BR122023026165A2 - Conjugados de peptídeo de camptotecina e usos dos mesmos - Google Patents

Conjugados de peptídeo de camptotecina e usos dos mesmos Download PDF

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BR122023026165A2
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Scott Jeffrey
Ryan Lyski
Maureen Ryan
Julia Cochran
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Seagen Inc.
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Abstract

São fornecidos no presente documento Conjugados de Camptotecina, Compostos de Camptotecina-Ligante, Compostos de Camptotecina, intermediários dos mesmos e método de preparação dos mesmos. Também são fornecidos no presente documento métodos de tratamento de câncer e doenças autoimunes com os Conjugados descritos no presente documento.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido de Patente Provisório no 62/653.961, depositado em 6 de abril de 2018, que está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
Referência a uma Listagem de Sequências
[002] Este pedido inclui uma listagem de sequências eletrônica em um arquivo denominado 4500- 00111_Sequence_Listing_ST25, criado em 18 de julho de 2019 e contendo 14 KB, que está aqui incorporado a título de referência.
Fundamentos
[003] Muito interesse envolveu o uso de anticorpos monoclonais (mAbs) para a distribuição direcionada de agentes citotóxicos às células tumorais. Embora várias classes de fármacos diferentes tenham sido avaliadas para distribuição por meio de anticorpos, apenas algumas classes de fármacos se mostraram suficientemente ativas como conjugados de fármacos de anticorpos, embora tenham um perfil de toxicidade adequado, para garantir o desenvolvimento clínico. Uma classe que recebe interesse são as camptotecinas.
[004] O projeto de Conjugados de Anticorpo e Fármaco (ADCs), ao anexar um agente citotóxico ao anticorpo, normalmente por meio de um ligante, envolve a consideração de uma variedade de fatores, incluindo a presença de uma alça de conjugação no fármaco para ligação ao ligante e tecnologia de ligante para anexar o fármaco a um anticorpo de uma maneira condicionalmente estável. Determinadas classes de fármacos que não têm alças de conjugação adequadas foram consideradas inadequadas para uso como ADCs. Embora possa ser possível modificar tal fármaco para incluir uma alça de conjugação, tal modificação pode interferir negativamente com o perfil de atividade do fármaco.
[005] Ligantes que compreendem ésteres e carbonatos também têm sido tipicamente usados para a conjugação de fármacos contendo álcool e resultam em ADCs com estabilidade variável e perfis de liberação de fármaco. Um perfil não ideal pode resultar em potência reduzida do ADC, especificidade imunológica insuficiente do conjugado e aumento da toxicidade devido à liberação não específica do fármaco do conjugado.
[006] Portanto, existe uma necessidade de novas tecnologias de ligante e conjugados úteis para terapia direcionada. A presente invenção aborda essas e outras necessidades.
Breve Sumário
[007] A invenção fornece, entre outros, Conjugados de Camptotecina, Compostos Ligantes-Camptotecina e Compostos de Camptotecina, métodos de preparação e uso dos mesmos e intermediários úteis na sua preparação. Os conjugados de camptotecina da presente invenção são estáveis em circulação, mas têm capacidade de infligir a morte celular uma vez que o fármaco livre é liberado de um conjugado na vizinhança ou dentro das células tumorais.
[008] Em uma modalidade principal, é fornecido um conjugado de camptotecina que tem uma Fórmula: L-(Q-D)p ou uma forma farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que L é uma Unidade de Ligante; Q é uma unidade de ligação com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL-; -Z-A- LP(S*)-RL-; -Z-A-S*-RL-Y-; e -Z-A- LP(S*)-RL-Y-; em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; LP é uma Unidade Conectora Paralela; S* é uma ligação ou Agente de Particionamento; RL é um peptídeo que compreende de 2 a 8 aminoácidos; e Y é uma Unidade Espaçadora; D é uma Unidade de Fármaco selecionada dentre: em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 haloalquila, C3-C8 cicloalquila, C3- C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila; RCé um membro selecionado do grupo que consiste em C1 C6 alquila e C3-C6 cicloalquila; cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C2-C6 heteroalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, C1-C8 aminoalquilC(O)- , C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila; ou RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquil e N(C1-C4 alquil)2; e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RB, RC, RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e p é de cerca de 1 a cerca de 16; em que Q é ligado através de qualquer um dos grupos hidroxila ou amina presentes em CPT1, CPT2, CPT3, CPT4 ou CPT5.
[009] Em outra modalidade principal, é fornecido um conjugado de camptotecina que tem uma Fórmula: L-(Q-D)p ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que L é uma Unidade de Ligante; Q é uma unidade de ligação com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL-; -Z-A- LP(S*)-RL-; -Z-A-S*-RL-Y-; e -Z-A- LP(S*)-RL-Y-; em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; LPé uma Unidade Conectora Paralela; S*é uma ligação ou Agente de Particionamento; RL é um peptídeo que compreende de 2 a 8 aminoácidos; e Y é uma Unidade Espaçadora; D é uma Unidade de Fármaco selecionada do grupo que consiste em: em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em -H, -(C1-C4)alquil-OH, C 1-C8 alquila, C1-C8 haloalquila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila; cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C2-C6 heteroalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, C1-C8 aminoalquilC(O)- , C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroaril e heteroarilC1-C4 alquila; ou RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RB, RC, RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e p é de cerca de 1 a cerca de 16; em que Q é ligado através de qualquer um dos grupos hidroxila ou amina presentes em CPT2 ou CPT5.
[0010] Em ainda outra modalidade principal, é fornecido um conjugado de camptotecina que tem uma Fórmula: L-(Q-D)p ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que L é uma Unidade de Ligante; Q é uma unidade de ligação com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL-; -Z-A- LP(S*)-RL-; -Z-A-S*-RL-Y-; e -Z-A- LP(S*)-RL-Y-; em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; LPé uma Unidade Conectora Paralela; S*é uma ligação ou Agente de Particionamento; RL é um peptídeo que compreende de 2 a 8 aminoácidos; e Y é uma Unidade Espaçadora; D é uma Unidade de Fármaco com a seguinte fórmula estrutural: ; em que cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C2-C6 heteroalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, C1-C8 aminoalquilC(O)- , C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroaril e heteroarilC1-C4 alquila; ou RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RB, RC, RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e p é de cerca de 1 a cerca de 16; em que Q é ligado através de qualquer um dos grupos hidroxila ou amina presentes em CPT5.
[0011] Outras modalidades principais, conforme observado acima, são compostos ligantes de camptotecina úteis como intermediários para a preparação de Conjugados de Camptotecina, em que o Composto de Ligante-Camptotecina é composto de uma Camptotecina (D) e uma Unidade Ligante (Q), em que a Unidade Ligante é composta por um Precursor da Unidade Extensora (Z’) com capacidade de formar uma ligação covalente a um ligando de direcionamento que fornece uma Unidade Ligante e um Ligante Liberável (RL) que é um peptídeo de 2 a 8 aminoácidos.
[0012] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos de tratamento de câncer que compreendem administrar a um indivíduo em necessidade disso um Conjugado de Camptotecina aqui descrito.
[0013] Em outro aspecto, são fornecidos aqui métodos de tratamento de câncer com o uso de Compostos de ligante- Camptotecina ou Camptotecinas aqui descritas.
[0014] Em outro aspecto, são fornecidos aqui kits que compreendem um Conjugado de Camptotecina aqui descrito.
Breve Descrição dos Desenhos
[0015] As Figuras 1A e 1B mostram um gráfico de volume tumoral médio para um modelo de xenoenxerto subcutâneo de camundongo L540cy de linfoma de Hodgkin, comparando a atividade de ADCs de camptotecina à base de peptídeo.
[0016] A Figura 2 mostra o efeito de ADCs de camptotecina à base de peptídeo no volume médio do tumor para um modelo de xenoenxerto subcutâneo de camundongo de carcinoma de células renais 786-O.
[0017] As Figuras 3A-3C mostram os resultados do modelo de tumor de xenoenxerto subcutâneo de espectador de linfoma anaplásico de células grandes Karpas 299/Karpas299- BVR.
[0018] As Figuras 4A-4D mostram a atividade de ADCs de camptotecina dirigidos por CD30 no modelo DelBVR.
[0019] As Figuras 5A e 5B mostram a atividade de ADCs de camptotecina dirigidos por CD30 e comparação com brentuximab vedotina no modelo DelBVR.
[0020] A Figura 6 mostra as atividades ADCs de camptotecina dirigidas por CD30 no modelo Karpas 299 com o uso de dosagem única e repetida.
[0021] As Figuras 7A e 7B mostram as atividades de ADCs de camptotecina dirigidos por CD30 no modelo L428 com o uso de dosagem única e repetida.
[0022] A Figura 8 mostra as atividades de ADCs de camptotecina dirigidos por CD30 no modelo DEL-15 com o uso de várias doses.
[0023] A Figura 9 mostra as atividades de ADCs de camptotecina dirigidos por CD30 no modelo L82.
[0024] A Figura 10 mostra os resultados de um estudo de estabilidade de ADC em plasma de camundongo.
[0025] A Figura 11 mostra o perfil farmacocinético de mAb IgG e ADCs de IgG-camptotecina em camundongo Sprague- Dawley.
[0026] A Figura 12 mostra os resultados de um ensaio de absorção de ADC em células de Kupffer.
[0027] A Figura 13 mostra os resultados da cromatografia de interação hidrofóbica com anticorpo monoclonal cAC10 não conjugado e ADCs de camptotecina dirigidos por CD30.
[0028] As Figuras 14A e 14B mostram os resultados da liberação de fármaco in vitro de ADCs de camptotecina dirigidos por CD30 na linha de células ALCL Karpass 299 e linha de células HL L540cy, respectivamente.
Descrição Detalhada Definições
[0029] A menos que indicado de outra forma, os seguintes termos e expressões, conforme usados neste documento, têm os seguintes significados. Quando nomes comerciais são usados neste documento, o nome comercial inclui a formulação do produto, o fármaco genérico e o ingrediente (ou ingredientes) farmacêutico ativo do produto com nome comercial, a menos que indicado de outra forma pelo contexto.
[0030] O termo “anticorpo”, como aqui usado, é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos monoespecíficos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos que exibem a atividade biológica desejada. A forma nativa de um anticorpo é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, cada par tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada. Em cada par, as regiões variáveis da cadeia leve e pesada (VL e VH) são, juntas, principalmente responsáveis pela ligação a um antígeno. Os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada consistem em uma região estrutural interrompida por três regiões hipervariáveis, também chamadas de “regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”. As regiões constantes podem ser reconhecidas e interagir com o sistema imunológico. (consulte, por exemplo, Janeway et al., 2001, Immunol. Biology, 5a Ed., Garland Publishing, Nova York). Um anticorpo pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse. O anticorpo pode ser derivado de qualquer espécie adequada. Em algumas modalidades, o anticorpo é de origem humana ou murina. Um anticorpo pode ser, por exemplo, humano, humanizado ou quimérico.
[0031] O termo “monoclonal anticorpo” conforme comparado no presente documento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto para possíveis mutações naturalmente ocorrentes que podem estar presentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais são altamente específicos, que são direcionados contra um único sítio antigênico. O modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido dentre uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método particular.
[0032] Um “anticorpo intacto” é aquele que compreende uma região variável de ligação ao antígeno, bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2, CH3 e CH4, conforme apropriado para a classe de anticorpo. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variante de sequência de aminoácidos dos mesmos.
[0033] Um “fragmento de anticorpo” compreende uma porção de um anticorpo intacto, que compreende a ligação ao antígeno ou região variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única, scFv, scFv-Fc, fragmentos de anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos (ou anticorpos), um fragmento (ou fragmentos) produzido por uma biblioteca de expressão de Fab, ou fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos acima que se ligam imunoespecificamente a um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno de célula cancerosa, um antígeno viral ou um antígeno microbiano).
[0034] Um “antígeno” é uma entidade à qual um anticorpo se liga especificamente.
[0035] Os termos “ligação específica” e “liga-se especificamente” significam que o anticorpo ou derivado de anticorpo se ligará, de uma maneira altamente seletiva, com seu epítopo correspondente de um antígeno alvo e não com a pluralidade de outros antígenos. Tipicamente, o anticorpo ou derivado de anticorpo se liga com uma afinidade de pelo menos cerca de 1x10-7 M, e de preferência 10-8 M a 10-9 M,
[0036] 10-10 M, 10-11 M ou 10-12 M e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para a ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado.
[0037] O termo “inibir” ou “inibição de” significa reduzir em uma quantidade mensurável ou prevenir totalmente.
[0038] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade de um conjugado eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um mamífero. No caso do câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado pode reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, desacelerar até certo ponto e de preferência parar) a infiltração de células cancerígenas em órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e de preferência parar) a metástase do tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Na medida em que o fármaco pode inibir o crescimento e/ou matar células cancerígenas existentes, o mesmo pode ser citostático e/ou citotóxico. Para a terapia do câncer, a eficácia pode, por exemplo, ser medida por meio da avaliação do tempo de progressão da doença (TTP) e/ou da determinação da taxa de resposta (RR).
[0039] O termo “substancial” ou “substancialmente” se refere a uma maioria, isto é, >50% de uma população, de uma mistura ou amostra, de preferência mais de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de uma população.
[0040] O termo “atividade citotóxica” se refere a um efeito de morte celular de um fármaco ou Conjugado de Camptotecina ou um metabólito intracelular de um Conjugado de Camptotecina. A atividade citotóxica pode ser expressa como o valor IC50, que é a concentração (molar ou massa) por unidade de volume na qual metade das células sobrevive.
[0041] O termo “atividade citostática” se refere a um efeito antiproliferativo de um fármaco ou Conjugado de Camptotecina ou um metabólito intracelular de um Conjugado de Camptotecina.
[0042] O termo “agente citotóxico”, como aqui usado, se refere a uma substância que tem atividade citotóxica e causa destruição de células. O termo pretende incluir agentes quimioterapêuticos e toxinas, como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo análogos sintéticos e derivados dos mesmos.
[0043] O termo “agente citostático”, como aqui usado, se refere a uma substância que inibe uma função das células, incluindo o crescimento ou multiplicação celular. Os agentes citostáticos incluem inibidores, como inibidores de proteínas, por exemplo, inibidores de enzimas. Os agentes citostáticos têm atividade citostática.
[0044] Os termos “câncer” e “canceroso” se referem a ou descrevem a condição fisiológica ou distúrbio em mamíferos que é tipicamente caracterizado por crescimento celular desregulado. Um "tumor" compreende uma ou mais células cancerosas.
[0045] Uma “doença autoimune”, como aqui usado, se refere a uma doença ou distúrbio decorrente de e dirigida contra os próprios tecidos ou proteínas de um indivíduo.
[0046] “Paciente”, como aqui usado, se refere a um indivíduo a quem é administrado um Conjugado de Camptotecina da presente invenção. O paciente inclui, sem limitação, um ser humano, rato, camundongo, porquinho-da-índia, primata não humano, porco, cabra, vaca, cavalo, cachorro, gato, pássaro e ave. Tipicamente, o paciente é um rato, camundongo, cachorro, primata humano ou não humano, mais tipicamente um ser humano.
[0047] Os termos “tratar” ou “tratamento”, a menos que indicado de outro modo pelo contexto, se referem a tratamento terapêutico e profilático, em que o objetivo é inibir ou desacelerar (atenuar) uma alteração ou distúrbio fisiológico indesejado, como o desenvolvimento ou espalhamento de câncer. Para os propósitos desta invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém, sem limitação, alívio de sintomas, diminuição de extensão de doença, estado de doença estabilizado (isto é, sem piora), atraso ou desaceleração de progressão de doença, melhoria ou paliação do estado de doença, e remissão (ou parcial ou total), ou detectável ou indetectável. “Tratamento” também pode significar prolongar sobrevivência em comparação com sobrevivência esperada se não receber tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a afecção ou distúrbio, bem como aqueles propensos a ter a afecção ou distúrbio.
[0048] No contexto do câncer, o termo “tratar” inclui qualquer uma ou todas as seguintes: matar células tumorais; inibir o crescimento de células tumorais, células cancerosas ou de um tumor; inibir a replicação de células tumorais ou células cancerosas, diminuir a carga global do tumor ou diminuir o número de células cancerosas e melhorar um ou mais sintomas associados à doença.
[0049] No contexto de uma doença autoimune, o termo “tratar” inclui qualquer um ou todos de: inibir a replicação de células associadas a um estado de doença autoimune incluindo, sem limitação, células que produzem um anticorpo autoimune, diminuindo a carga de anticorpos autoimunes e melhorar um ou mais sintomas de uma doença autoimune.
[0050] O termo “forma farmaceuticamente aceitável”, como aqui usado, se refere a uma forma de um composto revelado incluindo, sem limitação, sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres, hidratos, solvatos, polimorfos, isômeros, pró-fármacos e derivados marcados isotopicamente dos mesmos. Em uma modalidade, uma “forma farmaceuticamente aceitável” inclui, sem limitação, sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres, pró-fármacos e derivados marcados isotopicamente dos mesmos. Em algumas modalidades, uma “forma farmaceuticamente aceitável” inclui, sem limitação, isômeros e estereoisômeros farmaceuticamente aceitáveis, pró-fármacos e derivados marcados isotopicamente dos mesmos.
[0051] Em certas modalidades, a forma farmaceuticamente aceitável é um sal farmaceuticamente aceitável. O termo “sal farmaceuticamente aceitável”, como aqui usado, se refere a sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis de um composto (por exemplo, um fármaco, um ligante de fármaco ou um Conjugado de Camptotecina). Em alguns aspectos, o composto pode conter pelo menos um grupo amino e, consequentemente, sais de adição de ácido podem ser formados com o grupo amino. Os sais exemplares incluem, sem limitação, sulfato, trifluoroacetato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartarato, oleato, tanato, pantotenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato e sais pamoato (isto é, 1,1’-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula, como um íon acetato, um íon succinato ou outro contra-íon. O contra-íon pode ser qualquer parte orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga no composto original. Além disso, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais de um átomo carregado em sua estrutura. Os casos em que vários átomos carregados fazem parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ter vários contra-íons. Por conseguinte, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contra-íons.
[0052] Uma Unidade Ligante é uma parte bifuncional que conecta uma Camptotecina a uma Unidade Ligante em um Conjugado de Camptotecina. As Unidades Ligantes da presente invenção têm vários componentes (por exemplo, uma Unidade Extensora que em algumas modalidades terá uma Unidade Básica; uma Unidade Conectora, que pode estar presente ou ausente; uma Unidade Conectora Paralela, que também pode estar presente ou ausente; um Peptídeo, uma unidade de Ligação Liberável; e uma Unidade Espaçadora, que também pode estar presente ou ausente).
[0053] “Unidade de PEG”, como aqui usado, é uma parte orgânica composta por subunidades de etileno-oxi repetidas (PEGs ou subunidades de PEG) e pode ser polidispersa, monodispersa ou discreta (isto é, tendo um número discreto de subunidades de etileno-oxi). PEGs polidispersos são uma mistura heterogênea de tamanhos e pesos moleculares, enquanto os PEGs monodispersos são tipicamente purificados a partir de misturas heterogêneas e, portanto, fornecem um comprimento de cadeia única e peso molecular. As unidades de PEG preferenciais compreendem PEGs discretos, compostos que são sintetizados por etapas e não por meio de um processo de polimerização. PEGs discretos fornecem uma única molécula com comprimento de cadeia definido e especificado.
[0054] A Unidade de PEG fornecida neste documento compreende uma ou múltiplas cadeias de polietilenoglicol, cada uma composta por uma ou mais subunidades de etilenoxi, covalentemente ligadas entre si. As cadeias de polietilenoglicol podem ser ligadas entre si, por exemplo, em uma configuração linear, ramificada ou em forma de estrela. Tipicamente, pelo menos uma das cadeias de polietilenoglicol antes da incorporação em um Conjugado de Camptotecina é derivatizada em uma extremidade com uma parte alquila substituída por um grupo eletrofílico para ligação covalente ao nitrogênio carbamato de uma unidade de carbamato de metileno (isto é, representa um caso de R). Tipicamente, a subunidade etilenoxi terminal em cada cadeia de polietilenoglicol não envolvida na ligação covalente ao restante da Unidade Ligante é modificada com uma Unidade de Capeamento de PEG, tipicamente uma alquila opcionalmente substituída, como -CH3, CH2CH3 ou CH2CH2CO2H. Uma unidade de PEG preferencial tem uma cadeia de polietileno glicol única com 2 a 24 subunidades -CH2CH2O- ligadas covalentemente em série e terminadas em uma extremidade com uma unidade de capeamento de PEG.
[0055] A menos que indicado de outra forma, o termo “alquila” por si só ou como parte de outro termo se refere a uma cadeia linear ou ramificada, hidrocarboneto saturado ou insaturado substituído ou não substituído que tem o número indicado de átomos de carbono (por exemplo, “-C1-C8 alquila” ou “-C1-C10alquila” se refere a um grupo alquila que tem de 1 a 8 ou 1 a 10 átomos de carbono, respectivamente). Quando o número de átomos de carbono não é indicado, o grupo alquila tem de 1 a 8 átomos de carbono. Grupos representativos de cadeia linear “-C1-C8 alquila” incluem, sem limitação, - metila,
[0056] -etila, -n-propila, -n-butila, -n-pentila, - n-hexila, -n-heptila e -n-octila; enquanto -C3-C8 alquilas ramificadas incluem, sem limitação, -isopropila, - sec-butila, -isobutila, -terc-butila, -isopentila, e -2- metilbutila; -C2-C8 alquilas insaturadas incluem, sem limitação, -vinila, -allila,
[0057] -1-butenila, -2-butenila, -isobutilenila, -1 pentenila, -2 pentenila, -3-metil-1-butenila, -2 metil-2- butenila, -2,3 dimetil-2- butenila, -1-hexila, 2-hexila, - 3-hexila, -acetilenila, -propinila, -1 butinila,-2 butinila, -1 pentinila, -2 pentinila e -3 metil 1 butinila. Às vezes, um grupo alquila é não substituído. Um grupo alquila pode ser substituído por um ou mais grupos. Em outros aspectos, um grupo alquila será saturado.
[0058] A menos que indicado de outra forma, “alquileno”, por si só ou como parte de outro termo, se refere a um radical hidrocarboneto cíclico ou ramificado, saturado ou não substituído, de cadeia linear ou ramificada com o número declarado de átomos de carbono, tipicamente 1 a 10 átomos de carbono e que tem dois centros radicais monovalentes derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio do mesmo ou de dois átomos de carbono diferentes de um alcano parental. Radicais alquileno típicos incluem, sem limitação: metileno (-CH2-), 1,2-etileno (-CH2CH2-), 1,3- propileno (-CH2CH2CH2-), 1,4-butileno (-CH2CH2CH2CH2-), e similares. Em aspectos preferenciais, um alquileno é um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada (isto é, não é um hidrocarboneto cíclico).
[0059] A menos que indicado de outra forma, “arila”, por si só ou como parte de outro termo, significa um radical de hidrocarboneto carbocíclico aromático monovalente substituído ou não substituído com o número declarado de átomos de carbono, tipicamente 6 a 20 átomos de carbono, derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parental. Alguns grupos arila são representados nas estruturas exemplares como “Ar”. Grupos arila típicos incluem, sem limitação, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila e similares. Um exemplo de grupo arila é um grupo fenila.
[0060] A menos que indicado de outra forma, um “arileno”, por si só ou como parte de outro termo, é um grupo arila conforme definido acima que tem duas ligações covalentes (ou seja, é divalente) e pode estar nas orientações orto, meta ou para como mostrado nas seguintes estruturas, com fenila como o grupo exemplificador:
[0061] A menos que indicado de outra forma, um “C3 C8 heterociclo”, por si só ou como parte de outro termo, se refere a um sistema de anel monocíclico ou bicíclico monovalente substituído ou não aromático ou monocíclico não aromático com 3 a 8 átomos de carbono (também referido como membros do anel) e um a quatro membros do anel de heteroátomo independentemente selecionados de N, O, P ou S, e derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo do anel de um sistema de anel parental. Um ou mais átomos de N, C ou S no heterociclo podem ser oxidados. O anel que inclui o heteroátomo pode ser aromático ou não aromático. Os heterociclos nos quais todos os átomos do anel estão envolvidos na aromaticidade são referidos como heteroarilas e, de outra forma, são referidos como heterocarbociclos. Salvo indicação em contrário, o heterociclo está ligado ao seu grupo pendente em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulte em uma estrutura estável. Como tal, uma heteroarila pode ser ligada através de um carbono aromático de seu sistema de anel aromático, referido como uma heteroarila ligada a C, ou através de um átomo de N não duplamente ligado (ou seja, não =N-) em seu sistema de anel aromático, que é referido como uma heteroarila N-ligada. Assim, os heterociclos contendo nitrogênio podem ser ligados em C ou N e incluem partes de pirrol, como pirrol-1-ila (ligada em N) e pirrol-3-ila (ligada em C), e partes de imidazol, como imidazol -1-ila e imidazol-3-ila (ambas ligadas a N), e partes imidazol-2-ila, imidazol-4-ila e imidazol-5-ila (todas as mesmas ligadas a C).
[0062] A menos que indicado de outra forma, uma “C3 C8 heteroarila” é um heterociclo C3-C8 aromático em que o subscrito denota o número total de carbonos do sistema de anel cíclico do heterociclo ou o número total de carbonos aromáticos do sistema de anel aromático da heteroarila e não implica o tamanho do sistema de anel ou a presença ou ausência de fusão de anel. Exemplos representativos de um heterociclo C3-C8 incluem, sem limitação, pirrolidinila, azetidinila, piperidinila, morfolinila, tetra- hidrofuranila, tetra-hidropiranila, benzofuranila, benzotiofeno, indolila, benzopirazolila, pirrolila, tiofenila (tiofeno), furanila, tiazolila, imidazolila, pirazolila, pirimidinila, piridinila, pirazinila, piridazinila, isotiazolila e isoxazolila. Quando explicitamente dado, o tamanho do sistema de anel de um heterociclo ou heteroarila é indicado pelo número total de átomos no anel. Por exemplo, a designação como uma heteroarila de 5 ou 6 membros indica o número total de átomos aromáticos (ou seja, 5 ou 6) no sistema de anel heteroaromático da heteroarila, mas não implica o número de heteroátomos aromáticos ou carbonos aromáticos naquele sistema de anel. As heteroarilas fundidas são explicitamente declaradas ou implícitas pelo contexto como tal e são tipicamente indicadas pelo número de átomos aromáticos em cada anel aromático que são fundidos entre si para formar o sistema de anéis heteroaromáticos fundidos. Por exemplo, uma heteroarila com 5,6 membros é um anel aromático de 5 membros fundido a um anel aromático de 6 membros no qual um ou ambos os anéis têm heteroátomo (ou heteroátomos) aromático ou em que um heteroátomo é compartilhado entre os dois anéis.
[0063] Um heterociclo fundido a uma arila ou heteroarila de modo que o heterociclo permaneça não aromático e seja parte de uma estrutura maior por meio de ligação com a porção não aromática do sistema de anel fundido é um exemplo de um heterociclo opcionalmente substituído em que o heterociclo é substituído por fusão de anel com a arila ou heteroarila. Da mesma forma, uma arila ou heteroarila fundida a heterociclo ou carbociclo que faz parte de uma estrutura maior por meio de ligação com a porção aromática do sistema de anel fundido é um exemplo de uma arila ou heterociclo opcionalmente substituído em que a arila ou heterociclo é substituído por fusão de anel com o heterociclo ou carbociclo.
[0064] Salvo indicação em contrário, “heterociclo C3-C8”, por si só ou como parte de outro termo, se refere a um heterocíclico C3-C8 definido acima, em que um dos átomos de hidrogênio do heterociclo é substituído por uma ligação (ou seja, é divalente). Salvo indicação em contrário, um “heteroarileno C3-C8”, por si só ou como parte de outro termo, se refere a um grupo heteroarila C3-C8 definido acima, em que um dos átomos de hidrogênio do grupo heteroarila é substituído por uma ligação (ou seja, é divalente).
[0065] A menos que indicado de outra forma, um “carbociclo C3-C8”, por si só ou como parte de outro termo, é um anel carbocíclico monocíclico ou bicíclico não aromático saturado ou insaturado substituído ou não substituído monovalente com 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 membros derivado pela remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo de anel de um sistema de anel parental. Carbociclos -C3-C8 representativos incluem, sem limitação, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclopentadienila, ciclohexila, ciclohexenila, 1,3-ciclohexadienila, 1,4-ciclohexadienila, cicloheptila, 1,3-cicloheptadienila, 1,3,5- cicloheptatrienila, ciclooctila e ciclooctadienila.
[0066] Salvo indicação em contrário, um “carbociclo C3-C8”, por si só ou como parte de outro termo, se refere a um grupo carbociclo C3-C8 definido acima, em que outro dos átomos de hidrogênio dos grupos carbociclo é substituído por uma ligação (ou seja, é divalente).
[0067] Salvo indicação em contrário, o termo “heteroalquila”, por si só ou em combinação com outro termo, significa, salvo indicação em contrário, um hidrocarboneto estável de cadeia linear ou ramificada, ou combinações dos mesmos, totalmente saturado ou contendo de 1 a 3 graus de insaturação, consistindo no número indicado de átomos de carbono e de um a dez, de preferência um a três, heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N, Si e S, e em que os átomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode opcionalmente ser quaternizado. O heteroátomo (ou heteroátomos) O, N e S pode ser colocado em qualquer posição interior do grupo heteroalquila ou na posição em que o grupo alquila está ligado ao restante da molécula. O heteroátomo Si pode ser colocado em qualquer posição do grupo heteroalquila, incluindo a posição na qual o grupo alquila está ligado ao restante da molécula. Exemplos incluem -CH2-CH2-O-CH3, -CH2- CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)- CH3, -NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH- O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-O-CH3 e —CH=CH-N(CH3)-CH3. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e -CH2-O-Si(CH3) 3. Tipicamente, uma Ci a C4 heteroalquila ou heteroalquileno tem 1 a 4 átomos de carbono e 1 ou 2 heteroátomos e uma Ci a C3 heteroalquila ou heteroalquileno tem 1 a 3 átomos de carbono e 1 ou 2 heteroátomos. Em alguns aspectos, uma heteroalquila ou heteroalquileno é saturado.
[0068] Salvo indicação em contrário, o termo “heteroalquileno” por si só ou em combinação com outro termo significa um grupo divalente derivado de heteroalquila (como discutido acima), conforme exemplificado por -CH2-CH2-S-CH2- CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno, os heteroátomos também podem ocupar um ou ambos os terminais da cadeia. Além disso, para grupos de ligação alquileno e heteroalquileno, nenhuma orientação do grupo de ligação está implícita.
[0069] Salvo indicação em contrário, “aminoalquila” por si só ou em combinação com outro termo significa uma heteroalquila em que uma parte de alquila, conforme definido neste documento, é substituída por um grupo amino, alquilamino, dialquilamino ou cicloalquilamino. Aminoalquilas não limitativos exemplificadoras são -CH2NH2, -CH2CH2NH2, -CH2CH2NHCH3 e -CH2CH2N(CH3)2 e inclui ainda espécies ramificadas, como -CH(CH3)NH2 e -C(CH3)CH2NH2 na configuração (R)- ou (S)-. Alternativamente, uma aminoalquila é uma parte, grupo ou substituinte alquila conforme definido neste documento, em que um carbono sp3 diferente do carbono radical foi substituído por uma parte amino ou alquilamino, em que seu nitrogênio sp3 substitui o carbono sp3 da alquila, desde que aquele pelo menos um carbono sp3 permaneça. Quando se refere a uma parte aminoalquila como um substituinte para uma estrutura maior ou outra parte, a aminoalquila é covalentemente ligada à estrutura ou parte através do radical de carbono da parte alquila da aminoalquila.
[0070] Salvo indicação em contrário, “alquilamino” e “cicloalquilamino” por si só ou em combinação com outro termo significa um radical alquila ou cicloalquila, conforme descrito neste documento, em que o radical de carbono do radical alquila ou cicloalquila foi substituído por um radical nitrogênio, desde que pelo menos um carbono sp3 permaneça. Nos casos em que o alquilamino é substituído em seu nitrogênio por outra parte alquila, o radical substituído resultante é algumas vezes referido como uma parte, grupo ou substituinte dialquilamino, em que as partes alquila que substituem o nitrogênio são independentemente selecionadas. Substituintes exemplificadores e não limitativos de amino, alquilamino e dialquilamino incluem aqueles que têm a estrutura de -N(R’)2, em que R’ nesses exemplos são independentemente selecionados dentre hidrogênio ou C1-6 alquila, tipicamente hidrogênio ou metila, enquanto em cicloalquilaminas, que estão incluídas em heterocicloalquilas, ambos R’ juntamente com o nitrogênio ao qual estão ligados definem um anel heterocíclico. Quando ambos R’ são hidrogênio ou alquila, a parte é às vezes descrita como um grupo amino primário e um grupo amina terciária, respectivamente. Quando um R’ é hidrogênio e o outro é alquila, então a parte às vezes é descrita como um grupo amino secundário. Partes alquilamino primárias e secundárias são mais reativas como nucleófilos em relação aos centros eletrofílicos contendo carbonila, enquanto as aminas terciárias são mais básicas.
