at a controlled pH, was as efficient as the extraction performed using the buffer.

Kusnadi et al. (1998) avaliaram a eficiência de diferentes tampões na extração das proteínas avidina e β-glucuronidase de sementes de milho transgênico. Avaliou-se o uso de tampões fosfato, borato e Tris a diferentes valores de pH, com diferentes aditivos: ditiotreitol (DTT) e β-mercaptoetanol (ME) como agentes redutores; EDTA como inibidor de proteases e sais de cloreto de cálcio e cloreto de sódio. Como foi constatado que a avidina estava acumulada na parede celular, utilizou-se uma alta concentração de sal a fim de enfraquecer a interação desta proteína com a parede celular. A maior atividade específica de avidina foi obtida usando o tampão Tris a pH 7,9 contendo 500 mM de NaCl e 1 mM de CaC12, sendo que na ausência do NaCl, a atividade específica da avidina foi apenas 10% da atividade obtida na presença do sal. Já para a enzima βglucuronidase, que se encontrava dispersa no citosol, a extração completa foi obtida utilizando o tampão fosfato de sódio a pH 7,5 com a adição de 1% de SDS e 2% de ME. Entretanto, a presença de 1% de SDS causou a inativação da enzima e, portanto, a extração da β-glucuronidase foi realizada com o tampão fosfato, com uma eficiência de extração de 70%, estimada em relação à quantidade da enzima remanescente na farinha. No entanto, o tampão fosfato de sódio a pH 7,5 não é eficiente para extração de proteínas de caráter hidrofóbico de sementes.Kusnadi et al. (1998) evaluated the efficiency of different buffers in the extraction of avidin and β-glucuronidase proteins from transgenic corn seeds. The use of phosphate, borate and Tris buffers was evaluated at different pH values, with different additives: dithiothreitol (DTT) and β-mercaptoethanol (ME) as reducing agents; EDTA as a protease inhibitor and salts of calcium chloride and sodium chloride. As it was found that avidin was accumulated in the cell wall, a high concentration of salt was used in order to weaken the interaction of this protein with the cell wall. The highest specific activity of avidin was obtained using the Tris buffer at pH 7.9 containing 500 mM NaCl and 1 mM CaC12, and in the absence of NaCl, the specific activity of avidin was only 10% of the activity obtained in the presence of salt. For the βglucuronidase enzyme, which was dispersed in the cytosol, complete extraction was obtained using sodium phosphate buffer at pH 7.5 with the addition of 1% SDS and 2% ME. However, the presence of 1% SDS caused the inactivation of the enzyme and, therefore, the extraction of β-glucuronidase was performed with phosphate buffer, with an extraction efficiency of 70%, estimated in relation to the amount of enzyme remaining in the flour. . However, sodium phosphate buffer at pH 7.5 is not efficient for extracting hydrophobic proteins from seeds.

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Azzoni (2002) estudou o efeito das variáveis de extração pH e força iônica na extração de aprotinina recombinante produzida em milho transgênico. O autor concluiu que o pH e a força iônica das soluções utilizadas influenciaram significativamente a extração tanto da proteína recombinante, como também das impurezas que foram quantificadas: carboidratos, compostos fenólicos, proteínas e lipídeos. Uma variação de pH de 3 a 10 aumentou a extração de proteínas totais do milho de 0,25 para 2% (w/w) da biomassa, com uma consequente variação no conteúdo de impurezas a serem removidas durante o processo de purificação. No entanto, a condição descrita por Azzoni (2002) não é suficiente para se obter uma extração eficiente de proteínas de caráter hidrofóbico de sementes.Azzoni (2002) studied the effect of pH and ionic strength extraction variables on the extraction of recombinant aprotinin produced in transgenic corn. The author concluded that the pH and ionic strength of the solutions used significantly influenced the extraction of both the recombinant protein, as well as the impurities that were quantified: carbohydrates, phenolic compounds, proteins and lipids. A pH variation from 3 to 10 increased the extraction of total corn proteins from 0.25 to 2% (w / w) of the biomass, with a consequent variation in the content of impurities to be removed during the purification process. However, the condition described by Azzoni (2002) is not sufficient to obtain an efficient extraction of hydrophobic proteins from seeds.

