BRPI0315565B1

BRPI0315565B1 - METHOD FOR OBTAINING A NSO MYELOMA CELL LINE THAT CONTAINS A SEQUENCE THAT ENCODES A RECOMBINANT POLYPEPTIDE OR A RECOMBINANT PROTEIN ADAPTED TO GROW IN WHEAT AND PROTEIN FREE MEDIUM, AND, USE OF THE METHOD

Info

Publication number: BRPI0315565B1
Application number: BRPI0315565-0A
Authority: BR
Inventors: Rolando Perez Rodriguez; Adolfo Castillo Vitlloch; Svieta Vitores Sarazola; Tammy Boggiano Ayo; Luis Rojas Del Calvo
Original assignee: Centro De Inmunologia Molecular
Priority date: 2002-10-23
Filing date: 2003-10-22
Publication date: 2022-01-25

Abstract

"MÉTODO PARA SE OBTER UMA LINHAGEM CELULAR DE MAMÍFERO ADAPTADA PARA CRESCER EM MEIO LIVRE DE SORO E PROTEÍNA, LINHAGEM CELULAR DE MAMÍFERO, USO DO MÉTODO, ANTICORPOS HUMANIZADOS CONTRA O RECEPTOR DE EGF HR3 OU SEUS FRAGMENTOS, CONTRA O ANTÍGENO CD6 T1HT OU SEUS FRAGMENTOS, E CONTRA O ANTÍGENO CD3 T3Q OU SEUS FRAGMENTOS". A presente invenção diz respeito a um método de obtenção de células de mamífero adaptadas a crescer em meio livre de soro e de proteínas, o qual inclui um processo em duas etapas de adaptação em que existe um intervalo crítico de concentração de proteína em que as células devem adquirir a capacidade de sobreviver em meio livre de proteínas. O intervalo crítico da concentração da proteína é especifico para cada linhagem celular. A presente invenção também diz respeito a linhagens celulares de mamíferos que crescem de uma maneira estável em um meio livre de soro e proteínas por pelo menos 40 gerações. A invenção ainda diz respeito a clones que expressam os anticorpos humanizados anti-receptores de EGF hR~ 3~ e anti-CD6 T1hT e o anticorpo quimérico anti-CD~ 3~ T~ 3~Q, assim como os fragmentos dos referidos anticorpos."METHOD TO OBTAIN A MAMMALIAN CELL LINE ADAPTED TO GROW IN SERUM AND PROTEIN-FREE MEDIUM, MAMMALIAN CELL LINE, USE OF THE METHOD, HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST THE EGF HR3 RECEPTOR OR ITS FRAGMENTS, AGAINST THE CD6 T1HT ANTIGEN OR ITS FRAGMENTS , AND AGAINST THE CD3 T3Q ANTIGEN OR ITS FRAGMENTS". The present invention relates to a method of obtaining mammalian cells adapted to grow in serum-free and protein-free medium, which includes a two-step process of adaptation in which there is a critical range of protein concentration in which the cells must acquire the ability to survive in a protein-free environment. The critical range of protein concentration is specific for each cell line. The present invention also relates to mammalian cell lines that grow stably in a serum and protein free medium for at least 40 generations. The invention further relates to clones that express the humanized anti-EGF receptor hR-3β and anti-CD6 T1hT antibodies and the chimeric anti-CD3β T-3-Q antibody, as well as fragments of said antibodies.

Description

TECHNICAL FIELD

[001] A presente invenção diz respeito à biotecnologia, especificamente a um método para se obter linhagens celulares estáveis adaptadas para crescer em meio livre de soro e proteína, mediante um processo em duas etapas de adaptação.[001] The present invention relates to biotechnology, specifically to a method for obtaining stable cell lines adapted to grow in serum and protein free medium, through a two-step adaptation process.

PREVIOUS TECHNIQUE

[002] A partir do desenvolvimento do cultivo in vitro de células de mamíferos, a demanda quanto à produção em grande escala destas células aumentou por causa do potencial diagnóstico e terapêutico de muitos dos produtos obtidos por este meio. Estes agentes úteis incluem anticorpos monoclonais, o hormônio humano do crescimento, as linfocinas, a eritropoietina, os fatores de coagulação do sangue e os ativadores do plasminogênio do tecido.[002] From the development of in vitro culture of mammalian cells, the demand for large-scale production of these cells increased because of the diagnostic and therapeutic potential of many of the products obtained by this means. These useful agents include monoclonal antibodies, human growth hormone, lymphokines, erythropoietin, blood clotting factors, and tissue plasminogen activators.

[003] O uso dos anticorpos monoclonais recombinantes (AcMr) para a terapia e o diagnóstico in vivo de diversas enfermidades implica, em muitos casos, no uso dos tratamentos em altas doses. Este fato torna necessária a produção de AcMr específico em grande quantidade e com uma alta pureza.[003] The use of recombinant monoclonal antibodies (AcMr) for the therapy and in vivo diagnosis of several diseases implies, in many cases, the use of treatments in high doses. This fact makes it necessary to produce specific AcMr in large quantities and with high purity.

