BR122023002611B1 - FEED INGREDIENT COMPOSITION COMPRISING A DISPERSION OF MICROBIAL CELLS LYSED IN TRIGLYCERIDE OIL, METHOD FOR PREPARING A COMPOSITION AND FORMULATED FEED - Google Patents

FEED INGREDIENT COMPOSITION COMPRISING A DISPERSION OF MICROBIAL CELLS LYSED IN TRIGLYCERIDE OIL, METHOD FOR PREPARING A COMPOSITION AND FORMULATED FEED Download PDF

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BR122023002611B1
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Brazil
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oil
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microbial cells
food
micrometers
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BR122023002611-0A
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Portuguese (pt)
Inventor
Walter Rakitsky
John Piechocki
Wenhua Lu
Janice Wee
Jorge Galazzo
Original Assignee
Corbion Biotech, Inc
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Abstract

A presente divulgagao refere-se a ingredientes para alimento e alimento formulado, metodos para a sua fabricagao e usos dos mesmos em aplicagoes nutricionais, tais como em aquacultura, alimento para animais terrestres e nutrigao humana. As composigoes de ingredientes para alimento compreendem celulas microbianas lisadas com uma razao de aspecto pequeno e oleo de triglicerideo.The present disclosure relates to food ingredients and formulated food, methods for their manufacture and uses thereof in nutritional applications, such as in aquaculture, food for terrestrial animals and human nutrition. Food ingredient compositions comprise lysed microbial cells with a small aspect ratio and triglyceride oil.

Description

REFERENCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOSCROSS REFERENCE TO RELATED ORDERS

[1] O presente pedido reivindica o beneficio de prioridade sob o 35 U.S.C. §119(e) em rela?ao ao Pedido de Patente Provisorio dos E.U.A. N°. 62/357,829, submetido em 1 de julho de 2016, e intitulado, "INGREDIENTES PARA ALIMENTO CONTENDO CELULAS MICROBIANAS LISADAS", e ao Pedido de Patente Provisorio dos E.U.A. N°. 62/408,630, submetido em 14 de outubro de 2016, e intitulado, "INGREDIENTES PARA ALIMENTO CONTENDO CELULAS MICROBIANAS OXIDATIVAMENTE ESTAVEIS NAO LISADAS E LISADAS", e sob o 35 U.S.C. §120 em rela?ao ao Pedido de Patente dos E.U.A. N°. 15/636,506, submetido em 28 de junho de 2017, e intitulado, "INGREDIENTES PARA ALIMENTO COMPREENDENDO CELULAS MICROBIANAS LISADAS" cada um dos quais e incorporado no presente documento por referenda na sua totalidade.[1] The present application claims the benefit of priority under 35 U.S.C. §119(e) over U.S. Provisional Patent Application No. 62/357,829, submitted July 1, 2016, and entitled, "FOOD INGREDIENTS CONTAINING LYSED MICROBIAL CELLS", and U.S. Provisional Patent Application No. 62/408,630, filed October 14, 2016, and entitled, "FOOD INGREDIENTS CONTAINING NON-LYSED AND LYSED OXIDATIVELY STABLE MICROBIAL CELLS", and under 35 U.S.C. §120 in relation to U.S. Patent Application No. 15/636,506, submitted on June 28, 2017, and entitled, "FOOD INGREDIENTS COMPRISING LYSED MICROBIAL CELLS" each of which is incorporated herein by countersign in its entirety.

ANTECEDENTESBACKGROUND

[2] 6leos de triglicerideos produzidos por microrganismos e plantas conferem nutrientes essenciais para o consumo de organismos mais elevados na cadeia alimentar. Esses oleos de triglicerideos sao compostos de certos acidos graxos que nao sao encontrados ou que sao produzidos em quantidades menores nos organismos de ordem superior.[2] Triglyceride oils produced by microorganisms and plants provide essential nutrients for consumption by organisms higher up the food chain. These triglyceride oils are composed of certain fatty acids that are not found or that are produced in smaller quantities in higher order organisms.

[3] De particular importancia nutricional na cadeia alimentar sao os oleos de triglicerideos produzidos por microrganismos e plantas que sao ricos em acidos graxos poli-insaturados (PUFA). Os acidos graxos poli- insaturados incluem acidos graxos de omega-3 de cadeia longa, tais como o acido docosa-hexaenoico (DHA). O DHA e um componente importante na nutrisao humana, especialmente para os bebes. Animais aquaticos, tais como peixes e crustaceos, tambem precisam de DHA em sua dieta para o desenvolvimento e crescimento adequados. Alem disso, a alimenta?ao com DHA em animais domesticos recem-nascidos, tais como porcos, vacas e outros mamiferos, aumenta a taxa de sobrevivencia de leitoes, bezerros, cabritos e outros mamiferos recem-nascidos.[3] Of particular nutritional importance in the food chain are triglyceride oils produced by microorganisms and plants that are rich in polyunsaturated fatty acids (PUFA). Polyunsaturated fatty acids include long-chain omega-3 fatty acids such as docosahexaenoic acid (DHA). DHA is an important component in human nutrition, especially for babies. Aquatic animals, such as fish and shellfish, also need DHA in their diet for proper development and growth. Furthermore, feeding DHA to newborn domestic animals, such as pigs, cows and other mammals, increases the survival rate of piglets, calves, kids and other newborn mammals.

[4] Uma das principals fontes comerciais de acidos graxos de omega-3 de cadeia longa e o oleo de peixe. Cerca de um milhao de toneladas metricas de oleo de peixe sao produzidas a cada ano para uso principalmente em aplica?oes em aquacultura, na ra?ao de animais terrestres e na nutr^ao humana. A industria da aquacultura esta em crescimento, mas a disponibilidade de acidos graxos de omega-3 de cadeia longa a partir de peixes selvagens capturados nao aumentou com a demanda. A disponibilidade continua depende de politicas de sustentaveis de gestao da pesca, produtividade de sistemas naturais que sao sensiveis as mudansas climaticas e a outros fatores. Muitos paises tern quotas rigorosas sobre os peixes capturados na natureza.[4] One of the main commercial sources of long-chain omega-3 fatty acids is fish oil. About one million metric tons of fish oil are produced each year for use mainly in aquaculture applications, in terrestrial animal feed and in human nutrition. The aquaculture industry is growing, but the availability of long-chain omega-3 fatty acids from wild-caught fish has not increased with demand. Continued availability depends on sustainable fisheries management policies, productivity of natural systems that are sensitive to climate change and other factors. Many countries have strict quotas on wild-caught fish.

SUMARIOSUMMARY

[5] Em uma modalidade, e conferida uma composi?ao de ingrediente para alimento compreendendo uma dispersao de celulas microbianas lisadas em oleo de triglicerideo, em que: a) 5-90% em peso da composi?ao sao celulas lisadas, e b) 10-90% em peso da composi?ao e oleo de triglicerideos, em que o oleo de triglicerideos compreende oleo das celulas lisadas e oleo de outro organismo.[5] In one embodiment, a food ingredient composition comprising a dispersion of lysed microbial cells in triglyceride oil is provided, wherein: a) 5-90% by weight of the composition are lysed cells, and b) 10-90% by weight of the composition is triglyceride oil, wherein the triglyceride oil comprises oil from lysed cells and oil from another organism.

[6] Em algumas modalidades, o oleo de triglicerideos tern um perfil de acidos graxos de 10-70% em peso de acido docosa-hexaenoico (DHA), 15%-65% em peso de DHA, 20%-60% em peso de DHA, 25%- 55% de DHA em peso, 30%-55% de DHA em peso, ou 40%-55% de DHA em peso, de acidos graxos.[6] In some embodiments, the triglyceride oil has a fatty acid profile of 10-70% by weight docosahexaenoic acid (DHA), 15%-65% by weight DHA, 20%-60% by weight of DHA, 25%-55% DHA by weight, 30%-55% DHA by weight, or 40%-55% DHA by weight, fatty acids.

[7] Em algumas modalidades, o DHA e 4%-45%, 4%-40%, 4%- 35%, 4%-30%, 4%-25% em peso da composi?ao. Noutras modalidades, o DHA e 4%-20%, 4%-15%, 5%-15%, 5%-12%, 5% -10%, 5%-7%, 5%-8%, 6%-8% ou 6%-7% em peso da composi?ao.[7] In some embodiments, DHA is 4%-45%, 4%-40%, 4%-35%, 4%-30%, 4%-25% by weight of the composition. In other embodiments, DHA is 4%-20%, 4%-15%, 5%-15%, 5%-12%, 5%-10%, 5%-7%, 5%-8%, 6% -8% or 6%-7% by weight of the composition.

[8] Em algumas modalidades, as composisoes conferidas no presente documento compreendem 5%-15%, 5%-10%, 10%-15%, 10%- 25%, 15%-20%, ou 20%-25%, 30%-40%, 30%-50%, 30%-60%, 30%-70%, 30%-80%, 30%-90%, em peso, de celulas microbianas lisadas.[8] In some embodiments, the compositions provided herein comprise 5%-15%, 5%-10%, 10%-15%, 10%-25%, 15%-20%, or 20%-25% , 30%-40%, 30%-50%, 30%-60%, 30%-70%, 30%-80%, 30%-90%, by weight, of lysed microbial cells.

[9] Em algumas modalidades, a composi?ao proporcionada no presente documento compreende ainda menos do que 20%, 15%, 10%, 5%, 3% ou 1% em peso de celulas microbianas nao lisadas ou em que a composi?ao e isenta de celulas microbianas nao lisadas. Em algumas modalidades, as composi?oes sao isentas de celulas microbianas nao lisadas.[9] In some embodiments, the composition provided herein further comprises less than 20%, 15%, 10%, 5%, 3% or 1% by weight of unlysed microbial cells or in which the composition is not lysed. and free from unlysed microbial cells. In some embodiments, the compositions are free of unlysed microbial cells.

[0010] Em algumas modalidades, o oleo das celulas microbianas lisadas tern um perfil de acido graxo de 40-70%, 40-50%, 40-50%, 45-55% ou 50-55% de DHA em peso de acidos graxos.[0010] In some embodiments, the oil from lysed microbial cells has a fatty acid profile of 40-70%, 40-50%, 40-50%, 45-55% or 50-55% DHA by weight of acids. fatty.

[0011] Em algumas modalidades, as celulas lisadas tern uma razao de aspecto inferior a 1:1. Em outras modalidades, as celulas lisadas tern uma razao de aspecto de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10. Em algumas modalidades, as celulas lisadas tern uma razao de aspecto de 1:21,5, 1:2-1:4 ou 1:2-1:3. Em uma modalidade, as celulas lisadas tern uma razao de aspecto entre 1:1 e 1:5, entre 1:5 e 1:10, entre 1:10 e 1:15, ou entre 1:15 e 1:20.[0011] In some embodiments, the lysed cells have an aspect ratio of less than 1:1. In other embodiments, the lysed cells have an aspect ratio of 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, or 1:10. In some embodiments, the lysed cells have an aspect ratio of 1:21.5, 1:2-1:4, or 1:2-1:3. In one embodiment, the lysed cells have an aspect ratio between 1:1 and 1:5, between 1:5 and 1:10, between 1:10 and 1:15, or between 1:15 and 1:20.

[0012] Em algumas modalidades, as celulas lisadas tern um tamanho de particula mediano de 1-20 micrometros, 1-18 micrometros, 115 micrometros, 1-12 micrometros, 1-10 micrometros, 1-9 micrometros, 1- 8 micrometros, 1-7 micrometros, 1-6 micrometros, 1-5 micrometros, 1-4 micrometros, 1-3 micrometros, 5-100 micrometros, 5-90 micrometros, 5-80 micrometros, 5-80 micrometros, 5-70 micrometros, 5-60 micrometros, 5-50 micrometros, 5-40 micrometros, 5-30 micrometros, 5-20 micrometros ou 510 micrometros.[0012] In some embodiments, the lysed cells have a median particle size of 1-20 micrometers, 1-18 micrometers, 115 micrometers, 1-12 micrometers, 1-10 micrometers, 1-9 micrometers, 1-8 micrometers, 1-7 micrometers, 1-6 micrometers, 1-5 micrometers, 1-4 micrometers, 1-3 micrometers, 5-100 micrometers, 5-90 micrometers, 5-80 micrometers, 5-80 micrometers, 5-70 micrometers, 5-60 micrometers, 5-50 micrometers, 5-40 micrometers, 5-30 micrometers, 5-20 micrometers or 510 micrometers.

[0013] Em algumas modalidades, mais de metade das celulas lisadas permanecem suspensas na composi?ao durante pelo menos uma semana sem assentarem.[0013] In some embodiments, more than half of the lysed cells remain suspended in the composition for at least a week without settling.

[0014] Em algumas modalidades, o oleo a partir de outro organismo e oleo a partir de um peixe, planta, microbio oleaginoso ou combina5oes dos mesmos. Esses oleos incluem aqueles que sao extraidos e separados do outro organismo. Em algumas modalidades, o outro microrganismo e microalga, fungo ou levedura.[0014] In some embodiments, the oil from another organism is oil from a fish, plant, oleaginous microbe, or combinations thereof. These oils include those that are extracted and separated from the other organism. In some embodiments, the other microorganism is microalgae, fungus or yeast.

[0015] Em algumas modalidades, o oleo de uma planta e um oleo de coco, milho, semente de algodao, azeite, palma, amendoim, colza, canola, cartamo, sesamo, soja, oleo de soja, oleo de nozes, oleo de camelina ou oleo citrico, ou uma ou mais combina?oes dos mesmos.[0015] In some embodiments, the oil of a plant is an oil of coconut, corn, cottonseed, olive oil, palm, peanut, rapeseed, canola, cardamom, sesame, soybean, soybean oil, walnut oil, camelina or citrus oil, or one or more combinations thereof.

[0016] Em algumas modalidades, o oleo de um peixe e oleo de uma anchova, arenque, arinca, anchova, sarda, sardinha ou cavala ou uma ou mais combina?oes dos mesmos.[0016] In some embodiments, the oil from a fish is oil from an anchovy, herring, haddock, anchovy, mackerel, sardine or mackerel or one or more combinations thereof.

[0017] Em algumas modalidades, as celulas microbianas sao da familia Thaustochytriacae.[0017] In some embodiments, the microbial cells are from the Thaustochytriacae family.

[0018] Em algumas modalidades, as celulas microbianas sao do genero selecionado a partir do grupo consistindo em Crypthecodinium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium e Schizochytrium.[0018] In some embodiments, the microbial cells are of the genus selected from the group consisting of Crypthecodinium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium and Schizochytrium.

[0019] Em algumas modalidades, as celulas microbianas estao adaptadas de modo a crescerem em condi?oes de baixo teor de cloreto.[0019] In some embodiments, microbial cells are adapted to grow in low chloride conditions.

[0020] Em algumas modalidades, as composi?oes conferidas no presente documento adicionalmente compreendem lecitina.[0020] In some embodiments, the compositions provided herein additionally comprise lecithin.