Entre os trabalhos de produção de proteínas recombinantes em plantas que descrevem a etapa de extração apenas como uma etapa essencial, sem haver a preocupação com a otimização do processo, podemos citar a extração da enzima lactato desidrogenase produzida em tabaco transgênico (Mejàre et al., 1998). As folhas de tabaco foram homogeneizadas em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,2 contendo 0,3 M de NaCl. Fieldler et al. (1997) também utilizaram apenas uma solução tampão (tampão PBS pH 7,6) na extração de fragmentos de anticorpos produzidos em tabaco. A extração de anticorpos contra a Hepatite B, produzidos em tabaco, também foi realizada com tampão PBS, agora em pH 8,0 e com a adição de ácido ascórbico à 4°C (Valdés et al., 2003).Among the works of production of recombinant proteins in plants that describe the extraction step only as an essential step, without concern with the optimization of the process, we can mention the extraction of the enzyme lactate dehydrogenase produced in transgenic tobacco (Mejàre et al., 1998). The tobacco leaves were homogenized in 50 mM sodium phosphate buffer pH 7.2 containing 0.3 M NaCl. Fieldler et al. (1997) also used only a buffer solution (PBS buffer pH 7.6) in the extraction of fragments of antibodies produced in tobacco. The extraction of antibodies against Hepatitis B, produced in tobacco, was also carried out with PBS buffer, now at pH 8.0 and with the addition of ascorbic acid at 4 ° C (Valdés et al., 2003).

Para o caso da enzima tripsina bovina recombinante expressa em milho transgênico, o primeiro produto comercial de larga escala produzido em plantas transgênicas, a extração da farinha do milho foi realizada com tampão acetato em pH 3,2 contendo 100 mM de NaCl em uma relação massa-volume de 1:3. A suspensão foi agitada durante 30 min e então centrifugada a 10.000 g para a remoção do material insolúvel (Woodard et al., 2003).For the case of recombinant bovine trypsin enzyme expressed in transgenic corn, the first large-scale commercial product produced in transgenic plants, the extraction of corn flour was carried out with acetate buffer at pH 3.2 containing 100 mM NaCl in a mass ratio - volume of 1: 3. The suspension was stirred for 30 min and then centrifuged at 10,000 g to remove insoluble material (Woodard et al., 2003).

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No entanto, algumas moléculas possuem natureza hidrofóbic.a, o que faz com que o processo de extração destas moléculas da farinha de sementes não sej a possível por procedimentos comumente descritos para a extração de proteínas de plantas.However, some molecules are hydrophobic in nature, which means that the process of extracting these molecules from seed flour is not possible by procedures commonly described for the extraction of proteins from plants.

Processos de extração das proteínas zeínas, que constituem as prolaminas da semente de milho, e possuem uma característica hidrofóbica, foram propostos por alguns autores (Takahashi et al., 1996). A desvantagem destes processos para a produção de produtos de aplicação farmacêutica é que a maioria deles utiliza solvente orgânico para a extração. Além disso, solventes orgânicos, como o hexano, são danosos ao meio ambiente. 'Outros processos de extração de zeínas utilizam soluções alcoólicas em diferentes proporções (Russell e Tsao, 1982; Shukla e Cheryan, 2001). Condições bastante similares foram testadas na extração de pró-insulina de milho, resultando entretanto em baixa eficiência (como descrito a seguir). Wallace et al. (1990) desenvolveram um método de solubilização completa das proteínas do endosperma do milho utilizando um tampão alcalino contendo um agente redutor e um detergente. Os autores demonstraram que a agitação da farinha do milho durante 60 min a temperatura ambiente em tampão borato de sódio 125 mM pH 10,0 contendo SDS a 1% e ME a 2% representativa proporcionou uma quantitativamente das extração mais proteínas do milho. O SDS é um detergente que possui um efeito solubilizante, entretanto seu uso possui o inconveniente de interferir negativamente nas etapas seguintes do processo de RPB devido a formação de micelas.Processes for extracting the zein proteins, which constitute the corn seed prolamines, and have a hydrophobic characteristic, have been proposed by some authors (Takahashi et al., 1996). The disadvantage of these processes for the production of pharmaceutical products is that most of them use organic solvent for extraction. In addition, organic solvents, such as hexane, are harmful to the environment. 'Other zein extraction processes use alcoholic solutions in different proportions (Russell and Tsao, 1982; Shukla and Cheryan, 2001). Very similar conditions were tested in the extraction of pro-insulin from corn, resulting in low efficiency (as described below). Wallace et al. (1990) developed a method of complete solubilization of corn endosperm proteins using an alkaline buffer containing a reducing agent and a detergent. The authors demonstrated that stirring the corn flour for 60 min at room temperature in 125 mM sodium borate buffer pH 10.0 containing 1% SDS and a representative 2% ME provided a quantitative extraction plus corn proteins. SDS is a detergent that has a solubilizing effect, however its use has the drawback of interfering negatively in the following stages of the RPB process due to the formation of micelles.

