BR122023000986B1 - COMPOSITION COMPRISING RECOMBINANT MAREK'S DISEASE VIRUS OF SEROTYPE 1 (MDV1) - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se refere a vírus recombinantes e aos usos dos mesmos. mais particularmente, a invenção se refere a novos vírus recombinantes da doença de marek que codificam polipeptídeo(s) de interesse e ao seu uso para expressar ou distribuição tais polipeptídeos a animais, particularmente aves de criação. a invenção é particularmente adequada para vacinar aves de criação contra patógenos aviários.The present invention relates to recombinant viruses and their uses. More particularly, the invention relates to novel recombinant Marek's disease viruses encoding polypeptide(s) of interest and their use for expressing or delivering such polypeptides to animals, particularly poultry. the invention is particularly suitable for vaccinating poultry against avian pathogens.
Description
[001] A presente invenção se refere a vírus recombinantes e aos usos dos mesmos. Mais particularmente, a invenção se refere a novos vírus recombinantes da doença de Marek que codificam polipeptídeo(s) de interesse, e seu uso para expressar ou distribuir tais polipeptídeos a animais, particularmente aves de criação. A invenção é particularmente adequada para vacinar aves de criação contra patógenos aviários.[001] The present invention relates to recombinant viruses and their uses. More particularly, the invention relates to novel recombinant Marek's disease viruses encoding polypeptide(s) of interest, and their use to express or deliver such polypeptides to animals, particularly poultry. The invention is particularly suitable for vaccinating poultry against avian pathogens.
[002] A carne e ovos das aves de criação são fontes de alimento importantes, cujo consumo aumenta continuamente em virtude do crescimento da população humana e sua excelente relação qualidade-preço. A recente epidemia de gripe aviária focou a opinião pública sobre a saúde das aves de criação, bem como a garantia e segurança dos alimentos. A tecnologia de vacinas avícolas se tornou uma preocupação mundial.[002] The meat and eggs of poultry are important food sources, whose consumption is continually increasing due to the growth of the human population and their excellent quality-price ratio. The recent avian influenza epidemic has focused public opinion on the health of poultry, as well as food security and safety. Poultry vaccine technology has become a global concern.
[003] Vírus recombinantes que expressam proteínas de patógenos são comumente usados como vacinas avícolas contra patógenos alvo. Vacinas que incluem tais vírus induzem à expressão de proteínas de patógenos estranhos ou fragmentos dos mesmos no interior das células infectadas, as quais podem subsequentemente induzir a uma imunidade humoral protetora e específica, bem como imunidade mediada por células.[003] Recombinant viruses that express pathogen proteins are commonly used as poultry vaccines against target pathogens. Vaccines that include such viruses induce the expression of foreign pathogen proteins or fragments thereof within infected cells, which can subsequently induce protective and specific humoral immunity, as well as cell-mediated immunity.
[004] Sabe-se que diferentes vírus podem sobreviver no corpo de um animal infectado no estado de infecção latente ou persistente. Consequentemente, tais vírus, nos quais um gene estranho derivado de um patógeno foi integrado, foram desenvolvidos para serem usados como vacinas em vetores virais que aumentam a duração de imunidade em um animal imunizado.[004] It is known that different viruses can survive in the body of an infected animal in a latent or persistent infection state. Consequently, such viruses, into which a foreign gene derived from a pathogen has been integrated, have been developed to be used as viral vector vaccines that increase the duration of immunity in an immunized animal.
[005] Estes vetores virais (ou vírus recombinantes) se baseiam, tipicamente, em vírus avipox, tais como varíola aviária (documento EP-A-0517292), vírus do herpes, tais como os serotipos 1, 2 e 3 do vírus da doença de Marek (HVT) (por exemplo, documentos WO-A -87/04463, 5.980.906, 5.853.733) ou, alternativamente, o vírus da doença de Newcastle (Newcastle Disease Virus - NDV) e adenovirus aviário.[005] These viral vectors (or recombinant viruses) are typically based on avipox viruses, such as fowlpox (document EP-A-0517292), herpes viruses, such as serotypes 1, 2 and 3 of the disease virus. de Marek (HVT) (e.g. WO-A-87/04463, 5,980,906, 5,853,733) or, alternatively, Newcastle disease virus (NDV) and avian adenovirus.
[006] Estes vírus aviários recombinantes exibem níveis variáveis de proteção. Um HVT recombinante que expressa VP2 de IBDV demonstrou vantagens em relação às vacinas clássicas contra IBD (Vectormune® IBD). Outros vetores de HVT de interesse expressam antígenos NDV (Vectormune® ND) ou ILTV (Vectormune® LT).[006] These recombinant avian viruses exhibit varying levels of protection. A recombinant HVT expressing IBDV VP2 demonstrated advantages over classical IBD vaccines (Vectormune® IBD). Other HVT vectors of interest express NDV (Vectormune® ND) or ILTV (Vectormune® LT) antigens.
[007] Um dos problemas práticos de vírus recombinantes baseados em HVT é sua interferência quando vários vírus são usados em combinação para conferir imunogenicidade contra patógenos distintos. Na verdade, quando dois rHVT distintos que expressam diferentes antígenos são misturados, uma proteção inferior é causada pelo menos contra uma das doenças (vide, por exemplo, Slacum G. et al., 2009, The Compatibility of HVT Recombinants With Other Marek's Disease Vaccines, 58a Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, EUA, 23-25 de março, página 84).[007] One of the practical problems of HVT-based recombinant viruses is their interference when several viruses are used in combination to confer immunogenicity against distinct pathogens. In fact, when two distinct rHVTs expressing different antigens are mixed, inferior protection is provided against at least one of the diseases (see, for example, Slacum G. et al., 2009, The Compatibility of HVT Recombinants With Other Marek's Disease Vaccines , 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23-25, page 84).
[008] Consequentemente, há uma necessidade de novas abordagens para melhorar a vacinação em animais, particularmente em aves de criação, que venham a conferir proteção concomitante contra várias doenças.[008] Consequently, there is a need for new approaches to improve vaccination in animals, particularly in poultry, that will provide concomitant protection against several diseases.
[009] Vetores de HVT multivalentes foram desenvolvidos, os quais podem expressar dois peptídeos antigênicos distintos (vide documento PCT/EP2013/056839).[009] Multivalent HVT vectors have been developed, which can express two distinct antigenic peptides (see document PCT/EP2013/056839).
[010] A presente invenção descreve novos vírus recombinantes adequados para induzir a uma forte proteção imune em animais e os quais podem, além disso, ser usados em combinação com outras vacinas virais para adquirir imunidade prolongada.[010] The present invention describes new recombinant viruses suitable for inducing strong immune protection in animals and which can, in addition, be used in combination with other viral vaccines to acquire prolonged immunity.
[011] A presente invenção se refere a vírus recombinantes da doença de Marek (Marek Disease Virus - "MDV") os quais podem codificar um ou vários polipeptídeos de interesse. A invenção descreve, mais especificamente, vírus MDV aprimorados que compreendem um promotor derivado de beta- actina e, surpreendentemente, mostra que, no contexto destes vírus, tais construtos permitem expressão altamente aprimorada e indução de uma forte imunidade protetora. A invenção mostra, adicionalmente, que tais vírus são compatíveis para uso combinado com vírus do herpes aviário distintos para induzir à resposta imune aprimorada contra patógenos antigênicos distintos sem interferência cruzada substancial.[011] The present invention relates to recombinant Marek's disease viruses (Marek Disease Virus - "MDV") which may encode one or more polypeptides of interest. The invention describes, more specifically, improved MDV viruses that comprise a beta-actin-derived promoter and, surprisingly, shows that, in the context of these viruses, such constructs allow highly enhanced expression and induction of strong protective immunity. The invention further shows that such viruses are compatible for use in combination with distinct avian herpes viruses to induce enhanced immune responses against distinct antigenic pathogens without substantial cross-interference.
[012] Um objeto da invenção, portanto, reside em um vírus recombinante da doença de Marek ("rMDV") que compreende uma sequência de nucleotídeos recombinante que codifica um polipeptídeo de interesse operativamente ligado a um promotor derivado de um promotor de beta-actina de galinha.[012] An object of the invention, therefore, resides in a recombinant Marek's disease virus ("rMDV") comprising a recombinant nucleotide sequence encoding a polypeptide of interest operatively linked to a promoter derived from a beta-actin promoter of chicken.
[013] Um outro objeto da invenção é um vírus recombinante da doença de Marek que compreende (1) um promotor compreendendo uma sequência central de um promotor de beta-actina de galinha e (2) sob o controle do dito promotor, uma sequência de nucleotídeos recombinante que codifica um polipeptídeo.[013] Another object of the invention is a recombinant Marek's disease virus comprising (1) a promoter comprising a core sequence of a chicken beta-actin promoter and (2) under the control of said promoter, a sequence of recombinant nucleotide that encodes a polypeptide.
[014] A sequência de nucleotídeos recombinante pode ser inserida em várias regiões do genoma viral, de preferência, em uma região que não é essencial para replicação ou infecção viral, de preferência, no gene US2. Conforme será discutido, o rMDV da invenção pode compreender uma ou várias sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos recombinantes de interesse distintos. O polipeptídeo de interesse é, mais particularmente, um peptídeo antigênico, tipicamente um peptídeo antigênico de um patógeno aviário. O vírus recombinante da doença de Marek (rMDV) da invenção é, de preferência, de serotipo 1 (MDV1).[014] The recombinant nucleotide sequence can be inserted into various regions of the viral genome, preferably in a region that is not essential for viral replication or infection, preferably in the US2 gene. As will be discussed, the rMDV of the invention may comprise one or more nucleotide sequences encoding distinct recombinant polypeptides of interest. The polypeptide of interest is, more particularly, an antigenic peptide, typically an antigenic peptide from an avian pathogen. The recombinant Marek's disease virus (rMDV) of the invention is preferably serotype 1 (MDV1).
[015] Outro objeto da invenção reside em uma composição que compreende um vírus recombinante da doença de Marek conforme definido acima e, opcionalmente, um excipiente ou veículo e/ou um adjuvante veterinária ou farmaceuticamente aceitável adequado.[015] Another object of the invention resides in a composition comprising a recombinant Marek's disease virus as defined above and, optionally, a suitable excipient or vehicle and/or a suitable veterinary or pharmaceutically acceptable adjuvant.
[016] Um outro objeto da invenção se refere a uma composição de vacina que compreende um vírus recombinante da doença de Marek, conforme definido acima. Tal vacina pode ser usada, por exemplo, para imunização de aves, tais como aves de criação.[016] Another object of the invention relates to a vaccine composition comprising a recombinant Marek's disease virus, as defined above. Such a vaccine can be used, for example, for immunizing birds, such as poultry.
[017] Outro objeto da presente invenção reside em um vírus recombinante da doença de Marek ou composição conforme definido acima para uso para vacinar uma ave, de preferência, uma galinha.[017] Another object of the present invention resides in a recombinant Marek's disease virus or composition as defined above for use to vaccinate a bird, preferably a chicken.
[018] Outro objeto da invenção reside em um vírus recombinante da doença de Marek ou composição conforme definido acima para uso para induzir ou estimular uma resposta imune em uma ave, de preferência, uma galinha.[018] Another object of the invention resides in a recombinant Marek's disease virus or composition as defined above for use to induce or stimulate an immune response in a bird, preferably a chicken.
[019] Um outro objeto da invenção é um MDV1 recombinante conforme definido acima para uso em combinação com outro vírus do herpes recombinante de um serotipo diferente e que expressa um antígeno distinto para vacinar uma ave, de preferência, uma galinha, por meio de administração simultânea, separada, sequencial ou alternada.[019] Another object of the invention is a recombinant MDV1 as defined above for use in combination with another recombinant herpes virus of a different serotype and expressing a distinct antigen for vaccinating a bird, preferably a chicken, by administering simultaneous, separate, sequential or alternating.
[020] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de vacinação de um animal que compreende pelo menos uma administração de uma composição ou vírus, conforme definido acima.[020] In another aspect, the invention provides a method of vaccinating an animal that comprises at least one administration of a composition or virus, as defined above.
[021] Em um aspecto adicional, a invenção proporciona um método para induzir a uma resposta imunogênica ou protetora em um animal contra um ou mais patógenos aviários que compreende pelo menos uma administração de uma composição ou vírus, conforme definido acima.[021] In a further aspect, the invention provides a method for inducing an immunogenic or protective response in an animal against one or more avian pathogens comprising at least one administration of a composition or virus, as defined above.
[022] Um outro objetivo da invenção é um método para produção de um vírus recombinante da doença de Marek que compreende (i) a introdução de uma sequência de nucleotídeos recombinante que codifica um polipeptídeo sob o controle de um promotor que compreende uma sequência central de um promotor de beta-actina de galinha em um região não essencial do genoma de um vírus da doença de Marek, (ii) opcionalmente replicação do vírus e (iii) opcionalmente coleta do vírus.[022] Another object of the invention is a method for producing a recombinant Marek's disease virus comprising (i) introducing a recombinant nucleotide sequence encoding a polypeptide under the control of a promoter comprising a core sequence of a chicken beta-actin promoter in a non-essential region of the genome of a Marek's disease virus, (ii) optionally replicating the virus and (iii) optionally harvesting the virus.