[0021] Em algumas modalidades, as composi?oes conferidas no presente documento adicionalmente compreendem aditivos dieteticos, tais como micronutrientes. Aditivos dieteticos, incluem astaxantina, carotenoides, flavonoides, esterois, chalcitriois (vitamina D), tocoferois (vitamina E), e filoquinona e menaquinonas (vitamina K). Outros aditivos dieteticos incluem antibioticos, antifungicos, antiparasitarios e hormonios. As astaxantinas, os carotenoides e outros aditivos dieteticos podem ser adicionados na forma de biomassa microbiana. Por exemplo, leveduras, bacterias, fungos, microalgas ou outros microrganismos que produzem astaxantinas, carotenoides e outros micronutrientes podem ser adicionados a composi?ao.[0021] In some embodiments, the compositions provided herein additionally comprise dietary additives, such as micronutrients. Dietary additives include astaxanthin, carotenoids, flavonoids, sterols, chalcitriols (vitamin D), tocopherols (vitamin E), and phylloquinone and menaquinones (vitamin K). Other dietary additives include antibiotics, antifungals, antiparasitics and hormones. Astaxanthins, carotenoids and other dietary additives can be added in the form of microbial biomass. For example, yeast, bacteria, fungi, microalgae or other microorganisms that produce astaxanthins, carotenoids and other micronutrients can be added to the composition.

[0022] Em algumas modalidades, as composi?oes conferidas no presente documento adicionalmente compreendem um antioxidante. Em outras modalidades, o antioxidante e um antioxidante natural, lecitina, amido, acido ascorbico, tocoferois, extrato de alecrim, extrato de cha verde, palmitato de ascorbila, hidroxitolueno butilado (BHT), terc-butil- hidroquinona (TBHQ), etoxiquina, ou uma ou mais combinasoes dos mesmos.[0022] In some embodiments, the compositions provided herein additionally comprise an antioxidant. In other embodiments, the antioxidant is a natural antioxidant, lecithin, starch, ascorbic acid, tocopherols, rosemary extract, green tea extract, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene (BHT), tert-butylhydroquinone (TBHQ), ethoxyquin, or one or more combinations thereof.

[0023] Em algumas modalidades, e conferido um recipiente de transporte ou de armazenamento compreendendo a composi?ao conferida no presente documento. Em outras modalidades, o recipiente e um tambor ou um reservatorio de 2,1 x 102 L (55 galoes).[0023] In some embodiments, a transport or storage container comprising the composition set forth in this document is provided. In other embodiments, the container is a 2.1 x 102 L (55 gallon) drum or reservoir.

[0024] Em algumas modalidades, e conferido um metodo para preparar uma composi?ao de ingredientes de alimenta?ao conferidos no presente documento compreendendo: misturar celulas microbianas e o oleo de outro organismo de modo a formar uma mistura; lise das celulas microbianas na mistura de modo a formar a composi?ao como uma dispersao.[0024] In some embodiments, a method is provided for preparing a composition of feed ingredients set forth herein comprising: mixing microbial cells and the oil of another organism to form a mixture; lysing the microbial cells in the mixture to form the composition as a dispersion.

[0025] Em algumas modalidades, e conferido um metodo para preparar uma alimenta?ao formulada, compreendendo o contato da composi?ao conferida no presente documento com um alimento comestivel.[0025] In some embodiments, a method is provided for preparing a formulated food, comprising contacting the composition provided in this document with an edible food.

[0026] Em algumas modalidades, e conferido um alimento formulado compreendendo uma composi?ao conferida no presente documento e alimento comestivel.[0026] In some embodiments, a formulated food comprising a composition disclosed in this document is provided and edible food.

[0027] Em algumas modalidades, o alimento comestivel e revestido com a composi?ao. Em outras modalidades, o alimento comestivel e revestido com a composi?ao sob vacuo.[0027] In some embodiments, the edible food is coated with the composition. In other embodiments, the edible food is coated with the composition under vacuum.

[0028] Em algumas modalidades, o alimento comestivel e um alimento de aquacultura ou animal. Em outras modalidades, o alimento comestivel e um alimento de salmao. Em outras modalidades, o alimento comestivel compreende subprodutos de peixe ou de origem animal ou combina5oes dos mesmos.[0028] In some embodiments, the edible food is an aquaculture or animal food. In other embodiments, the edible food is a salmon food. In other embodiments, the edible food comprises by-products of fish or animal origin or combinations thereof.

[0029] Em algumas modalidades, o alimento formulado esta em uma forma peletizada.[0029] In some embodiments, the formulated food is in a pelletized form.

[0030] Em algumas modalidades, o alimento formulado contem pelo menos 1%, 1,5%, ou 2% de acidos graxos de omega-3.[0030] In some embodiments, the formulated food contains at least 1%, 1.5%, or 2% omega-3 fatty acids.

[0031] Em algumas modalidades, a composi?ao conferida no presente documento representa pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40% em peso do alimento formulado.[0031] In some embodiments, the composition given in this document represents at least 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 40% by weight of the formulated food.

[0032] Em algumas modalidades, a pasta da invensao ja nao e espontaneamente combustivel. As celulas microbianas que contem grandes quantidades de PUFA sao instaveis por oxida?ao. O armazenamento e o transporte de celulas microbianas que contem grandes quantidades de PUFAs podem ser problematicos devido a sua propensao para entrar em combustao espontanea. A dispersao de celulas microbianas lisadas em oleo de triglicerideos nao entra em combustao espontanea quando submetida a temperaturas de entre 50°C e 150°C. Em algumas modalidades, a combustao da composi?ao ou da dispersao do ingrediente para alimento microbiana lisada nao ocorre durante pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 horas, quando a composi?ao ou formula?ao de alimento e submetida a 80°C. A pasta da invensao e menos dispendiosa para expedir e segurar uma vez que nao entra em combustao espontanea.[0032] In some embodiments, the paste of the invention is no longer spontaneously combustible. Microbial cells that contain large amounts of PUFA are unstable due to oxidation. The storage and transport of microbial cells containing large amounts of PUFAs can be problematic due to their propensity to spontaneously combust. The dispersion of microbial cells lysed in triglyceride oil does not spontaneously combust when subjected to temperatures between 50°C and 150°C. In some embodiments, combustion of the lysed microbial food ingredient composition or dispersion does not occur for at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 hours, when the food composition or formulation is subjected to 80°C. The invention paste is less expensive to ship and handle as it does not spontaneously combust.

[0033] A pasta da invensao tambem minimiza o volume necessario para expedir uma determinada quantidade de celulas microbianas. As celulas microbianas nao lisadas possuem baixa densidade em volume. A dispersao das celulas lisadas e do oleo de triglicerideo aumenta significativamente a densidade em volume dos solidos (elimina o espa?o aereo entre os aglomerados) de tal forma que quase o dobro da biomassa se encaixa no mesmo espa?o; levando, desse modo, a custos de transporte e armazenamento reduzidos. Alem disso, a dispersao da invensao e mais facilmente isolada da exposi?ao ao oxigenio. A purga de um supersaco de biomassa seca com nitrogenio e dificil e requer quantidades significativas de nitrogenio e e dificil obter baixos niveis de oxigenio residual. Em contraste, a purga do pequeno espa?o de topo em um reservatorio contendo a pasta da invensao e facilmente conseguida e com muito menos nitrogenio.[0033] The paste of the invention also minimizes the volume necessary to dispatch a given quantity of microbial cells. Unlysed microbial cells have low volume density. The dispersion of the lysed cells and the triglyceride oil significantly increases the volume density of the solids (eliminates the air space between the clusters) in such a way that almost twice the biomass fits in the same space; thereby leading to reduced transportation and storage costs. Furthermore, the dispersion of the invention is more easily isolated from exposure to oxygen. Purging a dry biomass superbag with nitrogen is difficult and requires significant amounts of nitrogen and it is difficult to obtain low levels of residual oxygen. In contrast, purging the small head space in a reservoir containing the slurry of the invention is easily accomplished and with much less nitrogen.

[0034] Em algumas modalidades, a composi?ao ou o ingrediente para alimento conferidos no presente documento compreendem pelo menos um ou mais antioxidantes selecionados a partir do grupo consistindo em lecitina, amido, acido ascorbico, tocoferois, extrato de alecrim, extrato de cha verde, palmitato de ascorbila, BHT, TBHQ e PWL. Em algumas modalidades, os dois ou mais antioxidantes atrasam ou inibem a combustao da biomassa quando submetida a temperaturas de entre 50°C e 150°C. Em algumas modalidades, a combustao da composi?ao ou do ingrediente para alimento nao ocorre durante pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 horas quando a composi?ao ou formula?ao de alimento e submetida a 80°C.[0034] In some embodiments, the food composition or ingredient provided herein comprises at least one or more antioxidants selected from the group consisting of lecithin, starch, ascorbic acid, tocopherols, rosemary extract, tea extract green, ascorbyl palmitate, BHT, TBHQ and PWL. In some embodiments, the two or more antioxidants delay or inhibit the combustion of biomass when subjected to temperatures between 50°C and 150°C. In some embodiments, combustion of the food composition or ingredient does not occur for at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 hours when the food composition or formulation is subjected to 80°C.

[0035] Em algumas modalidades, e conferida uma composi?ao compreendendo celulas de microalgas do genero Crypthecodinium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, ou Schizochytrium e dois ou mais antioxidantes selecionados a partir do grupo consistindo em lecitina, amido, acido ascorbico, tocoferois, extrato de alecrim, extrato de cha verde, palmitato de ascorbila, BHT, TBHQ e PWL. As celulas de microalgas da composi?ao nao combustam durante pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 horas quando a composi?ao ou formula?ao de alimento esta sujeita a 80°C.[0035] In some embodiments, a composition is provided comprising microalgae cells of the genus Crypthecodinium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, or Schizochytrium and two or more antioxidants selected from the group consisting of lecithin, starch, ascorbic acid, tocopherols, extract of rosemary, green tea extract, ascorbyl palmitate, BHT, TBHQ and PWL. The microalgae cells in the composition do not burn for at least 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 hours when the composition or food formulation is subject to 80°C.

[0036] Em algumas modalidades, e conferido um metodo para aumentar o peso corporal de um animal. O metodo compreende alimentar o animal com alimento que e revestido com uma dispersao de celulas microbianas lisadas em oleo de triglicerideo, em que as celulas lisadas tern uma razao de aspecto inferior a 1:1.[0036] In some embodiments, a method is provided for increasing the body weight of an animal. The method comprises feeding the animal food that is coated with a dispersion of lysed microbial cells in triglyceride oil, wherein the lysed cells have an aspect ratio of less than 1:1.

[0037] A dispersao das celulas microbianas lisadas em oleo de triglicerideo contem de 5% a 90% em peso de celulas lisadas e entre 10% e 95% de oleo de triglicerideo em que o oleo de triglicerideo compreende oleo das celulas microbianas lisadas e oleo de outro organismo. Como um exemplo, uma pasta feita com 50 g de celulas de Schizochytrium contendo 50% de lipideo e 50 gramas de oleo de canola teria um total de 75 g de oleo (50 g de oleo de canola e 25 g de oleo de Schizochytrium).[0037] The dispersion of lysed microbial cells in triglyceride oil contains from 5% to 90% by weight of lysed cells and between 10% and 95% triglyceride oil wherein the triglyceride oil comprises oil from lysed microbial cells and oil from another organism. As an example, a paste made with 50 g of Schizochytrium cells containing 50% lipid and 50 grams of canola oil would have a total of 75 g of oil (50 g of canola oil and 25 g of Schizochytrium oil).

[0038] Em algumas modalidades, e conferido um metodo para aumentar o coeficiente de crescimento por unidade termica (TGC), o consumo de alimento (FI) ou a eficiencia do alimento (FE) de um animal. O metodo compreende alimentar o animal com alimento que e revestido com uma dispersao de celulas microbianas lisadas em oleo de triglicerideo, em que as celulas lisadas tern uma razao de aspecto inferior a 1:1. O metodo pode aumentar o TGC, FI e FE do animal.[0038] In some embodiments, a method is provided for increasing the growth coefficient per thermal unit (TGC), feed consumption (FI) or feed efficiency (FE) of an animal. The method comprises feeding the animal food that is coated with a dispersion of lysed microbial cells in triglyceride oil, wherein the lysed cells have an aspect ratio of less than 1:1. The method can increase the animal's TGC, FI and FE.

[0039] Em algumas modalidades, e conferido um metodo para diminuir o teor de acido docosa-hexaenoico nas fezes de um animal. O metodo compreende alimentar o animal com alimento que e revestido com uma dispersao de celulas microbianas lisadas em oleo de triglicerideo, em que as celulas lisadas tern uma razao de aspecto inferior a 1:1.[0039] In some embodiments, a method is provided for decreasing the content of docosahexaenoic acid in the feces of an animal. The method comprises feeding the animal food that is coated with a dispersion of lysed microbial cells in triglyceride oil, wherein the lysed cells have an aspect ratio of less than 1:1.

[0040] Em algumas modalidades, e conferido um metodo para aumentar a deposi?ao de proteina (PD), deposi?ao de lipideos (LD), a deposi?ao de docosa-hexaenoico (DHAD) ou o acido eicosapentaenoico (EPAD) de um animal. O metodo compreende alimentar o animal com alimento que e revestido com uma dispersao de celulas microbianas lisadas em oleo de triglicerideo, em que as celulas lisadas tern uma razao de aspecto inferior a 1:1. O metodo pode aumentar o PD, LD, DHAD ou EPAD do animal.[0040] In some embodiments, a method is provided for increasing protein deposition (PD), lipid deposition (LD), docosahexaenoic acid deposition (DHAD) or eicosapentaenoic acid (EPAD) of an animal. The method comprises feeding the animal food that is coated with a dispersion of lysed microbial cells in triglyceride oil, wherein the lysed cells have an aspect ratio of less than 1:1. The method can increase the animal's PD, LD, DHAD or EPAD.

BREVE DESCRICAO DOS DESENHOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0041] A Figura 1 mostra a porcentagem da densidade volumetrica como uma funsao do tamanho de particula (pm) para a mistura de oleo de canola e de biomassa do Exemplo 2 e das dispersoes resultantes da subsequente homogeneiza?ao ou moagem de esferas da mistura.[0041] Figure 1 shows the percentage volumetric density as a function of particle size (pm) for the canola oil and biomass mixture of Example 2 and the dispersions resulting from subsequent homogenization or ball milling of the mixture .

[0042] A Figura 2 mostra micrografias da mistura e das dispersoes do Exemplo 2.[0042] Figure 2 shows micrographs of the mixture and dispersions from Example 2.

[0043] A Figura 3 mostra a viscosidade como uma funsao da taxa de cisalhamento da mistura e das dispersoes do Exemplo 2.[0043] Figure 3 shows viscosity as a function of the shear rate of the mixture and the dispersions of Example 2.

[0044] A Figura 4 mostra a aparencia da mistura e das dispersoes do Exemplo 2, apos uma semana.[0044] Figure 4 shows the appearance of the mixture and dispersions of Example 2, after one week.

[0045] A Figura 5 mostra os valores de OxiPress (horas) da biomassa e/ou antioxidantes do Exemplo 3.[0045] Figure 5 shows the OxiPress values (hours) of biomass and/or antioxidants from Example 3.

[0046] A Figura 6 mostra a rela?ao entre os niveis dieteticos de DHA e a eficiencia da deposi?ao de DHA (eDHAD) do Exemplo 5.[0046] Figure 6 shows the relationship between dietary DHA levels and the efficiency of DHA deposition (eDHAD) of Example 5.