Streatfield e Howard (2003) descrevem o uso de plantas para a produção de insulina e outras proteínas relacionadas à insulina. Os autores utilizaram a semente de milho para a expressão da proteína recombinante e utilizaram um tampão Bis Tris em pH 6,5 com NaCl 500 mM para a extração das sementes moldas em um moedor de café caseiro.Streatfield and Howard (2003) describe the use of plants for the production of insulin and other insulin-related proteins. The authors used the corn seed for the expression of the recombinant protein and used a Bis Tris buffer at pH 6.5 with 500 mM NaCl for the extraction of the mold seeds in a homemade coffee grinder.

7/12 φ 10 • ·** · *·· · ··· · • · · · · · · ♦ · · · • · · * ·· * · ·· · · ·· · • · · · · · * · · · * « · ♦ ···«·*«· ···· • · · · · · · · · · • ·· ·· ·7/12 φ 10 • · ** · * ·· · ··· · • · · · · · ♦ · · · · · · ··· · · · · · ·· · • · · · · · · * · · · * «· ♦ ···« · * «· ···· · · · · · · · · · · ·· ·· ·

A extração de pró-insulina de endosperma de milho transgênico foi realizada por De Lucca (2003) utlizando tampão Tris-HCl 50 mM pH 8,5; EDTA 2 mM; benzamidina 5 mM; DTT 5 mM e Triton X100 0,2%. No entanto, o tampão de extração utilizado por De Lucca (2003) para ensaios de Western Blot é formado por uma solução contendo muitos aditivos e também é realizada em uma condição de alto cisalhamento, o que torna muito difícil e custosa a sua aplicação em escala industrial. Além disso, a presença de detergente é um inconveniente ao processo de RPB.The extraction of proinsulin from transgenic corn endosperm was performed by De Lucca (2003) using 50 mM Tris-HCl pH 8.5 buffer; 2 mM EDTA; 5 mM benzamidine; 5 mM DTT and 0.2% Triton X100. However, the extraction buffer used by De Lucca (2003) for Western Blot tests is formed by a solution containing many additives and is also carried out in a condition of high shear, which makes its application on a scale very difficult and costly. industrial. In addition, the presence of detergent is an inconvenience to the RPB process.

Tendo em vista este problema, e no propósito de superá-lo foram estudados diversos solventes em busca de um solvente de extração simples e de baixo custo, fundamental na viabilidade do processo de produção de proteínas recombinantes em plantas. Breve Descrição da InvençãoIn view of this problem, and in order to overcome it, several solvents have been studied in search of a simple and low-cost extraction solvent, fundamental in the viability of the process of production of recombinant proteins in plants. Brief Description of the Invention

A presente invenção se refere a um processo de extração de proteínas de sementes, preferencialmente a extração de proteínas com características hidrofóbicas, tal como a próinsulina recombinante, que pode ser humana ou animal, de sementes de milho transgênico, como etapa inicial do processo de recuperação e purificação de pró-insulina. A pró-insulina é a molécula precursora do hormônio insulina, medicamento utilizado no tratamento da diabetes. As etapas de extração incluem a preparação da farinha, a extração da proteína com um solvente aquoso alcalino com a adição de um agente redutor e a remoção dos sólidos em suspensão através de filtração ou centrifugação. A produção de proteínas recombinantes em plantas é mais econômica do que os atuais processos de fermentação. Um processo que utilize um tampão de extração simples, de baixo custo e eficiente pode reduzir os custos totais do processo de produção de fármacos, tais como a insulina a partir de plantas transgênicas.The present invention relates to a process of extracting protein from seeds, preferably the extraction of proteins with hydrophobic characteristics, such as the recombinant proinsulin, which can be human or animal, from transgenic corn seeds, as an initial stage of the recovery process and purification of proinsulin. Proinsulin is the precursor molecule of the hormone insulin, a medicine used to treat diabetes. The extraction steps include the preparation of the flour, the extraction of the protein with an aqueous alkaline solvent with the addition of a reducing agent and the removal of suspended solids through filtration or centrifugation. The production of recombinant proteins in plants is more economical than the current fermentation processes. A process that uses a simple, low-cost and efficient extraction buffer can reduce the total costs of the drug production process, such as insulin from transgenic plants.

