BR122022020594B1

BR122022020594B1 - Métodos para produzir camundongos geneticamente modificados, uso dos referidos camundongos e uso de uma sequência de ácido nucleico produzida pelos referidos camundongos

Info

Publication number: BR122022020594B1
Application number: BR122022020594-1A
Authority: BR
Inventors: John McWhirter; Lynn MacDonald; Sean Stevens; Samuel Davis; David R. Buckler; Karolina A. Hosiawa; Andrew J. Murphy
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2024-04-24

Abstract

Camundongos, tecidos, células e material genético são fornecidos compreendendo um locus de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada, um locus da cadeia leve humanizada que expressa uma cadeia leve universal e um gene que codifica um ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste. Camundongos são fornecidos que expressam cadeias pesadas humanizadas compreendendo domínios variáveis humanos, e que expressam cadeias leves humanizadas compreendendo domínios variáveis humanos em que as cadeias leves são derivadas de não mais do que uma, ou não mais do que duas, sequências V e J ou V/J rearranjadas da cadeia leve. Camundongos machos férteis que expressam anticorpos com cadeias leves universais e cadeias pesadas humanizadas são fornecidos. Métodos e composições para produção de proteínas de ligação biespecíficas são fornecidos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Camundongos, células, embriões, tecidos geneticamente modificados e ácidos nucleicos isolados para produção de anticorpos e sequências que codificam domínios variáveis da cadeia pesada da imu- noglobulina humana, incluindo anticorpos biespecíficos, e incluindo anticorpos biespecíficos que compreendem cadeias leves universais. As composições e os métodos incluem camundongos geneticamente modificados com substituições de linhagem germinativa no locus variável endógeno da cadeia pesada de camundongo, que compreendem loci da cadeia leve modificados que expressam cadeias leves derivadas de não mais do que um ou dois segmentos gênicos V da cadeia leve diferentes, em que os camundongos são ainda geneticamente modificados na sua linhagem germinativa tal que camundongos machos carregando estas modificações sejam férteis. São fornecidos camundongos geneticamente modificados que expressam domínios variáveis da cadeia leve universal e da cadeia pesada humanizada, em que os camundongos compreendem uma atividade de ADAM6 que é funcional em um camundongo macho.

ANTECEDENTES

[002] O desenvolvimento de anticorpos para uso como terapêutica humana tem uma história longa e complexa. Um avanço significante foi a capacidade de produzir sequências de anticorpo essencialmente totalmente humanas para usar no desenho de terapêutica humana eficaz com potencial reduzido de imunogenicidade. Os camundongos que agora existem são modificados na sua linhagem germinativa para gerar sequências de anticorpos humanos derivadas de segmentos gênicos não rearranjados (pesadas e leves) como transgenes ou como substituições em loci endógenos de imunoglobulina de camundongo. A substituição de sequências variáveis de camundongo por sequências variáveis humanas em loci endógenos em camundongos, como com camundongos humanizados VELOCIMMUNE®, permite o sistema imune do camundongo funcionar essencialmente normalmente. Como resultado, expor estes camundongos a um antígeno de escolha gera uma população maravilhosamente diversa, rica em células B clonalmente selecionadas que expressam domínios variáveis humanos de alta afinidade somaticamente mutados que podem ser usados na criação de anticorpos totalmente humanos direcionados contra o antígeno de escolha.

[003] Os domínios variáveis humanos feitos em camundongos humanizados podem ser usados para projetar anticorpos biespecíficos totalmente humanos, isto é, proteínas de ligação que são os heterodíme- ros das cadeias pesadas, onde a identidade e as especificidades de ligação dos domínios variáveis da cadeia pesada se diferenciam. Mas a seleção de cadeias leves que podem estar associadas efetivamente e expressar com os heterodímeros da cadeia pesada não tem solução fácil. O desenvolvimento de domínios variáveis da cadeia leve humana para uso na terapêutica humana é certamente possível em camundongos humanizados, mas não há nenhuma solução fácil para a seleção de que as cadeias leves se associarão efetivamente e expressarão com cadeias pesadas tendo as características desejadas de ligação, onde as cadeias leves não são prejudiciais para a expressão ou o comportamento de ligação de ambas as cadeias pesadas.

[004] Dessa forma, permanece uma necessidade na técnica de composições e métodos para desenvolver regiões variáveis de imuno- globulina humana para uso na terapêutica humana, incluindo regiões variáveis de imunoglobulina humana geradas de sequências de ácidos nucleicos em loci endógenos de imunoglobulina de camundongo. SUMÁRIO

[005] Os camundongos são descritos expressando domínios variáveis de imunoglobulina humana que são adequados para o uso em proteínas de ligação biespecíficas, incluindo anticorpos biespecíficos, em que os camundongos compreendem uma humanização de um locus variável endógeno da cadeia pesada de camundongo, em que os camundongos machos compreendendo a humanização são férteis, e em que os camundongos compreendem ainda uma humanização de um locus endógeno da cadeia leve de imunoglobulina que resulta no camundongo expressando um repertório da cadeia leve de imunoglobulina que é derivado de não mais do que um, ou não mais do que dois, segmentos gênicos V À e/ou K.

[006] Camundongos geneticamente engendrados são fornecidos de forma que domínios variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina humana amadurecida por afinidade adequada selecionada derivados de um repertório de segmentos V, D, e J da cadeia pesada humana não rearranjados, em que domínios variáveis da cadeia pesada humana amadurecida por afinidade se associam e expressam uma cadeia leve universal humanizada. A cadeia leve universal humanizada é expressa de um locus que compreende não mais do que um ou não mais do que dois segmentos V da cadeia leve humana e um segmento J humano operacionalmente ligado a um gene constante da cadeia leve, ou não mais do que uma ou não mais do que duas sequências rearranjadas de ácidos nucleicos humanas (VÀ/JÀ, Vk/Jk, VÀ/Jk ou Vk/JÀ) que codificam um domínio variável da cadeia leve operacionalmente ligado a um gene constante da cadeia leve. Em várias modalidades, os pares de domínio da cadeia leve humanizada universal com uma pluralidade de domínios variáveis da cadeia pesada humana amadurecidos por afinidade, em que a pluralidade de domínios variáveis da cadeia pesada especificamente se liga a epítopos diferentes ou antígenos.

[007] Em um aspecto, os construtos de ácido nucleico, as células, os embriões, os camundongos e os métodos são fornecidos para produzir camundongos compreendendo um locus variável de imunoglobu- lina da cadeia pesada humanizada e um locus variável de imunoglobu- lina da cadeia leve humanizada, em que o camundongo expressa uma de não mais do que duas cadeias leves universais, e os camundongos que são machos exibem fertilidade selvagem.

[008] Em um aspecto, um camundongo modificado é fornecido de forma que compreenda em sua linhagem germinativa um locus variável de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada em um locus da cadeia pesada de camundongo endógena e um locus variável de imuno- globulina da cadeia leve humanizada, em que o camundongo expressa uma cadeia leve universal, e em que o camundongo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta. Em várias modalidades, o locus variável de imunoglobulina da cadeia leve humanizada está em um locus endógeno da cadeia leve de camundongo.

[009] Em uma modalidade, o locus variável de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada compreende uma substituição no locus variável endógeno da cadeia pesada de camundongo de toda ou substancialmente todos os segmentos gênicos V, D e J da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo funcional com um ou vários segmentos gênicos V humano, D humano e J humano, em que um ou mais segmentos V, D e J humanos são operacionalmente ligados e capazes de rearranjo para formar um gene V/D/J rearranjado que é operacionalmente ligado a uma sequência constante da cadeia pesada.

[0010] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus da cadeia leve que foi engendrado para produzir uma cadeia leve universal, em que a cadeia leve universal é uma cadeia leve que é derivada de um locus da cadeia leve que compreende não mais do que um segmento V da cadeia leve e não mais do que um segmento J da cadeia leve ou locus da cadeia leve que compreende uma sequência de V/J única da cadeia leve rearranjada. Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina que compreende segmento V da cadeia leve de imunoglobulina humana única que é capaz da rearranjo com um segmento gênico J da cadeia leve humana (selecionado a partir de um ou uma pluralidade de segmentos J) e codificação de um domínio variável da cadeia leve humana. Em outra modalidade, o camundongo compreende não mais do que dois segmentos V da cadeia leve humana no locus da cadeia leve, cada segmento V do qual é capaz da rearranjo com um segmento gênico J humano (selecionado a partir de um ou uma pluralidade de segmento J da cadeia leve) e codificação de um domínio variável da cadeia leve humana rearran- jado.

[0011] Em uma modalidade, o segmento V da cadeia leve humana única é operacionalmente ligado a um segmento J da cadeia leve humana selecionado a partir de JK1, JK2, JK3, JK4 e JK5, em que o segmento V da cadeia leve humana única é capaz de rearranjo para formar uma sequência que codifica um gene de região variável da cadeia leve com qualquer um de um ou mais segmentos J da cadeia leve humana.

[0012] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus endógeno da cadeia leve que compreende uma substituição de todos ou substancialmente todo os segmentos gênicos V e J de camundongo sem mais de uma, ou não mais do que duas, sequências de ácidos nu- cleicos rearranjadas (V/J). Em uma modalidade, não mais do que uma ou não mais do que duas sequências de ácidos nucleicos rearranjadas (V/J) são selecionadas a partir de um VK1-39JK5 humano, um VK3- 20JK1 e uma combinação destes.

[0013] Em uma modalidade, o camundongo sem um locus endógeno da cadeia leve funcional que é capaz de expressar um domínio variável da cadeia leve de camundongo. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de uma cadeia leve universal em um locus K. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável de uma cadeia leve universal em um locus À,

[0014] Em uma modalidade, o segmento V humano (ou sequência V/J rearranjada) é operacionalmente ligado a uma sequência líder humana ou de camundongo. Em uma modalidade, a sequência líder é uma sequência líder de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência líder de camundongo é uma sequência líder de camundongo Vk3-7.

[0015] Em uma modalidade, o segmento V humano (ou sequência V/J rearranjada) é operacionalmente ligado a uma sequência promotora de imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência promotora é uma sequência promotora humana. Em uma modalidade específica, o promotor de imunoglobulina humana é um promotor Vk3-15 humano.

[0016] Em uma modalidade, os segmentos V e J não rearranjados ou a sequência rearranjada (V/J) é operacionalmente ligada a um gene de região constante da imunoglobulina da cadeia leve. Em uma modalidade específica, o gene da região constante é um gene de camundongo Ck.

[0017] Em uma modalidade, segmentos V e J não rearranjados ou a sequência rearranjada (V/J) estão presentes em um locus da cadeia leve k, e o locus da cadeia leve k compreende um potencializador intrô- nico de camundongo k, um potencializador de camundongo k 3’, ou tanto um potencializador intrônico como um potencializador 3’. Em uma modalidade específica, o locus k é um locus k endógeno.

[0018] Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus K compreendendo uma sequência que codifica um domínio variável de uma cadeia leve universal, e o camundongo compreende um locus lambda de imunoglobulina não funcional (À) da cadeia leve. Em uma modalidade específica, o locus da cadeia leve À compreende uma dele- ção de uma ou mais sequências do locus, em que uma ou mais dele- ções tornam o locus da cadeia leve À incapaz de rearranjo para formar um gene da cadeia leve. Em outra modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos V do locus da cadeia leve À são deletados. Em uma outra modalidade, o camundongo compreende uma deleção de todo, ou substancialmente todo, do locus variável da cadeia leve endógeno.

[0019] Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda em sua linhagem germinativa uma sequência selecionada a partir de um potencializador intrônico de camundongo 5’ K relativamente à sequência da cadeia leve de imunoglobulina rearranjada ou segmentos gênicos não rearranjados, um potencializador de camundongo 3’ K e uma combinação destes.

[0020] Em uma modalidade, a sequência de domínio variável da cadeia leve universal do camundongo compreende uma ou mais hipermu- tações somáticas; em uma modalidade, a sequência de domínio variável compreende uma pluralidade de hipermutações somáticas.

[0021] Em uma modalidade, o camundongo produz uma cadeia leve universal que compreende um domínio variável humano somaticamente mutado. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende um domínio variável humano somaticamente mutado derivado de um segmento V humano, um segmento J humano e um gene CK de camundongo. Em uma modalidade, o camundongo não expressa uma cadeia leve À.

[0022] Em uma modalidade, a sequência variável humana é uma sequência VK1-39JK5 humana rearranjada, e o camundongo expressa uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo (i) um domínio variável derivado de VK1-39JK5 e (ii) um CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada a uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) um CH de camundongo e (ii) um domínio variável da cadeia pesada humana somaticamente mutada. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve que é somaticamente mutada. Em uma modalidade, o CL é um CK de camundongo

[0023] Em uma modalidade, a sequência variável humana é uma sequência Vk3-20Jk1 humana rearranjada, e o camundongo expressa uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo (i) um domínio variável derivado de Vk3-20Jk1, e (ii) um CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada com uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) um CH de camundongo, e (ii) um domínio variável da cadeia pesada humana somaticamente mutada.

[0024] Em uma modalidade, o camundongo compreende tanto uma sequência Vk1-39Jk5 humana rearranjada como uma sequência Vk3- 20Jk1 humana rearranjada, e o camundongo expressa uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo (i) uma cadeia leve compreendendo um domínio variável derivado da sequência Vk1-39Jk5 ou da sequência Vk3-20Jk1, e (ii) um CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada com uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) um CH de camundongo, e (ii) um domínio variável da cadeia pesada humana somaticamente mutada. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve que é somaticamente mutada. Em uma modalidade, o CL é um Ck de camundongo

[0025] Em uma modalidade, o camundongo expressa um anticorpo quimérico reverso compreendendo uma cadeia leve que compreende um Ck de camundongo e um domínio variável humano somaticamente mutado derivado de uma sequência Vk1-39Jk5 humana rearranjada ou uma sequência Vk3-20Jk1 humana rearranjada e uma cadeia pesada que compreende um CH de camundongo e um domínio variável da cadeia pesada humana somaticamente mutada, em que o camundongo não expressa um anticorpo totalmente de camundongo e não expressa um anticorpo totalmente humano. Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus da cadeia leve K que compreende uma substituição de segmentos gênicos endógenos da cadeia leve K de camundongo com a sequência Vk1-39Jk5 humana rearranjada ou a sequência Vk3- 20Jk1 humana rearranjada, e compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos V, D e J endógenos da cadeia pesada de camundongo com um repertório completo ou substancialmente completo de segmentos gênicos V, D, e J da cadeia pesada humana.

[0026] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido de forma que expresse uma cadeia leve k única derivada de não mais do que uma, ou não mais do que duas, sequências da cadeia leve k rearranjadas, em que o camundongo, mediante imunização com o antígeno, exibe um título de soro que é comparável com um camundongo selvagem imunizado com o mesmo antígeno. Em uma modalidade específica, o camundongo expressa uma sequência da cadeia leve k única, em que a sequência da cadeia leve k única é derivada de não mais do que uma sequência da cadeia leve k rearranjada. Em uma modalidade, o título de soro é caracterizado como imunoglobulina total. Em uma modalidade específica, o título de soro é caracterizado como título específico de IgM. Em uma modalidade específica, o título de soro é caracterizado como título específico de IgG. Em uma modalidade mais específica, a sequência da cadeia leve k rearranjada é selecionada a partir de uma sequência Vk1-39Jk5 e Vk3-20Jk1. Em uma modalidade, a sequência da cadeia leve k rearranjada é uma sequência Vk1-39Jk5. Em uma modalidade, a sequência da cadeia leve k rearranjada é uma sequência Vk3-20Jk1.

[0027] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido de forma que expresse uma pluralidade de cadeias pesadas da imunoglobulina associadas com uma sequência da cadeia leve única. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende uma sequência humana. Em várias modalidades, a sequência humana é selecionada a partir de uma sequência variável, um CH1, uma dobradiça, um CH2, um CH3 e uma combinação destes. Em uma modalidade, a cadeia leve única compreende uma sequência humana. Em várias modalidades, a sequência humana é selecionada a partir de uma sequência variável, uma sequência constante e uma combinação destas. Em uma modalidade, o camundongo compreende um locus de imunoglobulina endógeno desativado e expressa a cadeia pesada e/ou a cadeia leve de um transgene ou epissoma extracromossômico. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição em um locus de camundongo endógeno de alguns ou todos os segmentos gênicos endógenos da cadeia pesada de camundongo (isto é, V, D, J), e/ou algumas ou todas sequências constantes da cadeia pesada de camundongo en-dógenas (por exemplo, CH1, dobradiça, CH2, CH3, ou uma combinação destes), e/ou algumas ou todas as sequências da cadeia leve de camundongo endógenas (por exemplo, V, J, constante, ou uma combinação destas), com uma ou mais sequências de imunoglobulina humana.

[0028] Em uma modalidade, o camundongo, após rearranjo de um ou mais segmentos gênicos V, D e J, ou um ou mais segmentos gênicos V e J, o camundongo compreende em seu genoma pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene ADAM6 de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, após o rearranjo, o camundongo compreende em seu ge- noma pelo menos duas sequências de ácidos nucleicos que codificam um gene ADAM6 de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, após o rearranjo, o camundongo compreende em seu genoma pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene ADAM6 de camundongo ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste. Em uma modalidade, o camundongo compreende o gene ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional deste em uma célula B.

[0029] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem um alelo ADAM6 endógeno não modificado único ou o ortólogo de homólogo ou fragmento funcional deste em um locus ADAM6 endógeno.

[0030] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequência ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional desta em uma posição no genoma de camundongo que se aproxima da posição do alelo ADAM6 de camundongo endógeno, por exemplo, 3’ de uma sequência de segmento gênico V final e 5’ de um segmento gênico D inicial.

[0031] Em uma modalidade, os camundongos machos compreendem uma sequência ADAM6 ou homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional desta flanqueada a montante, a jusante, ou a montante e a jusante (relativamente à direção da transcrição da sequência ADAM6) de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segmento gênico da região variável de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o segmento gênico da região variável de imunoglobulina é um segmento gênico humano. Em uma modalidade, o segmento gênico da região variável de imunoglobulina é um segmento gênico humano e a sequência que codifica a ADAM6 de camundongo ou o ortólogo ou o homólogo ou o fragmento desta funcional em um camundongo estão entre os segmentos gênicos V humanos; em uma modalidade, o camundongo compreende dois ou mais segmentos gênicos V humanos, e a sequência está em uma posição entre o segmento gênico V final e o penúltimo segmento gênico V; em uma modalidade, a sequência está em uma posição após final segmento gênico V e o primeiro segmento gênico D.

[0032] Em uma modalidade, o locus variável de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada sem um gene ADAM6 endógeno de camundongo. Em uma modalidade, o locus variável de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada compreende um gene ADAM6 que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade específica, o gene ADAM6 que é funcional no camundongo macho é um gene ADAM6 de camundongo e o gene ADAM6 de camundongo é colocado dentro ou imediatamente adjacente ao locus variável de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada.

[0033] Em uma modalidade, o locus variável de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada sem um gene ADAM6 endógeno de camundongo, e o camundongo compreende uma sequência ADAM6 ectópica que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, o gene ADAM6 ectópico que é funcional no camundongo macho é um gene ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade, o gene ADAM6 de camundongo está no mesmo cromossomo que o locus variável de imu- noglobulina da cadeia pesada humanizada. Em uma modalidade, o gene ADAM6 de camundongo está em um cromossomo diferente do que o locus variável de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada. Em uma modalidade, o gene ADAM6 de camundongo está em um epis- soma.

[0034] Em uma modalidade, o camundongo compreende um primeiro alelo da cadeia pesada endógena e um segundo alelo da cadeia pesada endógena, e o primeiro alelo da cadeia pesada endógena compreende uma deleção de um locus ADAM6 de camundongo, e o primeiro alelo da cadeia pesada endógena compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos segmentos funcionais V, D e J de camundongo com um ou mais segmentos humanos V, D e J. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo alelos da cadeia pesada endógena cada um compreende uma deleção de um locus ADAM6 endógeno de camundongo, e o primeiro e o segundo alelos da cadeia pesada endógena compreendem uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos funcionais V, D e J de camundongo com um ou mais segmentos humanos V, D e J. Em uma modalidade, o primeiro e/ou o segundo alelo compreende uma sequência de ácidos nucleicos ectópica que codifica uma ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos ectópica é localizada 3’ (relativamente à direcionalidade trans- cricional do locus variável da cadeia pesada) de um segmento gênico V de camundongo final e localizado 5’ (relativamente à direcionalidade transcricional da sequência constante) de um gene constante da cadeia pesada de camundongo (ou quimérico humano / camundongo) ou fragmento deste (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um humano e/ou camundongo: CH1 e/ou dobradiça e/ou CH2 e/ou CH3). Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos ectópica é localizada a jusante (relativamente à direção da transcrição do locus de segmento V) de um segmento V e a montante de um segmento D. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos ectópica está localizada entre a maior parte do penúltimo segmento V 3’ e a maior parte do último segmento V 3’. Em uma modalidade específica, a sequência de ácidos nucleicos ectópica é localizada entre o segmento V humano VH1-2 e segmento V humano VH6-1. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica entre dois segmentos gênicos V humanos é colocada em orientação de transcrição oposta relativamente aos segmentos gênicos V humanos. Em uma modalidade específica, a sequência nucleotídica codifica, de 5’ a 3’, relativamente à direção da transcrição de genes ADAM6, e sequência ADAM6a seguida de uma sequência ADAM6b. Em uma modalidade específica, o gene(s) ADAM6 é orientado em orientação transcricional oposta quando comparado com segmentos V flanque- adores a montante e a jusante.

[0035] Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos compreende uma sequência que codifica ADAM6a de camundongo ou fragmento funcional desta e/ou uma sequência que codifica ADAM6b de camundongo ou fragmento funcional desta, em que a ADAM6a e/ou ADAM6b ou fragmento(s) funcional destas são operacionalmente ligados a um promotor. Em uma modalidade, o promotor é um promotor humano. Em uma modalidade, o promotor é o promotor ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade específica, o promotor ADAM6 compreende a sequência localizada entre o primeiro códon do primeiro gene ADAM6 muito próximo à maior parte do segmento gênico DH de camun-dongo 5’ e a sequência sinal de recombinação da maior parte do segmento gênico DH 5’, em que 5’ é indicado relativamente à direção da transcrição dos genes de imunoglobulina de camundongo. Em uma modalidade, o promotor é um promotor viral. Em uma modalidade específica, o promotor viral é um promotor de citomegalovírus (CMV). Em uma modalidade, o promotor é um promotor de ubiquitina.

[0036] Em uma modalidade, a ADAM6a e/ou ADAM6b de camundongo são selecionadas a partir de ADAM6a da SEQ ID NO:1 e/ou ADAM6b da sequência SEQ ID NO:2. Em uma modalidade, o promotor ADAM6 de camundongo é o promotor da SEQ ID NO:3. Em uma modalidade específica, o promotor ADAM6 de camundongo compreende a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:3 diretamente a montante (relativamente à direção da transcrição de ADAM6a) do primeiro códon de ADAM6a e estendendo-se à extremidade da SEQ ID NO:3 a montante da região de codificação de ADAM6. Em outra modalidade específica, o promotor ADAM6 é um fragmento que se estende dentro de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 nucleotídeos a montante do códon de partida de ADAM6a a aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 2 kb ou 3 kb ou mais a montante do códon de partida de ADAM6a.

[0037] Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos compreende a SEQ ID NO:3 ou um fragmento desta que quando colocada em um camundongo que é estéril ou que tem baixa fertilidade devido a uma falta de ADAM6, melhora a fertilidade ou restitui a fertilidade a aproximadamente uma fertilidade selvagem. Em uma modalidade, a SEQ ID NO:3 ou um fragmento desta confere a um camundongo macho a capacidade de produzir uma célula de esperma que é capaz de atravessar um oviduto de camundongo fêmea a fim de fertilizar um óvulo de camundongo.

[0038] Em uma modalidade, os camundongos compreendem uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína ADAM6, ou ortólogo ou homólogo ou fragmento desta, que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade específica, a sequência de ácidos nucleicos está dentro ou adjacente a uma sequência de ácidos nu- cleicos humana que compreende um ou mais segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina. Em uma modalidade, um ou mais segmentos gênicos de região variável de imunoglobulina estão em um locus variável da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo endógena modificada. Em uma modalidade, a modificação compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gê- nicos funcionais variáveis de imunoglobulina de camundongo da cadeia pesada com uma pluralidade de segmentos gênicos da cadeia pesada humana não rearranjados que são operacionalmente ligados a um gene de região constante de camundongo endógeno. Em uma modalidade específica, a sequência de ácidos nucleicos está entre dois segmentos V humanos. Em uma modalidade específica, a sequência de ácidos nu- cleicos está entre um segmento V humano e um segmento D humano. Em uma modalidade específica, a sequência de ácidos nucleicos está entre um segmento D humano e um segmento J humano. Em uma modalidade específica, a sequência de ácidos nucleicos está a montante da maior parte do segmento 5’ (relativamente à direção da transcrição do segmento V) humano V. Em uma modalidade específica, a sequência de ácidos nucleicos está entre um segmento J humano e uma sequência gênica de região constante da cadeia pesada de camundongo endógena.

[0039] Em uma modalidade, camundongos machos são capazes de gerar descendência acasalando-se, com uma frequência que é aproximadamente a mesma de um camundongo selvagem. Em uma modalidade, os camundongos machos produzem esperma que pode transitar em um útero de camundongo por um oviduto de camundongo para fertilizar um óvulo de camundongo; em uma modalidade específica, o esperma dos camundongos transita pelo oviduto quase tão eficientemente como esperma de um camundongo selvagem. Em uma modalidade, aproximadamente 50% ou mais do esperma produzido no camundongo exibe a capacidade de entrar e/ou transitar em um oviduto para fertilizar um óvulo de camundongo.

[0040] Em uma modalidade, o camundongo sem um locus ADAM6 endógeno funcional, em que o camundongo compreende uma sequência nucleotídica ectópica que completa a perda da função de ADAM6 de camundongo em um camundongo macho. Em uma modalidade, a sequência nucleotídica ectópica confere ao camundongo macho uma capacidade de produzir a descendência que é comparável a um camundongo macho selvagem correspondente que contém um gene ADAM6 endógeno funcional. Em uma modalidade, a sequência confere ao camundongo uma capacidade de formar um complexo de ADAM2 e/ou ADAM3 e/ou ADAM6 na superfície da célula de esperma do camundongo. Em uma modalidade, a sequência confere ao camundongo uma capacidade de viajar em um útero de camundongo por um oviduto de camundongo a um óvulo de camundongo para fertilizar o óvulo.

[0041] Em uma modalidade, o camundongo sem um locus ADAM6 endógeno funcional e compreende uma sequência nucleotídica ectópica que codifica uma ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento desta que é funcional em um camundongo macho e em que o camundongo macho produz pelo menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do número de ninhadas que um camundongo selvagem da mesma idade e linhagem produz em um período de tempo de seis meses.

[0042] Em uma modalidade, o camundongo sem o gene ADAM6 endógeno funcional e compreendendo a sequência nucleotídica ectó- pica pelo menos produz aproximadamente 1,5 vezes, aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 2,5 vezes, aproximadamente 3 vezes, aproximadamente 4 vezes, aproximadamente 6 vezes, aproximadamente 7 vezes, aproximadamente 8 vezes, ou aproximadamente 10 vezes ou mais progênie quando reproduzido ao longo de um período de tempo de seis meses do que um camundongo da mesma idade e da mesma cepa ou similar sem o gene ADAM6 endógeno funcional e sem a sequência nucleotídica ectópica que é produzida substancialmente no mesmo período de tempo e substancialmente sob as mesmas condições.

[0043] Em uma modalidade, o camundongo sem o gene ADAM6 endógeno funcional e compreendendo a sequência nucleotídica ectó- pica produz uma média de pelo menos aproximadamente uma média de 2 vezes, de 3 vezes, ou de 4 vezes de filhotes por ninhada em um período de reprodução de 4 ou 6 meses do que um camundongo sem o gene ADAM6 endógeno funcional e que não tem a sequência nucleotí- dica ectópica, e que é produzido pelo mesmo período de tempo.

[0044] Em uma modalidade, o camundongo sem o gene ADAM6 endógeno funcional e compreendendo a sequência nucleotídica ectó- pica é um camundongo macho, e o camundongo macho produz o esperma que quando recuperado de ovidutos pós-copulação em aproximadamente 5-6 horas reflete uma migração de oviduto que pelo menos é de 10 vezes, pelo menos de 20 vezes, pelo menos de 30 vezes, pelo menos de 40 vezes, pelo menos de 50 vezes, pelo menos de 60 vezes, pelo menos de 70 vezes, pelo menos de 80 vezes, pelo menos de 90 vezes, de 100 vezes, de 110 vezes, ou de 120 vezes ou mais do que o esperma de um camundongo sem o gene ADAM6 endógeno funcional e que não tem a sequência nucleotídica ectópica.

[0045] Em uma modalidade, o camundongo sem o gene ADAM6 endógeno funcional e compreendendo a sequência nucleotídica ectó- pica quando copula com um camundongo fêmea gera o esperma que é capaz de atravessar o útero e entrar e atravessar o oviduto em aproximadamente 6 horas com uma eficiência que é aproximadamente igual ao esperma de um camundongo selvagem.

[0046] Em uma modalidade, o camundongo sem o gene ADAM6 endógeno funcional e compreendendo a sequência nucleotídica ectó- pica produz aproximadamente 1,5 vezes, aproximadamente 2 vezes, aproximadamente 3 vezes, ou aproximadamente 4 vezes ou mais ninhadas em um período de tempo comparável do que um camundongo sem o gene ADAM6 funcional e que não tem a sequência nucleotídica ectópica.

[0047] Em um aspecto, um camundongo é fornecido de forma que compreenda um locus de imunoglobulina variável da cadeia pesada de camundongo endógena humanizada e uma modificação de um locus de imunoglobulina da cadeia leve de camundongo, em que o camundongo expressa uma célula B que compreende uma sequência de imunoglo- bulina da cadeia pesada humana rearranjada operacionalmente ligada a uma sequência gênica de região constante da cadeia pesada humana ou de camundongo, e a célula B compreende em seu genoma (por exemplo, em um cromossomo de célula B) um gene que codifica uma ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento desta que é funcional em um camundongo macho (por exemplo, um gene ADAM6 de camundongo, por exemplo, ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b de camundongo), em que os domínios variáveis das cadeias leves À ou K da imunoglobulina de camundongos são derivados de não mais do que um ou não mais do que dois segmentos gênicos V da cadeia leve.

[0048] Em uma modalidade, a sequência de imunoglobulina rear- ranjada operacionalmente ligada à sequência gênica de região constante da cadeia pesada compreende uma sequência V, D e/ou J da cadeia pesada humana; uma sequência V, D e/ou J da cadeia pesada de camundongo; uma sequência V e/ou J da cadeia leve humana ou da cadeia leve de camundongo. Em uma modalidade, a sequência gênica de região constante da cadeia pesada compreende uma sequência da cadeia pesada humana ou de camundongo selecionada a partir do grupo consistindo de um CH1, uma dobradiça, um CH2, um CH3 e uma combinação destes.

[0049] Em um aspecto, um camundongo adequado para produção de anticorpos que têm a mesma cadeia leve é fornecido, em que todos ou substancialmente todos os anticorpos produzidos no camundongo são expressos com a mesma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende um domínio variável humano, e em que os anticorpos compreendem uma cadeia pesada que compreende um domínio variável humano.

[0050] Em um aspecto, um camundongo é fornecido de forma que seja caracterizado por uma incapacidade do camundongo de produzir uma célula B que expressa um domínio variável da cadeia leve de imu- noglobulina que é derivado de uma sequência da cadeia leve rearran- jada que não é uma sequência Vk1-39Jk5 humana ou uma Vk3-20Jk1 humana.

[0051] Em uma modalidade, o camundongo exibe uma proporção da cadeia leve k:À que é aproximadamente a mesma que um camundongo que compreende um complemento selvagem de segmentos gê- nicos V e J da cadeia leve de imunoglobulina.

[0052] Em um aspecto, um camundongo, como descrito neste pedido, é fornecido de forma que expresse uma cadeia leve de imunoglo- bulina derivada de uma sequência VK1-39JK5 humana ou uma VK3- 20JK1 humana, em que o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada de camundongo endógena com um ou mais segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humana e o camundongo exibe uma proporção de (a) células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leve À, para (b) células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leve K, de aproximadamente 1 para aproximadamente 20.

[0053] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve k única, em que a cadeia leve k única é derivada de uma sequência Vk1-39Jk5 humana e a proporção de células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leve À para células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leve k é aproximadamente 1 para aproximadamente 20; em uma modalidade, a proporção é aproximadamente 1 para pelo menos aproximadamente 66; em uma modalidade específica, a proporção é aproximadamente 1 para 66.

[0054] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve k única, em que a cadeia leve k única é derivada de uma sequência Vk3-20Jk5 humana e a proporção de células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leve À para células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leve k é de aproximadamente 1 para aproximadamente 20; em uma modalidade, a proporção é de aproximadamente 1 a aproximadamente 21. Em modalidades específicas, a proporção é de 1 para 20, ou de 1 para 21.

[0055] Em uma modalidade, a porcentagem de células B Igk+/IgÀ+ no camundongo é aproximadamente a mesma que em um camundongo selvagem. Em uma modalidade específica, a porcentagem de células B IgK+/IgÀ+ no camundongo é aproximadamente 2 a aproximadamente 6 por cento. Em uma modalidade específica, a porcentagem de células B IgK+/IgÀ+em um camundongo em que a cadeia leve K única rearranjada é derivada de uma sequência VK1-39JK5 é aproximadamente 2 a apro-ximadamente 3; em uma modalidade específica, aproximadamente 2.6. Em uma modalidade específica, a porcentagem de células B IgK+/IgÀ+ em um camundongo em que a cadeia leve k única rearranjada é derivada de uma sequência Vk3-20Jk1 é aproximadamente 4 a aproximadamente 8; em uma modalidade específica, aproximadamente 6.

[0056] Em uma modalidade, o camundongo não compreende uma modificação que reduz ou elimina uma capacidade do camundongo de mutar somaticamente qualquer locus da cadeia leve funcional do camundongo. Em uma modalidade, o único locus da cadeia leve funcional no camundongo expressa uma cadeia leve que compreende um domínio variável humano derivado de uma sequência rearranjada selecionada a partir de uma sequência Vk1-39Jk5 humana, uma sequência Vk3-20Jk1 humana e uma combinação destas.

[0057] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido de forma que expresse uma cadeia leve k única derivada de não mais do que uma, ou não mais do que duas, sequências da cadeia leve k rearranjadas, em que o camundongo exibe o uso da cadeia leve k que é aproximadamente 100 vezes ou mais, pelo menos aproximadamente 200 vezes ou mais, pelo menos aproximadamente 300 vezes ou mais, pelo menos aproximadamente 400 vezes ou mais, pelo menos aproximadamente 500 vezes ou mais, pelo menos aproximadamente 600 vezes ou mais, pelo menos aproximadamente 700 vezes ou mais, pelo menos aproximadamente 800 vezes ou mais, pelo menos aproxi-madamente 900 vezes ou mais, pelo menos aproximadamente 1000 vezes ou mais do que o uso da mesma cadeia leve k (isto é, derivado do mesmo segmento V e do mesmo segmento J, ou derivado do mesmo segmento V/J rearranjado) exibido por um camundongo carregando um locus completo ou substancialmente completo da cadeia leve K humana. Em uma modalidade específica, o camundongo carregando um locus da cadeia leve k humana completo ou substancialmente completo sem uma sequência não rearranjada da cadeia leve funcional de camundongo k. Em uma modalidade específica, o camundongo expressa a cadeia leve k única de não mais do que uma sequência da cadeia leve k rearranjada. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma cópia de uma sequência da cadeia leve k rearranjada (por exemplo, um heterozigoto). Em uma modalidade, o camundongo compreende duas cópias de uma sequência da cadeia leve k rearranjada (por exemplo, um homozigoto). Em uma modalidade mais específica, a sequência da cadeia leve k rearranjada é selecionada a partir de uma sequência Vk1- 39Jk5 e Vk3-20Jk1. Em uma modalidade, a sequência da cadeia leve k rearranjada é uma sequência Vk1-39Jk5. Em uma modalidade, a sequência da cadeia leve k rearranjada é uma sequência Vk3-20Jk1.