[004] Vários anticorpos monoclonais recombinantes com uso potencial na terapia e diagnóstico do câncer e enfermidades autoimunes se expressaram nas células de mieloma NSO, no Centro de Imunologia Molecular. A U.S. 5.891.996 descreve a obtenção de anticorpos quiméricos e humanizados contra o receptor do Fator de Crescimento Epidérmico, com utilidade no diagnóstico e na terapia de tumores que expressem referido receptor. A WO 97/19111 descreve anticorpos monoclonais que reconhecem o antígeno CD6 para uso diagnóstico e terapêutico em pacientes com psoríase. Gavilondo et al. em Hybridoma 9 no 5, 1999, relatou o anticorpo IOR-T3a que reconhece o antígeno CD3.[004] Several recombinant monoclonal antibodies with potential use in the therapy and diagnosis of cancer and autoimmune diseases were expressed in NSO myeloma cells at the Molecular Immunology Center. The U.S. 5,891,996 describes the production of chimeric and humanized antibodies against the Epidermal Growth Factor receptor, useful in the diagnosis and therapy of tumors that express said receptor. WO 97/19111 describes monoclonal antibodies that recognize the CD6 antigen for diagnostic and therapeutic use in patients with psoriasis. Gavilondo et al. in Hybridoma 9 on 5, 1999, reported the IOR-T3a antibody that recognizes the CD3 antigen.

[005] Para as condições de cultivo em meio livre de proteína, foram desenvolvidas várias técnicas. Assim, foram desenvolvidos os meios livres de proteína especificamente definidos, que permitem um crescimento da célula sob estas condições. A WO 97/05240 descreve a expressão de proteínas recombinantes sob condições de meio livre de proteínas.[005] For culture conditions in protein-free medium, several techniques have been developed. Thus, specifically defined protein-free media were developed which allow for cell growth under these conditions. WO 97/05240 describes the expression of recombinant proteins under protein-free media conditions.

[006] A JP 2.696.001 descreve o uso de um meio livre de proteína para a produção do fator VIII nas células de CHO, acrescentando um agente tensoativo não iônico ou ciclodextrina para aumentar a produtividade das células hospedeiras. Para aumentar a eficácia destes aditivos, recomenda-se a adição de, por exemplo, butirato e lítio.[006] JP 2,696,001 describes the use of a protein-free medium for the production of factor VIII in CHO cells, adding a non-ionic surfactant or cyclodextrin to increase the productivity of host cells. To increase the effectiveness of these additives, the addition of, for example, lithium butyrate is recommended.

[007] A WO 96/26266 descreve o cultivo de células em um meio com hidrolisado de proteína que contém glutamina, cujo conteúdo de aminoácidos livres é menor do que 15% do peso total da proteína, e cujos peptídeos têm um peso molecular menor do que 44 kD. Como meio de cultura para as células utiliza-se um meio mínimo sintético, como o meio básico ao qual se acrescentam, além do hidrolisado da proteína, soro fetal bovino, gentamicina e mercaptoetanol. Não foi mencionado o uso de meio contendo soro para a produção dos fatores recombinantes do sangue.[007] WO 96/26266 describes the cultivation of cells in a medium with protein hydrolyzate that contains glutamine, whose free amino acid content is less than 15% of the total weight of the protein, and whose peptides have a molecular weight less than than 44 kD. As a culture medium for the cells, a synthetic minimal medium is used, as the basic medium to which, in addition to the protein hydrolyzate, fetal bovine serum, gentamicin and mercaptoethanol are added. The use of serum-containing medium for the production of recombinant blood factors was not mentioned.

[008] A U.S. 5.393.668 A descreve o crescimento celular sob condições de meio livre de proteína, de células aderidas a superfícies sintéticas especiais.[008] The U.S. 5,393,668 A describes cell growth under protein-free medium conditions of cells adhered to special synthetic surfaces.

[009] Para estimular a proliferação celular, células de CHO, que superexpressam a insulina humana, proliferam sobre um substrato artificial que se tenha ligado covalentemente à insulina (Ito et al. 1996 PNAS USA. 93: 3598-3601).[009] To stimulate cell proliferation, CHO cells, which overexpress human insulin, proliferate on an artificial substrate that has covalently bound to insulin (Ito et al. 1996 PNAS USA. 93: 3598-3601).

[0010] Reiter et al. (1992, Cytotechnology 9: 247-253) descrevem a imobilização das células r-CHO crescidas primeiro em alta densidade sobre portadores em meio que contém soro, e a subseqüente perfusão das células imobilizadas no meio sem proteína durante a fase de produção, encontrando- se uma liberação contínua da proteína no sobrenadante da cultura. Ali, as células foram mantidas por menos de 10 gerações no meio sem proteína.[0010] Reiter et al. (1992, Cytotechnology 9: 247-253) describe the immobilization of r-CHO cells first grown at high density on carriers in serum-containing medium, and the subsequent perfusion of the immobilized cells in the protein-free medium during the production phase, finding continuous release of the protein into the culture supernatant. There, the cells were maintained for less than 10 generations in the protein-free medium.

