BR122022017524B1

BR122022017524B1 - RECOMBINANT BACILLUS BACTERIA, COATED PLANT SEEDS, AND FORMULATION

Info

Publication number: BR122022017524B1
Application number: BR122022017524-4A
Authority: BR
Inventors: Brian Thompson; Katie Thompson
Original assignee: Spogen Biotech Inc.
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-17
Publication date: 2023-08-15

Abstract

A presente invenção está direcionada de forma geral a proteínas de fusão contendo uma sequência de direcionamento que direciona a proteína de fusão ao exosporium de um membro da família de Bacillus cereus. A invenção também se refere aos membros da família de Bacillus cereus recombinante que expressam tais proteínas de fusão e formulações contendo os membros da família de Bacillus cereus recombinante expressando as proteínas de fusão. Métodos para estimular o crescimento da planta, para proteger as plantas de patógenos, e para potencializar a resistência ao estresse em uma planta pela aplicação dos membros da família de Bacillus cereus recombinantes ou as formulações para plantas ou meio de crescimento da planta também são descritos. A presente invenção também se refere a métodos de imobilização de esporos de um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão nas plantas.The present invention is generally directed to fusion proteins containing a targeting sequence that directs the fusion protein to the exosporium of a member of the Bacillus cereus family. The invention also relates to members of the recombinant Bacillus cereus family expressing such fusion proteins and formulations containing members of the recombinant Bacillus cereus family expressing the fusion proteins. Methods for stimulating plant growth, for protecting plants from pathogens, and for enhancing stress resistance in a plant by applying recombinant Bacillus cereus family members or plant formulations or plant growth media are also described. The present invention also relates to methods of immobilizing spores of a member of the recombinant Bacillus cereus family that expresses a fusion protein in plants.

Description

Cross Reference to Related Requests

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório n° de série 61/799,262, depositado em 15 de março de 2013, cujo pedido é incorporado neste documento a título de referência em sua totalidade.[001] This application claims the benefit of Provisional Patent Application serial no. 61/799,262, filed on March 15, 2013, which application is incorporated in this document by reference in its entirety.

Field of Invention

[002] A presente invenção geralmente diz respeito a proteínas de fusão contendo uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo que direciona a proteína de fusão para o exósporo de um membro da família Bacillus cereus. A invenção também diz respeito a membros da família de Bacillus cereus recombinantes que expressão tais proteínas de fusão e fórmulas contendo os membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressão as proteínas de fusão. A invenção ainda diz respeito aos métodos para estimulação do crescimento de plantas, para proteção de plantas contra patógenos e para aumento da resistência ao estresse em plantas por aplicação dos membros da família Bacillus cereus recombinantes ou das fórmulas em plantas ou um meio de crescimento de plantas. A invenção também diz respeito aos métodos para imobilização de esporos de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em plantas ou em matéria vegetal.[002] The present invention generally relates to fusion proteins containing a targeting sequence, an exospore protein or an exospore protein fragment that directs the fusion protein to the exospore of a member of the Bacillus cereus family. The invention also relates to recombinant Bacillus cereus family members that express such fusion proteins and formulas containing recombinant Bacillus cereus family members that express the fusion proteins. The invention further relates to methods for stimulating plant growth, for protecting plants against pathogens and for increasing stress resistance in plants by applying recombinant Bacillus cereus family members or formulas to plants or a plant growth medium. . The invention also relates to methods for immobilizing spores of a recombinant Bacillus cereus family member expressing a fusion protein in plants or vegetable matter.

Fundamentals of Invention

[003] Dentro da zona de circunda as raízes da planta se encontra uma região chamada de rizosfera. Na rizosfera, as bactérias, fungos e outros organismos competem por nutrientes e pela ligação com as estruturas da raiz da planta. Tanto as bactérias ou fungos prejudiciais como benéficos podem ocupar a rizosfera. As bactérias, fungos e o sistema de raiz da planta podem todos ser influenciados pelas ações de peptídeos, enzimas e outras proteínas na rizosfera. O aumento do solo ou tratamento das plantas com certos destes peptídeos, enzimas ou outras proteínas teria efeitos benéficos nas populações gerais de bactérias e fungos benéficos do solo, criariam um ambiente geral de solo mais saudável para o crescimento das plantas, melhoraria o crescimento das plantas e forneceria a proteção de plantas contra determinados patógenos bacterianos e fúngicos. No entanto, tentativas anteriores para introduzir peptídeos, enzimas e outras proteínas no solo a fim de induzir tais efeitos benéficos em plantas foram frustradas pela baixa sobrevivências das enzimas, proteínas e peptídeos no solo. Adicionalmente, a prevalência de proteases naturalmente presentes no solo leva à degradação das proteínas no solo. O ambiente ao redor das raízes de uma planta (a rizosfera) é uma mistura única de bactérias, fungos, nutrientes e raízes que possui qualidades diferentes em relação ao solo nativo. A relação simbiótica entre estes organismos é única e poderia ser alterada para melhor com a inclusão de proteínas exógenas. A alta concentração de fungos e bactérias na rizosfera causa ainda mais degradação das proteínas devido a altos níveis anormais de proteases e outros elementos prejudiciais às proteínas no solo. Além disso, as enzimas e outras proteínas introduzidas no solo podem rapidamente se dissipar das raízes das plantas.[003] Within the area surrounding the plant's roots is a region called the rhizosphere. In the rhizosphere, bacteria, fungi and other organisms compete for nutrients and attachment to the plant's root structures. Both harmful and beneficial bacteria or fungi can occupy the rhizosphere. Bacteria, fungi, and the plant's root system can all be influenced by the actions of peptides, enzymes, and other proteins in the rhizosphere. Augmenting soil or treating plants with certain of these peptides, enzymes or other proteins would have beneficial effects on the overall populations of beneficial soil bacteria and fungi, create an overall healthier soil environment for plant growth, improve plant growth and would provide plant protection against certain bacterial and fungal pathogens. However, previous attempts to introduce peptides, enzymes and other proteins into the soil in order to induce such beneficial effects in plants have been frustrated by the low survivals of the enzymes, proteins and peptides in the soil. Additionally, the prevalence of proteases naturally present in the soil leads to the degradation of proteins in the soil. The environment around a plant's roots (the rhizosphere) is a unique mix of bacteria, fungi, nutrients and roots that has different qualities than native soil. The symbiotic relationship between these organisms is unique and could be changed for the better with the inclusion of exogenous proteins. The high concentration of fungi and bacteria in the rhizosphere causes further protein degradation due to abnormally high levels of proteases and other protein-damaging elements in the soil. Additionally, enzymes and other proteins introduced into the soil can quickly dissipate from plant roots.

[004] Sendo assim, existe uma necessidade na técnica para um método que entregue de forma eficiente os peptídeos, enzimas e outras proteínas às plantas (por exemplo, nos sistemas de raízes de plantas) e para estender o período de tempo durante o qual tais moléculas permanecem ativas. Além disso, existe uma necessidade na técnica para um método de direcionamento seletivo de tais peptídeos, enzimas e proteínas para a rizosfera e para as folhas e raízes de plantas em especial.[004] Therefore, there is a need in the art for a method that efficiently delivers peptides, enzymes and other proteins to plants (e.g., in plant root systems) and to extend the period of time during which such molecules remain active. Furthermore, there is a need in the art for a method of selectively targeting such peptides, enzymes and proteins to the rhizosphere and to the leaves and roots of plants in particular.

Summary of the Invention

[005] Apresente invenção é direcionada a proteínas de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta, pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que liga uma planta. A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta compreende um hormônio de peptídeo, um peptídeo não hormonal ou uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de planta. A proteína de fusão também compreende uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser: (a) uma sequência de direcionamento compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 2035 da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%; (b) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (c) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 2035 de SEQ ID NO: 1; (d) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 1; (e) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 2; (f) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 3; (g) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 de SEQ ID NO: 3; (h) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (i) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (j) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 138 de SEQ ID NO: 5; (k) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 de SEQ ID NO: 5; (l) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (m) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (n) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-28 de SEQ ID NO: 7; (o) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-28 de SEQ ID NO: 7; (p) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (q) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (r) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SEQ ID NO: 9; (s) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 924 de SEQ ID NO: 9; (t) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (u) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10: (v) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID NO:11; (w) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1833 de SEQ ID NO: 11; (x) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (y) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (z) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO: 13; (aa) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 13; (ab) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (ac) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID NO:14; (ad) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 de SED ID NO: 15: (ae) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 de SED ID NO: 15; (af) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:15; (ag) uma proteína de exóporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (ah) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 de SED ID NO: 17; (ai) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 de SEQ ID NO: 17; (aj) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:17; (ak) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (al) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID NO: 19; (am) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 19 (an) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:19; (ao) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (ap) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID NO: 21; (aq) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 21; (ar) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (as) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID NO:22; (at) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID NO: 23; (au) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 924 de SEQ ID NO: 23; (av) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (aw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID NO:24; (ax) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID NO: 25; (ay) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 924 de SEQ ID NO: 25; (az) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:25; (ba) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (bb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 de SED ID NO: 27; (bc) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 de SEQ ID NO: 27; (bd) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:27; (be) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (bf) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID NO: 29; (bg) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 29; (bh) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:29; (bi) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (bj) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID NO: 31; (bk) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 924 de SEQ ID NO: 31; (bl) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:31; (bm) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (bn) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 de SED ID NO: 33; (bo) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:33; (bp) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (bq) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 116 de SED ID NO: 35 (br) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:35; (bs) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (bt) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 de SED ID NO:43; (bu) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 de SEQ ID NO: 43; (bv) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (bw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (bx) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 45; (by) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 45; (bz) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (ca) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (cb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 de SEQ ID NO: 47: (cc) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 de SED ID NO: 47: (cd) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO: 47; (ce) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (cf) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 de SEQ ID NO: 49; (cg) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 17-33 de SEQ ID NO: 49; (ch) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (ci) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (cj) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO: 51; (ck) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 51; (cl) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (cm) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (cn) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO: 53; (co) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 53; (cp) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (cq) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (cr) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 de SEQ ID NO: 55; (cs) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 de SEQ ID NO: 55; (ct) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (cu) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (cv) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 de SEQ ID NO: 57; (cw) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 de SEQ ID NO: 57; (cx) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (cy) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (cz) um fragmento de proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 59; (da) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 60; (db) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 61; (dc) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 62; (dd) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63; (de) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 64; (df) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65; (dg) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 66; (dh) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67; (di) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 68; (dj) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69; (dk) uma sequência de direcionamento compreendendo de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 84; (dz) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-31 de SEQ ID NO: 1; (ea) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 22-33 de SEQ ID NO: 1; (eb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-31 de SEQ ID NO: 1; (ec) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 de SEQ ID NO: 3; (ed) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-25 de SEQ ID NO: 3; ou (ef) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 de SEQ ID NO: 3.[005] The present invention is directed to fusion proteins comprising at least one plant growth stimulating protein or peptide, at least one protein or peptide that increases stress resistance in a plant or at least one protein or peptide that binds a plant. The plant growth stimulating protein or peptide comprises a peptide hormone, a non-hormonal peptide or an enzyme involved in the production or activation of a plant growth stimulating compound. The fusion protein also comprises a targeting sequence, an exospore protein or an exospore protein fragment. The targeting sequence, exospore protein or exospore protein fragment may be: (a) a targeting sequence comprising an amino acid sequence having at least 43% identity with amino acids 2035 of SEQ ID NO: 1, characterized in that that the identity with amino acids 25-35 is at least 54%; (b) a targeting sequence comprising amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1; (c) a targeting sequence comprising amino acids 2035 of SEQ ID NO: 1; (d) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 1; (e) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 2; (f) a targeting sequence comprising amino acids 1-27 of SEQ ID NO: 3; (g) a targeting sequence comprising amino acids 12-27 of SEQ ID NO: 3; (h) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 3; (i) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 4; (j) a targeting sequence comprising 138 amino acids of SEQ ID NO: 5; (k) a targeting sequence comprising amino acids 23-38 of SEQ ID NO: 5; (l) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 5; (m) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 6; (n) a targeting sequence comprising amino acids 1-28 of SEQ ID NO: 7; (o) a targeting sequence comprising amino acids 13-28 of SEQ ID NO: 7; (p) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 7; (q) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 8; (r) a targeting sequence comprising amino acids 1-24 of SEQ ID NO: 9; (s) a targeting sequence comprising amino acids 924 of SEQ ID NO: 9; (t) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 9; (u) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 10: (v) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SED ID NO:11; (w) a targeting sequence comprising amino acids 1833 of SEQ ID NO: 11; (x) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 11; (y) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 12; (z) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 13; (aa) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 13; (ab) a targeting sequence comprising SEQ ID NO:13; (ac) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SED ID NO:14; (ad) a targeting sequence comprising amino acids 1-43 of SED ID NO: 15: (ae) a targeting sequence comprising amino acids 28-43 of SED ID NO: 15; (af) a targeting sequence comprising SED ID NO:15; (ag) an exopore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:16; (ah) a targeting sequence comprising amino acids 1-27 of SED ID NO: 17; (ai) a targeting sequence comprising amino acids 12-27 of SEQ ID NO: 17; (aj) a targeting sequence comprising SED ID NO:17; (ak) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:18; (al) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SED ID NO: 19; (am) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 19 (an) a targeting sequence comprising SED ID NO:19; (ao) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:20; (ap) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SED ID NO: 21; (aq) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 21; (ar) a targeting sequence comprising SEQ ID NO:21; (as) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SED ID NO:22; (at) a targeting sequence comprising amino acids 1-24 of SED ID NO: 23; (au) a targeting sequence comprising amino acids 924 of SEQ ID NO: 23; (av) a targeting sequence comprising SEQ ID NO:23; (aw) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SED ID NO:24; (ax) a targeting sequence comprising amino acids 1-24 of SED ID NO: 25; (ay) a targeting sequence comprising amino acids 924 of SEQ ID NO: 25; (az) a targeting sequence comprising SED ID NO:25; (ba) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:26; (bb) a targeting sequence comprising amino acids 1-30 of SED ID NO: 27; (bc) a targeting sequence comprising amino acids 15-30 of SEQ ID NO: 27; (bd) a targeting sequence comprising SED ID NO:27; (be) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:28; (bf) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SED ID NO: 29; (bg) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 29; (bh) a targeting sequence comprising SED ID NO:29; (bi) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:30; (bj) a targeting sequence comprising amino acids 1-24 of SED ID NO: 31; (bk) a targeting sequence comprising amino acids 924 of SEQ ID NO: 31; (bl) a targeting sequence comprising SED ID NO:31; (bm) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:32; (bn) a targeting sequence comprising amino acids 1-15 of SED ID NO: 33; (bo) a targeting sequence comprising SED ID NO:33; (bp) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:34; (bq) a targeting sequence comprising amino acids 116 of SED ID NO: 35 (br) a targeting sequence comprising SED ID NO:35; (bs) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:36; (bt) a targeting sequence comprising amino acids 1-29 of SED ID NO:43; (bu) a targeting sequence comprising amino acids 14-29 of SEQ ID NO: 43; (bv) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 43; (bw) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 44; (bx) a targeting sequence comprising amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 45; (by) a targeting sequence comprising amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 45; (bz) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 45; (ca) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 46; (cb) a targeting sequence comprising amino acids 1-43 of SEQ ID NO: 47: (cc) a targeting sequence comprising amino acids 28-43 of SED ID NO: 47: (cd) a targeting sequence comprising SED ID NO: 47; (ce) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 48; (cf) a targeting sequence comprising amino acids 1-32 of SEQ ID NO: 49; (cg) a targeting sequence comprising amino acids 17-33 of SEQ ID NO: 49; (ch) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 49; (ci) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 50; (cj) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 51; (ck) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 51; (cl) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 51; (cm) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 52; (cn) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 53; (co) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 53; (cp) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 53; (cq) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 54; (cr) a targeting sequence comprising amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 55; (cs) a targeting sequence comprising amino acids 15-30 of SEQ ID NO: 55; (ct) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 55; (cu) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 56; (cv) a targeting sequence comprising amino acids 1-130 of SEQ ID NO: 57; (cw) a targeting sequence comprising amino acids 115-130 of SEQ ID NO: 57; (cx) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 57; (cy) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 58; (cz) an exospore protein fragment comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 59; (da) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 60; (db) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 61; (dc) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 62; (dd) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 63; (de) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 64; (df) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 65; (dg) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 66; (dh) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 67; (di) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 68; (dj) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 69; (dk) a targeting sequence comprising of exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% exospore identity comprising at least 85% exospore identity comprising at least 85% exospore identity comprising at least 85% exospore identity comprising at least 85% exospore identity comprising an at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity com of an exospore comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 84; (dz) a targeting sequence comprising amino acids 22-31 of SEQ ID NO: 1; (ea) a targeting sequence comprising amino acids 22-33 of SEQ ID NO: 1; (eb) a targeting sequence comprising amino acids 20-31 of SEQ ID NO: 1; (ec) a targeting sequence comprising amino acids 14-23 of SEQ ID NO: 3; (d) a targeting sequence comprising amino acids 14-25 of SEQ ID NO: 3; or (ef) a targeting sequence comprising amino acids 12-23 of SEQ ID NO: 3.

[006] A invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser: (a) uma sequência de direcionamento consistindo de uma sequência de aminoácidos que consiste de 16 aminoácidos e tendo pelo menos 43% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%; (b) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1; (c) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1; (d) uma sequência de direcionamento consistindo de SEQ ID NO: 1; (e) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 60; (f) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 de SEQ ID NO: 3; (g) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1227 de SEQ ID NO: 3; (h) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 3; (i) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 4; (j) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-38 de SEQ ID NO: 5; (k) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 23-38 de SEQ ID NO: 5; (l) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 5; (m) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 6; (n) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 128 de SEQ ID NO: 7; (o) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 13-28 de SEQ ID NO: 7; (p) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 7; (q) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 8; (r) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SEQ ID NO: 9; (s) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 9-24 de SEQ ID NO: 9; (t) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 9; (u) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 10: (v) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID NO:11; (w) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1833 de SEQ ID NO: 11; (x) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 11; (y) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 12; (z) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO: 13; (aa) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 13; (ab) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:13; (ac) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID NO:14; (ad) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 de SED ID NO: 15: (ae) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 de SED ID NO: 15; (af) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:15; (ag) uma proteína de exóporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:16; (ah) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-27 de SED ID NO: 17; (ai) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-27 de SEQ ID NO: 17; (aj) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:17; (ak) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:18; (al) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID NO: 19; (am) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 19 (an) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:19; (ao) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:20; (ap) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID NO: 21; (aq) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 21; (ar) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:21; (as) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID NO:22; (at) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID NO: 23; (au) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 924 de SEQ ID NO: 23; (av) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO:23; (aw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SED ID NO:24; (ax) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID NO: 25; (ay) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 924 de SEQ ID NO: 25; (az) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:25; (ba) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:26; (bb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 de SED ID NO: 27; (bc) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 de SEQ ID NO: 27; (bd) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:27; (be) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:28; (bf) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SED ID NO: 29; (bg) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 29; (bh) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:29; (bi) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:30; (bj) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-24 de SED ID NO: 31; (bk) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 924 de SEQ ID NO: 31; (bl) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:31; (bm) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:32; (bn) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-15 de SED ID NO: 33; (bo) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:33; (bp) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:34; (bq) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 116 de SED ID NO: 35 (br) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO:35; (bs) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO:36; (bt) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-29 de SED ID NO:43; (bu) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-29 de SEQ ID NO: 43; (bv) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 43; (bw) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 44; (bx) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 45; (by) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 45; (bz) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 45; (ca) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 46; (cb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-43 de SEQ ID NO: 47: (cc) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 28-43 de SED ID NO: 47: (cd) uma sequência de direcionamento compreendendo SED ID NO: 47; (ce) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 48; (cf) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-32 de SEQ ID NO: 49; (cg) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 17-33 de SEQ ID NO: 49; (ch) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 49; (ci) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 50; (cj) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO: 51; (ck) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 51; (cl) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 51; (cm) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 52; (cn) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-33 de SEQ ID NO: 53; (co) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 18-33 de SEQ ID NO: 53; (cp) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 53; (cq) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 54; (cr) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-30 de SEQ ID NO: 55; (cs) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 15-30 de SEQ ID NO: 55; (ct) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 55; (cu) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 56; (cv) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 1-130 de SEQ ID NO: 57; (cw) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 115-130 de SEQ ID NO: 57; (cx) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 57; (cy) uma proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 58; (cz) um fragmento de proteína de exósporo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 59; (da) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 61; (db) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 62; (dc) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 63; (dd) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 64; (de) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 65; (df) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 66; (dg) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 67; (dh) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 68; (di) uma sequência de direcionamento compreendendo SEQ ID NO: 69; (dj) uma sequência de direcionamento compreendendo de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com de exósporo compreendendo uma pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 84; (dy) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 22-31 de SEQ ID NO: 1; (dz) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 2233 de SEQ ID NO: 1; (ea) uma sequência de direcionamento consistindo de aminoácidos 20-31 de SEQ ID NO: 1; (eb) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-23 de SEQ ID NO: 3; (ec) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 14-25 de SEQ ID NO: 3; ou (ed) uma sequência de direcionamento compreendendo aminoácidos 12-23 de SEQ ID NO: 3.[006] The invention also relates to fusion proteins comprising a targeting sequence, an exospore protein, or exospore protein fragment, and at least one protein or peptide that protects a plant against a pathogen. The targeting sequence, an exospore protein or exospore protein fragment may be: (a) a targeting sequence consisting of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 43% identity with amino acids 20-35 of the SEQ ID NO: 1, characterized by the fact that the identity with amino acids 25-35 is at least 54%; (b) a targeting sequence consisting of amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1; (c) a targeting sequence consisting of amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1; (d) a targeting sequence consisting of SEQ ID NO: 1; (e) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 60; (f) a targeting sequence comprising amino acids 1-27 of SEQ ID NO: 3; (g) a targeting sequence comprising 1227 amino acids of SEQ ID NO: 3; (h) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 3; (i) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 4; (j) a targeting sequence comprising amino acids 1-38 of SEQ ID NO: 5; (k) a targeting sequence comprising amino acids 23-38 of SEQ ID NO: 5; (l) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 5; (m) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 6; (n) a targeting sequence comprising 128 amino acids of SEQ ID NO: 7; (o) a targeting sequence comprising amino acids 13-28 of SEQ ID NO: 7; (p) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 7; (q) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 8; (r) a targeting sequence comprising amino acids 1-24 of SEQ ID NO: 9; (s) a targeting sequence comprising amino acids 9-24 of SEQ ID NO: 9; (t) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 9; (u) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 10: (v) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SED ID NO:11; (w) a targeting sequence comprising amino acids 1833 of SEQ ID NO: 11; (x) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 11; (y) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 12; (z) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 13; (aa) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 13; (ab) a targeting sequence comprising SEQ ID NO:13; (ac) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SED ID NO:14; (ad) a targeting sequence comprising amino acids 1-43 of SED ID NO: 15: (ae) a targeting sequence comprising amino acids 28-43 of SED ID NO: 15; (af) a targeting sequence comprising SED ID NO:15; (ag) an exopore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:16; (ah) a targeting sequence comprising amino acids 1-27 of SED ID NO: 17; (ai) a targeting sequence comprising amino acids 12-27 of SEQ ID NO: 17; (aj) a targeting sequence comprising SED ID NO:17; (ak) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:18; (al) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SED ID NO: 19; (am) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 19 (an) a targeting sequence comprising SED ID NO:19; (ao) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:20; (ap) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SED ID NO: 21; (aq) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 21; (ar) a targeting sequence comprising SEQ ID NO:21; (as) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SED ID NO:22; (at) a targeting sequence comprising amino acids 1-24 of SED ID NO: 23; (au) a targeting sequence comprising amino acids 924 of SEQ ID NO: 23; (av) a targeting sequence comprising SEQ ID NO:23; (aw) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SED ID NO:24; (ax) a targeting sequence comprising amino acids 1-24 of SED ID NO: 25; (ay) a targeting sequence comprising amino acids 924 of SEQ ID NO: 25; (az) a targeting sequence comprising SED ID NO:25; (ba) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:26; (bb) a targeting sequence comprising amino acids 1-30 of SED ID NO: 27; (bc) a targeting sequence comprising amino acids 15-30 of SEQ ID NO: 27; (bd) a targeting sequence comprising SED ID NO:27; (be) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:28; (bf) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SED ID NO: 29; (bg) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 29; (bh) a targeting sequence comprising SED ID NO:29; (bi) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:30; (bj) a targeting sequence comprising amino acids 1-24 of SED ID NO: 31; (bk) a targeting sequence comprising amino acids 924 of SEQ ID NO: 31; (bl) a targeting sequence comprising SED ID NO:31; (bm) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:32; (bn) a targeting sequence comprising amino acids 1-15 of SED ID NO: 33; (bo) a targeting sequence comprising SED ID NO:33; (bp) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:34; (bq) a targeting sequence comprising amino acids 116 of SED ID NO: 35 (br) a targeting sequence comprising SED ID NO:35; (bs) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO:36; (bt) a targeting sequence comprising amino acids 1-29 of SED ID NO:43; (bu) a targeting sequence comprising amino acids 14-29 of SEQ ID NO: 43; (bv) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 43; (bw) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 44; (bx) a targeting sequence comprising amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 45; (by) a targeting sequence comprising amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 45; (bz) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 45; (ca) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 46; (cb) a targeting sequence comprising amino acids 1-43 of SEQ ID NO: 47: (cc) a targeting sequence comprising amino acids 28-43 of SED ID NO: 47: (cd) a targeting sequence comprising SED ID NO: 47; (ce) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 48; (cf) a targeting sequence comprising amino acids 1-32 of SEQ ID NO: 49; (cg) a targeting sequence comprising amino acids 17-33 of SEQ ID NO: 49; (ch) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 49; (ci) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 50; (cj) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 51; (ck) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 51; (cl) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 51; (cm) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 52; (cn) a targeting sequence comprising amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 53; (co) a targeting sequence comprising amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 53; (cp) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 53; (cq) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 54; (cr) a targeting sequence comprising amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 55; (cs) a targeting sequence comprising amino acids 15-30 of SEQ ID NO: 55; (ct) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 55; (cu) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 56; (cv) a targeting sequence comprising amino acids 1-130 of SEQ ID NO: 57; (cw) a targeting sequence comprising amino acids 115-130 of SEQ ID NO: 57; (cx) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 57; (cy) an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 58; (cz) an exospore protein fragment comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 59; (da) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 61; (db) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 62; (dc) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 63; (dd) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 64; (de) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 65; (df) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 66; (dg) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 67; (dh) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 68; (di) a targeting sequence comprising SEQ ID NO: 69; (dj) a targeting sequence comprising of exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% exospore identity comprising at least 85% exospore identity comprising at least 85% exospore identity comprising at least 85% exospore identity comprising at least 85% exospore identity comprising an at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity with exospore comprising at least 85% identity exospore com comprising at least 85% identity with SEQ ID NO: 84; (dy) a targeting sequence consisting of amino acids 22-31 of SEQ ID NO: 1; (dz) a targeting sequence consisting of amino acids 2233 of SEQ ID NO: 1; (ea) a targeting sequence consisting of amino acids 20-31 of SEQ ID NO: 1; (eb) a targeting sequence comprising amino acids 14-23 of SEQ ID NO: 3; (ec) a targeting sequence comprising amino acids 14-25 of SEQ ID NO: 3; or (ed) a targeting sequence comprising amino acids 12-23 of SEQ ID NO: 3.

