BRPI0207770B1 - Enzimas tendo atividade de alfa amilase, preparação compreendendo as mesmas, polinucleotídeos codificando as referidas enzimas, vetores, células hospedeiras, métodos de produção das referidas enizimas, método de hidrolisar uma ligação de amido, produzir um xarope, liquefação do amido, tratamento de fibras lignocelulósicas, para desengomar o tecido, lavar um objeto, detergente aditivo - Google Patents

Description

(54) Título: ENZIMAS TENDO ATIVIDADE DE ALFA AMILASE, PREPARAÇÃO COMPREENDENDO AS MESMAS, POLINUCLEOTIDEOS CODIFICANDO AS REFERIDAS ENZIMAS, VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DAS REFERIDAS ENIZIMAS, MÉTODO DE HIDROLISAR UMA LIGAÇÃO DE AMIDO, PRODUZIR UM XAROPE, LIQUEFAÇÃO DO AMIDO, TRATAMENTO DE FIBRAS LIGNOCELULÓSICAS, PARA DESENGOMAR O TECIDO, LAVAR UM OBJETO, DETERGENTE ADITIVO (73) Titular: BASF ENZYMES LLC. Endereço: 3550 John Hopkins Court, San Diego, Califórnia 92121, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: WALTER CALLEN; TOBY RICHARDSON; GERHARD FREY; MATGORZATA SLUPSKA; JANNE S. KEROVUO; JAY M. SHORT; ERIC J. MATHUR; KEVIN GRAY

Código de Controle: A6305A9742725053 0B63EA91973E9FB6

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/10/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 02/10/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ENZIMAS TENDO ATIVIDADE DE ALFA AMILASE, PREPARAÇÃO COMPREENDENDO AS MESMAS, POLINUCLEOTÍDEOS CODIFICANDO AS REFERIDAS ENZIMAS, VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DAS REFERIDAS ENIZIMAS, MÉTODO DE HIDROLISAR UMA LIGAÇÃO DE AMIDO, PRODUZIR UM XAROPE, LIQUEFAÇÃO DO AMIDO, TRATAMENTO DE FIBRAS LIGNOCELULÔSICAS, PARA DESENGOMAR O TECIDO, LAVAR UM OBJETO, DETERGENTE ADITIVO”.

Dados do Pedido Relacionado

Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório U.S. no 60/270.495, depositado em 21 de fevereiro de 2001, nova pendência; Pedido Provisório U.S. n° 60/270.496, depositado em 21 de fevereiro de 2001, nova pendência; e Pedido Provisional U.S. n° 60/291.122, depositado em 14 de maio de 2001, nova pendência, todos dos quais estão aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se, em geral, a enzimas, polinucleotídeos codificando as enzimas, o uso de tais polinucleotídeos e polipeptídeos, e mais especificadamente a enzimas tendo atividade de alfa amilase.

Fundamento

O amido é um carboidrato complexo freqüentemente encontrado na dieta humana. A estrutura do amido é polímeros de glicose ligados por ligações glicosídicas de a-1,4 e a-1,6, Amilase é uma enzima que catalisa a hidrólise de amidos nos açúcares. Amilase hidrolisa ligações a-1,4 glicosídicas internas no amido, basicamente aleatoriamente, para produzir malto-dextrinas de peso molecular mais baixo. A ruptura do amido é importante no sistema digestivo e comercial mente. Amilases são de considerável valor comercial, sendo empregada nos estágios iniciais (liquefação) do processo do amido; na moagem de milho a úmido; na produção de álcool; como agentes limpadores em matrizes detergentes; na indústria têxtil para desengomar

Segue-se folha 1 a

1a amido; em aplicações para cozedura; na indústria de bebidas; em campos petrolíferos nos processos de perfuração; na coloração de papel reciclado; e em alimentos para animais.

As amilases são produzidas por uma ampla variedade de micro5 organismos incluindo Bacillus e Aspergillus, com a maioria das amilases comerciais sendo produzidas a partir de fontes bacterianas tal como Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, ou Bacillus stearto-

Segue-se folha 2 thermophilus. Nos últimos anos, as enzimas em uso comercial têm sido aquelas de Bacillus licheniformis por causa de seu desempenho e estabilidade ao calor, pelo menos em pHs moderadamente alcalinos e neutros.

Em geral, o processamento de amido para frutose consiste de quatro etapas: liquefação do amido granular, sacarificação do amido liquidificado em dextrose, purificação, e isomerização para frutose. O objetivo de um processo de liquefação de amido é converter uma suspensão concentrada de grânulos de polímero de amido em uma solução de dextrinas de extensão de cadeia mais curta solúvel de viscosidade baixa. Esta etapa é essencial para manuseio conveniente com equipamento padrão e para conversão eficiente para glicose ou 10³ de outros açúcares. Para liquefazer o amido granular, é necessário gelatinizar os grânulos aumentando-se a temperatura do amido granular para acima de cerca de 72°C. O processo de aquecimento instantaneamente separa os grânulos de amido insolúveis para produzir uma solução de amido solúvel em água. A solução de amido solubilizada é então liquefeita por amilase. Um grânulo de amido é composto de 69-74% de amilopectina; 26-31% de amilose; 11-14% de água; 0,2-0,4% de proteína; 0,5-0,9% de lipídeo; 0,05-0,1% de cinzas, 0,02%0,03% de fósforo, 0,1% de pentosana. Aproximadamente 70% de um grânulo é amorfo e 30% é cristalino.

Um processo de liquefação enzimática comum envolve ajustar o pH de uma pasta fluida de amido granular entre 6,0 e 6,5, o pH ótimo de alfa-amilase derivado de Bacillus licheniformis, com a adição de hidróxido de cálcio, hidróxido de sódio ou carbonato de sódio. A adição de hidróxido de cálcio tem a vantagem de também fornecer íons de cálcio que são conhecidos por estabilizar a alfa-amilase contra desativação. Na adição de alfaamilase, a suspensão é bombeada através de um jato a vapor para instantaneamente aumentar a temperatura entre 80 graus- 115 graus C. O amido é imediatamente gelatinizado e, devido à presença de alfa-amilase, despolimerizado através de hidrólise aleatória de uma ligação glicosídica (1-4) por alfa-amilase a uma massa fluida que seja facilmente bombeada.

Em uma Segunda variação para o processo de liquefação, alfa3 amilase é adicionada à suspensão de amido, a suspensão é mantida em uma temperatura de 80-100 graus C para parcialmente hidrolisar os grânulos de amido, e a suspensão de amido parcialmente hidrolisada é bombeada através de um jato em temperaturas em excesso de cerca de 105 graus C até completamente gelatinizar qualquer estrutura granular restante. Após o resfriamento do amido gelatinizado, uma segunda adição de alfa-amilase pode ser feita para ainda hidrolisar o amido.

Uma terceira variação deste processo é chamada o processo de moagem a seco. Na moagem a seco, todo o grão é moído e combinado com água. O germe é opcionalmente removido por separação por flutuação ou técnicas equivalentes. A mistura resultante, a qual contém amido, fibra, proteína e outros componentes do grão; é liquefeita empregando alfaamilase. A prática geral na técnica é para experimentar liquefação enzimática em uma temperatura inferior quando empregando o processo de moagem a seco. Geralmente, a liquefação em temperatura baixa é acreditada ser menos eficiente do que a liquefação em temperatura elevada na conversão de amido para dextrinas solúveis.

Tipicamente, após a gelatinização a solução de amido é mantida em uma temperatura elevada na presença de alfa-amilase até que um DE de 10-20 seja alcançado, freqüentemente um período de 1-3 horas. O equivalente de dextrose (DE) é o padrão da indústria para medir a concentração de açúcares de redução total, calculado como D-glicose em uma base de peso seco. O amido granular não hidrolisado tem um DE de virtualmente zero, ao mesmo tempo em que o DE de D-glicose é definido como 100.

A moagem a úmido de milho é um processo que produz óleo de milho, farinha de glúten, amido e alimento de glúten. A amilase alcalina é empregada na liquefação do amido e glicoamilase é empregada na sacarificação, produzindo glicose. Milho, uma semente do qual consiste de um revestimento de semente externa (fibra), amido, uma combinação de amido e glicose e o germe interno, é submetido a um processo de quatro etapas, que resulta na produção de amido. O milho é extraído, desgerminado, desfibrado, e finalmente o glúten é separado. No processo de extração, os solúveis

são reservados. O produto restante após a remoção dos solúveis é desgerminado, resultando na produção de óleo de milho e produção de massa de óleo, que é adicionada aos solúveis da etapa de extração. O produto restante é destibrado e os sólidos de fibra são adicionados à mistura de massa/solúveis. Esta mistura de sólidos de fibra, massa de óleo e solúveis forma um alimento de glúten. Após o desfibramento, o produto restante é submetido à separação de glúten. Esta separação resulta em um amido e farinha de glúten. O amido é então submetido à liquefação e sacarificação para produzir glicose.

O envelhecimento dos produtos cozidos (tal como pão) tem sido reconhecido como um problema que torna-se mais sério quando mais tempo existe entre o momento da preparação do produto de pão e o momento do consumo. O termo envelhecimento é empregado para descrever alterações indesejáveis pelo consumidor nas propriedades do produto de pão após ter deixado o forno, tal como um aumento da firmeza do miolo, uma diminuição da elasticidade do miolo, e alterações na crosta, que torna-se elástica e dura. A firmeza do miolo do pão aumenta ainda durante o armazenamento até um nível, que seja considerado como negativo. O aumento na firmeza do miolo, que é considerado como o aspecto mais importante do envelhecimento, é reconhecido pelo consumidor um longo tempo antes do produto de pão ter de outro modo tornado-se inadequado para o consumo.

Há uma necessidade na indústria para a identificação e otimização de amilases, úteis para vários usos, incluindo processos de liquefação de amido de milho comercial. Essa segunda geração de amilases de ácido oferecerá características de desempenho e/ou preparação melhoradas durante a industrialização de enzimas padrão de Bacillus licheniformis, por exemplo.

Há também uma necessidade da identificação e otimização de amilases tendo utilidade nos produtos de lavagem de louça automática (ADW) e detergente de lavanderia. Nos produtos de ADW, a amilase funcionará em pH 10-11 e em 45-60°C na presença de quelantes de cálcio e condições oxidativas. Para lavanderia, a atividade em pH 9-10 e 40°C na i

matriz de detergente apropriada será requerida. As amilases são também úteis no descolamento de têxteis, processos de fermentação, modificação de amido no papel e indústria de polpa e outros processos descritos na técnica.

As publicações discutidas aqui são fornecidas somente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui é para ser construído como uma admissão de que a invenção não é intitulada para antecipar tal divulgação por virtude da invenção anterior.

Sumário da Invenção

A invenção fornece um ácido nucléico isolado tendo uma seqüência como apresentada nas SEQ ID N^:1,3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81,83, 85, 87, 89, 91,93, 95, 97, 99, 101,

103,	105,	107,	109,	111,	113,	115,	117,	119, 121,	123,	125,	127,	129,	131,
133,	135,	137,	139,	141,	143,	145,	147,	149, 151,	153,	155,	157,	159,	161,
163,	165,	167,	169,	171,	173,	175,	177,	179, 181,	183,	185,	187,	189,	191,
193,	195,	197,	199,	201,	203,	205,	207,	209, 211,	213,	215,	217,	219,	221,
223,	225,	227,	229,	231,	233,	235,	237,	239, 241,	243,	245,	247,	249,	251,
253,	255,	257,	259,	261,	263,	265,	267,	269, 271,	273,	275,	277,	279,	281,

283, 285, 287, 291,293, 295, 297, 299 e variantes destas tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência para SEQ ID N^: 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51,53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97,

99,	101,	103, 105,	107,	109, 111,	113,	115, 117,	119,	121,	123,	125,	127,
129,	131,	133,	135,	137,	139, 141,	143,	145, 147,	149,	151,	153,	155,	157,
159,	161,	163,	165,	167,	169, 171,	173,	175, 177,	179,	181,	183,	185,	187,
189,	191,	193,	195,	197,	199, 201,	203,	205, 207,	209,	211,	213,	215,	217,
219,	221,	223,	225,	227,	229, 231,	233,	235, 237,	239,	241,	243,	245,	247,
249,	251,	253,	255,	257,	259, 261,	263,	265, 267,	269,	271,	273,	275,	277,

279, 281, 283, 285, 287, 291, 293, 295, 297, 299 e codificando polipeptídeos tendo atividade de alfa amilase.

Um aspecto da invenção é um ácido nucléico isolado tendo uma

seqüência como apresentada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59,

61,63, 6£	i, 67,	69, 7	Ί, 73	75,	77,7	'9, 81	, 83, 85, 8	i7, 89, 91,	93, S	I5, 97	, 99,
101, 103,	105,	107,	109,	111,	113,	115,	117, 119,	121, 123,	125,	127,	129,
131, 133,	135,	137,	139,	141,	143,	145,	147, 149,	151, 153,	155,	157,	159,
161, 163,	165,	167,	169,	171,	173,	175,	177, 179,	181, 183,	185,	187,	189,
191, 193,	195,	197,	199,	201,	203,	205,	207, 209,	211, 213,	215,	217,	219,
221, 223,	225,	227,	229,	231,	233,	235,	237, 239,	241, 243,	245,	247,	249,
251, 253,	255,	257,	259,	261,	263,	265,	267, 269,	271, 273,	275,	277,	279,
281, 283,	285,	287,	291,	, 293	, 295	s 297	299 (a seguir refe	rido ι	como	se-

qüências de ácido nucléico do Grupo A), seqüências substancialmente idênticas a essas, e seqüências complementares a essas.

Outro aspecto da invenção é um ácido nucléico isolado incluindo pelo menos 10 bases consecutivas de uma seqüência apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, seqüências substancialmente idênticas a essas, e as seqüências complementares a essas.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um ácido nucléico isolado codificando um polipeptídeo tendo uma seqüência como apresentada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138,

140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168,

170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198,

202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230,

232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260,

262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290,

292, 294, 296, 298 e variantes destas codificando um polipeptídeo tendo atividade de alfa amilase, e tendo pelo menos 50% de identidade de seqüência para tais seqüências.

Outro aspecto da invenção é um ácido nucléico isolado codificando um polipeptídeo ou um fragmento funcional deste tendo uma seqüên-

cia como apresentada nas SEQ ID N2!: 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104,

106,	108,	110,	112,	114,	116,	118,	120,	122,	124,	126,	128,	130,	132,	134,
136,	138,	140,	142,	144,	146,	148,	150,	152,	154,	156,	158,	160,	162,	164,
166,	168,	170,	172,	174,	176,	178,	180,	182,	184,	186,	188,	190,	192,	194,
196,	198,	202,	204,	206,	208,	210,	212,	214,	216,	218,	220,	222,	224,	226,
228,	230,	232,	234,	236,	238,	240,	242,	244,	246,	248,	250,	252,	254,	256,
258,	260,	262,	264,	266,	268,	270,	272,	274,	276,	278,	280,	282,	284,	286,

288, 290, 292, 294, 296, 298 (a seguir referido como seqüências de aminoácido do Grupo B), e seqüências substancialmente idênticas a estas.

Outro aspecto da invenção é um ácido nucléico isolado codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 10 aminoácidos consecutivos de uma seqüência como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um polipeptídeo purificado tendo uma seqüência como apresentada na seqüência de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas.

Outro aspecto da invenção é um anticorpo purificado ou isolado que especificadamente se aglutina a um polipeptídeo tendo uma seqüência como apresentada nas seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas.

Outro aspecto da invenção é um anticorpo purificado ou isolado ou fragmento de aglutinação deste, que especificadamente se aglutina a um polipeptídeo tendo pelo menos 10 aminoácidos consecutivos de um dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas.

Outro aspecto da invenção é um método para preparar um polipeptídeo tendo uma seqüência como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas. O método inclui introduzir um ácido nucléico codificando o polipeptídeo em uma célula hospedeira, onde o ácido nucléico é operavelmente ligado a um

promotor, e cultivar a célula hospedeira sob condições que permitam a expressão do ácido nucléico.

Outro aspecto da invenção é um método para preparar um polipeptídeo tendo pelo menos 10 aminoácidos de uma seqüência como apre5 sentada nas seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas. O método inclui introduzir um ácido nucléico codificando o polipeptideo em uma célula hospedeira, onde o ácido nucléico é operavelmente ligado a um promotor, e cultivar a célula hospedeira sob condições que permitam a expressão do ácido nucléico, por meio da qual produzindo o polipeptideo.

Outro aspecto da invenção é um método para gerar uma variante incluindo obter um ácido nucléico tendo uma seqüência como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, seqüências substancialmente idênticas a estas, seqüências complementares às seqüências das seqüências do ácido nucléico do Grupo A, fragmentos compreendendo pelo menos 30 nucleotideos consecutivos das seqüências anteriores, e alterar um ou mais nucleotideos na seqüência para outro nucleotídeo, anular um ou mais nucleotideos. na seqüência, ou adicionar um ou mais nucleotídeos à seqüência.

Outro aspecto da invenção é um meio legível por computador tendo armazenado neste uma seqüência como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou uma seqüência de polipeptideo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a es25 tas.

Outro aspecto da invenção é um sistema de computador incluindo um processador e um dispositivo de armazenamento de dados onde o dispositivo de armazenamento de dados tem armazenado nele uma seqüência como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou um polipeptideo tendo uma seqüência como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas.

Outro aspecto da invenção é um método para comparar uma primeira seqüência com uma seqüência de referência onde a primeira seqüência é um ácido nucléico tendo uma seqüência como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou um código de polipeptídeo das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas. O método inclui leitura da primeira seqüência e da seqüência de referência através do uso de um programa de computador que compara as seqüências; e determinar diferenças entre a primeira seqüência e seqüência de referência com o programa de computador.

Outro aspecto da invenção é um método para identificar uma característica em uma seqüência como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou um polipeptídeo tendo uma seqüência como apresentada nas seqüên15 cias de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, incluindo leitura da seqüência através do uso de um programa de computador que identifica características nas seqüências; e identificar as características na seqüência com o programa de computador.

Outro aspecto da invenção é um ensaio para identificar frag20 mentos ou variantes das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, que retêm a função enzimática dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas. O ensaio inclui contatar o polipeptídeo das seqüências de aminoácido do Grupo B, seqüências substancialmente idênticas a estas, ou variante ou fragmento de polipeptídeo com uma molécula de substrato sob condições que permitam a variante ou fragmento de polipeptídeo funcionar, e detectar ou uma diminuição no nível do substrato ou um aumento no nível do produto de reação específico da reação entre o polipeptídeo e substrato por meio da qual identificando um fragmento ou variante de tais seqüências.

A invenção também fornece um processo para preparar uma massa ou um produto cozido preparado da massa que compreende adicio10 nar uma amilase da invenção à massa em uma quantidade que seja eficaz para retardar o envelhecimento do pão. A invenção também fornece uma massa compreendendo a referida amilase e uma pré-mistura compreendendo farinha junto com a referida amilase. Finalmente, a invenção fornece um cozimento enzimático aditivo, que contém a referida amilase.

O uso da amilase de acordo com a presente invenção fornece um efeito antienvelhecimento melhorado quando medido, por exemplo, pela firmeza menor do miolo, elasticidade retida do miolo, capacidade de corte melhorada (por exemplo, menos miolo, miolo não-pastoso), sabor ou aroma agradável.

Breve Descrição dos Desenhos

Os seguintes desenhos são ilustrativos das modalidades da invenção e não são pretendidos limitar o escopo da invenção como abrangido pelas reivindicações.

Figura 1 é um diagrama de bloco de um sistema de computador.

Figura 2 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo para comparar uma nova seqüência de proteína ou nucleotídeo com um banco de dados de sequências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova seqüência e as seqüências na base dos dados.

Figura 3 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo em um computador para determinar se duas seqüências são homólogas.

Figura 4 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo identificador 300 para detectar a presença de uma característica em uma seqüência.

Figura 5 é um gráfico mostrando a atividade residual de várias amilases seguindo aquecimento a 90°C durante 10 minutos no Exemplo 1.

Figura 6 é um gráfico que mostra a percentagem líquida de amido removido versus concentração de enzima em teste de lavagem ADW com alvejantes e quelantes.

Figura 7 é um gráfico mostrando a atividade da amilase de origem em pH 8, 40°C na formulação de ADW em 55°C.

Figura 8 é um gráfico da leitura dos dados da tolerância de H₂O₂ das novas enzimas no Exemplo 4.

Figura 9 é um gráfico dos dados da temperatura e pH para uma seleção das amilases caracterizada. Figura 9a mostra os dados em pH 8 e 40°C e Figura 9b mostra os dados em pH 10 e 50°C.

Figura 10 apresenta as seqüências a serem empregadas em experiências de reagrupamento com as enzimas.

Figura 11 ilustra uma amostra da Curva Padrão do ensaio do

Exemplo 5.

Figura 12 ilustra o perfil da taxa de pH para SEQ ID NO: 127, que tem um pH ótimo neutro e SEQ ID NO: 211, que tem um pH ótimo ao redor de 10.

Figura 13 mostra a estabilidade de Diversas amilases vs. uma enzima comercial, como discutido no Exemplo 2.

Figura 14, mostra o alinhamento da seqüência de a-amilases hipotermofílicas, como apresentado no Exemplo 8. Figura 14a mostra um alinhamento das seqüências de amilase. SEQ ID NO: 81= um clone ambiental; piro = Pyrococcus sp. (cepa: KOD1), Tachibana, Y., Mendez., L., Takagi, M. e Imanaka, T., J. Ferment. Bioeng. 82: 224-232, 1996; piro2= Pyrococcus furiosus, Appl. Environ. Microbiol. 63(9): 3569-3576, 1997; Termo- Thermococcus sp; Termo2= Thermococcus hydrothermalis, Leveque, E e outros, Patente: França 98.05655 05-Maio-1998, não publicada. Figura 14b mostra o alinhamento da seqüência de aminoácido das seqüências identificadas: SEQ ID NO: 81; piro; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; termo2; SEQ ID NO: 79; termo; piro2; clone A; termo 3. Figura 14c mostra o alinhamento da seqüência de ácido nucléico correspondendo à seqüência de polipeptídeo das Figuras 5 e 6. SEQ ID NO: 81; SEQ ID NO: 75.; SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 83; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 79; clone A; e SEQ ID NO: 73.

Figura 15 é uma árvore de ligação próxima para Thermococcales.

Figura 16 é a seqüência da invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção refere-se a amilases e polinucleotídeos codificando-os. Como empregado aqui, o termo amilase abrange enzimas tendo atividade de alfa amilase, por exemplo, alfa amilases capazes de hidrolisar ligações de a-1,4-glucano internas em polissacarídeos, incluindo enzimas de amilase capazes de hidrolisar o amido para açúcares em pHs alcalinos ou em pHs acídicos. Amilases da invenção são particularmente úteis nos processos de moagem a úmido de milho, detergentes, processos de cozimento, bebidas e em campo petrolífero (combustível de etanol). As amilases são também úteis no descolamento de têxteis, processos de fermentação, modificação de amido na indústria de polpa e papel e outros processos descritos na técnica.

Os polinucleotídeos da invenção têm sido identificados como polipeptídeos de codificação tendo atividade de alfa amilase ou alcalina. As amilases alcalinas da invenção podem incluir, porém não estão limitadas a SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 209 e SEQ ID NO: 211.

As alterações nas propriedades que podem ser obtidas nas variantes da invenção são alterações, por exemplo, na especificidade do substrato, aglutinação do substrato, padrão de divagem do substrato, estabilidade térmica , perfil da atividade/pH, perfil da estabilidade/pH [tal como estabilidade aumentada em valores de pH baixos (por exemplo, pH<6, em particular pH<5) ou elevados (por exemplo, pH>9)], estabilidade direcionada à oxidação, dependência de Ca²⁺, atividade específica, e outras propriedades de interesse. Por exemplo, a alteração pode resultar em uma variante que, quando comparada com a amilase de origem, tenha uma dependência de Ca²⁺ reduzida e/ou um perfil de atividade/pH alterado.

A presente invenção refere-se a alfa amilases e polinucleotídeos codificando-os. Como empregado aqui, o termo alfa amilase abrange en-

zimas tendo atividade de alfa amilase, por exemplo, enzimas capazes de hidrolisar o amido para açúcares. Ao contrário de muitas amilases conhecidas, as amilases da invenção podem não ser enzimas dependentes de cálcio.

É altamente desejável ser capaz de diminuir a dependência de Ca2+ de uma alfa amilase. Conseqüentemente, um aspecto da invenção fornece uma enzima de amilase que tem uma dependência de Ca2+ diminuída quando comparada com amilases de origem ou comerciais. A dependência de Ca2+ diminuída em geral terá a conseqüência funcional que a variante exibe uma atividade amilolítica satisfatória na presença de uma concentração mais inferior de íon de cálcio no veículo estrangeiro do que é necessário para uma enzima de origem ou comercial. Ainda freqüentemente terá a conseqüência de que a variante é menos sensível às condições de depleção de íon de cálcio tal como aquelas obtidas nos veículos contendo agentes de complexação de cálcio (tal como certos buiders detergentes).

Liquefação ou liquefazer'¹ significa um processo pelo qual o amido é convertido para dextrinas menos viscosas e de cadeia mais curta. Geralmente, este processo envolve a gelatinização do amido simultaneamente com ou seguido pela adição de alfa amilase. Em processos comerciais, é preferido que o amido granular seja derivado de uma fonte compreendendo milho, trigo, milo, sorgo, arroz ou bulgher. Entretanto, a presente invenção aplica-se a qualquer fonte de amido e grão que seja útil na liquefação, por exemplo qualquer outra fonte vegetal ou grão conhecido por produzir amido adequado para liquefação.

Amido granular ou grânulos de amido significa um componente insolúvel em água de grãos comestíveis que permanecem após a remoção das cascas, fibras, proteínas, gorduras, germe e solúveis através de infusão, craqueamento mecânico, separações, peneiramento, lavagem em contracorrente e etapas de centrifugação típicas do processo de moagem a úmido de grão. O amido granular compreende grânulos de amido intactos contendo, quase exclusivamente, moléculas de amido embaladas (isto é, amilopectina e amilose). No milho, o componente de amido granular com-

preende cerca de 99% de amido; o 1% restante sendo compreendido de proteína, gordura, cinzas, fibra e componentes restantes firmemente associados com os grânulos. A estrutura da embalagem do amido granular gravemente retarda a capacidade da alfa-amilase hidrolisar o amido. A gelatinização do amido é utilizada para separar os grânulos para formar uma solução de amido solúvel e facilitar a hidrólise enzimática.

Solução de Amido significa o amido gelatinizado solúvel em água que resulta do aquecimento do amido granular. Sob aquecimento dos grânulos acima de cerca de 72 graus C, o amido granular separa-se para formar uma mistura aquosa de moléculas de amido soltas. Esta mistura compreendendo, por exemplo, cerca de 75% de amilopectina e 25% de amilose em milhos de dente amarelo, forma uma solução viscosa na água. Em processos comerciais para formar glicose ou frutose, é a solução de amido que é liquefeita para formar uma solução de dextrina solúvel. Alfa amilase significa uma atividade enzimática que cliva ou hidrolísa a ligação alfa glicosídica (1-4), por exemplo, aquela nos polímeros de amido, amilopectina ou amilose. As alfa amilases adequadas são as alfa amilases de ocorrência natural bem como amilases de mutantes ou recombinantes que são úteis na liquefação do amido. As técnicas para produzir amilases variantes tendo atividade em um pH ou temperatura, por exemplo, que seja diferente da amilase do tipo selvagem, são incluídas aqui.

A faixa de temperatura da liquefação é geralmente qualquer temperatura de liquefação que seja conhecida por ser eficaz na liquefação do amido. Preferivelmente, a temperatura do amido é entre cerca de 80 graus C a cerca de 115 graus C, mais preferivelmente de cerca de 100 graus C a cerca de 110 graus C, e mais preferivelmente de cerca de 105 graus C a cerca de 108 graus C.

Em uma modalidade, as seqüências de sinal da invenção são identificadas seguindo a identificação dos novos polipeptídeos de amilase. As passagens pelas quais as proteínas são separadas e transportadas para sua localização celular apropriada são freqüentemente referidas como as passagens de objetivação das proteínas. Um dos elementos mais impor-

tantes em todos esses sistemas de objetivação é uma seqüência de aminoácido curta na terminação de amino de um polipeptídeo recentemente sintetizado chamado de seqüência de sinal. A seqüência de sinal conduz uma proteína para sua localização apropriada na célula e é removida durante o transporte ou quando a proteína alcança seu destino final. A maioria das proteínas secretadas, de membrana ou lisossômicas tem uma seqüência de sinal amino-terminal que a marca para deslocamento no lúmen do retículo endoplásmico. Mais do que 100 seqüências de sinal para proteínas neste grupo têm sido determinadas. As seqüências variam na extensão de 13 a 36 resíduos de aminoácido. Vários métodos para reconhecer as seqüências de sinal são conhecidos por aqueles versados na técnica. Em uma modalidade, os peptídeos são identificados por um método referido como SinalP. SinalP usa uma rede neural combinada que reconhece ambos peptídeos de sinal e seus sítios de divagem. (Nielsen, H., Engelbrecht, J. Brunalk, S., Von Heijne, G., Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering, vol. 10, n°1, p 1-6 (1997), por meio da qual incorporado por referência). Seria entendido que algumas das amilases da invenção possam não ter seqüências de sinal. Pode ser desejável incluir uma seqüência de ácido nucléico codificando uma seqüência de sinal de uma amilase operavelmente ligada a uma seqüência de ácido nucléico de uma amilase diferente ou, opcionalmente, uma seqüência de sinal de uma proteína de não-amilase pode ser desejada. A Tabela 3 mostra seqüências de sinal da invenção.

As frases ácido nucléico ou seqüência de ácido nucléico como empregadas aqui referem-se a um oligonucleotídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo ou a um fragmento de qualquer desses, o DNA ou RNA de origem genômica ou sintética que pode ser de filamento único ou de filamento duplo e pode representar um filamento de sentido ou anti-sentido, a ácido nucléico de peptídeo (PNA), ou a qualquer material tipo DNA ou tipo RNA, natural ou sintético na origem.

Uma seqüência de codificação de ou uma seqüência de nucleotídeo codificando uma proteína ou polipeptídeo particular, é uma se16 qüência de ácido nucléico que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo ou proteína quando colocada sob controle de seqüências reguladoras apropriadas.

O termo gene significa o segmento do DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo; inclui regiões precedendo e seguindo a região de codificação (leitora e trailer) bem como, onde aplicável, intervindo seqüências (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (exons).

Aminoácido ou seqüência de aminoácido como empregado aqui refere-se a uma seqüência de proteína, oligopeptídeo, peptídeo ou polipeptídeo, ou a um fragmento, porção ou subunidade de qualquer desses, e a moléculas sintéticas ou de ocorrência natural.

O termo polipeptídeo como empregado aqui, refere-se a aminoácidos unidos a cada outro por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeos modificados, isto é, isoésteres de peptídeo, e pode conter aminoácidos modificados exceto os 20 aminoácidos codificados por genes. Os polipeptídeos podem ser modificados ou por processos naturais, tal como processo pós-translacional, ou por técnicas de modificação química que são bem-conhecidas na técnica. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar no polipeptídeo, incluindo a cadeia principal do peptídeo, as cadeias laterais do aminoácido e a terminação de amino ou carboxila. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação possa estar presente no mesmo grau ou em graus variados em vários sítios em um determinado polipeptídeo. Além disso, um determinado polipeptídeo pode ter muitos tipos de modificações. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribósilação, amidação, ligação covalente de fiavina, ligação covalente de uma porção dè heme, ligação covalente de um derivado de nucleotídeo ou nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de um fosfitidilinositol, ciclização por reticulação, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulação covalente, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoliação, oxidação, pergilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilaj2e>í ção, racemização, selenoilação, sulfação, e adição mediada por transferência de RNA de aminoácidos para proteínas tal como arginilação (Observe Creighton, T.E., Proteins Structure and Moléculas Properties 2^a Edição. , W. H. Freeman e Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modi5 fication of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)).

Como empregado aqui, o termo isolado significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natural). Por exemplo, um polipeptídeo ou polinucleotídeo de ocorrência natural presente em um animal vivo não é isolado, porém o mesmo polipeptídeo ou polinucleotídeo, separado de alguns ou todos dos materiais co-existentes no sistema natural, é isolado. Tais polinucleotídeos podem ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos podem ser parte de uma composição, e ainda ser isolados pelo fato de que tal vetor ou composição não é parte de seu ambiente natural.

Como empregado aqui, o termo purificado não requer pureza absoluta; mais apropriadamente, é pretendido como uma definição relativa. Os ácidos nucléicos individuais obtidos de uma biblioteca têm sido convencionalmente purificados para homogeneidade eletroforética. As seqüências obtidas desses clones não podem ser obtidas diretamente ou a partir da biblioteca ou a partir do DNA humano total. Os ácidos nucléicos purificados da invenção têm sido purificados a partir do restante do DNA genômico no organismo por pelo menos 104-106 dobras. Entretanto, o termo purificado também inclui ácidos nucléicos que tenham sido purificados a partir do res25 tante do DNA genômico ou de outras seqüências em uma biblioteca ou outros ambientes por pelo menos uma ordem de magnitude, tipicamente duas ou três ordens, e mais tipicamente quatro ou cinco ordens de magnitude.

Como empregado aqui, o termo recombinante significa que o ácido nucléico está adjacente a um ácido nucléico da cadeia principal ao qual ele não está adjacente em seu ambiente natural. Adicionalmente, para ser enriquecido os ácidos nucléicos representarão 5% ou mais dos números de ácido nucléico inserido em uma população de moléculas da cadeia

principal de ácido nucléico. As moléculas da cadeia principal de acordo com a invenção incluem ácidos nucléicos tal como vetores de expressão, ácidos nucléicos de auto-replicação, vírus, ácidos nucléicos de integração, e outros vetores ou ácidos nucléicos empregados para manter ou manipular uma inserção de ácido nucléico de interesse. Tipicamente, os ácidos nucléicos enriquecidos representam 15% ou mais do número de ácidos nucléicos inseridos na população de moléculas da cadeia principal recombinante. Mais tipicamente, os ácidos nucléicos enriquecidos representam 50% ou mais do número de ácidos nucléicos inseridos na população de moléculas da cadeia principal recombinante. Em uma modalidade, os ácidos nucléicos enriquecidos representam 90% ou mais do número de ácidos nucléicos inseridos na população de moléculas da cadeia principal recombinante.

Proteínas ou polipeptídeos recombinantes referem-se a polipeptídeos ou proteínas produzidos por técnicas de DNA recombinante; isto é, produzidos de células transformadas por um constructo de DNA exógeno codificando a proteína ou polipeptídeo desejado. As proteínas ou polipeptídeos sintéticos são aqueles preparados por síntese técnica. Os métodos de síntese de peptídeo químicos de fase sólida podem também ser empregados para sintetizar o polipeptídeo ou fragmentos da invenção. Tal método tem sido conhecido na técnica desde o início de 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154, 1963) (Observe também Stewart, J. M. e Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2^a Edição, Pierce Chemical Co., Rockford, 111, pp 11-12) e tem recentemente sido empregado em kits de síntese e projeto de peptídeo de laboratório comercialmente disponível (Cambridge Research Biochemicals). Tais kits de laboratório comercialmente disponíveis têm geralmente utilizados os ensinamentos de Η. M. Geysen e outros, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81: 3998 (1984) e prover a subsistência de peptídeos de sintetização nas extremidades de uma multidão de hastes ou pinos todos dos quais estão conectados a uma única placa. Quando um tal sistema é utilizado, uma placa de hastes ou pinos é invertida e inserida em uma segunda placa de reservatórios ou cavidades correspondentes, que contêm soluções para ligar ou ancorar um aminoácido apropriado às extremidades dos pinos ou hastes. Repetindo-se uma tal etapa do processo, isto é, invertendo e inserindo as extremidades dos pinos e das hastes em soluções apropriadas, os aminoácidos são construídos em peptídeos desejados. Além disso, o número de sistemas de síntese de peptídeo FMOC estão disponíveis. Por exemplo, a montagem de um polipeptídeo ou fragmento pode ser realizada em um suporte sólido empregando um sintetizador de peptídeo automatizado Applied Biosystems, Inc. Model 431A . Tal equipamento fornece fácil acesso aos peptídeos da invenção, ou por síntese direta ou por síntese de uma série de fragmentos que podem ser acoplados empregando outras técnicas conhecidas.

Uma seqüência promotora é operavelmente ligada a uma seqüência de codificação quando a polimerase de RNA que inicia a transcrição no promotor transcreverá a seqüência de codificação no mRNA.

Plasmídeos são designados por um caso inferior p precedido e/ou seguido por números e/ou letras maiúsculas. Os plasmídeos de partida aqui estão ou comercialmente disponíveis, publicamente disponíveis em uma base não restrita, ou podem ser construídos de plasmídeos disponíveis de acordo com os procedimentos publicados. Além disso, os plasmídeos equivalentes àqueles descritos aqui são conhecidos na técnica e serão aparentes aos técnicos ordinariamente versados.

Digestão de DNA refere-se à clivagem catalítica do DNA com uma enzima de restrição que atua somente em certas seqüências no DNA. As várias enzimas de restrição empregadas aqui são comercialmente disponíveis e suas condições de reação, co-fatores e outros requerimentos foram empregados como seria conhecido pelos ordinariamente versados na técnica. Para propósitos analíticos, tipicamente 1 pg de plasmídeo ou fragmento de DNA é empregado com cerca de 2 unidades de enzima em cerca de 20 pl de solução de tampão. Para o propósito de isolar os fragmentos de DNA para construção de plasmídeo, tipicamente 5 a 50 pg de DNA são digeridos com 20 a 250 unidades de enzima em um volume maior. As quantidades de substrato e tampões apropriadas para enzimas de restrição particulares são especificadas pelo fabricante. Os tempos de incubação de cerca de 1 hora em 37°C são ordinariamente empregados, porém podem variar de acordo com as instruções dos fornecedores. Após a digestão, a eletroforese de gel pode ser realizada para isolar o fragmento desejado.

Oligonucleotídeo refere-se ou a um polideoxinucleotídeo de 5 filamento único ou dois filamentos de polideoxinucleotídeo complementares que podem ser quimicamente sintetizados. Tais oligonucleotídeos sintéticos têm nenhum 5’ fosfato e desse modo não se ligarão a outro oligonucleotídeo sem adicionar um fosfato com um ATP na presença de cinase. Um oligonucleotídeo sintético se ligará a um fragmento que não tenha sido desfosfori10 lado.

A frase substancialmente idêntico no contexto de dois ácidos nucléicos ou polipeptideos, refere-se a duas ou mais seqüências que tenham pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, e em alguns aspectos 90-95% de identidade de resíduo de aminoácido ou nucleotídeo, quando comparado e alinhado para correspondência máxima, quando medido empregando um dos conhecidos algoritmos de comparação da seqüência ou por inspeção visual. Tipicamente, a identidade substancial existe em uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, e mais comumente as seqüências são substancialmente idênticas em pelo menos cerca de 150-200 resíduos. Em al20 gumas modalidades, as seqüências são substancialmente idênticas na extensão total das regiões de codificação.

Adicionalmente uma seqüência de aminoácido substancialmente idêntica é uma seqüência que difere de uma seqüência de referência por uma ou mais substituições, anulações, ou inserções de aminoácidos conservativos ou não-conservativos, particularmente quando uma tal substituição ocorre em um sítio que não é o sítio ativo da molécula, e desde que o polipeptídeo essencialmente retenha suas propriedades funcionais. Uma substituição de aminoácido conservativo, por exemplo, substitui um aminoácido por outro da mesma classe (por exemplo, substituição de um aminoáci30 do hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina, ou metionina, por outro, ou substituição de um aminoácido polar por outro, tal como substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por as-

paragina). Um ou mais aminoácidos podem ser anulados, por exemplo, de um polipeptídeo de alfa amilase, resultando na modificação da estrutura do polipeptídeo, sem significantemente alterar sua atividade biológica. Por exemplo, os aminoácidos amino- ou carboxil-terminais que não são requeridos para atividade biológica de alfa amilase podem ser removidos. As seqüências de polipeptídeo modificadas da invenção podem ser ensaiadas para atividade biológica de alfa amilase por qualquer quantidade de métodos, incluindo contatar a seqüência de polipeptídeo modificada com um substrato de alfa amilase e determinar se o polipeptídeo modificado diminui a quantidade de substrato específico no ensaio ou aumenta os bioprodutos da reação enzimática de um polipeptídeo de alfa amilase funcional com o substrato.

Fragmentos como empregado aqui são uma porção de uma proteína de ocorrência natural que podem existir em pelo menos duas conformações diferentes. Os fragmentos podem ter a mesma ou substancialmente a mesma seqüência de aminoácido como a proteína de ocorrência natural. Substancialmente a mesma significa que uma seqüência de aminoácido é amplamente, porém não totalmente, a mesma, porém retém pelo menos uma atividade funcional da seqüência a qual está relacionada. Em geral duas seqüências de aminoácidos são substancialmente as mesmas ou substancialmente homólogas se elas são pelo menos cerca de 85% idênticas. Os fragmentos que têm estruturas tridimensionais diferentes, como a proteína de ocorrência natural, são também incluídos. Um exemplo deste, é uma molécula pró-forma, tal como uma pró-proteína de atividade baixa que pode ser modificada por divagem para produzir uma enzima madura com atividade significantemente mais elevada.

Hibridização refere-se ao processo pelo qual um filamento de ácido nucléico se une com um filamento complementar através do empareIhamento da base. As reações de hibridização podem ser sensíveis ê seletivas a fim de que uma seqüência particular de interesse possa ser identificada mesmo em amostras nas quais está presente em concentrações baixas. As condições adequadamente precisas podem ser definidas, por exemplo,

pelas concentrações de sal e formamida nas soluções de pré-hibridização e hibridização, ou pela temperatura de hibridização, e são bem-conhecidas na técnica. Em particular, a exatidão pode ser aumentada reduzindo-se a concentração de sal, aumentando-se a concentração de formamida, ou au5 mentando-se a temperatura de hibridização.

Por exemplo, a hibridização sob condições de exatidão elevada pode ocorrer em cerca de 50% de formamida em cerca de 37°C a 42°C. A hibridização pode ocorrer sob condições de exatidão reduzida em cerca de 35% a 25% de formamida em cerca de 30°C a 35°C. Em particular, a hibri10 dização pode ocorrer sob condições de exatidão elevada em 42°C em 50% de formamida, 5 X de SSPE, 0,3% de SDS, e 200 n/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado. A hibridização pode ocorrer sob condições de exatidão reduzida como descrito acima, porém em 35% de formamida em uma temperatura reduzida de 35°C. A faixa da temperatura corres15 pondendo a um nível particular de exatidão pode ser ainda reduzida calculando-se a relação da purina para pirimidina do ácido nucléico de interesse e ajustando-se a temperatura conseqüentemente. As variações nas faixas e condições acima são bem-conhecidas na técnica.

O termo variantes refere-se a polinucleotídeos ou polipeptí20 deos da invenção modificados em um ou mais resíduos de, pares de base, códons, íntrons, exons ou aminoácidos (respectivamente) também ainda retendo a atividade biológica de uma alfa amilase da invenção. As variantes podem ser produzidas por qualquer de vários meios, incluindo métodos tal como, por exemplo, PCR propenso a erro, mistura, mutagênesé direcionada ao oligonucleotídeo, montagem de PCR, mutagênese PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese cassete, mutagênese de conjunto recursivo, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese de sítio específico, reagrupamento de gene, GSSM e qualquer combinação destes. As técnicas para produzir amilase variante tendo atividade em um pH ou temperatura, por exemplo que seja diferente da amilase do tipo selvagem, são incluídas aqui.

As enzimas são catalisadores altamente seletivos. Sua legitimidade é a capacidade de catalisar as reações com estereo-, regio- e quimio23 seletividades excelentes que são não emparelhadas na química sintética convencional. Entretanto, as enzimas são notavelmente versáteis. Elas podem ser feitas para funcionar em solventes orgânicos, operar em pHs extremos (por exemplo, pHs elevados e pHs baixos), temperaturas extremas (por exemplo, temperaturas elevadas e temperaturas baixas), níveis de salinidade extremos (por exemplo, salinidade elevada e salinidade baixa), e catalisar reações com compostos que são estruturalmente não relacionados com seus substratos fisiológicos, naturais.

As enzimas são reativas com respeito a uma ampla faixa de 10 substratos naturais e não naturais, desse modo possibilitando a modificação de virtualmente qualquer composto de indução orgânico. Entretanto, as enzimas, catatisadores químicos tradicionais desiguais são altamente enantio-, e regiosseletivos. O grau elevado da especificidade do grupo funcional exibido pelas enzimas permite que alguém mantenha o registro de cada reação em uma sequência sintética induzindo a um novo composto ativo. As enzimas são também capazes de catalisar muitas reações diversas não relacionadas com sua função fisiológica in nature. Por exemplo, as peroxidases catalisam a oxidação dos.fenóis por peróxido de hidrogênio. As peroxidases podem também catalisar as reações de hidroxilação que não são relaciona20 das com a função nativa da enzima. Outros exemplos são proteases que catalisam a decomposição dos polipeptídeos. Na solução orgânica algumas proteases podem também acilar açúcares, uma função não relacionada com a função nativa dessas enzimas.

Em um aspecto, a invenção inclui um método para liquefazer uma composição contendo amido compreendendo contatar o amido com um polipeptídeo da invenção (por exemplo, um polipeptídeo purificado selecionado de polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em: seqüências de aminoácido do Grupo B, variantes tendo pelo menos cerca de 50% de homologia a pelo menos uma das seqüências de aminoácido do Grupo B, em uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, como determinado pela análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual; seqüências complementares a qualquer uma das seqüências de aminoácido do Grupo B; e seqüências complementares a variantes tendo pelo menos cerca de 50% de homologia a qualquer uma das seqüências de aminoácido do Grupo B em uma região de pelo menos cerca de 100 resíduos, como determinado pela análise com um algoritmo de comparação de seqüência ou por inspeção visual; e polipeptídeos tendo pelo menos 10 aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo tendo uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em seqüências de aminoácido do Grupo B). Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo é apresentado nas seqüências de aminoácido do Grupo Β. O amido pode ser de um material selecionado de arroz, arroz germinado, milho, cevada, trigo, legumes e batata doce. O xarope de glicose produzido pelo método da invenção é incluído aqui. Um tai xarope pode ser um xarope de maltose, um xarope de glicose, ou uma combinação destes. Em particular, o xarope produzido empregando a amilase da invenção tem um nível mais elevado de fração de DP2 e um nível mais elevado de DP3 (maltotriose e/ou panose) e menos do que os fragmentos DP7 maiores quando comparados com os xaropes produzidos pelas enzimas comerciais. Isto consiste com o perfil de liquefação uma vez que a minoria dos fragmentos amplos estão nos xaropes liquefeitos da invenção.

A invenção também fornece um método para remover amido contendo manchas de um material compreendendo contatar o material com um polipeptideo da invenção. Em um aspecto, a invenção fornece um método para lavar um objeto compreendendo contatar o objeto com um polipeptídeo da invenção sob condições suficientes para lavagem. Um polipeptídeo da invenção pode ser incluído como um aditivo de detergente por exemplo. A invenção também inclui um método para descolar têxteis compreendendo contatar o têxtil com um polipeptideo da invenção sob condições suficientes para descolar.

A invenção também fornece um método para reduzir o envelhecimento de produtos cozidos compreendendo a adição de um polipeptideo da invenção ao produto cozido, antes do cozimento.

A invenção também fornece um método para o tratamento de

fibras lignocelulósicas, onde as fibras são tratadas com um polipeptídeo da invenção, em uma quantidade que seja eficiente para melhorar as propriedades das fibras. A invenção inclui um descolorante enzimático de polpa de papel reciclado, onde o polipeptídeo é aplicado em uma quantidade que seja eficiente para o descoloramento eficaz da superfície da fibra.

Qualquer dos métodos descritos aqui inclui a possibilidade da adição de uma segunda alfa amilase ou uma beta amilase ou uma combinação destas. As amilases comerciais ou outras enzimas adequadas para uso em combinação com uma enzima da invenção são conhecidas por aqueles versados na técnica.

A invenção também inclui um método para aumentar o fluxo da produção de fluidos de uma formação subterrânea removendo-se o fluido prejudicial, contendo amido, viscoso formado durante operações de produção e encontrado na formação subterrânea que envolve uma cavidade completa perfurada compreendendo permitir a produção de fluido fluir da cavidade perfurada; reduzir o fluxo de produção dos fluidos da formação abaixo das taxas de fluxo esperadas; formular um tratamento de enzima misturando-se junto um fluido aquoso e um polipeptídeo da invenção; bombeando-se o tratamento de enzima para um local desejado na cavidade perfurada; permitindo a enzima o tratamento para degradar o fluido prejudicial contendo amido, viscoso, por meio do qual o fluido pode ser removido da formação subterrânea para a superfície da cavidade; e onde o tratamento de enzima é eficaz para atacar as ligações alfa glicosídicas no fluido contendo amido.

A presente invenção explora as únicas propriedades catalíticas das enzimas. Ao mesmo tempo em que o uso de biocatalisadores (isto é, enzimas brutas ou purificadas, células vivas ou não-vivas) em transformações químicas normalmente requer a identificação de um biocatalisador particular que reage com um composto de partida específico, a presente invenção emprega biocatalisadores selecionados e condições de reação que são específicos para grupos funcionais que estão presentes em muitos compostos de partida.

Cada biocatalisador é específico para um grupo funcional, ou

vários grupos funcionais relacionados, e pode reagir com muitos compostos de partida contendo este grupo funcional.

As reações biocatalíticas produzem uma população de derivados de um único composto de partida. Esses derivados podem ser submeti5 dos a outra rodada de reações biocatalíticas para produzir uma segunda população de compostos derivados. Mil das variações do composto original pode ser produzido com cada iteração de derivatização biocatalítica.

As enzimas reagem em sítios específicos de um composto de partida sem afetar o restante da molécula, um processo que é muito difícil de obter empregando-se métodos químicos tradicionais. Este grau elevado de especificidade biocatalítica fornece os meios para identificar um único composto ativo na biblioteca. A biblioteca é caracterizada pelas séries de reações biocatalíticas empregadas para produzir, uma então chamada história biossintética. A avaliação da biblioteca quanto às atividades biológi15 cas e traçado da história biossintética identifica a seqüência de reação específica produzindo o composto ativo. A seqüência de reação é repetida e a estrutura do composto sintetizado é determinada. Este modo de identificação, diferente de outras sínteses de métodos de avaliação, não requer tecnologias de imobilização, e compostos podem ser sintetizados e testados livres na solução empregando virtualmente qualquer tipo de ensaio de avaliação. É importante observar, que o grau elevado de especificidade de reações de enzima nos grupos funcionais considera o traçado das reações enzimáticas específicas que compõe a biblioteca biocataliticamente produzida.

Existem muitas vantagens na avaliação de bibliotecas de lambda fago para descobertas com base na expressão de amilase. Essas incluem detecção melhorada dos clones tóxicos; acesso melhorado aos substratos; necessidade reduzida de projetar um hospedeiro; passagem secundária do potencial para qualquer inclinação resultante da excisão da massa da biblioteca; e desenvolvimento mais rápido das densidades baixas do clone. Adicionalmente, existem vantagens na avaliação de bibliotecas de lambda fago ha fase líquida sobre a fase sólida. Essas incluem: maior flexi-

bilidade nas condições de ensaio; flexibilidade do substrato adicional; sensibilidade mais elevada para clones fracos; e facilidade de automação.

Muitas das etapas do procedimento são realizadas empregando automação robótica possibilitando a execução de milhares de reações biocatalíticas e ensaios de avaliação por dia bem como garantindo um nível elevado de exatidão e reproducibilidade. Como um resultado, uma biblioteca de compostos derivados pode ser produzida em uma questão de semanas o que levaria anos para produzir empregando métodos químicos correntes. (Para outros ensinamentos na modificação de moléculas, incluindo pequenas moléculas, observe PCT/US94/09174, aqui incorporada por referência em sua totalidade).

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método nãoestocástico chamado reagrupamento de gene sintético, que é algumas vezes relacionado com a mistura estocástica, evita que os blocos de construções de ácido nucléico não sejam misturados ou concatenados ou quimierizados aleatoriamente, porém são preferivelmente montados não-estocasticamente.

O método de reagrupamento de gene sintético não depende da presença de um nível elevado de homologia entre os polinucleotídeos a serem misturados. A invenção pode ser empregada para não-estocasticamente gerar bibliotecas (ou grupos) de moléculas descendentes compreendidas de 1O¹⁰⁰ quimeras diferentes. De modo concebível, o reagrupamento de gene sintético pode ainda ser empregado para gerar bibliotecas compreendidas de 1O¹⁰⁰⁰ quimeras descendentes diferentes. Desse modo, em um aspecto, a invenção fornece um método não-estocástico para produzir um grupo de moléculas de ácido nucléico quiméricas finalizadas tendo uma montagem total a fim de que seja escolhida pelo desenho, cujo método é compreendido das etapas de gerar pelo desenho uma pluralidade de blocos de construção de ácido nucléico específico tendo extremidades ligáveis mutuamente compatíveis úteis, e montagem desses blocos de construção de ácido nucléico, tal que a ordem de montagem total desenhada seja obtida.

As extremidades ligáveis mutualmente compatíveis dos blocos de construção de ácido nucléico a serem montadas são consideradas serem úteis por este tipo de montagem ordenada se elas permitem que os blocos de construção sejam acoplados em ordens predeterminadas. Desse modo, em um aspecto, a ordem da montagem geral na qual os blocos de construção de ácido nucléico podem ser acoplados é especificada pelo desenho das extremidades ligáveis e, se mais do que uma etapa de montagem é para ser empregada, então a ordem da montagem total na qual os blocos de construção de ácido nucléico podem ser acoplados é também especificada pela ordem seqüencial das etapas da montagem. Em uma modalidade da invenção, os pedaços de construção recozidos são tratados com uma enzima, tal como uma ligase (por exemplo, ligase de DNA T4) para obter ligação covalente dos pedaços da construção.

Em uma outra modalidade, o desenho dos blocos de construção do ácido nucléico é obtido sob análise das seqüêncías de um grupo de modelos de ácido nucléico progenitor que serve como uma base para produzir um grupo de progênie de moléculas de ácido nucléico quimérico finalizadas. Esses modelos de ácido nucléico progenitor desse modo servem como uma fonte de informação de seqüência que auxilia no desenho dos blocos de construção de ácido nucléico que são para ser mutagenizados, por exemplo, quimerizados ou misturados.

Em uma exemplificação, a invenção provê a subsistência da quimerização de uma família de genes relacionados e sua família codificada de produtos relacionados. Em uma exemplificação particular, os produtos codificados são enzimas. As amilases da presente invenção, por exemplo, alfa amilases ou amilases alcalinas, podem ser mutagenizadas de acordo com os métodos descritos aqui.

Desse modo, de acordo com um aspecto da invenção, as seqüências de uma pluralidade de modelos de ácido nucléico progenitor (por exemplo, polinucleotídeos das seqüêncías de ácido nucléico do Grupo A) são alinhadas a fim de selecionar um ou mais pontos de demarcação, cujos pontos de demarcação podem ser localizados em uma área de homologia.

Os pontos de demarcação podem ser empregados para delinear os limites dos blocos de construção de ácido nucléico a serem gerados. Desse modo, os pontos de demarcação identificados e selecionados nas moléculas progenitoras servem como pontos de quimerização potencial na montagem das moléculas progênies.

Tipicamente um ponto de demarcação útil está na área de homologia (compreendida de pelo menos uma base de nucleotídeo homóloga) dividida por pelo menos dois modelos progenitores, porém o ponto de demarcação pode ser uma área de homologia que é dividida por pelo menos metade dos modelos progenitores, pelo menos dois terços dos modelos progenitores, pelo menos três quartos dos modelos progenitores, e preferivelmente em quase todos dos modelos progenitores. Ainda mais preferivelmente um outro ponto de demarcação útil é uma área de homologia que é dividida por todos os modelos progenitores.

Em uma modalidade, o processo de reagrupamento do gene é realizado exaustivamente a fim de gerar uma biblioteca exaustiva. Em outras palavras, todas combinações possíveis ordenadas dos blocos de construção de ácido nucléico são representadas no grupo de moléculas de ácido nucléico quimérico finalizadas. Ao mesmo tempo, a ordem da montagem (isto é, a ordem da montagem de cada bloco de construção na seqüência 5' a 3 de cada ácido nucléico quimérico finalizado) em cada combinação é pelo desenho (ou não-estocástica). Por causa da natureza não-estocástica do método, a possibilidade de produtos laterais não desejados é geralmente reduzida.

Em outra modalidade, o método provê que o processo de reagrupamento de gene seja realizado sistematicamente, por exemplo, para gerar uma biblioteca sistematicamente compartimentalizada, com compartimentos que podem ser avaliados sistematicamente, por exemplo, um por um. Em outras palavras a invenção provê que, através do uso criterioso e seletivo de blocos de construção de ácido nucléico específicos, acoplada com o uso criterioso e seletivo de reações de montagem seqüencialmente graduadas, um desenho experimental pode ser obtido onde os grupos espe-

cíficos de produtos progênies são feitos em cada dos vários recipientes de reação. Isto permite que um exame sistemático e procedimento de avaliação sejam realizados. Desse modo, permite que uma quantidade potencial mente muito maior de moléculas progênies seja examinada sistematicamente em grupos menores.