A vantagem do processo aqui proposto é que a expressão da proteína recombinante foi direcionada para o endosperma da semente dè milho e, portanto, o processo de extração utiliza a farinha somente desta parte da semente. Além disso, utilizarThe advantage of the process proposed here is that the expression of the recombinant protein was directed to the endosperm of the corn seed and, therefore, the extraction process uses flour only from this part of the seed. In addition, using

8/12 • ··· · ··· · ··· · ····· · · · · * · • · ···· ···· · · ·· · • * ·· ··· ···· ·· • *····«·· · · · · ···· · · · · · · somente o endosperma é mais eficiente pois esta parte da semente possui somente, aproximadamente, 14% do óleo, enquanto o gérmem contém aproximadamente 80% do óleo. Isso é muito importante em termos de processo, pois o óleo pode causar danos aos equipamentos e entupimentos de membranas e resinas cromatográficas. A remoção de proteínas nativas da semente também é facilitada, uma vez que a complexidade protéica do gérmem é maior do que a do endosperma. Portanto, um processo de extração, que envolva uma etapa de degerminação da semente, como aqui proposto, é vantajosa. Outra vantagem importante do processo aqui proposto é que niveis de expressão em torno de 0,45% da proteína total solúvel foram obtidos, aproximadamente 64 vezes superior ao descrito por Streatfieid e Howard (2003) (0,007% da proteína total solúvel).8/12 • ··· · ··· · ··· · ····· · · · · * · • · ··· ····· · ·· · • * ·· ··· · ··· ·· • * ···· «·· · · · · ···· · · · · · · only the endosperm is more efficient because this part of the seed has only approximately 14% of the oil, while the germ contains approximately 80% of the oil. This is very important in terms of process, as the oil can cause damage to equipment and clogging of membranes and chromatographic resins. The removal of native proteins from the seed is also facilitated, since the protein complexity of the germ is greater than that of the endosperm. Therefore, an extraction process, which involves a seed degermination step, as proposed here, is advantageous. Another important advantage of the process proposed here is that expression levels around 0.45% of the total soluble protein were obtained, approximately 64 times higher than that described by Streatfieid and Howard (2003) (0.007% of the total soluble protein).

Descrição Detalhada da invençãoDetailed description of the invention

A presente invenção se refere a um processo de extração de proteínas de sementes, preferencialmente a extração de proteínas com características hidrofóbicas, tal como a próinsuiina recombinante, que pode ser humana ou animal, de sementes de milho transgênico, como etapa inicial do processo de recuperação e purificação de pró-insulina.The present invention relates to a process of extracting protein from seeds, preferably the extraction of proteins with hydrophobic characteristics, such as the recombinant proinsuiin, which can be human or animal, from transgenic corn seeds, as an initial stage of the recovery process and purification of proinsulin.

Para tal, fez-se uma análise qualitativa da eficiência de extração da pró-insulina da farinha do endosperma do milho transgênico em diferentes soluções (descritas na Tabela 1) através do ensaio qualitativo de eletroforese SDS-PAGE e Western Blot. Investigou-se o efeito de alguns componentes isoladamente, na tentativa de identificar os mais eficazes e se chegar a propor uma solução simples, de baixo custo e alta eficiência.For this, a qualitative analysis of the extraction efficiency of the pro-insulin from the transgenic corn endosperm flour was made in different solutions (described in Table 1) through the qualitative electrophoresis assay SDS-PAGE and Western Blot. The effect of some components was investigated in isolation, in an attempt to identify the most effective ones and to come up with a simple, low cost and high efficiency solution.

