BRPI0314435B1

BRPI0314435B1 - bread breeding composition, method for preparing a bakery product, method for increasing the carcass volume of a bakery product and bakery product

Info

Publication number: BRPI0314435B1
Application number: BRPI0314435A
Authority: BR
Inventors: Agnés Dutron; Anne Hoyoux; Bernard Genot; Georges Feller; Jacques Georis; Thierry Dauvrin; Tony Collins
Original assignee: Puratos Nv
Priority date: 2002-09-11
Filing date: 2003-09-11
Publication date: 2016-07-19
Also published as: US8309336B2; MXPA05002751A; CN1681392B; WO2004023879A1; EA200500470A1; ATE499006T1; CN1681392A; DE60336153D1; CA2498014A1; DK1549147T3; EP1549147A1; EA011452B1; PT1549147E; ES2360942T3; US8192772B2; EP1549147B1; US20110039325A1; JP2005537806A; CA2498014C; US20070054011A1

Abstract

The present invention describes a method to improve the properties of a dough and/or a baked product by adding a bread or dough-improving agent containing a enzyme with xylanolytic activity belonging to glycoside hydrolases family 8. Preferred enzymes are the psychrophilic xylanase from Pseudoalteromonas haloplanktis and the mesophilic xylanase Y from Bacillus halodurans C-125.

Description

"COMPOSIÇÃO DE MELHORAMENTO DE PÃO, MÉTODO PARA PREPARAR UM PRODUTO DE PADARIA, MÉTODO PARA AUMENTAR O VOLUME DA CARCAÇA DE UM PRODUTO DE PADARIA E PRODUTO DE PADARIA" Campo da invenção [001] A presente invenção respeita a um método e a uma composição para o melhoramento de produtos de padaria que compreende, pelo menos, uma enzima com atividade xilanolitica obtida a partir da hidrolase de glicosideo da família 8. Numa concretização da invenção tal enzima com atividade xilanolitica é também caracterizada pelo fato de haver uma inversão de configuração durante a hidrólise. Em concretizações específicas da invenção tal enzima com atividade xilanolitica é uma xilanase psicrofílica obtida a partir da Pseudoalteromonas haloplanktis ou uma xilanase mesofílica obtida a partir da Bacillus halodurans.Field of the Invention Field of the Invention [001] The present invention relates to a method and a composition for the preparation of a bread product, a method for preparing a baker's product, a method for raising the bulk of a baker's product and a baker's product. The improvement of bakery products comprising at least one xylanolytic activity enzyme obtained from the family 8 glycoside hydrolase. In one embodiment of the invention such xylanolytic activity enzyme is also characterized by the fact that there is a configuration inversion during hydrolysis. In specific embodiments of the invention such enzyme with xylanolytic activity is a psychrophilic xylanase obtained from Pseudoalteromonas haloplanktis or a mesophilic xylanase obtained from Bacillus halodurans.

Estado da técnica anterior [002] As xilanas são heteropolissacarídeos que formam a maior parte da hemicelulose presente na biomassa das plantas. A estrutura principal destes polissacarídeos é uma cadeia de resíduos de β 1-4 xilopiranosil ligados. Muitos grupos laterais diferentes podem ligar-se a esses resíduos, tais como resíduos de acetila, de arabinosila e de glucuronosila. Os compostos fenólicos tais como os ácidos ferúlicos ou hidroxicinâmicos também estão envolvidos através de ligação de éster na ligação cruzada das cadeias de xilana ou na ligação entre a xilana e as cadeias de lignina por exemplo.Background Art Xylans are heteropolysaccharides that form most of the hemicellulose present in plant biomass. The main structure of these polysaccharides is a chain of linked β 1-4 xylopyranosyl residues. Many different side groups may bind to such residues, such as acetyl, arabinosyl and glucuronosyl residues. Phenolic compounds such as ferulic or hydroxycinnamic acids are also involved by ester bonding in the crosslinking of the xylan chains or in the bond between xylan and lignin chains for example.

[003] As endoxilanases (ou endo-β-Ι,4-xilanases) hidrolisam especificamente a estrutura da hemicelulose. Em alguns casos, os grupos laterais podem dissimular a cadeia principal por bloqueio estérico. Foram descritas diferentes atividades de xilanases. A sua especificidade em relação ao seu substrato varia de umas para as outras. Algumas são mais ativas em arabinoxilanas insolúveis. O comprimento dos oligômeros produzidos também depende do tipo de xilanase considerado.Endoxylanases (or endo-β-Ι, 4-xylanases) specifically hydrolyze the structure of hemicellulose. In some cases, side groups may mask the main chain by steric blockade. Different xylanase activities have been described. Their specificity with respect to their substrate varies from one to another. Some are more active in insoluble arabinoxylans. The length of the produced oligomers also depends on the type of xylanase considered.

[004] As hidrolases de glicosideos (anteriormente conhecidas como celulase da familia D) foram classificadas em 91 famílias (http;//afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) baseadas em homologias sequenciais, características mecânicas e estruturais. Uma vez que as dobras das proteínas são melhor conservadas do que as suas sequências, algumas das famílias podem ser agrupadas em "clãs" (Henrissat B. 1991, Biochem. J. Vol. 280, p. 309) . As endo-beta-1,4-xilanases são geralmente classificadas nas famílias 10 (anteriormente família F) e 11 (anteriormente família G) e descobriu-se que têm frequentemente uma relação inversa entre o seu pi e o peso molecular. As xilanases da família 10 (EXslO) são maiores e, mais complexas, enquanto que as xilanases da família 11 (EXsll) são menores. Ademais, existe uma diferença significativa na estrutura e nas propriedades catalíticas de ambas as famílias. As EXslO apresentam um dobra em barril (a / β)8, têm cerca de 40% de estruturas α-helix e pertencem ao clã GH-A (Dominguez et al., 1995, Nat. Struct. Biol. Vol. 2, p. 569) enquanto as EXsll exibem uma conformação dobrada β-geleia, têm cerca de 3-5% de estruturas de α-helix e pertencem ao clã GH-C (Tõrrõnen et al. , 1994, EMBO J. Vol. 13, p. 2498) . As EXslO têm um local de ligação ao substrato menor e uma especificidade para o substrato mais baixa, têm frequentemente atividade de endoglucanase e produzem oligossacarídeos menores comparativamente às EXsll, que têm uma afinidade mais elevada para xilanas não substituídas (Biely et al. , 1997, J. Biotechnol. Vol. 57, p. 151) . Todas as xilanases de ambas as famílias caracterizadas até à data retêm a configuração anomérica do oxigênio glicosídico após hidrólise na qual dois glutamatos funcionam como resíduos catalíticos (Jeffries, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 7, p. 337).Glycoside hydrolases (formerly known as family D cellulase) have been classified into 91 families (http: // afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) based on sequential homologies, mechanical and structural characteristics. Since protein folds are better conserved than their sequences, some of the families can be grouped into "clans" (Henrissat B. 1991, Biochem. J. Vol. 280, p. 309). Endo-beta-1,4-xylanases are generally classified into families 10 (formerly family F) and 11 (formerly family G) and have often been found to have an inverse relationship between their pi and molecular weight. Family 10 xylanases (EXs10) are larger and more complex, while family 11 xylanases (EXs11) are smaller. In addition, there is a significant difference in the structure and catalytic properties of both families. EXs10 have a barrel bend (a / β) 8, have about 40% α-helix structures and belong to the GH-A clan (Dominguez et al., 1995, Nat. Struct. Biol. Vol. 2, p 569) while EXs111 exhibit a β-jelly folded conformation, they have about 3-5% α-helix structures and belong to the GH-C clan (Törrrönen et al., 1994, EMBO J. Vol. 13, p. 2498). EXs10 have a lower substrate binding site and lower substrate specificity, often have endoglucanase activity and produce smaller oligosaccharides compared to EXs11, which have a higher affinity for unsubstituted xylans (Biely et al., 1997). J. Biotechnol, Vol. 57, p. 151). All xylanases of both families characterized to date retain the anomeric configuration of glycosidic oxygen following hydrolysis in which two glutamates function as catalytic residues (Jeffries, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 7, p. 337).

[005] As xilanases são utilizadas em várias áreas industriais como nas indústrias da polpa, do papel, alimentar e de padaria. Outras aplicações relacionam-se com os setores dos sumos e das cervejas. As xilanases também podem ser utilizadas no processo de separação do trigo. Os efeitos tecnológicos observados são, entre outros, descoloração melhorada da polpa, redução da viscosidade dos alimentos ou alterações das características da massa de farinha.Xylanases are used in various industrial areas such as the pulp, paper, food and bakery industries. Other applications relate to the juice and beer sectors. Xylanases may also be used in the wheat separation process. The technological effects observed are, among others, improved pulp discoloration, reduced food viscosity or changes in dough characteristics.

[006] A utilização de xilanases (também designadas por hemicelulases ou pentosanases) na cozedura é bem conhecida há já alguns anos. Estas enzimas de condicionamento de massa de farinha podem melhorar a estabilidade e a moldabilidade da massa de farinha, assim como o crescimento no forno e a estrutura do miolo. Outros efeitos das enzimas são um volume de pão maior e um miolo mais fofo.The use of xylanases (also called hemicellulases or pentosanases) in cooking has been well known for some years. These dough conditioning enzymes can improve dough dough stability and moldability as well as oven growth and crumb structure. Other effects of enzymes are a larger volume of bread and a fluffier crumb.