[0011] Os métodos anteriores para a preparação acertada de uma cultura de células em grande escala sob condições de meio livre de proteína, foram descritos quanto a linhagens celulares mantidas em cultura, em particular as células VERO (WO 96/15231), na qual as células crescem sob condições de meio livre de soro e de proteína, desde a ampola original até uma grande escala técnica de 1200 litros.[0011] Previous methods for the successful preparation of a large-scale cell culture under protein-free medium conditions have been described with regard to cell lines maintained in culture, in particular VERO cells (WO 96/15231), in which cells are grown under serum and protein free medium conditions from the original vial to a large technical scale of 1200 liters.

[0012] A adaptação das células cultivadas inicialmente sob condições de meio contendo soro ao meio livre de proteína, é um processo um tanto enfadonho geralmente demorado, além de se ter observado que a produção de proteína expressa e a produtividade das células de CHO recombinantes diminuem muito depois da adaptação ao meio sem proteína em relação ao que contém soro (Paterson et al., 1994, Appl. Microbiologia. Biotechnol. 40: 691658). Isto é uma conseqüência da instabilidade ou a redução do crescimento do clone recombinante por causa da troca das condições de cultura. Apesar do uso de um clone original estável, por causa das condições extremas na fermentação, uma grande parte das células reduz ou perde totalmente sua capacidade de expressão, as quais crescem muito mais do que as células produtoras durante o processo de produção, motivo por que, finalmente, o cultivo do fermentador consiste em uma maior população de células não produtoras ou de células que tenham uma baixa expressão.[0012] The adaptation of cells initially cultured under serum-containing medium conditions to protein-free medium is a rather tedious process, generally time consuming, in addition to having observed that the production of expressed protein and the productivity of recombinant CHO cells decrease long after adaptation to protein-free versus serum-containing medium (Paterson et al., 1994, Appl. Microbiology. Biotechnol. 40: 691658). This is a consequence of instability or reduced growth of the recombinant clone because of changing culture conditions. Despite the use of a stable original clone, because of the extreme conditions in the fermentation, a large part of the cells reduce or completely lose their expression capacity, which grow much more than the producing cells during the production process, which is why Finally, the fermenter culture consists of a larger population of non-producing cells or cells that have a low expression.

[0013] A presente invenção fornece uma estratégia para desenvolver linhagens celulares estáveis adaptadas para crescer em meio livre de soro e de proteína. Seguindo-se a estratégia proposta, foram obtidos diferentes clones adaptados ao crescimento em meio livre de proteína.[0013] The present invention provides a strategy to develop stable cell lines adapted to grow in serum and protein free medium. Following the proposed strategy, different clones adapted to growth in protein-free medium were obtained.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Two-step adaptation of cell lines to growth in protein-free medium

[0014] Este procedimento abrange as linhagens de células de mamíferos, para as quais não é possível realizar um procedimento direto de adaptação do meio suplementado com soro ao meio livre de soro e de proteína.[0014] This procedure covers mammalian cell lines, for which it is not possible to perform a direct procedure of adapting the serum-supplemented medium to the serum- and protein-free medium.

[0015] O método da invenção inclui duas etapas na adaptação da linhagem ao meio livre de proteína (MLP). Na primeira etapa, considerada não crítica, a redução do conteúdo de proteínas do meio ocorre sem a perda da viabilidade celular e não há uma redução importante do tempo de duplicação da população em cada passo durante a redução da concentração de proteína. A etapa não crítica é observada geralmente entre 5 e 0,5 mg/ml de proteína total no meio de cultura, e este quase apresenta o mesmo índice de crescimento que no meio de cultura inicial.[0015] The method of the invention includes two steps in the adaptation of the strain to the protein-free medium (MLP). In the first step, considered non-critical, the reduction of the protein content of the medium occurs without loss of cell viability and there is no significant reduction in the population doubling time at each step during the reduction of the protein concentration. The non-critical step is generally observed between 5 and 0.5 mg/ml of total protein in the culture medium, and this has almost the same growth rate as in the initial culture medium.

[0016] Para iniciar esta primeira etapa, inicia-se de uma linhagem com uma viabilidade celular entre 80 e 100%, e as células crescem sucessivamente em meio de cultura com concentrações decrescentes de proteína até que se alcance uma concentração crítica em que a viabilidade seja reduzida a 0%, a qual constitui o ponto de partida para o início da segunda etapa.[0016] To start this first step, start with a strain with a cell viability between 80 and 100%, and the cells grow successively in culture medium with decreasing concentrations of protein until a critical concentration is reached where viability is reached. is reduced to 0%, which constitutes the starting point for the start of the second stage.