A extração em solução de NaCl 300 mM, pH 10,0 e ME 0,6% foi realizada com base em artigo de Landry e Moreaux (1981) em que os autores conseguiam a solubilização das glutelinas do milho neste solvente. Essa condição também não foi eficiente na solubilização da pró-insulina. Apesar da baixa complexidade obtido com solvente etanol 70%, uma característica desejada,Extraction in 300 mM NaCl solution, pH 10.0 and 0.6% ME was performed based on an article by Landry and Moreaux (1981) in which the authors managed to solubilize the corn glutelin in this solvent. This condition was also not efficient in solubilizing pro-insulin. Despite the low complexity obtained with 70% ethanol solvent, a desired characteristic,

9/12 • ··· · ··· · ··· · ··· ··· ··*·« ··* · * · • · ···* ···· ···· « • *·· · · · · ··· · · • ········ ···· ···· · · · · · · ele não é eficiente na extração de pró-insulina. Devido à baixa complexidade protéíca obtida no extrato utilizando solvente alcoólico optou-se por investigar combinações envolvendo os álcoois etanol ou isopropanol, o agente redutor DTT e os tampões glicina-HCl pH 3,0 e bicarbonato de sódio pH9/12 • ··· · ··· · ··· · ··· ··· ·· * · «·· * · * · • · ··· * ···· ····« • * ·· · · · · ··· · · • ········ ···· ···· · · · · · · it is not efficient in extracting pro-insulin. Due to the low protein complexity obtained in the extract using alcoholic solvent, it was decided to investigate combinations involving ethanol or isopropanol alcohols, the reducing agent DTT and the glycine-HCl buffers pH 3.0 and sodium bicarbonate pH

10,0.10.0.

Como as γ-zeínas são ditas solúveis em soluções compostas de 0 a 80% isopropanol na presença de um agente redutor e também em isopropanol 30% em tampão acetato de sódio 30 mM (Shukla e Cheryan, 2001), avaliou-se diferentes porcentagens deste álcool na presença de DTT 5 mM. Apesar da baixa complexidade protéica dos extratos obtidos quando feitas as extrações em solvente alcoólico a eficiência de extração de pró-insulina foi baixa em comparação com a extração em tampão alcalino.As γ-zeins are said to be soluble in solutions composed of 0 to 80% isopropanol in the presence of a reducing agent and also in 30% isopropanol in 30 mM sodium acetate buffer (Shukla and Cheryan, 2001), different percentages of this were evaluated. alcohol in the presence of 5 mM DTT. Despite the low protein complexity of the extracts obtained when extractions were made in alcoholic solvent, the extraction efficiency of proinsulin was low in comparison with extraction in alkaline buffer.

Com base nestes estudos foi desenvolvido um processo para a extração de proteínas de sementes, objeto da presente patente. A vantagem do processo proposto é que um processo que utilize uma solução de extração simples, de baixo custo e eficiente pode reduzir os custos totais do processo de produção de fármacos a partir de plantas transgênicas, tais como a insulina. O processo consiste, primeiramente, na preparação da farinha, preferencialmente na degerminação da semente. A degerminação das sementes de milho pode ser realizada pelo método a seco (dry milling), úmido (wet milling), ou semi-úmido, mas aqui preferencialmente se realizará a seco, utilizando um equipamento com a finalidade de degerminação, que pode ser um degerminador, um moinho de facas, ou equipamento desenvolvido para a degerminação da semente por atrito, mas preferencialmente, equipamento do tipo moinho de facas. Em seguida, é realizada a separação da fração rica em endosperma da fração rica em gérmen utilizando um equipamento de separação granulométrica como um dos diversos equipamentos de separação de sólidos, sendo aqui preferido o peneiramento, com fração retida de 300 a 1000 gm, masBased on these studies, a process was developed for the extraction of protein from seeds, object of the present patent. The advantage of the proposed process is that a process that uses a simple, low-cost and efficient extraction solution can reduce the total costs of the process of producing drugs from transgenic plants, such as insulin. The process consists, first, in the preparation of the flour, preferably in the degermination of the seed. The degermination of corn seeds can be carried out by the dry method (dry milling), damp (wet milling), or semi-humid, but here it will preferably be carried out dry, using an equipment with the purpose of degermination, which can be a degerminador, a knife mill, or equipment developed for the degermination of the seed by friction, but preferably, equipment of the type of knife mill. Then, the separation of the endosperm-rich fraction from the germ-rich fraction is performed using a granulometric separation equipment as one of the various solids separation equipment, with sieving being preferred here, with a fraction retained from 300 to 1000 gm, but