[007] O mecanismo de ação das xilanases na preparação do pão ainda não está claramente esclarecido. Existem cerca de 3 a 4% de pentosanas na farinha de trigo. Estas pentosanas conseguem absorver grandes quantidades de água (até 30%). Esta absorção de água contribui para as propriedades da massa de farinha assim como para a qualidade do produto final. A hidrólise parcial das pentosanas através de pentosanases em oligossacarídeos de cadeia curta solúveis em água aumenta a capacidade de ligação à água. Há também uma forte interação das pentosanas com a fração de glúten da farinha para formar uma rede. As pentosanases podem ajudar a relaxar esta rede forte e rigida e, consequentemente, permitem que o dióxido de carbono formado pelo fermento expanda melhor a massa de farinha.[007] The mechanism of action of xylanases in bread preparation is not yet clearly understood. There are about 3 to 4% pentosans in wheat flour. These pentosans can absorb large amounts of water (up to 30%). This water absorption contributes to the properties of the dough as well as the quality of the final product. Partial hydrolysis of pentosans by pentosanases in water-soluble short chain oligosaccharides increases water binding capacity. There is also a strong interaction of pentosans with the gluten fraction of flour to form a network. Pentosanases can help to relax this strong and rigid web and, as a result, allow the carbon dioxide formed by yeast to better expand the dough.

[008] Têm sido utilizados muitos tipos de preparações de hemicelulase como ingredientes ativos de cozedura e estão comercialmente disponíveis. São produzidos através de fermentação microbiana utilizando vários microrganismos como fontes de enzimas. Algumas destas enzimas também são produzidas por microrganismos modificados geneticamente. Todas as utilizações documentadas de xilanases com um efeito positivo no volume específico de produtos de padaria, referem-se a xilanases pertencentes a hidrolases de glicosídeos da Família 10 ou da Família 11 como anteriormente definido.[008] Many types of hemicellulase preparations have been used as active cooking ingredients and are commercially available. They are produced by microbial fermentation using various microorganisms as sources of enzymes. Some of these enzymes are also produced by genetically modified microorganisms. All documented uses of xylanases with a positive effect on the specific volume of bakery products refer to xylanases belonging to Family 10 or Family 11 glycoside hydrolases as defined above.

[009] Exemplos de xilanases para cozedura são as xilanases obtidas a partir de Bacillus Subtilis e Aspergillus niger.Examples of cooking xylanases are xylanases obtained from Bacillus Subtilis and Aspergillus niger.

[0010] Existe uma variedade de métodos para avaliar a atividade da xilanase numa preparação enzimática. Exemplos de tais métodos de determinação da atividade da xilanase são a medição da libertação de açúcar reduzido a partir da xilana (Miller G.L. 1959, Anal. Chem. Vol. 31, p. 426) ou a medição da libertação de compostos corados a partir de substratos modificados (por exemplo, AzoWAX ou Xilazime AX da Megazime). No entanto, não se encontrou uma correlação direta entre a atividade xilanolítica encontrada nas várias preparações enzimáticas e o efeito na cozedura. Resultados relacionados com a dosagem podem ser observados, até certo ponto, relativamente a uma única enzima, mas a mesma dosagem para duas xilanases de diferentes origens não confere o mesmo resultado à massa de farinha ou ao pão. Várias razões podem explicar isto: as diferenças na especificidade do substrato, as diferenças na temperatura e no pH ótimos, ...There are a variety of methods for evaluating xylanase activity in an enzyme preparation. Examples of such methods for determining xylanase activity are measuring reduced sugar release from xylan (Miller GL 1959, Anal. Chem. Vol. 31, p. 426) or measuring release of colored compounds from xylanase. modified substrates (e.g. AzoWAX or Xylazime AX from Megazime). However, no direct correlation was found between the xylanolytic activity found in the various enzyme preparations and the effect on cooking. Dosage-related results can be observed to some extent with respect to a single enzyme, but the same dosage for two xylanases from different origins does not give the same result to dough or bread. Several reasons may explain this: differences in substrate specificity, differences in optimal temperature and pH, ...

[0011] É de grande interesse desenvolver novas preparações enzimáticas, tais como agentes ou composições de melhoramento do pão, com propriedades novas ou melhoradas. Uma destas propriedades pode ser o fato de a fração de xilanase ser o menor possível (em termos de peso de enzimas necessárias para obter um resultado particular na cozedura).It is of great interest to develop new enzyme preparations, such as bread improving agents or compositions, with new or improved properties. One of these properties may be that the xylanase fraction is as small as possible (in terms of the weight of enzymes required to obtain a particular cooking result).

[0012] Foi recentemente descrita uma xilanase obtida a partir da bactéria da Antártida Pseudoalteromonas haloplanktis (Collins, T. et al. 2002. Uma nova xilanase da Família 8: caracterização funcional e físico-química. J.Biol. Chem. Vol. 277-38, p. 35133; Collins, T. et al. 2003, Atividade, estabilidade e flexibilidade em glicosidases adaptadas a ambientes térmicos extremos. J. Mol. Biol. Vol. 328, p. 419; Van Petegem F. et al., 2002. Análise preliminar por raio-X e cristalização de uma xilanase obtida da psicrofila Pseudoalteromonas haloplanktis. Ata Crystallogr D Biol Crystallogr. Vol. 58 (Pt 9), p. 1494-6) . Esta enzima é uma enzima psicrofílica típica e apresenta uma elevada atividade catalítica a baixa temperatura. Não é homóloga para xilanases da família 10 ou 11 mas tem 20 a 30% de identidade com as hidrolases de glicosídeos membros da família 8 (anteriormente família D) , uma família que compreende essencialmente endoglucanases mas também liquenases e quitosanases. Ademais, um FingerPRINTScan contra PRINTS utilizando o programa de pesquisa InterPro Scan (Zdobnov e Apweiler, 2001, Bioinformatics Vol. 17, p. 847) indicou que a sequência isolada continha a impressão digital das hidrolases de glicosil da família 8 e resíduos da família 8 que são estritamente conservados em 20 enzimas da família 8 analisadas.A xylanase obtained from the Antarctic bacteria Pseudoalteromonas haloplanktis has recently been described (Collins, T. et al. 2002. A new Family 8 xylanase: functional and physicochemical characterization. J.Biol. Chem. Vol. 277 -38, 35133; Collins, T. et al 2003, Activity, stability and flexibility in glycosidases adapted to extreme thermal environments J. Mol. Biol. Vol. 328, p. 419; Van Petegem F. et al. , 2002. Preliminary X-ray analysis and crystallization of a xylanase obtained from the psychrophyl Pseudoalteromonas haloplanktis (Ata Crystallogr D Biol Crystallogr. Vol. 58 (Pt 9), p. 1494-6). This enzyme is a typical psychophilic enzyme and has a high catalytic activity at low temperature. It is not homologous to family 10 or 11 xylanases but has 20 to 30% identity to family member glycoside hydrolases (formerly family D), a family comprising essentially endoglucanases but also lichenases and chitosanases. In addition, a FingerPRINTScan against PRINTS using the InterPro Scan research program (Zdobnov and Apweiler, 2001, Bioinformatics Vol. 17, p. 847) indicated that the isolated sequence contained the fingerprint of family 8 glycosyl hydrolases and family 8 residues. which are strictly conserved in 20 family 8 enzymes analyzed.

[0013] Contrariamente às EXslO e EXsll, esta xilanase da família 8 (EXs8) possui quer elevado pH, quer elevado peso molecular. As propriedades estruturais e catalíticas são diferentes das EXslO e EXsll. As Exs8 apresentam um (oí/oí) 6 invólucro de barril com 13 α-hélices e 13 β-fios e pertencem ao clã GH-M (Van Petegem et al. , 2003, A estrutura de uma xilanase da família 8 adaptada ao frio a uma resolução de 1,3 A. Adaptações estruturais ao frio e investigação do local ativo. J. Biol. Chem. Vol. 278(9), p. 7531-9). Estas enzimas não têm atividade de endoglucanase, quitosanase ou de liqueninase e parecem ser funcionalmente semelhantes às EXsll, sendo mais ativas em xilo-oligossacarídeos de cadeia longa.Unlike EXs10 and EXs11, this family 8 xylanase (EXs8) has both high pH and high molecular weight. The structural and catalytic properties are different from EXs10 and EXs11. The Exs8 have a (oi / oí) 6 13 a-helix and 13 β-strand casing and belong to the GH-M clan (Van Petegem et al., 2003, The structure of a cold-adapted family 8 xylanase at a resolution of 1.3 A. Structural cold adaptations and active site investigation (J. Biol. Chem. Vol. 278 (9), pp. 7531-9). These enzymes lack endoglucanase, chitosanase or licheninase activity and appear to be functionally similar to EXs11 and are more active in long chain xylo-oligosaccharides.

[0014] Em contraste com outras EXslO e EXsll conhecidas que retêm a configuração, as glico-hidrolases da família 8 (Fierobe et al. , 1993. Eur J. Biochem. Vol. 217, p. 557; http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/) tendem a hidrolisar o substrato com inversão da configuração anomérica do oxigênio glicosídico após hidrólise na qual um glutamato e um aspartato funcionam como resíduos catalíticos. Isto foi mostrado por exemplo para a xilanase psicrofílica obtida a partir da Pseudoalteromonas haloplanktis (Van Petegem et al., 2003, J. Biol. Chem., Vol. 278 (9), p. 7531-9; Collins, T. et al. 2002. Uma nova xilanase da família 8: caracterização funcional e físico-química. J. Biol. Chem. Vol. 277 (38), p. 35133). Já foram descritas outras xilanases pertencentes às hidrolases de glicosideos da familia 8 (Yoon, K-H., 1998, Clonagem molecular de um gene KK-1 da xilanase de Bacillus sp. e caracterização do produto do gene. Biochem. Mol. Biol. International. 45(2), p. 337; xilanase Y de Bacillus halodurans C-125 código de acesso GenBank/GenPept™ BAB05824). Estas xilanases apresentam homologias sequenciais entre elas assim como com a xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis como descrito por Collins et al (2002, vide acima).In contrast to other known EXs10 and EXs11 retaining configuration, family 8 glycohydrolases (Fierobe et al., 1993. Eur J. Biochem. Vol. 217, p. 557; http: // afmb. cnrs-mrs.fr/CAZY/) tend to hydrolyze the substrate by reversing the anomeric configuration of glycosidic oxygen following hydrolysis in which a glutamate and an aspartate function as catalytic residues. This has been shown for example for the psychophilic xylanase obtained from Pseudoalteromonas haloplanktis (Van Petegem et al., 2003, J. Biol. Chem., Vol. 278 (9), p. 7531-9; Collins, T. et al. 2002. A new family 8 xylanase: functional and physicochemical characterization (J. Biol. Chem. Vol. 277 (38), p. 35133). Other xylanases belonging to the family 8 glycoside hydrolases have already been described (Yoon, KH., 1998, Molecular cloning of a Bacillus sp. Xylanase KK-1 gene and characterization of the gene product. Biochem. Mol. Biol. International. 45 (2), pp. 337; Bacillus halodurans C-125 xylanase Y GenBank / GenPept ™ access code BAB05824). These xylanases have sequential homologies between them as well as with Pseudoalteromonas haloplanktis xylanase as described by Collins et al (2002, see above).