Por causa de sua capacidade de realizar quimerizações de uma maneira que é altamente flexível ainda mais exaustiva e sistemática também, particularmente quando há um nível baixo de homologia entre as moléculas progenitoras, a presente invenção provê a subsistência da geração de uma biblioteca (ou grupo) compreendida de uma grande quantidade de moléculas progênies. Por causa da natureza não-estocástica do reagrupamento de gene da presente invenção, as moléculas progênies geradas preferivelmente compreendem uma biblioteca de moléculas de ácido nucléico quimérico finalizado tendo uma ordem de montagem total que é escolhida pelo desenho. Em uma modalidade particular, uma tal biblioteca gerada é compreendida de mais do que 103 a mais do que 101000 espécies de moléculas de progênies diferentes.

Em um aspecto, um grupo de moléculas de ácido nucléico quimérico finalizado, produzido como descrito é compreendido de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo. De acordo com uma modalidade, este polinucleotídeo é um gene, que pode ser um gene feito pelo homem. De acordo com outra modalidade, este polinucleotídeo é uma passagem de gene, que pode ser uma passagem de gene feita pelo homem. A invenção provê que um ou mais genes feitos pelo homem gerados pela invenção possam ser incorporados em uma passagem de gene feita pelo homem, tal como passagem operável em um organismo eucariótico (incluindo uma planta).

Em outra exemplificação, a natureza sintética da etapa na qual os blocos de construção são gerados permite que o desenho e introdução dos nucleotídeos (por exemplo, um ou mais nucleotídeos, que podem ser, por exemplo, códon ou íntrons ou seqüências reguladoras) possam posteriormente ser opcionalmente removidos em um processo in vitro (por exem31 é'/<

pio, por mutagênese) ou em um processo in vivo (por exemplo, utilizando-se a capacidade de união do gene de um organismo hospedeiro). É apreciado que em muitos exemplos a introdução desses nucleotídeos pode também ser desejada por muitas outras razões além do benefício potencial de criar um ponto de demarcação útil.

Desse modo, de acordo com outra modalidade, a invenção fornece um bloco de construção de ácido nucléico que pode ser empregado para introduzir um íntron. Desse modo, a invenção fornece íntrons funcionais que podem ser introduzidos em um gene feito pelo homem da inven10 ção. A invenção também fornece íntrons funcionais que podem sér introduzidos em uma passagem de gene feito pelo homem da invenção. Conseqüentemente, a invenção provê a subsistência da geração de um polinucleotídeo quimérico que é um gene feito pelo homem contendo um (ou mais) íntrons artificialmente introduzidos.

Conseqüentemente, a invenção também provê a subsistência da geração de um polinucleotídeo quimérico que é uma passagem de gene feito pelo homem contendo um (ou mais) íntron artificialmente introduzido. Preferivelmente, os íntrons artificialmente introduzidos são funcionais em uma ou mais células hospedeiras para a maioria da união de gene de modo que os íntrons de ocorrência natural sirvam funcionalmente na união do gene. A invenção fornece um processo para produzir polinucleotídeos contendo íntrons feitos pelo homem a serem introduzidos em organismos hospedeiros para a recombinação e/ou união.

Um gene feito pelo homem produzido empregando a invenção pode também servir como um substrato para a recombinação com outro ácido nucléico. De outro modo, uma passagem de gene feito pelo homem produzida empregando a invenção pode também servir como um substrato para recombinação com outro ácido nucléico. Em um exemplo preferido, a recombinação é facilitada por, ou ocorre em, áreas de homologia entre o gene contendo o íntron feito pelo homem e um ácido nucléico, que serve como um par recombinante. Em um exemplo particularmente preferido, o par recombinante pode também ser um ácido nucléico gerado pela invenção, in-

cluindo um gene feito pelo homem ou uma passagem do gene feito pelo homem. A recombinação pode ser facilitada por ou pode ocorrer em áreas de homologia que existem em um (ou mais) íntron artificialmente introduzido no gene feito pelo homem.

O método de reagrupamento de gene sintético da invenção utiliza uma pluralidade de blocos de construção de ácido nucléico, cada dos quais preferivelmente tem duas extremidades ligáveis. As duas extremidades ligáveis em cada bloco de construção de ácido nucléico podem ser duas extremidades ásperas (isto é, cada tendo uma projeção de zero nucleotí10 deo), ou preferivelmente uma extremidade áspera e uma projeção, ou mais preferivelmente ainda duas projeções.

Uma projeção útil para este propósito pode ser uma projeção 3’ ou uma projeção 5’. Desse modo, um bloco de construção de ácido nucléico pode ter projeção 3' ou alternativamente uma projeção 5' ou alternativa15 mente duas projeções 3' ou alternativamente duas projeções 5'. A ordem total na qual os blocos de construção de ácido nucléico são montados para formar uma molécula de ácido nucléico quimérica finalizada é determinada pelo desenho experimental significativo e não é aleatório.

De acordo com uma modalidade preferida, um bloco de constru20 ção de ácido nucléico é gerado por síntese química de dois ácidos nucléicos de filamento único (também referido como oligos de filamento único) e contatando-os a fim de que os permita recozer para formar um bloco de construção de ácido nucléico de filamento duplo.

Um bloco de construção de ácido nucléico de filamento duplo pode ser de tamanho variável. Os tamanhos desses blocos de construção podem ser pequenos ou grandes. Os tamanhos preferidos de blocos de construção variam de um par de base (não incluindo qualquer projeção) a 100.000 pares de base (não incluindo qualquer projeção). Outras faixas de tamanhos preferidas são também fornecidas, as quais têm limites inferiores de 1 pb a 10.000 bp (incluindo todos os valores de números inteiros envolvidos), e limites superiores de 2 bp a 100.000 bp (incluindo todo o valor de número inteiro envolvido).

Muitos métodos existem pelos quais um bloco de construção de ácido nucléico de filamento duplo pode ser gerado, o qual é útil para a invenção; e esses são conhecidos na técnica e podem ser facilmente realizados por aqueles versados na técnica.

De acordo com uma modalidade, um bloco de construção de ácido nucléico de filamento duplo é gerado primeiro gerando-se dois ácidos nucléicos de filamento único e permitindo-os recozer para formar um bloco de construção de ácido nucléico de filamento duplo. Os dois filamentos de um bloco de construção de ácido nucléico de filamento duplo podem ser complementares em todo o nucleotídeo não considerando qualquer que forme uma projeção; desse modo não contendo nenhuma má combinação, não considerando qualquer projeção. De acordo com outra modalidade, os dois filamentos de um bloco de construção de ácido nucléico de filamento duplo são complementares em menos do que todos os nucleotídeos não considerando qualquer que forme uma projeção. Desse modo, de acordo com esta modalidade, um bloco de construção de ácido nucléico de filamento duplo pode ser empregado para introduzir degeneração de códon. Preferivelmente a degeneração de códon é introduzida empregando a mutagênese de saturação de sítio descrita aqui, empregando um ou mais cassetes N, N, G/T ou alternativamente empregando um ou mais cassetes N, N, N.

O método de recombinação in vivo da invenção pode ser realizado cegamente em um grupo de alelos ou híbridos desconhecidos de uma seqüência ou polinucleotídeo específico. Entretanto, não é necessário conhecer a seqüência de DNA ou RNA atual do polinucleotídeo específico.

O método para usar recombinação em uma população misturada de genes pode se útil para a geração de qualquer proteína, por exemplo, interleucina 1, anticorpos, tPA e hormônios do crescimento. Este método pode ser empregado para gerar proteínas tendo a atividade ou especificidade alterada. O método pode também ser útil para a geração de seqüências híbridas de ácido nucléico, por exemplo, regiões promotoras, íntrons, exons, seqüências realçadoras, 31 regiões não traduzidas ou 51 regiões nâo tra-

duzidas de genes. Desse modo este método pode ser empregado para gerar genes tendo taxas aumentadas de expressão. Este método pode também ser útil no estudo das seqüências de DNA repetitivas. Finalmente, este método pode ser útil para mudar ribozimas ou aptâmeros.

Em um aspecto, a invenção descrita aqui está direcionada ao uso de ciclos repetidos de reagrupamento redutivo, recombinação e seleção que considera a evolução molecular direcionada de seqüências lineares altamente complexas, tal como recombinação completa de proteínas, DNA ou RNA.

A mistura in vivo de moléculas é útil no fornecimento de variantes e pode ser realizada utilizando a propriedade natural de células para recombinar multímeros. Ao mesmo tempo em que a recombinação in vivo tem fornecido a rotina natural principal para diversidade molecular, a recombinação genética permanece um processo relativamente complexo que envolve (1) o reconhecimento de homologias; (2) divagem de filamentos, invasão de filamento, e etapas metabólicas induzindo à produção de quiasmas recombinantes; e finalmente (3) a resolução de quiasmas em moléculas recombinadas discretas. A formação do quiasma requer o reconhecimento das seqüências homólogas.

Em outra modalidade, a invenção inclui um método para produzir um polinucleotídeo híbrido de pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo. A invenção pode ser empregada para produzir um polinucleotídeo híbrido introduzindo-se pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo que divide pelo menos uma região da homologia de seqüência parcial em uma célula hospedeira adequada. As regiões da homologia de seqüência parcial promovem processos que resultam na reorganização da seqüência produzindo um polinucleotídeo híbrido. O termo polinucleotídeo híbrido, como empregado aqui, é qualquer seqüência de nucleotídeo que resulta do método da presente invenção e contém seqüência de pelo menos duas seqüências de polinucleotídeo original. Tais polinucleotídeos híbridos podem resultar de eventos de recombinação intermolecular que promovem a integração da seqüência entre as

moléculas de DNA. Além disso, tais polinucleotideos híbridos podem resultar de processos de reagrupamento redutivo intramolecular que utiliza seqüências repetidas para alterar uma seqüência de nucleotídeo em uma molécula de DNA.

A invenção fornece um meio para gerar polinucleotideos híbridos que podem codificar polipeptideos híbridos biologicamente ativos (por exemplo, alfa amilase híbrida). Em um aspecto, os polinucleotideos originais codificam polipeptideos biologicamente ativos. O método da invenção produz novos polipeptideos híbridos utilizando-se processos celulares que in10 tegram a seqüência dos polinucleotideos originais tal que o polinucleotideo híbrido resultante codifique um polipeptídeo demonstrando atividades derivadas dos polipeptideos biologicamente ativos originais. Por exemplo, os polinucleotideos originais podem codificar uma enzima particular de diferentes microorganismos. Uma enzima codificada por um primeiro polinucle15 otídeo de um organismo ou variante pode, por exemplo, funcionar eficazmente sob uma condição ambiental particular, por exemplo, salinidade elevada. Uma enzima codificada por um segundo polinucleotideo de um diferente organismo ou variante pode funcionar eficazmente sob uma condição ambiental diferente, tal como temperaturas extremamente elevadas. Uma seqüência contendo polinucleotideo híbrido dos primeiro e segundo polinucleotídeos originais pode codificar uma enzima que exibe características de ambas enzimas codificadas pelos polinucleotideos originais. Desse modo, a enzima codificada pelo polinucleotideo híbrido pode funcionar eficazmente sob condições ambientais divididas por cada das enzimas codificadas pelo primeiro e segundo polinucleotideos, por exemplo, salinidade elevada e temperaturas extremas.

As enzimas codificadas pelos polinucleotideos da invenção incluem, porém não estão limitadas a, hidrolases, tal como alfa amilases e amilases alcalinas. Um polipeptídeo híbrido resultando do método da inven30 ção pode exibir atividade de enzima especializada não divulgada nas enzimas originais. Por exemplo seguinte a recombinação e/ou reagrupamento redutivo de polinucleotideos codificando atividades de hidrolase, o poli36 peptídeo híbrido resultante codificado por um polinucleotídeo híbrido pode ser avaliado quanto à atividade de hidrolase especializada obtida de cada das enzimas originais, isto é, o tipo de ligação na qual a hidrolase atua e a temperatura na qual a hidrolase funciona. Desse modo, por exemplo, a hi5 drolase pode ser avaliada para determinar aquelas funcionalidades químicas que distinguem a hidrolase híbrida das hidrolases originais, tal como (a) amida (ligações de peptídeo), isto é proteases; (b) ligação de éster; isto é amilases e lipases; (c) acetais; isto é, glicosidase e, por exemplo, a temperatura, pH ou concentração de sal nos quais o polipeptideo híbrido funciona.

As fontes dos polinucleotídeos originais podem ser isoladas de organismos individuais (isolados), coleções de organismos que tenham sido desenvolvidos em veículos definidos (enriquecimento de cultura), ou, organismos não cultivados (amostras ambientais). O uso de um método independente de cultura para obter polinucleotídeos codificando novas bio15 atividades das amostras ambientais é mais preferível uma vez que permite que alguém acesse os recursos armazenados da biodiversidade.

Bibliotecas ambientais são geradas de amostras ambientais e representam os genomas coletivos de organismos de ocorrência natural arquivados nos vetores de clonagem que podem ser propagados em hospe20 deiros procarióticos adequados. Por causa do DNA clonado ser inieialmente extraído diretamente das amostras ambientais, as bibliotecas não são limitadas a pequenas frações de procariotas que podem ser desenvolvidos na cultura pura. Adicionalmente, uma normalização do DNA ambiental presente nessas amostras pode permitir representação mais igual do DNA de todas as espécies presentes na amostra original. Isto pode dramaticamente aumentar a eficiência dos genes de interesse da descoberta de constituintes menores da amostra que pode ser sub-representada por várias ordens de magnitude comparada as espécies dominantes.

Por exemplo, as bibliotecas de gene geradas a partir dê um ou mais microorganismos não cultivados são avaliadas quanto a uma atividade de interesse. As passagens potenciais codificando as moléculas bioativas de interesse são primeiro capturadas nas células procarióticas na forma de

bibliotecas de expressão de gene. Os polinucleotídeos codificando as atividades de interesse são isolados de tais bibliotecas e introduzidos em uma célula hospedeira. A célula hospedeira é desenvolvida sob condições que promovem a recombinação e/ou reagrupamento redutivo criando biomoléculas potencialmente ativas com atividades novas ou realçadas.

Os microorganismos dos quais o polinucleotídeo pode ser preparado incluem microorganismos procarióticos, tal como Eubactería e Archaebacteria, e microorganismos eucarióticos inferiores tal como fungos, algumas algas e protozoários. Os polinucleotídeos podem ser isolados de amostras ambientais, caso no qual o ácido nucléico pode ser recuperado sem cultivo de um organismo ou recuperado de um ou mais organismos cultivados. Em um aspecto, tais microorganismos podem ser extremófilos, tal como hipertermófilos, psicrófilos, psicrotrófis, halófilos, barófilos e acidófilos. Os polinucleotídeos codificando enzimas isoladas de microorganismos extremofílicos são particularmente preferidos. Tais enzimas podem funcionar em temperaturas acima de 100°C em fontes de água quente terrestre e ventos térmicos do mar profundo, em temperaturas abaixo de 0°C em águas árticas, no ambiente de sal saturado do Mar Morto, em valores de pH próximos a 0, em depósitos de carvão e origens ricas em enxofre geotérmicas, ou em valores de pH maiores do que 11 em sedimento de esgoto. Por exemplo, várias amilases e lipases clonadas e expressadas de organismos extremofílicos mostram atividade elevada por toda uma ampla faixa de temperaturas e pHs.

Das novas enzimas da presente invenção, muitas foram purificadas e caracterizadas em pH 8, em ambos 40°C e 50°C, e pH 10 em ambos 40°C e 50°C. Das enzimas constatadas serem purificadas e caracterizadas em pH 8 e 40°C, observado ter três vezes (628 U/mg) a atividade específica de uma enzima B. lichenoformis (228 U/mg). Adicionalmente, outra enzima foi observada ter aproximadamente a atividade equivalente (250 U/mg) à enzima B. lichenoformis. Em um pH 10 e 50°C, uma das enzimas tem uma atividade específica de 31 U/mg e outra tem uma atividade específica de 27,5 U/mg, ao mesmo tempo em que B. lichenoformis tem uma ativi38 dade específica de 27 U/mg.

Os polinucleotídeos selecionados e isolados como descrito acima são introduzidos em uma célula hospedeira adequada. Uma célula hospedeira adequada é qualquer célula que é capaz de promover a recombinação e/ou reagrupamento redutivo. Os polinucleotídeos selecionados estão preferivelmente ainda em um vetor que inclui seqüências de controle apropriadas. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica mais elevada, tal como uma célula de mamífero, ou uma célula eucariótica inferior, tal como célula de levedura, ou preferivelmente, a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução do constructo na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrano, ou eletroporação (Davis e outros, 1986).

Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, podem ser mencionados: células bacterianas, tal como, E. coli, streptomyces, Salmonella typhimurium; células fungais, tal como levedura; células de insetos tal como Drosofila S2 e Spodoptera Sf9; células de animais tal como CHO, COS, ou melanoma de intestinos; adenovírus; e células de planta. A seleção de um hospedeiro apropriado é considerada estar no escopo daqueles versados na técnica dos ensinamentos desta.

Com referências particulares aos vários sistemas de cultura de célula de mamífero que podem ser empregados para expressar a proteína recombinante, os exemplos de sistemas de expressão de mamífero incluem linhagens COS-7 de fibroblastos do rim do macaco, descrito em SV40transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants (Gluzman, 1981), e outras linhagens de células capazes de expressar um vetor compatível, por exemplo, as linhagens de células C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. Os vetores de expressão de mamíferos compreenderão uma origem de replicação, um realçador e promotor adequado, e também qualquer sítio de aglutinação de ribossomo necessário, sítio de poliadenilação, sítio de aceitação e doador de união, seqüência de terminação transcricional, e seqüências não transcritas de flanqueação 5'. As seqüências de DNA,

derivadas da união SV40, e sítios de poliadenilação podem ser empregados para fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos.

As células hospedeiras contendo os polinucleotídeos de interesse podem ser cultivadas em veículos nutrientes convencionais modifica5 dos quando apropriado para promotores de ativação, selecionando os transformantes ou amplificando os genes. As condições da cultura, tal como temperatura, pH e outros, são aqueles previamente empregados com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será aparente aos técnicos ordinariamente versados. Os clones que são identificados como tendo a atividade de enzima especificada podem então ser seqüenciados para identificar a seqüência de polinucleotídeo codificando uma enzima tendo a atividade realçada.

Em outro aspecto, é considerado que o método da presente invenção pode ser empregado para gerar novos polinucleotídeos codificando passagens bioquímicas de um ou mais opérons ou agrupamentos de genes ou porções destes. Por exemplo, as bactérias e muitos eucariotas têm um mecanismo coordenado para regular os genes, cujos produtos estão envolvidos nos processos relacionados. Os genes são agrupados, nas estruturas referidas como agrupamento de genes, em um único cromossomo e são transcritos juntos sob o controle de uma única seqüência reguladora, incluindo um único promotor que inicia a transcrição do agrupamento total. Desse modo, o agrupamento do gene é um grupo de genes adjacentes que são ou idênticos ou relacionados, freqüentemente quanto à sua função. Um exemplo de uma passagem bioquímica codificada por agrupamento de ge25 nes são policetidas. As policetidas são moléculas que são uma fonte extremamente rica de bioatividades, incluindo antibióticos (tal como tetraciclinas e eritromicinas). Agentes anticâncer (daunomicina), imunossupressores (FK506 e rapamicina), e produtos veterinários (monensina). Muitas policetidas (produzidas por sintase de policetidas) são valiosas como agentes tera30 pêuticos. Sintase de policetida são enzimas multifuncionais que catalisam a biossíntese de uma enorme variedade de cadeias de carbono diferindo na extensão e padrões de funcionalidade e ciclização. Os genes de sintase de policetida incluem-se nos agrupamentos de gene e pelo menos um tipo (designado tipo I) de sintase de policetida tem enzimas e genes de tamanho amplo, complicando a manipulação genética e estudos in vitro desses genes/proteínas.

O DNA de agrupamento de gene pode ser isolado de diferentes organismos e ligado nos vetores, particularmente vetores contendo seqüências reguladoras de expressão que podem controlar e regular a produção de uma proteína detectável ou atividade de disposição relacionada com proteína dos agrupamentos de gene ligados. O uso de vetores que têm uma capacidade excepcionalmente ampla para introdução de DNA exógeno é particularmente apropriado para uso com agrupamento de gene e é descrito por modo de exemplo aqui, para incluir o f-fator (ou fator de fertilidade) de E. coli. Este f-fator de E. coli é um plasmídeo que afeta a transferência de freqüência elevada de si próprio durante a conjugação e é ideal para obter e estavelmente propagar amplos fragmentos de DNA, tal como agrupamentos de gene de amostras microbiais misturadas, Uma modalidade particularmente preferida é empregar vetores de clonagem, referidos como vetores de fosmídeos ou de cromossomos artificiais bacterianos (BAC). Esses são derivados de f-fator de E. coli que é capaz de estavelmente integrar amplos segmentos de DNA genômico. Quando integrado com DNA de uma amostra ambiental não cultivada misturada, isto torna possível obter grandes fragmentos genômicos na forma de uma estável biblioteca de DNA ambiental. Outro tipo de vetor para uso na presente invenção é um vetor de cosmídeo. Os vetores de cosmídeo foram originalmente designados para clonar e propagar amplos segmentos de DNA genômico. A clonagem em vetores de cosmídeo é descrita em detalhes em Sambroak e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Uma vez ligado em um vetor apropriado, dois ou mais vetores contendo agrupamentos de gene de sintase de policetida diferentes podem ser introduzidos em uma célula hospedeira adequada. As regiões de homologia de seqüência parcial dividida pelo agrupamento de gene promoverão o processo que resulta na reorganização da seqüência resultando em um agru-

pamento de gene híbrido. O novo agrupamento de gene híbrido pode então ser avaliado quanto às atividades realçadas não encontradas nos agrupamentos de gene original.

Portanto, em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para produzir um polipeptideo híbrido biologicamente ativo e avaliar um tal polipeptideo quanto à atividade realçada:

(1) introduzindo-se pelo menos um primeiro polinucleotídeo na ligação operável e um segundo polinucleotídeo na ligação operável, referido pelo menos primeiro polinucleotídeo e segundo polinucleotídeo dividindo pelo menos uma região de homologia de seqüência parcial, em uma célula hospedeira adequada;

(2) desenvolvendo-se a célula hospedeira sob condições que promovam a reorganização da seqüência resultando em um polinucleotídeo híbrido em ligações operáveis;

(3) expressando-se um polipeptideo híbrido codificado pelo polinucleotídeo híbrido;

(4) avaliando-se o polipeptideo híbrido sob condições que promovam a identificação da atividade biológica realçada; e (5) isolando-se um polinucleotídeo codificando o polipeptideo híbrido.

Os métodos para avaliação de várias atividades de enzima são conhecidos por aqueles versados na técnica e são discutidos por todo o presente relatório descritivo. Tais métodos podem ser empregados quando isolando os polipeptídeos e polinucleotídeos da invenção.

Como exemplos representativos dos vetores de expressão que podem ser empregados, podem ser mencionados partículas virais, baculovírus, fago, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, fosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos, DNA viral (por exemplo, vacina, adenovírus, vírus de pústula de ave, pseudohidrofobia e derivados de SV40), cromossomos artificiais com base em P1, plasmídeos de levedura, cromossomos artificiais de levedura, e qualquer outro vetor específico para hospedeiros específicos de interesse (tal como bacilus, aspergilo e levedura). Desse modo, por exem42 pio, o DNA pode ser incluído em qualquer uma de uma variedade de vetores de expressão para expressar um polipeptídeo. Tais vetores incluem seqüências de DNA cromossômico, não cromossômico e sintético. Os grandes números de vetores adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica, e são comercialmente disponíveis. Os seguintes vetores são fornecidos por modo de exemplo; Bacteriano: vetores pQE (Qiagen), plasmídeos pBluescript, vetores pNH, (vetores lambda-ZAP)(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucariótico; pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser empregado contanto que eles sejam reproduzíveis e viáveis no hospedeiro. Os vetores de número de cópia baixo ou número de cópia elevado podem ser empregados com a presente invenção.

A seqüência de DNA no vetor de expressão é operativamente ligada a uma seqüência de controle de expressão apropriada (promotora) para direcionar a síntese de RNA. Os promotores bacterianos particulares nomeados incluem lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL e trp. Os promotores eucarióticos incluem ÇMV imediato tardio, cinase de timidina de HSV, SV40 precoce e tardia, LTRs de retrovírus, e metalotioneína-l de camun20 dongo. A seleção do promotor e vetor apropriado está bem no nível dos versados ordinários da técnica. O vetor de expressão também contém um sítio de aglutinação de ribossomo para iniciação da translação e um terminador de transcrição. O vetor pode também incluir seqüências apropriadas para amplificar a expressão. As regiões promotoras podem ser selecionadas de qualquer gene desejado empregando vetores de transferase de cloramfenicol (CAT) ou outros vetores com marcadores selecionáveis. Além disso, os vetores de expressão preferivelmente contêm um ou mais genes de marcadores selecionáveis para fornecer um traço fenotípico para a seleção de células hospedeiras transformadas tal como resistência à neomiciná ou re30 ductase de dihidrofolato para cultura de células eucarióticas, ou tal como resistência à ampicilina e tetraciclina em E. coli.

O reagrupamento in vivo é focado em processos interCif moleculares coletivamente referidos como recombinação que na bactéria, é geralmente observado como um fenômeno dependente de RecA. A invenção pode contar com processos de recombinação de uma célula hospedeira para recombinar e reagrupar sequências, ou a capacidade das células de mediar os processos redutivos para diminuir a complexidade de seqüências quase-repetidas na célula por anulação. Este processo de reagrupamento redutivo ocorre por um processo independente de RecA intra molecular.

Portanto, em outro aspecto da invenção, novos polinucleotídeos 10 podem ser gerados pelo processo de reagrupamento redutivo. O método envolve a geração de constructos contatando sequências consecutivas (seqüências de codificação original), sua inserção em um vetor apropriado, e sua introdução subseqüente em uma célula hospedeira apropriada. O reagrupamento da identidade molecular individual ocorre por processos combi15 natórios entre as seqüêncías consecutivas nas regiões de posse de constructos de homologia, ou entre as unidades quase-repetidas. O processo de reagrupamento recombina e/ou reduz a complexidade e extensão das seqüências repetidas, e resulta na produção de novas espécies moleculares. Vários tratamentos podem ser aplicados para realçar a taxa de reagrupa20 mento. Esses incluem tratamento com luz ultravioleta, ou químicos de danificação de DNA, e/ou o uso de linhagem de célula hospedeira exibindo níveis realçados de instabilidade genética. Desse modo o processo de reagrupamento pode envolver recombinações homólogas ou a propriedade natural de seqüêncías quase-repetidas para direcionar sua própria evolu25 ção.

As seqüêncías repetidas ou quase repetidas desempenham um papel na instabilidade genética. Na presente invenção, quaserepetidas são repetições que não são restritas à sua estrutura de unidade original. As unidades quase-repetidas podem ser apresentadas como uma disposição de seqüêncías em um constructo; unidades consecutivas de seqüências similares. Uma vez ligada, as junções entre as seqüêncías consecutivas tornam-se essencialmente invisíveis e a natureza quase-repetitiva

do constructo resultante é agora contínua no nível molecular. O processo de anulação das células executa para reduzir a complexidade do constructo resultante operando entre as seqüências quase repetidas. As unidades quase-repetidas fornecem um repertório praticamente ilimitado de modelos nos quais os eventos de deslizamento podem ocorrer. Os constructos contendo as quase-repetidas desse modo, eficazmente fornecem elasticidade molecular suficiente, pela qual os eventos de anulação (e potencialmente inserção) possam ocorrer virtualmente em qualquer lugar nas unidades quase-repetitivas.

Quando as seqüências quase-repetidas são todas ligadas na mesma orientação, por exemplo, do topo para cauda ou vice-versa, a célula não pode distinguir unidades individuais. Conseqüentemente, o processo redutivo pode ocorrer em toda a seqüência. Ao contrário, quando, por exemplo, as unidades estão presentes do topo para o topo, exceto do topo para a cauda, a inversão delineia os pontos finais da unidade adjacente a fim de que a formação de anulação favoreça a perda de unidades discretas. Desse modo, é preferível com o presente método que as seqüências estejam na mesma orientação. A orientação aleatória de seqüências quaserepetidas resultará na perda da eficiência do reagrupamento, ao mesmo tempo em que a orientação consistente das seqüências oferecerá a eficiência superior. Entretanto, ao mesmo tempo em que tendo a minoria das seqüências contíguas na mesma orientação diminui a eficiência, ela pode ainda fornecer elasticidade suficiente para a recuperação eficaz de novas moléculas. Os constructos podem ser feitos com as seqüências quaserepetidas na mesma orientação para permitir eficiência superior.

As seqüências podem ser montadas em uma orientação do topo para cauda empregando qualquer dos diversos métodos, incluindo os seguintes:

(a) Iniciadores que incluem um topo poli-A e cauda polí-T que quando fazem filamento único poderiam fornecer a orientação, podem ser utilizados. Isto é concluído tendo-se a primeira base pequena do iniciador feito de RNA e por esta razão facilmente removeu RNAseH.

(b) Iniciadores que incluem sítios de clivagem de restrição única, podem ser utilizados. Sítios múltiplos, uma batería de seqüências únicas, e síntese repetida e etapas de ligação seriam requeridos.

(c) A base pequena interna do iniciador poderia ser tiolada e uma exonuclease empregada para produzir moléculas apropriadamente com cauda.

A recuperação das seqüências reagrupadas conta com a identificação de vetores de clonagem com um índice repetitivo reduzido (RI). As seqüências de codificação reagrupadas podem então ser recuperadas por amplificação. Os produtos são novamente clonados e expressados. A recuperação dos vetores de clonagem com RI reduzido pode ser afetada:

1) Pelo uso de vetores somente estavelmente mantidos quando o constructo é reduzido na complexidade.

2) Pela recuperação física dos vetores encurtados por procedimentos físicos. Neste caso, o vetor de clonagem seria recuperado empregando procedimentos de isolação de plasmídeo padrão e tamanho fracionado ou em um gel de agarose, ou coluna com um corte de peso molecular baixo utilizando procedimentos padrão.

3) Pela recuperação dos vetores contendo genes interrompidos que podem ser selecionados quando o tamanho da inserção diminui.

4) Pelo uso de técnicas de seleção direta com um vetor de expressão e a seleção apropriada.

As seqüências de codificação (por exemplo, genes) de organismos relacionados podem demonstrar um grau elevado de homologia e codificam completamente diversos produtos de proteína. Esses tipos de seqüências são particularmente úteis na presente invenção como quaserepetições. Entretanto, ao mesmo tempo em que os exemplos ilustrados abaixo demonstram o reagrupamento das seqüências de codificação original quase idênticas (quase-repetições), este processo não é limitado a tais repetições quase idênticas.

Os seguintes exemplos demonstram um método da invenção. As seqüências de ácido nucléico de codificação (quase-repetições), derivadas de três (3) espécies únicas são descritas. Cada seqüência codifica uma proteína com um grupo distinto de propriedades. Cada das seqüências difere por um único ou poucos pares de base em uma única posição na seqüência. As seqüências quase-repetidas são separadamente ou coletivamente amplificadas e ligadas em agrupamentos aleatórios tal que todas possíveis permutações e combinações sejam disponíveis na população de moléculas ligadas. A quantidade de unidades quase-repetidas pode ser controlada pelas condições de montagem. A quantidade medida de unidades quase-repetidas em um constructo é definida como o índice repetitivo (RI).

Uma vez formados, os constructos podem, ou não podem ser fracionados por tamanho em um gel de agarose de acordo com os protocolos publicados, inseridos em um vetor de clonagem, e transfectados em uma célula hospedeira apropriada. As células são então propagadas e o reagrupamento redutivo é efetuado. A taxa do processo de reagrupamento redutivo pode ser estimulada pela introdução de detrimentos de DNA se desejado. A redução no RI é mediada pela formação de anulação entre as seqüências repetidas por um mecanismo intramolecular, ou mediada por eventos tipo recombinação através de mecanismos intermoleculares é imaterial. O resultado final é o reagrupamento das moléculas em todas combinações possíveis.

Opcionalmente, o método compreende a etapa adicional de avaliar os membros da biblioteca do grupo misturado para identificar os membros da biblioteca misturados individuais tendo a capacidade de se aglutinar ou de outro modo interagir, ou catalisar uma reação particular (por exemplo, tal como domínio catalítico de uma enzima) com uma macromolécula predeterminada, tal como por exemplo um receptor de proteináceo, um oligossacarídeo, viron, ou outra estrutura ou composto predeterminado.

Os polipeptídeos que são identificados de tais bibliotecas podem ser empregados para propósitos terapêuticos, diagnóstico, pesquisas e propósitos relacionados (por exemplo, catalisadores, solutos para aumentar a osmolaridade de uma solução aquosa, e outros), e/ou podem ser submeti-

dos a um ou mais ciclos de adição de mistura e/ou seleção.

Em outro aspecto, é considerado que antes ou durante a recombinação ou reagrupamento, os polinucleotídeos gerados pelo método da invenção podem ser submetidos a agentes ou processos que promovem a introdução de mutações nos polinucleotídeos originais. A introdução de tais mutações aumentaria a diversidade dos polipeptídeos e polinucleotídeos híbridos resultantes codificados a partir daqui. Os agentes ou processos que promovem mutagênese podem incluir, porém não estão limitados a:(+)CC-1065, ou um análogo sintético tal como (+)-CC-1065-(N3-Adenina (observe Sun e Hurley, (1992); uma adução de 4'-flúor-4-aminobifenila desacetilada ou N-acetilada capaz de inibir a síntese de DNA (observe, por exemplo, van de poli e outros, (1992)); ou uma adução de 4 aminobifenila desacetilada ou N-acetilada capaz de inibir a síntese de DNA (observe também, van de Poli e outros (1992), pp 751-758); cromo trivalente, um sal de cromo trivalente, uma adução de DNA de hidrocarboneto aromático poiicíclico (PAH) capaz de inibir a replicação de DNA, tal como 7-bromometilbenz[a]antraceno (BMA), tris(2,3-dibromopropil)fosfato (Tris-BP), 1,2dibromo-3-cloropropano (DBCP), 2-bromoacroleína (2BA), benzo[a]pireno7,8-diidrodiol-9-10-epóxido (BPDE), um sal de halogênio de platina (II), Nhidróxi-2-amino-3-metilimidazo[4,5-f]-quinolina (N-hidróxi-ÍQ), e N-hidróxi2-amino-1-metil-6-fenilimidazo[4,5-f]-piridina (N-hidróxi-PhlP). Os meios especialmente preferidos para reduzir ou parar a amplificação por PCR consiste de luz UV (+)-CC-1065 e (+)-CC-1065-(N3-Adenina). Os meios particularmente abrangidos são aduções de DNA ou polinucleotídeos compreendendo as aduções de DNA dos grupos de polinucleotídeos ou polinucleotídeos, que pode ser liberado ou removido por um processo incluindo aquecimento da solução compreendendo os polinucleotídeos antes de outro processamento.

Em outro aspecto a invenção está direcionada a um método para produzir proteínas recombinantes tendo atividade biológica tratando-se uma amostra compreendendo polinucleotídeos de modelo de filamento duplo codificando uma proteína do tipo selvagem sob condições de acordo

com a invenção que provê a subsistência da produção de polinucleotídeos híbridos ou reagrupados.

A invenção também provê a subsistência do uso de iniciadores de códon proprietário (contendo uma seqüência Ν,Ν,Ν degenerada) para introduzir pontos de mutações em um polinucleotídeo, a fim de que gere um grupo de polipeptídeos progênies no qual uma faixa total de substituições de aminoácido único é representada em cada posição de aminoácido (mutagênese saturada de sítio de gene (GSSM)). Os oligos empregados são compreendidos contiguamente de uma primeira seqüência homóloga, uma seqüência N, N, N degenerada, e preferivelmente porém não necessariamente uma segunda seqüência homóloga. Os produtos translacionais progênies a jusante do uso de tais oligos incluem todas possíveis alterações de aminoácidos em cada sítio de aminoácido junto ao polipeptídeo, porque a degeneração da seqüência de Ν,Ν,Ν inclui códons para todos 20 aminoácidos.

Em um aspecto, um tal oligo degenerado (compreendido de um cassete Ν,Ν,Ν degenerado) é empregado para submeter cada códon original em um modelo de polinucleotídeo parental a uma faixa total de substituição de códon. Em outro aspecto, pelo menos dois cassetes Ν,Ν,Ν degenerados são empregados - ou no mesmo oligo ou não- para submeter pelo menos dois códons originais em um modelo de polinucleotídeo parental a uma faixa total de substituições de códons. Desse modo, mais do que uma seqüência Ν,Ν,Ν pode estar contida em um oligo para introduzir mutações de aminoácido em mais do que um sítio. Esta pluralidade de seqüências Ν,Ν,Ν pode ser diretamente contígua, ou separada por uma ou mais seqüências de nucleotídeos adicionais. Em outro aspecto, os oligos úteis para adições e anulações de introdução podem ser empregados ou sozinhos ou em combinação com os códons contendo uma seqüência de Ν,Ν,Ν, para introduzir qualquer combinação ou permutação de adição, anulação e/ou substituição de aminoácido.

Em uma exemplificação particular, é possível simultaneamente mutagenizar duas ou mais posições de aminoácido contíguo empregando um oligo que contém o tripleto Ν,Ν,Ν contíguo, isto uma seqüência (N,N,N)n degenerada.

Em outro aspecto, a presente invenção provê a subsistência do uso de cassetes degenerados tendo menos degeneração do que a seqüência Ν,Ν,Ν. Por exemplo, pode ser desejável em alguns exemplos empregar (por exemplo, em um oligo) uma seqüência de tripleto degenerada compreendida de somente um N, onde o referido N pode estar na primeira, segunda ou terceira posição do tripleto. Qualquer outra base incluindo qualquer combinação e permutação deste pode ser empregada nas duas posições restantes do tripleto. Alternativamente, pode ser desejável em alguns exemplos empregar (por exemplo, em um oligo) uma seqüência de tripleto Ν,Ν,Ν degenerada, seqüência de tripleto N,N,G/T ou uma seqüência N,N,G/C.

É apreciado entretanto, que o uso de um tripleto degenerado (tal como seqüência de tripleto N,N,G/T ou N,N,G/C) como divulgado na presente invenção seja vantajoso por várias razões. Em um aspecto, esta invenção fornece um meio para sistematicamente e regularmente facilmente gerar a substituição da faixa total de possíveis aminoácidos (para um total de 20 aminoácidos) em cada e todas as posições de aminoácido em um polipeptídeo. Desse modo, para um polipeptídeo de 100 aminoácidos, a invenção fornece um modo para sistematicamente e regularmente facilmente gerar 2000 espécies distintas (isto é, 20 possíveis aminoácidos por vezes de posições de posições de 100 aminoácidos). É apreciado que seja fornecido, através do uso de um oligo contendo uma seqüência de tripleto de N,N,G/T ou N,N,G/C degenerada, 32 seqüências individuais que codificam para 20 possíveis aminoácidos. Desse modo, em um recipiente de reação no qual uma seqüência de polinucleotídeo parental é submetida à mutagênese por saturação empregando um tal oligo, existem 32 polinucleotídeos progênies distintos gerados codificando 20 polipeptídeos distintos. Ao contrário, o uso de um oligo não-degenerado na mutagênese direcionada ao sítio induz a somente um produto de polipeptídeo progênie por recipiente de reação.

Esta invenção também provê a subsistência do uso de oligos não-degenerados, que podem opcionalmente ser empregados em combina50 ção com os iniciadores degenerados divulgados. É apreciado que em algumas situações, seja vantajoso empregar oligos não-degenerados para gerar mutações de ponto específico em um polinucleotídeo de trabalho. Isto fornece um meio para gerar mutações de ponto notável específico, mutações de ponto induzindo a alterações de aminoácido correspondentes, e mutações de ponto que causam a geração de códons de interrupção e a expressão correspondente de fragmentos de polipeptídeo.

Desse modo, em uma modalidade preferida desta invenção, cada recipiente de reação de mutagênese por saturação contém polinucleotídeos codificando 20 moléculas de polipeptídeo progênies tal que todos os 20 aminoácidos sejam representados na posição de um aminoácido específico correspondendo à posição do códon mutagenizado no polinucleotídeo parental. Os polipeptídeos progênies degenerados de 32 dobras gerados de cada recipiente de reação de mutagênese por saturação podem ser submetidos à amplificação clonal (por exemplo, clonado em um hospedeiro E. coli adequado empregando um vetor de expressão) e submetido à avaliação da expressão. Quando um polipeptídeo de progênie individual é identificado por avaliação quanto à exposição de uma alteração favorável na propriedade (quando comparado com o polipeptídeo parental), ele pode ser seqüenciado para identificar a substituição de aminoácido correspondentemente favorável contida aqui.

É apreciado que sob mutagenização de cada e de todas as posições de aminoácido em um polipeptídeo parental empregando mutagênese por saturação como divulgado aqui, alterações de aminoácido favoráveis possam ser identificadas em mais do que uma posição de aminoácido. Uma ou mais novas moléculas progênies pode ser gerada a qual contenha uma combinação de todas ou parte dessas substituições de aminoácido favoráveis. Por exemplo, se 2 alterações de aminoácido favoráveis específicas são identificadas em cada das 3 posições de aminoácido em um polipeptídeo, as permutações incluem 3 possibilidades em cada posição (nenhuma alteração do aminoácido original, e cada de duas alterações favoráveis) e 3 posições. Desse modo, existem 3 x 3 x 3 ou 27 possibilidades totais, inclu-

indo 7 que foram previamente examinadas- 6 mutações de ponto único (isto é, 2 em cada das três posições) e nenhuma alteração em qualquer posição.

Em ainda outro aspecto, a mutagênese por saturação de sítio pode ser empregada junto com mistura, quimerização, recombinação e outros processos de mutagenização, junto com a avaliação. Esta invenção provê a subsistência do uso de qualquer processo de mutagênese, incluindo mutagênese por saturação, de uma maneira iterativa. Em uma exemplificação, o uso interativo de qualquer processo de mutagenização é empregado em combinação com a avaliação.

Desse modo em uma exemplificação não-limitante, esta invenção provê a subsistência do uso da mutagênese por saturação em combinação com processos de mutagenização adicionais, tal como processo onde dois ou mais polinucleotideos relacionados são introduzidos em uma célula hospedeira adequada tal que um polinucleotideo híbrido seja gerado por recombinação e reagrupamento redutivo.

Além de realizar a mutagênese junto com a seqüência inteira de um gene, a presente invenção fornece mutagênese que pode ser empregada para substituir cada de qualquer quantidade de bases em uma seqüência de polinucleotideo, onde a quantidade de bases a ser mutagenizada é preferivelmente todos os números inteiros de 15 a 100.000. Desse modo, ao invés de todas as posições de mutagênese junto com uma molécula, uma pode submeter todos ou vários números discretos de bases (preferivelmente uma subsérie totalizando de 15 a 100.000) para mutagênese. Preferivelmente, um nucleotídeo separado é empregado para mutagenização de cada posição ou grupo de posições junto com uma seqüência de polinucleotideo. Um grupo de 3 posições para ser mutagenizado pode ser um códon. As mutações são preferivelmente introduzidas empregando um iniciador mutagênico, contendo um cassete heterólogo, também refere-se como um cassete mutagênico. Os cassetes preferidos podem ter de 1 a 500 bases. Cada posição de nucleotídeo em tais cassetes heterólogos, serão N, A, C, G, T, A/C, A/G, A/T, C/G, C/T, G/T, C/G/T, A/G/T, A/C/T, A/C/G, OU E, onde E é qualquer base que não seja A, C, G, ou T (E pode ser referida como um projeto de oligo).

Em um sentido geral, a mutagênese de saturação é compreendida da mutagenização de uma série completa de cassetes mutagênicos (onde cada cassete é preferivelmente cerca de 1-500 bases em extensão) em seqüência de polinucleotídeo definida ser mutagenizado (onde a seqüência para ser mutagenizado é preferivelmente de cerca de 15 a 100.000 bases em extensão). Desse modo, um grupo de mutações (variando de 1 a 100 mutações) é introduzido em cada cassete para ser mutagenizado. Um agrupamento de mutações para serem introduzidas em um cassete pode ser diferente ou o mesmo de um segundo agrupamento de mutações para serem introduzidas em um segundo cassete durante a aplicação de um ciclo de mutagênese de saturação. Tais agrupamentos são exemplificados serem anulações, adições, agrupamentos de códons particulares, e agrupamentos de cassetes de nucleotídeos particulares.

As sequências definidas para serem mutagenizadas incluem um gene inteiro, passagem, cDNA, uma estrutura de leitura aberta inteira (ORF), e promotor inteiro, realçadores, repressores/transativadores, origem de replicação, íntron, operador, ou qualquer grupo funcional de polinucleotídeo. Geralmente, uma seqüência definida para este propósito pode ser qualquer polinucleotídeo que uma seqüência de polinucleotídeo de 15 bases, e seqüências de polinucleotídeos de extensão entre 15 bases e 15.0000 bases (esta invenção especificadamente nomeia todos os números inteiros envolvidos). As considerações em agrupamentos escolhidos de códons incluem tipos de aminoácidos codificados por um cassete mutagênico degenerado.

Em uma exemplificação particularmente preferida um agrupamento de mutações que podem ser introduzidas em um cassete mutagênico, esta invenção especificamente fornece durante substituições de códons degenerados (empregando oligos degenerados) que codificam para 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, e 20 aminoácidos em cada posição, e uma biblioteca de polipeptídeos codifica desse modo.

Um aspecto da invenção é um ácido nucléico isolado compre53 endendo uma das seqüências das sequências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, as seqüências complementares a estas, ou um fragmento compreendendo pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ,75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas de uma das seqüências de uma seqüência de ácido nucléico de Grupo A (ou as seqüências complementares a estas). Os ácidos nucléicos isolados, podem compreender DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, e DNA sintético. O DNA pode ser de duplo filamento ou único filamento, e se o filamento é único pode ser codificado o filamento ou não codificado o filamento (anti-sentido). Alternativamente, os ácidos nucléicos isolados podem compreender RNA.

Como discutido em mais detalhes abaixo, os ácidos nucléicos isolados de uma seqüência de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas estas, podem ser empregados para preparar um dos polipeptideos de uma seqüência de aminoácidos do grupo B, e as seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos de um dos polipeptideos de seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas.

Conseqüentemente, outro aspecto da invenção é um ácido nucléico isolado que codifica uma das seqüências de aminoácidos do Grupo B de polipeptideos, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos de um dos polipeptideos das seqüências de aminoácidos do Grupo B. As seqüências codificadas desses ácidos nucléicos podem ser idênticas para uma das seqüências codificadas de um dos ácidos nucléicos das seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, ou urn fragmento destas ou podem ser seqüências codificadas diferentes que codificam um dos polipeptideos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, seqüências substancialmente idênticas a estas, e fragmentos tendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 ou 150 aminoácidos consecutivos de um dos polipeptideos das seqüências de aminoácidos de

Grupo B, como um resultado da redundância ou degeneração do código genético. O código genético será conhecido por alguém versado na técnica e pode ser obtido, por exemplo, na página 214 de B. Lewin, Genes VI, Oxford University Press, 1997, a divulgação da qual está incorporada aqui por referência.

O ácido nucléico isolado que codifica um dos polipeptídeos das sequências de aminoácidos do grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, pode incluir, porém não está limitado a: somente a seqüência codificada de uma das seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, e seqüências de codificação adicional, tal como seqüências indutoras ou seqüências de próproteínas e seqüências não-codificadas, tal como íntrons ou seqüências não-codificadas 5' e/ou 3' das seqüências codificadas. Desse modo, como empregado aqui, o termo polinucleotídeo codificando um polipeptídeo abrangem um polinucleotídeo que inclui somente a seqüência codificada para o polipeptídeo bem como um polinucleotídeo que inclui seqüência nãocodificada e/ou codificada adicional.

Alternativamente, as seqüências de ácidos nucléicos das seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, podem ser mutagenizadas empregando técnicas convencionais, tal como mutagênese de sítio direcionado, ou outras técnicas familiares para aqueles versados na técnica, para introduzir alterações silenciosas nos polinucleotídeos de seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas. Como empregado aqui alterações silenciosas incluem, por exemplo, alterações que não alteram a seqüência de aminoácido codificada pelo polinucleotídeo. Tais alterações podem ser desejáveis a fim de aumentar o nível do polipeptídeo produzido pelas células hospedeiras contendo um vetor codificando o polipeptídeo introduzindo-se os códons ou pares de códons que ocorre freqüentemente em organismos hospedeiros.

A invenção também refere-se a polinucleotídeos que têm alterações de nucleotídeos que resultam em substituições de aminoácidos, adi55 ções, anulações, fusões e truncações nos polipeptídeos das sequências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas. Tais alterações de nucleotídeo podem ser introduzidas empregando técnicas tal como mutagênese de sítio direcionado, mutagênese química aleatória, anulação de exonuclease III, e outras técnicas de DNA recombinante. Alternativamente, tais alterações de nucleotídeo podem ser variantes alélicos ocorrendo naturalmente que são isoladas identificando-se os ácidos nucléicos que especificadamente hidridizam as sondas compreendendo pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas das seqüências de seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas (ou as seqüências complementares a estas) sob condições de altamente precisas, moderadas ou baixas como fornecidas aqui.

Os ácidos nucléicos isolados das seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, as seqüências complementares a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos 10 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas de uma das seqüências das seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou as seqüências complementares a estas podem também ser empregados como sondas para determinar quer uma amostra biológica, tal como uma amostra de solo, contém um organismo tendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção ou um organismo dos quais o ácido nucléico foi obtido. Em tais procedimentos, uma amostra biológica potencialmente abrigando o organismo dos quais o ácido nucléico foi isolado é obtida e ácidos nucléicos são obtidos da amostra. Os ácidos nucléicos são contatados com as sondas sob condições que permitam a sonda hibridizar especificamente qualquer seqüência complementar das quais estão presentes aqui.

Onde necessário, condições que permitem a sonda hibridizar especificadamente às seqüências complementares podem ser determinadas colocando-se a sonda em contato com as seqüências complementares das amostras conhecidas para conter a seqüência complementar bem como se56 qüências de controle que não podem conter a seqüência complementar. As condições de hibridização, tal como a concentração de sal do tampão de hibridização, a concentração de formamida do tampão de hibridização, ou a temperatura de hibridização, podem ser variadas para identificar as condi5 ções que permitem a sonda hibridizar especificadamente aos ácidos nucléicos complementares.

Se a amostra contém o organismo dos quais o ácido nucléico foi isolado, a hibridização específica da sonda é então detectada. A hibridização pode ser detectada rotulando-se a sonda com um agente detectável tal como um isótopo radioativo, um corante fluorescente ou uma enzima capaz de catalisar a formação de um produto detectável.

Muitos métodos para uso de sondas rotuladas para detectar a presença de ácidos nucléicos suplementares em uma amostra são familiares àqueles versados na técnica. Esses incluem Southern Blots Northern

Blots, procedimentos de hibridização de colônia, e pontos de manchas. Os protocolos para cada desses procedimentos são fornecidos em Ausubel e outros. Protocolos correntes em Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. (1997) e Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory manual 2^a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), as divulgações com20 pletas das quais estão incorporadas aqui por referência.

Alternativamente, mais do que uma sonda (pelo menos uma das quais é capaz de especificadamente hidridizar quaisquer seqüências complementares que estão presentes na amostra de ácido nucléico), pode ser empregada em uma reação de amplificação para determinar se a amostra contém um organismo contendo uma seqüência de ácido nucléico da invenção (por exemplo, um organismo dos quais o ácido nucléico foi isolado). Tipicamente, as sondas compreendem oligonucleotídeos. Em uma modalidade, a reação de amplificação pode compreender uma reação por PCR. Os protocolos PCR são descritos em Ausubel e Sambrook, supra. Alternativa30 mente, a amplificação pode compreender uma reação de cadeia de ligase, 3SR, ou reação de deslocamento de filamento. (Observe Barany, F., The Ligase Chain Reaction in a PCR World, PCR Methods and Applications

C¹} ι

1:5-16,1991; E. Fahy e outros, Self-sustained Sequence Replication (3SR): An lsothermal Transcription-based Amplification System Alternative to PCR, PCR Methods and Applications 1:25-33, 1991; and Walker G.T. et al., Strand Displacement Amplification-an lsothermal in vitro DNA Amplification Technique, Nucleic Acid Research 20:1691-1696, 1992, as divulgações das quais estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade). Em tais procedimentos, os ácidos nucléicos na amostra são contatados com as sondas, a reação de amplificação é realizada, e qualquer produto de amplificação resultante é detectado. O produto de amplificação pode ser detectado realizando-se eletroforese de gel nos produtos de reação e manchando o gel com um interlocutor tal como brometo de etídio. Alternativamente, uma ou mais das sondas podem ser rotuladas com um isótopo radioativo e. a presença de um,produto de amplificação radiçativo pode ser detectada por auto-radiografia após eletroforese em gel.

As sondas derivadas das seqüências próximas das extremidades das seqüências de seqüências de ácidos nucléicos do grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, podem também ser empregadas em procedimentos de comportamento do cromossomo para identificar clones contendo seqüência genômica localizada adjacente às seqüências das seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas. Tais métodos permitem o isolamento de genes que codificam proteínas adicionais do organismo hospedeiro.

Os ácidos nucléicos isolados de seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, as seqüências complementares a estas, ou um fragmento compreendendo pelo menos 10 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas de uma das seqüências de seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou as seqüências complementares a estas podem ser empregados como sondas para identificar e isolar ácidos nucléicos relacionados. Em algumas modalidades, os ácidos nucléicos relacionados, podem ser cDNAs ou DNAs genômicos dos organismos a não ser que um dos quais dos ácidos nucléicos estivesse

isolado. Por exemplo, os outros organismos podem ser organismos relacionados. Em tais procedimentos, uma amostra de ácido nucléico é contatada com uma sonda sob condições que permitem a sonda hibridizar especificadamente às seqüências relacionadas. A hibridização da sonda aos ácidos nucléicos do organismo relacionado é então detectada empregando qualquer dos métodos descritos acima.

Em reações de hibridização de ácido nucléico, as condições empregadas para alcançar um nível particular de precisão variarão, dependendo da natureza dos ácidos nucléicos sendo hibridizados. Por exemplo, a extensão, grau de complementaridade, composição de seqüência de nucleotídeo (por exemplo, GC v. conteúdo AT), e tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA v. DNA) das regiões de hibridização dos ácidos nucléicos podem ser consideradas em condições de hibridização selecionadas. Uma consideração adicional é se um dos ácidos nucléicos é imobilizado, por exemplo, em um filtro.

A hibridização pode ser realizada sob condições precisas baixas, precisas moderadas ou altamente precisas. Como um exemplo de hibridização de ácido nucléico, uma membrana de polímero contendo ácidos nucléicos desnaturados imobilizados é primeiro pré-hibridizada durante 30 minutos em 45°C em uma solução consistindo de 0,9 M de NaCI, 50mM de NaH₂PO₄, pH 7,0; 5,0 mM de Na2EDTA, 0,5% de SDS, 10x Denhardfs, e 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. Aproximadamente 2 x 107 cpm (atividade específica 4-9 x 108 cpm/pg) de ³²P de sonda de oligonucleotídeo de extremidade rotulada são então adicionados à solução. Após 12-16 horas de incubação, a membrana é lavada durante 30 minutos em temperatura ambiente em 1 x SET (150mM de NaCI, 20mM de Tris cloridrato, pH 7,8, 1mM de Na2EDTA) contendo 0,5% de SDS, seguido por uma lavagem de 30 minutos em 1x SET fresco em Tm-10°C para a sonda de oligonucleotídeo. A membrana é então exposta para película auto-radiográfica para detecção de sinais de hibridização.

Variando-se a precisão das condições de hibridização empregadas para identificar ácidos nucléicos, tal como cDNAs ou DNAs genômi59 cos, que hibridizam a sonda detectável, ácidos nucléicos tendo níveis diferentes de homologia a sonda podem ser identificados e isolados. A precisão pode ser variada conduzindo-se a hibridização em temperaturas variadas abaixo das temperaturas de fundição das sondas. A temperatura de fundi5 ção, Tm, é a temperatura sob resistência iônica definida e pH) na qual 50% das seqüências alvo hibridizam para uma sonda perfeitamente complementar. As condições altamente precisas são selecionadas para serem iguais ou cerca de 5°C abaixo do que Tm durante uma sonda particular. A temperatura de fundição da sonda pode ser calculada empregando as seguintes fór10 mulas:

Para as sondas entre 14 e 70 nucleotídeos em extensão a temperatura de fundição (Tm) é calculada empregando a fórmula: Tm= 81,5+16,6(log[Na+J)+0,41 (fração G+C)-(600/N) onde N é a extensão da sonda.

Se a hibridização é realizada em uma solução contendo formamida, a temperatura de fundição pode ser calculada empregando a equação: Tm=81,5 +16,6(log[Na+])+0,41(fração G+C)-(0,63% de formamida)(600/N) onde N é a extensão da sonda.

A pré-hibridização pode ser realizada em 6x SSC, 5X reagente de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 gg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado ou 6X SSC, 5x reagente de Denhardt, 0,5% de SDS. 100 pg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado, 50% de formamida. As fórmulas para SSC e soluções de Denhardt estão listadas em Sambrook e outros, supra.