[0047] A Figura 7 mostra Varia?oes do teor de DHA em files de salmao (sem pele) durante o estudo. Cada ponto de dados representa a media de duas amostras e cada amostra consistia em files de tres peixes agrupados por tanque.[0047] Figure 7 shows Variations in DHA content in salmon fillets (without skin) during the study. Each data point represents the average of two samples and each sample consisted of files of three fish grouped per tank.

DESCRICAODESCRIPTION DefinicoesDefinitions

[0048] "Proporsao" se refere a rela?ao entre a largura e a altura da celula lisada ou da celula nao lisada.[0048] "Proportion" refers to the relationship between the width and height of the lysed cell or the non-lysed cell.

[0049] "Aditivo(s) dietetico(s)" sao ingredientes que sao adicionados aos ingredientes para alimento de modo a conferirem micronutrientes ou outros compostos para melhorarem o rendimento ou a qualidade do produto animal. Os aditivos dieteticos sao tipicamente compostos soluveis em oleo, mas podem ser compostos soluveis em agua. Os aditivos dieteticos incluem, mas nao estao limitados a astaxantinas, carotenoides, flavonoides, esterois, chalcitriois (vitamina D), tocoferois (vitamina E), e filoquinona e menaquinonas (vitamina K). As astaxantinas sao usadas na aquacultura de modo a melhorar a cor dos produtos, tais como salmao e truta. Outros aditivos dieteticos incluem antibioticos, antifungicos e antiparasitarios usados para proteger a saude do animal e os hormonios para aumentar a taxa de crescimento e o tamanho do animal. A composi?ao do ingrediente para alimento pode compreender adicionalmente leveduras, bacterias, fungos, microalgas ou outros microrganismos que produzem astaxantinas, carotenoides e outros micronutrientes.[0049] "Dietary additive(s)" are ingredients that are added to food ingredients in order to impart micronutrients or other compounds to improve the yield or quality of the animal product. Dietary additives are typically oil-soluble compounds, but can be water-soluble compounds. Dietary additives include, but are not limited to, astaxanthins, carotenoids, flavonoids, sterols, chalcitriols (vitamin D), tocopherols (vitamin E), and phylloquinone and menaquinones (vitamin K). Astaxanthins are used in aquaculture to improve the color of products such as salmon and trout. Other dietary additives include antibiotics, antifungals and antiparasitics used to protect the animal's health and hormones to increase the animal's growth rate and size. The food ingredient composition may additionally comprise yeast, bacteria, fungi, microalgae or other microorganisms that produce astaxanthins, carotenoids and other micronutrients.

[0050] "Dispersao" se refere a solidos em misturas de oleo. Em tais misturas, os solidos estao visivelmente presentes a olho nu, sem o auxilio de amplia?ao.[0050] "Dispersion" refers to solids in oil mixtures. In such mixtures, the solids are visibly present to the naked eye, without the aid of magnification.

[0051] Um "perfil de acido graxo" e a distribui?ao de grupos acila graxa nos triglicerideos do oleo sem referenda a liga?ao a uma cadeia principal de glicerol. Os perfls de acidos graxos sao tipicamente determinados por conversao em ester metilico de acido graxo (FAME), seguida de analise por cromatografia gasosa (GC) com detector de ioniza?ao de chama (FID). O perfil de acido graxo pode ser expresso como um ou mais percentuais de urn acido graxo no sinal de acido graxo total determinado a partir da area sob a curva para aquele acido graxo. A medi?ao por FAME-GC-FID se aproxima as porcentagens em peso dos acidos graxos.[0051] A "fatty acid profile" is the distribution of fatty acyl groups in the oil's triglycerides without reference to attachment to a glycerol backbone. Fatty acid profiles are typically determined by conversion to fatty acid methyl ester (FAME), followed by analysis by gas chromatography (GC) with a flame ionization detector (FID). The fatty acid profile can be expressed as one or more percentages of a fatty acid in the total fatty acid signal determined from the area under the curve for that fatty acid. Measurement by FAME-GC-FID approximates the weight percentages of fatty acids.

[0052] "Acido graxo" no contexto de um oleo de triglicerideo se refere aos radicais de acila graxa em um triglicerideo. De acordo com isso, sera entendido que grupos acila graxa de triglicerideos podem ser descritos em termos do acido carboxilico que e produzido quando o triglicerideo e hidrolisado ou saponificado.[0052] "Fatty acid" in the context of a triglyceride oil refers to the fatty acyl radicals in a triglyceride. Accordingly, it will be understood that fatty acyl groups of triglycerides can be described in terms of the carboxylic acid that is produced when the triglyceride is hydrolyzed or saponified.

[0053] "Ingrediente para alimento" se refere a substancias que sao adicionadas a outros ingredientes ou alimentos de modo a produzir ou modificar um alimento.[0053] "Food ingredient" refers to substances that are added to other ingredients or foods in order to produce or modify a food.

[0054] A "eficiencia do alimento" (FE) e o ganho em massa corporal (peso) por quantidade dada de alimento consumido pelo animal.[0054] "Food efficiency" (FE) is the gain in body mass (weight) per given amount of food consumed by the animal.

[0055] O "consumo de alimento" (FI) e a quantidade de alimento consumida por um animal durante um periodo de tempo definido.[0055] "Food consumption" (FI) is the amount of food consumed by an animal during a defined period of time.

[0056] "Alimento", "alimento comestivel", "alimentos", "alimento formulado" e "produtos de alimento acabados" se referem a produtos tendo algum valor nutricional adequado para ingestao por um organismo vivo.[0056] "Food", "edible food", "food", "formulated food" and "finished food products" refer to products having some nutritional value suitable for ingestion by a living organism.

[0057] "Deposi?ao de lipideos" (LD) e o aumento no teor de lipideos do animal em graus por dia (mg °C/dia). A eficiencia da deposi?ao de lipideos (eLD) e a porcentagem de lipideos que e alimentada ao animal que acaba no teor de lipideos do animal. "Deposi?ao de acido docosa- hexanenoico" (DHAD) e o aumento no teor de DHA do animal em graus por dia (mg °C/dia). A eficiencia de "deposi?ao de acido docosa- hexanenoico" (eDHAD) e a porcentagem de acido docosa-hexaenoico que e alimentado ao animal que acaba no teor de DHA do animal. "Deposi?ao de acido eicospentaenoico" (EPAD) e o aumento no teor de EPA do animal em graus por dia (mg °C/dia). A eficiencia de "deposi?ao de acido eicospentaenoico" (eEPAD) e a porcentagem de acido eicospentaenoico que e alimentado ao animal que acaba no teor de lipideos do animal.[0057] "Lipid deposition" (LD) is the increase in the animal's lipid content in degrees per day (mg °C/day). Efficiency of lipid deposition (eLD) is the percentage of lipid that is fed to the animal that ends up in the animal's lipid content. "Docosahexaneenoic acid deposition" (DHAD) is the increase in the animal's DHA content in degrees per day (mg °C/day). The efficiency of "docosahexaenoic acid deposition" (eDHAD) is the percentage of docosahexaenoic acid that is fed to the animal that ends up in the animal's DHA content. "Eicospentaenoic acid deposition" (EPAD) is the increase in the animal's EPA content in degrees per day (mg °C/day). The efficiency of "eicospentaenoic acid deposition" (eEPAD) is the percentage of eicospentaenoic acid that is fed to the animal that ends up in the animal's lipid content.

[0058] "Cloreto baixo" se refere a condi?oes de crescimento em que a quantidade de cloreto e menor que a salinidade dos ambientes marinhos.[0058] "Low chloride" refers to growing conditions in which the amount of chloride is lower than the salinity of marine environments.

[0059] "Lise", "Lisar", "lisamento" significa interromper ou romper a parede celular ou a membrana celular de uma celula de modo suficiente para libertar pelo menos algum conteudo intracelular.[0059] "Lysis", "Lyse", "lysation" means disrupting or disrupting the cell wall or cell membrane of a cell sufficiently to release at least some intracellular contents.

[0060] Celulas "lisadas" ou celulas "rompidas" sao aquelas onde a parede e/ou membrana celulares foram rompidas. Apos a lise, o conteudo da celula, incluindo o oleo de triglicerideos, e parcial ou totalmente liberado a partir da celula. Apos a ruptura da parede e/ou da membrana celular, alguma porsao do conteudo intracelular, incluindo oleos triglicerideos, pode permanecer dentro da parede ou membrana celular rompida.[0060] "Lysed" cells or "ruptured" cells are those where the cell wall and/or membrane have been disrupted. After lysis, cell contents, including triglyceride oil, are partially or completely released from the cell. After rupture of the cell wall and/or membrane, some portion of the intracellular content, including triglyceride oils, may remain within the ruptured cell wall or membrane.

[0061] "Celula microbiana" se refere a um microrganismo unicelular. Microrganismos unicelulares incluem organismos microbianos eucarioticos. Organismos microbianos incluem aqueles capazes de fotossintese, bem como heterotroficos, que podem viver apenas a partir de uma fonte fixa de carbono.[0061] "Microbial cell" refers to a unicellular microorganism. Unicellular microorganisms include eukaryotic microbial organisms. Microbial organisms include those capable of photosynthesis, as well as heterotrophs, which can live only from a fixed carbon source.

[0062] Uma celula, microbio, ou microrganismo "oleaginoso" e capaz de produzir pelo menos 20% de lipideos por peso celular seco naturalmente ou atraves de melhoria de estirpe recombinante ou classica. Celulas e microrganismos oleaginosos incluem aqueles tais como microalgas, fungos e leveduras.[0062] An "oleaginous" cell, microbiome, or microorganism is capable of producing at least 20% lipids by dry cell weight naturally or through recombinant or classical strain improvement. Oleaginous cells and microorganisms include those such as microalgae, fungi and yeast.

[0063] "Deposi?ao de proteinas" (PD) e o aumento no teor de proteinas do animal em graus por dia (mg °C/dia). A eficiencia da deposi?ao de proteinas (ePD) e a porcentagem de proteinas que e alimentada ao animal que acaba no teor de proteinas do animal.[0063] "Protein deposition" (PD) is the increase in the animal's protein content in degrees per day (mg °C/day). The efficiency of protein deposition (ePD) is the percentage of proteins that are fed to the animal that ends up in the animal's protein content.

[0064] Uma "pasta" ou "pasta de microalga" e uma dispersao de celulas microbianas lisadas no oleo de triglicerideo. A pasta compreende celulas de microalgas lisadas com uma razao de aspecto inferior a 1:1. A pasta pode ser revestida por cima, revestida a vacuo, revestida por pulveriza?ao sobre alimento solida. O alimento solido pode ser preparado por peletiza?ao, extrusao, forma?ao ou preparada usando outros metodos conhecidos de prepara?ao de solidos.[0064] A "paste" or "microalgae paste" is a dispersion of microbial cells lysed in triglyceride oil. The paste comprises lysed microalgae cells with an aspect ratio of less than 1:1. The paste can be top coated, vacuum coated, spray coated onto solid food. The solid food can be prepared by pelleting, extrusion, forming or prepared using other known solid preparation methods.

[0065] Um "coeficiente de crescimento por unidade termica" (TGC) e um coeficiente matematico que descreve o crescimento de especies aquaticas que explica as mudansas no padrao de crescimento que ocorrem ao longo das fases da vida do animal.[0065] A "growth coefficient per thermal unit" (TGC) is a mathematical coefficient that describes the growth of aquatic species that explains the changes in growth pattern that occur throughout the animal's life stages.

[0066] "Molecula de triglicerideo" se refere a um unico triglicerideo composto por tres acidos graxos que estao ligados a uma cadeia principal de glicerol, tais como esteres. "6leos de triglicerideos" se referem a uma cole?ao de moleculas de triglicerideos variaveis que diferem na natureza e propor5ao dos diferentes acidos graxos e na forma como os diferentes acidos graxos estao ligados a cadeia principal de glicerol em rela?ao uns aos outros.[0066] "Triglyceride molecule" refers to a single triglyceride composed of three fatty acids that are linked to a glycerol backbone, such as esters. "Triglyceride oils" refer to a collection of variable triglyceride molecules that differ in the nature and proportion of the different fatty acids and in the way in which the different fatty acids are linked to the glycerol backbone in relation to each other.

[0067] Em algumas modalidades, as celulas microbianas contem oleos de triglicerideos ricos em DHA. Fontes comerciais de oleos ricos em DHA sao obtidas a partir das especies do genero Schizochytrium, com sp. denotando que a especie e nao identificada. Essas celulas podem ser preparadas por fermenta?ao heterotrofica conforme descrito por Barclay em E.U.A. 5.130.242, 5.340.742 e 5.340.594.[0067] In some embodiments, microbial cells contain triglyceride oils rich in DHA. Commercial sources of oils rich in DHA are obtained from species of the genus Schizochytrium, with sp. denoting that the species is not identified. These cells can be prepared by heterotrophic fermentation as described by Barclay in US 5,130,242, 5,340,742 and 5,340,594.

[0068] A maioria dos processos comerciais para produzir celulas DHA envolve o uso de um meio de cultura definido, vasos de fermenta?ao aerobicos industrials, parametros operacionais definidos (tais como pH/temperatura/niveis de sal) e secadores de tambor duplo para produzir o po caracteristico de flocos finos.[0068] Most commercial processes for producing DHA cells involve the use of a defined culture medium, industrial aerobic fermentation vessels, defined operational parameters (such as pH/temperature/salt levels) and double drum dryers to produce the characteristic powder of fine flakes.

[0069] A agua do mar contem cerca de 0,55 M de cloreto. Os ions de cloreto causam corrosao em equipamentos de a?o inoxidavel em ambientes industrials. E vantajoso minimizar a quantidade de cloreto nos meios de fermenta?ao e de outros liquidos usados durante o cultivo e o de modo a para minimizar a corrosao. Organismos marinhos que foram adaptados para crescer em condi?oes com concentrasoes de cloreto inferiores a 0,55 M sao conferidos no presente documento. As condi?oes de baixo teor de cloreto da invensao sao 300 a 500 mM de cloreto, 100 a 300 mM de cloreto, 50 a 100 mM de cloreto, 1 a 75 mM de cloreto, 1 a 50 mM de cloreto, 1 a 40 mM de cloreto, 1 a 30 mM de cloreto, 1 a 20 mM de cloreto, 1 a 15 mM de cloreto, 1 a 1 0 mM de cloreto, 0,5 a 10 mM de cloreto, 0,5 a 7,5 mM de cloreto ou 0,5 a 5 mM de cloreto.[0069] Seawater contains about 0.55 M chloride. Chloride ions cause corrosion in stainless steel equipment in industrial environments. It is advantageous to minimize the amount of chloride in fermentation media and other liquids used during cultivation and in order to minimize corrosion. Marine organisms that have been adapted to grow in conditions with chloride concentrations below 0.55 M are discussed in this document. The low chloride conditions of the invention are 300 to 500 mM chloride, 100 to 300 mM chloride, 50 to 100 mM chloride, 1 to 75 mM chloride, 1 to 50 mM chloride, 1 to 40 mM chloride, 1 to 30 mM chloride, 1 to 20 mM chloride, 1 to 15 mM chloride, 1 to 10 mM chloride, 0.5 to 10 mM chloride, 0.5 to 7.5 mM of chloride or 0.5 to 5 mM chloride.