[0058] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido de forma que expresse uma cadeia leve única derivada de não mais do que uma, ou não mais do que duas, sequências rearranja- das da cadeia leve k, em que a cadeia leve no camundongo geneticamente modificado exibe um nível de expressão que pelo menos é de 10 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, de 100 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, de 200 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, de 300 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, de 400 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, de 500 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, de 600 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, de 700 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, de 800 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes, ou de 900 vezes a aproximadamente de 1.000 vezes mais alto do que a expressão da mesma cadeia leve rearranjada exibida por um camundongo carregando um locus variável da cadeia leve K humana completo ou substancialmente completo. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende uma sequência humana. Em uma modalidade, a cadeia leve única é derivada de uma sequência da cadeia leve K rearranjada selecionada a partir de uma VK1-39JK5 humana, uma VK3-20JK1 humana e uma combinação destas.

[0059] Em uma modalidade, o nível de expressão da cadeia leve, para fins de comparação da expressão da cadeia leve com a expressão em um camundongo compreendendo um locus variável da cadeia leve substancialmente completamente humanizada, é caracterizado quantificando o mRNA da sequência da cadeia leve transcrita (de uma ou duas sequências rearranjadas) e comparando-o com a sequência da cadeia leve transcrita de um camundongo carregando um locus da cadeia leve completa ou substancialmente completa.

[0060] Em um aspecto, um método para produção de um anticorpo é fornecido, compreendendo a expressão em uma célula (a) uma primeira sequência de ácidos nucleicos de domínio variável da cadeia pesada humana de um camundongo imunizado como descrito neste pedido fundido a uma sequência gênica CH humana; (b) uma sequência de ácidos nucleicos de domínio variável da cadeia leve humana de um camundongo imunizado como descrito neste pedido fundido com uma sequência gênica CL humana; e, (c) manutenção da célula sob condições suficientes para expressar um anticorpo totalmente humano e isolamento do anticorpo. Em uma modalidade, a célula compreende uma segunda sequência de ácidos nucleicos de domínio variável da cadeia pesada humana de um segundo camundongo imunizado como descrito neste pedido fundido a uma sequência gênica CH humana, a primeira sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada codifica um primeiro domínio variável da cadeia pesada que reconhece um primeiro epítopo, e a segunda sequência de ácidos nucleicos da cadeia pesada codifica um segundo domínio variável da cadeia pesada que reconhece um segundo epítopo, em que o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos.

[0061] Em um aspecto, um método para produção de uma proteína de ligação ao epítopo é fornecido, compreendendo a exposição de um camundongo como descrito neste pedido a um antígeno que compreende um epítopo de interesse, mantendo o camundongo sob condições suficientes para o camundongo gerar uma molécula de imunoglobulina que especificamente se liga ao epítopo de interesse e isolamento da molécula de imunoglobulina que especificamente se liga ao epítopo de interesse; em que a proteína de ligação ao epítopo compreende uma cadeia pesada que compreende um domínio variável humano somaticamente mutado e um CH de camundongo, associado com uma cadeia leve que compreende um CL de camundongo e um domínio variável humano derivado de uma VK1-39JK5 humana rearranjada ou uma VK3- 20JK1 humana rearranjada.

[0062] Em um aspecto, um método para a produção de uma proteína biespecífica que se liga ao antígeno é fornecido, compreendendo a exposição de um primeiro camundongo como descrito neste pedido a um primeiro antígeno de interesse que compreende um primeiro epí- topo, exposição de um segundo camundongo como descrito neste pedido a um segundo antígeno de interesse que compreende um segundo epítopo, permitindo o primeiro e o segundo camundongos montarem respostas imunes aos antígenos de interesse, identificando no primeiro camundongo uma primeira região variável da cadeia pesada humana que se liga ao primeiro epítopo do primeiro antígeno de interesse, que identifica no segundo camundongo uma segunda região variável da cadeia pesada humana que se liga ao segundo epítopo do segundo antí- geno de interesse, produzindo um primeiro gene da cadeia pesada to-talmente humana que codifica uma primeira cadeia pesada que se liga ao primeiro epítopo do primeiro antígeno de interesse, produzindo um segundo gene da cadeia pesada totalmente humana que codifica uma segunda cadeia pesada que se liga ao segundo epítopo do segundo antígeno de interesse, expressando a primeira cadeia pesada e a segunda cadeia pesada em uma célula que expressa uma cadeia leve totalmente humana única derivada de um segmento gênico VK1-39 humano ou um VK3-20 humano para formar uma proteína biespecífica que se liga ao antígeno e isolamento da proteína biespecífica que se liga ao antígeno.

[0063] Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundo antí- geno não são idênticos.

[0064] Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundo antí- geno são idênticos, e o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos. Em uma modalidade, a ligação da primeira região variável da cadeia pesada ao primeiro epítopo não bloqueia a ligação da segunda região variável da cadeia pesada ao segundo epítopo.

[0065] Em uma modalidade, o primeiro antígeno é selecionado a partir de um antígeno solúvel e um antígeno de superfície celular (por exemplo, um antígeno tumoral), e o segundo antígeno compreende um receptor de superfície celular. Em uma modalidade específica, o receptor de superfície celular é um receptor de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o receptor de imunoglobulina é um receptor de Fc. Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são o mesmo receptor de superfície celular, e a ligação da primeira cadeia pesada ao primeiro epítopo não bloqueia a ligação da segunda cadeia pesada ao segundo epítopo.

[0066] Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia leve da cadeia leve compreende 2 a 5 mutações somáticas. Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia leve é uma cadeia leve cognata somaticamente mutada expressa em uma célula B do primeiro ou do segundo camundongo imunizado com o primeiro ou com o segundo domínio variável da cadeia pesada.

[0067] Em um aspecto, uma célula que expressa uma proteína de ligação ao epítopo é fornecida, em que a célula compreende: (a) uma sequência nucleotídica humana que codifica um domínio variável da cadeia leve humana que é derivado de uma VK1-39JK5 humana rearran- jada ou uma VK3-20JK1 humana rearranjada, em que a sequência de ácidos nucleicos humana é fundida (diretamente ou por um ligante) a uma sequência de ácidos nucleicos de domínio constante da cadeia leve de imunoglobulina humana (por exemplo, uma sequência de DNA de domínio constante K humano); e, (b) uma primeira sequência de ácidos nucleicos de domínio variável da cadeia pesada humana que codifica um domínio variável da cadeia pesada humana derivado de uma primeira sequência nucleotídica de domínio variável da cadeia pesada humana, em que a primeira sequência nucleotídica de domínio variável da cadeia pesada humana é fundida (diretamente ou por um ligante) a uma sequência de ácidos nucleicos de domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana (por exemplo, uma sequência de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgE humana); em que a proteína de ligação ao epí- topo reconhece um primeiro epítopo. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao epítopo liga-se ao primeiro epítopo com uma constante de dissociação mais baixa do que 10-6 M, mais baixa do que 10-8 M, mais baixa do que 10-9 M, mais baixa do que 10-10 M, mais baixa do que 1011 M, ou mais baixa do que 10-12 M. Em uma modalidade, a célula compreende uma segunda sequência nucleotídica humana que codifica um segundo domínio variável da cadeia pesada humana, em que a segunda sequência humana é fundida (diretamente ou por um ligante) a uma sequência de ácidos nucleicos de domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana, e em que o segundo domínio variável da cadeia pesada humana não reconhece especificamente o primeiro epítopo (por exemplo, exibe uma constante de dissociação de, por exemplo, 10- 6 M, 10-5 M, 10-4 M, ou superior), e em que a proteína de ligação ao epítopo se liga tanto ao primeiro epítopo quanto ao segundo epítopo, e em que a primeira e a segunda cadeias pesadas de imunoglobulina cada uma se associa a uma cadeia leve de acordo com (a). Em uma modalidade, o segundo domínio VH liga-se ao segundo epítopo com uma constante de dissociação que é mais baixa do que 10-6 M, mais baixa do que 10-7 M, mais baixa do que 10-8 M, mais baixa do que 10-9 M, mais baixa do que 10-10 M, mais baixa do que 10-11 M ou mais baixa do que 10-12 M.

[0068] Em uma modalidade, a proteína de ligação ao epítopo compreende uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina, cada uma associada a uma cadeia leve universal (por exemplo, uma cadeia leve derivada de uma sequência variável da cadeia leve humana rearranjada selecionada a partir de uma VK1-39JK5 humana ou uma VK3-20JK1 humana), em que a primeira cadeia pesada de imunoglobulina liga-se a um primeiro epítopo com uma constante de dissociação na faixa de nanomolar (por exemplo, 1 nM a 100 nM) a de picomolar (por exemplo, 1 pM a 100 pM), a segunda cadeia pesada de imunoglobulina se liga a um segundo epítopo com uma constante de dissociação na faixa de nanomolar a de picomolar (por exemplo, 1 pM a 100 nM), o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos, a primeira cadeia pesada de imunoglobulina não se liga ao segundo epítopo ou liga-se ao segundo epítopo com uma constante de dissociação mais fraca do que a faixa de micromolar (por exemplo, faixa de milimolar), a segunda cadeia pesada de imunoglobulina não se liga ao primeiro epítopo ou liga-se ao primeiro epítopo com uma constante de dissociação mais fraca do que a faixa de micromolar (por exemplo, faixa de milimolar), e um ou mais dos domínios variáveis (isto é, um ou mais do domínio variável da cadeia leve, o domínio variável da cadeia pesada da primeira cadeia pesada de imunoglobulina e o domínio variável da cadeia pesada) da segunda cadeia pesada de imu- noglobulina é somaticamente mutada. Em uma modalidade, a ligação da proteína de ligação ao epítopo ao primeiro epítopo não bloqueia a ligação da proteína de ligação ao epítopo ao segundo epítopo.

[0069] Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada de imunoglo- bulina compreende um determinante de ligação de proteína A selvagem, e a segunda cadeia pesada sem um determinante de ligação de proteína A selvagem. Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada de imunoglobulina liga-se à proteína A sob condições de isolamento, e a segunda cadeia pesada de imunoglobulina não se liga à proteína A ou liga-se à proteína A pelo menos de 10 vezes, cem vezes, ou mil vezes mais fraca do que a primeira cadeia pesada de imunoglobulina liga-se à proteína A sob condições de isolamento. Em uma modalidade específica, a primeira e a segunda cadeias pesadas são isotipos IgG1, em que a segunda cadeia pesada compreende uma modificação selecionada a partir de 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), e uma combinação destas, e em que a primeira cadeia pesada não tem tal modificação.

[0070] Em aspecto, um camundongo, embrião ou célula como descrito neste pedido compreende um locus da cadeia leve K que conserva elementos endógenos reguladores ou de controle, por exemplo, um po- tencializador intrônico de camundongo k, um potencializador de camundongo 3’ k, ou tanto um potencializador intrônico como um potencializa- dor 3’, em que os elementos reguladores ou os elementos de controle facilitam a mutação somática e a maturação de afinidade de uma sequência expressa do locus da cadeia leve k.

[0071] Em um aspecto, uma célula de camundongo é fornecido de forma que seja isolada de um camundongo como descrito neste pedido. Em uma modalidade, a célula é uma célula ES. Em uma modalidade, a célula é um linfócito. Em uma modalidade, o linfócito é uma célula B. Em uma modalidade, a célula B expressa uma cadeia pesada quimérica que compreende um domínio variável derivado de um segmento gênico V humano; e uma cadeia leve derivada de (a) uma sequência VK1-39/J humana rearranjada, (b) uma sequência VK3-20/J humana rearranjada ou (c) uma combinação destas; em que o domínio variável da cadeia pesada é fundido a uma região constante de camundongo e o domínio variável da cadeia leve é fundido a uma região constante de camundongo ou uma humana. Em uma modalidade, a célula de camundongo compreende pelo menos um gene que codifica uma ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta. Em uma modalidade, a célula é uma célula B e a célula B compreende uma sequência que codifica um domínio variável de imunoglobulina da cadeia pesada humana rearranjada e uma sequência que codifica um domínio variável da cadeia leve universal, em que a célula B compreende em um cromossomo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento desta que é funcional em um camundongo macho; em uma modalidade, a célula B de camundongo compreende dois alelos da sequência de ácidos nucleicos.

[0072] Em um aspecto, uma célula de camundongo é fornecida, compreendendo um primeiro cromossomo que compreende uma imu- noglobulina humanizada que o locus da cadeia pesada compreendendo segmentos humanos V, D e J não rearranjados; um segundo cromossomo que compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina humanizada que codifica ou é capaz de rearranjo para codificar uma cadeia leve, em que o locus da cadeia leve compreende não mais do que um segmento V (ou não mais do que dois segmentos V) e não mais do que um segmento J (ou não mais do que dois segmentos J) operacio-nalmente ligado a uma gene de região constante da cadeia leve, ou não mais do que uma ou não mais do que duas sequências V/J da cadeia leve rearranjada operacionalmente ligadas a um gene constante da cadeia leve; e um terceiro cromossomo que compreende a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento desta que é funcional em um camundongo macho. Em uma modalidade, os primeiro e terceiro cromossomos são os mesmos. Em uma modalidade, os segundo e terceiro cromossomos são os mesmos. Em uma modalidade, o primeiro, o segundo e o terceiro cromossomos são cada um diferentes. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos que codifica a ADAM6 de camundongo ou o ortólogo ou o homólogo ou o fragmento funcional desta estão presentes em duas cópias. Em uma modalidade, a célula é uma célula somática. Em uma modalidade específica, a célula somática é uma célula B. Em uma modalidade, a célula é uma célula germinal.

[0073] Em um aspecto, um hibridoma é fornecido, em que o hibri- doma é produzido com uma célula B de um camundongo como descrito neste pedido. Em uma modalidade específica, a célula B é de um camundongo como descrito neste pedido que foi imunizado com um antí- geno que compreende um epítopo de interesse, e a célula B expressa uma proteína de ligação que se liga ao epítopo de interesse, a proteína de ligação tem um domínio variável da cadeia pesada humana somaticamente mutada e uma região constante da cadeia pesada de camundongo, e tem um domínio variável da cadeia leve humana derivado de uma VK1-39JK5 humana rearranjada ou uma VK3-20JK1 humana rear- ranjada e um CL de camundongo.

[0074] Em um aspecto, uma célula é fornecida de forma que compreenda um gene da cadeia pesada totalmente humana que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro domínio variável da cadeia pesada de um camundongo como descrito neste pedido e um gene da cadeia leve totalmente humana que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência da cadeia leve universal como descrito neste pedido. Em uma modalidade, a célula compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um segundo domínio variável da cadeia pesada de um camundongo como descrito neste pedido, em que o primeiro e o segundo domínios variáveis da cadeia pesada são diferentes. Em uma modalidade, a célula é selecionada a partir de CHO, COS, 293, HeLa, e uma célula retiniana que expressa uma sequência de ácidos nucleicos viral (por exemplo, uma célula PERC.6™).

[0075] Em um aspecto, um embrião de camundongo é fornecido, em que o embrião compreende um doador célula ES que é derivada de um camundongo como descrito neste pedido.

[0076] Em um aspecto, o uso de um embrião de camundongo que compreende uma modificação genética como descrito neste pedido é fornecido, em que o uso compreende a criação de um camundongo geneticamente modificado como descrito neste pedido.

[0077] Em um aspecto, um domínio variável da cadeia pesada humana e uma sequência de aminoácidos de domínio variável da cadeia leve humana de um anticorpo produzido em um camundongo como descrito neste pedido são fornecidos.

[0078] Em um aspecto, uma sequência nucleotídica de domínio variável da cadeia pesada humana e uma sequência nucleotídica de domínio variável da cadeia leve humana de um anticorpo feito em um camundongo como descrito neste pedido é fornecido.

[0079] Em um aspecto, um anticorpo ou proteína de ligação ao an- tígeno ou fragmento de ligação ao antígeno deste (por exemplo, Fab, F(ab)2, scFv) produzido em um camundongo como descrito neste pedido é fornecido.

[0080] Em um aspecto, um camundongo produzido usando um vetor de direcionamento, construto de nucleotídeo, ou célula como descrito neste pedido é fornecido.

[0081] Em um aspecto, uma progênie de um acoplamento de um primeiro camundongo como descrito neste pedido com um segundo camundongo que é um camundongo selvagem ou geneticamente modificado é fornecida.

[0082] Em um aspecto, o uso de um camundongo como descrito neste pedido para produzir um anticorpo totalmente humano ou proteína totalmente humana de ligação ao antígeno e compreende um domínio variável de imunoglobulina ou fragmento funcional deste, é fornecido.

[0083] Em um aspecto, o uso de um camundongo ou tecido ou célula como descrito neste pedido para produzir um anticorpo biespecífico totalmente humano é fornecido.

[0084] Em um aspecto, o uso de uma sequência de ácidos nuclei- cos feita por um camundongo como descrito neste pedido é fornecido, em que o uso compreende a expressão da sequência de ácidos nuclei- cos na produção de um produto terapêutico humano.

[0085] Em um aspecto, o uso de um camundongo como descrito neste pedido para produzir uma linhagem celular imortalizada é fornecido.

[0086] Em um aspecto, o uso de um camundongo como descrito neste pedido para produzir um hibridoma ou quadroma é fornecido.

[0087] Em um aspecto, o uso de um camundongo como descrito neste pedido para produzir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de imunoglobulina ou fragmento desta é fornecido. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos é usada para produzir um anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antí- geno deste. Em uma modalidade, o camundongo é usado para produzir uma proteína de ligação ao antígeno selecionada a partir de um anticorpo, um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespe- cífico), um scFv, um bis-scFV, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um V-NAR, um VHH, um VL, um F(ab), um F(ab)2, um DVD (isto é, proteína de ligação ao antígeno de domínio variável dual), um SVD (isto é, proteína de ligação ao antígeno de domínio variável único), ou um ligador de célula T biespecífico (BiTE).

[0088] Em um aspecto, o uso do camundongo como descrito neste pedido para a produção de um medicamento (por exemplo, uma proteína de ligação ao antígeno), ou para a produção de uma sequência que codifica uma sequência variável de um medicamento (por exemplo, proteína de ligação ao antígeno), para o tratamento de uma doença ou distúrbio humanos é fornecido.

[0089] Qualquer uma das modalidades e aspectos descritos neste pedido podem ser usados em conjunto um com outro, a menos que de outra maneira indicado ou evidente do contexto. Outras modalidades ficarão evidentes para os versados na técnica de uma revisão da seguinte descrição.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0090] A FIG. 1A mostra uma ilustração geral, não em escala, para a substituição genômica direta de aproximadamente três megabases (Mb) do locus gênico variável da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo (símbolos fechados) com aproximadamente uma megabase (Mb) do locus gênico variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana (símbolos abertos).

[0091] A FIG. 1B mostra uma ilustração geral, não em escala, para a substituição genômica direta de aproximadamente três megabases (Mb) do locus gênico variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo K (símbolos fechados) com aproximadamente 0,5 megabases (Mb) do primeiro, ou proximal, de duas repetições quase idênticas de locus gênico variável da cadeia leve de imunoglobulina humana k (símbolos abertos).

[0092] A FIG. 2A mostra uma ilustração detalhada, não em escala, para três etapas iniciais (A-C) da substituição genômica direta do locus gênico variável da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo que resulta na deleção de todos segmentos gênicos VH, DH e JH de camundongo e substituição por três segmentos gênicos VH humano, todo DH humano e JH. Um vetor de direcionamento para a primeira inserção de segmentos gênicos da cadeia pesada da imunoglobulina humana é mostrado (3hVH BACvec) com um braço de homologia de camundongo 5’ de 67 kb, um cassete de seleção (retângulo aberto), um sítio de recombinação específico para o sítio (triângulo aberto), um fragmento genômico humano de 145 kb e um braço de homologia de camundongo 3’ de 8 kb. Segmentos gênicos humanos (símbolos abertos) e de camundongo (símbolos fechados) de imunoglobulina, cassetes de seleção adicionais (retângulos abertos) e sítios de recombinação específicos para o sítio (triângulos abertos) inserido de vetores de direciona-mento subsequentes são mostrados.

[0093] A FIG. 2B mostra uma ilustração detalhada, não em escala, para seis etapas adicionais (D-I) para substituição genômica direta do locus gênico variável da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo que resulta na inserção de 77 segmentos gênicos VH humanos adicionais e remoção do cassete de seleção final. Um vetor de direcionamento da inserção de segmentos gênicos VH humanos adicionais (18hVH BACvec) para a inserção inicial de segmentos gênicos da cadeia pesada humana (Alelo Híbrido 3hVH-CRE) é mostrado com um braço de homologia de camundongo 5’ de 20 kb, um cassete de seleção (retângulo aberto), um fragmento genômico humano de 196 kb e um braço de homologia humano de 62 kb que fica sobreposto com a extremidade 5’ da inserção inicial de segmentos gênicos da cadeia pesada humana que é mostrada com um sítio de recombinação específico para o sítio (triângulo aberto) localizado 5’ aos segmentos gênicos humanos. Segmentos gênicos humanos (símbolos abertos) e de camundongo (símbolos fechados) de imunoglobulina e cassetes de seleção adicionais (retângulos abertos) inseridos por vetores de direcionamento subsequentes são mostrados.

[0094] A FIG. 2C mostra uma ilustração detalhada, não em escala, para três etapas iniciais (A-C) para substituição genômica direta do locus gênico variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo K que resulta na deleção de todos os segmentos gênicos VK e JK de camundongo (Alelo Híbrido de Igk-CRE). Os cassetes de seleção (retângulos abertos) e sítios de recombinação específicos para o sítio (triângulos abertos) inseridos dos vetores de direcionamento são mostrados.

[0095] A FIG. 2D mostra uma ilustração detalhada, não em escala, para 5 etapas adicionais (D-H) para substituição genômica direta do locus gênico variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo k que resulta na inserção de todos os segmentos gênicos Vk e Jk na repetição proximal e deleção do cassete de seleção final (Alelo Híbrido 40hVkdHyg). Segmentos gênicos humanos (símbolos abertos) e de camundongo (símbolos fechados) de imunoglobulina e cassetes de seleção adicionais (retângulos abertos) inseridos por vetores de direcionamento subsequentes são mostrados.

[0096] A FIG. 3A mostra uma ilustração geral das posições de conjuntos de iniciador/sonda de PCR quantitativa (qPCR) para rastrear células ES para inserção de sequências gênicas da cadeia pesada humana e perda das sequências gênicas da cadeia pesada de camundongo. A estratégia de rastreamento em células ES e camundongos para a primeira inserção gênica pesada humana é mostrada com conjuntos de iniciador/sonda de qPCR para a região deletada (sondas de "perda" C e D), a região inserida (sondas "hIgH" G e H) e regiões flan- queadoras (sondas de "retenção" A, B, E e F) em um cromossomo de camundongo não modificado (topo) e um cromossomo corretamente visado (fundo).

[0097] A FIG. 3B mostra um cálculo representativo do número de cópias de sonda observado em células ES parentais e modificadas para a primeira inserção dos segmentos gênicos da cadeia pesada de imunoglobulina humana. O número de cópias de sonda observado de sondas A a F foi calculado como 2/2ΔΔCt. O ΔΔCt é calculado como ave[ΔCt (amostra) - medΔCt (controle)] onde ΔCt é a diferença em Ct entre sondas teste e de referência (entre 4 e 6 sondas de referência dependendo do ensaio). O termo medΔCt (controle) é o número médio ΔCt de amostras múltiplas (> 60) de DNA não visadas de células ES parentais. Cada clone de células ES modificado foi analisado em sextu- plicata. Para calcular números de cópias de sondas G e H de IgH em células ES parentais, supôs-se que estas sondas tivessem o número de cópias de 1 em células ES modificadas e Ct máximo de 35 foi usado embora nenhuma amplificação fosse observada.

[0098] A FIG. 3C mostra que um cálculo representativo de números de cópias para quatro camundongos de cada genótipo foi calculado de uma maneira similar usando somente sondas D e H. Camundongos selvagens: Camundongos WT; Camundongos heterozigotos para a primeira inserção de segmentos gênicos de imunoglobulina humana: Camundongos HET; Camundongos homozigotos para a primeira inserção de segmentos gênicos de imunoglobulina humana: Camundongos Homo.

[0099] A FIG. 4A mostra uma ilustração das três etapas empregadas para a construção de 3hVH BACvec pela recombinação homóloga bacteriana (BHR). Segmentos gênicos humanos (símbolos abertos) e de camundongo (símbolos fechados) de imunoglobulina, cassetes de seleção (retângulos abertos) e sítios de recombinação específicos para o sítio (triângulos abertos) inseridos para vetores de direcionamento são mostrados.

[00100] A FIG. 4B mostra eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) de três clones de BAC (B1, B2 e B3) após digestão de NotI. Os marcadores M1, M2 e M3 são marcadores PFG de faixa baixa, faixa média e escada lambda, respectivamente (New England BioLabs, Ipswich, MA).

[00101] A FIG. 5A mostra uma ilustração esquemática, não em escala, de modificações sequenciais do locus da cadeia pesada de imu- noglobulina de camundongo com quantidades crescentes de segmentos gênicos da cadeia pesada de imunoglobulina humana. Os camundongos homozigotos foram feitos de cada um dos três estágios diferentes de humanização da cadeia pesada. Os símbolos abertos refletem a sequência humana; os símbolos fechados refletem a sequência de camundongo.

[00102] A FIG. 5B mostra uma ilustração esquemática, não em escala, de modificações sequenciais de locus da cadeia leve de imunoglo- bulina de camundongo K com quantidades crescentes de segmentos gênicos da cadeia leve de imunoglobulina humana K. Camundongos ho- mozigotos foram produzidos de cada um de três estágios diferentes de humanização da cadeia leve k. Os símbolos abertos refletem a sequência humana; os símbolos fechados refletem a sequência de camundongo.

[00103] A FIG. 6 mostra gráficos de pontos de FACS de populações de células B em camundongos selvagens e humanizados Velo- cImmune®. As células do baço (linha superior, terceira linha a partir do topo e linha inferior) ou linfonodo inguinal (segunda linha a partir do topo) de camundongos selvagens (wt) ou VelocImmune® 1 (V1), Velo- cImmune® 2 (V2) ou VelocImmune® 3 (V3) foram marcadas para células B que expressam IgM na superfície (linha superior e segunda linha a partir do topo), imunoglobulina superficial que contém cadeias leves k ou À (terceira linha a partir do topo) ou IgM superficial de haplótipos específicos (fila inferior) e populações separadas por FACS.

[00104] A FIG. 7A mostra sequências de CDR3 da cadeia pesada representativas de anticorpos VelocImmune® randomicamente selecionados em torno da junção VH-DH-JH (CDR3), demonstrando adições juncionais e diversidade de nucleotídeos. As sequências de CDR3 da cadeia pesada são agrupadas de acordo com o uso de segmento gênico DH, a linhagem germinativa do qual é fornecida acima de cada grupo em negrito. Os segmentos gênicos VH para cada sequência de CDR3 da cadeia pesada é observada dentro de parênteses na extremidade 5’ de cada sequência (por exemplo, 3-72 é VH3-72 humana). Os segmentos gênicos JH de cada CDR3 da cadeia pesada são observados dentro de parênteses na extremidade 3’ de cada sequência (por exemplo, 3 é JH3 humano). As SEQ ID NOs para cada sequência mostrada está prosseguindo como se segue de cima para baixo: SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39.

[00105] A FIG. 7B mostra sequências de CDR3 da cadeia leve representativas de anticorpos VelocImmune® randomicamente selecionadas em torno da ligação VK-JK (CDR3), demonstrando adições juncionais e diversidade de nucleotídeos. Os segmentos gênicos VK de cada cadeia leve a sequência de CDR3 é observada dentro do parêntese na extremidade 5’ de cada sequência (por exemplo, 1-6 é Vk1-6 humano). Os segmentos gênicos Jk para cada CDR3 da cadeia leve são observados dentro de parênteses na extremidade 3’ de cada sequência (por exemplo, 1 é Jk1 humano). As SEQ ID NOs de cada sequência mostrada está prosseguindo como se segue de cima para baixo: SEQ ID NO:40; SEQ ID NO:41; SEQ ID NO:42; SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:51; SEQ ID NO:52; SEQ ID NO:53; SEQ ID NO:54; SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; SEQ ID NO:57; SEQ ID NO:58.

[00106] A FIG. 8 mostra frequências de hipermutação somática das cadeias pesadas e leves de anticorpos VelocImmune® marcados (após alinhamento a sequências de linhagem germinativa correspondentes) como porcentagem de sequências modificadas em cada posição de nu- cleotídeo (NT; coluna esquerda) ou aminoácido (AA; coluna direita) entre conjuntos de 38 sequências (IgM não imunizados), 28 (IgG não imunizados), 32 (IgK não imunizados de IgG), 36 (IgG imunizados) ou 36 (IgK não imunizados de IgG). As barras sombreadas indicam as posições de CDRs.

[00107] A FIG. 9A mostra níveis da imunoglobulina sérica de isotipos IgG e IgM em camundongos selvagens (barras abertas) ou Velo- cImmune® (barras fechadas).

[00108] A FIG. 9B mostra níveis da imunoglobulina sérica do isotipo IgA em camundongos selvagens (barras abertas) ou VelocImmune® (barras fechadas).

[00109] A FIG. 9C mostra níveis da imunoglobulina sérica do isotipo IgE em camundongos selvagens (barras abertas) ou VelocImmune® (barras fechadas).

[00110] A FIG. 10A mostra títulos de IgG específica para antígeno contra receptor de interleucina-6 do soro de sete camundongos VELO- CIMMUNE® (VI) e cinco selvagens (WT) após dois (sangria 1) ou três (sangria 2) ciclos de imunização com ectodomínio de receptor de inter- leucina-6.

[00111] A FIG. 10B mostra IgG específica para títulos específicos para o isotipo de anti-receptor de interleucina-6 de sete camundongos VelocImmune® (VI) e cinco selvagens (WT).

[00112] A FIG. 11A mostra a distribuição de afinidade dos anticorpos monoclonais anti-receptor de interleucina-6 gerados em camundongos VelocImmune®.

[00113] A FIG. 11B mostra o bloqueio específico para o antígeno de anticorpos monoclonais do receptor anti-interleucina-6 gerados em camundongos VelocImmune® (VI) e selvagens (WT).

[00114] A FIG. 12 mostra uma ilustração esquemática, não em escala, de genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo no locus da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. Um vetor de direcionamento (Vetor de Direcionamento mADAM6) usado para a inserção de ADAM6a e ADAM6b de camundongo em um locus da cadeia pesada endógena humanizada é mostrado com um cassete de seleção (HYG: higromicina) flanqueado por sítios de recombinação específicos para o sítio (Frt) incluindo sítios de restrição engendrados nas extremidades 5’ e 3’.

[00115] A FIG. 13 mostra uma ilustração esquemática, não em escala, de um pseudogene ADAM6 humano (hADAM6Φ) localizado entre os segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada humana 1-2 (VH1-2) e 6-1 (VH6-1). Um vetor de direcionamento da recombinação homóloga bacteriana (Vetor de Direcionamento hADAM6Φ) para deletar um pseudogene ADAM6 humano e inserir sítios de restrição únicos em um locus da cadeia pesada humana é mostrado com um cassete de seleção (NEO: neomicina) flanqueado por sítios de recombinação específicos para o sítio (loxP) incluindo sítios de restrição engendrados nas extremidades 5’ e 3’. Uma ilustração, não em escala, do locus da cadeia pesada humanizada visado resultante que contém um fragmento genô- mico que codifica genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo incluindo um cassete de seleção flanqueado por sítios de recombinação específicos para o sítio é mostrado.

[00116] A FIG. 14A mostra gráficos de contorno de FACS de linfóci- tos controlados em singletos para expressão superficial de IgM e B220 na medula óssea de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve K humana (H/K) e camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana tendo um fragmento genômico de camundongo inserido compreendendo genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6). A porcentagem de células B imaturas (B220intIgM+) e maduras (B220highIgM+) é observada em cada gráfico de contorno.

[00117] A FIG. 14B mostra o número total de células B imaturas (B220intIgM+) e maduras (B220highIgM+) na medula óssea isolada de fêmures de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve K humana (H/K) e camundongos homozigo- tos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve K humana que têm um fragmento genômico de camundongo ectópico codificação de genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6).

[00118] A FIG. 15A mostra gráficos de contorno de FACS de células B controladas por CD19+ para expressão superficial de c-kit e CD43 na medula óssea de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana (H/k) e camundongos ho- mozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana tendo um fragmento genômico de camundongo ectópico que codifica os genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6). A porcentagem de células pró-B (CD19+CD43+ckit +) e pré-B (CD19+CD43-ckit-) é observada nos quadrantes direito superior e esquerdo inferior, respectivamente, de cada gráfico de contorno.

[00119] A FIG. 15B mostra o número total de células pró-B (CD19+CD43+ckit+) e células pré-B (CD19+CD43-ckit-) na medula óssea isolada de fêmures de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana (H/k) e camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana tendo um fragmento genômico de camundongo ectó- pico compreendendo genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6).

[00120] A FIG. 16A mostra gráficos de contorno de FACS de linfóci- tos controlados por singletos para expressão superficial de CD19 e CD43 na medula óssea de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana (H/k) e camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve K humana que têm um fragmento genômico de camundongo ectópico que codifica os genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6). A porcentagem de células B imaturas (CD19+CD43-), pré-B (CD19+CD43int) e pró-B (CD19+CD43+) é observada em cada gráfico de contorno.

[00121] A FIG. 16B mostra histogramas de células B imaturas (CD19+CD43-) e pré-B (CD19+CD43int) na medula óssea de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana (H/k) e camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana tendo um fragmento genômico de camundongo ectópico que codifica os genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6).

[00122] A FIG. 17A mostra gráficos de contorno de FACS de linfóci- tos controlados por singletos da expressão superficial de CD19 e CD3 em esplenócitos de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana (H/k) e camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana que têm um fragmento genômico de camundongo ectó- pico que codifica os genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6). A porcentagem de células B (CD19+CD3-) e T (CD19-CD3+) é observada em cada gráfico de contorno.

[00123] A FIG. 17B mostra gráficos de contorno de FACs para células B controladas por CD19+ para expressão superficial de cadeia leve de IgÀ e IgK no baço de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana (H/k) e camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana tendo um fragmento genômico de camundongo ectópico que compreende genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6). A porcentagem de células B de IgÀ+ (quadrante esquerdo superior) e Igk- (quadrante direito inferior) é observada em cada gráfico de contorno.

[00124] A FIG. 17C mostra o número total de células B CD19+ no baço de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve K humana (H/K) e camundongos homozigo- tos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve K humana tendo um fragmento genômico de camundongo ectópico compreendendo genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6).

[00125] A FIG. 18A mostra gráficos de contorno de FACs de células B controladas por CD19+ para expressão superficial de IgD e IgM no baço de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana (H/k) e camundongos homozigo- tos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana tendo um fragmento genômico de camundongo ectópico compreendendo genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6). A porcentagem de células B maduras (CD19+IgDhighIgMint) é observada para cada gráfico de contorno. A flecha no gráfico de contorno direito ilustra o processo de maturação de células B em relação à expressão de superfície de IgD e IgM.

[00126] A FIG. 18B mostra o número total de células B no baço de camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana (H/k) e camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve k humana tendo um fragmento genômico de camundongo ectópico que codifica os genes ADAM6 de camundongo (H/k-A6) durante a maturação de CD19+Ig- MhighIgDint a CD19+IgMintIgDhigh.

[00127] A FIG. 19 ilustra uma estratégia de direcionamento para substituir segmentos gênicos de região variável da cadeia leve de imu- noglobulina de camundongo endógena por uma região gênica Vk1- 39Jk5 humana.

[00128] A FIG. 20 ilustra uma estratégia de direcionamento para substituir segmentos gênicos de região variável da cadeia leve de imu- noglobulina de camundongo endógena por uma região gênica VK3- 20JK1 humana.

[00129] A FIG. 21 ilustra uma estratégia de direcionamento para substituir segmentos gênicos de região variável da cadeia leve de imu- noglobulina de camundongo endógena por uma região gênica VpreB/JÀ5 humana.

[00130] A FIG. 22 mostra a porcentagem de células B CD19+ (eixo Y) do sangue periférico de camundongos selvagens (WT), camundongos homozigotos para uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada VK1-39JK5 (VK1-39JK5 HO) e camundongos homozigotos para uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada VK3- 20JK1 (VK3-20JK1 HO).