[023] Um outro objeto da invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende o genoma do vírus da doença de Marek ou um fragmento do mesmo, em que o dito genoma ou fragmento compreende um gene US2 modificado por meio de inserção de uma sequência de nucleotídeos recombinante compreendendo uma sequência que codifica um polipeptídeo sob o controle de um promotor que compreende uma sequência central de um promotor de beta- actina de galinha.[023] Another object of the invention relates to a recombinant nucleic acid molecule comprising the genome of the Marek's disease virus or a fragment thereof, wherein said genome or fragment comprises a US2 gene modified by insertion of a recombinant nucleotide sequence comprising a sequence encoding a polypeptide under the control of a promoter comprising a core sequence of a chicken beta-actin promoter.
[024] A invenção também se refere a um plasmídeo que compreende uma molécula de ácido nucleico, conforme definido acima.[024] The invention also relates to a plasmid comprising a nucleic acid molecule, as defined above.
[025] Outro objeto da invenção é uma célula hospedeira, ou uma cultura de tais células, que compreende uma molécula de ácido nucleico ou um plasmídeo ou um vírus, conforme definido acima.[025] Another object of the invention is a host cell, or a culture of such cells, which comprises a nucleic acid molecule or a plasmid or a virus, as defined above.
[026] A invenção se refere ainda a um método de imunização de uma ave que compreende administração, à dita ave, de uma quantidade eficaz para imunização de uma vacina ou composição ou vírus da invenção.[026] The invention further relates to a method of immunizing a bird which comprises administering, to said bird, an effective amount for immunization of a vaccine or composition or virus of the invention.
[027] A invenção fornece ainda um kit de vacina para imunização de uma ave que compreende uma quantidade eficaz de uma vacina da invenção e um meio para administração da dita vacina à dita ave.[027] The invention further provides a vaccine kit for immunizing a bird comprising an effective amount of a vaccine of the invention and a means for administering said vaccine to said bird.
[028] A invenção pode ser usada para expressar um polipeptídeo em qualquer animal, de preferência, para a vacinação de uma ave, e é adequada para a expressão de qualquer polipeptídeo ou peptídeo, especificamente qualquer peptídeo imunogênico de patógenos aviários.[028] The invention can be used to express a polypeptide in any animal, preferably for the vaccination of a bird, and is suitable for the expression of any polypeptide or peptide, specifically any immunogenic peptide from avian pathogens.
[029] A Figura 1 ilustra um diagrama esquemático do genoma de Rispens e da localização da região clonada, incluindo o sítio de inserção dentro do gene US2.[029] Figure 1 illustrates a schematic diagram of the Rispens genome and the location of the cloned region, including the insertion site within the US2 gene.
[030] A Figura 2 mostra um diagrama do genoma recombinante de Rispens/IBD, indicando as localizações da Junção 1 e Junção 2 amplificadas em reações de PCR para confirmar as estruturas genômicas dos vírus.[030] Figure 2 shows a diagram of the Rispens/IBD recombinant genome, indicating the locations of Junction 1 and Junction 2 amplified in PCR reactions to confirm the genomic structures of the viruses.
[031] A Figura 3 é um ensaio Western blot que detecta a expressão da proteína VP2 de IBDV por vírus Rispens/IBD recombinantes.[031] Figure 3 is a Western blot assay that detects expression of the IBDV VP2 protein by recombinant Rispens/IBD viruses.
[032] A Figura 4 ilustra as titulações de IBDV por ELISA em galinhas SPF vacinadas com Rispens/IBD recombinante usando um kit para ELISA de IBD comercial.[032] Figure 4 illustrates IBDV titers by ELISA in SPF chickens vaccinated with recombinant Rispens/IBD using a commercial IBD ELISA kit.
[033] A Figura 5 ilustra as titulações de IBDV por ELISA em galinhas White Leghorn comerciais vacinadas com Rispens/IBD recombinante usando um kit para ELISA de IBD comercial.[033] Figure 5 illustrates IBDV titers by ELISA in commercial White Leghorn chickens vaccinated with recombinant Rispens/IBD using a commercial IBD ELISA kit.
[034] As Figuras 6A e 6B ilustram as titulações de IBDV e NDV por ELISA em galinhas White Leghorn comerciais vacinadas com Rispens/IBD recombinante e HVT/ND recombinante usando um kit para ELISA de IBD comercial e um kit para ELISA de ND comercial.[034] Figures 6A and 6B illustrate IBDV and NDV titers by ELISA in commercial White Leghorn chickens vaccinated with recombinant Rispens/IBD and recombinant HVT/ND using a commercial IBD ELISA kit and a commercial ND ELISA kit.
[035] A Figura 7 ilustra a longa duração de imunidade ao IBDV conferida por um vírus recombinante da presente invenção.[035] Figure 7 illustrates the long-lasting immunity to IBDV conferred by a recombinant virus of the present invention.
[036] A presente invenção se refere, de modo geral, a rMDV que compreendem uma sequência de nucleotídeos recombinante que codifica um produto de interesse colocado sob o controle transcricional de um promotor derivado de beta-actina de galinha. A presente invenção também se refere a composições que compreendem tais rMDV, bem como ao uso das mesmas para vacinação de animais, em particular aves de criação.[036] The present invention generally refers to rMDV that comprise a recombinant nucleotide sequence that encodes a product of interest placed under the transcriptional control of a promoter derived from chicken beta-actin. The present invention also relates to compositions comprising such rMDV, as well as the use thereof for vaccinating animals, in particular poultry.
[037] A presente descrição será mais bem compreendida com referência às definições a seguir.[037] The present description will be better understood with reference to the following definitions.
[038] O termo "vírus" designa, em particular, uma partícula viral que compreende uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um genoma) encapsulada em uma cápside ou cápsula. O termo "vírus" também designa um vetor viral ou um genoma viral isolado.[038] The term "virus" designates, in particular, a viral particle that comprises a nucleic acid molecule (e.g., a genome) encapsulated in a capsid or capsule. The term "virus" also designates a viral vector or an isolated viral genome.
[039] O termo "recombinante" designa uma molécula a qual foi criada, concebida ou modificada por meio de tecnologias genéticas. Em relação a um vírus, o termo designa, mais especificamente, um vírus cujo genoma foi modificado através de inserção de pelo menos um ácido nucleico heterólogo, isto é, um ácido nucleico (por exemplo, ADN) que não se encontra naturalmente no genoma do vírus ou o qual é naturalmente encontrado no dito genoma, mas em uma forma diferente ou em uma posição diferente. Um vírus recombinante pode ser produzido por meio de uma variedade de métodos e, uma vez feito, pode ser reproduzido sem usar outras tecnologias genéticas. Em relação a um ácido nucleico (por exemplo, um gene), o termo "recombinante" indica um construto o qual não existe naturalmente ou o qual foi manipulado ou clonado ou rearranjado de modo que ele seja, por exemplo, flanqueado por sequências as quais não flanqueiam naturalmente a dita sequência.[039] The term "recombinant" designates a molecule which was created, designed or modified through genetic technologies. In relation to a virus, the term designates, more specifically, a virus whose genome has been modified through the insertion of at least one heterologous nucleic acid, that is, a nucleic acid (e.g. DNA) that is not found naturally in the genome of the virus. virus or which is naturally found in said genome, but in a different form or in a different position. A recombinant virus can be produced through a variety of methods, and once made, it can be reproduced without using other genetic technologies. In relation to a nucleic acid (e.g., a gene), the term "recombinant" indicates a construct which does not exist naturally or which has been manipulated or cloned or rearranged so that it is, for example, flanked by sequences which do not naturally flank said sequence.
[040] Na presente descrição, os termos "ácido nucleico" ou "sequência de nucleotídeos" são usados indiferentemente e se referem a uma molécula de ácido nucleico que tem uma sequência determinada, a qual pode ser desoxirribonucleotídeo (ADN) e/ou ribonucleotídeo (ARN). A sequência de nucleotídeos pode primeiro ser preparada, por exemplo, por meio de técnicas recombinantes, enzimáticas e/ou químicas e, subsequentemente, replicada em uma célula hospedeira ou um sistema in vitro. Uma sequência de nucleotídeos compreende, de preferência, um quadro de leitura aberta que codifica um produto de interesse, tal como um polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo, proteína, etc.) ou um ARN. A sequência de nucleotídeos pode conter sequências adicionais, tais como um terminador de transcrição, um peptídeo sinalizador, um IRES, um íntron, etc.[040] In the present description, the terms "nucleic acid" or "nucleotide sequence" are used interchangeably and refer to a nucleic acid molecule that has a determined sequence, which can be deoxyribonucleotide (DNA) and/or ribonucleotide ( RNA). The nucleotide sequence may first be prepared, for example, through recombinant, enzymatic and/or chemical techniques, and subsequently replicated in a host cell or an in vitro system. A nucleotide sequence preferably comprises an open reading frame that encodes a product of interest, such as a polypeptide (e.g., a peptide, protein, etc.) or an RNA. The nucleotide sequence may contain additional sequences, such as a transcription terminator, a signal peptide, an IRES, an intron, etc.
[041] O termo "região não traduzida", conforme usado aqui, se refere a uma região de nucleotídeos que não tem ORF e não define uma sequência de aminoácidos da proteína a ser expressa através de tradução ou uma região de nucleotídeos na qual o ORF não está envolvido em qualquer um de transcrição, tradução ou expressão de proteína.[041] The term "untranslated region", as used herein, refers to a region of nucleotides that has no ORF and does not define an amino acid sequence of the protein to be expressed through translation or a region of nucleotides in which the ORF is not involved in any of transcription, translation or protein expression.
[042] O termo "espécies aviárias" se destina a abranger todos os tipos de aves, tais como pássaros da classe Aves, isto é, animais vertebrados os quais têm penas, são alados, bípedes, endotérmicos e ovíparos. No contexto da invenção, aves ou espécies aviárias se refere, mais particularmente, a pássaros com interesses econômicos e/ou agronômicos, tais como aves de criação (tais como galinhas e perus), aves aquáticas (tais como patos e gansos) e aves ornamentais (tais como cisnes e psitacídeos).[042] The term "avian species" is intended to cover all types of birds, such as birds of the Aves class, that is, vertebrate animals which have feathers, are winged, bipedal, endothermic and oviparous. In the context of the invention, birds or avian species refers, more particularly, to birds with economic and/or agronomic interests, such as farmed birds (such as chickens and turkeys), waterfowl (such as ducks and geese) and ornamental birds (such as swans and parrots).
[043] O termo "vacina", conforme usado aqui, designa um agente que pode ser usado para induzir, estimular ou amplificar uma resposta imune em um organismo.[043] The term "vaccine", as used herein, designates an agent that can be used to induce, stimulate or amplify an immune response in an organism.
[044] Um "produto de interesse" inclui, sem limitação, um polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo, uma proteína, etc.), bem como um ARN (por exemplo, um ARN antissenso, um ARN interferente, um aptâmero, etc.).[044] A "product of interest" includes, without limitation, a polypeptide (e.g., a peptide, a protein, etc.), as well as an RNA (e.g., an antisense RNA, an interfering RNA, an aptamer, etc. .).
[045] Uma "resposta imune" designa o desenvolvimento, em um hospedeiro, de uma resposta imune celular e/ou mediada por anticorpos a uma composição ou vacina de interesse. Em geral, uma "resposta imune" inclui a produção de anticorpos, células B, células T auxiliares e/ou células T citotóxicas dirigidas especificamente a um antígeno ou antígenos incluídos na composição ou vacina de interesse. De preferência, a resposta imune é protetora, de modo que resistência à nova infecção será aumentada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida.[045] An "immune response" designates the development, in a host, of a cellular and/or antibody-mediated immune response to a composition or vaccine of interest. In general, an "immune response" includes the production of antibodies, B cells, T helper cells and/or cytotoxic T cells specifically directed to an antigen or antigens included in the composition or vaccine of interest. Preferably, the immune response is protective, such that resistance to new infection will be increased and/or the clinical severity of the disease reduced.
[046] Vírus da doença de Marek são vírus do herpes aviário. Vários serotipos de MDV foram reportados na técnica, particularmente o vírus da doença de Marek de serotipo 1, tal como a cepa CVI988/Rispens, e o vírus da doença de Marek de serotipo 2, tal como a cepa SB1. Os vírus da doença de Marek preferidos da invenção são derivados de serotipos ou cepas que não são patogênicas para a espécie animal alvo (por exemplo, aves). Um MDV mais preferido da invenção é um MDV recombinante de serotipo 1.[046] Marek's disease viruses are avian herpes viruses. Several MDV serotypes have been reported in the art, particularly serotype 1 Marek's disease virus, such as strain CVI988/Rispens, and serotype 2 Marek's disease virus, such as strain SB1. The preferred Marek's disease viruses of the invention are derived from serotypes or strains that are non-pathogenic for the target animal species (e.g., birds). A more preferred MDV of the invention is a serotype 1 recombinant MDV.