[0071] “Alquila substituída” e “arila substituída” significam alquila e arila, respectivamente, em que um ou mais átomos de hidrogênio, tipicamente um, são cada um independentemente substituídos por um substituinte. Substituintes típicos incluem, sem limitação, -X, -R’, -OH, -OR’, -SR’, , -N(R’)2, -N(R’)3, =NR’, -CX3, -CN, -NO2, -NR’C(=O)R’, -C(=O)R’, -C(=O)N(R’)2, - S(=O)2R’, -S(=O)2NR’, -S(=O)R’, -OP(=O)(OR’)2, -P(=O)(OR’)2, - PO3=, PO3H2, -C(=O)R’, -C(=S)R’, -CO2R’, -CO2-, -C(=S)OR’, - C(=O)SR’, -C(=S)SR’, -C(=O)N(R’)2, - C(=S)N(R’)2, e - C(=NR)N(R’)2, em que cada X é independentemente selecionado do grupo que consiste em um halogênio: -F, -Cl, -Br e -I; e em que cada R’ é independentemente selecionado do grupo que consiste em -H, -C1-C20 alquila, -C6-C20 arila, -C3-C14 heterociclo, um grupo de proteção e uma fração de pró- fármaco.
[0072] Mais tipicamente, os substituintes são selecionados do grupo que consiste em -X, -R’, -OH, -OR’, -SR’, -N(R’)2, -N(R’)3, =NR’, - NR’C(=O)R’, -C(=O)R’, -C(=O)N(R’)2, -S(=O)2R’, -S(=O)2NR’, - S(=O)R’, -C(=O)R’, -C(=S)R’, -C(=O)N(R’)2, -C(=S)N(R’)2, e -C(=NR)N(R’)2, em que cada X é independentemente selecionado do grupo que consiste em -F e - Cl, ou são selecionados a partir do grupo que consiste em -X, -R’, -OH, -OR’, -N(R’)2, -N(R’)3, - NR’C(=O)R’, -C(=O)N(R’)2, -S(=O)2R’, -S(=O)2NR’, - S(=O)R’, -C(=O)R’, -C(=O)N(R’)2, - C(=NR)N(R’)2, um grupo de proteção e uma parte de pró- fármaco, em que cada X é -F; e em que cada R’ é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, -C1-C20 alquila, -C6-C20 arila, -C3-C14 heterociclo, um grupo de proteção e uma fração de pró- fármaco. Em alguns aspectos, um substituinte alquila é selecionado do grupo que consiste em -N(R’)2, -N(R’)3 e - C(=NR)N(R’)2, em que R’ é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e -C1-C20 alquila. Em outros aspectos, alquila é substituída por uma série de partes etilenoxi para definir uma Unidade PEG. Os grupos alquileno, carbociclo, carbociclo, arileno, heteroalquila, heteroalquileno, heterociclo, heterociclo, heteroarila e heteroarileno, como descrito acima, também podem ser substituídos de forma similar.
[0073] “Grupo de proteção”, conforme usado aqui, significa uma parte que evita ou reduz a capacidade do átomo ou grupo funcional ao qual está ligado de participar de reações indesejadas. Os grupos de proteção típicos para átomos ou grupos funcionais são apresentados em Greene (1999), “Protective Groups In Organic Synthesis, 3AEd.”, Wiley Interscience. Grupos de proteção para heteroátomos, como oxigênio, enxofre e nitrogênio, são usados em alguns casos para minimizar ou evitar suas reações indesejadas com compostos eletrofílicos. Em outros casos, o grupo de proteção é usado para reduzir ou eliminar a nucleofilicidade e/ou basicidade do heteroátomo desprotegido. Exemplos não limitativos de oxigênio protegido são dados por -ORPR, em que RPRé um grupo de proteção para hidroxila, em que hidroxila é tipicamente protegida como um éster (por exemplo, acetato, propionato ou benzoato). Outros grupos de proteção para hidroxila evitam interferir com a nucleofilicidade de reagentes organometálicos ou outros reagentes altamente básicos, em que hidroxila é tipicamente protegida como um éter, incluindo alquil ou heterocicloalquil éteres, (por exemplo, metil ou tetrahidropiranil éteres), alcoximetil éteres (por exemplo, metoximetil ou etoximetil éteres), aril éteres opcionalmente substituídos e silil éteres (por exemplo, trimetilsilil (TMS), trietilsilil (TES), terc- butildifenilsilil (TBDPS), terc-butildimetilsilil (TBS/TBDMS), triisopropilsilil (TIPS) [trimetilsilil)etoxi] -metilsilil (SEM)). Os grupos de proteção de nitrogênio incluem aqueles para aminas primárias ou secundárias como em -NHRPR ou -N(RPR2-, em que pelo menos um de RPRé um grupo de proteção de átomo de nitrogênio ou ambos os RPR juntos compreendem um grupo de proteção.
[0074] Um grupo de proteção é adequado quando tem a capacidade de prevenir ou evitar reações colaterais indesejadas ou perda prematura do grupo de proteção sob condições de reação necessárias para efetuar a transformação química desejada em outra parte da molécula e durante a purificação da molécula recém-formada quando desejado, e pode ser removido em condições que não afetem adversamente a estrutura ou integridade estereoquímica dessa molécula recém-formada. A título de exemplo e não de limitação, um grupo de proteção adequado pode incluir aqueles anteriormente descritos para a proteção de grupos funcionais. Um grupo de proteção adequado é às vezes um grupo de proteção usado em reações de acoplamento de peptídeos.
[0075] “Álcool aromático” por si só ou parte de uma estrutura maior se refere a um sistema de anel aromático substituído com o grupo funcional hidroxila -OH. Assim, álcool aromático se refere a qualquer parte arila, heteroarila, arileno e heteroarileno, como aqui descrito, que tem um grupo funcional hidroxila ligado a um carbono aromático de seu sistema de anel aromático. O álcool aromático pode ser parte de uma fração maior, como quando seu sistema de anel aromático é um substituinte dessa fração, ou pode ser incorporado na fração maior por fusão de anel e pode ser opcionalmente substituído por porções conforme descrito neste documento, incluindo um ou mais outros substituintes de hidroxila. Um álcool fenólico é um álcool aromático que tem um grupo fenol como anel aromático.
[0076] “Álcool alifático” por si só ou parte de uma estrutura maior se refere a uma fração com um carbono não aromático ligado ao grupo funcional hidroxila -OH. O carbono que contém hidroxi pode ser não substituído (isto é, álcool metílico) ou pode ter um, dois ou três substituintes alquila ramificados ou não ramificados opcionalmente substituídos para definir um álcool primário, ou um álcool alifático secundário ou terciário com uma estrutura linear ou cíclica. Quando parte de uma estrutura maior, o álcool pode ser um substituinte dessa estrutura por ligação através do carbono contendo hidroxila, através de um carbono de uma alquila ou outra parte, conforme descrito neste documento, a esse carbono contendo hidroxila ou através de um substituinte dessa alquila ou outra parte. Um álcool alifático contempla uma estrutura cíclica não aromática (isto é, carbociclos e heterocarbociclos, opcionalmente substituídos) na qual um grupo funcional hidroxi está ligado a um carbono não aromático de seu sistema de anel cíclico.
[0077] “Arilalquila” ou “heteroarilalquila”, como aqui usado, significa um substituinte, parte ou grupo em que uma parte arila está ligada a uma parte alquila, isto é, aril-alquil-, em que os grupos alquila e arila são como descritos acima, por exemplo, C6H5-CH2- ou C6H5-CH(CH3)CH2-. Uma arilalquila ou heteroarilalquila está associada a uma estrutura ou parte maior através de um carbono sp3 de sua parte alquila.
[0078] “Grupo de retirada de elétrons (EWG)”, como aqui usado, significa um grupo funcional ou átomo eletronegativo que atrai a densidade de elétrons para longe de um átomo ao qual está ligado indutivamente e/ou por ressonância, o que for mais dominante (ou seja, um grupo funcional ou átomo pode estar se retirando elétron indutivamente, mas pode no geral ser doador de elétron por ressonância), e tende a estabilizar ânions ou partes ricas em elétrons. O efeito de retirada de elétrons é tipicamente transmitido indutivamente, embora na forma atenuada, para outros átomos ligados ao átomo ligado que se tornou deficiente em elétrons pelo grupo de retirada de elétrons (EWG), afetando assim a eletrofilicidade de um centro reativo mais remoto. Grupos de retirada de elétrons exemplares incluem, sem limitação, -C(=O), -CN, -NO2, -CX3, -X, - C(=O)OR’, -C(=O)N(R’)2, -C(=O)R’, -C(=O)X, -S(=O)2R’, - S(=O)2OR’, -S(=O)2NHR’, -S(=O)2N(R’)2, -P(=O)(OR’)2, - P(=O)(CH3)NHR’, -NO, -N(R’)3+, em que X é -F, -Br, -Cl ou -I, e R’ em alguns aspectos é, em cada ocorrência, independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e C1-6 alquila e certas partes ligadas a O, conforme descrito neste documento, como aciloxi.
[0079] EWGs exemplificadores também podem incluir grupos arila (por exemplo, fenila), dependendo da substituição e certos grupos heteroarila (por exemplo, piridina). Assim, o termo “grupos de retirada de elétrons” também inclui arilas ou heteroarilas que são adicionalmente substituídas por grupos de retirada de elétrons. Normalmente, os grupos de retirada de elétrons em arilas ou heteroarilas são -C(=O), -CN, -NO2, -CX3 e -X, em que X selecionado independentemente é halogênio, tipicamente -F ou -Cl. Dependendo de seus substituintes, uma parte alquila também pode ser um grupo de retirada de elétrons.
[0080] “Capacidade do grupo de saída” se refere à capacidade de um composto contendo álcool, tiol, amina ou amida correspondente a uma Camptotecina em um Conjugado de Camptotecina de ser liberado do Conjugado como um fármaco livre subsequente à ativação de um agente autoimolativo evento dentro do Conjugado. Essa liberação pode ser variável sem o benefício de uma unidade de carbamato de metileno à qual sua camptotecina está ligada (isto é, quando a camptotecina está diretamente ligada a uma parte autoimolativa e não tem uma unidade de carbamato de metileno interveniente). Bons grupos de saída são geralmente bases fracas e quanto mais ácido o grupo funcional que é expelido de tais conjugados, mais fraca é a base conjugada. Assim, a capacidade do grupo de saída de um fármaco livre contendo álcool, tiol, amina ou amida de uma camptotecina estará relacionada ao pKa do grupo funcional do fármaco que é expelido de um conjugado nos casos em que a unidade de carbamato de metileno (isto é, aquele em que uma camptotecina está diretamente ligada a uma parte autoimolativa) não é usado. Assim, um pKa mais baixo para esse grupo funcional aumentará sua capacidade de grupo de saída. Embora outros fatores possam contribuir para a liberação de fármaco livre a partir de conjugados que não têm o benefício de uma unidade de carbamato de metileno, geralmente um fármaco com um grupo funcional com um valor de pKa mais baixo será tipicamente um grupo de saída melhor do que um fármaco ligada por meio de um grupo funcional com um valor de pKa mais alto. Outra consideração é que um grupo funcional com um valor de pKa muito baixo pode resultar em um perfil de atividade inaceitável devido à perda prematura da Camptotecina por meio de hidrólise espontânea. Para conjugados que empregam uma unidade de carbamato de metileno, um grupo funcional comum (isto é, um ácido carbâmico) com um valor de pKa que permite a liberação eficiente de fármaco livre, sem sofrer perda inaceitável de camptotecina, é produzido após autoimolação.
[0081] “Parte succinimida”, como aqui usado, se refere a uma parte orgânica composta por um sistema de anel de succinimida, que está presente em um tipo de Unidade Extensora (Z) que é tipicamente ainda composta por uma parte contendo alquileno ligada ao nitrogênio imida desse sistema de anel. Uma porção succinimida resulta tipicamente da adição de Michael de um grupo sulfidrila de uma Unidade Ligante ao sistema de anel maleimida de um precursor de Unidade Extensora (Z'). Uma parte de succinimida é, portanto, composta por um sistema de anel de succinimida tio- substituída e quando presente em um Conjugado de Camptotecina tem seu nitrogênio de imida substituído pelo restante da Unidade Ligante do Conjugado de Camptotecina e é opcionalmente substituído por substituinte (ou substituintes) que estava presente no sistema de anéis de maleimida de Z'.
[0082] “Fração ácido-amida”, como aqui usado, se refere a ácido succínico com um substituinte amida que resulta do sistema de anel de succinimida tio-substituído de uma parte succinimida que tem sofrido quebra de uma de suas ligações carbonil-nitrogênio por hidrólise. A hidrólise que resulta em uma parte de ácido succínico-amida fornece uma Unidade Ligante com menor probabilidade de sofrer perda prematura da Unidade Ligante à qual está ligada por meio da eliminação do substituinte anticorpo-tio. Espera-se que a hidrólise do sistema de anel de succinimida da parte de succinimida tio-substituída forneça isômeros regioquímicos de partes de ácido-amida que são devido a diferenças na reatividade dos dois carbonos de carbonila do sistema de anel de succinimida atribuíveis, pelo menos em parte, a qualquer substituinte presente no sistema de anéis de maleimida do precursor da Unidade Extensora e no substituinte tio introduzido pelo ligando de direcionamento.
[0083] O termo “pró-fármaco”, como aqui usado, se refere a um composto menos biologicamente ativo ou inativo que é transformado dentro do corpo em um composto mais biologicamente ativo por meio de um processo químico ou biológico (isto é, uma reação química ou uma biotransformação enzimática) Tipicamente, um composto biologicamente ativo é tornado menos biologicamente ativo (isto é, é convertido em um pró-fármaco) modificando quimicamente o composto com uma porção de pró-fármaco. Em alguns aspectos, o pró-fármaco é um pró-fármaco do Tipo II, que é bioativado fora das células, por exemplo, em fluidos digestivos ou no sistema de circulação do corpo, por exemplo, no sangue. Os pró-fármacos exemplificadores são ésteres e β-D-glucopiranosideos.
[0084] Em muitos casos, a montagem dos conjugados, ligantes e componentes descritos neste documento se referirá a grupos reativos. Um “grupo reativo” ou RG é um grupo que contém um sítio reativo (RS) que tem a capacidade de formar uma ligação com os componentes da Unidade Ligante (ou seja, A, W, Y) ou a Camptotecina D. RS é o sítio reativo dentro de um Grupo Reativo (RG). Os grupos reativos incluem grupos sulfidrila para formar ligações dissulfeto ou ligações tioéter, grupos aldeído, cetona ou hidrazina para formar ligações hidrazona, grupos carboxílicos ou amino para formar ligações peptídicas, grupos carboxílicos ou hidroxi para formar ligações éster, ácidos sulfônicos para formar ligações sulfonamida, álcoois para formar ligações carbamato e aminas para formar ligações sulfonamida ou ligações carbamato. A tabela a seguir é ilustrativa de Grupos Reativos, Sítios Reativos e Grupos Funcionais exemplificadores que podem se formar após a reação do sítio reativo. A tabela não é limitativa. Um versado na técnica apreciará que as porções R’ e R’’ observadas na tabela são efetivamente qualquer parte orgânica (por exemplo, um grupo alquila, grupo arila, grupo heteroarila ou grupo alquila, arila ou heteroarila substituído) que é compatível com a formação de ligação fornecida na conversão de RG em um dos Grupos Funcionais Exemplificadores. Será também apreciado que, conforme aplicado às modalidades da presente invenção, R 'pode representar um ou mais componentes do ligante autoestabilizador ou ligante secundário opcional, conforme o caso, e R’’ pode representar um ou mais componentes do ligante secundário opcional, Camptotecina, unidade de estabilização ou unidade de detecção, conforme o caso.
[0085] Os compostos marcados isotopicamente também estão dentro do escopo da presente revelação. Como aqui usado, um “composto marcado isotopicamente” ou “derivado de isótopo” se refere a um composto presentemente revelado incluindo sais farmacêuticos e pró-fármacos dos mesmos, cada um como aqui descrito, em que um ou mais átomos são substituídos por um átomo com uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa normalmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados em compostos presentemente revelados incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, flúor e cloro, como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F e 36Cl, respectivamente.
[0086] Marcando isotopicamente os compostos presentemente revelados, os compostos podem ser úteis em ensaios de distribuição de fármaco e/ou substrato em tecido. Os compostos tritiados (3H) e marcados com carbono-14 (14C) são particularmente preferenciais pela sua facilidade de preparação e detectabilidade. Além disso, a substituição com isótopos mais pesados, como deutério (2H), pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou requisitos de dosagem reduzidos e, portanto, pode ser preferencial em algumas circunstâncias. Os compostos marcados isotopicamente presentemente revelados, incluindo sais farmacêuticos, ésteres e pró-fármacos dos mesmos, podem ser preparados por qualquer meio conhecido na técnica. Os benefícios também podem ser obtidos com a substituição de 12C normalmente abundante por 13C. (Consulte os documentos WO 2007/005643, WO 2007/005644, WO 2007/016361 e WO 2007/016431.)
[0087] Por exemplo, deutério (2H) pode ser incorporado em um composto revelados neste documento para o propósito de manipular o metabolismo oxidativo do composto por meio do efeito de isótopo cinético primário. O efeito do isótopo cinético primário é uma mudança na taxa de uma reação química que resulta da troca de núcleos isotópicos, que por sua vez é causada pela mudança nas energias do estado fundamental necessárias para a formação da ligação covalente após essa troca isotópica. A troca de um isótopo mais pesado geralmente resulta em uma redução da energia do estado fundamental para uma ligação química e, portanto, causa uma redução na taxa de quebra da ligação limitadora da taxa. Se a quebra da ligação ocorre em ou nas proximidades de uma região do ponto de sela ao longo da coordenada de uma reação de múltiplos produtos, as razões de distribuição do produto podem ser alteradas substancialmente. Para explicação: se o deutério está ligado a um átomo de carbono em uma posição não trocável, as diferenças de taxa de kM/kD = 2-7 são típicas. Se essa diferença de taxa for aplicada com sucesso a um composto revelado neste documento que é suscetível à oxidação, o perfil desse composto in vivo pode ser drasticamente modificado e resultar em propriedades farmacocinéticas melhoradas.
[0088] Ao constatar e desenvolver agentes terapêuticos, o especialista no assunto da técnica é capaz de otimizar os parâmetros farmacocinéticos enquanto retém as propriedades in vitrodesejáveis. É razoável supor que muitos compostos com perfis farmacocinéticos fracos são suscetíveis ao metabolismo oxidativo. Os ensaios microssômicos hepáticos in vitro atualmente disponíveis fornecem informações valiosas sobre o curso do metabolismo oxidativo desse tipo, que por sua vez permite o projeto racional de compostos deuterados daqueles revelados neste documento com estabilidade aprimorada através da resistência a tal metabolismo oxidativo. Melhorias significativas nos perfis farmacocinéticos dos compostos revelados neste documento são assim obtidas e podem ser expressas quantitativamente em termos de aumentos na meia-vida in vivo (t/2), concentração no efeito terapêutico máximo (Cmax), área sob a resposta à dose curva (AUC) e F; e em termos de custos reduzidos de depuração, dose e materiais.
[0089] O que se segue destina-se a ilustrar o acima: um composto que tem vários sítios potenciais de ataque para o metabolismo oxidativo, por exemplo, átomos de hidrogênio benzílico e átomos de hidrogênio ligados a um átomo de nitrogênio, é preparado como uma série de análogos em que várias combinações de átomos de hidrogênio são substituídos por átomos de deutério, de modo que alguns, a maioria ou todos esses átomos de hidrogênio foram substituídos por átomos de deutério. As determinações de meia-vida permitem uma determinação favorável e precisa da extensão em que a melhoria na resistência ao metabolismo oxidativo melhorou. Desse modo, é determinado que a meia-vida do composto original pode ser estendida em até 100% como resultado da troca de deutério-hidrogênio desse tipo.
[0090] A troca de deutério-hidrogênio em um composto revelado neste documento também pode ser usada para obter uma modificação favorável do espectro de metabólitos do composto de partida, a fim de diminuir ou eliminar metabólitos tóxicos indesejados. Por exemplo, se um metabólito tóxico surge através da clivagem da ligação carbono-hidrogênio (CH) oxidativa, pode-se razoavelmente presumir que o análogo deuterado diminuirá muito ou eliminará a produção do metabólito indesejado, mesmo se a oxidação particular não for determinante da taxa degrau. Informações adicionais sobre o estado da técnica com relação à troca de deutério-hidrogênio podem ser encontradas, por exemplo, em Hanzlik et al., J. Org. Chem. 55, 3.992 a 3.997, 1990, Reider et al., J. Org. Chem. 52, 3.326 a 3.334, 1987, Foster, Adv. Drug Res. 14, 1 a 40, 1985, Gillette et al, Biochemistry 33(10) 2.927 a 2.937, 1994, e Jarman et al. Carcinogenesis 16(4), 683 a 688, 1993.
[0091] As combinações de substituintes e variáveis previstas por esta invenção são apenas aquelas que resultam na formação de compostos estáveis. O termo “estável”, como aqui usado, se refere a compostos que têm estabilidade suficiente para permitir a fabricação e que mantém a integridade do composto por um período de tempo suficiente para ser útil para os fins aqui detalhados (por exemplo, administração terapêutica ou profilática a um assunto).
[0092] Os compostos da presente invenção são, subsequentemente à sua preparação, preferencialmente isolados e purificados para obter uma composição contendo uma quantidade em peso igual ou superior a 95% (“substancialmente puro”), que é então usada ou formulada como aqui descrito. Em certas modalidades, os compostos da presente invenção são mais de 99% puros.
Modalidades
[0093] Uma série de modalidades da invenção são descritas abaixo, as quais não pretendem limitar a invenção de forma alguma, e são seguidas por uma discussão mais detalhada dos componentes que constituem os conjugados. Um versado na técnica entenderá que cada um dos conjugados identificados e qualquer uma das modalidades selecionadas dos mesmos se destina a incluir o escopo completo de cada componente e ligante.
Conjugados de Camptotecina
[0094] Em um aspecto, são fornecidos aqui conjugados de camptotecina que têm uma fórmula: L-(Q-D)p ou uma forma farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que L é uma Unidade de Ligante; Q é uma unidade de ligação com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL-; -Z-A- LP(S*)-RL-; -Z-A-S*-RL-Y-; e -Z-A- LP(S*)-RL-Y-; em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; LP é uma Unidade Conectora Paralela; S* é uma ligação ou Agente de Particionamento; RL é um peptídeo que compreende de 2 a 8 aminoácidos; e Y é uma Unidade Espaçadora; D é uma Unidade de Fármaco selecionada dentre: em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 haloalquila, C3-C8 cicloalquila, C3- C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila; RCé um membro selecionado do grupo que consiste em C1 C6 alquila e C3-C6 cicloalquila; cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C2-C6 heteroalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, C1-C8 aminoalquilC(O)- , C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila; ou RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquil e N(C1-C4 alquil)2; e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RB, RC, RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e p é de cerca de 1 a cerca de 16; em que Q é ligado através de qualquer um dos grupos hidroxila ou amina presentes em CPT1, CPT2, CPT3, CPT4 ou CPT5.
[0095] Em outro aspecto, são fornecidos aqui conjugados de camptotecina que têm uma fórmula: L-(Q-D)p ou uma forma farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que L é uma Unidade de Ligante; Q é uma unidade de ligação com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL-; -Z-A- LP(S*)-RL-; -Z-A-S*-RL-Y-; e -Z-A- LP(S*)-RL-Y-; em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; LPé uma Unidade Conectora Paralela; S*é uma ligação ou Agente de Particionamento; RL é um peptídeo que compreende de 2 a 8 aminoácidos; e Y é uma Unidade Espaçadora;
[0096] D é uma Unidade de Fármaco selecionada dentre: em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em -H, -(C1-C4)alquil-OH, C 1-C8 alquila, C1-C8 haloalquila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila; cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C2-C6 heteroalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, C1-C8 aminoalquilC(O)- , C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila; ou RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquil e N(C1-C4 alquil)2; e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RB, RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e p é de cerca de 1 a cerca de 16; em que Q é ligado através de qualquer um dos grupos hidroxila ou amina presentes em CPT2 ou CPT5.
[0097] Em ainda outro aspecto, são fornecidos aqui conjugados de camptotecina que têm uma fórmula: L-(Q-D)p ou uma forma farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que L é uma Unidade de Ligante; Q é uma unidade de ligação com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL-; -Z-A- LP(S*)-RL-; -Z-A-S*-RL-Y-; e -Z-A- LP(S*)-RL-Y-; em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; LPé uma Unidade Conectora Paralela; S* é uma ligação ou Agente de Particionamento; RL é um peptídeo que compreende de 2 a 8 aminoácidos; e Y é uma Unidade Espaçadora; D é uma Unidade de Fármaco com a seguinte fórmula estrutural: ; em que cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C2-C6 heteroalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, C1-C8 aminoalquilC(O)- , C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila; ou RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquil e N(C1-C4 alquil)2; e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e p é de cerca de 1 a cerca de 16; em que Q é ligado através de qualquer um dos grupos hidroxila ou amina presentes em CPT5.
[0098] Em um grupo de modalidades, D tem a Fórmula CPT5.
[0099] Em um grupo de modalidades, D tem a Fórmula CPT2.
[00100] Em um grupo de modalidades, D tem a Fórmula CPT3.
[00101] Em um grupo de modalidades, D tem a Fórmula CPT4.
[00102] Em um grupo de modalidades, D tem a Fórmula CPT1.
[00103] Em algumas modalidades, a forma farmaceuticamente aceitável é um sal farmaceuticamente aceitável.
[00104] Em um grupo de modalidades, Q tem uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL- e -Z-A-S*-RL-Y-.
[00105] Em outro grupo de modalidades, Q tem uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A- LP(S*)-RL- e -Z-A- LP(S*)-RL-Y-.
[00106] Em um grupo de modalidades, os Conjugados de Camptotecina compreendem uma Unidade de Fármaco que tem Fórmula CPT1 e são representados por uma fórmula selecionada dentre: em que os grupos L, Z, A, S*, LP, RL e Y têm os significados fornecidos acima e em qualquer uma das modalidades especificamente citadas neste documento.
[00107] Em um outro grupo de modalidades, os Conjugados de Camptotecina compreendem uma Unidade de Fármaco que tem Fórmula CPT2 e são representados por uma fórmula selecionada dentre: em que os grupos L, Z, A, S*, LP, RL e Y têm os significados fornecidos acima e em qualquer uma das modalidades especificamente citadas neste documento.
[00108] Em um grupo de modalidades, RBé um membro selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila e C1-C8 haloalquila.
[00109] Em um grupo de modalidades, RBé um membro selecionado do grupo que consiste em C3-C8 cicloalquila, C3- C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila, e em que as porções cicloalquila e fenila de RBsão substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquil e N(C1-C4 alquil)2.
[00110] Em um outro grupo de modalidades, RBé H, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec- butila, terc-butila, pentila, isopentila, 1-etilpropila ou hexila. Em outras modalidades, RBé clorometila ou bromometila. Em outras modalidades, RBé fenila ou fenila halo-substituída. Em outras modalidades, RBé fenila ou fluorofenila.
[00111] Em um outro grupo de modalidades, os Conjugados de Camptotecina compreendem uma Unidade de Fármaco que tem Fórmula CPT3 e são representados por uma fórmula selecionada dentre: em que os grupos L, Z, A, S*, LP, RL e Y têm os significados fornecidos acima e em qualquer uma das modalidades especificamente citadas neste documento.
[00112] Em um grupo de modalidades, RCé C1-C6 alquila. Em algumas modalidades, RCé metila.
[00113] Em um grupo de modalidades, RCé C3-C6 cicloalquila.
[00114] Em um outro grupo de modalidades, os Conjugados de Camptotecina compreendem uma Unidade de Fármaco que tem Fórmula CPT4 e são representados por uma fórmula selecionada dentre: em que os grupos L, Z, A, S*, LP, RL e Y têm os significados fornecidos acima e em qualquer uma das modalidades especificamente citadas neste documento.
[00115] Em um outro grupo de modalidades, os Conjugados de Camptotecina compreendem uma Unidade de Fármaco que tem Fórmula CPT5 e são representados por uma fórmula selecionada dentre: em que os grupos L, Z, A, S*, LP, RL e Y têm os significados fornecidos acima e em qualquer uma das modalidades especificamente citadas neste documento.
[00116] Em um grupo de modalidades, tanto RF como RF’ são H.
[00117] Em um grupo de modalidades, pelo menos um dentre RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1 C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C2-C6 heteroalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)- e C1-C8 aminoalquilC(O)-.
[00118] Em um grupo de modalidades, cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1 C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C2-C6 heteroalquila, C1 C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)- e C1-C8 aminoalquilC(O)-.
[00119] Em um grupo de modalidades, pelo menos um dentre RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1- C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila, e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquil e N(C1-C4 alquil)2.
[00120] Em um grupo de modalidades, cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3 C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila, e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquil e N(C1-C4 alquil)2.
[00121] Em algumas modalidades, RFé H e RF’é C1-C8 alquila.
[00122] Em um grupo de modalidades, RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquil e N(C1-C4 alquil)2.
[00123] Em algumas modalidades, os Conjugados de Camptotecina têm a Fórmula (IC): ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que y é 1, 2, 3, ou 4, ou é 1 ou 4; e z é um número inteiro de 2 a 12, ou é 2, 4, 8, ou 12; e p é 1-16.
[00124] Em algum aspecto dessas modalidades, p é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em algum aspecto, p é 2, 4 ou 8.
[00125] Em algumas modalidades, os Conjugados de Camptotecina têm a Fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que p é 2, 4, ou 8, de preferência p é 8.
[00126] Em algumas modalidades, os Conjugados de Camptotecina têm a Fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; em que p é 2, 4, ou 8, de preferência p é 8.
[00127] Em algum aspecto dessas modalidades, p é 8.
Compostos de Camptotecina-Ligante
[00128] Em alguns aspectos, ao preparar os conjugados de camptotecina, será desejável sintetizar a combinação completa de fármaco-ligante ou o fármaco em combinação com uma porção do ligante, antes da conjugação com um ligante de direcionamento. Em tais modalidades, os Compostos de Camptotecina-Ligante, conforme descrito neste documento, são compostos intermediários. Nessas modalidades, a Unidade Extensora em um Composto de Camptotecina-Ligante ainda não está covalentemente ligada à Unidade Ligante e, portanto, tem um grupo funcional para conjugação a um ligando de direcionamento (ou seja, é um precursor da Unidade Extensora, Z’). Em um aspecto, um Composto de Camptotecina-Ligante compreende uma camptotecina (mostrada aqui como Fórmulas CPT1, CPT2, CPT3, CPT4 e CPT5) e uma Unidade Ligante (Q) que compreende um Ligante Liberável de Peptídeo (RL) através do qual a Unidade Ligante está conectada à Camptotecina. Assim, a Unidade Ligante compreende, além de RL (que é um ligante de peptídeo), um precursor de Unidade Extensora (Z’) que compreende um grupo funcional para conjugação a uma Unidade Ligante e com capacidade de (direta ou indiretamente) conectar o RL à Unidade Ligante. Uma Unidade Conectora Paralela (LP) pode estar presente em algumas modalidades quando se deseja adicionar um Agente de Particionamento (S*) como um apêndice da cadeia lateral. Em algumas modalidades, uma Unidade Conectora (A) está presente quando é desejável adicionar mais distância entre a Unidade Extensora e RL.
[00129] Em um aspecto, um Composto de Camptotecina- Ligante é composto por uma Camptotecina que tem a Fórmula CPT1, CPT2, CPT3, CPT4 ou CPT5, e uma Unidade Ligante (Q), em que Q compreende um Ligante Liberável de Peptídeo, diretamente ligado a um precursor de Unidade Extensora (Z’) ou indiretamente a Z’ através da ligação um componente (ou componentes) interveniente da Unidade Ligante do Composto de Camptotecina-Ligante (isto é, A, S* e/ou LP(S*)), em que Z’ é composto por um grupo funcional com capacidade de formar uma ligação covalente a um ligante de direcionamento.
[00130] No contexto dos Conjugados de Camptotecina e/ou Compostos de Camptotecina-Ligante - a montagem é mais bem descrita em termos de seus grupos de componentes. Embora alguns procedimentos também sejam descritos neste documento, a ordem de montagem e as condições gerais para preparar os Conjugados e Compostos serão bem compreendidos por um versado na técnica.
Grupos de componente Unidades Ligantes:
[00131] Em algumas modalidades da invenção, uma Unidade Ligante está presente. A Unidade Ligante (L-) é um agente de direcionamento que se liga especificamente a uma parte alvo. Em um grupo de modalidades, a Unidade Ligante se liga específica e seletivamente a um componente de célula (um Agente de Ligação de Célula) ou a outras moléculas alvo de interesse. A Unidade Ligante atua para direcionar e apresentar a Camptotecina (CPT1, CPT2, CPT3, CPT4 ou CPT5) ou um componente de fármaco contendo camptotecina para a população de células alvo particular com a qual a Unidade Ligante interage devido à presença de seu componente ou molécula alvo e permite a liberação subsequente do fármaco livre dentro (ou seja, intracelularmente) ou na vizinhança das células-alvo (ou seja, extracelularmente). As Unidades Ligantes, L, incluem, sem limitação, proteínas, polipeptídeos e peptídeos. Unidades Ligantes adequadas incluem, por exemplo, anticorpos, por exemplo, anticorpos de comprimento total e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, interferons, linfocinas, hormônios, fatores de crescimento e fatores estimuladores de colônias, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (como, sem limitação, transferrina), ou qualquer outra molécula ou substância de ligação celular. Em algumas modalidades, a Unidade Ligante (L) é um anticorpo ou um agente de direcionamento de proteína não anticorpo.