[007] A presente invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou um fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A proteína ou peptídeo que protege a planta de um patógeno pode compreender uma harpina, uma a-elastina, uma ß-elastina, uma sistemina, uma fenilalanina amonia-liase, uma elicitina, uma defensina, uma criptogeina, uma proteína flagelina, uma bacteriocina, uma lisozima, um peptídeo de lisozima, uma sideróforo, um peptídeo ativo não ribossomal, uma conalbumina, uma albumina, uma lactoferrina, um peptídeo de lactoferrina, ou TasA. Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno possui atividade inseticida, atividade helminticida, suprime insetos ou predação por vermes, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a proteína que protege uma planta contra um patógeno compreende uma enzima. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de protéina de exósporo listadas cima no parágrafo [005].[007] The present invention also relates to fusion proteins comprising a targeting sequence, an exospore protein, or a fragment of the exospore protein, and at least one protein or peptide that protects a plant against a pathogen. The protein or peptide that protects the plant from a pathogen may comprise a harpin, an a-elastin, a ß-elastin, a systemin, a phenylalanine ammonia-lyase, an elicitin, a defensin, a cryptogein, a flagellin protein, a bacteriocin , a lysozyme, a lysozyme peptide, a siderophore, a non-ribosomal active peptide, a conalbumin, an albumin, a lactoferrin, a lactoferrin peptide, or TasA. Alternatively, the protein or peptide that protects a plant against a pathogen has insecticidal activity, helminthicidal activity, suppresses insect or worm predation, or a combination thereof. Alternatively, the protein that protects a plant against a pathogen comprises an enzyme. The targeting sequence, exospore protein or exospore protein fragment can be any of the targeting sequences, exospore proteins or exospore protein fragments listed above in paragraph [005].

[008] A presente invenção é também direcionada a proteínas de fusão que compreendem pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e uma proteína de exósporo. A proteína de exósporo pode ser uma proteína de exósporo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com quaisquer uma das SED ID NOs: 71, 75, 80, 81, 82, 83 e 84.[008] The present invention is also directed to fusion proteins that comprise at least one protein or peptide of interest and an exospore protein. The exospore protein may be an exospore protein that comprises an amino acid sequence having at least 85% identity with any of the SED ID NOs: 71, 75, 80, 81, 82, 83 and 84.

[009] A presente invenção também se relaciona a um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa quaisquer umas das proteínas de fusão.[009] The present invention also relates to a member of the recombinant Bacillus cereus family that expresses any of the fusion proteins.

[0010] A invenção é também direcionada à fórmulas compreendendo quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes e um transportador agrícola aceitável.[0010] The invention is also directed to formulas comprising any of the recombinant Bacillus cereus family members and an acceptable agricultural carrier.

[0011] A presente invenção também diz respeito a um método para estimulação de crescimento de plantas. O método compreende introduzir em um meio de crescimento de planta quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão que compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, ou quaisquer das fórmulas que compreendem membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas. Alternativamente, o método compreende aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou em uma área que circunda uma planta ou semente de planta, quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, ou quaisquer das fórmulas que compreendem membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta. A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas é fisicamente ligado ao exósporo do membro da família Bacillus recombinante.[0011] The present invention also relates to a method for stimulating plant growth. The method comprises introducing into a plant growth medium any of the recombinant Bacillus cereus family members expressing a fusion protein comprising at least one plant growth stimulating protein or peptide, or any of the formulas comprising members of the Bacillus family. cereus recombinants that express a fusion protein comprising at least one plant growth stimulating protein or peptide. Alternatively, the method comprises applying to a plant, a plant seed, or an area surrounding a plant or plant seed, any of the recombinant Bacillus cereus family members that express a fusion protein comprising at least one protein or peptide of plant growth stimulation, or any of the formulas comprising recombinant Bacillus cereus family members expressing a fusion protein comprising at least one plant growth stimulating protein or peptide. The plant growth stimulating protein or peptide is physically attached to the exospore of the recombinant Bacillus family member.

[0012] A presente invenção também diz respeito a um método para estimulação de crescimento de plantas. O método compreende a introdução de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento de plantas ou aplicação de um membro da família Bacillus recombinante que expressa uma proteína de fusão em uma planta, uma semente de planta ou uma área ao redor de uma planta ou semente de planta. A proteína de fusão compreende pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta e uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo. A sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer um dos listados acima no parágrafo [005]. A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas é fisicamente ligado ao exósporo do membro da família Bacillus recombinante.[0012] The present invention also relates to a method for stimulating plant growth. The method comprises introducing a recombinant Bacillus cereus family member expressing a fusion protein into a plant growth medium or applying a recombinant Bacillus family member expressing a fusion protein into a plant, a plant seed or an area around a plant or plant seed. The fusion protein comprises at least one plant growth stimulating protein or peptide and a targeting sequence, an exospore protein or an exospore protein fragment. The targeting sequence, an exospore protein or an exospore protein fragment can be any of those listed above in paragraph [005]. The plant growth stimulating protein or peptide is physically attached to the exospore of the recombinant Bacillus family member.

[0013] A invenção adicionalmente diz respeito a um método para proteção de uma planta contra um patógeno ou aumento da resistência ao estresse em uma planta. O método compreende introduzir em um meio de crescimento de planta quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege a planta contra um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta, ou quaisquer das fórmulas que compreendem quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta. Alternativamente, o método compreende aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou em uma área ao redor de uma planta, quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta, ou quaisquer das fórmulas compreendendo quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam uma proteína de fusão compreendendo pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta. A proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno ou a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta é fisicamente ligado ao exósporo do membro da família Bacillus cereus recombinante.[0013] The invention additionally concerns a method for protecting a plant against a pathogen or increasing resistance to stress in a plant. The method comprises introducing into a plant growth medium any of the recombinant Bacillus cereus family members that express a fusion protein comprising at least one protein or peptide that protects the plant against a pathogen or at least one protein or peptide that increases resistance. to stress in a plant, or any of the formulas comprising any of the members of the Bacillus cereus family recombinants that express a fusion protein comprising at least one protein or peptide that protects a plant from a pathogen or at least one protein or peptide that increases the stress resistance in a plant. Alternatively, the method comprises applying to a plant, a plant seed, or to an area surrounding a plant, any of the recombinant Bacillus cereus family members that express a fusion protein comprising at least one protein or peptide that protects a plant. against a pathogen or at least one protein or peptide that increases stress resistance in a plant, or any of the formulas comprising any of the recombinant Bacillus cereus family members that express a fusion protein comprising at least one protein or peptide that protects a plant against a pathogen or at least a protein or peptide that increases stress resistance in a plant. The protein or peptide that protects a plant against a pathogen or the protein or peptide that increases stress resistance in a plant is physically attached to the exospore of the recombinant Bacillus cereus family member.

[0014] A presente invenção também é direcionada a um método para a imobilização de um esporo de membro da família Bacillus cereus recombinante em uma planta. O método compreende introduzir em um meio de crescimento de planta quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em planta, ou quaisquer das fórmulas que compreendem quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas. Alternativamente, o método compreende aplicar em uma planta, uma semente de planta, ou em uma área que circunda uma planta ou semente de planta, quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas, ou quaisquer das fórmulas que compreendem quaisquer dos membros da família Bacillus cereus recombinantes que expressam pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas. A proteína ou peptídeo de ligação em plantas é fisicamente ligado ao exósporo do membro da família Bacillus cereus recombinante.[0014] The present invention is also directed to a method for immobilizing a recombinant Bacillus cereus family member spore on a plant. The method comprises introducing into a plant growth medium any of the recombinant Bacillus cereus family members that express at least one plant-binding protein or peptide, or any of the formulas comprising any of the recombinant Bacillus cereus family members that express at least a binding protein or peptide in plants. Alternatively, the method comprises applying to a plant, a plant seed, or to an area surrounding a plant or plant seed, any of the recombinant Bacillus cereus family members that express at least one plant-binding protein or peptide, or any of the formulas comprising any of the recombinant Bacillus cereus family members that express at least one binding protein or peptide in plants. The binding protein or peptide in plants is physically attached to the exospore of the recombinant Bacillus cereus family member.

[0015] Outros objetos e características serão em parte aparente e em parte indicados doravante.[0015] Other objects and characteristics will be partly apparent and partly indicated hereinafter.

Brief Description of the Figures

[0016] A FIGURA 1 mostra um alinhamento de sequência de aminoácidos da porção amino-terminal da cepa Sterne de Bacillus anthracisBclA e com a região correspondente de várias proteínas de exósporo de membros da família de Bacillus cereus.[0016] FIGURE 1 shows an amino acid sequence alignment of the amino-terminal portion of the Sterne strain of Bacillus anthracisBclA and with the corresponding region of various exospore proteins from members of the Bacillus cereus family.

[0017] A FIGURA 2 mostra resultados exemplificativos de microscopia fluorescente para a expressão das proteínas de fusão contendo várias proteínas de exósporo ligadas a um relator de mCherry no exósporo.[0017] FIGURE 2 shows exemplary fluorescent microscopy results for the expression of fusion proteins containing various exospore proteins linked to an mCherry reporter in the exospore.

Definitions

[0018] Quando os artigos "um", "uma", "um", "o ou a", e "referido" são usados neste documento, significam "pelo menos um" ou "um ou mais" exceto se indicados de outra forma.[0018] When the articles "a", "an", "an", "the or the", and "referred to" are used in this document, they mean "at least one" or "one or more" unless otherwise indicated form.

[0019] Os termos "compreendendo", "incluindo" e "tendo" estão destinado a ser inclusivos e significam que pode existir elementos adicionais que não sejam os elementos listados.[0019] The terms "comprising", "including" and "having" are intended to be inclusive and mean that there may be additional elements other than the elements listed.

[0020] O termo "peptídeo bioativo" se refere a qualquer peptídeo que exerce uma atividade biológica. "Peptídeo bioativos" podem ser gerados, por exemplo, através de clivagem de uma proteína, pró- proteína ou pré-proteína por uma protease ou peptidase.[0020] The term "bioactive peptide" refers to any peptide that exerts a biological activity. "Bioactive peptides" can be generated, for example, through cleavage of a protein, pro-protein or pre-protein by a protease or peptidase.

[0021] Uma "enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas" inclui qualquer enzima que cataliza etapas em um caminho de síntese biológica para um composto que estimula o crescimento de plantas ou altera a estrutura de plantas, ou qualquer enzima que cataliza a conversão de um derivativo inativo ou menos ativo de um composto que estimula o crescimento de plantas ou altera a estrutura da planta para uma forma ativa ou mais ativa do composto. Tais compostos incluem, por exemplo, porém não se limitam a, pequenas moléculas de hormônios vegetais tais como auxinas ou citoquininas, peptídeos bioativos e pequenas moléculas de estimulação de crescimento de plantas sintetizadas por bactérias ou fungos na rizosfera (por ex., 2,3-butanediol).[0021] An "enzyme involved in the production or activation of a plant growth stimulating compound" includes any enzyme that catalyzes steps in a biological synthesis pathway for a compound that stimulates plant growth or alters plant structure, or any enzyme that catalyzes the conversion of an inactive or less active derivative of a compound that stimulates plant growth or alters plant structure to an active or more active form of the compound. Such compounds include, for example, but are not limited to, small molecules of plant hormones such as auxins or cytokinins, bioactive peptides, and small plant growth-stimulating molecules synthesized by bacteria or fungi in the rhizosphere (e.g., 2,3 -butanediol).

[0022] O termo "proteína de fusão"conforme usado neste documento se refere a uma proteína possuindo uma sequência de polipeptídeo que compreende sequências derivadas de duas ou mais proteínas separadas. Uma proteína de fusão pode ser gerada por unir uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou parte de um primeiro polipeptídeo com uma molécula de ácido nucleico que codifica todo ou parte de um segundo polipeptídeo para criar uma sequência de ácido nucleico que, quando expressa, resulta em polipeptídeo único tendo propriedades funcionais derivadas de cada uma das proteínas originais.[0022] The term "fusion protein" as used herein refers to a protein having a polypeptide sequence that comprises sequences derived from two or more separate proteins. A fusion protein can be generated by joining a nucleic acid molecule encoding all or part of a first polypeptide with a nucleic acid molecule encoding all or part of a second polypeptide to create a nucleic acid sequence that, when expressed, results in a single polypeptide having functional properties derived from each of the original proteins.

[0023] O termo "imobilização de um esporo de membro da família Bacillus cereus recombinante em uma planta" se refere a ligação de um esporo de membro da família Bacillus cereus em uma planta, por exemplo, em uma raiz de uma planta ou em uma porção aérea de uma planta tal como uma folha, caule, folha ou fruto, de forma que o esporo seja mantido na estrutura da raiz da planta ou porção aérea ao invés de se dissipar no meio de crescimento da planta ou no ambiente circundante das porções aéreas da planta.[0023] The term "immobilization of a recombinant Bacillus cereus family member spore on a plant" refers to the attachment of a Bacillus cereus family member spore to a plant, for example, to a root of a plant or to a aerial portion of a plant such as a leaf, stem, leaf or fruit, so that the spore is maintained in the plant's root structure or aerial portion rather than dissipating into the plant's growing medium or the environment surrounding the aerial portions of the plant.

[0024] Um "meio de crescimento de plantas" inclui qualquer material que é capaz de suportar o crescimento de uma planta.[0024] A "plant growth medium" includes any material that is capable of supporting the growth of a plant.

[0025] Uma "proteína ou peptídeo potencializador de sistema imune de planta" conforme usado neste documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que possui um efeito benéfico no sistema imune de uma planta.[0025] A "plant immune system enhancing protein or peptide" as used herein includes any protein or peptide that has a beneficial effect on the immune system of a plant.

[0026] O termo "proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas" conforme usado neste documento pode incluir qualquer proteína ou peptídeo que aumenta o crescimento da planta em uma planta exposta à proteína ou peptídeo.[0026] The term "plant growth stimulating protein or peptide" as used herein may include any protein or peptide that enhances plant growth in a plant exposed to the protein or peptide.

[0027] Uma "proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno"conforme usado neste documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que torna a planta exposta a proteína ou peptídeo menos susceptível à infecção com um patógeno.[0027] A "protein or peptide that protects a plant against a pathogen" as used herein includes any protein or peptide that makes the plant exposed to the protein or peptide less susceptible to infection with a pathogen.

[0028] Uma "proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta" conforme usado neste documento inclui qualquer proteína ou peptídeo que torna uma planta exposta a proteína ou peptídeo mais resistente ao estresse.[0028] A "protein or peptide that increases stress resistance in a plant" as used herein includes any protein or peptide that makes a plant exposed to the protein or peptide more resistant to stress.

[0029] O termo "proteína ou peptídeo de ligação de planta" se refere a qualquer proteína ou peptídeo que seja capaz de ligar-se especificamente ou não-especificamente a qualquer parte de uma planta (por exemplo, uma raiz de uma planta ou uma parte aérea de uma planta, como uma folha, um caule, uma flor ou uma fruta) ou um material de origem vegetal.[0029] The term "plant binding protein or peptide" refers to any protein or peptide that is capable of binding specifically or non-specifically to any part of a plant (e.g., a root of a plant or a aerial part of a plant, such as a leaf, stem, flower or fruit) or material of plant origin.

[0030] O termo "sequência de direcionamento" conforme usado neste documento se refere a uma sequência de polipeptídeo que, quando presente como parte de um polipeptídeo maior ou uma proteína, resulta na localização do polipeptídeo maior ou da proteína em um local subcelular específico. As sequências de direcionamento descritas neste documento resultam na localização de proteínas para o exósporo de um membro da família Bacillus cereus. Descrição Da Invenção[0030] The term "targeting sequence" as used herein refers to a polypeptide sequence that, when present as part of a larger polypeptide or a protein, results in localization of the larger polypeptide or protein to a specific subcellular location. The targeting sequences described herein result in the localization of proteins to the exospore of a member of the Bacillus cereus family. Description of the Invention

[0031] A presente invenção diz respeito a proteínas de fusão contendo uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo que direciona a proteína de fusão para o exósporo de um membro da família Bacillus cereus e: (a) pelo menos uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas; (b) pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno; (c) pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse de uma planta; ou (d) pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação de planta. Quando expresso em bactérias de membro da família de Bacillus cereus, estas proteínas de fusão são direcionadas a camada de exósporo do esporo e são fisicamente orientadas de forma que a proteína ou peptídeo esteja visível no lado de fora do esporo.[0031] The present invention relates to fusion proteins containing a targeting sequence, an exospore protein or an exospore protein fragment that directs the fusion protein to the exospore of a member of the Bacillus cereus family and: (a) at least one plant growth stimulating protein or peptide; (b) at least one protein or peptide that protects a plant against a pathogen; (c) at least one protein or peptide that increases the stress resistance of a plant; or (d) at least one plant binding protein or peptide. When expressed in bacteria from the Bacillus cereus family, these fusion proteins target the exospore layer of the spore and are physically oriented so that the protein or peptide is visible on the outside of the spore.

[0032] Este sistema de exibição de exósporo de Bacillus (BEMD) pode ser usado para entregar peptídeo, enzimas e outras proteínas para plantas (por exemplo, para folhas, frutos, flores, caules e raízes de plantas) ou para um meio de crescimento de planta tal como um solo. O peptídeos, enzimas e proteínas entregues no solo ou em outro meio de crescimento de plantas nesta maneira persiste e exibe uma atividade no solo para períodos de tempo estendidos. Introdução de bactérias de membro da família Bacillus cereus recombinantes que expressam as proteínas de fusão descritas neste documento no solo ou a rizosfera de uma planta que leva a um aumento benéfico do crescimento da planta em muitas condições de solo diferentes. O uso do BEMD para criar estas enzimas permite que elas continuem a exercer seus resultados benéficos para a planta e rizosfera ao longo dos primeiros meses de vida de uma planta.[0032] This Bacillus exospore display system (BEMD) can be used to deliver peptide, enzymes and other proteins to plants (e.g., to leaves, fruits, flowers, stems and roots of plants) or to a growth medium of plant such as soil. The peptides, enzymes and proteins delivered to the soil or other plant growth medium in this manner persist and exhibit activity in the soil for extended periods of time. Introduction of recombinant Bacillus cereus family member bacteria expressing the fusion proteins described herein into the soil or rhizosphere of a plant leads to a beneficial increase in plant growth in many different soil conditions. Using BEMD to create these enzymes allows them to continue to exert their beneficial results for the plant and rhizosphere throughout the first few months of a plant's life.

Targeting Sequences, Exospore Proteins, and Exospore Protein Fragments

[0033] Para facilitar a referência, as SEQ ID NOs. para peptídeos e sequências de proteínas mencionadas neste documento são listadas na Tabela 1 abaixo. Tabela 1: Sequências de Peptídeos e Proteínas [0033] For ease of reference, SEQ ID NOs. for peptides and protein sequences mentioned in this document are listed in Table 1 below. Table 1: Peptide and Protein Sequences

[0034] AA = amino acids[0034] AA = amino acids

[0035] B. anthracis Sterne strain BclA has 100% sequence identity with B. thuringiensis BclA. Thus, SEQ ID NOs: 1, 2, and 59 also represent amino acids 1-41 of B. thuringiensis BclA, full length B. thuringiensis BclA, and amino acids 1-196 of B. thuringiensis BclA, respectively. Likewise, SEQ ID NO: 60 also represents a methionine residue plus amino acids 20-35 of B. thuringiensis BclA.[0035] B. anthracis Sterne strain BclA has 100% sequence identity with B. thuringiensis BclA. Thus, SEQ ID NOs: 1, 2, and 59 also represent amino acids 1-41 of B. thuringiensis BclA, full length B. thuringiensis BclA, and amino acids 1-196 of B. thuringiensis BclA, respectively. Likewise, SEQ ID NO: 60 also represents a methionine residue plus amino acids 20-35 of B. thuringiensis BclA.

[0036] ** B. mycoides hypothetical protein TIGR03720 has 100% sequence identity with B. mycoides hypothetical protein WP003189234. Thus, SEQ ID NOs: 57 and 58 also represent amino acids 1-136 of B. mycoides hypothetical protein WP003189234 and full length B. mycoides hypothetical protein WP003189234, respectively.[0036] ** B. mycoides hypothetical protein TIGR03720 has 100% sequence identity with B. mycoides hypothetical protein WP003189234. Thus, SEQ ID NOs: 57 and 58 also represent amino acids 1-136 of B. mycoides hypothetical protein WP003189234 and full length B. mycoides hypothetical protein WP003189234, respectively.

[0037] Bacillusé um gênero da bactéria em forma de bastonete. A família da bactéria Bacillus cereus inclui as espécies Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, e Bacillus weihenstephensis. Sob condições ambientais estressantes, a bactéria da família Bacillus cereus passa por esporulação e forma endosporos ovais que podem permanecer dormentes por períodos de tempo prolongados. A camada mais externa dos endosporos é conhecida como exósporo e compreende uma camada basal circundada por uma tecido externo de projeções semelhantes a capilares. Os filamentos no tecido semelhante a capilares são predominantemente formados pela glicoproteína BcIA semelhante ao colágeno, enquanto que a camada basal é composta por inúmeras proteínas diferentes. Outra proteína relacionado ao colágeno, BcIB, também está presente no exósporo e exposta aos endosporos dos membros da família de Bacillus cereus. BcIA, o maior constituinte do tecido superficial tem mostrado estar ligado ao exósporo com seu amino-terminal (N-terminal) posicionado na camada basal e seu carboxi-terminal (C-terminal) se estendendo para fora do esporo.[0037] Bacillus is a genus of rod-shaped bacteria. The Bacillus cereus family of bacteria includes the species Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, and Bacillus weihenstephensis. Under stressful environmental conditions, bacteria from the Bacillus cereus family undergo sporulation and form oval endospores that can remain dormant for prolonged periods of time. The outermost layer of endospores is known as the exospore and comprises a basal layer surrounded by an outer tissue of capillary-like projections. The filaments in the capillary-like tissue are predominantly formed by the collagen-like glycoprotein BcIA, while the basal layer is composed of numerous different proteins. Another collagen-related protein, BcIB, is also present in the exospore and exposed to the endospores of members of the Bacillus cereus family. BcIA, the major constituent of the surface tissue has been shown to be attached to the exospore with its amino-terminus (N-terminus) positioned in the basal layer and its carboxy-terminus (C-terminus) extending outside the spore.

[0038] Descobriu-se previamente que determinadas sequências das regiões de N-terminal de BclA e BclB poderiam ser usadas para direcionar um peptídeo ou proteína para o exósporo de um endospóro de Bacillus cereus (videPedidos de Patentes U.S. N° 2010/0233124 e 2011/0281316, e Thompson et al., Targeting of the BclA and BclB proteins to the Bacillus anthracis spore surface, Molecular Microbiology 70(2):421-34 (2008), o conteúdo inteiro de cada um sendo incorporado neste documento por referência). Descobriu-se também que a proteína BetA/BAS3290 do Bacillus anthracis está localizada no exósporo.[0038] It was previously discovered that certain sequences from the N-terminal regions of BclA and BclB could be used to target a peptide or protein to the exospore of a Bacillus cereus endospore (see U.S. Patent Applications No. 2010/0233124 and 2011 /0281316, and Thompson et al., Targeting of the BclA and BclB proteins to the Bacillus anthracis spore surface, Molecular Microbiology 70(2):421-34 (2008), the entire contents of each being incorporated herein by reference) . The Bacillus anthracis protein BetA/BAS3290 was also found to be localized in the exospore.