[047] MDV são descritos em publicações (vide, por exemplo, Kingham et al. "The genome of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek's disease viruses" - Journal of General Virology (2001) 82, 1123-1135) e estão, em geral, disponíveis a partir de coleções. A sequência do genoma de MDV também está disponível em bibliotecas gênicas (n° de Acesso do GenBank AF291866 e DQ530348).[047] MDV are described in publications (see, for example, Kingham et al. "The genome of herpesvirus of turkeys: comparative analysis with Marek's disease viruses" - Journal of General Virology (2001) 82, 1123-1135) and are, generally available from collections. The MDV genome sequence is also available in gene libraries (GenBank Accession Nos. AF291866 and DQ530348).
[048] A invenção se refere a qualquer produto ou composição de rMDV em que uma sequência de nucleotídeos recombinante está operacionalmente ligada a um promotor derivado de beta actina. Na verdade, os inventores mostraram que tais construtos permitem expressão e indução altamente aprimoradas de forte imunidade protetora. A invenção mostra, adicionalmente, que tais vírus são compatíveis para uso combinado com vírus do herpes aviário distintos para induzir a uma resposta imune aprimorada contra patógenos antigênicos distintos sem interferência cruzada substancial. Conforme demonstrado nos exemplos, os inventores descobriram, surpreendentemente que, no contexto de um rMDV, este promotor causa expressão mais elevada e duradoura de um polipeptídeo e que tal expressão não é alterada pela coadministração de um vetor de vírus do herpes aviário distinto, deste modo, permitindo imunização concomitante contra vários antígenos distintos.[048] The invention relates to any rMDV product or composition in which a recombinant nucleotide sequence is operably linked to a beta actin-derived promoter. Indeed, the inventors have shown that such constructs allow for highly enhanced expression and induction of strong protective immunity. The invention further shows that such viruses are compatible for use in combination with distinct avian herpes viruses to induce an enhanced immune response against distinct antigenic pathogens without substantial cross-interference. As demonstrated in the examples, the inventors have surprisingly discovered that, in the context of an rMDV, this promoter causes higher and longer-lasting expression of a polypeptide and that such expression is not altered by co-administration of a distinct avian herpes virus vector, thus , allowing concomitant immunization against several distinct antigens.
[049] A sequência do promotor de beta actina de galinha foi reportada na técnica e está disponível em bibliotecas gênicas públicas. Uma sequência ilustrativa é representada em SEQ ID NO: 12.[049] The chicken beta actin promoter sequence has been reported in the art and is available in public gene libraries. An illustrative sequence is represented in SEQ ID NO: 12.
[050] Um promotor "derivado" a partir de um promotor de beta actina de galinha é um promotor que compreende uma sequência de um fragmento funcional de um promotor de beta actina de galinha, de preferência, uma sequência de um fragmento transcricionalmente ativo de um promotor de beta actina de galinha. O promotor pode ainda compreender resíduos ou domínios funcionais adicionais, os quais podem ser artificiais e/ou obtidos a partir de promotor(es) distinto(s). Um promotor derivado de um promotor de beta actina de galinha compreende, tipicamente, pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos da sequência do dito promotor de beta actina de galinha ou uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência com a mesma, de preferência, pelo menos 96, 97, 98 ou 99 % de identidade de sequência com a mesma, e exibe atividade transcricional, quer isoladamente ou quando combinado com um outro domínio.[050] A promoter "derived" from a chicken beta actin promoter is a promoter that comprises a sequence of a functional fragment of a chicken beta actin promoter, preferably a sequence of a transcriptionally active fragment of a chicken beta actin promoter. The promoter may further comprise additional residues or functional domains, which may be artificial and/or obtained from distinct promoter(s). A promoter derived from a chicken beta actin promoter typically comprises at least 50 consecutive nucleotides of the sequence of said chicken beta actin promoter or a sequence having at least 90% sequence identity thereto, preferably at least 96, 97, 98 or 99% sequence identity with it, and exhibits transcriptional activity, either alone or when combined with another domain.
[051] A sequência de promotor derivado de beta actina de galinha para uso na presente invenção é, mais preferivelmente, uma sequência que compreende pelo menos uma sequência central de um promotor de beta actina de galinha. A sequência central está, tipicamente, localizada dentro da região entre os nucleotídeos -1200 a -900 do promotor nativo, ainda mais preferivelmente entre os nt -1192 e -922. Um exemplo específico de uma sequência central de um promotor de beta actina de galinha é apresentado em SEQ ID NO: 5: [051] The chicken beta actin-derived promoter sequence for use in the present invention is, more preferably, a sequence comprising at least one core sequence of a chicken beta actin promoter. The core sequence is typically located within the region between nucleotides -1200 to -900 of the native promoter, even more preferably between nt -1192 and -922. A specific example of a core sequence from a chicken beta actin promoter is shown in SEQ ID NO: 5:
[052] Em uma modalidade particular, o promotor usado na presente invenção contém uma sequência central de um promotor de beta actina de galinha a qual compreende (i) SEQ ID NO: 5 ou (ii) uma sequência que tem pelo menos 90 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5, de preferência, pelo menos 96, 97, 98 ou 99 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5, e que exibe atividade de promoção de transcrição.[052] In a particular embodiment, the promoter used in the present invention contains a core sequence of a chicken beta actin promoter which comprises (i) SEQ ID NO: 5 or (ii) a sequence that is at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 5, preferably at least 96, 97, 98 or 99% sequence identity with SEQ ID NO: 5, and which exhibits transcription-promoting activity.
[053] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a um rMDV que compreende um ácido nucleico operativamente ligado a um promotor que compreende SEQ ID NO: 12.[053] In a particular embodiment, the invention relates to an rMDV comprising a nucleic acid operably linked to a promoter comprising SEQ ID NO: 12.
[054] Em outra modalidade particular, a invenção se refere a um rMDV que compreende um ácido nucleico operativamente ligado a um promotor que compreende SEQ ID NO: 5.[054] In another particular embodiment, the invention relates to an rMDV comprising a nucleic acid operably linked to a promoter comprising SEQ ID NO: 5.
[055] Os rMDV da invenção podem ser usados para distribuição e/ou expressar qualquer polipeptídeo de interesse, tais como polipeptídeos biologicamente ativos ou polipeptídeos imunogênicos (isto é, antigênicos). Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo de interesse é um peptídeo antigênico, ainda mais preferivelmente um peptídeo ou polipeptídeo derivado de um antígeno de um organismo patogênico capaz de causar uma infecção em um animal, particularmente uma ave. Exemplos de patógenos que causam infecção em aves incluem vírus, bactérias, fungos, protozoários, etc. O (poli)peptídeo imunogênico pode, de preferência, ser (derivado) de uma proteína da superfície, uma proteína secretada ou uma proteína estrutural do dito patógeno ou fragmentos da mesma. O polipeptídeo pode ser derivado de qualquer fonte, por exemplo, viral, procariota, eucariota ou sintética.[055] The rMDVs of the invention can be used to deliver and/or express any polypeptide of interest, such as biologically active polypeptides or immunogenic (i.e., antigenic) polypeptides. In a preferred embodiment, the polypeptide of interest is an antigenic peptide, even more preferably a peptide or polypeptide derived from an antigen of a pathogenic organism capable of causing an infection in an animal, particularly a bird. Examples of pathogens that cause infection in birds include viruses, bacteria, fungi, protozoa, etc. The immunogenic (poly)peptide may preferably be (derived) from a surface protein, a secreted protein or a structural protein of said pathogen or fragments thereof. The polypeptide can be derived from any source, for example, viral, prokaryotic, eukaryotic or synthetic.
[056] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico codifica um peptídeo antigênico de um agente patogênico de pássaro.[056] In a preferred embodiment, the nucleic acid encodes an antigenic peptide from a bird pathogen.
[057] Exemplos específicos de agentes patogênicos incluem, sem limitação, o vírus da gripe aviária, paramixovírus aviário de tipo 1, também denominado de vírus da doença Newcastle (NDV), metapneumovírus aviário, vírus da doença de Marek, vírus da doença de Gumboro, também denominado de vírus da doença bursal infecciosa (Infectious Bursal Disease Virus - IBDV), vírus da laringotraqueíte infecciosa (Infectious LaryngoTracheitis Virus - ILVT), vírus da bronquite infecciosa (Infectious Bronchitis Virus - IBV) , Escherichia coli, espécies Salmonella, Pasteurella multocida, Riemerella anatipestifer, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, micro-organismos micoplasmáticos que infectam espécies aviárias ou coccídeos.[057] Specific examples of pathogenic agents include, without limitation, avian influenza virus, avian paramyxovirus type 1, also called Newcastle disease virus (NDV), avian metapneumovirus, Marek's disease virus, Gumboro disease virus , also called infectious bursal disease virus (IBDV), infectious laryngotracheitis virus (Infectious LaryngoTracheitis Virus - ILVT), infectious bronchitis virus (Infectious Bronchitis Virus - IBV), Escherichia coli, Salmonella species, Pasteurella multocida , Riemerella anatipestifer, Ornithobacterium rhinotracheale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, mycoplasmic microorganisms that infect avian species or coccidia.
[058] De preferência, o polipeptídeo imunogênico é selecionado a partir da proteína F de NDV, da proteína VP2 de IBDV, da proteína gB de ILTV, da proteína de 40K de Mycoplasma galisepticum e da proteína de superfície hemaglutinina (HemAgglutinin - HA) do vírus da gripe aviária, ou fragmentos imunogênicos das mesmas.[058] Preferably, the immunogenic polypeptide is selected from the NDV F protein, the IBDV VP2 protein, the ILTV gB protein, the Mycoplasma galisepticum 40K protein and the hemagglutinin (HemAgglutinin - HA) surface protein of avian influenza virus, or immunogenic fragments thereof.
[059] Dentro do contexto da presente invenção, o termo "fragmento" de uma proteína designa, de preferência, um fragmento que compreende pelo menos 5 resíduos de aminoácidos consecutivos da dita proteína, ainda mais preferivelmente de 5-100. Em uma modalidade preferida, tal fragmento compreende pelo menos um epítopo e/ou é imunogênica in vivo, isto é, pode causar a produção de anticorpos que se ligam à proteína de comprimento completo.[059] Within the context of the present invention, the term "fragment" of a protein preferably designates a fragment comprising at least 5 consecutive amino acid residues of said protein, even more preferably 5-100. In a preferred embodiment, such a fragment comprises at least one epitope and/or is immunogenic in vivo, that is, it can cause the production of antibodies that bind to the full-length protein.
[060] Exemplos específicos de peptídeos imunogênicos incluem, por exemplo, um peptídeo que compreende os resíduos de aminoácidos 1-453 de toda a VP2.[060] Specific examples of immunogenic peptides include, for example, a peptide comprising amino acid residues 1-453 of the entire VP2.
[061] A clonagem de genes e construção de plasmídeos são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser essencialmente realizadas por meio de técnicas de biologia molecular convencionais (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, EUA, 2012).[061] Gene cloning and plasmid construction are well known to those skilled in the art and can essentially be carried out using conventional molecular biology techniques (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012).
[062] Conforme indicado acima, os rMDVs da invenção compreendem uma sequência recombinante clonada, tipicamente, em uma região não essencial do genoma viral. A clonagem pode ser realizada por meio de métodos conhecidos per se na técnica. Normalmente, os vírus recombinantes podem ser preparados através de recombinação homóloga entre o genoma viral e um construto (por exemplo, um plasmídeo) que compreende o ácido nucleico a ser inserido, flanqueado por nucleotídeos provenientes do sítio de inserção para permitir recombinação. A clonagem pode ser feita com ou sem eliminação das sequências endógenas. Em uma modalidade particular, a sequência recombinante é clonada em substituição de pelo menos parte de uma sequência do genoma, tal como pelo menos 50 nucleotídeos ou mais. Tal eliminação, por exemplo, aumenta a capacidade de clonagem do vetor.[062] As indicated above, the rMDVs of the invention comprise a recombinant sequence cloned, typically, in a non-essential region of the viral genome. Cloning can be carried out using methods known per se in the art. Typically, recombinant viruses can be prepared through homologous recombination between the viral genome and a construct (e.g., a plasmid) comprising the nucleic acid to be inserted, flanked by nucleotides originating from the insertion site to allow recombination. Cloning can be done with or without elimination of endogenous sequences. In a particular embodiment, the recombinant sequence is cloned in replacement of at least part of a genome sequence, such as at least 50 nucleotides or more. Such elimination, for example, increases the cloning capacity of the vector.