[0015] A lista das enzimas pertencentes às hidrolases de glicosideos da familia 8 é regularmente atualizada (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).The list of enzymes belonging to family 8 glycoside hydrolases is regularly updated (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).

Objetivos da invenção [0016] A presente invenção visa providenciar preparações enzimáticas novas tais como composições de melhoramento do pão.OBJECTS OF THE INVENTION The present invention aims to provide novel enzyme preparations such as bread improving compositions.

[0017] A presente invenção também visa providenciar um novo método para a obtenção de produtos de padaria melhorados através de tais preparações de enzimas.The present invention also aims to provide a novel method for obtaining improved bakery products through such enzyme preparations.

Sumário da invenção [0018] Foi surpreendentemente verificado que uma enzima com atividade xilanolitica e pertencente a hidrolases de glicosideos da familia 8 tinha um efeito positivo nas propriedades da massa de farinha ou nas propriedades dos produtos de padaria quando era adicionada durante a mistura da massa de farinha.SUMMARY OF THE INVENTION It has been surprisingly found that an enzyme with xylanolytic activity and belonging to family 8 glycoside hydrolases had a positive effect on dough properties or the properties of bakery products when added during dough mixing. flour.

[0019] Também foi surpreendentemente verificado que uma enzima com atividade de xilanase e que hidrolisa com inversão da configuração anomérica tinha um efeito positivo nas propriedades da massa de farinha ou nas propriedades dos produtos de padaria quando foi adicionada durante a mistura da massa de farinha.It has also surprisingly been found that an enzyme with xylanase activity and hydrolyzing with inversion of the anomeric configuration had a positive effect on dough properties or the properties of bakery products when it was added during dough mixing.

[0020] Foi ainda surpreendentemente verificado que a utilização de enzimas conforme acima descritas aumenta o volume do pão.It has also been surprisingly found that the use of enzymes as described above increases the volume of bread.

[0021] Verificou-se também que a utilização de algumas de tais enzimas com atividade xilanolitica obtidas a partir de hidrolases de glicosideos da familia 8, as EXs8, tornam possivel a utilização de menos enzimas para o mesmo efeito nas propriedades da massa de farinha ou do pão comparativamente às xilanases presentemente conhecidas.It has also been found that the use of some such xylanolytic activity enzymes obtained from family 8 glycoside hydrolases, EXs8, makes it possible to use fewer enzymes for the same effect on the dough properties or compared to presently known xylanases.

[0022] Uma concretização especifica desta invenção respeita às enzimas com atividade xilanolitica obtidas a partir de hidrolases de glicosideos da familia 8 e à sua utilização na indústria do pão como acima descrito.A specific embodiment of this invention relates to enzymes with xylanolytic activity obtained from family 8 glycoside hydrolases and their use in the bread industry as described above.

[0023] Uma concretização particular da invenção respeita a uma xilanase psicrofilica da familia 8 obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis e a uma xilanase Y mesofilica da familia 8 obtida a partir de Bacillus halodurans. Estas enzimas são xilanases que hidrolisam com inversão da configuração anomérica.A particular embodiment of the invention relates to a family 8 psychophilic xylanase obtained from Pseudoalteromonas haloplanktis and a family 8 mesophilic xylanase Y obtained from Bacillus halodurans. These enzymes are xylanases that hydrolyze with inversion of the anomeric configuration.

[0024] As xilanases preferenciais são as obtidas a partir das estirpes Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a, e Bacillus halodurans C-125 ou as obtidas a partir do gene correspondente expresso num hospedeiro adequado.Preferred xylanases are those obtained from the strains Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a, and Bacillus halodurans C-125 or those obtained from the corresponding gene expressed in a suitable host.

[0025] Preferencialmente, a composição de melhoramento do pão que compreende pelo menos uma enzima da invenção é adicionada durante a mistura da massa de farinha.Preferably, the bread improving composition comprising at least one enzyme of the invention is added during dough mixing.

[0026] Tal composição de melhoramento do pão também pode compreender outros agentes de melhoramento do pão selecionados de entre uma lista constituída por outras enzimas, emulsionadores, oxidantes, leite em pó, gorduras, açúcares, aminoácidos, sais, proteínas (glúten, locais de ligação de celulose) ou suas misturas.Such a bread improving composition may also comprise other bread improving agents selected from a list of other enzymes, emulsifiers, oxidizers, milk powder, fats, sugars, amino acids, salts, proteins (gluten, cellulose binding) or mixtures thereof.

[0027] Essas outras enzimas podem ser selecionadas de entre uma lista constituída por alfa-amilases, beta-amilases, amilases maltogênicas, outras xilanases, proteases, oxidase de glucose, oxido-redutases, glucanases, celulases, transglutaminases, isomerases, lipases, fosfolipases, pectinases ou suas misturas.These other enzymes may be selected from a list of alpha-amylases, beta-amylases, maltogenic amylases, other xylanases, proteases, glucose oxidase, oxido reductases, glucanases, cellulases, transglutaminases, isomerases, lipases, phospholipases. , pectinases or mixtures thereof.

[0028] Tal alfa-amilase é preferencialmente obtida a partir de Aspergillus oryzae.Such alpha amylase is preferably obtained from Aspergillus oryzae.

[0029] As enzimas com atividade xilanolítica segundo a invenção podem ser utilizadas em tal composição de melhoramento de pão sob a forma de extrato de células, de extrato de células livre ou de proteína purificada.Enzymes with xylanolytic activity according to the invention may be used in such a bread breeding composition in the form of cell extract, free cell extract or purified protein.

[0030] As enzimas da invenção podem ser misturadas com outros ingredientes e ser utilizadas sob a forma de um pó seco ou de um granulado, em particular um granulado não desempoado, ou sob a forma de um líquido, preferencialmente com um ou mais estabilizadores tais como polióis, açúcares, ácidos orgânicos ou álcoois açucarados.The enzymes of the invention may be mixed with other ingredients and may be used in the form of a dry powder or a granulate, in particular a non-peeled granulate, or in the form of a liquid, preferably with one or more such stabilizers. as polyols, sugars, organic acids or sugar alcohols.

[0031] Um outro aspecto da invenção respeita aos produtos de padaria obtidos ou susceptíveis de serem obtidos quando se utiliza uma enzima da invenção.Another aspect of the invention concerns bakery products obtained or obtainable when using an enzyme of the invention.

[0032] Um aspecto adicional da invenção respeita às composições de melhoramento do pão que compreendem pelo menos uma das enzimas da invenção.A further aspect of the invention relates to bread improving compositions comprising at least one of the enzymes of the invention.

[0033] Ainda um outro aspecto da invenção respeita a um método para aumentar o volume da carcaça de um produto de padaria, que compreende a etapa de adicionar, durante a mistura da massa de farinha de tal produto de padaria, uma quantidade suficiente de uma enzima com atividade xilanolitica selecionada de entre o grupo constituído por xilanases de hidrolase de glicosídeo da família 8, eventualmente enzimas com atividade xilanolitica que hidrolisam com inversão de configuração. É possível utilizar qualquer combinação ou mistura das enzimas acima descritas numa massa de farinha ou produto de padaria para qualquer das finalidades acima descritas.Yet another aspect of the invention relates to a method for increasing the carcass volume of a bakery product, which comprises the step of adding, while mixing the dough of such a bakery product, a sufficient amount of a enzyme with xylanolytic activity selected from the group consisting of family 8 glycoside hydrolase xylanases, eventually enzymes with xylanolytic activity that hydrolyze with inversion of configuration. Any combination or mixture of the above enzymes may be used in a dough or bakery product for any of the purposes described above.

Breve descrição das figuras [0034] A figura 1 representa o efeito de quantidades crescentes de xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a no volume de pãezinhos crocantes belgas;BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES Figure 1 represents the effect of increasing amounts of Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a xylanase on the volume of Belgian crispy rolls;

[0035] A figura 2 mostra uma eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida de várias amostras de xilanase (quantidade de enzima carregada proporcional à quantidade utilizada na cozedura, o mesmo fator de proporcionalidade para todas as enzimas).Figure 2 shows an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of various xylanase samples (amount of charged enzyme proportional to the amount used in cooking, the same proportionality factor for all enzymes).

Banda 1: marcadores de peso molecular.Band 1: molecular weight markers.

Bandas 2-5: quantidade de xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis (2-3) e de xilanase de Bacillus subtilis (4-5) necessária para tratar respectivamente 0,333 (2, 4) e 0,166 Kg (3, 5) de farinha de trigo.Bands 2-5: Amount of Pseudoalteromonas haloplanktis xylanase (2-3) and Bacillus subtilis (4-5) xylanase required to treat respectively 0.333 (2, 4) and 0.166 kg (3, 5) of wheat flour.