A hibridização é conduzida adicionado-se a sonda detectável a soluções de pré-hibridização listadas acima. Onde a sonda compreende DNA de filamento duplo, é desnaturada antes da adição da solução de hibridização. O filtro é contatado com a solução de hibridização durante um período suficiente de tempo para permitir a sonda hibridizar os cDNas ou

DNAs genômicos contendo seqüências complementares a isto ou homólogos destes. Para sondas sobre 200 nucleotídeos em extensão, a hibridização pode ser realizada em 15-25°C abaixo da Tm. Para sondas curtas, tal

como sondas de oligonucleotídeos, a hibridização pode ser conduzida em 510°c abaixo de Tm. Tipicamente, para hibridizações em 6X SSC, a hibridização é conduzida em aproximadamente 68°C. Freqüentemente, durante hibridizações em 50% de formamida contendo soluções, a hibridização é conduzida em aproximadamente 42°C.

Todas as hibridizações precedentes serão consideradas serem sob condições altamente precisas.

Seguinte a hibridização, o filtro é lavado para remover qualquer sonda detectável de ligação não-específica. A precisão empregada para lavar os filtros pode também ser variada dependendo da natureza dos ácidos nucléicos sendo hibridizados, a extensão dos ácidos nucléicos sendo hibridizados, o grau de complementaridade, a composição de seqüência do nucleotídeo (por exemplo, GC v. conteúdo AT), e o tipo de ácido nucléico (por exemplo, RNA v. DNA). Os exemplos das condições de lavagem precisas progressivamente altamente elevadas são como segue: 2xSSC, 0,1% de SDS em temperatura ambiente durante 15 minutos (precisão baixa); 0,1X SSC, 0,5% de SDS em temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (precisão moderada); 0,1 x SSC, 0,5% de SDS durante 15 a 30 minutos entre a temperatura de hibridização e 68°C (precisão elevada); e 0,15M de NaCI durante 15 minutos em 72°C (precisão muito elevada). Uma lavagem de precisão baixa final pode ser conduzida em 0,1X SSC em temperatura ambiente. Os exemplos acima são meramente ilustrativos de uma série de condições que podem ser empregadas para filtros de lavagens. Alguém versado na técnica conhecerá que existem numerosas receitas durante lavagem precisas diferentes. Alguns outros exemplos são determinados abaixo.

Os ácidos nucléicos que tenham hibridizado a sonda são identificados por auto-radiografia ou outras técnicas convencionais.

O procedimento acima pode ser modificado para identificar ácidos nucléicos tendo níveis de redução de homologia à seqüência da sonda. Por exemplo, para obter ácidos nucléicos de homologia reduzida à sonda detectável, condições menos precisas podem sere empregadas. Por exemplo, a temperatura de hibridização pode ser reduzida em incrementos de

5°C de 68°C a 42°C em um tampão de hibridização tendo uma concentração de Na⁺ de aproximadamente 1M. Seguinte a hibridização, o filtro pode ser lavado com 2x SSC, 0,5% de SDS na temperatura de hibridização. Essas condições são consideradas serem condições moderadas acima de 50°C e condições baixas abaixo de 50°C. Um exemplo específico de condições de hibridização moderadas é quando a hibridização acima é conduzida em 55°C. Um exemplo específico de condições de hibridização de precisão baixa é quando a hibridização acima é conduzida em 45°C.

Alternativamente, a hibridização pode ser realizada em tampões, tal como 6xSSC, contendo formamida em uma temperatura de 42°C. Neste caso, a concentração da formamida no tampão de hibridização pode ser reduzida em 5% de incrementos de 50% a 0% para identificar clones tendo níveis de redução de homologia à sonda. Seguinte a hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X SSC, 0,5% de SDS em 50°C. Essas condições são consideradas serem condições moderadas acima de 25% de formamida e condições baixas abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização moderadas é quando a hibridização acima é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo especifico de condições de hibridização de precisão baixa é quando a hibridização acima é conduzida em 10% de formamida.

Por exemplo, os métodos precedentes podem ser empregados para ácidos nucléicos isolados tendo uma seqüência com pelo menos cerca de 97%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% de homologia para uma seqüência de ácido nucléico selecionado a partir do grupo consistindo em uma das seqüências de seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos cerca de 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, ou 500 bases consecutivas destes, e a seqüências complementares destas. A homologia pode ser medida empregando o algoritmo de alinhamento. Por exemplo, os polinucleotídeos homólogos podem ter uma seqüência de codificação que é

uma variante alélica de ocorrência natural de uma das seqüêncías de codificação descritas aqui. Tais variantes alélicas podem ter uma substituição, anulação ou adição de um ou mais nucleotídeos quando comparadas aos ácidos nucléicos das seqüêncías de ácidos nucléicos do Grupo A ou as se5 qüências complementares a estas.

Adicionalmente, os procedimentos acima podem ser empregados para ácidos nucléicos isolados que codificam polipeptídeos tendo pelo menos cerca de 99%, 95%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos

60%, pelo menos 55%, ou pelo menos 50% de homologia para um polipeptídeo tendo a seqüência de uma das seqüêncías de aminoácidos do Grupo B, e seqüêncías substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ,40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes como determinado empregando um algoritmo de allinhamento de seqüência (por exemplo, tal como o algoritmo 3,0t78 da versão FASTA com os parâmetros característicos).

Outro aspecto da invenção é um polipeptídeo purificado ou isolado compreendendo a seqüência de uma das seqüêncías de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüêncías substancialmente idênticas a estas, ou frag20 mentos compreendendo pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes. Uma discussão acima, tais polipeptídeos podem ser obtidos por inserção de um ácido nucléico codificando o polipeptídeo em um vetor tal que a seqüência de codificação é operavelmente ligada a uma seqüência capaz de conduzir a expressão do polipeptídeo codificado em uma célula hospedeira adequada. Por exemplo, o vetor de expressão pode compreender um promotor, um sítio de aglutinação de ribossomo para iniciação da translação e um terminador de transcrição. O vetor pode também incluir seqüêncías apropriadas durante expressão de amplificação.

Os promotores adequados para expressar o polipeptídeo ou fragmentos destes em bactéria incluem os promotores E. coli lac ou trp, o promotor lacl, o promotor lacZ, o promotor T3, o promotor 77, o promotor

gpt, o promotor lambda P_R, o promotor lambda P_L, promotores de óperons codificando enzimas glicolfticas tal como cinase de 3-fosfogiicerato (PGK), e o promotor de fosfatase ácida. Os promotores de fungos incluem promotor de fator V. Os promotores eucarióticos incluem o promotor de CMV imediato precoce, promotor de cinase de timidina HSV, promotores de choque térmico, o promotor SV40 tardio e próximo, retrovírus de LTRs, e promotor de metalotioneina-l de camundongo. Outros promotores conhecidos para expressão de controle de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus podem também ser empregados.

Os vetores de expressão de mamíferos podem também compreender uma origem de replicação, qualquer sítio de aglutinação de ribossomo necessário, um sítio de poliadenilação, doador de emenda e sítio aceptor, seqüências de terminação transcricional, e seqüências não transcritas de flanqueação 5'. Em algumas modalidades, as seqüências de DNA derivadas de emendas SV40 e sítios de poliadenilação podem ser empregados para fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos.

Os vetores para expressão de polipeptídeo ou fragmentos destes em células eucarióticas podem também conter realçadores para aumentar os níveis de expressão. Os realçadores são elementos atuandtes-cis de DNA, freqüentemente de cerca de 10 a cerca de 300 bp em extensão que atua em um promotor para aumentar sua transcrição. Os exemplos incluem o realçador SV40 no último lado da origem de replicação bp 100 a 270, o realçador do promotor citomegalovírus próximo, o realçador de polioma no último lado da origem de replicação, e os realçadores de adenovírus.

Além disso, os vetores de expressão tipicamente contêm um ou mais genes de marcadores selecionados para permitir seleção de células hospedeiras contendo o vetor. Tais marcadores selecionados incluem genes codificando dihidrofolato reductase ou resistência da neomicina à conferência de genes para cultura de células eucarióticas, tetraciclina de conferência de genes ou resistência à ampicilina em E. coli, e o gene TRP1 S. cerevisiae.

Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica um dos polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes são agrupados na fase apropriada com uma seqüência líder capaz de secreção direta do polipeptídeo translado ou fragmento destes. Opcionalmente, o ácido nucléico pode codificar um polipeptídeo de fusão em que um dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes é fundido a peptídeos heterológos ou polipeptídeos, tal como peptídeos de identificação N-terminal que confere características desejadas, tal como estabilidade aumentada ou purificação simplificada.

A seqüência de DNA apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, a seqüência de DNA está ligada à posição desejada no vetor seguindo digestão do inserto e o vetor com endonucleases de restrição apropriadas. Alternativamente, as extremidades cegas em tanto no inserto como no vetor podem ser ligadas. Uma variedade de técnicas de clonagem são divulgadas em Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997 e Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual segunda edição Ed., Cold Spring harbor Laboratory Press (1989), as divulgações completas das quais estão incorporadas aqui por referência. Tais procedimentos e outros são julgados estarem no escopo da invenção por aqueles versados na técnica.

O vetor pode ser, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, ou um fago. Outros vetores incluem seqüências cromossômica, não cromossômica e DNA sintético, derivados de SV40; plasmídeos bactericidas, DNA fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA fago, DNA viral, tal como vacina, adenovírus, vírus de pústula de ave, e pseudohidrofobia. Uma variedade de vetores de expressão e clonagem para uso com hospedeiros euca65 rióticos e procarióticos são descritos por Sambrook, e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor, N. Y.; (1989), a divulgação das quais é aqui incorporada por referência.

Os vetores de bactérias particulares que podem também ser empregados incluem os plamídeos comercialmente disponíveis compreendendo elementos genéticos das cavidades de vetores de clonagem conhecidos pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Quiagen), pD10, psiX174 pBluescript II KS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 e pCM7. Os vetores eucarióticos particulares incluem pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro vetor pode ser empregado enquanto é reproduzível e viável na célula hospedeira.

A célula hospedeira pode ser qualquer das células hospedeiras familiares para aqueles versados na técnica, incluindo células procarióticas, células eucarióticas, células de mamíferos, células de insetos, ou células de plantas. Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, podem ser mencionados: células bactericidas, tal como E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias espécies com Pseudomonas genera, Streptomyces, e Staphylococcus, células fúngicas, tal como levedura, células de insetos tal como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, células de animais tal como CHO, COS ou melanoma de intestinos, e adenovírus. A seleção de um hospedeiro apropriado está dentro da capacidade daqueles versados na técnica.

O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras empregando qualquer uma das variedades de técnicas, incluindo transformação, transfecção, transdução, infecção viral, pistolas de gene, ou transferência de gene mediada por Ti. Os métodos particulares incluem transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por Dextrano-DEAE, lipofecção ou eletroporação (Davis, L., Dibner. M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, 1986)).

Onde apropriado, as células hospedeiras engenheiradas podem ser cultivadas em veículo de nutriente convencional modificado como apropriado para promotores de ativação, transformantes de seleção ou amplificação de genes da invenção. Seguindo a transformação de uma cepa hospedeira adequada e crescimento das cepas hospedeiras para uma densidade de célula apropriada, o promotor selecionado pode ser induzido por modos apropriados (por exemplo, mudanças de temperatura ou indução química) e as células podem ser cultivadas durante um período adicional para permiti-los produzir o polipeptídeos desejado ou fragmento deste.

As células são colhidas tipicamente por centrifugação, quebradas por modos químicos ou físicos, e o extrato bruto resultante é retido durante ainda a purificação. As células microbiais empregadas para expressão de proteínas podem ser quebradas por qualquer método conveniente, incluindo ciclo de congelamento-descongelamento, sonicação, quebra mecânica ou uso de agente de lise de células. Tais métodos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. O polipeptídeo expressado ou fragmento deste pode ser recuperado e purificado de culturas de células recombinantes por métodos incluindo sulfato de amônio ou precipitação em etanol, extração de ácido, cromatografia de permuta de cátion ou ânion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por afinidade, cromatografia por hidroxilapatita, e cromatografia por lecitina. As etapas de redobramento de proteínas podem ser empregadas, quando necessárias, completando-se a configuração do polipeptídeo. Se desejado, a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser empregada durante as etapas de purificação final.

Vários sistemas de cultura de células de mamíferos podem também ser empregados para expressar proteína recombinante. Os exemplos de sistemas de expressão de mamíferos incluem a linhagem de COS-7 de fibroblastos de rim de macacos (descritos por Gluzman, Cell, 23:175, 1981), e outras linhagens de células capazes de expressar proteínas de um vetor compatível, tal como as linhagens de células C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK.

Os constructos em células hospedeiras podem ser empregados

de uma maneira convencional para produzir o produto de gene codificado pela seqüência recombinante. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos produzidos pelas células hospedeiras contendo o vetor podem ser glicosilados ou podem ser não-glicosilados. Os polipeptídeos da invenção podem ou não pode também incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial.

Alternativamente, os polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idêntica a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes podem ser produzidos sinteticamente por síntese de peptídeo convencional. Em outras modalidades, os fragmentos ou porções dos polipeptídeos podem ser empregados para produzir o polipeptídeo de extensão total correspondente por síntese de peptídeo; destes, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para produção de polipeptídeos de extensão total.

Os sistemas de translação livre de células podem ser empregados para produzir um dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes empregando mRNAs transcritos de um constructo de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado a um ácido nucléico codificando o polipeptídeo ou fragmentos destes. Em algumas modalidades, o constructo de DNA pode ser linearizado antes de conduzir uma reação de transcrição in vitro. O mRNA transcrito é então incubado com um extrato de translação livre de célula apropriado, tal como um extrato reticulócito de coelho, para produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.

A invenção também refere-se a variantes dos polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes. O termo variante inclui derivados ou análogos desses polipeptídeos.

Em particular, as variantes podem diferir na seqüência de aminoácidos de poliepptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, por uma ou mais substituições, adições, anulações, fusões e truncações, que podem estar presentes em qualquer combinação.

As variantes pode ser de ocorrência natural ou criadas in vitro. Em particular, tais variantes podem ser criadas empregando técnicas de engenharia genética tal como mutagênese direcionada por sítio, mutagênese de química aleatória, procedimentos de anulação de Exonuclease III, e técnicas de clonagem padrão. Alternativamente, tais variantes, fragmentos, análogos, ou derivados podem ser criados empregando síntese química ou procedimentos de modificação.

Outros métodos de preparação de variantes são também familiares para aqueles versados na técnica. Esses procedimentos incluem nos quais as seqüências de ácidos nucléicos obtidos de isolados naturais são modificadas para gerar ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos tendo características que realçam seu valor em aplicações de laboratório e industriais. Em tais procedimentos, um número amplo de seqüência de variantes tendo um ou mais nucleotídeos diferentes com respeito à seqüência obtida dos isolados naturais são gerados e caracterizados. Tipicamente, esses nucleotídeos diferentes resultam em mudanças de aminoácidos com respeito á polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos do isolados naturais.

Por exemplo, as variantes podem ser criadas empregando PCR propensa a erros. Em PCR propensa a erros, a PCR é desempenhada sob condições onde a fidelidade da cópia da polimerase de DNA é curta, tal que uma taxa elevada de ponto de mutação é obtida junto com a extensão completa do produto PCR. PCR propensa a erro é descrita em Leung, D.W. e outros, Technique, 1: 11-15, (1989) e Caldwell, R.C. & Joyce G.F., PCR

Methods Applic., 2:28-33, 1992, a divulgação dos quais está incorporada aqui por referência em sua totalidade. Brevemente, em tais procedimentos, os ácidos nucléicos para serem mutagenizados são misturados com inicia69 dores PCR, tampão de reação, MgCI2, MnCI2, polimerase Taq e uma concentração apropriada de dNTPs para alcançar uma taxa elevada no ponto de mutação junto com a extensão completa do produto PCR. Por exemplo, a reação pode ser realizada empregando 20 moles de ácido nucléico para serem mutageinizados, 30pmol de cada iniciador PCR, um tampão de reação compreendendo 50mM de KCI, 10mM de Tris de HCl (pH8,3) e 0,01% de gelatina, 7mM de MgCI2, 0,5mM de MnCI2, 5 unidades de polimerase Taq, 0,2mM de dGTP, 0,2mM de dATP, 1mM de dCTP, e 1mM de dTTP. PCR pode ser realizada durante 30 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 45°C durante 1 minuto, 72°C durante 1 minuto. Entretanto, será apreciado que esses parâmetros podem ser variados como apropriados. Os ácidos nucléicos mutagenizados são clonados em um vetor apropriados e as atividades dos polipeptideos codificados pelos ácidos nucléicos mutagenizados são avaliadas.

As variantes podem também ser criadas empregando mutagênese direcionada a oligo nucleotideos para gerar mutações de sítio específicas em qualquer DNA clonado de interesse. A mutagênese de oligonucleotídeos é descrita em Reidhaar-olson, J.F. O Sauer, R. T. e outros, Science, 241-53-57, 1988, a divulgação dos quais está incorporada aqui por referência em sua totalidade. Brevemente, em tais procedimentos uma pluralidade dos oligonucleotídeos de filamentos duplos portando uma ou mais mutações para serem introduzidas no DNA clonado são sintetizados e inseridos no DNA clonado para serem mutagenizado. Os clones contendo o DNA mutagenizados são recuperados e as atividades dos polipeptideos de sua codificação são avaliadas.

Outro método para gerar variantes é agrupamento PCR. O agrupamento PCR envolve o agrupamento de um produto PCR de uma mistura de pequenos fragmentos de DNA. Um número amplo de reações PCR diferentes ocorre em paralelo no mesmo frasco, com os produtos de uma reação afetando os produtos de outra reação. O agrupamento PCR é descrito em Patente dos U.S. Njj 5.965.408, depositada em 9 de julho de 1996, intitulada, Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis, a divulgação da qual está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Ainda outro método de gerar variantes é mutagênese PCR sexual. Em mutagênese PCR sexual, a recombinação homologa forçada ocorre entre moléculas de DNA de diferentes porém sequências de DNA altamente relacionadas in vitro, como um resultado da fragmentação aleatória da molécula de DNA com base na seqüência homóloga, seguida pela fixação da passagem da extensão do iniciador em uma reação PCR. A mutagênese PCR sexual é descrita em Stemmer, W. P. PNAS, USA, 91:1074710751, 1994, a divulgação do qual está incorporada aqui por referência. Brevemente, em tais procedimentos uma pluralidade de ácidos nucléicos serem recombinados são digeridos com DNAse para gerar fragmentos tendo um tamanho médio de 50-200 nucleotídeos. Os fragmentos do tamanho médio desejado são purificados e re-suspensos em uma mistura PCR. PCR é conduzida sob condições que facilitam a recombinação entre os fragmentos de ácido nucléico. Por exemplo, PCR pode ser realizada por re-suspensão dos fragmentos purificados em uma concentração de 10-30ng/:1 em uma solução de 0,2mM de cada dNTP, 2,2mM de MgCI₂₎ 50mM de KCI, 10mM de Tris HCI, pH 9,0, e 0,1% de Triton X-100. 2,5 unidades de polimerase Taq por 100:1 de mistura de reação são adicionadas e PCR é realizada empregando o seguinte regime: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50-55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30-45 vezes) e 72°C durante 5 minutos. Entretanto, será apreciado que esses parâmetros possam ser variados quando apropriado. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos podem ser incluídos nas reações PCR. Em outras modalidades, o fragmento Klenow de polimerase DNA I pode ser empregado em uma primeira série de reações PCR e polimerase Taq pode ser empregada em uma série subseqüente de reações PCR. As seqüências recombinantes são isoladas e as atividades dos polipeptideos de sua codificação são avaliadas.

As variantes podem também ser criadas por mutagênese in vivo. Em algumas modalidades, mutações aleatórias em uma seqüência de interesse são geradas propagando-se a seqüência de interesse em uma cepa de bactéria, tal como uma cepa de E.coli, que carrega as mutações em uma ou mais das passagens de reparo de DNA. Tais cepas mutadoras têm uma mutação aleatória mais elevada do que aquelas de um parente do tipo selvagem. Propagar o DNA em uma dessas cepas eventualmente gerará mutações aleatórias no DNA. As cepas mutadoras adequadas para uso durante mutagênese in vivo são descritas em publicação PCT N⁹ WO 91/16427, publicada em 31 de outubro de 1991, intitulada Methods for Phenotype Creation from Multiple Gene Populations a divulgação das qual está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

As variantes podem também ser geradas empregando mutagênese cassete. Na mutagênese cassete uma pequena região de uma molécula de DNA de filamento duplo é substituída com um cassete de oligonucleotídeo sintético que difere da seqüência nativa. O oiigonucleotídeo freqüentemente contém seqüência nativa aleatória completamente e/ou parcialmente.

A mutagênese do conjunto recursivo pode também ser empregada para gerar variantes. A mutagênese de conjunto recursivo é um algoritmo para projetar proteínas (mutagênese de proteína) desenvolvido para produzir populações diversas de mutantes fenotipicamente relacionados àqueles membros que diferem na seqüência de aminoácidos. Este método usa um mecanismo de realimentação para cargas sucessivas de controle de mutagênese cassete combinatória. A mutagênese de conjunto recursivo é descrita emArkin, A.P. e Youvan, D. C., PNAS, USA, 89:7811-7815, 1992, a divulgação dos quais está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Em algumas modalidades, as variantes são criadas empregando mutagênese de conjunto exponencial. A mutagênese de conjunto exponencial é um processo para gerar bibliotecas combinatórias com um percentual elevado de mutantes funcionais e únicos, onde pequenos grupos de resíduos são colocados aleatoriamente em paralelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos que induzem à proteínas funcionais. A mutagênese de conjunto exponencial é descrita em Delegrave, S., e Youvan, D. C.

Biotechnology Research, 11:1548-1552, 1993, a divulgação dos quais está incorporada aqui por referência em sua totalidade. Mutagênese de sítio direcionado e aleatória são descritas em Arnold, F. H., Current Opinion in Biotechnology, 4:450-455, 1993, a divulgação do qual está incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Em algumas modalidades, as variantes são criadas empregando procedimentos de mistura onde as porções de uma pluralidade de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos distintos são fundidas juntas para produzir seqüências de ácidos nucléicos quiméricos que codificam polipeptídeos quiméricos como descrito em Patente U.S. N⁹ 5.965.408, depositada em 9 de julho de 1996, intitulada, Method of DNA Reassembly by Interrupting Synthesis, e Patente U.S. N⁹ 5.939.250, depositada em 22 de maio de 1996, intitulada, Production of Enzymes Having Desired Activities by Mutagenesis, ambas das quais estão incorporadas aqui por referência.

As variantes dos polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B podem ser variantes nas quais um ou mais resíduos de aminoácidos dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido de Grupo B são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não-conservado (preferivelmente um resíduo de aminoácido conservado) e tais resíduos de aminoácidos substituídos podem ou não podem ser um codificado pelo código genético.

As substituições conservativas são aquelas que substituem um determinado aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido de outras características. Tipicamente vistas como substituições conservativas são as seguintes substituições: substituições de um aminoácido alifático tal como alanina, valina, leucina, e isoleucina por outro aminoácido alifático; substituição de uma serina por uma treonina ou vice-versa; substituição de um resíduo acídico tal como ácido aspártico e ácido glutâmico por outro resíduo acídido, substituição de um resíduo portando um grupo amida, tal como asparagina e glutamina, por outro resíduo portanto um grupo amida; permuta de um resíduo básico tal como lisina e arginina por outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático tal como fenilalanina, tirosi-

na, por outro resíduo aromático.

Outras variantes são aquelas em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos dos polipeptideos das seqüências de aminoácidos do Grupo B incluem um grupo substituinte.

Ainda outras variantes são aquelas em que o polipeptídeo é associado com outro composto, tal como um composto para aumentar a meiavida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol).

As variantes adicionais são aquelas em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo, tal como seqüência líder, uma seqüência secretora, uma seqüência de pró-proteína ou uma seqüência que facilita a purificação, enriquecimento, ou estabilização do polipeptídeo.

Em algumas modalidades, os fragmentos, derivados e análogos retêm as mesmas funções biológicas ou atividades como os polipeptideos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes. Em outras modalidades, o fragmento, derivado, ou análogos incluem uma pró-proteína, tal que o fragmento, derivado, ou análogo possa ser ativado por clivagem da porção de pró-proteína para produzir um polipeptídeo ativo.

Outro aspecto da invenção são polipeptideos ou fragmentos destes que têm pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou mais do que cerca de 95% de homologia para um dos polipeptideos das seqüências de aminoácidos do grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes, ou um fragmento compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes. A homologia pode ser determinada empregando qualquer dos programas descritos acima que alinhe os polipeptideos ou fragmentos sendo comparados e determina a extensão da identidade do aminoácido ou similaridade entre eles. Será apreciado que a homologia do aminoácido inclui substituições de aminoácidos conservativos tal como aqueles descritos acima.

Os polipeptídeos ou fragmentos tendo homologia de um dos polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes, ou um fragmento compreendendo pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes podem ser obtidos isolando-se os ácidos nucléicos codificando-os empregando as técnicas descritas acima.

Alternativamente, os fragmentos ou polipeptídeos homólogos podem ser obtidos através de enriquecimento bioquímico ou procedimentos de purificação. A seqüência dos polipeptídeos potencialmente homólogos ou fragmentos pode ser determinada por digestão proteolítica , eletroforese por gel e/ou microssequenciamento. A seqüência dos fragmentos ou polipeptídeos homólogos prospectivos pode ser comparada a um dos polipeptídeos das seqüências do aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes, ou um fragmento compreendendo pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes empregando quaisquer dos programas descritos acima.

Outro aspecto da invenção é um ensaio para identificar fragmentos ou variantes das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes, que retêm a função enzimática dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes. Por exemplo, os fragmentos ou variantes dos referidos polipeptídeos, podem ser empregados para catalisar reações bioquímicas que indicam que os fragmentos ou variantes retêm a atividade enzimática dos polipeptídeos nas seqüências de aminoácidos do Grupo B.

O ensaio para determinar se os fragmentos de variantes retêm a atividade enzimática dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes incluem as etapas de: contatar o fragmento de polipeptideo ou variante com uma molécula de substrato sob condições que permitem o fragmento de polipeptideo ou variante funcionar, e detectar ou aumento no nível do substrato ou uma redução no nível do produto de reação específico da reação entre o polipeptideo e substrato.

Os polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes podem ser empregados em uma variedade de aplicações. Por exemplo, os polipeptídeos ou fragmentos destes podem ser empregados para catalisar reações bioquímicas. De acordo com um aspecto da invenção, existe um processo para utilizar os polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes ou polinucleotídeos codificando tais polipeptídeos para ligações glicosídicas hidrolisadas. Em tais procedimentos, uma substância contendo uma ligação glicosídica (por exemplo, amido) é contatada com um dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido do Grupo B, ou seqüências substancialmente idênticas destes sob condições que facilitam a hidrólise da ligação glicosídica.

Os polipeptídeos de seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes, podem também ser empregados na liquefação e sacarificação do amido. Empregando os polipeptídeos ou fragmentos destes desta invenção, a liquefação pode ser realizada em um pH menor do que com prévias enzimas. Em uma modalidade, a liquefação é realizada em um pH de 4,5. Adicionalmente, os polipeptídeos ou fragmentos destes desta invenção são cálcio menos dependente do que enzimas previamente empregadas nesses processos. Na liquefação as amilases são empregadas para hidrolisar o amido. Em uma modalidade preferida, os polipeptídeos ou fragmentos destes desta invenção são termoestáveis em 90-95°C.

Os polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes, podem também ser empregados para gerar anticorpos que aglutinam especificadamente aos polipeptídeos ou fragmentos. Os anticorpos resultantes podem ser empregados em procedimentos de

cromatografia de imunoafinidade para isolar ou purificar o polipeptídeo ou para determinar se o polipeptídeo está presente em uma amostra biológica. Em tais procedimentos, uma preparação de proteína, tal como um extrato, ou uma amostra biológica é contatada com um anticorpo capaz de aglutinar especificadamente a um dos polipeptídeos das seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes.

Em procedimentos de imunoafinidade, o anticorpo está ligado a um suporte sólido, tal como uma conta ou outra matriz de coluna. A preparação da proteína é colocada em contato com o anticorpo sob as condições em que o anticorpo aglutina especificadamente a um dos polipeptídeos de seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes, ou fragmentos destes. Após a lavagem para remover proteínas de ligação não-especificadamente, os polipeptídeos especificadamente ligados são eluídos.

A capacidade das proteínas em uma amostra biológica aglutinar ao anticorpo pode ser determinada empregando qualquer de uma variedade dos procedimentos familiares para aqueles versados na técnica. Por exemplo, a aglutinação pode ser determinada rotulando-se o anticorpo com um rótulo detectável tal como um agente fluorescente, um rótulo enzimático, ou um radioisótopo. Alternativamente, a aglutinação do anticorpo na amostra pode ser detectada empregando um anticorpo secundário tendo um tal rótulo detectável. Ensaios particulares incluem ensaios ELISA, ensaios sanduíche, radioimunoensaios, e Western Blots.

Os anticorpos policlonais gerados contra os polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destes, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes podem ser obtidos por injeção direta dos polipeptídeos em um animal ou administrando-se os polipeptídeos a um animal, por exemplo, um não-humano. O anticorpo desse modo obtido então aglutinará o polipeptídeo propriamente dito. Desta maneira, ainda uma seqüência codificando somente um fragmento do polipeptídeo pode ser empregada para gerar anticorpos que podem aglutinar para aqueles polipeptídeos nativos inteiros. Tais anticorpos podem então ser empregados para isolar o polipeptídeo a partir de poli5 peptídeos que expressam células.

Para preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que fornece anticorpos produzidos por cultura de linhagem de células contínua pode ser empregada. Os exemplos incluem a técnica da hibridoma (Kohler e Milstein, Nature, 256:495-497, 1975, a divulgação da qual é incorpo10 rada aqui por referência), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor e outros, Immunology Today 4:72, 1983, a divulgação da qual está incorporada aqui por referência), e a técnica de hibridoma EBV (cole e outros, 1985, em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss. Inc., pp.77-96, a divulgação da qual está incorporada aqui por referência).

As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente U.S. N^Q 4.946.778, a divulgação da qual está incorporada aqui por referência) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única para os polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo

B, e seqüências substancialmente idênticas a estas ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes. Alternativamente, os camundongos transgênicos podem ser empregados para expressar anticorpos humanizados para esses polipeptídeos ou fragmentos destes.

Anticorpos gerados contra os polipeptídeos das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos destes podem ser empregados na peneiração para polipeptídeos similares de outros organismos e amos30 tras. Em tais técnicas, os polipeptídeos do organismo são contactados com o anticorpo e aqueles polipeptídeos que especificadamente aglutinam o anticorpo são detectados. Qualquer dos procedimentos descritos acima pode

ser empregado para detectar a aglutinação do anticorpo. Um tal ensaio de peneiração é descrito em Methods for Measuring Cellulase Activities, Methods in Enzymology, Volume 160, pp. 87-116, que está aqui incorporado por referência.

Como empregado aqui o termo seqüência de ácido nucléico como apresentada em SEQ ID N2!: 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65,

67, 69, 71	I, 73,	75,	77, 7I	3, 81,	83, 85, 87, 89, 91,	93, 9	5, 97, 99,	101,	103,
105,	107,	109,	111,	113,	115,	117, 119, 121, 123,	125,	127, 129,	131,	133,
135,	137,	139,	141,	143,	145,	147, 149, 151, 153,	155,	157, 159,	161,	163,
165,	167,	169,	171,	173,	175,	177, 179, 181, 183,	185,	187, 189,	191,	193,
195,	197,	199,	201,	203,	205,	207, 209, 211, 213,	215,	217, 219,	221,	223,
225,	227,	229,	231,	233,	235,	237, 239, 241, 243,	245,	247, 249,	251,	253,
255,	257,	259,	261,	263,	265,	267, 269, 271, 273,	275,	277, 279,	281,	283,
285,	287,	289,	291,	293,	295,:	297, 299 abrange a	s seq	üências de nuci	leotí-

deo de seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e as seqüêncías substancialmente idênticas a estas, bem como as seqüências homólogas para seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e fragmentos destas e seqüências complementares para todas as seqüências precedentes. Os fragmentos incluem porções de SEQ ID l\T: 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81,83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135,

137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165,

167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195,

197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225,

227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255,

257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285,

287, 289, 291,293, 295, 297 e 299, compreendendo pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos consecutivos das seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas destas. A seqüência homóloga e fragmentos das se-

qüências do ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas destas, referem-se a uma seqüência tendo pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, ou 50% homólogos dessas seqüências. A homologia pode ser determinada empregando qualquer dos programas de computador e parâmetros descritos aqui, incluindo 3,0t78 de versão FASTA com os parâmetros característicos. A seqüência homóloga pode incluir seqüências de RNA em que as uridinas substituiem as timinas nas seqüências de ácido nucléico como apresentadas nas seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A. A seqüência homóloga pode ser obtida empregando qualquer dos procedimentos descritos aqui ou pode resultar da correção de erro de seqüência. Será apreciado que a seqüência de ácido nucléico como apresentada na seqüência de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, pode ser representada no formato de caráter único tradicional (Observe o revestimento dianteiro interno de Stryer, Lubert. Biochemistry, 3^a edição, W. H. Freeman & Co., New York) ou em qualquer outro formato que registre a identidade do nucleotídeo em uma seqüência.

Como empregado aqui o termo uma seqüência de polipeptídeo como apresentada em SEQ ID NX 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134,

136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164,

166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194,

196, 198, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226,

228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256,

258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286,

288, 290, 292, 294, 296, 298 abrange a seqüência de polipeptídeo das seqüências de aminoácidos do Grupo B, e as seqüências substancialmente idênticas a estas, que são codificadas por uma seqüência como apresentada em SEQ ID N^: 2, 4, 6, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76,

78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142,

144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172,

174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 202, 204,

206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234,

236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264,

266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294,

296, 298, seqüências de polipeptídeo homólogas aos polipeptídeos da seqüência de aminoácido do Grupo B, e as seqüências substancialmente idênticas a estas, ou fragmentos de qualquer das seqüências precedentes. As seqüências de polipeptídeos homólogas referem-se a uma seqüência de polipeptídeo tendo pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% ou 50% homólogo .para uma das seqüências de polipeptídeos da seqüência de aminoácidos do Grupo B. A homologia pode ser determinada empregando qualquer dos programas de computadores e parâmetros descritos aqui, incluindo 3,0t78 de versão FASTA com os parâmetros característicos ou com qualquer parâmetro modificado. A seqüência homóloga pode ser obtida empregando qualquer dos procedimentos descritos aqui ou qualquer resultado da correção de erro de seqüência. Os fragmentos de polipeptídeos compreendem pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 aminoácidos consecutivos dos polipeptídeos da seqüência de aminoácidos do Grupo B, e as seqüências substancialmente idênticas destes. Será apreciado que os polipeptídeos codificados como apresentados na seqüência de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estes, podem ser representados no formato de caráter único tradicional ou formato de três letras (Observe o revestimento dianteiro interno de Stryer, Lubert, Biochemistry, 3^a Edição, W. H. Freeman & Co., New York) ou em qualquer outro formato que refere-se à identidade dos polipeptídeos em uma seqüência.

Será apreciado para aqueles versados na técnica que uma seqüência de ácido nucléico como apresentada em SEQ ID N7 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51,

53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91,

93, 95, 97, 99,	101,	103,	105,	107, 109,	111,	113,	115, 117,	119,	121,	123,
125,	127,	129,	131,	133,	135,	137, 139,	141,	143,	145, 147,	149,	151,	153,
155,	157,	159,	161,	163,	165,	167, 169,	171,	173,	175, 177,	179,	181,	183,
185,	187,	189,	191,	193,	195,	197, 199,	201,	203,	205, 207,	209,	211,	213,
215,	217,	219,	221,	223,	225,	227, 229,	231,	233,	235, 237,	239,	241,	243,
245,	247,	249,	251,	253,	255,	257, 259,	261,	263,	265, 267,	269,	271,	273,
275,	277,	279,	281,	283,	285,	287, 289,	291,	293,	295, 297,	299 .	e um;	a se-

qüência de polipeptídeo como apresentada em SEQ ID Nfj 2, 4, 6, 10, 12,

14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 42, 44, 46, 48, 50, 52,

54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 80, 92,

94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 12, 124,

126,	128,	130,	132,	134,	136,	138, 140,	142,	144, 146,	148,	150, 152,	154,
156,	158,	160,	162,	164,	166,	168, 170,	172,	174, 176,	178,	180, 182,	184,
186,	188,	190,	192,	194,	196,	198, 202,	204,	206, 208,	210,	212, 214,	216,
218,	220,	222,	224,	226,	228,	230, 232,	234,	236, 238,	240,	242, 244,	246,
248,	250,	252,	254,	256,	258,	260, 262,	264,	266, 268,	270,	272, 274,	276,
278,	280,	282,	284,	286,	288,	290, 292,	294,	, 296, 298	podem ser armaze-

nadas, registradas, e preparadas por qualquer meio que pode ser lido e acessado por um computador. Como empregado aqui, as palavras registrado e armazenado refere-se a um processo para informação de armazenagem em um meio de computador. Um técnico versado pode adotar facilmente qualquer dos métodos atualmente conhecidos para registrar a informação em um meio legível por computador para gerar preparações compreendendo uma ou mais seqüências de ácidos nucléicos como apresentadas em seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, uma ou mais seqüências de polipeptídeos como apresentadas nas seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destas. Outro aspecto da invenção é um meio legível por computador tendo registrado neste pelo menos 2, 5, 10, 15, ou 20 seqüências de ácidos nucléicos como apresentadas nas seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas destas.

Outro aspecto da invenção é um meio legível por computador tendo registrado nele uma ou mais das seqüências de ácido nucléico como apresentadas nas seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas destas. Outro aspecto da invenção é um meio legível por computador tendo registrado neste uma ou mais das seqüências de polipeptídeos como apresentadas nas seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas nestas. Outro aspecto da invenção é um meio legível por computador tendo registrado nestes pelo menos 2, 5, 10, 15, ou 20 das seqüências como apresentadas acima.

O meio legível por computador inclui meio legível magneticamente, meio de leitura óptica, meio de leitura eletrônica e meio magnético óptico. Por exemplo, o meio legível por computador pode ser um disco rígido, um disco mole, uma fita magnética, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD), Memória de Acesso Aleatória (RAM), ou Memória Somente para Leitura (ROM) bem como outros tipos de meios conhecidos para aqueles versados na técnica.

As modalidades da invenção incluem sistemas (por exemplo sistemas com base na internet), particularmente sistemas de computador que armazenam e manipulam a seqüência de informação descrita aqui. Um exemplo de um sistema de computador 100 é ilustrado na forma de diagramas de blocos na Figura 1. Como empregado aqui, um sistema de computador refere-se aos componentes hardware, componentes software, e componentes de armazenamento de dados empregados para analisar uma seqüência de nucleotídeo de uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas nestas, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácidos do Grupo Β. O sistema de computador 100 tipicamente inclui um processador para processar, acessar e manipular a seqüência de dados. O processador 105 pode ser qualquer tipo bem-conhecido de unidade de processamento central, tal como, por

exemplo, o Pentium III da Intel Corporation, ou processador similar do Sun, Motorola, Compaq, AMD ou International Business Machines.

Tipicamente o sistema de computador 100 é um sistema de propósito geral que compreende o processador 105 e um ou mais componentes de armazenamento de dados internos 110 para armazenamento de dados, e um ou mais dispositivos de correção de dados para corrigir os dados armazenados nos componentes de armazenamento de dados. Um técnico versado na técnica pode facilmente apreciar que qualquer um dos sistemas de computadores correntemente disponíveis é adequado.

Em uma modalidade particular, o sistema de computador 100 inclui um processador 105 conectado a um barramento que está conectado a uma memória principal 115 (preferivelmente implementado como RAM) e um ou mais dispositivos de armazenamento de dados internos 110, tal como um disco rígido e/ou outro meio legível por computador tendo registrado os dados nestes. Em algumas modalidades, o sistema de computador 100 ainda inclui um ou mais dispositivos de correção de dados 118 para ler os dados armazenados nos dispositivos de armazenamento de dados internos 110.

O dispositivo de correção de dados 118 pode representar, por exemplo, um drive de disco mole, um drive de disco compacto, um drive de fita magnética, ou um modem capaz da conexão de um sistema de armazenamento de dados à distância (por exemplo através da internet)etc. Em algumas modalidades, o dispositivo de armazenamento de dados internos 110 é um meio legível por computador removível tal como um disco macio, um disco compacto, uma fita magnética, etc contendo a lógica de controle e/ou os dados registrados destes. O sistema de computador 100 pode vantajosamente incluir ou ser programado pelo software apropriado para ler a lógica do controle e/ou os dados dos componentes de armazenamento de dados uma vez inseridos no dispositivo de correção de dados.

O sistema de computador 100 inclui um monitor 120 que é empregado para exibir o rendimento para um usuário do computador. Deveria também ser notado que o sistema de computador 100 pode ser ligado a ou84 tros sistemas de computador 125a-c em uma rede ou rede de área ampla para fornecèr acesso centralizado ao sistema de computador 100.

Software para acessar e processar as seqüências de nucleotídeo de uma seqüência de ácidos nucléicos como apresentadas nas seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas destas, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de amino ácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas nestas, (tal como ferramentas de busca, ferramentas de comparação, e ferramentas de modelação, etc) pode residir na execução durante a memória principal 115.

Em algumas modalidades, o sistema de computador 100 pode ainda compreender um algoritmo de comparação de seqüência para comparar uma seqüência de ácido nucléico como apresentada em seqüências de ácidos nucléicos do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas destas, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácidos do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas destas, armazenados em um meio legível por computador para uma seqüência de nucleotídeo ou polinucleotídeo armazenadas em um meio legível por computador. Um algoritmo de comparação de seqüência refere-se a um ou mais programas que são implementados (localmente ou remotamente) no sistema de computador 100 para comparar uma seqüência de nucleotídeo com outras seqüências de nucleotídeos e/ou compostos armazenados em um dispositivo de armazenamento de dados. Por exemplo, o algoritmo de comparação de seqüência pode comparar as seqüências de nucleotídeos de uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas destas, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácidos no Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas nestas, armazenadas em meio legível por computador para armazenar as seqüências de referências de um meio legível por computador para identificar homologias ou motivos estruturais. Vários programas de comparação de seqüência identificados em outro lugar neste relatório descritivo de patente são particularmente contemplados para uso neste aspecto da invenção. As homologias de seqüência de ácido nucléico e/ou proteína podem ser avaliadas empregando qualquer das variedades de algoritmo de comparação de seqüência e programas conhecidos na técnica. Tais algoritmos e programas incluem, porém não estão limitados a TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, e CLUSTALW (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul e outros J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990; Thompson e outros, Nucleic Acids Res. 22(2): 46734680, 1994; Higgins e outros, Methods Enzymol. 266:383-402, 1996, Altschul e outros, J. Mol. Biol 215(3):403-410, 1990; Altschul e outros, Nature Genetics 3:266-272, 1993).

A homologia ou identidade é freqüentemente medida empregando o software de anáíise de seqüência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wl 53705). Tais seqüências similares de software semelhantes designando-se graus de homologia para várias anulações, substituições e outras modificações. Os termos homologia e identidade no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou seqüências de polipeptídeos, referem-se a duas ou mais seqüências ou sub-seqüências que são as mesmas ou têm um percentual especificado de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos quando comparados e alinhados para correspondência máxima durante uma janela de comparação ou região designada como medida empregando qualquer número de algoritmos de comparação de seqüência ou por alinhamento manual e inspeção visual.

Para comparação de seqüência, tipicamente uma seqüência atua como uma seqüência de referência, àquela seqüência teste quando comparado. Quando empregando um algoritmo de comparação de seqüência, seqüências de referência e teste são registradas em um computador, coordenadas subseqüentes são designadas, se necessário e parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são designados. Os parâmetros de programa característicos podem ser empregados, ou parâmetros alternati86 vos podem ser designados. O algoritmo de comparação de seqüência em seguida calcular o percentual das identidades de seqüência durante as seqüências testes relativas à seqüência de referência, com base nos parâmetros do programa.

Uma janela de comparação, como empregado aqui, inclui referência para um segmento de qualquer um dos números de posições contíguas selecionadas a partir do grupo consistindo em 20 a 600, freqüentemente cerca de 50 a cerca de 200, mais freqüentemente cerca de 100 a cerca de 150 na qual uma seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem otimamente alinhadas. Os métodos de alinhamento da seqüência para comparação são bem-conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math.

2:482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento da homologia de Needleman &

Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970; pela pesquisa da similaridade do método de person & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2444, 1988, por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA na Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer

Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por alinhamento manual e inspeção visual. Outros algoritmos para determinar a homologia ou a identidade incluém, por exemplo, além de um programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence

Alignmemt), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (Blocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, Smith-Waterman algorithm, DARWIN, Las Vegas algorithm, FNAT (Forced

Nucleotide Alignment Tool), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fristensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Construction Q Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program),

GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, ΡΙΜΑ, (Pattern-lnduced Multisequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) e WHAT-IF. Tais programas de alinhamento podem ser empregados para rede de banco de dados de genoma para identificar seqüências de polinucleotídeos tendo seqüências substancialmente idênticas. Vários bancos de dados de genoma são disponíveis, por exemplo, uma porção substancial para o genoma humano é disponível como parte do Projeto de seqüenciamento do Genoma Humano(J.Roach, http://weber.u.Washington.edu/-roach/human_genome_progress 2.html) (Gibbs, 1995). Pelo menos vinte e um outros genomas têm anteriormente sido seqüenciados, incluindo por exemplo, M. genitalium (Fraser e outros, 1995), M. jannaschii (Bult e outros, 1996), H. influenzae (Fleischmann e outros, 1995), E. coli (Blattner e outros, 1997), e levedura (S. cerevisiae) (Mewes e outros, 1997), e D.melanogaster (Adams e outros, 2000). O Progresso significante tem também sido feito no seqüenciamento de genomas de organismo de modelo, tal como camundongos, C. elegans, e Arabadopsis sp. Vários bancos de dados contendo informação genômica anotada com algumas informações funcionais são mantidos por diferentes organizações, e são acessíveis através da internet, por exemplo, http://wwwtigr.org/tdb; http://www.genetics.wisc.edu.; http://genome-www.stanford.edu/~ball;

http://hiv-web.lanl.gov; http://www.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.uk; http://Pasteur.fr/other/biology; and http://www.genome.wi.mit.edu.

Um exemplo de um algoritmo útil são algoritmo BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul e outros, Nuc. Acids Res.25:3389-3402, 1977, e Altschull e outros, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 respectivamente. Software para desempenhar análise BLAST é publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)· Este algoritmo envolve primeiro identificar os pares de seqüência de marca elevada (HSPs) identificando-se palavras pequenas de W extensão na seqüência da pergunta, que ou iguala ou satisfaz alguns valores positivos com algumas marcas T quando alinhadas com uma palavra da mesma extensão em uma seqüência de banco de dados. T é re. ferido como o princípio da marca da palavra adjacente (Altschul e outros, supra). Essas pequenas expressões contíguas iniciais atuam como sementes para pesquisas de iniciação HSPs por mais tempo encontrada contendoas. As comparações das expressões contíguas iniciais são estendidas em ambas direções junto com cada seqüência durante até que a marca de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As marcas cumulativas são calculadas, empregando, para seqüências de nucleotídeos, os parâmetros M (marca prêmio para um par de resíduos semelhantes; sempre >0). Para as seqüências de aminoácidos, uma matriz de marca é empregada para calcular a marca cumulativa. A extensão das expressões contíguas em cada direção é detida quando: a queda da marca de. alinhamento cumulativo pela quantidade X de seu valor máximo alcançado, a marca cumulativa parte de zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de marcas negativas; ou o fim ou a seqüência é reagida. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüência de nucleotídeos) emprega como características uma longa extensão (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M= 5, N= -4 e uma comparação de ambos filamentos. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como característica uma longa extensão de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de marcação BLOSUM62 (observe Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915, 1989) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M= 5, N -4, e uma comparação de ambos filamentos.

O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências (observe, por exemplo Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873, 1993). Uma medida da similaridade fornecida por algoritmo BLAST é a probabilidade da soma ser menor (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma conbinação entre dois nucleotídeos ou seqüência de aminoácidos ocorrería por alteração. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado similar a uma seqüência de

referência se a probabilidade de soma menor em uma comparação do ácido nucléico teste com o ácido nucléico de referência é menos do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menos do que cerca de 0,01, e mais preferivelmente menos do que cerca de 0,001.

Em uma modalidade, as homologias da seqüência de ácido nucléico e proteína são avaliadas empregando Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Em particular, cinco programas BLAST específicos são empregados para realizar o seguinte teste:

(1) BLASTP e BLAST3 comparam uma seqüência examinada de aminoácido contra um banco de dados da seqüência de proteína;

(2) BLASTN compara uma seqüência examinada de nucleotídeo contra um banco de dados da seqüência de nucleotídeo;

(3) BLASTX compara os produtos.de translação conceituais de seis estruturas de uma seqüência de nucleotídeo examinada (ambos filamentos) contra um banco de dados da seqüência da proteína;

(4) TBLASTN compara uma seqüência de proteína examinada contra um banco de dados da seqüência de nucleotídeo traduzida em todas as seis estruturas de leitura (ambos filamentos); e (5) TBLASTX compara as translações das seis estruturas de uma seqüência examinada de nucleotídeo contra as translações de seis estruturas de um banco de dados da seqüência de nucleotídeo.

O programa BLAST identifica seqüências homólogas por identificação de segmentos similares, que são referidos aqui como pares de segmento de marca elevada, entre uma seqüência de ácido nucléico ou aminoácido examinada e uma seqüência teste que é preferivelmente obtida de um banco de dados da seqüência de ácido nucléico de proteína. Os pares do segmento de marca elevada são preferivelmente identificados (isto é, alinhados) através de uma matriz de marcação, muitos dos quais são conhecidos na técnica. Preferivelmente, a matriz de marcação empregada é a matrix BLOSUM62 (Gonnet e outros, Science 256: 1443-1445, 1992; Henikoff e Henikoff, Proteins, 17:49-61 1993), Menos preferivelmente, as matrizes PAM ou PAM250 podem também ser empregadas (observe, por exemplo, Schwartz e Dayhoff, eds. 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation). Os programas BLAST são acessíveis através da Biblioteca Nacional de Medicina U.S., por exemplo, em www.ncbi.nlm.nih.gov.

Os parâmetros empregados com os algoritmos acima podem ser adaptados dependendo da extensão da seqüência e grau da homologia estudada. Em algumas modalidades, os parâmetros podem ser os parâmetros de omissão empregados pelos algoritmos na ausência de instruções do usuário.

A Figura 2 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo 200 para comparar uma nova seqüência de proteína ou nucleotídeo com um banco de dados das seqüências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova seqüência e as seqüências no banco de dados. O banco de dados das seqüências pode ser um banco de dados privado armazenado em um sistema de computador 100, ou um banco de dados público tal como GENBANK que está disponível na Internet.

O processo 200 inicia em um estado inicial 201 e então move-se para um estado 202 onde a nova seqüência a ser comparada é armazenada em uma memória em um sistema de computador 100. Como discutido acima, a memória pode ser qualquer tipo de memória, incluindo RAM ou um dispositivo de armazenamento interno.

O processo 200 então se move para o estado 204 onde o banco de dados das seqüências é aberto para análise e comparação. O processo 200 então se move para um estado 206 onde a primeira seqüência armazenada no banco de dados é lida em uma memória no computador. Uma comparação é então realizada em um estado 210 para determinar se a primeira seqüência é a mesma como a segunda seqüência. É importante observar que esta etapa não está limitada a realizar uma comparação exata entre a nova seqüência e a primeira seqüência no banco de dados. Os métodos bem-conhecidos são conhecidos por aqueles de experiência na técnica para comparar duas seqüências de proteína ou nucleotídeo, mesmo se elas não

são idênticas. Por exemplo, as aberturas podem ser introduzidas em uma seqüência a fim de aumentar o nível de homologia entre as duas seqüências testadas. Os parâmetros que controlam ou as aberturas ou outras características que são introduzidas em uma seqüência durante a comparação são normalmente introduzidos pelo usuário do sistema do computador.

Uma vez que uma comparação das duas seqüências tenha sido realizada no estado 210, uma determinação é feita em um estado de decisão 210 se as duas seqüências são as mesmas. Certamente, o termo mesma não está limitado a seqüências que são absolutamente idênticas. As seqüências que estão nos parâmetros de homologia introduzidos pelo usuário serão marcadas como mesmas no processo 200.

Se uma determinação é feita que as duas seqüências são a mesma, o processo 200 se move para um estado 214 onde o nome da seqüência do banco de dados é exibido pelo usuário. Este estado notifica o usuário que a seqüência com o nome exibido executou as restrições de homologia que foram introduzidas. Uma vez que o nome da seqüência armazenada é exibido pelo usuário, o processo 200 se move para um estado de decisão 218 onde uma determinação é feita se a maioria das seqüências existe no banco de dados. Se as seqüências não mais existem no banco de dados, então o processo 200 termina em um estado final 220. Entretanto, se a maioria das seqüências existem no banco de dados, então o processo 200 se move para um estado 224 onde um indicador é movido para a próxima seqüência no banco de dados a fim de que ele possa ser comparado com a nova seqüência. Desse modo, a nova seqüência é alinhada e comparada com todas as seqüências do banco de dados.

Seria observado que se uma determinação foi feita no estado de decisão 212 no qual as seqüências não foram homólogas, então o processo 220 se moveria imediatamente para o estado de decisão 218 a fim de determinar se qualquer outra seqüência estava disponível no banco de dados para comparação.

Conseqüentemente, um aspecto da invenção é um sistema de computador compreendendo um processador, um dispositivo de armazena92 mento de dados tendo armazenado neste uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a esta, um dispositivo de armazenamento de dados tendo recuperavelmente armazenado neste seqüências de nucleotídeo de referência ou seqüências de polipeptídeo a serem comparadas com uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a esta, e um çomparador de seqüência para conduzir a comparação. O çomparador de seqüência pode indicar um nível de homologia entre as seqüências comparadas ou identifica os motivos estruturais no código de ácido nucléico descrito acima das seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a esta, ou pode identificar motivos estruturais nas seqüências que são comparados com esses códigos de ácido nucléico e códigos de polipeptídeo. Em algumas modalidades, o dispositivo de armazenamento de dados pode ter armazenado nele as seqüências de pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 ou mais das seqüências de ácido nucléico como apresentadas nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou as seqüências de polipeptídeo como apresentadas nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas.

Outro aspecto da invenção é um método para determinar o nível de homologia entre uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a esta, e uma seqüência de nucleotídeo de referência. O método inclui ler o código de ácido nucléico ou o código de polipeptideo e a seqüência de polipeptideo ou nucleotídeo de referência através do uso de um programa de computador que determina os níveis de homologia e determinar a homologia entre o código de ácido nucléico ou código de polipeptídeo e a seqüência de polipeptideo ou nucleotídeo de referência com o programa do computador. O programa do computador pode ser qualquer de vários programas de computador para determinar os níveis de homologia, incluindo aqueles especificadamente enumerados aqui, (por exemplo, BLAST2N com o parâmetro de omissão ou com qualquer parâmetro modificado). O método pode ser implementado empregando os sistemas de computador descritos acima. O método pode também ser realizado lendo-se pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 ou mais das seqüências de ácido nucléico descritas acima como apresentadas nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, ou as seqüências de polipeptideo como apresentadas nas seqüências de aminoácido do Grupo B através do uso do programa de computador e determinar a homologia entre os códigos de ácido nucléico ou códigos de polipeptideo e seqüências de nucleotídeo de referência e seqüências de polipeptideo.

Figura 3 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo 250 em um computador para determinar se duas seqüências são homólogas. O processo 250 inicia em um estado inicial 252 e então se move para um estado 254 onde a primeira seqüência a ser comparada é armazenada em uma memória. A segunda seqüência a ser comparada é então armazenada em uma memória em um estado 256. O processo 250 então se move para um estado 260 onde a primeira posição na primeira seqüência é lida e em seguida para um estado 262 onde a primeira posição da segunda seqüência é lida. Deveria ser entendido que se a seqüência é uma seqüência de nucleotídeo, então a posição normalmente seria ou A, T, C, G ou U. Se a seqüência é uma seqüência de proteína, então está preferivelmente no código de aminoácido de letra minúscula a fim de que as primeira e segunda seqüências possam ser facilmente comparadas.

Uma determinação é então feita em um estado de decisão 264 se as duas posições são as mesmas. Se elas são as mesmas então o processo 250 se move para um estado 268 onde as posições próximas nas primeira e segunda seqüências são lidas. Uma determinação é então feita se as posições próximas são as mesmas. Se elas são, então o processo 250 contínua este loop até que as duas posições não sejam mais as mesmas. Se uma determinação é feita de que as duas posições próximas não são as mesmas, o processo 250 se move para um estado de decisão 274 para determinar se existem mais posições ou seqüências a serem lidas.

Se não existe mais posição a ser lida, então o processo 250 se move para um estado 276 onde o nível de homologia entre as primeira e segunda seqüências é exibido pelo usuário. O nível de homologia é determinado calculando-se a proporção de posições entre as seqüências que foram as mesmas da quantidade total de seqüências na primeira seqüência. Desse modo, se todas as posições em uma primeira seqüência de 100 nucleotídeos alinhada com uma das posições em uma segunda seqüência, o nível de homologia seria de 100%.