[063] Para esta finalidade, uma sequência que contém a região alvo é, tipicamente, primeiro clonada em um vetor adequado. De acordo com a invenção, tal região alvo é, de preferência, uma região não essencial para replicação ou infecção viral, tal como uma região não codificadora (ou não traduzida) ou um gene não essencial. Um exemplo preferido de tal região é o gene US2. Exemplos de vetores incluem plasmídeos, tais como pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8 ou pUC9; fagos, tais como o fago lambda e o fago M13; ou cosmídeo, tal como pHC79.[063] For this purpose, a sequence containing the target region is typically first cloned into a suitable vector. According to the invention, such a target region is preferably a region non-essential for viral replication or infection, such as a non-coding (or non-translated) region or a non-essential gene. A preferred example of such a region is the US2 gene. Examples of vectors include plasmids such as pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC18, pUC19, pUC7, pUC8 or pUC9; phages, such as lambda phage and M13 phage; or cosmid, such as pHC79.
[064] A sequência da região alvo é integrada no vetor de acordo com um método de clonagem convencional. A sequência da região alvo usada é, de preferência, de um comprimento suficiente de modo a permitir subsequente recombinação homóloga in vivo com o genoma viral. De preferência, a sequência da região alvo clonada deve ter pelo menos cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, tipicamente acima de 300, tal como entre 1000 e 2000 nucleotídeos.[064] The target region sequence is integrated into the vector according to a conventional cloning method. The target region sequence used is preferably of sufficient length to permit subsequent in vivo homologous recombination with the viral genome. Preferably, the cloned target region sequence should be at least about 100 nucleotides in length, typically over 300, such as between 1000 and 2000 nucleotides.
[065] As sequências codificadoras e o promotor, para inserção no vírus, são inseridos na região alvo do genoma viral clonado no vetor. A inserção deve, de preferência, ser feita de uma maneira que deixe uma porção de sequência da região alvo em cada lado do inserto clonado de um comprimento suficiente para permitir recombinação homóloga (por exemplo, de pelo menos 50 nucleotídeos, de preferência, de pelo menos 100 nucleotídeos). As sequências codificadoras e o promotor podem ser introduzidos na região alvo clonada por meio de procedimentos clássicos com enzimas de restrição e ligação. Se apropriado, mutação(ões) pode(m) ser realizada(s) em um sítio específico da região alvo para criar um novo sítio de clivagem para uma enzima de restrição. Técnicas convencionais de mutagênese bem conhecidas por aqueles versados na técnica podem ser usadas para esta finalidade tais como, por exemplo, mutagênese in vitro ou PCR.[065] The coding sequences and promoter, for insertion into the virus, are inserted into the target region of the viral genome cloned into the vector. The insertion should preferably be done in a manner that leaves a portion of target region sequence on each side of the cloned insert of sufficient length to permit homologous recombination (e.g., of at least 50 nucleotides, preferably of at least least 100 nucleotides). The coding sequences and promoter can be introduced into the cloned target region using classical restriction and ligation enzyme procedures. If appropriate, mutation(s) can be made at a specific site in the target region to create a new cleavage site for a restriction enzyme. Conventional mutagenesis techniques well known to those skilled in the art can be used for this purpose such as, for example, in vitro mutagenesis or PCR.
[066] Os vetores nos quais a sequência codificadora e o promotor foram inseridos na região do alvo obtida conforme acima podem ser introduzidos em uma célula infectada pelo MDV ou células transfectadas com o genoma do MDV usando técnicas conhecidas, tais como eletroporação, fosfato de cálcio, o método baseado em lipofectina ou similar. Os vírus recombinantes são, deste modo, produzidos por meio de recombinação nas ditas células entre as regiões homólogas de MDV-ADN e o vetor. Quando a quantidade do vetor está na faixa de 0,1 a 1000 μg, a eficiência de geração de vírus recombinantes é particularmente otimizada.[066] Vectors in which the coding sequence and promoter have been inserted into the target region obtained as above can be introduced into an MDV-infected cell or cells transfected with the MDV genome using known techniques, such as electroporation, calcium phosphate , the lipofectin-based method or similar. Recombinant viruses are thus produced through recombination in said cells between homologous regions of MDV-DNA and the vector. When the amount of vector is in the range of 0.1 to 1000 μg, the efficiency of generating recombinant viruses is particularly optimized.
[067] Os vírus recombinantes resultantes podem ser selecionados genotípica ou fenotipicamente usando técnicas de seleção conhecidas, por exemplo, por meio de hibridização, detecção de atividade enzimática codificada por um gene integrado juntamente com as sequências de ácido nucleico recombinantes ou detecção do peptídeo antigênico expresso pelo vírus recombinante imunologicamente. Os vírus recombinantes selecionados podem ser cultivados em larga escala em cultura de células, após o que peptídeos contendo vírus recombinantes podem ser coletados.[067] The resulting recombinant viruses can be selected genotypically or phenotypically using known selection techniques, for example, through hybridization, detection of enzymatic activity encoded by an integrated gene together with the recombinant nucleic acid sequences or detection of the expressed antigenic peptide by the immunologically recombinant virus. Selected recombinant viruses can be grown on a large scale in cell culture, after which peptides containing recombinant viruses can be collected.
[068] rMDVs preferidos da invenção compreendem pelo menos um ácido nucleico recombinante inserido no gene US2, mais preferivelmente em substituição de pelo menos parte do gene US2, ainda mais preferivelmente entre os 248° e 494° nucleotídeos do códon inicial.[068] Preferred rMDVs of the invention comprise at least one recombinant nucleic acid inserted into the US2 gene, more preferably replacing at least part of the US2 gene, even more preferably between the 248th and 494th nucleotides of the start codon.
[069] rMDVs mais preferidos da presente invenção são baseados em MDV de serotipo 1.[069] Most preferred rMDVs of the present invention are based on serotype 1 MDV.
[070] Além disso, rMDVs preferidos da invenção codificam um peptídeo antigênico selecionado dentre a proteína F de NDV, a proteína VP2 de IBDV, a proteína gB de ILTV, a proteína de 40K de Mycoplasma galisepticum e a proteína da superfície HA do vírus da gripe aviária, ou fragmentos das mesmas.[070] Furthermore, preferred rMDVs of the invention encode an antigenic peptide selected from the NDV F protein, the IBDV VP2 protein, the ILTV gB protein, the Mycoplasma galisepticum 40K protein and the HA surface protein of the virus. avian influenza, or fragments thereof.
[071] De acordo com uma modalidade particular, a invenção se refere a um MDV1 recombinante o qual compreende, inserido no gene US2, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína VP2 de IBDV, ou um fragmento da mesma, sob o controle de um promotor que compreende uma sequência central do promotor de beta actina de galinha.[071] According to a particular embodiment, the invention refers to a recombinant MDV1 which comprises, inserted into the US2 gene, a nucleotide sequence that encodes an IBDV VP2 protein, or a fragment thereof, under the control of a promoter comprising a core sequence from the chicken beta actin promoter.
[072] Exemplos específicos de tais rMDVs da invenção incluem RR013, RR030 e RR031.[072] Specific examples of such rMDVs of the invention include RR013, RR030 and RR031.
[073] Em RR013, a sequência do peptídeo antigênico está localizada sob o controle de um promotor Bac de SEQ ID NO: 12, inserido no gene US2 de MDV1.[073] In RR013, the antigenic peptide sequence is located under the control of a Bac promoter of SEQ ID NO: 12, inserted into the US2 gene of MDV1.
[074] Em RR030 e RR031, a sequência do peptídeo antigênico está localizada sob o controle do promotor Coa5 de SEQ ID NO: 5, inserido no gene US2 de MDV1.[074] In RR030 and RR031, the antigenic peptide sequence is located under the control of the Coa5 promoter of SEQ ID NO: 5, inserted into the US2 gene of MDV1.
[075] Os vírus recombinantes da presente invenção podem ser propagados em quaisquer culturas de células competentes. Após o crescimento necessário dos vírus ser alcançado, as células podem ser desprendidas das cavidades usando um raspador ou com tripsina e as células infectadas podem ser separadas do sobrenadante por meio de centrifugação.[075] The recombinant viruses of the present invention can be propagated in any competent cell cultures. After the necessary virus growth is achieved, the cells can be detached from the wells using a scraper or with trypsin and the infected cells can be separated from the supernatant by centrifugation.
[076] Exemplos de células competentes incluem CEF, ovo embrionado, células de rim de galinha e assim por diante. As células ou vírus podem ser cultivados em um meio de cultura, tal como MEM de Eagle, meio de cultura de Leibowitz-L-15/McCoy 5A (mistura a 1:1) a cerca de 37 °C durante 3 a 6 dias. As células infectadas são, tipicamente, suspensas em um meio de cultura contendo sulfóxido de dimetila (DMSO) a 10 % e armazenadas congeladas em nitrogênio líquido.[076] Examples of competent cells include CEF, embryonated egg, chicken kidney cells and so on. The cells or viruses can be grown in a culture medium such as Eagle's MEM, Leibowitz-L-15/McCoy 5A culture medium (1:1 mix) at about 37 °C for 3 to 6 days. Infected cells are typically suspended in a culture medium containing 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and stored frozen in liquid nitrogen.
[077] A invenção também se refere a composições, tais como vacinas, as quais compreendem um ou mais MDVs recombinantes da invenção.[077] The invention also relates to compositions, such as vaccines, which comprise one or more recombinant MDVs of the invention.
[078] As composições da invenção podem compreender o rMDV em um veículo ou excipiente veterinária ou farmaceuticamente aceitável. A composição pode, além disso, ou alternativamente, compreender um adjuvante adequado.[078] The compositions of the invention may comprise rMDV in a veterinary or pharmaceutically acceptable vehicle or excipient. The composition may further, or alternatively, comprise a suitable adjuvant.
[079] Os rMDVs da invenção podem ser usados na forma viva (por exemplo, para preparar vacinas vivas) ou, alternativamente, na forma inativada, atenuada ou morta. A produção de tais formas é conhecida na técnica.[079] The rMDVs of the invention can be used in live form (for example, to prepare live vaccines) or, alternatively, in inactivated, attenuated or killed form. The production of such shapes is known in the art.
[080] A vacina de acordo com a presente invenção pode ainda compreender um solvente adequado tal como, por exemplo, um tampão aquoso ou um tampão de fosfato. De preferência, a vacina ainda compreende aditivos. Os aditivos da presente invenção podem ser obtidos de qualquer uma de uma série de fontes, incluindo várias proteínas e peptídeos derivados de animais (por exemplo, hormônios, citocinas, fatores coestimuladores), e novos ácidos nucleicos derivados de vírus e outras fontes (por exemplo, ARN fita dupla, CpG), e assim por diante, os quais são administrados com a vacina em uma quantidade suficiente para aumentar a resposta imune. Além disso, qualquer variedade de combinações das substâncias supracitadas pode conferir um efeito de imunopotencialização e, portanto, pode formar um imunopotencializador da presente invenção.[080] The vaccine according to the present invention may further comprise a suitable solvent such as, for example, an aqueous buffer or a phosphate buffer. Preferably, the vaccine further comprises additives. The additives of the present invention can be obtained from any of a number of sources, including various animal-derived proteins and peptides (e.g., hormones, cytokines, co-stimulatory factors), and novel nucleic acids derived from viruses and other sources (e.g. , double-stranded RNA, CpG), and so on, which are administered with the vaccine in sufficient quantity to enhance the immune response. Furthermore, any variety of combinations of the aforementioned substances can confer an immunopotentiating effect and, therefore, can form an immunopotentiator of the present invention.
[081] As vacinas da presente invenção podem ainda ser formuladas com um ou mais de outros aditivos para manter a isotonicidade, o pH fisiológico e a estabilidade, por exemplo, um tampão, tal como solução salina fisiológica (0,85 %), solução salina tamponada com fosfato (Phosphate Buffered Saline), tampões de citrato, tris (hidroximetil aminometano (TRIS), solução salina e assim por diante, ou um antibiótico tamponado com Tris, por exemplo, neomicina ou estreptomicina, etc.[081] The vaccines of the present invention can also be formulated with one or more other additives to maintain isotonicity, physiological pH and stability, for example, a buffer, such as physiological saline solution (0.85%), saline solution. Phosphate Buffered Saline, citrate buffers, Tris (hydroxymethyl aminomethane (TRIS) saline, and so on, or a Tris-buffered antibiotic, for example, neomycin or streptomycin, etc.
[082] A via de administração pode ser qualquer via, incluindo vacinação oral, ocular (por exemplo, através de colírios), administração óculo-nasal usando aerossol, intranasal, cloacal na ração, na água ou através de pulverização, in ovo, topicamente ou por meio de injeção (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraorbital, intraocular, intradérmica e/ou intraperitoneal). Aqueles versados na técnica adaptarão facilmente a formulação da composição de vacina para cada tipo de via de administração.[082] The route of administration can be any route, including oral vaccination, ocular (for example, through eye drops), oculo-nasal administration using aerosol, intranasal, cloacal in feed, in water or through spraying, in ovo, topically or by injection (e.g., intravenous, subcutaneous, intramuscular, intraorbital, intraocular, intradermal and/or intraperitoneal). Those skilled in the art will readily adapt the formulation of the vaccine composition for each type of route of administration.