[00131] A FIG. 23A mostra a expressão de mRNA relativa (eixo Y) de uma cadeia leve derivada de VK1-39 em um ensaio de PCR quantitativa usando sondas específicas para a ligação de uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada de VK1-39JK5 (Sonda de Ligação VK1-39JK5) e do segmento gênico VK1-39 humano (Sonda VK1- 39) em um camundongo homozigoto para uma substituição dos segmentos gênicos VK e JK pelos segmentos gênicos VK e JK (HK), um camundongo selvagem (WT), e um camundongo heterozigoto para uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada Vk1-39Jk5 (Vk1- 39Jk5 HET). Os sinais são normalizados à expressão de Ck de camundongo. N.D.: não detectado.

[00132] A FIG. 23B mostra a expressão de mRNA relativa (eixo Y) de uma cadeia leve derivada de Vk1-39 em um ensaio de PCR quantitativa usando sondas específicas para a ligação de uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada Vk1-39Jk5 (Sonda de Ligação Vk1-39Jk5) e do segmento gênico Vk1-39 humano (Sonda Vk1-39) em um camundongo homozigoto para uma substituição dos segmentos gênicos VK e JK pelos segmentos gênicos VK e JK (HK), um camundongo selvagem (WT), e um camundongo homozigoto para uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada Vk1-39Jk5 (Vk1-39Jk5 HO). Os sinais são normalizados à expressão de Ck de camundongo.

[00133] A FIG. 23C mostra a expressão de mRNA relativa (eixo Y) de uma cadeia leve derivada de Vk3-20 em um ensaio de PCR quantitativa usando sondas específicas para a ligação de uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada Vk3-20Jk1 (Sonda de Ligação de Vk3-20Jk1) e do segmento gênico Vk3-20 humano (Sonda Vk3- 20) em um camundongo homozigoto para uma substituição dos segmentos gênicos Vk e Jk com segmentos gênicos Vk e Jk (Hk), um camundongo selvagem (WT), e um camundongo heterozigoto (HET) e ho- mozigoto (HO) de uma região da cadeia leve humana engendrada rear- ranjada Vk3-20Jk1. Os sinais são normalizados à expressão do Ck de camundongo.

[00134] A FIG. 24A mostra título de IgM (esquerda) e IgG (direita) em camundongos selvagens (WT; N=2) e homozigotos para uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada Vk1-39Jk5 (Vk1-39Jk5 HO; N=2) imunizados com β-galatosidase.

[00135] A FIG. 24B mostra o título de imunoglobulina total (IgM, IgG, IgA) em camundongos selvagens (WT; N=5) e homozigotos para uma região da cadeia leve humana engendrada rearranjada Vk3-20Jk1 (Vk3- 20Jk1 HO; N=5) imunizados com β-galatosidase.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00136] O termo "anticorpo", como usado neste pedido, inclui moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias de polipep- tídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (VH) e uma região constante da cadeia pesada (CH). A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hiper- variabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de arcabouço (FR). Cada VH e VL compreendem três CDRs e quatro FRs, arranjadas do amino-terminal ao carbóxi-ter- minal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (as CDRs da cadeia pesada podem ser abreviadas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; as CDRs da cadeia leve podem ser abreviadas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3. O termo anticorpo de "alta afinidade" refere- se a um anticorpo que tem um KD relativamente ao seu epítopo alvo de aproximadamente 10-9 M ou mais baixo (por exemplo, aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M ou aproximadamente 1 x 10-12 M). Em uma modalidade, KD é medido pela ressonância de plásmons de superfície, por exemplo, BIACORE™; em outra modalidade, KD é medido por ELISA.

[00137] A frase "anticorpo biespecífico" inclui um anticorpo capaz de seletivamente ligar-se a dois ou mais epítopos. Os anticorpos biespecí- ficos geralmente compreendem duas cadeias pesadas não idênticas, com cada cadeia pesada que especificamente se liga a um epítopo diferente - ou em duas moléculas diferentes (por exemplo, epítopos diferentes em dois imunógenos diferentes) ou na mesma molécula (por exemplo, epítopos diferentes no mesmo imunógeno). Se um anticorpo biespecífico for capaz de ligar-se seletivamente a dois epítopos diferentes (um primeiro epítopo e um segundo epítopo), a afinidade da primeira cadeia pesada do primeiro epítopo será geralmente pelo menos uma para duas ou três ou quatro ou mais ordens de grandeza mais baixa do que a afinidade da primeira cadeia pesada do segundo epítopo, e vice- versa. Os epítopos especificamente ligados pelo anticorpo biespecífico podem estar no mesmo alvo ou em um diferente (por exemplo, na mesma proteína ou uma diferente). Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos, por exemplo, combinando cadeias pesadas que reconhecem epítopos diferentes do mesmo imunógeno. Por exemplo, sequências de ácidos nucleicos que codificam sequências variáveis da cadeia pesada que reconhecem epítopos diferentes do mesmo imunógeno podem ser fundidas a sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas regiões constantes da cadeia pesada ou diferentes, e tais sequências podem ser expressas em uma célula que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina. Um anticorpo biespecífico típico tem duas cadeias pesadas cada uma tendo três CDRs da cadeia pesada, seguido por um domínio CH1 (N-terminal ao C-terminal), uma dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3 e uma cadeia leve de imunoglobulina que não confere especificidade de ligação ao epítopo mas que pode estar associada com cada cadeia pesada, ou que pode estar associada com cada cadeia pesada e que pode ligar-se a um ou mais dos epítopos ligados pelas regiões de ligação do epítopo da cadeia pesada, ou que pode estar associada com cada cadeia pesada e permitir ligação ou uma ou ambas das cadeias pesadas a um ou ambos os epítopos.

[00138] O termo "célula" inclui qualquer célula que é adequada para expressar uma sequência de ácidos nucleicos recombinante. As células incluem aquelas de procariotos e eucariotos (célula única ou célula múltipla), células bacterianas (por exemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobactérias, células fúngicas, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetais, células de insetos (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inseto infectadas com baculovírus, Trichoplusia ni, etc.) Células animais não humanas, células humanas ou fusões celulares tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em algumas modalidades, a célula é célula de ser humano, macaco, grande macaco, hamster, rato ou camundongo. Em algumas modalidades, a célula é eu- cariótica e é selecionada das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), célula retiniana, Vero, CV1, renal (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), célula CV-1, U937, 3T3, L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral e uma linhagem celular derivada de uma célula acima mencionada. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula retiniana que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6™).

[00139] A frase "região de determinação de complementaridade," ou o termo "CDR", inclui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucleicos de genes de imunoglobulina de um organismo que normalmente (isto é, em um animal selvagem) aparece entre duas regiões de arcabouço em uma região variável de uma cadeia leve ou uma pesada de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou um receptor de célula T). Uma CDR pode ser codificada, por exemplo, por uma sequência de linhagem germinativa ou uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por uma célula B naive ou uma madura ou uma célula T. Uma CDR pode ser somaticamente mutada (por exemplo, variar de uma sequência codificada na linhagem germinativa de um animal), humanizada e/ou modificada com substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para uma CDR3), as CDRs podem ser codificadas por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências de li-nhagem germinativa) que não são contíguas (por exemplo, em uma sequência de ácidos nucleicos não rearranjada) mas são contíguas em uma sequência de ácidos nucleicos de célula B, por exemplo, como o resultado de splicing ou união das sequências (por exemplo, recombi- nação V-D-J para formar uma CDR3 da cadeia pesada).

[00140] O termo "conservada", quando usado para descrever uma substituição de aminoácido conservativa, inclui a substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido tendo um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não modificará substancialmente as propriedades funcionais de interesse de uma proteína, por exemplo, a capacidade de uma região variável de ligar-se especificamente a um epítopo alvo com uma afinidade desejada. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem cadeias laterais alifáticas como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadeias laterais alifáticas e hidroxilas como serina e treonina; cadeias laterais contendo amida como asparagina e glutamina; cadeias laterais aromáticas como fenilalanina, tirosina e triptofano; cadeias laterais bá-sicas como lisina, arginina e histidina; cadeias laterais acídicas como ácido aspártico e ácido glutâmico; e, cadeias laterais contendo enxofre como cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos con- servativa incluem, por exemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/ti- rosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato e aspara- gina/glutamina. Em algumas modalidades, uma substituição de amino- ácido conservativa pode ser substituição de qualquer resíduo nativo em uma proteína por alanina, como usado em, por exemplo, mutagênese de varredura de alanina. Em algumas modalidades, uma substituição conservativa é feita tendo um valor positivo na matriz de probabilidade de log PAM250 descrita em Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45, por meio deste incorporado por referência. Em algumas modalidades, a substituição é uma substituição moderadamente conservativa em que a substituição tem um valor não negativo na matriz de probabilidade de log PAM250.

[00141] Em algumas modalidades, as posições de resíduo em uma cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina diferenciam-se por uma ou mais substituições de aminoácido conservativas. Em algumas modalidades, as posições de resíduo em uma cadeia leve de imunoglo- bulina ou fragmento funcional desta (por exemplo, um fragmento que permite a expressão e a secreção, por exemplo, de uma célula B) não são idênticas a uma cadeia leve cuja sequência de aminoácidos é listada neste pedido, mas se diferencia por uma ou mais substituições de aminoácido conservativas.

[00142] A frase "proteína de ligação ao epítopo" inclui uma proteína tendo pelo menos uma CDR e é capaz de seletivamente reconhecer um epítopo, por exemplo, é capaz de ligar-se a um epítopo com um KD que é aproximadamente um micromolar ou inferior (por exemplo, um KD que é aproximadamente 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-9 M, 1 x 1010 M, 1 x 10-11 M ou aproximadamente 1 x 10-12 M). As proteínas terapêuticas de ligação ao epítopo (por exemplo, os anticorpos terapêuticos) frequentemente requerem um KD que está na faixa de nanomolar ou de picomolar.

[00143] A frase "fragmento funcional" inclui fragmentos de proteínas de ligação ao epítopo que podem ser expressas, secretadas, e especificamente se ligam a um epítopo com um KD na faixa de micromolar, nanomolar ou picomolar. O reconhecimento específico inclui ter um KD que pelo menos está na faixa de micromolar, na faixa de nanomolar ou na faixa de picomolar.

[00144] O termo "linhagem germinativa" inclui referência a uma sequência de ácidos nucleicos de imunoglobulina em uma célula não somaticamente mutada, por exemplo, uma célula B não somaticamente mutada ou célula hematopoiética ou célula pré-B.

[00145] A frase "cadeia pesada," ou "cadeia pesada de imunoglobu- lina" inclui uma sequência de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer organismo. Os domínios variáveis da cadeia pesada incluem três CDRs da cadeia pesada e quatro regiões FR, a menos que de outra maneira especificado. Os fragmentos de cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs e combinações destas. Uma cadeia pesada típica tem, após o domínio variável (do N-terminal ao C- terminal), um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de especificamente reconhecer um epítopo (por exemplo, reconhecendo o epítopo com um KD na faixa de micromolar, nanomolar, ou picomolar), que é capaz de expressão e secreção de uma célula, e que compreende pelo menos uma CDR.

[00146] O termo "identidade", quando usado com relação à sequência, inclui a identidade como determinada por diversos algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de sequência de aminoácidos e/ou nucleotídeo. Em algumas modalidades descritas neste pedido, a identidade é determinada usando alinhamento ClustalW v. 1.83 (lento) empregando uma penalidade de lacuna aberta de 10,0, uma penalidade de lacuna de extensão 0,1, e usando uma matriz de similaridade Gonnet (MacVector™ 10.0.2, Ma- cVector Inc., 2008). O comprimento das sequências comparadas relativamente à identidade de sequências dependerá das sequências particulares, mas no caso de um domínio constante da cadeia leve, o comprimento deve conter a sequência de comprimento suficiente para se enovelar em um domínio constante da cadeia leve que é capaz de au- toassociação para formar um domínio constante da cadeia leve canônica, por exemplo, capaz de formar duas folhas beta que compreendem fitas beta e capaz de interação com pelo menos um domínio CH1 de um ser humano ou de um camundongo. No caso de um domínio CH1, o comprimento da sequência deve conter sequência de comprimento suficiente para enovelar-se em um domínio CH1 que é capaz de formar duas folhas beta que compreendem fitas beta e capaz de interação com pelo menos um domínio constante da cadeia leve de um camundongo ou um ser humano.

[00147] A frase "molécula de imunoglobulina" inclui duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina. As cadeias pesadas podem ser idênticas ou diferentes, e as cadeias leves podem ser idênticas ou diferentes.

[00148] A frase "cadeia leve" inclui uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina de qualquer organismo, e a menos que de outra maneira especificado inclui cadeias leves K e À e uma VpreB, bem como cadeias leves substitutas. Domínios variáveis da cadeia leve (VL) tipicamente incluem três CDRs da cadeia leve e quatro regiões de arcabouço (FR), a menos que de outra maneira especificado. Geralmente, uma cadeia leve inteira inclui, do terminal amino ao terminal carboxila, um domínio VL que inclui FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e um domínio constante da cadeia leve. As cadeias leves incluem aquelas, por exemplo, que não se ligam seletivamente a um primeiro ou a um segundo epítopo seletivamente ligado pela proteína de ligação ao epítopo na qual aparecem. As cadeias leves também incluem aquelas que se ligam e reconhecem ou auxiliam a cadeia pesada com ligação e reconhecimento de um ou mais epítopos seletivamente ligados pela proteína de ligação ao epítopo na qual aparecem.

[00149] Cadeias leves universais ou cadeias leves comuns, referem- se a cadeias leves produzidas em camundongos como descrito neste pedido, em que os camundongos são altamente restringidos na seleção de segmentos gênicos disponíveis para produzir um domínio variável da cadeia leve. Como resultado, tais camundongos fazem uma cadeia leve derivada, em uma modalidade, de não mais do que um ou dois segmentos V da cadeia leve não rearranjada e não mais do que um ou dois segmentos J da cadeia leve não rearranjada (por exemplo, um V e um J, dois V e um J, um V e dois J, dois V e dois J). Em uma modalidade, não mais do que uma ou duas sequências V/J da cadeia leve rearran- jada, por exemplo, uma sequência VK1-39JK5 humana rearranjada ou uma sequência VK3-20JK1 humana rearranjada. Em várias modalidades, as cadeias leves universais incluem versões somaticamente muta- das (por exemplo, amadurecidas por afinidade).

[00150] A frase "somaticamente mutada" inclui referência a uma sequência de ácidos nucleicos de uma célula B que sofreu troca de classe, em que a sequência de ácidos nucleicos de uma região variável de imu- noglobulina (por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada ou incluindo uma CDR da cadeia pesada ou sequência de FR) na célula B trocada de classe não é idêntica à sequência de ácidos nucleicos na célula B antes da troca de classe, tal como, por exemplo, uma diferença em uma sequência de ácidos nucleicos de CDR ou de arcabouço entre uma célula B que não sofreu troca de classe e uma célula B que sofreu troca de classe. "Somaticamente mutado" inclui referência a sequências de ácidos nucleicos de células B amadurecidas por afinidade que não são idênticas a sequências de região variável de imunoglobulina correspondentes em células B que não são amadurecidas por afinidade (isto é, sequências no genoma de células de linhagem germinativa). A frase "somaticamente mutada" também inclui referência a uma sequência de ácidos nucleicos de região variável de imunoglobulina de uma célula B após exposição da célula B a um epítopo de interesse, em que a sequência de ácidos nucleicos se diferencia da sequência de ácidos nu- cleicos correspondente antes da exposição da célula B ao epítopo de interesse. A frase "somaticamente mutada" refere-se a sequências de anticorpos que foram geradas em um animal, por exemplo, um camundongo tendo sequências de ácidos nucleicos de região variável de imunoglobulina humana, em resposta a um desafio de imunógeno e que resultam dos processos de seleção inerentemente operacionais em tal animal.

[00151] O termo "não rearranjado", com referência a uma sequência de ácidos nucleicos, inclui sequências de ácidos nucleicos que existem na linhagem germinativa de uma célula animal.

[00152] A frase "domínio variável" inclui uma sequência de aminoá- cidos de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina (modificada como desejado) que compreende as seguintes regiões de aminoácido, na sequência do N-terminal ao C-terminal (a menos que de outra maneira indicado): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Camundongos com Loci de Imunoglobulina Humanizados

[00153] O camundongo como um modelo genético foi muito potencializado por tecnologias de transgênicos e de nocaute, que permitiram o estudo dos efeitos da superexpressão direcionada ou deleção de genes específicos. Apesar de todas suas vantagens, o camundongo ainda apresenta obstáculos genéticos que o tornam um modelo imperfeito de doenças humanas e uma plataforma imperfeita para testar produtos terapêuticos humanos ou produzi-los. Em primeiro lugar, embora aproximadamente 99% de genes humanos tenham um homólogo de camundongo (Waterston, R.H., et al. (2002). Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420, 520-562). Produtos terapêuticos potenciais muitas vezes não consegue reagir de forma cruzada, ou reagir inadequadamente de forma cruzada com ortólogos de camundongo dos alvos humanos desejados. Para evitar este problema, os genes alvo selecionados podem ser "humanizados", isto é, o gene de camundongo pode ser eliminado e substituído pela sequência gênica ortóloga humana correspondente (por exemplo, US 6.586.251, US 6.596.541 e US 7.105.348, incorporados neste pedido por referência). Inicialmente, esforços para humanizar genes de camundongo por uma "estratégia" de humanização de nocaute mais cruzamento transgênico transmitido de um camundongo carregando uma deleção (isto é, nocaute) do gene endógeno com um camundongo carregando um transgene humano randomicamente integrado (ver, por exemplo, Bril, W.S., et al. (2006). Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution. Thromb Haemost 95, 341-347; Homanics, G.E., et al. (2006). Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease. BMC Med Genet 7, 33; Jamsai, D., et al. (2006). Um modelo de camundongo transgênico/nocaute de BAC humanizado para HbE/beta-talassemia. Genomics 88 (3):309-15; Pan, Q., et al. (2006). Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma- and CD3gammadelta-deficient mice. Mol Immunol 43, 1741-1750). Mas aqueles esforços foram impedidos por limitações de tamanho; tecnologias de nocaute convencionais não foram suficientes para substituir di-retamente grandes genes de camundongo por suas grandes contrapar- tes genômicas humanas. Uma abordagem franca de substituição homóloga direta, na qual um gene de camundongo endógeno é diretamente substituído pelo gene da contraparte humana na mesma posição genética exata do gene de camundongo (isto é, no locus de camundongo endógeno), é raramente investigado por causa de dificuldades técnicas. Até agora, os esforços na substituição direta envolvida entram em detalhes e procedimentos muito fatigantes, dessa forma limitando o comprimento do material genético que pode ser tratado e a precisão com a qual pode ser manipulado.

[00154] Os transgenes de imunoglobulina humanos exogenamente introduzidos rearranjam-se em células B precursoras em camundongos (Alt, F.W., Blackwell, T.K., e Yancopoulos, G.D. (1985). Immunoglobulin genes in transgenic mice. Trends Genet 1, 231-236). Este achado foi explorado por camundongos de engenharia usando abordagem de nocaute mais transgênico para expressar anticorpos humanos (Green, L.L. et al. (1994). Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat Genet 7, 1321; Lonberg, N. (2005). Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23, 1117-1125; Lonberg, N., et al. (1994). Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 368, 856-859; Jakobovits, A., et al. (2007). From Xeno- Mouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice. Nat Biotechnol 25, 1134-1143). Os loci da cadeia pesada e da cadeia leve K de imunoglobulina de camundongo endógenos foram inativados nestes camundongos pela deleção direcionadas de pequenas porções mas críticas de cada locus endógeno, se-guido pela introdução de loci gênicos de imunoglobulina humana como grandes transgenes integrados randomicamente, como descrito acima, ou minicromossomos (Tomizuka, K., et al. (2000). Double trans-chromo- somic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 722-727). Tais camundongos representaram um avanço importante na engenharia genética; anticorpos monoclonais totalmente humanos isolados deles produziram promessa de potenciais produtos terapêuticos para tratar uma variedade de doenças humanas (Gibson, T.B., et al. (2006). Randomized phase III trial results of panitumumab, a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer. Clin Colorectal Cancer 6, 29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim, Y.H., et al. (2007). Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma. Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005; Maker, A.V., et al. (2005). Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study. Ann Surg Oncol 12, 10051016; McClung, M.R., et al. (2006). Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density. N Engl J Med 354, 821-831). Mas, como discutido acima, estes camundongos exibem desenvolvimento de célula B comprometido e deficiências imunes quando comparados com camundongos selvagens. Tais problemas potencialmente limitam a capacidade dos camundongos de suportar uma resposta humoral vigorosa e, consequentemente, gerar anticorpos totalmente humanos contra alguns antígenos. As deficiências podem ser devido a: (1) funcionalidade ineficiente devido à introdução randômica dos transgenes de imunoglo- bulina humana e expressão incorreta resultante devido a uma falta de elementos de controle a montante e a jusante (Garrett, F.E., et al. (2005). Chromatin architecture near a potential 3' end of the igh locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell deve-lopment and in vivo occupancy at CTCF sites. Mol Cell Biol 25, 15111525; Manis, J.P., et al. (2003). Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region. Mol Immunol 39, 753-760; Pawlitzky, I., et al. (2006). Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking region of the mouse Igh locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A. J Immunol 176, 6839-6851); (2) interações interespécies ineficientes entre domínios constantes humanos e componentes de camundongo do receptor de complexo sinalizador de célula B na superfície celular, que pode prejudicar processos sinalizadores requeridos para maturação, proliferação e sobrevivência normais de células B (Hombach, J., et al. (1990). Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class. Nature 343, 760-762); e (3) interações interespécies ine-ficientes entre imunoglobulinas humanas solúveis e receptores de Fc de camundongo que poderiam reduzir a seleção por afinidade (Rao, S.P., et al. (2002). Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B cells. J Immunol 169, 1859-1868) e concentrações séricas de imunoglobulina (Brambell, F.W., et al. (1964). A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism. Nature 203, 1352-1354; Junghans, R.P., and Anderson, C.L. (1996). O receptor de proteção para catabolismo de IgG é o receptor de transporte intestinal neonatal contendo beta2-micro- globulina. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm, F., et al. (2006). Antibody-mediated regulation of the immune response. Scand J Immunol 64, 177-184; Nimmerjahn, F., and Ravetch, J.V. (2007). Fc-receptors as regulators of immunity. Adv Immunol 96, 179-204). Estas deficiências podem ser corrigidas pela humanização in situ somente das regiões variáveis dos loci de imunoglobulina de camundongo dentro das suas posições naturais no loci endógeno da cadeia pesada e da leve. Isto resultaria efetivamente em camundongos que produzem anticorpos reversos quiméricos (isto é, V humano: C de camundongo) que seriam capazes de interações e seleção normais com o ambiente de camundongo baseado na retenção de regiões constantes de camundongo. Ainda, tais anticorpos quiméricos reversos são prontamente reformatados em anticorpos totalmente humanos para fins tera-pêuticos.

[00155] Um método de uma grande substituição genética in situ dos genes variáveis de imunoglobulina de linhagem germinativa de camundongo por genes variáveis de imunoglobulina de linhagem germinativa humana ao manter a capacidade dos camundongos de gerar descendência é descrito. Especificamente, a substituição exata de seis megabases de loci gênicos variáveis de imunoglobulina tanto da cadeia pesada de camundongo como da cadeia leve K por suas contrapartes humanas ao deixar regiões constantes de camundongo intactas é descrita. Como resultado, os camundongos foram criados tendo uma substituição exata do seu repertório variável de imunoglobulina de linhagem germi- nativa inteira por sequências variáveis de imunoglobulina de linhagem germinativa humana equivalentes, ao manter as regiões constantes de camundongo. Regiões variáveis humanas são ligadas a regiões constantes de camundongo para formar loci de imunoglobulina de camundongo humano quiméricos que se rearranjam e expressam em níveis fisiologicamente apropriados. Os anticorpos expressos são "quimeras reversas", isto é, compreendem sequências de região variável humana e sequências de região constante de camundongo. Estes camundongos tendo regiões variáveis de imunoglobulina humanizadas que expressam anticorpos tendo regiões variáveis humanas e regiões constantes de camundongo são chamados de camundongos humanizados VEL- COIMMUNE®.

[00156] Camundongos humanizados VELCOIMMUNE® exibem um sistema imune humoral totalmente funcional que é essencialmente indistinguível daquele de camundongos selvagens. Exibem populações celulares normais em todos os estágios de desenvolvimento de célula B. Exibem a morfologia de órgão linfoide normal. Sequências de anticorpo de camundongos humanizados VELCOIMMUNE® exibem rear- ranjo de segmento variável normal e hipermutação somática normal. As populações de anticorpo nestes camundongos refletem distribuições de isotipo que resultam de troca de classe normal (por exemplo, troca de cis do isotipo normal). Imunizar camundongos humanizados VEL- COIMMUNE® resulta em respostas humorais robustas que geram uma grande diversidade de anticorpos tendo domínios variáveis de imuno- globulina humana adequados como candidatos terapêuticos. Esta pla-taforma fornece uma fonte abundante de sequências de região variável de imunoglobulina humana amadurecidas por afinidade para produzir anticorpos farmaceuticamente aceitáveis e outras proteínas de ligação ao antígeno.

[00157] É a substituição exata de sequências variáveis de imunoglo- bulina de camundongo com sequências variáveis de imunoglobulina humana que permite a criação dos camundongos humanizados VELO- CIMMUNE®. Mesmo até uma substituição exata de sequências de imu- noglobulina de camundongo endógenas em loci da cadeia pesada e leve por sequências de imunoglobulina humana equivalentes, por engenharia de recombinação sequencial de intervalos muito grandes de sequências de imunoglobulina humana, pode apresentar certos desafios devido à evolução divergente dos loci de imunoglobulina entre o camundongo e o homem. Por exemplo, as sequências intergênicas entremeadas dentro dos loci de imunoglobulina não são idênticas entre camundongos e seres humanos e, em algumas circunstâncias, podem não ser funcionalmente equivalentes. As diferenças entre camundongos e seres humanos nos seus loci de imunoglobulina podem ainda resultar em anormalidades em camundongos humanizados, particularmente ao humanizar ou manipular certas porções dos loci da cadeia pesada da imu- noglobulina de camundongo endógena. Algumas modificações nos loci da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo são deletérias. As modificações deletérias podem incluir, por exemplo, perda da capacidade dos camundongos modificados de se acasalarem e produzir descendência.

[00158] Uma substituição in situ exata, em larga escala de seis megabases das regiões variáveis dos loci de imunoglobulina da cadeia pesada e leve de camundongo (VH-DH-JH e VK-JK) com as 1,4 megabases de sequências genômicas humanas correspondentes foi realizada, ao deixar as sequências de camundongo flanqueadoras intactas e funcionais dentro dos loci híbridos, incluindo todos os genes da cadeia constante de camundongo e regiões de controle transcricionais do locus (Figura 1). Especificamente, as sequências gênicas humanas VH, DH, JH, Vk e Jk foram introduzidas através da inserção gradual de 13 vetores de direcionamento BAC quiméricos carregando fragmentos de sobreposição dos loci variáveis de linhagem germinativa humana em células ES de camundongo usando tecnologia de engenharia genética VELOCI- GENE® (ver, por exemplo, Pat. US No. 6.586.251 e Valenzuela, D.M., et al. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652659).

[00159] A humanização dos genes de imunoglobulina de camundongo representa a maior modificação genética ao genoma de camundongo até agora. Embora os esforços prévios com transgenes de imu- noglobulina humana randomicamente integrados encontraram algum êxito (discutido acima), a substituição direta dos genes de imunoglobu- lina de camundongo por suas contrapartes humanas aumenta dramaticamente a eficiência com a qual os anticorpos totalmente humanos podem ser eficientemente gerados em camundongos normais de outra maneira. Ainda, tais camundongos exibem uma diversidade dramaticamente aumentada de anticorpos totalmente humanos que podem ser obtidos após imunização com virtualmente qualquer antígeno, quando comparados com camundongos carregando loci endógenos desativados e transgenes de anticorpo totalmente humano. Múltiplas versões de loci substituídos, humanizados, exibem níveis completamente normais de células B maduras e imaturas, em contraste com camundongos com transgenes humanos randomicamente integrados, que exibem populações de células B significativamente reduzidas em vários estágios de diferenciação. Embora os esforços de aumentar o número de segmentos gênicos humanos em camundongos transgênicos humanos tenham reduzido tais defeitos, os repertórios de imunoglobulina expandidos não corrigiram completamente as reduções de populações de células B quando comparados com camundongos selvagens.

[00160] No entanto, a função imune humoral selvagem próxima observada em camundongos com loci de imunoglobulina substituídos, há outros desafios encontrados ao empregar uma substituição direta da imunoglobulina que não é encontrada em algumas abordagens que empregam transgenes randomicamente integrados. As diferenças na composição genética dos loci de imunoglobulina entre camundongos e seres humanos têm levado à descoberta de sequências benéficas para a propagação de camundongos com segmentos gênicos de imunoglobu- lina substituídos. Especificamente, genes ADAM de camundongo localizados dentro do locus de imunoglobulina endógeno está presente otimamente em camundongos com loci de imunoglobulina substituídos, devido ao seu papel na fertilidade.

Posição Genômica e Função de ADAM6 de Camundongo

[00161] Os camundongos machos sem a capacidade de expressar qualquer proteína ADAM6 funcional exibem um defeito severo na capacidade dos camundongos de acasalar e gerar descendência. Os camundongos sem a capacidade de expressar uma proteína ADAM6 funcional em virtude de uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos da região variável de imunoglobulina de camundongo por segmentos gênicos de região variável humana. A perda da função de ADAM6 acontece porque o locus ADAM6 está localizado dentro de uma região de locus gênico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógena, proximal à extremidade 3’ do locus de segmento gênico VH que está a montante dos segmentos gênicos DH. A fim de criar camundongos que são homozigotos para uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada de camundongo endógena por segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada humana, é geralmente uma abordagem trabalhosa estabelecer machos e fêmeas que são cada um ho- mozigoto para a substituição e esperar uma cópula reprodutiva. Ninhadas bem sucedidas são relativamente raras, e o tamanho da ninhada médio é muito baixo. Em vez disso, machos heterozigotos para substituição foram empregados para se acasalarem com fêmeas homozigotas para substituição para gerar progênie que são heterozigotos para a substituição, em seguida reproduzem um camundongo homozigoto a partir deste. Os inventores determinaram que a causa provável da perda em fertilidade nos camundongos machos é a ausência nos camundongos machos homozigotos de uma proteína ADAM6 funcional.

[00162] A proteína ADAM6 é membro da família ADAM de proteínas, onde ADAM é um acrônimo de Desintegrina A e Metaloprotease. A família ADAM de proteínas é grande e diversa, com funções diversas. Alguns membros da família ADAM estão envolvidos em espermatogênese e fertilização. Por exemplo, ADAM2 codifica uma subunidade da proteína fertilina, que está envolvida em interações de esperma-óvulo. ADAM3 ou ciritestina, parece necessária para a ligação de esperma à zona pelúcida. A ausência de ADAM2 ou de ADAM3 resulta em infertilidade. Foi postulado que ADAM2, ADAM3 e ADAM6 formam um complexo na superfície de células de esperma de camundongo.

[00163] O gene ADAM6 humano, normalmente encontrado entre os segmentos gênicos VH humanos VH1-2 e VH6-1, parece ser um pseudogene (Figura 12). Em camundongos, há dois genes - ADAM6 e ADAM6a - que são encontrados em uma região intergênica entre os segmentos gênicos VH e DH de camundongo, e no camundongo, os genes a e b de são orientados em uma orientação transcricional em oposição àquela da orientação de transcrição dos segmentos gênicos de imunoglobulina circundantes (Figura 11). Em camundongos, um locus ADAM6 funcional é aparentemente requerido para fertilização normal. Um locus ou sequência ADAM6 funcional, então, refere-se a um locus ou sequência ADAM6 que pode complementar, ou resgatar, a fertilização drasticamente reduzida exibida em camundongos machos com a ausência de loci ADAM6 endógenos ou que estejam danificados.

[00164] A posição da sequência intergênica em camundongos que codifica ADAM6a e ADAM6b torna a sequência intergênica suscetível à modificação ao modificar uma cadeia pesada de camundongo endógena. Quando os segmentos gênicos VH são deletados ou substituídos, ou quando os segmentos gênicos DH são deletados ou substituídos, há uma alta probabilidade de que um camundongo resultante exibirá um déficit severo na fertilidade. A fim de compensar o déficit, o camundongo é modificado para incluir uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína que completará a perda na atividade de ADAM6 devido a uma modificação do locus ADAM6 endógeno de camundongo. Em várias modalidades, a sequência nucleotídica que completa é aquela que codifica uma ADAM6a de camundongo, uma ADAM6b de camundongo, ou um homólogo ou ortólogo ou fragmento funcional destas que resgatam o déficit de fertilidade.

[00165] A sequência nucleotídica que resgata a fertilidade pode ser colocada em qualquer posição adequada. Pode ser colocada na região intergênica, ou em qualquer posição adequada no genoma (isto é, ec- topicamente). Em uma modalidade, a sequência nucleotídica pode ser introduzida em um transgene que randomicamente se integra no ge- noma de camundongo. Em uma modalidade, a sequência pode ser mantida epissomalmente, isto é, em um ácido nucleico separado em vez de em um cromossomo de camundongo. As posições adequadas incluem posições que são transcricionalmente permissivas ou ativas, por exemplo, um locus ROSA26.

[00166] O termo "ectópico" é destinado a incluir um deslocamento ou colocação em uma posição que não é normalmente encontrada na natureza (por exemplo, a colocação de uma sequência de ácidos nucleicos em uma posição que não é a mesma posição que a sequência de ácidos nucleicos que é encontrada em um camundongo selvagem). O termo em várias modalidades é usado no tocante ao seu objeto que está fora de sua posição normal ou apropriada. Por exemplo, a frase "uma sequência nucleotídica ectópica que codifica..." refere-se a uma sequência nucleotídica que aparece em uma posição na qual não é normalmente encontrada no camundongo. Por exemplo, em caso de uma sequência nucleotídica ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo (ou um ortólogo ou homólogo ou fragmento desta que fornece o mesmo benefício de fertilidade ou similar em camundongos machos), a sequência pode ser colocada em uma posição diferente no ge- noma do camundongo do que é normalmente encontrada em um camundongo selvagem. Um homólogo funcional ou ortólogo de ADAM6 de camundongo é uma sequência que confere um resgate da perda de fertilidade (por exemplo, a perda da capacidade de um camundongo macho de gerar descendência por acasalamento) que é observado em um camundongo ADAM6-/-. Homólogos ou ortólogos funcionais incluem proteínas que têm identidade de pelo menos aproximadamente 89% ou mais, por exemplo, identidade de até 99%, à sequência de aminoácidos de ADAM6a e/ou à sequência de aminoácidos de ADAM6b, e que pode complementar ou resgatar a capacidade de acasalar com sucesso, de um camundongo que tem um genótipo que inclui uma deleção ou nocaute de ADAM6a e/ou ADAM6b.

[00167] A posição ectópica pode ser em qualquer lugar (por exemplo, como com a inserção randômica de um transgene contendo uma sequência ADAM6 de camundongo), ou pode ser, por exemplo, em uma posição que se aproxima (mas não é precisamente a mesma como) de sua posição em um camundongo selvagem (por exemplo, em um locus de imunoglobulina de camundongo endógeno modificado, mas a montante ou a jusante da sua posição natural, por exemplo, dentro de um locus de imunoglobulina modificado mas entre segmentos gênicos diferentes, ou em uma posição diferente em uma sequência intergênica V- D de camundongo). Um exemplo de uma colocação ectópica é colocação dentro de um locus da cadeia pesada de imunoglobulina hu-manizada. Por exemplo, um camundongo compreendendo uma substituição de um ou mais segmentos gênicos VH endógenos por segmentos gênicos VH humanos, em que a substituição remove uma sequência ADAM6 endógena, pode ser engendrado para ter uma sequência ADAM6 de camundongo localizada dentro da sequência que contém os segmentos gênicos VH humanos. A modificação resultante geraria uma sequência ADAM6 (ectópica) de camundongo dentro de uma sequência gênica humana, e a colocação (ectópica) da sequência ADAM6 do camundongo dentro da sequência gênica humana pode se aproximar da posição do pseudogene ADAM6 humano (isto é, entre dois segmentos V) ou pode se aproximar da posição da sequência ADAM6 de camundongo (isto é, dentro da região intergênica V-D).