[0039] Em especial, os aminoácidos 20-35 de BclA da cepe Sterne de Bacillus anthacis foram encontrados como sendo suficientes para direcionar para o exósporo. Um alinhamento de sequência de aminoácidos 1-41 de BcIA (SEQ ID NO: 1) com as regiões N-terminal correspondentes de várias outras proteínas de exósporo da família Bacillus cereus e proteínas da família Bacillus cereus tendo relatado sequências são mostradas na Figura 1. Conforme pode ser visto na Figura 1, existe uma região de alta homologia entre todas as proteínas da região correspondente aos aminoácidos 20-41 de BcIA. Contudo, nestas sequências, os aminoácidos correspondem aos aminoácidos 36-41 de BclA que contém estrutura secundária e não são necessários para a localização da proteína de fusão ao exósporo. A região de sequência de direcionamento conservada de BclA aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1) é mostrado em negrito na Figura 1 e corresponde a sequência de direcionamento mínima necessária para a localização no exósporo. Uma região mais altamente conservada que transpõe aminoácidos 23-35 de BclA dentro da sequência de direcionamento é sublinhada nas sequências na Figura 1, é a sequência de reconhecimento para ExsFA/BxpB/ExsFB e homólogos, que direciona e monta as proteínas descritas na superfície do exósporo. As sequências de aminoácidos de SED ID NOs. 3, 5, e 7 na Figura 1 são os aminoácidos 1-33 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BetA/BAS3290, uma metionina seguida por aminoácidos 2-43 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BAS4623, e aminoácidos 1-34 de cepas Sterne de Bacillus anthracis , respectivamente. (Para BAS4623, descobriu-se que substituir a valina presente na posição 1 na proteína nativa com uma metionina resultou numa expressão melhor.)) Conforme pode ser visto a partir da Figura 1, cada uma destas sequências contém uma região conservada correspondendo aos aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1; mostrada em negrito) e uma região mais altamente conservada correspondendo aos aminácidos 20-35 de BclA (sublinhados).[0039] In particular, amino acids 20-35 of BclA from the Sterne strain of Bacillus anthacis were found to be sufficient to target the exospore. A sequence alignment of amino acids 1-41 of BcIA (SEQ ID NO: 1) with the corresponding N-terminal regions of several other Bacillus cereus family exospore proteins and Bacillus cereus family proteins having reported sequences is shown in Figure 1. As can be seen in Figure 1, there is a region of high homology between all proteins in the region corresponding to amino acids 20-41 of BcIA. However, in these sequences, the amino acids correspond to amino acids 36-41 of BclA which contains secondary structure and are not necessary for localization of the fusion protein to the exospore. The conserved targeting sequence region of BclA amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1) is shown in bold in Figure 1 and corresponds to the minimal targeting sequence required for localization to the exospore. A more highly conserved region spanning amino acids 23-35 of BclA within the targeting sequence is highlighted in the sequences in Figure 1, it is the recognition sequence for ExsFA/BxpB/ExsFB and homologues, which targets and assembles the proteins described on the surface of the exospore. The amino acid sequences of SED ID NOs. 3, 5, and 7 in Figure 1 are amino acids 1-33 of Sterne strain of Bacillus anthracis BetA/BAS3290, a methionine followed by amino acids 2-43 of Sterne strain of Bacillus anthracis BAS4623, and amino acids 1-34 of Sterne strain of Bacillus anthracis, respectively. (For BAS4623, it was found that replacing the valine present at position 1 in the native protein with a methionine resulted in better expression.)) As can be seen from Figure 1, each of these sequences contains a conserved region corresponding to amino acids 20 -35 of BclA (SEQ ID NO: 1; shown in bold) and a more highly conserved region corresponding to amino acids 20-35 of BclA (underlined).

[0040] Proteínas adicionais de membros da família de Bacillus cereus também contém a região de direcionamento conservada. Em especial, na Figura 1, SED ID NO: 9 são aminoácidos de 1-30 de cepa Sterne de Bacillus anthracis BAS1882, SEQ ID NO: 11 são aminoácidos de 1-39 de produto de gene KBAB4 2280 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 13 são aminoácidos de 1-39 de produto de gene KBAB4 3572 de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 15 são aminoácidos de 1-49 de peptídeo líder de exósporo VD200 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 17 são aminoácidos de 1-33 de peptídeo líder de exósporo VD166 de Bacillus cereus, SEQ ID NO: 19 são aminoácidos de 1-39 de proteína hipotética VD200 de Bacillus cereus IKG_04663, SEQ ID NO: 21 são aminoácidos de 1-39 de proteína ß-propulsora KBAB4 YVTN de Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 23 são aminoácidos 1-30 de proteína hipotética de Bacillus weihenstephensis bcerkbab4_2363, SEQ ID NO: 25 são aminoácidos de 1-30 de proteína hipotética de Bacillus weihenstephensis KBAB4 bcerkbab4_2131, SEQ ID NO: 27 são aminoácidos de 1-36 deBacillus weihenstephensis KBAB4 repetição de tripla hélice contendo colágeno, SEQ ID NO: 29 são aminoácidos de 139 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660, SEQ ID NO: 31 são aminoácidos de 1-30 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, SEQ ID NO: 33 são aminoácidos de 1-21 de Bacillus mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, SEQ ID NO: 35 são aminoácidos de 1-22 de Bacillus thuringiensis 35646 proteína de repetição de tripla hélice com colágeno, SEQ ID NO: 43 são aminoácidos de 1-35 de Bacillus cereus proteína hipotética WP_69652, SEQ ID NO: 45 são aminoácidos de 1-41 deBacillus cereus líder de exósporo WP016117717, SEQ ID NO: 47 são aminoácidos de 1-49 de Bacillus cereus peptídeo de exósporo WP002105192, SEQ ID NO: 49 são aminoácidos de 1-38 de Bacillus cereus proteína hipotética WP87353, SEQ ID NO: 51 são aminoácidos de 1-39 de Bacillus cereus peptídeo de exósporo 02112369, SEQ ID NO: 53 são aminoácidos de 1-39 de Bacillus cereus proteína de exósporo WP016099770, SEQ ID NO: 55 são aminoácidos de 1-36 de Bacillus thuringiensisproteína hipotética YP006612525, e SEQ ID NO: 57 são aminoácidos de 1-136 de Bacillus mycoides proteína hipotética TIGR03720. Conforme mostrado na Figura 1, cada uma das regiões de N-terminal destas proteínas contém uma região que é conservada com aminoácidos 20-35 de BclA (SEQ ID NO: 1; e uma região mais altamente conservada correspondendo aos aminácidos 25-35 de BclA.[0040] Additional proteins from members of the Bacillus cereus family also contain the conserved targeting region. In particular, in Figure 1, SED ID NO: 9 are amino acids 1-30 of Bacillus anthracis BAS1882 Sterne strain, SEQ ID NO: 11 are amino acids 1-39 of Bacillus weihenstephensis gene product KBAB4 2280, SEQ ID NO : 13 are amino acids 1-39 of gene product KBAB4 3572 of Bacillus weihenstephensis, SEQ ID NO: 15 are amino acids 1-49 of exospore leader peptide VD200 of Bacillus cereus, SEQ ID NO: 17 are amino acids 1-33 of exospore leader peptide VD166 of Bacillus cereus, SEQ ID NO: 19 are amino acids 1-39 of hypothetical protein VD200 of Bacillus cereus IKG_04663, SEQ ID NO: 21 are amino acids 1-39 of Bacillus ß-propeller protein KBAB4 YVTN weihenstephensis, SEQ ID NO: 23 are amino acids 1-30 of hypothetical Bacillus weihenstephensis protein bcerkbab4_2363, SEQ ID NO: 25 are amino acids 1-30 of hypothetical Bacillus weihenstephensis protein KBAB4 bcerkbab4_2131, SEQ ID NO: 27 are amino acids 1- 36 from Bacillus weihenstephensis KBAB4 triple helix repeat containing collagen, SEQ ID NO: 29 are amino acids from 139 from Bacillus mycoides 2048 hypothetical protein bmyco0001_21660, SEQ ID NO: 31 are amino acids from 1-30 from Bacillus mycoides 2048 hypothetical protein bmyc0001_22540, SEQ ID NO : 33 are amino acids 1-21 from Bacillus mycoides 2048 hypothetical protein bmyc0001_21510, SEQ ID NO: 35 are amino acids 1-22 from Bacillus thuringiensis 35646 triple helix repeat protein with collagen, SEQ ID NO: 43 are amino acids 1- 35 of Bacillus cereus hypothetical protein WP_69652, SEQ ID NO: 45 are amino acids 1-41 of Bacillus cereus exospore leader WP016117717, SEQ ID NO: 47 are amino acids 1-49 of Bacillus cereus exospore peptide WP002105192, SEQ ID NO: 49 are amino acids 1-38 of Bacillus cereus hypothetical protein WP87353, SEQ ID NO: 51 are amino acids 1-39 of Bacillus cereus exospore peptide 02112369, SEQ ID NO: 53 are amino acids 1-39 of Bacillus cereus exospore protein WP016099770 , SEQ ID NO: 55 are amino acids 1-36 of hypothetical Bacillus thuringiensis protein YP006612525, and SEQ ID NO: 57 are amino acids 1-136 of hypothetical Bacillus mycoides protein TIGR03720. As shown in Figure 1, each of the N-terminal regions of these proteins contains a region that is conserved with amino acids 20-35 of BclA (SEQ ID NO: 1; and a more highly conserved region corresponding to amino acids 25-35 of BclA .

[0041] Nas proteínas de fusão da presente invenção, qualquer parte de BclA que inclui aminoácidos de 20-35 pode ser usada como sequência de direcionamento na presente invenção. Além disso, proteínas de exósporo de comprimento total ou fragmentos de proteínas de exósporo podem ser usados para direcionamento às proteínas de fusão para o exósporo. Sendo assim, BclA de comprimento total ou um fragmento de BclA que inclui aminoácidos de 20-35 podem ser usados para direcionamento ao exósporo. Por exemplo, BclA de comprimento total (SEQ ID NO: 2) ou um fragmento de tamanho médio de BclA que não possui carboxi-terminal tal como SEQ ID NO: 59 (aminoácidos de 1-196 ou BclA) podem ser usados para direcionar as proteínas de fusão ao exósporo. Fragmentos de tamanho médio tal como o fragmento de SEQ ID NO: 59 possui menos de estrutura secundária do que o BclA de comprimento total e descobriu-se que pode ser adequado para uso como uma sequência de direcionamento. A sequência de direcionamento também podem compreender partes muito menores de BclA que incluem aminoácidos de 20-35, tal como a SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 1-41 de BclA), aminoácidos de 1-35 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 60 (um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 20-35 de BclA) Fragmentos ainda menores de BclA que incluem apenas alguns aminoácidos de 2035 também exibem a capacidade de direcionar proteínas de fusão ao exósporo. Por exemplo, a sequência de direcionamento podem compreender aminoácidos de 22-31 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos de 22-33 de SEQ ID NO: 1, ou aminoácidos de 20-31 deSEQ ID NO: 1.[0041] In the fusion proteins of the present invention, any part of BclA that includes amino acids from 20-35 can be used as a targeting sequence in the present invention. Furthermore, full-length exospore proteins or fragments of exospore proteins can be used to target fusion proteins to the exospore. Therefore, full-length BclA or a BclA fragment that includes 20-35 amino acids can be used for exospore targeting. For example, full-length BclA (SEQ ID NO: 2) or a medium-sized fragment of BclA that does not have a carboxy terminus such as SEQ ID NO: 59 (amino acids 1-196 or BclA) can be used to target the fusion proteins to the exospore. Medium-sized fragments such as the fragment of SEQ ID NO: 59 have less secondary structure than full-length BclA and have been found to be suitable for use as a targeting sequence. The targeting sequence may also comprise much smaller parts of BclA that include amino acids 20-35, such as SEQ ID NO: 1 (amino acids 1-41 of BclA), amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1, amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 60 (a methionine residue linked to amino acids 20-35 of BclA) Even smaller fragments of BclA that include only a few 2035 amino acids also exhibit the ability to target proteins fusion to the exospore. For example, the targeting sequence may comprise amino acids 22-31 of SEQ ID NO: 1, amino acids 22-33 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 20-31 of SEQ ID NO: 1.

[0042] Alternativamente, qualquer parte de BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, o produto de gene de KBAB4 2280, o produto de gene de BAB4 3572, peptídeo líder de exósporo VD200 de B. cereus, peptídeo líder de exósporo VD166 de B. cereus, proteína hipotética VD200 de B. cereus IKG_04663, B. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína ß-propulsora, B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363, B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131, B. weihenstephensis KBAB4 repetição de tripla hélice contendo colágeno, B. mycoides 2048 protéina hipotética bmyco0001_21660, B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, B. thuringiensis 35646 proteína de repetição de tripla hélice contendo colágeno, B. cereusproteína hipotética WP_69652, B. cereuslíder de exósporo WP016117717, B. cereuspeptídeo de exósporo WP002105192, B. cereusproetína hipotética WP87353, B. cereuspeptíde de exósporo 02112369, B. cereusproteína de exósporo WP016099770, B. thuringiensisproteína hipotética YP006612525, ou B. mycoidesproteína hipotética TIGR03720 que inclui aminoácidos que correspondem aos aminoácidos de 20-35 de BclA podem servir como a sequência de direcionamento. Conforme pode ser visto pela Figura 1, aminoácidos de 12-27 de BetA/BAS3290, aminoácidos de 23-38 de BAS4623, aminoácidos de de 13-28 de BclB, aminoácidos de 9-24 de BAS1882, aminoácidos de 18-33 de produto de gene KBAB4 2280, aminoácidos de 18-33 de produto de gene KBAB4 3572, aminoácidos de aminoácidos de 28-43 de B. cereus VD200 peptíde líder de exósporo, aminoácidos de 12-27 de B. cereus VD166 peptíde líder de exósporo, aminoácidos de 18-33 of B. cereus VD200 proteína hipotética IKG_04663, aminoácidos de 18-33 B. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína ß-propulsora, aminoácidos de 9-24 de B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363, aminoácidos de 9-24 de B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131, aminoácidos de 15-30 de B. weihenstephensis KBAB4 repetição de tripla hélice contendo colágeno, aminoácidos de 18-33 of B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660, aminoácidos de 9-24 de B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540, aminoácidos de 1-15 of B. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510, aminoácidos de 1-16 of B. thuringiensis 35646 proteína de repetição de tripla hélice contendo colágeno, aminoácidos de 14-29 de B. cereus proteína hipotética WP_69652, aminoácidos de 20-35 de B. cereus líder de exósporo WP016117717, aminoácidos de 28-43 de B. cereus peptídeo de exósporo WP002105192, aminoácidos de 17-32 de B. cereus proteína hipotética WP87353, aminoácidos de 18-33 de B. cereus peptídeo de exósporo 02112369, aminoácidos de 18-33 de B. cereus proteína de exósporo WP016099770, aminoácidos de 15-30 de B. thuringiensis proteína hipotética YP006612525, e aminoácidos de 115-130 de B. mycoides proteína hipotética TIGR03720 correspondendo aos aminoácidos de 20-35 de BclA. Sendo assim, qualquer parte destas proteínas que inclui os aminoácidos correspondentes listados acima pode servir como uma sequência de direcionamento.[0042] Alternatively, any part of BetA/BAS3290, BAS4623, BclB, BAS1882, the gene product of KBAB4 2280, the gene product of BAB4 3572, exospore leader peptide VD200 of B. cereus, exospore leader peptide VD166 of B. cereus, B. cereus hypothetical VD200 protein IKG_04663, B. weihenstephensis KBAB4 YVTN ß-propeller protein, B. weihenstephensis KBAB4 hypothetical protein bcerkbab4_2363, B. weihenstephensis KBAB4 hypothetical protein bcerkbab4_2131, B. weihenstephensis KBAB4 triple helix repeat containing collagen, B. mycoides 2048 hypothetical protein bmyco0001_21660, B. mycoides 2048 hypothetical protein bmyc0001_22540, B. mycoides 2048 hypothetical protein bmyc0001_21510, B. thuringiensis 35646 collagen-containing triple helix repeat protein, B. cereus hypothetical protein WP_ 69652, B. cereus exospore leader WP016117717, B. exospore cereuspeptide WP002105192, B. hypothetical cereusproetin WP87353, B. exospore cereuspeptide 02112369, B. exospore cereusprotein WP016099770, B. thuringiensis hypothetical protein YP006612525, or B. hypothetical mycoidesprotein ethics TIGR03720 which includes amino acids that correspond to amino acids 20-35 of BclA may serve as the targeting sequence. As can be seen from Figure 1, amino acids 12-27 of BetA/BAS3290, amino acids 23-38 of BAS4623, amino acids 13-28 of BclB, amino acids 9-24 of BAS1882, amino acids 18-33 of product of KBAB4 gene product 2280, amino acids 18-33 of gene product KBAB4 3572, amino acids of amino acids 28-43 of B. cereus VD200 exospore leader peptide, amino acids 12-27 of B. cereus VD166 exospore leader peptide, amino acids of 18-33 of B. cereus VD200 hypothetical protein IKG_04663, amino acids of 18-33 B. weihenstephensis KBAB4 YVTN ß-propeller protein, amino acids of 9-24 of B. weihenstephensis KBAB4 hypothetical protein bcerkbab4_2363, amino acids of 9-24 of B. weihenstephensis KBAB4 hypothetical protein bcerkbab4_2131, amino acids 15-30 of B. weihenstephensis KBAB4 collagen-containing triple helix repeat, amino acids 18-33 of B. mycoides 2048 hypothetical protein bmyco0001_21660, amino acids 9-24 of B. mycoides 2048 hypothetical protein bmyc0001 _22540 , amino acids 1-15 of B. mycoides 2048 hypothetical protein bmyc0001_21510, amino acids 1-16 of B. thuringiensis 35646 collagen-containing triple helix repeat protein, amino acids 14-29 of B. cereus hypothetical protein WP_69652, amino acids 20 -35 from B. cereus exospore leader WP016117717, amino acids 28-43 from B. cereus exospore peptide WP002105192, amino acids 17-32 from B. cereus hypothetical protein WP87353, amino acids 18-33 from B. cereus exospore peptide 02112369, amino acids 18-33 of B. cereus exospore protein WP016099770, amino acids 15-30 of B. thuringiensis hypothetical protein YP006612525, and amino acids 115-130 of B. mycoides hypothetical protein TIGR03720 corresponding to amino acids 20-35 of BclA. Therefore, any part of these proteins that includes the corresponding amino acids listed above can serve as a targeting sequence.

[0043] Além disso, qualquer sequência de aminoácidos compreendendo aminoácidos de 20-35 de BclA, ou qualquer dos aminoácidos correspondentes listados acima podem servir como a sequência de direcionamento.[0043] Furthermore, any amino acid sequence comprising amino acids 20-35 of BclA, or any of the corresponding amino acids listed above can serve as the targeting sequence.

[0044] Portanto, a sequência de direcionamento podem compreender aminoácidos de 1-35 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos 2035 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 60, aminoácidos de 22-31 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos de 22-33 de SEQ ID NO: 1, ou aminoácidos de 20-31 deSEQ ID NO: 1. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 60. Alternativamente, a sequência de direcionamento pode consistir de aminoácidos de 22-31 de SEQ ID NO: 1, aminoácidos de 22-33 de SEQ ID NO: 1, ou aminoácidos de 20-31 deSEQ ID NO: 1. Alternativamente, a proteína de exósporo podem compreender BclA de comprimento total (SEQ ID NO: 2) ou o fragmento de proteína de exósporo pode compreender um fragmento de tamanho médio de BclA que não contém carboxi-terminal, tal como SEQ ID NO: 59 (aminoácidos de 1-196 de BclA). Alternativamente, o fragmento de proteína de exósporo pode consistir de SEQ ID NO: 59.[0044] Therefore, the targeting sequence may comprise amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1, amino acids 2035 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 60, amino acids 22-31 of SEQ ID NO: 1, amino acids 22-33 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 20-31 of SEQ ID NO: 1. Alternatively, the targeting sequence consists of amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1, amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 60. Alternatively, the targeting sequence may consist of amino acids 22-31 of SEQ ID NO: 1, amino acids 22-33 of SEQ ID NO: 1, or amino acids 20-31 of SEQ ID NO: 1. Alternatively, the exospore protein may comprise full-length BclA (SEQ ID NO: 2) or the exospore protein fragment may comprise a fragment of average size of BclA that does not contain carboxy-terminus, such as SEQ ID NO: 59 (amino acids 1-196 of BclA). Alternatively, the exospore protein fragment may consist of SEQ ID NO: 59.

[0045] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-27 de SEQ ID NO: 3, aminoácidos de 12-27 de SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 3, ou a proteína de exósporo pode compreender BetA/BAS3290 de comprimento total (SEQ ID NO: 4). Descobriu-se também que um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 12-27 de BetA/BAS3290 pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 61. A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 14-23 de SEQ ID NO: 3, aminoácidos de 14-25 de SEQ ID NO: 3, ou aminoácidos de 12-23 deSEQ ID NO: 3.[0045] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-27 of SEQ ID NO: 3, amino acids 12-27 of SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 3, or the exospore protein may comprise BetA/ Full-length BAS3290 (SEQ ID NO: 4). It was also found that a methionine residue linked to amino acids 12-27 of BetA/BAS3290 can be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 61. The targeting sequence may also comprise amino acids 14-23 of SEQ ID NO: 3, amino acids 14-25 of SEQ ID NO: 3, or amino acids 12 -23 deSEQ ID NO: 3.

[0046] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-38 de SEQ ID NO: 5, aminoácidos de 23-38 de SEQ ID NO: 5, ou SEQ ID NO: 5, ou a proteína de exósporo pode compreender BAS4623 de comprimento total (SEQ ID NO: 6).[0046] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-38 of SEQ ID NO: 5, amino acids 23-38 of SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 5, or the exospore protein may comprise BAS4623 of full length (SEQ ID NO: 6).

[0047] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-28 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos de 13-28 de SEQ ID NO: 7, ou SEQ ID NO: 7, ou a proteína de exósporo pode compreender BclB de comprimento total (SEQ ID NO:8).[0047] Alternatively, the targeting sequence may comprise amino acids 1-28 of SEQ ID NO: 7, amino acids 13-28 of SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 7, or the exospore protein may comprise BclB full length (SEQ ID NO:8).

[0048] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-24 de SEQ ID NO: 9, aminoácidos de 9-24 de SEQ ID NO: 9, ou SEQ ID NO: 9, ou a proteína de exósporo pode compreender BAS1882 de comprimento total (SEQ ID NO: 10). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos 9-24 de BAS1882 também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 69.[0048] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-24 of SEQ ID NO: 9, amino acids 9-24 of SEQ ID NO: 9, or SEQ ID NO: 9, or the exospore protein may comprise BAS1882 of total length (SEQ ID NO: 10). A methionine residue linked to amino acids 9-24 of BAS1882 can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 69.

[0049] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID NO:11, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID NO: 11, ou SEQ ID NO: 11, ou a proteína de exósporo podem compreender B. weihenstephensis KBAB4 2280 produto de gene de comprimento total (SEQ ID NO: 12). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 18-33 de B. weihenstephensisKBAB4 2280 produto de gene também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 62.[0049] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 11, amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 11, or the exospore protein may comprise B. weihenstephensis KBAB4 2280 full-length gene product (SEQ ID NO: 12). A methionine residue linked to amino acids 18-33 of the B. weihenstephensisKBAB4 2280 gene product can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 62.

[0050] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID NO: 13, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID NO: 13, ou SEQ ID NO:13, ou a proteína de exósporo podem compreender B. weihenstephensis KBAB4 3572 produto de gene de comprimento total (SEQ ID NO:14). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 18-33 de B. weihenstephensisKBAB4 3572 produto de gene também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 63.[0050] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 13, amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 13, or SEQ ID NO: 13, or the exospore protein may comprise B. weihenstephensis KBAB4 3572 full-length gene product (SEQ ID NO:14). A methionine residue linked to amino acids 18-33 of the B. weihenstephensisKBAB4 3572 gene product can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 63.

[0051] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-43 da SEQ ID NO: 15, aminoácidos de 28-43 da SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO:15, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus VD200 peptídeo líder de exósporo de comprimento total (SEQ ID NO:16).[0051] Alternatively, the targeting sequence may comprise amino acids 1-43 of SEQ ID NO: 15, amino acids 28-43 of SEQ ID NO: 15, or SEQ ID NO: 15, or the exospore protein may comprise B cereus VD200 full-length exospore leader peptide (SEQ ID NO:16).

[0052] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-27 de SEQ ID NO: 17, aminoácidos de 12-27 de SEQ ID NO: 17, ou SEQ ID NO:17, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus VD166 peptídeo líder de exósporo de comprimento total (SEQ ID NO:18). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 12-27 de B. cereus VD166 peptídeo líder de exósporo também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 64.[0052] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-27 of SEQ ID NO: 17, amino acids 12-27 of SEQ ID NO: 17, or SEQ ID NO: 17, or the exospore protein may comprise B. cereus VD166 full-length exospore leader peptide (SEQ ID NO:18). A methionine residue linked to amino acids 12-27 of B. cereus VD166 exospore leader peptide can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 64.

[0053] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID NO: 19, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID NO: 19, ou SEQ ID NO:19, a proteína de exósporo pode compreender B. cereus VD200 proteína hipotética IKG_04663 de comprimento total (SEQ ID NO:20).[0053] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 19, amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 19, or SEQ ID NO: 19, the exospore protein may comprise B. cereus VD200 hypothetical full-length IKG_04663 protein (SEQ ID NO:20).

[0054] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-33 da SEQ ID NO: 21, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID NO: 21, ou SEQ ID NO:21, ou a proteína de exósporo pode compreenderB. weihenstephensis KBAB4 YVTN proteína ß- propulsora de comprimento total (SEQ ID NO:22). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 18-33 de B. weihenstephensisKBAB4 YVTN proteína b-propulsora também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 65.[0054] Alternatively, the targeting sequence may comprise amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 21, amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 21, or SEQ ID NO: 21, or the exospore protein may comprise B. weihenstephensis KBAB4 YVTN full-length ß-propeller protein (SEQ ID NO:22). A methionine residue linked to amino acids 18-33 of B. weihenstephensisKBAB4 YVTN b-propeller protein can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 65.