[0036] As figuras 3A e B representam a sequência de nucleotídeos do gene da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis (A) e da correspondente xilanase (B);Figures 3A and B represent the nucleotide sequence of the Pseudoalteromonas haloplanktis xylanase gene (A) and the corresponding xylanase (B);

[0037] A figura 4 representa a xilanase Y obtida a partir da estirpe Bacillus halodurans C-125.Figure 4 represents xylanase Y obtained from strain Bacillus halodurans C-125.

[0038] A invenção será descrita mais detalhadamente nos exemplos e concretizações seguintes com referência aos desenhos anexos. As concretizações e exemplos particulares não pretendem de modo algum limitar o âmbito da invenção tal como reivindicada.The invention will be described in more detail in the following examples and embodiments with reference to the accompanying drawings. Particular embodiments and examples are in no way intended to limit the scope of the invention as claimed.

Descrição detalhada da invenção [0039] A presente invenção respeita, em particular, à utilização, na cozedura, de enzimas da familia 8 com atividade xilanolitica, para melhorar, entre outros aspectos, o volume da carcaça. Tais enzimas podem ter outras atividades, mas a atividade xilanolitica deve ser tal que a enzima seja adequada aos objetivos da presente invenção. A. Preparação de algumas enzimas preferenciais segundo a invenção [0040] As enzimas com atividade xilanolitica obtidas a partir de hidrolases de glicosil da familia 8 podem ser obtidas de várias fontes (veja-se, por exemplo, http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/ para uma perspectiva global). Algumas das enzimas foram descritas na literatura cientifica e podem, portanto, ser obtidas através da utilização das técnicas descritas nas publicações correspondentes. Abaixo, descreve-se mais detalhadamente a preparação de algumas enzimas preferenciais segundo a invenção. A.l. Xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a [0041] A xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a foi descrita em Collins T et al. (2002.DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates in particular to the use in cooking of family 8 enzymes with xylanolytic activity to improve, among other aspects, carcass volume. Such enzymes may have other activities, but the xylanolytic activity should be such that the enzyme is suitable for the purposes of the present invention. A. Preparation of Some Preferred Enzymes According to the Invention Enzymes with xylanolytic activity obtained from family 8 glycosyl hydrolases can be obtained from various sources (see, for example, http: //afmb.cnrs- mrs.fr/CAZY/ to a global perspective). Some of the enzymes have been described in the scientific literature and can therefore be obtained by using the techniques described in the corresponding publications. Below, the preparation of some preferred enzymes according to the invention is described in more detail. A.l. Xylanase obtained from Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a Xylanase obtained from Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a has been described in Collins T et al. (2002.

Uma nova xilanase da familia 8: caracterização funcional e fisico-quimica. J. Biol. Chem. Vol. 277(38), p. 35133).A new family 8 xylanase: functional and physicochemical characterization. J. Biol. Chem. Vol. 277 (38), p. 35133).

Collins et al. descreve a preparação por cultura liquida de uma estirpe recombinante de Escherichia coli que transporta o gene da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a clonado num plasmideo de expressão.Collins et al. describes the liquid culture preparation of a recombinant Escherichia coli strain carrying the Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a xylanase gene cloned into an expression plasmid.

[0042] A sequência de nucleotideos do gene da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis está disponível, assim como também o está a correspondente sequência de aminoácidos (número de acesso EMBL AJ427921, sequência aqui incluída por referência à mesma, figuras 3A-B, SEQ ID No.s 6-7). A enzima tem um peso molecular de 46000Da, um ponto isoeléctrico de aproximadamente 9,5, uma temperatura ótima de 35°C e um pH ótimo entre 5,3 e 8. É uma xilanase verdadeira tendo xilotriose e xilotetraose por principais produtos de reação da hidrólise da xilana após incubação prolongada.The nucleotide sequence of the Pseudoalteromonas haloplanktis xylanase gene is available, as is the corresponding amino acid sequence (accession number EMBL AJ427921, sequence included herein by reference thereto, FIGS. 3A-B, SEQ ID NO. . 6-7). The enzyme has a molecular weight of 46000Da, an isoelectric point of approximately 9.5, an optimum temperature of 35 ° C and an optimum pH between 5.3 and 8. It is a true xylanase having xylotriose and xylotetraose as major reaction products of the enzyme. xylan hydrolysis after prolonged incubation.

[0043] A preparação em bruto ou purificada desta xilanase pode ser obtida começando-se pelo cultivo de qualquer das estirpes recombinantes de tipo selvagem num meio apropriado para exprimir a enzima, seguido eventualmente de uma ou várias etapas de purificação, tais como, mas não apenas, a centrifugação, o rompimento de células, a microfiltração, a ultrafiltração, a precipitação, a cromatografia líquida, a secagem a frio, ... A.2. Xilanase Y obtida a partir de Bacillus halodurans C-125 [0044] A sequência da xilanase Y da família 8 obtida a partir da estirpe Bacillus halodurans C-125 (ATCCCBAA-125) está disponível sob o código de acesso GenBank/GenPept™ BAB05824 (sequência aqui incluída por referência à mesma, figura 4, SEQ ID N° . 8) . A sequência de ADN correspondente está disponível como parte da sequência do genoma completo da estirpe Bacillus halodurans C-125 (código de acesso AP001514, sequência aqui incluida por referência à mesma).The crude or purified preparation of this xylanase can be obtained by starting either of the recombinant wild-type strains in an appropriate medium for expressing the enzyme, optionally followed by one or more purification steps such as, but not limited to. only, centrifugation, cell disruption, microfiltration, ultrafiltration, precipitation, liquid chromatography, cold drying, ... A.2. Xylanase Y obtained from Bacillus halodurans C-125 The family 8 xylanase Y sequence obtained from Bacillus halodurans strain C-125 (ATCCCBAA-125) is available under GenBank / GenPept ™ BAB05824 ( sequence included herein by reference thereto, Figure 4, SEQ ID NO: 8). The corresponding DNA sequence is available as part of the complete genome sequence of strain Bacillus halodurans C-125 (accession code AP001514, sequence included herein by reference).

[0045] A xilanase obtida a partir de Bacillus halodurans C-125 pode ser obtida começando-se pelo cultivo da estirpe num meio apropriado para exprimir a xilanase, seguido de uma ou várias etapas de purificação tais como, mas não apenas, a centrifugação, o rompimento de células, a microfiltração, a ultrafiltração, a precipitação, a cromatografia liquida, a secagem a frio.The xylanase obtained from Bacillus halodurans C-125 can be obtained by first cultivating the strain in an appropriate medium for expressing xylanase, followed by one or more purification steps such as, but not limited to centrifugation. cell disruption, microfiltration, ultrafiltration, precipitation, liquid chromatography, cold drying.

[0046] Alternativamente, a xilanase obtida a partir de Bacillus halodurans C-125 pode ser obtida começando-se pela clonagem do gene correspondente, utilizando-se técnicas bem conhecidas tais como a amplificação por PCR, a ligação a um vetor e a transformação num hospedeiro microbiano. Após esta etapa, a xilanase pode ser vantajosamente expressa num hospedeiro adequado, colocando-se o gene sob o controlo de sequências de controlo apropriadas, tais como, mas não somente, promotores e terminadores, e inserindo-se esta construção de ADN numa célula que permita a expressão do gene.Alternatively, xylanase obtained from Bacillus halodurans C-125 can be obtained by cloning the corresponding gene using well-known techniques such as PCR amplification, binding to a vector and transformation into a microbial host. After this step, xylanase can be advantageously expressed in a suitable host by placing the gene under control of appropriate control sequences, such as, but not only, promoters and terminators, and by inserting this DNA construct into a cell that is allow gene expression.

[0047] Numa concretização especifica da presente invenção o gene da xilanase será sobreexpresso em tal célula.In a specific embodiment of the present invention the xylanase gene will be overexpressed in such a cell.

[0048] A presente invenção, contudo, não se restringe às enzimas acima mencionadas, antes se estendendo a outras enzimas com atividade xilanolitica pertencentes às hidrolases de glicosidases da familia 8. Estas enzimas são produzidas por células vivas microbianas e não microbianas, tais como, mas não apenas, plantas ou animais. As enzimas podem ser obtidas diretamente de culturas de células vivas e/ou de amostras ou podem ser produzidas por estirpes recombinantes ou células hospedeiras. O gene que codifica a enzima em causa pode ser um gene sintético.The present invention, however, is not restricted to the above mentioned enzymes, but extends to other enzymes with xylanolytic activity belonging to the family 8 glycosidase hydrolases. These enzymes are produced by living microbial and non-microbial cells such as, but not just plants or animals. Enzymes may be obtained directly from live cell cultures and / or samples or may be produced by recombinant strains or host cells. The gene encoding the enzyme concerned may be a synthetic gene.

[0049] Por "estirpe recombinante" ou por "célula hospedeira recombinante" entende-se uma estirpe que tem incorporada a sequência de nucleotideos de tais enzimas com atividade xilanolitica pertencentes às hidrolases de glicosidases da familia 8.By "recombinant strain" or "recombinant host cell" is meant a strain which has incorporated the nucleotide sequence of such enzymes with xylanolytic activity belonging to the family 8 glycosidase hydrolases.

[0050] Vantajosamente, as células hospedeiras recombinantes são selecionadas de entre o grupo constituído pelo universo microbiano, preferencialmente as bactérias ou os fungos, incluindo o fermento e, mais preferencialmente, Bacillus.Advantageously, recombinant host cells are selected from the group consisting of the microbial universe, preferably bacteria or fungi, including yeast and more preferably Bacillus.

[0051] Preferencialmente, a dita estirpe recombinante é capaz de sobreexprimir a dita sequência de nucleotideos e permite, vantajosamente, uma elevada produção da referida xilanase.Preferably, said recombinant strain is capable of over-expressing said nucleotide sequence and advantageously permits a high production of said xylanase.