Alternativamente, o programa de computador pode ser um programa de computador que compara as seqüências de nucleotídeo de uma seqüência de ácido nucléico como apresentadas na invenção, com uma ou mais seqüências de nucleotídeo de referência a fim de determinar se o código do ácido nucléico das seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, difere de uma seqüência de ácido nucléico de referência em uma ou mais posições. Opcionalmente um tal programa registra a extensão e identidade dos nucleotídeos inseridos, anulados ou substituídos com respeito à seqüência ou do polinucleotídeo de referência ou de uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta. Em uma modalidade, o programa de computador pode ser um programa que determina se uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, contêm um único polimorfismo de nucleotídeo (SNP) com respeito a uma seqüência de nucleotídeo de referência.

Conseqüentemente, outro aspecto da invenção é um método para determinar se uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, diferem em um ou mais nucleotídeos de uma seqüência de nucleotídeo de referência compreendendo as etapas de leitura do código de ácido nucléico e as seqüências de nucleotídeo de referência através do uso de um programa de computador que identifica as diferenças entre as seqüências de ácido nucléico e identificar as diferenças entre o código de ácido nucléico e a seqüência de nucleotídeo de referência com o programa de computador. Em algumas modalidades, o programa de computador é um programa que identifica polimorfismos de nucleotídeo únicos. O método pode ser implementado pelos sistemas de computador descritos acima e o método ilustrado na Figura 3. O método pode.também ser realizado lendose pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 ou mais das seqüências de ácido nucléico como apresentadas nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, e a$ seqüências de nucleotídeo de referência através do uso do programa de computador e identificar as diferenças entre os códigos de ácido nucléico e as seqüências de nucleotídeo de referência com o programa de computador.

Em outras modalidades o sistema com base no computador pode ainda compreender um identificador para identificar características em uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a esta.

Um identificador refere-se a um ou mais programas que identifica certas características em uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a esta. Em uma modalidade, o identificador pode compreender um programa que identifica uma estrutura de leitura aberta em uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta.

A figura 5 é um diagrama de fluxo ilustrando uma modalidade de um processo do identificador 300 para detectar a presença de uma característica em uma seqüência. O processo 300 inicia em um estado inicial 302 e então se move para um estado 304 onde a primeira seqüência que será verificada quanto às características está armazenada em uma memória 115 no sistema de computador 100. O processo 300 então se move para um estado 306 onde um banco de dados das características de seqüência é aberto. Um tal banco de dados incluiría uma lista de cada dos atributos da característica junto com o nome da característica. Por exemplo, um nome da característica poderia ser Códon de Iniciação e o atributo seria ATG. Outro exemplo seria o nome da característica Caixa TAATAA e o atributo da característica seria TAATAA. Um exemplo de um tal banco de dados é produzido pela Universidade de Wisconsin Genetics Computer Group (www.gcg.com). Alternativamente, as características podem ser motivos de polipeptídeos estruturais tal como alfa hélices, beta folhas, ou motivos de polipeptídeo funcional tal como sítios ativos enzimáticos, motivos de hélicegiro-hélice ou outros motivos conhecidos por aqueles versados na técnica.

Uma vez que o banco de dados das características é aberto no estado 306, o processo 300 se move para um estado 308 onde a primeira característica é lida no banco de dados. Uma comparação do atributo da primeira característica com a primeira seqüência é então feita em um estado 310. Uma determinação é então feita em um estado de decisão 316 se o atributo da característica foi constatado na primeira seqüência. Se o atributo foi constatado, então o processo 300 se move para um estado 318 onde o nome da característica constatada é exibido pelo usuário.

O processo 300 então se move para um estado de decisão 320 onde uma determinação é feita se as características em movimento existem no banco de dados. Se as características não mais existem, então o processo 300 termina em um estado final 324. Entretanto, se mais características existem no banco de dados, então o processo 300 lê as características pró97 ximas da seqüência em um estado 326 e loops voltam para o estado 310 onde o atributo da próxima característica é comparado com a primeira seqüência.

Seria observado, que se os atributos de características não são constatados na primeira seqüência no estado de decisão 316, o processo 300 se move diretamente para o estado de decisão 320 a fim de determinar se mais características existem no banco de dados.

Conseqüentemente, outro aspecto da invenção é um método para identificar uma característica em uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a esta,, compreendendo ler os códigos de ácido nucléico ou códigos de polipeptídeo através do uso de um programa de computador que identifica as características nesta e identificar as características nos códigos de ácido nucléico com o programa de computador. Em uma modalidade, o programa de computador compreende um programa de computador que identifica estruturas de leitura aberta. O método pode ser realizado por leitura de uma única seqüência ou pelo menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 ou 40 das seqüências de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou as seqüências de polipeptídeo como apresentadas nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, através do uso do programa de computador e identificar as características nos códigos de ácido nucléico ou códigos de polipeptídeo com o programa de computador.

Uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a esta ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a esta, podem ser armazenadas e manipuladas em diversos programas de processador de dados em uma variedade de formatos. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas, podem ser armazenadas como um texto em um campo de processamento de palavras, tal como MicrosoftWORD ou WORDPERFECT ou como um campo ASCII em uma variedade de famílias de programas de banco de dados àqueles versados na técnica, tal como DB2, SYBASE, ou ORACLE. Além disso, muitos bancos de dados e programas de computador podem ser empregados como algoritmos de comparação de seqüência, identificadores, ou fontes de seqüências de nucleotídeo de referência ou seqüências de lipeptídeo a serem comparadas com a seqüência de ácido nucléico como apresentada nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substancialmente idênticas a estas, ou uma seqüência de polipeptídeo como apresentada nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substancialmente idênticas a estas. A seguinte lista é pretendida não limitar a invenção porém fornece orientação para programas e bancos de dados que são úteis com as seqüências de ácido nucléico como apresentadas nas seqüências de ácido nucléico do Grupo A, e seqüências substanci20 almente idênticas a estas, ou as seqüências de polipeptídeos como apresentadas nas seqüências de aminoácido do Grupo B, e seqüências substanciálmente idênticas a estas.

Os programas e bancos de dados que podem ser empregados incluem, porém não estão limitados a: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST e BLAST2 (NCBI), BLASTN e BLASTX (Altschul e outros, J. Mol. Biol, 215: 403, 1990), FASTA (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB (Brutlag e outros Comp. App. Biosci 6:23730 245, 1990), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), CatalySt/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius 2.DBAaccess (Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations

Inc), Discover (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.), QuanteMM, (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulation Inc.), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), Weblab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer ((Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulation Inc.), o banco de dados MDL de Available Chemicals Directory, o banco de dados MDL de Drug Data Report, o banco de dados de Comprehensive Medicinal Chemistry, banco de dados Derwenfs World Drug Index, o banco de dados BioByteMasterFile, o banco de dados Genbank, e o banco de dados Genseqn. Muitos outros programas e banco de dados seriam aparentes àqueles versados na técnica determinada na presente invenção.

Os motivos que podem ser detectados empregando os programas acima incluem zíperes de leucina de codificação de seqüência, motivos de hélice-giro-hélice, sítios de glicosilação, sítios de ubiquitinação, alfa hélices, e beta folhas, peptídeos de sinal codificando seqüência de sinal que conduz a secreção das proteínas codificadas, seqüências implicadas na regulação da transcrição tal como homeoboxes, extensões acídicas, sítios ativos enzimáticos, sítios de aglutinação de substrato, e sítios de divagem enzimática.

A presente invenção explora a única propriedade catalítica das enzimas. Ao mesmo tempo em que o uso de biocatalisadores (isto é, enzimas brutas ou purificadas, células vivas e não-vivas) em transformações químicas normalmente requer a identificação de um biocatalisador que particular reage com um composto de partida específico, a presente invenção usa condições de reação e biocatalisadores selecionados que são específicos de grupos funcionais que estão presentes em muitos compostos de partida, tal como pequenas moléculas. Cada biocatalisador é específico para um grupo funcional, ou vários grupos funcionais relacionados, e pode reagir com muitos compostos de partida contendo este grupo funcional.

100

As reações biocatalíticas produzem uma população de derivados de um único composto de partida. Esses derivados podem ser submetidos a outra rodada de reações biocatalíticas para produzir uma segunda população de compostos derivados. Milhares de variações do composto ou pequena molécula original pode ser produzida com cada iteração de derivatização biocatalítica.

As enzimas reagem em sítios específicos de um composto de partida sem afetar o resto da molécula, um processo que é muito difícil de obter empregando métodos químicos tradicionais. Este grau elevado de especificidade biocatalítica fornece os meios para identificar um único composto ativo na biblioteca. A biblioteca é caracterizada pelas séries de reações biocatalíticas empregadas para produzir, uma então chamada história biossintética. A avaliação da biblioteca quanto às atividades biológicas e traçado da história biossintética identifica a seqüência de reação específica produzindo o composto ativo. A seqüência de reação é repetida e a estrutura do composto sintetizado é determinada. Este modo de identificação, diferente de outras sínteses e métodos de avaliação, não requer tecnologias de imobilização, e compostos podem ser sintetizados e testados livres na solução empregando virtualmente qualquer tipo de ensaio de avaliação. É importante observar, que o grau elevado de especificidade de reações de enzima nos grupos funcionais considera o traçado das reações enzimáticas específicas que compõe a biblioteca biocataliticamente produzida.

Muitas das etapas do procedimento são realizadas empregando automação robótica possibilitando a execução de milhares de reações biocatalíticas e ensaios de avaliação por dia bem como garantindo um nível elevado de exatidão e reproducibilidade. Como um resultado, uma biblioteca de compostos derivados pode ser produzida em uma questão de semanas o que levaria anos para produzir empregando métodos químicos correntes.

Em uma modalidade particular, a invenção fornece um método para modificar pequenas moléculas, compreendendo contatar um polipeptídeo codificado com um polinucleotídeo ou fragmentos enzimaticamente ativos descrito aqui destes com uma pequena molécula para produzir uma

101 molécula pequena modificada. Uma biblioteca de pequenas moléculas modificadas é testada para determinar se uma molécula pequena modificada está presente na biblioteca que exibe uma atividade desejada. Uma reação biocatalítica específica que produz a pequena molécula modificada da atividade desejada é identificada sistematicamente eliminando-se cada das reações biocatalíticas empregadas para produzir uma porção da biblioteca, e então testar as pequenas moléculas produzidas na porção da biblioteca quanto à presença ou ausência das pequenas moléculas modificadas com a atividade desejada. As reações biocatalíticas específicas que produzem a pequena molécula modificada da atividade desejada são opcionalmente repetidas. As reações biocatalíticas são conduzidas com um grupo de biocatalisadores que reage com as porções estruturais distintas encontradas na estrutura de uma pequena molécula, cada biocatalisador é específico para uma porção estrutural ou um grupo de porções estruturais relacionadas; e cada biocatalisador reage com muitas pequenas moléculas diferentes que contêm a porção estrutural distinta.

Em outra modalidade, as novas amilases alcalinas da invenção foram identificadas avaliando-se igualmente atividade em pH elevado e identificação de amilases com estabilidade em uma formulação de lavagem de louça automática (ADW). As comparações foram feitas com a amilase derivada de Bacillus lichenformis. Um estudo da dependência da hidrólise no pH mostrou que a maioria das amilases alcalinas da invenção tiveram um pH ótimo de 7 ou menos, a exceção é o clone B com um pH ótimo de aproximadamente 8. A amilase alcalina da invenção retém a atividade nas formulações de ADW, embora o clone B seja sensível a temperaturas elevadas. Preferivelmente, quando empregada em produtos de ADW, a amilase alcalina da invenção funcionará em um pH 10-11 e em 45-60°C.

A invenção será ainda descrita com referência aos seguintes exemplos; entretanto, é para ser entendido que a invenção não é limitada a tais exemplos.

Exemplos

Exemplo 1

102

Identificação e Caracterização da g-Amilase Termoestável

O presente exemplo mostra a identificação de novas amilases de ácido. O programa de avaliação foi realizado sob condições de pH baixo ou neutro. As bibliotecas de DNA geradas de amostras de pH baixo foram objetivadas pela descoberta. Este esforço permitiu a descoberta de centenas de clones tendo a capacidade de degradar o amido. A seqüência de DNA e análise de bioinformática classificou muitos desses genes quando a amilase previamente não identificou.

Estudos Bioquímicos

A análise bioquímica dos clones genômicos de amilase mostrou que muitos tiveram pH ótimos menores do que pH 6. Os lisatos desses clones genômicos foram testados quanto à tolerância térmica por incubação em 70°C, 80°C, 90°C ou 100°C durante 10 minutos e medição da atividade residual em pH 4,5. Esses clones retendo >50% da atividade após o tratamento a quente em 80°C foram escolhidos para outra análise. Esses clones foram incubados em 90°C durante 10 minutos em pH 6,0 e 4,5 e testados quanto à atividade residual em pH 4,5 (Figura 1). Uma quantidade de clones reteve >40% de sua atividade seguindo este tratamento. Para propósito comparativo, a atividade residual de uma amilase envolvida, clone c, foi equivalente ao melhor das enzimas de segunda geração; a atividade específica do clone c foi maior.

A atividade térmica dos clones com atividade residual após o tratamento a quente em 90°C em pH 4,5 foi medida em temperatura ambiente, 70°C e 90°C em pH 4,5. A Tabela 1 mostra que a taxa de hidrólise de SEQ ID NO: 87 (amilase de B. stearothermophilus) e SEQ ID NO: 113 (amilase de B. licheniformis) diminui em temperaturas mais elevadas, ao mesmo tempo em que a taxa para SEQ ID NO: 125 contínua a aumentar quando a temperatura é aumentada para 70°C e somente reduz por volta de 50% em 90°C.

Avaliação do Candidato

Com base na atividade residual em pH 4,5 após um tratamento a quente de 90°C, a atividade específica e taxa de hidrólise de amido em

103

90°C quando comparada com amilase B. licheniformis, SEQ ID NO: 125 são comparadas com o clone c de amilase envolvido em um ensaio de liquefação de amido.

	Temperatura ambiente	70°C	90°C
SEQ ID NO.: 871	1,25	1,43	0,33
SEQ ID NO.: 1132	3,3	1,9	0,39
SEQ ID NO.: 125	1,9	47	19

Tabela 1. Taxas de hidrólise de amido rotulado de tinta (relativo às unidades de fluorescência/s) de três clones genômicos em pH 4,5 e 3 diferentes temperaturas. ¹amilase B. stearothermofilus,² amilase B. licheniformis.

Exemplo 2

Amilase Termoestável Ativa em pH Alcalino

O foco inicial deste exemplo foi a avaliação de um painel existente de amilase em uma formulação de lavagem de louça automática comercial (ADW). Este esforço identificou dois candidatos: um com atividade em pH elevado (SEQ ID NO: 115) e outro com estabilidade na formulação de ADW (SEQ ID NO: 207). Os estudos também incluem a identificação de amilase de pH elevado. Este esforço permitiu a descoberta de milhares de clones tendo a capacidade de degradar o amido. A seqüência de DNA e análise bioinformática classificaram muitos desses genes como amilase previamente não identificada. As estruturas de leitura aberta restantes foram neopululanase, amilopululanase e amilomaltase. Os estudos de aplicações e bioquímicos extensivos mostraram que 3 candidatos:(clone B, SEQ ID NO: 147 e SEQ ID NO: 139) tiveram atividade específica elevada em pH 10, porém infelizmente perderam a estabilidade na formulação de ADW. Em resumo, um painel de novas amilases cada tendo fenótipos desejáveis para a aplicação de ADW tem sido identificado.

Estudos Bioquímicos

A análise bioquímica dos clones genômicos de amilase mostrou que muitos deles hidrolisaram o amido em pH 10 e 50°C. Para produzir quantidades suficientes de enzima para outro teste de aplicação e bioquími104 co, a estrutura de leitura aberta de amilase dos 40 clones genômicos mais ativos foi subclonada nos vetores de expressão. Este esforço inclui preparar 2 constructos para aqueles clones contendo uma seqüência de sinal putativo e estabelecer as condições de desenvolvimento e indução para cada sub-clone (mais e menos o peptídeo de sinal de amilase).

A proteína ativa solúvel foi prosperamente purificada para homogeneidade de 34 subclones e atividade específica (unidades/mg, onde 1 unidade= pmol de açúcares de redução/min) foi medida em pH 8 e pH 10 (40°C e 50°C) empregando 2% de amido no tampão. A amilase de Bacillus licheniformis (SEQ ID NO: 113) foi escolhida como a marca de referência para esses estudos. A atividade específica foi determinada removendo-se as amostras em vários pontos de tempo durante uma reação de 30 minutos e analisando quanto aos açúcares de redução. A taxa inicial foi determinada ajustando-se as curvas de progresso com uma equação linear. Uma compa15 ração do candidato topo é mostrada na Tabela 2.

Um estudo para determinar a dependência da taxa de hidrólise em pH mostrou que somente o clone B é uma amilase alcalina com um pH ótimo de aproximadamente 8; todos os outros tiveram pH ótimo de 7 ou menos. Entretanto, é claro que o painel de comparações incluiu várias amila20 ses de chumbo com atividade apreciável em pH 10 e 50°C.

Tabela 2: Atividades Específicas (U/mg de Enzima Pura) de Amilase

Enzima	Atividade Específica pH 8, 40°C	Atividade Específica pH 10, 50°C
Clone B	682	20
SEQ ID NO.: 139	430	33
SEQ ID NO.: 127	250	47
SEQ ID NO.: 137	230	3
SEQ ID NO.: 113 (B. licheniformis)	228	27
SEQ ID NO.: 205	163	4
Resíduo	<40

Estabilidade

105

A estabilidade na presença da formulação de ADW foi medida para cada dos 3 candidatos topo identificados através da análise bioquímica. O ponto de referência desses estudos foi uma enzima comercial na matriz de formulação. A figura 13 ilustra a atividade residual (medida em pH 8 e 50°C) após uma incubação de 30 minutos em 50°C na presença de vários componentes da formulação de ADW; pH 8, pH10.8, solução de ADW (com alvejamento) e solução de ADW (sem alvejamento). A atividade medida após a incubação é expressada como um percentual da atividade original. Os dados mostram que o clone B foi muito sensível à temperatura elevada, enquanto as outras amilases foram menos afetadas. Qúando as enzimas foram incubadas em pH e temperatura elevados a enzima comercial SEQ ID NO: 139 tornou-se menos estável; entretanto, SEQ IDNO:127 reteve atividade total. O comportamento aparentemente anormal de SEQ ID NO: 127 após pH 10 de incubação versus pH 8 foi observado em experiências repetidas.

Quando a atividade da amilase do amido rotulado a seco é medida na matriz de ADW em 50°C, a amilase comercial exibiu aproximadamente 5% de sua atividade em pH 8. No mesmo ensaio, clone B, SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 127 exibiram < 2% de sua atividade original medida em pH 8.

Testes de Lavagem

Os testes de lavagem empregando slides revestidos por amido foram realizados para calibrar o desempenho de cada das enzimas purificadas em comparação à amilase comercial. Os slides revestidos por amido espaguete foram preparados de acordo com o protocolo. Dois s/ides revestidos por amido pré-pesados foram colocados no verso para reforçar em um tubo cônico de 50 ml e 25 ml da solução de ADW, ± enzima foram adicionados por tubo. Os tubos foram incubados durante 20 minutos em 50°C com rotação suave em um carrossel vertical. Seguindo o período de incubação, os slides foram imediatamente enxaguados em água e novamente secados durante a noite. Todas experiências foram fundidas em duplicatas ea enzima comercial foi fundida como um controle positivo. Os resultados (Figura

106

6) dessas experiências são expressados como % líquido de amido removido, por exemplo % de amido removido em ADW com enzima, menos o % do amido removido em ADW sozinho.

Exemplo 3

Otimização de Gene

As propriedades das enzimas podem ser melhoradas por várias estratégias de evolução, incluindo Gene Site Saturation Mutagenesis (GSSM®) e Gene Reassembly®, (Diversa Corporation, San Diego, CA). Tais técnicas serão aplicadas aos genes de amilase divulgados a fim de gerar um grupo de variantes que podem ser peneiradas para melhorar o desempenho.

As moléculas parenterais durante evolução serão uma ou todas das seguintes: SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 127 (uma forma truncada de SEQ ID NO: 127).

Uma peneira de passagem elevada tem sido desenvolvida para taxar o desempenho das enzimas na presença de desempenho de ADW. O desenvolvimento de um HTS é de suprema importância em qualquer programa de evolução. O HTS é automatizado e tem mostrado resultados consistentes para a amilase parenteral (Figura 7). As amilases parenterais têm atividades mensuráveis na formulação de ADW, entretanto altamente reduzido relativo à atividade de pH 8.

Mutantes de SEQ ID NO: 81 Gerados por GSSM ou por Mutação Aleatória GSSM

Hospedeiro: E.coli, XL1-blue MRF'

Vetor: pSE420

Origem: SEQ ID NO: 81

Os resíduos mutados incluídos #2 a #93, #118-159, #389 e #433.

Listas de Clones de Amilases Ativas Elevadas que têm sido Seqüenciados

Nome Alteração Dados em E.coli

SEQ ID NO: 81/4L Y4V, TAT para GTG 2x Aumentada em Atividade

SEQ ID NO: 81/4A Y4A, TAT para GCG 2x Aumentada em Atividade

107

SEQ ID NO: 81/30V SEQ ID NO: 81/31Q SEQ ID NO: 81-4V-30V SEQ ID NO: 81-2C SEQ ID NO: 81-4C

T30V, ACC para GTT 131Q, ATC para TAG 4V + 30V C154A&C155A C154A, C155A& C389A, C433A

2,5x Aumentada em Atividade 1,5x Aumentada em Atividade 3x Aumentada em Atividade

1,2x Aumentada em Atividade 2x Aumentada em Atividade

Nota:

Para SEQ ID NO: 81/31Q, o códon TAG deve codificar durante um códon parado, porém codificar para Gin em XL1-blue MRF' células por causa da mutação supE do hospedeiro.

Mutação Aleatório

As mutações aleatórias foram introduzidas à SEQ ID NO: 81 por PCR propensa a erro como segue:

Uso de dATP, dCTP, dGTP, ou dTTP não equilibrado na reação para introduzir mutações;

- Uso de concentração diferente de MnCI₂ na reação para introduzir mutações;

Uso de combinação de dois métodos acima.

Confirmação de Novos Clones Ativos desenvolver os mutantes superiores da peneiração primária em tubos 15 de Falcon de 15 mL e induzir com IPTG de 1 mM;

Re-Ensaio empregando amido RBB como substrato;

Seqüência do Clone para confirmar a mutação.

Lista de Clones de Amilase Ativa Elevada que têm sido Seqüenciados

Nome	Dados do Frasco de Mistura	Dados no Fermentador
SEQ ID NO:	1,3-2x Aumentada	mesmo como
81-4C-UM1	em Atividade	SEQ ID NO: 81-4C
SEQ ID NO:	2x Aumentada	mesmo como
81-4C-UM2	em Atividade	SEQ ID NO: 81-4C

Exemplo 4

Caracterização de g-Amilases tendo Atividade em pH Alcalino

108

As amilases da invenção tendo atividade de pH alcalino foram ainda caracterizadas. Os cinéticos em 2% de amido de pH 8 e 10 (40°C e 50°C) foram realizados.

Tabela 4:

Clones, Atividades Específicas	pH 8, 40°C	pH 10, 50°C
SEQ ID NO: 113(fí. Lichenoformis)	228 unidades/mg	27 unidades/mg
Clone B	682 unidades/mg	31 unidades/mg
SEQ ID NO: 139	430 unidades/mg	33 unidades/mg
SEQ ID NO: 127	540 unidades/mg	50 unidades/mg
Controle 0GLS (E.coli)	1,8 unidades/mg	0 unidades/mg

1 unidade de atividade é definida como liberação de 1 μιτιοΙ reduzindo açucares por minuto.

Exemplo 5

Ensaio de Atividade de Amilase: BCA Reduzindo Ensaios Finais

A atividade de amilase de clones de interesse foi determinada empregando a seguinte metodologia.

1. Preparar 2 soluções de substratos, como segue:

a) 2% de amido solúvel (batata) solução de pH 8 dissolvendo-se 2gm de amido de batata em 100 ml de 100 mM de fosfato de sódio pH 8).

b) 2% de amido solúvel (batata) solução de pH 10 dissolvendo-se 2 gm de amido de batata em 100 ml de 100 mM de carbonato de sódio.

Aquecer ambas soluções em um banho de água em ebulição, ao mesmo tempo em que misturando, durante 30-40 minutos até que dissolva o amido.

2. Preparar a solução A de 64 mg/ml de monohidrato de carbonato de 20 sódio, 24 mg/ml de bicarbonato de sódio e 19,5 mg/ml de BCA (sal de dissódio de 4,4'-dicarbóxi-2,2'-biquinolina (Sigma Chemical cat # D-8284). Adicionado acima para dH2O.

3. Preparar solução B combinando-se 1,24 mg/ml de pentahidrato de sulfato cúprico e 1,26 mg/ml de L-serina. Adicionar a mistura para dH2O.

4. Preparar um reagente trabalhando de uma relação 1:1 de soluções

109

Ae Β.

5. Preparar uma solução padrão de maltose de 10 mM de Maltose em dH2O, onde os 10mM de maltose são combinados em 2% de amido solúvel em pH desejado para uma concentração final de 0, 100, 200, 300, 400, 600 μΜ.

A curva padrão será gerada para cada série de tempo exato. Desde que a curva é determinada adicionando-se 10 μΙ dos padrões do reagente trabalhados trabalham até 0, 1,2, 3, 4, 6 nmol de maltose.

6. Adicionar alíquota de 1 ml de solução de substrato nos tubos microcentrifugados, equilibrar a temperatura desejada (5 minutos) em bloco aquecido ou banho de água aquecida. Adicionar 50 μΙ de solução de enzima para dentro da tampa do tubo.

7. Ao mesmo tempo em que a solução é misturada equilibrando 5 ml de ambas solução A & B. Adicionar alíquota de 100 ml para placa PCR de 96 cavidades. Placa de série no gelo.

8. Após 5 minutos de equilíbrio de temperatura, fechar com as tampas nos tubos, inverter e vórtice 3 vezes. Adicionar imediatamente alíquota de 10μΙ na placa como t = 0 (zero tempo exato). Permitir a mistura de enzima no bloco aquecido e adicionar alíquota de 10μΙ em cada tempo exato desejado (por exemplo, 0, 5, 10, 15, 20, 30 minutos).

9. Garantir que 12 cavidades sejam deixadas esvaziar (somente trabalhando reagente com alíquota) para a adição de 10μΙ de padrões, para a curva padrão.

10. Quando todos os tempos exatos são coletados e padrões são adicionados, a placa coberta e aquecida a 80°C durante 35 minutos. Resfriar a placa no gelo durante 10 minutos. Adicionar 100 μΙ de H₂O para todas as cavidades. Misturar e adicionar alíquota de 10 μΙ na placa de 96 cavidades de fundo chato e ler a absorção em 560 nm.

11. Zerar cada tempo exato da amostra contra seu próprio t =0 (subtrair a média t = 0 valor A560 de outro valor A560 médio). Converter ο A560 (experimental) para umole (Dividir A560(experimental) pelo declive da curva padrão (A560/umole). Gerar um declive de tempo exato e o umole (em umole/minuto), multiplicar por 100 (como o valor umole calcular somente

110 para os 1ΟμΙ empregados no ensaio, nenhuma quantidade feita no rxn de 1 ml). Para obter a atividade específica dividir o declive (em umole/minuto) pelo mg da proteína. Todos os pontos mostram ser feitos em um mínimo em duplicatas com os três melhores testes. Um exemplo de curva padrão é apresentado na Figura 11.

Tabela 5: Dados da Amostra

Clone	Diluição	Minutos	A560-1	A560-2	A 560 Médio	Zeroed A 560	(A560exp/std declive) umole
ENZ	50	0	0,1711	0,1736	0,17235	0	0,0000
		5	0,2104	0,2165	0,21345	0,0411	0,0005
		10	0,2492	0,2481	0,24865	0,0763	0,0009
		15	0,2984	0,2882	0,2933	0,12095	0,0014
		20	0,3355	0,3409	0,3382	0,16585	0,0020
		30	0,3942	0,3805	0,38735	0,215	0,0026
		40	0,4501	0,4412	0,44565	0,2733	0,0033

Atividade = 0,008646 umole/minuto

Concentração da Proteína Dividida (mg/ml) por qualquer diluição para obter mg empregado no ensaio.10 Dividir o declive acima por mg empregado no ensaio para obter a atividade específica.

Atividade Específica = 24,93 umole/minuto/mg (Observe por exemplo, Dominic W.S. Wong. Sarah B. Batt, e

George H. Robertson (2000). O microensaio de peneiramento rápido de ati15 vidade alfa amilase. J. Agric. Foood Chem. 48,4540-4543 e Jeffrey D. Fox e

John F. Robyt, (1991). Miniaturização de três análises de carboidratos empregando um leitor de placa de microamostra. Anal. Biochem. 195, 93-96, aqui incorporadas por referência).

Exemplo 6

Peneiramento para Atividade de a-amilase

A atividade de amilase de clones pode ser ensaiada por vários métodos conhecidos na técnica. O seguinte é a metodologia geral que foi empregada na presente invenção. As várias placas peneiradas, por placa,

111 mostraram ser aproximadamente 10.000 pfu’s. Para cada biblioteca de DNA: pelo menos 50.000 placas por biblioteca isolada e 200.000 placas por biblioteca não-isolada mostram ser peneiradas dependendo do título pfu para o lisado amplificado de Expresso Zap λ.

Determinação do Título da Biblioteca Lambda

1) pL da biblioteca amplificada de Expresso Zap lambda armazenada adicionado a 600μΙ_ de células E.coli MRF’ (OD₆₀₀= 1,0). Para diluir tronco MRF', 10mM de MgSO₄ são empregados.

2) Incubar em 37°C durante 15 minutos.

3) Transferir suspensão de 5-6 ml de ágar de topo NZY em 50°C e suavemente misturar.

4) Derramar imediatamente a solução de ágar em placa de veículo NZY (150 mm) amplo.

5) Permitir ágar de topo para solidificar completamente (aproximadamente 30 minutos), em seguida inverter placas.

6) Incubar a placa em 39°C durante 8-12 horas.

7) Número de placas é aproximado. Título fago determinado para produzir 10.000 pfu/placa. Diluir uma alíquota de fago de Biblioteca com tampão SM se necessário.

Peneiramento de Substrato

1) Expresso Zap Lambda (50.000 pfu) de biblioteca amplificada adicionado a 600 pL de células MRF de E.coli (OD600 = 1,0). Para bibliotecas não-desenvolvidas, preparar 4 tubos (50.000 pfu por tubo).

2) Incubar em 37°C durante 15 minutos.

3) Ao mesmo tempo em que fago/suspensão de célula são incubados, 1,0 mL de substrato de amido vermelho (1,2% peso/volume) é adicionado para 6,0 mL de ágar de topo NZY em 50°C e cuidadosamente misturado. Manter a solução em 50°C até que necessite.

4) Transferir 1/5 (10.000 pfu) da suspensão de célula para substrato/solução de ágar de topo e misturar suavemente.

5) Solução é imediatamente derramada em placas de veículo NZY (150 mm) amplo.

112

6) Permitir o ágar de topo solidificar completamente (aproximadamente 30 minutos), em seguida inverter a placa.

7) Repetir os procedimentos 4-64 vezes para o resto da suspensão de célula (1/5 de cada tempo de suspensão).

8) Incubar as placas em 39°C durante 8-12 horas.

9) Placas observadas para zonas de clareamento (halos) em volta das placas.

10) Placas com halos são nucleadas de ágar e transferidas para um microtubo estéril. Um furo amplo de 200μΙ_ de extremidade da pipeta bem trabalhado para remover (núcleo) o tampão de ágar contendo a placa desejada.

11) Fagos são re-suspensos em 500pL de tampão SM. 20 ml de clorofórmio são adicionados para inibir qualquer outro desenvolvimento de célula.

12) Suspensão de fago puro é incubada em temperatura ambiente durante 4 horas ou durante a noite antes da próxima etapa.

Isolação de Clones Puros

1) 10μΙ_ da suspensão de fago re-suspensa são adicionados à 500μΙ_ de células MRF's de E.coli (OD600=1,0).

2) Incubar em 37°C durante 15 minutos.

3) Ao mesmo tempo em que fago/suspensão de célula está incubando, 1mL do substrato de amido vermelho (1,2% peso/volume) é adicionado a 6,0 mL de ágar de topo de NZY em 50°C e vagarosamente misturado. Manter a solução em 50°C se necessário.

4) Suspensão de célula é transferida ao substrato/ágar de topo e gentilmente misturada.

5) Solução é imediatamente derramada em placa de veículo NZY (150 mm) amplo.

6) Permitir o ágar de topo solidificar completamente (aproximadamente 30 minutos), em seguida inverter placa.

7) Placa incubada em 39°C durante 8-12 horas.

8) Placa observada durante a zona de clareamento (halo) em cerca de

113 uma placa única (clone puro). Se uma placa única não pode ser isolada, ajustar o título e a suspensão de fago chapeada novamente.

9) Placa única com halo é nucleada de ágar e transferida a um microtubo estéril. Uma extremidade de pipeta de 200μΙ_ de furo grande bem trabalhado para remover (núcleo) o tampão ágar contendo a placa desejada. Para amplificar o título, o núcleo 5 de placas ativas únicas em um microtubo.

10) Fagos são re-suspensos em 500μΙ_ de tampão SM. 20μΙ_ de clorofórmio são adicionados para inibir qualquer outro desenvolvimento de célula.

11) Suspensão de fago puro é incubada em temperatura ambiente durante 4 horas ou durante a noite antes da próxima etapa. A suspensão de fago puro é depositada em -80°C adicionando-se DMSO na suspensão de fago (7% de volume/volume).

Excisão de Clone Puro

1) 100μΙ_ de suspensão de fago puro são adicionados a 200μΙ_ de células MRF, de E.coli (OD600 = 1,0). Para isto, 1,0μΙ_ de fago de auxiliar de ExAssist (>1 x 106 pfu/mL; Stratagene) é adicionado. Uso de tubo Falcon 2059 durante excisão.

2) Suspensão é incubada em 37°C durante 15 minutos.

3) 3,0 mL de 2x veículo YT são adicionados para suspensão de célula.

4) Incubado em 30°C durante pelo menos 6 horas ou durante a noite ao mesmo tempo em que sacudindo.

5) Tubo transferido em 70°C durante 20 minutos. A suspensão de fagomídeo pode ser armazenada em 4°C durante 1 a 2 meses.

6) 100 μί de suspensão de fagomídeo transferidos para um microtubo contendo 200 μί de células Exp 505 de E.coli (OD600=1,0).

7) Suspensão incubada em 37°C durante 15 minutos.

8) 300 μί de SOB são adicionados na suspensão.

9) Suspensão é incubada em 37°C durante 30 a 45 minutos.

10) 100pL de suspensão são transferidos a uma placa de veículo LB (90 mm) pequeno contendo Kanamicina (veículo LB com Kanamicina

114

50gg/mL) para bibliotecas de DNA de Expresso Zap ou Ampicilina (veículo LB com Kanamicina 100 gg/ml) para bibliotecas de DNA II Zap.

11) O resto da suspensão é transferido para outra placa de veículo LB pequeno.

12) Uso de contas de vidro estéril para distribuir uniformemente a suspensão na placa.

13) Placas são incubadas em 30°C durante 12 a 24 horas.

14) Placa observada durante colônias.

15) Colônia única inoculada em veículo líquido LB contendo antibiótico adequado e incubada em 30°C durante 12 a 24 horas.

16) Estoque de glicerol pode ser preparado adicionando-se 80% de glicerol na cultura de líquido (15% em volume/volume) e armazenado em 80°C.

Verificação da Atividade

1) 50gL de cultura de líquido são transferidos para um microtubo. Adicionar 500 μί de 8% de pH 7 de Azul Amilopectina no mesmo tubo. Preparar 2 tubos para cada clone.

2) Atividade é testada em 50°C durante 3 horas e durante a noite. Uso de tampão de pH 7 como controle.

3) Resfriar o espécime teste em banho de água gelada durante 5 minutos.

4) Adicionar 750pL de Etanol e misturar vagarosamente.

5) Centrifugar em 13000 rpm (16000 g's ) durante 5 minutos.

6) Medir OD do sobrenadante em 595 nm.

Análise RFLP

1) 1,0 mL de cultura de líquido é transferido para um microtubo estéril.

2) Centrifugar em 13200 rpm (160Ó0 g's) durante 1 minuto.

3) Descartar o sobrenadante. Adicionar outro 1,0 mL de cultura de líquido no mesmo microtubo estéril.

4) Centrifugar em 13200 rpm (16000 g's) durante 1 minuto.

5) Descartar o sobrenadante.

115

6) Seguir o protocolo de mini kit de execução QIAprep para isolação do plasmídeo.

7) Checar a concentração de DNA empregando BioFotômetro.

8) Usar Sac I e Κρη I durante primeira dupla digestão. Incubado em 37°C durante 1 hora.

9) Empregar Pst I e Xhol durante segunda dupla digestão. Incubado em 37°C durante 1 hora.

10) Adicionar carregamento seco na amostra digerida.

11) Fundir a amostra digerida em um gel de agarose de 1,0% durante 1-1,5 horas em 120 volts.

12) Visão do gel com formador de imagem do gel. Todos os clones com um padrão de digestão diferente serão enviados para análise de seqüência.

Exemplo 7

Ensaio para Amilase

Preparação de Culturas de Hospedeiro

1. Iniciar durante a noite a cultura de células hospedeiras MRF, de XL1Azul. Empregar uma .colônia única de uma placa de listas para inocular 10 mL de LB suplementado com 20 gg/mL de tetraciclina. Desenvolver durante a noite a cultura sacudindo em 37°C durante pelo menos 16 horas.

2. Utilizar técnica asséptica, inocular uma cultura de dia LB_Tet de 100 ml fresco com hospedeiro MRF, de XL1-Azul da cultura LB_Tet durante a noite.

3. Desenvolver em um misturador 37°C até que OD alcance 0,75-1,0.

4. Células hospedeiras péletes em 1000 x g durante 10 minutos e gentilmente re-suspensas em 10mM de MgSO₄ em OD5.

5. Diluir uma pequena quantidade de células hospedeiras para OD1 para uso em titulação e pintooling.

6. Preparações de hospedeiro podem ser empregadas durante até 1 semana quando armazenado no gelo ou em 4°C.

Observações

116

- Para o tempo de desenvolvimento curto durante o dia da cultura, usar ¹/2 X na concentração Tet usual em LB (¹/2 X = 10 pg/mL), ou omitir o antibiótico totalmente.

- Não usar NZY quando selecionando com Tetraciclina. A concentração do Mg⁺⁺ elevado no veículo NZY rende Tet inativo.

Bibliotecas de Lambda de Titulação

7. Colocar três tubos de microfuga estéril em uma prateleira.

8. Adicionar um alíquota de 995 pL de células hospedeiras preparadas em um tubo e 45 pL em células hospedeiras OD1 preparadas em cada dos dois tubos restantes.

9. Adicionar 5 pL de biblioteca lambda ao tubo contendo células hospedeiras de 995 pL e misturar por vórtice. Isto resulta em um fator de diluição de 200.

10. Preparar 1/2.000 e 1/20.000 diluições adicionando-se consecutivamente 5 pL de prévia diluição aos dois tubos restantes contendo 45 pL de células hospedeiras preparadas. A mistura por vórtice após cada diluição foi feita.

11. Permitir fago para absorver o hospedeiro por incubação em 37°C durante 15 minutos.

12. Por enquanto, a pipeta de 100 pL de células hospedeiras OD1 preparadas para cada dos três tubos 2059 Falcon.

13. Adicionar 5pL de cada diluição para um tubo 2059 separado contendo células hospedeiras.

14. Cada placa adicionando-se 3 mL de ágar de topo a cada tubo e derramar rapidamente sobre placas NZY de 90 mm. Garantir uma distribuição ainda macia antes de endurecer o ágar de topo.

15. Inverter as placas e incubar em 37°C durante a noite.

16. Placas de contagem e calcular o título do estoque da biblioteca (as placas formando unidades (pfu) por pL).

Peneiramento de Microtítulo Lambda para Amilase

Preparação

1. Preparar uma quantidade suficiente de cultura de hospedeiro MRF, de

117

Azul-XL1, como descrito acima, para a quantidade da peneiração planejada. Uma cultura de 100 mL é freqüentemente suficiente para biblioteca de 2-3 de peneiração.

2. Várias garrafas de autoclave compatíveis com o dispensor QFÍII2. Essas são as garrafas Corning de boca larga, 250 mL contendo um anel de selo em volta da borda.

3. Verificar se são as quantidades suficientes de placas, ágar de topo, amido BODIPY, solução de amido vermelho, etc. disponível para a peneira.

4. Tabela da Execução do robô do dia 2 com um reprèsentativo de automação.

Dia 1

1. Rotular as placas de 1536 cavidades (preta) com peneira de biblioteca e número de placa. Engrossadores de tubo Tough-Tags®, intervindo no modo de meia largura, são ideais para placas de 1536 cavidades rotuladas.

2. Calcular volumes de biblioteca, células hospedeiras e veículo NZY necessários para a peneiração. Isto é feito facilmente com uma extensão da folha Excel.

3. Combinar os volumes calculados da biblioteca lambda e células hospedeiras OD5 na garrafa Corning de boca larga de 250 mL estéril (contendo um anel de seleção).

4. Permitir absorção para ocorrer em 37°C durante 15 minutos.

5. Adicionar o volume calculado do veículo NZY e misturar bem. Isto é referido como a suspensão de veículo de fago de célula.

6. Desempenhar um título concomitante combinando-se 50 gL de suspensão de veículo de fago de célula com 250gL de células hospedeiras OD1 em um tubo 2059 Falcon, em seguida revestindo com 9mL de ágar de topo sob uma placa NZY de 150 mm. A placa título concomitante incubada em 37°C durante a noite.

7. Carregar o dispensor com o restante da suspensão e disposição de cada placa de 1536 cavidades rotuladas em 4 gL por cavidade. Se o

118 dispensor permite bolhas de ar em algumas cavidades, elas podem ser removidas centrifugando-se as placas em 200 x g durante 1 minuto.

8. Adicionar 0,5 μΙ_ de fago de controle positivo para cavidade de posição

AD46 de pelo menos duas das placas de ensaio. Uso de um clone de lambda de amilase positiva forte para este propósito. As versões lambda de SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 199 são boas escolhas de controles positivos.

9. Placas de ensaio incubadas em 37°C durante a noite em um incubador umidificado (> 95%).

Dia 2

1. Contar o pfu na placa título concomitante e determinar a densidade da semente média por cavidade (em pfu por cavidade).

2. Pintool pelo menos 2 placas de cada peneira de biblioteca (preferivelmente os controles positivos contendo 2) como segue:

a) Preparar placas de gramado de hospedeiro 2 para atuar como uma superfície em que pintoor·.

combinar 250 μΙ_ de células hospedeiras OD1 com 2 ml de 2% de amido vermelho e placas com 9 ml de ágar de topo com placas NZY de 150 mm. O controle de cada placa de tanto nível quanto possível como o ágar de topo solidifica a fim de produzir uma coloração uniforme vermelha através das placas.

b) empregar um ''pintoor' de 1536 posições esterilizado por chama duas vezes, reproduzir pelo menos 2 das placas de peneiramento nas placas de gramado do hospedeiro.

c) Placas e placas de recipiente pintooled em uma tampa de fluxo laminar com as tampas durante cerca de 15-30 minutos (para abertura de excesso de umidade).

d) Substituir as tampas e incubado invertido em 37°C durante a noite.

3. Preparar o tampão de substrato de amido 2x BODIPY como segue:

a) Calcular o volume total de 2x o substrato da solução tampão necessários para todas as placas de peneiração em 4μΙ_ por cavi-

119 dade (incluindo qualquer volume de espaço morto extra requerido pelo dispensador) e medir esta quantidade de 100 mM de CAPS de pH 10,4 em um veículo apropriado para o dispensador empregado.

b) Corrigir o bastante 0,5 mg de tubos de amido BODIPY para produzir o volume requerido de 2x o substrato tampão (calculado na etapa a) acima em uma concentração final de 20-30 gg/mL.

c) Dissolver cada 0,5mg de tubo em 50μΙ_ de DMSO em temperatura ambiente, protegido da luz, com vórtice frequente. Isto torna maior do que 15 minutos; alguns grupos de produção de amido BODIPY dissolvem melhor do que outros.

d) Adicionar 50μΙ_ de tampão CAPS de 100mM pH 10,4 a cada tubo e misturar por vórtice.

e) Agrupar os conteúdos de todos os tubos e remover qualquer agregado não dissolvido centrifugando-se durante 1 minuto em velocidade máxima em uma microfuga.

f) Adicionar o sobrenadante do resto do tampão CAPS de 100mM medido na etapa a) acima.

g) Proteger o 2x tampão de substrato da luz embrulhando-se em lâmina.

4. Tomar as placas e tampão de substrato no ambiente de automatização e programar o robô com os seguintes parâmetros:

a) dispensar 4μΙ_ do tampão de substrato por cavidade.

b) primeira leitura em 1 hora pós-substrato, segunda leitura em 9 horas, e terceira leitura em 17 horas; com 37°C de incubação entre as leituras.

c) filtro de excitação: 485 nm; filtro de emissão: 535 nm.

d) série de ganho Spectrafluor em 70, ou o ganho ótimo para a batelada de 2x o tampão de substrato preparado.

e) garantir que o incubador empregado protegerá as placas de ensaio da luz.

Dia 3

120

1. Checar as placas pintooled para clareadores na grama de bactéria em todas as posições correspondendo às cavidades na placa de ensaio apropriada. Checar também para clareadores no amido vermelho em qualquer das posições fixas. Se as placas contendo controles positivos fossem empregadas para pintooling, deveria ser capaz de observar uma zona de clareamento ampla no fundamento do vermelho. Ser cuidadoso dos contaminantes que também forma zonas de clareamento no amido vermelho (observe observação Contaminants That Form Clearing Zones in Red Starch, no final do Exemplo 7).

2. Identificar a observação putativa do registro dos dados produzidos pelo computador robô. O programa KANAL produzido por Engenheiros simplifica a análise de dados. Como uma norma de manuseio , uma observação putativa é caracterizada como uma cavidade tendo intensidade de sinal enxaguando pelo menos 1,5 dobras durante o fundamento.

3. Para cada putativo, remover 2μΙ_ da cavidade e adicionar a um tubo contendo 500μΙ_ de tampão SM e 50μΙ_ de CHCI₃. O vórtice para misturar e depósito em 4°Ç. Esta solução será referida mais adiante como o tronco 4e-3. As placas de peneiração original devem ser depositadas em 4°C, protegidas da luz, pelo menos até que as fugas sejam concluídas.

Isto é o método recomendado de quebra da observação putativa. É um ensaio de fase líquida que alivia na confirmação da atividade do amido BODIPY. Alternativamente, comparação putativa pode ser colocada diretamente nas placas de fase sólida contendo amido vermelho tal que 2.000-3.000 pfu por comparação são examinados para zonas de clareamento. Entretanto, a incapacidade de observar as zonas de clareamento no amido vermelho não é necessariamente uma indicação que uma comparação putativa foi um positivo falso. Então necessitará ser ensaiado empregando o formato em que foi originalmente identificado (isto é, fase líquida empregando amido BODIPY como substrato). Além disso, muitos positivos fracos são mais facilmente identificados empregando o método detalhado

121 abaixo.

Dia 1

1. Em um tubo cônico de 50 ml, estéril combinar 0,5 mL de células hospedeiras OD5 com 45,5 ml de NZY. Isto será referido a uma suspensão de veículo de hospedeiro.

2. Para cada comparação putativa ser analisada, alíquota de 1 mL de suspensão de veículo de hospedeiro em cada dos três tubos de microfuga estéril.

3. Série de pipetman de 12 canais no modo de multidispensa com um tamanho de alíquota de 20 pL e um número de alíquota de 2x. Montas o pipetman com uma série clara de extremidades estéreis.

4. Derramar cerca de 1 ml de suspensão de veículo de hospedeiro em uma nova bacia de solução estéril e carregar o pipetman de multicanal.

5. Dispensar 20pL por cavidade na última fila (fila P) de uma placa de 384 cavidades pretas (12 canais x2 = 24 cavidades). Esta fila será empregada para o controle.

6. Expelir o líquido restante das extremidades comovendo-se as extremidades contra a superfície da bacia e pressionando o botão RESET no pipetman. Derrubar o pipetman para baixo de um modo para prevenir a contaminação das extremidades. Não existe necessidade de mudar as extremidades neste ponto.

7. Derramar o restante do fluido na bacia em um recipiente de refugo (tipo um becher) tomando cuidado para evitar a contaminação de borrifos para trás.

8. Para a primeira putativa ser analisada, tomar 111 pL de tronco 4e-3 (observe dia 2 em Lambda Microtiter Screening for Amylases) e adicionar ao primeiro em uma série de três tubos contendo 1mL de suspensão de veículo de hospedeiro (etapa 2). Vórtex para misturar. Isto é diluição A.

9. Tomar 111 pL de Diluição A e adicionar ao próximo tubo da série. Vórtex para misturar. Isto é diluição B.

10. Tomar 111 pL de Diluição B e adicionar ao último tubo da série. Vórtex

122 para misturar. Isto é diluição C. Você deve agora ter três diluições de fago, onde as concentrações de cada difere por um fator de 10.

11. Derramar os conteúdos de Diluição C (o mais diluído das 3 amostras) na solução da bacia e carregar o pipetman de multicanal.

12. Dispensar 20 μΙ_ por cavidade na primeira fila da placa de 384 cavidades (12 canais x 2 = 24 cavidades).

13. Expelir o líquido restante nas extremidades comovendo-se as extremidades contra a superfície da bacia e pressionando-se o botão RESET no pipetman. Derrubar o pipetman para baixo de um modo para prevenir a contaminação das extremidades. Não existe a necessidade de mudar as extremidades neste ponto.

14. Esvaziar a bacia como descrito acima.

15. Derramar os conteúdos da Diluição B na mesma bacia e carregar o pipetman de multicanal.

16. Dispensar 20μΙ_ por cavidade na segunda fila das placas de 384 cavidades.

17. Realizar as etapas 13-16 similarmente para dispensar a Diluição A na terceira fila da placa..

18. Após todas três diluições terem sido revestidas nas terceiras 3 filas das placas, descartar todas as extremidades e a bacia de solução no recipiente de refugo bioperigoso.

19. Montar o pipetman com uma série clara de extremidades estéreis e aberta uma nova bacia de solução estéril.

20. Repetir as etapas 8-19 para cada comparação putativa restante, empregando filas restantes sobre a placa aciona para fila O. Cinco comparações putativas podem ser analisadas em uma placa de 384 cavidades, com a última fileira (fila P) exceto para os controles.

21. Adicionar 0,5 μΙ_ de cada controle para uma cavidade separada. Empregar pelo menos 2-3 controles separados, preferivelmente revestindo uma faixa de atividade.

22. Placas de ensaio incubadas em 37°C durante a noite em um incubador umidificado (> 95%).

123

Dia 2

1. Derramar todas as placas breakout em um gramado de hospedeiro com amido vermelho empregando o mesmo método descrito para Dia 2 em Lambda Microtiter Screening for Amylases, exceto que um pintoof' de posição 384 é empregado.

2. Preparar o tampão de substrato de amido 2x BODIPY como segue:

a) Calcular o volume total de 2x de solução de tampão de substrato necessários para todas as placas breakout em 20μΙ_ por cavidade (incluindo qualquer volume de espaço morto extra requerido pelo dispensador) e medindo esta quantidade de 100mM de CAPS pH 10,4 em um recipiente apropriado para o dispensador empregado.

b) Corrigir o suficiente 0,5 mg de tubos de amido BODIPY para produzir o volume requerido de 2x o tampão de substrato [calculado na etapa a) acima] em uma concentração final de 20-30 μg/ml.

c) Dissolver cada 0,5mg de tubo em 50μΙ_ de DMSO em temperatura ambiente, protegido da luz, com vórtice freqüente. Isto toma mais do que 15 minutos; alguns grupos de produção de amido BODIPY dissolvem melhor do que outros.

d) Adicionar 50μΙ_ de tampão de 100 mM de CAPS pH 10,4 a cada tubo e misturar por vórtice.

e) Derramar os conteúdos de todos os tubos e remover qualquer agregado não dissolvido centrifugando-se durante 1 minuto em velocidade máxima em um microfugo.

f) Adicionar o sobrenadante do resto do tampão CAPS de 10OmM medido na etapa a) acima.

g) Proteger o tampão de substrato 2x da luz embrulhando-se na lâmina.

3. Dispensar 20μ1_ por cavidade em todas as placas de breakout.

4. Embrulhar todas as placas em lâmina de alumínio e incubado em temperatura ambiente durante 2-6 horas.

5. Ler cada placa no Espectrafluor com as seguintes montagens:

124

a) leitura fluorescente (filtro de excitação: 485 nm, filtro de emissão: 535 nm)

b) definição da placa: 384 cavidades pretas

c) leitura do topo

d) ganho ótimo

e) número de flashes:3

6. Na extensão da folha Excel resultante, chart cada 3 filas putativa S' em um gráfico separado e checar durante atividade. Garantir que os controles positivos produzam sinais durante o fundamento.

7. Para cada putativa que aparece tem um sinal real entre as cavidades, colhetar uma amostra de uma cavidade positiva como segue:

a) Selecionar uma cavidade positiva de uma fila representante da diluição inicial mais elevada.

b) Transferir 2μΙ_ daquela cavidade em um tubo contendo 500μΙ_ de SM e 50μΙ_ de CHCI₃. Isto é referido como um tronco breakout.

c) Depósito em 4°C.

8. Empregar métodos previamente descritos, placas cerca de 10μΙ_ de cada tronco breakout em placas de NZY de 150 mm empregando amido vermelho. O objetivo é obter várias placas de cavidades separadas (pelo menos 20) das quais os núcleos isolados.

Dia 3

1. Checar as placas pintooled para uma incidência aceitável de clareadores no gramado de bactérias correspondendo às cavidades na placa de ensaio associada. Também checar durante clareamento no amido vermelho nos controles positivos e em qualquer putativa testada. Ser cuidadoso de contaminantes que também forma zonas de clareamento em amido vermelho (observe abaixo).

2. Das placas de fase sólida contendo diluições de troncos breakout, vários núcleos de placas isoladas, cada com 500μΙ_ de SM com 50μί_ de CHCI₃. Isto refere-se como o tronco isolado.

3. Os troncos isolados podem então ser individualmente testados no amido BODIPY empregando métodos descritos acima. Esta etapa pode

125 ser omitida se a placa que foi nucleada na etapa 2 produziu uma zona de clareamento no fundamento do amido vermelho. Os troncos isolados foram então individualmente testados no amido BODIPY empregando métodos descritos acima. Entretanto, esta etapa pode ser omitida se a placa que foi nucleada na etapa 2 produziu uma zona de clareamento no fundamento do amido vermelho.

Excisão

Dia 1

1. Em um tubo Falcon 2059, misturar 200 μΙ_ de hospedeiro MRF' de XL1 Azul OD1, 100μΙ_ de tronco isolado Lambda e 1 μ!_ de tronco de fago de ExAssist.

2. Incubar em 37°C o sacudidor durante 15 minutos.

3. Adicionar 3 mL do veículo NZY.

4. Incubar em 30°C o misturador durante a noite.

Dia 2

1. Aquecer o tubo de excisão a 70°C durante 20 minutos.

2. Centrifugar 1000 x g durante 10 minutos.

3. Em um tubo Falcon 2059, combinar o sobrenadante de 50μί com 200pL de hospedeiro EXP505 OD1.

4. Incubar em misturador a 37°C durante 15 minutos.

5. Adicionar 300μί de veículo SOB.

6. Incubar em misturador a 37°C durante 30-45 minutos.

7. Placas de 50μί na placa de LB_kan5o amplo empregando contas de vidro estéril. Se as placas são secas, veículo SOB extra pode ser adicionado para desembolsar auxílio às células.

8. Placa incubada em 30°C durante pelo menos 24 horas.

9. Cultivar um isolado para seqüência e/ou RFLP.

Desenvolver em 30°C de número de cópias de plasmídeo reduzido e é empregado para atenuar a toxicidade aparente de alguns clones de amilase.

Contaminantes que Formam Zonas de Clareamento em Amido Vermelho

Quando empregando amido vermelho no veículo sólido para

126 fago de ensaio para atividade de amilase, é comum observar unidades de formação de colônia (cfu) contaminantes que formam zonas de clareamento no amido vermelho. Para placas pintooled, é importante distinguir clones de fago de amilase positiva desses contaminantes quando eles alinham com uma posição de cavidade particular. A fonte dos micróbios contaminantes é presumivelmente os 2% de solução de tronco de amido vermelho, que não pode ser esterilizado por autoclavagem ou por filtração após preparação. É pensamento que eles são organismos oportunistas que sobrevivem metabolizando-se o amido vermelho. A fim de reduzir esses contaminantes, as téc10 nicas úteis estéreis quando fazendo 2% de soluções de amido vermelho e depósito ou em 4°C ou no gelo.

Exemplo 8

Análise Bioinformática

Uma análise de bioinformática inicial foi feita com as seqüências de α-amilase hipertermofílica conhecidas. A figura 14a mostra um alinhamento de algumas seqüências das quais tem sido depositadas no banco de dados NCBI. Esta análise revelou o potencial para iniciadores degenerados designados à PCR o gene menos inteiro sua seqüência de sinal (observe Figura 14a), produzindo potencialmente nova alfa-amilase de extensão total de uma biblioteca.