[0055] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-24 de SEQ ID NO: 23, aminoácidos de 9-24 de SEQ ID NO: 23, ou SEQ ID NO:23, ou a proteína de exósporo pode compreender B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363 de comprimento total (SEQ ID NO:24). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 9-24 de B. weihenstephensisKBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2363 também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 66.[0055] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-24 of SEQ ID NO: 23, amino acids 9-24 of SEQ ID NO: 23, or SEQ ID NO: 23, or the exospore protein may comprise B. weihenstephensis KBAB4 hypothetical full-length bcerkbab4_2363 protein (SEQ ID NO:24). A methionine residue linked to amino acids 9-24 of B. weihenstephensisKBAB4 hypothetical protein bcerkbab4_2363 can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 66.

[0056] A sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-24 de SEQ ID NO: 25, aminoácidos de 9-24 de SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO:25, ou a proteína de exósporo pode compreender B. weihenstephensis KBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131 de comprimento total (SEQ ID NO:26). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 9-24 de B. weihenstephensisKBAB4 proteína hipotética bcerkbab4_2131 também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 67.[0056] The targeting sequence may comprise amino acids 1-24 of SEQ ID NO: 25, amino acids 9-24 of SEQ ID NO: 25, or SEQ ID NO: 25, or the exospore protein may comprise B. weihenstephensis KBAB4 hypothetical full-length bcerkbab4_2131 protein (SEQ ID NO:26). A methionine residue linked to amino acids 9-24 of B. weihenstephensisKBAB4 hypothetical protein bcerkbab4_2131 can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 67.

[0057] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-30 da SEQ ID NO: 27, aminoácidos de 15-30 de SEQ ID NO: 27, ou SEQ ID NO:27, ou a proteína de exósporo pode compreender B. weihenstephensis KBAB4 repetição de tripla hélice contendo colágeno de comprimento total (SEQ ID NO:28).[0057] Alternatively, the targeting sequence may comprise amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 27, amino acids 15-30 of SEQ ID NO: 27, or SEQ ID NO: 27, or the exospore protein may comprise B .weihenstephensis KBAB4 triple helix repeat containing full-length collagen (SEQ ID NO:28).

[0058] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID NO: 29, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID NO: 29, ou SEQ ID NO:29, ou a proteína de exósporo pode compreenderB. mycoides 2048 proteína hipotética bmyco0001_21660 de comprimento total (SEQ ID NO:30).[0058] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 29, amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 29, or SEQ ID NO: 29, or the exospore protein may comprise B. mycoides 2048 hypothetical full-length bmyco0001_21660 protein (SEQ ID NO:30).

[0059] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-24 de SEQ ID NO: 31, aminoácidos de 9-24 de SEQ ID NO: 31, ou SEQ ID NO:31, ou a proteína de exósporo pode compreenderB. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_22540 de comprimento total (SEQ ID NO:32). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 9-24 B. mycoides2048 proteína hipotética bmyc0001_22540 pode também ser usada como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 68.[0059] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-24 of SEQ ID NO: 31, amino acids 9-24 of SEQ ID NO: 31, or SEQ ID NO: 31, or the exospore protein may comprise B. mycoides 2048 hypothetical full-length bmyc0001_22540 protein (SEQ ID NO:32). A methionine residue linked to amino acids 9-24 of the hypothetical B. mycoides2048 protein bmyc0001_22540 can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 68.

[0060] Alternativamente, a sequência de direcionamento compreende aminoácidos de 1-15 da SEQ ID NO: 33, ou SEQ ID NO:33, ou a proteína de exósporo compreendeB. mycoides 2048 proteína hipotética bmyc0001_21510 de comprimento total (SEQ ID NO:34).[0060] Alternatively, the targeting sequence comprises amino acids 1-15 of SEQ ID NO: 33, or SEQ ID NO: 33, or the exospore protein comprises B. mycoides 2048 hypothetical full-length bmyc0001_21510 protein (SEQ ID NO:34).

[0061] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-16 de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:35, ou a proteína de exósporo pode compreender B. thuringiensis 35646 proteína de repetição de tripla hélice contendo colágeno de comprimento total (SEQ ID NO:36).[0061] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-16 of SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 35, or the exospore protein may comprise B. thuringiensis 35646 full-length collagen-containing triple helix repeat protein (SEQ ID NO:36).

[0062] A sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-29 de SEQ ID NO:43, aminoácidos de 14-29 de SEQ ID NO: 43, ou SEQ ID NO: 43, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus proteína hipotética WP_69652 de comprimento total (SEQ ID NO: 44).[0062] The targeting sequence may comprise amino acids 1-29 of SEQ ID NO: 43, amino acids 14-29 of SEQ ID NO: 43, or SEQ ID NO: 43, or the exospore protein may comprise B. cereus full-length hypothetical protein WP_69652 (SEQ ID NO: 44).

[0063] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 45, aminoácidos 2035 de SEQ ID NO: 45, ou SEQ ID NO: 45, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus líder de exósporo WP016117717 de comprimento total (SEQ ID NO: 46). Um resíduo de metionina ligado aos aminoácidos de 20-35 de B. cereus líder de exósporo WP016117717 também pode ser usado como uma sequência de direcionamento. Sendo assim, a sequência de direcionamento pode compreender SEQ ID NO: 70.[0063] Alternatively, the targeting sequence may comprise amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 45, amino acids 2035 of SEQ ID NO: 45, or SEQ ID NO: 45, or the exospore protein may comprise B. cereus leader of full-length exospore WP016117717 (SEQ ID NO: 46). A methionine residue linked to amino acids 20-35 of B. cereus exospore leader WP016117717 can also be used as a targeting sequence. Therefore, the targeting sequence may comprise SEQ ID NO: 70.

[0064] A sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-43 de SEQ ID NO: 47, aminoácidos de 28-43 da SEQ ID NO: 47, ou SEQ ID NO: 47, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus peptídeo de exósporo WP002105192 (SEQ ID NO: 48).[0064] The targeting sequence may comprise amino acids 1-43 of SEQ ID NO: 47, amino acids 28-43 of SEQ ID NO: 47, or SEQ ID NO: 47, or the exospore protein may comprise B. cereus exospore peptide WP002105192 (SEQ ID NO: 48).

[0065] A sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-32 de SEQ ID NO: 49, aminoácidos de 17-32 de SEQ ID NO: 49, ou SEQ ID NO: 49, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus proteína hipotética WP87353 de comprimento total (SEQ ID NO: 50).[0065] The targeting sequence may comprise amino acids 1-32 of SEQ ID NO: 49, amino acids 17-32 of SEQ ID NO: 49, or SEQ ID NO: 49, or the exospore protein may comprise B. cereus full-length hypothetical protein WP87353 (SEQ ID NO: 50).

[0066] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-33 da SEQ ID NO: 51, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID NO: 51, ou SEQ ID NO: 51, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus peptídeo de exósporo 02112369 (SEQ ID NO: 52).[0066] Alternatively, the targeting sequence may comprise amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 51, amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 51, or SEQ ID NO: 51, or the exospore protein may comprise B cereus exospore peptide 02112369 (SEQ ID NO: 52).

[0067] A sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-33 de SEQ ID NO: 53, aminoácidos de 18-33 de SEQ ID NO: 53, ou SEQ ID NO: 53, ou a proteína de exósporo pode compreender B. cereus peptídeo de exósporo WP016099770 (SEQ ID NO: 54).[0067] The targeting sequence may comprise amino acids 1-33 of SEQ ID NO: 53, amino acids 18-33 of SEQ ID NO: 53, or SEQ ID NO: 53, or the exospore protein may comprise B. cereus exospore peptide WP016099770 (SEQ ID NO: 54).

[0068] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender aminoácidos de 1-30 da SEQ ID NO: 55, aminoácidos de 15-30 de SEQ ID NO: 55, ou SEQ ID NO: 55, ou a proteína de exósporo pode compreender B. thuringiensis proteína hipotética YP006612525 de comprimento total (SEQ ID NO: 56).[0068] Alternatively, the targeting sequence may comprise amino acids 1-30 of SEQ ID NO: 55, amino acids 15-30 of SEQ ID NO: 55, or SEQ ID NO: 55, or the exospore protein may comprise B .thuringiensis hypothetical full-length protein YP006612525 (SEQ ID NO: 56).

[0069] A sequência de direcionamento também pode compreender aminoácidos de 1-130 de SEQ ID NO: 57, aminoácidos de 115-130 de SEQ ID NO: 57, ou SEQ ID NO: 57, ou a proteína de exósporo pode compreenderB. mycoidesproteína hipotética TIGR03720 de comprimento total (SEQ ID NO: 58).[0069] The targeting sequence may also comprise amino acids 1-130 of SEQ ID NO: 57, amino acids 115-130 of SEQ ID NO: 57, or SEQ ID NO: 57, or the exospore protein may comprise B. full-length hypothetical mycoidesprotein TIGR03720 (SEQ ID NO: 58).

[0070] Além disso, pode ver prontamente através do alinhamento da sequência na Figura 1 que, enquanto os aminoácidos de 20-35 de BclA são conservados e os aminoácidos de 25-35 são mais conservados, algum grau de variação pode ocorrer nesta região sem afetar a capacidade da sequência de direcionamento para direcionar uma proteína ao exósporo. A Figura 1 lista o percentual de identidade de cada um dos aminoácidos correspondentes de cada sequência aos aminoácidos de 20-35 de BclA ("de 20-35% de identidade") e aos aminoácidos de 25-35 de BclA ("de 25-35% de identidade"). Sendo assim, por exemplo, conforme comparado aos aminoácidos de 20-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são cerca de 81,3% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são cerca de 50,0% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são cerca de 43,8% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 62,5% idênticos, os aminoácidos correspondentes de KBAB4 2280 produto de gene são cerca de 81,3 idênticos e os aminoácidos correspondentes de KBAB4 3572 produto de gene são cerca de 81,3% idênticos. As identidades das sequências sobre esta região para as sequências restantes são listadas na Figura 1.[0070] Furthermore, you can readily see from the sequence alignment in Figure 1 that, while amino acids 20-35 of BclA are conserved and amino acids 25-35 are more conserved, some degree of variation can occur in this region without affect the ability of the targeting sequence to direct a protein to the exospore. Figure 1 lists the percent identity of each of the corresponding amino acids of each sequence to amino acids 20-35 of BclA ("20-35% identity") and to amino acids 25-35 of BclA ("25- 35% identity"). Thus, for example, as compared to amino acids 20-35 of BclA, the corresponding amino acids of BetA/BAS3290 are about 81.3% identical, the corresponding amino acids of BAS4623 are about 50.0% identical, the corresponding amino acids of BclB are about 43.8% identical, the corresponding amino acids of BAS1882 are about 62.5% identical, the corresponding amino acids of KBAB4 2280 gene product are about 81.3 identical, and the corresponding amino acids of KBAB4 3572 gene product gene are about 81.3% identical. The sequence identities over this region for the remaining sequences are listed in Figure 1.

[0071] Com respeito aos aminoácidos de 25-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290 são cerca de 90,9% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS4623 são cerca de 72,7% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BclB são cerca de 54,5% idênticos, os aminoácidos correspondentes de BAS1882 são cerca de 72,7% idênticos, os aminoácidos correspondentes de KBAB4 2280 produto de gene são cerca de 90,9% idênticos e os aminoácidos correspondentes de KBAB4 3572 produto de gene são cerca de 81,8% idênticos. As identidades das sequências sobre esta região para as sequências restantes são listadas na Figura 1.[0071] With respect to amino acids 25-35 of BclA, the corresponding amino acids of BetA/BAS3290 are about 90.9% identical, the corresponding amino acids of BAS4623 are about 72.7% identical, the corresponding amino acids of BclB are about 54.5% identical, the corresponding amino acids of BAS1882 are about 72.7% identical, the corresponding amino acids of KBAB4 2280 gene product are about 90.9% identical, and the corresponding amino acids of KBAB4 3572 gene product are approximately 81.8% identical. The sequence identities over this region for the remaining sequences are listed in Figure 1.

[0072] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 43% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 43% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%.[0072] Furthermore, the targeting sequence may comprise an amino acid sequence having at least 43% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 54 %. Alternatively, the targeting sequence consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 43% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 54%.

[0073] A sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%.[0073] The targeting sequence may also comprise an amino acid sequence having at least 50% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 63%. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 50% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 63%.

[0074] A sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%.[0074] The targeting sequence may also comprise an amino acid sequence having at least 50% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 72%. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 50% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 72%.

[0075] A sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 56% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 56% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%.[0075] The targeting sequence may also comprise an amino acid sequence having at least 56% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 63%. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 56% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 63%.

[0076] Alternativamente, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 62% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. A sequência de direcionamento também pode consistir em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 62% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é de pelo menos 72%.[0076] Alternatively, the targeting sequence may comprise an amino sequence having at least 62% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 72%. The targeting sequence may also consist of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 62% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 of SEQ ID NO :1 is at least 72%.

[0077] A sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%. Alternativamente, a sequência de direcionamento consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 68% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%.[0077] The targeting sequence may comprise an amino acid sequence having at least 68% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 81%. Alternatively, the targeting sequence consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 68% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 81%.

[0078] A sequência de escolha pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos 2035 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é de pelo menos 72%.[0078] The sequence of choice may comprise an amino sequence having at least 75% identity with amino acids 2035 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 72%. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 75% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein identity with amino acids 25-35 of SEQ ID NO :1 is at least 72%.

[0079] A sequência de escolha também pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é de pelo menos 81%.[0079] The sequence of choice may also comprise an amino sequence having at least 75% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 81%. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 75% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein identity with amino acids 25-35 of SEQ ID NO :1 is at least 81%.

[0080] A sequência de direcionamento também pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO:1, em que a identidade com aminoácidos de 25-35 é de pelo menos aproximadamente 81%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO:1, em que a identidade com aminoácidos de 25-35 é de pelo menos aproximadamente 81%.[0080] The targeting sequence may also comprise an amino acid sequence having at least 81% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO:1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least approximately 81 %. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 81% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO:1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least minus approximately 81%.

[0081] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 90%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 90%.[0081] Furthermore, the targeting sequence may comprise an amino acid sequence having at least 81% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 90 %. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 81% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 90%.

[0082] A pessoa versada na técnica reconhecerá que as variantes das sequências acima também podem ser usadas como sequências de direcionamento, desde que a sequência de direcionamento compreenda aminoácidos de 20-35 de BclA, os aminoácidos correspondentes de BetA/BAS3290, BAS4263, BclB, BAS1882, o KBAB4 2280 produto de gene, ou o KBAB 3572 produto de gene, ou uma sequência compreendendo qualquer das identidades de sequências observadas acima para aminoácidos de 20-35 e 25-35 de BclA estejam presentes.[0082] The person skilled in the art will recognize that variants of the above sequences can also be used as targeting sequences, provided that the targeting sequence comprises amino acids 20-35 of BclA, the corresponding amino acids of BetA/BAS3290, BAS4263, BclB , BAS1882, the KBAB4 2280 gene product, or the KBAB 3572 gene product, or a sequence comprising any of the sequence identities noted above for amino acids 20-35 and 25-35 of BclA are present.

[0083] Descobriu-se também que determinadas proteínas de exósporo da família de Bacillus cereus que não contém regiões tendo homologia aos aminoácidos de 25-35 de BclA também podem ser usadas para direcionar um peptídeo ou proteína ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus. Em especial, as proteínas de fusão podem compreender uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 71 (B. mycoides InhA), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 72 (B. anthracis Sterne BAS1141 (ExsY)), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 73 (B. anthracis Sterne BAS1144 (BxpB/ExsFA)), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 74 (B. anthracis Sterne BAS1145 (CotY)), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 75 (B. anthracis Sterne BAS1140), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 76 (B. anthracis H9401 ExsFB), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 77 (B. thuringiensis HD74 InhA1), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 78 (B. cereus ATCC 10876 ExsJ), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 79 (B. cereus ExsH), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 80 (B. anthracis Ames YjcA), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 81 (B. anthracis YjcB), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 82 (B. anthracis Sterne BclC), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 83 (Bacillus thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 fosfatase ácida), uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 84 (B. thuringiensis HD74 InhA2). Inclusão de uma proteína de exósporo compreendendo SEQ ID NO: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, ou 84 nas proteínas de fusão descritas neste documento resultarão no direcionamento ao exósporo de um membro da família de B. cereus.[0083] It has also been discovered that certain exospore proteins from the Bacillus cereus family that do not contain regions having homology to amino acids 25-35 of BclA can also be used to target a peptide or protein to the exospore of a member of the Bacillus family. cereus. In particular, the fusion proteins may comprise an exospore protein comprising SEQ ID NO: 71 (B. mycoides InhA), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 72 (B. anthracis Sterne BAS1141 (ExsY)), a exospore protein comprising SEQ ID NO: 73 (B. anthracis Sterne BAS1144 (BxpB/ExsFA)), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 74 (B. anthracis Sterne BAS1145 (CotY)), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 75 (B. anthracis Sterne BAS1140), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 76 (B. anthracis H9401 ExsFB), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 77 (B. thuringiensis HD74 InhA1), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 78 (B. cereus ATCC 10876 ExsJ), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 79 (B. cereus ExsH), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 80 (B. anthracis Ames YjcA), a exospore protein comprising SEQ ID NO: 81 (B. anthracis YjcB), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 82 (B. anthracis Sterne BclC), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 83 (Bacillus thuringiensis serovar konkukian str. 97-27 acid phosphatase), an exospore protein comprising SEQ ID NO: 84 (B. thuringiensis HD74 InhA2). Inclusion of an exospore protein comprising SEQ ID NO: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, or 84 in the fusion proteins described herein will result in targeting the exospore of a member of the B. cereus family.

[0084] Além do mais, proteínas de exósporo tendo um alto grau de identidade de sequência com qualquer das proteínas de exósporo de comprimento total ou os fragmentos de proteínas de exósporo descritos acima também podem ser usados para direcionar um peptídeo ou proteína ao exósporo de um membro da família de Bacillus cereus. Sendo assim, a proteína de fusão pode compreender uma proteína de exósporo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com quaisquer uma das SED ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 e 84. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender uma proteína de exósporo tendo pelo menos 90%, em pelo menos 95%, em pelo menos 98%, em pelo menos 99%, ou 100% de identidade com quaisquer umas das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 e 84.[0084] Furthermore, exospore proteins having a high degree of sequence identity with any of the full-length exospore proteins or exospore protein fragments described above can also be used to target a peptide or protein to the exospore of a member of the Bacillus cereus family. Thus, the fusion protein may comprise an exospore protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with any of the SED ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 and 84. Alternatively, the fusion protein may comprise an exospore protein having at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99 %, or 100% identity with any of the SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 , 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 and 84.

[0085] Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína de exósporo consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com SEQ ID NO: 59. Alternativamente, a proteína de fusão pode compreender um fragmento de proteína de exósporo consistindo de uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com a SEQ ID NO: 59.[0085] Alternatively, the fusion protein may comprise an exospore protein fragment consisting of an amino acid sequence having at least 85% identity with SEQ ID NO: 59. Alternatively, the fusion protein may comprise a protein fragment of exospore consisting of an amino acid sequence having at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99% or at least 100% identity with SEQ ID NO: 59.

[0086] Em qualquer uma das sequências de direcionamento, as proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas neste documento, a sequência de direcionamento, proteína de exósporo, ou fragmento de proteína de exósporo podem compreender a sequência de aminoácidos GXT em seu carbóxi terminal, em que X é qualquer aminoácido.[0086] In any of the targeting sequences, exospore proteins or exospore protein fragments described herein, the targeting sequence, exospore protein, or exospore protein fragment may comprise the amino acid sequence GXT at its carboxy terminal, where X is any amino acid.

[0087] Em quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo e fragmentos de proteínas de exósporo descritos neste documento, a sequência de direcionamento, proteína de exósporo, ou fragmento de proteína de exósporo podem compreender uma resíduo de alanina na posição da sequência de direcionamento que corresponde ao aminoácido 20 da SEQ ID NO: 1.[0087] In any of the targeting sequences, exospore proteins, and exospore protein fragments described herein, the targeting sequence, exospore protein, or exospore protein fragment may comprise an alanine residue at the position of the targeting sequence. which corresponds to amino acid 20 of SEQ ID NO: 1.

Fusion Proteins

[0088] A presente invenção diz respeito às proteínas de fusão compreendendo uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo de simulação de crescimento de plantas, caracterizado pelo fato que a proteína ou peptídeo de simulação de crescimento de plantas compreende um peptídeo hormonal, um peptídeo não hormonal, um uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [005].[0088] The present invention relates to fusion proteins comprising a targeting sequence, an exospore protein or an exospore protein fragment, and at least one plant growth simulating protein or peptide, characterized by the fact that the protein or plant growth simulating peptide comprises a hormonal peptide, a non-hormonal peptide, an enzyme involved in the production or activation of a plant growth stimulating compound. The targeting sequence, exospore protein or exospore protein fragment can be any of the targeting sequences, exospore proteins or exospore protein fragments described above in paragraph [005].

[0089] A presente invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [005].[0089] The present invention also relates to fusion proteins comprising a targeting sequence, exospore protein, or exospore protein fragment, and at least one protein or peptide that increases stress resistance in a plant. The targeting sequence, exospore protein or exospore protein fragment can be any of the targeting sequences, exospore proteins or exospore protein fragments described above in paragraph [005].

[0090] Adicionalmente, a presente invenção relaciona-se a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo de ligação em plantas. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [005].[0090] Additionally, the present invention relates to fusion proteins comprising a targeting sequence, exospore protein, or exospore protein fragment, and at least one binding protein or peptide in plants. The targeting sequence, exospore protein or exospore protein fragment can be any of the targeting sequences, exospore proteins or exospore protein fragments described above in paragraph [005].

[0091] A presente invenção relaciona-se também às proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [006].[0091] The present invention also relates to fusion proteins that comprise a targeting sequence, an exospore protein, or exospore protein fragment, and at least one protein or peptide that protects a plant against a pathogen. The targeting sequence, exospore protein or exospore protein fragment can be any of the targeting sequences, exospore proteins or exospore protein fragments described above in paragraph [006].

[0092] A presente invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou um fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno. A proteína ou peptídeo que protege a planta de um patógeno pode compreender uma harpina, uma a-elastina, uma ß-elastina, uma sistemina, uma fenilalanina amonia-liase, uma elicitina, uma defensina, uma criptogeina, uma proteína flagelina, uma bacteriocina, uma lisozima, um peptídeo de lisozima, uma sideróforo, um peptídeo ativo não ribossomal, uma conalbumina, uma albumina, uma lactoferrina, um peptídeo de lactoferrina, ou TasA. Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno possui atividade inseticida, atividade helminticida, suprime insetos ou predação por vermes, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a proteína que protege uma planta contra um patógeno compreende uma enzima. A sequência de direcionamento, proteína de exósporo ou fragmento de proteína de exósporo pode ser quaisquer das sequências de direcionamento, proteínas de exósporo ou fragmentos de proteínas de exósporo descritas cima no parágrafo [005].[0092] The present invention also relates to fusion proteins comprising a targeting sequence, an exospore protein, or a fragment of the exospore protein, and at least one protein or peptide that protects a plant against a pathogen. The protein or peptide that protects the plant from a pathogen may comprise a harpin, an a-elastin, a ß-elastin, a systemin, a phenylalanine ammonia-lyase, an elicitin, a defensin, a cryptogein, a flagellin protein, a bacteriocin , a lysozyme, a lysozyme peptide, a siderophore, a non-ribosomal active peptide, a conalbumin, an albumin, a lactoferrin, a lactoferrin peptide, or TasA. Alternatively, the protein or peptide that protects a plant against a pathogen has insecticidal activity, helminthicidal activity, suppresses insect or worm predation, or a combination thereof. Alternatively, the protein that protects a plant against a pathogen comprises an enzyme. The targeting sequence, exospore protein or exospore protein fragment can be any of the targeting sequences, exospore proteins or exospore protein fragments described above in paragraph [005].

[0093] A proteína de fusão pode ser feita usando clonagem padrão e métodos de biologia molecular conhecidos na técnica. Por exemplo, um gene que codifica uma proteína ou peptídeo (por ex., um gene que codifica uma proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas) pode ser amplificado por reação em cadeira de polimerase (PCR) e ligado ao DNA que codifica para qualquer uma das sequências de direcionamento descritas acima para formar uma molécula de DNA que codifica a proteína de fusão. A molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser clonada em qualquer vetor adequado, por exemplo, um vetor de plasmídeo. A adequabilidade do vetor compreende um sítio de clonagem múltipla no qual a molécula de DNA que codifica a proteína de fusão pode ser facilmente inserida. O vetor também contém de forma adequada um marcador selecionável, tal como um gene de resistência a antibióticos, tal como bactérias transformadas, transfectadas ou reproduzidas com o vetor podem ser prontamente identificadas e isoladas. Onde o vetor é um plasmídeo, a adequabilidade do plasmídeo também compreende uma origem de replicação. O DNA que codifica a proteína de fusão é adequada sob o controle de um promotor de esporulação que provocará a expressão da proteína de fusão ao exósporo de um endosporo de membro da família de B. cereus (por ex., um promotor de bclA nativo de um membro da família de B. cereus). Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado ao DNA cromossômico de um hospedeiro de um membro da família B. cereus.[0093] The fusion protein can be made using standard cloning and molecular biology methods known in the art. For example, a gene encoding a protein or peptide (e.g., a gene encoding a plant growth stimulating protein or peptide) can be amplified by polymerase chain reaction (PCR) and ligated to DNA encoding any of the targeting sequences described above to form a DNA molecule encoding the fusion protein. The DNA molecule encoding the fusion protein can be cloned into any suitable vector, for example, a plasmid vector. The suitability of the vector comprises a multiple cloning site into which the DNA molecule encoding the fusion protein can be easily inserted. The vector also suitably contains a selectable marker, such as an antibiotic resistance gene, so that bacteria transformed, transfected or reproduced with the vector can be readily identified and isolated. Where the vector is a plasmid, the suitability of the plasmid also comprises an origin of replication. The DNA encoding the fusion protein is under the control of a sporulation promoter that will cause expression of the fusion protein to the exospore of a B. cereus family member endospore (e.g., a native bclA promoter from a member of the B. cereus family). Alternatively, the DNA encoding the fusion protein can be integrated into the chromosomal DNA of a host from a member of the B. cereus family.