[0052] As enzimas com atividade xilanolitica produzidas segundo a presente invenção podem ser utilizadas diretamente para o objetivo da presente invenção e/ou podem sofrer uma ou mais purificações ou (mais) etapas de cultura. Numa concretização particular da invenção, as enzimas podem ser usadas sob a forma pura.The xylanolytic activity enzymes produced according to the present invention may be used directly for the purpose of the present invention and / or may undergo one or more purifications or (more) culture steps. In a particular embodiment of the invention the enzymes may be used in pure form.

[0053] Os métodos de preparação possíveis para as enzimas segundo a invenção incluem, entre outros, a preparação ou purificação a partir de culturas de microrganismos, recombinantes ou não, em matrazes com agitação ou em fermentadores, a preparação ou purificação a partir de culturas imobilizadas, a extração e/ou purificação a partir de células vivas (plantas, ...), B. Aplicação da enzima [0054] A enzima com atividade xilanolitica segundo a presente invenção, purificada ou não purificada, é particularmente adequada enquanto agente de melhoramento do pão. Os agentes de melhoramento do pão são produtos que podem melhorar ou aumentar a textura, o sabor, os efeitos anti-ressequimento, a moleza, a moleza do miolo durante o armazenamento, a frescura, a moldabilidade da massa de farinha e o volume do produto final. Preferencialmente, a dita enzima com atividade xilanolitica melhora a facilidade de manuseamento da massa de farinha e/ou aumenta o volume especifico do produto de padaria final. "Produto de padaria" visa incluir qualquer produto preparado a partir da massa de farinha, em particular um produto de padaria fermentado. A massa de farinha é obtida a partir de qualquer tipo de farinha ou cereal (baseada, por exemplo, no trigo, centeio, cevada, aveia ou milho). Preferencialmente, a massa de farinha é preparada com trigo ou com misturas incluindo trigo.Possible methods of preparation for the enzymes according to the invention include, but are not limited to, preparation or purification from recombinant or non-recombinant microorganism cultures in agitated matrices or fermenters, preparation or purification from cultures immobilization, extraction and / or purification from living cells (plants, etc.), B. Enzyme Application The enzyme with xylanolytic activity according to the present invention, purified or unpurified, is particularly suitable as a bread breeding. Bread improving agents are products that can improve or increase the texture, taste, anti-dryness effects, softness, crumb softness during storage, freshness, dough moldability and product volume. Final. Preferably, said enzyme with xylanolytic activity improves the ease of handling of the dough and / or increases the specific volume of the final bakery product. "Bakery product" is intended to include any product prepared from dough, in particular a fermented bakery product. The dough is obtained from any type of flour or cereal (based for example on wheat, rye, barley, oats or corn). Preferably, the dough is prepared with wheat or with mixtures including wheat.

[0055] Um dos aspectos da presente invenção consiste em mostrar que as enzimas com atividade xilanolitica pertencentes à familia 8 podem ser vantajosamente utilizadas numa fórmula de melhoramento do pão.One aspect of the present invention is to show that enzymes with xylanolytic activity belonging to family 8 can be advantageously used in a bread improvement formula.

[0056] Numa outra concretização da presente invenção, mostra-se que uma enzima com atividade xilanolitica pertencente às hidrolases de glicosideos da familia 8 aumenta o volume da carcaça de um produto de padaria.In another embodiment of the present invention, an enzyme with xylanolytic activity belonging to the family 8 glycoside hydrolases is shown to increase the carcass volume of a bakery product.

[0057] Numa outra concretização da presente invenção, mostra-se que a quantidade de uma enzima da familia 8, com atividade xilanolitica, necessária para obter um resultado particular na cozedura é excepcionalmente menor que a quantidade geralmente utilizada quando se trabalha com enzimas disponíveis comercialmente.In another embodiment of the present invention, it is shown that the amount of a family 8 enzyme with xylanolytic activity required to obtain a particular cooking result is exceptionally less than the amount generally used when working with commercially available enzymes. .

[0058] Num aspecto adicional, a presente invenção respeita ao efeito aditivo da dita enzima com atividade xilanolitica com outras enzimas, em particular com uma alfa-amilase, preferencialmente uma alfa-amilase obtida a partir de Aspergillus oryzae. A dita enzima com atividade xilanolitica pode ser utilizada em combinação com outros agentes de melhoramento do pão tais como, mas não apenas, enzimas, emulsionantes, oxidantes, leite em pó, gorduras, açúcares, aminoácidos, sais, proteínas (glúten, locais de ligação de celulose), sendo tais agentes de melhoramento bem conhecidos dos técnicos da especialidade. Exemplos de enzimas são, embora não somente, as alfa- amilases, beta-amilases, amilases maltogênicas, xilanases, proteases, oxidase de glucose, oxido-redutases, glucanases, celulases, transglutaminases, isomerases, lipases, fosfolipases, pectinases, etc.In a further aspect, the present invention relates to the additive effect of said enzyme with xylanolytic activity with other enzymes, in particular with an alpha amylase, preferably an alpha amylase obtained from Aspergillus oryzae. Said enzyme with xylanolytic activity may be used in combination with other bread improving agents such as, but not limited to, enzymes, emulsifiers, oxidizers, milk powder, fats, sugars, amino acids, salts, proteins (gluten, binding sites). such enhancing agents are well known to those skilled in the art. Examples of enzymes are, but not only, alpha-amylases, beta-amylases, maltogenic amylases, xylanases, proteases, glucose oxidase, oxido-reductases, glucanases, cellulases, transglutaminases, isomerases, lipases, phospholipases, pectinases, etc.

[0059] A enzima com atividade xilanolitica segundo a presente invenção pode ser utilizada sob diversas formas. Podem ser usadas diretamente no processo células que exprimem a enzima, tais como fermentos, fungos, bactérias Archea ou bactérias. A dita enzima pode ser utilizada como um extrato de células, um extrato de célula livre (isto é, porções das células hospedeiras que foram submetidas a uma ou mais etapas de rompimento, centrifugação e/ou extração) ou como uma proteína purificada. Qualquer uma das formas acima descritas pode ser utilizada em combinação com outra enzima sob qualquer uma das formas acima descritas. Tais células, extratos de células, extratos de células livres ou enzimas podem ser misturados com diferentes ingredientes, por exemplo, sob a forma de um pó seco ou de um granulado, em particular um granulado não desempoado, sob a forma de um liquido, por exemplo com estabilizadores tais como polióis, açúcares, ácidos orgânicos, álcoois açucarados, segundo métodos estabelecidos.The enzyme with xylanolytic activity according to the present invention may be used in various forms. Cells expressing the enzyme may be used directly in the process, such as yeast, fungus, Archea bacteria or bacteria. Said enzyme may be used as a cell extract, a free cell extract (i.e. portions of the host cells that have undergone one or more disruption, centrifugation and / or extraction steps) or as a purified protein. Any of the forms described above may be used in combination with another enzyme in any of the forms described above. Such cells, cell extracts, free cell extracts or enzymes may be mixed with different ingredients, for example in the form of a dry powder or granulate, in particular a non-stripped granulate, as a liquid, for example. example with stabilizers such as polyols, sugars, organic acids, sugar alcohols according to established methods.

Exemplos Exemplo 1: Preparação da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a [0060] A xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis foi obtida como descrito (Collins et al, 2002, veja-se acima) a partir de uma cultura liquida de uma estirpe recombinante de Escherichia coli transformada com um vetor de ADN contendo o gene correspondente Exemplo 2; Preparação da xilanase a partir de Bacillus halodurans C-125 Estirpe bacteriana e condições de cultura [0061] Cultivou-se Bacillus halodurans C-125 (ATCC BAA- 125) em meio Alkaline Bacillus (10g/l de glucose, 5g/l de extrato de fermento (Difco), 10g/l de Bato Tryptone (Difco), lg/1 de K2HPO4, 0,2g/l de MgSC>4, 10g/l de Na2C0g) suplementada com 10g/l de xilana de madeira de bétula (Sigma) durante 72 horas a 37°C. Após centrifugação durante lh a 18000g e 4°C, o sobrenadante foi concentrado por precipitação com 80% de sulfato de amónio e ressuspenso em 20mM de MOPS a um pH de 8,0. Esta fração representa a fração de extrato bruto que será utilizada nos testes de cozedura.Examples Example 1: Preparation of Pseudoalteromonas haloplanktis xylanase TAH3a The xylanase obtained from Pseudoalteromonas haloplanktis was obtained as described (Collins et al, 2002, see above) from a liquid culture of a recombinant Escherichia strain. coli transformed with a DNA vector containing the corresponding gene Example 2; Preparation of xylanase from Bacillus halodurans C-125 Bacterial strain and culture conditions Bacillus halodurans C-125 (ATCC BAA-125) was grown in Alkaline Bacillus medium (10g / l glucose, 5g / l extract). yeast (Difco), 10g / l Bato Tryptone (Difco), 1g / l K2HPO4, 0.2g / l MgSO4, 10g / l Na2CO0) supplemented with 10g / l birch wood xylan ( Sigma) for 72 hours at 37 ° C. After centrifugation for 1h at 18000g and 4 ° C, the supernatant was concentrated by precipitation with 80% ammonium sulfate and resuspended in 20mM MOPS at pH 8.0. This fraction represents the fraction of crude extract that will be used in the cooking tests.