[0070] A secagem das celulas microbianas no caldo de fermenta?ao aquoso pode ser realizada primeiro desaguando opcionalmente o caldo de fermenta?ao (concentrando o caldo de fermenta?ao) de modo a aumentar o conteudo celular do caldo. Desaguamento ou concentra?ao se refere a separa?ao da biomassa do caldo de fermenta?ao ou outro meio liquido e, portanto, e uma separa?ao solido-liquido. Assim, durante o desaguamento, o meio de cultura e removido da biomassa (por exemplo, se drenando o caldo de fermenta?ao atraves de um filtro que retem a biomassa), ou a biomassa e de outra forma removida do meio de cultura. Processos comuns de desaguamento incluem centrifuga?ao, filtra?ao e o uso de pressao mecanica. Esses processos podem ser usados individualmente ou em qualquer combina?ao.[0070] Drying the microbial cells in the aqueous fermentation broth can be carried out by first optionally dewatering the fermentation broth (concentrating the fermentation broth) in order to increase the cellular content of the broth. Dewatering or concentration refers to the separation of biomass from the fermentation broth or other liquid medium and is therefore a solid-liquid separation. Thus, during dewatering, the culture medium is removed from the biomass (for example, by draining the fermentation broth through a filter that retains the biomass), or the biomass is otherwise removed from the culture medium. Common dewatering processes include centrifugation, filtration and the use of mechanical pressure. These processes can be used individually or in any combination.

[0071] Apos o passo opcional de desaguamento, o caldo concentrado, agora com urn maior teor de solidos, pode ser seco por metodos de secagem conhecidos, incluindo, mas nao se limitando a secagem em tambor, secagem pneumatica, secagem por pulveriza?ao, liofilizasao e outros metodos de secagem.[0071] After the optional dewatering step, the concentrated juice, now with a higher solids content, can be dried by known drying methods, including, but not limited to drum drying, pneumatic drying, spray drying , freeze-drying and other drying methods.

[0072] Um secador de tambor opera aplicando uma pelicula do caldo de fermenta?ao (ou caldo de fermenta?ao desaguado) a superficie de um tambor aquecido e rolante. A porsao aquosa do caldo evapora deixando um solido seco na superficie do tambor. Os solidos secos sao entao raspados para fora do tambor com uma faca. Os secadores pneumaticos retiram ou arrastam o material que deve ser seco em um fluxo de ar quente. Enquanto o material e arrastado no ar quente, a umidade e rapidamente removida. O material seco e, entao, separado do ar umido e o ar umido e, entao, recirculado para a secagem adicional. Um secador por pulveriza?ao opera pulverizando o caldo de fermenta?ao (ou caldo de fermenta?ao desaguado) em uma dispersao de goticulas flnas em uma corrente de ar aquecido. O material arrastado e rapidamente seco e forma um po seco. A secagem por pulveriza?ao pode ser conseguida atraves de um secador em caixa, ou um secador por pulveriza?ao de forma alta, ou secador em leito fluidizado, ou um secador em leito fluidizado movel (p.ex., um secador por pulveriza?ao FilterMat®, GEA Process Engineering, Inc.).[0072] A drum dryer operates by applying a film of fermentation broth (or dewatered fermentation broth) to the surface of a heated, rolling drum. The aqueous portion of the broth evaporates leaving a dry solid on the surface of the drum. The dry solids are then scraped out of the drum with a knife. Pneumatic dryers remove or drag material that must be dried in a stream of hot air. As the material is drawn through the hot air, moisture is quickly removed. The dry material is then separated from the moist air and the moist air is then recirculated for further drying. A spray dryer operates by spraying fermentation broth (or dewatered fermentation broth) into a dispersion of fine droplets into a stream of heated air. The entrained material is quickly dried and forms a dry powder. Spray drying can be accomplished by means of a box dryer, or a high-form spray dryer, or fluidized bed dryer, or a mobile fluidized bed dryer (e.g., a spray dryer FilterMat®, GEA Process Engineering, Inc.).

[0073] Os pos secos podem ser misturados com oleos que foram extraidos de outros organismos. Os oleos podem ser oleos puros que sao substancialmente isentos de materials solidos. Os oleos podem ser oleos extraidos, tais como oleos vegetais, oleos de peixe ou combinasoes dos mesmos. Os oleos sao predominantemente oleos de triglicerideos. Os oleos de peixe ricos em DHA incluem os oleos de anchovas selvagens da America do Sul e arenque do hemisferio norte. Os oleos misturados com os pos secos tambem podem incluir o oleo extraido dos thraustochytrids. Em alguns casos, onde os oleos sao predominantemente oleos vegetais e contem menos de 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de oleo de peixe.[0073] Dry powders can be mixed with oils that have been extracted from other organisms. The oils may be pure oils that are substantially free of solid materials. The oils may be extracted oils, such as vegetable oils, fish oils or combinations thereof. The oils are predominantly triglyceride oils. DHA-rich fish oils include oils from wild anchovies from South America and herring from the Northern Hemisphere. Oils mixed with dry powders may also include oil extracted from thraustochytrids. In some cases, where the oils are predominantly vegetable oils and contain less than 50%, 40%, 30%, 20% or 10% fish oil.

[0074] Os pos misturados e os oleos podem ser moldos ou ser usados outros metodos para lisar as celulas microbianas. A lise das celulas permite que o oleo de triglicerideo das celulas seja liberado na composi?ao do ingrediente para alimento. A lise mecanica pode ser realizada por varios metodos bem conhecidos, tais como moinho de rolos, homogeneizador ou moagem de esferas.[0074] The mixed powders and oils can be molded or other methods used to lyse the microbial cells. Cell lysis allows triglyceride oil from cells to be released into the food ingredient composition. Mechanical lysis can be carried out by several well-known methods, such as roller mill, homogenizer or ball milling.

[0075] A extensao do rompimento celular pode ser verificada por analise microscopica. A porcentagem das celulas lisadas pode ser determinada atraves da observa?ao e contando o numero de celulas lisadas e nao lisadas apos a lise das celulas. Em modalidades especificas, as celulas lisadas da invensao sao superiores a 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% lisadas.[0075] The extent of cellular disruption can be verified by microscopic analysis. The percentage of lysed cells can be determined by observing and counting the number of lysed and unlysed cells after cell lysis. In specific embodiments, the lysed cells of the invention are greater than 50%, 60%, 70%, 80%, 90% or 95% lysed.

[0076] A lise ou ruptura das celulas pode ser realizada por metodos mecanicos, enzimaticos, quimicos, virais, eletricos, ultrassonicos, osmoticos ou outros. Um disruptor de pressao, tal como um homogeneizador de elevada pressao, pode ser usado para lisar as celulas. Um desregulador de pressao faz a lise das celulas atraves do bombeamento de uma mistura de celulas e oleo, por exemplo, oleo de canola ou outro oleo vegetal, atraves de uma valvula de oriflcio restrita para lisar as celulas. Pressoes elevadas (de 5 MPa (50 bar) ate 150 MPa (1.500 bar)) sao aplicadas, seguidas por uma expansao instantanea atraves de um bocal de saida. Um homogeneizador Niro (Niro Soavi GEA) (ou qualquer outro homogeneizador de pressao elevada) ou outro homogeneizador comercialmente disponivel pode ser usado para processar celulas em particulas de 5 a 500 micrometros de comprimento. A razao de aspecto das celulas lisadas diminui de um valor de cerca de 1:1 para celulas nao lisadas para 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10. Processamento de biomassa com homogeneizadores de pressao elevada pode produzir lise das celulas para mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais do que 95% das celulas, atraves do controle da pressao, velocidade de salda e outros parametros.[0076] Cell lysis or rupture can be carried out by mechanical, enzymatic, chemical, viral, electrical, ultrasonic, osmotic or other methods. A pressure disruptor, such as a high pressure homogenizer, can be used to lyse the cells. A pressure regulator lyses cells by pumping a mixture of cells and oil, for example, canola oil or other vegetable oil, through a restricted orifice valve to lyse the cells. High pressures (from 5 MPa (50 bar) to 150 MPa (1,500 bar)) are applied, followed by instantaneous expansion through an outlet nozzle. A Niro homogenizer (Niro Soavi GEA) (or any other high pressure homogenizer) or other commercially available homogenizer can be used to process cells into particles 5 to 500 micrometers in length. The aspect ratio of lysed cells decreases from a value of about 1:1 for unlysed cells to 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 or 1:10. Biomass processing with high pressure homogenizers can produce cell lysis for more than 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or more than 95% of the cells, through controlling the pressure, speed of output and other parameters.

[0077] Altemativamente, um moinho de bolas (tambem conhecido como moinho de esferas) pode ser usado. Em um moinho de bolas, as celulas sao agitadas em suspensao com pequenas particulas abrasivas, tais como esferas. As celulas rompem devido as forsas de cisalhamento, o trituramento entre as esferas e as colisoes com as esferas. As esferas rompem as celulas de modo a liberarem os conteudos celulares. O moinho de bolas Dyno-mill ECM Ultra (CB Mills) e outros moinhos de esferas comercialmente disponiveis podem ser usados. As celulas tambem podem ser rompidas por forsas de cisalhamento, tais como com o uso de mistura (tal como com uma misturador de alta velocidade ou um misturador de Waring, como exemplos), a prensa francesa, ou mesmo por centrifuga?ao para romper as celulas. Os misturadores de cisalhamento podem ser usados para lisar celulas, incluindo misturadores de alto cisalhamento em linha e misturadores de alto cisalhamento em massa.[0077] Alternatively, a ball mill (also known as a ball mill) can be used. In a ball mill, cells are agitated in suspension with small abrasive particles such as spheres. The cells rupture due to shear forces, grinding between the spheres and collisions with the spheres. The spheres rupture the cells to release the cellular contents. The Dyno-mill ECM Ultra ball mill (CB Mills) and other commercially available ball mills can be used. Cells can also be disrupted by shear forces, such as with the use of mixing (such as with a high-speed mixer or a Waring mixer, as examples), the French press, or even by centrifugation to break up the cells. cells. Shear mixers can be used to lyse cells, including in-line high shear mixers and bulk high shear mixers.

[0078] A razao de aspecto da celula lisada e menor do que 1:1. Noutra modalidade, a razao de aspecto e de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10. A razao de aspecto da celula nao lisada e aproximadamente de 1:1. Uma vantagem das celulas lisadas e que tern uma razao de aspecto inferior a 1:1. A razao de aspecto menor e vantajosa uma vez que, como e usada a suspensao de celula lisada/oleo em equipamentos industrials, a pasta de celula lisada/oleo evita ou minimiza o entupimento do equipamento, incluindo orificios que sao usados para pulverizar a suspensao de celula lisada/oleo no alimento extrudado.[0078] The aspect ratio of the lysed cell is less than 1:1. In another embodiment, the aspect ratio is 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 or 1:10. The aspect ratio of the unlysed cell is approximately 1:1. An advantage of lysed cells is that they have an aspect ratio of less than 1:1. The smaller aspect ratio is advantageous since, as the lysed cell/oil suspension is used in industrial equipment, the lysed cell/oil slurry prevents or minimizes clogging of the equipment, including holes that are used to spray the lysed cell suspension. lysed cell/oil in the extruded food.

[0079] A composi?ao do ingrediente para alimento pode entao ser formulada com outros ingredientes de alimento de modo a produzir um alimento formulado. Em algumas modalidades, a composi?ao do ingrediente para alimento contendo celulas lisadas e revestida em alimento prensado ou extrudado, tal como por pulveriza?ao. Os alimentos prensados ou extrudados podem ser ricos em proteinas, tais como os derivados de peixes e/ou subprodutos animais. O alimento formulado tambem pode incluir aditivos adicionais de modo a melhorar o sabor, a estabilidade e a vida de prateleira.[0079] The food ingredient composition can then be formulated with other food ingredients to produce a formulated food. In some embodiments, the food ingredient composition containing lysed cells is coated onto pressed or extruded food, such as by spraying. Pressed or extruded foods can be rich in proteins, such as those derived from fish and/or animal by-products. The formulated food may also include additional additives to improve flavor, stability and shelf life.

[0080] O alimento formulado pode ser usado em um aquacultura para alimentar peixes de viveiro ou marisco. Peixes de viveiro incluem peixes camivoros. Em algumas modalidades os peixes de viveiro ou o marisco sao salmonideos, enguias, crustaceos, peixes marinhos, peixes de agua doce, tilapia ou enguias. Noutras modalidades, o peixe ou marisco e um robalo, goraz, olho-de-boi, garoupa, perca ou camarao.[0080] The formulated food can be used in an aquaculture to feed farmed fish or shellfish. Farmed fish include camivorous fish. In some embodiments, farmed fish or shellfish are salmonids, eels, crustaceans, marine fish, freshwater fish, tilapia or eels. In other modalities, the fish or seafood is sea bass, sea bream, amberjack, grouper, perch or shrimp.

ExemplosExamples Exemplo 1. Ingrediente do alimentoExample 1. Food ingredient

[0081] Celulas de Schizochytrium ricas em DHA (biomassa) preparadas por fermenta?ao heterotrofica padrao foram secas e misturadas usando um misturador de tipo impulsor padrao com oleo de canola em niveis de carga de 10%, 20% e 30% em peso de biomassa. A biomassa em misturas de oleo foi entao processada atraves de um homogeneizador de alta pressao ou um moinho de esferas de forma a produzir uma dispersao de celulas de algas lisadas em oleo. Para a lise no homogeneizador de alta pressao, pressoes de 20 MPa a 120 MPa (200 a 1.200 bar) foram usadas e foram suficientes para lisar as celulas.[0081] DHA-rich Schizochytrium cells (biomass) prepared by standard heterotrophic fermentation were dried and mixed using a standard impeller type mixer with canola oil at loading levels of 10%, 20% and 30% by weight of biomass. The biomass in oil mixtures was then processed through a high pressure homogenizer or ball mill to produce a dispersion of lysed algal cells in oil. For lysis in the high-pressure homogenizer, pressures of 20 MPa to 120 MPa (200 to 1,200 bar) were used and were sufficient to lyse the cells.

Exemplo 2. Analise de mistura e dispersoes preparadas a partir da misturaExample 2. Analysis of mixture and dispersions prepared from the mixture

[0082] Uma mistura de biomassa de 20% em peso com oleo de canola do Exemplo 1 foi preparada e analisada por analise de tamanho de particula por difra?ao a laser em um Malvern Mastersizer 3000. A mistura tambem foi homogeneizada a 40 MPa (400 bar) e submetida a moagem de esferas, e as dispersoes resultantes tambem foram analisadas. A Figura 1 mostra que as dispersoes submetidas a moagem de esferas tinham um tamanho de particula medio inferior as dispersoes homogeneizadas, e ambas tinham tamanhos medios de particula inferiores aos da mistura parental.[0082] A mixture of 20% by weight biomass with canola oil from Example 1 was prepared and analyzed by laser diffraction particle size analysis on a Malvern Mastersizer 3000. The mixture was also homogenized at 40 MPa ( 400 bar) and subjected to ball milling, and the resulting dispersions were also analyzed. Figure 1 shows that the ball milled dispersions had a smaller average particle size than the homogenized dispersions, and both had smaller average particle sizes than the parent mixture.