[00132] Em um grupo de modalidades, uma Unidade Ligante é ligada a Q (uma unidade de ligante) que compreende um Ligante Liberável de Peptídeo. Como observado acima, ainda outros componentes de ligação podem estar presentes nos conjugados descritos neste documento para servir ao propósito de fornecer espaço adicional entre o composto de fármaco de Camptotecina e a Unidade Ligante (por exemplo, uma Unidade Extensora e opcionalmente uma Unidade Conectora, A), ou fornecer atributos para a composição para aumentar a solubilidade (por exemplo, um Agente de Particionamento, S*). Em algumas dessas modalidades, a Unidade Ligante está ligada a Z da Unidade Ligante por meio de um heteroátomo da Unidade Ligante. Os heteroátomos que podem estar presentes em uma Unidade Ligante para essa ligação incluem enxofre (em uma modalidade, de um grupo sulfidrila de um ligante de direcionamento), oxigênio (em uma modalidade, de um grupo carboxila ou hidroxila de um ligante de direcionamento) e nitrogênio, opcionalmente substituído (em uma modalidade, de um grupo funcional amina primária ou secundária de um ligante de direcionamento ou em outra modalidade de um nitrogênio de amida opcionalmente substituído). Esses heteroátomos podem estar presentes no ligando de direcionamento no estado natural do ligando, por exemplo, em um anticorpo de ocorrência natural, ou podem ser introduzidos no ligando de direcionamento por meio de modificação química ou manipulação biológica.
[00133] Em uma modalidade, uma Unidade de Ligando tem um grupo funcional sulfidrila de modo que a Unidade Ligando seja ligada à Unidade de Ligante através do átomo de enxofre do grupo funcional sulfidrila.
[00134] Em outra modalidade, uma Unidade de Ligando tem um ou mais resíduos de lisina que têm a capacidade de reagir com ésteres ativados (tais ésteres incluem, sem limitação, N-hidroxissuccimida, pentafluorofenila e ésteres de p-nitrofenila) de um precursor de Unidade Extensora de um intermediário do Composto Ligante Camptotecina e, portanto, fornece uma ligação amida que consiste no átomo de nitrogênio da Unidade de Ligando e o grupo C=O da Unidade Extensora da Unidade Ligante.
[00135] Em ainda outro aspecto, uma Unidade de Ligando tem um ou mais resíduos de lisina com capacidade de modificação química para introduzir um ou mais grupos sulfidrila. Nessas modalidades, a Unidade de Ligando é covalentemente ligada à Unidade Ligante por meio do átomo de enxofre do grupo funcional sulfidrila. Os reagentes que podem ser usados para modificar lisinas dessa maneira incluem, sem limitação, S-acetiltioacetato de N-succinimidila (SATA) e cloridrato de 2-iminotiolano (reagente de Traut).
[00136] Em outra modalidade, uma Unidade de Ligando tem um ou mais grupos de carboidratos com capacidade de modificação para fornecer um ou mais grupos funcionais sulfidrila. A Unidade de Ligando quimicamente modificada em um Conjugado de Camptotecina é ligada a um componente de Unidade Ligante (por exemplo, uma Unidade Extensora) através do átomo de enxofre do grupo funcional sulfidrila.
[00137] Em ainda outra modalidade, a Unidade de Ligando tem um ou mais grupos de carboidratos que podem ser oxidados para fornecer um grupo funcional aldeído (-CHO) (consulte, por exemplo, Laguzza, et al., 1989, J. Med. Chem. 32(3):548-55). Nessas modalidades, o aldeído correspondente interage com um sítio reativo em um precursor da Unidade Extensora para formar uma ligação entre a Unidade Extensora e a Unidade de Ligando. Sítios reativos em um precursor de Unidade Extensora que têm a capacidade de interagir com um grupo funcional contendo carbonila reativo em uma Unidade de Ligando de direcionamento incluem, sem limitação, hidrazina e hidroxilamina. Outros protocolos para a modificação de proteínas para a fixação de Unidades de Ligante (Q) ou espécies relacionadas são descritos em Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002) (aqui incorporado a título de referência).
[00138] Em alguns aspectos, uma Unidade de Ligando tem a capacidade de formar uma ligação interagindo com um grupo funcional reativo em um precursor de Unidade Extensora (Z’) para formar uma ligação covalente entre a Unidade Extensora (Z) e a Unidade de Ligando correspondente ao ligando de direcionamento. O grupo funcional de Z’ com essa capacidade de interagir com um ligando de direcionamento dependerá da natureza da Unidade de Ligando. Em algumas modalidades, o grupo reativo é uma maleimida que está presente em uma Unidade Extensora antes de sua fixação para formar uma Unidade de Ligando (isto é, uma parte de maleimida de um precursor da Unidade Extensora). A fixação covalente de uma Unidade de Ligando a uma Unidade Extensora é realizada através de um grupo funcional sulfidrila de uma Unidade de Ligando interagindo com o grupo funcional maleimida de Z’ para formar uma succinimida tio-substituída. O grupo funcional sulfidrila pode estar presente na Unidade de Ligando no estado natural da Unidade de Ligando, por exemplo, em um resíduo de ocorrência natural, ou pode ser introduzido na Unidade de Ligando por meio de modificação química ou por manipulação biológica.
[00139] Em ainda outra modalidade, a Unidade de Ligando é um anticorpo e o grupo sulfidrila é gerado por redução de um dissulfeto intercadeia do anticorpo. Por conseguinte, em algumas modalidades, a Unidade de Ligante é conjugada a um resíduo de cisteína de dissulfeto (ou dissulfetos) intercadeia reduzido.
[00140] Em ainda outra modalidade, a Unidade de Ligando é um anticorpo e o grupo funcional sulfidrila é quimicamente introduzido no anticorpo, por exemplo, pela introdução de um resíduo de cisteína. Por conseguinte, em algumas modalidades, a Unidade de Ligante (com ou sem uma camptotecina ligada) é conjugada a uma Unidade de Ligando através de um resíduo de cisteína introduzido de uma Unidade de Ligando.
[00141] Foi observado para bioconjugados que o sítio de conjugação de fármaco pode afetar uma série de parâmetros, incluindo facilidade de conjugação, estabilidade de fármaco- ligante, efeitos nas propriedades biofísicas dos bioconjugados resultantes e citotoxicidade in vitro. No que diz respeito à estabilidade de fármaco-ligante, o sítio de conjugação de uma parte de fármaco-ligante a uma Unidade de Ligando pode afetar a capacidade da parte de fármaco-ligante conjugada de sofrer uma reação de eliminação, em alguns casos, para causar a liberação prematura de fármaco livre. Os sítios para conjugação em um ligando de direcionamento incluem, por exemplo, um dissulfeto intercadeia reduzido, bem como resíduos de cisteína selecionados em sítios manipulados. Em algumas modalidades, os métodos de conjugação para formar Conjugados de Camptotecina, como aqui descrito, usam resíduos de tiol em sítios geneticamente manipulados que são menos suscetíveis à reação de eliminação (por exemplo, posições 239 de acordo com o índice EU conforme estabelecido em Kabat) em comparação com métodos de conjugação que usam resíduos de tiol de uma ligação dissulfeto reduzida. Em outras modalidades, os métodos de conjugação para formar Conjugados de Camptotecina, como aqui descrito, usam resíduos de tiol em sítios que são mais suscetíveis à reação de eliminação (por exemplo, resultante da redução de dissulfeto intercadeia).
[00142] Em algumas modalidades, um Conjugado de Camptotecina compreende uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo não imunorreativo, como sua Unidade de Ligando. Consequentemente, em algumas modalidades, a Unidade de Ligando é uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo não imunorreativo. Exemplos incluem, sem limitação, transferrina, fatores de crescimento epidérmico (“EGF”), bombesina, gastrina, peptídeo liberador de gastrina, fator de crescimento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, fatores de crescimento transformadores (“TGF” ), como TGF-α e TGF-β, fator de crescimento vaccinia (“VGF”), insulina e fatores de crescimento similares à insulina I e II, somatostatina, lectinas e apoproteína de lipoproteína de baixa densidade.
[00143] As Unidades de Ligando particularmente preferenciais são de anticorpos. Na verdade, em qualquer uma das modalidades aqui descritas, a Unidade de Ligando pode ser de um anticorpo. Os anticorpos policlonais úteis são populações heterogêneas de moléculas de anticorpo derivadas de soros de animais imunizados. Anticorpos monoclonais úteis são populações homogêneas de anticorpos para um determinado determinante antigênico (por exemplo, um antígeno de células cancerígenas, um antígeno viral, um antígeno microbiano, uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um produto químico, ácido nucleico ou fragmentos dos mesmos). Um anticorpo monoclonal (mAb) para um antígeno de interesse pode ser preparado com o uso de qualquer técnica conhecida na técnica, que proporciona a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares contínuas em cultura.
[00144] Os anticorpos monoclonais úteis incluem, sem limitação, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclonais humanizados ou anticorpos monoclonais humanos- camundongo (ou outras espécies) quiméricos. Os anticorpos incluem anticorpos de comprimento total e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos por qualquer uma das inúmeras técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7.308 a 7.312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72 a 79; e Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3 a 16).
[00145] O anticorpo pode ser um fragmento funcionalmente ativo, derivado ou análogo de um anticorpo que se liga imunoespecificamente a células alvo (por exemplo, antígenos de células cancerígenas, antígenos virais ou antígenos microbianos) ou outros anticorpos ligados a células tumorais ou matriz. Nesse aspecto, “funcionalmente ativo” significa que o fragmento, derivado ou análogo tem a capacidade de se ligar imunoespecificamente às células alvo. Para determinar quais sequências de CDR se ligam ao antígeno, os peptídeos sintéticos contendo as sequências de CDR podem ser usados em ensaios de ligação com o antígeno por qualquer método de ensaio de ligação conhecido na técnica (por exemplo, o ensaio de núcleo BIA) (consulte, por exemplo, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, Md; Kabat E et al., 1980, J. Immunology 125(3):961 a 969).
[00146] Outros anticorpos úteis incluem fragmentos de anticorpos, como, sem limitação, fragmentos F(ab’)2, fragmentos Fab, Fvs, anticorpos de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, scFv, scFv-FV ou qualquer outra molécula com a mesma especificidade que a anticorpo.
[00147] Além disso, anticorpos recombinantes, como anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, que compreendem porções humanas e não humanas, que podem ser produzidos por meio do uso de técnicas de DNA recombinante padrão, são anticorpos úteis. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, como, por exemplo, aquelas que têm uma região variável derivada de um monoclonal murino e regiões constantes de imunoglobulina humana. (Consulte, por exemplo, a Patente no U.S. 4.816.567; e Patente no U.S. 4.816.397, que são incorporadas neste documento a título de referência em sua totalidade). Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpos de espécies não humanas que têm uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e uma região estrutural de uma molécula de imunoglobulina humana. (Consulte, por exemplo, a Patente no U.S. 5.585.089, que é incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade.) Tais anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica, por exemplo, com o uso de métodos descritos na Publicação Internacional no WO 87/02671; Publicação de Patente no EP 0 184 187; Publicação de Patente no EP 0 171 496; Publicação de Patente no EP 0 173 494; Publicação Internacional no WO 86/01533; Patente no U.S. 4.816.567; Publicação de Patente Patente no EP 012 023; Berter et al., Science 240:1.041 a 1.043, 1988; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3.439 a 3.443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3.521 a 3.526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214 a 218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999 a 1.005; Wood et al., 1985, Nature 314:446 a 449; e Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1.553 a 1.559; Morrison, 1985, Science 229:1.202 a 1.207; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Patente no U.S. 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature 321:552 a 525; Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534; e Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4.053 a 4.060; cada um dos quais é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.
[00148] Anticorpos totalmente humanos em alguns casos (por exemplo, quando a imunogenicidade para um anticorpo não humano ou quimérico pode ocorrer) são mais desejáveis e podem ser produzidos com o uso de camundongos transgênicos que não têm a capacidade de expressar genes de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina endógena, mas que podem expressar genes humanos genes de cadeia pesada e leve.
[00149] Os anticorpos incluem análogos e derivados que são modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula, desde que essa ligação covalente permita que o anticorpo retenha a sua imunoespecificidade de ligação ao antígeno. Por exemplo, mas não a título de limitação, derivados e análogos dos anticorpos incluem aqueles que foram posteriormente modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, PEGuilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma unidade de anticorpo celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, sem limitação, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica na presença de tunicamicina, etc. Além disso, o análogo ou derivado pode conter um ou mais aminoácidos não naturais.
[00150] Os anticorpos podem ter modificações (por exemplo, substituições, deleções ou adições) em resíduos de aminoácidos que interagem com os receptores Fc. Em particular, os anticorpos podem ter modificações nos resíduos de aminoácidos identificados como envolvidos na interação entre o domínio anti-Fc e o receptor FcRn (consulte, por exemplo, Publicação Internacional no WO 97/34631, que é incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade).
[00151] Os anticorpos imunoespecíficos para um antígeno de células cancerosas podem ser obtidos comercialmente ou produzidos por qualquer método conhecido por um versado na técnica, como técnicas de expressão recombinante. A sequência de nucleotídeos que codifica anticorpos imunoespecíficos para um antígeno de células cancerosas pode ser obtida, por exemplo, a partir da base de dados GenBank ou uma base de dados semelhante, as publicações da literatura ou por clonagem e sequenciamento de rotina.
[00152] Em uma modalidade específica, um anticorpo conhecido para o tratamento do câncer pode ser usado.
[00153] Em outra modalidade específica, os anticorpos para o tratamento de uma doença autoimune são usados de acordo com as composições e métodos da invenção.
[00154] Em certas modalidades, anticorpos úteis podem se ligar a um receptor ou complexo de receptor expresso em um linfócito ativado. O receptor ou complexo receptor pode compreender um membro da superfamília do gene da imunoglobulina, um membro da superfamília do receptor do TNF, uma integrina, um receptor de citocina, um receptor de quimiocina, uma proteína de histocompatibilidade principal, uma lectina ou uma proteína de controle do complemento.
[00155] Em alguns aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina se ligará especificamente a CD19, CD30, CD33, CD70 ou LIV-1.
[00156] Em alguns aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina se liga especificamente a CD30. Em outros aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina é um anticorpo anti-CD30 cAC10, que é descrito na Publicação de Patente Internacional no WO 02/43661. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD30 compreende CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD30 compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: e uma região variável de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD30 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
[00157] Em alguns aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina se liga especificamente a CD70. Em outros aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina é um anticorpo anti-CD70 h1F6, que é descrito na Publicação de Patente Internacional no WO 2006/113909. Em alguns aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina se liga especificamente a CD48. Em outros aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina é um anticorpo anti-CD48 hMEM102, que é descrito na Publicação de Patente Internacional no WO 2016/149535. Em alguns aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina se liga especificamente a NTB-A. Em outros aspectos, o anticorpo que é incorporado a um Conjugado de Camptotecina é um anticorpo anti-NTB-A h20F3, que é descrito na Publicação de Patente Internacional no WO 2017/004330.
Camptotecinas:
[00158] As Camptotecinas utilizadas nos vários aspectos e modalidades aqui descritas são representadas pelas fórmulas: conforme descrito aqui.
[00159] Em uma modalidade específica, as Camptotecinas têm a Fórmula: em que cada RF e RF’é independentemente H, glicila, hidroxiacetila, etila, ou 2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etila, ou em que RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel de heterocicloalquila com 5, 6 ou 7 membros. Em alguns aspectos, RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 6 membros. Em alguns aspectos, o anel com 6 membros é um grupo morfolinila ou piperazinila. Em alguns aspectos, RF’é H e RFé glicila, hidroxiacetila, etila, ou 2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etila. Em alguns aspectos, RF’é H e RF compreende um grupo alifático. RF’é H e RF compreende um grupo arila. Em alguns aspectos, RF’é H e RF compreende um grupo amida. Em alguns aspectos, RF’é H e RF compreende um grupo óxido de etileno.
[00160] Em uma modalidade específica, as Camptotecinas têm a Fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que RBé -H, -(C1-C4)alquil-OH, -(C1-C4)alquil-O-(C1- C4)alquil-NH2, -C 1-C8 alquila, C1-C8 haloalquila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila ou fenilC1-C4 alquila. Em alguns aspectos, RB compreende uma C1 C8 alquila. Em alguns aspectos, RB compreende um grupo ciclopropila, pentila, hexila, terc-butila, ou ciclopentila.
[00161] Ainda outras Camptotecinas são úteis no contexto dos Conjugados e Compostos aqui descritos. Efetivamente, a Camptotecina terá uma estrutura fundida de cinco ou seis anéis análoga às estruturas fornecidas como Fórmulas CPT1, CPT2, CPT3, CPT4 e CPT5, mas pode ter grupos adicionais, incluindo, sem limitação, uma hidroxila, tiol, amina ou grupo funcional amida cujo heteroátomo de oxigênio, enxofre ou nitrogênio opcionalmente substituído tem a capacidade de incorporação em um ligante e tem a capacidade de ser liberado do conjugado como um fármaco droga livre. Em alguns aspectos, esse grupo funcional fornece o único sítio em um fármaco medicamento disponível para fixação à Unidade de Ligante (Q). A parte de fármaco-ligante resultante é aquela que pode liberar fármaco livre ativo de um Conjugado de Camptotecina que tem essa parte no sítio direcionado por sua Unidade de Ligando para exercer um efeito citotóxico, citostático ou imunossupressor.
[00162] “Fármaco livre” se refere ao fármaco, uma vez que existe uma vez liberada da parte de fármaco-ligante. Em algumas modalidades, o fármaco livre inclui um fragmento do grupo Ligante Liberável de Peptídeo (RL) ou Unidade Espaçadora (Y). Em algumas modalidades, o fármaco livre que inclui um fragmento do grupo Ligante Liberável de Peptídeo é biologicamente ativo. O fármaco livre que inclui um fragmento do Ligante Liberável de Peptídeo ou Unidade Espaçadora (Y) é liberada do restante da parte de fármaco- ligante por meio da clivagem do Ligante Liberável ou liberada através da clivagem de uma ligação no grupo da Unidade Espaçadora (Y) e ficam ativos após o lançamento. Em algumas modalidades, o fármaco livre difere do fármaco conjugado em que o grupo funcional do fármaco para fixação à unidade de montagem autoimolativa não está mais associado aos componentes do Conjugado de Camptotecina (diferente de um heteroátomo previamente compartilhado). Por exemplo, o grupo funcional hidroxila livre de um fármaco contendo álcool pode ser representado como D-O*H, enquanto na forma conjugada o heteroátomo de oxigênio designado por O*é incorporado à unidade de carbamato de metileno de uma unidade autoimolativa. Após a ativação da porção autoimolativa e liberação do fármaco livre, a ligação covalente a O*é substituída por um átomo de hidrogênio de modo que o heteroátomo de oxigênio designado por O* esteja presente no fármaco livre como -O-H.
[00163] Em algumas modalidades, as Camptotecinas são biologicamente ativas. Em algumas modalidades, essas Camptotecinas são úteis em um método de inibir topoisomerase, matar células tumorais, inibir o crescimento de células tumorais, células cancerosas ou de um tumor, inibir a replicação de células tumorais ou células cancerosas, diminuir a carga geral do tumor ou diminuir o número de células cancerosas ou melhorar um ou mais sintomas associados a um câncer ou doença autoimune. Tais métodos compreendem, por exemplo, colocar células cancerosas em contato com um composto de Camptotecina.
Unidades de Ligante (Q)
[00164] Como observado acima, em algumas modalidades, o grupo de ligação Q tem uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL- - Z-A-LP(S*)-RL- - Z-A-S*-RL-Y-; e - Z-A-LP(S*)-RL-Y-, em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma Unidade Conectora; LP é uma Unidade Conectora Paralela; S* é um Agente de Particionamento; RL é um Ligante Liberável de Peptídeo; e Y é uma Unidade Espaçadora.
[00165] Em um grupo de modalidades, Q tem uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL-; e -Z-A-S*-RL-Y-; em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; S*é um Agente de Particionamento; e Y é uma Unidade Espaçadora.
Unidade Extensora (Z) ou (Z’):
[00166] Uma Unidade Extensora (Z) é um componente de um conjugado de camptotecina ou um composto ligante de camptotecina ou outro intermediário que atua para conectar a unidade de ligante ao restante do conjugado. Nesse aspecto, uma Unidade Extensora, antes da ligação a uma Unidade de Ligando (isto é, um precursor da Unidade Extensora, Z’), tem um grupo funcional que pode formar uma ligação com um grupo funcional de um ligando de direcionamento.
[00167] Em alguns aspectos, um precursor de Unidade Extensora (Z’) tem um grupo eletrofílico que tem a capacidade de interagir com um grupo nucleofílico reativo presente em uma Unidade de Ligando (por exemplo, um anticorpo) para fornecer uma ligação covalente entre uma Unidade de Ligando e a Unidade Extensora de uma Unidade de Ligante. Os grupos nucleofílicos em um anticorpo com essa capacidade incluem, sem limitação, grupos funcionais sulfidrila, hidroxila e amino. O heteroátomo do grupo nucleofílico de um anticorpo é reativo a um grupo eletrofílico em um precursor da unidade extensora e fornece uma ligação covalente entre a Unidade de ligando e a Unidade Extensora de uma Unidade de Ligante ou parte de Fármaco-Ligante. Grupos eletrofílicos úteis para esse propósito incluem, sem limitação, maleimida, grupos haloacetamida e ésteres de NHS. O grupo eletrofílico fornece um sítio conveniente para a fixação do anticorpo para formar um Conjugado de Camptotecina ou intermediário de Unidade de Ligando-Ligante.
[00168] Em outra modalidade, um precursor de Unidade Extensora tem um sítio reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo a um grupo eletrofílico presente em uma Unidade de Ligando (por exemplo, um anticorpo). Grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo para esse propósito incluem, sem limitação, grupos aldeído e carbonil cetona. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de um precursor de Unidade Extensora pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente ao anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis em um precursor de Unidade Extensora para esse propósito incluem, sem limitação, hidrazida, hidroxilamina, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e arilhidrazida. O grupo eletrofílico em um anticorpo fornece um sítio conveniente para a fixação do anticorpo para formar um Conjugado de Camptotecina ou intermediário de Unidade de Ligando-Ligante.
[00169] Em algumas modalidades, um átomo de enxofre de uma Unidade de Ligando está ligado a um sistema de anel de succinimida de uma Unidade Extensora formado pela reação de um grupo funcional tiol de um ligando de direcionamento com uma parte de maleimida do precursor da Unidade Extensora correspondente. Em outras modalidades, um grupo funcional tiol de uma Unidade de Ligando reage com uma parte alfa haloacetamida para fornecer uma Unidade Extensora ligada a enxofre por deslocamento nucleofílico de seu substituinte halogênio.
[00170] Unidades extensoras representativas dessas modalidades incluem aquelas dentro dos colchetes das Fórmulas Za e Zb (onde a Unidade de Ligando L é mostrada para referência):
[00171] em que a linha ondulada indica a fixação à Unidade Conectora Paralela (LP) ou Unidade Conectora (A) se LPestá ausente, ou um Agente de Particionamento (S*), se LP está ausente, e R17é -C1-C10 alquileno-, C1-C10 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(C1-C8 alquileno)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-C(=O)-, C1-C10 heteroalquileno- C(=O)-, -C3-C8 carbociclo-C(=O)-, -O-(C1-C8 alquileno)-C(=O)- , -arileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-arileno-C(=O)-, - arileno-C1-C10 alquileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-C(=O)-,-(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno- C(=O)-, -C3-C8 heterociclo-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-C(=O)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno- C(=O)-, -C1-C10 alquileno-NH-, C1-C10 heteroalquileno-NH-, - C3-C8 carbociclo-NH-, -O-(C1-C8 alquileno)-NH-, -arileno-NH- , -C1-C10 alquileno-arileno-NH-, -arileno-C1-C10 alquileno-NH- , -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-NH-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-NH-, -C3-C8 heterociclo-NH-, - C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-NH-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-NH-, -C1-C10 alquileno-S-, C1-C10 heteroalquileno-S -, -C3-C8 carbociclo-S -, -O-(C1-C8 alquileno)-S -, -arileno-S-, -C1-C10 alquileno-arileno-S-, - arileno-C1-C10 alquileno-S-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-S-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-S-, -C3-C8 heterociclo-S-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-S- ou -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-S-.
[00172] Em alguns aspectos, o grupo R17 de Fórmula Za é opcionalmente substituído por uma Unidade Básica (BU), como uma parte de aminoalquila, por exemplo, - (CH2) xNH2, - (CH2)xNHRa, e -(CH2)xNRa2, em que x é um número inteiro de 1 a 4 e cada Raé independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-6 alquila e C1-6 haloalquila, ou dois grupos Rasão combinados com o nitrogênio ao qual estão ligados para formar um grupo azetidinila, pirrolidinila ou piperidinila.
[00173] Uma Unidade Extensora ilustrativa é aquela de Fórmula Za ou Zb em que R17é -C1-C10 alquileno-C(=O)-, -C1 C10 heteroalquileno-C(=O)-, -C3-C8 carbociclo-C(=O)-, -O-(C1- C8 alquileno)-C(=O)-, -arileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno- arileno-C(=O)-, -arileno-C1-C10 alquileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-C(=O)-,-(C3-C8 carbociclo)-C1- C10 alquileno-C(=O)-, -C3-C8 heterociclo-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-C(=O)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-C(=O)-.
[00174] Outra Unidade Extensora ilustrativa é aquela de Fórmula Za em que R17 é -C1-C5 alquileno-C(=O)-, em que o alquileno é opcionalmente substituído por uma Unidade Básica (BU) como uma aminoalquila opcionalmente substituída, por exemplo, -(CH2 )xNH2, -(CH2 )xNHRa e -(CH2)xN(Ra)2, em que x é um número inteiro de 1 a 4 e cada Raé independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-6 alquila e C1-6 haloalquila, ou dois grupos Rasão combinados com o nitrogênio ao qual estão fixados para formar um grupo azetidinila, pirrolidinila ou piperidinila. Durante a síntese, o grupo funcional amino básico da Unidade Básica pode ser protegido por um grupo protetor.
[00175] As modalidades exemplificadoras de Unidades Extensoras ligadas a uma Unidade de Ligando são as seguintes: em que a linha ondulada adjacente à carbonila indica ligação a LP, A ou S*, nas fórmulas acima dependendo da presença ou ausência de A e/ou LP.
[00176] Em algumas modalidades preferenciais, uma Unidade Extensora (Z) é composta por uma fração de succinimida, que quando ligada a L é representada pela estrutura de Fórmula Za’: em que a linha ondulada adjacente à carbonila indica ligação a LP, A ou S* nas fórmulas acima dependendo da presença ou ausência de A e/ou LP; R17 é -C1-C5 alquileno-, em que o alquileno é substituído por uma Unidade Básica (BU), em que BU é -(CH2)xNH2, -(CH2 )xNHRa, ou -(CH2 ) xN(Ra) 2, em que x é um número inteiro de 1 a 4 e cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-6 alquila e C1-6 haloalquila, ou ambos Ra juntamente com o nitrogênio ao qual estão fixados definem um grupo azetidinila, pirrolidinila ou piperidinila.
[00177] Será entendido que uma succinimida substituída por Unidade de Ligando pode existir na forma (ou formas) hidrolisada. Essas formas são exemplificadas abaixo para hidrólise de Za’ ligado a L, em que as estruturas que representam os regioisômeros dessa hidrólise são as Fórmulas Zb’ e Zc’. Consequentemente, em outras modalidades preferenciais, uma Unidade Extensora (Z) é composta por uma parte de ácido-amida que, quando ligada a L, é representada pelo disposto a seguir: a linha ondulada adjacente à carbonila ligada a R17é como definido para Za’, dependendo da presença ou ausência de A e/ou LP; e R17é -C1-C5 alquileno-, em que o alquileno é substituído por uma Unidade Básica (BU), em que BU é -(CH2 )xNH2, -(CH2 )xNHRa, ou -(CH2 )xN(Ra)2, em que x é um número inteiro de 1 a 4 e cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-6 alquila e C1-6 haloalquila, ou ambos Ra juntamente com o nitrogênio ao qual estão fixados definem um grupo azetidinila, pirrolidinila ou piperidinila.
[00178] Em algumas modalidades, uma Unidade Extensora (Z) é composta por uma parte de ácido-amida que, quando ligada a L, é representada pela estrutura de Fórmula Zd’ ou Ze’: em que a linha ondulada adjacente à carbonila é conforme definido para Za’.
[00179] Em modalidades preferenciais, uma Unidade Extensora (Z) é composta por uma fração de succinimida, que quando ligada a L é representada pela estrutura de que é gerado a partir de um análogo maleimido-amino- (um derivado do ácido 3-amino-2- (2,5- dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)propanoico), ou é composto por uma parte de ácido-amida que, quando ligada a L, é representada pela estrutura de: .
[00180] Unidades Extensoras ilustrativas ligadas a uma Unidade de Ligando (L) e uma Unidade Conectora (A) têm as seguintes estruturas, que são compostas pela estrutura de Zb’ ou Zc’, em que -R17- ou -R17 (BU)- é -CH2-, — CH2CH2- ou -CH(CH2NH2)-: em que a linha ondulada adjacente à carbonila é conforme definido para Za’.
[00181] Em um grupo de modalidades, Z-A- compreende um componente de ácido maleimido-alcanoico ou um componente mDPR. Consulte, por exemplo, o documento WO 2013/173337. Em um grupo de modalidades, Z-A- é um componente maleimidopropionila.
[00182] Outras Unidades Extensoras ligadas a uma Unidade de Ligando (L) e uma Unidade Conectora (A) têm as estruturas acima, em que A nas estruturas Z-A acima é substituído por uma Unidade Conectora paralela com a estrutura de em que n encontra-se de 8 a 24; RPEGé um grupo de capeamento de Unidade PEG, de preferência-CH3 ou -CH2CH2CO2H, o asterisco (*) indica ligação covalente a uma Unidade Extensora que corresponde em estrutura à Fórmula Za, Za’, Zb’ ou Zc’ e a linha ondulada indica ligação covalente ao Ligante Liberável (RL).
[00183] As Unidades Extensoras ilustrativas antes da conjugação com a Unidade de Ligando (isto é, precursores da Unidade Extensora) são compostas por uma parte de maleimida e são representadas por estruturas, incluindo aquela de Fórmula Z’a: ' 17 11<> em que a linha ondulada adjacente à carbonila é como definida para Za’; e R17é -(CH2)i-5-, opcionalmente substituído por uma Unidade Básica como uma aminoalquila opcionalmente substituída, por exemplo, -(CH2 )xNH2, -(CH2 )xNHRa, e -(CH2 )xN(Ra) 2, em que x é um número inteiro de 1 a 4 e cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-6 alquila e C1-6 haloalquila, ou dois grupos Rasão combinados com o nitrogênio ao qual estão fixados para formar um grupo azetidinila, pirrolidinila ou piperidinila.
[00184] Em algumas modalidades preferenciais de Fórmula Z’a, um precursor da Unidade Extensora (Z’) é representado por uma das seguintes estruturas: em que a linha ondulada adjacente à carbonila é conforme definido para Za’.
[00185] Em outras modalidades preferenciais, um precursor de Unidade Extensora (Z’) é composto de uma parte de maleimida e é representado pela estrutura de Fórmula Za’:
[00186] em que a linha ondulada adjacente à carbonila ligada a R17 é como definido para Za’; e R17 é -C1-C5 alquileno- , em que o alquileno é substituído por uma Unidade Básica (BU), em que BU é -(CH2 )xNH2, -(CH2 )xNHRa, ou -(CH2 )xN(Ra)2, em que x é um número inteiro de 1 a 4 e cada Ra é independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-6 alquila e C1-6 haloalquila, ou ambos Ra juntamente com o nitrogênio ao qual estão fixados definem um grupo azetidinila, pirrolidinila ou piperidinila.
[00187] Em modalidades mais preferenciais, o precursor da Unidade Extensora (Z’) é composto por uma parte de maleimida e é representado pela estrutura de: em que a linha ondulada adjacente à carbonila é conforme definido para Za’.
[00188] Em Unidades Extensoras com uma parte de BU, será entendido que o grupo funcional amino dessa parte pode ser protegido por um grupo de proteção de amino durante a síntese, por exemplo, um grupo de proteção lábil em ácido (por exemplo, BOC).
[00189] Os precursores da Unidade Extensora ilustrativos covalentemente fixados a uma Unidade Conectora que são constituídas pela estrutura de Za ou Za’, em que - R17- ou -R17(BU)- é -CH2-, -CH2CH2- ou —CH(CH2NH2)- têm as seguintes estruturas: em que a linha ondulada adjacente à carbonila é conforme definido para Za’.
[00190] Outros precursores da Unidade Extensora ligados a uma Unidade Conectora (A) têm as estruturas acima, em que A nas estruturas Z’-A acima é substituído por uma Unidade Conectora Paralela e Agente de Particionamento (- LP(S*)-) tendo a estrutura de em que n varia de 8 a 24; RPEGé um grupo de cobertura da Unidade PEG, de preferência -CH3 ou -CH2CH2CO2H, o asterisco (*) indica ligação covalente ao precursor da Unidade Extensora correspondente em estrutura à Fórmula Za ou Za’ e a linha ondulada indica ligação covalente a RL. Em casos como os mostrados aqui, o grupo PEG mostrado pretende ser um exemplo de uma variedade de Agentes de Particionamento, incluindo grupos de PEG de comprimentos diferentes e outros Agentes de Particionamento que podem ser diretamente fixados ou modificados para fixação à Unidade Conectora Paralela.