Clonagem e sobre expressão do gene da xilanase YCloning and over xylanase Y gene expression

[0062] O ADN genómico foi extraído e purificado a partir de culturas com 16 horas, cultivadas a 37°C em meio Alkaline Bacillus modificado como acima descrito, com o kit de Purificação de ADN Genómico Wizard® (Promega). Baseado na sequência publicada (acesso GenBank/GenPept™ AP001514), todo o gene de xilanase Y foi amplificado por PCR utilizando-se polimerase VENT (Biolabs Inc, Bervely, MA, USA) com a sequência iniciadora sentido. 5' -GGGCATATGAAGAAAACGACAGAAGG TG-3', SEQ ID N°.: 1 contendo um local Nde I (sublinhado) e com a sequência iniciadora anti-sentido. 5' -GGCTCGAGCTAG TGTTCCTCTTCTTG- 3', SEQ ID N°.: 2 contendo um local Xho I (sublinhado) e o códon de terminação (a itálico).Genomic DNA was extracted and purified from 16 hour cultures grown at 37 ° C in modified Alkaline Bacillus medium as described above with the Wizard® Genomic DNA Purification kit (Promega). Based on the published sequence (GenBank / GenPept ™ Access AP001514), the entire xylanase Y gene was PCR amplified using VENT polymerase (Biolabs Inc, Bervely, MA, USA) with the sense primer sequence. 5'-GGGCATATGAAGAAAACGACAGAAGG TG-3 ', SEQ ID NO: 1 containing an Nde I site (underlined) and with antisense primer. 5 '-GGCTCGAGCTAG TGTTCCTCTTCTTG-3', SEQ ID NO .: 2 containing an Xho I site (underlined) and the stop codon (italic).

[0063] Após 3 minutos de desnaturação inicial a 95°C, realizaram-se 25 ciclos de amplificação utilizando-se um aparelho Progene (Techne Cambridge, UK) . Cada ciclo incluiu desnaturação a 95°C durante 1 min, hibridização a 52°C durante 30 segundos e extensão a 72°C durante 1,5 minutos.After 3 minutes of initial denaturation at 95 ° C, 25 rounds of amplification were performed using a Progene apparatus (Techne Cambridge, UK). Each cycle included denaturation at 95 ° C for 1 min, hybridization at 52 ° C for 30 seconds and extension at 72 ° C for 1.5 minutes.

[0064] O produto de PCR foi clonado num vetor PCRScript Amp SK(+) (Stratagene), utilizando-se o procedimento recomendado pelo fornecedor, e utilizado para transformar as células ultracompetentes Kan Epicurian Coli XLlO-Gold® . A seleção azul-branco permitiu a seleção de colônias brancas que transportavam o fragmento de PCR. A preparação de plasmideo purificado (plasmideo Nucleospin, Macherey-Nagel) foi sequenciada num sequenciador de ADN ALF (Pharmacia Biotech). A sequenciação do fragmento inserido foi levada a cabo utilizando-se as sequências iniciadoras universais T7 e RP assim como as seguintes sequências de iniciação: 5' -GTGCGGATGAAGGAATGTC-3', SEQ ID N°.: 3 5' -GTATGGTCCATCAACAGAGG-3', SEQ ID N°.: 4 5' -GATGGCATAAAAATCCTGG-3'. SEQ ID N°.: 5 [0065] A sequência obtida era idêntica à sequência publicada que poderia ser obtida a partir do GenBank/genPept™ com o número de acesso AP001514.The PCR product was cloned into a PCRScript Amp SK (+) vector (Stratagene) using the procedure recommended by the supplier and used to transform Kan Epicurian Coli XL10-Gold® ultracompetent cells. The blue-white selection allowed the selection of white colonies carrying the PCR fragment. The purified plasmid preparation (Nucleospin, Macherey-Nagel plasmid) was sequenced on an ALF DNA sequencer (Pharmacia Biotech). Sequencing of the inserted fragment was performed using the T7 and RP universal primers as well as the following priming sequences: 5'-GTGCGGATGAAGGAATGTC-3 ', SEQ ID NO: 35'-GTATGGTCCATCAACAGAGG-3', SEQ ID NO: 45 '-GATGGCATAAAAATCCTGG-3'. SEQ ID NO: 5 The sequence obtained was identical to the published sequence that could be obtained from GenBank / genPept ™ with accession number AP001514.

[0066] O gene da xilanase Y, uma vez clonado no PCRScript Amp SK(+), foi então extirpado com Nde I e Xho I e ligado ao vetor de clonagem pET 22b(+) (Novagen). O plasmideo recombinante resultante foi transformado para células E. coli BL21 (DE3) (Stratagene).The xylanase Y gene, once cloned into PCRScript Amp SK (+), was then deleted with Nde I and Xho I and ligated to the pET 22b (+) cloning vector (Novagen). The resulting recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) cells (Stratagene).

Produção da xilanase Y recombinante da familia 8 a partir de Bacillus halodurans C-125.Production of family 8 recombinant xylanase Y from Bacillus halodurans C-125.

[0067] Quinze ml de uma pré-cultura com cinco horas (37°C) das células E. coli BL21 (DE3) que transportam o gene da xilanase foram centrifugados a lOOOOg durante 1 minuto e o disco sedimentar foi ressuspenso em 900ml de caldo Terrific (12g/l de Bato triptona (Difco), 24g/l de extrato de fermento (Difco), 4ml/l de glicerol, 12,54g/l de K2HPO4, 2,31g/l de KH2PO4) contendo 200pg/ml de ampicilina num matraz de 3 litros com agitação. A cultura foi incubada a 37 °C e a 250rpm até se ter alcançado uma absorvência a 550nm entre 3-4, após o que a expressão da enzima foi induzida com lmM de isopropil-l-tio-p-galactopiranosideo. Após 15 horas adicionais de incubação a 37°C as células foram colhidas por centrifugação a 18000g durante 30 minutos a 4°C, ressuspensas em 50nM de BICINE contendo lOmM de NaCl, rompidas num rompedor de células pré-refrigerado (Constant Systems Ltd, Warwick, UK) a 28Kpsi e centrifugadas a 40.000g durante 30 minutos.Fifteen ml of a five hour (37 ° C) preculture of the E. coli BL21 (DE3) cells carrying the xylanase gene were centrifuged at 100,000g for 1 minute and the sedimentary disc was resuspended in 900ml of broth. Terrific (12g / l Bato tryptone (Difco), 24g / l yeast extract (Difco), 4ml / l glycerol, 12.54g / l K2HPO4, 2.31g / l KH2PO4) containing 200pg / ml of ampicillin in a 3 liter flask with stirring. The culture was incubated at 37 ° C and 250rpm until an absorbance at 550nm of 3-4 was reached, after which expression of the enzyme was induced with 1mM isopropyl-1-thio-p-galactopyranoside. After an additional 15 hours of incubation at 37 ° C the cells were harvested by centrifugation at 18000g for 30 minutes at 4 ° C, resuspended in 50nM BICINE containing 10mM NaCl, disrupted in a pre-refrigerated cell breaker (Constant Systems Ltd, Warwick , UK) at 28 Kpsi and centrifuged at 40,000g for 30 minutes.

Produção da xilanase recombinante de Bacillus halodurans C-125, da familia 8 [0068] As células de uma pré-cultura com cinco horas (37°C) das células E. coli BL21 (DE3) que transportam o gene da xilanase foram colhidas por centrifugação a lO.OOOg durante 1 minuto e utilizadas para inocular cinco litros (15ml de pré-cultura por litro de cultura) de caldo Terrific (12g/l de Bato triptona (Difco), 24g/l de extrato de fermento (Difco), 4ml/l de glicerol, 12,54g/l de K2HPO4, 2,31g/l de KH2PO4) contendo 200pg/ml de ampicilina. A cultura foi incubada a 37°C e a 250rpm até se ter alcançado uma absorvência de 550nm entre 3-4, após o que a expressão da enzima foi induzida com lmM de isopropil-l-tio-β-galactopiranosideo. Após 4 horas adicionais de incubação a 37°C as células foram colhidas por centrifugação a 18000g durante 20 minutos a 4°C, ressuspensas em 20mM de MOPS (Sigma), rompidas num rompedor de células pré-refrigerado (Constant Systems Ltd.) a 28Kpsi e centrifugadas a 40.000g durante 30 minutos. O ADN cromossomático foi removido por tratamento com 0,2% de sulfato de protamina (Calbiochem) e centrifugação a 40.000g durante 30 minutos. Adicionaram-se, então, 25 unidades de benzonase (Merck, Darmstadt, Alemanha) e a solução foi utilizada em testes de cozedura.Production of Bacillus halodurans C-125, Family 8 Recombinant Xylanase Cells from a five hour (37 ° C) preculture of E. coli BL21 (DE3) cells carrying the xylanase gene were harvested by centrifugation at 100,000g for 1 minute and used to inoculate five liters (15ml preculture per liter culture) of Terrific broth (12g / l Bato Tryptone (Difco), 24g / l yeast extract (Difco), 4ml / l glycerol, 12.54g / l K2HPO4, 2.31g / l KH2PO4) containing 200pg / ml ampicillin. The culture was incubated at 37 ° C and 250rpm until an absorbance of 550nm between 3-4 was reached, after which expression of the enzyme was induced with 1mM isopropyl-1-thio-β-galactopyranoside. After an additional 4 hours of incubation at 37 ° C the cells were harvested by centrifugation at 18,000g for 20 minutes at 4 ° C, resuspended in 20mM MOPS (Sigma), disrupted in a pre-refrigerated cell breaker (Constant Systems Ltd.) at 28 Kpsi and centrifuged at 40,000g for 30 minutes. Chromosomal DNA was removed by treatment with 0.2% protamine sulfate (Calbiochem) and centrifugation at 40,000g for 30 minutes. Then 25 units of benzonase (Merck, Darmstadt, Germany) were added and the solution was used in cooking tests.

Exemplo 3; Efeito da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a na cozedura de pãezinhos crocantes belgas [0069] Foram realizados testes de cozedura para demonstrar o efeito positivo da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a na cozedura. O efeito positivo foi avaliado pelo aumento do volume do pão por comparação com uma referência que não continha tal enzima.Example 3; Effect of Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a xylanase on the baking of Belgian crispy rolls Baking tests have been performed to demonstrate the positive effect of Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a xylanase on baking. The positive effect was assessed by increasing the volume of bread compared to a reference containing no such enzyme.