[0094] A proteína de fusão também pode compreender sequências de polipeptídeo adicional que não são parte da sequência de direcionamento, proteína de exósporo, fragmento de proteína de exósporo, ou proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege uma planta de um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação em plantas. Por exemplo, a proteína de fusão pode incluir marcadores para facilitar a purificação ou visualização da proteína de fusão (por ex., um marcador de polihistidina ou uma proteína fluorescente tal como GFP ou YFP) ou a visualização de esporos de membro da família de Bacillus cereus que expressam a proteína de fusão.[0094] The fusion protein may also comprise additional polypeptide sequences that are not part of the targeting sequence, exospore protein, exospore protein fragment, or plant growth stimulating protein or peptide, the protein or peptide that protects a plant from a pathogen, the protein or peptide that increases stress resistance in a plant, or the binding protein or peptide in plants. For example, the fusion protein may include tags to facilitate purification or visualization of the fusion protein (e.g., a polyhistidine tag or a fluorescent protein such as GFP or YFP) or visualization of Bacillus family member spores. cereus that express the fusion protein.

[0095] A expressão das proteínas de fusão no exósporo usando as sequências de direcionamento, proteínas de exósporo e fragmentos de proteínas de exósporo descritas neste documento é aumentada devido à falta de estrutura secundária no amino-terminal destas sequências, que permite o dobramento nativo das proteínas de fusão e retenção de atividade. O dobramento adequado pode ser ainda aumentado pela inclusão de um ligador de aminoácidos pequeno entre a sequência de direcionamento, proteína de exósporo, fragmento de proteína de exósporo e a proteína parceira de fusão.[0095] Expression of the fusion proteins in the exospore using the targeting sequences, exospore proteins and fragments of exospore proteins described herein is increased due to the lack of secondary structure at the amino terminus of these sequences, which allows native folding of the fusion proteins and retention of activity. Proper folding can be further enhanced by including a small amino acid linker between the targeting sequence, exospore protein, exospore protein fragment, and the fusion partner protein.

[0096] Sendo assim, quaisquer umas das proteínas de fusão descritas neste documento podem compreender um ligador de aminoácidos entre a sequência de direcionamento, a proteína de exósporo ou o fragmento de proteína de exósporo e a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege a planta contra um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação em plantas.[0096] Therefore, any of the fusion proteins described herein may comprise an amino acid linker between the targeting sequence, the exospore protein or exospore protein fragment and the plant growth stimulation protein or peptide, the protein or peptide that protects the plant against a pathogen, the protein or peptide that increases stress resistance in a plant, or the binding protein or peptide in plants.

[0097] O ligador pode compreender um ligador de polialanina ou um ligador de poliglicina.. Um ligador compreendendo uma mistura de resíduos de alanina e glicina pode também ser usado. Por exemplo, onde a sequência de direcionamento compreender SEQ ID NO: 1,uma proteína de fusão pode possuir uma das seguintes estruturas:[0097] The linker may comprise a polyalanine linker or a polyglycine linker. A linker comprising a mixture of alanine and glycine residues may also be used. For example, where the targeting sequence comprises SEQ ID NO: 1, a fusion protein may have one of the following structures:

[0098] Sem ligador: SEQ ID NO: 1 - Proteína Parceira de Fusão[0098] Without linker: SEQ ID NO: 1 - Fusion Partner Protein

[0099] Ligador de Alanina: SEQ ID NO: 1-An-Proteína Parceira de Fusão[0099] Alanine Linker: SEQ ID NO: 1-An-Protein Fusion Partner

[00100] Ligador de Glicina: SEQ ID NO: 1-Gn-Proteina Parceira de Fusão[00100] Glycine Linker: SEQ ID NO: 1-Gn-Protein Fusion Partner

[00101] Ligador Misto de Alanina e Glicina: SEQ ID NO: 1 - (A/G)n - Proteína Parceira de Fusão[00101] Mixed Alanine and Glycine Linker: SEQ ID NO: 1 - (A/G)n - Fusion Partner Protein

[00102] onde An, Gn, e (A/G)n são quaisquer números de alaninas, quaisquer números de glicinas, ou quaisquer números de uma mistura de alaninas e glicinas, respectivamente. Por exemplo, n pode ser 1 a 25, e é preferencialmente 6 a 10. Onde o ligador compreende uma mistura de resíduos de alanina e glicina, qualquer combinação de resíduos de glicina e alanina pode ser usada. Nas estruturas acima, "Proteína Parceira de Fusão"representa a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação em plantas.[00102] where An, Gn, and (A/G)n are any numbers of alanines, any numbers of glycines, or any numbers of a mixture of alanines and glycines, respectively. For example, n may be 1 to 25, and is preferably 6 to 10. Where the linker comprises a mixture of alanine and glycine residues, any combination of glycine and alanine residues may be used. In the structures above, "Fusion Partner Protein" represents the plant growth-stimulating protein or peptide, the protein or peptide that protects a plant against a pathogen, the protein or peptide that increases stress resistance in a plant, or the protein or binding peptide in plants.

[00103] Alternativamente ou em adição, o ligador pode compreender um sítio de reconhecimento de protease. A inclusão de um sítio de reconhecimento de protease permite a remoção direcionada, após exposição a uma protease que reconhece o sítio de reconhecimento de protease, da proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas, a proteína ou peptídeo que protege a planta contra um patógeno, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência ao estresse em uma planta ou a proteína ou peptídeo de ligação em plantas. Proteínas Ou Peptídeos De Estimulação De Crescimento Em Plantas[00103] Alternatively or in addition, the linker may comprise a protease recognition site. The inclusion of a protease recognition site allows for the targeted removal, upon exposure to a protease that recognizes the protease recognition site, of the plant growth stimulating protein or peptide, the protein or peptide that protects the plant against a pathogen , the protein or peptide that increases stress resistance in a plant, or the binding protein or peptide in plants. Plant Growth Stimulating Proteins or Peptides

[00104] Conforme observado acima, a presente invenção diz respeito às proteínas de fusão compreendendo uma sequência de direcionamento, uma proteína de exósporo ou um fragmento de proteína de exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo de simulação de crescimento de plantas, caracterizado pelo fato que a proteína ou peptídeo de simulação de crescimento de plantas compreende um peptídeo hormonal, um peptídeo não hormonal, um uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas.[00104] As noted above, the present invention relates to fusion proteins comprising a targeting sequence, an exospore protein or an exospore protein fragment, and at least one plant growth simulating protein or peptide, characterized by fact that the plant growth simulating protein or peptide comprises a hormonal peptide, a non-hormonal peptide, an enzyme involved in the production or activation of a plant growth stimulating compound.

[00105] Por exemplo, onde a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento em plantas compreender uma peptídeo hormonal, o peptídeo hormonal pode compreender uma fitosulfosina (por ex., fitosulfosina-a), clavata 3 (CLV3), sistemina, ZmlGF, ou um SCR/SP11.[00105] For example, where the plant growth stimulating protein or peptide comprises a hormonal peptide, the hormonal peptide may comprise a phytosulfosin (e.g., phytosulfosin-a), clavata 3 (CLV3), systemin, ZmlGF, or an SCR/SP11.

[00106] Onde a proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de plantas compreender um peptídeo não hormonal, o peptídeo não hormonal pode compreender uma RKN 16D10, Hg-Syv46, um peptídeo eNOD40, melittina, mastoparano, Mas7, RHPP, POLARIS, ou inibidor de kuniz tripsina (KTI).[00106] Where the plant growth stimulating protein or peptide comprises a non-hormonal peptide, the non-hormonal peptide may comprise an RKN 16D10, Hg-Syv46, an eNOD40 peptide, melittin, mastoparan, Mas7, RHPP, POLARIS, or inhibitor of kuniz trypsin (KTI).

[00107] A proteína ou peptídeo de estimulação de crescimento de planta compreende uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de planta. Uma enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas pode ser qualquer enzima que cataliza etapas em um caminho de síntese biológica para um composto que estimula o crescimento de plantas ou altera a estrutura de plantas, ou qualquer enzima que cataliza a conversão de um derivativo inativo ou menos ativo de um composto que estimula o crescimento de plantas ou altera a estrutura da planta para uma forma ativa ou mais ativa do composto.[00107] The plant growth stimulating protein or peptide comprises an enzyme involved in the production or activation of a plant growth stimulating compound. An enzyme involved in the production or activation of a plant growth stimulating compound may be any enzyme that catalyzes steps in a biological synthesis pathway for a compound that stimulates plant growth or alters plant structure, or any enzyme that catalyzes the conversion of an inactive or less active derivative of a compound that stimulates plant growth or alters plant structure to an active or more active form of the compound.

[00108] O composto de estimulação de crescimento de plantas pode compreender um composto produzido por bactérias ou fungos na rizosfera, por exemplo, 2,3-butanediol.[00108] The plant growth stimulating compound may comprise a compound produced by bacteria or fungi in the rhizosphere, for example, 2,3-butanediol.

[00109] Alternativamente, o composto de estimulação de crescimento em plantas pode compreender um hormônio de crescimento de plantas, por ex., uma citoquinina ou um derivativo de citoquinina, etileno, uma auxina ou um derivativo de auxina, uma ácido giberélico ou um derivativo de ácido giberélico, ácido abscísico ou um derivativo de ácido abcísico, ou um áicdo jasmônico ou um derivativo de ácido jasmônico.[00109] Alternatively, the plant growth stimulating compound may comprise a plant growth hormone, e.g., a cytokinin or a cytokinin derivative, ethylene, an auxin or an auxin derivative, a gibberellic acid or a derivative of gibberellic acid, abscisic acid or an abscisic acid derivative, or a jasmonic acid or a jasmonic acid derivative.

[00110] Onde o composto de estimulação de crescimento em plantas compreender uma citoquinina ou derivativo de citoquinina, a citoquinina ou derivativo de citoquinina pode compreender cinetina, cis- zeatina, trans-zeatina, 6-benzilaminopurina, dihidroxizeatina, N6-(D2- isopentenil) adenina, ribosilzeatina, N6-(D2-isopentenil) adenosina, 2- metiltio-cis-ribosilzeatina, cis-ribosilzeatina, trans-ribosilzeatina, 2- metiltio-trans-ribosilzeatina, ribosilzeatina-5-monosfosfato, N6- metilaminopurina, N6-dimetilaminopurine, 2’-deoxyzeatina ribosídeo, 4- hidroxi-3-metil-trans-2-butenilaminopurina, orto-topolina, meta-topolina, benzyladenina, orto-metiltopolina, meta-metiltopolina, ou uma combinaçao dos mesmos.[00110] Where the plant growth stimulating compound comprises a cytokinin or cytokinin derivative, the cytokinin or cytokinin derivative may comprise kinetin, cis-zeatin, trans-zeatin, 6-benzylaminopurine, dihydroxyzeatin, N6-(D2- isopentenyl ) adenine, ribosylzeatin, N6-(D2-isopentenyl) adenosine, 2- methylthio-cis-ribosylzeatin, cis-ribosylzeatin, trans-ribosylzeatin, 2- methylthio-trans-ribosylzeatin, ribosylzeatin-5-monosphosphate, N6- methylaminopurine, N6- dimethylaminopurine, 2'-deoxyzeatin riboside, 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine, ortho-topoline, meta-topoline, benzyladenine, ortho-methyltopoline, meta-methyltopoline, or a combination thereof.

[00111] Onde o composto de estimulação de crescimento em plantas compreender uma auxina ou um derivativo de auxina, a auxina ou derivativo de auxina podem compreender uma auxina ativa, uma auxina inativa, uma auxina conjugada, uma auxina de ocorrência natural ou uma auxina sintética ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a auxina ou derivativo de auxina podem compreender indole-3-ácido acétivo, indole-3-ácido pírúvico, indole-3-acetaldoxima, indole-3- acetamida, indole-3-acetonitrila, indole-3-etanol, indole-3-iyruvato, indole-3-acetaldoxima, indole-3-ácido butírico, um acido fenilacético, 4- cloroindole-3-ácido acético, uma auxina conjugada a glicose, ou uma combinação dos mesmos.[00111] Where the plant growth stimulating compound comprises an auxin or an auxin derivative, the auxin or auxin derivative may comprise an active auxin, an inactive auxin, a conjugated auxin, a naturally occurring auxin or a synthetic auxin. or a combination thereof. For example, auxin or auxin derivative may comprise indole-3-acetic acid, indole-3-pyruvic acid, indole-3-acetaldoxime, indole-3-acetamide, indole-3-acetonitrile, indole-3-ethanol, indole -3-yruvate, indole-3-acetaldoxime, indole-3-butyric acid, a phenylacetic acid, 4-chloroindole-3-acetic acid, an auxin conjugated to glucose, or a combination thereof.

[00112] A enzima envolvida na produção ou ativação de um composto de estimulação de crescimento de plantas pode compreender uma redutase acetoína, uma hidrolase indol-3-acetamida, um monooxigenase de triptofano, uma sintetase de acetolactato, uma descarboxilase acetolactato-a, uma piruvato descarboxilase, uma redutase de diacetilo, uma desidrogenase butanodiol, um aminotransferase (por exemplo, aminotransferase triptofano), um descarboxilase de triptofano, uma oxidase de amina, um descarboxilase indol-3-piruvato, uma desidrogenase indol-3-acetaldeído, uma oxidase de cadeia lateral de triptofano, uma hidrolase de nitrilo, uma nitrilase, uma peptidase, uma protease, uma isopentenyltransferase fosfato de adenosina, uma fosfatase, uma cinase de adenosina, um fosforribosiltransferase de adenina, CYP735A, uma fosfo 5'ribonucleotide, um nucleosidase adenosina, uma isomerase de cistrans zeatina, zeatina um O-glicosiltransferase, um ß- glucosidase, uma hidroxilase-cis, cis um CK-hidroxilase, uma CK N-glicosiltransferase, um fosfo 2,5-ribonucleótido, um nucleosidase adenosina, um nucleósido de purina fosforilase, um redutase zeatina, uma redutase de hidroxilamina, um 2-oxoglutarato dioxigenase, um giberélico 2B / 3B hidrolase, uma giberelina 3-oxidase, uma giberelina 20-oxidase, uma chitosinase, quitinase, um ß-1,3-glucanase, um ß-1,4-glucanase, um ß-1,6- glucanase, uma desaminase de ácido aminociclopropano-1-carboxílico, ou uma enzima envolvida na produção de um fator nod (por exemplo, Noda, nodB, ou nodi).[00112] The enzyme involved in the production or activation of a plant growth stimulating compound may comprise an acetoin reductase, an indole-3-acetamide hydrolase, a tryptophan monooxygenase, an acetolactate synthetase, an acetolactate-a decarboxylase, an pyruvate decarboxylase, a diacetyl reductase, a butanediol dehydrogenase, an aminotransferase (e.g., tryptophan aminotransferase), a tryptophan decarboxylase, an amine oxidase, an indole-3-pyruvate decarboxylase, an indole-3-acetaldehyde dehydrogenase, an oxidase tryptophan side chain, a nitrile hydrolase, a nitrilase, a peptidase, a protease, an adenosine phosphate isopentenyltransferase, a phosphatase, an adenosine kinase, an adenine phosphoribosyltransferase, CYP735A, a phospho 5'ribonucleotide, an adenosine nucleosidase , a cistrans zeatin isomerase, a zeatin an O-glycosyltransferase, a ß-glucosidase, a cis-hydroxylase, a cis-a CK-hydroxylase, a CK N-glycosyltransferase, a phospho 2,5-ribonucleotide, an adenosine nucleosidase, a purine phosphorylase, a zeatin reductase, a hydroxylamine reductase, a 2-oxoglutarate dioxygenase, a gibberellin 2B/3B hydrolase, a gibberellin 3-oxidase, a gibberellin 20-oxidase, a chitosinase, chitinase, a ß-1,3-glucanase , a ß-1,4-glucanase, a ß-1,6-glucanase, an aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase, or an enzyme involved in the production of a nod factor (e.g., Noda, nodB, or nodi) .

[00113] Onde a enzima compreender uma protease ou peptidase, a protease ou peptidase pode ser uma protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, pró-proteínas ou pré-proteínas para criar um peptídeo ativo. O peptídeo bioativo pode ser qualquer peptídeo que exerce uma atividade biológica.[00113] Where the enzyme comprises a protease or peptidase, the protease or peptidase may be a protease or peptidase that cleaves proteins, peptides, proproteins or preproteins to create an active peptide. The bioactive peptide can be any peptide that exerts a biological activity.

[00114] Exemplos de peptídeos bioativos incluem RKN 16D10 e RHPP.[00114] Examples of bioactive peptides include RKN 16D10 and RHPP.

[00115] A protease ou peptidase que cliva proteínas, peptídeos, pró-proteínas o pré-proteínas para criar um péptido bioativo pode compreender subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, termolisina , papaina, pepsina, tripsina, a pronase, a carboxilase, uma serina protease, uma protease glutâmico, uma protease de aspartato, uma protease de cisteína, treonina uma protease, ou uma metaloprotease.[00115] The protease or peptidase that cleaves proteins, peptides, proproteins or preproteins to create a bioactive peptide may comprise subtilisin, an acidic protease, an alkaline protease, a proteinase, an endopeptidase, an exopeptidase, thermolysin, papain, pepsin, trypsin, pronase, carboxylase, a serine protease, a glutamic protease, an aspartate protease, a cysteine protease, a threonine protease, or a metalloprotease.

[00116] A protease ou peptidase pode clivar proteínas em um meio rico em proteínas (por ex., meio de soja ou extrato de levedura).[00116] The protease or peptidase can cleave proteins in a protein-rich medium (e.g., soybean medium or yeast extract).

Proteins Or Peptides That Protect Plants Against Pathogens

[00117] A presente invenção relaciona-se às proteínas de fusão que compreendem uma sequência de direcionamento, uma proteína do exósporo, ou fragmento da proteína do exósporo, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno.[00117] The present invention relates to fusion proteins that comprise a targeting sequence, an exospore protein, or exospore protein fragment, and at least one protein or peptide that protects a plant against a pathogen.

[00118] A proteína ou peptídeo que protege a planta contra um patógeno pode compreender uma proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imune da planta. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que estimula uma resposta imune de planta pode compreender uma proteína ou peptídeo potencializador de sistema imune de plantas. A proteína ou peptídeo potencializador de sistema imune de planta pode ser qualquer proteína ou peptídeo que possui um efeito benéfico no sistema imune de uma planta. Proteínas ou peptídeos potencializadoras de sistema imune de plantas incluem harpinas, a-elastinas, ß-elastinas, sisteminas, fenilalanina, amonia-liase, elicitinas, defensinas, criptogeínas, proteínas flagelinas e peptídeos flagelinos (por ex., fl22).[00118] The protein or peptide that protects the plant against a pathogen can comprise a protein or peptide that stimulates an immune response from the plant. For example, the protein or peptide that stimulates a plant immune response may comprise a plant immune system enhancing protein or peptide. A plant immune system-enhancing protein or peptide can be any protein or peptide that has a beneficial effect on a plant's immune system. Plant immune-enhancing proteins or peptides include harpins, α-elastins, β-elastins, systemins, phenylalanine, ammonia lyase, elicitins, defensins, cryptogeins, flagellin proteins, and flagellin peptides (e.g., fl22).

[00119] Alternativamente, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra uma patógeno pode ser uma proteína ou peptídeo que possui atividade antibacteriana, atividade antifúngica ou tanto atividade antibacteriana como antifúngica. Exemplos de tais proteínas e peptideos incluem bacteriocinas, lisozimas, peptideos de lisozima (por exemplo, LysM), sideróforos, péptidos ativos não-ribossomais, conalbumins, albuminas, lactoferrinas lactoferrina, peptídeos (por exemplo, LfcinB ), e tasa.[00119] Alternatively, the protein or peptide that protects a plant against a pathogen may be a protein or peptide that has antibacterial activity, antifungal activity or both antibacterial and antifungal activity. Examples of such proteins and peptides include bacteriocins, lysozymes, lysozyme peptides (e.g., LysM), siderophores, non-ribosomal active peptides, conalbumins, albumins, lactoferrins, lactoferrin peptides (e.g., LfcinB), and tasa.

[00120] A proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno pode possuir uma proteína ou peptídeo que possui atividade inseticida, atividade helminticida, suprime insetos ou predação por vermes, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno pode compreender uma toxina bacteriana inseticida (por ex., uma proteína inseticida VIP), uma endotoxina, um Toxina Cry (por ex., toxina Cry de Bacillus thuringiensis), uma proteína ou peptídeo inibidor de protease (por ex., um inibidor de tripsina ou uma inibidor de protease arrowhead), uma protease de cisteína ou quitinase. Onde a toxina Cry for uma toxina Cry de Bacillus thuringiensis, a toxina cry pode ser uma proteína Cry5B ou uma proteína Cry21A. Cry5B e Cry21A podem ter anto atividade inseticida como nematicida.[00120] The protein or peptide that protects a plant against a pathogen may have a protein or peptide that has insecticidal activity, helminthicidal activity, suppresses insect or worm predation, or a combination thereof. For example, the protein or peptide that protects a plant against a pathogen may comprise an insecticidal bacterial toxin (e.g., a VIP insecticidal protein), an endotoxin, a Cry toxin (e.g., Bacillus thuringiensis Cry toxin), a protease inhibitor protein or peptide (e.g., a trypsin inhibitor or an arrowhead protease inhibitor), a cysteine protease, or chitinase. Where the Cry toxin is a Bacillus thuringiensis Cry toxin, the cry toxin may be a Cry5B protein or a Cry21A protein. Cry5B and Cry21A may have both insecticidal and nematicidal activity.

[00121] Aproteína que protege uma planta contra um patógeno pode compreendee uma enzima. Enzima adequadas incluem protease e lactonases. As proteases e lactonases podem ser específicas para uma molécula de sinalização bacteriana (por ex., uma molécula de sinalização de homoserina de lactona bacteriana).[00121] The protein that protects a plant against a pathogen may comprise an enzyme. Suitable enzymes include proteases and lactonases. Proteases and lactonases can be specific to a bacterial signaling molecule (e.g., a bacterial lactone homoserine signaling molecule).

[00122] Onde a enzima for uma lactonase, a lactonase pode compreender 1,4 - lactonase , lactonase 2 - pirona -4,6 -dicarboxilato de dimetilo , 3 - enol - lactonase oxoadipate , actinomicina lactonase , deoxylimonate anel-A - lactonase , gluconolactonase L- rhamnono - 1,4 - lactonase , limonina - anel-D - lactonase , esteróide - lactonase , triacetato - lactonase , ou xylono - 1,4 - lactonase.[00122] Where the enzyme is a lactonase, the lactonase may comprise 1,4-lactonase, lactonase 2-pyrone-4,6-dimethyl dicarboxylate, 3-enol-lactonase oxoadipate, actinomycin lactonase, deoxylimonate ring-A-lactonase, gluconolactonase L-rhamnono-1,4-lactonase, limonin-D-ring-lactonase, steroid-lactonase, triacetate-lactonase, or xylono-1,4-lactonase.

[00123] A enzima também pode ser uma enzima que é específica para um componente celular de uma bactéria ou fungo. Por exemplo , a enzima pode compreender uma ß - 1,3 - glucanase , um ß - 1,4 - glucanase , um ß -1,6 - glucanase , um chitosinase , quitinase , uma enzima chitosinase -like , um liticase , uma peptidase , uma proteinase, uma protease ( por exemplo , uma protease alcalina , uma protease ácida , neutra ou uma protease ) , uma mutanolisina , um stapholysin , ou uma lisozima.[00123] The enzyme can also be an enzyme that is specific to a cellular component of a bacteria or fungus. For example, the enzyme may comprise a ß-1,3-glucanase, a ß-1,4-glucanase, a ß-1,6-glucanase, a chitosinase, chitinase, a chitosinase-like enzyme, a lyticase, a peptidase , a proteinase, a protease (e.g., an alkaline protease, an acidic protease, or a neutral protease), a mutanolysin, a stapholysin, or a lysozyme.

[00124] Para quaisquer das proteínas de fusão supracitadas compreendendo uma proteína ou peptídeo que protege uma planta contra um patógeno, o patógeno pode ser um patógeno bacteriano ou fúnggico. Por exemplo , o patógeno pode compreender uma proteobactéria classe a, um proteobactéria - classe ß , uma proteobactéria classe Y, ou uma combinação dos mesmos . Em especial, patógenos bacterianos incluem Agrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris, e combinações dos mesmos.[00124] For any of the aforementioned fusion proteins comprising a protein or peptide that protects a plant against a pathogen, the pathogen may be a bacterial or fungal pathogen. For example, the pathogen may comprise a class A proteobacteria, a class ß proteobacteria, a class Y proteobacteria, or a combination thereof. In particular, bacterial pathogens include Agrobacterium tumefaciens, Pantoea stewartii, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Pseudomonas aeruginosa, Xanthomonas campestris, and combinations thereof.