[00191] Em outra modalidade, a Unidade Extensora está ligada à unidade de ligando por meio de uma ligação dissulfeto entre um átomo de enxofre da Unidade de Ligando e um átomo de enxofre da Unidade Extensora. Uma Unidade Extensora representativa dessa modalidade é representada dentro dos colchetes da Fórmula Zb:
[00192] em que a linha ondulada indica fixação à Unidade Conectora Paralela (LP) ou Unidade Conectora (A) se LPestá ausente ou um Agente de Particionamento (S*), se A e LPestão ausentes e R17é -C1-C10 alquileno-, C1-C10 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(C1-C8 alquileno)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-C(=O)-, C1-C10 heteroalquileno- C(=O)-, -C3-C8 carbociclo-C(=O)-, -O-(C1-C8 alquileno)-C(=O)- , -arileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-arileno-C(=O)-, - arileno-C1-C10 alquileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-C(=O)-,-(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno- C(=O)-, -C3-C8 heterociclo-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-C(=O)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno- C(=O)-, -C1-C10 alquileno-NH-, C1-C10 heteroalquileno-NH-, - C3-C8 carbociclo-NH-, -O-(C1-C8 alquileno)-NH-, -arileno-NH- , -C1-C10 alquileno-arileno-NH-, -arileno-C1-C10 alquileno-NH- , -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-NH-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-NH-, -C3-C8 heterociclo-NH-, - C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-NH-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-NH-, -C1-C10 alquileno-S-, C1-C10 heteroalquileno-S -, -C3-C8 carbociclo-S -, -O-(C1-C8 alquileno)-S -, -arileno-S-, -C1-C10 alquileno-arileno-S-, - arileno-C1-C10 alquileno-S-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-S-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-S-, -C3 C8 heterociclo-S-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-S-, ou -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-S-.
[00193] Em ainda outra modalidade, o grupo reativo de um precursor de Unidade Extensora contém um sítio reativo que pode formar uma ligação com um grupo amino primário ou secundário de uma Unidade de Ligando. Exemplos desses locais reativos incluem, sem limitação, ésteres ativados, como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenil, ésteres de pentafluorofenil, ésteres de tetrafluorofenil, anidridos, cloretos de ácido, cloretos de sulfonil, isocianatos e isotiocianatos. As Unidades Extensoras representativas dessa modalidade são representadas dentro dos colchetes das Fórmulas Zci, Zcii e Zciii:
[00194] em que a linha ondulada indica fixação à Unidade Conectora Paralela (LP) ou Unidade Conectora (A) se LPestá ausente ou um Agente de Particionamento (S*), se A e LPestão ausentes e R17é -C1-C10 alquileno-, C1-C10 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(C1-C8 alquileno)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-C(=O)-, C1-C10 heteroalquileno- C(=O)-, -C3-C8 carbociclo-C(=O)-, -O-(C1-C8 alquileno)-C(=O)- , -arileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-arileno-C(=O)-, - arileno-C1-C10 alquileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-C(=O)-,-(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno- C(=O)-, -C3-C8 heterociclo-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-C(=O)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno- C(=O)-, -C1-C10 alquileno-NH-, C1-C10 heteroalquileno-NH-, - C3-C8 carbociclo-NH-, -O-(C1-C8 alquileno)-NH-, -arileno-NH- , -C1-C10 alquileno-arileno-NH-, -arileno-C1-C10 alquileno-NH- , -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-NH-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-NH-, -C3-C8 heterociclo-NH-, - C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-NH-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-NH-, -C1-C10 alquileno-S-, C1-C10 heteroalquileno-S -, -C3-C8 carbociclo-S -, -O-(C1-C8 alquileno)-S -, -arileno-S-, -C1-C10 alquileno-arileno-S-, - arileno-C1-C10 alquileno-S-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-S-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-S-, -C3- C8 heterociclo-S-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-S-, ou -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-S-.
[00195] Em ainda outro aspecto, o grupo reativo do precursor da Unidade Extensora contém um nucleófilo reativo que tem a capacidade de reagir com um eletrófilo presente em, ou introduzido em, uma Unidade de Ligando. Por exemplo, uma parte de carboidrato em um ligando de direcionamento pode ser levemente oxidada com o uso de um reagente como o periodato de sódio e o grupo funcional eletrofílico resultante (-CHO) do carboidrato oxidado pode ser condensado com um precursor da Unidade Extensora que contém um nucleófilo reativo, como uma hidrazida, uma oxima, uma amina primária ou secundária, uma hidrazina, uma tiosemicarbazona, um carboxilato de hidrazina ou uma arilhidrazida, como aqueles descritos por Kaneko, T. et al. (1991) Bioconjugate Chem. 2:133-41. As Unidades Extensoras representativas dessa modalidade são representadas dentro dos colchetes das Fórmulas Zdi, Zdii e Zdiii:
[00196] em que a linha ondulada indica fixação à Unidade Conectora Paralela (LP) ou Unidade Conectora (A) se LP ou um Agente de Particionamento (S*), se A e LPestão ausentes e R17é -C1-C10 alquileno-, C1-C10 heteroalquileno-, -C3-C8 carbociclo-, -O-(C1-C8 alquileno)-, -arileno-, -C1-C10 alquileno-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-, -C3-C8 heterociclo-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, -C1-C10 alquileno-C(=O)-, C1-C10 heteroalquileno-C(=O)-, -C3-C8 carbociclo-C(=O)-, -O-(C1-C8 alquileno)-C(=O)-, -arileno- C(=O)-, -C1-C10 alquileno-arileno-C(=O)-, -arileno-C1-C10 alquileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-C(=O)- ,-(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-C(=O)-, -C3-C8 heterociclo-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 heterociclo)- C(=O)-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-C(=O)-, -C1-C10 alquileno-NH-, C1-C10 heteroalquileno-NH-, -C3-C8 carbociclo- NH-, -O-(C1-C8 alquileno)-NH-, -arileno-NH-, -C1-C10 alquileno-arileno-NH-, -arileno-C1-C10 alquileno-NH-, -C1-C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-NH-, -(C3-C8 carbociclo)-C1-C10 alquileno-NH-, -C3-C8 heterociclo-NH-, -C1-C10 alquileno-(C3- C8 heterociclo)-NH-, -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-NH- , -C1-C10 alquileno-S-, C1-C10 heteroalquileno-S -, -C3-C8 carbociclo-S -, -O-(C1-C8 alquileno)-S -, -arileno-S-, -C1-C10 alquileno-arileno-S-, -arileno-C1-C10 alquileno-S-, -C1 C10 alquileno-(C3-C8 carbociclo)-S-, -(C3-C8 carbociclo)-C1- C10 alquileno-S-, -C3-C8 heterociclo-S-, -C1-C10 alquileno-(C3- C8 heterociclo)-S-, ou -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno- S-.
[00197] Em alguns aspectos da presente invenção, a Unidade Extensora tem uma massa de não mais do que cerca de 1.000 daltons, não mais do que cerca de 500 daltons, não mais do que cerca de 200 daltons, de cerca de 30, 50 ou 100 daltons a cerca de 1.000 daltons, de cerca de 30, 50 ou 100 daltons a cerca de 500 daltons, ou de cerca de 30, 50 ou 100 daltons a cerca de 200 daltons.
Unidade Conectora (A)
[00198] Uma Unidade Conectora (A) serve para ligar a Unidade Extensora (Z) ao Agente de Particionamento (S*) ou Combinação de Unidade Conectora Paralela/Agente de Particionamento (-LP(S*)-). Em algumas modalidades, a Unidade Conectora (A) é uma ligação que liga diretamente os componentes. Em algumas modalidades, uma Unidade Conectora (A) é incluída em um Conjugado de Camptotecina ou Composto Ligante de Camptotecina para adicionar distância adicional entre a Unidade Extensora (Z) ou precursor da mesma (Z’) e o Ligante Liberável de Peptídeo (RL). Em alguns aspectos, a distância extra ajudará na ativação dentro do RL. Consequentemente, a Unidade Conectora (A), quando presente, estende a estrutura da Unidade de Ligante. Nesse aspecto, uma Unidade Conectora (A) é covalentemente ligada à Unidade Extensora (ou precursor da mesma) em um terminal e é ligada covalentemente à Unidade Conectora Paralela (LP) opcional ou ao Agente de Particionamento (S*) em seu outro terminal.
[00199] O especialista no assunto da técnica apreciará que a Unidade Conectora pode ser qualquer grupo que sirva para fornecer a fixação do Agente de Particionamento/parte do Ligante Liberável de Peptídeo (-S*- RL-) ou da Unidade Conectora Paralela/Agente de Particionamento/Parte do Ligante Liberável do Peptídeo (- LP(S*)-RL-) para o restante da Unidade de Ligante (Q). A Unidade Conectora pode ser, por exemplo, composta por um ou mais (por exemplo, 1 a 10, de preferência, 1, 2, 3 ou 4) aminoácidos naturais ou não naturais, amino álcool, amino aldeído, resíduos diamino. Em alguns aspectos, a Unidade Conectora é um único aminoácido natural ou não natural, aminoálcool, amino aldeído ou resíduo diamino. Um exemplo de aminoácido com capacidade de atuar como Unidades Conectoras é β-alanina.
[00200] Em alguns aspectos, a Unidade Conectora tem a fórmula denotada abaixo:
[00201] em que as linhas onduladas indicam a fixação da Unidade Conectora dentro do Conjugado de camptotecina ou Composto de Ligante de Camptotecina; e em que R111é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, p-hidroxibenzila, metila, isopropila, isobutila, sec-butila, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, - CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, - (CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, - (CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, - (CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3- piridilmetil-, 4-piridilmetil-,
[00202] e cada R100é independentemente selecionado dentre hidrogênio ou -C1-C3 alquila, de preferência hidrogênio ou CH3; e o subscrito c é um número inteiro independentemente selecionado de 1 a 10, de preferência 1 a 3.
[00203] Uma Unidade Conectora representativa com um grupo carbonila para fixação ao Agente de Particionamento (S*) ou ao -LP(S*)- é a seguinte:
[00204] em que, em cada caso, R13 é independentemente selecionado do grupo que consiste em -C1-C6 alquileno-, -C3- C8carbociclo-, -arileno-, -C1-C10 heteroalquileno-, -C3- C8heterociclo-, -C1-C10alquileno-arileno-, -arileno-C1- C10alquileno-, -C1-C10alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3- C8carbociclo)-C1-C10alquileno-, -C1-C10alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, e -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, e o subscrito c é um número inteiro na faixa de 1 a 4. Em algumas modalidades, R13 é -C1-C6 alquileno e c é 1.
[00205] Uma outra Unidade Conectora representativa com um grupo carbonila para fixação ao Agente de Particionamento (S*) ou ao -LP(S*)- é a seguinte:
[00206] em que R13 é -C1-C6 alquileno-, -C3- C8carbociclo-, -arileno-, -C1-C10 heteroalquileno-, -C3- C8heterociclo-, -C1-C10alquileno-arileno-, -arileno-C1- C10alquileno-, -C1-C10alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3- C8carbociclo)-C1-C10alquileno-, -C1-C10alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, ou -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-. Em algumas modalidades R13 é -C1-C6 alquileno.
[00207] Uma Unidade Conectora representativa com uma parte de NH que se liga ao Agente de Particionamento (S*) ou ao -LP(S*)- é a seguinte:
[00208] em que, em cada caso, R13 é independentemente selecionado do grupo que consiste em -C1-C6 alquileno-, -C3- C8carbociclo-, -arileno-, -C1-C10 heteroalquileno-, -C3- C8heterociclo-, -C1-C10alquileno-arileno-, -arileno-C1- C10alquileno-, -C1-C10alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3- C8carbociclo)-C1-C10alquileno-, -C1-C10alquileno-(C3-C8 heterociclo)-, e -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, e o subscrito c é de 1 a 14. Em algumas modalidades R13 é -C1-C6 alquileno e o subscrito c é 1.
[00209] Uma outra Unidade Conectora representativa com uma parte de NH que se liga ao Agente de Particionamento (S*) ou ao -LP(S*)- é a seguinte:
[00210] em que R13 é -C1-C6 alquileno-, -C3- C8carbociclo-, -arileno-, -C1-C10 heteroalquileno-, -C3- C8heterociclo-, -C1-C10alquileno-arileno-, -arileno-C1- C10alquileno-, -C1-C10alquileno-(C3-C8carbociclo)-, -(C3- C8carbociclo)-C1-C10alquileno-, -C1-C10alquileno-(C3-C8 heterociclo)-,
[00211] -(C3-C8 heterociclo)-C1-C10 alquileno-, - C(=O)C1-C6 alquileno- ou -C1-C6 alquileno-C(=O)-C1-C6 alquileno.
[00212] As modalidades selecionadas de Unidades Conectoras incluem aquelas que têm a seguinte estrutura
[00213] em que a linha ondulada adjacente ao nitrogênio indica ligação covalente a uma Unidade Extensora (Z) (ou seu precursor Z’), e a linha ondulada adjacente à carbonila indica ligação covalente ao Agente de Particionamento (S*) ou a -LP(S*)-; e m é um número inteiro que varia de 1 a 6, de preferência 2 a 6, mais preferencialmente 2 a 4.
Ligante Liberável de Peptídeo (RL):
[00214] Em algumas modalidades, o Ligante Liberável de Peptídeo (RL) compreenderá duas ou mais sequências contíguas ou não contíguas de aminoácidos (por exemplo, de modo que RL tenha de 2 a não mais de 12 aminoácidos). O Ligante Liberável de Peptídeo pode compreender ou consistir em, por exemplo, uma unidade dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo, undecapeptídeo ou dodecapeptídeo. Em alguns aspectos, na presença de uma enzima (por exemplo, uma protease associada a tumor), uma ligação amida entre os aminoácidos é clivada, o que em última análise leva à liberação de fármaco livre.
[00215] Cada aminoácido pode ser natural ou não natural e/ou um isômero D ou L, desde que RL compreenda uma ligação clivável que, quando clivada, inicia a liberação da Camptotecina. Em algumas modalidades, o Ligante Liberável de Peptídeo compreenderá apenas aminoácidos naturais. Em alguns aspectos, o Ligante Liberável de Peptídeo terá de 2 a não mais de 12 aminoácidos em sequência contígua.
[00216] Em algumas modalidades, cada aminoácido é independentemente selecionado do grupo que consiste em alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutâmico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, prolina, triptofano, valina, cisteína, metionina, selenocisteína, ornitina, penicilamina, β-alanina, ácido aminoalcanoico, ácido aminoalquinoico, ácido aminoalcanodioico, ácido aminobenzoico, ácido amino-heterociclo-alcanoico, ácido heterociclo-carboxílico, citrulina, estatina, ácido diaminoalcanoico e derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, cada aminoácido é independentemente selecionado do grupo que consiste em alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutâmico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, prolina, triptofano, valina, cisteína, metionina e selenocisteína. Em algumas modalidades, cada aminoácido é independentemente selecionado do grupo que consiste em alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutâmico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, prolina, triptofano e valina. Em algumas modalidades, cada aminoácido é selecionado dos aminoácidos proteinogênicos ou não proteinogênicos.
[00217] Em outra modalidade, cada aminoácido é independentemente selecionado do grupo que consiste nos seguintes L-aminoácidos (naturais): alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutâmico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, triptofano e valina.
[00218] Em outra modalidade, cada aminoácido é independentemente selecionado do grupo que consiste nos seguintes D-isômeros desses aminoácidos naturais: alanina, arginina, ácido aspártico, asparagina, histidina, glicina, ácido glutâmico, glutamina, fenilalanina, lisina, leucina, serina, tirosina, treonina, isoleucina, triptofano e valina.
[00219] Em algumas modalidades, o Ligante Liberável de Peptídeo compreenderá apenas aminoácidos naturais. Em outras modalidades, o Ligante Liberável de Peptídeo compreenderá apenas aminoácidos não naturais. Em algumas modalidades, o Ligante Liberável de Peptídeo é composto por um aminoácido natural ligado a um aminoácido não natural. Em algumas modalidades, o Ligante Liberável de Peptídeo é composto por um aminoácido natural ligado a um D-isômero de um aminoácido natural.
[00220] Em outra modalidade, cada aminoácido é independentemente selecionado do grupo que consiste em β- alanina, N-metilglicina, glicina, lisina, valina e fenilalanina.
[00221] Ligantes liberáveis de peptídeo exemplificadores incluem dipeptídeos ou tripeptídeos com- Val-Lys-Gly-, -Val-Cit-, -Phe-Lys- ou -Val-Ala-.
[00222] Ligantes liberáveis de peptídeos úteis podem ser aproveitados e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada a um tumor. Em algumas modalidades, a clivagem de uma ligação é catalisada por catepsina B, C ou D ou uma protease de plasmina.
[00223] Em algumas modalidades, o Ligante Liberável de Peptídeo (RL) será representado por -(-AA-) 2-12-, ou (- AA-AA-)1-6, em que AA é, em cada ocorrência independentemente, selecionado de aminoácidos naturais ou não naturais. Em um aspecto, AA é em cada ocorrência independentemente selecionado de aminoácidos naturais. Em outro aspecto, RL é um tripeptídeo com a Fórmula: AA1-AA2-AA3, em que AA1, AA2 e AA3 são, cada um, independentemente, um aminoácido e em que AA1 se fixa a -NH- e AA3 se fixa a S*. Em ainda outro aspecto, AA3 é gly ou β-ala.
[00224] Em algumas modalidades, o Ligante Liberável de Peptídeo tem a fórmula denotada abaixo entre colchetes, o subscrito w é um número inteiro que varia de 2 a 12, ou w é 2, 3 ou 4, ou w é 3: em que R19 é, em cada caso, independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, metila, isopropila, isobutila, sec-butila, benzila, p-hidroxibenzila, -CH2OH, - CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, - CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, - (CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, - (CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, - CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4- piridilmetil-, fenila, ciclohexila,
[00225] Em alguns aspectos, cada R19é independentemente hidrogênio, metila, isopropila, isobutila, sec-butila, -(CH2)3NH2 ou -(CH2)4NH2. Em alguns aspectos, cada R19é independentemente hidrogênio, isopropila, ou -(CH2)4NH2.
[00226] Ligantes Liberáveis de Peptídeo Ilustrativos são representados pelas Fórmulas (Pa), (Pb) e (Pc)
[00227] em que R20 e R21 são da seguinte maneira:
[00228] em que R20, R21 e R22 são da seguinte maneira:em que R20, R21, R22 e R23 são da seguinte maneira: ; em que R20, R21, R22 e R23são da seguinte maneira: R20 R21 R22 R23 H benzila isobutila H; e metila isobutila metila isobutila.
[00229] Em algumas modalidades, RL compreende um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly, gly- gly-gly, gly-gly-gly-gly, val-gly-gly, val-cit-gly, val-gln- gly, val-glu-gly, phe-lys-gly, leu-lys-gly, gly-val-lys-gly, val-lys-gly-gly, val-lys-gly, val-lys-ala, val-lys-leu, leu- leu-gly, gly-gly-phe-gly, gly-gly-phe-gly-gly, val-gly e val-lys-β-ala.
[00230] Em outras modalidades, RL compreende um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly-gly, gly-gly-gly-gly, val-gly-gly, val-cit-gly, val-gln-gly, val- glu-gly, phe-lys-gly, leu-lys-gly, gly-val-lys-gly, val-lys- gly-gly, val-lys-gly, val-lys-ala, val-lys-leu, leu-leu-gly, gly-gly-phe-gly e val-lys-β-ala.
[00231] Ainda em outras modalidades, RL compreende um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly-gly, val-gly-gly, val-cit-gly, val-gln-gly, val-glu-gly, phe-lys- gly, leu-lys-gly, val-lys-gly, val-lys-ala, val-lys-leu, leu-leu-gly e val-lys-β-ala.
[00232] Ainda em outras modalidades, RL compreende um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly-gly- gly, gly-val-lys-gly, val-lys-gly-gly e gly-gly-phe-gly.
[00233] Em outras modalidades, RL é um peptídeo selecionado do grupo que consiste em val-gln-gly, val-glu- gly, phe-lys-gly, leu-lys-gly, val-lys-gly, val-lys-ala, val-lys-leu, leu-leu-gly e val-lys-β-ala.
[00234] Ainda em outras modalidades, RL é val-lys- gly.
[00235] Ainda em outras modalidades, RL é val-lys-β- ala.
Agente de Particionamento (S*):
[00236] Os Conjugados de Camptotecina aqui descritos também podem incluir um Agente de Particionamento (S*). As porções do Agente de Particionamento são úteis, por exemplo, para mascarar a hidrofobicidade de Camptotecinas particulares ou outros componentes da Unidade de Ligação.
[00237] Agentes de Particionamento representativos incluem unidades de polietileno glicol (PEG), unidades de ciclodextrina, poliamidas, peptídeos hidrofílicos, polissacarídeos e dendrímeros.
[00238] Quando as unidades de polietileno glicol (PEG), unidades de ciclodextrina, poliamidas, peptídeos hidrofílicos, polissacarídeos ou dendrímeros estão incluídos em Q, os grupos podem estar presentes como um componente “em linha” ou como uma cadeia lateral ou componente ramificado. Para aquelas modalidades em que uma versão ramificada está presente, as Unidades de Ligante incluirão tipicamente um resíduo de lisina (ou Unidade Conectora Paralela, LP) que fornece conjugação funcional simples, por exemplo, da Unidade PEG, ao restante da Unidade de Ligação.
Unidade de Polietileno Glicol (PEG)
[00239] PEGs polidispersos, PEGs monodispersos e PEGs discretos podem ser usados como parte dos Agentes de Particionamento nos Compostos da presente invenção. PEGs polidispersos são uma mistura heterogênea de tamanhos e pesos moleculares, enquanto os PEGs monodispersos são tipicamente purificados a partir de misturas heterogêneas e, portanto, fornecem um comprimento de cadeia única e peso molecular. PEGs preferenciais compreendem PEGs discretos, compostos que são sintetizados por etapas e não por meio de um processo de polimerização. PEGs discretos fornecem uma única molécula com comprimento de cadeia definido e especificado.
[00240] Os PEGs fornecidos aqui compreendem uma ou múltiplas cadeias de polietileno glicol. Uma cadeia de polietileno glicol é composta de pelo menos duas subunidades de óxido de etileno (CH2CH2O). As cadeias de polietilenoglicol podem ser ligadas entre si, por exemplo, em uma configuração linear, ramificada ou em forma de estrela. Tipicamente, pelo menos uma das cadeias de PEG é derivatizada em uma extremidade para ligação covalente a um sítio apropriado em um componente da Unidade de Ligante (por exemplo, LP) ou pode ser usada como um grupo de ligação em linha (por exemplo, bifuncional) no interior para unir covalentemente dois dos componentes da Unidade de Ligante (por exemplo, ZAS*-RL-, ZAS*-RL-Y-). Fixações exemplificadoras na Unidade de Ligante são por meio de ligações cliváveis não condicionalmente ou via ligações cliváveis condicionalmente. Ligações exemplificadoras são via ligação amida, ligações éter, ligações éster, ligações hidrazona, ligações oxima, ligações dissulfeto, ligações peptídicas ou ligações triazol. Em alguns aspectos, o anexo dentro da Unidade de Ligante é por meio de uma ligação clivável não condicionalmente. Em alguns aspectos, a ligação na Unidade de Ligante não é através de uma ligação éster, ligação hidrazona, ligação oxima ou ligação dissulfeto. Em alguns aspectos, a fixação na Unidade de Ligante não é via uma ligação de hidrazona.
[00241] Uma ligação condicionalmente clivável se refere a uma ligação que não é substancialmente sensível à clivagem enquanto circula no plasma, mas é sensível à clivagem em um ambiente intracelular ou intratumoral. Uma ligação clivável não condicionalmente é aquela que não é substancialmente sensível à clivagem em qualquer ambiente biológico. A hidrólise química de uma hidrazona, a redução de um dissulfeto e a clivagem enzimática de uma ligação peptídica ou ligação glicosídica são exemplos de ligações cliváveis condicionalmente.
[00242] Em algumas modalidades, a Unidade PEG será diretamente ligada a uma Unidade Conectora Paralela B. O outro terminal (ou terminais) da Unidade PEG pode ser livre e não conectado e pode assumir a forma de um metoxi, ácido carboxílico, álcool ou outro grupo funcional adequado. O metoxi, ácido carboxílico, álcool ou outro grupo funcional adequado atua como um limite para a subunidade PEG terminal da Unidade PEG. Por desconectado, entende-se que a Unidade de PEG não será ligada nesse sítio desconectado a uma Camptotecina, a um anticorpo ou a outro componente de ligação. O especialista no assunto da técnica entenderá que a Unidade de PEG, além de compreender subunidades de etileno glicol repetidas, também pode conter material não-PEG (por exemplo, para facilitar o acoplamento de múltiplas cadeias de PEG entre si). O material não-PEG se refere aos átomos na Unidade de PEG que não fazem parte das subunidades repetidas -CH2CH2O-. Em algumas modalidades aqui fornecidas, a Unidade de PEG compreende duas cadeias de PEG monoméricas ligadas entre si por meio de elementos não PEG. Em outras modalidades aqui fornecidas, a Unidade de PEG compreende duas cadeias de PEG lineares ligadas a um núcleo central ou Unidade Conectora Paralela (isto é, a própria Unidade de PEG é ramificada).
[00243] Há uma série de métodos de fixação de PEG disponíveis para aqueles especialistas no assunto da técnica, [consulte, por exemplo, Goodson, et al. (1990) Bio/Technology 8:343 (PEGylation of interleukin-2 at its glycosylation site after site-directed mutagenesis); EP 0 401 384 (coupling PEG to G-CSF); Malik, et al., (1992) Exp. Hematol. 20:1.028 a 1.035 (PEGylation of GM-CSF using tresyl cloride); ACT Pub. no WO 90/12874 (PEGylation of erythropoietin containing a recombinantly introduced cysteine residue using a cysteine-specific mPEG derivative); Pat. no U.S. 5.757.078 (PEGylation of EPO peptides); Pat. no U.S. 5.672.662 (Poly(ethylene glycol) e polímeros relacionados monossubstituídos por ácidos propiônico ou butanoico e derivados funcionais dos mesmos para aplicações biotécnicas); Pat. no U.S. 6.077.939 (PEGylation of an N- terminal .alpha.-carbon of a peptide); Veronese et al., (1985) Appl. Biochem. Bioechnol 11:141 a 142 (PEGylation of an N-terminal α-carbon of a peptide with PEG- nitrofenilcarbonate (“PEG-NPC”) or PEG- triclorofenilcarbonate); e Veronese (2001) Biomaterials 22:405 a 417 (Review article on peptide and protein PEGylation)].
[00244] Por exemplo, o PEG pode ser ligado covalentemente a resíduos de aminoácidos por meio de um grupo reativo. Os grupos reativos são aqueles aos quais uma molécula de PEG ativada pode ser ligada (por exemplo, um amino livre ou grupo carboxila). Por exemplo, resíduos de aminoácidos N-terminais e resíduos de lisina (K) têm um grupo amino livre; e os resíduos de aminoácidos do terminal C têm um grupo carboxila livre. Grupos tiol (por exemplo, como encontrados em resíduos de cisteína) também são úteis como um grupo reativo para anexar PEG. Além disso, foram descritos métodos assistidos por enzima para a introdução de grupos ativados (por exemplo, hidrazida, aldeído e grupos amino aromáticos) especificamente no terminal C de um polipeptídeo (consulte Schwarz, et al. (1990) Methods Enzymol. 184:160; Rose, et al. (1991) Bioconjugate Chem. 2:154; e Gaertner, et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:7224].
[00245] Em algumas modalidades, as moléculas de PEG podem ser ligadas a grupos amino com o uso de PEG metoxilado (“mPEG”) com diferentes frações reativas. Exemplos não limitativos de tais frações reativas incluem succinimidil succinato (SS), succinimidil carbonato (SC), mPEG-imidato, para-nitrofenilcarbonato (NPC), succinimidil propionato (SPA) e cloreto cianúrico. Exemplos não limitativos de tais mPEGs incluem succinato de mPEG-succinimidil (mPEG-SS), succinato de mPEG2-succinimidil (mPEG2-SS); mPEG- succinimidil carbonato (mPEG-SC), mPEG2-succinimidil carbonato (mPEG2-SC); mPEG-imidato, mPEG-para- nitrofenilcarbonato (mPEG-NPC), mPEG-imidato; mPEG2-para- nitrofenilcarbonato (mPEG2-NPC); mPEG-succinimidil propionato (mPEG-SPA); mPEG2-succinimidil propionato (mPEG, --SPA); mPEG-N-hidroxi-succinimida (mPEG-NHS); mPEG2-N- hidroxi-succinimida (mPEG2 - NHS); cloreto mPEG-cianúrico; cloreto mPEG2-cianúrico; mPEG2-Lysinol-NPC e mPEG2-Lys-NHS.
[00246] Geralmente, pelo menos uma das cadeias de PEG que constituem a Unidade de PEG é funcionalizada de modo que tenha a capacidade de ligação covalente a outros componentes da Unidade de Ligante.
[00247] A funcionalização inclui, por exemplo, por meio de uma amina, tiol, éster NHS, maleimida, alcino, azida, carbonila ou outro grupo funcional. Em algumas modalidades, a Unidade de PEG compreende ainda material não PEG (isto é, material não compreendido por -CH2CH2O-) que fornece acoplamento a outros componentes da Unidade de Ligante ou para facilitar o acoplamento de duas ou mais cadeias de PEG.
[00248] A presença da unidade de PEG (ou outro agente de particionamento) na Unidade de Ligante pode ter dois impactos potenciais sobre a farmacocinética do Conjugado de Camptotecina resultante. O impacto desejado é uma diminuição na depuração (e consequente aumento na exposição) que surge da redução nas interações não específicas induzidas pelos elementos hidrofóbicos expostos do Conjugado de Camptotecina ou da própria Camptotecina. O segundo impacto é indesejável e é uma diminuição no volume e na taxa de distribuição que às vezes surge do aumento no peso molecular do Conjugado de Camptotecina. O aumento do número de subunidades de PEG aumenta o raio hidrodinâmico de um conjugado, normalmente resultando em diminuição da difusividade. Por sua vez, a difusividade diminuída normalmente diminui a capacidade de o conjugado de camptotecina penetrar em um tumor (Schmidt e Wittrup, Mol Cancer Ther 2009; 8:2.861 a 2.871). Por causa desses dois efeitos farmacocinéticos concorrentes, é desejável usar um PEG que seja suficientemente grande para diminuir a depuração do Conjugado de Camptotecina, aumentando assim a exposição do plasma, mas não tão grande a ponto de diminuir muito sua difusividade, a ponto de interferir com a capacidade do Conjugado de Camptotecina para atingir a população de células alvo pretendida. Consulte os exemplos (por exemplo, exemplos 1, 18 e 21 do documento US2016/0310612), que está aqui incorporado a título de referência, para metodologia para selecionar um tamanho de PEG ideal para um fármaco-ligante particular.
[00249] Em um grupo de modalidades, a Unidade de PEG compreende uma ou mais cadeias de PEG lineares, em que cada uma tem pelo menos 2 subunidades, pelo menos 3 subunidades, pelo menos 4 subunidades, pelo menos 5 subunidades, pelo menos 6 subunidades , pelo menos 7 subunidades, pelo menos 8 subunidades, pelo menos 9 subunidades, pelo menos 10 subunidades, pelo menos 11 subunidades, pelo menos 12 subunidades, pelo menos 13 subunidades, pelo menos 14 subunidades, pelo menos 15 subunidades, pelo menos 16 subunidades, pelo menos 17 subunidades, pelo menos 18 subunidades, pelo menos 19 subunidades, pelo menos 20 subunidades, pelo menos 21 subunidades, pelo menos 22 subunidades, pelo menos 23 subunidades ou pelo menos 24 subunidades. Em modalidades preferenciais, a Unidade de PEG compreende um total combinado de pelo menos 4 subunidades, pelo menos 6 subunidades, pelo menos 8 subunidades, pelo menos 10 subunidades ou pelo menos 12 subunidades. Em algumas de tais modalidades, a Unidade de PEG compreende não mais do que um total combinado de cerca de 72 subunidades, de preferência não mais do que um total combinado de cerca de 36 subunidades.
[00250] Em outro grupo de modalidades, a Unidade de PEG compreende um total combinado de 4 a 72, 4 a 60, 4 a 48, 4 a 36 ou 4 a 24 subunidades, de 5 a 72, 5 a 60, 5 a 48, 5 a 36 ou 5 a 24 subunidades, de 6 a 72, 6 a 60, 6 a 48, 6 a 36 ou de 6 a 24 subunidades, de 7 a 72, 7 a 60, 7 a 48, 7 a 36 ou 7 a 24 subunidades, de 8 a 72, 8 a 60, 8 a 48, 8 a 36 ou 8 a 24 subunidades, de 9 a 72, 9 a 60, 9 a 48, 9 a 36 ou 9 a 24 subunidades, de 10 a 72, 10 a 60, 10 a 48, 10 a 36 ou 10 a 24 subunidades, de 11 a 72, 11 a 60, 11 a 48, 11 a 36 ou 11 a 24 subunidades, de 12 a 72, 12 a 60, 12 a 48, 12 a 36 ou 12 a 24 subunidades, de 13 a 72, 13 a 60, 13 a 48, 13 a 36 ou 13 a 24 subunidades, de 14 a 72, 14 a 60, 14 a 48, 14 a 36 ou 14 a 24 subunidades, de 15 a 72, 15 a 60, 15 a 48, 15 a 36 ou 15 a 24 subunidades, de 16 a 72, 16 a 60, 16 a 48, 16 a 36 ou 16 a 24 subunidades , de 17 a 72, 17 a 60, 17 a 48, 17 a 36 ou 17 a 24 subunidades, de 18 a 72, 18 a 60, 18 a 48, 18 a 36 ou 18 a 24 subunidades, de 19 a 72, 19 a 60, 19 a 48, 19 a 36 ou 19 a 24 subunidades, de 20 a 72, 20 a 60, 20 a 48, 20 a 36 ou 20 a 24 subunidades, de 21 a 72, 21 a 60, 21 a 48, 21 a 36 ou 21 a 24 subunidades, de 22 a 72, 22 a 60, 22 a 48, 22 a 36 ou 22 a 24 subunidades , de 23 a 72, 23 a 60, 23 a 48, 23 a 36 ou 23 a 24 subunidades, ou de 24 a 72, 24 a 60, 24 a 48, 24 a 36 ou 24 subunidades.