[00168] Em vários aspectos, os camundongos que compreendem deleções ou substituições do locus de região variável da cadeia pesada endógena ou porções deste podem ser produzidos contendo uma sequência nucleotídica ectópica que codifica uma proteína que confere benefícios de fertilidade similares à ADAM6 de camundongo (por exemplo, um ortólogo ou um homólogo ou um fragmento desta que é funcional em um camundongo macho). A sequência nucleotídica ectópica pode incluir uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína que é um homólogo ou ortólogo de ADAM6 (ou fragmento desta) de uma linhagem de camundongo diferente ou uma espécie diferente, por exemplo, uma espécie de roedor diferente, e que confere um benefício na fertilidade, por exemplo, número de ninhadas aumentado durante um período de tempo determinado e/ou número de filhotes por ninhada au-mentado e/ou a capacidade de uma célula de esperma de um camundongo macho de atravessar um oviduto de camundongo para fertilizar um óvulo de camundongo.

[00169] Em uma modalidade, a ADAM6 é um homólogo ou ortólogo que é pelo menos 89% a 99% idêntica a uma proteína ADAM6 de camundongo (por exemplo, pelo menos 89% a 99% idêntica à ADAM6a de camundongo ou ADAM6b de camundongo). Em uma modalidade, a sequência nucleotídica ectópica codifica uma ou mais proteínas independentemente selecionadas a partir de uma proteína pelo menos 89% idêntica à ADAM6a de camundongo, uma proteína pelo menos 89% idêntica à ADAM6b de camundongo e uma combinação destas. Em uma modalidade, o homólogo ou ortólogo é uma proteína de rato, hamster, camundongo ou porquinho da índia que é ou é modificado para ser aproximadamente 89% ou mais idêntico à ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b de camundongo. Em uma modalidade, o homólogo ou ortó- logo é 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a uma ADAM6a de camundongo e/ou ADAM6b de camundongo.

ADAM6 Ectópica em Camundongos da Cadeia Pesada Humanizada

[00170] Os camundongos que produzem anticorpos humanos têm estado disponíveis já há algum tempo. Embora representem um avanço importante no desenvolvimento de anticorpos terapêuticos humanos, estes camundongos exibem diversas anormalidades significantes que limitam sua utilidade. Por exemplo, exibem o desenvolvimento de célula B comprometido. O desenvolvimento comprometido pode ser devido a uma variedade de diferenças entre os camundongos transgênicos e camundongos selvagens.

[00171] Anticorpos humanos não poderiam interagir otimamente com a célula pré-B de camundongo ou receptores de células B na superfície de células de camundongo que sinalizam para maturação, proliferação ou sobrevivência durante a seleção clonal. Anticorpos totalmente humanos não poderiam interagir otimamente com um sistema de receptor de Fc de camundongo; os camundongos expressam receptores de Fc que não exibem uma correspondência individual com receptores de Fc humanos. Finalmente, vários camundongos que produzem anticorpos totalmente humanos não incluem todas as sequências de camundongo genuínas, por exemplo, elementos potencializadores a jusante e outros elementos de controle de locus, que podem ser requeridos para o de-senvolvimento de célula B selvagem.

[00172] Os camundongos que produzem anticorpos totalmente humanos geralmente compreendem loci de imunoglobulina endógenos que estão desativados de algum modo e transgenes humanos que compreendem segmentos gênicos de imunoglobulina variáveis e constantes são introduzidos em uma posição randômica no genoma de camundongo. Enquanto o locus endógeno é suficientemente desativado para não rearranjar segmentos gênicos para formar um gene de imunoglobu- lina funcional, a meta de produzir anticorpos totalmente humanos em tal camundongo pode ser alcançada - embora com o desenvolvimento de célula B comprometido.

[00173] Embora compelido a produzir anticorpos totalmente humanos do locus de transgene humano, a geração de anticorpos humanos em um camundongo é aparentemente um processo não favorecido. Em alguns camundongos, o processo não é favorecido de modo a resultar na formação de cadeias pesadas constantes de camundongo / variáveis humanas quiméricas (mas não cadeias leves) pelo mecanismo de trans- troca. Por este mecanismo, os transcritos que codificam anticorpos totalmente humanos passam por troca de isotipo em trans do isotipo humano a um isotipo de camundongo. O processo está em trans, porque o transgene totalmente humano está localizado à parte do locus endógeno que conserva uma cópia não danificada de um gene de região constante da cadeia pesada de camundongo. Embora em tal trans-troca de camundongos seja prontamente aparente o fenômeno ainda é insuficiente para resgatar o desenvolvimento de célula B, que permanece francamente prejudicado. Em todo caso, os anticorpos trans-trocados produzidos em tais camundongos conservam cadeias leves totalmente humanas, uma vez que o fenômeno de trans-troca aparentemente não ocorre relativamente em cadeias leves; a trans-troca presumivelmente depende de sequências de troca em loci endógenos usados (embora diferentemente) em troca de isotipo normal em cis. Dessa forma, mesmo quando camundongos engendrados para produzir anticorpos totalmente humanos selecionam um mecanismo de trans-troca para produzir anticorpos com regiões constantes de camundongo, a estratégia ainda é insuficiente para resgatar o desenvolvimento de célula B normal.

[00174] Uma preocupação primária na criação de produtos terapêuticos humanos baseados em anticorpo está fazendo uma diversidade suficientemente grande de sequências de região variável de imunoglo- bulina humana para identificar domínios variáveis úteis que especificamente reconhecem epítopos particulares e se ligam a eles com uma afinidade desejável, normalmente - mas não sempre - com alta afinidade. Antes do desenvolvimento de camundongos humanizados VELO- CIMMUNE®, não houve nenhuma indicação que camundongos que expressam regiões variáveis humanas com as regiões constantes de camundongo exibiriam qualquer diferença significante de camundongos que produziram anticorpos humanos de um transgene. Aquela suposição, entretanto, foi incorreta.

[00175] Camundongos humanizados VELOCIMMUNE®, que contêm uma substituição exata de regiões variáveis de imunoglobulina de camundongo com regiões variáveis de imunoglobulina humana nos loci de camundongo endógenos, exibem uma surpreendente e notável similaridade com camundongos selvagens relativamente ao desenvolvimento de célula B. Em um surpreendente e atordoante desenvolvimento, camundongos humanizados VELOCIMMUNE® exibiram uma resposta essencialmente normal, selvagem, à imunização que somente se diferenciou em uma circunstância significante de camundongos selvagens - as regiões variáveis geradas em resposta à imunização são totalmente humanas.

[00176] Camundongos humanizados VELOCIMMUNE® contêm uma substituição exata, de larga escala, de regiões variáveis de linhagem germinativa da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo (IgH) e cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, cadeia leve K, IgK) com regiões variáveis de imunoglobulina humana correspondentes, nos loci endógenos. Em total, aproximadamente seis megabases de loci de camundongo são substituídas por aproximadamente 1,4 megabases da sequência genômica humana. Esta substituição exata resulta em um camundongo com loci de imunoglobulina híbridos que produzem cadeias pesadas e leves que têm regiões variáveis humanas e uma região constante de camundongo. A substituição exata de segmentos de camundongo VH-DH-JH e Vk-Jk deixam sequências flanqueadoras de camundongo intactas e funcionais nos loci de imunoglobulina híbridos. O sistema imune humoral do camundongo funciona como de um camundongo selvagem. Desenvolvimento de célula B é desimpedido em qualquer circunstância significante e uma rica diversidade de regiões variáveis humanas é gerada no camundongo no desafio de antígeno.

[00177] Camundongos humanizados VELOCIMMUNE® são possíveis porque os segmentos gênicos de imunoglobulina de cadeias pesadas e leves k se rearranjam similarmente em seres humanos e camundongos, que não é dizer que seus loci são os mesmos ou mesmo quase portanto claramente não são. Entretanto, os loci são bastante similares que a humanização do locus gênico variável da cadeia pesada pode ser realizada substituindo aproximadamente 3 milhões de pares de base da sequência de camundongo contígua que contém todos os segmentos gênicos VH, DH e JH com aproximadamente 1 milhão de bases da sequência genômica humana contígua que cobre basicamente a sequência equivalente de um locus de imunoglobulina humana.

[00178] Em algumas modalidades, substituição adicional de certas sequências gênicas da região constante de camundongo com sequências gênicas humanas (por exemplo, substituição da sequência CH1 de camundongo pela sequência CH1 humana e substituição da sequência CL de camundongo pela sequência CL humana) resultam em camundongos com loci de imunoglobulina híbridos que produzem anticorpos que têm regiões variáveis humanas e regiões constantes parcialmente humanas, adequadas, por exemplo, para produção de fragmentos de anticorpo totalmente humanos, por exemplo, Fab totalmente humano. Os camundongos com loci de imunoglobulina híbridos exibem rearranjo de segmento gênico variável normal, hipermutação somática normal e troca de classe normal. Estes camundongos exibem um sistema imune humoral que é indistinguível de camundongos selvagens, e exibem populações celulares normais em todos os estágios de desenvolvimento de célula B e estruturas de órgão linfoides normais - mesmo onde os camundongos sem um repertório completo de segmentos gênicos de região variável humana. A imunização destes camundongos resulta em respostas humorais robustas que exibem uma larga diversidade do uso de segmento gênico variável.

[00179] A substituição exata de segmentos gênicos da região variável de linhagem germinativa de camundongo permite criação de camundongos que têm loci de imunoglobulina parcialmente humanos. Como os loci de imunoglobulina parcialmente humanos se rearranjam, se hi- pertransformam, e trocam de classe normalmente, os loci de imunoglo- bulina parcialmente humanos geram anticorpos em um camundongo que compreendem regiões variáveis humanas. As sequências nucleotí- dicas que codificam as regiões variáveis podem ser identificadas e clo- nadas, em seguida fundidas (por exemplo, em um sistema in vitro) com qualquer sequência da escolha, por exemplo, qualquer isotipo de imu- noglobulina adequado para um uso particular, resultando em um anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno derivada inteiramente de sequências humanas.

[00180] A humanização em larga escala por métodos de engenharia de recombinação foi usada para modificar células-tronco embrionárias (ES) de camundongo para substituir precisamente até 3 megabases do locus de imunoglobulina da cadeia pesada de camundongo que incluiu essencialmente todos os segmentos gênicos VH, DH e JH de camundongo com segmentos gênicos humanos equivalentes com até uma sequência genômica humana de 1 megabase contendo alguns ou essencialmente todos os segmentos gênicos VH, DH e JH humanos. Até um segmento de 0,5 megabase do genoma humano compreendendo uma de duas repetições que codificam essencialmente todos os segmentos gênicos VK e JK foi usado para substituir um segmento de 3 megabases do locus da cadeia leve K da imunoglobulina de camundongo contendo essencialmente todos os segmentos gênicos camundongo Vk e Jk.

[00181] Os camundongos com tais loci de imunoglobulina substituídos podem compreender uma perturbação ou deleção do locus ADAM6 endógeno de camundongo, que é normalmente encontrado entre a maior parte do segmento gênico VH 3’ e a maior parte do segmento gê- nico 5’ DH no locus da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. A perturbação nesta região pode levar a redução ou eliminação da funcionalidade do locus ADAM6 endógeno de camundongo. Se a maior parte dos segmentos gênicos 3’ VH do repertório da cadeia pesada humana forem usados em uma substituição, uma região intergê- nica que contém um pseudogene que parece ser um pseudogene ADAM6 humano está presente entre estes segmentos gênicos VH, isto é, entre VH1-2 e VH1-6 humano. Entretanto, os camundongos machos que compreendem esta sequência intergênica humana exibem pouca ou nenhuma fertilidade.

[00182] Os camundongos são descritos compreendendo os loci substituídos como descrito acima, e que também compreendem uma sequência de ácidos nucleicos ectópica que codifica uma ADAM6 de camundongo, onde os camundongos exibem fertilidade essencialmente normal. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos ectópica é a SEQ ID NO:3, colocada entre VH1-2 e VH1-6 humano no locus da cadeia pesada de camundongo endógena modificada. A direção da transcrição dos genes ADAM6 da SEQ ID NO:3 é oposta relativamente à direção da transcrição dos segmentos gênicos VH humanos circundantes. Embora os exemplos neste pedido mostrem o resgate da fertilidade colocando a sequência ectópica entre os segmentos gênicos VH humanos indicados, versados reconhecerão que será esperado que a colocação da sequência ectópica em qualquer locus permissivo trans- cricionalmente adequado no genoma de camundongo (ou até extracro- mossomicamente) resgate similarmente a fertilidade em um camundongo macho.

[00183] O fenômeno de complementação de um camundongo sem um locus ADAM6 funcional com uma sequência ectópica que compreende um gene ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste é um método geral que é aplicável ao resgate de qualquer camundongo com loci ADAM6 endógenos não funcionais ou minimamente funcionais. Dessa forma, muitos camundongos que compreendem uma modificação perturbadora de ADAM6 do locus da cadeia pesada de imunoglobulina podem ser resgatados com as composições e métodos da invenção. Consequentemente, a invenção compreende camundongos com uma grande variedade de modificações de loci da cadeia pesada da imunoglobulina que comprometem a função de ADAM6 endógena. Alguns exemplos (não limitantes) são fornecidos nesta descrição. Além de camundongos humanizados VELO- CIMMUNE® descritos, as composições e os métodos relacionados a ADAM6 podem ser usados em muitas aplicações, por exemplo, ao modificar um locus da cadeia pesada em uma grande variedade de formas.

[00184] Em um aspecto, um camundongo é fornecido de forma que compreenda uma sequência ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta), uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH de camundongo por um ou mais segmentos gênicos VH humanos, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos DH de camundongo e segmentos gênicos JH por segmentos gênicos DH humanos e JH humanos; em que o camundongo não tem um CH1 e/ou região de dobradiça. Em uma modalidade, o camundongo produz uma proteína de ligação de domínio variável único que é um dímero de cadeias de imunoglobulina selecionadas a partir de: (a) VH humano - CH1 de camundongo - CH2 de camundongo - CH3 de camundongo; (b) VH humano - dobradiça de camundongo - CH2 de camundongo - CH3 de camundongo; e, (c) VH humano - CH2 de camundongo - CH3decamundongo.

[00185] Em um aspecto, a sequência nucleotídica que resgata a fertilidade é colocada dentro de uma sequência de região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana (por exemplo, entre os segmentos gênicos VH1-2 e VH1-6 humanos) em um camundongo que tem uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo (mVH’s, mDH’s e mJH’s) com um ou mais segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina humana (hVH’s, hDH’s e hJH’s), e o camundongo compreende ainda uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos variáveis da cadeia leve K de imunoglobulina de camundongo (mVK’s, mJK’s) com um ou mais segmentos gênicos variáveis da cadeia leve de imunoglobulina humana k (hVk’s e hJk’s). Em uma modalidade, a sequência nucleotídica é colocada entre um segmento gênico VH1-2 humano e um segmento gênico VH1-6 hu-mano em camundongo humanizado VELOCIMMUNE® (US 6.596.541 e US 7.105.348, incorporado neste pedido por referência). Em uma mo-dalidade, tal camundongo humanizado VELOCIMMUNE® modificado compreende uma substituição por todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina humana (todos os hVH’s, hDH’s e hJH’s) e todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos variáveis da cadeia leve de K imunoglobulina humana (hVK’s e hJK’s).

[00186] Em um aspecto, um locus ADAM6 de camundongo funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional deste) pode ser colocado no meio de segmentos gênicos VH humanos que substituem os segmentos gênicos VH de camundongo endógeno. Em uma modalidade, todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH de camundongo são removidos e substituídos por um ou mais segmentos gênicos VH humanos e o locus ADAM6 de camundongo é colocado imediatamente adjacente à extremidade 3’ dos segmentos gênicos VH humanos, ou entre dois segmentos gênicos VH humanos. Em uma modalidade específica, o locus ADAM6 de camundongo é colocado entre dois segmentos gênicos VH perto do terminal 3’ dos segmentos gênicos VH humanos inseridos. Em uma modalidade específica, a substituição inclui segmentos gênicos VH humanos VH1-2 e VH6-1 e o locus ADAM6 de camundongo é colocado a jusante do segmento gênico VH1-2 e a montante do segmento gênico VH6-1. Em uma modalidade específica, o arranjo de segmentos gênicos VH humanos é então o seguinte (de montante a jusante relativamente à direção da transcrição dos segmentos gênicos VH humanos): VH1-2 humano - locus ADAM6 de camundongo - VH6-1 humano. Em uma modalidade específica, o pseudogene ADAM6 entre VH1-2 humano e VH6-1 humano é substituído pelo locus ADAM6 de camundongo. Em uma modalidade, a orientação de um ou mais de ADAM6a de camundongo e de ADAM6b de camundongo do locus ADAM6 de camundongo é oposta relativamente à direção da transcrição quando comparada com a orientação dos segmentos gêni- cos VH humanos. Alternativamente, o locus ADAM6 de camundongo pode ser colocado na região intergênica entre a maior parte do segmento gênico VH humano 3’ e a maior parte do segmento gênico DH 5’. Isto pode ser o caso se a maior parte do segmento DH 5’ é de camundongo ou humano.

[00187] Similarmente, um camundongo modificado com um ou mais segmentos gênicos VL humanos (por exemplo, segmentos VK ou VÀ) substituindo todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH de camundongo endógenos podem ser modificados para manter o locus ADAM6 endógeno de camundongo, como descrito acima, por exemplo, empregando um vetor de direcionamento que tem um braço de homo- logia a jusante que inclui um locus ADAM6 de camundongo ou fragmento funcional deste, ou substituindo um locus ADAM6 de camundongo danificado por uma sequência ectópica posicionada entre dois segmentos gênicos VL humanos ou entre os segmentos gênicos VL humanos e um segmento gênico DH (ou humano ou de camundongo, por exemplo, VÀ + m/hDH), ou segmento gênico J (ou humano ou camundongo, por exemplo, Vk + JH). Em uma modalidade, a substituição inclui dois ou mais segmentos gênicos VL humanos e o locus ADAM6 de ca-mundongo ou o fragmento funcional deste são colocados entre a maior parte de dois segmentos gênicos 3’ VL. Em uma modalidade específica, o arranjo de segmentos gênicos VL humanos é então o seguinte (de montante a jusante relativamente à direção da transcrição dos segmentos gênicos humanos): VL3’-1 humano - locus ADAM6 de camundongo - VL3’ humano. Em uma modalidade, a orientação de um ou mais de ADAM6a de camundongo e de ADAM6b de camundongo do locus ADAM6 de camundongo é oposta relativamente à direção da transcrição quando comparada com a orientação dos segmentos gênicos VL humanos. Alternativamente, o locus ADAM6 de camundongo pode ser colocado na região intergênica entre a maior parte do segmento gênico VL 3’ humano e a maior parte do segmento gênico DH 5’. Isto pode ser o caso se a maior parte do segmento DH 5’ é de camundongo ou humano.

[00188] Em um aspecto, um camundongo é fornecido com uma substituição de um ou mais segmentos gênicos VH de camundongo endógenos, e que compreende pelo menos um segmento gênico de DH de camundongo endógeno. Em tal camundongo, a modificação dos segmentos gênicos VH de camundongo endógenos podem compreender uma modificação de um ou mais da maior parte dos segmentos gênicos VH 3’, mas não a maior parte do segmento gênico 5’ DH, onde cuidado é tomado para que a modificação de um ou mais da maior parte dos segmentos gênicos VH 3’ não perturbe ou produza o locus ADAM6 endógeno de camundongo não funcional. Por exemplo, em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH de camundongo endógeno por um ou mais segmentos gênicos VH humanos, e o camundongo compreende um ou mais segmentos gênicos DH endógenos e um locus de ADAM6 de camundongo endógeno funcional.

[00189] Em outra modalidade, o camundongo compreende a modificação da maior parte dos segmentos gênicos VH 3’ de camundongo endógenos e uma modificação de um ou mais segmentos gênicos de DH de camundongo endógenos, e a modificação é realizada para manter a integridade do locus ADAM6 endógeno de camundongo até a extensão em que o locus ADAM6 endógeno permanece funcional. Em um exemplo, tal modificação é feita em duas etapas: (1) substituição da maior parte dos segmentos gênicos VH 3’ de camundongo endógenos por um ou mais segmentos gênicos VH humanos que empregam um vetor de direcionamento com um braço de homologia a montante e um braço de homologia a jusante em que o braço de homologia a jusante inclui todo ou uma porção de um locus de ADAM6 de camundongo funcional; (2) então substituição e o segmento gênico DH de camundongo endógeno por um vetor de direcionamento tendo um braço de homologia a montante que inclui todo ou uma porção funcional de um locus ADAM6 de camundongo.

[00190] Em vários aspectos, empregando camundongos que contêm uma sequência ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou um ortólogo ou homólogo ou homólogo funcional desta são úteis onde as modificações perturbam a função de ADAM6 do camundongo endógena. A probabilidade de perturbar a função de ADAM6 de camundongo endógena é alta ao fazer modificações no loci de imuno- globulina de camundongo, em particular ao modificar regiões variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo e sequências circundantes. Por isso, tais camundongos fornecem benefício particular ao produzir camundongos com loci da cadeia pesada de imunoglobulina que são deletados total ou parcialmente, são humanizados total ou parcialmente ou são substituídos (por exemplo, com sequências VK ou VK) total ou parcialmente. Os métodos para produzir as modificações genéticas descritas para os camundongos descritos abaixo são conhecidos pelos versados na técnica.

[00191] Os camundongos contendo uma sequência ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou proteína substancialmente idêntica ou similar que confere os benefícios de fertilidade de uma proteína ADAM6 de camundongo, é particularmente útil em conjunto com modificações para um locus gênico de região variável da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo que perturbam ou de- letam a sequência ADAM6 de camundongo endógena. Embora principalmente descritos com relação a camundongos que expressam anticorpos com regiões variáveis humanas e regiões constantes de camundongo, tais camundongos são úteis com relação a qualquer modificação genética que perturba o gene de ADAM6 endógeno de camundongo. Os versados reconhecerão que isto engloba uma grande variedade de camundongos geneticamente modificados que contêm modificações do locus gênico de região variável da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo. Estes incluem, por exemplo, camundongos com uma de- leção ou uma substituição de todos ou uma porção dos segmentos gê- nicos da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo, apesar de outras modificações. Exemplos não limitantes são descritos abaixo.

[00192] Em alguns aspectos, camundongos geneticamente modificados são fornecidos que compreendem um gene ADAM6 ectópico de camundongo, de roedor ou outro gene ADAM6 (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento) funcional em um camundongo, e um ou mais segmentos gênicos da região variável e/ou constante de imunoglobulina humana.

[00193] Em um aspecto, um camundongo é fornecido de forma que compreenda uma sequência ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH de camundongo por um ou mais segmentos gênicos VH humanos; uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos DH de camundongo por um ou mais segmentos gênicos DH humanos; e uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos JH de camundongo por um ou mais segmentos gênicos JH humanos.

[00194] Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituição de uma sequência nucleotídica CH1 de camundongo por uma sequência nucleotídica CH1 humana. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituição de uma sequência nu- cleotídica de dobradiça de camundongo por uma sequência nucleotídica de dobradiça humana. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituição de um locus variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL e JL) por um locus variável da cadeia leve de imunoglobulina humana. Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda uma substituição de uma sequência nucleotídica de região constante da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo por uma sequência nucleotídica de região constante da cadeia leve de imunoglo- bulina humana. Em uma modalidade específica, VL, JLe CL são sequências da cadeia leve K de imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma sequência de região constante de imunoglobulina de CH2decamundongo e uma de CH3 de camundongo fundidas com uma dobradiça humana e uma sequência CH1 humana, tal que os loci de imunoglobulina de camundongo se rearranjam para formar um gene que codifica uma proteína de ligação compreendendo (a) uma cadeia pesada que tem uma região variável humana, uma região CH1 humana, uma região de dobradiça humana e uma região CH2 decamundongo e uma CH3 de camundongo; e (b) um gene que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende um domínio variável humano e uma região constante humana.

[00195] Em um aspecto, um camundongo é fornecido de forma que compreenda uma sequência ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH de camundongo por um ou mais segmentos gênicos VL humanos, e opcionalmente uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos DH e/ou segmentos gê- nicos JH por um ou mais segmentos gênicos DH humanos e/ou segmentos gênicos JH humanos, ou opcionalmente uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos DH e segmentos gê- nicos JH por um ou mais segmentos gênicos JL humanos.

[00196] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH, DH e JH de camundongo por um ou mais segmentos gênicos VL, um ou mais DH e um ou mais J (por exemplo, JK ou JÀ), em que os segmentos gênicos são operacionalmente ligados a uma região de dobradiça de camundongo endógena, em que o camundongo forma um gene da cadeia de imunoglobulina rearranjado que contém, de 5’ a 3’ na direção da transcrição, VL humano - DH humano ou de camundongo - J humano ou de camundongo - dobradiça de camundongo - CH2decamundongo - CH3 de camundongo. Em uma modalidade, a região J é uma região JK humana. Em uma modalidade, a região J é uma região JH humana. Em uma modalidade, a região J é uma região JÀ humana. Em uma modalidade, a região VL humana é selecionada a partir de uma região VÀ humana e uma região Vk humana.

[00197] Em modalidades específicas, o camundongo expressa um anticorpo de domínio variável único que tem uma região constante de camundongo ou humana e uma região variável derivada de um Vk humano, um DH humano e um Jk humano; um Vk humano, um DH humano e um JH humano; um VÀ humano, um DH humano e um JÀ humano; um VÀ humano, um DH humano e um JH humano; um Vk humano, um DH humano e um JÀ humano; um VÀ humano, um DH humano e um Jk humano. Na modalidade específica, as sequências de reconhecimento de recombinação são modificadas de forma a permitir rearranjos produtivos para ocorrer entre os citados segmentos gênicos V, D e J ou entre os citados segmentos gênicos V e J.

[00198] Em um aspecto, um camundongo é fornecido de forma que compreenda uma sequência ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta), uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH de camundongo por um ou mais segmentos gênicos VL humanos, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos DH e segmentos gênicos JH de camundongo por segmentos gênicos JL humanos; em que o camundongo não tem uma região CH1 e/ou região de dobradiça.

[00199] Em uma modalidade, o camundongo não tem uma sequência que codifica um domínio CH1. Em uma modalidade, o camundongo não tem uma sequência que codifica uma região de dobradiça. Em uma modalidade, o camundongo não tem uma sequência que codifica um domínio CH1 e uma região de dobradiça.

[00200] Em uma modalidade específica, o camundongo expressa uma proteína de ligação que compreende um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina humano (À ou K) fundido a um domínio CH2 de camundongo que é ligado a um domínio CH3 de camundongo.

[00201] Em um aspecto, um camundongo é fornecido de forma que compreenda uma sequência ADAM6 ectópica que codifica uma proteína ADAM6 funcional (ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta), uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos VH de camundongo por um ou mais segmentos gênicos VL humanos, uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos DH e JH de camundongo por segmentos gênicos JL humanos.

[00202] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma dele- ção de uma sequência gênica de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina que codifica uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH1 e uma de dobradiça, ou uma região CH1 e uma região de dobradiça e uma região CH2.

[00203] Em uma modalidade, o camundongo produz uma proteína de ligação de domínio variável único compreendendo um homodímero selecionado do seguinte: (a) VL humano - CH1 de camundongo - CH2 de camundongo - CH3 de camundongo; (b) VL humano - dobradiça de camundongo - CH2 de camundongo - CH3 de camundongo; (c) VL humano - CH2decamundongo - CH3decamundongo.

[00204] Em um aspecto, um camundongo é fornecido com um locus de imunoglobulina da cadeia pesada endógena desativado, compreendendo um locus ADAM6 inválido ou deletado de camundongo endógeno, em que o camundongo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que expressa um anticorpo humano ou de camundongo ou humano/de camundongo ou outro quimérico. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos está presente em um transgene integrado que está integrado randomicamente no genoma de camundongo. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos está em um epis- soma (por exemplo, um cromossomo) não encontrado em um camundongo selvagem.

Cadeia Leve, Comum, ou Universal

[00205] Esforços prévios para produzir proteínas de ligação ao epí- topo multiespecíficas úteis, por exemplo, anticorpos biespecíficos, foram impedidos pela variedade de problemas que frequentemente compartilham um paradigma comum: seleção in vitro ou manipulação de sequências para engendrar racionalmente, ou engendrar por tentativa e erro, um formato adequado para parear uma imunoglobulina humana biespecífica heterodimérica. Infelizmente, a maioria se não todas as abordagens de engenharia in vitro forneceram basicamente correções ad hoc que são adequadas, se em absoluto, para moléculas individuais. Por outro lado, métodos in vivo para empregar organismos complexos para selecionar pareamentos apropriados que são capazes de levar a terapêutica humana não foram realizados.

[00206] Geralmente, sequências de camundongo nativas não são frequentemente uma boa fonte para sequências terapêuticas humanas. Pelo menos por esta razão, geração de regiões variáveis de imunoglo- bulina da cadeia pesada de camundongo que pareiam com uma cadeia leve humana comum é de utilidade prática limitada. Mais esforços de engenharia in vitro seriam despendidos em um processo de tentativa e erro para tentar humanizar sequências variáveis da cadeia pesada de camundongo ao esperar conservar a especificidade de epítopo e a afinidade ao manter a capacidade de acoplar com a cadeia leve humana comum, com resultado incerto. No fim de tal processo, o produto final pode manter um pouco de especificidade e afinidade, e associar-se com a cadeia leve comum, mas enfim a imunogenicidade em um ser humano permaneceria provavelmente um risco muito grande.

[00207] Por isso, um camundongo adequado para produzir produtos terapêuticos humanos incluiria um repertório apropriadamente grande de segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humana no lugar dos segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada de camundongo endógena. Os segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humana devem ser capazes de se rearranjar e recombi- nar com um domínio constante da cadeia pesada de camundongo endógena para formar uma cadeia pesada quimérica reversa (isto é, uma cadeia pesada que compreende um domínio variável humano e uma região constante de camundongo). A cadeia pesada deve ser capaz de troca de classe e hipermutação somática para que um repertório apropriadamente grande de domínios variáveis da cadeia pesada esteja disponível para o camundongo para selecionar aquele que pode associar- se com o repertório limitado de regiões variáveis da cadeia leve hu-mana.

[00208] Um camundongo que seleciona uma cadeia leve comum de uma pluralidade de cadeias pesadas tem uma utilidade prática. Em várias modalidades, anticorpos que expressam em um camundongo que somente pode expressar uma cadeia leve comum terão cadeias pesadas que podem se associar e expressar uma cadeia leve idêntica ou substancialmente idêntica. Isto é particularmente útil na criação de anticorpos biespecíficos. Por exemplo, tal camundongo pode ser imunizado com um primeiro imunógeno para gerar uma célula B que expressa um anticorpo que especificamente se liga a um primeiro epítopo. O camundongo (ou geneticamente um mesmo camundongo) pode ser imunizado com um segundo imunógeno para gerar uma célula B que expressa um anticorpo que especificamente se liga ao segundo epítopo. As regiões pesadas variáveis podem ser clonadas das células B e expressas com a mesma região constante da cadeia pesada e a mesma cadeia leve, e expressas em uma célula para produzir um anticorpo biespecífico, em que o componente da cadeia leve do anticorpo biespecífico foi selecionado por um camundongo para se associar e expressar o componente da cadeia leve.

[00209] Os inventores engendraram um camundongo para gerar cadeias leves de imunoglobulina que se juntarão apropriadamente com uma família bastante diversa de cadeias pesadas, incluindo cadeias pesadas cujas regiões variáveis partem de sequências de linhagem ger- minativa, por exemplo, regiões variáveis amadurecidas por afinidade ou somaticamente mutadas. Em várias modalidades, o camundongo é inventado para parear domínios variáveis da cadeia leve humanas com domínios variáveis da cadeia pesada humana que compreendem mutações somáticas, dessa forma permitindo uma via para proteínas de ligação de alta afinidade adequadas para o uso como produtos terapêuticos humanos.

[00210] O camundongo geneticamente engendrado, por meio do processo longo e complexo de seleção de anticorpo dentro de um organismo, faz escolhas biologicamente apropriadas no pareamento de uma coleção diversa de domínios variáveis da cadeia pesada humana com um número limitado de opções da cadeia leve humana. A fim de alcançar isto, o camundongo é engendrado para apresentar um número limitado de opções de domínio variável da cadeia leve humana em conjunto com uma larga diversidade de opções de domínio variável da cadeia pesada humana. No desafio com um antígeno, o camundongo maximiza o número de soluções no seu repertório para desenvolver um anticorpo para o antígeno, limitado basicamente ou sozinho pelo número ou opções da cadeia leve no seu repertório. Em várias modalidades, isto inclui a permissão do camundongo para realizar mutações somáticas adequadas e compatíveis do domínio variável da cadeia leve que será todavia compatível com uma variedade relativamente grande de domínios variáveis da cadeia pesada humana, incluindo em particular domínios variáveis da cadeia pesada humana somaticamente mutados.

[00211] Para alcançar um repertório limitado de opções da cadeia leve, o camundongo é engendrado para originar não funcional ou substancialmente não funcional sua capacidade de produzir, ou rearranjar, um domínio variável da cadeia leve de camundongo nativa. Isto pode ser alcançado, por exemplo, deletando os segmentos gênicos de região variável da cadeia leve do camundongo. O locus de camundongo endógeno então pode ser modificado por um segmento gênico de região variável da cadeia leve humana exógeno adequado de escolha, operacionalmente ligado ao domínio constante da cadeia leve de camundongo endógena, de uma maneira tal que os segmentos gênicos de região variável humanos exógenos possam se combinar com o gene de região constante da cadeia leve de camundongo endógena e formar um gene da cadeia leve quimérica reversa rearranjada (variável humana, constante de camundongo). Em várias modalidades, a região variável da cadeia leve é capaz de ser somaticamente mutada. Em várias modalidades, para maximizar a capacidade da região variável da cadeia leve de adquirir mutações somáticas, o potencializador(es) apropriado é conservado no camundongo. Por exemplo, na modificação de um locus da cadeia leve K de camundongo para substituir segmentos gênicos da cadeia leve de camundongo endógeno K por segmentos gênicos da cadeia leve k humana, o potencializador intrônico de camundongo k e potencializa- dor de camundongo 3’ k são funcionalmente mantidos ou não perturbados.

[00212] Um camundongo geneticamente engendrado é fornecido de forma que expresse um repertório limitado das cadeias leves reversas quiméricas (variável humana, constante de camundongo) associado a uma diversidade de cadeias pesadas reversas quiméricas (variável humana, constante de camundongo). Em várias modalidades, segmentos gênicos da cadeia leve K de camundongo endógena são deletados e substituídos por uma região da cadeia leve humana simples (ou duas) rearranjada, operacionalmente ligada ao gene Ck de camundongo en-dógeno. Em modalidades para maximizar a hipermutação somática da região da cadeia leve humana rearranjada, o potencializador intrônico de camundongo k e o potencializador de camundongo 3’ k é mantido. Em várias modalidades, o camundongo também compreende um locus da cadeia leve À não funcional ou deleção deste ou uma deleção que origina o locus incapaz de produzir uma cadeia leve À.

[00213] Um camundongo geneticamente engendrado é fornecido de forma que, em várias modalidades, compreenda um locus de região variável da cadeia leve sem segmentos gênicos VL e JL da cadeia leve de camundongo endógena e compreende uma região variável da cadeia leve humana rearranjada, em uma modalidade, uma sequência VL/JL humana rearranjada, operacionalmente ligada a uma região constante de camundongo, em que o locus é capaz de sofrer hipermutação somática, e em que o locus expressa uma cadeia leve que compreende a sequência VL/JL humana ligada a uma região constante de camundongo. Dessa forma, em várias modalidades, o locus compreende um potencializador de camundongo 3’ k, que está correlacionado com nível de hipermutação somática normal, ou selvagem.

[00214] O camundongo geneticamente engendrado em várias modalidades quando imunizado com um antígeno de interesse gera células B que exibem uma diversidade de rearranjos de regiões variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina humana que expressam e funcionam com uma ou com duas cadeias leves rearranjadas, incluindo modalidades onde uma ou duas cadeias leves compreendem regiões variáveis da cadeia leve humana que compreendem, por exemplo, 1 a 5 mutações somáticas. Em várias modalidades, tais cadeias leves humanas expressas são capazes de associação e expressão de qualquer região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana expressa no camundongo.