10/12 « ··· · «·· · ··· · ··· ··· ····* ··· · · · • · · · ·· · * ·· · · ·· · • « · · ··· · ··· · · • ········ ···· «··· * · · ··· pref eridamente 500 pm. A fração retida (considerada rica em endosperma) deverá ser passada em um equipamento de moagem, que pode ser moinho de bola, moinho de barras, moinho de impacto, moinho pendular, moinhos de martelo, seguida de uma etapa de separação granulométrica, tal como peneiramento, mas preferencialmente usar um moinho de rolos conectado a um jogo de peneiras, que além da produção da farinha fina (diâmetro médio de partículas menor que 500 pm) , propicia a separação de impurezas, tais como as cascas das sementes. A extração deverá ser realizada, preferencialmente, com a farinha obtida somente do endosperma da semente. A farinha deverá ser mantida sob refrigeração antes da realização da extração, se esta não for feita em processo contínuo. A temperatura deve ser mantida entre -18 a 10 °C, preferencialmente entre 4 e 10 °C.10/12 «··· ·« ·· · ··· · ··· ··· ···· * ··· · · · • · · · ·· · * ·· · · ·· · • « · ··· · ··· · · • ········ ···· «··· * · ··· preferably 500 pm. The retained fraction (considered rich in endosperm) must be passed in a grinding equipment, which can be ball mill, bar mill, impact mill, pendulum mill, hammer mills, followed by a granulometric separation step, such as sieving, but preferably use a roller mill connected to a set of sieves, which in addition to the production of fine flour (average particle diameter less than 500 pm), allows the separation of impurities, such as the seed husks. The extraction should be carried out, preferably, with the flour obtained only from the endosperm of the seed. The flour must be kept refrigerated before the extraction is carried out, if it is not done in a continuous process. The temperature must be kept between -18 to 10 ° C, preferably between 4 and 10 ° C.

A extração da proteína da farinha deverá ser realizada em tanques, preferencialmente em tanques do tipo agitados, com solução alcalina, tal como tampão bicarbonato de sódio, bicarbonato de amônio, bicarbonato de cálcio, borato de sódio, glicina, mas preferencialmente o tampão bicarbonato de sódio, na faixa de concentração de 1 mM a 1 M, preferindo utilizar a concentração de 50 mM. A solução extratora poderá conter ainda um agente redutor tal como ditíotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), β-mercaptaetanol (ME), preferencialmente o ditíotreitol (DTT) , na faixa de concentração de 1 mM a 1 M, preferencialmente 5 mM. A relação massa de farinha-volume de solvente deverá ser de 1:2 a 1:50, preferindo a relação de 1:10. 0 tempo de extração deverá ser de 30 min a 24 horas, preferindo o tempo de 2 horas e a temperatura da extração deverá ser na faixa de 4 a 4 0°C, preferencialmente a 25°C (ou temperatura ambiente). Após a agitação, a suspensão deverá ser filtrada ou centrifugada e então submetida ao processo de purificação da proteína de interesse.The extraction of protein from flour should be carried out in tanks, preferably in agitated type tanks, with alkaline solution, such as sodium bicarbonate buffer, ammonium bicarbonate, calcium bicarbonate, sodium borate, glycine, but preferably the bicarbonate buffer sodium, in the concentration range of 1 mM to 1 M, preferring to use the concentration of 50 mM. The extracting solution may also contain a reducing agent such as dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), β-mercaptaethanol (ME), preferably dithiothreitol (DTT), in the concentration range of 1 mM to 1 M, preferably 5 mM. The dough-to-volume ratio of solvent should be 1: 2 to 1:50, preferring the 1:10 ratio. The extraction time should be from 30 min to 24 hours, preferring the time of 2 hours and the extraction temperature should be in the range of 4 to 40 ° C, preferably at 25 ° C (or room temperature). After stirring, the suspension should be filtered or centrifuged and then subjected to the purification process of the protein of interest.

O processo de extração de proteínas de sementes, objeto desta patente, tem como ainda vantagem a utilização de um tampão de extração simples, de baixo custo e com elevadaThe process of extracting protein from seeds, object of this patent, also has the advantage of using a simple extraction buffer, of low cost and with high

11/12 • · ·· · • · · · · • · · · · · • ·* ·« • · · · • · · • ·· eficiência. E em se tratando de uma etapa da produção de um fármaco, o emprego de técnicas e materiais economicamente viáveis é fundamental na viabilidade geral do processo de produção. Produzir sementes de milho que contenham lkg de próinsulina, pode custar até 20 vezes menos que produzir11/12 • · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · efficiency. And in the case of a stage in the production of a drug, the use of economically viable techniques and materials is fundamental in the general viability of the production process. Producing corn seeds that contain 1 kg of protinsulin can cost up to 20 times less than producing

bactérias com essa mesma massa de pró-insulina.bacteria with that same mass of pro-insulin.