[0017] Nesta segunda etapa, considerada crítica, na qual ocorre uma redução da viabilidade e do tempo de duplicação celular, as células necessitam de mais tempo para que se adaptem à passagem de uma situação da concentração da proteína para outra de menor concentração. Existem concentrações críticas de proteína no meio de cultura, que não é possível passar por cima durante o processo de adaptação. Estas concentrações críticas de proteína são específicas para cada linhagem celular, e geralmente estão abaixo de 0,6 mg/ml. Uma vez que as células tenham recuperado os índices iniciais de viabilidade e de velocidade de crescimento nestas concentrações críticas de proteína, é possível cultivar as células na condição seguinte, com uma concentração de proteína mais baixa.[0017] In this second stage, considered critical, in which there is a reduction in cell viability and duplication time, cells need more time to adapt to the passage from a situation of protein concentration to another of lower concentration. There are critical concentrations of protein in the culture medium that cannot be bypassed during the adaptation process. These critical protein concentrations are specific to each cell line, and are generally below 0.6 mg/ml. Once the cells have regained initial viability and growth rate indices at these critical protein concentrations, it is possible to culture the cells in the next condition with a lower protein concentration.

[0018] Para conduzir esta segunda etapa, uma vez determinada a concentração crítica, recorre-se à concentração anterior em que ainda exista crescimento celular, considerada como concentração pré-crítica, e, a partir dela, reduz-se lentamente a referida concentração de proteína até que as células recuperem a viabilidade e o tempo de duplicação original.[0018] To conduct this second stage, once the critical concentration has been determined, the previous concentration in which there is still cell growth is used, considered as pre-critical concentration, and, from there, the aforementioned concentration of protein until cells regain original viability and doubling time.

[0019] A combinação de passos para reduzir a concentração de proteína na etapa crítica determinará o tempo total de adaptação nesta etapa e a velocidade da adaptação (Vadapt.), calculada como a relação:

[0019] The combination of steps to reduce the protein concentration in the critical step will determine the total adaptation time in this step and the adaptation speed (Vadapt.), calculated as the relation:

[0020] Não obstante, esta combinação de situações não terá influência sobre o tempo necessário para a adaptação a cada concentração de proteína, incluindo as concentrações críticas.[0020] However, this combination of situations will not influence the time required for adaptation to each protein concentration, including critical concentrations.

[0021] Isto é, para determinar-se o final da etapa não crítica e das concentrações críticas, é necessário executar uma adaptação passo a passo, e isto é realizado mediante diluições em série do cultivo celular no meio sem proteína desejado, reduzindo-se à metade a concentração de proteína em cada situação (Tabela 1). Esta redução pode ser feita tanto pela redução da concentração de soro quanto suplementando-se o meio básico com diferentes níveis de alguns substituintes do soro ricos em proteínas.TABELA 1: Redução passo a passo da concentração de proteína para determinar-se as concentrações críticas, iniciando-se com um meio de cultura suplementado com 5 mg/ml de proteína (equivalente a 10% de soro fetal bovino).

Legenda: SFB - Soro Fetal Bovino MLP - Meio Livre de Proteína MCS - Meio Contendo Soro * O conteúdo total de proteína do soro fetal bovino foi estimado ao redor de 50 mg/ml (6).[0021] That is, to determine the end of the non-critical step and critical concentrations, it is necessary to carry out a step-by-step adaptation, and this is carried out by serial dilutions of the cell culture in the desired protein-free medium, reducing halved the protein concentration in each situation (Table 1). This reduction can be done either by reducing the whey concentration or by supplementing the basic medium with different levels of some protein-rich whey substituents.TABLE 1: Step-by-step reduction of the protein concentration to determine the critical concentrations, starting with a culture medium supplemented with 5 mg/ml of protein (equivalent to 10% fetal bovine serum).

Caption: FBS - Fetal Bovine Serum MLP - MCS Protein Free Medium - Serum-Containing Medium * The total protein content of fetal bovine serum has been estimated to be around 50 mg/ml (6).

[0022] Antes de iniciar-se o procedimento de adaptação, as células devem ser mantidas com mais de 80% de viabilidade em frascos T no meio padrão empregado geralmente para o cultivo das células.[0022] Before starting the adaptation procedure, the cells must be maintained at more than 80% viability in T flasks in the standard medium generally used for cell culture.