Proteínas de Ligação ao Epítopo que se Ligam a mais de um Epí- topo

[00215] As composições e os métodos do descrito neste pedido podem ser usados para produzir proteínas de ligação que se ligam a mais de um epítopo com alta afinidade, por exemplo, anticorpos biespecífi- cos. As vantagens da invenção incluem a capacidade de selecionar ligação apropriadamente alta de cadeias de imunoglobulina da cadeia pesada (por exemplo, amadurecidas por afinidade) cada uma das quais se associará com uma cadeia leve única.

[00216] A síntese e a expressão de proteínas de ligação biespecífi- cas foram problemáticas, parcialmente devido a questões associadas com a identificação de uma cadeia leve adequada que possa se associar e expressar duas cadeias pesadas diferentes, e parcialmente devido a questões de isolamento. Os métodos e as composições descritas neste pedido permitem um camundongo geneticamente modificado selecionar, por meio de processos naturais de outra maneira, uma cadeia leve adequada que possa se associar e expressar mais de uma cadeia pesada, incluindo cadeias pesadas que são somaticamente mutadas (por exemplo, amadurecidas por afinidade). Sequências VL e VH humanas de células B adequadas de camundongos imunizados como descrito neste pedido que expressam anticorpos amadurecidos por afinidade tendo cadeias pesadas quiméricas reversas (isto é, variável humana e constante de camundongo) podem ser identificados e clonados na estrutura em um vetor de expressão com uma sequência gênica de região constante humana adequada (por exemplo, uma IgG1 humana). Dois tais construtos podem ser preparados, em que cada construto codifica um domínio variável da cadeia pesada humana que se liga a um epítopo diferente. Um dos VLS humanos (por exemplo, VK1-39JK5 humano ou VK3-20JK1 humano), na sequência de linhagem germinativa ou de uma célula B em que a sequência foi somaticamente mutada, pode ser fundido na estrutura a um gene de região constante humana adequado (por exemplo, um gene constante K humano). Estes três construtos pesados e leves totalmente humanos podem ser colocados em uma célula adequada para expressão. A célula expressará duas espécies principais: uma cadeia pesada homodimérica com a cadeia leve idêntica e uma cadeia pesada heterodimérica com a cadeia leve idêntica. Para permitir uma separação fácil destas espécies principais, uma das cadeias pesadas é modificada para omitir um determinante de ligação de Proteína A, resultando em uma afinidade diferencial de uma proteína de ligação homodimérica de uma proteína de ligação heterodimé- rica. As composições e os métodos que conduzem esta questão são descritos em USSN 12/832.838, depositado em 25 de junho de 2010, intitulado "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format," publicou como US 2010/0331527A1, por meio deste incorporado por referência.

[00217] Em um aspecto, uma proteína de ligação ao epítopo como descrito neste pedido é fornecida, em que as sequências humanas VL e VH são derivadas de camundongos descritos neste pedido que foram imunizados com um antígeno que compreende um epítopo de interesse.

[00218] Em uma modalidade, uma proteína de ligação ao epítopo é fornecida de forma que compreenda um primeiro e um segundo polipep- tídeo, o primeiro polipeptídeo compreendendo, do N-terminal ao C-ter- minal, uma primeira região que se liga ao epítopo que seletivamente se liga a um primeiro epítopo, seguida de uma região constante que compreende uma primeira região CH3 de IgG humana selecionada a partir de IgG1, IgG2, IgG4 e uma combinação destas; e, um segundo polipeptídeo compreendendo, do N-terminal ao C-terminal, uma segunda região que se liga ao epítopo que seletivamente se liga a um segundo epítopo, seguida de uma região constante que compreende uma segunda região CH3 de IgG humana selecionada a partir de IgG1, IgG2, IgG4 e uma combinação destas, em que a segunda região CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina a ligação do segundo domínio CH3 à proteína A.

[00219] Em uma modalidade, a segunda região CH3 compreende uma modificação H95R (pela numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). Em outra modalidade, a segunda região CH3 compreende ainda uma modificação Y96F (IMGT; Y436F por EU).

[00220] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG1 humana modificada, e compreende ainda uma modificação selecionada a partir do grupo consistindo de D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I por EU).

[00221] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG2 humana modificada, e compreende ainda uma modificação selecionada a partir do grupo consistindo de N44S, K52N e V82I (IMGT; N384S, K392N e V422I por EU).

[00222] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG4 humana modificada, e compreende ainda uma modificação selecionada a partir do grupo consistindo de Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I pela EU).

[00223] Um método para produção de uma proteína de ligação ao epítopo que se liga a mais de um epítopo deve imunizar um primeiro camundongo conforme a invenção com um antígeno que compreende um primeiro epítopo de interesse, em que o camundongo compreende um locus de região variável da cadeia leve de imunoglobulina endógena que não contém um VL de camundongo endógeno que é capaz de rear- ranjo e formação de uma cadeia leve, em que no locus de região variável da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo endógena é uma região VL humana rearranjada única operacionalmente ligada ao gene de região constante da cadeia leve endógena de camundongo, e a região VL humana rearranjada é selecionada a partir de um VK1-39JK5 humano e um VK3-20JK1 humano e segmentos gênicos VH de camundongo endógenos foram substituídos total ou parcialmente com segmentos gênicos VH humanos, tal que cadeias pesadas de imunoglobu- lina feitas pelo camundongo são cadeias pesadas unicamente ou substancialmente que compreendem domínios variáveis humanos e domí-nios constantes de camundongo. Quando imunizado, tal camundongo produzirá um anticorpo quimérico reverso, compreendendo somente um de dois domínios variáveis da cadeia leve humana (por exemplo, um de VK1-39JK5 humano ou VK3-20JK1 humano). Uma vez que uma célula B é identificada codificando um VH que se liga ao epítopo de interesse, a sequência nucleotídica de VH (e, opcionalmente, o VL) pode ser recuperada (por exemplo, por PCR) e clonada em um construto de expressão na estrutura com um domínio constante de imunoglobulina humana adequado. Este processo pode ser repetido para identificar um segundo domínio VH que se liga a um segundo epítopo, e uma segunda sequência gênica VH pode ser recuperada e clonada em um vetor de expressão na estrutura para um segundo domínio constante de imunoglobulina adequado. O primeiro e o segundo domínios constantes de imunoglobulina podem ser os mesmos isotipos ou diferentes e um dos domínios constantes de imunoglobulina (mas não o outro) podem ser modificados como descrito neste pedido ou em US 2010/0331527A1, e a proteína de ligação ao epítopo pode ser expressa em uma célula adequada e isolada baseada na sua afinidade diferencial para Proteína A quando comparada a uma proteína homodimérica que se liga ao epítopo, por exemplo, como descrito em US 2010/0331527A1.

[00224] Em uma modalidade, um método para produção de uma proteína biespecífica que se liga ao epítopo é fornecido, compreendendo a identificação de uma primeira sequência nucleotídica VH humana (VH1) amadurecida por afinidade (por exemplo, compreendendo uma ou mais hipermutações somáticas) de um camundongo como descrito neste pedido, identificando uma segunda sequência nucleotídica VH humana (VH2) amadurecido por afinidade (por exemplo, compreendendo uma ou mais hipermutações somáticas) de um camundongo como descrito neste pedido, clonando VH1 na estrutura com uma cadeia pesada humana sem uma modificação de determinante de Proteína A como descrito em US 2010/0331527A1 para formar a cadeia pesada 1 (HC1), clonando VH2 na estrutura com uma cadeia pesada humana que compreende um determinante de Proteína A como descrito em US 2010/0331527A1 para formar a cadeia pesada 2 (HC2), introduzindo um vetor de expressão que compreende HC1 e o mesmo vetor de expressão ou um diferente compreendendo HC2 em uma célula, em que a célula também expressa uma cadeia leve de imunoglobulina humana que compreende um VK1-39 humano/jK5 humano ou um VK3-20 hu- mano/jKl humano fundido a um domínio constante da cadeia leve humana, permitindo a célula expressar uma proteína biespecífica que se liga ao epítopo e compreende um domínio VH codificado por VH1 e um domínio VH codificado por VH2, e isolando a proteína biespecífica que se liga ao epítopo baseada na sua capacidade diferencial de ligar-se à Proteína A quando comparada a uma proteína homodimérica monoes- pecífica que se liga ao epítopo. Em uma modalidade específica, HC1 é uma IgG1, e HC2 é uma IgG1 que compreende a modificação H95R (IMGT; H435R por EU) e compreende ainda a modificação Y96F (IMGT; Y436F por EU). Em uma modalidade, o domínio VH codificado por VH1, o domínio VH codificado por VH2 ou ambos, são somaticamente muta- dos.

Genes VH Humanos que Expressam com um VL Humano Comum

[00225] Uma variedade de regiões variáveis humanas de anticorpos amadurecidos por afinidade originados contra quatro antígenos diferentes foi expressa com sua cadeia leve cognata ou com pelo menos uma de uma cadeia leve humana selecionada a partir de VK1-39JK5 humano, VK3-20JK1 humano ou VpreBJÀ5 humano (ver o Exemplo 10). Para anticorpos para cada um dos antígenos, cadeias pesadas de famílias gê- nicas de alta afinidade somaticamente mutadas diferentes com sucesso parearam com regiões de linhagem germinativa humana rearranjada VK1-39JK5 e VK3-20JK1 e foram secretadas de células que expressam cadeias pesadas e leves. Para VK1-39JK5 e VK3-20JK1, os domínios de VH derivados das seguintes famílias gênicas VH humanas expressaram favoravelmente: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 323, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, e 6-1. Dessa forma, um camundongo que é engendrado para expressar um repertório limitado de domínios VL humanos de um ou ambos de VK1-39JK5 e VK3-20JK1 gerará uma população diversa de domínios VH humanos somaticamente mutados de um locus VH modificado para substituir os segmentos gêni- cos VH de camundongo por segmentos gênicos VH humanos.

[00226] Os camundongos geneticamente engendrados para expressar cadeias pesadas reversas quiméricas (variável humana, constante de camundongo) de imunoglobulina associadas a uma cadeia leve rear- ranjada única (por exemplo, uma VK1-39/J ou uma VK3-20/J), quando imunizados com um antígeno de interesse, geraram células B que compreenderam uma diversidade de rearranjos VH humanos e expressaram uma diversidade de anticorpos específicos de alta afinidade para o antígeno com propriedades diversas relativamente à sua capacidade de bloquear a ligação do antígeno ao seu ligante, e relativamente à sua capacidade de ligar-se a variantes do antígeno (ver os Exemplos 14 até o 15).

[00227] Dessa forma, os camundongos e os métodos descritos neste pedido são úteis em criação e seleção de domínios variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina humana, incluindo domínios variáveis da cadeia pesada humana somaticamente mutados, que resultam de uma diversidade de rearranjos, que exibem uma grande variedade de afinidades (incluindo exposição de um KD de aproximadamente um nanomolar ou menos), uma grande variedade de especificidades (incluindo a ligação a epítopos diferentes do mesmo antígeno), e que se associa e expressa a mesma ou substancialmente a mesma região variável da cadeia leve de imunoglobulina humana.

[00228] Em um aspecto, um primeiro camundongo que compreende um locus de região variável da cadeia pesada humanizada é reproduzido com um segundo camundongo compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um locus da cadeia leve comum, ou universal como descrito neste pedido. Em uma modalidade, o primeiro ou o segundo camundongo compreende uma sequência de ácidos nuclei- cos ectópica que codifica uma ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta. A progênie é produzida para obter camundongos homozigotos para um locus da cadeia pesada humanizada e homozigotos para o locus da cadeia leve universal. Em uma modalidade, o primeiro camundongo ou o segundo camundongo compreende uma modificação de um locus endógeno da cadeia leve de camundongo para fornecer o locus endógeno da cadeia leve de camun-dongo não funcional (por exemplo, uma deleção ou um nocaute, por exemplo, de um locus endógeno À e/ou K). Em uma modalidade, o primeiro camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos V, D e J de camundongo endógenos funcionais por um ou mais segmentos gênicos V, D e J humanos não rearranjados (por exemplo, todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos V, D e J humanos funcionais); e o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos V e J da cadeia leve funcionais sem mais de uma ou não mais do que duas sequências V/J da cadeia leve rearranjadas. Em uma modalidade, o primeiro camundongo compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos ectópica que codifica uma ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos ectópica está em um locus da cadeia pesada da imunoglobulina humanizada.

[00229] Em uma modalidade, camundongos que compreendem a sequência ectópica e que são homozigotos para o locus da cadeia leve universal e para o locus da cadeia pesada humanizada são imunizados com um antígeno de interesse em gerar anticorpos que compreendem uma pluralidade de domínios variáveis humanos somaticamente muta- dos que se associam e expressam uma cadeia leve universal. Em uma modalidade, as sequências de ácidos nucleicos de domínio variável da cadeia pesada humana identificadas no camundongo são empregadas em um sistema de expressão para produzir um anticorpo totalmente humano que compreende o domínio variável da cadeia pesada humana e uma cadeia leve que compreende uma sequência da cadeia leve universal do camundongo.

[00230] Os seguintes exemplos são fornecidos para descrever àqueles versados ordinários na técnica como fazer e usar os métodos e composições da invenção, e não são destinados a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos para assegurar a exatidão relativamente aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais e os desvios devem ser contabilizados. A menos que indicado de outra maneira, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é indicada em Centígrados, e a pressão é a atmosférica ou próxima.

EXEMPLOS Exemplo I Humanização de Genes de Imunoglobulina de Camundongo.

[00231] Cromossomos artificiais bacterianos (BACs) humanos e de camundongo foram usados para engendrar 13 vetores de direcionamento de BAC diferentes (BACvecs) para humanização da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo e loci da cadeia leve K. As tabelas 1 e 2 apresentam descrições detalhadas das etapas realizadas para a construção de todos os BACvecs empregados para a humanização da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo e loci da cadeia leve k, respectivamente.

Identificação de BACs Humanos e de Camundongo.

[00232] BACs de camundongo que transpõem as extremidades 5’ e 3’ da cadeia pesada de imunoglobulina e loci da cadeia leve k foram identificados pela hibridização de filtros marcados com a biblioteca de BAC ou por agrupamentos de DNA de biblioteca de BAC de camundongo de rastreamento por PCR. Os filtros foram hibridizados sob condições padrão usando sondas que corresponderam às regiões de interesse. Os agrupamentos de biblioteca foram rastreados por PCR usando pares de iniciadores únicos que flanqueiam a região visada de interesse. PCR adicional usando os mesmos iniciadores foi realizada para deconvoluir um dado poço e isolar o BAC correspondente de interesse. Tanto os filtros de BAC como os agrupamentos de biblioteca foram gerados de 129 células ES de camundongo SvJ (Incyte Geno- mics/Invitrogen). BACs humanos que cobrem a cadeia pesada de imu- noglobulina inteira e loci da cadeia leve k foram identificados por hibri- dização de filtros marcados com a biblioteca de BAC (bibliotecas Caltech B, C, ou D & biblioteca RPCI-11, Research Genetics/Invitrogen) por meio do rastreamento de agrupamentos de biblioteca de BAC humano (biblioteca Caltech, Invitrogen) por um método baseado em PCR ou usando um banco de dados de sequência de extremidade de BAC (biblioteca Caltech D, TIGR).

Construção de BACvecs (tabelas 1 e 2).

[00233] A recombinação homóloga bacteriana (BHR) foi realizada como descrito (Valenzuela et al., 2003; Zhang, Y., et al. (1998). A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nat Genet 20, 123-128). Na maioria dos casos, os fragmentos lineares foram gerados pela ligação de caixas de homologia derivadas de PCR a cassetes clonados seguidos do isolamento em gel de produtos de ligação e eletroporação em bactérias BHR-competentes que abrigam o BAC alvo. Após seleção por antibióticos apropriados em placas de petri, BACs corretamente recombinados foram identificados por PCR através de ambas as novas ligações seguidas da análise de restrição em géis de campo pulsado (Schwartz, D.C., e Cantor, C.R. (1984) Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. Cell 37, 67-75) e verificação do ponto por PCR usando iniciadores distribuídos através das sequências humanas.

[00234] Um 3hVH BACvec foi construído usando três etapas de BHR sequenciais para a etapa inicial da humanização do locus da cadeia pesada de imunoglobulina (FIG. 4A e a Tabela 1). Na primeira etapa (Etapa 1), um cassete foi introduzido em um BAC parental humano a montante do segmento gênico VH1-3 humano que contém uma região de homologia para o locus da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo (HB1), gene que confere a resistência à canamicina em bactérias e a resistência a G418 em células animais (kanR) e um sítio de recombinação específico para o sítio (por exemplo, loxP). Na segunda etapa (Etapa 2), um segundo cassete foi introduzido somente a jusante do último segmento JH que contém uma segunda região de homologia para o locus da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo (HB2) e um gene que confere resistência em bactérias à espectinomi- cina (specR). Esta segunda etapa incluiu a eliminação de sequências de locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana a jusante de JH6 e o gene de resistência a cloranfenicol do vetor de BAC (cmR). Na terceira etapa (Etapa 3), o BAC humano duplamente modificado (B1) foi então linearizado usando sítios I-CeuI que tinham sido adicionados durante as duas primeiras etapas e se integraram em um BAC de camundongo (B2) por BHR pelas duas regiões de homologia (HB1 e HB2). As seleções de fármaco para a primeira (cm/kan), segunda (spec/kan) e terceira (cm/kan) etapas foram projetadas para serem específicas para os produtos desejados. Os clones de BAC modificados foram analisados pela eletroforese em gel em campo pulsado (PFGE) após digestão com enzimas de restrição para determinar a construção apropriada (FIG. 4B).

[00235] De uma maneira similar, 12 BACvecs adicionais foram engendrados para a humanização dos loci da cadeia pesada e da cadeia leve K. Em alguns exemplos, a ligação de BAC foi realizada em vez de BHR para unir dois grandes BACs pela introdução de sítios de restrição raros em ambos os BACvecs parentais por BHR junto com colocação cuidadosa de marcadores selecionáveis. Isto permitiu sobrevivência do produto de ligação desejado após seleção com combinações de marcadores de fármacos específicas. BACs recombinantes obtidos pela ligação após digestão com enzimas de restrição raras foram identificados e rastreados de uma maneira similar aos obtidos por BHR (como descrito acima).Tabela 1 Tabela 2

Modificação de células-tronco embrionárias (ES) e geração de ca-mundongos.

[00236] Direcionamento da célula ES (F1H4) foi realizado usando método de engenharia genética VelociGene® como descrito (Valenzuela et al., 2003). Derivação de camundongos das células ES modificadas por qualquer blastócito (Valenzuela et al., 2003) ou injeção de 8 células (Poueymirou et al., 2007) foi como descrito. As células ES direcionadas e os camundongos foram confirmados rastreando DNA de células ES ou camundongos com conjuntos únicos de sondas e iniciadores em um ensaio baseado em PCR (por exemplo, FIG. 3A, 3B e 3C). Todos os estudos de camundongo foram vigiados e aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Assistência Animal de Regeneron (IACUC).

Análise de Cariótipo e Hibridização Fluorescente IN SITU (FISH).

[00237] A Análise de cariótipo foi realizada por Repositórios Celulares Coriell (Instituto Coriell para Pesquisa Médica, Camden, NJ). FISH foi realizada em células ES direcionadas como descrito (Valenzuela et al., 2003). Sondas correspondendo ao DNA de BAC de camundongo ou DNA de BAC humano foram marcadas pela tradução nick (Invitrogen) com nucleotídeos dUTP fluorescentemente marcados no espectro laranja ou espectro verde (Vysis).

Locus Gênico Variável da Cadeia Pesada de Imunoglobulina.

[00238] A humanização da região variável do locus da cadeia pesada foi alcançada em nove etapas sequenciais pela substituição direta de apro-ximadamente três milhões de pares de base (Mb) da sequência genômica de camundongo contígua que contém todos os segmentos gênicos VH, DH e JH com aproximadamente um Mb da sequência genômica humana con-tígua que contém os segmentos gênicos humanos equivalentes (FIG. 1A e Tabela 1) usando tecnologia de engenharia genética VELOCIGENE® (ver, por exemplo, Pat. US No. 6.586.251 e Valenzuela et al., 2003).

[00239] O íntron entre segmentos gênicos JH e genes da região constante (o íntron J-C) contém um potencializador transcricional (Neuberger, M.S. (1983) Expression and regulation of immunoglobulin heavy chain gene transfected into lymphoid cells. EMBO J 2, 1373-1378) seguido de uma região de repetições simples requeridas para recombina- ção durante a troca de isotipo (Kataoka, T. et al. (1980) Rearrangement of immunoglobulin gamma 1-chain gene and mechanism for heavychain class switch. Proc Natl Acad Sci U S A 77, 919-923). A ligação entre a região VH-DH-JH humana e a região CH de camundongo (a ligação proximal) foi escolhida para manter o potencializador intrônico da cadeia pesada de camundongo e domínio de troca a fim de conservar tanto a expressão eficiente como a troca de classe do locus da cadeia pesada humanizada dentro do camundongo. A posição de nucleotídeo exata deste e ligações subsequentes em todas as substituições foi pos-sível pelo uso do método de engenharia genética VelociGene® (supra), que empregou recombinação homóloga bacteriana dirigida por oligonu- cleotídeos sintetizados. Dessa forma, a ligação proximal foi colocada aproximadamente 200 bp a jusante do último segmento gênico JH e a ligação distal foi colocada várias centenas a montante da maior parte do segmento gênico 5’ de VH do locus humano e aproximadamente 9 kb a jusante do segmento gênico de camundongo VH1-86, também conhecido como J558.55. O segmento gênico VH1-86 de camundongo (J558.55) é o segmento gênico variável da cadeia pesada mais distal, relatado ser um pseudogene em camundongos C57BL/6, mas potencialmente ativo, embora com uma sequência RSS pobre, no alelo 129 visado. A extremidade distal do locus da cadeia pesada de camundongo reportado pode conter elementos de controle que regulam a expressão de locus e/ou o rearranjo (Pawlitzky et al., 2006).

[00240] Uma primeira inserção da sequência de DNA de imunoglo- bulina humana no camundongo foi alcançada usando 144 kb da extremidade proximal do locus da cadeia pesada humana que contém 3 segmentos gênicos humanos VH, 27 DH e 9 JH inseridos na extremidade proximal do locus IgH de camundongo, com uma deleção concomitante de 16,6 kb da sequência genômica de camundongo, usando aproximadamente 75 kb de braços de homologia de camundongo (Etapa A, FIG. 2A; Tabelas 1 e 3, 3hVH). Esta grande inserção de 144 kb e a deleção concomitante de 16,6 kb foram realizados em uma etapa única (Etapa A) que ocorreu com uma frequência de 0,2% (Tabela 3). As células ES corretamente visadas foram marcadas por um ensaio de sondas de perda de alelo nativo (LONA) (Valenzuela et al., 2003) usando sondas dentro e flanqueando a sequência de camundongo deletada e dentro da sequência humana inserida e a integridade do grande inserto humano foi verificada usando múltiplas sondas que transpõem a inserção inteira (FIG. 3A, 3B e 3C). Como muitos ciclos de direcionamento celular ES sequencial foram esperados, clones de células ES visados nesta, e todas as subsequentes, as etapas foram submetidas à análise cariotípica (supra) e somente aqueles clones que mostram cariótipos normais em pelo menos 17 de 20 extensões foram utilizados para as etapas subsequentes.

[00241] As células ES visadas da Etapa A foram re-visadas com um BACvec que produziu uma deleção de 19 kb na extremidade distal do locus da cadeia pesada (Etapa B, FIG. 2A). O BACvec da Etapa B continha um gene de resistência à higromicina (hyg) em contraste com o gene de resistência à neomicina (neo) contido no BACvec da Etapa A. Os genes de resistência dos dois BACvecs foram projetados tais que, após direcionamento bem sucedido ao mesmo cromossomo, aproximadamente três Mb do locus gênico variável da cadeia pesada de camundongo contendo todos os segmentos gênicos VH de camundongo além de VH1-86 e todos os segmentos gênicos DH além de DQ52, bem como os dois genes de resistência, foram flanqueados de sítios loxP; DQ52 e todos os segmentos gênicos da cadeia JH de camundongo foram dele- tados em clones de célula da Etapa A. Clones de célula ES duplamente visados no mesmo cromossomo foram identificados pela condução do cassete proximal 3hVH à homozigosidade em G418 de alto teor (Mortensen, R.M. et al. (1992) Production of homozygous mutant ES cells with a single targeting construct. Mol Cell Biol 12:2391-2395) e após o destino do cassete de hyg distal. Os segmentos de camundongo até quatro Mb de tamanho, que foi modificado de uma maneira a serem flanqueados por sítios loxP, foram com sucesso deletados em células ES pela expressão transiente de CRE recombinase com altas eficiências (até -11%) mesmo na ausência da seleção por fármaco (Zheng, B., et al. (2000). Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Mol Cell Biol 20:648-655). De uma maneira similar, os inventores alcançaram uma deleção de três Mb em 8% de clones de células ES após expressão de Cre transiente (Etapa C, FIG. 2A; Tabela 3). A deleção foi marcada pelo ensaio de LONA usando sondas em qualquer extremidade da sequência de camundongo deletada, bem como a perda de neo e hyg e a aparência de um produto de pcr através do ponto de deleção que contém o único sítio loxP restante. Ainda, a deleção foi confirmada pela hibridização de fluorescência in situ (dados não mostrados).

[00242] O restante da região variável da cadeia pesada humana foi adicionado ao alelo 3hVH em uma série de 5 etapas usando método de engenharia genética Velocigene® (Etapas E-H, FIG. 2B), com cada etapa envolvendo inserção exata de até 210 kb de sequências gênicas humanas. Para cada etapa, a extremidade proximal de cada novo BACvec foi projetada para ficar sobreposta à maioria das sequências humanas distais da etapa prévia e a extremidade distal de cada novo BACvec continha a mesma região distal da homologia de camundongo como usado na Etapa A. Os BACvecs de etapas D, F e H continham cassetes de seleção neo, ao passo que aqueles das etapas E e G continham cassetes de seleção hyg, dessa forma as seleções foram alternadas entre G418 e higromicina. Direcionamento na Etapa D foi analisado pela perda do produto de pcr único através do sítio loxP distal do Alelo Híbrido 3hVH. Direcionamento para Etapas E até I foi analisado pela perda do cassete de seleção prévio. Na etapa final (Etapa I, FIG. 2B), cassete de seleção neo, flanqueado por sítios Frt (McLeod, M. et al. (1986) Identification of the crossover site during FLP-mediated recombination in the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle. Mol Cell Biol 6, 3357-3367), foi removido pela expressão FLPe transiente (Buchholz, F. et al. (1998) Improved properties of FLP recombinase evolved by cycling mutagenesis. Nat Biotechnol 16, 657-662). As sequências humanas de BACvecs das Etapas D, E e G foram derivadas de dois BACs humanos parentais cada um, ao passo que aquelas dasEtapas F e H foram de BACs únicos. A retenção de sequências humanas foi confirmada em cada etapa usando múltiplas sondas que transpõem as sequências humanas inseridas (como descrito acima, por exemplo, Fig. 3A, 3B e 3C). Somente aqueles clones com cariótipo normal e potencial de linhagem germinativa foram transportados em cada etapa. As células ES da etapa final ainda foram capazes de contribuir para a linhagem germinativa após nove manipulações sequenciais (Tabela 3). Os camundongos homozigotos para cada um dos alelos da cadeia pesada eram viáveis, pareceram saudáveis e demonstraram um sistema imune humoral essencialmente selvagem (ver o Exemplo 3).Tabela 3

Locus Gênico Variável da Cadeia Leve K de Imunoglobulina

[00243] A região variável da cadeia leve K foi humanizada em oito etapas sequenciais pela substituição direta de aproximadamente três Mb da sequência de camundongo que contém todos os segmentos gê- nicos Vk e Jk com aproximadamente 0,5 Mb da sequência humana que contém os segmentos gênicos Vk e Jk de uma maneira similar àquela da cadeia pesada (FIG. 1B; Tabelas 2 e 4).

[00244] A região variável do locus da cadeia leve k humana contém duas repetições de 400 kb quase idênticas separadas por um espaçador de 800 kb (Weichhold, G.M. et al. (1993) The human immunoglobulin kappa locus consists of two copies that are organized in opposite polarity, Genomics 16:503-511). Como as repetições são tão similares, a quase toda a diversidade de locus pode ser reproduzida em camundongos usando repetição proximal. Ainda, um alelo humano natural do locus da cadeia leve K que não tem repetição distal foi relatado (Schaible, G. et al. (1993) The immunoglobulin kappa locus: polymorphism and haplotypes of Caucasoid and non-Caucasoid individuals, Hum Genet 91:261-267). Aproximadamente três Mb da sequência gênica variável da cadeia leve k de camundongo foram substituídos por aproximadamente 0,5 Mb da sequência gênica variável da cadeia leve k humana para substituir efetivamente todos os segmentos gênicos Vk e Jk de camundongo por todos os segmentos gênicos Vk e Jk humanos (FIG. 2C e 2D; Tabelas 2 e 4). Em contraste com o método descrito no Exemplo 1 para o locus da cadeia pesada, a região gênica de Vk inteira de camundongo, contendo todos os segmentos gênicos Vk e Jk, foi deletada em um processo de três etapas antes que qualquer sequência humana fosse adicionada. Em primeiro lugar, o cassete neo foi introduzido na extremidade proximal da região variável (Etapa A, FIG. 2C). Depois, um cassete hyg foi inserido na extremidade distal do locus k (Etapa B, FIG. 2C). Os sítios LoxP foram novamente situados dentro de cada cassete de seleção tal que o tratamento com Cre induziu a deleção de 3 Mb restantes da região Vk de camundongo junto com ambos os genes de resistência (Etapa C, FIG. 2C).

[00245] Um fragmento genômico humano de aproximadamente 480 kb de tamanho que contém a região variável da cadeia leve k de imuno- globulina inteira foi inserido em quatro etapas sequenciais (FIG. 2D; Tabelas 2 e 4), com até 150 kb da sequência da cadeia leve k de imuno- globulina humana inserida em uma etapa única, usando métodos similares aos empregados para a cadeia pesada (ver o Exemplo 1). O gene de resistência à higromicina final foi removido pela expressão FLPe tran-siente. Como com a cadeia pesada, os clones de células ES visados foram avaliados para a integridade do inserto humano inteiro, cariótipo normal e potencial de linhagem germinativa após cada etapa. Os camundongos homozigotos para cada um dos alelos da cadeia da cadeia leve K foram gerados e encontrados ser saudáveis e de aparência normal.Tabela 4

Exemplo II Geração de Camundongos Totalmente Humanizados por Combinação de Múltiplos Alelos de Imunoglobulina Humanizada

[00246] Em vários pontos, células ES que carregam uma porção da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou repertórios variáveis da cadeia leve K como descrito no Exemplo 1 foram microinjetados e os camundongos resultantes criados para criar múltiplas versões de camundongos humanizados VelocImmune® com frações progressivamente maiores dos repertórios de imunoglobulina de linhagem germina- tiva humana (Tabela 5; FIG. 5A e 5B). Camundongos humanizados Ve- locImmune® 1 (V1) possuem 18 segmentos gênicos VH humanos e todos os segmentos gênicos DH e JH humanos combinados com 16 segmentos gênicos VK humanos e todos os segmentos gênicos JK hu-manos. Camundongos humanizados VelocImmune® 2 (V2) e camundongos humanizados VelocImmune® (V3) aumentaram os repertórios variáveis que carregam um total de 39 VH e 30 Vk e 80 VH e 40 Vk respectivamente. Uma vez que as regiões genômicas que codificam os segmentos gênicos VH de camundongo, DH e JH, e os segmentos gêni- cos Vk e Jk, foram completamente substituídos, os anticorpos produzidos por qualquer versão de camundongos humanizados VelocImmune® contêm regiões variáveis humanas ligadas a regiões constantes de camundongo. Os loci da cadeia leve À de camundongo permanecem intactos em todas as versões de camundongos humanizados Velo- cImmune® e servem como um comparador da eficiência da expressão de vários loci da cadeia leve k humanizados VelocImmune®.

[00247] Os camundongos duplamente homozigotos tanto para hu-manizações da cadeia pesada de imunoglobulina como para da cadeia leve k foram gerados de um subconjunto dos alelos descritos no Exemplo 1. Todos os genótipos observados durante o curso do melhoramento para gerar os camundongos duplamente homozigotos ocorreram em proporções aproximadamente mendelianas. A progênie masculina ho- mozigota para cada um dos alelos da cadeia pesada humana mostrou fertilidade reduzida. A fertilidade reduzida resultou da perda da atividade de ADAM6 do camundongo. O locus gênico variável da cadeia pesada de camundongo contém dois genes ADAM6 funcionais introduzidos (ADAM6a e ADAM6b). Durante a humanização do locus gênico variável da cadeia pesada de camundongo, a sequência genômica humana inserida continha um pseudogene ADAM6. ADAM6 de camundongo pode ser requerida para fertilidade, e dessa forma a falta de genes ADAM6 de camundongo em loci gênicos variáveis da cadeia pesada humanizadas poderia levar à fertilidade reduzida nestes camundongos apesar da presença do pseudogene humano. Exemplos 7-9 descrevem a substituição exata dos genes ADAM6 de camundongo deletados de volta em um locus gênico variável da cadeia pesada humanizada e restauração de um nível selvagem da fertilidade em camundongos com um locus de imunoglobulina da cadeia pesada humanizada.Tabela 5

Exemplo III Populações de Linfócitos em Camundongos com Genes de Imuno- globulina Humanizada

[00248] As populações de células B maduras em três versões diferentes de camundongos VelocImmune® foram avaliadas por citometria de fluxo.

[00249] Resumidamente, as suspensões celulares de medula óssea, baço e timo foram feitas usando métodos padrão. As células foram res- suspensas em 5x105 células/mL em tampão de marcação BD Pharmin- gen FACS, bloqueadas com anti-CD16/32 de camundongo (BD Phar- mingen), marcadas com o coquetel apropriado de anticorpos e fixadas com BD CYTOFIX™ todos de acordo com as instruções do fabricante. Os precipitados celulares finais foram ressuspensos em 0,5 mL de tampão de marcação e analisados usando BD FACSCALIBUR™ e o programa CELLQUEST BD Pro™. Todos os anticorpos (BD Pharmingen) foram preparados em uma diluição de massa/coquetel e adicionados a uma concentração final de 0,5 mg/105 de células. Os coquetéis de anticorpo para marcação de medula óssea (A-D) foram como se segue: A: anti-IgMb-FITC de camundongo, anti-IgMa-PE de camundongo, anti- CD45R (B220)-APC de camundongo; B: anti-CD43 (S7)-PE de camun-dongo, anti-CD45R (B220)-APC de camundongo; C: anti-CD24 (HSA)- PE de camundongo; anti-CD45R (B220)-APC de camundongo; D: anti- BP-1-PE de camundongo, anti-CD45R (B220)-APC de camundongo. Os coquetéis de anticorpo para marcação de baço e linfonodo inguinal (EH) foram como se segue: E: anti-IgMb-FITC de camundongo, anti-IgMa- PE de camundongo, anti-CD45R (B220)-APC de camundongo; F: anti- Ig de camundongo, cadeia leve A1, À2, À3-FITC, anti-cadeia leve de IgK de camundongo-PE, anti-CD45R (B220)-APC de camundongo; G: anti- Ly6G/C-FITC de camundongo, anti-CD49b (DX5)-PE de camundongo, anti-CD11b-APC de camundongo; H: anti-CD4 (L3T4)-FITC de camundongo, anti-CD45R (B220)-PE de camundongo, anti-CD8a-APC de camundongo. Os resultados são mostrados na FIG. 6.

[00250] Os linfócitos isolados de baço ou linfonodo de camundongos humanizados homozigotos VelocImmune® foram marcados para a ex-pressão superficial dos marcadores B220 e IgM e analisados usando citometria de fluxo (FIG. 6). Os tamanhos das populações células B ma-duras B220+ IgM+ em todas as versões dos camundongos humanizados VelocImmune® testados foram virtualmente idênticos àqueles de ca-mundongos selvagens, apesar do número de segmentos gênicos VH que continham. Além disso, os camundongos que contêm loci híbridos homozigotos humanizados da cadeia pesada de imunoglobulina, até aqueles com somente 3 segmentos gênicos VH mas loci normal da cadeia leve K de imunoglobulina de camundongo ou camundongos que contêm loci da cadeia leve K híbrido homozigoto humanizado com loci da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo normal, também tinha números normais de células B220+ IgM+ nos seus compartimentos periféricos (não mostrado). Estes resultados indicam que os loci quiméricos com segmentos gênicos variáveis humanos e regiões constantes de camundongo podem povoar totalmente o compartimento de células B maduras. Além disso, o número de segmentos gênicos variáveis nos loci da cadeia pesada ou da cadeia leve K, e dessa forma diversidade teórica do repertório de anticorpo, não está em correlação com a capacidade de gerar populações selvagens de células B maduras. Em contraste, os camundongos com transgenes de imunoglobulina totalmente humanos randomicamente integrados e loci de imunoglobulina de camundongo inativados reduziram números de células B nestes compartimentos, com severidade do déficit dependendo do número de segmentos gênicos variáveis incluídos no transgene (Green, L.L., e Jakobovits, A. (1998) Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes, J Exp Med 188:483-495). Isto demonstra que a estratégia "humanização genética in situ" resulta em um resultado funcional fundamentalmente diferente do que os transgenes randomicamente integrados alcançados na abordagem "nocaute mais transgênico".