[00125] Outros patógenos bacterianos e fúngicos incluem Acarosporina microspora, Aceria guerreronis, Achlya conspicua, Achlya klebsiana, Achlysiella williamsi, Acholeplasmataceae, Acidovorax avenae, Acremonium strictum, Acrocalymma medicaginis, Acrodontium simplex, Acrophialophora fusispora, Acrosporium tingitaninum, Aecidium, Aecidium aechmantherae, Aecidium amaryllidis, Aecidium breyniae, Aecidium campanulastri, Aecidium cannabis, Aecidium cantensis, Aecidium caspicum, Aecidium foeniculi, Agrobacterium tumefaciens, Albonectria rigidiuscula, Albugo bliti, Albugo candida, Albugo ipomoeae-panduratae, Albugo laibachii, Albugo occidentalis, Albugo tragopogonis, Alternaria, Alternaria alternata, Alternaria brassicae, Alternaria brassicicola, Alternaria carthami, Alternaria cinerariae, Alternaria citri, Alternaria dauci, Alternaria dianthi, Alternaria dianthicola, Alternaria euphorbiicola, Alternaria helianthi, Alternaria helianthicola, Alternaria japonica, Alternaria leucanthemi, Alternaria limicola, Alternaria linicola, Alternaria mali, Alternaria padwickii, Alternaria panax, Alternaria radicina, Alternaria raphani, Alternaria saponariae, Alternaria senecionis, Alternaria solani, Alternaria tenuissima, Alternaria triticina, Alternaria zinniae, Amazonia, Amphobotrys ricini, Anguillosporella vermiformis, Anguina (genus), Anguina agrostis, Anguina amsinckiae, Anguina australis, Anguina balsamophila, Anguina funesta, Anguina graminis, Anguina spermophaga, Anguina tritici, Anisogramma anomala, Anthostomella pullulans, Antrodia albida, Antrodia serialiformis, Antrodia serialis, Aphanomyces cladogamus, Aphanomyces cochlioides, Aphanomyces euteiches, Aphanomyces euteiches f.sp. pisi, Aphanomyces raphani, Aphelenchoides, Aphelenchoides arachidis, Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides parietinus, Aphelenchoides ritzemabosi, Aphelenchus avenae, Apiognomonia errabunda, Apiognomonia veneta, Apiospora montagnei, Appendiculella, Armillaria, Armillaria affinis, Armillaria apalosclera, Armillaria camerunensis, Armillaria duplicate, Armillaria fellea, Armillaria fumosa, Armillaria fuscipes, Armillaria griseomellea, Armillaria heimii, Armillaria mellea, Armillaria melleorubens, Armillaria montagnei, Armillaria omnituens, Armillaria pallidula, Armillaria paulensis, Armillaria pelliculata, Armillaria procera, Armillaria puiggarii, Armillaria singular, Armillaria socialis, Armillaria solidipes, Armillaria tabescens, Armillaria tigrensis, Armillaria umbrinobrunnea, Armillaria viridiflava, Armillaria yungensis, Arthrocladiella, Arthuriomyces peckianus, Ascochyta asparagine, Ascochyta bohemica, Ascochyta caricae, Ascochyta doronici, Ascochyta fabae f.sp. lentis, Ascochyta graminea, Ascochyta hordei, Ascochyta humuli, Ascochyta pisi, Ascochyta prasadii, Ascochyta sorghi, Ascochyta spinaciae, Ascochyta tarda, Ascochyta tritici, Ascospora ruborum, Ashbya gossypii, Aspergillus aculeatus, Aspergillus fischerianus, Aspergillus niger, Asperisporium caricae, Asperisporium minutulum, Asteridiella, Asteridiella perseae, Asteroma caryae, Asteroma coryli, Asteroma inconspicuum, Athelia arachnoidea, Athelia rolfsii, Aurantiporus fissilis, Belonolaimus, Belonolaimus gracilis, Belonolaimus longicaudatus, Beniowskia sphaeroidea, Bionectria ochroleuca, Bipolaris, Bipolaris cactivora, Bipolaris cookie, Bipolaris incurvata, Bipolaris sacchari, Biscogniauxia capnodes var. capnodes, Biscogniauxia marginata, Biscogniauxia nummularia, Bjerkandera adusta, Blakeslea trispora, Blumeria graminis, Botryodiplodia oncidii, Botryodiplodia ulmicola, Botryosphaeria cocogena, Botryosphaeria corticola, Botryosphaeria disrupta, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria marconii, Botryosphaeria obtuse, Botryosphaeria quercuum, Botryosphaeria rhodina, Botryosphaeria ribis, Botryosphaeria stevensii, Botryosporium pulchrum, Botryotinia, Botryotinia fuckeliana, Botrytis anthophila, Botrytis cinerea, Botrytis fabae, Bremia lactucae, Brenneria salicis, Briosia ampelophaga, Bulbomicrosphaera, Burkholderia andropogonis, Burkholderia caryophylli, Burkholderia glumae, Cadophora malorum, Caespitotheca, Calonectria indusiata, Calonectria kyotensis, Calonectria quinqueseptata, Calvatia versispora, Camarosporium pistaciae, Camarotella acrocomiae, Camarotella costaricensis, Candidatus Liberibacter, Capitorostrum cocoes, Capnodium footii, Capnodium mangiferum, Capnodium ramosum, Capnodium theae, Caulimoviridae, Cephaleuros virescens, Cephalosporium gramineum, Ceratobasidium cereal, Ceratobasidium cornigerum, Ceratobasidium noxium, Ceratobasidium ramicola, Ceratobasidium setariae, Ceratobasidium stevensii, Ceratocystis adiposa, Ceratocystis coerulescens, Ceratocystis fimbriata, Ceratocystis moniliformis, Ceratocystis paradoxa, Ceratocystis pilifera, Ceratocystis pluriannulata, Ceratorhiza hydrophila, Ceratospermopsis, Cercoseptoria ocellata, Cercospora, Cercospora angreci, Cercospora apii, Cercospora apii f.sp. clerodendri, Cercospora apiicola, Cercospora arachidicola, Cercospora asparagi, Cercospora atrofiliformis, Cercospora beticola, Cercospora brachypus, Cercospora brassicicola, Cercospora brunkii, Cercospora cannabis, Cercospora cantuariensis, Cercospora capsici, Cercospora carotae, Cercospora corylina, Cercospora fragariae, Cercospora fuchsiae, Cercospora fusca, Cercospora fusimaculans, Cercospora gerberae, Cercospora halstedii, Cercospora handelii, Cercospora hayi, Cercospora hydrangea, Cercospora kikuchii, Cercospora lentis, Cercospora liquidambaris, Cercospora longipes, Cercospora longissima, Cercospora mamaonis, Cercospora mangiferae, Cercospora medicaginis, Cercospora melongenae, Cercospora minima, Cercospora minuta, Cercospora nicotianae, Cercospora odontoglossi, Cercospora papaya, Cercospora penniseti, Cercospora pisa-sativae, Cercospora platanicola, Cercospora puderii, Cercospora pulcherrima, Cercospora rhapidicola, Cercospora rosicola, Cercospora rubrotincta, Cercospora sojina, Cercospora solani, Cercospora solani-tuberosi, Cercospora sorghi, Cercospora theae, Cercospora tuberculans, Cercospora vexans, Cercospora vicosae, Cercospora zeae-maydis, Cercospora zebrina, Cercospora zonata, Cercosporella rubi, Cereal cyst nematode, Ceriporia spissa, Ceriporia xylostromatoides, Cerrena unicolor, Ceuthospora lauri, Choanephora, Choanephora cucurbitarum, Choanephora infundibulifera, Chondrostereum purpureum, Chrysomyxa ledi var. rhododendri, Chrysomyxa ledicola, Chrysomyxa piperiana, Chrysomyxa roanensis, Cladosporium, Cladosporium arthropodii, Cladosporium caryigenum, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium cladosporioides f.sp. pisicola, Cladosporium cucumerinum, Cladosporium herbarum, Cladosporium musae, Cladosporium oncobae, Clavibacter michiganensis, Claviceps fusiformis, Claviceps purpurea, Claviceps sorghi, Claviceps zizaniae, Climacodon pulcherrimus, Climacodon septentrionalis, Clitocybe parasitica, Clonostachys rosea f. rosea, Clypeoporthe iliau, Cochliobolus, Cochliobolus carbonum, Cochliobolus cymbopogonis, Cochliobolus hawaiiensis, Cochliobolus heterostrophus, Cochliobolus lunatus, Cochliobolus miyabeanus, Cochliobolus ravenelii, Cochliobolus sativus, Cochliobolus setariae, Cochliobolus spicifer, Cochliobolus stenospilus, Cochliobolus tuberculatus, Cochliobolus victoriae, Coleosporium helianthi, Coleosporium ipomoeae, Coleosporium madiae, Coleosporium pacificum, Coleosporium tussilaginis, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum arachidis, Colletotrichum capsici, Colletotrichum cereale, Colletotrichum crassipes, Colletotrichum dematium, Colletotrichum dematium f. spinaciae, Colletotrichum derridis, Colletotrichum destructivum, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum gossypii, Colletotrichum higginsianum, Colletotrichum kahawae, Colletotrichum lindemuthianum, Colletotrichum lini, Colletotrichum mangenotii, Colletotrichum musae, Colletotrichum nigrum, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum pisi, Colletotrichum sublineolum, Colletotrichum trichellum, Colletotrichum trifolii, Colletotrichum truncatum, Coniella castaneicola, Coniella diplodiella, Coniella fragariae, Coniothecium chomatosporum, Coniothyrium celtidis-australis, Coniothyrium henriquesii, Coniothyrium rosarum, Coniothyrium wernsdorffiae, Coprinopsis psychromorbida, Cordana johnstonii, Cordana musae, Coriolopsis floccose, Coriolopsis gallica, Corticium invisum, Corticium penicillatum, Corticium theae, Coryneopsis rubi, Corynespora cassiicola, Coryneum rhododendri, Crinipellis sarmentosa, Cronartium ribicola, Cryphonectriaceae, Cryptocline cyclaminis, Cryptomeliola, Cryptoporus volvatus, Cryptosporella umbrina, Cryptosporiopsis tarraconensis, Cryptosporium minimum, Curvularia caricae-papayae, Curvularia penniseti, Curvularia senegalensis, Curvularia trifolii, Cylindrocarpon candidum, Cylindrocarpon ianthothele var. ianthothele, Cylindrocarpon magnusianum, Cylindrocarpon musae, Cylindrocladiella camelliae, Cylindrocladiella parva, Cylindrocladium clavatum, Cylindrocladium lanceolatum, Cylindrocladium peruvianum, Cylindrocladium pteridis, Cylindrosporium cannabinum, Cylindrosporium juglandis, Cylindrosporium rubi, Cymadothea trifolii, Cytospora, Cytospora palmarum, Cytospora personata, Cytospora platani, Cytospora sacchari, Cytospora sacculus, Cytospora terebinthi, Cytosporina ludibunda, Dactuliophora elongata, Daedaleopsis confragosa, Dasineura urticae, Datronia scutellata, Davidiella carinthiaca, Davidiella dianthi, Davidiella tassiana, Deightoniella papuana, Deightoniella torulosa, Dendrophoma marconii, Dendrophora erumpens, Denticularia mangiferae, Dermea pseudotsugae, Diaporthaceae, Diaporthe, Diaporthe arctii, Diaporthe citri, Diaporthe dulcamarae, Diaporthe eres, Diaporthe helianthi, Diaporthe lagunensis, Diaporthe lokoyae, Diaporthe melonis, Diaporthe orthoceras, Diaporthe perniciosa, Diaporthe phaseolorum, Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Diaporthe phaseolorum var. phaseolorum, Diaporthe phaseolorum var. sementes de sojae, Diaporthe rudis, Diaporthe tanakae, Diaporthe toxica, Dibotryon morbosum, Dicarpella dryina, Didymella bryoniae, Didymella fabae, Didymella lycopersici, Didymosphaeria arachidicola, Didymosphaeria taiwanensis, Dilophospora alopecuri, Dimeriella sacchari, Diplocarpon earlianum, Diplocarpon mali, Diplocarpon mespili, Diplocarpon rosae, Diplodia laelio-cattleyae, Diplodia manihoti, Diplodia paraphysaria, Diplodia theae-sinensis, Discosia artocreas, Guignardia fulvida, Discostroma corticola, Distocercospora, Distocercospora livistonae, Ditylenchus, Ditylenchus africanus, Ditylenchus angustus, Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci, Dolichodorus heterocephalus, Dothideomycetes, Dothiorella aromatic, Dothiorella dominicana, Dothiorella gregaria, Dothiorella ulmi, Drechslera avenacea, Drechslera campanulata, Drechslera dematioidea, Drechslera gigantea, Drechslera glycines, Drechslera musae-sapientium, Drechslera teres f. maculate, Drechslera wirreganensis, Durandiella pseudotsugae, Eballistra lineata, Eballistra oryzae, Eballistraceae, Echinodontium tinctorium, Ectendomeliola, Elsinoê ampelina, Elsinoê australis, Elsinoê batatas, Elsinoê brasiliensis, Elsinoê fawcettii, Elsinoê leucospila, Elsinoê mangiferae, Elsinoê piri, Elsinoê randii, Elsinoê rosarum, Elsinoê sacchari, Elsinoê theae, Elsinoê veneta, Endomeliola, Endothia radicalis, Endothiella gyrosa, Entoleuca mammata, Entorrhizomycetes, Entyloma ageratinae, Entyloma dahlia, Entyloma ellisii, Epicoccum nigrum, Ergot, Erwinia, Erwinia chrysanthemi, Erwinia psidii, Erysiphaceae, Erysiphales, Erysiphe, Erysiphe alphitoides, Erysiphe betae, Erysiphe brunneopunctata, Erysiphe cichoracearum, Erysiphe cruciferarum, Erysiphe flexuosa, Erysiphe graminis f. sp. avenae, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Erysiphe heraclei, Erysiphe pisi, Eutypella parasitica, Eutypella scoparia, Exobasidium burtii, Exobasidium reticulatum, Exobasidium vaccinii var. japonicum, Exobasidium vaccinii-uliginosi, Exobasidium vexans, Exophiala,Flavescence dorée, Fomes fasciatus, Fomes lamaênsis, Fomes meliae, Fomitopsis cajanderi, Fomitopsis palustris, Fomitopsis rosea, Fomitopsis spraguei, Fomitopsis supina, Forma specialis, Frommeella tormentillae, Fusarium, Fusarium affine, Fusarium arthrosporioides, Fusarium circinatum, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium incarnatum, Fusarium solani, Fusarium merismoides, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. batatas, Fusarium oxysporum f.sp. betae, Fusarium oxysporum f.sp. cannabis, Fusarium oxysporum f.sp. citri, Fusarium oxysporum f.sp. coffea, Fusarium oxysporum f.sp. cubense, Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis, Fusarium oxysporum f.sp. dianthi, Fusarium oxysporum f.sp. lentis, Fusarium oxysporum f.sp. lini, Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, Fusarium oxysporum f.sp. medicaginis, Fusarium oxysporum f.sp. pisi, Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, Fusarium pallidoroseum, Fusarium proliferatum, Fusarium redolens, Fusarium sacchari, Fusarium solani f.sp. pisi, Fusarium sporotrichioides, Fusarium subglutinans, Fusarium sulphureum, Fuscoporia torulosa, Fusicladium pisicola, Fusicoccum aesculi, Fusicoccum amygdali, Gaeumannomyces graminis var tritici, Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis, Galactomyces candidum, Ganoderma brownii, Ganoderma lobatum, Ganoderma orbiforme, Ganoderma philippii, Ganoderma tornatum, Ganoderma zonatum, Geastrumia polystigmatis, Georgefischeriaceae, Georgefischeriales, Geosmithia morbida, Geotrichum, Geotrichum candidum, Geotrichum candidum var. citri- aurantii, Geotrichum klebahnii, Gibberella, Gibberella acuminata, Gibberella avenacea, Gibberella baccata, Gibberella cyanogena, Gibberella fujikuroi, Gibberella fujikuroi var. subglutinans, Gibberella intricans, Gibberella pulicaris, Gibberella stilboides, Gibberella xylarioides, Gibberella zeae, Gibellina cerealis, Gilbertella persicaria, Gjaerumiaceae, Gliocladium vermoeseni, Globodera pallida, Globodera rostochiensis, Globodera tabacum, Gloeocercospora sorghi, Gloeocystidiellum porosum, Gloeophyllum mexicanum, Gloeophyllum trabeum, Gloeoporus dichrous, Gloeosporium cattleyae, Gloeosporium theae-sinensis, Glomerella cingulate, Glomerella glycines, Glomerella graminicola, Glomerella tucumanensis, Gnomonia caryae, Gnomonia comari, Gnomonia dispora, Gnomonia iliau, Gnomonia leptostyla, Gnomonia nerviseda, Gnomonia rubi, Golovinomyces cichoracearum var. latisporus, Granulobasidium vellereum, Graphiola phoenicis, Graphium rigidum, Graphium rubrum, Graphyllium pentamerum, Grovesinia pyramidalis, Guignardia bidwellii f. muscadinii, Guignardia camelliae, Guignardia citricarpa, Guignardia mangiferae, Guignardia musae, Guignardia philoprina, Gummosis, Gymnoconia nitens, Gymnopus dryophilus, Gymnosporangium clavipes, Gymnosporangium sabinae, Gymnosporangium globosum, Gymnosporangium juniperi- virginianae, Gymnosporangium kernianum, Gymnosporangium nelsonii, Gymnosporangium yamadae, Haematonectria haematococca, Hansenula subpelliculosa, Hapalosphaeria deformans, Haplobasidion musae, Haustorium, Helicobasidium compactum, Helicobasidium longisporum, Helicobasidium purpureum, Helicoma muelleri, Helicotylenchus, Helicotylenchus dihystera, Helicotylenchus multicinctus, Helminthosporium cookei, Helminthosporium papulosum, Helminthosporium solani, Helotiales, Hemicriconemoides kanayaensis, Hemicriconemoides mangiferae, Hemicycliophora arenaria, Hemlock woolly adelgid, Hendersonia creberrima, Hendersonia theicola, Hericium coralloides, Heterobasidion annosum, Heterodera, Heterodera amygdali, Heterodera arenaria, Heterodera aucklandica, Heterodera avenae, Heterodera bergeniae, Heterodera bifenestra, Heterodera cacti, Heterodera cajani, Heterodera canadensis, Heterodera cardiolata, Heterodera carotae, Heterodera ciceri, Heterodera cruciferae, Heterodera delvii, Heterodera elachista, Heterodera filipjevi, Heterodera gambiensis, Heterodera goettingiana, Heterodera hordecalis, Heterodera humuli, Heterodera latipons, Heterodera medicaginis, Heterodera oryzae, Heterodera oryzicola, Heterodera rosii, Heterodera sacchari, Heterodera schachtii, Heterodera tabacum, Heterodera trifolii, Heteroderidae, Hexagonia hydnoides, Hirschmanniella oryzae, Hoplalaimus galeatus, Hoplolaimidae, Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus indicus, Hoplolaimus magnistylus, Hoplolaimus pararobustus, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus uniformis, Huanglongbing, Hyaloperonospora, Hyaloperonospora arabidopsidis, Hyaloperonospora brassicae, Hyaloperonospora parasitica, Hymenula affinis, Hyphodermella corrugata, Hyphodontia aspera, Hyphodontia sambuci, Hypochnus, Hypoxylon tinctor, Idriella lunata, Inonotus arizonicus, Inonotus cuticularis, Inonotus dryophilus, Inonotus hispidus, Inonotus ludovicianus, Inonotus munzii, Inonotus tamaricis, Irenopsis, Irpex destruens, Irpex lacteus, Isariopsis clavispora, Johncouchia mangiferae, Kabatiella caulivora, Kabatiella lini, Karnal bunt, Khuskia oryzae, Kretzschmaria deusta, Kretzschmaria zonata, Kuehneola uredinis, Kutilakesa pironii, Labrella coryli, Laeticorticium roseum, Laetiporus baudonii, Lagenocystis radicicola, Laricifomes officinalis, Lasiodiplodia theobromae, Leandria momordicae, Leifsonia xyli xyli, Lentinus tigrinus, Lenzites betulina, Lenzites elegans, Lepteutypa cupressi, Leptodontidium elatius var. elatius, Leptographium microsporum, Leptosphaeria acuta, Leptosphaeria cannabina, Leptosphaeria coniothyrium, Leptosphaeria libanotis, Leptosphaeria lindquistii, Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria musarum, Leptosphaeria pratensis, Leptosphaeria sacchari, Leptosphaeria woroninii, Leptosphaerulina crassiasca, Leptosphaerulina trifolii, Leptothyrium nervisedum, Leptotrochila medicaginis, Leucocytospora leucostoma, Leucostoma auerswaldii, Leucostoma kunzei, Leucostoma persoonii, Leveillula compositarum f. helianthi, Leveillula leguminosarum f. lentis, Leveillula taurica, Ligniera pilorum, Limacinula tenuis, Linochora graminis, Longidorus africanus, Longidorus maximus, Longidorus sylphus, Lopharia crassa, Lophodermium, Lophodermium aucupariae, Lophodermium schweinitzii, Lophodermium seditiosum, Macrophoma mangiferae, Macrophoma theicola, Macrophomina phaseolina, Macrosporium cocos, Magnaporthe, Magnaporthe grisea, Magnaporthe salvinii, Mamianiella coryli, Marasmiellus cocophilus, Marasmiellus inoderma, Marasmiellus scandens, Marasmiellus stenophyllus, Marasmius crinis-equi, Marasmius sacchari, Marasmius semiustus, Marasmius stenophyllus, Marasmius tenuissimus, Massarina walkeri, Mauginiella scaettae, Melampsora, Melampsora lini var. lini, Melampsora medusae, Melampsora occidentalis, Melanconis carthusiana, Melanconium juglandinum, Meliola, Meliola mangiferae, Meliolaceae, Meloidogyne acronea, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne artiellia, Meloidogyne brevicauda, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne enterolobii, Meloidogyne fruglia, Meloidogyne gajuscus, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Meloidogyne naasi, Meloidogyne partityla, Meloidogyne thamesi, Meripilus giganteus, Merlinius brevidens, Meruliopsis ambigua, Mesocriconema xenoplax, Microascus brevicaulis, Microbotryum violaceum, Microdochium bolleyi, Microdochium dimerum, Microdochium panattonianum, Microdochium phragmitis, Microsphaera, Microsphaera coryli, Microsphaera diffusa, Microsphaera ellisii, Microsphaera euphorbiae, Microsphaera hommae, Microsphaera penicillata, Microsphaera penicillata var. vaccinii, Microsphaera vaccinii, Microsphaera verruculosa, Microstroma juglandis, Moesziomyces bullatus, Monilinia azaleae, Monilinia fructicola, Monilinia fructigena, Monilinia laxa, Monilinia mali, Moniliophthora perniciosa, Moniliophthora roreri, Monilochaetes infuscans, Monochaetia coryli, Monochaetia mali, Monographella albescens, Monographella cucumerina, Monographella nivalis var. neglecta, Monographella nivalis var. nivalis, Mononegavirales, Monosporascus cannonballus, Monosporascus eutypoides, Monostichella coryli, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor hiemalis f. silvaticus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor racemosus, Mycena citricolor, Mycena maculate, Mycocentrospora acerina, Mycoleptodiscus terrestris, Mycosphaerella angulata, Mycosphaerella arachidis, Mycosphaerella areola, Mycosphaerella berkeleyi, Mycosphaerella bolleana, Mycosphaerella brassicicola, Mycosphaerella caricae, Mycosphaerella caryigena, Mycosphaerella cerasella, Mycosphaerella citri, Mycosphaerella coffeicola, Mycosphaerella confusa, Mycosphaerella cruenta, Mycosphaerella dendroides, Mycosphaerella eumusae, Mycosphaerella fragariae, Mycosphaerella gossypina, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella henningsii, Mycosphaerella horii, Mycosphaerella juglandis, Mycosphaerella lageniformis, Mycosphaerella linicola, Mycosphaerella louisianae, Mycosphaerella musae, Mycosphaerella musicola, Mycosphaerella palmicola, Mycosphaerella pinodes, Mycosphaerella pistaciarum, Mycosphaerella pistacina, Mycosphaerella platanifolia, Mycosphaerella polymorpha, Mycosphaerella pomi, Mycosphaerella punctiformis, Mycosphaerella pyri, Didymella rabiei, Mycosphaerella recutita, Mycosphaerella rosicola, Mycosphaerella rubi, Mycosphaerella stigmina-platani, Mycosphaerella striatiformans, Mycovellosiella concors, Mycovellosiella fulva, Mycovellosiella koepkei, Mycovellosiella vaginae, Myriogenospora aciculispora, Myrothecium roridum, Myrothecium verrucaria, Nacobbus aberrans, Nacobbus dorsalis, Naevala perexigua, Naohidemyces vaccinii, Nectria, Nectria cinnabarina, Nectria coccinea, Nectria ditissima, ectria foliicola, Nectria mammoidea var. rubi, Nectria mauritiicola, Nectria peziza, Nectria pseudotrichia, Nectria radicicola, Nectria ramulariae, Nectriella pironii, Nemania diffusa, Nemania serpens var. serpens, Nematospora coryli, Neocosmospora vasinfecta, Neodeightonia phoenicum, Neoerysiphe, Neofabraea malicorticis, Neofabraea perennans, Neofusicoccum mangiferae, Neonectria galligena, Oidiopsis gossypii, Oidium (genus), Oidium