[0023] Para realizar-se a adaptação, realizam-se consecutivamente os seguintes passos que transitam pelas duas etapas anteriormente mencionadas: i. As células são semeadas em pelo menos 3 repetições em uma densidade de 1 a 5 x 105 células/ml em meio de cultivo contendo soro e proteínas, depois de 48 horas substitui-se a metade do sobrenadante da cultura por meio fresco livre de proteína, ficando a concentração final de proteína em 50% da concentração inicial; ii. Substitui-se todo o meio de cultura a cada 48 horas pelo meio fresco com 50% da concentração inicial de proteínas; iii. Deixam-se crescer as células no meio com 50% da concentração inicial de proteínas, até que a cultura alcance a confluência; iv. Semeiam-se as células obtidas no passo anterior (iii) em pelo menos 3 repetições, a uma densidade de 1 a 5 x 105 células/ml no meio que contém 50% da concentração inicial de proteína e, depois de 48 horas de crescimento, substitui-se a metade do sobrenadante da cultura por meio fresco livre de proteína, ficando a concentração final de proteínas nos 50% da concentração anterior; v. Substitui-se todo o meio a cada 48 horas pelo meio fresco que contém os 50% da concentração de proteína anterior; vi. Deixam-se crescer as células no meio que contém os 50% da concentração de proteína anterior, até que a cultura alcance a confluência; vii. Repetem-se os procedimentos (iv) a (vi), reduzindo-se, em cada ciclo, a concentração da proteína contida no meio, até os 50% da usada no ciclo anterior, até alcançar-se uma concentração de proteína que provoque a morte celular. viii. A partir de uma cultura com mais de 80% de viabilidade, cultivada na concentração na concentração pré-crítica, as células são semeadas em pelo menos 3 repetições a uma densidade de 2 a 6 x 105 células/ml em meio de cultura na concentração pré- crítica, e depois de 48 horas substituem-se os 25% do sobrenadante da cultura pelo meio fresco sem proteína, ficando a concentração final de proteína nos 75% da concentração pré- crítica; ix. Substitui-se todo o meio a cada 48 horas, pelo meio fresco que contém os 75% da concentração pré-crítica; x. Deixam-se crescer as células no meio que contém os 75% da concentração pré-crítica de proteína, até que a cultura alcance a confluência; xi. Semeia-se a linhagem celular derivada do passo anterior em pelo menos 3 repetições, a uma densidade de 2 a 6 x 105 células/ml no meio que contém os 75% da concentração pré-crítica de proteína e, após 48 horas de crescimento, substituem-se os 25% do sobrenadante da cultura por meio fresco livre de proteína, ficando a concentração final de proteína nos 75% da concentração anterior; xii. Substitui-se todo o meio a cada 48 horas pelo meio fresco que contém os 75% da concentração anterior; xiii. Deixam-se crescer as células no meio que contém os 75% da concentração anterior de proteína, até que a cultura alcance a confluência; xiv. Repetem-se os procedimentos (xi) a (xiii), reduzindo-se, em cada ciclo, a concentração da proteína contida no meio até que os 75% da usada no ciclo anterior, até que se alcance uma concentração de proteína tal que, quando as células sejam transferidas para uma concentração mais baixa, cresçam com uma viabilidade similar e com o tempo de duplicação original, de maneira que a redução subseqüente da concentração de proteína não afete a viabilidade nem o tempo de duplicação.[0023] To carry out the adaptation, the following steps are carried out consecutively, passing through the two previously mentioned steps: i. Cells are seeded in at least 3 repetitions at a density of 1 to 5 x 105 cells/ml in culture medium containing serum and proteins, after 48 hours half of the culture supernatant is replaced with fresh protein-free medium, the final concentration of protein being 50% of the initial concentration; ii. The entire culture medium is replaced every 48 hours with fresh medium with 50% of the initial protein concentration; iii. Cells are allowed to grow in medium with 50% of the initial protein concentration until the culture reaches confluence; iv. The cells obtained in the previous step (iii) are seeded in at least 3 repetitions, at a density of 1 to 5 x 10 5 cells/ml in the medium containing 50% of the initial concentration of protein and, after 48 hours of growth, half of the culture supernatant is replaced with fresh protein-free medium, leaving the final protein concentration at 50% of the previous concentration; v. The entire medium is replaced every 48 hours with fresh medium containing 50% of the previous protein concentration; saw. The cells are allowed to grow in the medium containing the above 50% protein concentration until the culture reaches confluence; vii. Procedures (iv) to (vi) are repeated, reducing, in each cycle, the concentration of the protein contained in the medium, up to 50% of that used in the previous cycle, until reaching a concentration of protein that causes the cell death. viii. From a culture with more than 80% viability, grown at the pre-critical concentration, the cells are seeded in at least 3 replicates at a density of 2 to 6 x 105 cells/ml in culture medium at the pre-critical concentration. - critical, and after 48 hours, the 25% of the culture supernatant is replaced by fresh medium without protein, leaving the final protein concentration at 75% of the pre-critical concentration; ix. The entire medium is replaced every 48 hours with fresh medium containing 75% of the pre-critical concentration; x. Cells are allowed to grow in medium containing 75% of the precritical protein concentration until the culture reaches confluence; xi. The cell line derived from the previous step is seeded in at least 3 repetitions, at a density of 2 to 6 x 10 5 cells/ml in the medium containing the 75% of the pre-critical concentration of protein and, after 48 hours of growth, 25% of the culture supernatant is replaced with fresh protein-free medium, leaving the final protein concentration at 75% of the previous concentration; xii. The entire medium is replaced every 48 hours with fresh medium containing 75% of the previous concentration; xiii Cells are allowed to grow in medium containing 75% of the previous concentration of protein until the culture reaches confluence; xiv. Procedures (xi) to (xiii) are repeated, reducing, in each cycle, the concentration of the protein contained in the medium until 75% of that used in the previous cycle, until reaching a concentration of protein such that, when the cells are transferred to a lower concentration, they grow to a similar viability and original doubling time, so that subsequent reduction in protein concentration does not affect viability or doubling time.