As seguintes bibliotecas foram peneiradas por PCR de DNA genômico:

Tabela 6:

Biblioteca #	Nome	Positivo PCR	Subclonado
5	A.lithotropicus	Não
13	Pyrodictium occultum	Não
17	Pyrodictium TAG11	Não	Sim
113	Deep sea inrichment	Sim	Sim
170	Deep sea enrichment	Sim	Sim
198	Archaeglobus	Não
206	Acidianus sp	Não
453	Mixed iceland enrich	Não
455	Mixed iceland enrich	Sim	Sim

A figura 14b mostra um alinhamento da seqüência identificada e

127 a tabela abaixo lista suas identidades de percentuais relativas.

128

Tabela 7: % da Identidade da Seqüência do Nucleotídeo

SEQ ID NO.: 79	83	84	73	83,8	84	LO LO co	85,4	83,3	83	o o
SEQ ID NO.: 85	82,6	82,8	r-‘ r-	83,2	84,7	CM lo oo	84,9	96	100
SEQ ID NO.: 83	82,1	82,9	LL	82,8	φ 00	<q φ oo	84,8	100
SEQ ID NO.: 77	82,6	82,2	74,2	83,8	88,8	00 oo 03	100
SEQ ID NO.: 75	82,5	82	74	83,5	88,9	o o T—
Therme 2	80,1	80,5	71,1 .	81,7	100
Therme	82,1	82,5	71,5	100
Piro 2	75,1	74,8	100
Piro	91,7	100
SEQ ID NO.: 81	o o
	SEQ ID NO.: 81	Piro	Piro 2	Therme	Therme 2	SEQ ID NO.: 75	SEQ ID NO.: 77	SEQ ID NO.: 83	SEQ ID NO.: 85	SEQ ID NO.: 79	Clone A

129

A identidade de aminoácido varia de cerca de 85-98% de identidade. Conseqüentemente, essas seqüências são úteis na mistura de genes como descrito aqui.

A figura 14c mostra o alinhamento do ácido nucléico das seqüências de polipeptídeo correspondentes acima. A expressão dessas amilases no pSE420 do vetor de expressor e XL1-Azul de linhagem de células hospedeiras mostra 1703 e 1706 tendo atividade de amilase.

Exemplo 9

Caracterização da Biblioteca de alfa-Amilase GP-1 63 de pH ótimo e Determinação de Atividade Específica

Em experiências iniciais, a SEQ ID NO: 81 de Thermococcus mostrou que foi eficaz em ambas liquefação de amido para moagem a úmido de milho e descolando para tecidos. Esta enzima tem um pH ótimo de 4,5 a 5,0. Neste pH inferior, é possível usar pouco ou nenhum cálcio que diminui todos Os custos de operação e menos formação de subproduto. Além disso, neste pH inferior, existe química reduzida usada e íon de permuta de carga. O padrão de indústria de amilase B.licheniformis é subótimo em ambos termoestabilidade e pH ótimo. A amilase 63GP-1 tem uma atividade específica de aplicação mais elevada comparada à amilase B.licheniformis e portanto muito menos enzima é requerida para hidrolisar uma tonelada de amido (tanto como enzima de menos 20 dobras pode ser empregada).

O pH ótimo para a hidrólise de amido foi determinado reagindose 50μΙ_ do GP-1, 0,35 U/ml, com uns 100 ml de 1% de solução de amido solúvel (0,0175 U/g de amido) durante 30 minutos em 95°C. As extremidades de redução geradas na solução de amido liquefeito foram medidas pelo ensaio de neocupronina, descrito aqui. O percentual de hidrólise de amido de milho foi determinado medindo-se várias extremidades de redução de açucares produzidas com o ensaio de neocupronina. Setenta gramas de solução tampão (pH4-7) foram pesados e 100ppm de cálcio foram adicionadas. Trinta gramas de amido de milho foram misturados na solução tampão para formar uma pasta fluida de amido. A enzima foi adicionada e os recipientes selados e incubados em 95°C durante 30 minutos com uma taxa de

130 aquecimento inicial de seis graus C por minuto. Uma amostra de 1ml foi extraída de becheres de reação e analisadas por ensaio de neocupronina. O ótimo para GP-1 foi entre pH 4,5 e 5, ao mesmo tempo que a amilase comercial B.licheniformis realizou otimamente em cerca de pH 6,0.

Exemplo 10

Reagrupamento da Ligação de Amilase

Nove fragmentos (cada cerca de 150 bp) foram amplificados de cada dos clones de origem SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, revestindo a estrutura de leitura aberta total. Os iniciadores são fornecidos na Tabela 8.

Tabela 8

GAACACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCAAAGTATTCCGAGCTCGAAG

GAACGGTCTCATTCCGCCAGCCAGCAAGGGGATGAGCGG

GAACCGTCTCAAAACACGGCCCATGCCTACGGC

GAACGTCTCACCTCGACTTCCACCCCAACGAGGTCAAG

GAACGTCTCAGGCGCTTTGACTACGTGAAGGGC

GAACGGTCTCAACAAGATGGATGAGGCCTTTG

GAACCGTCTCACGATATAATCTGGAACAAGTACCTTGC

GAACCGTCTCAGAAGCACGAGCATAGTTTACTACG

GAACCGTCTCAAAGGTGGGTTTATGTGCCG

GAACGTCTCAGGAATCCAAATGGCGGATATTCCCGC

GAACGGTCTCAGTTTATCATATTGATGAGCTCC

GAACCGTCTCAGAGGTAGTTGGCAGTATATTTG

GAACGTCTCACGCCAGGCATCAACGCCGATG

GAACGTCTCATTGTAGTAGAGCGGGAAGTC

GAACGGTCTCAATCGGTGTCGTGGTTTGCTAC

GAACCGTCTCACTTCCACCTGCGAGGTGGTC

GAACCGTCTCACCTTCCAACCTTGCTCGAGC

TCGAGACTGACTCTCACCCAACACCGCAATAGC

GAACACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCCAAGTACCTGGAGCTCGAAG

AGG

GAACGGTCTCATTCCCCCGGCGAGCAAGGGC

GAACCGTCTCAAAACACCGCCCACGCCTACGG

GAACGTCTCACCTCGACTTCCACCCCAAC

GAACGTCTCAGGCGCTTCGACTACGTCAAGG

GAACGGTCTCAACAAGATGGACGCGGCCTTTGAC

GAACCGTCTCACGATATAATTTGGAACAAGTACCC

GAACCGTCTCAGAAGCACCGACATAGTCTAC

GAACCGTCTCAAAGGTGGGTCTACGTTCCG

GAACGTCTCAGGAATCCATATTGCGGAGATTCCGGC

GAACGGTCTCAGTTTATCATGTTCACGAGCTC

GAACCGTCTCAGAGGTAGTTGGCCGTGTACTTG

GAACGTCTCAGCCATGCGTCAACGCCGATG

GAACGTCTCATTGTAGTAGAGCGGGAAGTCG

GAACGGTCTCAATCGGTGTCGTGGTTTGCAACG

SEQ ID NO:
258	Spel
259	Bsal
260	BsmBI
261	BsmAI
262	BsmAI
263	Bsal
264	BsmBI
265	BsmBI
266	BsmBI
267	BsmAI
268	Bsal
269	BsmBI
270	BsmAI
271	BsmAI
272	Bsal
273	BsmBI
274	BsmBI
275
276	Spel
277	Bsal
278	BsmBI
279	BsmAI
280	BsmAI
281	Bsal
282	BsmBI
283	BsmBI
284	BsmBI
285	BsmAI
286	Bsal
287	BsmBI
288	BsmAI
289	BsmAI
290	Bsal

131

Tabela 8 - continuação -

•5

GAACCGTCTCACTTCCACCGGCGAGGTGGTCGTG

GAACCGTCTCACCTTCCGGCCTTGCTCGAGCC

TCGAGACTGACTCTCAGCCCACCCCGCAGTAGCTC

GAACACTAGTAGGAGGTAACTTATGGCCAAGTACTCCGAGCTGGAAG

AGG

GAACGGTCTCATTCCTCCCGCGAGCAAGGG

GAACCGTCTCAAAACACCGCCCACGCCTATG

GAACGTCTCACCTCGACTTCCACCCGAACGAGC

GAACGTCTCAGGCGCTTCGACTACGTCAAGG

GAACGGTCTCAACAAGATGGACGAGGCCTTCG

GAACCGTCTCACGATATAATCTGGAACAAG

GAACCGTCTCAGAAGCACTGACATCGTTTACTACG

GAACCGTCTCAAAGGTGGGTTTACGTTCCG

GAACGTCTCAGGAATCCATATCGCCGAAAT

GAACGGTCTCAGTTTATCATGTTTATGAGC gaaccgtctcagagGtagttggccgtgtatttac

GAACGTCTCACGCCAGGCATCGATGCCGAT

GAACGTCTCATTGTAGTAGAGGGCGAAGTCAAAG

GAACGGTCTCAATCGGTATCGTGGTTGGCTACAAAC

GAACCGTCTCACTTCCTCCGGCGAGGTTGTCATG

GAACCGTCTCACCTTCCGGCTTTGCTTGAGGC

TCGAGACTGACTCTCACCCAACACCGCAGTAGCTCC

CACACAGCAGCAACCAACCTCGAGACTGACTCTCASCC

291	BsmBI
292	BsmBI
293
294	Spel
295	Bsal
296	BsmBI
297	BsmAI
298	BsmAI
299	Bsal
300	BsmBI
301	BsmBI
302	BsmBI
303	BsmAI
304	Bsal
305	BsmBI
306	BsmAI
307	BsmAI
308	Bsal
309	BsmBI
310	BsmBI
311
312	Bbvl

As condições empregadas para PCR foram como segue: 3 minutos 94°C, (30 segundos 94°C; 30 segundos 55°C, 30 segundos 68°C) x 30 ciclos, seguidos por 10 minutos em 68°C. Os produtos PCR correspondendo a regiões homólogas das três origens foram agrupados (1:1:1), cortados com a enzima de restrição apropriada (observe Tabela 8), e purificados por gel. Quantidades iguais de agregados de fragmentos foram combinadas e ligadas (16°C; durante a noite). Os produtos de ligação de 450bp resultante foram purificados por gel e ligados para produzir genes de amilase de extensão total. Os produtos de extensão total resultante foram purificados por gel e amplificados por PCR empregando uma mistura de iniciadores F1 SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79 e iniciador (SEQ ID NO: 312). As condições empregadas para PCR foram como segue: 3 minutos 94°C, (30 segundos 94°C; 30 segundos 50°C, 60 segundos 68°C) x 30 ciclos, seguidos por 10 minutos em 68°C. Os produtos PCR resultante (~1,4 kbp) foram purificados, cortados com Spel e Bbvl, purificados por gel, ligados por pMYC(vetor de Mycogen, cortado com Spel/Xhol), e transformados em E.coli de Topo 10. O DNA de plasmídeo de um agregado de -21000 co15

132 lônias foi isolado e transformado nos Pseudomonas.

Peneiramento de α-amilase Reagrupada

O Pseudomonas fluorescens transformado (MB214) contendo pMYC derivado dos clones de origem SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79 foi classificado como placas de 96 ou 384 cavidades por FACS e tratado com uréia 6M. A peneiração primária empregando amido RBB e/ou amido FITC como substratos foi realizada como descrito mais totalmente abaixo. Os clones ativos elevados foram peneirados empregando amido RBB como substrato empregando culturas induzidas e por ensaio de liquefação. Os troncos e clones ativos elevados de novas seqüências com base nos dados de liquefação foram realizados.

A biblioteca de amilase reagrupada transformada (MB214)Pf), foi coletada e classificada em placas de 96 cavidades (ou placas de 384 cavidades) em 1 célula/cavidade em 50μΙ de LB + Tet. As placas foram incubadas durante 24 horas em 30°C. As placas replicadas foram feitas correspondendo a cada das cavidades durante armazenagem. Quarenta e cinco (45) μΙ_ de 12M de uréia foram adicionados a cada cavidade e as placas foram sacudidas durante .10 minutos. As placas manteram temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora e o lisado armazenado em 4°C.

Ensaio Empregando Amido RBB

75μΙ de substrato de amido RBB (1% de amido de milho isolúvel RBB em 50mM de tampão NaAc, pH= 4,5) foram adiconados em cada cavidade de uma nova placa de 96 cavidades (fundo V). Cinco micro-litros de lisado de enzima foram transferidos em cada cavidade com substrato empregando Biomek ou Zymark. As placas foram seladas com fita de seleção de alumínio e brevemente sacudidas no misturador. As placas foram incubadas em 90°C durante 30 minutos, seguidas por resfriamento em temperatura ambiente durante cerca de 5 a 10 minutos. Cem microlitros de 100% de etanol foram adicionados para cada cavidade, as placas seladas e brevemente sacudidas no misturador. As placas foram então centrifugadas em 400rpm durante 20 minutos empregando centrífuga de topo de bancada. 100μΙ de sobrenadante foram transferidos em uma nova placa de 96 cavi133 • ¹⁰ dades (fundo uniforme) por Biomek e leitura de OD₅₉₅. Controles: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79.

Ensaio Empregando Amido FITC

Adicionar 50μΙ de substrato (0,01% de amido FITC em 100mM de tampão NaAc, pH = 4,5) em cada cavidade de uma nova placa de 384 cavidades. Transferidos 5μΙ de lisado de enzima em cada cavidade com substrato e incubadas as placas em temperatura ambiente durante a noite. A mudança da polarização do substrato, excitação em 485 nm, emissão em 535nm, foi lida durante cada cavidade. Controles: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79. Preferivelmente as placas de 96 cavidades são empregadas para todos os ensaios.

Confirmação de Novos Clones Ativos

Cada clone positivo de peneiração foi desenvolvido e induzido empregando um protocolo padrão. Cada clone foi examinado para desenvolver (isto é, com o passar do tempo a densidade da célula), atividade no nível por célula (ensaio de amido RBB e ensaio de liquefação), expressão (gel de proteína) e solubilidade da proteína (por análise de microscópio). Os clones.elevados novos confirmados foram transferidos durante fermentação.

Embora a invenção tenha sido descrita em detalhes com referência a certas modalidades preferidas desta, será entendido que as modificações e variações estão dentro do espírito e escopo daquilo que é descrito e reivindicado. Tahala 3

SEQ ID NO,

SEQ IDNO: 87 SEQ ID NO: 91 SEQ IDNO: 93 SEQ ID NO: 97 SEQ ID NO: 99 SEQ IDNO: 103 SEQ IDNO: 105 SEQ ID NO: 109 SEQ IDNO: 111 SEQ IDNO: 113 SEQ IDNO: 117 SEQ IDNO: 119 SEQ IDNO: 123 SEQ ID NO: 125

Seqüência de Sinal

AA1-23 (SEQ IO NO:213) AA1-23 (SEQ IDNO: 214} AA1-33(SEQ ID NO: 215) AA1-31 (SEQ ID NO: 216) AA1-30(SEQ ID NO: 217) ÁA1-22 (SEQ ID NO: 218) AA1-33 (SEQ ID NÓ: 219) AA1-25 (SEQ ID NO: 220) AA1-35(S£Q ID NO: 221) AA1-26 (SEQ ID NO: 222) AA1-21 (SEQ IDNO: 223) AA1-3Q(SEQ IDNO: 224) AA1-35(SEQ ID NO: 225) AA1-28(SEQ ID NO: 226)

134

Tabela 3 - continuação

SEQ ID NO.

SEQ ID NO: 127 SEQ ID NO: 131 SEQ ID NO: 133 SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 139 SEQ ID NO: 141 SEQ ID NO: 143 SEQ ID NO: 145 SEQ ID NO: 147 SEQ ID NO: 149 SEQ ID NO: 69 SEQ ID NO: 153 SEQ ID NO: 155 SEQ ID NO: 157 SEQ ID NO: 159 SEQ ID NO: 161 SEQ ID NO: 167 SEQ ID NO: 169 SEQ ID NO: 173 SEQ ID NO: 175 SEQ ID NO: 177 SEQ ID NO: 179 SEQ ID NO: 185 SEQ ID NO: 189 SEQ ID NO: 191 SEQ ID NO: 193 SEQ ID NO: 197 SEQ ID NO: 199 SEQ ID NO: 201 SEQ ID NO: 203 SEQ ID NO: 205 SEQ ID NO.:73 SEQ ID NO.: 79

Seqüência de Sinal

AA1-30 (SEQ IDNO: 227) AA1-30 (SEQ ID NO: 228) AA1-30 (SEQ ID NO: 229) AA1-28 (SEQ ID NO: 230) AA1-23 (SEQ IO NO: 231) AA1-23 (SEQ ID NO: 232) AA1-30 (SEQ ID NO: 233) AA1-27 (SEQ ID NO: 234) AA1-29 (SEQ ID NO: 235) AA1-28 (SEQ ID NO: 236) AA1-27 (SEQ ID NO: 237) AA1-26 (SEQ ID NO: 238) AA1-33 (SEQ ID NO: 239) AA1-25 (SEQ ID NO: 240) AA1-25 (SEQ ID NO: 241) AA1-36 (SEQ ID NO: 242) AA1-36 (SEQ ID NO: 243) AA1-23 (SEQ ID NO: 244) AA1-25 (SEQ ID NO: 245) AA1-22 (SEQ ID NO: 246) AA1-23 (SEQ ID NO: 247) AA1-23 (SEQ ID NO: 248) AA1-25 (SEQ ID NO: 249) AA1-36 (SEQ ID NO: 250) AA1-25 (SEQ ID NO: 251) AA1-25 (SEQ ID NO: 252) AA1-23 (SEQ ID NO: 253) AA1-23 (SEQ ID NO: 254) AA1-30 (SEQ ID NO: 255) AA1-25 (SEQ ID NO: 256) AA1-16 (SEQ ID NO: 257) AA1-16(SEQ IDNO: 7) AA1-26 (SEQ ID NO: 8)

Claims (61)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo tendo atividade de amilase alfa, em que referida sequência é selecionada a partir do grupo 5

   5 consistindo em (a) uma sequência de ácido nucléico como definida em SEQ ID

   NO: 53;

   (b) uma sequência de ácido nucléico complementar à sequência de ácido nucléico como definida em SEQ ID NO: 53.

   io 2. Polipeptídeo purificado possuindo atividade amilase, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo consistindo em um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54.

   3. Método de produzir um polipeptídeo como definido na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de

   15 introduzir um ácido nucléico codificando o polipeptídeo em uma célula hospedeira sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo, e recuperar o polipeptídeo.

   4. Método de hidrolisar uma ligação de amido, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma substância contendo o amido com

   20 um polipeptídeo como definido na reivindicação 2 sob condições que facilitam a hidrólise da ligação carbono-halogênio.

   5. Método para catalisar a decomposição de um amido, 30 caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contatar uma amostra contendo amido com um polipeptídeo como definido na reivindicação 2 sob

   25 condições que facilitam a decomposição do haloalcano ou ácido halocarboxílico.

   6. Preparação de proteína, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo como definido na reivindicação 2 e em que a preparação de proteína é um líquido.

   30 7. Preparação da proteína, caracterizada 5 pelo fato de que compreende um polipeptídeo como definido na reivindicação 2 e em que o polipeptídeo é um sólido.

   Petição 870180038850, de 10/05/2018, pág. 8/10

   8. Vetor de clonagem, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico como definida na 10 reivindicação 1 que codifica um polipeptídeo tendo atividade de amilase alfa.

   9. Célula hospedeira de bactéria, levedura ou fungo, 5 caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 que codifica um polipeptídeo tendo atividade de amilase alfa.

   10. Vetor de expressão capaz de replicar em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo

   10 tendo uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

   11. Vetor de acordo com a reivindicação 8 ou 10, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir do grupo consistindo em vetores virais, vetores de plasmídeo, vetores de fago, vetores de fagomídio, cosmídio, bacteriófagos, cromossomos artificiais, vetores de adenovírus, e vetores virais

   15 adeno associados.

   12. Célula hospedeira de bactéria, levedura ou fungo, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão como 25 definido na reivindicação 12.

   13. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 9 ou 12, 20 caracterizada pelo fato de que o hospedeiro é selecionado a partir do grupo consistindo em procariotos, fungos e leveduras.

   14. Método para liquefazer uma composição contendo amido, 30 caracterizado pelo fato de que compreende contatar o amido com um polipeptídeo como definido na reivindicação 2.

   25 15. Método para lavar um objeto, caracterizado pelo fato de que compreende contatar referido objeto com um polipeptídeo como definido na reivindicação 2 sob condições suficientes para referida lavagem.

   16. Método para desengomar o tecido, caracterizado pelo fato de que compreende contatar referido tecido com um polipeptídeo como

   30 definido na reivindicação 2 sob condições suficientes 5 para a referida desengomagem.

   17. Método para o tratamento de fibras lignocelulósicas, caracterizado pelo fato de que as fibras são tratadas com um polipeptídeo

   Petição 870180038850, de 10/05/2018, pág. 9/10 como definido na reivindicação 2 em uma quantidade que é eficiente para melhorar as propriedades das fibras.

   18. Método de acordo com a reivindicação 17, para descoloração enzimática da polpa de papel reciclado, caracterizado pelo fato

   5 de que o polipeptídeo como definido na reivindicação 2 é aplicado em uma quantidade que é eficiente para descoloração eficaz da superfície da fibra.

   19. Método para liquefação do amido, caracterizado pelo fato de que compreende contatar referido amido com um polipeptídeo como definido na reivindicação 2 sob condições suficientes para referida liquefação.

   io 20. Detergente aditivo, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo como definido na reivindicação 2.

   21. Método para produzir um xarope de glicose elevada ou maltose elevada ou uma mistura de xarope, caracterizado pelo fato de que compreende:

   15 liquefazer o amido empregando uma quantidade suficiente de um polipeptídeo como definido na reivindicação 2 para obter uma amido 25 hidrolase solúvel; e sacarificar a amido hidrolase solúvel, desse modo resultando em um xarope.

   20 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

   14, 19, ou 21, caracterizado pelo fato de que o amido é de um material selecionado a partir de arroz, arroz germinado, milho, cevada, trigo, legumes e batata doce.

   23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

   25 14,19, ou 22, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a adição de uma segunda amilase alfa ou uma amilase beta ou uma combinação das mesmas.

   Petição 870180038850, de 10/05/2018, pág. 10/10

   1/116 • · · ·

   FIG 1 • · · ·
2. 2/116 ··· ··· ···

   201

   NãO 220

   C Fim

   FIG 2
3. 3/116

   252

   FIG 3
4. 4/116

   302

   Não

   FIG 4
5. 5/116 :· · · · · · · • · · · · · · φ

   Ξ3 ω

   Φ φ

   Ό

   Φ

   Ό ’>

   Φ

   Φ

   Τ3

   -S θ'

   0SEQ 10 ΝΟ 17 □SEOIDWO. 127 SEQ 10 »Ο l<7 UQIDNOJI) SEQIDNO:I03 QUOIONO:»! QUQIDNO.I1>

   SIQIDNO: I» pH 6 pH 4.5

   FIG 5
6. 6/116 % em rede de amido removido ♦ Comercial SEQ ID NO: 113 ♦ SEQIDNO: 139 ♦ SEQIDNO: 127

   Concentração de enzima(mg/l)

   FIG 6

   1: * : :
7. 7/116

   FIG 7 » · · · · ··· ··· ··· · • · f · S · · · · · * ·
8. 8/116 ··«··· · · ·

   Tolerância h₂o₂

   Tempo em im H₂o₂(min)

   FIG 8 • Λ »«· ··*··· *

   Ι··« · · * ·
9. 9/116

   FIG 9a

   Atividade específica (pH 8.40 C) (Com atividade >4U/mg)

   FIG 9b

   Atividade específica @ pH 10, 50C » 4 ' »
10. 10/116

    SEQ XD NO.:113 (1) SEQ ID NO.:127 (1) · SEQ XD NO.:115 íl) 1 SEQ XD NO. :113(76) | SEQ XD NO.:127(79) 1 SEQ XD NO.:115(81) | SEQ ID NO.:113(156) SEQ ID NO.:127(159) SEQ XD NO.:115(150) SEQ XD NO.:113(234) SBQ XD NO. :127(239) SEQ XD NO. .115(200) SBQ XD NO. :113.(312) SEQ XD »0.:127(317) SBQ XD NO.:115(272) SBQ XD NO. :113(390) SEQ XD NO. :127(392) SEQ XD NO.:115(331) SEQ XD NO.:113(468) SEQ XD NO.:1271470) SEQ XD NO.:115(410) SEQ ID NO.:113 (485) SBQ XD NO.:127 (541) SEQ ID NO.:115 (437)

    -XANLNi

    161 _ ιβο eovtavevopadiwSvxsCQQikantkfhfpgrggtysdfk EWVQAVEVNPggRNQETsSrYQIQAMTKFDFPGRGNTYSSFK PPSgVXSgKYgAHYMDPHPN-..........

    wnwxnruuTgwu£»att<u«N*WJAKUi»«-NtaimivaHiBNtef«xuxj4i2«UiiguxvnrgvAM<ipvKW'

    KRWYHFDGTiwDESgKLNBSTKrEGTGKAfDfEVDjjENGNÍDYLMjftDLOMDHPíWTEUOW'

    - - --N|STSECTroOFPD£®Hl.VPFNaiqp.S*SNES--------------------------Y.

    241

    HnfenJpWKHVRgiffCKEBtWBBylBniB hikys γγρε^Λη vrsqtrknlfaEgBksydvhf gGYGAWVj^DÍLSOWGO——gAaGjYSErrHVD rfjHCTNF YITKTSt^HS ís5g--

    401

    IARg^YfiY

    481

    BGEPXVN561

    ÍOYIOHQglIC ítBivJyddSeJi

    320

    KXflFBAgSTQCGO YDHRKI.LNG - mwrwgsxssGYflcHRyxxwB - JyfmdeSfpnknipaJvyaBSgb

    400

    GTKOSSQ- -rsxpaBkhkxepBl

    YYGIPKYN.....X^ÕksKXOpLL

    YEEM1NKD--------KIJíNg---g

    480 «•V iDXSVMlSGXAAglTDGPgGMtRMYViatQHXGSTgHDSTeHRS—EPWmSW ilDSKPNSGIJUEXTOGFGCgKWNYVgXKHAGKV£gD&rgNXS--fTVTXNÃDS ~CPlPGL-STYgaG3DWXERwgHVBSKPAGYTIH8YTCHLGGWVDRg!g8YD§

    560

    SIÍVQR..........................-...................

    _5IKvJkTSQVTPTVKNXTTISGGNVYWGNX PBLONWNTANA1 KMTPSSYPTNKATXALP

    SYggHSSAGVC..............-......................................

    605

    FIG 10
11. 11/116

    y = 83.565X R² = 0.9967 Maltose de pH 10 na curva «4 S oj « oi oi 1 IOB> IW OCO OOM Maltose umol toa* 0 «

    FIG 11
12. 12/116

    Efeito do pH

    PH

    SEQIDNO.211 -^SÊQIDNO. 127

    FIG 12
13. 13/116

    FIG 13
14. 14/116 • · · · · · ·

    FIG 14a:

    SEQ IDNO:8I Piro

    Piro 2 Termo

    Termo 2 Con-senso

    SEQIDNO: 81 Piro

    Piro 2 Termo

    Termo 2 Con-senso

    SEQIDNO: 81 Piro

    Piro 2 Termo

    Termo 2 Con-senso

    SEQIDNO: 81 Piro

    Piro 2 Termo

    Termo 2 Con-senso _________________MKK FVALFITMFF WSMAW.....AQPASAAK __________ MKK FVALLITMFF WSMAAV.....AQPASAAK __________ VNIKK LTPLLTLLLF FI...VL.....ASPVSAAK

    SESQCTATCT WRWYMSAKK LLALLFVLAV LVGVAVIPAR VGIAPVSAGA ____________________________MA RKVLVALLVF LWLSVSAVP

    .....................................-........SA- Indicador de senso

    51 . 100 YS..ELEEGG VIMQAFYWDV PGGGIWWDTI RSKIPEWYEA GISAIWIPPA YS..ELEEGG VIMQAFYWDV PAGGIWWDTI RSKIPEWYEA GISAIWIPPA YL..ELEEGG VIMQAFYWDV PGGGIWWDHI RSKIPEWYEA GISAIWLPPP TSRPSLEEGG VIMQAFYWDV PAGGIWWDTI RSKIPDWASA GISAIWIPPA AKAETLENGG VIMQAFYWDV PGGGIWWDTI AQKIPDWASA GISAIWIPPA -----DB-GG VIMQAFYWDV P-GGIWWD-I --KIP-W--A GISAIW-PPlffl 15 O

    SKGMSGGYSM GYDPYDFFDL GBYNQKGTIE TRFGSKQELI NMINTAHAYG SKGMGGAYSM GYDFYDFFDL GEYNQKGTVE TRFGSKQELI NMINTAHAYG SKGMSGGYSM GYDPYDYFDL GEYYQKGTVE TRFGSKEELV RLIQTAHAYG SKGMSGAYSM GYDFYDFFDL GEYYQKGTVE TRFGSKQELI NMINTAHSYG SKGMSGGYSM GYDPYDFFDL GEYYQKGSVE TRFGSKEELV NMINTAHAHN SKGM-G-YSM GYDPYD-FDL GEY-QKG--E TRFGSK-EL- --I-TAH--151 200

    IKVIADIVIN HRAGGDLEWN PFVGDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE IKVIADIVIN HRAGGDLEWN PFVGDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE IKVIADWIN HRAGGDLEWN PFVGDYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE IKVIADIVIN HRAGGDLEWN PFTNSYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE MKVIADIVIN HRAGGDLEWN PFTNSYTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE -KVIAD-VIN HRAGGDLEWN PF---YTWTD FSKVASGKYT ANYLDFHPNE

    SEQIDNO: 81

    Piro Piro 2 Termo

    Termo 2 Con-senso

    SEQIDNO: 81 Piro

    Piro 2 Termo

    Termo 2 Con-senso

    SEQIDNO: 81 Piro

    Piro 2 Termo

    Termo 2 Con-senso

    201

    VKCCDEGTFG

    VKCCDEGTFG

    LHCCDEGTPG

    VKCCDEGTFG

    LHAGDSGTFG •-—D-GTFG

    251

    KGYGAWWKD KGYGAWWKD KGYGAWWRD KGYGAWWKD KGYAPWWKN KGY--WW-301

    MDEAFDNKNI

    MDEAFDNTNI

    MDEAFDNNNI

    MDEAFDNKNI

    MDEAFDNNNI

    MDEAFDN-NI

    GFPDIAHEKS

    GFPDIAHEKE

    GFPDICHHKE

    GFPDIAHEKS

    GYPDICHDKS

    G-PDI-H-KWLNWWGGWAV WLNWWGGWAV WLNWWGGWAV WLKWW. ALAV WLNRWGGWAV WL--W---AV

    PALVSALQNG

    PALVDALQNG

    PALVYALQNG

    PALVSALQNG

    PALVDALKNG

    PALV-AL-NG

    WDQHWLWASD

    WDQHWLWASD

    WDQYWLWKSN

    WDQYWLWASQ

    WDQHWLWASN

    WDQ-WLW-SGEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    QTWSRD PFK GTWSRDPFK QTWSRD PFK QTWSRD PFK GTWSRDPFK -TWSRD PFK

    ESYAAYLRSI ESYAAYLRSI ESYAAYLRSI KSYAAYLRSI ESYAAYLR SI -SYAAYLRSI

    LLNWAYSSGA

    LLNWAYSSGA

    LLSWAYESGA

    LLNWAYSSGA

    LLSWAYDSGA

    LL-WAY-SGA

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    25 0

    GVDAWRFDYV

    GVDAWRFDYV

    GFDGWRFDYV

    GIDAWRFDYV

    GIDAWRFDYV

    G-D-WRFDYV

    300

    KVFDFPLYYK KVFDFPLYYK KVFDFPLYY K KVFDFPLYY K KVFDFPLYYK KVFDFPLYY K

    35 0

    DIIWNKYLAY

    DIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    NIIWNKYPAY

    -IIWNKY-AY • ·
15. 15/116

    FIG 14a(cont.)

    • SEQ ID NO: 81 Piro Piro 2 Termo Termo 2 Con-senso 351 AFILTYEGQP VIFYRDYEEW AFILTYEGQP VIFYRDYEEW AFILTYEGQP VIFYRDFEEW AFILTYEGQP VIFYRDYEEW AFILTYEGQP AIFYRDYEEW AFILTYEGQP -IFYRD-EEW LNKDRLNNLI LNKDKLNNLI LNKDKLINLI LNKDRLKNLI LNKDRLRNLI LNXD-L- NLI WIHDHLAGGS WIHDHLAGGS WIHDHLAGGS WIHNNLAGGS WIHDHLAGGS WIH--LAGGS 400 TSIVYYDSDE TSIVYYDSDE TTIVYYDNDE TSIVYYDNDE TDIIYYDSDE T-I-YYD-DE 401 45 0 SEQ ID NO: 81 MIFVRNGYGS KPGLITYINL GSSKVGRWVY VPKFAGACIH EYTGNLGGWV • Piro LIFVRNGDSK RPGLITYINL GSSKVGRWVY VPKFAGACIH EYTGNLGGWV Piro 2 LIFVRNGDSR RPGLITYINL SPNWVGRWVY VPKFAGACIH EYTGNLGGWV Termo LIFVRNGYGN KPGLITYINL GSSKVGRWVY VPKFAGSCIH EYTGNLGGWV * Termo 2 LIFVRNGYGD RPGLITYINL GSSKAGRWVY VPKFAGSCIH EYTGNLGGWI Con-senso -IFVRNG--- -PGLITYINL -----GRWVY VPKFAG-CIH EYTGNLGGW- 451 486 SEQ ID NO: 81 DKYVYSSGWV YFEAPAYDPA NGQYGYSVWS YCGVG* Piro DKYVESSGWV YLEAPAYDPA SGQYGYTVWS YCGVG* Piro 2 DKRVDSSGWV YLEAPPHDPA NGYYGYSVWS YCGVG* Termo DKYVGSNGWV YLEAPAHDPA KGQYGYSVWS YCGVG* Termo 2 DKWVDSSGRV YLEAPAHDPA NGQYGYSVWS YCGVG* Con-senso DK-V-S-G-V Y-EAP--DPA -G-YGY- VWS YCGVG*

    Indicador de anti-senso • · · ··· ···
16. 16/116

    FIG 14b

    SEQIDNO: 81

    Piro

    SEQIDNO: 73 Termo 2

    SEQIDNO: 75 SEQIDNO: 77 SEQIDNO: 83 SEQIDNO: 85

    SEQ IDNO:79 Termo Piro 2

    CLONEA

    Con-senso

    1 ⁵⁰ ________________________MKKFVA LFITMFFVVS MAWAQPASA ____________________-___MKKFVA LLITMFFVVS MAAVAQPASA ____________________________MA RKVLVALLVF LWLSVSAVP

    ------------------------MKPAKL LVFVLWSIL AGLYAQPAGA

    SESQCTATCT WRWYMSAKK LLALLFVLAV LVGVAVIPAR VGXAPVSAGA

    ----------- VNIKK LTPLLTLLLF FIVLASPVSA

    -------------------- MRRSARV LVLIIAFFLL AGIYYPSTSA

    SEQIDNO: 81

    Piro

    SEQIDNO: 73 Termo 2

    SEQIDNO: 75 SEQIDNO: 77 SEQIDNO: 83

    SEQIDNO: 85 SEQIDNO: 79

    Termo Piro 2

    CLONEA

    Con-senso

    AKYSELEEGG

    AKYSELEEGG

    ---MALEEGG

    AKAETLENGG

    ---MALEEGG —MALEEGG

    ---MALEEGG

    ---MALEEGG

    AKYLELEEGG TSRPSLEEGG AKYLELEEGG AKYSELEQGG .......-GG

    VIMQAFYWDV

    VIMQAFYWDV

    LIMQAFYWDV

    VIMQAFYWDV

    LIMQAFYWDV

    LIMQAFYWDV

    LIMQAFYWDV

    LIMQAFYWDV

    VIMQAFYWDV

    VIMQAFYWDV

    VIMQAFYWDV

    VIMQAFYWDV

    -IMQAFYWDV

    PGGGIWWDTI

    PAGGIWWDTI

    PGGGIWWDTI

    PGGGIWWDTI

    PMGGIWWDTI

    PMGGIWWDTI

    PGGGIWWDTI

    PGGGIWWDTI

    PSGGIWWDTI

    PAGGIWWDTI

    PGGGIWWDHI

    PEGGIWWDTI

    P-GGIWWD-I

    RSKIPEWYEA RSKIPEWYEA AQKIPDWASA AQKIPDWASA AQKIPDHASA AQKIPDWASA AQKIPEWASA AQKIPEWASA RQKIPEWYDA RSKIPDWASA RSKIPEWYEA RQKIPEWYDA — KIP-W- -A

    100

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWIPPA

    GISAIWLPPP

    GISAIWIPPA

    GISAIW-PPSEQIDNO: 81

    Piro

    SEQIDNO: 73 Termo 2

    SEQIDNO: 75 SEQIDNO: 77 SEQIDNO: 83 SEQIDNO: 85 SEQIDNO: 79

    Termo Piro 2

    CLONE A Con-senso

    101 15 0 SKGMSGGYSM GYDPYDFFDL GEYNQKGTIS TRFGSKQELI NMINTAHAYG SKGMGGAYSM GYDPYDFFDL GEYNQKGTVE TRFGSKQELI NMINTAHAYG SKGMSGGYSM GYDPYDFFDL GEYYQKGSVE TRFGSKEELV NMINTAHAHN SKGMSGGYSM GYDPYDFFDL GEYYQKGSVE TRFGSKEELV NMINTAHAHN SKGMSGGYSM GYDPYDYFDL GEYYQKGTVE TRFGSKQELI NMINTAHAYG SKGMSGGYSM GYDPYDYFDL GEYYQKGTVE TRFGSKQELI NMINTAHAYG SKGMSGGYSM GYDPYDFFDL GEYYQKGTVE TRFGSKEELV NMINTAHSYG SKGMSGGYSM GYDPYDFFDL GEYYQKGTVE TRFGSKEELV NMINTAHSYG SKGMGGAYSM GYDPYDFFDL GEYDQKGTVE TRFGSKQELV NMINTAHAYG SKGMSGAYSM GYDPYDFFDL GEYYQKGTVE TRFGSKQELI NMINTAHSYG SKGMSGGYSM GYDPYDYFDL GEYYQKGTVE TRFGSKEELV RLIQTAHAYG SKGMGGAYSM GYDPYDYFDL GEFYQKGTVE TRFGSKEELV NMISTAHQYG SKGM-G-YSM GYDPYD-FDL GE--QKG--E TRFGSK-EL- --I-TAH--SEQIDNO: 81 Piro

    SEQIDNO: 73 Termo 2

    SEQIDNO: 75 SEQIDNO: 77 SEQIDNO: 83 SEQIDNO: 85 SEQIDNO: 79

    Termo Piro 2

    CLÓNEA

    Con-senso

    151

    IKVIADIVIN

    IKVIADIVIN

    MKVIADIVIN

    MKVIADIVIN

    MKVIADIVIN

    MKVIADIVIN

    IKVIADIVIN

    IKVIADIVIN

    IKVIADIVIN

    IKVIADIVIN

    IKVIADWIN

    IKVIADIVIN

    -KVIAD-VIN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGGLSWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGGDLEWN

    HRAGG-LEWN

    PFVGDYTWTD PFVGDYTWTD PFTNSYTWTD PFTNSYTWTD PFVNDYTWTD PFVNDYTWTD PFVNDYTWTD PFVNDYTWTD PFVNDYTWTD PFTNSYTWTD PFVGDYTWTD PYVGDYTWTD P—- —— YTWTD

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYT

    FSKVASGKYK

    FSKVASGKY200

    ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE ANYLDFHPNE AHYMDFHPNN A-Y-DFHPN ··· ··· ··· ·
17. 17/116

    14b(cont.)

    SEQ ID NO: 81

    Piro

    SEQ ID NO: 73

    Termo 2

    SEQ IDNO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ IDNO: 83 SEQ IDNO: 85 SEQ IDNO: 79

    Termo Piro 2

    CLONEA Con-senso

    SEQ IDNO: 81 Piro

    SEQ IDNO: 73 Termo 2

    SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ IDNO: 83 SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 79

    Termo Piro 2

    CLONEA Con-senso

    SEQ1D NO: 81

    Piro

    SEQ IDNO: 73 Termo 2

    SEQ ID NO: 75 SEQ IDNO: 77 SEQ ID NO: 83 SEQ IDNO: 85 SEQ IDNO: 79

    Termo Piro 2

    CLONEA Con-senso

    SEQIDNO:8Í

    Piro

    SEQ IDNO: 73 Termo 2

    SEQ IDNO: 75 SEQ IDNO: 77 SEQ IDNO: 83 SEQ IDNO: 85 SEQ IDNO: 79

    Termo Piro 2

    CLONEA Con-senso

    201

    VKCCDEGTFG

    VKCCDEGTPG

    LHAGDSGTFG

    LHAGDSGTFG

    LHAGDSGTFG

    LHAGDSGTFG

    LHCCDEGTFG

    LHCCDEGTFG

    VKCCDEGTFG

    VKCCDEGTFG

    LHCCDEGTFG

    YSTSDEGTFG

    ----D-GTFG

    251

    KGYGAWWKD KGYGAWWKD KGYAPWWKN KGYAPWWKN KGYAPWWRD KGYAPWWKD KGYGAWWND KGYGAWWND KGYGAWWKD KGYGAWWKD KGYGAWWKD KGYGAWWKD KGY--WW-301

    MDEAFDNKNI

    MDEAFDNTNI

    MDEAFDNNNI

    MDEAFDNNNI

    MDEAFDNNNI

    MDEAFDNNNI

    MDEAFDNTNI

    MDEAFDNTNI

    MDAAFDNKNI

    MDEAFDNKNI

    MDEAFDNNNI

    MDEAFDNKNI

    MD-AFDN-NI

    351

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    AFILTYEGQP

    GFPDIAHEKS

    GFPDIAHEKS

    GYPDICHDKS

    GYPDICHDKS

    GYPDICHDKS

    GYPDICHDKS

    GYPDICHDKS

    GYPDICHDKS

    GFPDIAHEKS

    GFPDIAHEKS

    GFPDICHHKE

    GFPDIDHLVP

    G-PDI-H--WLNWWGGWAV WLNWWGGWAV WLNRWGGWAV WLNRWGGWAV WLNWWGGWAV WLNWWGGWAV WLSWWGGWAV WLSWWGGWAV WLDWWGGWAV WLKWW.ALAV WLNWWGGWAV WLSQWGGWAV WL--W---AV

    PALVSALQNG

    PALVDALQNG

    PALVDALKNG

    PALVDALKNG

    PALVDALRYG

    PALVDALRYG

    PALVDALRYG

    PALVYALKNG

    PALVEALKNG

    PALVSALQNG

    PALVYALQNG

    PALVYAIQNG

    PALV-A---G

    VIFYRDYEEW

    VIFYRDYEEW

    AIFYRDYEEW

    AIFYRDYEEW

    TIFYRDYEEW

    TIFYRDYEEW

    VIFYRDYEEW

    VIFYRDYEEW

    TIFYRDYEEW

    VIFYRDYEEW

    VIFYRDFEEW

    VIFYRDYEEW

    -IFYRD-EEW

    LNKDRLNNLI LNKDKLNNLI LNKDRLRNLI LNKDRLRNLI LNKDKLKNLI LNKDKLKNLI LNKDKLNNLI LNKDKLNNLI LNKDRLRNLI LNKDRLKNLI LNKDKLINLI LNKDKLNNLI LNKD-L- NLI

    WIHDHLAGGS

    WIHDHLAGGS

    WIHDHLAGGS

    WIHDHLAGGS

    WIHDNLAGGS

    WIHDNLAGGS

    WIHDHLAGGS

    WIHDHLAGGS

    WIHDHLAGGS

    WIHNNLAGGS

    WIHDHLAGGS

    WIHEHLAGGS

    WIH--LAGGS

    WDQHWLWASD

    WDQHWLWASD

    WDQHWLWASN

    WDQHWLWASN

    WDQYWLWASQ

    WDQYWLWASQ

    WDQYWLWASS

    WDQYWLWASS

    WDQYWLWASN

    WDQYWLWASQ

    WDQYWLWKSN

    FNQYWLWASN

    --Q-WLW-SGEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    GEYWDTNVDA

    QTWSRDPFK

    GTWSRDPFK

    GTWSRDPFK

    GTWSRDPFK

    QTWSRDPPK

    QTWSRDPFK

    QTWSRDPFK

    GTWSRDPFK

    GTWSRDPFK

    QTWSRDPFK

    QTWSRDPFK

    ETWSRDPFK

    -TWSRDPFK

    ESYAAYLRSI esyaaylrsi

    ESYAAYLRSI

    ESYAAYLRSI

    ESYAAYLRSI

    ESYAAYLRSI

    ESYAAYLRSI

    ESYAAYLRSI

    ESYAAYLRSI

    KSYAAYLRSI

    ESYAAYLRSI

    ESYAAYLRSI

    -SYAAYLRSI

    LLNWAYSSGA LLNWAYSSGA LLSWAYDSGA LLSWAYDSGA VLNWAYSSGA VLNWAYSSGA LLNWAYSSGA LLNHAYNSGA LLNWAYSSDA LLNWAYSSGA LLSWAYESGA LLNWAYSSGA -L-WAY-S-A

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    AVTFVANHDT

    25 0

    GVDAWRFDYV

    GVDAWRFDYV

    GIDAWRFDYV

    GIDAWRFDYV

    GIDAWRFDYV

    GIDAWRFDYV

    GVDAWRFDYV

    GVDAWCFDYV

    GVDAWRFDYV

    GIDAWRFDYV

    GFDGWRFDYV

    GIDAWRFDYV

    G-D-W-FDYV

    300

    KVFDFPLYYK KVFDFPLYYX KVFDFPLYYK KVFDFPLYYX KVFDFALYY X KVFDFALYYK KVFDFPLYYK KVFDFPLYYK KVFDFPLYYK KVFDFPLYYK KVFDFPLYYK KVFDFPLYYK KVFDF-LYYK

    350

    DIIWNKYLAY

    DIIWNKYPAY

    NIIWNKYPAY

    NIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    DIIWNKYPAY

    NIIWNKYPAY

    -IIWNKY-AY

    400

    TSIVYYDSDE

    TSIVYYDSDE

    TDIIYYDSDE

    TDIIYYDSDE

    TDIVYYDNDE

    TDIVYYDNDE

    TDIVYYDSDE

    TDIVYYDSDE

    TDIVYYDNDE

    TSIVYYDNDB

    TTIVYYDNDB

    TKILYYDDDE

    T-I-YYD-DE • · · ··· ··· ··· ·

    I · · · · · · ···
18. 18/116 *····· · · ·

    FIG 14b(cont.)

    SEQ ID NO: 81 401 MIFVRNGYGS Piro LIFVRNGDSK SEO ID NO: 73 LIFVRNGYGD Termo 2 LIFVRNGYGD SEQ ID NO: 75 LIFVRNGYGS SEQ ID NO: 77 LIFVRNGYGS SEQ1D NO: 83 LIFVRNGYGT SEQ IDNO: 85 - LIFVRNGYGT SEQ IDNO: 79 LIFVRNGYGD Termo LIFVRNGYGN Piro 2 LIFVRNGDSR CLONE A LIFMREGYGD Con-senso -IF-R-G- —

    SEQ ID NO: 81 451 VDKYVYSSGW Piro VDKYVESSGW SEQ ID NO: 73 IDKWVDSSGR Termo 2 IDKWVDSSGR SEQ ID NO: 75 VDKWVDSSGW SEQ ID NO: 77 VDKWVDSSGW SEQ ID NO: 83 IDKYVSSSGW SEQ ID NO: 85 IDKYVSSSGW SEQ IDNO: 79 VDKWVDSSGW Termo VDKYVGSNGW Piro 2 VDKRVDSSGW CLONE A VDRYVQYDGW Con-senso -D--V---G-

    KPGLITYINL GSSKVGRWVY RPGLITYINL GSSKVGRWVY KPGLITYINL GSSKAGRWVY KPGLITYINL GSSKAGRWVY KPGLITYINL GSSKAGRWVY KPGLITYINL ASSKAGRWVY KPGLITYINL GSSKVGRWVY KPGLITYINL GSSKAGRWVY KPGLITYINL GSSKAGRWVY KPGLITYINL GSSKVGRWVY RPGLITYINL SPNWVGRWVY RPGLITYINL GSDWAERWVN -PGLITYINL -.....RWVVYFEAPAYDP ANGQYGYSVW VYLEAPAYDP ASGQYGYTVW VYLEAPAHDP ANGQYGYSVW VYLEAPAHDP ANGQYGYSVW VYLEAPAHDP ANGQYGYSVW VYLEAPAHDP ANGQYGYSVW VYLEAPAHDP ANGYYGYSVW VYLEAPAHDP ANGQYGYSVW VYLEAPAHDP ANGYYGYSVW VYLEAPAHDP AKGQYGYSVW VYLEAPPHDP ANGYYGYSVW VKLTAPPHDP ANGYYGYSVW V---AP--DP A-G-YGY-VW

    45 0

    V.PKFAGACI HEYTGNLGGW V.PKFAGACI HEYTGNLGGW V.PKFAGSCI HEYTGNLGGW V.PKFAGSCI HEYTGNLGGW V.PKFAGSCI HEYTGNLGGW V.PKFAGSCI HEYTGNLGGW V.PKFAGSCI HEYTGNLGGW V.PKFAGSCI HEYTGSLGGW V.PKFAGACI HEYTGNLGGW V.PKFAGSCI HEYTGNLGGW V.PKFAGACI HEYTGNLGGW VGSKFAGYTI HEYTGNLGGW V--KFAG--I HEYTG-LGG.W

    487

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYCGVG*

    SYAGVG*

    SY-GVG*

    ··· ··· ··· ·
19. 19/116

    FIG 14c:

    SEQ ID NO: 13 SEQ ©NO 15 SEQ ©NO 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 SEQ ©NO II

    CLONE A Con-senso

    ---ATGAAGC CTGCGAAACT CCTCGTCTTT GTGCTCGTAG TCTCTATCCT

    ---ATGAAGA AGTTTGTCGC CCTGTTCATA ACCATGTTTT TCGTAGTGAG

    ATGAGGAGAT CCGCAAGGGT TTTGGTTCTG ATTATAGCOT TTTTCCTCCT

    SEQ ©NO: »3 SEQ ©NO 15 SEQ ©NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NQ 73 SEQ ID NQ 79 SEQ ID Natl

    CLONE A Con-senso

    51 100

    -------------------- ATGGCTCTGG

    ----------------------------------------- ATGGCTCTGG

    ---------------------------------------- ATGGCTCTGG

    -------------------- ATGGCTCTGG

    ---------------------------------------- ATGGCTCTGG

    CGCGGGGCTC TACGCCCAGC CCGCGGGGGC GGCCAAGTAC CTGGAGCTCG CATGGCAGTC GTTGCACAGC CAGCTAGCGC CGCAAAGTAT TCCGAGCTCG GGCGGGGATT TACTACCCCT CCACGAGTGC CGCGAAGTAC TCCGAGCTGG

    SEQ ID Na 13 SEQ ID Na 15 SEQ ID NO: 75 SEQ ID Na 77 SEQ ID NQ 73 SEQ ID NQ. 79 SEQ ID Να II

    CLONE A Con-senso

    SEQID NO 13 SEQ ID NO 15 SEQID NO 75 SEQ ©NO 77 SEQ ©NO 73 SEQ ©NO 79 SEQ ©NO II

    CLONEÁ Con-senso

    SEQ ©NO 13 SEQ ©NO 15 SEQ ©NO 75 SEQ IDNO 77 SEQ IDNO: 73 SEQ IDNO 79 SEQ IDNO 11

    CLONE A

    Con-senso

    101

    AAGAGGGCGG AAGAGGGCGG AAGAGGGCGG AAGAGGGCGG TAGAGGGCGG AAGAGGGCGG AAGAAGGCGG AGCAGGGCGG -----GGCGG

    151

    GGAATCTGGT

    GGAATCTGGT

    GGAATCTGGT

    GGAATCTGGT

    GGAATCTGGT

    GGAATATGCT

    GGAATCTGGT

    GGAATCTGGT

    GGAAT-TGGT

    201

    AGGAATCTCA AGGAATCTCA CGGGATTTCG CGGGATTTCG CGGGATTTCG CGGAATCTCC GGGAATATCC AGGCATATCC -GG-AT- TCGCTCATAATG GCTTATAATG GCTTATAATG GCTCATAATG GCTTATAATG CGTCATAATG CGTTATAATG AGTCATAATG —T-ATAATG

    GGGACACAAT

    GGGACACCAT

    GGGACACGAT

    GGGACACGAT

    GGGACACCAT

    GGGACACAAT

    GGGACACCAT

    GGGACACAAT

    GGGACAC-AT

    GCGATATGGA

    GCGATATGGA

    GCGATATGGA

    GCGATATGGA

    GCAATATGGA

    GCAATATGGA

    GCCATTTGGA

    GCCATCTGGA

    GC-AT-TGGA

    CAGGCCTTCT

    CAGGCATTCT

    CAGGCATTCT

    CAGGCCTTCT

    CAGGCCTTCT

    CAGGCGTTCT

    CAGGCCTTCT

    CAGGCCTTCT

    CAGGC-TTCT

    AGCTCAAAAG AGCCCAGAAG AGCCCAGAAG AGCCCAGAAG AGCCCAGAAG ACGGCAGAAG CAGGAGCAAG ACGGCAGAAG .......AAG

    TTCCACCAGC

    TTCCACCAGC

    TTCCCCCCGC

    TCCCTCCCGC

    TTCCTCCCGC

    TTCCCCCGGC

    TTCCGCCAGC

    TACCCCCGGC

    T-CC-CC-GC

    ACTGGGATGT

    ATTGGGACGT

    ACTGGGACGT

    ACTGGGACGT

    ACTGGGACGT

    ACTGGGACGT

    ACTGGGACGT

    ACTGGGACGT

    A-TGGGA-GT

    ATACCCGAAT

    ATACCCGAAT

    ATACCCGACT

    ATACCCGACT

    ATACCCGACT

    ATACCGGAGT

    ATACCGGAGT

    ATCCCTGAAT

    AT-CC-GA-T

    GAGTAAGGGC

    GAGTAAGGGA

    GAGCAAGGGT

    GAGCAAGGGT

    GAGTAAGGGC

    GAGCAAGGGC

    CAGCAAGGGG

    GAGCAAGGGC

    -AG-AAGGG150

    TCCTGGAGGA

    CCCAGGTGGA

    CCCCATGGGA

    CCCCATGGGA

    CCCAGGTGGA

    GCCTTCAGGA

    CCCAGGTGGA

    TCCGGAGGGA

    -CC----GGA

    200

    GGGCAAGTGC GGGCAAGTGC GGGCAAGCGC GGGCAAGCGC GGGCGAGCGC GGTACGATGC GGTACGAGGC GGTACGATGC GG------GC

    2S0

    ATGAGCGGTG

    ATGAGCGGTG

    ATGAGCGGCG

    ATGAGCGGCG

    ATGAGCGGCG

    ATGGGCGGCG

    ATGAGCGGCG

    ATGGGCGGGG

    ATG-GCGG-G
20. 20/116

    FIG 14C(cont.)