arachidis, Oidium caricae-papayae, Oidium indicum, Oidium mangiferae, Oidium manihotis, Oidium tingitaninum, Olpidium brassicae, Omphalia tralucida, Oncobasidium theobromae, Onnia tomentosa, Ophiobolus anguillides, Ophiobolus cannabinus, Ophioirenina, Ophiostoma ulmi, Ophiostoma wageneri, Ovulariopsis papayae, Ovulinia azaleae, Ovulitis azaleae, Oxyporus corticola, Oxyporus latemarginatus, Oxyporus populinus, Oxyporus similis, Ozonium texanum var. parasiticum, Paecilomyces fulvus, Paralongidorus maximus, Paratrichodorus christiei, Paratrichodorus minor, Paratylenchus curvitatus, Paratylenchus elachistus, Paratylenchus hamatus, Paratylenchus macrophallus, Paratylenchus microdorus, Paratylenchus projectus, Paratylenchus tenuicaudatus, Pathovar, Pauahia, Peach latent mosaic viroid, Pectobacterium carotovorum, Peltaster fructicola, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium funiculosum, Penicillium glabrum, Penicillium italicum, Penicillium purpurogenum, Penicillium ulaiense, Peniophora, Peniophora albobadia, Peniophora cinerea, Peniophora quercina, Peniophora sacrata, Perenniporia fraxinea, Perenniporia fraxinophila, Perenniporia medulla-panis, Perenniporia subacida, Periconia circinata, Periconiella cocoes, Peridermium californicum, Peronosclerospora miscanthi, Peronosclerospora sacchari, Peronosclerospora sorghi, Peronospora, Peronospora anemones, Peronospora antirrhini, Peronospora arborescens, Peronospora conglomerata, Peronospora destructor, Peronospora dianthi, Peronospora dianthicola, Peronospora farinosa, Peronospora farinosa f.sp. betae, Peronospora hyoscyami f.sp. tabacina, Peronospora manshurica, Peronospora potentillae, Peronospora sparsa, Peronospora trifoliorum, Peronospora valerianellae, Peronospora viciae, Pestalosphaeria concentrica, Pestalotia longiseta, Pestalotia longisetula, Pestalotia rhododendri, Pestalotiopsis, Pestalotiopsis adusta, Pestalotiopsis arachidis, Pestalotiopsis disseminata, Pestalotiopsis guepini, Pestalotiopsis leprogena, Pestalotiopsis longiseta, Pestalotiopsis mangiferae, Pestalotiopsis palmarum, Pestalotiopsis sydowiana, Pestalotiopsis theae, Pestalotiopsis versicolor, Phacidiopycnis padwickii, Phacidium infestans, Phaeochoropsis mucosa, Phaeocytostroma iliau, Phaeocytostroma sacchari, Phaeoisariopsis bataticola, Phaeolus schweinitzii, Phaeoramularia angolensis, Phaeoramularia dissiliens, Phaeoramularia heterospora, Phaeoramularia manihotis, Phaeoseptoria musae, Phaeosphaerella mangiferae, Phaeosphaerella theae, Phaeosphaeria avenaria f.sp. avenaria, Phaeosphaeria avenaria f.sp. triticae, Phaeosphaeria herpotrichoides, Phaeosphaeria microscopica, Phaeosphaeria nodorum, Phaeosphaeriopsis obtusispora, Phaeotrichoconis crotalariae, Phakopsora gossypii, Phakopsora pachyrhizi, Phanerochaete allantospora, Phanerochaete arizonica, Phanerochaete avellanea, Phanerochaete burtii, Phanerochaete carnosa, Phanerochaete chrysorhizon, Phanerochaete radicata, Phanerochaete salmonicolor, Phanerochaete tuberculata, Phanerochaete velutina, Phellinus ferreus, Phellinus gilvus, Phellinus igniarius, Phellinus pini, Phellinus pomaceus, Phellinus weirii, Phialophora asteris, Phialophora cinerescens, Phialophora gregata, Phialophora tracheiphila, Phloeospora multimaculans, Pholiota variicystis, Phoma, Phoma caricae-papayae, Phoma clematidina, Phoma costaricensis, Phoma cucurbitacearum, Phoma destructiva, Phoma draconis, Phoma eupyrena, Phoma exigua, Phoma exigua var. exigua, Phoma exigua var. foveata, Phoma exigua var. linicola, Phoma glomerata, Phoma glycinicola, Phoma herbarum, Phoma insidiosa, Phoma medicaginis, Phoma microspora, Phoma nebulosa, Phoma oncidii-sphacelati, Phoma pinodella, Phoma scabra, Phoma sclerotioides, Phoma strasseri, Phoma tracheiphila, Phomopsis arnoldiae, Phomopsis asparagi, Phomopsis asparagicola, Phomopsis azadirachtae, Phomopsis cannabina, Phomopsis caricae-papayae, Phomopsis coffeae, Phomopsis elaeagni, Phomopsis ganjae, Phomopsis javanica, Phomopsis lokoyae, Phomopsis mangiferae, Phomopsis obscurans, Phomopsis perseae, Phomopsis prunorum, Phomopsis scabra, Phomopsis sclerotioides, Phomopsis tanakae, Phomopsis theae, Photoassimilate, Phragmidium, Phragmidium mucronatum, Phragmidium rosae-pimpinellifoliae, Phragmidium rubi- idaei, Phragmidium violaceum, Phyllachora cannabis, Phyllachora graminis var. graminis, Phyllachora gratissima, Phyllachora musicola, Phyllachora pomigena, Phyllachora sacchari, Phyllactinia, Phyllactinia angulata, Phyllactinia guttata, Phyllody, Phyllosticta, Phyllosticta alliariaefoliae, Phyllosticta anacardiacearum, Phyllosticta arachidis- hypogaeae, Phyllosticta batatas, Phyllosticta capitalensis, Phyllosticta caricae-papayae, Phyllosticta carpogena, Phyllosticta circumscissa, Phyllosticta coffeicola, Phyllosticta concentrica, Phyllosticta coryli, Phyllosticta cucurbitacearum, Phyllosticta cyclaminella, Phyllosticta erratica, Phyllosticta hawaiiensis, Phyllosticta lentisci, Phyllosticta manihotis, Phyllosticta micropuncta, Phyllosticta mortonii, Phyllosticta nicotianae, Phyllosticta palmetto, Phyllosticta penicillariae, Phyllosticta perseae, Phyllosticta platani, Phyllosticta pseudocapsici, Phyllosticta sementes de sojaecola, Phyllosticta solitaria, Phyllosticta theae, Phyllosticta theicola, Phymatotrichopsis omnivora, Physalospora abdita, Physalospora disrupta, Physalospora perseae, Physarum cinereum, Physoderma alfalfae, Physoderma leproides, Physoderma trifolii, Physopella ampelopsidis, Phytophthora, Phytophthora alni, Phytophthora boehmeriae, Phytophthora cactorum, Phytophthora cajani, Phytophthora cambivora, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Phytophthora fragariae, Phytophthora fragariae var. rubi, Phytophthora gallica, Phytophthora hibernalis, Phytophthora infestans, Phytophthora inflata, Phytophthora iranica, Phytophthora katsurae, Phytophthora kernoviae, Phytophthora lateralis, Phytophthora medicaginis, Phytophthora megakarya, Phytophthora megasperma, Phytophthora nicotianae, Phytophthora palmivora, Phytophthora phaseoli, Phytophthora plurivora, Phytophthora ramorum, Phytophthora sementes de sojae, Phytophthora syringae, Phytophthora tentaculata, Phytoplasma, Pichia membranifaciens, Pichia subpelliculosa, Pileolaria terebinthi, Pilidiella quercicola, Plasmodiophora brassicae, Plasmopara, Plasmopara halstedii, Plasmopara helianthi f. helianthi, Plasmopara lactucae-radicis, Plasmopara nivea, Plasmopara obducens, Plasmopara penniseti, Plasmopara pygmaea, Plasmopara viticola, Platychora ulmi, Plenodomus destruens, Plenodomus meliloti, Pleochaeta, Pleosphaerulina sojicola, Pleospora alfalfae, Pleospora betae, Pleospora herbarum, Pleospora lycopersici, Pleospora tarda, Pleospora theae, Pleurotus dryinus, Podosphaera, Podosphaera clandestina var. clandestine, Podosphaera fusca, Podosphaera leucotricha, Podosphaera macularis, Podosphaera pannosa, Podosphaera tridactyla, Podosphaera tridactyla var. tridactyla, Podosphaera xanthii, Polymyxa graminis, Polyscytalum pustulans, Polystigma fulvum, Poria Pseudoepicoccum cocos, Pseudomonas amygdali, Pseudomonas asplenii, Pseudomonas avellanae, Pseudomonas caricapapayae, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas coronafaciens, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas ficuserectae, Pseudomonas flavescens, Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas helianthi, Pseudomonas marginalis, Pseudomonas Pseudomonas palleroniana, salomonii, Pseudomonas Pseudomonas tomato, turbinellae, Pseudomonas viridiflava, Pseudoperonospora cannabina, Pseudoperonospora cubensis, Pseudoperonospora humuli, Pseudopezicula tetraspora, Pseudopezicula tracheiphila, Pseudopeziza jonesii, Pseudopeziza medicaginis, Pseudopeziza trifolii, Pseudoseptoria donacis, Puccinia, Puccinia angustata, Puccinia arachidis, Puccinia aristidae, Puccinia asparagi, Puccinia cacabata, Puccinia campanulae, Puccinia carthami, Puccinia coronate, Puccinia coronata var. hordei, Puccinia dioicae, Puccinia erianthi, Puccinia extensicola var. hieraciata, Puccinia helianthi, Puccinia hordei, Puccinia jaceae var. solstitialis, Puccinia kuehnii, Puccinia mariae-wilsoniae, Puccinia melanocephala, Puccinia menthae, Puccinia pelargonii- zonalis, Puccinia pittieriana, Puccinia poarum, Puccinia psidii, Puccinia purpurea, Puccinia recondita, Puccinia schedonnardii, Puccinia sessilis, Puccinia striiformis f. sp. hordei, Puccinia striiformis var. striiformis, Puccinia subnitens, Puccinia substriata var. indica, Puccinia verruca, Puccinia xanthii, Pucciniaceae, Pucciniastrum, Pucciniastrum americanum, Pucciniastrum arcticum, Pucciniastrum coryli, Pucciniastrum epilobii, Pucciniastrum hydrangeae, Punctodera chalcoensis, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus, Pycnostysanus azaleae, Pyrenochaeta lycopersici, Pyrenochaeta terrestris, Pyrenopeziza brassicae, Pyrenophora, Pyrenophora avenae, Pyrenophora chaetomioides, Pyrenophora graminea, Pyrenophora seminiperda, Pyrenophora teres, Pyrenophora teres f. maculata, Pyrenophora teres f. teres, Pyrenophora tritici-repentis, Pythiaceae, Pythiales, Pythium, Pythium acanthicum, Pythium aphanidermatum, Pythium aristosporum, Pythium arrhenomanes, Pythium buismaniae, Pythium debaryanum, Pythium deliense, Pythium dissotocum, Pythium graminicola, Pythium heterothallicum, Pythium hypogynum, Pythium irregulare, Pythium iwayamae, Pythium mastophorum, Pythium middletonii, Pythium myriotylum, Pythium okanoganense, Pythium paddicum, Pythium paroecandrum, Pythium perniciosum, Pythium rostratum, Pythium scleroteichum, Pythium spinosum, Pythium splendens, Pythium sulcatum, Pythium sylvaticum, Pythium tardicrescens, Pythium tracheiphilum, Pythium ultimum, Pythium ultimum var. ultimum, Pythium vexans, Pythium violae, Pythium volutum, Quinisulcius acutus, Quinisulcius capitatus, Radopholous similis, Radopholus similis, Ralstonia solanacearum, Ramichloridium musae, Ramularia, Ramularia beticola, Ramularia brunnea, Ramularia coryli, Ramularia cyclaminicola, Ramularia macrospora, Ramularia menthicola, Ramularia necator, Ramularia primulae, Ramularia spinaciae, Ramularia subtilis, Ramularia tenella, Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Resinicium bicolor, Rhabdocline pseudotsugae, Rhabdocline weirii Rhabdoviridae, Rhinocladium corticola, Rhizoctonia, Rhizoctonia leguminicola, Rhizoctonia rubi, Rhizoctonia solani, Rhizomorpha subcorticalis, Rhizophydium graminis, Rhizopus arrhizus, Rhizopus circinans, Rhizopus microsporus var. microspores, Rhizopus oryzae, Rhodococcus fascians, Rhynchosporium, Rhynchosporium secalis, Rhytidhysteron rufulum, Rhytisma acerinum, Rhytisma vitis, Rigidoporus lineatus, Rigidoporus microporus, Rigidoporus ulmarius, Rigidoporus vinctus, Rosellinia arcuata, Rosellinia bunodes, Rosellinia necatrix, Rosellinia pepo, Rosellinia subiculata, Rotylenchulus, Rotylenchulus parvus, Rotylenchulus reniformis, Rotylenchus brachyurus, Rotylenchus robustus, Saccharicola taiwanensis, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces kluyveri, Sarocladium oryzae, Sawadaea, Sawadaea tulasnei, Schiffnerula cannabis, Schizoparme straminea, Schizophyllum commune, Schizopora flavipora, Schizothyrium pomi, Scleroderris canker, Sclerophthora macrospora, Sclerophthora rayssiae, Sclerospora graminicola, Sclerospora mischanthi, Sclerotinia borealis, Sclerotinia minor, Sclerotinia ricini, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia spermophila, Sclerotinia trifoliorum, Sclerotium, Sclerotium cinnamomi, Sclerotium delphinii, Scutellonema brachyurum, Scutellonema cavenessi, Scytinostroma galactinum, Seimatosporium mariae, Seimatosporium rhododendri, Selenophoma linicola, Septobasidium, Septobasidium bogoriense, Septobasidium pilosum, Septobasidium pseudopedicellatum, Septobasidium theae, Septocyta ruborum, Septogloeum potentillae, Septoria, Septoria aciculosa, Septoria ampelina, Septoria azalea, Septoria bataticola, Septoria campanulae, Septoria cannabis, Septoria caryae, Septoria citri, Septoria cucurbitacearum, Septoria darrowii, Septoria dianthi, Septoria eumusae, Septoria fragariae, Septoria fragariaecola, Septoria glycines, Septoria helianthi, Septoria humuli, Septoria hydrangeae, Septoria lactucae, Septoria liquidambaris, Septoria lycopersici, Septoria lycopersici var. malagutii, Septoria menthae, Septoria ostryae, Septoria passerinii, Septoria pisi, Septoria pistaciae, Septoria platanifolia, Septoria rhododendri, Septoria secalis, Septoria selenophomoides, Setosphaeria rostrata, Setosphaeria turcica, Sirosporium diffusum, Sparassis, Sphaceloma, Sphaceloma arachidis, Sphaceloma coryli, Sphaceloma menthae, Sphaceloma perseae, Sphaceloma poinsettiae, Sphaceloma pyrinum, Sphaceloma randii, Sphaceloma sacchari, Sphaceloma theae, Sphacelotheca reiliana, Sphaerella platanifolia, Sphaeropsis tumefaciens, Sphaerotheca, Sphaerotheca castagnei, Sphaerotheca fuliginea, Sphaerulina oryzina, Sphaerulina rehmiana, Sphaerulina rubi, Sphenospora kevorkianii, Spiniger meineckellus, Spiroplasma, Spongipellis unicolor, Sporisorium cruentum, Sporisorium ehrenbergi, Sporisorium scitamineum, Sporisorium sorghi, Sporonema phacidioides, Stagonospora avenae f.sp. triticae, Stagonospora meliloti, Stagonospora recedens, Stagonospora sacchari, Stagonospora tainanensis, Steccherinum ochraceum, Stegocintractia junci, Stegophora ulmea, Stemphylium alfalfa, Stemphylium bolickii, Stemphylium cannabinum, Stemphylium globuliferum, Stemphylium lycopersici, Stemphylium sarciniforme, Stemphylium solani, Stemphylium vesicarium, Stenella anthuriicola, Stereum, Stereum hirsutum, Stereum rameale, Stereum sanguinolentum, Stigmatomycosis, Stigmella platani-racemosae, Stigmina carpophila, Stigmina liquidambaris, Stigmina palmivora, Stigmina platani, Stigmina platani-racemosae, Subanguina radicicola, Subanguina wevelli, Sydowia polyspora, Sydowiella depressula, Sydowiellaceae, Synchytrium endobioticum, Synchytrium fragariae, Synchytrium liquidambaris, Taiwanofungus camphoratus, Tapesia acuformis, Tapesia yallundae, Taphrina aurea, Taphrina bullata, Taphrina caerulescens, Taphrina coryli, Taphrina deformans, Taphrina entomospora, Taphrina johansonii, Taphrina potentillae, Taphrina ulmi, Taphrina wiesneri, Thanatephorus cucumeris, Thielaviopsis, Thielaviopsis basicola, Thyrostroma compactum, Tilletia barclayana, Tilletia caries, Tilletia controversa, Tilletia laevis, Tilletia tritici, Tilletia walkeri, Tilletiariaceae, Tobacco necrosis virus, Togniniaceae, Trachysphaera fructigena, Trametes gibbosa, Trametes hirsute, Trametes nivosa, Trametes pubescens, Tranzschelia discolor f.sp. persica, Tranzschelia pruni-spinosae var. discolor, Trichaptum biforme, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma viride, Trichothecium roseum, Tripospermum acerinum, Truncatella, Truncatella laurocerasi, Tubercularia lateritia, Tubercularia ulmea, Tubeufia pezizula, Tunstallia aculeata, Tylenchorhynchus, Tylenchorhynchus brevilineatus, Tylenchorhynchus claytoni, Tylenchorhynchus dubius, Tylenchorhynchus maximus, Tylenchorhynchus nudus, Tylenchorhynchus phaseoli, Tylenchorhynchus vulgaris, Tylenchorhynchus zeae, Tylenchulus semipenetrans, Typhula idahoensis, Typhula incarnate, Typhula ishikariensis, Typhula ishikariensis var. canadensis, Typhula variabilis, Typhulochaeta, Tyromyces calkinsii, Tyromyces chioneus, Tyromyces galactinus, Ulocladium atrum, Ulocladium consortiale, Uncinula, Uncinula macrospora, Uncinula necator, Uredo behnickiana, Uredo kriegeriana, Uredo musae, Uredo nigropuncta, Uredo rangelii, Urocystis, Urocystis agropyri, Urocystis brassicae, Urocystis occulta, Uromyces, Uromyces apiosporus, Uromyces beticola, Uromyces ciceris-arietini, Uromyces dianthi, Uromyces euphorbiae, Uromyces graminis, Uromyces inconspicuus, Uromyces lineolatus subsp. nearcticus, Uromyces medicaginis, Uromyces musae, Uromyces oblongus, Uromyces pisi-sativi, Uromyces proêminens var. poinsettiae, Uromyces trifolii-repentis var. fallens, Uromyces viciae-fabae var. viciae-fabae, Urophlyctis leproides, Urophlyctis trifolii, Urophora cardui, Ustilaginales, Ustilaginoidea virens, Ustilaginomycetes, Ustilago, Ustilago avenae, Ustilago hordei, Ustilago maydis, Ustilago nigra, Ustilago nuda, Ustilago scitaminea, Ustilago tritici, Valsa abietis, Valsa ambiens, Valsa auerswaldii, Valsa ceratosperma, Valsa kunzei, Valsa nivea, Valsa sordida, Valsaria insitiva, Venturia carpophila, Venturia inaequalis, Venturia pirina, Venturia pyrina, Veronaea musae, Verticillium, Verticillium albo-atrum, Verticillium albo-atrum var. menthae, Verticillium dahliae, Verticillium longisporum, Verticillium theobromae, Villosiclava virens, Virescence, Waitea circinata, Wuestneiopsis Georgiana, Xanthomonas ampelina, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas campestris pv. campestris, Xanthomonas oryzae, Xeromphalina fraxinophila, Xiphinema americanum, Xiphinema bakeri, Xiphinema brevicolle, Xiphinema diversicaudatum, Xiphinema insigne, Xiphinema rivesi, Xiphinema vuittenezi, Xylaria mali, Xylaria polymorpha, Xylella fastidiosa, Xylophilus, Xylophilus ampelinus, Zopfia rhizophila, Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces florentinus.[00125] Other bacterial and fungal pathogens include Acarosporina microspora, Aceria guerreronis, Achlya conspicua, Achlya klebsiana, Achlysiella williamsi, Acholeplasmataceae, Acidovorax avenae, Acremonium strictum, Acrocalymma medicaginis, Acrodontium simplex, Acrophialophora fusispora, Acrosporium tingitaninum, Aeci dium, Aecidium aechmantherae, Aecidium amaryllidis, Aecidium breyniae, Aecidium campanulastri, Aecidium cannabis, Aecidium cantensis, Aecidium caspicum, Aecidium foeniculi, Agrobacterium tumefaciens, Albonectria rigidiuscula, Albugo bliti, Albugo candida, Albugo ipomoeae-panduratae, Albugo laibachii, Albugo occidentalis, Albugo trago pogonis, Alternaria, Alternaria alternata , Alternaria Brasísicae, Alternaria Brasosicicoicola, Alternaria Carthami, Alternaria Cinerariae, Alternaria Citri, Alternaria Dauci, Alternaria Dianthi, Alternaria Diancola, Alternaria Euphorbiicola, Alternaria Heliathico, Alternaria Japonica, Alternaria Leucanthemi, Alternaria Linicola, Alternaria Mali, Alternaria padwickii, Alternaria panax, Alternaria radicina, Alternaria raphani, Alternaria saponariae, Alternaria senecionis, Alternaria solani, Alternaria tenuissima, Alternaria triticina, Alternaria zinniae, Amazonia, Amphobotrys ricini, Anguillosporella vermiformis, Anguina (genus), Anguina agrostis, Anguina amsinckiae, Anguina aus tralis , Anguina balsamophila, Anguina funesta, Anguina graminis, Anguina spermophaga, Anguina tritici, Anisogramma anomala, Anthostomella pullulans, Antrodia albida, Antrodia serialiformis, Antrodia serialis, Aphanomyces cladogamus, Aphanomyces cochlioides, Aphanomyces euteiches, Aphanomyces euteiches f.sp. pisi, Aphanomyces raphani , Aphelenchoides, Aphelenchoides arachidis, Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Aphelenchoides parietinus, Aphelenchoides ritzemabosi, Aphelenchus avenae, Apiognomonia errabunda, Apiognomonia veneta, Apiospora montagnei, Appendiculella, Armillaria, Armillaria affinis, Armillaria apalosclera, Armillaria camerunensis, Armilla ria duplicate, Armillaria fellea, Armillaria Fumaza, Armillaria fuscipes, Armillaria griseomellea, Armillaria heimii, Armillaria mellea, Armillaria melleorubens, Armillaria montagnei, Armillaria omnituens, Armillaria pallidula, Armillaria paulensis, Armillaria pelliculata, Armillaria procera, Armillaria puiggarii, Armillaria singular, Armillaria socialis, Armillaria solidipes, Armillaria tabescens, Armillaria tigrensis, Armillaria umbrinobrunnea, Armillaria viridiflava, Armillaria yungensis, Arthrocladiella, Arthuriomyces peckianus, Ascochyta asparagine, Ascochyta bohemica, Ascochyta caricae, Ascochyta doronici, Ascochyta fabae f.sp. lentis, Ascochyta graminea, Ascochyta hordei, Ascochyta humuli, Asco chyta pisi, Ascochyta prasadii, Ascochyta sorghi, Ascochyta spinaciae, Ascochyta tarda, Ascochyta tritici, Ascospora ruborum, Ashbya gossypii, Aspergillus aculeatus, Aspergillus fischerianus, Aspergillus niger, Asperisporium caricae, Asperisporium minutulum, Asteridiella, Asteridiella perseae, Asteroma caryae, A steroma coryli, Asteroma inconspicuum, Athelia arachnoidea, Athelia rolfsii, Aurantiporus fissilis, Belonolaimus, Belonolaimus gracilis, Belonolaimus longicaudatus, Beniowskia sphaeroidea, Bionectria ochroleuca, Bipolaris, Bipolaris cactivora, Bipolaris cookie, Bipolaris incurvata, Bipolaris sacchari, Biscogniauxia capnodes var. capnodes, Biscogniauxia marginata, Biscogniauxia nummularia, Bjerkandera adusta, Blakeslea trispora, Blumeria graminis, Botryodiplodia oncidii, Botryodiplodia ulmicola, Botryosphaeria cocogena, Botryosphaeria corticola, Botryosphaeria disrupta, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria marconii, Botryosphaeria obtuse, Botryospha eria quercuum, Botryosphaeria rhodina, Botryosphaeria ribis, Botryosphaeria stevensii, Botryosporium pulchrum, Botryotinia, Botryotinia fuckeliana, Botrytis anthophila, Botrytis cinerea, Botrytis fabae, Bremia lactucae, Brenneria salicis, Briosia ampelophaga, Bulbomicrosphaera, Burkholderia andropogonis, Burkholderia caryophylli, Burkholderia glumae, Cadophora malorum , Caespitotheca, Calonectria indusiata, Calonectria kyotensis , Calonectria quinqueseptata, Calvatia versispora, Camarosporium pistaciae, Camarotella acrocomiae, Camarotella costaricensis, Candidatus Liberibacter, Capitorostrum cocoes, Capnodium footii, Capnodium mangiferum, Capnodium ramosum, Capnodium theae, Caulimoviridae, Cephaleuros virescens, Cephalosporium gramineum, Ceratobasidium cereal, Ceratobasidium cornigerum, Ceratobasidium noxium , Ceratobasidium ramicola, Ceratobasidium setariae, Ceratobasidium stevensii, Ceratocystis adiposa, Ceratocystis coerulescens, Ceratocystis fimbriata, Ceratocystis moniliformis, Ceratocystis paradoxa, Ceratocystis pilifera, Ceratocystis pluriannulata, Ceratorhiza hydrophila, Ceratospermopsis, Cercoseptoria ocellata, Cercospora, Cercospora angreci, Cercospora apii, Cercospora apii f .sp. clerodendri, Cercospora apiicola, Cercospora arachidicola, Cercospora asparagi, Cercospora atrofiliformis, Cercospora