Escolha Alélica e Exclusão de Locus.

[00251] A capacidade de manter a exclusão alélica foi examinada em camundongos heterozigotos para versões diferentes do locus da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada.

[00252] A humanização dos loci de imunoglobulina foi realizada em uma linhagem F1 ES (F1H4 (Valenzuela et al., 2003)), derivada de embriões heterozigotos 129S6/SvEvTac e C57BL/6NTac. As sequências gênicas variáveis de linhagem germinativa da cadeia pesada humana são direcionadas ao alelo 129S6, que transporta o haplótipo de IgMa, ao passo que o alelo de camundongo não modificado C576BL/6N suporta o haplótipo de IgMb. Estas formas alélicas de IgM podem ser distinguidas pela citometria de fluxo usando anticorpos específicos para os polimorfismos encontrados nos alelos de IgMb ou IgMa. Como mostrado na FIG. 6 (fila inferior), as células B identificadas em camundongos he- terozigotos para cada versão do locus da cadeia pesada humanizada somente expressam um alelo único, IgMa (alelo humanizado) ou IgMb (alelo selvagem). Isto demonstra que os mecanismos envolvidos na exclusão alélica estão intactos em camundongos humanizados Velo- cImmune®. Além disso, o número relativo de células B positivas para o alelo humanizado (IgMa) é aproximadamente proporcional ao número de segmentos gênico VH presentes. O locus de imunoglobulina humanizado é expresso em aproximadamente 30% das células B em camundongos heterozigotos humanizados VelocImmune® 1, que têm 18 segmentos gênicos VH humanos, e em 50% das células B em camundongos VelocImmune® 2 e 3 (não mostrado) heterozigotos humanizados, com 39 e 80 segmentos gênicos VH humanos, respectivamente. Notavelmente, a proporção de células que expressam o alelo humanizado contra o de camundongo selvagem (0,5 para camundongos humanizados VelocImmune® 1 e 0,9 para camundongos humanizados Velo- cImmune® 2) é maior do que a proporção do número de segmentos gênicos variáveis contidos nos loci humanizados contra selvagens (0,2 para camundongos humanizados VelocImmune® 1 e 0,4 para camundongos humanizados VelocImmune® 2). Isto pode indicar que a probabilidade da escolha de alelo é intermediária entre uma escolha randô- mica de um ou outro cromossomo e uma escolha randômica de qualquer segmento V particular RSS. Além disso, pode haver uma fração de células B, mas não todas, nos quais um alelo fica acessível para recom- binação, completa o processo e fecha a recombinação antes que outro alelo fique acessível. Além disso, a distribuição plana de células que têm IgM superficial (sIgM) derivadas do locus da cadeia pesada híbrido humanizado ou do locus da cadeia pesada de camundongo selvagem é evidência que o locus híbrido está operando em um nível normal. Ao contrário, os transgenes de imunoglobulina humanos randomicamente integrados competem fracamente com loci de imunoglobulina de camundongo selvagem (Bruggemann, M., et al. (1989) A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice. PNAS 86, 6709-6713; Green et al. (1994); Tuaillon, N. et al. (1993) Human immunoglobulin heavy-chain minilocus recombination in transgenic mice: gene-segment use in mu and gamma transcripts, Proc Natl Acad Sci USA 90:3720-3724). Isto ainda demonstra que as imunoglobulinas produzidas por camundongos humanizados VelocImmune® são funcionalmente diferentes do que as produzidas por transgenes randomica- mente integrados em camundongos feitos por abordagens "nocaute mais transgênico".

[00253] Os polimorfismos das regiões CK não estão disponíveis em 129S6 ou C57BL/6N para examinar a exclusão alélica dos loci da cadeia leve k humanizados contra não humanizados. Entretanto, camundongos humanizados VELOCIMMUNE® todos possuem os loci da cadeia leve de camundongo selvagem À, por isso, é possível observar se o rearranjo e a expressão de loci da cadeia leve k humanizados podem prevenir a expressão da cadeia leve À de camundongo. A proporção do número de células que expressam a cadeia leve k humanizada quanto ao número de células que expressam cadeia leve de camundongo À foi relativamente inalterada em camundongos humanizados VelocImmune® comparados com camundongos selvagens, apesar do número de segmentos gênicos Vk humanos inseridos no locus da cadeia leve k (FIG. 6, terceira linha a partir do topo). Além disso não houve nenhum aumento no número de células duplas positivas (k mais À), indicando que a re- combinação produtiva nos loci híbridos da cadeia leve k resulta na supressão apropriada da recombinação dos loci da cadeia leve À de camundongo. Em contraste, os camundongos que contêm transgenes ran- domicamente integrados da cadeia leve k aos loci da cadeia leve À de camundongo inativados - mas loci da cadeia leve À de camundongo selvagem - exibiram proporções À/K dramaticamente aumentadas (Ja- kobovits, 1998), contendo que os transgenes da cadeia leve k introduzidos não funcionam bem em tais camundongos. Isto ainda de-monstra que o resultado funcional diferente observado em imunoglobu- linas feitas por camundongos humanizados VELOCIMMUNE® quando comparados com os feitos por camundongos "nocaute mais transgê- nico".

Desenvolvimento de Célula B.

[00254] Como as populações de células B maduras em camundongos humanizados VelocImmune® parecem-se com aquelas de camundongos selvagens (descrito acima), é possível que os defeitos na primeira diferenciação de célula B sejam compensados pela expansão de populações de células B maduras. Vários estágios da diferenciação de célula B foram examinados pela análise de populações de células B usando citometria de fluxo. A tabela 6 apresenta a proporção da fração de células em cada linhagem de célula B definida por FACs, usando marcadores de superfície celular específicos, em camundongos humanizados VelocImmune® em comparação com elementos da mesma ni- nhagem selvagem.

[00255] O desenvolvimento precoce de célula B ocorre na medula óssea, e estágios diferentes da diferenciação de célula B são caracterizados por modificações em tipos e quantidades da expressão de marcador de superfície celular. Estas diferenças na expressão superficial estão correlacionadas com as modificações moleculares que ocorrem nos loci de imunoglobulina dentro da célula. A transição de célula pró-B à pré-B requer o rearranjo bem sucedido e a expressão da proteína da cadeia pesada funcional, enquanto a transição de pré-B ao estágio B amadurecido é governada pelo rearranjo correto e a expressão de uma cadeia leve K ou À. Dessa forma, a transição ineficiente entre estágios da diferenciação de célula B pode ser detectada por modificações nas populações relativas de células B em um dado estágio.Tabela 6

[00256] Nenhum defeito principal foi observado na diferenciação de célula B em nenhum dos camundongos humanizados VelocImmune®. A introdução de segmentos gênicos da cadeia pesada humana não parece afetar a transição de pró-B para pré-B, e a introdução de segmentos gênicos da cadeia leve K humanas não afeta transição de pré-B à B em camundongos humanizados VelocImmune®. Isto demonstra que moléculas de imunoglobulina "reversas quiméricas" que possuem regiões variáveis humanas e constantes de camundongo funcionam normalmente no contexto de sinalização de célula B e moléculas de coreceptor que conduzem à diferenciação de célula B apropriada em um ambiente de camundongo. Em contraste, o equilíbrio entre as populações diferentes durante a diferenciação de célula B é perturbado até extensões variadas em camundongos que contêm transgenes de imu- noglobulina randomicamente integrados e loci da cadeia pesada endógena inativada ou da cadeia leve k (Green e Jakobovits (1998)).

Exemplo IV Repertório Gênico Variável em Camundongos de Imunoglobulina Humanizada

[00257] O uso de segmentos gênicos variáveis humanos no repertório de anticorpo humanizado de camundongos humanizados Velo- cImmune® foi analisado pela reação de polimerase em cadeia com transcriptase reversa (RT-PCR) de regiões variáveis humanas de múltiplas fontes incluindo células de hibridoma e esplenócitos. A sequência de região variável, o uso de segmento gênico, a hipermutação somática e a diversidade juncional de segmentos gênicos de região variável rearranjados foram determinados.

[00258] Resumidamente, RNA total foi extraído de 1 x 107-2 x 107 esplenócitos ou aproximadamente 104-105 células de hibridoma usando TRIzol™ (Invitrogen) ou Mini Kit Qiagen RNeasy™ (Qiagen) e investi-gadas com iniciadores específicos da região constante de camundongo usando sistema Superscript™ III ONe-Step RT-PCR (Invitrogen). As re-ações foram realizadas com 2-5 μL de RNA de cada amostra usando iniciadores 3’ específicos constantes pareados acima com iniciadores líder agrupados de cada família de regiões variáveis humanas tanto da cadeia pesada como da cadeia leve K, separadamente. Os volumes de reagentes e iniciadores e condições de RT-PCR/PCR foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. As sequências de iniciadores foram baseadas em múltiplas fontes (Wang, X e Stollar, B.D. (2000) Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT- PCR, J Immunol Methods 244:217-225; Ig-primer sets, Novagen). Onde apropriado, reações de PCR secundárias aninhadas foram realizadas com iniciadores de arcabouço específicos para a família agrupados e o mesmo iniciador constante de imunoglobulina de camundongo 3’ específico usado na reação primária. As alíquotas (5 μL) de cada reação foram analisadas por eletroforese em agarose e os produtos de reação foram purificados em agarose usando um Kit de Extração em Gel MONTAGE™ (Millipore). Os produtos purificados foram clonados usando o Sistema de Clonagem TOPO™ TA (Invitrogen) e transformados em células E.coli DH10β por eletroporação. Clones individuais foram selecionados a partir de cada reação de transformação e cultivados em 2 mL de culturas de caldo LB com seleção por antibióticos durante a noite a 37°C. DNA de plasmídeo foi purificado de culturas bacterianas por uma abordagem baseada em kit (Qiagen).

Uso de Gene Variável de Imunoglobulina.

[00259] DNA de plasmídeo de clones tanto da cadeia pesada como da cadeia leve K foi sequenciado com iniciadores de sentido reverso T7 ou M13 no Analisador Genético ABI 3100 (Applied Biosystems). Os dados de sequência brutos foram importados para Sequencher™ (v4.5, Gene Codes). Cada sequência foi montada em contíguos e alinhada a sequências de imunoglobulina humana usando a função de busca de IMGT V-Quest (Brochet, X. et al. (2008) IMGT/V-QUEST: the highly customized and integrated system for IG and TR standardized V-J and V- D-J sequence analysis. Nucleic Acids Res 36:W503-508) para identificar uso de segmento VH, DH, JH humano e Vk, Jk. As sequências foram comparadas com sequências de linhagem germinativa de hipermutação somática e análise de ligação de recombinação.

[00260] Os camundongos foram gerados de células ES que contêm a modificação da cadeia pesada inicial (Alelo Híbrido 3hVH-CRE, fundo da FIG. 2A) por complementação RAG (Chen, J. et al. (1993) RAG-2- deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development, Proc Natl Acad Sci USA 90:4528-4532), e cDNA foi preparado de RNA de esplenócito. O cDNA foi amplificado usando conjuntos de iniciadores (descritos acima) específicos para o mRNA da cadeia pesada quimérica predita que surgiria junto à recombinação V(D)J dentro dos segmentos gênicos humanos inseridos e splicing subsequente aos domínios constantes de IgM ou IgG de camundongo. As sequências derivadas destes clones de cDNA (não mostrado) demonstraram que a recombinação V(D)J apropriada tinha ocorrido dentro das sequências gênicas variáveis humanas, que os segmentos gênicos V(D)J humanos rearranjados foram apropriadamente entrançados na estrutura para domínios constantes de camundongo e aquela recombi- nação de troca da classe tinha ocorrido. A análise de sequência adicional de produtos de mRNA de loci de imunoglobulina híbridos sub-sequentes foi realizada.

[00261] Em um experimento similar, células B selvagens não imunizadas e camundongos humanizados VelocImmune® foram separados pela citometria de fluxo baseada na expressão superficial de B220 e IgM ou IgG. Células B220+ IgM+ ou IgG+ superficial (sIgG+) foram agrupadas e sequências VH e VK foram obtidas após amplificação por RT-PCR e clonagem (descrito acima). O uso do gene representativo em um conjunto de cDNAs amplificados por RT-PCR de camundongos humanizados VelocImmune® 1 não imunizados (Tabela 7) e camundongos humanizados VelocImmune® 3 (Tabela 8) foi registrado (*RSS defectivo; +não possui ou pseudogene).Tabela 7 Tabela 8

[00262] Como mostrado nas Tabelas 7 e 8, quase todos os segmen-tos gênicos humanos funcionais VH, DH, JH, VK e JK são utilizados. Dos segmentos gênicos variáveis funcionais descritos mas não detectados em camundongos humanizados VELOCIMMUNE® deste experimento, vários foram relatados possuir sequências sinal de recombinação (RSS) incorretas e, dessa forma, não seriam esperados ser expressos (Fee- ney, A.J. (2000) Factors that influence formation of B cell repertoire. Immunol Res 21:195-202). A análise de vários outros conjuntos de se-quências de imunoglobulina de vários camundongos humanizados VE- LOCIMMUNE®, isolados tanto de repertórios naive como imunizados, mostrou o uso destes segmentos gênicos, embora em frequências mais baixas (dados não mostrados). Os dados de uso gênico agregados mos-traram que todos os segmentos gênicos humanos funcionaisVH, DH, JH, Vk e Jk contidos em camundongos humanizados VelocImmune® foram observados em vários repertórios naive e imunizados (dados não mos-trados). Embora o segmento gênico VH7-81 humano tenha sido identificado na análise de sequências de locus da cadeia pesada humana (Matsuda, F. et al. (1998) The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus, J Exp Med 188:2151-2162), não está presente em camundongos humanizados VelocImmune® como confirmado pelo ressequenciamento do ge- noma de camundongo humanizado VelocImmune® 3 inteiro.

[00263] É conhecido que as sequências das cadeias pesadas e leves de anticorpos mostram variabilidade excepcional, especialmente em segmentos de polipeptídeos curtos dentro do domínio variável rearran- jado. Estas regiões, conhecidas como regiões hipervariáveis ou regiões de determinação complementares (CDRs) criam o sítio de ligação ao antígeno na estrutura da molécula de anticorpo. As sequências polipep- tídicas intervenientes são chamadas regiões de arcabouço (FRs). Há três CDRs (CDR1, CDR2, CDR3) e 4 FRs (FR1, FR2, FR3, FR4) tanto em cadeias pesadas como em leves. Uma CDR, CDR3, é única em que esta CDR é criada pela recombinação tanto de segmentos gênicos VH, DH e JH quanto VK e JK e gera uma quantidade significativa de diversidade de repertório antes que o antígeno seja encontrado. Esta junção é imprecisa tanto devido a deleções de nucleotídeo através da atividade de exonucleases como devido a adições codificadas sem molde através de desoxinucleotidil transferase (TdT) terminal e, dessa forma, permite sequências novas resultarem do processo de recombinação. Embora FRs possam mostrar mutação somática substancial devido à alta mutabilidade da região variável no conjunto, a variabilidade não é, entretanto, distribuída igualmente através da região variável. As CDRs são concentradas e as regiões localizadas da alta variabilidade na superfície da molécula de anticorpo que permitem ligação ao antígeno. Sequências da cadeia pesada e da cadeia leve de anticorpos selecionados a partir de camundongos humanizados VelocImmune® em torno da ligação de CDR3 que manifesta diversidade juncional são mostrados na FIG. 7A e 7B, respectivamente.

[00264] Como mostrado na FIG. 7A, as adições de nucleotídeo codificadas de sem molde (N-adições) são observadas tanto em união de VH-DH como em de DH-JH em anticorpos de camundongos humanizados VelocImmune®, indicando a função apropriada de TdT com os segmentos humanos. Os parâmetros de segmentos VH, DH e JH quanto às suas contrapartes de linhagem germinativa indicam que a atividade de exonuclease também ocorreu. Diferentemente do locus da cadeia pesada, os rearranjos da cadeia leve K humana exibem pouca ou nenhuma adição de TdT em CDR3, que é formado pela recombinação de segmentos Vk e Jk (FIG. 7B). Isto é esperado devido à falta da expressão de TdT em camundongos durante os rearranjos da cadeia leve na transição de célula pré-B à B. A diversidade observada na CDR3 de regiões Vk humanas rearranjadas é introduzida predominantemente por meio da atividade de exonuclease durante o evento de recombinação.

Hipermutação Somática.

[00265] Diversidade adicional é adicionada às regiões variáveis de genes de imunoglobulina rearranjados durante a reação de centro germinal por um processo denominado hipermutação somática. Células B que expressam regiões variáveis somaticamente mutadas competem com outras células B pelo acesso ao antígeno apresentado pelas células dendríticas foliculares. Aquelas células B com afinidade mais alta para o antígeno vão se expandir mais e passarão por troca de classe antes de sair à periferia. Dessa forma, células B que expressam isotipos trocados tipicamente encontravam o antígeno e sofriam reações de centro germinal e terão números aumentados de mutações em relação a células B naive. Além disso, seria esperado que as sequências de região variável de células B sIgM+ predominantemente naive tivessem relativamente menos mutações do que sequências variáveis de células B sIgG+ que sofreram seleção de antígeno.

[00266] As sequências a partir de clones randômicos de VH ou VK de células B sIgM+ ou sIgG+ de camundongos humanizados Velo- cImmune® não imunizados ou células B sIgG+ de camundongos imunizados foram comparados com seus segmentos gênicos variáveis de linhagem germinativa e modificações quanto à sequência de linhagem germinativa observada. As sequências nucleotídicas resultantes foram traduzidas in silico e mutações que levam a modificações de aminoáci- dos também observadas. Os dados foram cotejados de todas as regiões variáveis e a variação percentual em uma dada posição foi calculada (FIG.8).

[00267] Como mostrado na FIG. 8, as regiões variáveis da cadeia pesada humana derivadas de células B sIgG+ de camundongos humanizados VelocImmune® não imunizados exibem muitos outros nucleotí- deos quanto a células B sIgM+ dos mesmos agrupamentos de esplenó- citos e regiões variáveis da cadeia pesada derivadas de camundongos imunizados exibem até mais modificações. O número de modificações é aumentado nas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) quanto às regiões de arcabouço, indicando a seleção de antí- geno. As sequências de aminoácidos correspondentes das regiões variáveis da cadeia pesada humana também exibem números significativamente mais altos de mutações em IgG contra IgM e até mais em IgG imunizada. Estas mutações novamente parecem ser mais frequentes nas CDRs comparadas com as sequências de arcabouço, sugerindo que os anticorpos foram selecionados a partir do antígeno in vivo. Um aumento similar no número mutações de nucleotídeos e de aminoácidos é visto nas sequências Vk derivadas de células B IgG+ de camundongos imunizados.

[00268] O uso gênico e a hipermutação somática observada em ca-mundongos humanizados VelocImmune® demonstram que essencialmente todos os segmentos gênicos presentes são capazes de rearranjo para formar anticorpos quiméricos reversos totalmente funcionalmente nestes camundongos. Além disso, anticorpos derivados de camundongo VelocImmune® humanizado participam totalmente dentro do sistema imune do camundongo para sofrer seleção e maturação por afinidade para criar anticorpos humanos totalmente maduros que podem neutralizar efetivamente seu antígeno alvo. Camundongos humanizados VelocImmune® são capazes de montar respostas imunes robustas a múltiplas classes de antígenos que resultam no uso de uma ampla variação de anticorpos humanos que são tanto de alta afinidade como adequados para o uso terapêutico (dados não mostrados).

Exemplo V Análise de Estrutura Linfoide e Isotipos Séricos

[00269] As estruturas visíveis de baço, linfonodos inguinais, placas de Peyer e timo de amostras de tecido a partir de camundongos selvagens ou humanizados VelocImmune® marcados com H&E foram examinados por microscopia ótica. Os níveis de isotipos de imunoglobulina no soro coletado de camundongos selvagens e humanizados Velo- cImmune® foram analisados usando a tecnologia Luminex™.

Estrutura de Órgão Linfoide.

[00270] A estrutura e a função dos tecidos linfoides são em parte de-pendentes mediante desenvolvimento apropriado de células hemato- poiéticas. Um defeito no desenvolvimento ou função de células B pode ser exibido como uma alteração na estrutura dos tecidos linfoides. Após análise de seções de tecido marcadas, nenhuma diferença significante na aparência de órgãos linfoides secundários entre camundongos selvagens e humanizados VelocImmune® foi identificada (dados não mostrados).

Níveis de Imunoglobulina Sérica.

[00271] O nível de expressão de cada isotipo é similar em camundongos selvagens e humanizados VelocImmune® (FIG. 9A, 9B e 9C). Isto demonstra que a humanização dos segmentos gênicos variáveis não tinha efeito adverso aparente após troca de classe ou expressão de imunoglobulina e secreção e por isso aparentemente mantêm todas as sequências de camundongo endógenas necessárias para estas funções.

Exemplo VI Imunização e Produção de Anticorpo em Camundongos de Imuno- globulina Humanizada

[00272] As versões diferentes de camundongos humanizados Velo- cImmune® foram imunizados com o antígeno para examinar a resposta humoral ao desafio de antígeno estranho.

Imunização e Desenvolvimento de Hibridoma.

[00273] Camundongos humanizados VelocImmune® e selvagens podem ser imunizados com um antígeno na forma de proteína, DNA, uma combinação de DNA e proteína ou células que expressam o antí- geno. Os animais são tipicamente estimulados a cada três semanas para um total de duas a três vezes. Após cada estímulo de antígeno, amostras de soro de cada animal são coletadas e analisadas para respostas de anticorpo específicas para o antígeno pela determinação de título de soro. Antes da fusão, os camundongos receberam um estímulo pré-fusão final de 5 μg de proteína ou DNA, como desejado, através de injeções intraperitoniais e/ou intravenosas. Os esplenócitos são coletados e fundidos a células de mieloma Ag8.653 em uma câmara de ele- trofusão de acordo com o protocolo sugerido do fabricante (Cyto Pulse Sciences Inc., Glen Burnie, MD). Dez dias após a cultura, os hibridomas são rastreados para a especificidade de antígeno usando um ensaio ELISA (Harlow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, New York). Alternativamente, células B específicas para o antígeno são isoladas diretamente de camundongos humanizados VelocImmune® imunizados e rastreados usando técnicas padrão, incluindo as descritas aqui, para obter anticorpos humanos es-pecíficos para um antígeno de interesse.

Determinação de Título de Soro.

[00274] Para monitorar a resposta de soro antiantígeno dos animais, as amostras de soro são coletadas aproximadamente 10 dias após cada estímulo e os títulos são determinados usando o antígeno ELISA espe-cífico. Resumidamente, placas de 96 poços Nunc MaxiSorp™ são reco-bertas com antígeno 2 μg/mL durante a noite a 4° C e bloqueadas com albumina sérica bovina (Sigma, St. Louis, MO). Permite-se que as amostras de soro em diluições seriais de 3 vezes se liguem às placas por uma hora à temperatura ambiente. As placas então são lavadas com PBS contendo Tween-20 0,05% e a IgG ligada é detectada usando o anti- Fc de camundongo de cabra conjugado a HRP (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA) para o título de IgG total, ou para anticorpos policlonais específico para isotipo marcado com biotina ou específicos para cadeia leve (SouthernBiotech Inc.) para títulos específicos de isotipo, respectivamente. Para anticorpos marcados com biotina, após a lavagem da placa, estreptavidina conjugada a HRP (Pierce, Rockford, IL) é adicionada. Todas as placas são desenvolvidas usando substratos colorimétricos como BD OptEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Após a reação ser parada com ácido fosfórico 1 M, a absorção ótica em 450 nm é registrada e os dados são analisados usando o programa Prism™ de Graph Pad. Diluições requeridas para obter duplo sinal de fundo são definidas como título.

[00275] Em um experimento, camundongos humanizados Velo- cImmune® foram imunizados com receptor de interleucina-6 humana (hIL-6R). Um conjunto representativo de títulos de soro de Velo- cImmune® e camundongos selvagens imunizados com hIL-6R é mostrado na FIG. 10A e 10B.

[00276] Camundongos humanizados VelocImmune® e selvagens montaram respostas fortes em direção ao IL-6R com faixas de títulos similares (FIG. 10A). Várias coortes de camundongos humanizados Ve- locImmune® e selvagens alcançaram uma resposta máxima após um estímulo de antígeno único. Estes resultados indicam que a força da resposta imune e a cinética a este antígeno foram similares em camun-dongos humanizados VelocImmune® e selvagens. Estas respostas de anticorpo específicas para o antígeno foram ainda analisadas para exa-minar os isotipos particulares dos anticorpos específicos para o antí- geno encontrados nos soros. Tanto grupos de humanizados Velo- cImmune® -se como de selvagens predominantemente provocaram uma resposta de IgG1 (FIG. 10B), sugerindo que a troca de classe durante a resposta humoral é similar em camundongos de cada tipo.

Determinação de Afinidade de Ligação de Anticorpo ao Antígeno em Solução.

[00277] Um ensaio de competição de solução baseado em ELISA é tipicamente projetado para determinar a afinidade de ligação do anticorpo ao antígeno.

[00278] Resumidamente, os anticorpos no meio condicionado são bem misturados antes de usar com diluições seriais da proteína de an- tígeno variando de 0 a 10 mg/mL. As soluções de mistura de anticorpo e antígeno então são incubadas por duas a quatro horas à temperatura ambiente até alcançar o equilíbrio de ligação. As quantidades do anticorpo livre nas misturas então são medidas usando um ELISA sanduíche quantitativo. Placas de noventa e seis poços Maxisorb™ (VWR, West Chester, PA) são recobertas com proteína de antígeno 1 μg/mL em solução de PBS durante a noite a 4°C seguido de bloqueio não específico de BSA. As soluções de mistura anticorpo-antígeno então são transferidas para estas placas seguidas da incubação por uma hora. As placas então são lavadas com tampão de lavagem e os anticorpos ligados à placa foram detectados com um reagente de anticorpo policlonal anti-IgG de camundongo de cabra conjugado a HRP (Jackson Immuno Research Lab) e desenvolvidos usando substratos colorimétricos como BD OptEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Após a reação ser parada com ácido fosfórico 1 M, a absorção ótica em 450 nm é registrada e os dados são analisados usando o programa Prism™ de Graph Pad. A dependência dos sinais nas concentrações do antígeno na solução é analisada com uma análise de 4 parâmetros ajustados e relatada como IC50, a concentração de antígeno requerida alcançar a redução de 50% do sinal das amostras de anticorpo sem a presença do antígeno na solução.

[00279] Em um experimento, camundongos humanizados Velo- cImmune® foram imunizados com hIL-6R (como descrito acima). A FIG. 11A e 11B mostram um conjunto representativo de medidas de afinidade de anticorpos anti-hIL6R de camundongos humanizados Velo- cImmune® e selvagens.

[00280] Após os camundongos imunizados receberem um terceiro estímulo de antígeno, os títulos de soro são determinados por ELISA. Os esplenócitos são isolados de coortes selecionadas de camundongo selvagem e humanizado VelocImmune® e fundidos com células de mi- eloma Ag8.653 para formar hibridomas e cultivados sob seleção (como descrito acima). De um total de 671 hibridomas anti-IL-6R produzidos, 236 foram encontrados expressar anticorpos específicos para o antí- geno. Meios coletados de poços positivos para antígeno foram usados para determinar a afinidade da ligação de anticorpo ao antígeno usando uma solução de ELISA de competição. Os anticorpos derivados de ca-mundongos humanizados VelocImmune® exibem uma ampla variação da afinidade na ligação ao antígeno em solução (FIG. 11A). Além disso, 49 de 236 hibridomas anti-IL-6R foram encontrados bloquear IL-6 da ligação ao receptor em um bioensaio in vitro (dados não mostrados). Ainda, estes 49 anticorpos de bloqueio anti-IL-6R exibiram uma faixa de altas afinidades de solução similares àquela de anticorpos de bloqueio derivados da imunização paralela de camundongos selvagens (FIG. 11B).

Exemplo VII Construção de um Vetor de Direcionamento de ADAM6 de Camun-dongo

[00281] Um vetor de direcionamento para inserção de genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo em um locus da cadeia pesada humanizada foi construído usando tecnologia de engenharia genética VELOCIGENE® (supra) para modificar o Cromossomo Artificial Bacte- riano (BAC) 929d24 obtido do doutor Fred Alt (Universidade de Harvard). DNA de BAC 929d24 foi engendrado para conter fragmentos ge- nômicos contendo genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo e um cassete de higromicina para deleção direcionada de um pseudogene ADAM6 humano (hADAM6Φ) localizado entre os segmentos gênicos VH1-2 humano e VH6-1 do locus da cadeia pesada humanizada (FIG. 12).

[00282] Em primeiro lugar, um fragmento genômico que contém o gene ADAM6b de camundongo, sequência de ~800 bp a montante (5’) e sequência de ~4800 bp a jusante (3’) foi subclonado do clone de BAC 929d24. Um segundo fragmento genômico contendo o gene ADAM6a de camundongo, sequência de ~300 bp a montante (5’) e sequência de ~3400 bp a jusante (3’), foi separadamente subclonado do clone de BAC 929d24. Dois fragmentos genômicos que contêm genes ADAM6b e ADAM6a de camundongo foram ligados a um cassete de higromicina flanqueado por sítios de recombinação Frt para criar o vetor de direcionamento (Vetor de Direcionamento ADAM6 de Camundongo, Figura 20; SEQ ID NO:3). Sítios de enzima de restrição diferentes foram engendrados para a extremidade 5’ do vetor de direcionamento após gene ADAM6b de camundongo e para a extremidade 3’ após gene ADAM6a de camundongo (fundo da FIG. 12) para ligação no locus da cadeia pesada humanizada.

[00283] Uma modificação separada foi feita a um clone de BAC contendo uma substituição do locus da cadeia pesada de camundongo com o locus da cadeia pesada humana, incluindo o pseudogene ADAM6 humano localizado entre os segmentos gênicos humanos VH1-2 e VH6-1 do locus humanizado da ligação subsequente do vetor de direcionamento ADAM6 de camundongo (FIG. 13).

[00284] Resumidamente, um cassete de neomicina flanqueado por sítios de recombinação loxP foi engendrado para conter braços de ho- mologia contendo a sequência genômica humana nas posições 3’ do segmento gênico VH1-2 humano (5’ relativamente a hADAM6Φ) e 5’ do segmento gênico VH6-1 humano (3’ relativamente a hADAM6Φ; ver o meio da FIG. 13). A posição do sítio de inserção deste construto de direcionamento era aproximadamente 1,3 kb 5’ e ~350 bp 3’ do pseudogene ADAM6 humano. O construto de direcionamento também incluiu os mesmos sítios de restrição que o vetor de direcionamento ADAM6 de camundongo para permitir ligação de BAC subsequente entre o clone de BAC modificado contendo a deleção do pseudogene ADAM6 humano e o vetor de direcionamento ADAM6 de camundongo.

[00285] Seguinte à digestão de DNA de BAC derivado de ambos os construtos, os fragmentos genômicos foram ligados em conjunto para construir um clone de BAC engendrado contendo um locus da cadeia pesada humanizada contendo uma sequência genômica ectopicamente colocada compreendendo sequências nucleotídicas ADAM6a e ADAM6b de camundongo. O construto de direcionamento final para a deleção de um gene ADAM6 humano dentro de um locus da cadeia pesada humanizada e a inserção do sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo em células ES contidas, de 5’ a 3’, um fragmento genô- mico 5’ que contém ~13 kb da sequência genômica humana 3’ do segmento gênico VH1-2 humano, ~800 bp da sequência genômica de camundongo a jusante do gene ADAM6b de camundongo, o gene ADAM6b de camundongo, ~4800 bp da sequência genômica a montante do gene ADAM6b de camundongo, um sítio 5’ de Frt, um cassete de higromicina, um sítio 3’ de Frt, ~300 bp da sequência genômica de camundongo a jusante do gene ADAM6a de camundongo, o gene ADAM6a de camundongo, ~3400 bp da sequência genômica de camundongo a montante do gene ADAM6a de camundongo e um fragmento genômico 3’ contendo ~30 kb da sequência genômica humana 5’ do segmento gênico VH6-1 humano (fundo da FIG. 13).

[00286] O clone de BAC engendrado (descrito acima) foi usado para eletroporar células ES de camundongo que continham um locus da cadeia pesada humanizada para células ES modificadas criadas compreendendo uma sequência genômica camundongo ectopicamente colocada compreendendo as sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo dentro de um locus da cadeia pesada humanizada. As células ES positivas contendo o fragmento genômico ectópico de camundongo dentro do locus da cadeia pesada humanizada foi identificado por um ensaio de PCR quantitativa usando sondas TAQMAN™ (Lie, Y.S. e Petropoulos, C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5’nu- clease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48). As regiões a montante e a jusante fora da porção modificada do locus da cadeia pesada humanizada foram confirmadas por PCR usando iniciadores e sondas localizados dentro da região modificada para confirmar a presença do sequência genômica de camundongo ectópica dentro do locus da cadeia pesada humanizada bem como o cassete de higromicina. A sequência nucleotídica através do ponto de inserção a montante incluiu o seguinte, que indica a sequência genômica da cadeia pesada humana a montante do ponto de inserção e um sítio de restrição I-Ceu I (contido dentro dos parênteses abaixo) ligados contiguamente à sequência genômica de camundongo presente no ponto de inserção: (CCAGCTTCAT TAGTA- ATCGT TCATCTGTGG TAAAAAGGCA GGATTTGAAG CGATGGA- AGA TGGGAGTACG GGGCGTTGGA AGACAAAGTG CCACACAGCG CAGCCTTCGT CTAGACCCCC GGGCTAACTA TAACGGTCCT AAGGTAGCGA G) GGGATGACAG ATTCTCTGTT CAGTGCACTC AGGGTCTGCC TCCACGAGAA TCACCATGCC CTTTCTCAAG AC- TGTGTTCT GTGCAGTGCC CTGTCAGTGG (SEQ ID NO:4). A sequência nucleotídica através do ponto de inserção a jusante na extremidade 3’ da região visada incluiu o seguinte, que indica a sequência ge- nômica de camundongo e um sítio de restrição PI-Sce I (contido dentro dos parênteses abaixo) ligado contiguamente com a sequência genô- mica da cadeia pesada humana a jusante do ponto de inserção: (AGGGGTCGAG GGGGAATTTT ACAAAGAACA AAGAAGCGGG CA- TCTGCTGA CATGAGGGCC GAAGTCAGGC TCCAGGCAGC GGGA- GCTCCA CCGCGGTGGC GCCATTTCAT TACCTCTTTC TCCGCAC- CCG ACATAGATAAAGCTT) ATCCCCCACC AAGCAAATCC CCC- TACCTGG GGCCGAGCTT CCCGTATGTG GGAAAATGAA TCCCTGAGGT CGATTGCTGC ATGCAATGAA ATTCAACTAG (SEQ ID NO:5).

[00287] As células ES visadas descritas acima foram usadas como células ES doadoras e introduzidas em um embrião de camundongo de estágio de 8 células pelo método de engenharia de camundongo VELO- CIMOUSE® (ver, por exemplo, Pat. US No. 7.6598.442, 7.576.259, 7.294.754). Os camundongos carregando um locus da cadeia pesada humanizada contendo uma sequência genômica de camundongo ectó- pica que compreende as sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo foram identificados por genotipagem usando uma modificação do ensaio de alelo (Valenzuela et al., 2003) que detectou a presença de genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo dentro do locus da cadeia pesada humanizada.

[00288] Os camundongos carregando um locus da cadeia pesada humanizada contendo os genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo são reproduzidos para uma linhagem de camundongo FLPe deletora (ver, por exemplo, Rodríguez, C.I. et al. (2000) High-efficiency deleter mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25:139-140) a fim de remover qualquer cassete de higromicina FRTed introduzido pelo vetor de direcionamento que não é removido, por exemplo, no estágio de célula ES ou no embrião. Opcionalmente, o cassete de higromicina é conservado nos camundongos.