[0083] Os tamanhos menores tambem sao vistos nas micrografias da Figura 2 (amplia?ao de 400x). O valor de Dv50 (valor de distribui?ao de 50% ou menos) da mistura foi de 228 pm, enquanto a dispersao homogeneizada tinha um Dv50 de 15,3 pm e as dispersoes submetidas a moagem de esferas tinham um Dv50 de 3,8 pm, indicando que as dispersoes tern melhores caracteristicas para uso em pulverizadores.[0083] The smaller sizes are also seen in the micrographs in Figure 2 (400x magnification). The Dv50 value (distribution value of 50% or less) of the mixture was 228 pm, while the homogenized dispersion had a Dv50 of 15.3 pm and the ball milled dispersions had a Dv50 of 3.8 pm, indicating that the dispersions have better characteristics for use in sprayers.

[0084] Um Reometro Malvern Kinexus Pro foi usado para medir a viscosidade da Figura 3. Se descobriu que as dispersoes submetidas a moagem de esferas tinham uma viscosidade mais baixa do que qualquer taxa de cisalhamento dada em compara?ao com as dispersoes homogeneizadas, que por sua vez eram mais baixas que a mistura.[0084] A Malvern Kinexus Pro Rheometer was used to measure the viscosity of Figure 3. It was found that the ball milled dispersions had a lower viscosity than any given shear rate compared to the homogenized dispersions, which in turn, they were lower than the mixture.

[0085] A mistura e as duas dispersoes foram deixadas a assentar e as suas aparencias apos uma semana sao mostradas na Figura 4. Se descobriu que as dispersoes submetidas a moagem de esferas permanecem substancialmente em suspensao. A mistura mostrou o maior grau de sedimenta?ao.[0085] The mixture and the two dispersions were allowed to settle and their appearances after one week are shown in Figure 4. It was found that the dispersions subjected to ball milling remain substantially in suspension. The mixture showed the highest degree of sedimentation.

Exemplo 3. Analise de estabilidade oxidativaExample 3. Oxidative stability analysis

[0086] A biomassa seca do Exemplo 1 foi combinada com varios antioxidantes usando um misturador manual. A biomassa seca com ou sem antioxidantes foi analisada usando um Oxipress a aproximadamente 80°C. Foram usados antioxidantes naturais e sinteticos e incluiram L-alfa- Lecitina (soja, Calbiochem # 429415), amido (milho, Argo), acido ascorbico (Spectrum Chemical Co.), Liquido ParadigmOx White (PWL- galatos, Kemin), RPT40 (alecrim, tocoferol, palmitato de ascorbila, Kemin), NaturFort LGR105 (extrato de cha verde e alecrim, Kemin), Rendox CQ (TBHQ, Kemin), Rendox EQ (etoxiquina, Kemin) BHT (cristalino dissolvido em etanol, Kemin) e Covi-ox T-30P (tocoferois mistos). A Figura 5 mostra a surpreendente e inesperada estabilidade oxidativa de certas biomassas contendo lecitina.[0086] The dry biomass from Example 1 was combined with various antioxidants using a manual mixer. Dry biomass with or without antioxidants was analyzed using an Oxipress at approximately 80°C. Natural and synthetic antioxidants were used and included L-alpha-Lecithin (soy, Calbiochem #429415), starch (corn, Argo), ascorbic acid (Spectrum Chemical Co.), ParadigmOx White Liquid (PWL-gallates, Kemin), RPT40 ( rosemary, tocopherol, ascorbyl palmitate, Kemin), NaturFort LGR105 (green tea and rosemary extract, Kemin), Rendox CQ (TBHQ, Kemin), Rendox EQ (ethoxyquin, Kemin) BHT (crystalline dissolved in ethanol, Kemin) and Covi -ox T-30P (mixed tocopherols). Figure 5 shows the surprising and unexpected oxidative stability of certain lecithin-containing biomasses.

[0087] A estabilidade oxidativa da biomassa quando preparada com antioxidantes RPT40 (4000 ppm) e lecitina (1%) e aproximadamente 22 horas a 80°C. Isto e surpreendente e inesperado uma vez que a estabilidade oxidativa da biomassa quando formulada com 4.000 ppm apenas de RPT40 e de cerca de 16 horas e a estabilidade oxidativa da biomassa quando formulada com apenas 1% de lecitina e de cerca de 1,5 horas. Quando a biomassa e formulada com ambos RPT40 e lecitina, a estabilidade e de 22 horas, muito superior a estabilidade prevista de 17,5 horas.[0087] The oxidative stability of biomass when prepared with antioxidants RPT40 (4000 ppm) and lecithin (1%) and approximately 22 hours at 80°C. This is surprising and unexpected since the oxidative stability of biomass when formulated with just 4,000 ppm of RPT40 is about 16 hours and the oxidative stability of biomass when formulated with just 1% lecithin is about 1.5 hours. When biomass is formulated with both RPT40 and lecithin, stability is 22 hours, much higher than the expected stability of 17.5 hours.

Exemplo 4. Alimento formuladoExample 4. Formulated food

[0088] A pasta do Exemplo 1 foi revestida por cima em peletes de alimento extrudadas usando um aparelho de revestimento a vacuo. O pelete resultante continha 20% em peso da dispersao do Exemplo 1.[0088] The paste from Example 1 was top coated onto extruded food pellets using a vacuum coating apparatus. The resulting pellet contained 20% by weight of the dispersion from Example 1.

Exemplo 5. Estudo de alimento de salmonldeoExample 5. Salmonid food study

[0089] Quatro dietas de aquacultura foram formuladas para conter 2,0% de DHA e uma proporsao de DHA para EPA entre 2,1 e 2,5. A Tabela 1 abaixo divulga os ingredientes e as quantidades de cada ingrediente para as dietas A, B, C e D. A Tabela 2 abaixo divulga o conteudo nutricional das quatro dietas. A dieta A (controle) nao continha qualquer biomassa de Schizochytrium, mas usava oleo de peixe padrao aplicado como revestimento de cobertura como a principal fonte dietetica de DHA (alem da farinha de peixe que contem baixos niveis de DHA). A dieta B continha biomassa de Schizochytrium nao lisada. Para a dieta B, apos o alimento ser extrudado, os peletes foram revestidos com oleo de canola e oleo de arenque. A dieta C continha biomassa de Schizochytrium submetida a moagem com esferas que foi misturada com oleo de canola e revestida a vacuo juntamente com os outros oleos mostrados na Tabela 1 em alimento para salmao extrudado. A dieta D continha biomassa de Schizochytrium que foi homogeneizada a 40 MPa (400 bar) e misturada com oleo de canola e revestida a vacuo juntamente com os outros oleos mostrados na Tabela 1 em alimento para salmao extrudado. Os niveis de DHA acabaram sendo menores que o esperado em ~ 1,5% em vez de 2%. Essa discrepancia entre os teores de DHA na dieta calculados e observados pode ter resultado de niveis de DHA inferiores aos habituais em um dos oleos de peixe. A Tabela 2 mostra o conteudo nutritivo das dietas A, B, C e D. O oleo de arenque foi comprado e o teor tipico de acido graxo do oleo de arenque pode ser encontrado em NRC (2011). O ingrediente de oleo de peixe de atum 70DHA esta comercialmente disponivel a partir da Edwards International Inc. Tabela 1: Formulas de alimento (calculadas) das dietas experimentais Tabela 2: Conteudo nutricional calculado das dietas experimentais [0089] Four aquaculture diets were formulated to contain 2.0% DHA and a DHA to EPA ratio between 2.1 and 2.5. Table 1 below discloses the ingredients and quantities of each ingredient for diets A, B, C and D. Table 2 below discloses the nutritional content of the four diets. Diet A (control) did not contain any Schizochytrium biomass, but used standard fish oil applied as a top coat as the main dietary source of DHA (apart from fishmeal which contains low levels of DHA). Diet B contained unlysed Schizochytrium biomass. For diet B, after the food was extruded, the pellets were coated with canola oil and herring oil. Diet C contained ball-milled Schizochytrium biomass that was mixed with canola oil and vacuum coated along with the other oils shown in Table 1 on extruded salmon feed. Diet D contained Schizochytrium biomass that was homogenized at 40 MPa (400 bar) and mixed with canola oil and vacuum coated along with the other oils shown in Table 1 on extruded salmon feed. DHA levels ended up being lower than expected by ~1.5% instead of 2%. This discrepancy between calculated and observed dietary DHA levels may have resulted from lower than usual DHA levels in one of the fish oils. Table 2 shows the nutritional content of diets A, B, C and D. Herring oil was purchased and the typical fatty acid content of herring oil can be found in NRC (2011). The tuna fish oil ingredient 70DHA is commercially available from Edwards International Inc. Table 1: Feed formulas (calculated) of the experimental diets Table 2: Calculated nutritional content of experimental diets

[0090] A Tabela 3 mostra a compara?ao entre a composi?ao de nutrientes calculados (Cal.) e analisados de dietas experimentais. Na Tabela 3, AVC e NJFL se referem aos laboratories onde as analises foram conduzidas. A protelna em bruto analisada nas dietas experimentais foi 24% superior do que a calculada. Em contraste, os lipideos em bruto da dieta analisada, DHA e EPA, foram menores que os calculados. Pequenas diferensas tambem foram observadas entre os laboratories;[0090] Table 3 shows the comparison between the calculated (Cal.) and analyzed nutrient composition of experimental diets. In Table 3, AVC and NJFL refer to the laboratories where the analyzes were conducted. The crude protein analyzed in the experimental diets was 24% higher than that calculated. In contrast, the crude lipids of the analyzed diet, DHA and EPA, were lower than those calculated. Small differences were also observed between laboratories;

[0091] As diferensas entre os nutrientes calculados e analisados podem ser explicadas pela composi?ao de ingredientes que diferem por vezes, de um lote para o outro, bem como a partir da composi?ao prescrita no software de formula?ao e incertezas dos metodos analiticos. Tabela 3: compara?ao entre a composi?ao de nutrientes calculados (Cal.) e analisados [0091] The differences between the calculated and analyzed nutrients can be explained by the composition of ingredients that sometimes differ from one batch to another, as well as from the composition prescribed in the formulation software and uncertainties of the analytical methods. Table 3: comparison between the calculated (Cal.) and analyzed nutrient composition

[0092] Condicoes de cultivo: Agua salgada em um sistema de recirculacao de aquacultura equipado com oito tanques circulares de 850 litros. A agua foi mantida a 13,7 ± 1,3°C e > 80% de satura?ao de oxigenio dissolvido. Cada dieta experimental foi alocada aleatoriamente em dois tanques.[0092] Cultivation conditions: Salt water in an aquaculture recirculation system equipped with eight 850-liter circular tanks. The water was maintained at 13.7 ± 1.3°C and > 80% dissolved oxygen saturation. Each experimental diet was randomly allocated to two tanks.

[0093] Colheita de amostras: Foram preparados files de nove peixes (agrupados) no inicio e tres peixes de cada tanque nos dias 28, 56, 84 e 112. Os Files correspondiam a Trim E em http://primanor.com/salmon-fillet-trim-guide/, ou seja, sem pele, aparados sem gordura da barriga, sem barbatanas. A unica exce?ao foi que as espinhas finas nao foram removidas. A materia fecal, agrupada por grupo de tratamento, foi coletada no dia 84 e 112.[0093] Sample collection: Files of nine fish (grouped) were prepared at the beginning and three fish from each tank on days 28, 56, 84 and 112. The Files corresponded to Trim E at http://primanor.com/salmon -fillet-trim-guide/, i.e. skinless, trimmed without belly fat, without fins. The only exception was that the thin pimples were not removed. Fecal matter, grouped by treatment group, was collected on days 84 and 112.

[0094] Analise de laboratorio: Foram realizadas analises proximais de composi?oes de proteina, lipideo, cinza, materia seca e acidos graxos totais de dietas (n = 4), fezes (n = 8) e files em tres peixes por tanque agrupados por tanque (n = 33). A analise quimica foi conduzida da seguinte forma: materia seca, 105°C por 16 h (AOAC 930.15), cinza no minimo 6 h a 550°C e nitrogenio (AOAC 990.03; usando um analisador de 78 elementos LECO FP528, St. Joseph, MI, EUA; proteina em bruto = N x 6,25) e lipideo (Bligh & Dyer, 1959). Os teores totais de acidos graxos das dietas e files foram determinados, de acordo com McNiven et al. (2011). Resumidamente, os esteres metilicos de acidos graxos (FAME) foram preparados de acordo com o procedimento de Sukhija e Palmquist (1988) e foram analisados em um cromatografo liquido a gas da Hewlett Packard 5890 equipado com um autoamostrador e injetor da serie 7673, coluna capilar de silica fundida Agilent DB23 (30 m x 0,53 mm x 0,5 m de espessura da pelicula), detector FID e integrado com o software Agilent Chemstation (Agilent Technologies Canada Inc., Mississauga, ON, Canada). As condi?oes operacionais foram: Inje?ao em coluna; temperatura do fomo, 70°C durante 0,5 min, em seguida, 10°C/min ate 170°C e mantida durante 3 min, 5°C/min ate 210°C e mantida durante 6 min, 25°C/min ate 230°C e mantida por 4,2 min; temperatura do detector, 250°C; hidrogenio como gas transportador e nitrogenio como gas de compensa?ao. O acido nonadecanoico foi adicionado como um padrao intemo e padroes FAME (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN, EUA; Matreya,Pleasant Gap, PA, EUA) foram usados para identificar os picos cromatograficos. Os resultados foram relatados como mg/100 mg de acido graxo total usando fatores de corre?ao publicados (Ackman, 2002).[0094] Laboratory analysis: Proximal analyzes of protein, lipid, ash, dry matter and total fatty acid compositions of diets (n = 4), feces (n = 8) and files were carried out on three grouped fish per tank per tank (n = 33). Chemical analysis was conducted as follows: dry matter, 105°C for 16 h (AOAC 930.15), ash at least 6 h at 550°C and nitrogen (AOAC 990.03; using a 78-element analyzer LECO FP528, St. Joseph, MI, USA; crude protein = N x 6.25) and lipid (Bligh & Dyer, 1959). The total fatty acid content of diets and files were determined, according to McNiven et al. (2011). Briefly, fatty acid methyl esters (FAME) were prepared according to the procedure of Sukhija and Palmquist (1988) and were analyzed on a Hewlett Packard 5890 gas liquid chromatograph equipped with a 7673 series autosampler and injector, capillary column of Agilent DB23 fused silica (30 m x 0.53 mm x 0.5 m film thickness), FID detector and integrated with Agilent Chemstation software (Agilent Technologies Canada Inc., Mississauga, ON, Canada). The operating conditions were: Column injection; oven temperature, 70°C for 0.5 min, then 10°C/min to 170°C and held for 3 min, 5°C/min to 210°C and held for 6 min, 25°C/min min up to 230°C and maintained for 4.2 min; detector temperature, 250°C; hydrogen as carrier gas and nitrogen as compensation gas. Nonadecanoic acid was added as an internal standard and FAME standards (Nu-Chek-Prep, Elysian, MN, USA; Matreya, Pleasant Gap, PA, USA) were used to identify chromatographic peaks. Results were reported as mg/100 mg total fatty acid using published correction factors (Ackman, 2002).