[00251] Em algumas modalidades, o Agente de Particionamento S* é uma Unidade de PEG linear que compreende de 2 a 20, ou de 2 a 12, ou de 4 a 12, ou 4, 8 ou 12 subunidades -CH2CH2O-. Em algumas modalidades, a unidade de PEG linear é conectada em uma extremidade da unidade PEG à unidade RL e na outra extremidade da unidade de PEG às Unidades Extensora/Conectora (Z-A-). Em algumas modalidades, a Unidade de PEG é conectada à Unidade RL através de um grupo -CH2CH2C(O)- que forma uma ligação amida com a Unidade RL (por exemplo, -(CH2CH2O)n-CH2CH2C(O)-RL) e à Unidade Extensora/Unidade Conectora (ZA-) através de um grupo -NH- (por exemplo, ZA-NH-(CH2CH2O)n-) que forma uma ligação amida com a porção ZA-.
[00252] Modalidades ilustrativas para Unidades de PEG que estão conectadas às Unidades Extensora/Conectora e RL (Z-A-) são mostradas abaixo:
[00253] e, em uma modalidade particular, a Unidade de PEG é:
[00254] em que a linha ondulada à esquerda indica o sítio de fixação a ZA-, a linha ondulada à direita indica o sítio de fixação a RL e cada b é selecionado independentemente de 2 a 72, 4 a 72, 6 a 72, 8 a 72, 10 a 72, 12 a 72, 2 a 24, 4 a 24, 6 a 24 ou 8 a 24, 2 a 12, 4 a 12, 6 a 12 e 8 a 12. Em algumas modalidades, o subscrito b é 2, 4, 8, 12 ou 24. Em algumas modalidades, o subscrito b é 2. Em algumas modalidades, o subscrito b é 4. Em algumas modalidades, o subscrito b é 8. Em algumas modalidades, o subscrito b é 12.
[00255] Em algumas modalidades, a Unidade de PEG linear que está conectada à Unidade Conectora Paralela em uma extremidade e compreende uma tampa terminal na outra extremidade. Em algumas modalidades, a Unidade de PEG está conectada à Unidade Conectora Paralela por meio de um grupo carbonila que forma uma ligação amida com o grupo amino de resíduo de lisina da Unidade Conectora Paralela (por exemplo, -(OCH2CH2)n-C(O)-LP-) e inclui um Grupo de tampa terminal de Unidade de PEG selecionado do grupo que consiste em C1- 4alquila e C1-4alquil-CO2H. Em algumas modalidades, o Agente de Particionamento S* é uma Unidade de PEG linear que compreende 4, 8 ou 12 subunidades -CH2CH2O- e uma tampa de metil terminal.
[00256] Unidades de PEG lineares ilustrativas que podem ser usadas em qualquer uma das modalidades fornecidas neste documento são as seguintes:
[00257] e, em uma modalidade particular, a Unidade de PEG é:
[00258] em que a linha ondulada indica o sítio de fixação à Unidade Conectora Paralela (LP), e cada n é selecionada independentemente de 4 a 72, 6 a 72, 8 a 72, 10 a 72, 12 a 72, 6 a 24 ou 8 a 24. Em algumas modalidades, o subscrito b é cerca de 4, cerca de 8, cerca de 12 ou cerca de 24.
[00259] Conforme usado neste documento, os termos “PEG2”, “PEG4”, “PEG8” e “PEG12” se referem a modalidades específicas da Unidade de PEG que compreendem o número de subunidades de PEG (ou seja, o número da assinatura “b”). Por exemplo, “PEG2” se refere às modalidades da Unidade de PEG que compreende 2 subunidades de PEG, “PEG4” se refere às modalidades da Unidade de PEG que compreende 4 subunidades de PEG, “PEG8” se refere às modalidades da Unidade de PEG que compreende 8 subunidades de PEG e “EG12” se refere às modalidades da Unidade de PEG que compreende 12 subunidades de PEG. Compostos de camptotecina-forro
[00260] Conforme descrito neste documento, o número de subunidades de PEG é selecionado de modo que melhore a eliminação do Conjugado de Camptotecina resultante, mas não tenha impacto significativo na capacidade de o Conjugado penetrar no tumor. Em modalidades, o número de subunidades de PEG a serem selecionadas para uso terá de preferência de 2 subunidades a cerca de 24 subunidades, de 4 subunidades a cerca de 24 subunidades, mais preferencialmente cerca de 4 subunidades a cerca de 12 subunidades.
[00261] Em modalidades preferenciais da presente revelação, a Unidade de PEG é de cerca de 300 daltons a cerca de 5 quilodaltons; de cerca de 300 daltons, a cerca de 4 quilodaltons; de cerca de 300 daltons, a cerca de 3 quilodaltons; de cerca de 300 daltons, a cerca de 2 quilodaltons; ou de cerca de 300 daltons, a cerca de 1 quilodalton. Em alguns desses aspectos, a Unidade de PEG tem pelo menos 6 subunidades ou pelo menos 8, 10 ou 12 subunidades. Em alguns desses aspectos, a Unidade de PEG tem pelo menos 6 subunidades ou pelo menos 8, 10 ou 12 subunidades, mas não mais do que 72 subunidades, de preferência não mais do que 36 subunidades.
[00262] Será apreciado que, ao se referir a subunidades de PEG, e dependendo do contexto, o número de subunidades pode representar um número médio, por exemplo, quando se refere a uma população de Conjugados de Camptotecina ou Compostos de Camptotecina-Ligante e com o uso de PEGs polidispersos.
Unidade Conectora Paralela (LP):
[00263] Em algumas modalidades, os Conjugados de Camptotecina e Compostos de Camptotecina-Ligante compreenderão uma Unidade Conectora Paralela para fornecer um ponto de ligação a um Agente de Particionamento (mostrado nas Unidades de Ligante como -LP(S*)-). Como uma modalidade geral, a Unidade de PEG pode ser ligada a uma Unidade Conectora Paralela, como lisina, como mostrado abaixo, em que a linha ondulada e os asteriscos indicam ligação covalente dentro da Unidade de Ligante de um Conjugado de Camptotecina ou Composto de Camptotecina-Ligante:
[00264] Em algumas modalidades, a Unidade Conectora Paralela (LP) e o Agente de Particionamento (S*) (juntos, - LP(S*)-) têm a estrutura de em que n encontra-se de 8 a 24; RPEGé um grupo de capeamento de Unidade PEG, de preferência-CH3 ou -CH2CH2CO2H, o asterisco (*) indica ligação covalente a uma Unidade Conectora A que corresponde à Fórmula Za, Za’, Zb’ ou Zc’ e a linha ondulada indica ligação covalente ao Ligante Liberável (RL). Em algumas modalidades, a estrutura é fixada a uma Unidade Conectora A na fórmula Za ou Za’. Em algumas modalidades, n é 2, 4, 8 ou 12. Em casos como os mostrados aqui, o grupo PEG mostrado pretende ser um exemplo de uma variedade de Agentes de Particionamento, incluindo grupos de PEG de comprimentos diferentes e outros Agentes de Particionamento que podem ser diretamente fixados ou modificados para fixação à Unidade Conectora Paralela.
Espaçador (Y):
[00265] Em algumas modalidades, os Conjugados de Camptotecina fornecidos neste documento terão um Espaçador (Y) entre o Ligante Liberável (RL) e a Camptotecina. O Espaçador pode ser um grupo funcional para facilitar a ligação de RL à Camptotecina, ou pode fornecer componentes estruturais adicionais para facilitar ainda mais a liberação da Camptotecina do restante do Conjugado (por exemplo, um componente para-aminobenzil (PAB) autoimolativo)
[00266] Ainda outras Unidades Espaçadoras são representadas pelas Fórmulas:
[00267] em que, em cada caso, EWG representa um grupo de remoção de elétron. Em algumas modalidades, EWG é selecionado do grupo que consiste em -CN, -NO2, -CX3, -X,, C(=O)OR’, -C(=O)N(R’)2, -C(=O)R’, -C(=O)X, -S(=O)2R’, - S(=O)2OR’, -S(=O)2NHR’, -S(=O)2N(R’)2, -P(=O)(OR’)2, - P(=O)(CH3)NHR’, -NO, -N(R’)3+, em que X é -F, -Br, -Cl, ou - I, e R’ é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e C1-6 alquila.
[00268] Ainda em outras modalidades, Unidades Espaçadoras são representadas pelas Fórmulas: SO2Me SO2Me
[00269] Ainda em outras modalidades, Unidades Espaçadoras são representadas pelas Fórmulas:
O Subscrito “p”
[00270] Em um aspecto da invenção, o subscrito p representa o número de partes de Ligante de Fármaco em uma Unidade de Ligando de um Conjugado de Camptotecina individual e é um número inteiro de preferência na faixa de 1 a 16, 1 a 12, 1 a 10 ou 1 a 8. Conjugados de Camptotecina individuais também podem ser referidos como um composto de Conjugado de Camptotecina. Em qualquer uma das modalidades aqui, pode haver 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 partes de Ligante de Fármaco conjugadas a uma Unidade de Ligando de um Conjugado de Camptotecina individual. Em outro aspecto da invenção, um grupo de modalidades descreve uma população de Conjugados de Camptotecina individuais substancialmente idênticos, exceto para o número de partes de Composto de Camptotecina-Ligante ligadas a cada Unidade de Ligando (isto é, uma composição de Conjugado de Camptotecina) de modo que p representa o número médio de partes de composto de Camptotecina-Ligante ligadas às Unidades de Ligando da composição de Conjugado de Camptotecina. Nesse grupo de modalidades, p é um número na faixa de 1 a cerca de 16, 1 a cerca de 12, 1 a cerca de 10, ou 1 a cerca de 8, de 2 a cerca de 16, 2 a cerca de 12, 2 a cerca de 10, ou 2 a cerca de 8. Em alguns aspectos, p é cerca de 2. Em alguns aspectos, p é cerca de 4. Em alguns aspectos, p é cerca de 8. Em alguns aspectos, p é cerca de 16. Em alguns aspectos, p é 2. Em alguns aspectos, p é 4. Em alguns aspectos, p é 8. Em alguns aspectos, p é 16. Em alguns aspectos, o valor de p se refere à carga média de fármaco, bem como à carga de fármaco do ADC predominante na composição.
[00271] Em alguns aspectos, a conjugação será por meio dos dissulfetos intercadeias e haverá de 1 a cerca de 8 moléculas de Composto de Camptotecina-Ligante (Q-D) conjugadas a uma molécula de ligando. Em alguns aspectos, a conjugação será por meio de um resíduo de cisteína introduzido, bem como dissulfetos intercadeias e haverá de 1 a 10 ou 1 a 12 ou 1 a 14 ou 1 a 16 moléculas de Composto de Camptotecina-Ligante conjugadas a uma molécula de ligando. Em alguns aspectos, a conjugação será por meio de um resíduo de cisteína introduzido e haverá 2 ou 4 moléculas de Composto de Camptotecina-Ligante conjugadas a uma molécula de ligando.
Fármaco Livre Parcialmente Liberado
[00272] Em algumas modalidades, são compostos em que a unidade RL no conjugado foi clivada, deixando a parte de fármaco com um resíduo de aminoácido ligado a isso. Em algumas modalidades, o fármaco livre parcialmente liberado (Conjugado de Fármaco-Aminoácido) é um composto de Fórmula (IV): ou um estereoisômero ou mistura de estereoisômeros do mesmo, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que Rx é uma cadeia lateral de aminoácido como aqui descrito. Em algumas modalidades, Rx é H, metila, isopropila, benzila ou -(CH2)4-NH2. Em algumas modalidades, Rx é H ou metila. Em algumas modalidades, Rx é H. Em algumas modalidades, Rx é metila.
[00273] Em algumas modalidades, o composto de Fórmula (IV) é um composto biologicamente ativo. Em algumas modalidades, tais compostos são úteis em um método de inibir topoisomerase, matar células tumorais, inibir o crescimento de células tumorais, células cancerosas ou de um tumor, inibir a replicação de células tumorais ou células cancerosas, diminuir a carga geral do tumor ou diminuir o número de células cancerosas ou melhorar um ou mais sintomas associados a um câncer ou doença autoimune. Tais métodos compreendem, por exemplo, colocar uma célula cancerosa em contato com um composto de Fórmula (IV).
Misturas e Composições de Conjugados de Camptotecina
[00274] A presente invenção fornece misturas de Conjugado de Camptotecina e composições farmacêuticas que compreendem qualquer um dos Conjugados de Camptotecina aqui descritos. As misturas e composições farmacêuticas compreendem uma pluralidade de conjugados. Em alguns aspectos, cada um dos conjugados na mistura ou composição é idêntico ou substancialmente idêntico, no entanto, a distribuição de ligantes de fármaco nos ligandos na mistura ou composições pode variar, bem como a carga de fármaco. Por exemplo, a tecnologia de conjugação usada para conjugar fármaco-ligantes a anticorpos como o ligando de direcionamento pode resultar em uma composição ou mistura que é heterogênea em relação à distribuição de compostos de Camptotecina-Ligante no anticorpo (Unidade de Ligando) dentro da mistura e/ou composição. Em alguns aspectos, o carregamento de compostos de Camptotecina-Ligante em cada uma das moléculas de anticorpo em uma mistura ou composição de tais moléculas é um número inteiro na faixa de 1 a 14.
[00275] Nesses aspectos, quando se refere à composição como um todo, o carregamento de fármaco-ligantes é um número na faixa de 1 a cerca de 14. Dentro da composição ou mistura, também pode haver uma pequena porcentagem de anticorpos não conjugados. O número médio de fármaco- ligantes por Unidade de Ligando na mistura ou composição (isto é, carga média de fármaco) é um atributo importante, pois determina a quantidade máxima de fármaco que pode ser entregue à célula alvo. A carga média de fármaco pode ser 1, 2 ou cerca de 2, 3 ou cerca de 3, 4 ou cerca de 4, 5 ou cerca de 5, 6 ou cerca de 6, 7 ou cerca de 7, 8 ou cerca de 8, 9 ou cerca de 9, 10 ou cerca de 10, 11 ou cerca de 11, 12 ou cerca de 12, 13 ou cerca de 13, 14 ou cerca de 14, 15 ou cerca de 15, 16 ou cerca de 16.
[00276] Em alguns aspectos, as misturas e composições farmacêuticas compreendem uma pluralidade (isto é, população) de conjugados, no entanto, os conjugados são idênticos ou substancialmente idênticos e são substancialmente homogêneos no que diz respeito à distribuição de fármaco-ligantes nas moléculas de ligando dentro da mistura e/ou composição e no que diz respeito ao carregamento de fármaco-ligantes nas moléculas de ligando dentro da mistura e/ou composição. Em alguns de tais aspectos, a carga de fármaco-ligantes em uma Unidade de Ligando de anticorpo é 2 ou 4. Dentro da composição ou mistura, também pode haver uma pequena porcentagem de anticorpos não conjugados. A carga média de fármaco em tais modalidades é de cerca de 2 ou cerca de 4. Normalmente, tais composições e misturas resultam do uso de técnicas de conjugação específicas do sítio e a conjugação é devida a um resíduo de cisteína introduzido.
[00277] O número médio de camptotecinas ou compostos de Camptotecina-Ligante por Unidade de Ligando em uma preparação de uma reação de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, como espectrometria de massa, ensaio ELISA, HPLC (por exemplo, HIC). A distribuição quantitativa de Conjugados de Camptotecina em termos de p também pode ser determinada. Em alguns casos, a separação, purificação e caracterização de Conjugados de Camptotecina homogêneos podem ser alcançadas por meio de HPLC de fase reversa ou eletroforese.
[00278] Em alguns aspectos, as composições são composições farmacêuticas que compreendem os Conjugados de Camptotecina aqui descritos e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica está na forma líquida. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é um sólido. Em alguns aspectos, a composição farmacêutica é um pó liofilizado.
[00279] As composições, incluindo composições farmacêuticas, podem ser fornecidas na forma purificada. Como aqui usado, “purificado” significa que, quando isolado, o isolado contém pelo menos 95% e, em outro aspecto, pelo menos 98%, do Conjugado em peso do isolado.
Métodos de Uso Tratamento de Câncer
[00280] Os conjugados de Camptotecina aqui descritos são úteis para inibir a multiplicação de uma célula tumoral ou célula cancerosa, causando apoptose em um tumor ou célula cancerosa, ou para o tratamento do câncer em um paciente. Por conseguinte, são fornecidos aqui métodos de tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade disso, em que o método inclui administrar ao indivíduo um ou mais Conjugados de Captotecina aqui descritos.
[00281] Os Conjugados de Camptotecina podem ser usados em uma variedade de configurações para o tratamento de câncer. Os Conjugados de Camptotecina podem ser usados para administrar um medicamento a uma célula tumoral ou cancerosa. Sem estar limitado pela teoria, em uma modalidade, a Unidade de Ligando de um Conjugado de Camptotecina se liga a ou se associa a uma célula cancerosa ou a um antígeno associado a uma célula tumoral, e o Conjugado de Camptotecina pode ser absorvido (internalizado) dentro da célula tumoral ou célula cancerosa através de endocitose mediada por receptor ou outro mecanismo de internalização. O antígeno pode ser ligado a uma célula tumoral ou célula cancerosa ou pode ser uma proteína de matriz extracelular associada à célula tumoral ou célula cancerosa. Uma vez dentro da célula, o fármaco é liberado por clivagem do peptídeo dentro da célula. Em uma modalidade alternativa, o fármaco livre é liberado do Conjugado de Camptotecina fora da célula tumoral ou da célula cancerosa e o fármaco livre subsequentemente penetra na célula.
[00282] Em uma modalidade, a Unidade de Ligando se liga à célula tumoral ou célula cancerosa.
[00283] Em outra modalidade, a Unidade de Ligando se liga a uma célula tumoral ou antígeno de célula cancerosa que está na superfície da célula tumoral ou célula cancerosa.
[00284] Em outra modalidade, a Unidade de Ligando se liga a uma célula tumoral ou antígeno de célula cancerosa que é uma proteína de matriz extracelular associada à célula tumoral ou célula cancerosa.
[00285] A especificidade da Unidade de Ligando para uma determinada célula tumoral ou célula cancerosa pode ser importante para determinar os tumores ou cânceres que são tratados de forma mais eficaz. Por exemplo, os Conjugados de Camptotecina que têm como alvo um antígeno de célula cancerosa presente em cânceres hematopoiéticos podem ser úteis no tratamento de malignidades hematológicas (por exemplo, anti-CD30, anti-CD70, anti-CD19, unidade de ligando de ligação a anti-CD33 (por exemplo, anticorpo) podem ser úteis para o tratamento de doenças hematológicas). Os Conjugados de Camptotecina que têm como alvo um antígeno de células cancerígenas presentes em tumores sólidos podem ser úteis no tratamento de tais tumores sólidos.
[00286] Os cânceres que podem ser tratados com um conjugado de camptotecina incluem, sem limitação, cânceres hematopoiéticos, como, por exemplo, linfomas (Linfoma de Hodgkin e Linfomas Não-Hodgkin) e leucemias e tumores sólidos. Exemplos de cânceres hematopoiéticos incluem linfoma folicular, linfoma anaplásico de grandes células, linfoma de células do manto, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mielocítica crônica, leucemia linfocítica crônica, linfoma difuso de grandes células B e mieloma múltiplo. Exemplos de tumores sólidos incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma ósseo, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma ósseo, câncer de colorromioma, câncer de colorromioma, câncer colorromioma, câncer colorromioma, câncer colorrabiocárico, câncer de colorromioma, câncer do colo do rim, câncer ósseo, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de esôfago, câncer de estômago, câncer oral, câncer nasal, câncer de garganta, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, câncer uterino, câncer testicular, carcinoma pulmonar de células pequenas, carcinoma de bexiga, câncer epitelial carcinoma, glioma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, câncer de pele, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma.
[00287] Em modalidades preferenciais, os cânceres tratados são qualquer um dos linfomas e leucemias listados acima.
Terapia Multimodal para Câncer
[00288] Os cânceres, incluindo, sem limitação, um tumor, metástase ou outra doença ou distúrbio caracterizado por crescimento celular descontrolado, podem ser tratados ou inibidos pela administração de um Conjugado de Camptotecina.
[00289] Em outras modalidades, métodos para o tratamento do câncer são fornecidos, incluindo a administração a um paciente em necessidade disso de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Camptotecina e um agente quimioterápico. Em uma modalidade, o agente quimioterapêutico é aquele com o qual o tratamento do câncer não foi considerado refratário. Em outra modalidade, o agente quimioterapêutico é aquele com o qual o tratamento do câncer foi considerado refratário. Os Conjugados de Camptotecina podem ser administrados a um paciente que também foi submetido à cirurgia como tratamento para o câncer.
[00290] Em algumas modalidades, o paciente também recebe um tratamento adicional, como radioterapia. Em uma modalidade específica, o Conjugado de Camptotecina é administrado simultaneamente com o agente quimioterapêutico ou com terapia de radiação. Em outra modalidade específica, o agente quimioterapêutico ou terapia de radiação é administrado antes ou após a administração de um Conjugado de Camptotecina.
[00291] Um agente quimioterápico pode ser administrado ao longo de uma série de sessões. Qualquer um ou uma combinação dos agentes quimioterapêuticos, como agente (ou agentes) quimioterapêutico padrão de cuidado, pode ser administrado.
[00292] Além disso, os métodos de tratamento do câncer com um Conjugado de Camptotecina são fornecidos como uma alternativa à quimioterapia ou radioterapia, em que onde a quimioterapia ou a radioterapia foi comprovada ou pode ser muito tóxica, por exemplo, resulta em efeitos colaterais inaceitáveis ou insuportáveis para o indivíduo sendo tratado. O paciente a ser tratado pode, opcionalmente, ser tratado com outro tratamento de câncer, como cirurgia, radioterapia ou quimioterapia, dependendo de qual tratamento é considerado aceitável ou suportável.
Tratamento de Doenças Autoimunes
[00293] Os Conjugados de Camptotecina são úteis para matar ou inibir a replicação indesejada de células que produzem uma doença autoimune ou para tratar uma doença autoimune.
[00294] Os Conjugados de Camptotecina podem ser usados em uma variedade de configurações para o tratamento de uma doença autoimune em um paciente. Os Conjugados de Camptotecina podem ser usados para entregar um medicamento a uma célula-alvo. Sem estar limitado pela teoria, em uma modalidade, o Conjugado de Camptotecina se associa a um antígeno na superfície de uma célula imune pró-inflamatória ou inadequadamente estimulada e o Conjugado de Camptotecina é, então, absorvido dentro da célula-alvo por meio de endocitose mediada por receptor. Uma vez dentro da célula, a Unidade de Ligante é clivada, resultando na liberação da Camptotecina. A Camptotecina liberada fica, então, livre para migrar no citosol e induzir atividades citotóxicas ou citostáticas. Em uma modalidade alternativa, o fármaco é clivado do Conjugado de Camptotecina fora da célula alvo e a camptotecina subsequentemente penetra na célula.
[00295] Em uma modalidade, a Unidade de Ligando se liga a um antígeno autoimune. Em um aspecto, o antígeno está na superfície de uma célula envolvida em uma condição autoimune.
[00296] Em uma modalidade, a Unidade de Ligando se liga a linfócitos ativados que estão associados ao estado de doença autoimune.
[00297] Em uma outra modalidade, o Conjugado de Camptotecina mata ou inibe a multiplicação de células que produzem um anticorpo autoimune associado a uma doença autoimune particular.
[00298] Tipos particulares de doenças autoimunes que podem ser tratadas com os Conjugados de Camptotecina incluem, sem limitação, distúrbios relacionados a linfócitos Th2 (por exemplo, dermatite atópica, asma atópica, rinoconjuntivite, rinite alérgica, síndrome de Omenn, esclerose sistêmica e doença enxerto contra hospedeiro ); Distúrbios relacionados a -linfócitos Th1 (por exemplo, artrite reumatoide, esclerose múltipla, psoríase, síndrome de Sjorgren, tireoidite de Hashimoto, doença de Grave, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener e tuberculose); e distúrbios relacionados com -linfócitos B ativados (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Goodpasture, artrite reumatoide e diabetes tipo I).
Terapia de Múltiplos Fármacos de Doenças Autoimunes
[00299] Métodos para o tratamento de uma doença autoimune também são revelados incluindo a administração a um paciente em necessidade disso de uma quantidade eficaz de um Conjugado de Camptotecina e outro agente terapêutico conhecido para o tratamento de uma doença autoimune.
Composições e Métodos de Administração
[00300] A presente invenção fornece composições são composições farmacêuticas que compreendem os Conjugados de Camptotecina aqui descritos e um carreador farmaceuticamente aceitável. Os Conjugados de Camptotecina podem estar em qualquer forma que permita que o composto seja administrado a um paciente para o tratamento de um distúrbio associado à expressão do antígeno ao qual a Unidade de Ligando se liga. Por exemplo, os conjugados podem estar na forma de um líquido ou sólido. A via de administração preferencial é a parenteral. A administração parenteral inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, injeção intraesternal ou técnicas de infusão. Em um aspecto, as composições são administradas por via parenteral. Em um aspecto, os conjugados são administrados por via intravenosa. A administração pode ser por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus.
[00301] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para permitir que um composto fique biodisponível após a administração da composição a um paciente. As composições podem assumir a forma de uma ou mais unidades de dosagem.
[00302] Os materiais usados na preparação das composições farmacêuticas podem ser não tóxicos nas quantidades usadas. Será evidente para os versados na matéria que a dosagem ideal do ingrediente (ou ingredientes) ativo na composição farmacêutica dependerá de uma variedade de fatores. Os fatores relevantes incluem, sem limitação, o tipo de animal (por exemplo, ser humano), a forma particular do composto, a forma de administração e a composição empregada.
[00303] A composição pode estar, por exemplo, na forma de um líquido. O líquido pode ser útil para administração por injeção. Em uma composição para administração por injeção, um ou mais dentre um tensoativo, conservante, agente umectante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizador e agente isotônico também podem ser incluídos.
[00304] As composições líquidas, sejam soluções, suspensões ou outra forma similar, também podem incluir um ou mais dos seguintes: diluentes estéreis, como água para injeção, solução salina, de preferência soro fisiológico, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos, como mono ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicois, glicerina, ciclodextrina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes, como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, como ácido etilenodiaminotetracético; tampões, como aminoácidos, acetatos, citratos ou fosfatos; detergentes, como tensoativos não iônicos, polióis; e agentes para o ajuste da tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose. Uma composição parenteral pode ser confinada em uma ampola, uma seringa descartável ou um frasco de dose múltipla fabricado de vidro, plástico ou outro material. A solução salina fisiológica é um adjuvante exemplificador. Uma composição injetável é preferencialmente estéril.
[00305] A quantidade do conjugado que é eficaz no tratamento de um distúrbio ou condição particular dependerá da natureza do distúrbio ou condição e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, os ensaios in vitro ou in vivo podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideais. A dose precisa a ser empregada nas composições também dependerá da via de administração e da gravidade da doença ou distúrbio, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente.
[00306] As composições compreendem uma quantidade eficaz de um composto de modo que seja obtida uma dosagem adequada. Normalmente, essa quantidade é pelo menos cerca de 0,01% de um composto em peso da composição.
[00307] Para administração intravenosa, a composição pode compreender de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg de um Conjugado de Camptotecina por kg de peso corporal do animal. Em um aspecto, a composição pode incluir de cerca de 1 a cerca de 100 mg de um Conjugado de Camptotecina por kg de peso corporal do animal. Em outro aspecto, a quantidade administrada estará na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 25 mg/kg de peso corporal de um composto. Dependendo do fármaco usado, a dosagem pode ser ainda menor, por exemplo, 1,0 μg/kg a 5,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 3,0 mg/kg, 2,0 mg/kg ou 1,0 mg/kg, ou 1,0 μg/kg a 500,0 μg/kg do peso corporal do indivíduo.
[00308] Geralmente, a dosagem de um conjugado administrado a um paciente é tipicamente cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg do peso corporal do indivíduo ou de 1,0 μg/kg a 5,0 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 15 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 15 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 20 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada é entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg ou cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada está entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada está entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso corporal do indivíduo. Em algumas modalidades, a dosagem administrada está entre cerca de 0,1 a 4 mg /kg, ainda mais preferencialmente 0,1 a 3,2 mg/kg, ou ainda mais preferencialmente 0,1 a 2,7 mg/kg do peso corporal do indivíduo ao longo de um ciclo de tratamento.
[00309] O termo “carreador” se refere a um diluente, adjuvante ou excipiente, com o qual um composto é administrado. Esses carreadores farmacêuticos podem ser líquidos, como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, origem animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim. Os carreadores podem ser solução salina, goma de acácia, gelatina, pasta de amido, talco, queratina, sílica coloidal, ureia. Além disso, podem ser usados agentes auxiliares, estabilizantes, espessantes, lubrificantes e corantes. Em uma modalidade, quando administrado a um paciente, o composto ou composições e carreadores farmaceuticamente aceitáveis são estéreis.
[00310] A água é um carreador exemplificador quando os compostos são administrados por via intravenosa. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os carreadores farmacêuticos adequados também incluem excipientes, como amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol. As presentes composições, se desejado, também podem conter pequenas quantidades de agentes umectantes ou emulsionantes, ou agentes tamponantes de pH.
[00311] Em uma modalidade, os conjugados são formulados de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a animais, particularmente seres humanos. Normalmente, os carreadores ou veículos para administração intravenosa são soluções tampão aquosas isotônicas estéreis. Quando necessário, as composições também podem incluir um agente solubilizante. As composições para administração intravenosa podem compreender opcionalmente um anestésico local, como lidocaína, para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou sachês indicando a quantidade de agente ativo. Quando um conjugado deve ser administrado por infusão, pode ser dispensado, por exemplo, com um frasco de infusão contendo água estéril de grau farmacêutico ou soro fisiológico. Quando o conjugado é administrado por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[00312] As composições farmacêuticas são geralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotônicas e em total conformidade com todos os regulamentos de Boas Práticas de Fabricação (GMP) da U.S. Food and Drug Administration.
Métodos de Preparo de Conjugados de Camptotecina
[00313] Os Conjugados de Camptotecina aqui descritos podem ser preparados em uma construção em série de anticorpos, ligantes e unidades de fármaco, ou de uma forma convergente por porções de montagem seguida por uma etapa de montagem completa.
[00314] Em um grupo de modalidades, os Compostos de Camptotecina-Ligante, conforme fornecidos neste documento, são combinados com uma Unidade de Ligando adequada para facilitar a ligação covalente dos Compostos de Camptotecina- Ligante à Unidade de Ligando. Em algumas modalidades, a Unidade de Ligando é um anticorpo que tem pelo menos 2, pelo menos 4, pelo menos 6 ou 8 tióis disponíveis para ligação dos Compostos de Ligante como resultado da redução das ligações dissulfeto intercadeias. Em algumas modalidades, os Compostos de Camptotecina-Ligante são ligados à Unidade de Ligando através de uma parte de cisteína introduzida no anticorpo.
Kits para Uso Terapêutico
[00315] Em alguns aspectos, são fornecidos kits para uso no tratamento do câncer e no tratamento de doenças autoimunes. Esses kits podem incluir uma composição farmacêutica que compreende um Conjugado de Camptotecina aqui descrito.
[00316] Em algumas modalidades, o kit pode incluir instruções para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos aqui descritos. As instruções incluídas podem fornecer uma descrição da administração das composições farmacêuticas a um indivíduo para atingir a atividade pretendida, por exemplo, o tratamento de uma doença ou condição como o câncer, em um indivíduo. Em algumas modalidades, as instruções relacionadas ao uso das composições farmacêuticas aqui descritas podem incluir informações quanto à dosagem, cronograma de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multidose) ou doses de subunidade. As instruções fornecidas nos kits da revelação são normalmente instruções escritas em um rótulo ou folheto informativo. O rótulo ou bula indica que as composições farmacêuticas são usadas para tratar, retardar o início e/ou aliviar uma doença ou distúrbio em um indivíduo.
[00317] Em algumas modalidades, os kits fornecidos neste documento estão em embalagens adequadas. A embalagem adequada inclui, sem limitação, frascos, garrafas, potes, embalagens flexíveis e similares. Também contempladas são embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, como um inalador, dispositivo de administração nasal ou um dispositivo de infusão. Em algumas modalidades, um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica).
[00318] Em algumas modalidades, os kits fornecidos neste documento incluem um agente terapêutico adicional útil no tratamento de um câncer de doença autoimune, conforme descrito neste documento.