[00289] Os filhotes são genotipados e um filhote heterozigoto para um locus da cadeia pesada humanizada que contém um fragmento ge- nômico de camundongo ectópico que compreende as sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo são selecionados para caracterizar a expressão gênica de ADAM6 de camundongo e fertilidade.

Exemplo VIII Caracterização de camundongos de resgate de ADAM6 Citometria de fluxo.

[00290] Três camundongos com 25 semanas de idade homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e leve K humana (H/K) e três camundongos com 18-20 semanas de idade homozigotos para a cadeia leve k humana e pesada humana tendo o fragmento ge- nômico de camundongo ectópico que codifica o genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo dentro de ambos os alelos do locus da cadeia pesada humana (H/k-A6) foram sacrificados para identificação e análise de populações de células de linfócitos por FACs no Sistema BD LSR II (BD Bioscience). Os linfócitos foram controlados de linhagens celulares específicas e analisados para a progressão através de vários estágios de desenvolvimento de célula B. Os tecidos coletados dos animais incluíram sangue, baço e medula óssea. O sangue foi coletado em tubos BD microtainer com EDTA (BD Biosciences). A medula óssea foi coletada de fêmures por lavagem com o meio RPMI completo suple-mentado com soro de bezerro fetal, piruvato de sódio, HEPES, 2-mer- captoetanol, aminoácidos não essenciais e gentamicina. Células vermelhas sanguíneas de preparações de sangue, baço e medula óssea foram lisadas com um tampão de lise baseado em cloreto de amônio (por exemplo, tampão de lise ACK), seguido de lavagem com o meio RPMI completo.

[00291] Para marcação de populações celulares, 1 x 106 células de várias fontes de tecido foram incubadas com anti-CD16/CD32 de camundongo (2.4G2, BD Biosciences) em gelo por 10 minutos, seguidos de marcação com um ou uma combinação dos seguintes coquetéis de anticorpo por 30 min em gelo.

[00292] Medula óssea: anti-FITC-CD43 de camundongo (1B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-eFluor780-B220 (RA3- 6B2, eBioscience), A700-CD19 (1D3, BD Biosciences).

[00293] Sangue periférico e baço: anti- FITC-K de camundongo (187.1, BD Biosciences), PeÀ (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC-CD3 (145-2C11, BD), A700-CD19 (1D3, BD), APC-eFluor780-B220 (RA3- 6B2, eBioscience). Seguinte à incubação com os anticorpos marcados, as células foram lavadas e fixadas em formaldeído 2%. A aquisição de dados foi realizada em um citômetro de fluxo LSRII e analisados com FlowJo. Resultados de um camundongo representativo H/k e H/k-A6 são mostrados nas FIGS. 14-18.

[00294] Os resultados demonstram que as células B progridem através dos camundongos H/k-A6 pelos estágios do desenvolvimento de célula B de uma maneira similar a camundongos H/k na medula óssea e compartimentos periféricos, e mostram modelos normais da maturação uma vez que entram na periferia. Os camundongos H/k-A6 demonstraram uma população aumentada de células CD43intCD19+ quando comparados com camundongos H/K (FIG. 16B). Isto pode indicar uma expressão de IgM acelerada do locus da cadeia pesada humanizada que contém um fragmento genômico de camundongo ectópico que compreende sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo em camundongos H/k-A6. Na periferia, populações de células B e T dos camundongos H/k-A6 parecem normais e similares a camundongos H/k.

Morfologia de Testículo e Caracterização de Esperma.

[00295] Para determinar se a infertilidade em camundongos tendo loci variáveis da cadeia pesada humanizados de imunoglobulina é devido a defeitos no testículo e/ou de produção de esperma, morfologia de testículo e conteúdo de esperma do epidídimo foi examinado.

[00296] Resumidamente, testículos de dois grupos de cinco camundongos por grupo (Grupo 1: camundongos homozigotos para loci gêni- cos variáveis da cadeia pesada e leve k, mADAM6-/-; Grupo 2: camundongos heterozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia leve k, mA- DAM6 +/-) foram dissecados com o epidídimo intacto e pesado. Os espécimes então foram fixados, introduzidos em parafina, secionados e marcados com marcador hematoxilina e eosina (HE). Seções de testículos (2 testículos por camundongo, para um total de 20) foram examinadas para defeitos na morfologia e evidência da produção de esperma, enquanto as seções de epidídimo foram examinadas para a presença de esperma.

[00297] Neste experimento, nenhuma diferença em peso de testículo ou morfologia foi observada entre camundongos mADAM6-/- e camundongos mADAM6+/-. Esperma foi observado em todos os genótipos, tanto nos testículos como no epidídimo. Estes resultados estabelecem que a ausência de genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo não levam a modificações detectáveis na morfologia de testículo, e que o esperma é produzido em camundongos na presença e na ausência destes dois genes. Defeitos na fertilidade de camundongos machos ADAM6-/-, por isso, provavelmente não serão devidos à baixa produção de esperma.

Motilidade e Migração de Esperma.

[00298] Os camundongos sem outros membros da família gênica de ADAM são estéreis devido a defeitos em motilidade ou migração de esperma. A migração de esperma é definida como a capacidade do esperma de passar do útero para o oviduto e é normalmente necessária para a fertilização em camundongos. Para determinar se a deleção de ADAM6a e ADAM6b de camundongo afetam este processo, migração de esperma foi avaliada em camundongos mADAM6-/-. A motilidade de esperma também foi examinada.

[00299] Resumidamente, o esperma foi obtido de testículos de (1) camundongos heterozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia leve K humana (ADAM6 +/-); (2) camundongos homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e homozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia leve K humanas (ADAM6-/-); (3) camundongos ho- mozigotos para loci gênicos variáveis da cadeia pesada humana e ho- mozigotos para cadeia leve K selvagem (ADAM6-/-mK); e, (4) camundon-gos selvagens C57 BL/6 (WT). Nenhuma anormalidade significante foi observada em contagem de esperma ou motilidade de esperma total por inspeção. Para todos os camundongos, dispersão do cúmulo foi observada, indicando que cada amostra de esperma foi capaz de penetrar as células do cúmulo e ligar-se à zona pelúcida in vitro. Estes resultados estabelecem que os camundongos ADAM6-/- têm esperma que é capaz de penetrar o cúmulo e ligar-se à zona pelúcida.

[00300] A fertilização de óvulos de camundongo in vitro (fertilização in vitro) foi feita usando esperma de camundongos como descrito acima. Um número levemente mais baixo de embriões clivados estava presente para ADAM6-/- um dia após fertilização in vitro, bem como um número reduzido do esperma ligado aos óvulos. Estes resultados estabelecem que esperma de camundongos ADAM6-/-, uma vez expostos a um óvulo, são capazes de penetrar o cúmulo e ligar-se à zona pelúcida.

[00301] Em outro experimento, a capacidade do esperma de camundongos ADAM6-/- para migrar do útero e pelo oviduto foi determinada em um ensaio de migração de esperma.

[00302] Resumidamente, um primeiro grupo de cinco camundongos fêmeas superovuladas foram expostas a cinco machos ADAM6-/-. Um segundo grupo de cinco camundongos fêmeas superovuladas foram expostas a cinco machos ADAM6+/-. Os pares de acasalamento foram observados para copulação, e pós-copulação de cinco a seis horas, o útero e o oviduto ligado de todas as fêmeas foram removidos e lavados para análise. As soluções de lavagem foram verificadas para óvulos para verificar a ovulação e obter uma contagem de esperma. A migração de esperma foi avaliada de dois modos diferentes. Em primeiro lugar, ambos os ovidutos foram removidos do útero, lavados com água com salina, e qualquer esperma identificado foi contado. A presença de óvulos também foi observada como evidência da ovulação. Em segundo lugar, os ovidutos foram deixados ligados ao útero e ambos os tecidos foram fixados, introduzidos em parafina, secionados e marcados (como descrito acima). As seções foram examinadas para a presença do esperma, tanto no útero como em ambos os ovidutos.

[00303] Para as cinco fêmeas acasaladas com cinco machos ADAM6-/-, muito pouco esperma foi encontrado na solução de lavagem do oviduto. As soluções de lavagem de ovidutos das cinco fêmeas acasaladas com cinco machos ADAM6+/- exibiram um nível de esperma aproximadamente 25 a 30 vezes mais alto (avg, n = 10 ovidutos) do que presente em soluções de lavagem dos ovidutos das cinco fêmeas acasaladas com cinco machos ADAM6-/-.

[00304] Seções histológicas de útero e oviduto foram preparadas. As seções foram examinadas para a presença de esperma no útero e no oviduto (o colliculus tubarius). A inspeção de seções histológicas de ovi- duto e útero revelou que para camundongos fêmeas acasaladas com camundongos ADAM6-/-, o esperma foi encontrado no útero mas não no oviduto. Ainda, seções de fêmeas acasaladas com camundongos ADAM6-/- revelaram que o esperma não foi encontrado na junção utero- tubária (UTJ). Em seções de fêmeas acasaladas com camundongos ADAM6+/-, o esperma foi identificado na UTJ e no oviduto.

[00305] Estes resultados estabelecem que os camundongos sem genes ADAM6a e ADAM6b produzem o esperma que exibem um defeito de migração in vivo. Em todos os casos, o esperma foi observado dentro do útero, indicando que a copulação e a liberação de esperma aparentemente ocorrem normalmente, mas pouco a nenhum esperma foi observado dentro dos ovidutos após copulação como medido por contagem de esperma ou por observação histológica. Estes resultados estabelecem que os camundongos sem os genes ADAM6a e ADAM6b produzem o esperma que exibem uma incapacidade de migrar do útero ao oviduto. Este defeito aparentemente leva à infertilidade porque o esperma é incapaz de cruzar a junção uterina-túbulo no oviduto, onde os óvulos são fertilizados. Tomados em conjunto, todos estes resultados convergem para suportar a hipótese de que genes ADAM6 de camundongo ajudam a direcionar o esperma com motilidade normal a migrar do útero, pela junção uterotubária e o oviduto, e dessa forma abordar um óvulo para alcançar o evento de fertilização. O mecanismo pelo qual ADAM6 alcança isto pode ser diretamente pela ação das proteínas ADAM6, ou pela expressão coordenada com outras proteínas, por exemplo, outras proteínas ADAM, na célula de esperma, como descrito abaixo.

Expressão de Família Gênica de ADAM.

[00306] É conhecido que um complexo de proteínas ADAM está presente como um complexo na superfície do esperma amadurecido. Os camundongos sem outros membros da família gênica de ADAM perdem este complexo como esperma maduro, e exibem uma redução de múltiplas proteínas ADAM no esperma maduro. Para determinar se uma falta de genes ADAM6a e ADAM6b afeta outras proteínas ADAM em uma maneira similar, Western blots de extratos proteicos do testículo (esperma imaturo) e epidídimo (esperma amadurecido) foram analisados para determinar os níveis de expressão de outros membros da família gênica de ADAM.

[00307] Neste experimento, os extratos proteicos foram analisados de quatro camundongos ADAM6-/- e quatro ADAM6+/-. Os resultados mostraram que a expressão de ADAM2 e ADAM3 não foi afetada em extratos de testículo. Entretanto, tanto ADAM2 como ADAM3 foram dra-maticamente reduzidos em extratos de epidídimo. Isto demonstra que a ausência de ADAM6a e ADAM6b no esperma de camundongos ADAM6- /- pode ter um efeito direto de acordo com a expressão e possivelmente a função de outras proteínas ADAM como o esperma amadurecido (por exemplo, ADAM2 e ADAM3). Isto sugere que ADAM6a e ADAM6b são parte de um complexo de proteína ADAM na superfície do esperma, que poderia ser crítica para a migração de esperma apropriada.

Exemplo IX Uso de Gene Variável da Cadeia Pesada Humana em Camundongos de Resgate de ADAM6

[00308] O uso de gene variável da cadeia pesada humana selecionado foi determinado para homozigotos de camundongos para loci gê- nicos variáveis da cadeia pesada e leve K de camundongo faltando os genes ADAM6a e ADAM6b (mADAM6-/-) ou contendo um fragmento ge- nômica ectópico que codifica os genes ADAM6a e ADAM6b de camundongo (ADAM6+/+; ver o Exemplo 1) por um ensaio de PCR quan-titativa usando sondas TAQMAN™ (como descrito acima).

[00309] Resumidamente, células B CD19+ foram purificadas dos baços de camundongos mADAM6-/- e ADAM6+/+ usando Microcontas CD19 de camundongo (Miltenyi Biotec) e RNA total foi purificado usando o kit RNeasy™ Mini (Qiagen). RNA genômico foi removido usando um tratamento com DNase isenta de RNase em coluna (Qiagen). Aproxi-madamente 200 ng de mRNA foi transcrito reversamente em cDNA usando kit de Síntese First Stand cDNA (Invitrogen) e em seguida amplificado com TAQMAN™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) usando o Sistema de Detecção de Sequência ABI 7900 (Applied Biosystems). A expressão relativa de cada gene foi normalizada à Constante K de camundongo (mCK). A tabela 9 apresenta combinações de sonda MGB sentido/anti-sentido/TAQMAN™ usadas neste experimento.Tabela 9

[00310] Neste experimento, a expressão dos quatro genes VH humanos foi observada nas amostras analisadas. Ainda, os níveis de expressão foram comparáveis entre camundongos mADAM6-/- e ADAM6+/+. Estes resultados demonstram que os genes VH humanos que foram tanto distais ao sítio de modificação (VH3-23 como VH1-69) quanto proximais ao sítio de modificação (VH1-2 e VH6-1) foram todos capazes de recom- binar-se para formar uma cadeia pesada humana funcionalmente expressa. Estes resultados demonstram que o fragmento genômico ectó- pico compreendendo as sequências ADAM6a e ADAM6b de camundongo inseridas em uma sequência genômica da cadeia pesada humana não afetou recombinação de segmentos gênicos V(D)J da cadeia pesada humana dentro do locus e estes camundongos são capazes de recombinar segmentos gênicos da cadeia pesada humana de maneira normal para produzir proteínas de imunoglobulina da cadeia pesada funcionais.

Exemplo X Identificação de Regiões Variáveis da Cadeia Pesada Humana que se Associam a Regiões Variáveis da Cadeia Leve Humana Selecionadas

[00311] Um sistema de expressão in vitro foi construído para determinar se uma cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada única pode ser co-expressa com cadeias pesadas humanas dos anticorpos humanos específicos para o antígeno.

[00312] Os métodos para geração de anticorpos humanos em ca-mundongos geneticamente modificados são conhecidos (ver por exemplo, US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, camundongo humanizado VELOCIMMUNE®). A tecnologia de camundongo humanizado VELOCIMMUNE® envolve a geração de um camundongo geneticamente modificado tendo um genoma compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve humana operacionalmente ligadas aos loci de região constante de camundongo endógenos tais que o camundongo produza um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta à estimulação anti- gênica. DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves dos anticorpos produzidos de camundongo humanizado VELO- CIMMUNE® são totalmente humanos. Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como descrito abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. Regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar um anticorpo totalmente humano que contém um iso- tipo não IgM, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 selvagens ou modificadas. Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, a ligação do antígeno de alta afinidade e características de especificidade alvo residem na região variável.

[00313] Camundongo humanizado VELOCIMMUNE® foi imunizado com um fator de crescimento que promove angiogênese (Antígeno C) e os anticorpos humanos específicos para o antígeno foram isolados e sequenciados para uso de gene V usando técnicas padrão reconhecidas na técnica. Os anticorpos selecionados foram clonados para regiões constantes da cadeia pesada e leve humana e 69 cadeias pesadas foram selecionadas para parear com uma de três cadeias leves humanas: (1) a cadeia leve K cognata ligou-se a uma região constante K humana, (2) uma linhagem germinativa humana rearranjada VK1-39JK5 ligada a uma região constante k humana, ou (3) uma linhagem germina- tiva humana rearranjada Vk3-20Jk1 ligada a uma região constante k humana. Cada par de cadeia pesada e cadeia leve foi co-transfectado em células CHO-K1 usando técnicas padrão. A presença do anticorpo no sobrenadante foi detectada por IgG anti-humana em um ensaio ELISA.O título de anticorpo (ng/ml) foi determinado para cada par de cadeia leve/cadeia pesada e os títulos com as cadeias leves de linhagem ger- minativa rearranjadas diferentes foram comparados com os títulos obtidos com a molécula de anticorpo parental (isto é, cadeia pesada pare- ada com a cadeia leve cognata) e porcentagem do título nativo foi calculada (Tabela 10). VH: gene variável da cadeia pesada. ND: nenhuma expressão detectada sob condições experimentais atuais.Tabela 10

[00314] Em um experimento similar, camundongos humanizados VE- LOCIMMUNE® foram imunizados com vários antígenos diferentes e ca-deias pesadas selecionadas de anticorpos humanos específicos para o antígeno foram testadas para sua capacidade de parear com cadeias leves de linhagem germinativa humana rearranjadas diferentes (como descrito acima). Os antígenos usados neste experimento incluíram uma enzima envolvida na homeostase de colesterol (Antígeno A), um hormônio de soro envolvido na regulação de homeostase de glicose (Antígeno B), um fator de crescimento que promove angiogênese (Antígeno C) e um receptor de superfície celular (Antígeno D). Os anticorpos específicos para o antígeno foram isolados de camundongos de cada grupo de imunização e regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve foram clonadas e sequenciadas. Da sequência das cadeias pesadas e leves, uso do gene V foi determinado e as cadeias pesadas selecionadas foram pareadas com sua cadeia leve cognata ou com uma região VK1- 39JK5 de linhagem germinativa humana rearranjada. Cada par de cadeia pesada / cadeia leve foi co-transfectado em células CHO-K1 e a presença do anticorpo no sobrenadante foi detectada por anti-IgG humana em um ensaio ELISA. O título de anticorpo (μg/ml) foi determinado para cada pareamento de cadeia pesada / cadeia leve e os títulos com as cadeias leves de linhagem germinativa humanas rearranjadas diferentes foram comparados com os títulos obtidos com a molécula de anticorpo parental (isto é, cadeia pesada pareada com a cadeia leve cognata) e porcentagem do título nativo foi calculada (Tabela 11). VH: gene variável da cadeia pesada. VK: gene variável da cadeia leve de K. ND: nenhuma expressão detectada sob condições experimentais atuais.Tabela 11

[00315] Os resultados obtidos destes experimentos demonstram que cadeias pesadas somaticamente mutadas, de alta afinidade, de famílias gênicas diferentes são capazes de parear com regiões VK1-39JK5 e VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana rearranjada e serem se- cretadas da célula como uma molécula de anticorpo normal. Como mostrado na Tabela 10, o título de anticorpo foi aumentado para aproximadamente 61% (42 de 69) de cadeias pesadas quando pareadas com a cadeia leve de VK1-39JK5 humana rearranjada e aproximadamente 29% (20 de 69) de cadeias pesadas quando pareadas com a cadeia leve de VK3-20JK1 humana rearranjada quando comparada com a cadeia leve cognata do anticorpo parental. Para aproximadamente 20% (14 de 69) das cadeias pesadas, ambas as cadeias leves de linhagem germinativa humanas rearranjadas conferiram um aumento na expressão quando comparadas com a cadeia leve cognata do anticorpo parental. Como mostrado na Tabela 11, a região VK1-39JK5 de linhagem germinativa humana rearranjada conferiu um aumento na expressão de várias cadeias pesadas específicas para uma faixa de classes diferentes de an- tígenos quando comparadas com a cadeia leve cognata dos anticorpos parentais. O título de anticorpo foi aumentado em mais de duas vezes do que de aproximadamente 35% (15/43) das cadeias pesadas quando comparadas com a cadeia leve cognata dos anticorpos parentais. Para duas cadeias pesadas (315 e 316), o aumento foi maior do que dez vezes quando comparado com o anticorpo parental. Dentro de todas as cadeias pesadas que mostraram a expressão de aumento em relação à cadeia leve cognata do anticorpo parental, a família de três cadeias pesadas (VH3) é super-representada em comparação com outras famílias gênicas de região variável da cadeia pesada. Isto demonstra uma relação favorável de cadeias pesadas VH3 humanas para parear com cadeias leves VK1-39JK5 e VK3-20JK1 da linhagem germinativa humana rearranjada.

Exemplo XI Geração de um Locus da Cadeia Leve de Linhagem Germinativa Humana Rearranjada

[00316] Vários vetores de direcionamento da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjados foram feitos usando tecnologia de engenharia genética VELOCIGENE® (ver, por exemplo, Pat. US No. 6.586.251 e Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) para modificar os clones 302g12 e 254m04 de Cromossomo Bacteriano Artificial (BAC) genômico de camundongo (Invitrogen). Ao usar estes dois clones de BAC, construtos genômicos foram engendrados para conter uma região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada única e inseridos em um locus da cadeia leve K endógeno que foi anteriormente modificado para deletar a variável K endógena e juntar segmentos gênicos.

Construção de Vetores de Direcionamento da Cadeia Leve de Li-nhagem Germinativa Humana Rearranjada.

[00317] Três regiões da cadeia leve de linhagem germinativa humanas rearranjada diferentes foram feitas usando técnicas de biologia molecular padrão reconhecidas na técnica. Os segmentos gênicos variáveis humanos usados para construir estas três regiões incluíram a sequência Vk1-39Jk5 humana rearranjada, uma sequência Vk3-20Jk1 humana rearranjada e uma sequência VpreBJI5 humana rearranjada.

[00318] Um segmento de DNA contendo éxon 1 (codificação do pep- tídeo líder) e íntron 1 do gene Vk3-7 de camundongo foi feito por síntese de novo de DNA (Integrated DNA Technologies). A parte da 5’ região não traduzida até um sítio de enzima de restrição BlpI que ocorre naturalmente foi incluída. Éxons de genes Vk1-39 e Vk3-20 humanos foram amplificados por PCR de bibliotecas de BAC genômico humano. Os iniciadores de sentido direto tinham uma extensão 5’ contendo o sítio de aceptor de junção do íntron 1 do gene Vk3-7 de camundongo. O iniciador de sentido reverso usado para PCR da sequência Vk1-39 humana incluiu uma extensão que codifica Jk5 humano, ao passo que o iniciador de sentido reverso usado para PCR da sequência Vk3-20 humana incluiu uma extensão que codifica JK1 humano. A sequência VpreBJÀ5 humana foi feita por síntese de novo de DNA (Integrated DNA Technologies). Uma porção do íntron Jk-Ck humano incluindo o sítio doador de junção foi amplificado por PCR do plasmídeo pBS-296-HA18-PISceI. O iniciador de PCR de sentido direto incluiu uma parte de codificação de extensão de uma sequência JK5, JK1 ou JÀ5 humana. O iniciador de sentido reverso incluiu um sítio PI-SCEI, que foi anteriormente engendrado no íntron.

[00319] O éxon 1/íntron 1 de camundongo VK3-7, éxons da cadeia leve variável humana e fragmentos de íntron JK-CK humano foram conectados pela PCR de extensão de sobreposição, digeridos com BlpI e PI-SceI, e ligados no plasmídeo pBS-296-HA18-PISceI, que continha o promotor do segmento gênico variável Vk3-15 humano. Um cassete de higromicina loxed dentro do plasmídeo pBS-296-HA18-PISceI foi substituído por um cassete de higromicina FRTed flanqueado de sítios AscI e NotI. O fragmento NotI/PI-SceI deste plasmídeo foi ligado no BAC 254m04 de camundongo modificado, que continha a parte do íntron Jk- Ck de camundongo, o éxon de Ck de camundongo e aproximadamente 75 kb da sequência genômica a jusante do locus k de camundongo que forneceu um braço de homologia 3’ para recombinação homóloga nas células ES de camundongo. O fragmento NotI/AscI deste BAC então foi ligado no BAC 302g12 de camundongo modificado, que continha um cassete de neomicina FRTed e aproximadamente 23 kb da sequência genômica a montante do locus k endógeno para recombinação homóloga nas células ES de camundongo.

Vetor de Direcionamento VK1-39JK5 de Linhagem Germinativa Humana Rearranjada (FIG. 19).

[00320] Os sítios enzimáticos de restrição foram introduzidos nas ex-tremidades 5’ e 3’ de um inserto da cadeia leve engendrado para clonagem em um vetor de direcionamento: um sítio AscI na extremidade 5’ e um sítio PI-SCEI na extremidade 3’. Dentro do sítio AscI 5’ e do sítio PISCEI 3’, o construto de direcionamento de 5’ a 3’ incluiu um braço de homologia 5’ contendo a sequência 5’ para o locus da cadeia leve k de camundongo endógena obtida do clone de BAC 302g12 de camundongo, um gene de resistência à neomicina FRTed, uma sequência genômica incluindo o promotor VK3-15 humano, uma sequência líder do segmento gênico variável VK3-7 de camundongo, uma sequência de ín- tron do segmento gênico variável VK3-7 de camundongo, uma região de leitura aberta de uma região VK1-39JK5 de linhagem germinativa humana rearranjada, uma sequência genômica contendo uma porção do íntron JK-CK humano e um braço de homologia 3’ contendo a sequência 3’ do segmento gênico JK5 de camundongo endógeno obtido do clone de BAC 254m04 de camundongo (Figura 19, meio). Genes e/ou sequências a montante do locus da cadeia leve k de camundongo endógena e a jusante da maior parte do segmento gênico Jk 3’ (por exemplo, poten- cializador endógeno 3’) não foram modificados pelo construto de direcionamento (ver a Figura 19). A sequência do locus Vk1-39Jk5 humano engendrado é mostrada na SEQ ID NO:59.

[00321] A inserção direcionada da região Vk1-39Jk5 de linhagem germinativa humana rearranjada em DNA de BAC foi confirmada pela reação de polimerase em cadeia (PCR) usando iniciadores localizados em sequências dentro da região da cadeia leve da linhagem germinativa humana rearranjada. Resumidamente, a sequência de íntron 3’ à sequência líder Vk3-7 de camundongo foi confirmada com iniciadores ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO:60) e ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO:61). A região de leitura aberta da região Vk1-39Jk5 de linhagem germinativa humana rearranjada foi confirmada com iniciadores 1633- h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ ID NO:62) e 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ ID NO:63). O cassete de neo- micina foi confirmado com iniciadores neoF (ggtggagagg ctattcggc; SEQ ID NO:64) e neoR (gaacacggcg gcatcag; SEQ ID NO:65). DNA de BAC alvo então foi usado para eletroporar células ES de camundongo para criar células ES modificadas para gerar camundongos quiméricos que expressam uma região Vk1-39Jk5 de linhagem germinativa humana rearranjada.

[00322] Os clones de células ES positivos foram confirmados pelo rastreamento Taqman™ e cariotipagem usando sondas específicas para a região da cadeia leve VK1-39JK5 engendrada inserida no locus endógeno. Resumidamente, a sonda neoP (TGGGCACAAC AGACAA- TCGG CTG; SEQ ID NO:66) que se liga dentro do gene marcador de neomicina, sonda ULC-m1P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTG- TTC; SEQ ID NO:67) que se liga dentro da sequência de íntron 3’ à sequência líder VK3-7 de camundongo e sonda 1633h2P (ATCAGCA- GAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO:68) que se liga dentro da região de leitura aberta VK1-39JK5 da linhagem germinativa humana re- arranjada. Os clones de células ES positivos então foram usados para implantar camundongos fêmeas para dar origem a uma ninhada de filhotes que expressam a região da cadeia leve de VK1-39JK5 da linhagem germinativa.

[00323] Alternativamente, células ES carregando a região da cadeia leve de VK1-39JK5 de linhagem germinativa humana rearranjada é transfectada com um construto que expressa FLP a fim de remover o cassete de neomicina FRTed introduzido pelo construto de direcionamento. Opcionalmente, o cassete de neomicina é removido por reprodução a camundongos que expressam FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é conservado nos camundongos.

Vetor de Direcionamento VK3-20JK1 de Linhagem Germinativa Humana Rearranjada (FIG. 20).

[00324] De uma maneira similar, um locus da cadeia leve engendrado que expressa uma região de VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana rearranjada foi feita usando um construto de direcionamento incluindo, de 5’ a 3’, um braço de homologia 5’ que contém sequência 5’ ao locus da cadeia leve K de camundongo endógena obtido do clone de BAC 302g12 de camundongo, um gene de resistência à neomicina FRTed, uma sequência genômica incluindo o promotor VK3-15 humano, uma sequência líder do camundongo segmento gênico variável de VK3- 7, uma sequência de íntron do segmento gênico variável VK3-7 de ca-mundongo, uma região de leitura aberta de uma região de VK3-20JK1 de linhagem germinativa humana rearranjada, uma sequência genô- mica que contém uma porção do íntron JK-CK humano e um braço de homologia 3’ que contém sequência 3’ do segmento gênico JK5 de camundongo endógeno obtido do clone de BAC 254m04 de camundongo (Figura 20, meio). A sequência do locus Vk3-20Jk1 humano engendrado é mostrada na SEQ ID NO:69.

[00325] A inserção direcionada da região de Vk3-20Jk1 de linhagem germinativa humana rearranjada em DNA BAC foi confirmada pela reação de polimerase em cadeia (PCR) usando iniciadores localizados em sequências dentro da região da cadeia leve de Vk3-20Jk1 de linhagem germinativa humana rearranjada. Resumidamente, a sequência de ín- tron 3’ à sequência líder de Vk3-7 de camundongo foi confirmada com iniciadores ULC-m1F (SEQ ID NO:60) e ULC-m1R (SEQ ID NO:61). A região de leitura aberta da região de Vk3-20Jk1 de linhagem germina- tiva humana rearranjada foi confirmada com iniciadores 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO:70) e 1635-h2R (AAGTAG- CTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO:71). O cassete de neomi- cina foi confirmado com iniciadores neoF (SEQ ID NO:64) e neoR (SEQ ID NO:65). DNA de BAC direcionado então foi usado para eletroporar células ES de camundongo para células ES modificadas criadas para gerar camundongos quiméricos que expressam cadeia leve de Vk3- 20Jk1 de linhagem germinativa humana rearranjada.

[00326] Os clones de células ES positivos foram confirmados pelo rastreamento Taqman™ e cariotipagem usando sondas específicas para a região da cadeia leve Vk3-20Jk1 engendrada inserida no locus da cadeia leve K endógeno. Resumidamente, a sonda neoP (SEQ ID NO:66) que se liga dentro do gene marcador de neomicina, a sonda ULC-m1P (SEQ ID NO:67) que se liga dentro da sequência líder Vk3-7 de camundongo e a sonda 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO:72) que se liga dentro da região de leitura aberta de Vk3-20Jk1 humano. Os clones de células ES positivos então foram usados para implantar em camundongos fêmeas. Uma ninhada de filhotes expressando a região da cadeia leve de Vk3-20Jk1 de linhagem germi- nativa humana.

[00327] Alternativamente, células ES carregando a região da cadeia leve de Vk3-20Jk1 de linhagem germinativa humana pode ser transfec- tada com um construto que expressa FLP a fim de remover o cassete de neomicina FRTed introduzido pelo construto de direcionamento. Op-cionalmente, o cassete de neomicina pode ser removido por reprodução de camundongos que expressam FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é conservado nos camundongos.

Vetor de Direcionamento de VpreBJI5 de Linhagem germinativa Humana rearranjada (FIG. 21).

[00328] De uma maneira similar, um locus da cadeia leve engendrado que expressa uma região de VpreBJI5 de linhagem germinativa humana rearranjada foi feito usando um construto de direcionamento incluindo, de 5’ a 3’, um braço de homologia 5’ contendo a sequência 5’ ao locus da cadeia leve k de camundongo endógeno obtido do clone de BAC 302g12 de camundongo, um gene de resistência à neomicina FRTed, uma sequência genômica incluindo o promotor Vk3-15 humano, uma sequência líder do segmento gênico variável de Vk3-7 de camundongo, uma sequência de íntron do segmento gênico variável de Vk3-7 de camundongo, uma região de leitura aberta de uma região de VpreBJÀ5 de linhagem germinativa humana rearranjada, uma sequência genômica que contém uma porção do íntron JK-CK humano e um braço de homologia 3’ contendo a sequência 3’ do segmento gê- nico de Jk5 de camundongo endógeno obtido do clone de BAC 254m04 de camundongo (Figura 21, meio). A sequência do locus VpreBJI5 humano engendrado é mostrada na SEQ ID NO:73.

[00329] A inserção direcionada da região VpreBJÀ5 de linhagem ger- minativa humana rearranjada em DNA de BAC foi confirmada pela reação de polimerase em cadeia (PCR) usando iniciadores localizados em sequências dentro da região da cadeia leve de região VpreBJÀ5 de li-nhagem germinativa humana rearranjada. Resumidamente, a sequência de íntron 3’ à sequência líder Vk3-7 de camundongo foi confirmada com iniciadores ULC-m1F (SEQ ID NO:60 e ULC-m1R (SEQ ID NO:61). A região de leitura aberta da região VpreBJÀ5 de linhagem germinativa humana rearranjada foi confirmada com iniciadores 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO:74) e 1616-h1R (CCGATGT- CAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO:75). O cassete de neomicina foi con-firmado com iniciadores neoF (SEQ ID NO:64) e neoR (SEQ ID NO:65). DNA de BAC direcionado então foi usado para eletroporar células ES de camundongo para criar células ES modificadas para gerar camundongos quiméricos que expressam a cadeia leve de VpreBJÀ5 de linhagem germinativa humana rearranjada.

[00330] Os clones de células ES positivos são confirmados pelo ras- treamento Taqman™ e cariotipagem usando sondas específicas para a região da cadeia leve VpreBJÀ5 engendrada inserida no locus da cadeia leve k endógeno. Resumidamente, a sonda neoP (SEQ ID NO:66) que se liga dentro do gene marcador de neomicina, sonda ULC-m1P (SEQ ID NO:67) que se liga dentro da sequência líder IgVk3-7 de camundongo e a sonda 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO:76) que se liga dentro da região de leitura aberta de VpreBJÀ5 humano. Os clones de células ES positivos então são usados para implantar camundongos fêmeas para dar origem a uma ninhada de filhotes que expressam uma região da cadeia leve de linhagem germina- tiva.

[00331] Alternativamente, as células ES carregando a região da cadeia leve de VpreBJI5 de linhagem germinativa humana rearranjada é transfectada com um construto que expressa FLP a fim de remover o cassete de neomicina FRTed introduzido pelo construto de direcionamento. Opcionalmente, o cassete de neomicina é removido por reprodução para camundongos que expressam FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é conservado nos camundongos.

Exemplo XII Geração de Camundongos que expressam uma cadeia leve humana rearranjada única

[00332] As células ES direcionadas descritas acima foram usadas como células ES doadoras e introduzidas em um embrião de camundongo de estágio de 8 células pelo método VELOCIMOUSE® (ver, por exemplo, Pat. US No. 7.294.754 e Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99. VELOCIMICE® carregando independentemente uma região da cadeia leve VK1-39JK5 de linhagem germinativa humana engendrada, uma região da cadeia leve VK3-20JK1 ou uma região da cadeia leve VpreBJÀ5 são identificados pela genotipagem usando uma modificação do ensaio de alelo (Valenzuela et al., supra) que detecta a presença da região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rear- ranjada única.

[00333] Os filhotes são genotipados e um filhote heterozigoto ou ho- mozigoto para a região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada única são selecionados para caracterização da expressão da região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada.

Citometria de fluxo.

[00334] A expressão da região da cadeia leve humana rearranjada no repertório de anticorpo normal de camundongos da cadeia leve comum foi validada pela análise de expressão de imunoglobulina K e À em esplenócitos e sangue periférico de camundongos da cadeia leve comum. As suspensões celulares de baços coletados e sangue periférico de camundongos selvagens (n=5), heterozigotos da cadeia leve comum Vk1-39Jk5 (n=3), homozigotos da cadeia leve comum Vk1-39Jk5 (n=3), heterozigotos da cadeia leve comum Vk3-20Jk1 (n=2) e homozigotos da cadeia leve comum Vk3-20Jk1 (n=2) foram produzidos usando métodos padrão e marcado com CD19+, IgI+ e Igk+ usando anticorpos fluorescen-temente marcados (BD Pharmigen).