[0024] No método de adaptação proposto na presente invenção, o meio de cultura em que inicialmente se semeiam as células, compreende entre 5% e 10% do soro fetal bovino.[0024] In the adaptation method proposed in the present invention, the culture medium in which the cells are initially seeded comprises between 5% and 10% of fetal bovine serum.

[0025] No referido método, a linhagem celular de mamífero que se adapta a crescer em meio livre de proteína é um mieloma, particularmente NSO.[0025] In said method, the mammalian cell line that adapts to grow in protein-free medium is a myeloma, particularly NSO.

[0026] A invenção também pode ser aplicada à adaptação de NSO transfectada com uma seqüência que codifica uma proteína ou polipeptídeo recombinante, particularmente quando a seqüência codifique um anticorpo recombinante ou seus fragmentos, pelo que referida seqüência também inclui as linhagens celulares de mamífero adaptadas ao crescimento em meio livre de proteína.[0026] The invention can also be applied to the adaptation of NSO transfected with a sequence encoding a recombinant protein or polypeptide, particularly when the sequence encodes a recombinant antibody or fragments thereof, whereby said sequence also includes mammalian cell lines adapted to the growth in protein-free medium.

[0027] Nas diferentes formas de realização da invenção, esta fornece linhagens celulares de mamífero que expressam qualquer um dos anticorpos humanizados ou quiméricos anti-receptores de EGF hR3, anti-CD6 T1hT, anti-CD3 T3Q ou seus fragmentos, adaptadas ao crescimento mediante o método da invenção, em meio livre de proteína, assim como os referidos anticorpos obtidos das referidas linhagens.[0027] In different embodiments of the invention, it provides mammalian cell lines that express any of the humanized or chimeric anti-EGF hR3 receptor antibodies, anti-CD6 T1hT, anti-CD3 T3Q or fragments thereof, adapted for growth by the method of the invention, in protein-free medium, as well as said antibodies obtained from said strains.

[0028] As linhagens adaptadas pelo método da invenção crescem estavelmente em condições de meio livre de soro e de proteínas, por pelo menos 40 gerações.[0028] Strains adapted by the method of the invention grow stably in serum and protein free medium conditions for at least 40 generations.

EXAMPLES OF ACHIEVEMENT EXAMPLE 1: ADAPTATION OF RECOMBINANT hR3 CELL LINE TO PROTEIN-FREE MEDIUM

[0029] A linhagem celular recombinante hR3 foi obtida pela transfecção da linhagem celular de mieloma NSO, com as construções dos vetores para a expressão das cadeias leves e pesadas do anticorpo monoclonal humanizado hR3, que reconhece o receptor do EGF humano.[0029] The hR3 recombinant cell line was obtained by transfecting the NSO myeloma cell line, with vector constructs for the expression of the light and heavy chains of the humanized monoclonal antibody hR3, which recognizes the human EGF receptor.

[0030] A adaptação desta linhagem celular ao meio livre de proteínas foi realizada seguindo-se o procedimento descrito anteriormente, por meio de uma redução do conteúdo de proteínas em duas etapas.[0030] The adaptation of this cell line to the protein-free medium was carried out following the procedure described above, by means of a reduction of the protein content in two steps.

[0031] As células foram inicialmente cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e logo a partir de uma concentração de proteínas de 0,15 mg/ml, o soro fetal foi substituído pelo suplemento rico em proteínas, Nutridoma NS (Boheringer Manheinn), acrescentado ao meio basal RPMI-1640 (meio livre de soro). A redução no conteúdo de proteínas realizou-se por diluições sucessivas em meio PFHM-II (Gibco) do conteúdo de proteínas presentes no meio inicial.[0031] The cells were initially cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and then from a protein concentration of 0.15 mg/ml, the fetal serum was replaced by the supplement rich in proteins, Nutridoma NS (Boheringer Manheinn), added to RPMI-1640 basal medium (serum-free medium). The reduction in the protein content was carried out by successive dilutions in PFHM-II medium (Gibco) of the protein content present in the initial medium.

[0032] Os resultados do cálculo das concentrações críticas e das velocidades de adaptação Vadapt para esta linhagem celular são apresentados nas Figuras 1 e 2, respectivamente.[0032] The results of the calculation of critical concentrations and Vadapt adaptation rates for this cell line are presented in Figures 1 and 2, respectively.

EXAMPLE 2: ADAPTATION OF T1hT RECOMBINANT CELL LINE TO PROTEIN-FREE MEDIUM

[0033] A linhagem celular recombinante T1hT foi obtida pela transfecção da linhagem celular de mieloma NSO, com as construções dos vetores para a expressão das cadeias leves e pesadas do anticorpo monoclonal T1hT humanizado pelo método de supressão de epítopos T e que reconhece o receptor CD6 de linfócitos T humanos.[0033] The T1hT recombinant cell line was obtained by transfecting the NSO myeloma cell line, with the vector constructs for the expression of the light and heavy chains of the humanized T1hT monoclonal antibody by the T epitope suppression method and that recognizes the CD6 receptor of human T lymphocytes.