[083] Cada dose de vacina pode conter uma dose adequada suficiente para estimular uma resposta imune protetora em espécies de aves. A otimização de tal dose é bem conhecida na técnica. A quantidade de antígeno por dose pode ser determinada por meio de métodos conhecidos usando reações de antígeno/anticorpo, por exemplo, através do método ELISA.[083] Each vaccine dose may contain an adequate dose sufficient to stimulate a protective immune response in avian species. Optimization of such a dose is well known in the art. The amount of antigen per dose can be determined by known methods using antigen/antibody reactions, for example via the ELISA method.
[084] As vacinas da invenção podem ser administradas como doses únicas ou em doses repetidas, dependendo do protocolo de vacinação.[084] The vaccines of the invention can be administered as single doses or in repeated doses, depending on the vaccination protocol.
[085] As vacinas da presente invenção são ainda vantajosas pelo fato de que elas conferem, às espécies de aves, até 80 % de proteção contra os patógenos aviários alvo.[085] The vaccines of the present invention are further advantageous in that they provide bird species with up to 80% protection against target avian pathogens.
[086] A presente invenção se refere ainda ao uso da vacina conforme descrito acima para imunização de espécies de aves, tais como aves de criação, e ao método de imunização de espécies de aves através de administração de uma quantidade imunologicamente eficaz da vacina de acordo com a invenção. A vacina pode, vantajosamente, ser administrada por via intradérmica, subcutânea, intramuscular, oral, in ovo, através de administração mucosal ou administração óculo-nasal.[086] The present invention further relates to the use of the vaccine as described above for immunizing bird species, such as farmed birds, and to the method of immunizing bird species by administering an immunologically effective amount of the vaccine according to with the invention. The vaccine can advantageously be administered intradermally, subcutaneously, intramuscularly, orally, in ovo, through mucosal administration or oculonasal administration.
[087] A presente invenção também se refere a kits de vacinação para imunização de espécies de aves os quais compreendem uma quantidade eficaz da vacina multivalente conforme descrito acima e um meio para administração dos ditos componentes à dita espécie. Por exemplo, tal kit compreende um dispositivo de injeção enchido com a vacina de acordo com a invenção e instruções para injeção intradérmica, subcutânea, intramuscular ou in ovo. Alternativamente, o kit compreende um dispositivo de pulverização/aerossol ou colírio enchido com a vacina de acordo com a invenção e instruções para administração óculo- nasal, oral ou mucosal.[087] The present invention also relates to vaccination kits for immunizing bird species which comprise an effective amount of the multivalent vaccine as described above and a means for administering said components to said species. For example, such a kit comprises an injection device filled with the vaccine according to the invention and instructions for intradermal, subcutaneous, intramuscular or in ovo injection. Alternatively, the kit comprises a spray/aerosol device or eye drops filled with the vaccine according to the invention and instructions for oculonasal, oral or mucosal administration.
[088] Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão descritos na seção experimental a seguir, a qual é ilustrativa da invenção reivindicada.[088] Other aspects and advantages of the present invention will be described in the following experimental section, which is illustrative of the claimed invention.
[089] Nos experimentos, vários vírus recombinantes foram produzidos e usados, os quais são designados da seguinte forma (vírus/sítio de inserção/genes inseridos): RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc RR024: Rispens/US2/RSV-VP2stc RR025: Rispens/US2/SV40-VP2stc RR030: Rispens/US2/Coa5-VP2stc RR031: Rispens/US2/Coa5-VP2stc2 FW023 (controle de HVT/IBD recombinante): HVT/U145- 46/Bac-VP2stc FW029 (controle de HVT/ND recombinante): HVT/U145- 46/Pec-F[089] In the experiments, several recombinant viruses were produced and used, which are designated as follows (virus/insertion site/inserted genes): RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc RR024: Rispens/US2/RSV-VP2stc RR025: Rispens/US2/SV40-VP2stc RR030: Rispens/US2/Coa5-VP2stc RR031: Rispens/US2/Coa5-VP2stc2 FW023 (recombinant HVT/IBD control): HVT/U145-46/Bac-VP2stc FW029 (recombinant HVT/IBD control): Recombinant HVT/ND): HVT/U145- 46/Pec-F
[090] A construção do plasmídeo foi essencialmente realizada por meio de técnicas convencionais de biologia molecular (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 4a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, EUA, 2012).[090] The construction of the plasmid was essentially carried out using conventional molecular biology techniques (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012).
[091] Um fragmento de ADN de 2,2-kb do genoma Rispens que flanqueia o sítio de inserção pretendido (dentro do gene US2) foi clonado através de reações de PCR, eliminando uma porção (0,2 kb) do gene US2 e adicionando sítio de reconhecimento SfiI no sítio de inserção (Figura 1). Resumidamente, usando ADN extraído de Rispens como um modelo, foram realizadas duas reações de PCR. Os pares de iniciadores usados são SEQ ID NO: 1 (5'- AAACGAATTCGAAGCTTGCATGCCCCGCTAAGGAC-3') e SEQ ID NO: (5'- GCCACCAGATGGAACTGGGGCCAATAAGGCCGGTATGCCGTGGGCC-3') e SEQ ID NO: 3 (5'-GGCCCACGGCATACCGGCCTTATTGGCCCCAGTTCCATCTGGTGGC-3') e SEQ ID NO: 4 (5'-GATTACGAATTCGCCCTTTTACATGCTGC CCCAA-3'). Outra reação de PCR foi realizada usando uma mistura de produtos de PCR a partir das duas reações de PCR anteriores como um modelo e SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4 como iniciadores. Um fragmento de PCR obtido foi clonado no vetor pUC18 (N° de Acesso GenBank 109136) após digestão com EcoRI e HindIII, resultando no pRisUS2Sfi.[091] A 2.2-kb DNA fragment from the Rispens genome flanking the intended insertion site (within the US2 gene) was cloned through PCR reactions, eliminating a portion (0.2 kb) of the US2 gene and adding SfiI recognition site at the insertion site (Figure 1). Briefly, using DNA extracted from Rispens as a template, two PCR reactions were performed. The primer pairs used are SEQ ID NO: 1 (5'- AAACGAATTCGAAGCTTGCATGCCCCGCTAAGGAC-3') and SEQ ID NO: (5'- GCCACCAGATGGAACTGGGGCCAATAAGGCCGGTATGCCGTGGGCC-3') and SEQ ID NO: 3 (5'-GGCCCACGGCATACCGGCCTTATTGGCCCCAGTTCCATCTGGTGGC-3') and SEQ ID NO: 4 (5'-GATTACGAATTCGCCCTTTTACATGCTGC CCCAA-3'). Another PCR reaction was performed using a mixture of PCR products from the two previous PCR reactions as a template and SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4 as primers. An obtained PCR fragment was cloned into the pUC18 vector (GenBank Accession No. 109136) after digestion with EcoRI and HindIII, resulting in pRisUS2Sfi.
[092] Usando o plasmídeo pRisUS2Sfi, vários vetores de homologia contendo um promotor e o gene VP2 de IBDV da cepa de desafio padrão (VP2-STC) foram construídos. Estes vetores de homologia foram usados para construir Rispens/IBD recombinante (RR013, RR024, 5 RR025, RR030 e RR031). Primeiro, pRisUS2Sfi foi clivado com SfiI e desfosforilado com Fosfatase Alcalina Shewanella sp. S1B1 recombinante (PAP) (Funakoshi # DE110). O cassete de promotor Bac-VP2-STC foi obtido por meio de digestão com BglI de p45/46bacVP2-STC#11 (Patente dos Estados Unidos N° 6.764.684) e inserido no pRisUS2Sfi digerido com SfiI, resultando no pRisUS2bacVP2stc. Este plasmídeo, pRisUS2bacVP2stc, foi usado para construir um Rispens/IBD recombinante, RR013. Plasmídeos de homologia que contêm uma sequência central parcial (SEQ ID NO: 5) do promotor Bac (promotor Coa5) também foram construídos. O promotor Coa5 foi obtido a partir do plasmídeo pGICOA (Patente dos Estados Unidos N° 6.866.852) por meio de digestão com XbaI e BglI e ligado com um fragmento XbaI-EcoRI (6,3 kb) e um fragmento EcoRI-BglI (0,1 kb) de p45/46bacVP2- STC#11, resultando no P45/46COA5VP2-STC#11. O cassete de promotor Coa5-VP2-STC foi, então, cortado do P45/46COA5VP2- STC#11 através de digestão com BglI e ligado com o pRisUS2Sfi digerido com SfiI, resultando no pRisUS2Coa5VP2stc. Este plasmídeo, pRisUS2Coa5VP2stc, foi usado para construir RR030. Outro vetor de homologia com o promotor Coa5 foi construído tendo uma sequência diferente entre o promotor Coa5 e o gene VP2-STC. Após PCR usando pRisUS2Coa5VP2stc como modelo e SEQ ID NO: 6 (5'-GTGGGGACCCGAGGATTTTG-3') e SEQ ID NO: 7 (5'- GCGTCTAGA GGATCGATCCACCGGTCGCCACCATGACAAACCTGCAAGATCA-3') como iniciadores, um fragmento de ADN obtido foi digerido com XbaI e SalI e, então, inserido em um fragmento XbaI-SalI (5,2 kb) do pRisUS2Coa5VP2stc. O plasmídeo resultante, pRisUS2Coa5VP2stc2, foi usado para fazer RR031. Um cassete de promotor de RSV-VP2-STC e um cassete de promotor de SV40-VP2- STC foram obtidos por meio de digestão do p44-45d46RsvVP2 e p44-45d46SV40VP2 (Patente EP 12305390), respectivamente, com BglI. Estes fragmentos foram ligados com o pRisUS2Sfi digerido com SfiI, resultando no pRisUS2RSVVP2stc e pRisUS2SV40VP2stc. Estes plasmídeos foram usados para construir RR024 e RR025, respectivamente.[092] Using the pRisUS2Sfi plasmid, several homology vectors containing a promoter and the IBDV VP2 gene from the standard challenge strain (VP2-STC) were constructed. These homology vectors were used to construct recombinant Rispens/IBD (RR013, RR024, 5 RR025, RR030 and RR031). First, pRisUS2Sfi was cleaved with SfiI and dephosphorylated with Shewanella sp. Alkaline Phosphatase. Recombinant S1B1 (PAP) (Funakoshi #DE110). The Bac-VP2-STC promoter cassette was obtained through BglI digestion of p45/46bacVP2-STC#11 (United States Patent No. 6,764,684) and inserted into the SfiI-digested pRisUS2Sfi, resulting in pRisUS2bacVP2stc. This plasmid, pRisUS2bacVP2stc, was used to construct a recombinant Rispens/IBD, RR013. Homology plasmids containing a partial core sequence (SEQ ID NO: 5) of the Bac promoter (Coa5 promoter) were also constructed. The Coa5 promoter was obtained from plasmid pGICOA (United States Patent No. 6,866,852) by digestion with XbaI and BglI and ligated with an XbaI-EcoRI fragment (6.3 kb) and an EcoRI-BglI fragment ( 0.1 kb) of p45/46bacVP2-STC#11, resulting in P45/46COA5VP2-STC#11. The Coa5-VP2-STC promoter cassette was then cut from P45/46COA5VP2-STC#11 via BglI digestion and ligated with the SfiI-digested pRisUS2Sfi, resulting in pRisUS2Coa5VP2stc. This plasmid, pRisUS2Coa5VP2stc, was used to construct RR030. Another homology vector with the Coa5 promoter was constructed having a different sequence between the Coa5 promoter and the VP2-STC gene. After PCR using pRisUS2Coa5VP2stc as template and SEQ ID NO: 6 (5'-GTGGGGACCCGAGGATTTTG-3') and SEQ ID NO: 7 (5'- GCGTCTAGA GGATCGATCCACCGGTCGCCACCATGACAAACCTGCAAGATCA-3') as primers, a DNA fragment obtained was digested with XbaI and SalI and then inserted into an XbaI-SalI fragment (5.2 kb) of pRisUS2Coa5VP2stc. The resulting plasmid, pRisUS2Coa5VP2stc2, was used to make RR031. An RSV-VP2-STC promoter cassette and an SV40-VP2-STC promoter cassette were obtained by digesting p44-45d46RsvVP2 and p44-45d46SV40VP2 (EP Patent 12305390), respectively, with BglI. These fragments were ligated with the SfiI-digested pRisUS2Sfi, resulting in pRisUS2RSVVP2stc and pRisUS2SV40VP2stc. These plasmids were used to construct RR024 and RR025, respectively.