Exemplo 1: Extração da pró-insulina da farinha do endosperma de sementes de milho trãnsgênico em tempão alcalinoExample 1: Extraction of proinsulin from endosperm flour from transgenic corn seeds in alkaline weather

Sementes de milho trãnsgênico expressando a proteína heteróloga pró-insulina humana foram produzidas pelo grupo do Laboratório de Plantas do CBMEO - UNICAMP. Primeiramente, plantas dé milho da linhagem A188 do cruzamento Hy II-A x Hy II-B foram transformadas geneticamente e então cruzadas com plantas da variedade de milho comercial QPM BR451. A produção da proteína heteróloga foi direcionada para o endosperma da semente de milho utilizando-se um promotor de gene de γkafirina (proteína do sorgo) e para o interior do retículo endoplasmátíco através de um peptídeo sinal de uma a-coixina de Coix. A transformação estável das plantas de milho foi feita utilizando a técnica de bombardeamento (De Lucca, 2003).Transgenic corn seeds expressing the heterologous human pro-insulin protein were produced by the group from the CBMEO Plant Laboratory - UNICAMP. First, A188 maize plants from the Hy II-A x Hy II-B crossing were genetically transformed and then crossed with plants of the commercial corn variety QPM BR451. The production of the heterologous protein was directed to the corn seed endosperm using a γkafirine (sorghum protein) gene promoter and to the interior of the endoplasmic reticulum through a signal peptide from a Coix α-coixin. The stable transformation of the corn plants was done using the bombardment technique (De Lucca, 2003).

As sementes de milho foram degerminadas a seco utilizando um equipamento de degerminação do tipo moinho de facas (marca Renard, Brasil). Em seguida, foi realizada a separação da fração rica em endosperma da fração rica em gérmen utilizando uma peneira de abertura 0,5 mm. A fração retida nesta peneira (considerada rica em endosperma) foi passada em um moinho de rolos (marca Quadrumat, Alemanha) conectado a um jogo de peneiras, que além da produção da farinha fina, propiciou a separação das cascas das sementes. Os ensaios de extração foram realizados com a farinha obtida somente do endosperma do milho. Os diâmetros médios de partícula área-volume das partículas das farinhas de milho utilizadas nos experimentos foi de 0,22 mm. As farinhas foram mantidas a 4°C até a realização dos experimentos.The corn seeds were dry degerminated using a knife mill degermination equipment (Renard brand, Brazil). Then, the endosperm-rich fraction was separated from the germ-rich fraction using a 0.5 mm sieve. The fraction retained in this sieve (considered to be rich in endosperm) was passed in a roller mill (Quadrumat brand, Germany) connected to a set of sieves, which in addition to the production of fine flour, provided the separation of the husks from the seeds. The extraction tests were carried out with the flour obtained only from the corn endosperm. The average particle diameters of area-volume of the corn flour particles used in the experiments was 0.22 mm. The flours were kept at 4 ° C until the experiments were carried out.