Modalidades Exemplificadoras
[00319] Modalidade 1: Um Conjugado de Camptotecina que tem uma Fórmula: L-(Q-D)p ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que L é uma Unidade de Ligante; Q é uma unidade de ligação com uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A-S*-RL-; -Z-A- LP(S*)-RL-; -Z-A-S*-RL-Y-; e -Z-A-LP(S*)-RL-Y-; em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; LPé uma Unidade Conectora Paralela; S*é um Agente de Particionamento; RL é um peptídeo que compreende de 2 a 8 aminoácidos; e Y é uma Unidade Espaçadora; D é uma Unidade de Fármaco selecionada do grupo que consiste em: em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 haloalquila, C3-C8 cicloalquila, C3- C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila; RCé um membro selecionado do grupo que consiste em C1 C6 alquila e C3-C6 cicloalquila; cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, C 1-C8 aminoalquilC(O)-, C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila; ou RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RB, RC, RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; o subscrito p é um número inteiro de 1 a 16; e em que Q é ligado através de qualquer um dos grupos hidroxila e amina presentes em CPT1, CPT2, CPT3, CPT4 ou CPT5.
[00320] Modalidade 2: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que D tem a Fórmula CPT5. Modalidade 3: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que D tem a Fórmula CPT2. Modalidade 4: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que D tem a Fórmula CPT3. Modalidade 5: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que D tem a Fórmula CPT4. Modalidade 6: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que D tem a Fórmula CPT1. Modalidade 7: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que L é um anticorpo. Modalidade 8: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 3, em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, e C1-C8 haloalquila. Modalidade 9: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 3, em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em C3-C8 cicloalquila, C3-C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila, e em que as porções de cicloalquila e fenila de RBsão substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2. Modalidade 10: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 4, em que RCé C1-C6 alquila. Modalidade 11: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 4, em que RCé C3-C6 cicloalquila. Modalidade 12: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 2, em que tanto RF como RF’são H. Modalidade 13: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 2, em que pelo menos um dentre RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, e C1-C8 aminoalquilC(O)-. Modalidade 14: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 2, em que cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1 C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, e C1-C8 aminoalquilC(O)-. Modalidade 15: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 2, em que pelo menos um dentre RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1- C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroaril e heteroarilC1-C4 alquila, e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2. Modalidade 16: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 2, em que cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C3-C10 cicloalquila, C3- C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroaril e heteroarilC1-C4 alquila, e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2. Modalidade 17: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1 ou 2, em que RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1- C4 alquil)2. Modalidade 18: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que Q é uma Unidade de Ligante que tem uma fórmula selecionada do grupo que consiste em: -Z-A- S*-RL-; e -Z-A-S*-RL-Y-;
[00321] em que Z é uma Unidade Extensora, A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; S*é um Agente de Particionamento; e Y é uma Unidade Espaçadora. Modalidade 19: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 18, em que Z- A- compreende um componente de ácido maleimido-alcanoico ou um componente de mDPR. Modalidade 20: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 18, em que RL é um dipeptídeo. Modalidade 21: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que RL é um tripeptídeo. Modalidade 22: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 18, em que RL é um tetrapeptídeo. Modalidade 23: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 18, em que RL é um pentapeptídeo. Modalidade 24: Um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 18 a 23, em que RL compreende aminoácidos selecionados do grupo que consiste em β-alanina, N-metilglicina, glicina, lisina, valina e fenilalanina. Modalidade 25: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que Y está presente e compreende:
[00322] em que EWG é um grupo de retirada de elétron. Modalidade 26: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que Y está presente e compreende:
[00323] Modalidade 27: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, em que Y está presente e compreende: em que EWG é um grupo de retirada de elétron. Modalidade 28: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 25 ou 27, em que EWG é um membro selecionado do grupo que consiste em - CN, -NO2, -CX3, -X,, C(=O)OR’, -C(=O)N(R’)2, -C(=O)R’, -C(=O)X, -S(=O)2R’, -S(=O)2OR’, -S(=O)2NHR’, -S(=O)2N(R’)2, - P(=O)(OR’)2, -P(=O)(CH3)NHR’, -NO, -N(R’)3+, em que X é -F, - Br, -Cl, ou -I, e R’é independentemente selecionado do grupo que consiste em hidrogênio e C1-6 alquila. Modalidade 29: Um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 1 a 27, em que RL é um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly, gly-gly-gly, gly-gly-gly-gly, val-gly- gly, val-cit-gly, val-gln-gly, val-glu-gly, phe-lys-gly, leu-lys-gly, gly-val-lys-gly, val-lys-gly-gly, val-lys-gly, val-lys-ala, val-lys-leu, leu-leu-gly, gly-gly-phe-gly, gly- gly-phe-gly-gly, val-gly e val-lys-β-ala. Modalidade 30: Um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 1 a 27, em que RL é um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly, gly-gly-gly, gly-gly-gly-gly, val-gly- gly, val-cit-gly, val-gln-gly, val-glu-gly, phe-lys-gly, leu-lys-gly, gly-val-lys-gly, val-lys-gly-gly, val-lys-gly, val-lys-ala, val-lys-leu, leu-leu-gly, gly-gly-phe-gly, gly- gly-phe-gly-gly, val-gly, e val-lys-β-ala; Y é um Unidade de PEG; e Z-X é um componente de ácido maleimido-alcanoico, ou um componente de mDPR. Modalidade 31: Um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 1 a 27, em que S*é uma Unidade de PEG; e Z-A- é um componente de maleimidopropionila ou um componente de mDPR. Modalidade 32: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 31, em que Z-A- é um componente de maleimidopropionila. Modalidade 33: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 31, em que Q tem a Fórmula:
[00324] em que n é um número inteiro de 2 a 20; RL é um di-, tri-, tetra- ou pentapeptídeo; a linha ondulada marcada com um único * indica o sítio de fixação a D ou a uma Unidade Espaçadora (Y); e a linha ondulada marcada com *** indica o ponto de fixação a um átomo de enxofre de L. Modalidade 34: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 33, em que n é um número inteiro de 4 a 10. Modalidade 35: Um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 1 a 34, em que L é um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD30, CD33, CD70 e LIV-1. Modalidade 36: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 1, Fórmula:
[00325] em que Ab é um anticorpo específico para um antígeno selecionado do grupo que consiste em CD19, CD30, CD33, CD70 e LIV-1, RL é um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly-gly-gly, val-lys-β-ala, val-gln-gly, val-lys-ala, phe-lys-gly, val-lys-gly-gly, gly-gly, val-lys- gly, val-gly-gly, leu-leu-gly, leu-lys-gly, val-glu-gly, gly-gly-gly, val-asp-gly, val-lys, val-gly e gly-val-lys- gly; e p é um número inteiro de 1 a 16. Modalidade 37: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 36, em que RL é selecionado do grupo que consiste em val-lys-β-ala, val-gln- gly, val-lys-ala, phe-lys-gly, val-lys-gly, val-gly-gly, leu-leu-gly, leu-lys-gly, val-glu-gly, gly-gly-gly e val- asp-gly. Modalidade 38: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 36, em que RL é selecionado do grupo que consiste em val-lys-β-ala, val-gln-gly, val-lys-ala, phe-lys-gly, val-lys-gly, val-gly-gly, leu-lys-gly, val-glu-gly e val- asp-gly. Modalidade 39: Um Conjugado de Camptotecina da Modalidade 36, em que RL é val-lys-gly.
[00326] Modalidade 40: Um Composto Camptotecina- Ligante que tem uma Fórmula selecionada do grupo que consiste em: Z’-A—S*-RL-D; Z’-A-LP(S*)-RL-D; Z’-A-S*-RL-Y-D; e Z’-A-LP(S*)-RL-Y-D; em que Z’ é uma Unidade Extensora; A é uma ligação ou uma Unidade Conectora; LPé uma Unidade Conectora Paralela; S*é um Agente de Particionamento; RL é um peptídeo que compreende de 2 a 8 aminoácidos; Y é uma Unidade Espaçadora; e D é uma Unidade de Fármaco selecionada do grupo que consiste em em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 haloalquila, C3-C8 cicloalquila, C3- C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila; RCé um membro selecionado do grupo que consiste em C1 C6 alquila e C3-C6 cicloalquila; cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, C 1-C8 aminoalquilC(O)-, C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila; ou RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RB, RC, RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2; o subscrito p é um número inteiro de 1 a 16; e em que Q é ligado através de qualquer um dos grupos hidroxila e amina presentes em CPT1, CPT2, CPT3, CPT4 ou CPT5.
[00327] Modalidade 41: Um Composto de Camptotecina- Ligante da Modalidade 40 que tem a Fórmula (i) ou (iii). Modalidade 42: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 40 que tem a Fórmula (ii) ou (iv). Modalidade 43: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 40 que tem a Fórmula (i). Modalidade 44: Um Composto de Camptotecina- Ligante da Modalidade 40 que tem a Fórmula (iii). Modalidade 45: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que D é CPT5. Modalidade 46: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila e C1-C8 haloalquila. Modalidade 47: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em C3-C8 cicloalquila, C3- C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila e fenilC1-C4 alquila, e em que as porções de cicloalquila e fenila de RBsão substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2. Modalidade 48: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que RCé C1-C6 alquila. Modalidade 49: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que RCé C3-C6 cicloalquila. Modalidade 50: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que tanto RF como RF’são H. Modalidade 51: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que pelo menos um dentre RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)- e C1-C8 aminoalquilC(O)-. Modalidade 52: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C1-C8 alquila, C1-C8 hidroxialquila, C1-C8 aminoalquila, C1-C4 alquilaminoC1-C8 alquila, (C1-C4 hidroxialquil)(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, di(C1-C4 alquil)aminoC1-C8 alquila, C1-C4 hidroxialquilC1-C8 aminoalquila, C1-C8 alquilC(O)-, C1-C8 hidroxialquilC(O)-, e C1-C8 aminoalquilC(O)-. Modalidade 53: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que pelo menos um dentre RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquilC1- C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroarila e heteroarilC1-C4 alquila, e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1- C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2. Modalidade 54: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que cada RF e RF’é um membro independentemente selecionado do grupo que consiste em H, C3-C10 cicloalquila, C3-C10cicloalquilC1-C4 alquila, C3-C10 heterocicloalquila, C3 C10 heterocicloalquilC1-C4 alquila, fenila, fenilC1-C4 alquila, difenilC1-C4 alquila, heteroaril e heteroarilC1-C4 alquila, e em que porções de cicloalquila, heterocicloalquila, fenila e heteroarila de RF e RF’são substituídas por 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1-C4 alquil)2. Modalidade 55: Um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 44, em que RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um anel com 5, 6 ou 7 membros que tem 0 a 3 substituintes selecionados dentre halogênio, C1-C4 alquila, OH, OC1-C4 alquila, NH2, NHC1-C4 alquila e N(C1- C4 alquil)2. Modalidade 56: Um Composto de Camptotecina- Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 55, em que Z’- A- é maleimidopropionila, mDPR, maleimidocaproila ou maleimidopropionil-β-Alanila. Modalidade 57: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 56, em que Z’-A- é maleimidopropionila. Modalidade 58: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 56, em que Z’-A- é mDPR. Modalidade 59: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 40, em que S* é um grupo de PEG. Modalidade 60: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 40, em que RL compreende um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly, gly-gly-gly, gly-gly-gly-gly, val-gly-gly, val- cit-gly, val-gln-gly, val-glu-gly, phe-lys-gly, leu-lys-gly, gly-val-lys-gly, val-lys-gly-gly, val-lys-gly, val-lys-ala, val-lys-leu, leu-leu-gly, gly-gly-phe-gly, gly-gly-phe-gly- gly, val-gly e val-lys-β-ala. Modalidade 62: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 40, em que RL compreende um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly, gly-gly-gly, gly-gly-gly-gly, val-gly-gly, val-cit-gly, val- gln-gly, val-glu-gly, phe-lys-gly, leu-lys-gly, gly-val-lys- gly, val-lys-gly-gly, val-lys-gly, val-lys-ala, val-lys-leu, leu-leu-gly, gly-gly-phe-gly, gly-gly-phe-gly-gly, val-gly e val-lys-β-ala; Z’-A- é maleimidopropionila, mDPR ou maleimidopropionil-β-Alanila; e S* é um grupo de PEG. Modalidade 62: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 40 sel ecionado do grupo que consiste em:
[00328] em que RL é um peptídeo selecionado do grupo que consiste em gly-gly-gly-gly, val-lys-β-ala, val-gln-gly, val-lys-ala, phe-lys-gly, val-lys-gly-gly, gly-gly, val-lys- gly, val-gly-gly, leu-leu-gly, leu-lys-gly, val-glu-gly, gly-gly-gly, val-asp-gly, val-lys, val-gly e gly-val-lys- gly. Modalidade 63: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 62 em que RL é selecionado do grupo que consiste em val-lys-β-ala, val-gln-gly, val-lys-ala, phe-lys-gly, val-lys-gly, val-gly-gly, leu-leu-gly, leu-lys-gly, val-glu- gly, gly-gly-gly e val-asp-gly. Modalidade 64: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 62, em que RL é selecionado do grupo que consiste em val-lys-β-ala, val-gln- gly, val-lys-ala, phe-lys-gly, val-lys-gly, val-gly-gly, leu-lys-gly, val-glu-gly e val-asp-gly. Modalidade 65: Um Composto de Camptotecina-Ligante da Modalidade 62 em que RL é val-lys-gly.
[00329] Modalidade 66: Um Composto de Camptotecina que tem a Fórmula:
[00330] em que cada RF e RF’é independentemente um membro selecionado do grupo que consiste em H, glicila, hidroxiacetila, etila, e 2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etila, ou em que RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um morfolino. Modalidade 67: O Composto de Camptotecina da Modalidade 66, em que RFé H e RF’é glicila, hidroxiacetila, etila, 2-(2-(2- aminoetoxi)etoxi)etila. Modalidade 68: O Composto de Camptotecina da Modalidade 66, em que RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual está fixado para formar um morfolino.
[00331] Modalidade 69: Um Composto de Camptotecina que tem a Fórmula:
[00332] em que RBé um membro selecionado do grupo que consiste em ciclopropila, pentila, hexila, terc-butila e ciclopentila.
[00333] Modalidade 70: Um método de tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade disso, em que o dito método compreende a administração ao indivíduo de um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 1 a 39. Modalidade 71: O método da Modalidade 70, em que dito câncer é selecionado do grupo que consiste em linfomas, leucemias e tumores sólidos. Modalidade 72: O método da Modalidade 70, em que disse que o dito câncer é um linfoma ou uma leucemia. Modalidade 73: O Método de qualquer uma das Modalidades 70 a 73, que compreende adicionalmente um agente terapêutico adicional. Modalidade 74: O método da Modalidade 73, em que o dito agente terapêutico adicional é um ou mais agentes quimioterapêuticos ou radioterapia.
[00334] Modalidade 75: Um método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade disso, em que o dito método compreende a administração ao indivíduo de um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 1 a 39. Modalidade 76: O método da Modalidade 75, em que a dita doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em distúrbios relacionados a linfócitos Th2, distúrbios relacionados a -linfócitos Th1 e distúrbios relacionados a -linfócitos B ativados.
[00335] Modalidade 77: Um método de preparação de um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 1 a 39, em que o dito método compreende a reação de um anticorpo com um Composto de Camptotecina-Ligante de qualquer uma das Modalidades 40 a 65.
[00336] Modalidade 78: Um kit que compreende um Conjugado de Camptotecina de qualquer uma das Modalidades 1 a 39. Modalidade 79: O kit da Modalidade 77, que compreende adicionalmente um agente terapêutico adicional. Exemplos Procedimentos Experimentais Abreviações para Síntese
Materiais e Métodos
[00337] Os seguintes materiais e métodos são aplicáveis aos procedimentos sintéticos descritos nessa seção, a menos que indicado de outra forma. Todos os solventes anidros disponíveis comercialmente foram usados sem purificação adicional. Materiais de partida, reagentes e solventes foram adquiridos de fornecedores comerciais (SigmaAldrich e Fischer). Os produtos foram purificados por cromatografia em coluna flash com o uso de um sistema de purificação flash Biotage Isolera One (Charlotte, NC). UPLC- MS foi realizado em um espectrômetro de massa com detector único quádruplo Waters com interface com um sistema Waters Acquity UPLC equipado com uma coluna de fase reversa Waters Acuity UPLC BEH C18 2,1 x 50 mm, 1,7 μm. O eluente consistia nos solventes acetonitrila com ácido fórmico a 0,1% e ácido fórmico aquoso a 0,1%. O método geral foi um gradiente de acetonitrila a 3 a 60% ao longo de 1,7 min, em seguida, um gradiente linear de 60 a 95% a 2,0 min, seguido por isocrático de acetonitrila 95% a 2,5 min, em seguida, um equilíbrio da coluna para 3% de 2,8 a 3,0 min com uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. 2 = 0,4 ml/min), equipado com uma coluna de fase reversa Acquity UPLC BEH C18 2,1 x 50 mm, 1,7 μm. HPLC preparativa foi realizada em um sistema de entrega de solvente Waters 2454 Binary Gradient Module configurado com um detector Wasters 2998 PDA. Os produtos foram purificados com o diâmetro apropriado de coluna de uma coluna de fase reversa Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 80 Â 250 mm eluindo com ácido trifluoroacético a 0,05% em água e ácido trifluoroacético a 0,05% em acetonitrila.
Preparações de Compostos de Camptotecina
[00338] Os Compostos de Camptotecina fornecidos nos seguintes exemplos podem ser usados na preparação de Compostos de Camptotecina-Ligante, bem como de Conjugados de Camptotecina, como aqui descrito.
Exemplo 1
[00339] Proteção de TBS de SN-38: SN-38 1
[00340] 7-etil-10-hidroxi-camptotecina (SN-38) (160,0 mg, 0,4077 mmmol) adquirido junto à MedChemExpress foi suspenso em DCM anidro (2 ml). DIPEA (0,22 ml, 1,3 mmol) foi adicionado seguido por TBSCl (154 mg, 1,02 mmol). A reação foi agitada durante 30 minutos até SN-38 se tornar solúvel e a conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi bruscamente terminada com MeOH, filtrada através de um tampão de sílica e concentrada in vacuo. O óleo incolor obtido foi triturado com Hex. O produto precipitou da solução. O precipitado foi coletado por filtração e enxaguado com Hex para render TBS-SN-38 (1) como um sólido esbranquiçado (200 mg, 0,395 mmol, 97%). Ta = 1,86 min Método Hidrofóbico UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C28H35N2O5Si 507,23, 506,96 encontrado. Exemplo 2
[00341] O composto 2-a foi sintetizado de acordo com o procedimento descrito por Burke, P. J., Jeffrey, S. C. et al. em Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1.242 a 1.250. Composto 2-a (50 mg, 0,108 mmol) dissolvido em DCM (1 ml). DMAP (13 mg, 0,11 mmol) foi adicionado à reação seguido por Boc2O (24 mg, 0,11 mmol). A reação foi agitada durante 5 minutos, altura em que se observou a conversão completa no produto desejado. O produto protegido foi purificado por cromatografia em coluna 10G Biotage Ultra 0-5% MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado foram concentradas in vacuo para render o composto 2-b como um sólido amarelo (49 mg, 0,087 mmol, 80%). Ta = 2,24 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C30H34N3O8 564,23, 564,10 encontrado.
[00342] Composto 2-b (49 mg, 0,087 mmol) dissolvido em DCM anidro (2 ml). DMAP (37 mg, 0,304 mmol) foi adicionado e a reação foi resfriada a 0 °C. Trifosgênio (12 mg, 0,039 mmol) dissolvido 10 mg/ml em DCM foi adicionado por gotejamento à reação ao longo de 15 minutos. Uma alíquota de 2 ul foi bruscamente terminada em 98 ul de diluente de MeOH e injetada no UPLC-MS. A conversão completa para o aduto MeOH foi observada por UPLC-MS. A mistura de reação (composto 2) pode ser usada diretamente nas etapas de acoplamento com ligantes adequados. Ta = 2,09 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C32H36N3O10 622,24, 622,02 encontrado. Exemplo 3
[00343] Composto 3-a (150 mg, 0,334 mmol) dissolvido em DCM anidro (2 ml). DMAP (143 mg, 1,17 mmol) foi adicionado. Trifosgênio (45 mg, 0,15 mmol) dissolvido em DCM anidro (50 mg/ml) foi adicionado por gotejamento durante 5 minutos. A reação foi agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Uma alíquota de 2 ul da mistura de reação foi bruscamente terminada em 98 ul de diluente de MeOH. Conversão quase completa em carbonato de MeOH observada indicando a formação de cloroformato. O produto 3 pode ser usado sem purificação adicional nas etapas de acoplamento com ligantes adequados. Ta = 1,55 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C27H27N2O8 507,18, 507,06 encontrado.
Exemplo 4
[00344] Preparação de 7-metilamino derivado- metilenodioxi camptotecina (aqui referido como 7-MAD-MDCPT ou Composto 4)
[00345] 6-Amino-3,4-(metilenodioxi)acetofenona (5,00 g, 27,9 mmoles) foi dissolvido em DCM (100 ml). A reação foi resfriada a 0 °C e DIPEA (7,29 ml, 41,9 mmoles) foi adicionado seguido pela adição lenta de cloreto de acetila (2,49 ml, 34,9 ml). A reação foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada durante 30 minutos. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi bruscamente terminada com MeOH (5 ml) e a reação foi concentrada in vacuo para render o composto 4-a como um sólido branco usado na próxima etapa sem purificação adicional. Ta = 1,37 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C11H12NO4 222,08, 222,11 encontrado.
[00346] O composto 4-a (27,9 mmoles) da etapa anterior foi dissolvido em AcOH (100 ml). HBr 33% em peso em AcOH (9,78 ml, 55,8 mmoles) foi adicionado lentamente. Bromo (1,44 ml, 27,9 mmoles) foi adicionado por gotejamento durante 15 minutos. A reação foi agitada durante 30 minutos, altura em que se observou a conversão em produto desejado. A reação foi vertida sobre água gelada e o precipitado foi coletado por filtração e lavado com água. O filtrado foi seco para se obter um pó amarelo que era uma mistura do produto desejado, composto 4-b, com material de partida e impurezas do produto dibrominado que foi usado na etapa seguinte sem purificação adicional (7,2 g, 24 mmoles, 86%). Ta = 1,58 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C11H11BrNO4 299,99, 299,90 encontrado.
[00347] Composto 4-b (7,2 g, 24 mmoles) foi dissolvido em EtOH (100 ml). HBr concentrado (5 ml) foi adicionado e a reação foi aquecida ao refluxo durante 60 minutos. Foi observada conversão quase completa para o produto desprotegido. A reação foi concentrada in vacuo, diluída com DCM (200 ml) e H2O (200) ml. A fase aquosa foi extraída com DCM (3 x 200 ml), as fases orgânicas coletadas foram secas com MgSO4, filtradas e concentradas in vacuo. O produto cru foi purificado por cromatografia em coluna 0-10% MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado com impurezas menores foram concentradas para se obter o composto 4-c como um pó amarelo (4,05 g, 15,7 mmoles, 65%). Ta = 1,57 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C9H9BrNO3 257,98, 257,71 encontrado.
[00348] Composto 4-c (1,00 g, 3,87 mmoles), p-TSA (667 mg, 3,87 mmoles) e 4-Etil-4-hidroxi-7,8-di-hidro-1H-pirano [3,4-f] indolizina- 3,6,10(4H)-triona (1,02 g, 3,87 mmoles, obtida junto à Avra Laboratories Pvt. Ltd.) foram carregados em um frasco. DSM (5 ml) foi adicionado para homogeneizar os sólidos e, então, evaporado sob nitrogênio. Os sólidos puros foram, então, aquecidos a 120 °C sob alto vácuo (1 mbar) durante 60 minutos. A reação foi resfriada à temperatura ambiente, o produto bruto precipitado com H2O, filtrado e lavado com H2O. O precipitado foi purificado por cromatografia em coluna 0-10% MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado foram concentradas in vacuo para render o composto 4-d como um sólido marrom (989 mg, 2,04 mmol, 53%). Ta = 1,57 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C9H9BrNO3 257,98, 257,71 encontrado. Ta = 1,62 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C22H17BrN2O6 485,03, 484,95 encontrado.
[00349] Composto 4-d (188 mg, 0,387 mmol) foi dissolvido em EtOH (5 ml). Hexametilenotetramina (163 mg, 1,16 mmol) foi adicionada e a reação foi agitada em refluxo durante 90 minutos. A reação foi resfriada e HCl conc. aq. (0,1 ml) foi adicionado. A reação foi concentrada e purificada por HPLC prep. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render o Composto 4 como um sólido branco sujo (109 mg, 0,259 mmol, 67%).
[00350] Os seguintes compostos podem ser preparados a partir de 7-MAD-MDCPT (Composto 4) ou a partir do Composto 4-d, com o uso de métodos convencionais: Tabela I. 5 [1] O substrato (4-d do Exemplo 4, 10,0 mg, 20,6 μmoles) foi dissolvido em DMF anidro (0,25 ml). Metilamina 62 μmoles) foi adicionada. A reação foi agitada durante 30 minutos e depois bruscamente terminada com AcOH (20 μl). A reação foi purificada por HPLC prep. As frações contendo o produto desejado (5) foram liofilizadas para render um sólido amarelo (3,27 mg, 7,51 μmoles, 36%). Ta = 1,57 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C9H9BrNO3 257,98, 257,71 encontrado. Ta = 0,93 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C23H22N3O6 436,15, 435,78 encontrado. [2] Os Exemplos 5a - 5aa foram realizados seguindo os procedimentos gerais delineados para o Composto 5. Tabela II.
[00351] 6-nitro-1,3-benzodioxol-5-carbonitrila (2,00 g, 10,4 mmoles) foi dissolvido em EtOH (50 ml). A reação foi colocada sob atmosfera de nitrogênio. Pd/C (2,22 g, 10% em peso, 2,08 mmoles) adicionado à reação. Reação colocada sob atmosfera de hidrogênio. A reação foi agitada durante 2 horas. A reação foi filtrada através de um leito de Celite e enxaguada com MeOH. O eluente foi concentrado in vacuo e purificado por cromatografia flash 0-10% DCM em MeOH. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um sólido vermelho (1,46 g, 9,00 mmoles, 87%). Ta = 1,14 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C8H7N2O2 163,05, 162,37 encontrado.
[00352] 6-amino-1,3-benzodioxol-5-carbonitrila (50 mg, 0,31 mmol) foi colocado sob atmosfera de nitrogênio e dissolvido em THF anidro (1 ml). CuBr (1,5 mg, 0,010 mmol) foi adicionado seguido por brometo de 4-fluorofenilmagnésio 1M em THF (1,23 ml). A reação foi aquecida a 60 °C durante 30 minutos e, então, resfriada à temperatura ambiente. Uma solução de H2SO4 a 15% foi adicionada à reação lentamente e agitada durante 30 minutos. A reação foi vertida em NaHCO3 sat. (50 ml), e extraída com EtOAc (3 x 50 ml). O orgânico foi seco com MgSO4, filtrado e concentrado in vacuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna 10G Biotage Ultra 0-10% EtOAc em Hex. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um sólido vermelho (46,2 mg, 0,178 mmol, 58%). Ta = 1,81 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C14H11FNO3 260,07, 259,46 encontrado.
[00353] Substrato (46,2 mg, 0,178 mmol), p-TSA (30,7 mg, 0,178 mmol) e 4-Etil-4-hidroxi-7,8-di-hidro-1H-pirano [3,4-f]indolizina-3,6,10(4H)-triona (46,9 mg, 0,178 mmol) foram carregados em um frasco de cintilação. DCM (1 ml) foi adicionado para homogeneizar os sólidos. O solvente foi concentrado sob nitrogênio. Os sólidos puros foram, então, aquecidos a 120 °C sob alto vácuo (1 mbar) durante 60 minutos. A reação foi reconstituída em DCM (50 ml), lavada com H2O, a fase orgânica foi seca com MgSO4, filtrada e concentrada in vacuo. O produto cru foi purificado por cromatografia em coluna 10G Biotage Ultra 0-10% MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado (6) foram concentradas para render um sólido vermelho (32,9 mg, 0,0676 mmol, 38%). Ta = 1,81 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C27H20FN2O6 487,13, 487,19 encontrado.
[00354] Os Exemplos 6a-6o foram sintetizados com o uso de um procedimento semelhante ao acima para o Composto 6. Tabela III. 7 [3] 7-Etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38) (76,0 mg, 0,19 mmol) foi dissolvido em diclorometano, seguido pela adição de trietilamina (128 μl, 0,92 mmol) e DMAP (2,60 mg, 0,02 mmol). A mistura foi resfriada a 0 °C em um banho de gelo, seguido pela adição por gotejamento de cloreto de acetila (15,9 μl, 0,22 mmol). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 16 h. A reação foi diluída com diclorometano, lavada com NH4Cl saturado, água e salmoura. A fase orgânica foi, então, seca sobre MgSO4, filtrada, concentrada e purificada sobre sílica por meio de cromatografia em coluna flash Biotage (CH2Cl2/MeOH 0-15%) para produzir SN-38 acetilado (7). MS (m/z) calculado 435,15 (M+H)+, 435,07 encontrado. Exemplo 8 [4] Os compostos no Exemplo 8 foram preparados de acordo com procedimentos publicados e métodos gerais. Tabela IV. Preparações de Ligante de Camptotecina Exemplo 1-1 Preparação de MC-Gly-Gly-Phe-Gly-aminometoxiacetil-7- MAD-MDCPT Síntese de ácido MC-GGFG-Hemiaminal-Glicólico
[00355] Com base no procedimento publicado (WO 2015/155998 PCT/JP2015/002020) Fmoc-Gly-Gly-OH (4,70 g, 13,3 mmoles) foi parcialmente dissolvido em THF (120 ml), tolueno (40 ml) e piridina (2 ml). Foi adicionado tetraacetato de chumbo (7,35 g, 16,6 mmoles) à solução. A solução ficou laranja. A reação foi aquecida ao refluxo. A solução tornou- se incolor com um precipitado branco após 1 hora. A reação foi agitada durante um total de 3 horas, então, filtrada através de um leito de celite, enxaguada com EtOAc e concentrada in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia em coluna 100G KP-Sil 10-100% EtOAc em Hex. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um sólido incolor (3,39 g, 9,19 mmol, 69%). Ta = 1,85 min Método Geral UPLC. Apenas capaz de observar imínio devido à fragmentação do hemiaminal por MS (m/z) [M + H]+ calc. para C18H17N2O3 309,12, encontrado 309,13.
[00356] Substituição de PPTS:
[00357] O substrato (3,39 g, 9,19 mmoles) foi dissolvido em DCM anidro (50 ml). Glicato de benzila (13,05 ml, 91,94 mmoles) foi adicionado seguido por PPTS (231 mg, 0,919 mmol) e a reação foi submetida a refluxo de um dia para o outro. Conversão quase completa observada por UPLC- MS. A mistura de reação foi diluída com EtOAC (200 ml), lavada com água (3 x 200 ml), seca com MgSO4, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia em coluna 10-100% EtOAc em Hex. A fração contendo o produto desejado foi concentrada para render um pó branco (4,30 g, 9,06 mmoles, 99%). Ta = 2,18 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + Na]+ calc. para C27H26N2NaO6 497,17, encontrado 497,06.
[00358] Desproteção de Fmoc:
[00359] O substrato (1,00 g, 2,11 mmoles) foi dissolvido em piperidina a 20% em DMF e agitado durante 20 minutos. A reação foi concentrada in vacuo e usada na etapa seguinte sem purificação adicional.
[00360] Acoplamento de Fmoc-Phe-Osu:
[00361] O produto bruto (2,11 mmoles) da etapa anterior foi dissolvido em DMF (2 ml). DIPEA (0,73 ml, 4,2 mmoles) foi adicionado seguido por Fmoc-Phe-OSu (1,71 g, 3,16 mmoles). A reação foi agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente, então, concentrada in vacuo e purificada por cromatografia em coluna 100G KP-Sil, 10-100% de EtOAc em Hex. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um sólido branco (910 mg, 1,46 mmol, 70%). Ta = 2,28 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + Na]+ calc. para C36H35N3NaO7 644,24, encontrado 644,04.
[00362] Desproteção de Fmoc:
[00363] O substrato (910 mg, 1,46 mmol) foi dissolvido em piperidina a 20% em DMF e agitado durante 20 minutos. A reação foi concentrada in vacuo e usada na etapa seguinte sem purificação adicional. Acoplamento de dipeptídeo de Fmoc: o
[00364] O produto bruto (1,46 mmol) da etapa anterior foi dissolvido em DMF anidro (2 ml). DIPEA (1,00 ml, 5,76 mmoles) e Fmoc-Gly-Gly-OH (1,07 g, 3,02 mmoles) foram adicionados à reação seguido por HATU (1,09 g, 2,88 mmoles). A reação foi agitada durante 30 minutos. A reação foi bruscamente terminada com AcOH e purificada por Prep-HPLC 50 mm 10-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um sólido branco (650 mg, 0,88 mmol, 61%). Ta = 2,13 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + Na]+ calc. para C40H41N5NaO9 758,28, encontrado 758,13.
[00365] Desproteção de Benzil Éster de Pd Catalisado:
[00366] O substrato (650 mg, 0,88 mmol) foi suspenso em 2:1 EtOH:EtOAc (12 ml) e colocado sob atmosfera de nitrogênio. Pd/C (10% em peso, 132 mg, 0,124 mmol) foi adicionado à solução. Hidrogênio foi borbulhado através da reação (1 atm) durante 1 hora. A reação foi filtrada através de celite, enxaguada com MeOH e concentrada in vacuo. Usado na próxima etapa sem purificação adicional.
[00367] Desproteção de Fmoc:
[00368] O sólido bruto (0,88 mmol) da etapa anterior foi dissolvido em DMF (8 ml). Piperidina (2 ml) adicionada. Agitada por 10 minutos. A reação foi concentrada in vacuo para produzir um sólido branco. Usado na próxima etapa sem purificação adicional.