[0095] Calculos e Analise Estatistica: A taxa de crescimento foi calculada usando o coeficiente de crescimento por unidade termica (TGC): onde Wf e Wo sao peso corporal final e inicial, respectivamente, de peixe em unidades de g, n (= 1,2,...) e o numero de dias registrados a partir de Wo, e Tt (°C) e a temperatura media diaria da agua.[0095] Calculations and Statistical Analysis: The growth rate was calculated using the growth coefficient per thermal unit (TGC): where Wf and Wo are the final and initial body weight, respectively, of fish in units of g, n (= 1,2,...) and the number of days recorded from Wo, and Tt (°C) is the average daily water temperature.

[0096] Os resultados das analises de acidos graxos e proximos serviram para descrever as taxas de deposi?ao de nutrientes usando a seguinte equa?ao (Dumas et al., 2007): onde Dj e a taxa de deposi?ao [mg (°C • d)"1] de nutrientes j, Fj e Ij sao a massa final e inicial da totalidade do corpo de nutrientes j (mg) no final e no inicio do periodo de 84 dias, respectivamente, n representa o numero de dias para o periodo de Fj a Ij, Tt (°C) e a temperatura media diaria da agua para o dia U, o produto do qual resulta em unidades de graus-dia.[0096] The results of the analyzes of fatty acids and nearby served to describe the rates of nutrient deposition using the following equation (Dumas et al., 2007): where Dj is the deposition rate [mg (°C • d)"1] of nutrients j, Fj and Ij are the final and initial mass of the entire body of nutrients j (mg) at the end and beginning of the period of 84 days, respectively, n represents the number of days for the period from Fj to Ij, Tt (°C) and the average daily water temperature for day U, the product of which results in units of degree days.

[0097] As taxas de deposi?ao de nutrientes serviram, por sua vez, para estimar a eflciencia da deposi?ao de nutrientes usando as seguintes equa?oes modificadas a partir de Dumas et al. (2007): onde eDj e eflciencia (%) da deposi?ao de nutriente y [mg (peixe)"1], INj (mg) e a ingestao diaria de nutriente j para o dia U.[0097] Nutrient deposition rates were, in turn, used to estimate the efficiency of nutrient deposition using the following equations modified from Dumas et al. (2007): where eDj is efficiency (%) of nutrient deposition y [mg (fish)"1], INj (mg) and the daily intake of nutrient j for day U.

[0098] Os resultados foram analisados usando ANOVA de uma via e o teste de compara?ao multipla de Tukey com JMP® versao 12.0.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).[0098] The results were analyzed using one-way ANOVA and Tukey's multiple comparison test with JMP® version 12.0.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

[0099] 4.0 Resultados e Discussao: Nao foram observadas diferensas estatisticas entre os tratamentos para o peso corporal inicial (P = 0,590), peso corporal final (P = 0,483), TGC (P = 0,387), consumo de alimento (P = 0,588) e eflciencia do alimento (P = 0,484) (Tabela 4). Alem disso, os tratamentos alimentares nao afetaram significativamente o consumo de alimento e a eflciencia do alimento (os valores de P variaram entre 0,44 e 0,90). O crescimento de salmao alimentado com dietas C (AP- BM) e D (AP-H400) foi superior a do Controle e B (AP). Os valores de TGC observados neste estudo sao comparaveis com outros estudos realizados com a mesma estirpe de salmao (por exemplo, Wolters et al., 2009). Esses resultados indicaram que a inclusao de AlgaPrime nas dietas de salmao sustentou o desempenho do crescimento e a conversao do alimento de forma semelhante ao oleo de peixe.[0099] 4.0 Results and Discussion: No statistical differences were observed between treatments for initial body weight (P = 0.590), final body weight (P = 0.483), TGC (P = 0.387), food consumption (P = 0.588 ) and food efficiency (P = 0.484) (Table 4). Furthermore, food treatments did not significantly affect food consumption and food efficiency (P values ranged between 0.44 and 0.90). The growth of salmon fed diets C (AP-BM) and D (AP-H400) was superior to that of Control and B (AP). The TGC values observed in this study are comparable with other studies carried out with the same salmon strain (e.g. Wolters et al., 2009). These results indicated that the inclusion of AlgaPrime in salmon diets supported growth performance and feed conversion in a similar way to fish oil.

[00100] A tabela 4 mostra o peso corporal inicial (IBW) e o peso corporal final (FBW), o coeficiente de crescimento por unidade termica (TGC), o consumo de alimento (FI) e a eflciencia do alimento (FE) de salmao do Atlantico alimentado com dietas contendo tanto sem AlgaPrime (Controle), refei?ao de AlgaPrime (AP), esferas moidas de AlgaPrime (AP- BM) e AlgaPrime homogeneizado a 40 MPa (400 bar) (AP-H400); os dados sao medias (desvio padrao); os valores medios em uma coluna sem sobrescrito em comum diferem significativamente (p <0,05) com base no teste de Tukey (a ausencia de sobrescrito indica que nao ha diferen£a). O peso corporal final das dietas B, C e D, quando comparado com o salmao que foi alimentado com a dieta de controle (sem AlgaPrime). O coeficiente de crescimento termico aumentou de 0,176 ate 0,193, com p <0,05. Tabela 4 [00100] Table 4 shows the initial body weight (IBW) and final body weight (FBW), the growth coefficient per thermal unit (TGC), the feed intake (FI) and the feed efficiency (FE) of Atlantic salmon fed diets containing both no AlgaPrime (Control), AlgaPrime meal (AP), AlgaPrime ground beads (AP-BM) and AlgaPrime homogenized at 40 MPa (400 bar) (AP-H400); data are averages (standard deviation); mean values in a column without a common superscript differ significantly (p < 0.05) based on Tukey's test (the absence of a superscript indicates no difference). The final body weight of diets B, C and D, when compared to salmon that were fed the control diet (without AlgaPrime). The thermal growth coefficient increased from 0.176 to 0.193, with p <0.05. Table 4

[00101] Utiliza?ao e deposito de DHA: As diferen£as observadas entre os tratamentos para as concentra?oes de protelna (P = 0,626), de lipldeos (P = 0,185), DHA (P = 0,699) e EPA (P = 0,256) nos files de salmao do Atlantico neste estudo sao mostrados na Tabela 5. Inesperadamente, o maior teor de DHA em files foi obtido com AlgaPrime homogeneizado a 40 MPa (400 bar). A composi?ao do file nao foi significativamente afetada pelos tratamentos dieteticos neste estudo (Tabela 5). O teor de protelna no file de salmao do Atlantico (FP) esteve de acordo com a literatura (por exemplo, Waagbo et al., 1993). No entanto, mais variabilidade foi observada com os lipldeos e acidos graxos. O teor de lipldeos dos files (FL) foi inferior aos observados por Waagbo et al. (1993) e Acharya (2011), mas permaneceram dentro da faixa relatada pela FAO (http://www.fao.org/wairdocs/tan/x5916e/x5916e01.htm). O teor de DHA (FDHA) e EPA (FEPA) foi quase 5X e 2X superior, respectivamente, neste estudo em compara?ao com files de salmao do Atlantico do Chile e do Canada adquiridos em uma mercearia local (Apendice 2). Em contraste, o nivel de DHA + EPA de salmao do Atlantico comprado na mercearia local foi 2 X superior, pelo menos do que no nosso estudo (por exemplo, Kousoulaki et al., 2015; Sprague et al., 2016). Em Kousoulaki et al. (2016), o teor de DHA e EPA de files foi comparavel a este estudo em 0,7 e 0,1%, respectivamente. Essas diferen£as podem ser explicadas, pelo menos em parte, pelo teor de acidos graxos das fontes de lipideos da dieta e pelo aparo dos flies que pode afetar os resultados dos lipideos e dos acidos graxos.[00101] Use and deposit of DHA: The differences observed between treatments for the concentrations of protein (P = 0.626), lipids (P = 0.185), DHA (P = 0.699) and EPA (P = 0.256) in the Atlantic salmon fillets in this study are shown in Table 5. Unexpectedly, the highest DHA content in fillets was obtained with AlgaPrime homogenized at 40 MPa (400 bar). File composition was not significantly affected by dietary treatments in this study (Table 5). The protein content in Atlantic salmon fillet (FP) was in accordance with the literature (e.g. Waagbo et al., 1993). However, more variability was observed with lipids and fatty acids. The lipid content of the files (FL) was lower than that observed by Waagbo et al. (1993) and Acharya (2011), but remained within the range reported by FAO (http://www.fao.org/wairdocs/tan/x5916e/x5916e01.htm). The content of DHA (FDHA) and EPA (FEPA) was almost 5X and 2X higher, respectively, in this study compared to Atlantic salmon fillets from Chile and Canada purchased at a local grocery store (Appendix 2). In contrast, the DHA + EPA level of Atlantic salmon purchased at the local grocery store was at least 2X higher than in our study (e.g., Kousoulaki et al., 2015; Sprague et al., 2016). In Kousoulaki et al. (2016), the DHA and EPA content of files was comparable to this study at 0.7 and 0.1%, respectively. These differences can be explained, at least in part, by the fatty acid content of dietary lipid sources and fly trimming that can affect lipid and fatty acid results.

[00102] A Tabela 5 mostra o teor de proteina e de lipideo dos files de salmao. A proteina de file inicial e final (FP), lipideo (FL), acido docosa-hexaenoico (FDHA) e acido eicosapentaenoico (FEPA) de salmao do Atlantico alimentado com dietas contendo tanto sem AlgaPrime (Controle), refei?ao de AlgaPrime (AP), esferas moidas de AlgaPrime (AP- BM) e AlgaPrime homogeneizado a 40 MPa (400 bar) (AP-H400); os dados sao medias (desvio-padrao); os valores medios em uma coluna sem sobrescrito em comum diferem significativamente com base no teste de Tukey. A amostra inicial e o file do salmao antes do inicio do estudo do alimento (tratamento). Tabela 5: [00102] Table 5 shows the protein and lipid content of salmon fillets. Lead and end file protein (FP), lipid (FL), docosahexaenoic acid (FDHA) and eicosapentaenoic acid (FEPA) of Atlantic salmon fed diets containing both AlgaPrime (Control) and AlgaPrime meal ( AP), ground AlgaPrime spheres (AP-BM) and AlgaPrime homogenized at 40 MPa (400 bar) (AP-H400); data are averages (standard deviation); mean values in a column with no common superscript differ significantly based on Tukey's test. The initial sample is the salmon fillet before the start of the food study (treatment). Table 5:

[00103] Teor de DHA das fezes: O teor de DHA das fezes foi determinado. Com exce?ao da dieta B (AP), o teor de DHA nas fezes era ~75X inferior do que nas dietas, sugerindo que a maior parte do DHA da dieta foi absorvida pelo trato digestivo dos salmoes alimentados com as outras dietas (Tabela 6). O teor de DHA nas fezes de salmao alimentado com dieta B (AP) foi significativamente superior do que em outros tratamentos (P <0,05). Talvez a disponibilidade de DHA a partir da refei?ao de AP foi menor em compara?ao com AP mais processada, mas essa hipotese precisa de ser validada. Embora nao tenhamos estimado os coeficientes de digestibilidade neste estudo, demonstramos em um ensaio anterior que a digestibilidade de DHA a partir de AP foi elevada em ~ 95% (Dumas, 2016).[00103] DHA content of feces: The DHA content of feces was determined. With the exception of diet B (AP), the DHA content in the feces was ~75X lower than in the diets, suggesting that most of the DHA in the diet was absorbed by the digestive tract of salmon fed the other diets (Table 6 ). The DHA content in feces of salmon fed diet B (AP) was significantly higher than that in other treatments (P < 0.05). Perhaps the availability of DHA from the AP meal was lower compared to more processed AP, but this hypothesis needs to be validated. Although we did not estimate digestibility coefficients in this study, we demonstrated in a previous trial that DHA digestibility from AP was elevated by ~95% (Dumas, 2016).

[00104] Os teores de acido docosa-hexaenoico (DHA) em dietas e fezes de salmao do Atlantico alimentado com dietas contendo tanto sem AlgaPrime (Controle), refei?ao de AlgaPrime (AP), esferas moidas de AlgaPrime (AP-BM) e AlgaPrime homogeneizado a 40 MPa (400 bar) (AP-H400) sao mostrados na Tabela 6. Os dados sao medias (desvio padrao); os valores medios em uma coluna sem sobrescrito em comum diferem significativamente com base no teste de Tukey (a ausencia de sobrescrito indica que nao ha diferensa). A quantidade de DHA nas fezes de salmao alimentado com dieta B diferiu com p <0,05. Desse modo, o DHA conferido ao salmao na forma de pasta de algas lisada resultou em melhor absorsao pelo salmao do que quando conferido ao salmao como biomassa de algas nao lisada incorporada no alimento seco. Tabela 6 1 Nenhuma replicacao foi conduzida nas dietas.[00104] Docosahexaenoic acid (DHA) contents in diets and feces of Atlantic salmon fed diets containing both AlgaPrime (Control), AlgaPrime meal (AP), AlgaPrime ground beads (AP-BM) and AlgaPrime homogenized at 40 MPa (400 bar) (AP-H400) are shown in Table 6. Data are means (standard deviation); mean values in a column without a common superscript differ significantly based on the Tukey test (the absence of a superscript indicates no difference). The amount of DHA in the feces of salmon fed diet B differed with p <0.05. Thus, DHA imparted to the salmon in the form of lysed algal paste resulted in better absorption by the salmon than when imparted to the salmon as unlysed algal biomass incorporated into the dry feed. Table 6 1 No replications were conducted on the diets.

[00105] Os níveis de DHA aumentaram mais rapidamente durante o primeiro mês em filés de salmão alimentado com as Dietas B e C em comparação com os outros tratamentos (Figura 1). No dia 28, os teores de DHA nos filés de salmão alimentados com a dieta D foram de 0,27 e 0,45% nas amostras 1 e 2, respectivamente. A amostra de 0,27% pode ser considerada como um "outlier". Nesse caso, o teor de DHA nos filés seria idêntico entre a Dieta D e o Controle. No geral, os níveis mais elevados de DHA foram alcançados entre um e dois meses após o início do estudo, e os níveis permaneceram relativamente semelhantes posteriormente para os salmões alimentados com dietas contendo AP. Veja a Figura 7.[00105] DHA levels increased more rapidly during the first month in salmon fillets fed Diets B and C compared to the other treatments (Figure 1). On day 28, DHA contents in salmon fillets fed diet D were 0.27 and 0.45% in samples 1 and 2, respectively. The 0.27% sample can be considered an “outlier”. In this case, the DHA content in the fillets would be identical between Diet D and Control. Overall, the highest DHA levels were achieved between one and two months after the start of the study, and levels remained relatively similar thereafter for salmon fed diets containing AP. See Figure 7.