[093] Construção de Rispens recombinante foi realizada por meio de recombinação homóloga em células em cultura ou E. coli. Para recombinação homóloga em células em cultura, o ADN viral de tipo selvagem do vírus Rispens foi preparado conforme descrito por Morgan et al. (Avian Diseases, 34: 345-351, 1990). Aproximadamente 2 μg de ADN de Rispens e 1 μg de um dos vetores de homologia foram transfectados em aproximadamente 107 células CEF através de eletroporação usando Nucleofector II (Lonza, Basileia, Suíça). As células transfectadas foram adicionadas a L-15 de Leibovitz (Life Technologies Corp., Cat #41300-39), meio 5A de McCoy (Life Technologies Corp., Cat #21500-061) (1:1) e soro de vitelo a 4 % [meio LM (+)], colocadas em placas de cultura tecidual com 96 cavidades e, então, incubadas a 37 °C em 4-5 % de CO2 durante 5-7 dias, até que as placas de Rispens se tornassem visíveis. As células foram, então, liberadas das placas por meio de tratamento com tripsina, transferidas igualmente para duas placas com 96 cavidades com CEF e incubadas durante 4 a 6 dias, até que placas fossem observadas. O rastreio foi realizado através do ensaio em placa preta, que mostra coloração apenas de placas que expressam a proteína VP2 de IBDV. Resumidamente, uma das duas placas foi fixada com metanol:acetona (1:2) e incubada com anticorpo monoclonal R63 anti-VP2 de IBDV (ATCC #: HB-9490). Em seguida, incubadas com anticorpo biotinilado anti-IgG de camundongo (Vector Laboratories, Cat # BA-9200) e, então, com o kit VECTASTAIN ABC-AP (Vector Laboratories, Cat# AK-5000), placas que expressam a proteína VP2 foram coradas mediante adição de solução NBT/BCIP (Roche Applied Science, Cat# 1681451). As cavidades que contêm placas recombinantes coradas foram identificadas e as células das cavidades correspondentes na outra placa com 96 cavidades foram tratadas com tripsina. As células foram, então, diluídas em células CEF secundárias frescas e transferidas para placas com 96 cavidades para completar o primeiro ciclo de purificação. O procedimento de purificação foi repetido até que todas as placas estivessem coradas positivamente no ensaio de placa preta. Para recombinação homóloga em E. coli, a cepa DH10B de E. coli que traz o genoma de Rispens como cromossomas artificiais bacterianos (Bacterial Artificial Chromosomes - BAC) e plasmídeo pKD46 (N° de Acesso GenBank AY048746) foi transfectada com 1 μg de um dos vetores de homologia após indução de enzimas de recombinação mediante adição de L-arabinose a 10 mM. A transfecção foi realizada através de eletroporação usando Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories) a 1.75 kV, 25 μF e 200 ohms. Após transfecção, a E. coli foi colocada sobre placas de agar com meio de Luria-Bertani (LB) e incubadas de um dia para o outro a 37 °C. Clones de E. coli trazendo um inserto apropriado contendo o gene VP2 foram identificados através de PCR usando um amplificação com um par de iniciadores de uma região entre o gene VP2 e a região do sítio de inserção do genoma de Rispens. Os iniciadores são SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8 (5'- TGAACTACACAAAATTGATACTGA -3'). ADN de Rispens BAC foi extraído de clones que continham o inserto e transfectado em CEF usando Nucleofector II (Lonza). As células CEF transfectadas foram colocadas em placas com 96 cavidades e incubadas a 37 °C em 4-5 % de CO2 durante 5-7 dias, até que placas de Rispens se tornassem visíveis. Placas que expressam a proteína VP2 foram purificadas conforme descrito acima.[093] Construction of recombinant Rispens was carried out through homologous recombination in cultured cells or E. coli. For homologous recombination in cultured cells, wild-type viral DNA from Rispens virus was prepared as described by Morgan et al. (Avian Diseases, 34: 345-351, 1990). Approximately 2 μg of Rispens DNA and 1 μg of one of the homology vectors were transfected into approximately 107 CEF cells via electroporation using Nucleofector II (Lonza, Basel, Switzerland). Transfected cells were added to Leibovitz's L-15 (Life Technologies Corp., Cat #41300-39), McCoy's 5A medium (Life Technologies Corp., Cat #21500-061) (1:1) and calf serum at 4% [LM (+) medium], placed in 96-well tissue culture plates and then incubated at 37°C in 4-5% CO2 for 5-7 days until Rispens plates became visible . The cells were then released from the plates by trypsin treatment, transferred equally to two 96-well plates with CEF, and incubated for 4 to 6 days until plaques were observed. The screening was carried out using the black plate assay, which shows staining only of plaques expressing the IBDV VP2 protein. Briefly, one of the two plates was fixed with methanol:acetone (1:2) and incubated with IBDV anti-VP2 monoclonal antibody R63 (ATCC #: HB-9490). Then, incubated with biotinylated anti-mouse IgG antibody (Vector Laboratories, Cat# BA-9200) and then with the VECTASTAIN ABC-AP kit (Vector Laboratories, Cat# AK-5000), plates expressing the VP2 protein were stained by adding NBT/BCIP solution (Roche Applied Science, Cat# 1681451). The wells containing stained recombinant plates were identified and cells in the corresponding wells in the other 96-well plate were treated with trypsin. The cells were then diluted in fresh secondary CEF cells and transferred to 96-well plates to complete the first round of purification. The purification procedure was repeated until all plaques were positively stained in the black plaque assay. For homologous recombination in E. coli, the DH10B strain of E. coli that carries the Rispens genome as bacterial artificial chromosomes (Bacterial Artificial Chromosomes - BAC) and plasmid pKD46 (GenBank Accession No. AY048746) was transfected with 1 μg of a of homology vectors after induction of recombination enzymes by addition of 10 mM L-arabinose. Transfection was performed via electroporation using Gene Pulser Xcell (Bio-Rad Laboratories) at 1.75 kV, 25 μF, and 200 ohms. After transfection, E. coli was placed on agar plates with Luria-Bertani (LB) medium and incubated overnight at 37 °C. E. coli clones carrying an appropriate insert containing the VP2 gene were identified through PCR using a primer pair amplification of a region between the VP2 gene and the insertion site region of the Rispens genome. The primers are SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 8 (5'- TGAACTACACAAAATTGATACTGA -3'). Rispens BAC DNA was extracted from clones containing the insert and transfected into CEF using Nucleofector II (Lonza). Transfected CEF cells were plated in 96-well plates and incubated at 37°C in 4-5% CO2 for 5-7 days until Rispens plaques became visible. Plaques expressing VP2 protein were purified as described above.
[094] As estruturas de genoma do Rispens/IBD recombinante foram verificadas através de duas reações de PCR, amplificando as regiões de junção (Junção 1 e Junção 2) em cada extremidade dos genes inseridos. A Figura 2 mostra onde a Junção 1 e a Junção 2 estão localizadas no genoma do vírus recombinante. Os pares de iniciadores usados nas reações de PCR são SEQ ID NO: 9 (5'-GAGGCGGACGTAAATGGAGA-3') e SEQ ID NO: 8 para a Junção 1 e SEQ ID NO: 10 (5'- GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3') e SEQ ID NO: 11 (5'- TATGAGCGGCAGTTATCGTGT-3') para a Junção 2. Os tamanhos esperados dos produtos de PCR foram observados com todos os Rispens recombinante, confirmando que estes Rispens recombinante têm as estruturas de genoma esperadas.[094] The recombinant Rispens/IBD genome structures were verified through two PCR reactions, amplifying the junction regions (Junction 1 and Junction 2) at each end of the inserted genes. Figure 2 shows where Junction 1 and Junction 2 are located in the recombinant virus genome. The primer pairs used in the PCR reactions are SEQ ID NO: 9 (5'-GAGGCGGACGTAAATGGAGA-3') and SEQ ID NO: 8 for Junction 1 and SEQ ID NO: 10 (5'- GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3') and SEQ ID NO: 11 (5'- TATGAGCGGCAGTTATCGTGT-3') for Junction 2. The expected sizes of the PCR products were observed with all recombinant Rispens, confirming that these recombinant Rispens have the expected genome structures.
[095] A expressão da proteína VP2 pelo Rispens/IBD recombinante foi confirmada pelo ensaio de placa preta e o ensaio de Western blot. Os procedimentos para o ensaio de placa preta são descritos no Experimento 2. A Western blot foi realizada usando células CEF infectadas com os vírus recombinantes e anticorpos monoclonais R63 anti-VP2 de IBDV. Resumidamente, células CEF em placas com 6 cavidades foram infectadas com um dos vírus recombinantes ou a cepa de Rispens precursora em uma multiplicidade de infecção de cerca de 0,1. Três dias após a inoculação, as células foram coletadas com tripsina e centrifugadas a 913 x g durante 5 minutos. O pellet foi lavado com PBS e ressuspenso em 100 μl de PBS. Após adicionar o mesmo volume de 2 X tampão de amostra de SDS (Tris-Cl a 130 mM (pH de 6,8), SDS a 6 %, glicerol a 20 %, 2-mercaptoetanol a 10 % e azul de Bromo fenol a 0,01 %), a suspensão de células foi fervida durante 5 minutos. As amostras foram separadas por SDS-PAGE usando um gel de poliacrilamida a 12 % e transferidas para uma membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore). A membrana foi seca completamente e, então, incubada com o anticorpo monoclonal R63. Após o anticorpo R63 ser lavado, anticorpo biotinilado anti-IgG de camundongo (Vector Laboratories, Cat# BA-9200) e, então, com o kit VECTASTAIN ABC-AP (Vector Laboratories, Cat# AK-5000). A proteína ligada com o anticorpo monoclonal R63 foi visualizada mediante adição de uma solução de NBT/BCIP (Roche Applied Science, Cat# 1681451). Conforme mostrado na Figura 3, bandas de proteína de 40 quilodaltons (kDa), o qual era o tamanho previsto da proteína VP2, foram observadas apenas nas fileiras com as células infectadas pelo vírus recombinante. Rispens recombinante com um promotor Bac inteiro ou parcial, isto é, RR013, RR030 e RR031, expressa mais proteína VP2 do que RR024, o qual tem um promotor de RSV.[095] The expression of the VP2 protein by recombinant Rispens/IBD was confirmed by the black plaque assay and the Western blot assay. The procedures for the black plaque assay are described in Experiment 2. Western blot was performed using CEF cells infected with the recombinant viruses and R63 anti-VP2 IBDV monoclonal antibodies. Briefly, CEF cells in 6-well plates were infected with one of the recombinant viruses or the precursor Rispens strain at a multiplicity of infection of about 0.1. Three days after inoculation, cells were harvested with trypsin and centrifuged at 913 x g for 5 minutes. The pellet was washed with PBS and resuspended in 100 μl of PBS. After adding the same volume of 2X SDS sample buffer (130 mM Tris-Cl (pH 6.8), 6% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol and phenol bromine blue 0.01%), the cell suspension was boiled for 5 minutes. Samples were separated by SDS-PAGE using a 12% polyacrylamide gel and transferred to a PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore). The membrane was dried completely and then incubated with the monoclonal antibody R63. After the R63 antibody was washed, biotinylated anti-mouse IgG antibody (Vector Laboratories, Cat# BA-9200) and then with the VECTASTAIN ABC-AP kit (Vector Laboratories, Cat# AK-5000). The protein bound with the R63 monoclonal antibody was visualized by adding an NBT/BCIP solution (Roche Applied Science, Cat# 1681451). As shown in Figure 3, protein bands of 40 kilodaltons (kDa), which was the predicted size of the VP2 protein, were observed only in the rows with cells infected with the recombinant virus. Recombinant Rispens with a full or partial Bac promoter, i.e., RR013, RR030 and RR031, expresses more VP2 protein than RR024, which has an RSV promoter.