[0070] A xilanase foi testada nos pãezinhos crocantes belgas que todos os dias são produzidos em grande escala na Bélgica. O processo descrito é bem conhecido por qualquer padeiro experiente e é obvio para um técnico na especialidade que os mesmos resultados podem ser obtidos utilizando-se equipamento de outros fornecedores.Xylanase has been tested on the Belgian crispy rolls that are produced on a large scale every day in Belgium. The process described is well known to any experienced baker and it is obvious to one skilled in the art that the same results can be obtained using equipment from other suppliers.

[0071] Os ingredientes utilizados são enunciados no quadro 1 abaixo: Quadro 1 (1): Uma unidade de xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis é definida como a quantidade de enzimas necessárias para libertar lpmole de açúcar reduzido (expresso como x i1o se} a partir da xilana de madeira de bétula a 30QC e com um pH de 4,5 (Método Melson-Somogyi) [0072] Qs ingredientes forara misturados durante 2 minutos a baixa velocidade e durante 8 minutos a alta velocidade num misturador Diosna SP24 . A temperatura final da massa de farinha assim como as temperaturas de levedura e de delineamento foram de 25°C, Após descansar durante 15 minutos a 25°C, a massa de farinha voltou a ser trabalhada manualmente e descansou durante mais 10 minutos. Mais tarde, prepararam-se pedaços de massa de farinha com 2 kg que ficaram em delineamento durante 10 minutos. Qs pedaços de massa de farinha com 2 Kg foram divididos e preparados utilizando uma Eberhardt Optímat, Foram obtidos pedaços redondos de massa de farinha com 66g, Após um novo período de descanso de 5 minutos, os pedaços de massa de farinha foram cortados por pressão e submetidos a uma etapa final de delineamento durante 70 minutos. Os pedaços de massa de farinha foram cozidos a 230°C num forno com vapor MIWE Condo™ (Michael Wenz-Arnstein-Alemanha). Mediu-se o volume de 6 pâezinhos, utilizando-se o método do afastamento das sementes de colza habitualmente utilizado.The ingredients used are listed in Table 1 below: Table 1 (1): One unit of Pseudoalteromonas haloplanktis xylanase is defined as the amount of enzymes required to release 1 lpmole of reduced sugar (expressed as x io if} from birch wood xylan at 30 ° C and pH 4.5 (Melson-Somogyi Method) The ingredients were mixed for 2 minutes at low speed and for 8 minutes at high speed in a Diosna SP24 mixer. The yeast dough as well as the yeast and design temperatures were 25 ° C. After resting for 15 minutes at 25 ° C, the dough was reworked manually and rested for a further 10 minutes. 2 kg dough pieces that were outlined for 10 minutes The 2 kg dough pieces were divided and prepared using an Eberhardt Optímat. 66g flour dough After a further 5 minute rest period, the flour dough pieces were cut by pressure and subjected to a final design step for 70 minutes. The dough pieces were baked at 230 ° C in a MIWE Condo ™ steam oven (Michael Wenz-Arnstein-Germany). The volume of 6 rolls was measured using the commonly used rapeseed spacing method.

[0073] Os resultados são· apresentados no· quadro 2 abaixo: _____________________Quadro 2_____________________ [0074] Uma representação gráfica do efeito da xilanase é mostrada na figura 1.[0073] The results are presented in Table 2 below: _____________________Table 2_____________________ [0074] A graphical representation of the xylanase effect is shown in figure 1.

[0075] Estes resultados mostram que a xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis tem um efeito positivo no volume do pão.These results show that Pseudoalteromonas haloplanktis xylanase has a positive effect on bread volume.

Exemplo 4: Comparação de quantidades de xilanase utilizada na cozedura [0076] A quantidade relativa de xilanases necessárias para se obter o mesmo efeito no volume que no teste dos pâezinhos crocantes belgas descrito no exemplo 3 foi comparada por eletroforese em gel de SDS-poIiacrilamida.Example 4: Comparison of Amounts of Xylanase Used in Cooking The relative amount of xylanases required to achieve the same effect on volume as in the Belgian crispbread test described in Example 3 was compared by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.

[0077] As xilanases testadas e os seus respectivos níveis de utilização na cozedura foram os seguintes: a xilanase obtida a partir de Pseudoa1teromonas haloplanktis TAH3a (30 unidades de P. Haloplanktis /100 kg de farinha); - a xilanase obtida a partir de Bacillus subtilis (Belase B210 (BELDEM S.A, Bélgica) — 3g/100 kg de farinha). Quantidades de enzimas correspondentes à quantidade necessária para tratar 0,333 kg e 0,166 kg de farinha, e resultando no mesmo aumento de volume, foram carregadas num gel para eletroforese em SDS-poliacrilamida "Ready Gel" (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) pré-vazado em 12% Tris HCL, e ensaiadas num dispositivo "Mini Protean II" (BIO-RAD) segundo o processo do fabricante. As proteínas foram coradas com azul de Coomassie utilizando um procedimento padrão.The xylanases tested and their respective levels of use in cooking were as follows: the xylanase obtained from Pseudoa1teromonas haloplanktis TAH3a (30 units of P. Haloplanktis / 100 kg flour); - xylanase obtained from Bacillus subtilis (Belase B210 (BELDEM S.A, Belgium) - 3g / 100 kg flour). Enzyme amounts corresponding to the amount needed to treat 0.333 kg and 0.166 kg of flour, and resulting in the same volume increase, were loaded onto a SDS-Ready-to-use polyacrylamide electrophoresis gel (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) pre-cast in 12% Tris HCL, and tested on a "Mini Protean II" device (BIO-RAD) according to the manufacturer's process. Proteins were stained with Coomassie blue using a standard procedure.

[0078] Uma imagem do gel corado é mostrada na figura 2.An image of the stained gel is shown in figure 2.

[0079] Pode concluir-se por esta imagem que a quantidade de xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a necessárias na cozedura é significativamente mais baixa comparativamente à outra.It can be concluded from this image that the amount of xylanase obtained from Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a required in cooking is significantly lower compared to the other.

Exemplo 5; Efeito da xilanase de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a em pães argentinos [0080] Foram realizados testes de cozedura para demonstrar o efeito positivo das xilanases da família 8 na cozedura numa outra receita diferente da utilizada no exemplo 3, tal como, por exemplo, em pães argentinos. 0 efeito positivo foi avaliado pelo aumento do volume do pão comparado a uma referência que não continha a enzima e pela extensão do corte na superfície do pão.Example 5; Effect of Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a xylanase on Argentinian breads Baking tests were performed to demonstrate the positive effect of family 8 xylanases on baking in a recipe other than that used in example 3, such as, for example, on Argentine breads. The positive effect was assessed by increasing the volume of bread compared to a reference that did not contain the enzyme and by extending the cut on the bread surface.

[0081] As enzimas da invenção foram testadas nos pães argentinos que são tipicamente pães compridos que necessitam de um longo período de delineamento (17 horas a 20°C) . O processo descrito é bem conhecido por qualquer padeiro experiente e é óbvio para um técnico na especialidade que os mesmos resultados podem ser obtidos utilizando-se equipamento de outros fornecedores, [0082] Os ingredientes utilizados são enunciados no quadro 3 abaixo: Quadro 3 (1) : 0 melhorador padrão utilizado contém: alfa amilase fúngica (Fungamyl 75.000/ Novozymes} lg/100 kg de farinha/ 1Og de vitamina C, Azodicarbonamido 2g/100 kg de farinha.The enzymes of the invention have been tested on Argentinean breads which are typically long breads that require a long design period (17 hours at 20 ° C). The process described is well known to any experienced baker and it is obvious to one skilled in the art that the same results can be obtained using equipment from other suppliers. The ingredients used are listed in Table 3 below: Table 3 (1 ): The standard enhancer used contains: fungal alpha amylase (Fungamyl 75,000 / Novozymes} lg / 100 kg flour / 10g vitamin C, Azodicarbonamido 2g / 100 kg flour.

Isto é um exemplo de um melhorador padrão. As quantidades absolutas e relativas de aditivos podem variar em função de uma adaptação local à farinha de trigo e ao processo. (2) : Uma unidade de xilanase é definida como a quantidade de enzimas necessárias para libertar lpmoie de açúcar reduzido (expresso como xilose) a partir da xilana de madeira de bétula a 3Q°C e com um pH de 4,5 (método liei son-Somogy i) .This is an example of a standard enhancer. Absolute and relative amounts of additives may vary depending on local adaptation to wheat flour and process. (2): One unit of xylanase is defined as the amount of enzymes required to release reduced sugar monoxide (expressed as xylose) from birch wood xylan at 30 ° C and pH 4.5 (liei method). son-Somogy i).

[0083] Os ingredientes foram misturados durante 2 minutos a baixa velocidade e durante 1 minutos a alta velocidade num misturador Diosna SP24, A temperatura final da massa de farinha durante o descanso foi de 25°C, enquanto que durante o delineamento foi de 2Q°C. Após descansar durante 20 minutos a 25°C, a massa de farinha voltou a ser trabalhada manualmente e descansou durante 17 horas a 20°C durante o delineamento. Mais tarde, prepararam-se pedaços de massa de farinha com 2 kg que ficaram em delineamento durante 10 minutos. Os pedaços de massa de farinha com 0,35 Kg foram divididos e preparados utilizando um Bertrand R8/L8 (+/- 30 cm) e submetidos a uma etapa final de delineamento durante 17 horas. Os pedaços de massa de farinha foram cozidos a 210°C durante 3 0 min num forno com vapor MIWE Condo™ (Michael Wenz-Arnstein-Alemanha). Mediu-se o volume dos pães argentinos, utilizando-se o método do afastamento das sementes de colza habitualmente utilizado.The ingredients were mixed for 2 minutes at low speed and for 1 minute at high speed in a Diosna SP24 mixer. The final dough temperature at rest was 25 ° C, while during design was 20 ° C. Ç. After resting for 20 minutes at 25 ° C, the dough was reworked by hand and rested for 17 hours at 20 ° C during the design. Later, 2 kg dough pieces were prepared and outlined for 10 minutes. The 0.35 kg dough pieces were divided and prepared using a Bertrand R8 / L8 (+/- 30 cm) and subjected to a final design step for 17 hours. The dough pieces were baked at 210 ° C for 30 min in a MIWE Condo ™ steam oven (Michael Wenz-Arnstein-Germany). The volume of Argentinean breads was measured using the commonly used rapeseed spacing method.