[00335] Resumidamente, 1x106 células foram incubadas com anti- CD16/CD32 de camundongo (clone 2.4G2, BD Pharmigen) em gelo por 10 minutos, seguidos por marcação com o seguinte coquetel de anticorpo por 30 minutos em gelo: anti-CD19 de camundongo conjugado a APC (clone 1D3, BD Pharmigen), anti-CD3 de camundongo conjugado a PerCP-Cy5.5 (clone 17A2, BioLegend), anti-Igk de camundongo conjugado a FITC (clone 187.1, BD Pharmigen), anti-IgÀ de camundongo conjugado a PE (clone RML-42, BioLegend). Seguinte à marcação, as células foram lavadas e fixadas em formaldeído 2%. A aquisição de dados foi realizada em um citômetro LSRII e analisados com FlowJo™. Passagem: células B totais (CD19+CD3-), células B Igk+ (Igk+IgI- CD19+CD3-), células B IgI+ (Igk-IgI+CD19+CD3-). Os dados reunidos de sangue e amostras de esplenócito demonstraram resultados similares. A tabela 12 apresenta o percentual de células B positivas CD19+ do sangue periférico de um camundongo representativo de cada grupo que são IgI+, Igk+, ou IgI+Igk+. Percentual de células B CD19+ no sangue periférico de camundongos selvagens (WT) e homozigotos para a cadeia leve comum VK1-39JK5 ou para VK3-20JK1 são mostrados na FIG. 22.Tabela 12

Expressão da Cadeia Leve Comum.

[00336] A expressão de cada cadeia leve comum (VK1-39JK5 e VK3- 20JK1) foi analisada em camundongos heterozigotos e homozigotos usando um ensaio de PCR quantitativa (por exemplo, Taqman™).

[00337] Resumidamente, células B CD19+ foram purificadas dos baços de camundongos selvagens, homozigotos para uma substituição dos loci de região variável da cadeia pesada de camundongo e da cadeia leve K pelos loci de região variável da cadeia pesada humana correspondente e da cadeia leve K (HK), bem como camundongos homozi- gotos e heterozigotos para cada região da cadeia leve humana rearran- jada (Vk1-39Jk5 ou Vk3-20Jk1) usando Microcontas de CD19 de camundongo (Miltenyi Biotec) de acordo com as especificações do fabricante. RNA total foi purificado de células B CD19+ usando kit RNeasy™ Mini (Qiagen) de acordo com especificações do fabricante e RNA genô- mico foi removido usando um tratamento com DNase isenta de RNase em coluna (Qiagen). 200 ng de mRNA foram transcritos reversamente em cDNA usando kit de Síntese First Stand cDNA (Invitrogen) e o cDNA resultante foi amplificado com Taqman™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Todas as reações foram realizadas usando o Sistema de Detecção de Sequência ABI 7900 (Applied Biosystems) usando iniciadores e sondas MGB Taqman™ que transpõem (1) a ligação Vk- Jk de ambas as cadeias leves comuns, (2) o gene Vk sozinho (isto é, Vk1-39 e Vk3-20), e (3) região Ck de camundongo. A tabela 13 apresenta as sequências dos iniciadores e sondas empregadas para este ensaio. A expressão relativa foi normalizada à expressão da região CK de camundongo. Os resultados são mostrados na FIG. 23A, 23B e 23C.Tabela 13

Anticorpos de Cadeia Leve Comum Específicos para o Antígeno.

[00338] Os camundongos da cadeia leve comum carregando uma cadeia leve comum de Vk1-39Jk5 ou Vk3-20Jk1 no locus da cadeia leve de camundongo endógena k foram imunizados com β-galactosidase e o título de anticorpo foi medido.

[00339] Resumidamente, β-galactosidase (Sigma) foi emulsionada no adjuvante TITERMAX™ (Sigma), de acordo com as instruções do fabricante. Selvagens (n=7), homozigotos da cadeia leve comum Vk1- 39JK5 (n=2) e homozigotos da cadeia leve comum VK3-20JK1 (n=5) foram imunizados pela injeção subcutânea com 100 μg de β-galactosi- dase /TITERMAX™. Os camundongos foram estimulados pela injeção subcutânea duas vezes, 3 semanas à parte, com 50 μg de β-galactosi- dase/TITERMAX™. Após o segundo estímulo, o sangue foi coletado de camundongos anestesiados usando uma sangria retro-orbital em tubos separadores de soro (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Para medir anticorpos IgG ou IgM anti-β-galactosidase, placas de ELISA (Nunc) foram recobertas com 1 μg/mL de β-galactosidase durante a noite a 4°C. O antígeno em excesso foi lavado antes de bloquear com PBS com BSA 1% por uma hora à temperatura ambiente. Diluições seriais do soro foram adicionadas às placas e incubadas por uma hora à temperatura ambiente antes da lavagem. As placas então foram incubadas com anti-IgM (Southern Biotech) ou anti-IgG (Southern Biotech) conjugados a HRP por uma hora à temperatura ambiente. Após outra lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato de TMB (BD Biosciences). As reações foram paradas com ácido sulfúrico 1N e OD450 foi lida usando Leitor de Placa Victor X5 (Perkin Elmer). Os dados foram analisados com Prisma GRAPHPAD™ e o sinal foi calculado como a diluição do soro que está duas vezes acima do fundo. Os resultados são mostrados na FIG. 24A e 24B.

[00340] Como mostrado neste Exemplo, a proporção de células B K/À tanto nos compartimentos esplênicos como nos periféricos de camundongos da cadeia leve comum de Vk1-39Jk5 e Vk3-20Jk1 demonstraram um modelo próximo do selvagem (Tabela 12 e FIG. 22). Os camundongos da cadeia leve comum de VpreBJà5, entretanto, demonstraram menos células B periféricas, das quais aproximadamente 1-2% expressam a região da cadeia leve humana engendrada (dados não mostrados). Os níveis de expressão das regiões da cadeia leve humanas rear- ranjadas de Vk1-39Jk5 e Vk3-20Jk1 do locus da cadeia leve k endógeno foram elevados em comparação com um locus da cadeia leve K endógeno que contém uma substituição completa dos segmentos gênicos VK e Jk de camundongo por segmentos gênicos Vk e Jk humanos (FIG. 23A, 23B e 23C). Os níveis de expressão da região da cadeia leve humana VpreBJÀ5 rearranjada demonstrou alta expressão similar do locus da cadeia leve k endógeno tanto em camundongos heterozigotos como em homozigotos (dados não mostrados). Isto demonstra que na competição direta com loci da cadeia leve endógenos À, K ou ambos de camundongo, uma sequência VL/JL humana rearranjada única pode ter rendimento melhor do que a expressão de nível selvagem do locus da cadeia leve k endógeno e dar origem à frequência de célula B normal esplênica e sanguínea. Além disso, a presença de um locus da cadeia leve k engendrado tendo uma sequência Vk1-39Jk5 humana ou Vk3- 20Jk1 humana foi bem tolerada pelos camundongos e parece funcionar no modo selvagem representando uma porção substancial do repertório da cadeia leve no componente humoral da resposta imune (FIG. 24A e 24B).

Exemplo XIII Reprodução de Camundongos Expressando uma Cadeia Leve de Linhagem Germinativa Humana Rearranjada Única

[00341] Este Exemplo descreve várias outras linhagens de camundongo geneticamente modificadas que podem ser reproduzidas por qualquer um dos camundongos da cadeia leve comum descritos neste pedido para criar linhagens de camundongo múltiplas geneticamente modificadas que abrigam loci de imunoglobulina múltiplos geneticamente modificados.

Nocaute de IgÀ endógena (KO).

[00342] Para otimizar o uso do locus da cadeia leve engendrado, os camundongos carregando uma das regiões da cadeia leve de linhagem germinativa humanas rearranjadas são reproduzidos com outro camundongo que contém uma deleção no locus da cadeia leve À endó-geno. Desta maneira, a progênie obtida expressará, como sua única cadeia leve, a região da cadeia leve de linhagem germinativa humana re- arranjada como descrito no Exemplo 11. A reprodução é realizado por técnicas padrão reconhecidas na técnica e, alternativamente, por um criador comercial (por exemplo, Jackson Laboratories). As linhagens de camundongo que carregam um locus da cadeia leve engendrado e uma deleção do locus da cadeia leve À endógeno são rastreadas para presença da região da cadeia leve única e ausência de cadeias leves À de camundongo endógenas.

Locus da Cadeia Pesada Endógena Humanizado.

[00343] Os camundongos carregando um locus da cadeia leve de linhagem germinativa humana engendrada são reproduzidos com camundongos contendo uma substituição do locus gênico variável da cadeia pesada de camundongo endógeno pelo locus gênico variável da cadeia pesada humana (ver US 6.596.541; camundongo humanizado VELOCIMMUNE®, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). Camundongo humanizado VELOCIMMUNE® compreende um genoma que compreende regiões variáveis da cadeia pesada humana operacionalmente ligadas ao loci de região constante de camundongo endógenos tais que o camundongo produza anticorpos que compreendem uma região variável da cadeia pesada humana e uma região constante de camundongo da cadeia pesada em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas dos anticorpos é isolado e operacionalmente ligado ao DNA que codifica regiões constantes da cadeia pesada humana. DNA então é expresso em uma célula capaz de expressar a cadeia pesada totalmente humana do anticorpo.

[00344] Os camundongos carregando uma substituição do locus de VH de camundongo endógeno pelo locus VH humano e uma região de VL de linhagem germinativa humana rearranjada única no locus da cadeia leve K endógeno são obtidos. Anticorpos quiméricos reversos contendo cadeias pesadas somaticamente mutadas (VH humano e CH de camundongo) com uma cadeia leve humana única (VL humano e CL de camundongo) são obtidos na imunização com um antígeno de interesse. As sequências nucleotídicas VH e VL de células B expressando os anticorpos são identificadas e os anticorpos totalmente humanos são produzidos pela fusão de sequências nucleotídicas VH e VL a sequências nucleotídicas CH e CL humanas em um sistema de expressão adequado.

Exemplo XIV Geração de Anticorpos de Camundongos Expressando Cadeias Pesadas Humanas e uma Região da Cadeia Leve de Linhagem Ger- minativa Humana Rearranjada

[00345] Após reprodução de camundongos contendo a região da cadeia leve humana engendrada para várias linhagens desejadas que contêm modificações e deleções de outros loci de Ig endógenos (como descrito no Exemplo 12), camundongos selecionados podem ser imunizados com um antígeno de interesse.

[00346] Geralmente, um camundongo humanizado VELOCIMMUNE® que contém uma das regiões da cadeia leve de linhagem germinativa humanas rearranjadas únicas é desafiado com um antígeno, e as células linfáticas (como Células B) são recuperadas do soro dos animais. As células linfáticas são fundidas com uma linhagem celular de mieloma para preparar linhagens celulares de hibridoma imortais, e tais linhagens celulares de hibridoma são rastreadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos que contêm variáveis da cadeia pesada humana e cadeias leves de linhagem ger- minativa humanas rearranjadas que são específicas para o antígeno usado para a imunização. DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e da cadeia leve é isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e cadeia leve. Devido à presença das sequências de camundongo endógenas e quaisquer elementos presentes adicionais atuando sobre o cis no locus endógeno, a cadeia leve única de cada anticorpo pode ser somaticamente mutada. Isto adiciona diversidade adicional ao repertório específico para o antígeno que compreende uma cadeia leve única e diversas sequências da cadeia pesada. As sequências de anticorpo clonadas resultantes são posteriormente expressas em uma célula, como uma célula CHO. Alternativamente, DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos para o antígeno ou os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas é identificado diretamente de linfócitos específicos para o antí- geno.

[00347] Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de ca-mundongo. Como descrito acima, os anticorpos são caracterizados e selecionados para características desejáveis, incluindo afinidade, sele-tividade, epítopo, etc. Regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo totalmente humano que contém uma cadeia pesada humana so-maticamente mutada e uma cadeia leve única derivada de uma região da cadeia leve de linhagem germinativa humana rearranjada da invenção. Regiões constantes humanas adequadas incluem, por exemplo, IgG1 ou IgG4 selvagem ou modificada.

[00348] Coortes separados de camundongos humanizados VELO- CIMMUNE® que contêm uma substituição do locus da cadeia pesada de camundongo endógena por segmentos gênicos VH, DH, e JH humanos e uma substituição do locus da cadeia leve K de camundongo endógena pela região da cadeia leve humana da linhagem germinativa engendrada Vk1-39Jk5 ou pela região da cadeia leve humana da linhagem germinativa engendrada Vk3-20Jk1 (descrita acima) foram imunizados com uma proteína de receptor de superfície de célula humana (Antígeno E). O antígeno E é administrado diretamente para o coxim plantar traseiro de camundongos com seis injeções consecutivas a cada 3-4 dias. Dois a três microgramas de Antígeno E são misturados com 10 μg do oligonucleotídeo CpG (Cat # tlrl-modn - oligonucleotídeo ODN1826; InVivogen, San Diego, CA) e 25 μg de Adju-Phos (Adjuvante de gel de fosfato de alumínio, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca) antes de injeção. Um total de seis injeções são dadas antes da recuperação antigênica final, que é dada 3-5 dias antes do sacrifício. Sangrias após a 4a e a 6a injeção são coletados e a resposta imune de anticorpo é monitorada por um imunoensaio específico para o antígeno padrão.

[00349] Quando uma resposta imune desejada é alcançada, os es- plenócitos são coletados e fundidos com células de mieloma de camun-dongo para conservar sua viabilidade e linhagens celulares de hibri- doma de forma. As linhagens celulares de hibridoma são rastreadas e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos de cadeia leve comum específicos para Antígeno E. Usando esta técnica, vários anticorpos de cadeia leve comum específicos para Antí- geno E (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis da cadeia pesada humana, o mesmo domínio variável da cadeia leve humana e domínios constantes de camundongo) são obtidos.

[00350] Alternativamente, anticorpos de cadeia leve comum anti-antí- geno E são isolados diretamente de células B positivas para o antígeno sem fusão a células de mieloma, como descrito em U.S. 2007/0280945A1, neste pedido especificamente incorporado por referência em sua totalidade. Usando este método, vários anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E totalmente humanos (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis da cadeia pesada humana, uma cadeia leve VK1- 39JK5 humana engendrada ou uma região da cadeia leve VK3-20JK1 humana engendrada e domínios constantes humanos) foi obtido.

[00351] As propriedades biológicas de anticorpos anti-antígeno E exemplares da cadeia leve comum gerados conforme os métodos deste Exemplo são descritas detalhadamente abaixo.

Exemplo XV Uso de Segmento Gênico da Cadeia Pesada em Anticorpos de cadeia leve Comuns Específicos para o Antígeno

[00352] Para analisar a estrutura de anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E humano produzidos, ácidos nucleicos que codificam regiões variáveis de anticorpo da cadeia pesada foram clonados e sequenciados. Das sequências de ácidos nucleicos e das sequências de aminoácidos preditas dos anticorpos, o uso gênico foi identificado para a região variável da cadeia pesada (HCVR) de anticorpos de cadeia leve comum selecionados obtidos de camundongos humanizados VELOCIMMUNE® imunizados que contêm a cadeia leve VK1 -39JK5 humana engendrada ou a região da cadeia leve VK3-20JK1 humana engendrada. Os resultados são mostrados nas Tabelas 14 e 15, que demonstram que os camundongos de acordo com a invenção geram anticorpos de cadeia leve comum específicos para o antígeno de uma variedade de segmentos gênicos da cadeia pesada humana, devido a uma variedade de rearranjos, ao empregar um camundongo que expressa uma cadeia leve de somente um VKl-39-humano ou uma cadeia leve derivada de VK3-20 humano. Os segmentos gênicos VH humanos das 2, 3, 4, e 5 famílias rearranjadas com uma variedade de segmentos DH humanos e segmentos JH humanos para produzir anticorpos específicos para o antígeno.Tabela 14 Tabela 15

Exemplo XVI Determinação de Capacidade de Bloqueio de Anticorpos de cadeia leve Comum Específicos para o Antígeno por Ensaio LUMINEX™

[00353] Noventa e oito anticorpos de cadeia leve comum humanos originados contra o Antígeno E foram testados para sua capacidade de bloquear a ligação do ligante natural de Antígeno E (Ligante Y) ao Antí- geno E em um ensaio baseado em contas.

[00354] O domínio extracelular (ECD) do Antígeno E foi conjugado a dois marcadores de epítopo myc e um marcador histidina 6X (Antígeno E-mmH) e acoplado pela amina a microesferas carboxiladas em uma concentração de 20 μg/mL no tampão de MES. A mistura foi incubada por duas horas à temperatura ambiente seguida da desativação de conta com Tris 1M pH 8,0 seguido de lavagem em PBS com Tween-20 0,05% (v/v). As contas então foram bloqueadas com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo BSA 2% (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Em uma placa de 96 poços com filtro, os sobrenadantes que contêm anticorpos de cadeia leve comum específicos para Antí- geno E, foram diluídos 1:15 no tampão. Um controle negativo que contém um sobrenadante sem anticorpo com os mesmos componentes dos meios em relação ao sobrenadante com anticorpo foi preparado. As contas marcadas com Antígeno E foram adicionadas aos sobrenadan- tes e incubadas durante a noite a 4°C. Proteína Y ligante biotinilada foi adicionada a uma concentração final de 0,06 nM e incubada por duas horas à temperatura ambiente. A detecção do ligante Y biotinilado ligado a contas marcadas com Antígeno E-myc-myc-6His foi determinada com R-ficoeritrina conjugada à Estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD) seguido da medida em um analisador baseado em citometria de fluxo LU- MINEX™. Intensidade de Fluorescência Média (MFI) de fundo de uma amostra sem Ligante Y foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão do MFI subtraído do fundo de cada amostra pelo valor de controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[00355] Em um experimento similar, os mesmos 98 anticorpos de cadeia leve comum humanos originados contra o Antígeno E foram testados para sua capacidade de bloquear a ligação do Antígeno E a contas de Ligante marcadas com Y.

[00356] Resumidamente, o Ligante Y foi acoplado por amina a mi- croesferas carboxiladas em uma concentração de 20 μg/mL diluído no tampão de MES. A mistura foi incubada duas horas em temperatura am-biente seguida de desativação de contas com Tris 1M pH 8 então lavagem em PBS com Tween-20 0,05% (v/v). As contas então foram bloqueadas com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo BSA 2% (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Em uma placa de 96 poços com filtro, sobrenadantes que contêm os anticorpos de cadeia leve comum específicos para Antígeno E foram diluídos 1:15 no tampão. Um controle negativo que contém um sobrenadante sem anticorpo com os mesmos componentes dos meios em relação ao sobrenadante de anticorpo foi preparado. Um antígeno E-mmH biotinilado foi adicionado a uma concentração final de 0,42 nM e incubado durante a noite a 4°C. Contas marcadas com ligante Y então foram adicionadas à mistura an- ticorpo/Antígeno E e incubadas por duas horas à temperatura ambiente. A detecção do antígeno E-mmH biotinilado ligado a contas de Ligante Y foi determinada com R-ficoeritrina conjugada à Estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD) seguido da medida em um analisador baseado em citometria de fluxo LUMINEX™. Intensidade de Fluorescência Média (MFI) de fundo de uma amostra sem Antígeno E foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão do MFI subtraído do fundo de cada amostra pelo valor de controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[00357] As tabelas 16 e 17 mostram porcentagem de bloqueio de 98 anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E testados em ambos ensaios de LUMINEX™. ND: não determinado sob condições experi-mentais atuais.Tabela 16 Tabela 17

[00358] No primeiro experimento de LUMINEX™ descrito acima, 80 anticorpos de cadeia leve comum que contêm a cadeia leve engendrada de VK1-39JK5 foram testados para sua capacidade de bloquear a ligação de Ligante Y a contas marcadas com Antígeno E. Destes 80 anticorpos de cadeia leve comum, 68 demonstraram bloqueio >50%, enquanto 12 demonstraram bloqueio <50% (6 no bloqueio de 25-50% e 6 no bloqueio <25%). Já que 18 anticorpos de cadeia leve comum que contêm a cadeia leve de VK3-20JK1 engendrada, 12 demonstraram bloqueio >50%, enquanto 6 demonstraram bloqueio <50% (3 no bloqueio de 25-50% e 3 no bloqueio <25%) de ligação de Ligante Y a contas marcadas com Antígeno E.

[00359] No segundo experimento de LUMINEX™ descrito acima, os mesmos 80 anticorpos de cadeia leve comum que contêm a cadeia leve engendrada de VK1-39JK5 foram testados para sua capacidade de bloquear a ligação do Antígeno E a contas marcadas com Ligante Y. Destes 80 anticorpos de cadeia leve comum, 36 demonstraram bloqueio >50%, enquanto 44 demonstraram bloqueio <50% (27 no bloqueio de 25-50% e 17 no bloqueio <25%). Para os 18 anticorpos de cadeia leve comum que contêm a cadeia leve de VK3-20JK1 engendrada, 1 demonstrou bloqueio >50%, enquanto 17 demonstraram bloqueio <50% (5 no bloqueio de 25-50% e 12 no bloqueio <25%) de ligação do Antígeno E a contas marcadas com Ligante Y.

[00360] Os dados das Tabelas 16 e 17 estabelecem que os rearran- jos descritos nas Tabelas 14 e 15 geraram anticorpos de cadeia leve comum específicos anti-antígeno E que bloquearam a ligação do Li- gante Y ao seu receptor cognato Antígeno E com graus variados de eficácia, que é compatível com anticorpos de cadeia leve comum anti- antígeno E das Tabelas 14 e 15 que compreendem anticorpos com es-pecificidade de epítopo de sobreposição e não sobreposição relativamente ao Antígeno E.

Exemplo XVII Determinação da Capacidade de Bloqueio de Anticorpos de cadeia leve Comum Específicos para o Antígeno por ELISA

[00361] Os anticorpos de cadeia leve comum humanos originados contra o Antígeno E foram testados para sua capacidade de bloquear a ligação de Antígeno E a uma superfície recoberta com Ligante Y em um ensaio ELISA.

[00362] O ligante Y foi recoberto em placas de 96 poços em uma concentração de 2 μg/mL diluído em PBS e incubado durante a noite seguido de lavagem quatro vezes em PBS com Tween-20 0,05%. A placa então foi bloqueada com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo BSA 0,5% (p/v) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) por uma hora à temperatura ambiente. Em uma placa separada, os sobrenadan- tes que contêm anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E foram diluídos 1:10 no tampão. Um sobrenadante sem anticorpo com os mesmos componentes dos anticorpos foi usado como um controle negativo. O antígeno E-mmH (descrito acima) foi adicionado a uma concentração final de 0,150 nM e incubado por uma hora à temperatura ambiente. A mistura anticorpo/Antígeno E-mmH então foi adicionada à placa que contém Ligante Y e incubada por uma hora à temperatura ambiente. A detecção do Antígeno E-mmH ligado ao Ligante Y foi determinada com Peroxidase de Rábano Silvestre (HRP) conjugada ao anticorpo anti- Penta-His (Qiagen, Valência, CA) e desenvolvida pela resposta colori- métrica padrão usando substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizada por ácido sulfúrico. A absor- vância foi lida em OD450 durante 0,1 segundo. A absorvância de fundo de uma amostra sem Antígeno E foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão do MFI subtraído do fundo de cada amostra pelo valor de controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[00363] As tabelas 18 e 19 mostram o bloqueio de 98 por cento de anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E testados no ensaio ELISA. ND: não determinado sob condições experimentais atuais.Tabela 18 Tabela 19

[00364] Como descrito neste Exemplo, de 80 anticorpos de cadeia leve comum contendo a cadeia leve de VK1-39JK5 engendrada testada para sua capacidade de bloquear ligação de Antígeno E a uma superfície recoberta com Ligante Y, 22 demonstraram bloqueio >50%, enquanto 58 demonstraram bloqueio <50% (20 no bloqueio 25-50% e 38 no bloqueio <25%). Para 18 anticorpos de cadeia leve comum que contêm a cadeia leve engendrada de VK3-20JK1, um demonstrou bloqueio >50%, enquanto 17 demonstraram bloqueio <50% (5 no bloqueio de 2550% e 12 no bloqueio <25%) do Antígeno E ligando-se a um Ligante superfície recoberta com Y.

[00365] Estes resultados também são compatíveis com o agrupamento de anticorpo de cadeia leve comum específico para Antígeno E que compreende anticorpos com especificidade de epítopo de sobreposição e não sobreposição relativamente ao Antígeno E.

Exemplo XVIII Determinação de Afinidade de BIACORE™ para Anticorpos de cadeia leve Comum Específicos para o Antígeno

[00366] As constantes de dissociação de equilíbrio (KD) para sobre- nadantes de anticorpos selecionados foram determinadas por SPR (Ressonância de plásmons de superfície) usando um aparelho BIA- core™ T100 (GE Healthcare). Todos os dados foram obtidos usando HBS-EP (HEPES 10 mm, NaCl 150 mm, EDTA 0,3 mM, Tensoativo P20 0,05%, pH 7,4) tanto como tampões de corrida como de amostra, a 25°C. Os anticorpos foram capturados de amostras de sobrenadante brutas em uma superfície de chip sensor CM5 anteriormente derivada com uma alta densidade de anticorpos anti-Fc humano usando a química de acoplamento de amina padrão. Durante a etapa de captura, os sobrenadantes foram injetados através da superfície de anti-Fc humano em uma taxa de fluxo de 3 μL/min, durante um total de 3 minutos. A etapa de captura foi seguida de uma injeção de tampão de corrida ou de analito em uma concentração de 100 nM por 2 minutos em uma taxa de fluxo de 35 μL/min. A dissociação do antígeno do anticorpo capturado foi monitorada por 6 minutos. O anticorpo capturado foi removido por uma breve injeção de glicina 10 mM, pH 1,5. Todos os sensorgra- mas foram dobrados referenciados por subtração de sensorgramas de injeções de tampão dos sensorgramas de analito, por meio disso removendo artefatos causados pela dissociação do anticorpo da superfície de captura. Os dados de ligação de cada anticorpo foram ajustados a um modelo de ligação 1:1 com o transporte de massa usando programa de avaliação BIACORE™ T100 v2.1. Os resultados são mostrados nas Tabelas 20 e 21.Tabela 20 Tabela 21

[00367] As afinidades de ligação de anticorpos de cadeia leve comum que compreendem os rearranjos mostrados nas Tabelas 14 e 15 variam, com quase toda a exposição de um KD na faixa de nanomolar. Os dados de afinidade são compatíveis com os anticorpos de cadeia leve comum que resultam da associação combinatória de domínios variáveis rearranjados descritos nas Tabelas 14 e 15 que são de alta afinidade, clonalmente selecionados, e somaticamente mutados. Acoplados com dados anteriormente mostrados, os anticorpos de cadeia leve comum descritos nas Tabelas 14 e 15 compreendem uma coleção de diversos anticorpos de alta afinidade que exibem especificidade de um ou mais epítopos no Antígeno E.

Exemplo XIX Determinação de Especificidades de Ligação de Anticorpos de Cadeia Leve Comum Específicos para o Antígeno por Ensaio LUMI- NEX™

[00368] Os anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E selecionados foram testados para sua capacidade de ligar-se ao ECD de An- tígeno E e variantes de ECD de Antígeno E, incluindo o ortólogo de macaco cinomolgous (Antígeno E Mf), que se diferencia da proteína humana em aproximadamente 10% dos seus resíduos de aminoácido; um mutante de deleção de Antígeno E sem os últimos 10 aminoácidos da extremidade C-terminal de ECD (Antígeno E-ΔCT); e dois mutantes que contêm uma substituição de alanina em posições suspeitas de interação com Ligante Y (Antígeno E-Ala1 e AntigenE-Ala2). As proteínas de An- tígeno E foram produzidas em células CHO e cada uma continha um marcador C-terminal myc-myc-His.

[00369] Para os estudos de ligação, proteína ECD de Antígeno E ou proteína variante (descrito acima) de 1 mL de meio de cultura foi capturada pela incubação por 2 horas à temperatura ambiente com 1 x 106 contas de microesferas (Luminex™) covalentemente recobertas com um anticorpo monoclonal anti-myc (MAb 9E10, linhagem celular de hi- bridoma CRL-1729™; ATCC, Manassas, VA). As contas então foram lavadas com PBS antes do uso. Os sobrenadantes que contêm anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E foram diluídos 1:4 em tampão e adicionados a placas de 96 poços com filtro. Um sobrenadante sem anticorpo foi usado como controle negativo. As contas que contêm proteínas de Antígeno E capturadas então foram adicionadas às amostras de anticorpo (3000 contas por poço) e incubadas durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as contas de amostra foram lavadas e o anticorpo de cadeia leve comum ligado foi detectado com um anticorpo anti-IgG humana conjugado à R-ficoeritrina. A intensidade de fluorescência das contas (aproximadamente 100 contas contadas para cada ligação de amostra de anticorpo para cada proteína de Antígeno E) foi medida com um analisador baseado em citometria de fluxo Luminex™, e a intensidade de fluorescência mediana (MFI) de pelo menos 100 contas contadas por interação de conta/anticorpo foi registrada. Os resultados são mostrados nas Tabelas 22 e 23.Tabela 22 Tabela 23

[00370] Os sobrenadantes de anticorpo de cadeia leve comum anti- antígeno E exibiu alta ligação específica às contas ligadas ao Antígeno E-ECD. Para estas contas, o sobrenadante sem anticorpo de controle negativo resultou em sinal insignificante (<10 MFI) quando combinado com a amostra de contas de Antígeno E-ECD, ao passo que os sobre- nadantes que contêm anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E exibiram sinal de ligação forte (MFI médio de 2627 para 98 sobrenadan- tes de anticorpo; MFI> 500 para amostras de anticorpo 91/98).

[00371] Como uma medida da capacidade de anticorpos de cadeia leve comum anti-antígeno E selecionados para identificar epítopos dife-rentes no ECD do Antígeno E, a ligação relativa dos anticorpos às vari-antes foi determinada. Todas as quatro variantes de Antígeno E foram capturadas para contas anti-myc LUMINEX™ como descrito acima para estudos de ligação ao Antígeno E nativo - ECD, e as proporções de ligação relativas (MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD) foram determinadas. Para 98 sobrenadantes de anticorpo de cadeia leve comum testados mostrados nas Tabelas 21 e 22, as proporções médias (MFIvariante/MFIAntígeno E- ECD) diferenciaram-se para cada variante, provavelmente refletindo quantidades diferentes de captura de proteínas nas contas (proporções médias de 0,61, 2,9, 2,0, e 1,0 para o Antígeno E-ΔCT, Antígeno E-Ala1, Antígeno E-Ala2, e Antígeno E Mf, respectivamente). Para cada variante proteica, a ligação de um subconjunto de 98 anticorpos de cadeia leve comum testados mostrou ligação muito reduzida, indicando sensibilidade à mutação que caracterizou uma dada variante. Por exemplo, 19 das amostras de anticorpo de cadeia leve comum ligadas ao Antígeno E Mf com MFIvariante/MFIAntígeno E-ECD <8%. Uma vez que muitos neste grupo incluem anticorpos de afinidade alta ou moderadamente alta (5 com KD <5nM, 15 com KD <50 nM), é provável que o sinal mais baixo deste grupo resulte da sensibilidade a diferenças de sequência (epí- topo) entre o Antígeno E nativo-ECD e uma dada variante em vez de afinidades mais baixas.

[00372] Estes dados estabelecem que os anticorpos de cadeia leve comum descritos nas Tabelas 14 e 15 representam um grupo diverso de anticorpos de cadeia leve comum específicos para Antígeno-E que especificamente reconhecem mais de um epítopo no Antígeno E.

Claims

1. Método de produzir um camundongo geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que compreende modificar geneticamente o camundongo para incluir em sua linhagem germinativa: (a) um locus variável da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada compreendendo pelo menos um segmento de gene VH humano não rearranjado, pelo menos um segmento de gene DH humano não rearranjado, e pelo menos um segmento de gene JH humano não rearranjado, em que o locus variável da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada é operacionalmente ligado a um gene de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina; (b) um locus variável da cadeia leve de imunoglobulina humanizada compreendendo (i) uma única sequência V/J da cadeia leve humana rearranjada, em que a única sequência V/J da cadeia leve humana rearranjada é uma sequência VK1-39/JK humana rearranjada ou uma sequência VK3-20/JK humana rearranjada, ou (ii) não mais do que um segmento gênico V da cadeia leve humana e não mais do que um segmento gênico J da cadeia leve humana, em que o não mais do que um segmento gênico V da cadeia leve humana é VK1-39 ou VK3-20, em que o locus variável da cadeia leve de imunoglobulina humanizada é operacionalmente ligado a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina; e, (c) uma sequência de ácidos nucleicos ectópica que codifica uma proteína ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta, em que a proteína ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta, é expressa a a partir da sequência de ácido nucleico ectópica.

2. Método de produzir um camundongo geneticamente modificado macho, caracterizado pelo fato de que compreende modificar geneticamente o camundongo para compreender em sua linhagem germinativa: um locus variável da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada, e um locus variável da cadeia leve de imunoglobulina humanizada, em que o camundongo geneticamente modificado exibe fertilidade selvagem, em que o locus variável da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada compreende uma substituição no locus endógeno variável da cadeia pesada de camundongo de todos ou substancialmente todos os segmentos gênicos V, D e J funcionais da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo com um ou mais segmentos gênicos VH humanos não rearranjados, um ou mais segmentos gênicos DH humanos não rearranjados, e um ou mais segmentos gênicos JH humanos não rearranjados, em que o um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados e capazes de se rearranjar para formar um gene VH/DH/JH rearranjado que é operacionalmente ligado a um gene de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina, em que o locus variável da cadeia leve de imunoglobulina humanizada compreende: (i) não mais do que um segmento gênico V da cadeia leve humana e não mais do que um segmento gênico J da cadeia leve humana, operacionalmente ligada a um gene de região constante de cadeia leve de imunoglobulina, em que o não mais do que um segmento gênico V da cadeia leve humana é VK1-39 ou VK3-20, ou (ii) uma sequência V/J única da cadeia leve humana rearranjada, operacionalmente ligada a um gene de região constante de cadeia leve de imunoglobulina, em que a sequência V/J única da cadeia leve humana rearranjada é uma sequência VK1-39/JK humana rearranjada ou uma sequência VK3-20/JK humana rearranjada.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico ectópica que codifica a proteína ADAM6 de camundongo ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta está em um locus diferente do locus variável da cadeia pesada de imunoglobulina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gene da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é um gene de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina de camundongo.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o gene da região constante da cadeia leve de imunoglobulina é um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina de camundongo.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que não mais do que um segmento J da cadeia leve humana é JK1 ou JK5, ou uma sequência V/J da cadeia leve humana rearranjada inclui um segmento J que é JK1 or JK5.

7. Método de produzir um camundongo macho geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que compreende modificar geneticamente um camundongo de modo que expresse uma pluralidade de cadeias pesadas de imunoglobulina associadas com cadeias leves de imunoglobulinas humanizadas universais, em que cada cadeia leve de imunoglobulina humanizada universal é derivada de um locus variável da cadeia leve que compreende: (i) uma sequência V/J única da cadeia leve humana rearranjada, em que a sequência V/J única da cadeia leve humana rearranjada é uma sequência Vk1-39/Jk humana rearranjada ou uma sequência Vk3-20/Jk humana rearranjada, ou (ii) não mais do que um segmento gênico V da cadeia leve humana e não mais do que um segmento gênico J da cadeia leve humana, em que o não mais do que um segmento gênico V da cadeia leve humana é VK1-39 ou VK3-20, em que o locus da cadeia leve está presente na linhagem germinativa do camundongo, e em que o camundongo macho é capaz de gerar prole por meio de cruzamento, com uma frequência que é aproximadamente a mesma que de um rato selvagem.

8. Método de produzir um camundongo geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que compreende modificar geneticamente um camundongo de modo que expresse uma pluralidade de anticorpos IgG diferentes, cada um compreendendo: cadeia pesada de imunoglobulina que inclui um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana, em que diferentes anticorpos na pluralidade de diferentes anticorpos IgG apresentam diferentes cadeias pesadas de imunoglobulinas; e cadeias leves de imunoglobulinas, em que cada cadeia leve de imunoglobulina inclui um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina humana codificada pela mesma sequência V/J única da cadeia leve rearranjada, em que a sequência V/J única da cadeia leve rearranjada está presente na linhagem do camundongo, e em que o segmento gênico V na sequência V/J única rearranjada é Vk1-39 ou Vk3-20; e em que o camundongo inclui em seu genoma uma sequência de ácido nucleico ectópico que expressa uma proteína ADAM6 ou ortólogo ou homólogo ou fragmento funcional desta que é funcional em um camundongo macho.