[096] A eficácia dos vírus Rispens recombinantes que expressam o gene VP2 de IBDV foi avaliada contra um desafio com IBDV virulento. Três vírus Rispens/IBD recombinantes (RR013, RR024 e RR025) foram usados, cuja expressão do antígeno é controlada por diferentes promotores. Galinhas White Leghorn sem patógenos específicos (Specific Pathogen Free - SPF) em um dia de idade foram divididas em seis grupos e os pintinhos nos Grupos 3 a 5 foram vacinados subcutaneamente com aproximadamente 3000 unidades formadoras de placas (plaque forming unity - pfu)/0,2 ml de um dos Rispens recombinantes (Grupo 3 , RR013: Grupo 4, RR024: Grupo 5, RR025). Pintinhos no Grupo 6 foram vacinados com FW023 (rHVT/IBD-STC#11: Patente dos Estados Unidos N° 6.764.684), o qual era um controle de HVT/VP2 recombinante. Pintinhos no Grupo 1 (controle negativo não imunizado, não desafiado) e pintinhos no Grupo 2 (controle positivo não imunizado, desafiado) foram deixados não vacinados. O sangue das galinhas foi coletado a cada semana entre 2 e 7 semanas de idade para avaliação da imunidade humoral contra IBDV. Anticorpos anti-IBDV foram quantificados com um kit ELISA para IBDV comercial (IDEXX Laboratories, FlockChek IBD). A 7 semanas de idade, todas as galinhas, com exceção do Grupo 1, foram desafiadas com uma dose média infecciosa para embrião (EID50) de 103 da cepa virulenta de desafio com IBDV padrão (STC) através da via oral. As galinhas foram observadas diariamente quanto a sinais clínicos associados à IBD, tais como depressão e a morte. Sete dias após o desafio foi realizada necropsia das galinhas e observadas quanto a lesões bursais macroscópicas, tais como edema, descoloração, atrofia, hemorragia e exsudatos amarelos ou gelatinosos. Os pesos do corpo e da bursa também foram medidos na necropsia para cálculo do índice B/B, o qual é a proporção entre o peso da bursa e o peso corporal de pássaros desafiados dividido pela mesma proporção de pássaros não desafiados.[096] The efficacy of recombinant Rispens viruses expressing the IBDV VP2 gene was evaluated against a challenge with virulent IBDV. Three recombinant Rispens/IBD viruses (RR013, RR024 and RR025) were used, whose antigen expression is controlled by different promoters. One-day-old Specific Pathogen Free (SPF) White Leghorn chickens were divided into six groups and chicks in Groups 3 to 5 were vaccinated subcutaneously with approximately 3000 plaque forming units (pfu)/0 .2 ml of one of the recombinant Rispens (Group 3, RR013: Group 4, RR024: Group 5, RR025). Chicks in Group 6 were vaccinated with FW023 (rHVT/IBD-STC#11: United States Patent No. 6,764,684), which was a recombinant HVT/VP2 control. Chicks in Group 1 (unimmunized, unchallenged negative control) and chicks in Group 2 (unimmunized, challenged positive control) were left unvaccinated. Blood from chickens was collected every week between 2 and 7 weeks of age to assess humoral immunity against IBDV. Anti-IBDV antibodies were quantified with a commercial IBDV ELISA kit (IDEXX Laboratories, FlockChek IBD). At 7 weeks of age, all chickens except Group 1 were challenged with a mean embryo infectious dose (EID50) of 103 of the virulent standard IBDV challenge strain (STC) via the oral route. The chickens were observed daily for clinical signs associated with IBD, such as depression and death. Seven days after the challenge, the chickens were necropsied and observed for macroscopic bursal lesions, such as edema, discoloration, atrophy, hemorrhage and yellow or gelatinous exudates. Body and bursa weights were also measured at necropsy to calculate the B/B index, which is the proportion between the weight of the bursa and the body weight of challenged birds divided by the same proportion of unchallenged birds.
[097] A Tabela 1 resume os resultados. TABELA 1. PROTEÇÃO DE RISPENS RECOMBINANTES CONTRA O DESAFIO POR IBDV VIRULENTO EM GALINHAS SPF (ENSAIO DE EFICÁCIA 1) NINC = controles negativos não imunizados, não desafiados NICC = controles positivos não imunizados, desafiados RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc RR024: Rispens/US2/RSV-VP2stc RR025: Rispens/US2/SV40-VP2stc FW023 (controle de HVT/IBD recombinante): HVT/UL45- 46/Bac-VP2stc[097] Table 1 summarizes the results. TABLE 1. PROTECTION OF RECOMBINANT RISPENS AGAINST CHALLENGE BY VIRULENT IBDV IN SPF CHICKENS (EFFICACY TRIAL 1) NINC = unimmunized, unchallenged negative controls NICC = unimmunized, challenged positive controls RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc RR024: Rispens/US2/RSV-VP2stc RR025: Rispens/US2/SV40-VP2stc FW023 (HVT control/ Recombinant IBD): HVT/UL45-46/Bac-VP2stc
[098] Todas as galinhas no Grupo 2 (controle positivo desafiado) desenvolveram lesões bursais macroscópicas típicas de IBD, enquanto que todas as galinhas no Grupo 1 (controle positivo não desafiado) permaneceram sem tais lesões. A proteção conferida pelo RR013 (Grupo 3) foi de 87 % (13/15) e foi equivalente à proteção pelo controle de HVT/IBD recombinante FW023 (Grupo 6). O índice B/B do grupo 3 foi de 0,95, sugerindo que não há atrofia significativa na bursa. Surpreendentemente, RR024 (Grupo 4) e RR025 (Grupo 5) conferiram apenas proteções parciais (53 % e 33 %). Todos os grupos vacinados forneceram titulações de IBD por ELISA mais elevadas, começando a partir de 3 semanas de idade (Figura 4).[098] All chickens in Group 2 (challenged positive control) developed macroscopic bursal lesions typical of IBD, while all chickens in Group 1 (unchallenged positive control) remained without such lesions. The protection conferred by RR013 (Group 3) was 87% (13/15) and was equivalent to the protection by the recombinant HVT/IBD control FW023 (Group 6). The B/B index of group 3 was 0.95, suggesting that there is no significant atrophy in the bursa. Surprisingly, RR024 (Group 4) and RR025 (Group 5) provided only partial protection (53% and 33%). All vaccinated groups gave higher IBD ELISA titers starting at 3 weeks of age (Figure 4).
[099] As titulações em galinhas vacinadas com RR013 foram consistentemente mais elevadas do que aquelas em galinhas vacinadas com RR024 ou RR025, o que é consistente com os resultados de proteção após desafio.[099] Titers in chickens vaccinated with RR013 were consistently higher than those in chickens vaccinated with RR024 or RR025, which is consistent with the results of protection after challenge.
[0100] Em conclusão, RR013 com um promotor Bac conferiu imunidade humoral e protetora substancialmente superior em relação ao RR024 e RR025, ambos os quais contêm promotores que não Bac.[0100] In conclusion, RR013 with a Bac promoter conferred substantially superior humoral and protective immunity relative to RR024 and RR025, both of which contain non-Bac promoters.
[0101] A eficácia de RR013, RR030, e RR031, todos os quais contêm um promotor Bac inteiro ou parcial, foi investigada em galinhas poedeiras comerciais (White Leghorn) com anticorpos maternos. Galinhas com um dia de idade foram divididas em seis grupos e os pintinhos nos Grupos 3 a 5 foram vacinados subcutaneamente com aproximadamente 3000 unidades formadoras de placas (pfu)/0,2 ml de um dos Rispens recombinantes (Grupo 3, RR013: Grupo 4, RR030: Grupo 5, RR031). Os pintinhos no Grupo 6 foram vacinados com FW023, o qual era um controle de HVT/VP2 recombinante. Os pintinhos no Grupo 1 (controle negativo não imunizado, não desafiado) e os pintinhos no Grupo 2 (controle positivo não imunizado, desafiado) foram deixados não vacinados. O sangue das galinhas foi coletado a cada semana entre 1 e 7 semanas de idade e testado quanto à presença de anticorpos anti-IBDV com um kit ELISA para IBDV comercial (teste IDEXX de Ab ao IBD: IDEXX Laboratories). O desafio foi realizado duas vezes com 5 semanas de idade e 7 semanas de idade. Uma metade das galinhas em cada grupo foi desafiada em 5 semanas de idade e a outra metade foi desafiada em 7 semanas de idade. Para o desafio, 103 EID50 da cepa virulenta de IBDV STC foram administrados por via oral. Observação e avaliação após o desafio foram conduzidas da mesma maneira conforme no Exemplo 5.[0101] The efficacy of RR013, RR030, and RR031, all of which contain an entire or partial Bac promoter, was investigated in commercial laying hens (White Leghorn) with maternal antibodies. One-day-old chickens were divided into six groups and chicks in Groups 3 to 5 were vaccinated subcutaneously with approximately 3000 plaque forming units (pfu)/0.2 ml of one of the recombinant Rispens (Group 3, RR013: Group 4 , RR030: Group 5, RR031). Chicks in Group 6 were vaccinated with FW023, which was a recombinant HVT/VP2 control. Chicks in Group 1 (unimmunized, unchallenged negative control) and chicks in Group 2 (unimmunized, challenged positive control) were left unvaccinated. Blood from chickens was collected every week between 1 and 7 weeks of age and tested for the presence of anti-IBDV antibodies with a commercial IBDV ELISA kit (IDEXX IBD Ab test: IDEXX Laboratories). The challenge was performed twice at 5 weeks of age and 7 weeks of age. One half of the chickens in each group were challenged at 5 weeks of age and the other half were challenged at 7 weeks of age. For challenge, 103 EID50 of the virulent IBDV STC strain were administered orally. Post-challenge observation and evaluation were conducted in the same manner as in Example 5.
[0102] As Tabelas 2 e 3 resumem os resultados. TABELA 2. PROTEÇÃO DE RISPENS RECOMBINANTES CONTRA O DESAFIO POR IBDV VIRULENTO EM GALINHAS POEDEIRAS COMERCIAIS EM 5 SEMANAS DE IDADE (ENSAIO DE EFICÁCIA DE 2) NINC = controles negativos não imunizados, não desafiados NICC = controles positivos não imunizados, desafiados RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc RR024: Rispens/US2/RSV-VP2stc RR025: Rispens/US2/SV40-VP2stc FW023 (controle de HVT/IBD recombinante): HVT/UL45- 46/Bac-VP2stc TABELA 3. PROTEÇÃO DE RISPENS RECOMBINANTES CONTRA O DESAFIO POR IBDV VIRULENTO EM GALINHAS POEDEIRAS COMERCIAIS EM 7 SEMANAS DE IDADE (ENSAIO DE EFICÁCIA DE 2) [0102] Tables 2 and 3 summarize the results. TABLE 2. PROTECTION OF RECOMBINANT RISPENS AGAINST VIRULENT IBDV CHALLENGE IN COMMERCIAL LAYING HENS AT 5 WEEKS OF AGE (EFFICACY TRIAL OF 2) NINC = unimmunized, unchallenged negative controls NICC = unimmunized, challenged positive controls RR013: Rispens/US2/Bac-VP2stc RR024: Rispens/US2/RSV-VP2stc RR025: Rispens/US2/SV40-VP2stc FW023 (HVT control/ Recombinant IBD): HVT/UL45- 46/Bac-VP2stc TABLE 3. PROTECTION OF RECOMBINANT RISPENS AGAINST CHALLENGE BY VIRULENT IBDV IN COMMERCIAL LAYING CHICKENS AT 7 WEEKS OF AGE (EFFICACY TRIAL OF 2)
[0103] Após o desafio em 5 semanas de idade, todos os grupos vacinados com Rispens recombinante contendo um promotor BAC conferiram uma excelente proteção (90 % para RR013, 95 % para RR030 e 95 % para RR031), enquanto que todas as galinhas no controle positivo não imunizado desafiado (Grupo 2) desenvolveram lesões bursais macroscópicas típicas de IBD (Tabela 2). Controle de HVT/IBD recombinante FW023 conferiu uma proteção de 81 %, a qual era menor do que os grupos com Rispens recombinantes. Todas as galinhas no Grupo 1 (controle negativo não desafiado) permaneceram sem tais lesões. O índice B/B elevado no controle positivo não imunizado desafiado (Grupo 2), ao mesmo tempo em que exibe lesões macroscópicas típicas de IBD na Bursa, pode indicar o envolvimento de anticorpos maternos remanescentes, levando ao retardo no desenvolvimento de lesões bursais. Após o desafio em 7 semanas de idade, todos os grupos vacinados com Rispens recombinante novamente contendo um promotor BAC conferiram uma excelente proteção (84 % para RR013, 91 % para RR030 e 80 % para RR031), enquanto que todas as galinhas no controle positivo não imunizado desafiado (Grupo 2) desenvolveram lesões bursais macroscópicas típicas de IBD (Tabela 3). Os índices B/B dos grupos vacinados estavam acima de 0,91, sugerindo que não há atrofia significativa na bursa. Os resultados do ELISA de IBDV mostram que, após declínio dos anticorpos maternalmente derivados de 1 semana a 4 semanas, todos os grupos vacinados forneceram titulações de IBD por ELISA mais elevadas (Figura 5). As titulações em galinhas vacinadas com RR030 e RR031 foram maiores do que aquelas em galinhas vacinadas com FW023 entre 5 e 7 semanas de idade.[0103] After challenge at 5 weeks of age, all groups vaccinated with recombinant Rispens containing a BAC promoter conferred excellent protection (90% for RR013, 95% for RR030 and 95% for RR031), while all chickens in the challenged non-immunized positive control (Group 2) developed macroscopic bursal lesions typical of IBD (Table 2). Recombinant HVT/IBD control FW023 provided 81% protection, which was lower than the recombinant Rispens groups. All chickens in Group 1 (unchallenged negative control) remained free of such lesions. The elevated B/B ratio in the challenged non-immunized positive control (Group 2), while exhibiting macroscopic lesions typical of IBD in the Bursa, may indicate the involvement of remaining maternal antibodies, leading to delayed development of bursal lesions. After challenge at 7 weeks of age, all groups vaccinated with recombinant Rispens again containing a BAC promoter conferred excellent protection (84% for RR013, 91% for RR030 and 80% for RR031), whereas all chickens in the positive control non-immunized challenged (Group 2) developed macroscopic bursal lesions typical of IBD (Table 3). The B/B ratios of the vaccinated groups were above 0.91, suggesting that there is no significant atrophy in the bursa. The IBDV ELISA results show that, after a decline in maternally derived antibodies from 1 week to 4 weeks, all vaccinated groups gave higher IBD ELISA titers (Figure 5). Titers in chickens vaccinated with RR030 and RR031 were higher than those in chickens vaccinated with FW023 at 5 to 7 weeks of age.