[00369] Acoplamento de MC-OSu:
[00370] O produto bruto (0,88 mmol) da etapa anterior foi dissolvido em DMF (10 ml). DIPEA (1 ml) foi adicionado seguido por MC-OSu (407 mg, 1,32 mmol). A reação foi agitada durante 10 minutos. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. AcOH (1 ml) foi adicionado para arrefecer bruscamente a reação. Purificado por Prep-HPLC 50 mm 10-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um sólido branco (453 mg, 0,735 mmol, 83 %). Ta = 1,21 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C28H37N6O10 617,26, 617,07 encontrado.
[00371] Acoplamento de ligante MC-GGFG-Glicólico com 7-MAD-MDCPT:
[00372] Ácido MC-GGFG-Glicólico (46 mg, 0,075 mmol) foi dissolvido em DMF (0,5 ml). DIPEA (26 μl, 0,149 mmol) foi adicionado seguido por COMU (32 mg, 0,075 mmol). A reação foi agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente. A solução de ácido ativado foi adicionada diretamente ao sólido de fármaco 7-MAD-MDCPT (do Exemplo 4). A conversão completa foi observada por UPLC-MS após 5 minutos. A reação foi bruscamente terminada com AcOH, purificada por Prep-HPLC 10 95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render o produto desejado como um sólido branco (8,00 mg, 7,84 μmoles, 21%). Ta = 1,93 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C50H54N9O15 1020,37, 1020,09 encontrado. Exemplo 2-1 Preparação de MC-Val-Cit-PABA-7-MAD-MDCPT Ex2-1
[00373] Sal de TFA 7-MAD-MDCPT (20,0 mg, 0,0374 mmol) e MC-Val-Cit-PABA-PNP (82,7 mg, 0,112 mmol) foram dissolvidos em DMF anidro (0,5 ml). DIPEA (26 μl, 0,149 mmol) foi adicionado. A conversão completa foi observada por UPLC- MS após 10 minutos. A reação foi bruscamente terminada com AcOH e purificada por Prep-HPLC 21 mm 10-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó branco (2,4 mg, 2,4 μmol, 6%). Ta = 1,59 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C51H58N9O14 1.020,41, 1.020,09 encontrado. Exemplo 3-1 Preparação de MP-PEG4-Val-Lys-7-MAD-MDCPT Ex3-1
Síntese de Peptídeo de Fase Sólida de MP-PEG4-VK(Boc)-OH
[00374] Resina de 2-clorotritila (1,6 mmol/g, 2 gramas) foi adicionada ao vaso de reação e lavada com DMF 2 vezes. A resina foi intumescida em 20 ml de DMF por 10 minutos e, então, drenada. Fmoc-Lys (Boc) -OH (937 mg, 2 mmoles) e DIPEA (0,7 ml, 4 mmoles) dissolvido em 10 ml de DMF foi adicionado à resina e agitado por 30 minutos em temperatura ambiente. MeOH (5 ml) foi adicionado à resina e agitado durante 5 min, então, drenado e lavado com DMF 5 vezes. A substituição foi considerada como sendo 1 mmol/g. A resina foi lavada com DCM 3 vezes, lavada com MeOH 3 vezes, depois seca sob alto vácuo de um dia para o outro. A resina Fmoc-Lys(Boc)-2-clorotritil preparada (1 grama) foi adicionada a um vaso de reação. A resina foi lavada com DMF 3 vezes e intumescida em 10 ml de DMF por 10 minutos, então drenada. O Fmoc foi desprotegido com o uso do procedimento geral desprotegido. Com o uso do procedimento geral de acoplamento Fmoc-Val-OH foi acoplado à resina, seguido pelo procedimento geral de desproteção. MP-PEG4-OH foi acoplado com o uso do procedimento geral de acoplamento. A resina foi, então, lavada com DCM 3 vezes, seguido por MeOH 3 vezes, e colocada sob alto vácuo durante a noite. O peptídeo foi clivado da resina por agitação da resina em uma solução de 1 ml de ácido acético, 2 ml de hexafluoroisopropanol e 7 ml de DCM durante 1 hora. A resina foi, então, filtrada e enxaguada com DCM 3 vezes e, então, a solução foi concentrada in vacuo. O pó branco foi dissolvido em 2:1 DMA:H2O (3 ml) e purificado por HPLC preparativa com o uso de uma coluna de fase reversa 30 x 250 mm Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 80Â com o uso de um gradiente de eluição de 5-60-95% de MeCN (0,05% TFA) em 0,05% TFA aquoso descrito abaixo. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó branco (343 mg, 0,461 mmol, 46%). Ta = 1,50 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C34H57N5O13 744,16, 744,40 encontrado. Eluição de Gradiente 5-60-95%
[00375] Acoplar MP-PEG4-VK(Boc)-OH com Desproteção de 7-MAD-MDCPT e Boc
[00376] MP-PEG4-VK(Boc)-OH (30 mg, 0,040 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (0,5 ml) e DIPEA (50 μl, 0,28 mmol). HATU (15,3 mg, 0,0403 mmol) foi adicionado à solução. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de ácido ativado foi adicionada diretamente ao sólido 7-MAD-MDCPT (17 mg, 0,04 mmol). A reação como monitor para conclusão por UPLC-MS. A conversão completa foi observada após 120 minutos. A reação foi acidificada com AcOH (50 μl, 0,87 mmol) e purificada por HPLC preparativa com o uso de uma coluna de fase reversa 21 x 250 mm Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 80Â com o uso de um gradiente de eluição de 5-60-95% de MeCN (TFA a 0,05%) em TFA 0,05% aquoso descrito anteriormente. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó amarelo (5 mg, 0,0044 mmol, 11%). Ta = 1,70 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C57H75N7O18 1.146,52, 1.147,19 encontrado.
[00377] MP-PEG4-VK(Boc)-7-MAD-MDCPT foi dissolvido em TFA a 20% em DCM. A reação foi monitorada para conclusão por UPLC-MS. Conversão completa após 10 minutos. A reação foi concentrada in vacuo, reconstituída em AcOH a 10% em 2:1 DMA:H2O e purificada por HPLC preparativa com o uso de uma coluna de fase reversa 21 x 250 mm Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 80Â com o uso de uma eluição de gradiente 5-60-95% de MeCN (TFA a 0,05%) em TFA a 0,05% aquoso descrito anteriormente. Foram coletadas frações com absorvância a 385 nm. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render o composto 3-1 como um pó amarelo (2,5 mg, 0,0023 mmol, 55%). Ta = 1,12 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C52H67N7O16 1.046,47, 1.047,26 encontrado. Exemplo 4-1 Preparação de MP-PEG4-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT Síntese de peptídeo de fase sólida de MP-PEG4-VK(Boc)G- OH [5] Glicina não protegida pré-carregada 1,1 mmol/g em resina de 2-clorotritila foi adquirida junto à BAChem. Resina (1 grama) foi adicionada ao vaso de reação. Resina lavada com DMF 4 vezes e drenada completamente. A resina intumesceu por agitação em DMF por 30 minutos e drenou. Com o uso do procedimento geral de acoplamento, Fmoc-Lys(Boc)-OH foi acoplado à resina. O Fmoc foi desprotegido com o uso do procedimento geral de desproteção. Com o uso do procedimento geral de acoplamento Fmoc-Val-OH foi acoplado à resina, seguido pelo procedimento geral de desproteção. MP-PEG4-OH foi acoplado com o uso do procedimento geral de acoplamento. A resina foi, então, lavada com DCM 3 vezes, seguido por MeOH 3 vezes, e colocada sob alto vácuo durante a noite. O peptídeo foi clivado da resina por agitação da resina em uma solução de 1 ml de ácido acético, 2 ml de hexafluoroisopropanol e 7 ml de DCM durante 1 hora. A resina foi, então, filtrada e enxaguada com DCM 3 vezes e, então, a solução foi concentrada in vacuo. O pó branco foi dissolvido em 2:1 DMA:H2O (3 ml) e purificado por HPLC preparativa com o uso de uma coluna de fase reversa 30 x 250 mm Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 8 0Â com o uso de um gradiente de eluição de 5-60-95% de MeCN (0,05% TFA) em 0,05% TFA aquoso descrito abaixo. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó branco (354 mg, 0,442 mmol, 40%). Ta = 1,39 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C36H59N6O14 801,42, 801,02 encontrado. Eluição de Gradiente 5-60-95%
Procedimento de Desproteção de Fmoc Geral
[00378] Uma solução de piperidina a 20% em DMF (10 ml) foi adicionada à resina, agitada por 1 minuto e drenada. Outros 10 ml de piperidina a 20% em DMF foram adicionados à resina, agitados por 30 minutos e drenados. A resina lavada com DMF 4 vezes e drenada completamente.
Procedimento de Acoplamento Geral
[00379] Foi preparada uma solução em DMF (10 ml) de Fmoc Aminoácido (3 mmoles), HATU (3 mmoles), DIPEA (6 mmoles). A solução foi adicionada à resina e agitada durante 60 minutos. O vaso de reação foi drenado e lavado com DMF 4 vezes.
Síntese de MP-PEG4-VK(Boc)G-OSu
[00380] MP-PEG4-VKG-OH (90,0 mg, 0,112 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (0,3 ml) e DIPEA (0,05 ml, 0,302 mmol) foi adicionado. TSTU (67,6 mg, 0,224 mmol) foi adicionado ao vaso de reação, e a conversão para o éster ativado da N-hidroxisuccinimida (OSu) foi monitorada por UPLC-MS. A conversão completa foi observada após 5 minutos. A reação foi acidificada com AcOH (0,05 ml, 0,874 mmol). A reação foi purificada por cromatografia flash Biotage com o uso de coluna de sílica gel 10G Ultra com um gradiente de eluição de MeOH a 0-10% em DCM. As frações contendo o produto desejado foram concentradas in vacuo para produzir um sólido branco que era o produto desejado MP-PEG4-VK(Boc)G-OSu (91,2 mg, 0,102 mmol, 90%). Ta =1,48 Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C40H62N7O16 898,44, 898,33 encontrado.
Acoplar MP-PEG4-VK(Boc)G—OSu com 7-MAD-MDCPT
[00381] Uma solução de 7-MAD-MDCPT (24 mg, 0,057 mmol) dissolvido em DMF anidro (0,48 ml) foi adicionada diretamente ao recipiente de reação com o MP-PEG4-VK(Boc)G-OSu (50 mg, 0,056 mmol). DIPEA (0,05 ml, .303 mmol) foi adicionado ao vaso de reação. A solução amarela transparente tornou-se opaca após a adição de base. A reação foi monitorada para conclusão por UPLC-MS. A conversão completa no produto acoplado desejado foi observada após 5 minutos. A reação foi acidificada com AcOH (0,05 ml, 0,87 mmol) e purificada por filtração através de coluna de gel de sílica com um gradiente de eluição de MeOH a 0-10% em DCM. O eluente foi concentrado in vacuo para render um sólido amarelo que era o produto desejado MP-PEG4-VKG-7-MAD-MDCPT (32 mg, 0,027 mmol, 48%). Ta = 1,59 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C58H77N9O19 1.204,54, 1.204,25 encontrado.
Desproteção de Boc de MP-PEG4-VK(Boc)G-7-MAD-MDCPT
[00382] MP-PEG4-VK(Boc)-G-7-MAD-MDCPT foi dissolvido em TFA a 20% em DCM. A reação foi monitorada para conclusão por UPLC-MS. A conversão completa foi observada após 10 minutos. A reação foi concentrada in vacuo, reconstituída em AcOH a 10% em 2:1 DMA:H2O e purificada por HPLC preparativa com o uso de uma coluna de fase reversa 21 x 250 mm Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 80Â com o uso de uma eluição de gradiente 5-60-95% de MeCN (TFA a 0,05%) em TFA a 0,05% aquoso descrito anteriormente. Foram coletadas frações com absorvância a 385 nm. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render o Composto Ex_4-1 como um pó amarelo (33 mg, 0,030 mmol, 80%). Ta = 1,12 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C53H69N9O17 1104,49, 1.104,70 encontrado. Exemplo 4-2 Preparação de MP-PEG2-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT
[00383] O Composto Ex_4-2 foi sintetizado com o uso do procedimento geral descrito no Exemplo 4-1 PEG4 por PEG2. Exemplo 4-3
Preparação de MP-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT
[00384] O Composto Ex_4-3 foi sintetizado com o uso do procedimento geral descrito no Exemplo 4-1 PEG4 por PEG8. Exemplo 4-4 Preparação de MP-PEG12-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT
[00385] O Composto Ex_4-4 foi sintetizado com o uso do procedimento geral descrito no Exemplo 4-1, substituindo PEG4 por PEG12.
[00386] A Tabela a seguir resume os dados de caracterização para os Compostos Ex_4-2, Ex_4-3 e Ex_4-4. Tabela V.
Exemplo 4-5 Preparação de MP-Lys[(C(O)(CH2CH2O) i2 — CH3)]-Val-Lys-Gly-7- MAD-MDCPT
[00387] Síntese de peptídeo em fase sólida de MP- Lys[(C(O)(CH2CH2O)12-CH3)]-Val-Lys(Boc)-Gly-OH:
[00388] Glicina não protegida pré-carregada 0,87 mmol/g em resina de 2-clorotritila foi adquirida junto à Iris Biotech. Resina (0,287 grama, 0,25 mmol) foi adicionada ao vaso de reação. Resina foi lavada com DMF 3 vezes e drenada completamente. A resina intumesceu por agitação em DMF por 30 minutos e drenou. Com o uso do procedimento geral de acoplamento, Fmoc-Lys(Boc)-OH foi acoplado à resina. O Fmoc foi desprotegido com o uso do procedimento geral de desproteção. Com o uso do procedimento geral de acoplamento Fmoc-Val-OH foi acoplado à resina, seguido pelo procedimento geral de desproteção. Fmoc-Lys(PEG12)-OSu (WO 2015057699) foi acoplado com o uso do procedimento geral de acoplamento sem adição de HATU. O Fmoc foi desprotegido com o uso do procedimento geral de desproteção. O éster N- hidroxisuccinimida do ácido 3-(maleimido) propiônico foi acoplado com o uso do procedimento geral de acoplamento sem a adição de HATU. A resina foi, então, lavada com DCM 3 vezes, seguido por Et2O 3 vezes, e colocada sob alto vácuo durante a noite. O peptídeo foi clivado da resina por agitação da resina em uma solução de 1 ml de ácido acético, 2 ml de trifluoroetanol e 7 ml de DCM durante 1 hora. A resina foi, então, filtrada e enxaguada com DCM 3 vezes e, então, a solução foi concentrada in vacuo. O material cru foi dissolvido em DMSO (2 ml) e purificado por HPLC preparativa usando uma coluna de fase reversa de 21 x 250 mm Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 80Â com o uso de um gradiente de eluição de 5-60-95% de MeCN (ácido fórmico a 0,1%) em ácido fórmico aquoso a 0,1%. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um óleo viscoso. O óleo foi dissolvido em MeCN (2 ml) e precipitado com Et2O. O produto foi coletado por filtração para render um sólido amorfo incolor (170,7 mg, 0,136 mmol, 55%). Ta = 1,32 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C57H102N7O23 1.252,70, 1.252,79 encontrado.
Procedimento de Desproteção de Fmoc Geral
[00389] Uma solução de piperidina a 20% em DMF (5 ml) foi adicionada à resina, agitada por 1 minuto e drenada. Outros 5 ml de piperidina a 20% em DMF foram adicionados à resina, agitados por 30 minutos e drenados. A resina lavada com DMF 4 vezes e drenada completamente.
Procedimento de Acoplamento Geral
[00390] Foi preparada uma solução em DMF (5 ml) de Fmoc Aminoácido (0,75 mmol), HATU (0,75 mmol), DIPEA (1,5 mmol). A solução foi adicionada à resina e agitada durante 60 minutos. O vaso de reação foi drenado e lavado com DMF 4 vezes.
[00391] MP-Lys[(C(O)(CH2CH2O)12-CH3)]-Val-Lys(Boc)- Gly-OH (59,4 mg, 0,0475 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (0,1 ml). DIPEA (12,4 μl, 0,0712 mmol) foi adicionado seguido por TSTU (14,3 mg, 0,0475 mmol). A reação foi agitada durante 10 minutos para permitir a ativação completa do ácido no éster NHS. 7-MAD-MDCPT (10,0 mg, 0,02373 mmol, 100 mg/ml em DMF) foi adicionado à reação. A conversão completa foi observada após 5 minutos. A reação foi bruscamente terminada com AcOH (25 μl) e purificada por prep-HPLC 5-60-95% MeCN em H2O 0,1% TFA. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um sólido amarelo (12,3 mg, 0,00740 mmol, 31%). Ta = 1,56 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C79H118N10O28 1655,82, 1655,89 encontrado.
[00392] O composto foi dissolvido em TFA a 20% A reação foi monitorada para conclusão por UPLC-MS. A conversão completa foi observada após 10 minutos. A reação foi concentrada in vacuo, reconstituída em MeCN a 40% em H2O 0,05% TFA e liofilizada para se obter o composto Ex_4-5 um pó amarelo presumido como o sal de TFA (12,99 mg, 0,00778 mmol, 105,16%). Ta = 1,27 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C74H111N10O26 1555,77, 1555,86 encontrado. Exemplo 5-1 Preparação de MP-PEG4-Gly-Gly-7-MAD-MDCPT
[00393] O peptídeo MP-PEG4-Gly-Gly-OH foi sintetizado por síntese de peptídeo de fase sólida com o uso do seguinte procedimento geral.
Procedimento Geral para Intumescimento:
[00394] Resina de aminoácidos desprotegida (200 mg) pré-carregada 1,1 mmol/g em resina de 2-clorotritila foi adquirida junto à BAChem. A resina foi adicionada ao vaso de reação. A resina foi lavada com DMF (4 x 2 ml) e drenada completamente. A resina foi dilatada por agitação em DMF (2 ml) durante 30 minutos e drenada.
Procedimento de Desproteção de Fmoc Geral
[00395] Uma solução de piperidina a 20% em DMF (2 ml) foi adicionada à resina, agitada por 1 minuto e drenada. Outros 2 ml de piperidina a 20% em DMF foram adicionados à resina, agitados por 30 minutos e drenados. A resina foi lavada com DMF (4 x 2 ml) e drenada completamente.
Procedimento de Acoplamento Geral
[00396] Foi preparada uma solução em DMF (2 ml) de Fmoc Aminoácido (0,6 mmol), HATU (0,6 mmol), DIPEA (0,6 mmol). A solução foi adicionada à resina e agitada durante 60 minutos. O vaso de reação foi drenado e lavado com DMF (4 x 2 ml) e completamente drenado.
Procedimento de Clivagem Geral:
[00397] O peptídeo foi clivado da resina por agitação da resina em uma solução de 1:2:7 AcOH:hexafluoroisopropanol:DCM (5 ml) durante 1 hora. A resina foi, então, filtrada e enxaguada com DCM (3 x 10 ml), e então a solução foi concentrada in vacuo e purificada por HPLC preparativa com o uso de uma coluna de fase reversa de 21 x 250 mm Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 80Â com o uso de um gradiente de eluição 5-60-95% de MeCN (TFA a 0,05%) em TFA a 0,05% aquoso. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó branco.
[00398] Com o uso do procedimento geral para a síntese de peptídeo de fase sólida, o peptídeo MP-PEG4-Gly-Gly-OH foi sintetizado para render um pó branco (45 mg, 0,085 mmol, 42%). Ta = 0,83 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C22H35N4O11 531,23, 530,82 encontrado.
Procedimento de Acoplamento de TSTU
[00399] O peptídeo (45 mg, 0,085 mmol) foi dissolvido em 0,2 ml de DMF. TSTU (28 mg, 0,093 mmol, 1,1 eq) foi adicionado. DIPEA (1,2 eq) foi adicionado e a reação foi agitada 30 minutos. A reação foi bruscamente terminada AcOH. Purificada por FCC 0-10% MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um pó branco (10 mg, 0,016 mmol, 19%). Ta = 0,96 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C26H38N5O13 628,25, 627,94 encontrado. [6] 7-MAD-MDCPT (1,1 eq) 20 mg/ml em DMF foi adicionado a peptídeo de éster NHS diretamente. DIPEA foi adicionado (18 μl, 0,10 mmol, 1,2 eq) e agitado durante 30 minutos. A reação foi bruscamente terminada com AcOH e purificada por prep-HPLC. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó branco. Ta = 1,25 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C44H52N7O16 934,35, 934,52 encontrado.
Procedimento de Desproteção Geral
[00400] Ligantes de fármaco à base de peptídeo com grupos de proteção lábeis a ácidos foram dissolvidos em TFA a 20% em DCM (2 ml) e agitados durante 30 minutos. A reação foi concentrada in vacuo.
[00401] Os compostos 5-1a a 5-1s foram sintetizados com o uso do procedimento geral relatado para o Exemplo 5- 1. A parte de fármaco em cada exemplo é de Fórmula CPT5, ligada através de uma ligação N no nitrogênio aminometil como mostrado para o Exemplo 5-1. Tabela VI. Exemplo 6-1 Preparação de MC-Gly-Gly-Phe-Gly-7-NHCH2OCH2—MDCPT Síntese de peptídeo de fase sólida de MC-Gly-Gly-Phe-OH
[00402] Fenilalanina não protegida pré-carregada 1,1 mmol/g em resina de 2-clorotritila foi adquirida junto à BAChem. Resina (1 grama) foi adicionada ao vaso de reação. Resina lavada com DMF 4 vezes e drenada completamente. A resina foi intumescida por agitação em DMF por 30 minutos e drenada. Com o uso do procedimento geral de acoplamento, Fmoc-Gly-OH foi acoplado à resina. O Fmoc foi desprotegido com o uso do procedimento geral de desproteção. Com o uso do procedimento geral de acoplamento Fmoc-Gly-OH foi acoplado à resina, seguido pelo procedimento geral de desproteção. MC-OH foi acoplado com o uso do procedimento geral de acoplamento. A resina foi, então, lavada com DCM 3 vezes, seguido por MeOH 3 vezes, e colocada sob alto vácuo durante a noite. O peptídeo foi clivado da resina por agitação da resina em uma solução de 1 ml de ácido acético, 2 ml de hexafluoroisopropanol e 7 ml de DCM durante 1 hora. A resina foi, então, filtrada e enxaguada com DCM 3 vezes e a solução foi concentrada in vacuo. O sólido branco foi purificado por HPLC preparativa com o uso de uma coluna de fase reversa 30 x 250 mm Phenomenex Max-RP 4 μm Synergi 80Â com o uso de um gradiente de eluição 5-60-95% de MeCN (TFA a 0,05%) em TFA a 0,05% aquoso. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó branco (207 mg, 0,438 mmol, 44%). Ta = 1,28 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C23H29N4O7 473,20, 473,00 encontrado. Preparação de FmocGly-7-NHCH2OCH2~MDCPT
[00403] O substrato (52 mg, 0,014 mmol) foi dissolvido em DCM (1 ml). TMSCl (0,25 ml) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada durante 20 minutos e depois concentrada in vacuo. O produto cru foi usado imediatamente na próxima etapa.
[00404] O ligante ativado da etapa anterior foi dissolvido em DCM anidro (1 ml) e adicionado diretamente ao sólido 7-BAD-MDCPT (20,0 mg, 0,0474 mmol). O recipiente de reação foi vedado e agitado a 60 °C durante 24 horas. A reação foi bruscamente terminada com MeOH e concentrada in vacuo. O produto cru foi purificado por cromatografia em coluna 10G Biotage Ultra 0-10% MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado e impureza de fármaco livre foram concentradas in vacuo para produzir um sólido amarelo (25 mg, 50% de pureza 0,017 mmol, 36%). Ta = 1,77 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C40H35N4O10 731,24, 731,07 encontrado.
[00405] O substrato (0,017 mmol) foi dissolvido em piperidina 20% em DMF (1 ml). A reação foi agitada durante 5 minutos e depois concentrada in vacuo. A reação foi purificada por Prep-HPLC 21 mm 10 a 95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um sólido amarelo (5,2 mg, 0,010 mmol, 60%). Ta = 1,02 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C25H24N4O8 509,17, 509,00 encontrado.
[00406] MC-GGFG-OH (14,5 mg, 0,0307 mmol) foi dissolvido em DMF (0,5 ml). DIPEA (9 μl, 0,05 mmol) foi adicionado seguido por TSTU (9,3 mg, 0,031 mol). A reação foi agitada durante 5 minutos. Conversão completa no produto éster NHS observada por UPLC-MS. A solução de NHS éster ativada foi adicionada diretamente ao sólido de Fármaco-Gly. A conversão completa observada por UPLC-MS após 5 minutos. A reação foi bruscamente terminada com AcOH e purificada por prep-HPLC. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó amarelo (3,30 mg, 3,43 μmol, 34%). Ta = 1,53 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C48H51N8O14 963,35, 963,14 encontrado. Exemplo 7-1 Preparação de MP-PEG4-Val-Lys-PABA-7-MAD-MDCPT EEDQ acoplamento Fmoc-Lys(Boc)-PABA
[00407] Fmoc-Lys(Boc)-OH (500 mg, 1,07 mmol) suspenso em 1 ml de DCM e agitado. EEDQ (528 mg, 2,13 mmoles) adicionado seguido por PABA (263 mg, 2,13 mmoles). Os reagentes tornaram-se solúveis após 1 minuto e, então, precipitaram da mistura após 10 minutos. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. Precipitado filtrado e lavado com DCM (3 x 50 ml). O produto desejado foi obtido como um sólido branco (612 mg, 1,07 mmol, quantitativo). Usado na próxima etapa sem purificação adicional. Ta = 2,08 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C33H40N3O6 574,29, 574,28 encontrado. Desproteção
[00408] O substrato (612 mg, 1,07 mmol) foi dissolvido em 5 ml de piperidina a 20% em solução de DMF. A reação foi agitada durante 10 minutos à temperatura ambiente. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi concentrada in vacuo e usada na etapa seguinte sem purificação adicional. Ta = 0,80 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C18H30N3O4 352,22, 351,69 encontrado. Acoplamento de Fmoc-Val-OSu
[00409] O substrato cru (1,07 mmol) da etapa anterior foi dissolvido em DMF (2 ml). Fmoc-Val-OSu (581 mg, 1,33 mmol) adicionado seguido por DIPEA (0,37 ml, 2,13 mmoles) e agitado durante 30 minutos. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi bruscamente terminada com AcOH, concentrada in vacuo e purificada por FCC 100G KP- Sil 0 a 10% MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render um sólido branco (716 mg, 1,06 mmol, 99%). Ta = 2,12 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C38H49N4O7 673,36, 673,31 encontrado. Desproteção
[00410] O substrato (716 mg, 1,06 mmol) foi dissolvido em 5 ml de piperidina a 20% em solução de DMF. A reação foi agitada durante 10 minutos à temperatura ambiente. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi concentrada in vacuo e usada na etapa seguinte sem purificação adicional. Ta = 0,94 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C23H39N4O5 451,29, 450,72 encontrado. Acoplamento de MP-PEG4-Osu
[00411] O substrato cru (1,06 mmol) da etapa anterior foi dissolvido em DMF (1 ml). MP-PEG4-OSu (1,09 mg, 2,13 mmol) foi adicionado seguido por DIPEA (0,55 ml, 3,19 mmoles) e agitado durante 30 minutos. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. A mistura de reação crua foi usada na próxima etapa. Ta = 1,40 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C41H65N6O13 849,46, 849,06 encontrado. Ativação de PNP
[00412] À mistura de reação crua do anterior foi adicionado carbonato de bis-nitrofenol (969 mg, 3,19 mmoles). A reação foi agitada durante 30 minutos. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi bruscamente terminada com AcOH e purificada por Prep-HPLC 50 mm 10-50 70-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram concentradas in vacuo com o uso do método HPLC lio no Genevac. As frações concentradas renderam um sólido branco (621 mg, 0,612 mmol, 58%). Ta = 1,26 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C48H68N7O17 1.014,47, 1.014,25 encontrado. Acoplamento de 7-MAD-MDCPT
[00413] 7-MAD-MDCPT (10 mg, 24 mmol) dissolvido em 50 mg/ml em DMF adicionado diretamente ao ligante ativado (93 mg, 0,092 mmol). DIPEA (0,047 ml, 36 mmoles) foi adicionado e a reação foi agitada. A reação foi observada progredindo lentamente para o produto após 10 minutos. Para acelerar a reação, foi adicionada uma quantidade catalítica de DMAP (0,01 mg). A conversão completa foi observada por UPLC-MS após 30 minutos. A reação foi bruscamente terminada com AcOH e purificada por Prep-HPLC 21 mm 10-36-54-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó amarelo (22,4 mg, 17,3 μmol, 72,5%). Ta = 1,66 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C64H82N9O20 1.296,57, 1.296,54 encontrado.
[00414] O substrato (3,5 mg, 2,7 μmoles) foi dissolvido em TFA a 10% em DCM (2 ml). Deixou-se agitar por 10 minutos, ponto em que a conversão quase completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi diluída com MeOH (2 ml) e concentrada in vacuo. Reconstituída em 0,3 ml de DMSO. Nenhuma degradação do produto foi observada após a concentração. A reação foi purificada por Prep-HPLC 10 mm 5 25-41-95 % MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó amarelo (1,9 mg, 1,6 μmol, 59%). Ta = 1,22 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C59H74N9O18 1.196,52, 1.196,23 encontrado.
Exemplo 8-1
[00415] Nos Exemplos e Tabelas Biológicas a seguir, os compostos de comparação nesse exemplo foram preparados e usados para avaliação. A estrutura para esses compostos de comparação é fornecida como:
Exemplo 9-1 Preparação de MP-PEG4-Val-Lys-7-NH(CH2CH2O)2CH2CH2NHCH2-MDCPT
[00416] Peptídeo MP-PEG4-VK(Boc)-OH (10,0 mg, 0,0181 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (0,2 ml). DIPEA (6,3 μl, 0,036 mmol) foi adicionado seguido por TSTU (5,99 mg, 0,0199 mmol). O ácido foi deixado ativar o éster NHS por 20 minutos. O fármaco (composto 5y) em 0,1 ml de DMF foi adicionado à reação. A conversão completa foi observada por UPLC-MS após 5 minutos. A reação foi bruscamente terminada com AcOH (10 μl) e purificada por Prep-HPLC 21 x 250 mm 5-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó amarelo (11,62 mg, 9,09 μmoles, 50%).
[00417] O substrato (11,62 mg, 9,09 μmoles) foi dissolvido em TFA a 20% em DCM (2 ml). A conversão completa no produto desprotegido foi observada por UPLC-MS após 10 minutos. A reação foi concentrada in vacuo e purificada por HPLC preparativa 10 x 250 mm MaxRP 5-60-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render um pó amarelo (2,96 mg, 2,51 μmoles, 28%). Preparação de MP-PEG4-Val-Lys-Gly-7-NH(CH2CH2θ) 2CH2CH2NHCH2- MDCPT
[00418] O Composto Ex_9-1b foi sintetizado com o uso do procedimento geral descrito acima para a preparação do Composto Ex_9-1a.
[00419] A Tabela a seguir resume os dados de caracterização para os Compostos Ex_9-1a e Ex_9-1b. Tabela VII. Exemplo 10-1 Preparação de mDPR-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT Ex10-1a Síntese de peptídeo de fase sólida de Fmoc-VK(Boc)G-OH:
[00420] Glicina não protegida pré-carregada 0,87 mmol/g em resina de 2-clorotritila foi adquirida junto à Iris Biotech. Resina (2 gramas) foi adicionada ao vaso de reação. A resina foi intumescida com DCM por 30 minutos, lavada com DMF 3 vezes e drenada completamente. Com o uso do procedimento geral de acoplamento, Fmoc-Lys(Boc)-OH foi acoplado à resina. O Fmoc foi desprotegido com o uso do procedimento geral de desproteção. Com o uso do procedimento geral de acoplamento, Fmoc-Val-OH foi acoplado à resina. A resina foi, então, lavada com DCM 3 vezes, seguido por Et2O 3 vezes, e seca sob vácuo. O peptídeo foi clivado da resina por agitação da resina em uma solução de 4 ml de ácido acético, 8 ml de trifluoroetanol e 28 ml de DCM durante 1 hora. A resina foi, então, filtrada e enxaguada com DCM 3 vezes e, então, a solução foi concentrada in vacuo. O resíduo cru foi dissolvido com 2 ml de MeCN e precipitado com 100 ml de Et2O. O precipitado foi coletado por filtração para render um pó branco (738,6 mg, 1,180 mmol, 68%). Ta = 2,06 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C33H45N4O8 625,32, 625,30 encontrado.
Procedimento de Desproteção de Fmoc Geral
[00421] Uma solução de piperidina a 20% em DMF (20 ml) foi adicionada à resina, agitada por 1 minuto e drenada. Outros 20 ml de piperidina a 20% em DMF foram adicionados à resina, agitados por 30 minutos e drenados. A resina lavada com DMF 4 vezes e drenada completamente.
Procedimento de Acoplamento Geral
[00422] Foi preparada uma solução em DMF (20 ml) de Fmoc Aminoácido (5 mmol), HATU (5 mmol), DIPEA (5 mmol). A solução foi adicionada à resina e agitada durante 60 minutos. O vaso de reação foi drenado e lavado com DMF 4 vezes.