[00106] Deposição de proteína, DHA e EPA: As taxas de deposição de proteína, DHA e EPA nos filés de salmão do Atlântico aumentaram quando comparadas com o óleo de peixe de peixes alimentados (Tabela 7). Os valores de p das taxas de deposi?ao de proteina, DHA e EPA foram P=0,417, P=0,639 e P=0,197, respectivamente. As maiores taxas de deposi?ao de DHA foram observadas com AlgaPrime homogeneizado a 40 MPa (400 bar), o que e consistente com o maior teor de DHA relatado em files de salmao alimentados com o mesmo tratamento (Tabela 5 acima). A menor deposi?ao de DHA foi registrada com a dieta B (AP), que tambem resultou em fezes contendo o maior teor de DHA, conforme relatado na Tabela 6. Desse modo, e razoavel concluir que o DHA originado da refei?ao AP (Dieta B) estava menos disponivel. A deposi?ao de lipideos (LD) foi menor nos files de salmao alimentados com a refei?ao de AlgaPrime (Dieta B) do que com o Controle (oleo de peixe) e AlgaPrime processado a 40 MPa (400 bar) (Tabela 7). Essa diferensa pode ser explicada por uma menor digestibilidade lipidica na refei?ao de AlgaPrime em compara^ao com o AlgaPrime homogeneizado.[00106] Protein, DHA and EPA deposition: The deposition rates of protein, DHA and EPA in Atlantic salmon fillets increased when compared to fish oil from fed fish (Table 7). The p values of the deposition rates of protein, DHA and EPA were P=0.417, P=0.639 and P=0.197, respectively. The highest DHA deposition rates were observed with AlgaPrime homogenized at 40 MPa (400 bar), which is consistent with the highest DHA content reported in salmon fillets fed the same treatment (Table 5 above). The lowest DHA deposition was recorded with diet B (AP), which also resulted in feces containing the highest DHA content, as reported in Table 6. Therefore, it is reasonable to conclude that DHA originated from the AP meal (Diet B) was less available. Lipid deposition (LD) was lower in salmon fillets fed the AlgaPrime meal (Diet B) than the Control (fish oil) and AlgaPrime processed at 40 MPa (400 bar) (Table 7 ). This difference can be explained by a lower lipid digestibility in the AlgaPrime meal compared to the homogenized AlgaPrime.

[00107] As taxas de deposi?ao de proteina (PD), de lipideos (LD), acido docosa-hexaenoico (DHAD) e acido eicosapentaenoico (EPAD) em files (sem pele, aparados) de salmao do Atlantico alimentado com dietas contendo tanto sem AlgaPrime (Controle), refei?ao de AlgaPrime (AP), esferas moidas de AlgaPrime (AP-BM) e AlgaPrime homogeneizado a 40 MPa (400 bar) (AP-H400) sao mostrados na Tabela 7. Os dados sao medias (desvio-padrao); os valores medios em uma coluna sem sobrescrito em comum diferem significativamente com base no teste de Tukey (a ausencia de sobrescrito indica que nao ha diferensa). AlgaPrime, homogeneizado e nao homogeneizado, ambos aumentaram a deposi?ao de proteina no salmao. Alem disso, a quantidade de acido docosa-hexaenoico e deposi?ao de acido eicosapentaenoico aumentaram com a biomassa de algas homogeneizadas. A deposi?ao de lipideos (LD) foi significativamente menor (P =0,024) nos files de salmao alimentados com a refei?ao de AlgaPrime (Dieta B) do que com o Controle (oleo de peixe) e AlgaPrime processado a 40 MPa (400 bar) (Tabela 5). Essa diferen£a pode ser explicada por uma menor digestibilidade lipidica na refei?ao de AlgaPrime em compara?ao com o AlgaPrime homogeneizado. Desse modo, a inclusao de celulas de algas em dietas de salmao como uma pasta que e revestida em peletes extrudados aumenta significativamente a deposi?ao de lipideos quando comparada com a inclusao direta de celulas de algas em alimentos para aquacultura. Tabela 7 [00107] The deposition rates of protein (PD), lipids (LD), docosahexaenoic acid (DHAD) and eicosapentaenoic acid (EPAD) in fillets (skinless, trimmed) of Atlantic salmon fed with diets containing both without AlgaPrime (Control), AlgaPrime meal (AP), AlgaPrime ground spheres (AP-BM) and AlgaPrime homogenized at 40 MPa (400 bar) (AP-H400) are shown in Table 7. Data are averages (standard deviation); mean values in a column without a common superscript differ significantly based on the Tukey test (the absence of a superscript indicates no difference). AlgaPrime, homogenized and non-homogenized, both increased protein deposition in salmon. Furthermore, the amount of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid deposition increased with the homogenized algal biomass. Lipid deposition (LD) was significantly lower (P =0.024) in salmon fillets fed with the AlgaPrime meal (Diet B) than with the Control (fish oil) and AlgaPrime processed at 40 MPa ( 400 bar) (Table 5). This difference can be explained by a lower lipid digestibility in the AlgaPrime meal compared to the homogenized AlgaPrime. Therefore, the inclusion of algal cells in salmon diets as a paste that is coated on extruded pellets significantly increases lipid deposition when compared to the direct inclusion of algal cells in aquaculture feeds. Table 7

[00108] AlgaPrime e oleo de peixe resultou em eficiencias mais elevadas de deposi?ao de proteina (P=0,397), lipideo (P =0,205), DHA (P=0,239) e EPA (P=0,371) (Tabela 8). A eficiencia da deposi?ao de DHA (eDHAD) esta inversamente relacionada com o teor/disponibilidade de DHA na dieta (Roselund et al., 2016; Kousoulaki et al., 2016). Os resultados divulgados no presente documento corroboram essa observa?ao (Figura 6). Desse modo, valores baixos de eDHAD podem ser explicados pelos elevados niveis de DHA disponivel na dieta e nao significa necessariamente que uma fonte de DHA e melhor do que outra. As eficiencias de deposi?ao de nutrientes foram calculadas usando os resultados laboratoriais da AVC relatados na Tabela 3.[00108] AlgaPrime and fish oil resulted in higher deposition efficiencies of protein (P=0.397), lipid (P =0.205), DHA (P=0.239) and EPA (P=0.371) (Table 8). The efficiency of DHA deposition (eDHAD) is inversely related to the content/availability of DHA in the diet (Roselund et al., 2016; Kousoulaki et al., 2016). The results published in this document corroborate this observation (Figure 6). Therefore, low eDHAD values can be explained by high levels of DHA available in the diet and do not necessarily mean that one source of DHA is better than another. Nutrient deposition efficiencies were calculated using the AVC laboratory results reported in Table 3.

[00109] A Tabela 8 mostra a eficiencia de deposi?ao de proteina (ePD), de lipideos (eLD), acido docosa-hexaenoico (eDHAD) e acido eicosapentaenoico (eEPAD) em files (sem pele, aparados) de salmao do Atlantico alimentado com dietas contendo tanto sem AlgaPrime (Controle), refei?ao de AlgaPrime (AP), esferas moidas de AlgaPrime (AP-BM) e AlgaPrime homogeneizado a 40 MPa (400 bar) (AP-H400). Os dados sao medias (desvio-padrao); os valores medios em uma coluna sem sobrescrito em comum diferem significativamente com base no teste de Tukey (a ausencia de sobrescrito indica que nao ha diferensa). AlgaPrime, homogeneizado e nao homogeneizado, ambos aumentaram a eficiencia da deposi?ao de proteina. A eflciencia da deposi?ao de lipideos aumentou com a biomassa de algas homogeneizadas. Alem disso, a eflciencia da deposi?ao de acido eicosapentaenoico aumentou com a biomassa de algas homogeneizadas. Tabela 8 [00109] Table 8 shows the deposition efficiency of protein (ePD), lipids (eLD), docosahexaenoic acid (eDHAD) and eicosapentaenoic acid (eEPAD) in files (skinless, trimmed) of Atlantic salmon fed diets containing either no AlgaPrime (Control), AlgaPrime meal (AP), AlgaPrime ground beads (AP-BM) and AlgaPrime homogenized at 40 MPa (400 bar) (AP-H400). Data are averages (standard deviation); mean values in a column without a common superscript differ significantly based on the Tukey test (the absence of a superscript indicates no difference). AlgaPrime, homogenized and non-homogenized, both increased the efficiency of protein deposition. The efficiency of lipid deposition increased with homogenized algal biomass. Furthermore, the efficiency of eicosapentaenoic acid deposition increased with homogenized algal biomass. Table 8

Exemplo 6. Estirpes Tolerantes a Pouco Cloreto de Schizochytrium limacinumExample 6. Low Chloride Tolerant Strains of Schizochytrium limacinum

[00110] A presensa de elevados niveis de cloreto coloca desafios de corrosao em equipamentos industrials, incluindo tanques de fermenta?ao, tubula?oes, bombas e outras unidades. A redu?ao do cloreto confere beneficios de menor potencial de corrosao em equipamentos usados para o cultivo e o processamento de biomassa rica em DHA.[00110] The presence of high levels of chloride poses corrosion challenges in industrial equipment, including fermentation tanks, pipes, pumps and other units. Chloride reduction provides the benefits of reduced corrosion potential in equipment used for the cultivation and processing of DHA-rich biomass.

[00111] As culturas de Schizochytrium foram cultivadas em serie em meio de cloreto reduzido ate que a popula?ao evoluiu e foi capaz de atingir um crescimento semelhante ao da estirpe parental no meio de cloreto original completo. A popula?ao evoluida foi selecionada para isolados de modo a identificar estirpes adequadas para o cultivo em meios com niveis reduzidos de cloreto.[00111] Schizochytrium cultures were serially grown in reduced chloride medium until the population evolved and was able to achieve growth similar to that of the parental strain in the original full chloride medium. The evolved population was screened for isolates in order to identify strains suitable for cultivation in media with reduced chloride levels.

[00112] A estirpe S. limacinum, S9026, foi usada como a cultura fonte para a evolu?ao da tolerancia ao baixo teor de cloreto. O crescimento nessas culturas foi monitorado como Densidade 6ptica (OD) atraves da medi?ao da absorvancia a 750 nm. Celulas (1,5 mL) de S9026 que tinham sido criopreservadas com 20% (p/v) de glicerol a -80 °C foram descongeladas a temperatura ambiente e usadas para inocular 50 mL de meio 03SF25 que contem 8,4 mM de cloreto (Tabela 9 e 10) em um balao com defletores de 250 mL. Essa cultura de celulas foi entao incubada a 28°C e 200 rpm em um agitador rotativo com um curso de duas polegadas, durante 24 horas, ate que a OD750 variou de 3-6. 5% da cultura de sementeira primaria resultante foram usados para inocular 50 mL de meio 03SF25 modificado com 0,25 mM de cloreto (97% de redu?ao em cloreto) em um balao com defletores de 250 mL. A cultura de cloreto reduzido foi incubada a 28°C e 200 rpm em um agitador rotativo, ate que a sua OD750 final atingiu 3-6. Em contraste com a cultura primaria de S9026 que atingiu o crescimento-alvo dentro de 24 horas, o cultivo com cloreto reduzido necessitou de 4-5 dias para atingir o crescimento alvo, indicando a necessidade de cloreto pelo S9026. A cultura de celulas resultante foi subcultivada 4 vezes em serie em meio 03SF25 modificado com 0,25 mM de cloreto em um balao com defletores de 250 mL ate a sua taxa de crescimento celular ser semelhante a da sua estirpe parental S9026 em meio 03SF25. As taxas de crescimento foram estimadas como semelhantes se um inoculo de 1-5% v/v em meio 03SF25 modificado contendo 0,25 mM de Cl foi capaz de atingir OD de 3-6 dentro de 24 horas. A subcultura final (designada S9026-MF5-l-0,25 mM de Cl) foi plaqueada em agar GYPS e as colonias individuals foram rastreadas quanto produ?ao de lipideos. Tabela 9. Composipao de meio Q3SF25 definido ou modificado Tabela 10. Composicao da solucao de estoque de vitamina DAS3 Tabela 11. Composicao de C-Trace 7 (solucao de estoque trace metal) [00112] The S. limacinum strain, S9026, was used as the source culture for the evolution of tolerance to low chloride. Growth in these cultures was monitored as Optical Density (OD) by measuring absorbance at 750 nm. Cells (1.5 mL) of S9026 that had been cryopreserved with 20% (w/v) glycerol at -80 °C were thawed at room temperature and used to inoculate 50 mL of 03SF25 medium containing 8.4 mM chloride. (Table 9 and 10) in a flask with 250 mL baffles. This cell culture was then incubated at 28°C and 200 rpm on a rotary shaker with a two-inch stroke for 24 hours until the OD750 ranged from 3-6. 5% of the resulting primary seed culture was used to inoculate 50 ml of 03SF25 medium modified with 0.25 mM chloride (97% reduction in chloride) in a 250 ml baffle flask. The reduced chloride culture was incubated at 28°C and 200 rpm on a rotary shaker until its final OD750 reached 3-6. In contrast to the primary culture of S9026 which reached target growth within 24 hours, the reduced chloride culture required 4-5 days to reach target growth, indicating the need for chloride by S9026. The resulting cell culture was subcultured 4 times serially in 0.25 mM chloride modified 03SF25 medium in a 250 ml baffle flask until its cell growth rate was similar to that of its parental strain S9026 in 03SF25 medium. Growth rates were estimated to be similar if a 1-5% v/v inoculum in modified 03SF25 medium containing 0.25 mM Cl was able to reach OD of 3-6 within 24 hours. The final subculture (designated S9026-MF5-1-0.25 mM Cl) was plated on GYPS agar and individual colonies were screened for lipid production. Table 9. Composition of defined or modified Q3SF25 medium Table 10. Composition of the DAS3 vitamin stock solution Table 11. Composition of C-Trace 7 (trace metal stock solution)

[00113] 80 isolados colhidos a partir de S9026-MF5-l-0,25mM Cl foram rastreados em tubos de biorreator de 50 mL contendo 10 mL de meio 03SF25 modificado com cloreto a 0,25 mM como se segue. Cada isolado foi inoculado em 0,8 mL de meio 03SF25 modificado (Cl a 0,25 mM) em um formato de cultivo de blocos de 96 po?os e depois incubado a 28°C e 900 rpm em um agitador multitron durante 20-24 h de modo a preparar as culturas de sementeira primarias. As resultantes culturas de sementeira primarias foram inoculadas a 4% (v/v) em 9,6 mL de meio 03SF25 modificado (cloreto a 0,5 mM) em tubos de biorreator de 50 mL. Os tubos de biorreator de produ?ao foram incubados a 28°C e 200 rpm em um agitador rotativo durante 3 dias e depois colhidos para ensaio de lipideos. A estirpe parental S9026 tambem foi cultivada em 03SF25 (Cl a 8,4 mM) em paralelo como controle.[00113] 80 isolates collected from S9026-MF5-l-0.25mM Cl were screened in 50 mL bioreactor tubes containing 10 mL of 0.25 mM chloride modified 03SF25 medium as follows. Each isolate was inoculated into 0.8 mL of modified 03SF25 medium (0.25 mM Cl) in a 96-well block culture format and then incubated at 28°C and 900 rpm in a multitron shaker for 20- 24 hours in order to prepare the primary sowing crops. The resulting primary seed cultures were inoculated at 4% (v/v) in 9.6 mL of modified 03SF25 medium (0.5 mM chloride) in 50 mL bioreactor tubes. Production bioreactor tubes were incubated at 28°C and 200 rpm on a rotary shaker for 3 days and then harvested for lipid assay. The parental strain S9026 was also grown in 03SF25 (8.4 mM Cl) in parallel as a control.