    SEQ ID Να 13 SEQ ID NO: 15 SEQ ID Na 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: II

    CLONEA Con-senso

    251

    GTTATTCCAT GGGCTACGAT GTTATTCCAT GGGCTACGAT GCTATTCGAT GGGCTACGAC GCTATTCGAT GGGCTACGAC GCTATTCGAT GGGCTACGAC CCTATTCGAT GGGCTACGAC GTTACTCGAT GGGCTACGAT CCTACTCGAT GGGCTACGAC --TA-TC-AT GGGCTACGACCCTACGATT TCTTTGACCT CCCTACGATT TCTTTGACCT CCCTACGATT ATTTTGACCT CCCTACGATT ATTTTGACCT CCCTACGATT TCTTCGACCT CCCTACGACT TCTTTGACCT CCCTACGATT TCTTTGACCT CCCTACGATT ACTTCGATCT CCCTACGA-T --TT-GA-CT

    300

    CGGCGAGTAC

    CGGCGAGTAC

    CGGTGAGTAC

    CGGTGAGTAC

    CGGTGAGTAC

    CGGTGAGTAC

    CGGCGAGTAC

    GGGCGAGTTT

    -GG-GAGT-SEQ ID NO: «3 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID Μλ 73 SEQ ID NO. 79 SEQ ID Να II

    CLONEA Con-senso

    301

    TATCAGAAGG

    TATCAGAAGG

    TACCAGAAGG

    TACCAGAAGG

    TACCAGAAGG

    GACCAGAAGG

    AACCAGAAGG

    TACCAGAAGG

    -A-CAGAAGG

    SEQ ID Na 13 SEQ ID NO: 15 SEQ ID Na 75 SEQ ID Na 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID Na 79 SEQ ID NO: II

    CLONE A Con-senso

    351

    GAACATGATA

    GAACATGATA

    AAACATGATA

    AAACATGATA

    GAACATGATA

    GAACATGATA

    CAATATGATA

    CAACATGATC

    -AA-ATGATGGACAGTTGA GGACAGTTGA GAACGGTGGA GAACGGTGGA GAAGCGTTGA GAACGGTAGA GAACCATCGA GAACCGTTGA G-A-—T-GA

    AACACCGC AC AACACCGCAC AACACCGCCC AACACCGCCC AACACCGCCC AACACCGCCC AACACGGCCC TCCACGGCCC —CAC-GC-C

    GACGCGCTTC GACGCGCTTC AACAAGATTC AACGAGGTTC GACCCGCTTC GACGCGCTTT AACGCGCTTT GACCCGCTTC -AC—G-TTACTCCTACGG ACTCCTACGG ACGCCTATGG ACGCCTATGG ATGCTCACAA ACGCCTACGG ATGCCTACGG ACCAGTACGG A.....A--GGCTCAAAGG

    GGCTCAAAGG

    GGCTCAAAGC

    GGCTCAAAGC

    GGATCAAAAG

    GGCTCCAAGC

    GGCTCTAAAC

    GGCTCCAAGG

    GG-TC-AA—

    CATAAAGGTG

    CATAAAGGTG

    CATGAAGGTA

    CATGAAGGTA

    CATGAAGGTC

    CATCAAGGTC

    CATAAAGGTC

    CATCAAGGTT

    CAT-AAGGT350

    AAGAACTGGT

    AAGAACTGGT

    AGGAGCTCAT

    AGGAGCTCAT

    AGGAGCTTGT

    AGGAGCTCGT

    AGGAGCTCAT

    AAGAGCTCGT

    A-GA-CT--T

    400

    ATAGCAGACA

    ATAGCGGACA

    ATAGCCGATA

    ATAGCCGATA

    ATAGCGGACA

    ATCGCAGACA

    ATAGCGGACA

    ATAGCGGACA

    AT-GC-GA-A

    SEQ ID Na 13 SEQ ID Na 15 SEQ ID Na 75 SEQ ID NO: π SEQ ID NO: 73 SEQ ID Na 79 SEQIDNa.lt

    CLONEA Con-senso

    SEQ ID Na 13 SEQ ID Na 15 SEQ ID NO: 75 SEQ Π3 Na 77 SEQ Π3 Na 73 SEQ ID Na 79 SEQ ID Να II

    CLONE A

    Con-senso

    401 . TAGTCATAAA

    TAGTCATAAA TAGTCATCAA TAGTCATCAA TAGTCATCAA TAGTAATCAA TCGTCATAAA TAGTGATAAA T-GT-AT -AA

    451

    AACGACTATA AACGACTATA AACGACTATA AACGACTATA AACAGCTACA AATGACTACA GGGGACTACA GGCGACTATA .....CTA-A

    CCACCGCGCC

    CCACCGCGCC

    CCACCGCGCC

    CCACCGCGCC

    CCACCGCGCC

    CCACCGCGCC

    CCACCGCGCA

    CCACCGCGCA

    CCACCGCGCCCTGGACAGA CCTGGACAGA CCTGGACCGA CCTGGACCGA CCTGGACCGA CCTGGACGGA CCTGGACGGA CCTGGACGGA CCTGGAC- GA

    GGTGGAGACC GGTGGAGGCC GGCGGCGATC GGCGGTGACC GGCGGCGACC GGAGGAGACC GGCGGAGACC GGTGGAGACC GG-GG-G—C

    CTTCTCAAAA CTTCTCAAAA CTTCTCGAAG CTTCTCAAAG TTTCTCGAAG CTTCTCGAAG CTTCTCAAAG CTTTTCTAAG -TT-TC-AATTGAGTGGAA

    TCGAGTGGAA

    TGGAGTGGAA

    TGGAGTGGAA

    TGGAGTGGAA

    TTGAGTGGAA

    TCGAGTGGAA

    TCGAATGGAA

    T-GA-TGGAA

    GTCGCCTCCG

    GTCGCCTCCG

    GTCGCGTCGG

    GTCGCGTCGG

    GTCGCGTCGG

    GTCGCTTCCG

    GTGGCCTCGG

    GTCGCCTCCG

    GT-GC-TC-G

    450

    CCCCTTCGTG CCCCTTCGTG CCCCTTCGTG CCCCTTCGTG TCCTTTCACC CCCCTTCGTC CCCGTTCGTT CCCATACGTC -CC-T-C--500

    GTAAATATAC

    GTAAATATAC

    GTAAATACAC

    GTAAATACAC

    GCAAGTACAC

    GCAAGTACAC

    GCAAATATAC

    GGAAATACAA

    G-AA-TA-A- • · · ·*« ··· ··· »

    I · X · · · · ···
21. 21/116 ·«···· · « ·

    FIG 14C(cont.)

    SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO lí SEQ ID NO 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO 73 SEQ ID NO 79 SEQ ID NO: II

    CLONE A Con-senso

    501

    GGCCAACTAC

    AGCCAACTAC

    GGCCAACTAC

    GGCCAACTAC

    GGCCAACTAC

    GGCCAACTAC

    TGCCAACTAC

    GGCCCACTAC

    -GCC-ACTAC

    SEQ ID NO II SEQ ID NO 15 SEQ ID NO 75 SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 73 SEQ ID NO 79 SEQ1DNOI1

    CLONE A Con-senso

    551

    GTACCTTTGG

    GTACCTTTGG

    GAACATTTGG

    GAACATTTGG

    GAACATTTGG

    GCACCTTTGG

    GCACATTTGG

    GAACCTTCGG

    G-AC-TT-GG

    CTTGACTTCC

    CTTGACTTCC

    CTCGACTTCC

    CTCGACTTCC

    CTCGACTTCC

    CTCGACTTCC

    CTCGACTTCC

    ATGGACTTCC

    -T-GACTTCC

    AGGATACCCT

    AGGATACCCT

    AGGCTATCCC

    AGGCTATCCC

    AGGCTATCCC

    AGGGTTCCCG

    AGGCTTCCCA

    TGGCTTCCCA

    -GG-T--CCACCCAAACGA ACCCAAACGA ACCCGAACGA ACCCGAACGA ACCCGAACGA ACCCCAACGA ACCCCAACGA ATCCAAACAA A-CC-AAC- A

    GATATATGTC

    GATATATGTC

    GACATATGCC

    GACATATGCC

    GACATATGCC

    GACATAGCCC

    GACATAGCCC

    GACATTGATC

    GA-AT----C

    GCTTCACTGT

    GCTTCACTGT

    GCTCCACGCG

    GCTCCATGCG

    GCTTCACGCG

    GGTCAAGTGC

    GGTCAAGTGC

    CTACAGCACC

    ACGACAAAAG ACGACAAAAG ACGACAAGAG ACGACAAGAG ACGACAAGAG ACGACAAGAG ACGAGAAGAG ACCTCGTGCC AC........

    550

    TGTGATGAAG

    TGTGATGAAG

    GGCGATTCCG

    GGCGATTCCG

    GGCGATTCCG

    TGCGACGAGG

    TGTGACGAGG

    TCAGACGAGG

    ---GA----G

    600

    CTGGGACCAG CTGGGACCAG CTGGGACCAG CTGGGACCAG CTGGGACCAG CTGGGACCAG CTGGGACCAG CTTCAACCAG CT---ACCAG

    SEQ ID NO 13 SEQ ID NO 15 SEQ Π3 NO 75 SEQ ID NO 77 SEQ ID NO 73 SEQ ID NO 79 SEQ ID NO 11

    CLONE A Con-senso

    601

    TACTGGCTCT

    TACTGGCTCT

    TACTGGCTCT

    TACTGGCTCT

    CACTGGCTCT

    TACTGGCTCT

    CACTGGCTCT

    TACTGGCTGT

    -ACTGGCT-T

    GGGCGAGCAG

    GGGCGAGCAG

    GGGCCAGCCA

    GGGCCAGCCA

    GGGCCAGCAA

    GGGCGAGCAA

    GGGCGAGCGA

    GGGCGAGCAA

    GGGC-AGC-CGAAAGCTAC

    CGAAAGCTAC

    GGAGAGCTAC

    GGAGAGCTAC

    CGAAAGCTAC

    CGAGAGCTAC

    TGAGAGCTAC

    CGAGAGCTAC

    -GA-AGCTAC

    GCTGCCTACC

    GCTGCCTACC

    GCGGCCTATC

    GCGGCATATC

    GCCGCCTACC

    GCCGCCTACC

    GCCGCCTACC

    GCCGCCTACC

    GC-GC-TA-C

    650

    TCAGGAGCAT

    TCAGGAGCAT

    TCAGGAGCAT

    TCAGGAGCAT

    TCCGGAGCAT

    TCAGGAGCAT

    TAAGGAGCAT

    TCAGGAGCAT

    T--GGAGCAT

    SEQ ID NO: 13 651 AGGGGTTGAC SEQ ID NO 15 AGGGGTTGAC SEQ ID NO: 75 CGQCATCGAC SEQ ID NO: 77 CGGCATCGAT SEQ Π> NO 73 CGGCATCGAC SEQ ID NO 79 CGGCGTTGAC SEQ ID NO 11 CGGCGTTGAT CLONEA AGGGATCGAT Con-senso -GG--T- GA- SEQ ID NO 13 701 TTGTTAACGA SEQ ID NO 15 TTGTTAACGA SEQ Π3 NO: 75 TCGTCAGGGA SEQ ID NO 77 TCGTCAAGGA SEQ Π> NO 73 TCGTTAAGAA SEQ ID NO 79 TCGTCAAGGA SEQ ID NO II TCGTCAAGGA CLONEA TCGTCAAGGA Con-senso T-GT-A---A

    GCCTGGCGTT TCGACTACGT GCCTGGIGTT TCGACTACGT GCCTGGCGCT TCGACTACGT GCCTGGCGCT TCGACTACGT GCCTGGCGCT TCGACTACGT GCATGGCGCT TCGACTACGT GCCTGGCGCT TTGACTACGT GCCTGGCGCT TTGACTACGT GC-TGG-G-T T-GACTACGT

    CTGGCTCAGC TGGTGGGGAG CTGGCTCAGC TGGTGGGGAG CTGGCTGAAC TGGTGGGGAG CTGGCTGAAC TGGTGGGGAG CTGGCTGAAC CGGTGGGGCG CTGGCTGGAC TGGTGGGGAG CTGGCTCAAC TGGTGGGGCG CTGGCTGAGT CAGTGGGGCG CTGGCT......GTGGGG- G

    700

    CAAGGGCTAC GGAGCATGGG CAAGGGCTAC GGAGCCTGGG CAAGGGCTAT GCTCCCTGGG CAAGGGCTAT GCTCCCTGGG CAAGGGCTAC GCTCCCTGGG CAAGGGCTAC GGAGCGTGGG GAAGGGCTAC GGAGCGTGGG TAAGGGCTAC GGCGCGTGGG -AAGGGCTA- G---C-TGGG

    750

    GCTGGGCCGT TGGAGAGTAC GCTGGGCCGT TGGAGAGTAC GCTGGGCAGT TGGAGAGTAC GCTGGGCGGT TGGAGAGTAC GCTGGGCGGT TGGAGAGTAC GCTGGGCCGT CGGGGAGTAC GCTGGGCCGT TGGCGAGTAC GCTGGGCCGT CGGCGAGTAC GCTGGGC-GT -GG-GAGTAC • ··· ·» ··· ·

    «. · · · · ·«· k * fc « * · k ·
22. 22/116

    FIG 14C(cont.)

    751

    SEQ ID NO: 83 TGGGACACGA ACGTTGATGC ACTCCTCAAC TGGGCATACA SEQ ID NO: 15 TGGGACACTA ACGTTGATGC ACTCCTCAAC TGGGCATACA SEQ ID NO: 75 TGGGACACCA ACGTCGACGC TGTTCTCAAC TGGGCATACT SEQ ID NO: 77 TGGGACACCA ACGTCGACGC TGTTCTCAAC TGGGCATACT SEQ ID NO:'73 TGGGACACCA ACGTCGATGC ACTCCTGAGC TGGGCCTACG SEQ ID NO. 79 TGGGACACAA ACGTTGATGC ACTGCTCAAC TGGGCCTACT SEQIDNO:ll TGGGACACCA ACGTTGATGC ACTCCTCAAC TGGGCCTACT

    CLONE A TGGGACACCA ACGTCGATGC GCTCCTCAAC TGGGCCTACA Con-senso TGGGACAC-A ACGT-GA-GC --T-CT-A-C TGGGC-TAC800

    GCAGCGGCGC

    ACAGCGGCGC

    CGAGCGGTGC

    CGAGCGGTGC

    ACAGCGGTGC

    CGAGCGATGC

    CGAGCGGCGC

    GCAGCGGCGC

    --AGCG--GC

    SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: II

    CLONEA Con-senso

    801

    CAAGGTCTTT

    CAAGGTCTTT

    CAAGGTCTTT

    CAAGGTCTTT

    TAAAGTCTTC

    AAAAGTCTTC

    CAAGGTCTTC

    CAAGGTCTTC

    -AA-GTCTTGACTTCCCGC

    GACTTCCCGC

    GACTTCGCCC

    GACTTCGCCC

    GACTTCCCGC

    GACTTCCCGC

    GACTTCCCGC

    GACTTCCCGC

    GACTTC-C-C

    TCTACTACAA

    TCTACTACAA

    TCTACTACAA

    TCTACTACAA

    TCTACTACAA

    TCTACTACAA

    TCTACTACAA

    TCTACTACAA

    TCTACTACAA

    GATGGACGAA

    GATGGACGAA

    GATGGACGAG

    GATGGACGAG

    GATGGACGAG

    GATGGACGCG

    GATGGATGAG

    GATGGACGAG

    GATGGA-G-850

    GCCTTCGACA

    GCCTTCGACA

    GCCTTCGATA

    GCCTTCGATA

    GCCTTCGATA

    GCCTTTGACA

    GCCTTTGACA

    GCCTTTGACA

    GCCTT-GA-A

    SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: II

    CLONEA Con-senso

    851

    ACACCAACAT

    ATACCAACAT

    ACAACAACAT

    ACAACAACAT

    ACAACAACAT

    ACAAGAACAT

    ACAAAAACAT

    ACAAGAACAT

    A-A--AACAT

    SEQIDNO:» SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: II

    CLONE A Con-senso

    901

    GTCAGCCGCG

    GTCAGCCGCG

    GTCAGCCGCG

    GTCAGCCGCG

    GTCAGCCGCG

    GTCAGCCGCG

    GTCTCCCGCG

    GTCAGCAGGG

    GTC--C-G-G

    CCCGGCATTA

    CCCCGCTTTG

    TCCCGCCCTG

    TCCCGCCCTG

    CCCCGCCCTC

    TCCCGCACTC

    TCCAGCGCTC

    TCCCGCCCTC

    -CC-GC--TATCCCTTCAA

    ACCCATTCAA

    ACCCGTTCAA

    ACCCGTTCAA

    ACCCGTTCAA

    ACCCGTTTAA

    ACCCGTTCAA

    ATCCCTTCAA

    A-CC-TT-AA

    GTGGATGCAC GTTTACGCCC GTGGACGCCC GTGGACGCCC GTGGACGCCC GTCGAGGCCC GTCTCTGCCC GTTTACGCCA GT----GC- GGCGGTAACT GGCGGTAACT GGCTGTGACG GGCTGTGACG AGCCGTGACC GGCCGTAACC GGCCGTAACC GGCCGTTACC -GC-GT-AC TCAGATACGG TCAAGAATGG TCAGATACGG TCAGATACGG TCAAGAACGG TCAAGAACGG TTCAGAACGG TCCAGAACGG T-----A-GG

    TTCGTTGCCA

    TTCGTTGCCA

    TTTGTAGCCA

    TTTGTAGCCA

    TTCGTTGCCA

    TTCGTTGCAA

    TTTGTAGCAA

    TTCGTGGCTA

    TT-GT-GC-A

    900

    CCAGACAGTG

    CGGGACAGTG

    CCAGACAGTG

    TCAGACAGTG

    AGGCACGGTC

    GGGCACAGTC

    CCAGACTGTT

    TGAAACCGTC

    ----AC-GT950

    ACCACGATAC

    ACCACGATAC

    ACCACGATAC

    ACCACGATAC

    ACCACGATAC

    ACCACGACAC

    ACCACGACAC

    ACCACGATAC

    ACCACGA-AC

    SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: 11

    CLONEA

    Con-senso

    951

    AGATATAATC

    AGATATAATC

    CGACATAATC

    CGACATAATC

    CAACATAATC

    GGACATAATT

    CGATATAATC

    GAACATAATC

    --A-ATAATTGGAACAAGT

    TGGAACAAGT

    TGGAACAAGT

    TGGAACAAGT

    TGGAACAAGT

    TGGAACAAGT

    TGGAACAAGT

    TGGAACAAGT

    TGGAACAAGT

    ATCCGGCTTA ATCCGGCTTA ATCCAGCCTA ATCCAGCCTA ATCCGGCCTA ACCCGGCCTA ACCTTGCTTA ACCCTGCCTA A-C- -GC-TA

    TGCATTCATC

    TGCATTCATC

    CGCGTTCATC

    CGCGTTCATC

    CGCCTTCATC

    CGCCTTCATC

    TGCTTTCATC

    TGCCTTCATC

    -GC-TTCATC

    1000

    CTTACCTATG

    CTTACCTATG

    CTCACCTACG

    CTCACCTACG

    CTCACCTATG

    CTCACCTACG

    CTCACCTACG

    CTCACCTACG

    CT-ACCTA-G
23. 23/116 • ··· ¹ · * > 4 · > · «

    FIG 14C(cont.)

    SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: lí SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQIDNÒ:73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: II

    CLONE A Con-senso

    1001

    AGGGACAGCC

    AGGGACAGCC

    AGGGCCAGCC

    AGGGCCAGCC

    AGGGACAGCC

    AGGGCCAGCC

    AAGGCCAGCC

    AAGGTCAGCC

    A-GG-CAGCC

    TGTTATATTC

    TGTTATATTC

    GACAATATTC

    GACAATATTC

    GGCAATATTC

    GACGATATTC

    CGTCATATTT

    CGTCATCTTC

    ----AT-TTTACCGCGACT

    TACCGCGACT

    TACCGCGACT

    TACCGCGACT

    TACCGCGACT

    TACCGCGACT

    TACCGCGACT

    TACCGCGACT

    TACCGCGACT

    ACGAGGAGTG acgaggagtg

    ACGAGGAGTG

    ACGAGGAGTG

    ACGAGGAGTG

    ACGAGGAGTG

    ACGAGGAGTG

    ACGAGGAGTG

    ACGAGGAGTG

    1050

    GCTCAACAAG

    GCTCAACAAG

    GCTCAACAAG

    GCTCAACAAG

    GCTCAACAAG

    GCTCAACAAG

    GCTCAACAAG

    GCTCAACAAG

    GCTCAACAAG

    SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: lí SEQIDNO:7Í SEQ ID NO: 77 SEQ ID NCh 73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: II

    CLONE A Con-senso

    1051

    GATAAGCTTA GATAAGCTTA GACAAGCTCA GATAAGCTCA GACAGGCTCA GACAGGCTCA GACAGGTTGA GACAAACTCA GA-A- —T-A

    ACAACCTCAT

    ACAACCTCAT

    AGAACCTCAT

    AGAACCTCAT

    GGAACCTCAT

    AGAACCTCAT

    ACAACCTCAT

    ACAACCTCAT

    --AACCTCAT

    CTGGATACAC CTGGATACAC CTGGATACAT CTGGATACAT CTGGATACAC CTGGATACAC ATGGATACAC ATGGATTCAC -TGGAT-CAGATCACCTTG

    GATCACCTTG

    GACAACCTCG

    GACAACCTCG

    GACCACCTCG

    GACCACCTCG

    GACCACCTCG

    GAGCACCTGG

    GA--ACCT-G

    1100

    CTGGAGGGAG

    CTGGAGGGAG

    CCGGAGGGAG

    CCGGAGGGAG

    CGGGAGGAAG

    CCGGTGGAAG

    CAGGTGGAAG

    CAGGGGGAAG

    C-GG-GG-AG

    SEQ ID NO: 13 SEQ IDNO:IÍ SEQIDNO:7í SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NG 79 SEQ ID Να II

    CLONEA Con-senso

    1101

    TACTGACATT TACTGACATT CACTGACATC CACTGACATC CACAGACATC CACCGACATA CACGAGCATA CACCAAGATC -AC-- —ATGTTTACTACG

    GTTTACTACG

    GTTTACTACG

    GTTTACTACG

    ATCTACTACG

    GTCTACTACG

    GTTTACTACG

    CTCTACTACG

    -T-TACTACG

    ACAGCGACGA

    ACAGCGACGA

    ACAACGACGA

    ACAACGACGA

    ACAGCGACGA

    ATAACGATGA

    ACAGCGACGA

    ACGACGATGA

    A---CGA-GA

    GCTTATCTTT

    GCTTATCTTT

    GCTGATATTC

    GCTGATATTC

    GCTTATCTTC

    ACTCATCTTC

    GATGATTTTC

    GCTCATCTTC

    --T-AT-TT1150

    GTGAGAAACG

    GTGAGAAACG

    GTGAGAAACG

    GTGAGAAACG

    GTGAGAAACG

    GTCAGGAACG

    GTGAGGAACG

    ATGAGGGAAG

    -T-AG--A-G

    SEQ ID Na 13 SEQ ID Na lí SEQIDNa7í SEQ ID Na 77 SEQ ID Na 73 SEQ ID Na 79 SEQ ID Να II

    CLONEA Con-senso

    1151

    GCTATGGCAC GCTATGGCAC GCTACGGAAG GCTACGGAAG GCTACGGGGA GCTACGGGGA GCTATGGAAG GCTACGGCGA GCTA-GG- —

    CAAACCAGGA CAAACCAGGA CAAGCCGGGA CAAGCCGGGA CAAGCCGGGA CAAGCCGGGG CAAGCCTGGC CAGGCCCGGG CA—CC-GGCTGATAACCT CTGATAACCT CTGATAACAT CTGATAACAT CTGATAACCT CTTATAACCT CTTATAACTT CTTATAACCT CT-ATAAC-T

    ATATCAACCT

    ATATCAACCT

    ACATCAACCT

    ACATCAACCT

    ACATCAACCT

    ACATCAACCT

    ACATCAACCT

    ACATCAACCT

    A-ATCAACCT

    1200 CGGCTCAAGC CGGCTCAAGC CGGCTCAAGC CGCCTCAAGC CGGCTCAAGC AGGCTCGAGC CGGCTCGAGC CGGTAGCGAC -G.......C

    SEQ ID Na 13 SEQ ID Na lí SEQIDNa7S SEQ ID Ntt 77 SEQ ID Na 73 SEQ ID Na 79 SEQ ID Να II

    CLONE A

    Con-senso

    1201

    AAAGTTGGAA AAAGCTGGAA AAAGCCGGAA AAAGCCGGAA AAGGCCGGAA AAGGCCGGGA AAGGTTGGAA TGGGCGGAGA -—G—G—A

    GGTGGGTCTA GGTGGGTCTA GGTGGGTTTA GGTGGGTTTA GGTGGGTCTA GGTGGGTCTA GGTGGGTTTA GATGGGTGAA G-TGGGT--A

    CGTT...CCA CGTT...CCA CGTT.. .CCG CGTT...CCG CGTT.. .CCG CGTT.. .CCG TGTG...CCG CGTTGGCTCA -GT-----CAAGTTCGCCG

    AAGTTCGCCG

    AAGTTCGCAG

    AAGTTCGCAG

    AAGTTCGCAG

    AAGTTCGCGG

    AAGTTCGCGG

    AAGTTCGCGG

    AAGTTCGC-G

    1250 GTTCATGCAT GTTCATCCAT GCTCGTGCAT GCTCGTGCAT GCTCGTGCAT GAGCGTGCAT GCGCGTGCAT GCTATACAAT G-------AT

    V
24. 24/116

    LÁ

    FIG 14C(cont.)

    SEQ ID NO: (3 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: 11

    CLONE A Con-senso

    SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 15 SEQ ©NO: 75 SEQ ID NO: 77 SEQ©NO:73 SEQ ID NO: 79 SEQ ID Να II

    CLONEA Con-senso

    1251

    CCAOGAGTAC CCACGAGTAC ACACGAGTAC ACACGAGTAC ACACGAGTAC CCACGAGTAC CCACGAGTAT CCACGAATAC -CACGA- TA1301

    CCAGCGGCTG CCAGCGGCTG CAAGCGGCTG CAAGCGGCTG CAAGCGGTCG CAAGCGGGTG CAAGCGGCTG ACGACGGCTG — --CGG--G

    ACCGGCAACC ACCGGCAGCC ACCGGCAACC ACCGGCAATC ACCGGCAACC ACCGGCAACC ACTGGTAACC ACCGGAAACC AC-GG-A- -C

    GGTCTATCTT

    GGTCTACCTT

    GGTTTACCTC

    GGTCTACCTC

    GGTCTACCTT·

    GGTGTACCTC

    GGTCTATTTC

    GGTCAAGCTT

    GGT--A--TTCGGCGGTTG

    TCGGCGGTTG

    TCGGCGGCTG

    TCGGCGGCTG

    TCGGCGGCTG

    TCGGCGGCTG

    TCGGAGGCTG

    TCGGCGGCTG

    TCGG-GG-TG

    GAGGCCCCAG GAGGCCCCGG GAGGCTCCTG GAGGCTCCTG GAGGCCCCCG GAGGCCCCTG GAAGCTCCAG ACCGCTCCGC ---GC-CC- GATAGACAAG

    GATAGACAAG

    GGTGGACAAG

    GGTGGACAAG

    GATTGACAAG

    GGTGGACAAG

    GGTAGACAAG

    GGTCGACAGG

    G-T-GACA-G

    CCCACGACCC

    CCCACGACCC

    CCCACGACCC

    CCCACGACCC

    CCCACGACCC

    CCCACGACCC

    CTTACGACCC

    CACACGATCC

    C--ACGA-CC

    1300 TACGTCTCCT TACGTCTCCT TGGGTGGACT TGGGTGGACT TGGGTTGACT TGGGTGGACT TACGTCTACT TACGTCCAGT T—GT- T

    1350

    GGCGAACGGC

    GGCCAATGGC

    GGCCAACGGC

    GGCCAACGGC

    GGCCAACGGC

    GGCCAACGGC

    TGCCAACGGG

    GGCAAACGGC

    -GC-AA-GGS£Q©Nai3 SEQ ID NO: 15 SEQ ID Na 75 SEQ©NO:77 SEQ ID NO: 73 SEQ ©NO: 7» SEQ ©Na II

    CLONE A Con-senso

    1351 1393 TACTACGGCT ACTCCGTATG GAGCTACTGC GGGGTTGGGT GACAGTATGGCT ACTCCGTCTG GAGCTATTGC GGGGTTGGGT GACAGTACGGCT ACTCCGTTTG GAGCTATTGC GGTGTTGGGT GACAGTACGGCT ACTCCGTCTG GAGCTACTGC GGTGTTGGGT GACAGTACGGCT ACTCCGTATG GAGCTACTGC GGTGTTGGGT GATATTACGGCT ACTCCGTCTG GAGCTACTGC GGGGTGGGCT GACAGTATGGCT ACTCCGTGTG GAGCTATTGC GGTGTTGGGT GATATTACGGCT ACTCGGTCTG GAGCTACGCC GGAGTTGGAT GA- A-TA-G GCT ACTC-GT-TG GAGCTA---C GG-GT-GG-T GA·«· *·· ···
25. 25/116

    FIG 15

    CRI

    100

    5» rGR3 1JGR2 1GR5 <(>R4 'GR5

    94 —T. profundo

    Í-T. barosjiíi

    T.eeto 'P/sp.KOJM T. peptoBophih» T.*sp. SM-2

    T. «tettcri

    ι. liytinwnurniin.s % de diferença de seqüência

    CS1 T.reUr 5.2% CR! P. filMVIU 73% T.cdcr P. AirLoais 4.9%

    -T. raesicalis T fumicolans

    -Γ. liionilis T. barophilus iP.hcrikoshii.«q lp.shokiii.setj r-P. abttsi I—P. furicsus

    M. fervidas

    -M. thiTRtnlith.

    M. igncwt A. fiilgübu

    Valores tirados por 100 replicados

    Suramil fc Xaran. DaçvSci Kctcjnà Pu II. ic jwvix '«· ·»· »·«
26. 26/116

    FIG 16

    SEQIDNO.: 1 atggcaaagtattccgagctcgaagagggcgggctcataatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgat agcccagaagatacccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggáacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacaccgcccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggtgacctggagtggaacccctt cgtgaacgactatacctggaccgacttctcaaaggtcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgc gggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggactg gtggggaggctgggccgtcggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgotcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgactt cccgctctactacaagatggacgcggcctttgacaacaagaacattcccgcactcgtcgaggccctcaagaacgggggcacagtcgtcagcc gcgacccgtttaaggccgtaaccttcgttgcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgag ggccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccgg aggaagcactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaa cctcgcctcaagcaaagccggàaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggt ggacaagtgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagc tactgcggtgttgggtga

    SEQIDNO.: 2

    Met A!- Lys Tyr Ssr Glu Leu Glu Glu Gly Gly Leu Ile Mcí Gin Ale rha Tyr Trp v ai πυ mci

    Gly Gly De Trp Trp Asp Thr He Ala Gin Lys De Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly De Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai De Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser De Gly De Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe De Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr De Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu De Trp De His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr De Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys De His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQIDNO.: 3 atggccaagtacctggagctcgaagagggcgggctcatoatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgat agcccagaagatacccgaçtgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacaccgcccacgcctacggcatcaaggtcatcgcagacatagtaatcaaccaccgcgccggaggagaccttgagtggaacccct tcgtcaatgactacacctggacggacttctcgaaggtcgcttccggcaagtacacggccaattacctcgacttccacccgaacgagctccatgc gggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggclgaactggt gggsaggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcg ccctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcgac ccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggcc
27. 27/116

    Fig 16(cont.) agccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggagga agcactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacctc gcctcaagcgaagccggaaggtgggtctacgttccgaagttcgcgggagcgtgcatccacgagtacaccggcaacctcggcggctgggtgg acaagtgggtggactcaagcgggtgggtgtacctcgaggcccctgcccacgacccggccaacggctattacggctactccgtctggagctatt gcggtgttgggtga

    SEQ ID NO.: 4

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Met Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pto Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser He Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin TTir Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ala Ser Ser Glu Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asn Prn AJa Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 5 atggccaagtactccgagctggaagagggcggcgttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccat caggagcaagataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcccccggcaagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacaccgcccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggtgacctggagtggaacccctt cgtgaacgactatacctggaccgacttctcaaaggtcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgc gggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggt ggggaggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcg ccctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcgac ccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtaccttgcttatgctttcatcctcacctacgaaggccag cccgtcatattctaccgcgaccacgaggagtggctcaacaaggacaggttgaacaacctcatatggatacacgaccacctcgcaggtggaag caccgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacctaggc tcgagcaaggccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtagacaa gtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctactgcggg gtgggctga

    SEQ IDN0.:6

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly
28. 28/116

    Fig 16(cont.)

    Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Tip Vai Vai Lys Asp Tip Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Vai Ile Phe Tyr Arg Asp His Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Asn Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Tip Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 9 atggccaagtactccgagctggaagagggcgggctcataatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgat agcccagaagatacccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatg cgggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggt ggggaggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcg ccctctactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgccctggtggacgcr.rtçagntacggtc^gsjsgtggícsgvtgug acccgncaaggctgtgacgtttgtagccaaccacgataccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggc cagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggagg aagcactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgcgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacct cgcctcaagcaaagccggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggtgg acaagtgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagctac tgcggtgttgggtga

    SEQ ID NO.: 10

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Met Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Asp Tip Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Vai Asp Ala Leu Arg Tyr Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Ala Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu ·«···· « · · · ·

    Fig 16(cont.)
29. 29/116 ··· ···

    Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Tip Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Tip Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 11 atggccaagtacctggagctcgaggagggcgggctcataatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgat agcccagaagatacccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacaccgcccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggtgacctggagtggaacccctt cgtgaacgactatacctggaccgacttctcaaaggtcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgc gggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggt ggggaggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcg ccctctactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgccctggtggacgccctcagatacggtcagacagtggtcagccgcg acccgttcaaggctgtgacgtttgtagccaaccacgataccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggc cagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggatacgctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggagg aagcacgagcatagtttactacgacagcgacgagatgatcttcgtgaggaacggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaacctc ggctcgagcaaggttggaaggtgggtctacgttccgaagttcgcgggagcgtgcatccacgagtacaccggcaacctcggcggctgggtgg acaagtgggtggactcaagcgggtgggtgtacctcgaggcccctgcccacgacccggccaacggctattacggctactccgtctggagctac tgcggtgttggctga

    SEQ IDNO.: 12

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Met Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Are Phe Gly Ser Lys Gin Gin Leu Vai Asn Met lie Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai Ile Ala Asp De Vai íle Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Tip Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Vai Asp Ala Leu Arg Tyr Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg, Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Thr Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr lie Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQID NO.: 13 atggccaagtacctggagctcgaagagggcggggtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaat acggcagaagataccggagtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtatgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaac atgataaacacggcacatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccgtt cgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccaccccaacgaggtcaagtg ctgtgacgagggcacatttggaggcttcccagacatagcccacgagaagagctgggaccagcactggctctgggcgagcgatgagagctac gccgcctacctaaggagcatcggcgttgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggactg gtggggaggctgggccgtcggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgactt
30. 30/116

    Fig 16(cont.) cccgctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcg acccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggàacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgaggg ccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggag gaagcactgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacct aggctcgagcaaggccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtag acaagtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctactg cggígttggctga

    SEQIDNO.: 14

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Gin Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly He Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gin His Tip Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Tip Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Ajg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn T.en Gly Ser Ser Lys Ala Gly Aig Trp 'vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQIDNO.: 15 atggccaagtactccgagctggaagagggcgggctcataatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgat agcccagaagatacccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatg cgggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggactg gtggggaggctgggccgtcggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgactt cccgctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcg acccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatttggaacaagtacccggcctacgccttcatcctcacctacgaggg ccagccgacgatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggctcaagaacctcatctggatacacgaccaccttgccggtg gaagcactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacc tcgcctcaagcaaagccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtag acaagtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctattgc gglgttgggtga

    SEQIDNO.: 16

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31. 31/116

    Fig 16 (cont.)

    Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Tip Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu GIn Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Ττρ Leu Asn Lys Asp Arg Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr fle Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQID NO.: 17 atggccaagtactccgagctggaagggggcgggctcataatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgat agcccagaagatacccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccaggagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccaccccaacgaggtcaagt gctgtgacgagggcacatttggaggcttcccagacatagcccacgagaagagctgggaccagcactggctctgggcgagcgatgagagcta cgccgcctacctaaggagcatcggcgttgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactegctggaef ggtgeggaggctgggrpgícgggg2gísctgggaçaeaaacgrtgargcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgac ttcccgctctactacaagatggacgcggcctttgacaacaagaacattcccgcactcgtcgaggccctcaagaacgggggcacagtcgtcagc cgcgacccgtttaaggccgtaaccttcgttgcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacga gggccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccg gaggaagcacgagcatagtttactacgacagcgacgagatgatcttcgtgaggaacggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaa cctcggctcgagcaaggttggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggt ggacaagtgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagc tactgcggtgttgggtga

    SEQID NO.: 18

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Gly Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Met Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Glu Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Vai • · · ··· ··· ··· · (J »····· · · ··· *-**r >

    » · ί · · · · · · · A-r⁷-’

    Fig I6(cont.)
32. 32/116

    Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys He His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ IDNO.: 19 atggccaagtacctggagctcgaagagggcgggctcataatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgat agcccagaagatacccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattcctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgattattttgaccttggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacat gataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccgttc gttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgcg ggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgc ggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggtgg gggggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcgcc ctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcgaccc gttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatttggaacaagtacccggcctacgccttcatcctcacctacgagggccag ccgacgatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggctcaagaaçctcatctggatacacgaccacctcgccggtggaag cactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacctcgc ctcaagcaaagccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagcatactggtaacctcggaggctgggtagaca agtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctactgcgg tgttggctga

    SEQ ID NO.: 20

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Met Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala Tle Trp He rro rro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys He His Glu His Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQ ID NO.: 21 atggccaagtactccgagctggaagagggcggcgttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccat caggagcaagataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcctcccgggagcaagggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgatgatttggacctgggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaac atgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccgtt cgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgc gggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac
33. 33/116

    Fig 16 (cont.) gcggtatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggactg gtggggaggctgggccgtcggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgactt cccgctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcg acccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatttggaacaagtacccggcctacgccttcatcctcacctacgaggg ccagccgacgatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggctcaagaacctcatctggatacacgactacctcgccggtg gaagcactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacc tcgcctcaagcaaagccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtag acaagtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctattgc * ggtgttggctga

    SEQ ID NO.: 22

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Gly Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Asp Leu Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Vai Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tvr Arg Asp Tvr Glu Gly Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Tyr Leu Àla Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQ ID NO.: 23 atggccaagtactccgagctggaagagggcggcgttatagtgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccat caggagcaagataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatg cgggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggactg gtggggaggctgggccgtcggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgactt cccgctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcg acccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgaggg ccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggag gaagcatgagcatagtttactacgacagcgacgagatgatcttcgtgaggaacggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaacctc ggctcgagcaaggttggaaggtgggtctacgttccgaagttcgcgggagcgtgcatccacgagtacaccggcaacctcggcggctgggtgg acaagtgggtggactcaagcgggtgggtgtacctcgaggcccctgcccacgacccggccaacggctattacggctactccgtctggagctatt gcggtgttggctga

    SEQ ID NO.: 24 ι ι ’ :
34. 34/116

    Fig 16(cont.)

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Vai Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Tip Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Tip Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asp Tip Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe VaLAla Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe He Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr He Phe. Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Met Ser Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 25 atggccaagtacctggagctcgaagagggcgggctcataatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgat agcccagaagatacccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattcctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacat gataaacaccgcccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggtgacctggagtçgaaccccttcgt gaacgsctatacctggãúugaUicicaaaggrcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgcggg cgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgcgg catatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggtgggg aggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcgccctc tactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgccctggtgggcgccctcagatacggtcagacagtggtcagccgcgaccc gttcaaggctgtgacgtttgtagccaaccacgataccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggccagc cgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggaggaagc accgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggcacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacctaggct cgagcaaggccggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggtggacaa gtgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagctattgcg gtgttgggtga

    SEQ ID NO.: 26

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Met Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala He Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly TyT Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Tip Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Vai Gly Ala Leu Arg Tyr Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp tt »

    Fig 16(cont.)

    Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile He Tip Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg His Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 27 atggcaaagtattccgagctcgaagagggcggcgttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccatc aggagcaagataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatggg ctacgacccctacgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacatg ataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccgttcgt tggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgcggg cgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgcgg catatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggtgggg aggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcgccctc tactacaagatggacgcggcctttgacaacaagaacattcccgcactcgtcgaggccctcaagaacgggggcacagtcgtcagccgcgacc cgtttaaggccgtaaccttcgttgcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggccag ccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggaggaag cactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacctcgc gtcaagcaaagccggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggtggaca agtgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagctactgc ggtgttgggtga

    SEQ ID NO.: 28

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    36/116

    Fig 16(cont.) catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggtctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgc gggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggt ggggaggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcg ccctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcgac ccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtaccttgcttatgccttcatcctcacctacgaaggccag cccgtcatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggttgaacaacctcatatggatacacgaccacctcgcagggggaag caccgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacctaggc tcgagcaaggccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtagacaa gtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctactgcggt gttgggtga

    SEQ IDNO.: 30

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    SEQ IDNO.: 31 atggcaaagtactccgagctggaagagggcggcgttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccat caggagcaggataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatg cgggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctcaactgg tggggcggctgggccgttggcgagtactgggacaccaacgttgatgcactcctcaactgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgacttc ccgctctactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgccctggtggacgccctcagatacggtcagacagtggtcagccgc gacccgttcaaggctgtgacgtttgtagccaaccacgataccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgaggg ccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctggccggag gaagcacgagcatagtttactacgacagcgacgagatgatcttcgtgaggaccggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaacct cggctcgagcaaggttggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtaga caagtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctattgcg gtgttggctga

    37/116

    Fig 16 (cont.) ······ · · ·

    SEQ IDNO.:32

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Mel Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Arg lie Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Tip Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Vai Asp Ala Leu Arg Tyr Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp He Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Thr Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQIDNO.: 33 atggccaagtactccgagctggaagagggcggggtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaat acggcagaagataccggagtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacat gataaacacggccoatgcçtnpggcoí33aggícatagcggâcâiügíi;aiaaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccgttc gttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgcg ggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgc ggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctcaactggtg gggcggctgggccgttggcgagtactgggacaccaacgttgatgcactcctcaactgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgactttcc gctctactacaagatggacgcggcctttgacaacaagaacattcccgcactcgtcgaggccctcaagaacgggggcacagtcgtcagccgcg acccgtttaaggccgtaaccttcgttgcaaaccacgacaccgatataatctggaccaagtaccttgcttatgctttcatcctcacctacgaaggcca gcccgtcatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggttgaacaacctcatatggatacacgaccacctcgcaggtggaag caccgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacctaggc tcgagcaaggccggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggtggacaa gtgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagctactgcg gtgttggctga

    SEQIDNO.: 34

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Gin Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Tip Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala

    Fig 16 (cont.)
35. 38/116 • ··· ··· ·· · » • · · · · · · • · · · · · «

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    SEQ ID NO.: 36

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Tip Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu lie Trp Ile His Asp Asn Vai Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tip Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQ ID NO.: 71 atggccaagtacctggagctcgaagagggcggggtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaat

    Fig 16(cont.)
36. 39/116 acggcagaagataccggagtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtagcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatg cgggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggt ggggaggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcg ccctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcgac ccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggcc agccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatetggatacatgacaacctcgccggagga agcactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacctc gcctcaagcaaagccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcalccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtaga caagtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctactgc ggggtgggctga

    SEQ ID NO.: 72

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Gin Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Tip Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lyç Va! Phe Asp The Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr He Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Tip Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr He Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQ ID NO.: 49 gtggtttatgacgatgtccgctatgacctttatgccgtaggcatgggccgtgtttatcatgttcacgagctcctgcttggagccaaagcgcgtctct accgttcccttctggtcgtactcaccgaggtcaaagaagtcgtaggggtcgtagcccatcgaataggcgccgcccatgcccttgctcgccggg ggaatccatatcgccgaaatcccggcgcttgcccagtcgggtatcttctgggctatcgtgtcccaccagattcctcccatggggacgtcccagta gaaggcctgcattatgagcccgccctcttcgagcccggaatactttgccataagttacctcctactagtagattaaaattctgtttcctgtgtgaaatt gtt

    SEQIDNO.: 50

    Vai Vai Tyr Asp Asp Vai Arg Tyr Asp Leu Tyr Ala Vai Gly Met Gly Arg Vai Tyr His Vai His Glu Leu Leu Leu Gly Ala Lys Ala Arg Leu Tyr Arg Ser Leu Leu Vai Vai Leu Thr Glu Vai Lys Glu Vai Vai Gly Vai Vai Ala His Arg Ile Gly Ala Ala His Ala Leu Ala Arg Arg Gly Asn Pro Tyr Arg Arg Asn Pro Gly Ala Cys Pro Vai Gly Tyr Leu Leu Gly Tyr Arg Vai Pro Pro Asp Ser Ser His Gly Asp Vai Pro Vai Glu Gly Leu His Tyr Glu Pro Ala Leu Phe Glu Pro Gly Ile Leu Cys His Lys Leu Pro Pro Thr Ser Arg Leu Lys Phe Cys Phe Leu Cys Glu Ile Vai
37. 40/116

    Fig l6(cont.)

    SEQIDNO.: 51 ,

    ATGGCCAAGTACCTGGAGCTCGAAGAGGGCGGGGTCATAATGCAGGCGTTCTACTGGG acgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaatacggcagaagataccggagtggt

    ACGATGCCGGAATCTCCGCAATATGGATTCCCCCGGCGAGCAAGGGCATGGGCGGCGC

    CTATTCGATGGGCTACGACCCCTACGACTTCTTTGACCTCGGTGAGTACGACCAGAAG

    GGAACGGTAGAGACGCGCTTTGGCTCCAAGCAGGAGCTCGTGAACATGATAAACACC

    GCCCACGCCTATGGCATGAAGGTAATAGCCGATATAGTCATCAACCACCGCGCCGGCG

    GTGACCTGGAGTGGAACCCCTTCGTGAACGACTATACCTGGACCGACTTCTCAAAGGT

    CGCGTCGGGTAAATACACGGCCAACTACCTCGACTTCCACCCCAACGAGGTCAAGTGC

    TGTGACGAGGGCACATTTGGAGGCTTCCCAGACATAGCCCACGAGAAGAGCTGGGAC

    CAGCACTGGCTCTGGGCGAGCGATGAGAGCTACGCCGCCTACCTAAGGAGCATCGGCG

    TTGATGCCTGGCGCTTTGACTACGTGAAGGGCTACGGAGCGTGGGTCGTCAAGGACTG

    GCTCAACTGGTGGGGCGGCTGGGCCGTTGGCGAGTACTGGGACACCAACGTTGATGCA

    CTCCTCAACTGGGCCTACTCGAGCGGCGCCAAGGTCTTCGACTTCCCGCTCTACTACAA

    GATGGATGAGGCCTTTGACAACAAAAACATTCCAGCGCTCGTCTCTGCCCTTCAGAAC

    GGCCAGACTGTTGTCTCCCGCGACCCGTTCAAGGCCGTAACCTTTGTAGCAAACCACG

    ACACCGATATAATCTGGAACAAGTATCCAGCCTACGCGTTCATCCTCACCTACGAGGG

    CCAGCCGACAATATTC.TACCGCGACTACGAGGAGTGGCTCAACAAGGATAAGCTCAAG

    AACCTCATCTGGATACATGACAACCTCGCCGGAGGAAGCACTGACATCGTTTACTACG

    ACAACGACGAGCTGATATTCGTGAGAAACGGCTACGGAAGCAAGCCGGGACTGATAA

    CATACATCAACCTCGCCTCAAGCAAAGCCGGAAGGTGGGTTTACGTTCCGAAGTTCGC

    AGGCTCGTGCATACACGAGTACACCGGCAATCTCGGCGGCTGGGTGGACAAGTGGGTG

    GACTCAAGCGGCTGGGTCTACCTCGAGGCTCCTGCCCACGACCCGGCCAACGGCCAGT

    ACGGCTACTCCGTCTGGAGCTATTGCGGTGTTGGCTGA

    SFn τη wn _: 52

    MAfCYLELEEGGVIMQAFYWDVPSGGIWWDTIRQKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMGGAYS

    MGYDPYDFFDLGEYDQKGTVETRFGSKQELVNMINTAHAYGMKVIADIVINHRAGGDLE

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    FVRNGYGSKPGLITYINLASSKAGRWVYVPKFAGSCIHEYTGNLGGWVDKWVDSSGWVY

    LEAPAHDPANGQYGYSVWSYCGVG

    SEQ ID NO.: 37 atggccaagtacctggagctcgaagagggcggggtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaat acggcagaagataccggagtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacaccgcccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggtgacctggagtggaacccctt cgtgaacgactatacctggaccgacttctcaaaggtcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgc gggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctac gcggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgcgggtcgtcaaggaclggctcaactg gtggggcggctgggccgttggcgagtactgggacaccaacgttgatgcactcctcaactgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgactt cccgctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcg acccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgaggg ccagccgacaatattctatcgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggagg aagcactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacct cgcctcaagcaaagccggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggtgg ι : · t:

    Fig 16(cont.)
38. 41/116 acaagtgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagctac tgcggggtggggtga

    SEQ ID NO.: 38

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai He Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Ser Gly Gly Ile Tip Trp Asp Thr Ile Arg Gin Lys He Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly He Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Tip Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Tip Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Arg Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Tip Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tip Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQ ID NO.: 39 atggccaagtacctggagctcgaagagggcggggtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcaggaggaatategtgggacacaat acggcagaagataccggagtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcctcccgcgagcaggggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacat gataaacaccgcccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggtgacctggagtggaaccccttcgt gaacgactatacctggaccgacttctcaaaggtcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgcggg cgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgcgg catatctcaggagcatcggtatcgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctcaactggtggg gcggctgggccgttggcgagtactgggaccccaacgttgatgccctcctcccctgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgacttcccgc tctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcgacccg ttcaaggccgtaacctttgtagccaaccacgataccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggccagcc gacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggaggaagca ccgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacctaggctc gagcaaggccggaaggtgggtctacgttccgaagttcgcgggagcgtgcatccacgagtacaccggcaacctcggcggctgggtggacaa gtgggtggactcaagcgggtgggtgtacctcgaggcccctgcccacgacccggccaacggctattacggctactccgtctggagctactgcg gggtgggctga

    SEQ ID NO.: 40

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Ser Gly Gly Ile Tip Trp Asp Thr Ile Arg Gin Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Arg Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala

    Fig 16 (cont.)
39. 42/116

    Tyr Leu Arg Ser Ile Gly He Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Pro Asn Vai Asp Ala Leu Leu Pro Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Tip Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQIDNO.: 41 atggccaagtacctggagctcgaagagggcggggtcataatgcaggcgttòtactgggacgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaat acggcagaagataccggagtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacat gataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccgttc gttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgcg ggcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgc ggcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctcaactggtg gggcggctgggccgttggcgagtactgggacaccaacgttgatgcactcctcaactgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgacttccc gctctactacaagatggacgcggcctttgacaacaagaacattcccgcactcgtcgaggccctcaagaacgggggcacagtcgtcagccgcg acccgtttaaggccgtaaccttcgttgcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggc cagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggagg aagcacgagcatagtttactacgacagcgacgagatgatcttcgtgaggaacggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaacctc ggctcgagcaaggnggaaggigggiíiaigígccgsagttcg=gggcgcgt2catccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtagac aagtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctactgcg gtgttgggtga

    SEQ ID NO.: 42

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Gin Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Tip Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    Fig 16 (cont.)
40. 43/116

    SEQ ID NO.: 43 atggccaagtactccgagctggaagagggcggcgttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccat caggagcaagataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccaccccaacgaggtcaagt gctgtgacgagggcacatttggaggcttcccagacatagcccacgagaagagctgggaccagcactggctctgggcgagcgatgagagcta cgccgcctacctaaggagcatcggcgttgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggact ggtggggaggctgggccgtcggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgac ttcccgctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgc gacccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagg gccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgtcggag gaagcacgagcatagtttactacgacagcgacgagatgatcttcgtgaggaacggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaacct cggctcgagcaaggttggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggtgg acaagtgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagctac tgcggtgttggctga

    SEQ ID NO.: 44

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lyc Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Vai Gly Gly Ser Thr Ser Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQID NO.: 45 atggccaagtactccgacctggaagagggcggcgttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccat caggagcaagataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccg ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccaccccaacgaggtcaagt gctgtgacgagggcacatttggaggcttcccagacatagcccacgagaagagctgggaccagcactggctctgggcgagcgatgagagcta cgccgcctacctaaggagcatcggcgttgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctcaactg gtggggcggetgggccgttggcgagtactgggacaccaacgttgatgcactcctcaactgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgáctt cccgctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcg acccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgaggg ccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggag <

    » ;
41. 44/116

    Fig 16 (cont.) gaagcaccgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacct aggctcgagcaaggccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtag acaagtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctattgc ggtgttgggtga

    SEQ ID NO.: 46

    Met Ala Lys Tyr Ser Asp Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp TyT Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Tip Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQ ID NO.: 47 atggccaagtacaccgagctggaagagggcggcgttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccat caggagcaagataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatg ggctacgacccctacgacttctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaa catgataaacaccgcccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggtgacctggagtggaacccctt cgtgaacgactatacctggaccgacttctcaaaggtcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccaccccaacgaggtcaagtg ctgtgacgagggcacatttggaggcttcccagacatagcccacgagaagagctgggaccagcactggctctgggcgagcgatgagagctac gccgcctacctaaggagcatcggcgttgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctcaactgg tggggcggttgggcegttggcgagtactgggacaccaacgttgatgcactcctcaactgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgacttc ccgctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcga cccgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtaccttgcttatgctttcatcctcacctacgaaggcca gcccgtcatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggttgaacaacctcatatggatacacgaccacctcgcaggtggaag cacgagcatagtttactacgacagcgacgagatgatcttcgtgaggaacggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaacctcggct cgagcaaggttggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggcccgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggtggacaag tgggtggactcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagctactgcgg tgttgggtag

    SEQ ID NO.: 48

    Met Ala Lys Tyr Thr Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys

    Fig 16 (cont.)
42. 45/116

    Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn ValAsp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn He Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Vai Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Asn Asn Leu Ile Trp He His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Pro Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ IDNO.: 53

    ATGGCCAAGTACTCCGAGCTGGAAGAGGGCGGCGTTATAATGCAGGCCTTCTACTGGG

    ACGTCCCAGGTGGAGGAATCTGGTGGGACACCATCAGGAGCAAGATACCGGAGTGGT

    ACGAGGCGGGAATATCCGCCATTTGGATTCCCCCGGCGAGCAAGGGCATGGGCGGCG

    CCTATTCGATGGGCTACGACCCCTACGACTTCTTTGACCTCGGTGAGTACGACCAGAA

    GGGAACGGTAGAGACGCGCTTTGGCTCCAAGCAGGAGCTCGTGAACATGATAAACAC

    GGCCCATGCCTACGGCATAAAGGTCATAGCGGACATCGTCATAAACCACCGCACAGGC

    GGAGACCTCGAGTGGAACCCGTTCGTTGGGGACTACACCTGGACGGACTTCTCAAAGG

    TGGCCTCGGGCAAATATACTGCCAACTACCTCGACTTCCACCCCAACGAGGTCAAGTG

    CTGTGACGAGGGCACATTTGGAGGCTTCCCAGACATAGCCCACGAGAAGAGCTGGGA

    CCAGCACTGGCTCTGGGCGAGCGATGAGAGCTACGCCGCCTACCTAAGGAGCATCGGC

    G Γ1 GaTGCCTGGCGCTTCGACTACGTCAAGGGCTACGGAGCGTGGGTCGTCAAGGACT

    GGCTGGACTGGTGGGGAGGCTGGGCCGTCGGGGAGTACTGGGACACAAACGTTGAlG cactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgacttcccgctctactac

    AAGATGGATGAGGCCTTTGACAACAAAAACATTCCAGCGCTCGTCTCTGCCCTTCAGA

    ACGGCCAGACTGTTGTCTCCCGCGACCCGTTCAAGGCCGTAACCTTTGTAGCAAACCA

    CGACACCGATATAATCTGGAACAAGTATCCAGCCTACGCGTTCATCCTCACCTACGAG

    GGCCAGCCGACAATATTCTACCGCGACTACGAGGAGTGGCTCAACAAGGATAAGCTCA

    AGAACCTCATCTGGATACATGACAACCTCGCCGGAGGAAGCACTGACATCGTTTACTA

    CGACAACGACGAGCTGATATTCGTGAGAAACGGCTACGGAAGCAAGCCGGGACTGAT

    AACATACATCAACCTCGCCTCAAGCAAAGCCGGAAGGTGGGTCTACGTTCCGAAGTTC

    GCGGGAGCGTGCATCCACGAGTACACCGGCAACCTCGGCGGCTGGGTGGACAAGTGG

    GTGGACTCAAGCGGGTGGGTGTACCTCGAGGCCCCTGCCCACGACCCGGCCAACGGCT

    ATTACGGCTACTCCGTCTGGAGCTACTGCGGTGTTGGCTGA

    SEQ ID NO.: 54

    MAKYSELEEGGVIMQAFYWDVPGGGrWWDTIRSKIPEWYEAGISAIWIPPASKGMGGAYS

    MGYDPYDFFDLGEYDQKGTVETRFGSKQELVNMINTAHAYGIKVIADIVINHRTGGDLEW

    NPFVGDYTWTDFSKVASGKYTANYLDFHPNEVKCCDEGTFGGFPDIAHEKSWDQHWLW

    ASDESYAAYLRSIGVDAWRFDYVKGYGAWWKDWLDWWGGWAVGEYWDTNVDALL

    NWAYSSDAKVFDFPLYYKMDEAFDNKNIPALVSALQNGQTVVSRDPFKAVTFVANHDTD

    IIWNKYPAYAFILTYEGQPTIFYRDYEEWLNKDKLKNLIWIHDNLAGGSTDIVYYDNDELIF

    VRNGYGSKPGLITYINLASSKAGRWVYVPKFAGACIHEYTGNLGGWVDKWVDSSGWVY

    LEAPAHDPANGYYGYSVWSYCGVG

    SEQ ID NO.: 55 * ϊ *
43. 46/116

    Fig 16 (cont.)