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A extração de proteínas de sementes em tampão bicarbonato de sódio 50 mM foi realizada em tanque agitado. Em um reator encamisado de 250 ml (5,5 cm de diâmetro), a quantidade de farinha de 5,0 g foi agitada em 50, 0 ml de solução extratora durante duas horas. O agitador utilizado nos ensaios foi um agitador mecânico modelo Q-251D da marca IKA Labortechnik (Alemanha) , com um impelidor do tipo pás inclinadas (4 cm de diâmetro e inclinação de pás de 45°) . A velocidade de rotação do impelidor foi de 500 rpm e a temperatura foi de 25 °C. Após a agitação, a suspensão foi centrifugada a 10°C e 13000 g durante 20 min. A quantificação de pró-insulina nos extratos foram realizadas através de ensaios tipo ELISA segundo a técnica de sanduíche com dois anticorpos utilizando um kit ELISA comercial específico para a detecção de pró-insulina humana total (DakoCytomation, Inglaterra). As análises foram realizadas de acordo com o procedimento descrito pelo fabricante. Os valores máximos de concentração de pró-insulina obtidos foram em torno de 20 μg/ml ou 0,45% da proteína total solúvel. Segundo Twyman et al. (2003), níveis de expressão entre 0,1 e 1% TSP são suficientemente competitivos em relação a outros de sistemas de expressão para viabilizar economicamente o uso de plantas como biorreatores.The extraction of protein from seeds in 50 mM sodium bicarbonate buffer was performed in a stirred tank. In a jacketed reactor of 250 ml (5.5 cm in diameter), the amount of flour of 5.0 g was stirred in 50.0 ml of extracting solution for two hours. The stirrer used in the tests was a mechanical stirrer model Q-251D from IKA Labortechnik (Germany), with an inclined paddle type impeller (4 cm in diameter and 45 ° blade inclination). The rotation speed of the impeller was 500 rpm and the temperature was 25 ° C. After stirring, the suspension was centrifuged at 10 ° C and 13000 g for 20 min. The quantification of proinsulin in the extracts was carried out through ELISA assays according to the sandwich technique with two antibodies using a specific commercial ELISA kit for the detection of total human proinsulin (DakoCytomation, England). The analyzes were performed according to the procedure described by the manufacturer. The maximum values of pro-insulin concentration obtained were around 20 μg / ml or 0.45% of the total soluble protein. According to Twyman et al. (2003), levels of expression between 0.1 and 1% TSP are sufficiently competitive in relation to others of expression systems to economically make possible the use of plants as bioreactors.

A descrição acima da presente invenção foi apresentada com o propósito de ilustração e descrição. Além disso, a descrição não tenciona limitar a invenção à forma aqui revelada. Em consequência, variações e modificações compatíveis com os ensinamentos acima e a habilidade ou conhecimento da técnica relevante, estão dentro do escopo da presente invenção.The above description of the present invention has been presented for the purpose of illustration and description. In addition, the description is not intended to limit the invention to the form disclosed herein. As a result, variations and modifications compatible with the above teachings and the skill or knowledge of the relevant technique are within the scope of the present invention.

As modalidades acima descritas tencionam melhor explicar os modos conhecidos para a prática da invenção e para permitir que os técnicos na área utilizem a invenção em tais, ou outras, modalidades e com várias modificações necessárias pelas aplicações específicas ou usos da presente invenção.The modalities described above are intended to better explain the known methods for practicing the invention and to allow those skilled in the art to use the invention in such, or other, modalities and with various modifications necessary for the specific applications or uses of the present invention.

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Claims

1. Process for the extraction of protein from seeds characterized by the use of transgenic maize seeds with expression of the heterologous human proinsulin protein genetically transformed from the A188 line of the Hy II-A x Hy II-B crossing crossed with plants of the commercial corn variety QPM BR451 with targeting the heterologous protein to the endosperm using a γkafirine gene promoter (sorghum protein) and into the endoplasmic reticulum through a signal peptide from a Coix α-coixin and understand the following steps:

The. Dry degermination of seeds in a knife mill;

B. Particle size separation by sieving, with fraction retained from 300 to 1000 pm, preferably 500 pm;

ç. Grinding of the fraction rich in endosperm retained by a roller mill connected to a set of sieves;

d. Obtaining fine flour with an average particle diameter of 500 pm;

and. Keep the flour refrigerated between 18 ° C and 10 ° C, preferably between 4 ° C and 10 ° C;

f. Extraction of the protein with the flour mass-volume ratio of the solvent is from 1: 2 to 1:50, preferably from 1:10, in an agitated type tank with alkaline solution, preferably sodium bicarbonate buffer in the concentration range between 1 mM at 1M, preferably 50 mM and a reducing agent, dithiothreitol (DTT) in the concentration range between 1 mM to 1M, preferably 5 mM; occur for 30 min to 24 hours, preferably 2 hours and under the temperature in the range of 4 to 40 ° C, preferably at 25 ° C;

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g. Stir the suspension at 500 rpm at 25 ° C;

H. Centrifuge the suspension at 10 ° C and 13000 g for 20 min; and

i. Obtaining pro-insulin with maximum concentration values of 20 μg / ml or 0.45% of the total soluble protein.

Petition 870170067146, of 9/11/2017, p. 6/9