[0034] A adaptação desta linhagem celular ao meio livre de proteínas foi realizada seguindo-se o procedimento descrito no ponto 2, por meio de uma redução do conteúdo de proteínas em duas etapas.[0034] The adaptation of this cell line to the protein-free medium was carried out following the procedure described in point 2, by means of a reduction of the protein content in two steps.

[0035] As células foram inicialmente cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB. A redução no conteúdo de proteínas realizou-se por diluições sucessivas em meio PFHM-II (Gibco) do conteúdo de proteínas presentes no meio inicial.[0035] Cells were initially cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS. The reduction in the protein content was carried out by successive dilutions in PFHM-II medium (Gibco) of the protein content present in the initial medium.

[0036] Os resultados do cálculo das concentrações críticas e das velocidades de adaptação Vadapt para esta linhagem celular são apresentados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.[0036] The results of the calculation of critical concentrations and Vadapt adaptation rates for this cell line are shown in Figures 3 and 4, respectively.

EXAMPLE 3: ADAPTATION OF T3Q RECOMBINANT CELL LINE TO PROTEIN-FREE MEDIUM

[0037] A linhagem celular recombinante T3Q foi obtida pela transfecção da linhagem celular de mieloma NSO, com as construções dos vetores para a expressão das cadeias leves e pesadas do anticorpo monoclonal T3Q humanizado pelo método de supressão de epítopos T e que reconhece o receptor do CD3 de linfócitos T humanos.[0037] The T3Q recombinant cell line was obtained by transfecting the NSO myeloma cell line, with the vector constructs for the expression of the light and heavy chains of the humanized T3Q monoclonal antibody by the T epitope suppression method and that recognizes the T3Q receptor. CD3 of human T lymphocytes.

[0038] A adaptação desta linhagem celular ao meio livre de proteínas foi realizada seguindo-se o procedimento descrito no ponto 2, por meio de uma redução do conteúdo de proteínas em duas etapas.[0038] The adaptation of this cell line to the protein-free medium was carried out following the procedure described in point 2, through a reduction of the protein content in two steps.

[0039] As células foram inicialmente cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB. A redução no conteúdo de proteínas realizou-se por diluições sucessivas em meio PFHM-II (Gibco) do conteúdo de proteínas presentes no meio inicial.[0039] Cells were initially cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% FBS. The reduction in the protein content was carried out by successive dilutions in PFHM-II medium (Gibco) of the protein content present in the initial medium.

[0040] Os resultados do cálculo das concentrações críticas e das velocidades de adaptação Vadapt para esta linhagem celular são apresentados nas Figuras 5 e 6, respectivamente.[0040] The results of the calculation of critical concentrations and Vadapt adaptation rates for this cell line are presented in Figures 5 and 6, respectively.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0041] Figura 1: Correlação dos tempos necessários para adaptar a linhagem hR3 a cada concentração de proteínas (até que se recupere a viabilidade e o tempo de duplicação) com o logaritmo natural (neperiano) do inverso da concentração de proteínas. Os valores de concentrações críticas de proteínas para a linhagem celular hR3 são: -0,32 e 0,11 mg/ml da concentração de proteínas totais.[0041] Figure 1: Correlation of the times required to adapt the hR3 strain to each protein concentration (until viability and doubling time are recovered) with the natural logarithm (Neperian) of the inverse of the protein concentration. The critical protein concentration values for the hR3 cell line are: -0.32 and 0.11 mg/ml total protein concentration.

[0042] Figura 2: Correlação do tempo total transcorrido desde o início do procedimento de adaptação com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas para a linhagem celular hR3. Valor da velocidade de adaptação desta linhagem na fase crítica: -0,0053 mg/d.[0042] Figure 2: Correlation of the total time elapsed since the beginning of the adaptation procedure with the natural logarithm of the inverse of the protein concentration for the hR3 cell line. Value of adaptation speed of this strain in the critical phase: -0.0053 mg/d.

[0043] Figura 3: Correlação dos tempos necessários para adaptar a linhagem T1hT a cada concentração de proteínas (até que se recupere a viabilidade e o tempo de duplicação) com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas. Os valores de concentrações críticas de proteínas para a linhagem celular T1hT são: -0,12 e 0,01 mg/ml da concentração de proteínas totais.[0043] Figure 3: Correlation of the times required to adapt the T1hT strain to each protein concentration (until viability and doubling time are recovered) with the natural logarithm of the inverse of the protein concentration. The critical protein concentration values for the T1hT cell line are: -0.12 and 0.01 mg/ml total protein concentration.

[0044] Figura 4: Correlação do tempo total transcorrido desde o início do procedimento de adaptação com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas para a linhagem celular T1hT. Valor da velocidade de adaptação desta linhagem na fase crítica: -0,0014 mg/d.[0044] Figure 4: Correlation of the total time elapsed since the beginning of the adaptation procedure with the natural logarithm of the inverse of the protein concentration for the T1hT cell line. Value of adaptation speed of this strain in the critical phase: -0.0014 mg/d.