    ATGGCCAAGTACCTGGAGCTCGAGGAGGGCGGGGTCATAATGCAGGCGTTCTACTGGG acgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaatacggcagaagataccggagtggt

    ACGATGCCGGAATCTCCGCAATATGGATTCCCCCGGCGAGCAAGGGCATGGGCGGCGC

    CTATTCGATGGGCTACGACCCCTACGACTTCTTTGACCTCGGTGAGTACGACCAGAAG

    GGAACGGTAGAGACGCGCTTTGGCTCCAAGCAGGAGCTCGTGAACATGATAAACACC

    GCCCACGCCTATGGCATGAAGGTAATAGCCGATATAGTCATCAACCACCGCGCCGGCG

    GTGACCTGGAGTGGAACCCCTTCGTGAACGACTATACCTGGACCGACTTCTCAAAGGT

    CGCGTCGGGTAAATACACGGCCAACTACCTCGACTTCCACCCGAACGAGCTCCATGCG

    GGCGATTCCGGAACATTTGGAGGCTATCCCGACATATGCCACGACAAGAGCTGGGACC

    AGTACTGGCTCTGGGCCAGCCAGGAGAGCTACGCGGCATATCTCAGGAGCATCGGCAT

    CGATGCCTGGCGCTTTGACTACGTGAAGGGCTACGGAGCGTGGGTCGTCAAGGACTGG

    CTCAACTGGTGGGGCGGCTGGGCCGTTGGCGAGTACTGGGACACCAACGTTGATGCAC

    TCCTCAACTGGGCCTACTCGAGCGGCGCCAAGGTCTTCGACTTCCCGCTCTACTACAAG

    ATGGATGAGGCCTTTGACAACAAAAACATTCCAGCGCTCGTCTCTGCCCTTCAGAACG

    GCCAGACTGTTGTCTCCCGCGACCCGTTCAAGGCCGTAACCTTTGTAGCAAACCACGA

    CACCGATATAATCTGGAACAAGTACCTTGCTTATGCTTTCATCCTCACCTACGAAGGCC

    AGCCCGTCATATTCTACCGCGACTACGAGGAGTGGCTCAACAAGGACAGGTTGAACAA

    CCTCATATGGATACACGACCACCTCGCAGGTGGAAGCACGAGCATAGTTTACTACGAC

    AGCGACGAGATGATCTTCGTGAGGAACGGCTATGGAAGCAAGCCTGGCCTTATAACTT φ ACATCAACCTCGGCTCGAGCAAGGTTGGAAGGTGGGTTTACGTTCCGAAGTTCGCAGG

    CTCGTGCATACACGAGTACACCGGCAATCTCGGCGGCTGGGTGGACAAGTGGGTGGAC TCAAGCGGCTGGGTCTACCTCGAGGCTCCTGCGCACGACCCGGCCAACGGCCAGTACG GCTACTCCGTCTGGAGCTATTGCGGTGTTGGCTGA

    SEQ ID NO.: 56

    JVLvKYLELEEGGVIMQ.WVDVPSG^TWWDTIROKIPEWYDAGISAIWIPPASKGMGGAYS

    - - MGYDPYDFFDLGEYDQKGTVETRFGSKQELVNMINTAHAYGMKVIADIVINHKAGÜDLE

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    SEQ ID NO.: 57

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    ACGTGCCTTCAGGAGGAATATGGTGGGACACAATACGGCAGAAGATACCGGAGTGGT

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44. 47/116

    Fig 16 (cont.) taccgatataatctggaacaagtaccttgcttatgctttcatcctcacctacgaaggcc

    AGCCCGTCATATTCTACCGCGACTACGAGGAGTGGCTCAACAAGGACAGGTTGAACAA

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    ACTCAAGCGGGTGGGTGTACCTCGAGGCCCCTGCCCACGACCCGGCCAACGGCTATTA

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    SEQ ID NO.: 58

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    SEQ ID NO.: 59 atggccaagtacctggagctcgaagagggcggggtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaat acggcagaagataccggagtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacat gataaacaccgcccacgcctacggcatcaaggtcatcgcagacatagtaatcaaccaccgcgccggaggagaccttgagtggaaccccttcg tcaateactacacctggacggacttctcgaaggtcgcttccggcaagtacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgcgg gcgattccggaacatttggaggctatcccgauaíaígccacgac2?g»gcteggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgcg gcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggaciggcígaactggtggg gaggctgggcggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcgccct ctactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgccctggtggacgccctcagatacggtcagacagtggtcagccgcgacc cgttcaaggctgtgacgtttgtagccaaccacgataccgatataatttggaacaagtacccggcctacgccttcatcctcacctacgagggccag ccgacgatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggctcaagaacctcatctggatacacgaccacctcgccggtggaag cactgacatcgtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacctcgc gtcaagcaaagccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtagaca agtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctattgcggt gttgggtga

    SEQ ID NO.: 60

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    Fig 16 (cont.)
45. 48/116 ······ · · ·

    Ala Phe Ile Leu Thi Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Tip Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQ ID NO.: 61 atggccaagtactccgagctgaaaaagggcggggtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaat acggcagaagataccggagtggtacgaggcgggaatatccgccatttggattcctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacat galaaacaccgcccacgcctacggcatcaaggtcatcgcagacatagtaatcaaccaccgcgccggaggagaccttgagtggaaccccttcg tcaatgactacacctggacggacttctcgaaggtcgcttccggcaagtacacggccaactacctcaacttccacccgaacgagctccatgcgg gcgattccggaacatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgcg gcatatctcaggagcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggactggtg gggaggctgggccgtcggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgacttccc gctctactacaagatggatgaggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcgacc cgttcaaggccgtaacctttgtagcaaaccatgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggccag ccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggaggaag caccgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacctaggc tcgagcaaggccggaaggtgggtctacgttccgaagttcgcgggagcgtgcatccacgagtacaccggcaacctcggcggctgggtggaca agtgggtggactcaagcgggtgggtgtacctcgaggcccctgcccacgacccggccaacggctattacggctactccgtctggagctactgc ggggtgggctga

    SEQ IDNO.: 62

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46. 49/116

    Fig 16 (cont.) ttcgttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccaccccaacgaggtcaagt gctgtgacgagggcacatttggaggcttcccagacatagcccacgagaagagctgggaccagcactggctctgggcgagcgatgagagcta cgccgcctacctaaggagcatcggcgttgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctcaactg gtggggcggctgggccgttggcgagtactgggacaccaacgttgatgcactcctcaactgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgactt cccgctctactacaagatggacgcggcctttgacaacaagaacattcccgcactcgtcgaggccctcaagaacgggggcacagtcgtcagcc gcgacccgtttaaggccgtaaccttcgttgcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgag ggccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccgg aggaagcaccgacatagtctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaa cctaggctggagcaaggccggaaggtgggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctggg tagacaagtacgtctactcaagcggctgggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagcta ctgcggggtggggtga

    SEQ ID NO.: 64

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Gin Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Gly Gly Ala Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asp Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Vai Asn Met Πβ Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Ala He Ala Asp He Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tvr Glu Glv Gin p_ro n_g pu_c ·τ·„ ~-_JU q_1u

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47. 50/116

    Fig l6(cont.)

    SEQ ID NO.: 66

    Met Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Tip Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Gly Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Tip He Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu. Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Vai Asp Ala Leu Arg Tyr Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala' Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai TyT Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 67 atggccaagtacctggagctcgaagagggcggggtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcgggaggaatatggtgggacacaat acggcagaagataccggagtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgg gctacgacccctacgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacat gataaacacggcccatgcctacggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccgttc gttggggactacacctggacggacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttceaccccaacgaggtcaagtgct gtgacgagggcacatttggaggcttcccagacatagcccacgagaagagctgggaccagcactggctctgggcgagcgatgagagctacg ccgcctacctaaggagcatcggcgttgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggactggt ggggaggctgggccgtcggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgacttc ccgctctactacaagatggacgaggccttcgataacaacaacattcccgccctggtggacgccctcagatacggtcagacagtggtcagccgc gacccgttcaaggctgtgacgtttgtagccaaccacgataccgatataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgaggg ccagccgacaatattctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggag gaagcacgagcatagtttactacgacagcgacgagatgatcttcgtgaggaacggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaacct cggctcgagcaaggttggaaggtgggtctacgttccgaagttcgcgggagcgtgcatccacgagtacaccggcaacctcggcggctgggtg gacaagtgggtggactcaagcgggtgggtgtacctcgaggcccctgcccacgacccggccaacggctattacggctactccgtctggagcta ctgcgtggtgggctga

    SEQ ID NO.: 68

    Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe TyT Trp Asp Vai Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Gin Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu
48. 51/116

    Fig 16 (cont.)

    Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Vai Asp Ala Leu Arg Tyr Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu He Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser He Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Vai Vai Gly SEQ ID NO.: 73 atggctctggaagagggcgggcttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccatagcccagaagat acccgactgggcgagcgccgggatttcggcaatatggattcctcccgcgagtaagggcatgagcggcggctattcgatgggctacgacccct acgatttcttcgacctcggtgagtactaccagaagggaagcgttgagacccgcttcggatcaaaagaggagcttgtgaacatgataaacaccgc ccatgctcacaacatgaaggtcatagcggacatagtcatcaaccaccgcgccggcggcgacctggagtggaatcctttcaccaacagctacac ctggaccgatttctcgaaggtcgcgtcgggcaagtacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagcttcacgcgggcgattccggaa catttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagcactggctctgggccagcaacgaaagctacgccgcctacctccgg agcatcggcatcgacgcctggcgcttcgactacgtcaagggctacgctccctgggtcgttaagaactggctgaaccggtggggcggctgggc ggttggagagtactgggacaccaacgtcgatgcactcctgagctgggcctacgacagcggtgctaaagtcttcgacttcccgctctactacaag atggacgaggccttcgataacaacaacatccccgccctcgtggacgccctcaagaacggaggcacggtcgtcagccgcgacccgttcaaag ccgtgaccttcgttgccaaccacgataccaacataatctggaacaagtatccggcctacgccttcatcctcacctatgagggacagccggcaat attctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggctcaggaacctcatctggatacacgaccacctcgcgggaggaagcacagac atcatctactacgacagcgacgagcttatcttcgtgagaaacggctacggggacaagccgggactgataacctacatcaacctcggctcaagc aaggccggaaggtgggtctacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaacctcggcggctggattgacaagtgggt tgactcaagcggtcgggtctaccttgaggcccccgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtatggagctactgcggtgttg ggtga

    SEQ ID NO.: 74

    Met Ala Leu Glu Glu Gly Gly Leu He Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Ser Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Glu Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala His Asn Met Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Thr Asn Ser Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asn Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly He Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asn Trp Leu Asn Arg Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Ser Trp Ala Tyr Asp Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Vai Asp Ala Leu Lys Asn Gly Gly Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asn Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Ala Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Arg Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr He Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Ile Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Arg Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 75 atggctctggaagagggcgggcttataatgcaggcattctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgatagcccagaagat acccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggattccccccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgggctacgacccct

    Fig¹ 16 (cont.)
49. 52/116 acgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacaagattcggctcaaagcaggagctcataaacatgataaacaccg cccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggcgatctggagtggaaccccttcgtgaacgactata cctggaccgacttctcgaaggtcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccacgcgggcgattccgga acatttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgcggcctatctcag gagcatcggcatcgacgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcagggactggctgaactggtggggaggctggg cagttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcgccctctactacaag atggacgaggccttcgataacaacaacattcccgccctggtggacgccctcagatacggccagacagtggtcagccgcgacccgttcaaggc tgtgacgtttgtagccaaccacgataccgacataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggccagccgacaatat tctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggagggagcactgacatc gtttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacctcggctcaagcaaa gccggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaacctcggcggctgggtggacaagtgggtgga ctcaagcggctgggtttacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtttggagctattgcggtgttgggtga

    SEQ IDNO.: 76

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    SEQ ID NO.: 77 atggctctggaagagggcgggctcataatgcaggccttctactgggacgtccccatgggaggaatctggtgggacacgatagcccagaagat acccgactgggcaagcgccgggatttcggcgatatggatccctcccgcgagcaagggtatgagcggcggctattcgatgggctacgacccct acgattattttgacctcggtgagtactaccagaagggaacggtggaaacgaggttcggctcaaagcaggagctcataaacatgataaacaccg cccacgcctatggcatgaaggtaatagccgatatagtcatcaaccaccgcgccggcggtgacctggagtggaaccccttcgtgaacgactata cctggaccgacttctcaaaggtcgcgtcgggtaaatacacggccaactacctcgacttccacccgaacgagctccatgcgggcgattccggaa catttggaggctatcccgacatatgccacgacaagagctgggaccagtactggctctgggccagccaggagagctacgcggcatatctcagg agcatcggcatcgatgcctggcgcttcgactacgtcaagggctatgctccctgggtcgtcaaggactggctgaactggtggggaggctgggc ggttggagagtactgggacaccaacgtcgacgctgttctcaactgggcatactcgagcggtgccaaggtctttgacttcgccctctactacaaga tggacgaggccttcgataacaacaacattcccgccctggtggacgccctcagatacggtcagacagtggtcagccgcgacccgttcaaggct gtgacgtttgtagccaaccacgataccgacataatctggaacaagtatccagcctacgcgttcatcctcacctacgagggccagccgacaatatt ctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagctcaagaacctcatctggatacatgacaacctcgccggagggagcactgacatcg tttactacgacaacgacgagctgatattcgtgagaaacggctacggaagcaagccgggactgataacatacatcaacctcgcctcaagcaaag ccggaaggtgggtttacgttccgaagttcgcaggctcgtgcatacacgagtacaccggcaatctcggcggctgggtggacaagtgggtggac tcaagcggctgggtctacctcgaggctcctgcccacgacccggccaacggccagtacggctactccgtctggagctactgcggtgttgggtga

    Fig 16 (cont.)
50. 53/116 • ··· · · · · ·

    SEQ ID NO.: 78

    Met Ala Leu Glu Glu Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Met Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Asp Trp Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Met Lys Vai Ile Ala Asp He Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp He Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Gin Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Ala Pro Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Vai Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Asn Asn Ile Pro Ala Leu Vai Asp Ala Leu Arg Tyr Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe He Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Ala Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 79 atgaagcctgcgaaactcctcgtctttgtgctcgtagtctctatcctcgcggggctctacgcccagcccgcgggggcggccaagtacctggagc tcgaagagggcggcgtcataatgcaggcgttctactgggacgtgccttcaggaggaatatggtgggacacaatacggcagaagataccgga gtggtacgatgccggaatctccgcaatatggattcccccggcgagcaagggcatgggcggcgcctattcgatgggctacgacccctacgactt ctttgacctcggtgagtacgaccagaagggaacggtagagacgcgctttggctccaagcaggagctcgtgaacatgataaacaccgcccacg cctacggcatcaaggtcatcgcagacatagtaatcaaccaccgcgccggaggagaccttgagtggaaccccttcgtcaatgactacacctgga cggacttctcgaaggtcgcttccggcaagtacacggccaactacctcgacttccaccccaacgaggtcaagtgctgcgacgagggcacctttg gagggttcccggacatagcccacgagaagagctgggaccagtactggctctgggcgagcaacgagagctacgccgcctacctcaggagca tcggcgttgacgcatggcgcttcgactacgtcaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctggactggtggggaggctgggccgt cggggagtactgggacacaaacgttgatgcactgctcaactgggcctactcgagcgatgcaaaagtcttcgacttcccgctctactacaagatg gacgcggcctttgacaacaagaacattcccgcactcgtcgaggccctcaagaacgggggcacagtcgtcagccgcgacccgtttaaggccgt aaccttcgttgcaaaccacgacacggacataatttggaacaagtacccggcctacgccttcatcctcacctacgagggccagccgacgatattc taccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaggctcaagaacctcatctggatacacgaccacctcgccggtggaagcaccgacatag tctactacgataacgatgaactcatcttcgtcaggaacggctacggggacaagccggggcttataacctacatcaacctaggctcgagcaagg ccgggaggtgggtctacgttccgaagttcgcgggagcgtgcatccacgagtacaccggcaacctcggcggctgggtggacaagtgggtgga ctcaagcgggtgggtgtacctcgaggcccctgcccacgacccggccaacggctattacggctactccgtctggagctactgcggggtgggct

    6^a

    SEQ IDNO.: 80

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51. 54/116

    Fig 16 (cont.)

    Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asp Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Vai Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp He Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Asn Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys He His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Trp Vai Asp Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly SEQ IDN0.:81 atgaagaagtttgtcgccctgttcataaccatgtttttcgtagtgagcatggcagtcgttgcacagccagctagcgccgcaaagtattccgagctc gaagaaggcggcgttataatgcaggccttctactgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccatcaggagcaagataccggagt ggtacgaggcgggaatatccgccatttggattccgccagccagcaaggggatgagcggcggttactcgatgggctacgatccctacgatttctt tgacctcggcgagtacaaccagaagggaaccatcgaaacgcgctttggctctaaacaggagctcatcaatatgataaacacggcccatgccta cggcataaaggtcatagcggacatcgtcataaaccaccgcgcaggcggagacctcgagtggaacccgttcgttggggactacacctggacg gacttctcaaaggtggcctcgggcaaatatactgccaactacctcgacttccaccccaacgaggtcaagtgctgtgacgagggcacatttggag gcttcccagacatagcccacgagaagagctgggaccagcactggctctgggcgagcgatgagagctacgccgcctacctaaggagcatcg gcgttgatgcctggcgctttgactacgtgaagggctacggagcgtgggtcgtcaaggactggctcaactggtggggcggctgggccgttggc gagtactgggacaccaacgttgatgcactcctcaactgggcctactcgagcggcgccaaggtcttcgacttcccgctctactacaagatggatg aggcctttgacaacaaaaacattccagcgctcgtctctgcccttcagaacggccagactgttgtctcccgcgacccgttcaaggccgtaaccttt gtagcaaaccacgacaccgatataatctggaacaagtaccttgcttatgctttcatcctcacctacgaaggccagcccgtcatattctaccgcgac tacgaggagtggctcaacaaggacaggttgaacaacctcatatggatacacgaccacctcgcaggtggaagcacgagcatagtctactacga cagcgacgagatgatcttcgtgaggaacggctatggaagcaagcctggccttataacttacatcaacctcggctcgagcaaggttggaaggtg ggtttatgtgccgaagttcgcgggcgcgtgcatccacgagtatactggtaacctcggaggctgggtagacaagtacgtctactcaagcggctg ggtctatctcgaagctccagcttacgaccctgccaacgggcagtatggctactccgtgtggagctattgcggtgttgggtga

    SEQ ID NO.: 82

    Met Lys Lys Phe Vai Ala Leu Phe He Thr Met Phe Phe Vai Vai Ser Met Ala Vai Vai Ala Gin Pro Ala Ser Ala Ala Lys Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Gly Gly Vai Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg Ser Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Glu Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp He Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Asn Gin Lys Gly Thr Ile Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gin Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Vai He Ala Asp Ile Vai lie Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Gly Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Vai Lys Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Phe Pro Asp Ile Ala His Glu Lys Ser Trp Asp Gin His Trp Leu Trp Ala Ser Asp Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Lys Asn He Pro Ala Leu Vai Ser Ala Leu Gin Asn Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Vai Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Arg Leu Asn Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Vai Asp Lys Tyr Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    Fig 16 (cont.)
52. 55/116

    SEQ ID NO.: 83 atggctctggaagacggcgggctcataatgcaggccttctactgggatgttcctggaggaggaatctggtgggacacaatagctcaaaagata cccgaatgggcaagtgcaggaatctcagcgatatggattccaccagcgagtaagggcatgagcggtggttattccatgggctacgatccctac gatttctttgacctcggcgagtactatcagaaggggacagttgagacgcgcttcggctcaaaggaagaactggtgaacatgataaacaccgca cactcctacggcataaaggtgatagcagacatagtcataaaccaccgcgccggtggagaccttgagtggaaccccttcgtgaacgactatacct ggacagacttctcaaaagtcgcctccggtaaatatacggccaactaccttgacttccacccaaacgagcttcactgttgtgatgaaggtacctttg gaggataccctgatatatgtcacgacaaaagctgggaccagtactggctctgggcgagcagcgaaagctacgctgcctacctcaggagcata ggggttgacgcctggcgtttcgactacgtcaagggctacggagcatgggttgttaacgactggctcagctggtggggaggctgggccgttgga gagtactgggacacgaacgttgatgcactcctcaactgggcatacagcagcggcgccaaggtctttgacttcccgctctactacaagatggacg aagccttcgacaacaccaacatcccggcattagtggatgcactcagatacggccagacagtggtcagccgcgatcccttcaaggcggtaacttt cgttgccaaccacgatacagatataatctggaacaagtatccggcttatgcattcaíccttacctatgagggacagcctgttatattctaccgcgac tacgaggagtggctcaacaaggataagcttaacaacctcatctggatacacgatcaccttgctggagggagtactgacattgtttactacgacag cgacgagcttatctttgtgagaaacggctatggcaccaaaccaggactgataacctatatcaacctcggctcaagcaaagttggaaggtgggtc tacgttccaaagttcgccggttcatgcatccacgagtacaccggcaacctcggcggttggatagacaagtacgtctcctccagcggctgggtct atcttgaggccccagcccacgacccggcgaacggctactacggctactccgtatggagctactgcggggttgggtga

    SEQID NO.: 84

    Met Ala Leu Glu Asp Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Ala Gin Lys Ile Pro Glu Trp Ala Ser Ala Gly lie Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Glu Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ser Tyr Gly Ile Lys Vai Ile Ala Asp Ile Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Ser Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly Vai Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Asn Asp Trp Leu Ser Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Thr Asn Ile Pro Ala Leu Vai Asp Ala Leu Arg Tyr Gly Gin Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Vai Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Asn Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Thr Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Vai Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp Ile Asp Lys Tyr Vai Ser Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO.: 85 atggctctggaagagggcgggcttataatgcaggcattctattgggacgtcccaggtggaggaatctggtgggacaccatagcccagaagata cccgaatgggcaagtgcaggaatctcagcgatatggattccaccagcgagtaagggaatgagcggtggttattccatgggctacgatccctac gatttctttgacctcggcgagtactatcagaaggggacagttgagacgcgcttcggctcaaaggaagaactggtgaacatgataaacaccgca cactcctacggcataaaggtgatagcggacatagtcataaaccaccgcgccggtggaggcctcgagtggaaccccttcgtgaacgactatacc tggacagacttctcaaaagtcgcctccggtaaatatacagccaactaccttgacttccacccaaacgagcttcactgttgtgatgaaggtacctttg gaggataccctgatatatgtcacgacaaaagctgggaccagtactggctctgggcgagcagcgaaagctacgctgcctacctcaggagcata ggggttgacgcctggtgtttcgactacgtcaagggctacggagcctgggttgttaacgactggctcagctggtggggaggctgggccgttgga gagtactgggacactaacgttgatgcactcctcaactgggcatacaacagcggcgccaaggtctttgacttcccgctctactacaagatggacg aagccttcgacaataccaacatccccgctttggtttacgccctcaagaatggcgggacagtggtcagccgcgacccattcaaggcggtaacttt cgttgccaaccacgatacagatataatctggaacaagtatccggcttatgcattcatccttacctatgagggacagcctgttatattctaccgcgac tacgaggagtggctcaacaaggataagcttaacaacctcatctggatacacgatcaccttgctggagggagtactgacattgtttactacgacag cgacgagcttatctttgtgagaaacggctatggcaccaaaccaggactgataacctatatcaacctcggctcaagcaaagctggaaggtgggtc
53. 56/116

    Fig 16 (cont.) tacgttccaaagttcgccggttcatgcatccacgagtacaccggcagcctcggcggttggatagacaagtacgtctcctccagcggctgggtct accttgaggccccggcccacgacccggccaatggccagtatggctactccgtctggagctattgcggggttgggtga

    SEQ ID NO.: 86

    Met Ala Leu Glu Glu Gly Gly Leu Ile Met Gin Ala Phe Tyr Trp Asp Vai Pro Gly Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr He Ala Gin Lys Ile Pro Glu Trp Ala Ser Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp Pro Tyr Asp Phe Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gin Lys Gly Thr Vai Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Glu Glu Leu Vai Asn Met Ile Asn Thr Ala His Ser Tyr Gly Ile Lys. Vai Ile Ala Asp He Vai Ile Asn His Arg Ala Gly Gly Gly Leu Glu Trp Asn Pro Phe Vai Asn Asp Tyr Thr Trp Thr Asp Phe Ser Lys Vai Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Cys Cys Asp Glu Gly Thr Phe Gly Gly Tyr Pro Asp He Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Ser Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser He Gly Vai Asp Ala Trp Cys Phe Asp TyT Vai Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Vai Vai Asn Asp Trp Leu Ser Trp Trp Gly Gly Trp Ala Vai Gly Glu Tyr Trp Asp Thr Asn Vai Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Asn Ser Gly Ala Lys Vai Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Glu Ala Phe Asp Asn Thr Asn Ile Pro Ala Leu Vai Tyr Ala Leu Lys Asn Gly Gly Thr Vai Vai Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Vai Thr Phe Vai Ala Asn His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe He Leu Thr Tyr Glu Gly Gin Pro Vai Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Asn Asn Leu Ile Trp Ile His Asp His Leu Ala Gly Gly Ser Thr Asp Ile Vai Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Leu Ile Phe Vai Arg Asn Gly Tyr Gly Thr Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Ala Gly Arg Trp Vai Tyr Vai Pro Lys Phe Ala Gly Ser Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Ser Leu Gly Gly Trp Ile Asp Lys Tyr Vai Ser Ser Ser Gly Trp Vai Tyr Leu Glu Ala Pro Ala His Asp Pro Ala Asn Gly Gin Tyr Gly Tyr Ser Vai Trp Ser Tyr Cys Gly Vai Gly

    SEQ ID NO: 87 atgttcctgctcgcgtttttgctcactgcctcgctgttctgcccaacaggacagcccgccaaggctgccgcaccgtttaacggcaccatgatgca gtattttgaatggtacttgccggatgatggcacgttatggaccaaagtggccaatgaagccaacaacttatccagccttggcatcaccgctctttg gctgccgcccgcttacaaaggaacaagccgcagcgacgtagggtacggagtatacgacttgtatgacctcggcgaattcaatcaaaaaggga ccgtccgcacaaaatacggaacaaaagctcaatatcttcaagccattcaagccgcccacgccgctggaatgcaagtgtacgccgatgtcgtgtt cgaccataaaggcggcgctgacggcacggaatgggtggacgccgtcgaagtcaatccgtccgaccgcaaccaagaaatctcgggcacctat caaatccaagcatggacgaaatttgattttcccgggcggggcaacacctactccagctttaagtggcgctggtaccattttgacggcgttgattgg gacgaaagccgaaaattgagccgcatttaçaaattccgcggcatcggcaaagcgtgggattgggaagtagacacggaaaacggaaactatg actacttaatgtatgccgaccttgatatggatcatcccgaagtcgtgaccgagctgaaaaactgggggaaatggtatgtcaacacaacgaacatt gatgggttccggcttgatgccgtcaagcatattaagttcagtttttttcctgattggttgtcgtatgtgcgttctcagactggcaagccgctatttaccg tcggggaatattggagctatgacatcaacaagttgcacaattacattacgaaaacagacggaacgatgtctttgtttgatgccccgttacacaaca aattttataccgcttccaaatcagggggcgcatttgatatgcgcacgttaatgaccaatactctcatgaaagatcaaccgacattggccgtcacctt cgttgataatcatgacaccgaacccggccaagcgctgcagtcatgggtcgacccatggttcaaaccgttggcttacgcctttattctaactcggc aggaaggatacccgtgcgtcttttatggtgactattatggcattccacaatataacattccttcgctgaaaagcaaaatcgatccgctcctcatcgc gcgcagggattatgcttacggaacgcaacatgattatcttgatcactccgacatcatcgggtggacaagggaaggggtcactgaaaaaccagg atccgggctggccgcactgatcaccgatgggccgggaggaagcaaatggatgtactgttggcaaacaacacgctggaaaagtgttctatga

    SEQIDNO: 88

    Met Phe Leu Leu Ala Phe Leu Leu Thr Ala Ser Leu Phe Cys Pro Thr Gly Gin Pro Ala Lys Ala Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gin Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Vai Ala Asn Glu Ala Asn Asn Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Arg Ser Asp Vai Gly Tyr Gly Vai Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gin Lys Gly Thr Vai Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ala Gin Tyr Leu Gin Ala Ile Gin Ala Ala His Ala Ala Gly Met Gin Vai Tyr Ala Asp Vai Vai Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Trp Vai Asp Ala Vai Glu Vai Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gin Glu Ile Ser Gly Thr TyT Gin Ile Gin Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp •
54. 57/116

    Fig 16(cont.)

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55. 58/116

    Fig 16 (cont.) ······ · · · gagcgattgcgaaaaacacaaaagattacgtgctgaatttagaaacgaagcaattcaaaaagcttctcgagagtacttctagagcggccgcgg gcccatcgattttccacccgggtggggtaccaggta

    SEQ ID NO: 90

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    Figi 16 (cont.)
56. 59/116

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    SEQIDNO: 92

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    Fig 16 (cont.)
57. 60/116 ··· ··· ··· · • · · · · · • · · · · · • ··· · · · · ·

    SEQ ID NO: 93 atgaaatcgtttgcattcatgcctatccttttttatgcaaacgatttcatcagtgaaagggaaggaggaggaaaaatggggaagaatatgagaaga agattcacgtatttttcaatcttcttattgttcgttcagctgttttcatttagtgcaaccgctagcgccaatggaacggtgaacagtagtcctgtggttaa tggaaacgaagtcacgtttctatatggaggaacaggaaacgagcagtctgtgttactggcaggctcctttaatgattggcagaaagatggtgaca agaagattgcactaacaaaaggcgacaataacgtctggtctgtcacgcaaacacttcaagatgggacatatacgtataagtttgttgtagatggtc aatgggtggcggatccgcttaacccgaatcaagtagacgacggttacggcggccgtaatagtgtcgttgttgtcgggacaccggtgcaacaag aacggacagtgacgcttgttggtaacttacaagacgaattaggtcatacgagcgaatgggatccgaaagcgacagctacagtgatgaaaaagg aagggaacgggttatatacgtttacaggtacacttccagccggaacgtacgagtataaaattgcgattaatggcagctgggacgaaaactatggt gtcggcggccgcgatggcgggaatattaagctgctattaaatgaacaaacaacggttacattttattacaacgacagaacgcatgcgattgcgg attcgacttggtatgcaccaattctaaaagaaaagcagccgcggctcgttggaacgattttaccagctattggttatgaaacagacgtgaacggtt ggacgccgcaaacatcaacggcgttgttgtcagatgatgattttgattccatttatacgtttaaggcgcgtgtgccaaaagggacatatgaatataa agtagttcttgggaatgattggacatatgaaaattatccacaagataatgccaaattaaatgtgcttgaagaaacgacaattacctttttctttaacgc gaaaacgaaagtagtgtataccgattacaatccaagcggttcggatggtatcgtccaaaaagaccgtttgaagcataatacgtgggattcgttgta tcgccaaccgtttggtgcggtgaaagctgggacagaagtgacccttcgtttatcagcgaaaaaaggtgatttgacaaaagcggatgtatatgtaa aaaatacgacaaccggcacagcgaaactatattcgatgaaaaaagccggtgttcttggcgaagaagaatattgggaagcgacattcacaccgg atgtgaaaggagtatacggttataaatttattgcggtagatgctggaacgaaagcagaatacggggaagatacacaagaagggcagtgggga aaagcagtagataaaaatgcagagctgttccaattaacggtgtacgacccatcctaccaaacaccggattggatgaaagaagcagttgtatatca aattttccctgatccaaag

    SEQ ID NO: 94

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    SEQ ID NO: 95 atgtatacactattcatccgttcatattttgatactgatggtgatggtgtaggagactttagtggagttgctgaaaaggtagattatctaaaatctcttg gagtagatacagtctggtttttaccatttaataaaagtaaatcttatcatggatatgatgttgaagattactatgatgtagaaccagattatggaacact acaagatcttgataatatgataaaagttctaaatgaaaatggaataaaggtagtaatggatcttgttgttaatcatacgtcggatacacatccatggtt tcttgatgcagttgaaaatactactaattctccatattggaactattacattatgagcttggatgagcctcaaaataagaatcattggcattataaggtt aattcaaaaggacaaactgtgtggtattttggattgtttgattcatcaatgccggaccttaattacgacaaccctaaagtaatggatgaagtgaaaaa • · · *··

    Fig 16(cont.)
58. 61/116 aataatagatttttgggcagatatgggagtagatggatttagattagatgcagcaaaacattattatggatttgactggagcgatggaattgaacag tcagcaagcgttgcaaaagagatagaagactatataaaagataaactaggggaaaatgcaatagttgtgagtgaggtttacgatggagattcaa atgttcttttaaaatttgctccaatgcctgtgtttaattttagttttatgtacaatttgagaggaaattttgaagggagagataacttaatttcagactctatt agttgggttgattcctcgttgtataatttaaatgtttttcattttccatttattgatagtcatgatcttgacagatttatttctgagcttgtagatagtaaatatc agggagatgtaatatctgccacaaaacaatatttgctagttaatgctttactactctcattaacaggcatgccaactatttactatggtgatgaaatag gacttaggggatggaagtggcattcagaaccatgggatatacctgtgcgtgagccaatgcaatggtataaggatcaaaaagggaacggtcaaa cttattggacaaaagagttttacgaaggtattactgaaggaagtgctaatgaagatggagcaatatacgatgatccagatgatggagtatctgtag aagaacaagaaaatggatattctattttaaacttttttaaagaatttatcaacttacgaaaagattatccggcacttgcttttggaagtactacgattga gagagattggaaaaacttgtatgttttgaaaaagtcgtataacttccaggatgttcttgtattaattaaccttgatccaacgtattcaaatacatacgaa gttccagaagggtataaatgggtgtggtatgcattttttgatggtgacaactatgaatttggagcaaaagatgaaatgattttacagaátacaagttg gacgataaatccaaggcaaatttatatatttgtaaagtaa

    SEQ ID NO: 96

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    SEQ ID NO: 97 atgaggaagaagatgtcgcattcaagatttacttttcttttgatcttagcactttttattttcttctccggttgtatttcagaagttaaaagcgaaagccag ctactaaattcaaagcaaaaggtccttgtaaaagtaaatgttaatacgccatttattgagaatgctactactaatacgtggagtgtttcaaaagaatct tttattgattatcttagtaaagtgattattactgttaaggatgtaaatgatcagattgtatttactaaggaaacaacgaacaaaacaaatatttattttgaa attgaacttcttcctggaacttatacatttgaggtaaaaggatatgaggaagatttagttatattttcaggggaaaaagttaatcagatcatagatgag aaaaataatattgttaatgtcgaaactttttttgttaatggaatagttaggacaataattgaagttgacgatattatttataaaaattatgatattacatcgg caacgttgatcttcaaaaaagatacagcacaagaagattatgaagaggtacctgtaacacttacaggtacttccactttaattaataaagaattatat cctggtatgtggactgtaaaatttgaagttgatcttaaatcaaaggatgcaagtatgttaccagaaaaagttcatcttgaaaatgaatttagcataga agtgcttccagcaaagacaaaaagtttaacatttaatgtagtctttgatacagaggttaatgaaccgaaattagtagttgtatttccgcaaattgagtt gccttttgtggatcctgtaacaaatttaagtggagagataaatgaattagaagggaatctttcaatgaattgggactattcagatccaaatgcagaat tttatgtgtataaagaattagaggaacaaggagaatatttgtatgaatttgttggaaaaacacgcgagaaaagttatacaatagaaaattttaccaag caagaattcgataaatttagtggaatcgctattaatgtttatgccaacggtaaagagagtggattagttgttctaaaaaaagaaaatattaaacttata gatttagaaagtgttgacagtataagtgctacttataacgttgatacgaatgagcttaagttggattggaattataccaattcaagtgttacttttgaag

    Fig 16(cont.)
59. 62/116 ttttgaaaaaaggtataaatagcaatgaatacgaaataatttctcaactaacacaaaattctttttcaacagaattcacaggcaggcaattttgggatc ttgagaaaattgcgattagagtagttgctaatggatttgaaagtaagattaatgagatttcaagagatgatataactataacateattgaatcttcctct tacatcgtctactatgtatacactattcatccgttcatattttgatactgatggtgatggtgtaggagactttagtggagttgctgaaaaggtagattatc taaaatctcttggagtagatacagtctggtttttaccatttaataaaagtaaatcttatcatggatatgatgttgaagattactatgatgtagaaccagat tatggaacactacaagatcttgataatatgataaaagttctaaatgaaaatggaataaaggtagtaatggatcttgttgttaatcatacgtcggatac acatccatggtttcttgatgcagttgaaaatactactaattctccatattggaactattacattatgagcttggatgagcctcaaaataagaateattgg cattataaggttaattcaaaaggacaaactgtgtggtattttggattgtttgattcatcaatgccggaccttaattacgacaaccctaaagtaatggat gaagtgaaaaaaataatagatttttgggcagatatgggagtagatggatttagattagatgcagcaaaacattattatggatttgactggagcgatg gaattgaacagtcagcaagcgttgcaaaagagatagaagactatataaaagataaactaggggaaaatgcaatagttgtgagtgaggtttacga tggagattcaaatgttcttttaaaatttgctccaatgcctgtgtttaattttagttttatgtacaatttgagaggaaattttgaagggagagataacttaatt tcagactctattagttgggttgattcctcgttgtataatttaaatgtttttcattttccatttattgatagtcatgatcttgacagatttatttctgagcttgtag atagtaaatatcagggagatgtaatatctgccacaaaacaatatttgctagttaatgctttactactctcattaacaggcatgccaactatttactatgg tgatgaaataggacttaggggatggaagtggcattcagaaccatgggatatacctgtgcgtgagccaatgcaatggtataaggatcaaaaagg gaacggtcaaacttattggacaaaagagttttacgaaggtattactgaaggaagtgctaatgaagatggagcaatatacgatgatccagatgatg gagtatctgtagaagaacaagaaaatggatattctattttaaacttttttaaagaatttatcaacttacgaaaagattatccggcacttgcttttggaagt actacgattgagagagattggaaaaacttgtatgttttgaaaaagtcgtataacttccaggatgttcttgtattaattaaccttgatecaacgtattcaa atacatacgaagttccagaagggtataaatgggtgtggtatgcattttttgatggtgacaactatgaatttggagcaaaagatgaaatgattttacag aatacaagttggacgataaatccaaggcaaatttatatatttgtaaagtaa

    SEQ ID NO: 98

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    Figure 16 (cont.)
60. 63/116

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    SEQ ID NO: 99 atgtacacactcttcatccgctctttttacgatacaaacaacgacggtgtaggtgactacaacggtgttgcccaaaaagtagactatctcaaaacg cttggagtggatacagtttggttcttgccgttcaacaaagcaaaatcgtaccacggttacgatgttgaagactactacgatgtagaacctgactatg gaacatacgcacaacttgaaaatatgataaagacactcaatcagaacggaattcgtgttgttatggacttggttgtgaaccacacttccgatacac actcgtggtttctggatgccgttgagaacacaacgaattcgaaatattggagctactacataatgacacttgaaaatagagacggttggaatcact ggcattggaagataaactcaaaagggcaaaaagtttactacttcggactgtttgactcatcaatgcccgatttgaatttcgacaatccacaagtgat gaacgaaatcaagagaataatcgatttctggataacagttggtgtggatggtttcagacttgatgcaccaaagcactacaaaggctgggattggg acgacggcatttcaggttcagcagcaatcgcgagggaaatagaaagttacatcaggagcaagttaggaaacgatgcgatagttgtcggggaa gtgtacgatggaaatccatcggttctttcacaatttgcaccgatgccggcgttcaacttcacattcatgtatggaataacaggcaaccatgagggg aaagataacctgctgggagaaacaatttcatgggttaatggagcgagttattatctcaacgtaaaacatttcccgttcatagacaatcacgatttga acagatggatatcgatacttatcgaccaaaagtatagtggaaacacacaagttggtacgaagcagtatattttaacaaatgcgctcttgctttcctta aacggtatgcctgttatttattatgggaatgaaataggcttgagaggatggaaatggggacaagacccgtgggatttgccggtgagagagccga tgcagtggtacgcaagtcaaagtggagctgggcagacatggtggacaaagcctgtctaccagcaaaaaggaatcacatttggaaatgcaaac gtcgatggtgcgatgtacgatgatccaaatgatggggtttcagtagaagagcagatgaatggttacacgataaataacttctttaaacaattcataa ccctgaggaagacatatccggctctatcgaaaggttcgataacgatagaacgcgactggaagaacctgtacgttatcaaacgagtctacggaa atcaggaagtgcttgtattgataaacttagacccaacttggccgaacaattacacgttaccaggtggatacaggtgggtctggtatgcgttctttaa tgggagtttgtttgaatttggcaataaaaacgaatcaccactgagccaagataccaactggacagtcaatccaaggcaagtgtatgtgtttgtgaa ggactaa

    SEQIDNO: 100

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    Fig> 16(cont.)
61. 64/116

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    SEQIDNO: 102

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    Fig 16 (cont.) ^03/110

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    SEQ IDNO: 104

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    66/116

    Fig 16 (cont.)

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    SEQIDNO: 105 atgtccctattcaaaaaaatctttccgtggattgtatctctacttcttttgttttcgtttattgctcctttttccattcaaacagaaaaagtccgcgctggaa gtgttccagtgaatggaacgatgatgcaatatttcgaatggtaccttccagacgatggaacactatggacgaaagtagcaaataacgcccaatct ttagcgaatcttggcattactgccctttggcttccccctgcctataaaggaacaagcagcagtgacgttggatatggcgtttatgatttatatgacct aggagagtttaatcaaaaaggaactgtccgaacaaaatacggaacaaaaacacaatatatccaagcaatccaagcggcgcatacagcaggaa tgcaagtatatgcagatgtcgtctttaaccataaagccggtgcagatgggacagaactagtggatgcagtagaagtaaacccttctgaccgcaat caagaaatatcaggaacatatcaaatccaagcgtggacaaaatttgattttcctggtcgtggaaacacctattctagttttaaatggcgttggtatca tttcgatggaacggactgggatgagagtagaaaactaaatcgtatttacaaattccgcggcacgggaaaagcatgggattgggaagtagataca gaaaatgggaattatgactatctcatgtatgcagatttggatatggatcatccagaggttgtatctgaactaaaaaattggggaaagtggtatgtaa ccacaaccaatatcgacggattccgtctggatgcagtgaagcatattaaatatagctttttcccagactggctatcgtatgtacgaacccaaacac aaaagcctctttttgccgttggcgaattttggagctatgacattaacaagctacacaactatattacaaagacgaacggctctatgtccctattcgat gccccgctgcataacaatttttatatagcatcgaaatcaggtggctattttgatatgcgcacattactcaacaacacattgatgaaagatcaaccaa cactatcggtcacattagtagacaatcacgatactgagccagggcaatctttgcagtcgtgggtcgagccgtggtttaaaccgttagcttacgcat ttatcttgacccgccaagaaggttatccgtgcatcttttatggagattactatggtattccaaaatacaacattcctgcgctgaaaagcaaacttgatc cgctgttaattgctcgaagagattatgcctacggaacacagcacgactatattgacaatgcagatattatcggctggacgcgggaaggagtagct gaaaaagcaaattcgggacttgctgcactcattaccgacggacctggcggaagcaaatggatgtatgttggcaaacaacacgctggcaaaac gttttatgatctaaccggcaatcgaagtgatacagtgacaatcaacgctgatggatggggagaatttaaagtcaatggagggtctgtatccatatg ggttccaaaaacatcaaccacttcccaaatcacatttactgtaaataatgccacaaccgtttggggacaaaatgtatacgttgtcgggaatatttcg cagctgggcaac

    SEQIDNO: 106

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    SEQ ID NO: 108

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    1 Fig 16 (cont.)

    68/Π6

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    SEQ IDNO: 110

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    69/116

    Fig 16 (cont.) tatctccggagcatagggatcgatgcatggcgtttcgactacgtcaaaggttacggagcgtgggttgttaacgactggctcagctggtggggag gttgggccgttggagagtactgggacaccaacgttgatgcactccttaactgggcatacaacagcggtgccaaggtctttgacttcccgctctac tacaagatggacgaagcctttgacaacaccaacatccccgctttggtttacgccctccagaacggaggaacagtcgtttcccgcgatcccttcaa ggcagtaactttcgttgccaaccacgataccgatataatctggaacaagtatccggcttatgcgttcatccttacctatgagggacagcctgttatat tctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggataagcttaacaaccttatctggatacacgagcaccttgccggaggaagtaccaagatcct ctactacgataacgatgagctaatattcatgagggagggctacgggagcaagccgggcctcataacctacataaacctcggaaacgactggg ccgagcgctgggtgaacgtcggctcaaagtttgccggctacacaatccatgaatacacaggcaatctcggtggctgggttgacaggtgggttc agtacgacggatgggttaaactgacggcacctcctcacgatccagccaacggatattacggctactcagtctggagctacgcaggcgtcggat ga

    SEQIDNO: 112

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    Fig 16 (cont.) gacatggcatgacattaccggaaaccgttcggagccggttgtcatcaattcggaaggctggggagagtttcacgtaaacggcgggtcggtttca atttatgttcaaagatag

    SEQ IDNO: 114

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    SEQID NO: 115 atggcgaagtactccgagctggagcagggcggagtcataatgcaggccttctactgggacgttccggagggaggaatctggtgggacacaat acggcagaagatccctgaatggtacgatgcaggcatatccgccatctggatacccccggcgagcaagggcatgggcggggcctactcgatg ggctacgacccctacgattacttcgatctgggcgagttttaccagaagggaaccgttgagacccgcttcggctccaaggaagagctcgtcaaca tgatctccacggcccaccagtacggcatcaaggttatagcggacatagtgataaaccaccgcgcaggtggagacctcgaatggaacccatac gtcggcgactatacctggacggacttttctaaggtcgcctccgggaaatacaaggcccactacatggacttccatccaaacaactacagcacct cagacgagggaaccttcggtggcttcccagacattgatcacctcgtgcccttcaaccagtactggctgtgggcgagcaacgagagctacgccg cctacctcaggagcatagggatcgatgcgtggcgctttgactacgttaagggctacggcgcgtgggtcgtcaaggactggctgagtcagtggg gcggctgggccgtcggcgagtactgggacaccaacgtcgatgcgctcctcaactgggcctacagcagcggcgccaaggtcttcgacttccc gctctactacaagatggacgaggcctttgacaacaagaacattcccgccctcgtttacgccatccagaacggtgaaaccgtcgtcagcagggat cccttcaaggccgttaccttcgtggctaaccacgatacgaacataatctggaacaagtaccctgcctatgccttcatcctgacctacgaaggtcag cccgtcatcttctaccgcgactacgaggagtggctcaacaaggacaaactcaacaacctcatatggattcacgagcacctggcagggggaag caccaagatcctctactacgacgacgatgagctcatcttcatgagggaaggctacggcgacaggcccgggcttataacctacatcaacctcggt agcgactgggcggagagatgggtgaacgttggctcaaagttcgcgggctatacaatccacgaatacaccggaaacctcggcggctgggtcg acaggtacgtccagtacgacggctgggtcaagcttaccgctccgccacacgatccggcaaacggctattacggctactcggtctggagctacg ccggagttggaagatctcatcaccatcaccatcactaa

    SEQ IDNO: 116

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    Fig 16 (cont.)

    71/116

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    SEQIDNO: 117 ttgcgagtgttcctggttgtgccaaagctgagccgcccatttcaggcagagtcacaacaacaagacagggacataacaatgaaacacacagcg ggaatgctggcgatcgcaggtatgctgatcgcccccttggcgcatgccgatgtcatactgcacgccttcaactggaaatacagtgaagtcaccg ccaaggccgatctcatcaaggctgccggctacaagcaggtgctcatctcaccgcctctgaagtcctcgggcaacgagtggtgggctcgttacc agccccaggatctgcgcctggtcgacaccccccttggcaacaagcaggatctggagcagctgatcgccgcgatgcagacccggggcattgc cgtctacgcggacgtggtgctcaaccacatggccaacgaaagctggaagcgcagcgacctcaactaccccggcagcgagctgctgcaaag ctacgccggcaatccggcctactttgaacgccagaagctctttggcgatctggggcagaacttcctcgccggccaggattttcatccggagggg tgcatcaccgactggaacaatccgggccatgtccagtactggcgactgtgcggcggggcgggtgacaaggggctgccggatctggacccca acaactgggtggtgaaccagcaacaggcttacctgcaggcgctcaaggggatggggatcaagggttttcgggtcgatgcggtcaagcacatg agcgattaccagatcaacgccgtgttcacccccgagatcaaacaggggatgcacgtctttggcgaggtgatcaccacggggggcgccggca acagcgactatgagaacttcctcaaaccctacctcgacagcagcggccagggggcctacgacttcccgctcttcgcctccctgcgtggagcgc tgggctacggcggcagcatgaacctgctggccgatcccggtgcctatggtcaggcgctgccgggtagccgcgccgtcaccttcgccatcacc cacgacatccccaccaacgacggtttccgctaccagatcctcaaccagaccgacgagagactggcctatgcctacctgctcggtcgcgatggc ggttcgcctctggtctactccgatcacggtgaaaccagggacaaggacggattgcgctggcaggactactatctgcgcaccgatctcaaaggg atgatccgcttccataacacagtgcagggtcaaccgatgcagctcatcggcagtaacgactgcttcgtgctgttcaagcgtggcaagcagggc gtggtcggcatcaacaagtgcgactacgagcaggagtactggctcgataccgccagattcgagatgaactggtatcgcaactaccgggatgtg ctcgaccagaatgccgtggtcaacgtgcagagccagtgggtaaggctgaccatcccggcccgcggcgccagaatgtggctgcaggagtga

    SEQ IDNO: 118

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    Figi 16 (cont.)

    72/116

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    SEQIDNO: 119 atgcaaacgtttgcattcttattttactcaaagaaaggatgggtgtgcatgaattatttgaaaaaagtgtggttgtattacgctatcgtcgctaccttaa tcatttcctttcttacacctttttcaacagcacaagctaatactgcacctgttaacggaacaatgatgcaatatttcgaatgggacttacctaatgatgg gacgctttggacgaaagtaaaaaatgaagctaccaâtctttcttcactaggtatcacagcactatggctccctccagcatataaaggaacgagcc aaagcgatgtcggatacggtgtttacgatttatatgaccttggggaatttaatcaaaaagggacgatccgaacgaaatacggaacaaaaacaca atatattcaagccattcaaactgcccaagccgcagggatgcaagtatatgcggatgttgtatttaatcataaggcaggggctgacagtacagaatt tgtcgatgcagttgaggtaaacccttctaatcgaaatcaagaaacatctggcacatatcaaattcaagcatggacaaaatttgattttcctggtcgtg gaaacacatactccagcttcaaatggcgctggtaccattttgatggtacggattgggacgaaagtcgtaaattaaatcgtatttacaaattccgcgg tacaggaaaagcgtgggactgggaagtcgatacagaaaacggaaactatgattatttaatgttcgctgatttagatatggatcaccctgaggttgt gacagaattaaaaaactggggaacgtggtacgtcaatactacaaatatcgatggattccgcttagatgccgtaaaacatattaaatacagctttttc cctgactggctaacatatgtacgtaatcaaacaggaaaaaatttatttgccgttggggaattttggagctatgacgtcaataagctgcataattacat tacaaaaacaaatgggtcgatgtcattatttgatgcacccttgcataacaacttttataccgcttccaaatcgagtggatattttgacatgcgttatttat tgaataatacattaatgaaagatcaaccttcactcgctgtaacacttgtcgataaccacgacacgcaaccagggcaatctttacagtcatgggtcg aaccttggtttaaacagcttgcttacgcctttattttaacaagacaagaagggtatccttgcgtattttacggtgattattatggaatccctaaatacaat atcccggggttaaaaagtaaaatcgacccgcttttaattgctcgtcgtgattacgcttatggaacacaacgtgattacattgatcatcaagacattat cggatggacacgagaaggcattgatgcaaaaccgaactctggactggcggctttaattaccgacggtcctggtggaagtaaatggatgtatgtc ggtaaaaagcatgccgggaaagtattttatgatttaactggaaatcgaagtgacacagtaacgattaatgcggatggttggggagaatttaaagta aacggaggatccgtctcaatttgggtggctaaaacgtcaaacgtcacatttacagtcaataacgccacaacaacaagcggacaaaacgtatatg ttgtcggcaacattccagagctaggcaattgtcgcacgggttaa

    SEQID NO: 120

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    Fig 16 (cont.)

    73/116

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    SEQ ID NO: 122

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    1 1

    V,

    Fig 16 (cont.)

    74/116

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    SEQ ID NO: 124

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    Fig 16 (cont.)

    75/116 d?

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    SEQ IDNO: 126

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    SEQ IDNO: 127 gtgtgcatgaattatttgaaaaaagtgtggttgtattacgctatcgtcgctaccttaatcatttactttcttacgcccttttcaactgcacaagccaacac tgcaccagtcaacggaacgatgatgcaatatttcgaatgggatttaccgaatgatggcacactttggacgaaagtaaaaaacgaagcaagcagt ctttcttctttaggtattactgcgttatggttaccacctgcatacaaaggaacgagccaaggggatgtcgggtatggcgtgtacgatttgtatgactt aggagaatttaatcaaaaagggacgattcgaacgaaatacggaacaaaaacgcaatatttacaagccattcaagcggcaaaaagcgctggcat gcaagtatacgctgatgtcgtatttaatcacaaggcgggggcagatagtacagaatgggttgacgcagtcgaagtgaatccttctaatcgaaacc aagaaacatctggcacatatcaaattcaagcatggacaaaatttgatttccctggccgtgggaacacatactcaagctttaaatggcgatggtatc attttgacggtacggattgggatgaaagccgaaaactaaatcgtatttacaaatttcgtggcacaggaaaagcatgggattgggaagtagacaca gagaacggaaactatgactacttaatgtttgctgatttagatatggatcaccctgaagtcgtgacagagctaaaaaactggggaacatggtacgtc

    Fig 16 (cont.)

    76/116 aatacgacaaatgtcgatgggtttcgcttagatgcagtaaagcatattaaatatagcttcttcccagattggttaacacatgtgcgttcacaaacacg aaaaaatctttttgcagtaggagaattttggagctacgatgtcaataaactgcataactacattacaaaaacaagtggaaccatgtcgttatttgatg cgccacttcataacaacttttacactgcttcaaaatctagcgggtattttgacatgcgctatttgttaaataatacgttgatgaaagaccagccttctet tgcggtcacactcgttgataatcatgacacgcaaccgggacaatctttacaatcatgggtagagccttggtttaagccgcttgcttatgcctttatttt gacaagacaagaaggatatccttgcgtattttacggcgactattacggcatccctaaatacaacattccgggattgaaaagtaaaatcgatccgct tctcattgcccgtagagactacgcatacggaacacaacgtgattatattgaccatcaagacattattggatggacacgggaaggaattgactcaa aaccgaactctggacttgcggctttaattactgacggccctggtggaagtaaatggatgtatgtaggtaaaaagcatgctggaaaagtgttttacg atctcactggaaatcgaagcgatacggtaacgattaatgcagacggctggggagagtttaaagtaaacggtggctccgtttccatttgggttgcc aaaacatcacaagtcacgtttaccgtcaacaatgcgacaacgataagcggacaaaatgtgtatgtcgttggtaacattccagagctcggaaattg gaacacagcaaacgcaatcaaaatgaccccatcttcttatccaacgtggaaagcaaccattgctcttccacaaggaaaagccattgaatttaaatt tattaaaaaagaccaatcgggaaatgttgtttgggaaagcattccaaaccgaacatacaccgttccatttttatcaacaggctcatatacagctagtt ggaatgtaccttaa

    SEQ IDNO: 128

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    SEQIDNO: 129 ttgcgttgccgccgtggcagggacgggtgttggtgcgggcggcgtaatgcgctgccgcgacacccgcgtgaacaaaataatatgaattatttg aataggatgggggtgtcaagaatgacaaaatctcgagagttgcggtgttcatggaaagtatttgttgttgggtgcctgttgtggatggcttgggga tcttccgcgtccgccggcgtattgatgcaaggcttctactgggacgccagtaccgggaccagtgattcgtggtggacgcatttggccaagcaag ccaacggtctaaaacgggcggggttcaccgccgtatggattcctccggtgcttaaaggggcttcagggggctattccaacgggtacgatccctt tgacgactatgatatcggaagcaaggaccagaaaggtaccgtggcgacgcgatgggggacgcgagaagaactgcaacgtgccgtggccgt gatgcgcgcgaacggtctggatgtgtatgtggatctggtgctgaaccaccgcaacggggacgacgggaattggaattttcattacaaagatgc gtacggcaaagtgggttacgggcggtttcaaaaggggttttacgattttcaccccaactacaacattcaggatgccaatgttcccaacgaggattc ··· «·« ··· ****** Vi · · *

    Fig 16(cont.) cagcttcgggcgcgatttagcccatgacaatccgtatgtggccgatggactgaaggctgcaggcgattggctgaccaaagccctcgatgttca gggatatcgtctggattacgtgaaaggcatcagctacaccttcctgaaaagttatctgtcctatggggccatgaacggaaaatttgccgtcggtga gtactgggatgccaaccgggatacgttgaactggtgggcgaacacggcgatggaagggcgggcccatgtgtttgattttgcgttgcgcgagg agctgaaaaacatgtgcaatgcggacgggtactacgacatgcgtcgattggaccacgcgggtctggtcggaatcgacccgtggaaggcggt gacgtttgtcgaaaaccatgatacggatcggcacgaccccatctacaataacaagcatttggcgtatgcctacatcttgacgtcggaagggtatc cgacggtgttctggaaggattactaccaatacggaatgaagccgatcatcgacaacctcatttggatccacgaacacattgcgtacggaacgac ccaagagcgttggaaagacgaagatgtctttgtgtatgagcggaccggaggcaagcggctattggtggggcttaacgacaatcgcgccacca gcaaaacggtcaccgtacagaccggctttggtgccaacgtggccttgcacgactacaccggcaacggccccgatctccgtaccgacgcctac ggtcgggtaaccttgaccattcctgcaaacgggtacgtggcctattccgttccgggcatctccggatcctttgtgccggtcgagaaaaccgtgac gcaggagtttgccggggcgtccgacttggatàttcgtccggccgataacacgcaatttgtgcaggtcgggcggatatacgccaaggcaaacaa gccggttacagcggaattgtattgggatgccaaagactggacgacctccacgtcgattctcctagaagtgcgttcggcttcgggaacgctcatc acgacaaagaccgtgacccaattgtcgtcccagggtacccgcgtttccttcacgccttcggctaccggatggtacgtcttttccattcgaagctat aacacgccttcgacgaacccaaagccggcctactggttaaaggtaacgtatacggcgccgcaattgcttcagtaa

    SEQ ID NO: 130

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    Fig» 16(cont.) ^/β/“° agctatcaeaactaccctgggctctatggccccaacgacttccaccagccggtgtgcagcatcaccaactacggggatgcgaacaatgtgcag cgttgcgagctctcgggcttgcaggacctggacactgggagcgcttatgtgcgcggcaagatcgccgactatctggtggatctggtcaacatg ggggtcaagggcttccgggtggatgcggccaagcacatcagcccgaccgacctgggcgccatcatcgatgcggtcaacagccgcaccggc gcgaaccgccctttctggtttctggaggtgattggcgcggccggcgaggcagtgcagccgaaccagtacttctcgctcggcggcggccaggt caccgtgaccgagttcaactatgggaagcaaatcttcggcaagttcgccggtggcggccgtctggccgagctgcgcagcttcggtgaaacctg gggcctgatgcccagcagcaaagcgattgctttcatcgacaaccacgacaagcagcgcggtcatggcggcggtggcaactatctgacctacc accatggctcgacctacgatctggccaacatcttcatgctggcttggccttatggctacccggcgctgatgtccagctatgccttcaaccgcagc acggcctacgacacgagctttggcccgccacacgacagtggtggcgccacccgtggcccctgggatggtggcggcagccagccggcctgc ttcaaccagagcatcggtggctgggtgtgtgagcaccgctggcggggcatcgccaatatggtggccttccgcaacgccacgctgcccaactg gaccgtgaccgactggtgggacaacggcaacaaccagatcgctttcgggcggggtgacaagggcttcgtggtgatcaaccgcgaagacgc cgcgctgacgcgcaacttcaagaccagcctgccagccggccagtactgcgatgtcatctccggggacttcaacaatggtcagtgcacgggcc atgtggtgacggtcgatgccggcggctacgtgacgctgacggccgggcccaatggtgcggcggccatccacgtgggcgcccgtctggacg gcgcctctcagccgccgacgaccgcctcggtgacèttcaacgcgtcggccgataccttttggggacagaacctgttcgtcgtgggcaaccaca gcgcactgggcaactggtcgccggcggccgccaggccgatgacttggatttccggttcgggcacgcgcgggaactggcgcgcggtgctca atttgccggccaataccacctaccaatacaagttcatcaagaaggacggggctggaaacgtggtttgggagggcggtggcaatcgcgtcgtga ccacgccgtctgggggcggatcggtgagcacgggcggcaattggcagtag

    SEQ IDNO: 132

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    Fig 16 (cont.)