[0084] Os resultados são apresentados no quadro 4 abaixo: Quadro 4 [0085] Estes resultados mostram que a xilanase da família 8 tem um efeito positivo na confecção de pão com um longo periodo de delineamento a baixa temperatura (isto é, 20°C). A quantidade de enzima comercial (Bel'ase B210, vide acima) aqui utilizada é 3 vezes mais elevada do que a dosagem ótima requerida conforme se descreve no exemplo 3 para pâezinhos crocantes belgas, enquanto que a quantidade necessária de xilanase da família 8 permaneceu inalterada. Também existe uma diferença entre a concentração de enzimas necessárias para otimizar a extensão do corte e a necessária para um aumento de volume ótimo.The results are shown in Table 4 below: Table 4 These results show that family 8 xylanase has a positive effect on bread making with a long period of low temperature design (ie 20 ° C). ). The amount of commercial enzyme (Bel'ase B210, see above) used herein is 3 times higher than the optimal dosage required as described in Example 3 for Belgian crispy rolls, while the required amount of family 8 xylanase remained unchanged. . There is also a difference between the concentration of enzymes needed to optimize cut length and that required for optimum swelling.

Exemplo 6; Efeito, na cozedura, de várias enzimas da invenção versus outras enzimas [0086] Foram realizados testes de cozedura para demonstrar o efeito positivo, na cozedura, de várias enzimas com atividade xilanolitica pertencentes às hidrolases de glicosideos da família 8. O efeito positivo foi avaliado pelo aumento de volume do pão comparativamente a uma referência que não continha tais enzimas assim como a uma preparação de enzimas comercial (Bel'ase B210, vide acima).Example 6; Effect on cooking of various enzymes of the invention versus other enzymes Cooking tests were performed to demonstrate the positive effect on cooking of various enzymes with xylanolytic activity belonging to the glycoside hydrolases of family 8. The positive effect was evaluated. by increasing the volume of bread compared to a reference containing no such enzymes as well as a commercial enzyme preparation (Bel'ase B210, see above).

[0087] A xilanase obtida a partir de Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a foi preparada e purificada como se descreve no exemplo 1. A xilanase Y obtida a partir de Bacillus halodurans C-125 foi preparada a partir de uma estirpe Escherichia coli recombinante como se descreve no exemplo 2.The xylanase obtained from Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a was prepared and purified as described in example 1. The xylanase Y obtained from Bacillus halodurans C-125 was prepared from a recombinant Escherichia coli strain as described in the example. 2.

[0088] O método utilizado para avaliar o desempenho das duas enzimas foi um pequeno teste de cozedura que consistiu na preparação de massa de farinha com lOOg de farinha.[0088] The method used to evaluate the performance of the two enzymes was a small baking test which consisted of the preparation of dough with 100g of flour.

[0089] O procedimento descrito é bem conhecido dos técnicos na especialidade e é óbvio que os mesmos resultados podem ser obtidos utilizando-se equipamento de outros fornecedores.The procedure described is well known to those skilled in the art and it is obvious that the same results can be obtained using equipment from other suppliers.

[0090] Os ingredientes utilizados são enunciados no quadro 5 abaixo: Quadro 5 (1): Uma unidade de xilanase é definida como a quantidade de enzimas necessárias para libertar l piriole de açúcar reduzido (expresso como xilose) a partir da xilana da madeira de bétula a 30°C e com um pH de 4,5 (método Nelson-Somogyi) .The ingredients used are listed in Table 5 below: Table 5 (1): A unit of xylanase is defined as the amount of enzymes required to release reduced sugar pyriole (expressed as xylose) from the wood xylan. birch at 30 ° C and pH 4.5 (Nelson-Somogyi method).

Os ingredientes foram misturados durante 4,5 minutos num misturador National. Foram pesados 150g de pedaços de massa de farinha e ficaram a descansar durante 20 minutos a 25°C em caixas plásticas, As massas de farinha voltaram a ser trabalhadas durante mais 20 minutos. 0 tempo final de delineamento foi de 50 minutos a 36°C. Qs pedaços de massa de farinha foram, então, cozidos a 225°C durante 20 minutos. Mediu-se o volume dos pães, utilizando-se o método do afastamento das sementes de colza habitualmente utilizado.The ingredients were mixed for 4.5 minutes in a National mixer. 150g pieces of dough were weighed and rested for 20 minutes at 25 ° C in plastic boxes. The doughs were reworked for a further 20 minutes. The final design time was 50 minutes at 36 ° C. The dough pieces were then baked at 225 ° C for 20 minutes. Bread volume was measured using the commonly used rapeseed spacing method.

[0091] Os resultados são apresentados no quadro 6 abaixo: Quadro 6 [0092] Estes resultados mostram que o efeito positivo das enzimas da invenção não está restringido à xilanase de Pseudóalteromonas haloplanktis TAH3a. Do mesmo modo, outras preparações de enzimas com atividade xilanolítica pertencentes â hidrolase de glicosídeo da família 8 podem melhorar as propriedades do pão (aqui demonstrado para a xilanase de Bacillus halodurans C-125, outros resultados não são mostrados}.The results are shown in Table 6 below: Table 6 These results show that the positive effect of the enzymes of the invention is not restricted to Pseudolalteromonas haloplanktis TAH3a xylanase. Similarly, other xylanolytic activity enzyme preparations belonging to the family 8 glycoside hydrolase may improve the properties of bread (shown here for Bacillus halodurans C-125 xylanase, other results are not shown).

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Bread-making composition for increasing the carcass volume of a bakery product or for increasing the extent of surface cut of a bakery product, characterized in that it comprises at least one enzyme with xylanolytic activity selected from the group consisting of glycoside hydrolases of the family 8.

2 . Bread breeding composition according to claim 1, characterized in that said enzyme hydrolyses with inversion of configuration.

Bread breeding composition according to either claim 1 or claim 2, characterized in that said enzyme is a xylanase obtained from a strain of Pseudoalteromonas haloplanktis.

Bread breeding composition according to claim 3, characterized in that said strain of Pseudoalteromonas haloplanktis is Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a and the xylanase preferably obtained has the amino acid sequence of SEQ I NO: 7.

Bread breeding composition according to either claim 1 or claim 2, characterized in that said enzyme is a xylanase obtained from a strain of Bacillus halodurans.

Bread breeding composition according to claim 5, characterized in that said Bacillus halodurans strain is Bacillus halodurans C-125 and the xylanase preferably obtained has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

Bread improving composition according to any one of claims 1 to 6, characterized in that said improving composition further comprises another bread improving agent which is selected from a list of other enzymes; emulsifiers, oxidizers, milk powder, fats, sugars, amino acids, salts, proteins (gluten, cellulose binding sites) or mixtures thereof.

Bread melon composition according to Claim 7, characterized in that said other enzymes are selected from a list consisting of alpha-amylases, beta-amylases, maltogenic amylases, other xylanases, proteases, glucose oxidase. , oxido reductases, glucanases, cellulases, transglutaminases, isomerases, lipases, phospholipases, pectinases or mixtures thereof.

Bread breeding composition according to claim 8, characterized in that said alpha-amylase is an alpha-amylase obtained from Asperglllus oryzae.

Bread improving composition according to any one of claims 1 to 9, characterized in that said enzyme with xylanolytic activity is present as a cell extract, a free cell extract or as a purified protein.

Bread improvement composition according to any one of claims 1 to 10, characterized in that said enzyme with xylanolytic activity is mixed with other ingredients in the form of a dry powder or granulate, in particular a undressed granules, or in liquid form, preferably with one or more stabilizers such as polyols, sugars, organic acids or sugar alcohols.

Method for preparing a bakery product, characterized in that it comprises the step of adding to the dough of said bakery product an enhancement composition as defined in claims 1 to 11.

Method according to claim 12, characterized in that said bread improving composition is added during the mixing of the dough.

Method for increasing the carcass volume of a bakery product, comprising the step of adding, during the dough mixing step of such a bakery product, between 25 and 12000 units of an active enzyme One unit of xylanase is defined as the amount of enzyme required to release 1 μπιοίε of reduced sugar (expressed as xylose) from birch wood xylan at 30 ° C and a pH of 4.5, said enzyme selected from the group consisting of the family glycoside hydrolase xylanases 8.

15. Method for increasing the carcass volume of a bakery product or for increasing the extent of surface cut of a bakery product, comprising the step of adding, while mixing the dough of such a product. 25 to 12000 units of an enzyme with xylanolytic activity, where one unit of xylanase is defined as the amount of enzyme required to release 1 pmole of reduced sugar (expressed as xylose) from the birch wood xylan at 30 ° C. ° C and a pH of 4.5, said enzyme being selected from the group consisting of family 8 glycoside hydrolase xylanases, family 8 glycoside hydrolases which hydrolyze with inversion of configuration and / or a combination thereof.

Bakery product, characterized in that it is obtained by the method defined in any one of claims 12 to 15.

Bakery product according to claim 16, characterized in that it is an Argentinean bread with an increased cut length.