[0104] Em resumo, RR013, RR030 e RR031, todos os quais contêm um promotor Bac inteiro ou parcial combinado com o gene VP2, conferiram uma excelente proteção em galinhas poedeiras White Leghorn comerciais com anticorpos maternos a 5 e 7 semanas de idade após vacinação em um dia de idade.[0104] In summary, RR013, RR030 and RR031, all of which contain an entire or partial Bac promoter combined with the VP2 gene, conferred excellent protection in commercial White Leghorn laying hens with maternal antibodies at 5 and 7 weeks of age after vaccination in a day old.
[0105] Neste exemplo, a estabilidade de RR030 e RR031 foi avaliada em culturas de células (in vitro) e em galinhas (in vivo). Para estabilidade in vitro, os vírus foram passados em fibroblastos de embrião de galinha (Chicken Embryo Fibroblasts - CEF) 20 vezes. Para estabilidade in vivo, os vírus foram inoculados em galinhas poedeiras comerciais (White Leghorn) de um dia de idade e, então, novamente isolados das galinhas vacinadas em 5 e 7 semanas de idade por meio de inoculação de linfócitos de sangue periférico das galinhas sobre CEFs. Os vírus após passagens e os vírus isolados das galinhas vacinadas in vitro foram testados por PCR e o ensaio de placa preta com o anticorpo monoclonal R63 anti-VP2 de IBDV.[0105] In this example, the stability of RR030 and RR031 was evaluated in cell cultures (in vitro) and in chickens (in vivo). For in vitro stability, viruses were passaged in chicken embryo fibroblasts (Chicken Embryo Fibroblasts - CEF) 20 times. For in vivo stability, the viruses were inoculated into one-day-old commercial laying hens (White Leghorn) and then isolated again from the vaccinated hens at 5 and 7 weeks of age by inoculating peripheral blood lymphocytes from the hens onto CEFs. Viruses after passages and viruses isolated from chickens vaccinated in vitro were tested by PCR and the black plaque assay with the IBDV anti-VP2 monoclonal antibody R63.
[0106] O ensaio de PCR detectou as bandas esperadas com todas as amostras testadas, sugerindo que não havia eliminação ou alteração detectável no genoma viral. Após o ensaio de placa preta usando anticorpo monoclonal R63 anti-VP2 de IBDV, todas as placas foram coradas de preto com todas as amostras testadas.[0106] The PCR assay detected the expected bands with all samples tested, suggesting that there was no detectable deletion or change in the viral genome. After black plaque assay using R63 anti-IBDV VP2 monoclonal antibody, all plaques were stained black with all samples tested.
[0107] Portanto, RR030 e RR031 são genética e fenotipicamente estáveis in vitro e in vivo.[0107] Therefore, RR030 and RR031 are genetically and phenotypically stable in vitro and in vivo.
[0108] De modo a investigar a duração da imunidade ao IBDV conferida pelo Rispens/IBD, galinhas vacinadas com RR030 foram monitoradas em relação às titulações de IBDV por ELISA através de 41 semanas de idade. Mais particularmente, galinhas poedeiras comerciais (White Leghorn) de um dia de idade com anticorpos maternos foram vacinadas subcutaneamente com aproximadamente 3000 pfu/0,2 ml de Rispens/IBD recombinante (RR030). O sangue das galinhas foi coletado semanalmente entre 1 e 7 semanas de idade e quinzenalmente depois. Os soros foram testados quanto à presença de anticorpos anti-IBDV com um kit ELISA para IBDV comercial (teste IDEXX de Ab ao IBD: IDEXX Laboratories). Conforme mostrado na Figura 7, após os anticorpos maternos contra IBDV diminuírem através de 3 semanas de idade, as titulações por ELISA começaram a aumentar. As titulações continuaram a aumentar até valores S/P de mais de 2,5 através de 25 semanas de idade e o alto nível das titulações de IDBV por ELISA foram mantidos até 41 semanas de idade. Este resultado demonstra que Rispens/IBD confere duração de imunidade contra IBDV excepcionalmente duradoura.[0108] In order to investigate the duration of immunity to IBDV conferred by Rispens/IBD, chickens vaccinated with RR030 were monitored for IBDV titers by ELISA through 41 weeks of age. More particularly, one-day-old commercial laying hens (White Leghorn) with maternal antibodies were vaccinated subcutaneously with approximately 3000 pfu/0.2 ml of recombinant Rispens/IBD (RR030). Chicken blood was collected weekly between 1 and 7 weeks of age and biweekly thereafter. Sera were tested for the presence of anti-IBDV antibodies with a commercial IBDV ELISA kit (IDEXX IBD Ab Test: IDEXX Laboratories). As shown in Figure 7, after maternal antibodies against IBDV declined through 3 weeks of age, ELISA titers began to increase. Titers continued to increase to S/P values of more than 2.5 through 25 weeks of age and the high level of IDBV titers by ELISA were maintained until 41 weeks of age. This result demonstrates that Rispens/IBD confers exceptionally long-lasting immunity against IBDV.
[0109] Neste exemplo, a compatibilidade entre Rispens/IBD recombinante (RR030) contendo um promotor BAC e HVT/ND recombinante (FW029) (rHVT/NDV: Patente dos Estados Unidos N° 6.866.852) foi investigada. Galinhas poedeiras comerciais (White Leghorn) de um dia de idade com anticorpos maternos foram divididas em seis grupos e vacinadas. O Grupo 1 foi vacinado por via subcutânea com aproximadamente 3000 pfu/0,2 ml do Rispens/IBD recombinante (RR030) apenas. O Grupo 2 recebeu uma mistura de RR030 e HVT/ND recombinante (FW029), ambos a 3000 PFU/0,2 ml. Um grupo de pintinhos (Grupo 3) foi vacinado com FW029 apenas. Os pintinhos no Grupo 4 foram vacinados com FW023, o qual era um controle de HVT/VP2 recombinante. Os pintinhos no Grupo 5 (controle positivo não imunizado, desafiado) e no Grupo 6 (controle negativo não imunizado, não desafiado) foram deixados não vacinados. O sangue das galinhas foi coletado a cada semana entre 2 e 7 semanas de idade e testado quanto à presença de anticorpos anti-IBDV com um kit ELISA para IBDV comercial (teste IDEXX de Ab ao IBD: IDEXX Laboratories) e a presença de anticorpos anti-NDV com um kit ELISA para NDV comercial (teste IDEXX de Ab ao NDV: IDEXX Laboratories). O desafio com qualquer IBDV virulento ou NDV virulento foi realizado em 7 semanas de idade. Todas as galinhas no Grupo 1 (RR030 apenas) e Grupo 4 (FW023 apenas) e uma metade das galinhas no Grupo 2 (RR030 + FW029) e Grupo 5 (controle positivo não imunizado, desafiado) receberam desafio com IBDV com 103 EID50 da cepa virulenta de IBDV STC por via oral, enquanto que todas as galinhas no Grupo 3 (FW029 apenas) e a outra metade das galinhas no Grupo 2 (RR030 + FW029) e Grupo 5 (controle positivo não imunizado, desafiado) receberam desafio com NDV com 103 EID50 da cepa muito virulenta de NDV (velogênica neurotrópica) Texas GB através de injeção intramuscular na região femoral. Observação e avaliação após desafio com IBDV foram conduzidas da mesma maneira conforme nos Exemplos 5 e 6. Para o desafio com NDV, as galinhas foram observadas diariamente durante 14 dias quanto a sinais clínicos típicos de ND velogênica neurotrópica, tais como depressão, sintomas neurológicos e mortes.[0109] In this example, compatibility between recombinant Rispens/IBD (RR030) containing a BAC promoter and recombinant HVT/ND (FW029) (rHVT/NDV: United States Patent No. 6,866,852) was investigated. One-day-old commercial laying hens (White Leghorn) with maternal antibodies were divided into six groups and vaccinated. Group 1 was vaccinated subcutaneously with approximately 3000 pfu/0.2 ml of recombinant Rispens/IBD (RR030) only. Group 2 received a mixture of RR030 and recombinant HVT/ND (FW029), both at 3000 PFU/0.2 ml. A group of chicks (Group 3) was vaccinated with FW029 only. Chicks in Group 4 were vaccinated with FW023, which was a recombinant HVT/VP2 control. Chicks in Group 5 (unimmunized, challenged positive control) and Group 6 (unimmunized, unchallenged negative control) were left unvaccinated. Blood from the chickens was collected every week between 2 and 7 weeks of age and tested for the presence of anti-IBDV antibodies with a commercial IBDV ELISA kit (IDEXX IBD Ab test: IDEXX Laboratories) and the presence of anti-IBD antibodies. -NDV with a commercial NDV ELISA kit (IDEXX NDV Ab Test: IDEXX Laboratories). Challenge with either virulent IBDV or virulent NDV was performed at 7 weeks of age. All chickens in Group 1 (RR030 only) and Group 4 (FW023 only) and one half of the chickens in Group 2 (RR030 + FW029) and Group 5 (non-immunized positive control, challenged) were challenged with IBDV with 103 EID50 of the strain virulent IBDV STC infection orally, whereas all chickens in Group 3 (FW029 only) and the other half of the chickens in Group 2 (RR030 + FW029) and Group 5 (non-immunized positive control, challenged) received NDV challenge with 103 EID50 of the very virulent strain of NDV (neurotropic velogenic) Texas GB through intramuscular injection in the femoral region. Observation and evaluation following IBDV challenge were conducted in the same manner as in Examples 5 and 6. For NDV challenge, chickens were observed daily for 14 days for clinical signs typical of neurotropic velogenic ND, such as depression, neurological symptoms and deaths.
[0110] Os resultados são resumidos na Tabela 4. TABELA 4. COMPATIBILIDADE ENTRE RISPENS/IBD RECOMBINANTE E HVT/NDV RECOMBINANTE EM GALINHAS POEDEIRAS COMERCIAIS (ESTUDO DE EFICÁCIA 3) RR030: Rispens/US2/Coa5-VP2stc FW029 (controle de HVT/ND recombinante): HVT/UL45- 46/Pec-F FW023 (controle de HVT/IBD recombinante): HVT/UL45- 46/Bac-VP2stc NICC = controles positivos não imunizados, desafiados NINC = controles negativos não imunizados, não desafiados[0110] The results are summarized in Table 4. TABLE 4. COMPATIBILITY BETWEEN RECOMBINANT RISPENS/IBD AND RECOMBINANT HVT/NDV IN COMMERCIAL LAYING CHICKENS (EFFECTIVENESS STUDY 3) RR030: Rispens/US2/Coa5-VP2stc FW029 (recombinant HVT/ND control): HVT/UL45- 46/Pec-F FW023 (recombinant HVT/IBD control): HVT/UL45- 46/Bac-VP2stc NICC = controls unimmunized positive, challenged NINC = unimmunized, unchallenged negative controls
[0111] RR030 combinado com FW029 (Grupo 2) conferiu uma excelente proteção tanto contra o desafio com IBD quanto ND. Após desafio com IBDV, RR030 combinado com FW029 (Grupo2) conferiu proteção de 94 % (15/16), a qual era equivalente à proteção pelo RR030 apenas (Grupo 1) de 88 % de proteção (15/17). No grupo vacinado com FW023, 94 % das galinhas foram protegidos. Todas as galinhas no grupo de controle positivo não imunizado, desafiado (Grupo 5) desenvolveram lesões bursais macroscópicas. Após desafio com NDV, proteção de 88 % (15/17) foi observada com o Grupo 2 (RR030 combinado com FW029), enquanto que o FW029 (14/16) apenas conferiu uma proteção de 88 %. Todas as galinhas no grupo de controlo positive desafiado (Grupo 5) exibiram sinais clínicos de ND. Os resultados do ELISA também demonstraram que a imunidade humoral desenvolvida pelo RR030 ou FW029 não diminuiu quando estes dois vírus eram combinados (Figuras 6A e 6B).[0111] RR030 combined with FW029 (Group 2) provided excellent protection against both IBD and ND challenge. After challenge with IBDV, RR030 combined with FW029 (Group2) conferred 94% protection (15/16), which was equivalent to the protection by RR030 alone (Group 1) of 88% protection (15/17). In the group vaccinated with FW023, 94% of chickens were protected. All chickens in the non-immunized, challenged positive control group (Group 5) developed macroscopic bursal lesions. After challenge with NDV, 88% protection (15/17) was observed with Group 2 (RR030 combined with FW029), while FW029 (14/16) only provided 88% protection. All chickens in the challenged positive control group (Group 5) exhibited clinical signs of ND. The ELISA results also demonstrated that the humoral immunity developed by RR030 or FW029 did not decrease when these two viruses were combined (Figures 6A and 6B).
[0112] Em conclusão, este exemplo demonstra uma ausência de interferência entre Rispens/IBD recombinante contendo um promotor Bac e HVT/ND recombinante.[0112] In conclusion, this example demonstrates a lack of interference between recombinant Rispens/IBD containing a Bac promoter and recombinant HVT/ND.
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