[0045] Figura 5: Correlação dos tempos necessários para adaptar a linhagem T3Q a cada concentração de proteínas (até que se recupere a viabilidade e o tempo de duplicação) com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas. O valor de concentração crítica de proteínas para a linhagem celular T3Q é de: -0,63 mg/ml da concentração de proteínas totais.[0045] Figure 5: Correlation of the times required to adapt the T3Q strain to each protein concentration (until viability and doubling time are recovered) with the natural logarithm of the inverse of the protein concentration. The critical protein concentration value for the T3Q cell line is: -0.63 mg/ml total protein concentration.

[0046] Figura 6: Correlação do tempo total transcorrido desde o início do procedimento de adaptação com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas para a linhagem celular T3Q. Valor da velocidade de adaptação desta linhagem na fase crítica: -0,0172 mg/d.[0046] Figure 6: Correlation of the total time elapsed since the beginning of the adaptation procedure with the natural logarithm of the inverse of the protein concentration for the T3Q cell line. Value of adaptation speed of this strain in the critical phase: -0.0172 mg/d.

Claims

1. Method for obtaining an NSO myeloma cell line that contains a sequence that encodes a recombinant polypeptide or a recombinant protein, adapted to grow in serum and protein free medium, characterized in that it comprises two steps: I. A first stage in which, from a strain with a cell viability between 80 and 100%, the cells are grown in culture medium with consecutive reduction of protein concentrations until a critical concentration of protein in which the viability drops to 0%; II. A second stage, which is composed of the following steps: i. Cells are seeded from a cell culture with a viability of 80% or greater growing at the pre-critical protein concentration in 3 wells at a density in a range of 2 to 6x10 5 cells/mL, where the cells are grown in the pre-critical protein concentration and after 48 hours the 25% of the supernatant is replaced with fresh protein-free medium, thus making a final protein concentration that is 75% of the pre-critical protein concentration; ii. Every 48 hours, the supernatant is completely replaced with fresh culture medium with a protein concentration that is 75% of the pre-critical protein concentration; iii. Cells are grown to confluence under this protein concentration; iv. Cells from step (iii) are seeded in 3 wells with a density in the range of 2 to 6x10 5 cells/ml in culture medium with a protein concentration that is 75% of the pre-critical protein concentration; where after 48 hours, 25% of the supernatant is replaced with fresh protein-free medium, thus making it a final protein concentration that is 75% of the concentration of the previous step; v. Every 48 hours, the supernatant is completely replaced with fresh culture medium with a protein concentration that is 75% of the concentration in step (iii); saw. Cells are grown to confluence under this protein concentration; vii. Steps (iv) to (vi) are repeated, during each cycle the protein concentration is reduced to 75% of the concentration of the previous cycle, then this procedure is repeated until reaching a protein concentration that does not cause any loss of cell viability and decrease in population doubling time, when cells are transferred to a medium with lower protein concentration and are able to grow without any loss of cell viability and decrease in population doubling time before the first subculture, it is considered that cells reached the non-critical stage again and seed them directly in protein-free medium (0 mg/mL protein concentration).

2. Method according to claim 1, characterized in that the first stage consists of the following steps: i. Seed 3 wells in the six-well culture plate with the recombinant cell line using the standard cell culture medium (with the initial concentration of protein), at a density of 1 to 5 x 10 5 cells/ml, after 48 hours replace - half of the culture supernatant per fresh protein-free medium, thus making a final protein concentration that is 50% of the initial condition; ii. Every 48 hours, completely replace the supernatant with fresh culture medium with a protein concentration that is 50% of the initial condition; iii. Cells are grown to confluence under this protein concentration; iv. Cells from step (iii) are seeded in 3 wells, at a density of 1 to 5x105 cells/ml in culture medium with a protein concentration that is 50% of the initial condition and, after 48 hours of growth, replaced. half of the culture supernatant is mixed with fresh protein-free medium, leaving the final protein concentration at 50% of the previous concentration; v. Every 48 hours, completely replace the supernatant with fresh culture medium with a protein concentration that is 50% of the previous condition; saw. Cells are grown to confluence under this protein concentration; vii. Steps (iv) to (vi) are repeated, reducing, during each cycle, the concentration of the protein contained in the medium, up to 50% of the concentration of the previous cycle, repeating this procedure until reaching a concentration protein that causes cell death.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that the medium in which the cells are initially seeded comprises between 5% and 10% of fetal bovine serum.

4. Method according to claim 3, characterized in that the sequence that encodes a recombinant polypeptide or a recombinant protein encodes a recombinant antibody or a fragment thereof.

5. Use of the method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it is to obtain cell lines adapted to grow in protein-free medium.

6. Use of the method according to claim 5, characterized in that said cell line is a myeloma.

7. Use of the method according to claim 6, characterized in that said cell line is the NSO cell line.