[00423] Peptídeo Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-OH (7,386 mg, 1,180 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (4 ml). TSTU (373,7 mg, 1,24 mmol) foi adicionado seguido por DIPEA (0,31 ml, 1,77 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos, ponto em que a conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi bruscamente terminada com AcOH (0,20 ml). A reação foi diluída com EtOAC (100 ml), lavada com H2O (3 x 100 ml), seca com MgSO4, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo foi ressuspenso em uma quantidade mínima de DCM (5 ml) e precipitado com hexanos (100 ml). O precipitado foi coletado por filtração e seco sob vácuo para obter o produto desejado Fmoc-Val-Lys(Boc)- Gly-OSu como um pó branco (759,7 mg, 1,05 mmol, 89%). Ta = 2,12 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C37H48N5O10 722,34, 722,39 encontrado.
[00424] 7-MAD-MDCPT (50,0 mg, 0,118 mmol) foi dissolvido em DMF anidro (1 ml). Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-OSu (129 mg, 0,178 mmol) foi adicionado seguido por DIPEA (0,041 ml, 0,24 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 5 minutos, ponto em que a conversão completa em produto desejado foi observada por UPLC-MS. A reação foi concentrada in vacuo e purificada por FCC 10G Biotage Ultra 0-6% MeOH em DCM. As frações contendo o produto desejado foram concentradas in vacuo para render o produto desejado Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT como um sólido castanho (97,9 mg, 0,0953 mmol, 80%). Ta = 2,07 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C56H63N6O13 1028,44, 1028,22 encontrado.
[00425] Fmoc-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT (97,9 mg, 0,0953 mmol) foi dissolvido em piperidina a 20% em DMF. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos. Conversão completa no produto desprotegido de Fmoc foi observada por UPLC-MS. A reação foi concentrada in vacuo para render o H-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT desejado como um sólido castanho, que foi dissolvido em DMF anidro (0,5 ml). Fmoc-PEG8-NHS (90,6 mg, 0,119 mmol, Broadpharm: BP- 21634, CAS: 1334170-03-4) foi adicionado à reação seguido por DIPEA (0,025 ml, 0,143 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos, ponto em que a conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi bruscamente terminada com AcOH (0,025 ml) e purificada por prep-HPLC 21 x 250 mm Max-RP 5-40-95% MeCN em H2O 0,1% TFA em ácido fórmico. As frações contendo o produto desejado foram concentradas para render o produto desejado Fmoc-PEG8- Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT como um sólido castanho (53,2 mg, 0,0367 mmol, 38% ao longo de 2 etapas). Ta = 1,32 min Método Hidrofóbico UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C74H99N8O22 1.451,69, 1.452,15 encontrado.
[00426] Fmoc-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT (53,2 mg, 0,0367 mmol) foi dissolvido em piperidina a 20% em DMF. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 10 minutos, ponto em que a conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi concentrada in vacuo para render H- PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT como um sólido castanho. Uma solução 0,0367 M em DMF anidro do produto cru foi preparada e usada como um reagente na próxima etapa para formar análogos de maleimida. NHBoc NHBoc
[00427] O H-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT cru 0,0367 M em DMF (0,50 ml, 0,018 mmol) foi resfriado com um banho de gelo/água. MDPR(Boc)-OH (15,6 mg, 0,0550 mmol, CAS: 1491152-23-8, preparação descrita no documento WO 2013173337), e COMU (23,6 mg, 0,0550 mmol) foram adicionados à reação, seguido por 2,6-lutideno (12,8 μl, 0,110 mmol). A reação foi deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada de um dia para o outro (15 horas). A conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi bruscamente terminada por AcOH (0,020 ml) e purificada por prep-HPLC 10 x 250 mm Max-RP 5-60-95% MeCN em H2O 0,1% Ácido Fórmico. As frações contendo o produto desejado foram concentradas in vacuo para render mDPR(Boc)-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD- MDCPT como um sólido amarelo (13,4 mg, 8,97 μmoles, 49%). Ta = 1,71 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C71H103N10O25 1.495,71, 1.495,04 encontrado.
[00428] MDPR(Boc)-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT (13,4 mg, 8,97 μmoles) foi dissolvido em TFA a 20% em DCM e agitado por 10 minutos. A conversão completa foi observada por UPLC-MS. A reação foi concentrada in vacuo e purificada por HPLC preparativa 10 x 250 mm Max-RP 5-30-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render mDPR-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT (Composto Ex_10-1a) como um sólido amarelo que foi presumido ser o sal de TFA duplo (13,4 mg, 8,77 μmoles, 98%). Ta = 1,06 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + Na]+ calc. para C61H86N10NaO21 1.317,59, encontrado 1.317,50. Preparação de MC-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT
[00429] Ao H-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT cru (a partir do procedimento acima para a preparação do composto Ex_10-1a) 0,0367M em DMF (0,50 ml, 0,018 mmol) foi adicionado MCOSu (17,0 mg, 0,0550 mmol, TCI America: S0428, CAS: 55750 63-5), seguido por DIPEA (9,6 μl, 0,055 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 5 minutos, ponto em que a conversão completa foi observada. A reação foi bruscamente terminada por AcOH (0,02 ml) e purificada por prep-HPLC 10 x 250 mm Max-RP 5-60-95% MeCN em H2O 0,1% Ácido Fórmico. As frações contendo o produto desejado foram concentradas in vacuo para render MC-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly- 7-MAD-MDCPT como um sólido amarelo (17,4 mg, 18,3 μmoles, 67%). Ta = 1,63 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C69H100N9O23 1.422,69, 1.422,27 encontrado.
[00430] MC-PEG8-Val-Lys(Boc)-Gly-7-MAD-MDCPT (17,4 mg, 12,2 μmoles) foi dissolvido em TFA a 20% em DCM e agitado por 20 minutos. A conversão completa foi observada por UPLC- MS. A reação foi concentrada in vacuo e purificada por HPLC preparativa 10 x 250 mm Max-RP 5-40-95% MeCN em H2O 0,05% TFA. As frações contendo o produto desejado foram liofilizadas para render MC-PEG8-Val-Lys-Gly-7-MAD-MDCPT (Composto Ex_10-1b) como um sólido amarelo que foi presumido ser o sal de TFA (16,54 mg, 11,52 μmoles, 94%). Ta = 1,27 min Método Geral UPLC. MS (m/z) [M + H]+ calc. para C64H92N9O21 1.322,64, encontrou 1.322,15.
Método de Conjugação de Camptotecina
[00431] Os ADCs total ou parcialmente reduzidos foram preparados em mistura de propileno glicol (PG) 1X PBS a 50%. Metade da porção de PG foi adicionada ao mAb reduzido, e metade PG foi adicionada ao estoque de fármaco-ligante de camptotecina DMSO 1 mM. A mistura PG/fármaco-ligante foi adicionada ao mAb reduzido em porções de 25%. Após a adição de fármaco-ligante estar completa, o excesso de fármaco- ligante foi removido por tratamento com carvão ativado (1 mg de carvão para 1 mg de mAb). O carvão foi, então, removido por filtração e o ADC resultante foi trocado por tampão com o uso de uma coluna NAP5 ou PD10, em trealose a 5% em 1X PBS pH 7,4.
Exemplos Biológicos Avaliação de ADC e Pequena Molécula in vitro
[00432] A potência in vitro foi avaliada em várias linhas de células cancerosas. Todas as linhas de células foram autenticadas por perfil de STR no IDEXX Bioresearch e cultivadas por não mais do que 2 meses após a ressuscitação. As células cultivadas em crescimento de fase logarítmica foram semeadas por 24 horas em placas de 96 poços contendo 150 μl de RPMI 1640 suplementado com FBS a 20%. Diluições em série de conjugados de anticorpo-fármaco em meios de cultura de células foram preparadas em 4x concentrações de trabalho e 50 μl de cada diluição foram adicionados às placas de 96 poços. Após a adição dos artigos de teste, as células foram incubadas com artigos de teste durante 4 dias a 37 °C. Após 96 horas, a inibição do crescimento foi avaliada por CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) e a luminescência foi medida em um leitor de placas. O valor IC50, determinado em triplicado, é definido aqui como a concentração que resulta em 50% de redução no crescimento celular em relação aos controles não tratados.
[00433] Nas tabelas a seguir, os valores IC50 para ADCs e fármacos livres de CPT são dados em concentrações de ng/ml e mmol/ml, respectivamente, com os valores entre parênteses representando a porcentagem de células restantes na concentração mais alta testada (1.000 ng/ml para ADCs e 1 μM para composto livre de CPT, a menos que indicado de outra forma) em relação a células não tratadas. A viabilidade celular foi determinada por coloração CellTiter-Glo após 96h de exposição a ADC. ND = Não Determinado. Ag1 é um anticorpo que visa um antígeno ubíquo e prontamente internalizável em células cancerosas, Ag2 é um anticorpo cAC10 direcionado a células cancerosas CD30(+), Ag3 é um anticorpo h1F6 direcionado a células cancerosas CD70(+), Ag4 é um anticorpo hMEM102 direcionado a células cancerosas CD48(+) , Ag5 é um anticorpo h20F3 direcionado a células cancerosas que expressam NTB-A e h00 é um anticorpo de controle de não ligação.
[00434] Tabelas 1A-1D. Potência in vitro (valores IC50) de ADCs camptotecina (DAR = 8). A. ADCs anti-Ag1 direcionados às células de carcinoma renal (786-O), células de câncer pancreático (BxPC3), células de carcinoma hepático (HepG2), células de leucemia promielocítica aguda (HL-60), células de linfoma de Hodgkin (L540cy), células de mieloma múltiplo (MM.1R), células de leucemia mieloide aguda (MOLM13), células de linfoma de Burkitt (Ramos), células de melanoma (SK-MEL-5) e células cancerosas de linfócitos B (SU-DHL-4 e U266), B. ADCs anti-Ag2 direcionados a células de linfoma de Hodgkin (DEL e L540cy) e células de linfoma não Hodgkin (Karpas 299), que são antígeno positivas, com teste contra células de carcinoma renal (786-O), que são antígeno negativas, C. ADCs anti-Ag3 direcionados às células de carcinoma renal (786-O, Caki-1 e UM-RC-3) e células de linfoma de Burkitt (Raji), e ADCs anti-Ag4 e ADCs anti-Ag5 direcionados às células de mieloma múltiplo (EJM, KMM-1, MM.1R) e células cancerosas de linfócitos B (NCI-H929 e U- 266), que são antígeno positivas, com teste contra uma linha de células de linfoblastos antígeno negativas (TF-1a). Ex_8- 1a se refere a Ag1-MC-GGFG-NHCH2-DXd(1) e Ex_4-1 se refere a MP-PEG4-VKG-7-MAD-MDCPT. Tabela 1A. ADCs Anti-Ag1
[00435] Tabela 1B. ADCs Anti-Ag2
[00436] Tabela 1C. ADCs Anti-Ag3
[00437] Tabela 1D. ADCs Anti-Ag4 e ADCs anti-Ag5 Atividade diferencial nas linhas de células CD30+ DEL parental e CD30/MDR + DEL-BVR
[00438] Tabela 2. Atividade diferencial da camptotecina Ag2-Ex_4-1 (DAR = 8) nas linhas de células CD30+ DEL parental e CD30/MDR + DEL-BVR. A linha de células de linfoma DEL parental foi cultivada na presença de brentuximabe vedotina para induzir a superexpressão do fenótipo MDR, resultando na linha DEL brentuximabe resistente a vedotina (DEL-BVR). Brentuximabe vedotina, que é Ag2-vc-MMAE (DAR = 4), foi incluído como controle. Ex4-1 se refere a MP-PEG4-VKG-7- MAD-MDCPT.
Níveis de Agregação
[00439] Tabela 3. Níveis de agregação de ADC para fármaco-ligantes de camptotecina à base de peptídeo (DAR = 4). A agregação de ADC foi determinada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Níveis mais baixos de agregação foram observados quando sequências de peptídeos hidrofílicos e/ou unidades PEG4 foram incluídas em construtos de fármaco- ligantes de camptotecina à base de peptídeos. Tabela 3 • DAR inferior a 4
[00440] Tabela 4. A potência in vitro (valores de IC50) de ADCs DAR4 anti-Ag1 de camptotecina à base de peptídeo contra várias linhas de células de câncer demonstram potência dependente da sequência.
[00441] Tabela 4A. células de câncer renal (786-O), células de câncer pancreático (BxPC3), células de câncer hepático (HepG2) e células de leucemia promielocítica aguda (HL-60).
[00442] Tabela 4B. células de leucemia promielocítica aguda resistentes a múltiplos fármacos (HL-60/RV), células de linfoma de Hodgkin (L540cy), células de mieloma múltiplo (MM.R1) e células de leucemia mieloide aguda (MOLM13).
[00443] Tabela 4C. Células de linfoma de Burkitt (Ramos), células de melanoma (SK-MEL-5) e células cancerosas de linfócitos B (SU-DHL-4 e U266). Tabela 4A
[00444] Tabela 5. Avaliação de ADCs anti-Ag1 de camptotecina à base de peptídeo selecionados (DAR = 8) variando em hidrofobicidade contra várias linhas de células de câncer
[00445] Tabela 5A. células de câncer renal (786-O), células de câncer pancreático (BxPC3), células de câncer hepático (HepG2), células de leucemia promielocítica aguda MDR(-) e MDR(+) (HL-60 e HL60/RV, respectivamente) e células de linfoma de Hodgkin (L540cy).
[00446] Tabela 5B. células de mieloma múltiplo (MM.R1), células de leucemia mieloide aguda (MOLM13), células de linfoma de Burkitt (Ramos), células de melanoma (SK-MEL-5) e células cancerosas de linfócitos B (SU-DHL-4 e U266). Tabela 5A
[00447] Tabela 6. Avaliação in vitro de camptotecina à base de peptídeo (DAR = 8) direcionada a várias células cancerosas que expressam Ag1 em comparação com ADCs de controle de não ligação (h00)
[00448] Tabela 6A. células de câncer renal (786-O), células de câncer pancreático (BxPC3), células de câncer hepático (HepG2), células de leucemia promielocítica aguda MDR(-) e MDR(+) (HL-60 e HL60/RV, respectivamente) e células de linfoma de Hodgkin (L540cy).
[00449] Tabela 6B. células de mieloma múltiplo (MM.R1), células de leucemia mieloide aguda (MOLM13), células de linfoma de Burkitt (Ramos), células de melanoma (SK-MEL-5) e células cancerosas de linfócitos B (SU-DHL-4 e U266). Tabela 6A
[00450] Tabela 7. Potência citotóxica de compostos de camptotecina como fármacos livres.
[00451] Tabela 7A. células de câncer renal (786-O), células de câncer pancreático (BxPC3), células de câncer hepático (HepG2), células de leucemia promielocítica aguda MDR(-) e MDR(+) (HL-60 e HL60/RV, respectivamente), células de linfoma de Hodgkin (L540cy) e células de mieloma múltiplo (MM.1R).
[00452] Tabela 7B. células de leucemia mieloide aguda (MOLM-13), células de linfoma de Burkitt (Ramos), células de melanoma (SK-MEL-5) e células cancerosas de linfócitos B (SU-DHL-4 e U266).
[00453] + + + + IC50 entre 0,1 a < 1 nM, + + + IC50 entre 1 a <10 nM, ++ IC50 entre > 10 nM a d 100 nM, + IC50 entre > 100 nM a < 1.000 nMm, | IC50 > 1.000 nM. Tabela 7ª
Métodos de Modelo in vivo
[00454] Todos os experimentos foram conduzidos em concordância com o Animal Care and Use Committee em uma instalação totalmente credenciada pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. Os experimentos de eficácia foram conduzidos nos modelos de xenoenxertos 786-O, L540cy e Karpas/Karpas-BVR, DelBVR, Karpas 299, L428, DEL-15 e L82. As células tumorais, como uma suspensão celular, foram implantadas subcutâneas em SCID imunocomprometidos ou em camundongos nus. Após o enxerto do tumor, os camundongos foram randomizados para grupos de estudo (5 camundongos por grupo) quando o volume médio do tumor atingiu cerca de 100 mm3. O ADC ou controles foram administrados uma vez por meio de injeção intraperitoneal. O número médio de fármaco-ligante ligado a um anticorpo é indicado entre parênteses ao lado do ADC (também referido aqui como número de razão fármaco-anticorpo (DAR), por exemplo, DAR4, DAR8, etc.). O volume do tumor em função do tempo foi determinado com o uso da Fórmula (C x L2)/2. Os animais foram sacrificados quando os volumes do tumor atingiram 750 mm3. Os camundongos que apresentam regressões duráveis foram encerrados após 10 a 12 semanas após o implante.
[00455] Os animais foram implantados com células L540cy. Após 7 dias, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio de tumor de 100 mm3 e, então, tratados com uma única dose de ADC camptotecina cAC10-Ex_8-1a (4) ou cAC10-Ex_4-1 (4), a 3 ou 10 mg/kg. Em outro experimento, tratado com uma dose única de camptotecina ADC cAC10-Ex_4-1 (8) ou cAC10-Ex_4-3 (8), a 1 ou 3 mg/kg. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados nas Figuras 1A a 1B.
[00456] Os animais foram implantados com células 786- O. No dia 10, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio de tumor de 100mm3 e, então, tratados com uma única dose de ADC camptotecina cAC10-Ex_8-1a (4) ou cAC10-Ex_4-1 (4), a 10 mg/kg. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados na Figura 2.
[00457] Os animais foram implantados com uma mistura 1:1 de células CD30+ Karpas299 e CD30- resistentes a Karpas299-brentuximabe vedotina (Karpas299-BVR). Após 8 dias, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio de tumor de 100 mm3 e, então, tratados com uma única dose de ADC camptotecina cAC10-Ex_8-1a (4) ou cAC10-Ex_4-1 (4), a 10 mg/kg. Em outro experimento, os animais foram tratados com uma dose única de camptotecina ADC cAC10-Ex_8- 1a (8), cAC10-Ex_4-1 (8) ou cAC10-Ex_4-3 (8), a 3 ou 10 mg/kg. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados nas Figuras 3A-3C.
[00458] Os animais foram implantados com células DelBVR. No dia 7, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio de tumor de 100 mm3 e, então, tratados com uma dose única de camptotecina ADC cAC10-Ex_4-1(8), cAC10-Ex_4-3(8), cAC10-Ex_4- 4(8), ou cAC10-Ex_4-5(8), a 0,3 ou 1 mg/kg. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados na Figura 4.
[00459] Os animais foram implantados com células DelBVR. No dia 7, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio de tumor de 100 mm3 e, então, tratados com uma dose única de ADC camptotecina cAC10-Ex_4-1(4) ou cAC10-Ex_4-1(8), em 1 ou 2 mg/kg, ou com uma dose única de camptotecina ADC cAC10-Ex_4-3(4) ou cAC10-Ex_4-3(8), a 0,6 ou 1 mg/kg. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados na Figura 5.
[00460] Os animais foram implantados com células Karpas299. Após 7 dias, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio de tumor de 100 mm3 e, então, tratados com uma única dose de controle não ligante h00- Ex_4-3 (8), ou camptotecina ADC cAC10-Ex_4-3(8), a 1, 3 ou 10 mg/kg com dose única ou multidose. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados na Figura 6.
[00461] Os animais foram implantados com células L428. Após 7 dias, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio de tumor de 100 mm3 e, então, tratados com camptotecina ADC cAC10-Ex_4-3 (8), a 1, 3 ou 10 mg/kg com dose única ou multidose. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados na Figura 7.
[00462] Os animais foram implantados com células DEL- 15. Após 7 dias, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio do tumor de 100 mm3 e, então, tratados com uma dose única de camptotecina ADC cAC10-Ex_4-3(8), a 0,1, 0,3 ou 1 mg/kg. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados na Figura 8.
[00463] Os animais foram implantados com células L82. Após 7 dias, os animais foram classificados em grupos com um tamanho médio do tumor de 100 mm3 e, então, tratados com uma dose única de camptotecina ADC cAC10-Ex_4-1(8), a 1 mg/kg. Os animais foram avaliados quanto ao tamanho do tumor e sinais de vida durante o curso do estudo. Os resultados são mostrados na Figura 9.
[00464] Os dados nas Figuras 1 a 9 mostraram ADCs cAC10-Ex_4-1, cAC10-Ex_4-3, cAC10-Ex_4-4 e cAC10-Ex_4-5 ADCs todos exibiram atividades antitumorais in vivo nos modelos testados. Os dados nas Figuras 1 a 9 também mostraram que cAC10-Ex_4-1 e cAC10-Ex_4-3 ADCs exibiram potência in vivo melhorada em comparação com ADC cAC10-Ex_8-1a, incluindo atividade melhorada no modelo de espectador Karpas/Karpas BVR (como mostrado na Figura 3A-3C).
Determinação de Estabilidade de Plasma de ADC
[00465] Todos os estoques de ADC foram normalizados para 2,5 mg/ml. As alíquotas de 2,5 ml de uso único de camundongo citratado (Balb C) foram armazenadas a -80 °C antes do uso. Uma solução estoque em ADC em plasma de camundongo foi produzida da seguinte maneira. ADC (50 μg) em 200 μl de plasma (por ponto no tempo, 0,25 mg/ml) com concentração de PBS final a 13,85. As amostras de plasma foram incubadas a 37 graus Celsius por 6 h, 1 dia, 3 dias e 7 dias, e foram amostradas em duplicata. Após cada ponto no tempo, as amostras foram armazenadas a -80 graus Celsius até serem processadas para análise. Foi preparada uma pasta aquosa a 50% de IgSelect em 1XPBS. Para cada amostra de ponto de tempo, 50 μl da pasta de IgSelect foram adicionados a uma placa de filtro de 3 uM e vácuo foi aplicado para remover o sobrenadante. A resina foi lavada (2X1 ml 1X PBS), com vácuo aplicado após cada lavagem. A amostra (180 ul) foi aplicada, e a placa de filtro foi agitada (1.200 rpm por 1 h a 4 graus Celsius. O vácuo foi, então, aplicado para remover o plasma. A resina foi lavada com 1 ml de PBS + NaCl 50 mM, 1 ml de PBS e com 1 ml de água, com vácuo sendo aplicado após cada lavagem. A placa de amostra foi, então, centrifugada a 500xg por 2 minutos sobre uma placa de coleta Waters de 350 μl. O ADC foi eluído da resina por tratamento com 50 μl de Gly pH3 (2x50 ul), misturando a 500 rpm por 2 min a 4 °C, centrifugado a 500xg por 3 min em uma placa de 96 poços de 350 μl, em que cada poço contém 10 μl de tampão Tris 1M pH 7,4. A concentração de ADC foi determinada com o uso de um leitor de placa UV-Vis. As amostras foram desglicosiladas com o uso de 1 μl de PNGase por amostra e incubadas por 1 h a 37 graus Celsius. Cada ADC foi reduzido pela adição de 12 μl de DTT 100 mM e incubação por 15 min a 37 graus Celsius. Finalmente, as amostras (injeção de 10 ou 50 μl) foram analisadas com o uso de um método PLRP-MS de 15 min para avaliar a composição da cadeia leve e pesada para quantificar a carga de fármaco para cada ponto de tempo. Como mostrado na Figura 10, ADC à base de Ex_4-1 demonstrou estabilidade de fármaco-ligante ex vivo melhorada em plasma de camundongo, em relação a ADCs à base de Ex_8-1a e Ex_8-1b, contribuindo para a atividade in vivo melhorada.
Método Experimental de Análise de PK de ADC
[00466] Esse procedimento descreve um método para a quantificação da IgG humana total em plasma K2EDTA de roedor.
[00467] O método usa um mAb de cadeia leve kappa anti- humano conjugado com biotina (SDIX) como o reagente de captura, e o mesmo anticorpo conjugado com Alexafluor-647 como o reagente de detecção, para quantificação de anticorpo humano e/ou artigo de teste de conjugado anticorpo-fármaco como Anticorpo Total (TAb) em plasma de roedor K2EDTA. O ensaio foi realizado com o uso da plataforma GyroLab xPlore, que utiliza um disco contendo estruturas microfluídicas com colunas de microesferas revestidas com estreptavidina em escala de nanolitro nas quais o ensaio de ligação ao ligante ocorre. Resumidamente, as amostras de estudo foram diluídas com plasma de roedor K2EDTA agrupado intocado conforme necessário e, então, juntamente com calibradores, controles e um branco de plasma, foram diluídas com tampão Rexxip-HX em uma diluição mínima necessária (MRD) de 1:10 antes de sendo carregado em uma placa de amostra de 96 poços. Reagente de captura de biotina-anti-kappa humano a 1 ug/ml em solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 com Tween-20 (PBS-T), reagente de detecção de AF647-anti-kappa humano a 25 nM em tampão Rexxip F e lavagem de tampão PBS-T foi adicionado a uma placa de reagente de 96 poços, e ambas as placas foram vedadas e adicionadas ao instrumento. Um arquivo de execução foi estabelecido no software GyroLab Control e um modelo de amostra foi exportado para o Excel para permitir a entrada de designações de amostra e fatores de diluição. Esse modelo foi, então, importado de volta para o GyroLab Control antes de iniciar a execução. O ensaio foi sequencial: o reagente de captura biotinilado foi aplicado ao BioAffy1000 CD primeiro, o disco foi lavado com PBS-T e, então, o branco de plasma diluído, padrões, controles e amostras foram adicionados. Após uma lavagem com PBS-T subsequente, o reagente de detecção conjugado com AF647 foi aplicado. Após uma lavagem final com PBS-T, cada coluna do disco foi lida com detecção de fluorescência induzida por laser (comprimento de onda de excitação: 635nm). A resposta detectada em PMT a 1% foi submetida a uma regressão logística de 5 parâmetros (5-PL) com o uso do software Gyrolab Evaluator para conversão da resposta de fluorescência em ng/ml de Anticorpo Total presente nas amostras.
[00468] A faixa do ensaio para quantificação de IgG humana total em plasma K2EDTA de roedor foi de 22,9 ng/ml (LLOQ) a 50.000 ng/ml (ULOQ) para artigos de teste de anticorpos não conjugados e 22,9 ng/ml (LLOQ) a 100.000 ng/ml (ULOQ) para ADCs. Os níveis de controle de qualidade foram estabelecidos em 80,0 ng/ml (LQC), 800 ng/ml (MQC) e 8.000 ng/ml (HQC2) e 40.000 ng/ml (HQC1).
[00469] Os ADCs de camptotecina (DAR8) foram incubados a 37 graus Celsius em plasma de camundongo (Balb C). O plasma foi coletado a 6 h, 24 h, 72 h e 7 dias. Os ADCs foram isolados do plasma com IgSelect, desglicosilados com PNGase e reduzidos com ditiotreitol. Ambas as cadeias pesada e leve de ADC foram avaliadas por PLRP-MS para quantificar a carga de fármaco para cada ponto de tempo.
[00470] Os ratos foram injetados com 1 mg/kg de IgG parental, ou IgG-camptotecina Ex_4-1 e ADCs Ex_8a. As amostras de coletas de sangue programadas foram processadas e anticorpo IgG humano e ADCs foram capturados do plasma por meio de um mAb de cadeia leve kappa anti-humano conjugado com biotina e microesferas revestidas com estreptavidina. Anticorpo IgG humano e ADCs foram quantificados via ELISA com o uso de um reagente de detecção kappa AF647-anti-humano. Conforme mostrado na Figura 11, ADC à base de Ex_4-1 mostrou baixa absorção por células de Kupffer (macrófago do fígado), em relação ao ADC à base deem Ex_8-1a. O ensaio é um substituto para a depuração de ADC in vivo pelo fígado e sugere uma taxa de depuração baixa para ADCs com base no Ex_4-1.
Ensaio in vitro de Célula Kupffer
[00471] ADCs testados no ensaio de células de Kupffer foram duplamente marcados com corante fluorescente e fármaco-ligantes de maleimida citotóxicos. Os anticorpos foram primeiro conjugados com corante fluorescente (Alexa Fluor 647 NHS éster, Thermo Fisher, Parte no A20006) a um DAR=4 médio. Os anticorpos marcados com corante foram, então, reduzidos com o uso de TCEP e conjugados com fármaco-ligantes de maleimida a um DAR=8 médio. Células Kupffer de rato purificadas (Life Technologies Corp. Parte no RTKCCS) foram semeadas em placas de 96 poços revestidas com colágeno I (ThermoFisher, Parte no A1142803) a uma densidade de 50.000 células/poço e deixadas aderir à placa por 24-48 horas antes para adicionar ADCs. As células Kupffer foram incubadas com ADCs a uma concentração de 0,1 mg/ml em meio de cultura de células por 24 horas. Após 24 horas de incubação, o meio foi removido, as células foram dissociadas com Versene, transferidas para uma placa de fundo cônico e lavadas uma vez por peletização de células em uma centrífuga a 400 x g por 5 min, então, ressuspensas em PBS + BSA a 2%. Um Intellicyt iQue Screener equipado com software ForeCyt foi usado para contar e medir a absorção de ADC nas células por intensidade fluorescente média (MFI) para cada condição de tratamento. Conforme mostrado na Figura 12, ADC à base de Ex_4-1 (DAR8) mostrou baixa absorção por células de Kupffer (macrófago do fígado), em relação ao ADC à base deem Ex_8- 1a (DAR8). O ensaio é um substituto para a depuração de ADC in vivo pelo fígado e sugere uma taxa de depuração baixa para ADCs com base no Ex_4-1.
Estudo de hidrofobicidade com o Uso de Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC)
[00472] CAC10 nu, cAC10-Ex_4-1(8) e cAC10-Ex_8-1a(8) (aprox. 75 μg) foram injetados em uma coluna Butyl HIC NPR (2,5 μm, 4,6 mm x 3,5 mm, Tosoh Bioscience, PN 14947 ) a 25 °C e eluídos com um gradiente linear de 12 minutos de B a 0 a 100% a uma taxa de fluxo de 0,8 ml/min (Fase móvel A, sulfato de amônio 1,5 M em fosfato de potássio 25 mM, pH 7; Fase móvel B, Fosfato de potássio 25 mM, pH 7, isopropanol 25%). Um sistema HPLC Waters Alliance equipado com um detector de comprimento de onda múltiplo e software Empower3 foi usado para resolver e quantificar espécies de anticorpos com diferentes proporções de fármaco por anticorpo. Como mostrado na Figura 13, cAC10-Ex_4-1 ADC exibiu hidrofobicidade reduzida em comparação com cAC10-Ex_8-1a ADC ou anticorpo cAC10 nu. A hidrofobicidade de ADC é um contribuinte para a eliminação e absorção não específica de ADC.
Estudo de Liberação de Fármaco
[00473] A liberação de fármaco in vitro de cAC10- Ex_4-3 ADC (DAR 8) foi estudada na linha de células ALCL Karpas 299 e na linha de células HL L540cy. Um ADC h00-Ex_4- 3 se não ligação (DAR 8) foi usado como o controle. As células Karpas 299 (CD30 positivo, linfoma de células T) e L540cy (CD30 positivo, linfoma de Hodgkin) foram semeadas a 5E6 células/ml (total de 5E6 células) em meio fresco (RPMI + FBS a 10%, RPMI + FBS a 20%, respectivamente). Após o plaqueamento, as células foram doeadas com cAC10-Ex_4-3 ADC (DAR 8) e h00-Ex_4-3 (DAR 8) a 10 ng/ml de cultura. As células tratadas foram incubadas a 37 °C e coletadas 24 horas após a dose. Após a coleta, as células foram sedimentadas, lavadas com PBS e congeladas em um pequeno volume de PBS. Para a preparação de amostra de espectrometria de massa analítica (LC-MS/MS), as células foram extraídas em metanol frio contendo um padrão interno e incubadas em gelo. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante (contendo a pequena molécula extraída) foi removido e seco sob nitrogênio. As amostras secas foram reconstituídas em água a 95% contendo ácido fórmico a 0,1% e injetadas na coluna Waters Acquity BEH C18 (1,7 μm, 2,1x50 mm) conectada a um Espectrômetro de Massa Sciex 6500+ Triple Quadrupole. Como mostrado nas Figuras 14A e 14B, os fármacos livres Composto 4 e Composto 4b estão presentes em células tratadas com cAC10-Ex_4-3 ADC (DAR 8), mas não detectáveis em células tratadas com h00-Ex_4-3 ADC (DAR 8). Tabela de Sequências

Claims (8)

1. Composto de Camptotecina caracterizado pelo fato de que tem a Fórmula: em que cada RF e RF’é independentemente H, glicila, hidroxiacetila, etila, ou 2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etila, ou em que RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual cada um está fixado para formar um anel heterocicloalquila com 5, 6 ou 7 membros.
2. Composto de Camptotecina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que RF e RF’são combinados com o átomo de nitrogênio ao qual cada um está fixado para formar um anel com 6 membros.
3. Composto de Camptotecina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que RF’é H e RF é glicila, hidroxiacetila, etila, ou 2-(2-(2- aminoetoxi)etoxi)etila, um grupo alifático, um grupo arila, um grupo amida, ou um grupo óxido de etileno.
4. Composto de Camptotecina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o composto é caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo selecionado do Composto 4, Composto 5 e Compostos nas Tabelas I e II.
5. Composto de Camptotecina caracterizado pelo fato de que tem a Fórmula: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que RBé -(C1-C4)alquil-OH, -(C1-C4)alquil-O-(C1- C4)alquil-NH2, -C1-C8 alquila, C1-C8 haloalquila, C3-C8 cicloalquila, C3-C8cicloalquilC1-C4 alquila, fenila ou fenilC1-C4 alquila.
6. Composto de Camptotecina, de acordo com a reivindicação 5, em que o composto é caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em Composto 6 e compostos na Tabela III.
7. Uso de um Conjugado de Camptotecina, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para produzir um medicamento para tratar câncer ou uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade desse.
8. Uso do Composto de Camptotecina, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para produzir um medicamento para tratar câncer em um indivíduo em necessidade desse, em que o medicamento é capaz de colocar em contato as células cancerosas com o referido Composto de Camptotecina.
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