    79/116

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    SEQIDNO: 134

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    Fig 16 (cont.)

    80/116 • t. 9

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    SEQ ID NO: 136

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    81/116

    Fig 16 (cont.) gggccggggtgatcgtccgctcgcccgccgtgggatcgatgggctcgccccgggtgtcgtccgccaccttgaagccgcggtgctcgttgcc ggggatgccgtagtagatccgctcgccgagatcgacccagaccggacagccgccctcctggaagcgcgggtcgcccggcggcgtgccga agaagaacacctcctggcgggtgttgcggaggaaccgctcaccgatcacgtccgggaacagcccggccagccagggaccgcaggcgaag acgtagaggtcggccgcgagagtggagccgtccgaaaggtgàagccgctccaagggccccgggaccatggcggcctgccggtactcccc gccctcgccctggaacagctccaccacggtccggcaggcgcgccgggcgaacagggcgccggcttcctcctcgtaccagatcgtgcggac gccgtcgaaatcgacctgggggaagcggctccgggcctccccctgagacagctcggcgaccggcagccccgcgtcctccagaaaaggaa gggagtcgcggacgtagctgtcgtcctcgccgcacatccagaggaccccggtccttttgtacagccggtaaccggactggacttcggcgtccc gccagagctcgaaggagcgggcgacccactccacgtacagacggtcgggtccgtaggcgccgcggatgatccgcgtctcgccaccggag ctggagcgggagtgccccggaccccaggcgtccaggagggtcacccgggctccgcggcggaggagatgcagggcggtccagccgccg aaggcgccggcgccgacgacggcgatatggggatgggagggcatggcgggcgtaaggttatcgcagcccgatccttcgctggcatcccat ctccgaccggagtatcctggaaaattcgaagaaggagatcgacatgcaatcgaacggaaacgtga

    SEQ IDNO: 138

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    Fig 16(cont.)

    82/116 aactctatggcggttatcatgagtgatggtcctggcggaacaaagtggatgtacacaggttcaccgagcacacgttatgtcgataaactaggtart cgtaccgaagaagtatggactaacgctagtggatgggccgaattcccagtgaacggcggatcggtttctgtttgggttggcgttaaataa SEQ ID NO: 140

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    SEQIDNO: 141 atgaaaccaataaataccctactcatatccgcccttgctgtttgttctttcagttccgcgacttacgccgatactattttgcacgcgttcaattggaagt attcagatgtgacggccaacgcgaatcaaattgctcaagctggttataagaaagtgcttgttgcgcctgcaatgaaatcgagtggcagccaatgg tgggctcgctatcaacctcaagatctacgcactatcgattctcctttgggcaataaacaagatttagccgcaatgattgccgcactcaaaggtgtg ggcgtcgatgtgtatgccgatgtggtactcaaccatatggcgaatgaaagctggaagcgaagtgacttgaattaccctggcacagaagtgctaa acgattatgctagccgttcaagctactatgctgaccagactctgtttggcaacctagcacaaggttatgtgtcagcgaacgactttcatccagcgg gctgtatttcagattggaacgaccctggtcatgttcagtattggcgtttgtgtggcgcagatggtgatgtaggtttacctgaccttgatccaaacaac tgggtggtttcacaacagcgtttgtatctgaaagcgctaaaagatatgggcatcaaagggttccgaattgatgcagtgaagcacatgagccaata ccaaatcgatcaggtattcacgtctgaaattactgcgaacatgcatgtgtttggtgaagtgattactagcggtggagcagggaatagcggctatg aatcgttcttagcgccttacctgaataatactaatcactctgcctacgatttcccgctgtttgcatcgattcgctcggcattttctatggggggcggttt aaatcaactgcatgatcctaaagcgtacggtcaggcacttgatgataatcgctcgatcacctttgcgatcacacatgatattccaaccaatgacgg cttccgctaccaaattatggacccacaagacgagcagcttgcttacgcgtatatccttggtaaagacggtggcacgccgctgatctacagtgatg atcttcctgattctgaagacaaggataacggtcgttggggcaatgtttggaacagttcgacaatgaaaaacatgttgagcttccataacgcgatgc aaggcaaaacaatgacgatgatttctagcgaccattgcactttgttgtttaagcgtggcaaagaaggtgttgtgggtattaacaagtgtggtgaaa cgcgtggcgtgacggttgatacctaccaacatgagtttaattggcatgttcaatacaaagacgtgttaagcagcgcaacagaaaccgtgacttct cgttaccatacgttcaatctaccaccacgcagtgcgcgtatgtttaagctgtag

    SEQ ID NO: 142

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    Fig 16 (cont.)

    83/116

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    SEQIDNO: 144

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    84/116

    Fig 16 (cont.)

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    SEQ ID NO: 146

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    85/116

    Fig 16 (cont.)

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    SEQIDNO: 148

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    86/116

    Fig 16 (cont.)

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    SEQ ID NO: 150

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    87/116

    Fig 16(cont.)

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    SEQIDNO: 151 atgaaaactattctttcaacaatcatggtgatggcggctgcggctgccaccaccgtagaggctcaaggctggccggaaaactacggcggcgtc atgttgcagggattctactgggattcctattcagccaccaagtggactaaactggaagcacaggctgacgagatctgcaactatttctcgctggta tgggtaccacagtcggcctataccggcagcagtacctccatgggctacgacccgctgtattacttcgaccagcattcatcgttcggcaccgaag agcagctacggtcgttcatcagtacctacaagcagaaaggaactggcatcatagccgatgtagttgtcaatcaccgaaagaatgtctcaaactg ggtggatttcccggccgagacctacaacggtgtaacctatcagatggtaagcaccgacatcgtttcgaacgatgacggcggaaaaacagcca cttgggcaaatcaaaacggctacagtctctcctccaatgccgacgaaggcgaaggctgggacggcatgcgcgacctggaccacaagtcgca gaacgtgcagaaatcggttcttgcctacaccaaatatctggttgacgacttaggctataccggattccgctacgatatggtaaagggatttgacgg atcgcatgtagccgactacaacaccaatgccggcgtgcagttctctgtcggcgaatattgggacggcactgcatcgaaagtttacagttggatca acagcaccaaaaagagcgatgtgccgcagtcggcagccttcgacttcgctttccgatacacctgccgcgatgccgtcaacaacaagaactgg gcgaacctgaagaacacttccggtatcagcgatgccgattacaggcgctattcggttacgtttgttgaaaatcacgatacggaataccgttcagct acggcttcccaggatcccatcaagggtgatacggttgccctcaatgcctggatgctggctatgccgggcacaccttgtgttttcctgaaacattgg accgactgcaaggaagagatcaagaatctcatcgaggcacgtcgcctggtcggtattcacaaccagagcacctatgccgaatggatgagcgg tgcagcctacatcggacgtaccgtaacaggtacgaacggcaccttacgtgttctgtgcggctcttatcagtataatgtagccgccaactacattca gattctctcaggcaaaaactataaatactacgtactcaacacgctcgaggctccctggatcgggaaaggttccggctcgtacaccgaaggtgaa accgtaacggttccgctcatcgccatatcggccgatgccaatgccaagctggtatataccaccgacggcacagaccccaccgcaacctcaaca gccgtaaccagcggaacggaactgaccatcacttcggacgccgtcctgaaggttggtctgctttccggcggcatcgtcaggaacatacagagc cgtacattcaccttccaggctgcaaacacctccgagtattacacagccaccatgcacgtatgcaaccagtccggagctctcaatccgctgtttgc ctatgtttgggcaggaccggacaacgagcagattaacggcaactggccgggcaccaagctcaccgctaccattaccgaaaacaaccttacct

    Fig 16 (cont.)

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    SEQIDNO: 152

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    Fig 16 (cont.)

    89/116 aacaggaaatgggaattatgatatgagaaatattttaaatggaacagtaatgaaaaatcaccctgcactcgcagttactctcgttgagaatcatgat tctcagcctgggcagtcattggaatctgtagtaagtccgtggtttaagccgctggcatatgcatttattttaactcgtgcagagggctatccttcagtt ttctatggtgattactatgggacaagcggaaatagtagttatgaaattccagcgttaaaagataaaattgatccaattttgacggcacgaaaaaactt tgcatatggtacgcagcgtgattatttagaccatccagatgtgattggctggacaagagaaggcgatggtgtacatgctaattctggtttagcgac attactctcggacggaccaggaggatcaaagtggatggatgttggaaagaataacgctggggaagtatggtacgatattacgggtaatcaaac aaatactgtaacaattaataaggacggatgggggcagttctatgtaagtggcggctcagtttccatatatgttcagcggtaa

    SEQ ID NO: 70

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    Fig) 16 (cont.)

    90/116

    SEQ IDNO: 154

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    SEQ IDNO: 155 gtgtcaagaatgtttgcaaaacgattcaaaacctctttactgccgttattcgctggatttttattgctgtttcatttggttctggcaggaccaacggctg cgaatgctgaaacggctaacaaatcaaatgagcttacagcaccgtcgatcaaiagcggaaccattcttcatgcttggaattggtcgttcaatacgt taaaacacaatatgaaggatattcatgatgcaggatatacagcgattcagacgtctccgattaaccaagtcaaggaagggaaccaaggaaataa aaacatgtcgaactggtactggctctatcagccgacatcgtaccaaattggcaaccgttacttaggtactgaacaagaatttaaagaaatgtgtgc agccgctgaagaatatggcataaaggttattgttgacgcggtcatcaatcataccaccagtgactatgccgcgatttccaatgagattaagagtatt ccaaactggacacatggaaacacacaaattaaaaactggtctgatcgatgggatgtcacgcagaatgcattgctcgggctgtatgactggaata cacaaaatacacaagtacagtcctatttgaaacggttcttagaaagagcattgaatgacggggcagacggttttcgatttgatgccgccaaacata tagagcttccggatgatggcagttacggcagtcaattttggccgaatatcacaaatacatctgcagagttccaatacggagaaatcctgcaggat agtgcttcaagagatgcttcatatgcgaattatatgaatgtgacagcgtctaactatgggcattccataaggtccgctttaaagaatcgtaatctggg cgtgtcgaatatctcccactatgcatcagatgtgtctgcggacaagctagtgacatgggtagaatcgcatgatacgtatgccaatgatgatgaag agtcgacatggatgagcgatgatgatatccgtttaggctgggcggtgatagcttctcgttcaggcagtacgcctcttttcttttccagacctgaggg aggcggaaatggtgtgagattcccggggaaaagccaaataggcgatcgcgggagtgctttatttgaagatcaggctatcactgcggtcaatag atttcacaatgtgatggctggacagcctgaggaactctcgaacccaaatggaaacaaccagatatttatgaatcagcgcggctcacatggcgttg tgctggcaaatgcaggttcatcctctgtttctatcaatacgccaacaaaattgcctgatggcaggtatgataataaagctggggcaggttcatttca agtaaatgacggtaaactgacaggcacgatcaatgccaggtctgtggctgtgctttatcctgatgatattgcaaaagcgcctcatgttttccttgag aattacaaaacaggtgtaacacattctttcaatgatcaactgacgattacactgcgtgcagatgcgaatacaacaaaagccgtttatcaaatcaata atggaccagagacggcgtttaaggatggagatcaattcacaatcggaaaaggagatccatttggcaaaacatacaccatcatgttaaaaggaac gaacagtgatggtgtaacgaggaccgaggaatacagttttgttaaaagagatccagcttcggccaaaaccatcggctatcaaaatccgaatcatt ggagccaggtaaatgcttatatctataaacatgatgggggccgggca

    SEQ IDNO: 156 • « · « ·

    Fig 16 (cont.)

    91/116

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    SEQ IDNO: 157 atgcaaacgattgcaaaaaaaggggatgaaacgatgaaagggaaaaaatggacagcattagctctaacactgccgctggctgctagcttatca acaggcgttcacgccgaaaccgtacataaaggtaaagctccaacagcagataaaaacggtgtcttttatgaggtgtatgtaaactctttttacgat gcaaataaagatggacatggtgatttaaaaggtcttacacaaaagctggattatttgaatgacggcaattctcataccaaaaatgatcttcaagtaa acggaatttggatgatgccggtaaacccttctcctagctatcataaatatgatgtaacggactattataacattgatccgcagtacggaaatctgca agattttcgcaagctgatgaaagaagcagataaacgagacgtaaaggttattatggacctcgttgtgaatcatacaagcagtgaacatccttggtt tcaagctgcattaaaagataaaaacagcaagtacagagattactatatttgggccgataaaaatactgatttaaatgaaaaaggatcttgggggca gcaagtatggcataaagctccaaacggagagtatttttatggtacgttttgggaaggaatgcctgacttaaattacgataatcccgaagtaagaaa agaaatgattaacgtcgggaaattttggctaaagcaaggcgttgacgggttccgcttagatgctgcgcttcatatttttaaaggtcaaacacctgaa ggcgctaagaaaaatatcgtgtggtggaatgagtttagagatgcaatgaaaaaagaaaaccctaacgtatatctaacgggtgaagtatgggatc aaccggaagtagtagctccttactatcaatcgcttgattctttatttaactttgatttagcaggaaagattgtaaactctgtaaaatcaggaaatgatca aggaatcgcgactgcagcagccgcaactgatgagctgttcaaatcatacaatccaaataaaattgacggcattttcttaaccaaccatgaccaaa atcgcgtcatgagtgagctaagcggcgatgtgaataaagcaaagtcagctgcctctatcttacttacgcttcctggcaacccgtatatttattacgg tgaagaaattggaatgaccggtgaaaagcctgatgagttaatccgtgaaccgttccgctggtacgaaggcaatggacttggacaaaccagctg ggaaacatccgtatacaacaaaggcggcaatggtgtgtcagtagagacacaaacaaaacaaaaggattctttgttaaatcattaccgtgaaatga ttcgcgtgcgtcagcagcatgaagagttagtaaaaggaacccttcaatctatttcagtagacagtaaagaagtcgttgcctatagccgcacgtata aaggcaaatcgattagcgtgtatcataatatttcaaatcaaccggtaaaagtatctgtaacagcgaaaggtaaattgatttttgctagtgaaaaaggt gcaaaaaaagtcaaaaatcagcttgtggttccagctaatacaacggttttaataaaataa

    SEQ IDNO: 158

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    Fig 16 (cont.)

    92/116

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    SEQIDNO: 160

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    Fig 16 (cont.)

    93/116 lá 9 * • · · • ·

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    SÉQIDNO: 162

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    Fig 16 (cont.)

    94/116

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    SEQIDNO: 164

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    Fig 16(cont.)

    95/116

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    SEQIDNO: 166

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    VÍ»

    Fig 16(cont.) ^96/116 aaggcgctaagaaaaatctcctgtggtggaatgaatttagagatgcaatgaaaaaggaaaaccctaacgtatatctaacgggtgaagtatggga tcaaccggaâgtagtagctccttactatcaatcgcttgattctttatttaactttgatttagcaggaaagattgtaaactctgtaaaatcaggaaatgat caaggaatcgcgactgcagcagcggcaacggatgaactgttcaaatcatacaatccaaataaaattgacggtattttcttaaccaaccatgacca aaatcgcgtcatgagtgagctaagcggcgatgtgaataaagcaaagtcagctgcctctatcttacttacgcttcctggcaacccgtatatttattac ggtgaagaaatcggcatgaccggtgaaaagcctgatgagttaatccgtgaaccgttccgctggtacgaaggaaacggacttggacaaaccag ctgggaaacacctgtatacaacaaaggcggcaacggcgtgtctgtagaagcacaaacaaaacaaaaggactctttgttaaatcattaccgtgaa atgattcgcgtgcgtcagcagcacgaagagttagtaaaaggaacgcttcaatctatttcagtagacagtaaagaagtcgttgcctatagccgcac gtataaaggcaaatcgattagcgtgtatcataatatttcaaatcaaccggtaaaagtatctgtagcagcaaaaggtaaattgatttttggtagtgaaa aaggtgctaagaaagtcaaaaatcagcttgtgattccggcgaatacaacggttttaataaaataa

    SEQ IDNO: 168

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    SEQ ID NO: 169 atgaaaacattcaaattaaaacgcacttttttaccgctaaccttgctgctcagtgctcctgcctttgctgggcaaaatggcaccatgatgcagtatttt cattggtatgtacctaatgatggcgcattatggacgcaggttgaaagcaatgctccagcactcgctgaaaacggttttacagcgctctggctacc gccagcttacaaaggcgcgggcggcagtaatgacgtcggttatggcgtctatgatatgtacgatttaggtgagtttgatcaaaaaggctcagtac gaaccaaatacggcaccaaggctcagtacatctctgcaatcaatgccgcgcacaacaacaatatccaaatctacggcgatgttgtgtttaaccac cgaggtggtgctgatgggaagtcgtgggtcgataccaagcgcgttgattgggacaaccgtaacattgaactgggcgacaaatggattgaagct tgggttgagtttaattttcctggccgcaacgacaaatactcaaacttccattggacttggtatcactttgacggtgttgactgggatgatgccggcaa agaaaaagcgatctttaaattcaaaggcgaaggaaaagcatgggattgggaagtcagctctgaaaaaggcaattacgactacctaatgtacgc cgatttagacatggatcaccaagaagttaaacaagagctgaaagattggggtgagtggtacatcaacatgaccggcgttgatggctttagaatg gatgccgtgaagcacattaaatatcagtatctacaagagtggattgatcatttacgttggaaaacaggcaaagagcttttcaccgttggtgagtatt ggaattacgacgtaaatcaactgcataactttattactaagacctctggcagtatgtcgttgttcgatgcgccgcttcacatgaacttctacaacgcg tcaaaatctggcggcaattacgatatgcgccaaatcatgaatggcacgttgatgaaggacaacccagtcaaagctgtgactctcgtagaaaacc acgatacacagccattgcaggcgttagagtcgacagtggattggtggttcaagcctcttgcttacgcattcattttattgcgtgaagaaggttatcc atcagtgttctacgcagattactacggcgcgcagtacagcgacaaaggctacaacatcaatatggccaaagttccttacattgaagaacttgtaa : : · j

    Fig 16 (cont.)

    97/116 cactgcgtaaagagtatgcgtatggcaaacagaattcttatctcgaccactgggatgtgattggctggacccgagagggcgatgctgaacatcc aaactcaatggcggtgatcátgagtgatggaccaggtggcaaaaaatggatgtataccggtaagccaagcacgcgctatgtcgacaagctgg gtatccgaactgaagaagtttggaccgataccaatggctgggcagaatttcctgtcaatggtggttcagtctcggtttgggtgggcgttaagtaa

    SEQIDNO: 170

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    SEQIDNO: 172

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    1 · 2··· · ···

    98/116

    Fig 16 (cont.)

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    SEQIDNO: 173 atgcaaacgattgcaaaaaaaggggatgaaacgatgaaagggaaaaaatggacagctttagctctaacactgccgctggctgctagcttatca acaggcgttcacgcagaaactgtacataaaggtaaagctccaacagcagataaaaacggtgttttttatgaggtgtatgtaaactctttttacgatg caaataaagatggacatggtgatttaaaaggtctgacacaaaagttggattatttaaatgacggcaattctcatacaaagaatgatcttcaagtaaa cgggatttggatgatgccggtaaacccttctcctagctatcataaatatgatgtaacggactattataacattgatcctcagtacggaagtctgcaa gatttccgcaaactgatgaaagaagcagataaacgagacgtaaaagttattatggaccttgttgtgaatcatacgagcagtgaacacccttggttt caagctgcactaaaagataaaaacagcaagtacagagattactatatttgggctgataaaaataccgatttgaatgaaaaaggatcttggggaca gcaagtatggcataaagctccaaacggagagtatttttacggaacgttctgggaaggaatgcctgacttaaattacgataaccctgaagtaagaa aagaaatgattaacgtcggaaagttttggctaaagcaaggcgttgatggcttccgcttagatgctgcccttcatatctttaaaggtcaaactcctga aggcgctaagaaaaatctcctgtggtggaatgagtttagagatgcaatgaaaaaagaaaaccctaacgtatatctaacgggtgaagtatgggat cagccggaagtagtagctccttattatcaatcgcttgattccctatttaactttgatttagcaggaaaaattgtcagctctgtaaaagcaggaaatgat caaggaatcgccactgcagcagcggcaacggatgagctgttcaaatcatacaatccaaataaaattgacggcattttcttaaccaaccatgacca aaaccgcgtcatgagtgagctaagcggagatgtgaataaagcaaaatcagctgcttctatcttacttacgcttcctggaaatccgtatatttattacg gtgaagaaattggcatgaccggtgaaaagcctgatgaattaatccgtgaaccgttccgctggtacgaaggcaacggaattggacaaactagct gggaaacacctgtatataacaaaggcggcaatggtgtgtctgtagaagcacaaaccaaacaaaaggattctttgttaaatcattaccgtgaaatg attcgcgtgcgtcagcagcacgaagagttagtaaaaggaacgcttcagtctatttcagtagacagtaaagaagttgtcgcttatagccgtacgtat aaaggcaactccattagtgtgtatcataatatttcaaatcaacctgtaaaagtatctgtagcggcgaaaggtaaattgatttttgctagtgaaaaagg tgctaaaaaaggcaaaaatcagcttgtgattccggcgaatgcgacggttttaataaaataa

    SEQIDNO: 174

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    Fig 16 (cont.)

    99/116 ·· · · · ·

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    SEQID NO: 176

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    Fig 16 (cont.)

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    SEQIDNO: 178

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    Fig 16 (conr.) 101/116 gccagcttacaaaggcgcgggcggcagtaatgatgtcggttatggcgtctacgatatgtacgatttaggtgagtttgatcaaaaaggctcagtac gaaccaaatacggtaccaaggctcagtacatctctgcaatcaatgctgcgcacaacaacaatatccaaatttacggcgacgttgtgtttaaccatc gtggtggcgctgatgggaagtcgtgggtcgataccaagcgcgttgattgggacaaccgtaacattgaactgggcgacaaatggattgaagctt gggttgagtttaattttcctagccgcaacgacaaatactcgaacttccattggacttggtatcactttgacggtgttgactgggatgatgccggcaa agaaaaagcgatctttaaattcaaaggcgaaggaaaagcatgggattgggaagtcagctctgaaaaaggcaattacgactacctaatgtacgc cgatttagacatggatcacccagaagttaaacaagagctgaaagattggggtgagtggtacatcaacatgaccggcgttgatggctttagaatg gatgccgttaagcacattaaatatcagtatctacaagagtggattgatcatttacgttggaaaacaggcaaagagcttttcaccgttggtgagtattg gaattacgacgtaaatcaactgcataactttattactaagacctctggcagtatgtcgttgttcgatgcgccgcttcacatgaacttctacaacgcgt caaaatctggcggcaattacgatatgcgccaaatcatgaatggcacgttgatgaaggacaacccagtcaaagctgtgactctcgtagaaaacca cgatacgcagccattgcaggcgttagagtcgacagtggattggtggttcaagcctcttgcttacgcattcatcttgttgcgtgaagaaggttatcca tcggtgttctacgcagattactacggcgcgcagtacagcgacaaaggttacaacattaatatggccaaagtgccttacattgaagaacttgtaaca ctgcgtaaagagtatgcgtatggcaaacagaattcttatctcgaccattgggatgtgattggctggactcgagagggcgatgctgaacatccaaa ctcaatggcggtgatcatgagtgatggaccgggcggaacaaaatggatgtataccggtaatccaagcacgcgctatgtcgacaagctgggtat ccgaactgaagatgtttggaccgatgccaatggctgggcagaatttcctgtcaatggtggttcagtctcggtttgggtgggcgttaagtaa

    SEQIDNO: 180

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    Fig 16 (cont.) 102/116 gcggctatgcgcccgaacgggtcgacagctggatgagcgacagcgccgacagcagtttctgcgttggcgagctgtggaaaagcccgtccga gtacccgagctgggactggcgcaacacggcgagctggcagcagatcatcaaggactggtccgaccgggccaagtgcccggtgttcgacttc gcgctcaaggagcgcatgcagaacggctcggtcgccgactggaagcatggcctcaatggcaacccggacccgcgctggcgcgaggtggc ggtgacctttgtcgacaaccacgacaccggctattcgcccgggcagaacggcggccagcaccactgggcgctgcaggacgggctgatccg ccaggcctacgcctacatcctcaccagcccgggcacgccggtggtgtactggtcgcacatgtacgactggggctacggcgacttcattcgcca gctgatccaggtgcggcgcaccgctggcgtgcgcgccgattcggcgatcagcttccacagcggctacagcggcctggtcgctaccgtcagc ggcagccatcagaccctggtggtggcgctcaactccgatctggccaaccccggccaggtcgccagcggcagcttcagcgaggcggtcaac gccagcaacggccaggtgcgcgtctggcgcagcggtagcggcgatggcggcggcaatgacggcggcgagggcggtctggtcaatgtgaa cttccgctgcgacaacggcgtgacgcagatgggcgacagcgtctacgcggtgggcaacgtcagccagctcggcaactggagcccggcctc cgcggtacggctgaccgacaccagcagctatccgacctggaagggcagcatcgccctgcctgacggtcagaacgtggaatggaagtgcctg atccgtaacgaggcggacgcgacgctggtgcgccagtggcaatcgggcggcaacaaccaggtccaggccgctgccggcgcgagcacca gcggctcgttctga

    SEQIDNO: 182

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    Fig 16 (cont.)

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    SEQ IDNO: 184

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    Fig 16(cont.)

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    SEQIDNO: 186

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    5«

    Fig 16 (cont.)

    105/116 ggcatcctgggtactccgtaaactctgcgaagcccgttccgcgctctgtgttttccccatccaggatattttggccctgtcttcagacttttatgcaat gacagcggacgaggaacgcatcaatattccgggcagtgtatccggatttaactggacataccggttgcctgcggcaatcgaggatttatctaaa aacagccaacttataaccgcaatccagaccgcgttgcaggaccgccgggcgaggaaggcacaaggagcacagcaatga

    SEQIDNO: 188

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    SEQIDNO: 189 atgcaaacgattgcaaaaaaaggggatgaaacgatgaaagggaaaaaatggacagctttagctctaacactgccgctggctgctagcttatca acaggcgttcacgccgaaaccgtacataaaggtaaatctccagctgcagataaaaacggtgtcttttatgaggtgtatgtaaactctttttacgatg caaataaagatggacatggtgatttaaaaggtcttacacaaaaactggactatttaaatgatggcaattctcatacaaagaatgatcttcaagtaaa cgggatttggatgatgccgatcaacccttctcctagctatcataaatatgatgtaacggactattataacattgattctcagtacggaaatctgcaag attttcgcaagctaatgaaagaagcagataaacgagatgtaaaagttattatggacctcgttgtgaatcatacgagcagtgaacacccttggtttca agctgcgttaaaagataaaaacagcaagtacagagattactatatttgggctgataaaaataccgatttgaatgaaaaaggatcttggggacaac aagtatggcacaaagctccaaacggagagtatttttacggaacgttctgggaaggaatgcctgacttaaattacgataaccctgaagtaagaaaa gaaatgattaacgtcggaaagttttggctaaagcaaggcgttgacggcttccgcttagatgctgcccttcatatctttaaaggtcaaacacctgaa ggcgctaagaaaaatattgtgtggtggaatgaatttagagatgcgatgaaaaaagaaaacccgaacgtatatctaacgggcgaagtatgggatc agccggaagtggtagctccttattatcagtcgcttgattccctatttaactttgatttagcaggaaaaattgtcagctctgtaaaagcaggaaatgatc aaggaatcgctactgcagcagcggcaacagatgaactgttcaaatcatacaatccaaataaaattgacggcattttcttaaccaatcatgaccaaa atcgcgtcatgagtgagttaagcggagatgtcaataaagcaaagtcagctgcctctatcttacttacgcttcctggaaatccgtatatttattacggt gaagaaatcggcatgaccggtgaaaagcctgatgaattaatccgtgaaccgttccgctggtacgaaggaaacggacttggacaaactagttgg

    106/116

    Fig 16 (cont.) gaaacacctgtatacaataaaggcggcaacggcgtgtctgtagaagcacaaaccaaacaaaaggactctttgttaaatcattaccgtgaaatgat tcgcgtgcgtcagcagcacgaagagttagtaaaaggaacgcttcaatctatttcagtagacagtaaagaagttgttgcttatagccgtacgtataa aggcaactccattagtgtgtatcataatatttcaaatcaacctgtaaaagtatctgtagcagcgaaaggtaaattgatttttgctagtgaaaaaggtg ctaaaaaggtcaaaaatcagcttgtgattccggcgaatacaacggttttagtaaaataa

    SEQIDNO: 190 * Met Gin Thr Ile Ala Lys Lys Gly Asp Glu Thr Met Lys Gly Lys Lys Trp Thr Ala Leu Ala Leu Thr Leu Pro Leu Ala Ala Ser Leu Ser Thr Gly Vai His Ala Glu Thr Vai His Lys Gly Lys Ser Pro Ala Ala Asp Lys Asn Gly Vai Phe Tyr Glu Vai Tyr Vai Asn Ser Phe Tyr Asp Ala Asn Lys Asp Gly His Gly Asp Leu Lys Gly Leu Thr Gin Lys Leu Asp Tyr Leu Asn Asp Gly Asn Ser His Thr Lys Asn Asp Leu Gin Vai Asn Gly Ile Trp Met Met Pro Ile Asn Pro Ser Pro Ser Tyr His Lys Tyr Asp Vai Thr Asp Tyr Tyr Asn Ile Asp Ser Gin Tyr Gly Asn Leu Gin Asp Phe Arg Lys Leu Met Lys Glu Ala Asp Lys Arg Asp Vai Lys Vai Ile Met Asp Leu Vai Vai Asn His Thr Ser Ser Glu His Pro Trp Phe Gin Ala Ala Leu Lys Asp Lys Asn Ser Lys Tyr Arg Asp Tyr Tyr Ile Trp Ala Asp Lys Asn Thr Asp Leu Asn Glu Lys Gly Ser Trp Gly Gin Gin Vai Trp His Lys Ala Pro Asn Gly Glu Tyr Phe Tyr Gly Thr Phe Trp Glu Gly Met Pro Asp Leu Asn Tyr Asp Asn Pro Glu Vai Arg Lys Glu Met Ile Asn Vai Gly Lys Phe Trp Leu Lys Gin Gly Vai Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ala Leu His Ile Phe Lys Gly Gin Thr Pro Glu Gly Ala Lys Lys Asn He Vai Trp Trp Asn Glu Phe Arg Asp Ala Met Lys Lys Glu Asn Pro Asn Vai Tyr Leu Thr Gly Glu Vai Trp Asp Gin Pro Glu Vai Vai Ala Pro Tyr Tyr Gin Ser Leu Asp Ser Leu Phe Asn Phe Asp Leu Ala Gly Lys Ile Vai Ser Ser Vai Lys Ala Gly Asn Asp Gin Gly Ile Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Asp Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Asn Pro Asn Lys Ile Asp Gly Ile Phe Leu Thr Asn His Asp Gin Asn Arg Vai Met Ser Glu Leu Ser Gly Asp Vai Asn Lys Ala Lys Ser Ala Ala Ser Ile Leu Leu Thr Leu Pro Gly Asn Pro Tyr Ile Tyr Tyr Gly Glu Glu Ile Gly Met Thr Gly Glu Lys Pro Asp Glu Leu Ile Arg Glu Pro Phe Arg Trp Tyr Glu Gly Asn Gly Leu Gly Gin Thr Ser Trp Glu Thr Pro Vai Tyr Asn Lys Gly Gly Asn Gly Vai Ser Vai Glu Ala Gin Thr Lys Gin Lys Asp Ser Leu Leu Asn His Tyr Arg Glu Met Ile Arg Vai Arg Gin Gin His Glu Glu Leu Vai Lys Gly Thr Leu Gin Ser Ile Ser Vai Asp Ser Lys Glu Vai Vai Ala Tyr Ser Arg Thr Tyr Lys Gly Asn Ser Ile Ser Vai Tyr His Asn Ile Ser Asn Gin Pro Vai Lys Vai Ser Vai Ala Ala Lys Gly Lys Leu He Phe Ala Ser Glu Lys Gly Ala Lys Lys Vai Lys Asn Gin Leu Vai Ile Pro Ala Asn Thr Thr Vai Leu Vai Lys SEQ IDNO: 191 atgcaaacgattgcaaaaaaaggggatgaaacgatgaaagggaaaaaatggacagctttagctctaacactgccgctggctgctagcttatca acaggcgttcacgccgaaaccgtacataaaggtaaatctccaacagcagataaaaacggtgtcttttatgaagtgtatgtaaactctttttacgatg caaataaagatggacatggtgacttaaaaggtcttacacaaaagttggactatttaaatgacggcaattctcatacaaaaaatgatcttcaagtaaa cgggatttggatgatgccagtcaacccttctcctagctatcataaatatgatgtaacggactattataacattgatccgcagtacggaaatctgcaa gattttcgcaagctgatgaaagaagcagacaaacgagacgtaaaagtcattatggaccttgttgtgaatcatacgagcagtgaacacccttggttt caagctgcgttaaaagataaaaacagcaagtacagagattactatatttgggctgataaaaataccgacttgaatgaaaaaggatcttggggaca acaagtatggcataaagctccaaacggagagtatttttacggaacgttctgggaaggaatgcctgacttaaattacgataaccctgaagtaagaa aagaaatgattaacgtcggaaagttttggctaaagcaaggcgttgacgggttccgcttagatgctgcgcttcatatttttaaaggtcaaacagctga aggcgctaagaaaaatatcctgtggtggaatgagtttagagatgcgatgaaaaaagaaaatccgaatgtatatctaacgggtgaagtatgggat cagcctgaagtggtagctccttattatcaatcgcttgattctttatttaattttgatttagcaggaaaaattgtcagctctgtaaaagcaggaaatgatc aaggaatcgccactgcagcagcagcaacagatgaactgttcaaatcatacaatccaaacaaaattgatggcatattcttaaccaaccatgaccaa aatcgcgtcatgagtgagctgagcggcgatgtgagcaaagcaaaatcagctgcttctatcttacttacgcttcctggcaacccgtatatttattacg gtgaagaaatcggcatgaccggtgaaaagcctgatgaattaatccgtgaaccgttccgctggtacgaaggaaacggacttggacaaaccagtt gggaaacacctgtatacaataaaggcggaaacggtgtgtctgtagaagcacaaaccaaacaaaaggattctttgttaaatcattaccgtgaaatg attcgcgtgcgtcagcagcatgaagagttagtaaaaggaacgcttcaatctatttcagtagacagtaaagaagttgttgcttatagccgtacgtata aaggcaactccattagtgtgtatcataatatttcaaatcaaccggtaaaagtatctgtagcagcgaaaggtaaattgatttttgctagtgaaaaaggt gctaagaaagtcaaaaatcagcttgtggttccggcgaatacaacggttttaatgaaataa

    SEQIDNO: 192

    107/116

    Fig 16 (cont.)

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    SEQIDNO: 193 atgaaattcaaaaagagtttatctgccgggctccttttgttcggaggtctgagcggtgtgacaccatccgtcgctgcggaggtgccacgaaccgc atttgtccatttattcgaatggagttggccggatattgccaccgaatgcgaaacctttcttggccctaaggggttctctgcggttcaggtgtctccgc cgcaaaaaagcgtcagcaatgctgcctggtgggcgcgctaccaacctgttagttactcttttgaagggcgcagtggaacccgggctcaatttgc ggatatggtccagcgttgtaaagcggtgggggtcgatatttatctggatgcggtgatcaaccatatggcagcacaagatcgctattttccagaagt accttacagcagtaatgattttcacagttgcacgggcgatatcgattattccaaccgctggtcgattcaaaattgcgatctggttgggctgaacgat ctcaaaaccgagtcagaatacgttcggcagaaaattgcagactatatgaacgatgcgctcagtctgggcgtggcggggtttcggattgatgccg ccaagcatatcccggccggcgacatcgcggcgatcaagagcaagctcaacggcagcccgtatatctatcaggaggttatcggggcggcagg ggagccggtacaaaccagcgagtacacgtatattggagacgtgacggaatttaacttcgcccggaccatcgggcctaaatttaagcaaggtaat attaaagacctgcaggggattggttcgtggagcggctggctgagcagcgacgatgcggtgacctttgtgaccaaccatgacgaagaacgcca taaccctggccaggttctcagccatcaggactttggcaatctgtatttcctcggtaacgtgtttactctggcgtatccttacggctacccaaaagtga tgtcggggtactacttcagtaattttgatgccgggccaccatcgacaggggtacattctggtaatgcgtgtggctttgatggcggtgattgggtctg cgaacacaaatggcgtggtgtagccaacatggtggcgtttcgcaaccacacagcagcccagtggcaggtcactgactggtgggacgatggtt acaatcaggtggcgtttggtcgtggcgggctgggctttgtggtgatcaatcgagatgacaataaaggcatcaatcagagtttccagacgggaat gcccgctggcgagtattgtgacatcattgccggtgatttcgacacccagagcggtcattgcagcgctacgacgatcaccgtcgacagtcaggg gtatgcacattttactgtcggtagtcatcaggccgctgcgattcacattggcgcgaaactcggctccgtgtgccaggactgtggcggcacggcc gcagagacaaaagtctgctttgacaatgcacaaaactttagccaaccgtatttgcattactggaatgtcaatgcggatcaggccgtagcgaatgc aacctggccgggcgtcgcgatgacggctgaaaatggcggttactgctacgattttggtgtcggtctcaattcacttcaggtaattttcagcgataa cggcgccagccaaaccgctgatctgaccgccagcagtccgacgttgtgttaccagaacggaacgtggcgtgacagtgacttctgtcagagta gcaatgtgggcaacgagagttggtatttccgtggaacctcaaacggttggggcgtgagcgcactcacttatgaggctgcgacaggcctgtaca ctacggtgcagagctttaacggggaggagtcgcccgcacgctttaaaattgatgatggcaactggagtgagtcgtatccaagtgctgattatcaa gtcggtgattatgccacctacacgatcacgtttgacagccagacgaaggccatcaccgtgacttcgcagtaa

    SEQID NO: 194

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    Fig 16 (cont.)

    108/116

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    SEQ IDNO: 195 atgctgacagaccgtttctttgatggcgatacatcaaacaacgacccttacaaccagaactacgatgctaaaaacgaccggggaacttatcagg gcggcgattttaaaggaatcacgcaaaaattggattatctcgataagctaggcgtgaacacaatctggatcagcccgatcgtggaaaatatcaag catgatgtccgttatgacaactctgaagggcattcatactatgcttaccacggctactgggcaagcaacttcggtgcgttaaacccacacttcggt acaatggaagatttccatacactgattgacgctgcccatgaaaaaggcatcaagatcatggttgacgtagtattaaaccacactggttatggctta aaagatatcaacggagaagtttccaatcctccagccggttacccaactgacgcagaacgcagcacatatagcagcctgcttcgccagggttca aatgtcggctctgatgaggttgttggcgaattagctggcctacctgacttaaaaacagaagaccccgcagtccgccagacaatcatcgactggc aaacagactggatcacgaaagctactacagctaaaggaaacacaattgactacttccgtgtcgacactgtgaagcacgttgaagacgcaacat ggatggcattcaaaaatgacctcactgaaaaaatgccgacacacaaaatgatcggggaagcttggggagcaagtgccaataaccaacttggat accttgaaacaggtatgatggactcactgcttgacttcgacttcaaaggcattgcgcacgatttcgtgaacggcaagcttaaggcagcaaacgat gccctgactgcccgcaacggtaaaattgacaacacagctactttaggttcattccttggaagccatgacgaagatggtttcctatttaaagaagga aatgacaaaggcaagcttaaggttgctgcttccctgcaagcaacatcaaaaggccagccggtcatctattatggtgaagagcttggtcaaagtg gagcaaacaactatccgcaatacgataaccgttatgacctggcatgggacaaagttgaaaacaacgacgtccttgagcactacactaaggtcct gaacttcagaagcgctcattcagaagtgttcgctaaaggtgaacgcgcaacaattggcggttctgacgctgataaattcttactttttgctcgtaaa aatggaaacgaagctgcttacgtcggcttgaacgttgctgacacagcaaaagacgtaacactgactgtttctgcaggtgcagtcgtaactgacc actatgcagataaaacttatactgcttcagaagctggagaaatcacattgacgatcccggcaaaagctgatggcggtactgttttactaacggttg aaggcggagaaatcacagctgctaaagcggcaagcgaaggcgacggcacagttgagccagtccctgcgaaccacatccgcattcactacaa ccgtacagacaacaactatgaaaactacggtgcatggctgtggaacgatgtagcctccccttctgccaactggccgactggcgctacaatgtttg aaaaaacagacagctacggtgcatacatcgacgtaccacttaaagagggcgctaagaacatcggcttcctcgttatggatgtaacaaaaggtga tcagggtaaagacggcggcgacaaaggttttacgatctcatcacctgaaatgaacgaaatttggatcaagcaaggttctgacaaggtgtacactt acgagccagttgatcttccggcgaacactgtccgcgtccactatgtacgtgacaacgcagactacgaaaacttcggtatctggaactggggcga tgtaacagcaccttccgaaaactggcctacaggcgcagcgaaattcgatggtacagaccgttacggtgcgtatgtcgacattacgctaaaagaa

    Fig 16 (cont.)

    109/116

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    SEQ IDNO: 196

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    SEQ ID NO: 198

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    Fig 16 (cont.)

    111/116

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    SEQ ID NO: 202

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    SEQ ID NO: 204

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    Fig 16 (cont.)

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    114/116

    Fig 16 (cont.)

    SEQ ID NO: 206

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    SEQ ID NO: 207 ctgtcgactgagcctttcgttttgggctcgagactgactctcagcccaccccgcagtagctccagacggagtagccgtaatagccgttggccgg gtcgtgggcaggggcctcgaggtacacccacccgcttgagtccacccacttgtccacccagccgccgaggttgccggtgtactcgtggatgc acgctcccgcgaacttcggaacgtagacccaccttccggctttgcttgaggcgaggttgatgtatgttatcagtcccggcttgcttccgtagccgt ttctcacgaatatcagctcgtcgttgtcgtagtaaacgacgtcagtgcttcctccggccaggttgtcatgtatccagatgaggttcttgagcttatcct tgttgagccactcctcgtagtcgcggtagaatattgtcggctggccctcgtaggtgaggatgaacgcgtaggctggatacttgttccagattatat cggtgtcgtggtttgcaacgaaggttacggccttaaacgggtcgcggctgacgactgtgcccccgttcttgagggcctcgacgagtgcgggaa tgttcttgttgtcaaaggccgcgtccatcttgtagtagagcgggaagtcgaagaccttggcgccgctcgagtaggcccagttgaggagtgcatc aacgttggtgtcccagtactcgccaacggcccagccgccccaccagttgagccagtccttgacgacccacgctccgtggcccttcacgtagtc aaagcgccaggcatcaacgccgatgctccttaggtaggcggcgtagctctcatcgctcgcccagagccagtgctggtcccagctcttctcgtg ggctatgtctgggaagcctccaaatgtgccctcgtcacagcacttgacctcgttggggtggaagtcgaggtagttggcagtatatttgcccgagg ccacctttgagaagtccgtccaggtgtagtccccaacgaacgggttccactcgaggtctccgcctgcgcggtggtttatgacgatgtccgctatg acctttatgccgtaggcatgggccgtgtttatcatgttcacgagctcctgcttggagccaaagcgcgtctctaccgttcccttctggtcgtactcacc gaggtcaaagaagtcgtaggggtcgtagcccatcgaataggcgccgcccatgcccttgctcgccgggggaatccaaatggcggatattcccg cctcgtaccactccggtatcttgctcctgatggtgtcccaccagattcctccacctgggacgtcccagtagaaggcctgcattataacgccgccct cttccagctcggagtacttggccataagttacctcctactagtagattaaaa

    SEQ ID NO: 208

    Leu Ser Thr Glu Pro Phe Vai Leu Gly Ser Arg Leu Thr Leu Ser Pro Pro Arg Ser Ser Ser Arg Arg Ser Ser Arg Asn Ser Arg Tip Pro Gly Arg Gly Gin Gly Pro Arg Gly Thr Pro Thr Arg Leu Ser Pro Pro Thr Cys Pro Pro Ser Arg Arg Gly Cys Arg Cys Thr Arg Gly Cys Thr Leu Pro Arg Thr Ser Glu Arg Arg Pro Thr Phe Arg Leu Cys Leu Arg Arg Gly Cys Met Leu Ser Vai Pro Ala Cys Phe Arg « · · · · · ······

    I · * · ·

    115/116

    Fig 16 (cont.)

    Ser Arg Phe Ser Arg Ile Ser Ala Arg Arg Cys Arg Ser Lys Arg Arg Gin Cys Phe Leu Arg Pro Gly Cys His Vai Ser Arg Gly Ser Ala Tyr Pro Cys Ala Thr Pro Arg Ser Arg Gly Arg He Leu Ser Ala Gly Pro Arg Arg Gly Thr Arg Arg Leu Asp Thr Cys Ser Arg Leu Tyr Arg Cys Arg Gly Leu Gin Arg Arg Leu Arg Pro Thr Gly Arg Gly Arg Leu Cys Pro Arg Ser Gly Pro Arg Arg Vai Arg Glu Cys Ser Cys Cys Gin Arg Pro Arg Pro Ser Cys Ser Arg Ala Gly Ser Arg Arg Pro Trp Arg Arg Ser Ser Arg Pro Ser Gly Vai His Gin Arg Trp Cys Pro Ser Thr Arg Gin Arg Pro Ser Arg Pro Thr Ser Ala Ser Pro Arg Pro Thr Leu Arg Gly Pro Ser Arg Ser Gin Ser Ala Arg His Gin Arg Arg Cys Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ser Ser His Arg Ser Pro Arg Ala Ser Ala Gly Pro Ser Ser Ser Arg Gly Leu Cys Leu Gly Ser Leu Gin Met Cys Pro Arg His Ser Thr Pro Arg Trp Gly Gly Ser Arg Gly Ser Trp Gin Tyr He Cys Pro Arg Pro Pro Leu Arg Ser Pro Ser Arg Cys Ser Pro Gin Arg Thr Gly Ser Thr Arg Gly Leu Arg Leu Arg Gly Gly Leu Arg Cys Pro Leu Pro Leu Cys Arg Arg His Gly Pro Cys Leu Ser Cys Ser Arg Ala Pro Ala Trp Ser Gin Ser Ala Ser Leu Pro Phe Pro Ser Gly Arg Thr His Arg Gly Gin Arg Ser Arg Arg Gly Arg Ser Pro Ser Asn Arg Arg Arg Pro Cys Pro Cys Ser Pro Gly Glu Ser Lys Trp Arg Ile Phe Pro Pro Arg Thr Thr Pro Vai Ser Cys Ser Trp Cys Pro Thr Arg Phe Leu His Leu Gly Arg Pro Ser Arg Arg Pro Ala Leu Arg Arg Pro Leu Pro Ala Arg Ser Thr Trp Pro Vai Thr Ser Tyr Ile Lys

    SEQ ID NO: 209 atgattcagcccatgcactctcgggaacaggcctgccgtctcattccggcactgatcatgacatttgcactggcactgccgttgcaaattcgtgccg atgtcaccctgcatgctttcaactggagctatgccgatgtcgctgatcgggccgttgacatcgctgcagcagggtacagtgccgtgctggtggccc cgccacttcgatccgaaggcacggcctggtgggcgcgataccagccccaggatctccgccttatcgaccatccgctgggcaatacacatgacttc gtcaacatgatcgatgctctcgatgatgtgggtgtgggcgtgtacgccgacatcgtgctcaaccacatggccaatgaggctgcacaaaggcctga cctgaactaccctggtcaggcagtgcttgacgaatatgcttccgatcccggtcatttcgagggcttgaggctgttcggtaatctgagcttcaatttcct gtcggaacatgatttcggacccgcccagtgcattcaggattacagcgatgtgtttcaggtccagaactggcggctgtgcggaccgccgccggacc cgggcctgcccgacctggtcgccaatgactgggtgatctctcaacagcgccagtatctggaagccatcaaggcgctgggtgtggctggcatgcg catcgacgcggtcaagcatatgcccatgagccatatcaatgccgttctcacccccgagatccggtcgggcttgcatgtgtttggcgaagtcatcacc tccggtggggctggtgatacatcctacgaccgttttctggccccttacctggcacaaagcgaccatggtgcctatgactttccattgtttgaaaccatt cgccgtgctttcggcttcggtggcagcatgagtgaactggtcgatcctgctgcctacggtcaggccctgccaccggaccgcgccatcaccttcgtc atcacgcacgatattccgaacaatgacggatttcgctaccagatactcgaccccgtcgatgaatcactggcctacgcctacattctgggccgcgatg gcggtgtcccgcttctgtattccgacaacaatgaaagcggcgatggccgctggatcgatgcctggcaacgtccggatctggttgcaatggtcggct tccacaatgcagtccacggtcaggacatggccgtgctttcacatgacgactgccacctgctgtttcggcgcggcagcctcgggattgtcggcatca acaagtgcggccatgcactcagctcctgggtcaacatgaaccagagcgtactgtggtggtacgcggactacacagacgtgctcgacagcaacag cgttgtcaacatccagtcatcctggcacgagttcatccttcccgcccgccaggcacgcctgtggttgcga

    SEQ IDNO: 210

    MIQPMHSREQACRLIPALIMTFALALPLQIRADVTLHAFNWSYADVADRAVDIAAAGYSA

    VLVAPPLRSEGTAWWARYQPQDLRLIDHPLGNTHDFVNMIDALDDVGVGVYADIVLNHM

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    QVQNWRLCGPPPDPGLPDLVANDWVISQQRQYLEAIKALGVAGMRIDAVKHMPMSHINA

    VLTPEIRSGLHVFGEVITSGGAGDTSYDRFLAPYLAQSDHGAYDFPLFETIRRAFGFGGSMS

    ELVDPAAYGQALPPDRAITFV1THDIPNNDGFRYQILDPVDESLAYAYILGRDGGVPLLYSD

    NNESGDGRWIDAWQRPDLVAMVGFHNAVHGQDMAVLSHDDCHLLFRRGSLGIVGINKC

    GHALSSWVNMNQSVLWWYADYTDVLDSNSWNIQSSWHEFILPARQARLWLR

    SEQ IDNO: 211

    GTGTTTCGTTCTGACACAGTTTCGCGTACCTGCATGTATGGTGCGCTGCGTAATGCCTA

    CCAACCCGATCGGGTGTTTACTGGAGTCACGGTGCGGACATGCAACTTAAAAAAGCAT

    GCTCATCGCCAGGCGCTGTTGTTCATCGTGACGCGGTGCCTGTGCCTGAAATCCAGGC

    AGACCCATAAAAACAACAACAAACCGATAACAAACGACCCAAGCCTTCTAAGAGGAG

    AAAACGGGATGGCTTTTAAACTACGCAAAAAGGCGCTCGTTGGCCTGTTCACGGCCGG • · • ·

    Fig 16 (cont.)

    116/116

    CGCAATGGTATATGCCGGTGCAGCGGCGAGTGGTGAAATCATTCTGCAGGGCTTCCAC

    TGGCACTCCAAGTGGGGCGGCAACAATCAGGGTTGGTGGCAGGTGATGGAAGGTCAG

    GCCAACACCATCGCCAACGCCGGCTTTACGCACGTGTGGTTCCCGCCGGTCCATAACT

    CGGCCGATGCCGAGGGTTACCTACCCCGCGAGCTGAACAACCTCAACTCCAGCTATGG

    CTCCGAAGCACAGCTGCGCAGCGCCATCCAGGCACTGAACAATCGCGGCGTGCATGCG

    ATTGCCGATGTGGTCATGAACCACCGGGTGGGCTGCTCTGGCTGGGCGGATTTCTGTA

    ACCCGGACTGGCCGACCTGGTACATCGTCGCCAATGATTCCTGGCCCGGTGGCCCGAA

    AAGCCAGAACTGGGACACGGGTGAGACGTACCACGCCGCCCGTGACCTCGATCACGC

    CAATCCGCAGGTGCGCAACGATATCTCGCACTACCTGAACAGCCGCCTCAAGGACGTC

    GGCTTCTCCGGCTGGCGCTGGGACTATGCCAAGGGTTTCTGGCCCGGCTATGTCGGCG agtacaactggaacaccaacccgaacttctgtgtgggtgaggtgtgggacgatctcga

    CCCCAACAATCCCAACCCGCACCGCCAGCAACTGGTGGACTGGGTTGATGCTACCGGT

    GGCAGTTGTCACGTCTTCGACTTCACCACCAAGGGGCTGACGAACTATGCGCTGCAGC

    ATGGCCAGTACTGGCGCCTGCAGGGTGATAATGGTGGCCCGGCTGGCGGCATCGGCTG

    GTGGCCGCAACGCATGGTGACCTTCGTCGACAACCATGACACGGGCCCGAGCAATCAC

    TGTGGTGACGGCCAGAACCTCTGGCCCGTGCCCTGTGACAAGGTCATGGAGGCGTATG

    CCTACATCCTGACCCATCCGGGCGTGCCGTCGGTGTACTGGACGCACTTCTTCAACTGG

    AATCTTGGTAGCGAGATCAGCCAGTTGATGCAGATCCGCAAGAACCAGGGCGTGCACT

    CCGGTTCCGACGTCTGGATCGCCGAGGCCCGTCACGGCCTGTACGCCGCCTATATCAA

    CGGTAATGTGGCGATGAAGATGGGCTGGGATAACTGGAGCCCGGGCTGGGGCTGGTC

    GCTGGCGGCCTCCGGTAACAACTGGGCCGTCTGGACACGCTGA

    SEQIDNO: 212

    VFRSDTVSRTCMYGALRNAYQPDRVFTGVTVRTCNLKKHAHRQALLFIVTRCLCLKSRQT

    HKNNNKPITNDPSLLRGENGMAFKLRKKALVGLFTAGAMVYAGAAASGEIILQGFHWHS

    KWGGNNQGWWQVMEGQANTIANAGFTHVWFPPVHNSADAEGYLPRELNNLNSSYGSEA

    QLRSAIQALNNRGVHAIADWMNHRVGCSGWADFCNPDWPTWYIVANDSWPGGPKSQN

    WDTGETYHAARDLDHANPQVRNDISHYLNSRLKDVGFSGWRWDYAKGFWPGYVGEYN

    WNTNPNFCVGEVWDDLDPNNPNPHRQQLVDWVDATGGSCHVFDFTTKGLTNYALQHGQ

    YWRLQGDNGGPAGGIGWWPQRMVTFVDNHDTGPSNHCGDGQNLWPVPCDKVMEAYA

    YILTHPGVPSVYWTHFFNWNLGSEISQLMQIRKNQGVHSGSDVWIAEARHGLYAAYINGN

    VAMKMGWDNWSPGWGWSLAASGNNWAVWTR