[00114] Dois isolados com boa produtividade de lipideo e teor de DHA em lipideos foram identificados a partir de rastreio primario e, em seguida, criopreservados como S9179 e S9180, respectivamente. Apos a criopreserva?ao, S9179 e S9180 foram confirmados por darem uma boa produ?ao de lipideos e teor de DHA em lipideos comparaveis com a estirpe parental em meio de cloreto reduzido (03SF25 modificado com Cl a 0,5 mM).[00114] Two isolates with good lipid productivity and DHA content in lipids were identified from primary screening and then cryopreserved as S9179 and S9180, respectively. After cryopreservation, S9179 and S9180 were confirmed to give good lipid production and DHA content in lipids comparable to the parental strain in reduced chloride medium (0.5 mM Cl modified O3SF25).

[00115] S9179 e S9180 tambem foram avaliados em fermentadores de escala laboratorial de 3 L (Applikon, Holanda) em um processo de fermenta?ao descontlnuo alimentado por densidade celular elevada usando NH4, N/P16 a 350 mM comparavel com aquele usado para avalia?ao de S9026. Para o cultivo de S9026, os estagios de sementes tipicamente compreendiam o cultivo em 03SF25 (Cl a 8,4 mM) em frascos e inoculados a 10% v/v em meio de produ?ao contendo Cl a 10-11 mM. Para avalia?ao de S9179 e S9180, os estagios do frasco de semente foram cultivados em 03SF25 modificado (Cl a 0,25 mM) e o meio de produ?ao foi modificado de forma a atingir Cl a 1 mM (Tabela 12). Para facilitar a hidrolise da sacarose, foram adicionados 1,5 mL/L de solu?ao de invertase Maxvert a 20 g/L (esterilizada por filtra?ao) no inicio das opera?oes de fermenta?ao.[00115] S9179 and S9180 were also evaluated in 3 L laboratory scale fermentors (Applikon, Netherlands) in a batch fermentation process fed by high cell density using NH4, N/P16 at 350 mM comparable to that used to evaluate Action of S9026. For cultivation of S9026, seed stages typically comprised cultivation in 03SF25 (8.4 mM Cl) in flasks and inoculation at 10% v/v into production medium containing 10-11 mM Cl. For evaluation of S9179 and S9180, seed flask stages were grown in modified 03SF25 (0.25 mM Cl) and the production medium was modified to achieve 1 mM Cl (Table 12). To facilitate sucrose hydrolysis, 1.5 mL/L of 20 g/L Maxvert invertase solution (sterilized by filtration) were added at the beginning of fermentation operations.

[00116] As culturas foram cultivadas a 28°C com taxa de aera?ao de 1,0 wm. O xarope VHP esterilizado (70% p/p) foi usado como materia- prima de carbono e foi introduzido usando um algoritmo responsivo a DO (alimenta?ao pulsada a pedido de modo a atingir <10 g/L de a?ucar total por inje?ao). O pH foi mantido a 5,1 ± 0,2 automaticamente atraves da adi?ao de acido (16% p/p de H2S04) e base (28% p/p de hidroxido de amonio seguido de 10% p/p de NaOH). O nivel de oxigenio dissolvido (DO) foi mantido a >20% da satura?ao de ar pelo controle automatico de agita?ao (500-1250 rpm) seguido de suplementa?ao por oxigenio puro (0100%). Sulfato de amonio (NH4 + a 50 mM em lote) e hidroxido de amonio (NH4+ a 300 mM) foram usados como fonte de nitrogenio. Conforme requerido, o caldo de fermenta?ao foi submetido a amostra de modo a determinar o DCW, titulo lipidico e composi?ao de acidos graxos, solidos totais e concentra?oes residuais de a?ucar no caldo. Tabela 12. Composi?ao do meio de fermenta?ao definido em lote no fermentador [00116] The cultures were grown at 28°C with an aeration rate of 1.0 wm. Sterilized VHP syrup (70% w/w) was used as carbon feedstock and was introduced using a DO-responsive algorithm (pulsed feed on demand to achieve <10 g/L total sugar per injection). The pH was maintained at 5.1 ± 0.2 automatically by adding acid (16% w/w H2SO4) and base (28% w/w ammonium hydroxide followed by 10% w/w NaOH ). The dissolved oxygen (DO) level was maintained at >20% of air saturation by automatic agitation control (500-1250 rpm) followed by supplementation with pure oxygen (0100%). Ammonium sulfate (NH4+ at 50 mM batch) and ammonium hydroxide (NH4+ at 300 mM) were used as nitrogen source. As required, the fermentation broth was sampled in order to determine the DCW, lipid titer and fatty acid composition, total solids and residual sugar concentrations in the broth. Table 12. Composition of the fermentation medium defined in batch in the fermenter

[00117] Ambas as estirpes S9179 e S9180 mostraram um desempenho de estirpe comparavel sobre a biomassa e a produ?ao/rendimento de lipldeo, teor de DHA em lipldeos e produtividade/rendimento de DHA nos fermentadores.[00117] Both strains S9179 and S9180 showed comparable strain performance on biomass and lipid production/yield, DHA content in lipids and DHA productivity/yield in fermenters.

[00118] Embora a presente invensao tenha sido descrita com referenda a modalidades especlficas da mesma, sera entendido que modifica5oes adicionais sao posslveis. O presente pedido se destina a cobrir quaisquer varia?oes, usos ou adapta?oes da seguinte invensao, no geral, os princlpios da invensao e incluindo tais desvios da presente divulga?ao como consta na pratica conhecida ou comum dentro da tecnica a qual pertence a invensao e conforme pode ser aplicado a caracteristicas estipuladas no presente documento.[00118] Although the present invention has been described with reference to specific embodiments thereof, it will be understood that additional modifications are possible. The present application is intended to cover any variations, uses or adaptations of the following invention, in general, the principles of the invention and including such deviations from the present disclosure as are in known or common practice within the art to which it pertains. the invention is as can be applied to characteristics stipulated in this document.

Claims (15)

1. Composi?ao de ingrediente de ra?ao, caracterizada pelo fato de que a composi?ao compreende uma dispersao de celulas microbianas lisadas em oleo de triglicerideo, em que: a. 10-90% em peso da composi?ao sao celulas microbianas lisadas e b. 10-90% em peso da composi?ao e oleo de triglicerideos, em que o oleo de triglicerideo compreende oleo das celulas microbianas lisadas e oleo de peixe, planta, microbio oleaginoso, animal ou combina5oes dos mesmos, em que o DHA e 4-10% em peso da composi?ao do ingrediente alimentar, e em que as celulas microbianas lisadas tern um tamanho medio de particula de 5-100 micrometros, e em que as celulas microbianas sao da familia Thraustochytriaceae e/ou do genero Crypthecodinium.1. Feed ingredient composition, characterized by the fact that the composition comprises a dispersion of microbial cells lysed in triglyceride oil, wherein: a. 10-90% by weight of the composition are lysed microbial cells and b. 10-90% by weight of the composition is triglyceride oil, wherein the triglyceride oil comprises oil from lysed microbial cells and oil from fish, plant, oleaginous, animal microbes or combinations thereof, wherein DHA is 4- 10% by weight of the food ingredient composition, and wherein the lysed microbial cells have an average particle size of 5-100 micrometers, and wherein the microbial cells are from the family Thraustochytriaceae and/or the genus Crypthecodinium. 2. Composi?ao de acordo com a reivindica?ao 1, caracterizada pelo fato de que o oleo de triglicerideo tern um perfil de acido graxo de 10-50% de acido docosahexaenoico (DHA) em peso de acidos graxos, opcionalmente em que o DHA e de 5-10%, 5-7%, 5- 8%, 6-8% ou 6-7% em peso da composi?ao.2. Composition according to claim 1, characterized by the fact that the triglyceride oil has a fatty acid profile of 10-50% docosahexaenoic acid (DHA) by weight of fatty acids, optionally wherein the DHA is 5-10%, 5-7%, 5-8%, 6-8% or 6-7% by weight of the composition. 3. Composi?ao de acordo com a reivindica?ao 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende 10-15%, 10-25%, 15-20% ou 20-25% em peso de celulas microbianas lisadas.3. Composition according to claim 1 or 2, characterized in that it comprises 10-15%, 10-25%, 15-20% or 20-25% by weight of lysed microbial cells. 4. Composi?ao de acordo com a reivindica?ao 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda menos de 20%, 15%, 10%, 5%, 3% ou 1% em peso da composi?ao de celulas microbianas nao lisadas.4. Composition according to claim 1, characterized by the fact that it further comprises less than 20%, 15%, 10%, 5%, 3% or 1% by weight of the composition of non-microbial cells. lysed. 5. Composi?ao de acordo com qualquer uma das reivindica?oes 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o oleo das celulas microbianas lisadas tem um perfil de acido graxo de 40-70%, 40-60%, 4050%, 45-55% ou 50-55 % DHA em peso de acidos graxos.5. Composition according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the oil from the lysed microbial cells has a fatty acid profile of 40-70%, 40-60%, 4050%, 45 -55% or 50-55% DHA by weight of fatty acids. 6. Composi?ao de acordo com qualquer uma das reivindicasoes 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as celulas microbianas lisadas tem um tamanho medio de particula de 5-90 micrometros, 5-80 micrometros, 5-70 micrometros, 5-60 micrometros, 5-50 micrometros, 5-40 micrometros, 5-30 micrometros, 5-20 micrometros ou 5-20 micrometros.6. Composition according to any one of claims 1 to 5, characterized by the fact that the lysed microbial cells have an average particle size of 5-90 micrometers, 5-80 micrometers, 5-70 micrometers, 5-60 micrometers, 5-50 micrometers, 5-40 micrometers, 5-30 micrometers, 5-20 micrometers or 5-20 micrometers. 7. Composi?ao de acordo com qualquer uma das reivindica5oes 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o oleo de uma planta e coco, milho, semente de algodao, azeite, palma, amendoim, colza, canola, cartamo, gergelim, soja, oleo de soja, oleo de nozes, oleo de camelina, ou oleo citrico, ou uma ou mais combinasoes dos mesmos; opcionalmente, em que o oleo de um peixe e de um oleo de anchova, arenque, arinca, capelina, sarda, sardinha, cavala obtido do processamento de peixe, atum, salmao ou uma ou mais combinasoes dos mesmos.7. Composition according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the oil from a plant is coconut, corn, cottonseed, olive oil, palm, peanut, rapeseed, canola, cardamom, sesame, soybean , soybean oil, walnut oil, camelina oil, or citrus oil, or one or more combinations thereof; optionally, wherein the oil of a fish is an oil of anchovy, herring, haddock, capelin, mackerel, sardine, mackerel obtained from processing fish, tuna, salmon or one or more combinations thereof. 8. Composi?ao de acordo com qualquer uma das reivindica5oes 1 a 7, caracterizada pelo fato de que as celulas microbianas sao do genero selecionado do grupo que consiste em Crypthecodinium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium e Schizochytrium.8. Composition according to any one of claims 1 to 7, characterized by the fact that the microbial cells are of the genus selected from the group consisting of Crypthecodinium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium and Schizochytrium. 9. Composi?ao de acordo com qualquer uma das reivindica5oes 1 a 8, caracterizada pelo fato de compreende ainda astaxantina, carotenoides, flavonoides, lecitina, esterois, calcitriois (vitamina D), tocoferois (vitamina E) e filoquinona e menaquinona (vitamina K), antibioticos, antifungicos, antiparasitarios e hormonios.9. Composition according to any one of claims 1 to 8, characterized in that it further comprises astaxanthin, carotenoids, flavonoids, lecithin, sterols, calcitriols (vitamin D), tocopherols (vitamin E) and phylloquinone and menaquinone (vitamin K ), antibiotics, antifungals, antiparasitics and hormones. 10. Composi?ao de acordo com qualquer uma das reivindica5oes 1 a 9, caracterizada pelo fato de compreende ainda um antioxidante, opcionalmente em que o antioxidante e um antioxidante natural, hidroxitolueno butilado (BHT), terc-butilhidroquinona (TBHQ), etoxiquina ou uma ou mais combina?oes dos mesmos.10. Composition according to any one of claims 1 to 9, characterized in that it further comprises an antioxidant, optionally wherein the antioxidant is a natural antioxidant, butylated hydroxytoluene (BHT), tert-butylhydroquinone (TBHQ), ethoxyquin or one or more combinations thereof. 11. Metodo para preparar uma composi?ao de acordo com qualquer uma das reivindicasoes 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o metodo compreende: a) misturar celulas microbianas e o oleo de outro organismo para formar uma mistura; e b) lisar as celulas microbianas na mistura para formar a composi?ao como uma dispersao.11. Method for preparing a composition according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the method comprises: a) mixing microbial cells and the oil of another organism to form a mixture; and b) lysing the microbial cells in the mixture to form the composition as a dispersion. 12. Metodo para preparar uma ra?ao formulada, caracterizado pelo fato de que o metodo compreende o contato da composi?ao de qualquer uma das reivindica?oes 1 a 10 com um alimento comestivel.12. Method for preparing a formulated feed, characterized by the fact that the method comprises contacting the composition of any one of claims 1 to 10 with an edible food. 13. Metodo de acordo com a reivindica?ao 12, caracterizado pelo fato de que o alimento comestivel e revestido com a composi?ao, opcionalmente em que o alimento comestivel e revestido com a composi?ao sob vacuo; e/ou em que o alimento comestivel e uma aquicultura ou ra?ao animal, opcionalmente em que o alimento comestivel e uma ra?ao para salmao; e/ou em que o alimento comestivel compreende peixe ou subprodutos animais ou combinasoes dos mesmos.13. Method according to claim 12, characterized by the fact that the edible food is coated with the composition, optionally wherein the edible food is coated with the composition under vacuum; and/or wherein the edible food is an aquaculture or animal feed, optionally wherein the edible food is a salmon feed; and/or wherein the edible food comprises fish or animal by-products or combinations thereof. 14. Metodo de acordo com a reivindica?ao 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a ra?ao formulada esta na forma peletizada; e/ou em que a ra?ao formulada contem pelo menos 1%, 1,5% ou 2% de acidos graxos omega-3; e/ou em que a composi?ao representa pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40% em peso do alimento formulado.14. Method according to claim 12 or 13, characterized by the fact that the formulated feed is in pelleted form; and/or where the formulated feed contains at least 1%, 1.5% or 2% omega-3 fatty acids; and/or wherein the composition represents at least 10, 15, 20, 25, 30, 35 or 40% by weight of the formulated food. 15. Racao formulada, caracterizada pelo fato de que a ra?ao formulada compreende uma composi?ao de acordo com qualquer uma das reivindica?oes 1 a 10 e alimento comestlvel, opcionalmente em que o alimento e um alimento para aquicultura ou animal, opcionalmente em que o alimento comestivel e uma ra?ao para aquicultura ou uma ra?ao animal.15. Formulated feed, characterized in that the formulated feed comprises a composition according to any one of claims 1 to 10 and edible food, optionally wherein the food is an aquaculture or animal feed, optionally wherein the edible food is an aquaculture feed or an animal feed.
BR122023002611-0A 2016-07-01 2017-06-29 FEED INGREDIENT COMPOSITION COMPRISING A DISPERSION OF MICROBIAL CELLS LYSED IN TRIGLYCERIDE OIL, METHOD FOR PREPARING A COMPOSITION AND FORMULATED FEED BR122023002611B1 (en)

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