beticola, Cercospora brachypus, Cercospora brassicicola, Cercospora brunkii, Cercospora cannabis, Cercospora cantuariensis, Cercospora capsici, Cercospora carotae, Cercospora corylina, Cercospora fragariae, Cercospora fuchsiae , Cercospora fusca, Cercospora fusimaculans, Cercospora gerberae, Cercospora halstedii, Cercospora handelii, Cercospora hayi, Cercospora hydrangea, Cercospora kikuchii, Cercospora lentis, Cercospora liquidambaris, Cercospora longipes, Cercospora longissima, Cercospora mamaonis, Cercospora mangiferae, Cercospora medicaginis, Cercospora me longenae, Cercospora minima , Minuta Cercospora, Cercospora Nicotianae, Cercospora Odontoglossi, Papaya Cercospora, Cercospora Penniseti, Pisa-Savativae Cercospora, Cercospora Platanico, Cercospora Pulcherrima, Cercospora Rhapidicola, Rosigal Cercospora, Rubrotymal Cercospora, Sojin Cercospora, Cercospora SOLANI COSPORA, CERCOSPORA SOLANI-TUBEROSI, Cercospora sorghi, Cercospora theae, Cercospora tuberculans, Cercospora vexans, Cercospora vicosae, Cercospora zeae-maydis, Cercospora zebrina, Cercospora zonata, Cercosporella rubi, Cereal cyst nematode, Ceriporia spissa, Ceriporia xylostromatoides, Cerrena unicolor, Ceuthospora lauri, Choanephora, Choanephora cucurbitarum , Choanephora infundibulifera, Chondrostereum purpureum, Chrysomyxa ledi var. rhododendri, Chrysomyxa ledicola, Chrysomyxa piperiana, Chrysomyxa roanensis, Cladosporium, Cladosporium arthropodii, Cladosporium caryigenum, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium cladosporioides f.sp. pisicola, Cladosporium cucumerinum, Cladosporium herbarum, Cladosporium musae, Cladosporium oncobae, Cla vibacter michiganensis, Claviceps fusiformis, Claviceps purpurea , Claviceps sorghi, Claviceps zizaniae, Climacodon pulcherrimus, Climacodon septentrionalis, Clitocybe parasitica, Clonostachys rosea f. rosea, Clypeoporthe iliau, Cochliobolus, Cochliobolus carbonum, Cochliobolus cymbopogonis, Cochliobolus hawaiiensis, Cochliobolus heterostrophus, Cochliobolus lunatus, Cochliobolus miyabeanus, Cochliobolus ravenelii, Cochliobolus sativus, Cochliobolus setariae, Cochliobolus spicifer, Cochliobolus stenospilus, Cochliobolus tuberculatus, Cochliobolus victoriae, Coleosporium helianthi, Coleosporium ipomoeae, Coleosporium madiae, Coleosporium pacificum, Coleosporium tussilaginis, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum arachidis, Colletotrichum capsici, Colletotrichum cereale, Colletotrichum crassipes, Colletotrichum dematium, Colletotrichum dematium f. spinaciae, Colletotrichum derridis, Colletotrichum destructivum, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum gossypii, Colletotrichum higginsianum, Colletotrichum kahawae, Colletotrichum lindemuthianum, Colletotrichum lini, Colletotrichum mangenotii, Colletotrichum musae, Colletotrichum nigrum, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum pisi, Colleto trichum sublineolum, Colletotrichum trichellum, Colletotrichum trifolii, Colletotrichum truncatum, Coniella castaneicola, Coniella diplodiella, Coniella fragariae, Coniothecium chomatosporum, Coniothyrium celtidis-australis, Coniothyrium henriquesii, Coniothyrium rosarum, Coniothyrium wernsdorffiae, Coprinopsis psychromorbida, Cordana johnstonii, Cordana musae, Coriolopsis floccose, Coriolopsis gallica, Corticium invisum, Corticium penicillatum, Corticium theae, Coryneopsis rubi, Corynespora cassiicola, Coryneum rhododendri, Crinipellis sarmentosa, Cronartium ribicola, Cryphonectriaceae, Cryptocline cyclaminis, Cryptomeliola, Cryptoporus volvatus, Cryptosporella umbrina, Cryptosporiopsis tarraconensis, Cryptosporium minimum, Curvularia caricae-papayae, Curvularia penniseti, Curvularia senegalensis, Curvularia trifolii , Cylindrocarpon candidum, Cylindrocarpon ianthothele var. ianthothele, Cylindrocarpon magnusianum, Cylindrocarpon musae, Cylindrocladiella camelliae, Cylindrocladiella parva, Cylindrocladium clavatum, Cylindrocladium lanceolatum, Cylindrocladium peruvianum, Cylindrocladium pteridis, Cylindrosporium cannabinum, Cylindrosporium juglandis, Cylindrosporium rubi, Cymadothea trifolii, Cy tospora, Cytospora palmarum, Cytospora personata, Cytospora platani, Cytospora sacchari, Cytospora sacculus, Cytospora terebinthi, Cytosporina ludibunda, Dactuliophora elongata, Daedaleopsis confragosa, Dasineura urticae, Datronia scutellata, Davidiella carinthiaca, Davidiella dianthi, Davidiella tassiana, Deightoniella papuana, Deightoniella torulosa, Dendrophoma marconii, Dendrophora erumpens, Denticularia man giferae, Dermea pseudotsugae, Diaporthaceae, Diaporthe, Diaporthe arctii, Diaporthe citri, Diaporthe dulcamarae, Diaporthe eres, Diaporthe helianthi, Diaporthe lagunensis, Diaporthe lokoyae, Diaporthe melonis, Diaporthe orthoceras, Diaporthe perniciosa, Diaporthe phaseolorum, Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Diaporthe phaseolorum var. phaseolorum, Diaporthe phaseolorum var. soya seeds, Diaporthe rudis, Diaporthe tanakae, Diaporthe toxica, Dibotryon morbosum, Dicarpella dryina, Didymella bryoniae, Didymella fabae, Didymella lycopersici, Didymosphaeria arachidicola, Didymosphaeria taiwanensis, Dilophospora alopecuri, Dimeriella sacchari, Diplocarpon earlianum, Diplocarpon mali, Di plocarpon mespili, Diplocarpon rosae, Diplodia laelio-cattleyae, Diplodia manihoti, Diplodia paraphysaria, Diplodia theae-sinensis, Discosia artocreas, Guignardia fulvida, Discostroma corticola, Distocercospora, Distocercospora livistonae, Ditylenchus, Ditylenchus africanus, Ditylenchus angustus, Ditylenchus destructor, D itylenchus dipsaci, Dolichodorus heterocephalus, Dothideomycetes , Dothiorella aromatic, Dothiorella dominicana, Dothiorella gregaria, Dothiorella ulmi, Drechslera avenacea, Drechslera campanulata, Drechslera dematioidea, Drechslera gigantea, Drechslera glycines, Drechslera musae-sapientium, Drechslera teres f. maculate, Drechslera wirreganensis, Durandiella pseudotsugae, Eballistra lineata, Eballistra oryzae, Eballistraceae, Echinodontium tinctorium, Ectendomeliola, Elsinoê ampelina, Elsinoê australis, Elsinoê Batatas, Elsinoê brasiliensis, Elsinoê fawcettii, Elsinoê leucospila, Elsinoê mangiferae, El sinoê piri, Elsinoê randii, Elsinoê rosarum , Elsinoê sacchari, Elsinoê theae, Elsinoê veneta, Endomeliola, Endothia radicalis, Endothiella gyrosa, Entoleuca mammata, Entorrhizomycetes, Entyloma ageratinae, Entyloma dahlia, Entyloma ellisii, Epicoccum nigrum, Ergot, Erwinia, Erwinia chrysanthemi, Erwinia psidii, Erysiphaceae, Ery siphales, Erysiphe , Erysiphe alphitoides, Erysiphe betae, Erysiphe brunneopunctata, Erysiphe cichoracearum, Erysiphe cruciferarum, Erysiphe flexuosa, Erysiphe graminis f. sp. avenae, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Erysiphe heraclei, Erysiphe pisi, Eutypella parasitica, Eutypella scoparia, Exobasidium burtii, Exobasidium reticulatum, Exobasidium vaccinii var. japonicum, Exobasidium vaccinii-uliginosi, Exobasidium vexans, Exophiala, Flavescence dorée, Fomes fasciatus, Fomes lamaênsis, Fomes meliae, Fomitopsis cajanderi, Fomitopsis palustris, Fomitopsis rosea, Fomitopsis spraguei, Fomitopsis supina, Forma specialis, Frommeella tormentillae, Fusarium, Fusarium affine, Fusarium arthrosporioides, Fusarium circinatum, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium incarnatum, Fusarium solani, Fusarium merismoides, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, Fusarium oxysporum f.sp. asparagi, Fusarium oxysporum f.sp. potatoes, Fusarium oxysporum f.sp. betae, Fusarium oxysporum f.sp. cannabis, Fusarium oxysporum f.sp. citri, Fusarium oxysporum f.sp. coffea, Fusarium oxysporum f.sp. cubense, Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis, Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici, Fusarium pallidoroseum, Fusarium proliferatum, Fusarium redolens, Fusarium sacchari, Fusarium solani f.sp. pisi, Fusarium sporotrichioides, Fusarium subglutinans, Fusarium sulphureum, Fuscoporia torulosa, Fusicladium pisicola, Fusicoccum aesculi, Fusicoccum amygdali, Gaeumannomyces graminis var tritici, Gaeumannomyces graminis var. avenae, Gaeumannomyces graminis var. graminis, Galactomyces candidum, Ganoderma brownii, Ganoderma lobatum, Ganoderma orbiforme, Ganoderma philippii, Ganoderma tornatum, Ganoderma zonatum, Geastrumia polystigmatis, Georgefischeriaceae, Georgefischeriales, Geosmithia morbida, Geotrichum, Geotrichum candidum, Geotrichum candidum var. citri- aurantii, Geotrichum klebahnii, Gibberella, Gibberella acuminata, Gibberella avenacea, Gibberella baccata, Gibberella cyanogena, Gibberella fujikuroi, Gibberella fujikuroi var. subglutinans, Gibberella intricans, Gibberella pulicaris, Gibberella stilboides, Gibberella xylarioides, Gibberella zeae, Gibellina cerealis, Gilbertella persicaria, Gjaerumiaceae, Gliocladium vermoeseni, Globodera pallida, Globodera facechiensis, Globodera tabacum, Gloeocercospora sorghi, Gloeocystidiellum porosum, Gloeo phyllum mexicanum, Gloeophyllum trabeum, Gloeoporus dichrous, Gloeosporium cattleyae, Gloeosporium theae-sinensis, Glomerella cingulate, Glomerella glycines, Glomerella graminicola, Glomerella tucumanensis, Gnomonia caryae, Gnomonia comari, Gnomonia dispora, Gnomonia iliau, Gnomonia leptostyla, Gnomonia nerviseda, Gnomonia rubi, Golovinomyces ci choracearum var. latisporus, Granulobasidium vellereum, Graphiola phoenicis, Graphium rigidum, Graphium rubrum, Graphyllium pentamerum, Grovesinia pyramidalis, Guignardia bidwellii f. muscadinii, Guignardia camelliae, Guignardia citricarpa, Guignardia mangiferae, Guignardia musae, Guignardia philoprina, Gummosis, Gymnoconia nitens, Gymnopus dryophilus, Gymnosporangium clavipes, Gymnosporangium sabinae, Gymnosporangium globosum, Gymnosporangium juniperi- virginianae, Gymnosporangium kernianum, Gymnospor angium nelsonii, Gymnosporangium yamadae, Haematonectria haematococca , Hansenula subpelliculosa, Hapalosphaeria deformans, Haplobasidion musae, Haustorium, Helicobasidium compactum, Helicobasidium longisporum, Helicobasidium purpureum, Helicoma muelleri, Helicotylenchus, Helicotylenchus dihystera, Helicotylenchus multicinctus, Helminthosporium cookei, Helminthosporium papulosum, Helminthosporium sol ani, Helotiales, Hemicriconemoides kanayaensis, Hemicriconemoides mangiferae, Hemicycliophora arenaria, Hemlock woolly adelgid, Hendersonia creberrima, Hendersonia theicola, Hericium coralloides, Heterobasidion annosum, Heterodera, Heterodera amygdali, Heterodera arenaria, Heterodera aucklandica, Heterodera avenae, Heterodera bergeniae, Heterodera bifenestra, Heterodera cacti, Heterodera cajani, Heterodera canad ensis, Heterodera cardiolata, Heterodera carotae, Heterodera ciceri, Heterodera cruciferae, Heterodera delvii, Heterodera elachista, Heterodera filipjevi, Heterodera gambiensis, Heterodera goettingiana, Heterodera hordecalis, Heterodera humuli, Heterodera latipons, Heterodera medicaginis, Heterodera oryzae, Heterodera oryzicola, He terodera rosii, Heterodera sacchari, Heterodera schachtii , Heterodera tabacum, Heterodera trifolii, Heteroderidae, Hexagonia hydnoides, Hirschmanniella oryzae, Hoplalaimus galeatus, Hoplolaimidae, Hoplolaimus columbus, Hoplolaimus indicus, Hoplolaimus magnistylus, Hoplolaimus pararobustus, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus uniformis, Huanglongbing, Hya loperonospora, Hyaloperonospora arabidopsidis, Hyaloperonospora brassicae, Hyaloperonospora parasitica , Hymenula affinis, Hyphodermella corrugata, Hyphodontia aspera, Hyphodontia sambuci, Hypochnus, Hypoxylon tinctor, Idriella lunata, Inonotus arizonicus, Inonotus cuticularis, Inonotus dryophilus, Inonotus hispidus, Inonotus ludovicianus, Inonotus munzii, Inonotus tamaricis, Irenopsis, Ir pex destruens, Irpex lacteus, Isariopsis clavispora, Johncouchia mangiferae, Kabatiella caulivora, Kabatiella lini, Karnal bunt, Khuskia oryzae, Kretzschmaria goddess, Kretzschmaria zonata, Kuehneola uredinis, Kutilakesa pironii, Labrella coryli, Laeticorticium roseum, Laetiporus baudonii, Lagenocystis radicicola, Laricifomes officinalis, La siodiplodia theobromae, Leandria momordicae , Leifsonia xyli xyli, Lentinus tigrinus, Lenzites betulina, Lenzites elegans, Lepteutypa cupressi, Leptodontidium elatius var. elatius, Leptographium microsporum, Leptosphaeria acuta, Leptosphaeria cannabina, Leptosphaeria coniothyrium, Leptosphaeria libanotis, Leptosphaeria lindquistii, Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria musarum, Leptosphaeria pratensis, Leptosphaeria sacchari, Leptosphaeria woroninii, Leptosphaerulina crassiasca, Leptospha erulina trifolii, Leptothyrium nervisedum, Leptotrochila medicaginis, Leucocytospora leucostoma, Leucostoma auerswaldii, Leucostoma kunzei, Leucostoma persoonii, Leveillula compositarum f. helianthi, Leveillula leguminosarum f. lentis, Leveillula taurica, Ligniera pilorum, Limacinula tenuis, Linochora graminis, Longidorus africanus, Longidorus maximus, Longidorus sylphus, Lopharia crassa, Lophodermium, Lophodermium aucupariae, Lophodermium schweinitzii, Lophodermium seditiosum, Macrophoma mangiferae, Macrophoma theicola, Macro phomina phaseolina, Macrosporium cocos, Magnaporthe , Magnaporthe grisea, Magnaporthe salvinii, Mamianiella coryli, Marasmiellus cocophilus, Marasmiellus inoderma, Marasmiellus scandens, Marasmiellus stenophyllus, Marasmius crinis-equi, Marasmius sacchari, Marasmius semiustus, Marasmius stenophyllus, Marasmius tenuissimus, Massarina walkeri, Mauginiella scaettae, Melampsora, Melampsora lini var . lini, Melampsora medusae, Melampsora occidentalis, Melanconis carthusiana, Melanconium juglandinum, Meliola, Meliola mangiferae, Meliolaceae, Meloidogyne acronea, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne artiellia, Meloidogyne brevicauda, Meloidogyne chitwoodi, Meloidogyne enterolobii, Meloidogyne fruglia, Meloidogyne gajus cus, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica , Meloidogyne naasi, Meloidogyne partityla, Meloidogyne thamesi, Meripilus giganteus, Merlinius brevidens, Meruliopsis ambigua, Mesocriconema xenoplax, Microascus brevicaulis, Microbotryum violaceum, Microdochium bolleyi, Microdochium dimerum, Microdochium panattonianum, Microdochium phragmitis, Microsphaera, Microsphaera coryli , Microsphaera diffusa, Microsphaera ellisii , Microsphaera euphorbiae, Microsphaera hommae, Microsphaera penicillata, Microsphaera penicillata var. vaccinii, Microsphaera vaccinii, Microsphaera verruculosa, Microstroma juglandis, Moesziomyces bullatus, Monilinia azaleae, Monilinia fructicola, Monilinia fructigena, Monilinia laxa, Monilinia mali, Moniliophthora perniciosa, Moniliophthora roreri, Monilochaetes infuscans, Monochaetia coryli, Monochaetia mali, Mono graphella albescens, Monographella cucumerina, Monographella nivalis var. neglecta, Monographella nivalis var. nivalis, Mononegavirales, Monosporascus cannonballus, Monosporascus eutypoides, Monostichella coryli, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor hiemalis f. silvaticus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor racemosus, Mycena citricolor, Mycena maculate, Mycocentrospora acerina, Mycoleptodiscus terrestris, Mycosphaerella angulata, Mycosphaerella arachidis, Mycosphaerella areola, Mycosphaerella berkeleyi, Mycosphaerella bolleana, Mycosphaerella brassicicola, Mycospha erella caricae, Mycosphaerella caryigena, Mycosphaerella cerasella, Mycosphaerella citri, Mycosphaerella coffeicola, Mycosphaerellaconsciente, Mycosphaerella cruenta, Mycosphaerella dendroides, Mycosphaerella eumusae, Mycosphaerella fragariae, Mycosphaerella gossypina, Mycosphaerella graminicola, Mycosphaerella henningsii, Mycosphaerella horii, Mycosphaerella juglandis, Mycospha erella lageniformis, Mycosphaerella linicola, Mycosphaerella louisianae, Mycosphaerella musae Mycosphaerella musicola ruby, Mycosphaerella stigmina-platani, Mycosphaerella striatiformans , Mycovellosiella concors, Mycovellosiella fulva, Mycovellosiella koepkei, Mycovellosiella vaginae, Myriogenospora aciculispora, Myrothecium roridum, Myrothecium verrucaria, Nacobbus aberrans, Nacobbus dorsalis, Naevala perexigua, Naohidemyces vaccinii, Nectria, Nectria cinnabarina, Nectria coc cinea, Nectria ditissima, ectria foliicola, Nectria mammoidea var. rubi, Nectria mauritiicola, Nectria peziza, Nectria pseudotrichia, Nectria radicicola, Nectria ramulariae, Nectria pironii, Nemania diffusa, Nemania serpens var. serpens, Nematospora coryli, Neocosmospora vasinfecta, Neodeightonia phoenicum, Neoerysiphe, Neofabraea malicorticis, Neofabraea perennans, Neofusicoccum mangiferae, Neonectria galligena, Oidiopsis gossypii, Oidium (genus), Oidium arachidis, Oidium caricae-papayae, Oidium indicum, Oidium mangiferae , Oidium manihotis, Oidium tingitaninum, Olpidium brassicae, Omphalia tralucida, Oncobasidium theobromae, Onnia tomentosa, Ophiobolus anguillides, Ophiobolus cannabinus, Ophioirenina, Ophiostoma ulmi, Ophiostoma wageneri, Ovulariopsis papayae, Ovulinia azaleae, Ovulitis azaleae, Oxyporus corticola, Oxyporus latemarginatus, Oxyporus populinus, Oxyporus similis, Ozonium texanum var. parasiticum, Paecilomyces fulvus, Paralongidorus maximus, Paratrichodorus christiei, Paratrichodorus minor, Paratylenchus curvitatus, Paratylenchus elachistus, Paratylenchus hamatus, Paratylenchus macrophallus, Paratylenchus microdorus, Paratylenchus projectus, Paratylenchus tenuicaudatus, Pathovar, Pauahia, Peach latent mosaic viroid , Pectobacterium carotovorum, Peltaster fructicola, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium funiculosum, Penicillium glabrum, Penicillium italicum, Penicillium purpurogenum, Penicillium ulaiense, Peniophora, Peniophora albobadia, Peniophora cinerea, Peniophora quercina, Peniophora sacrata, Perenniporia fraxinea, Perenniporia frax inophila, Perenniporia medulla-panis, Perenniporia subacida, Periconia circinata, Periconiella cocoes, Peridermium californicum, Peronosclerospora miscanthi, Peronosclerospora sacchari, Peronosclerospora sorghi, Peronospora, Peronospora anemones, Peronospora antirrhini, Peronospora arborescens, Peronospora conglomerata, Peronospora destructor, Peronospora dianthi, Peronospora dian thicola, Peronospora farinosa, Peronospora farinosa f. sp. betae, Peronospora hyoscyami f.sp. tabacina, Peronospora manshurica, Peronospora potentillae, Peronospora sparsa, Peronospora trifoliorum, Peronospora valerianellae, Peronospora viciae, Pestalosphaeria concentrica, Pestalotia longiseta, Pestalotia longisetula, Pestalotia rhododendri, Pestalotiopsis, Pestalotiopsi s adusta, Pestalotiopsis arachidis, Pestalotiopsis disseminata, Pestalotiopsis guepini, Pestalotiopsis leprogena, Pestalotiopsis longiseta, Pestalotiopsis mangiferae, Pestalotiopsis palmarum, Pestalotiopsis sydowiana, Pestalotiopsis theae, Pestalotiopsis versicolor, Phacidiopycnis padwickii, Phacidium infestans, Phaeochoropsis mucosa, Phae ocytostroma iliau, Phaeocytostroma sacchari, Phaeoisariopsis Bataticola, Phaeolus schweinitzii, Phaeoramularia angolensis , Ph. eosphaeriopsis obtusispora, Phaeotrichoconis crotalariae, Phakopsora gossypii, Phakopsora pachyrhizi, Phanerochaete allantospora, Phanerochaete arizonica, Phanerochaete avellanea, Phanerochaete burtii, Phanerochaete carnosa, Phanerochaete chrysorhizon, Phanerochaete radicata, Phanerochaete salmonicolor, Phanerochaete tuberculata, Phanerochaete velutina, Phellinus ferreus, Phellinus gilvus, Phellinus igniarius, Phellinus pini, Phellinus pomaceus , Phellinus weirii, Phialophora asteris, Phialophora cinerescens, Phialophora gregata, Phialophora tracheiphila, Phloeospora multimaculans, Pholiota variicystis, Phoma, Phoma caricae-papayae, Phoma clematidina, Phoma costaricensis, Phoma cucurbitacearum, Phoma destructiva, Phoma draconis, Phoma eupyrena , Phoma demands, Phoma demands var. exigua, Phoma exigua var. foveata, Phoma exigua var. linicola, Phoma glomerata, Phoma glycinicola, Phoma herbarum, Phoma insidiosa, Phoma medicaginis, Phoma microspora, Phoma nebulosa, Phoma oncidii-sphacelati, Phoma pinodella, Phoma scabra, Phoma sclerotioides, Phoma strasseri, Phoma tracheiphila, Phomopsis arnoldiae, Phomopsis asparagi, Phomopsis asparagicola, Phomopsis azadirachtae, Phomopsis cannabina, Phomopsis caricae-papayae, Phomopsis coffeae, Phomopsis elaeagni, Phomopsis ganjae, Phomopsis javanica, Phomopsis lokoyae, Phomopsis mangiferae, Phomopsis obscurans, Phomopsis perseae, Phomopsis prunorum, Phomopsis scabra , Phomopsis sclerotioides, Phomopsis tanakae, Phomopsis theae, Photoassimilate, Phragmidium, Phragmidium mucronatum, Phragmidium rosae-pimpinellifoliae, Phragmidium rubi-idaei, Phragmidium violaceum, Phyllachora cannabis, Phyllachora graminis var. graminis, Phyllachora gratissima, Phyllachora musicola, Phyllachora pomigena, Phyllachora sacchari, Phyllactinia, Phyllactinia angulata, Phyllactinia guttata, Phyllody, Phyllosticta, Phyllosticta alliariaefoliae, Phyllosticta anacardiacearum, Phyllosticta arachidis- hypogaeae, Phyllosticta potatoes, Phyllosticta capital ensis, Phyllosticta caricae-papayae, Phyllosticta carpogena , Phyllosticta circumscissa, Phyllosticta coffeicola, Phyllosticta concentrica, Phyllosticta coryli, Phyllosticta cucurbitacearum, Phyllosticta cyclaminella, Phyllosticta erratica, Phyllosticta hawaiiensis, Phyllosticta lentisci, Phyllosticta manihotis, Phyllosticta micropuncta, Phyllosticta Mortonii, Phyl losticta nicotianae, Phyllosticta palmetto, Phyllosticta penicillariae, Phyllosticta perseae, Phyllosticta platani, Phyllosticta pseudocapsici, Phyllosticta soyaecola seeds, Phyllosticta solitaria, Phyllosticta theae, Phyllosticta theicola, Phymatotrichopsis omnivora, Physalospora abdita, Physalospora disrupta, Physalospora perseae, Physarum cinereum, Physoderma alfalfae, Physoderma leproides, Physode rma trifolii, Physopella ampelopsidis, Phytophthora, Phytophthora alni , Phytophthora boehmeriae, Phytophthora cactorum, Phytophthora cajani, Phytophthora cambivora, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drechsleri, Phytophthora erythroseptica, Ph ytophthora fragariae, Phytophthora fragariae var. rubi, Phytophthora gallica, Phytophthora hibernalis, Phytophthora infestans, Phytophthora inflata, Phytophthora iranica, Phytophthora katsurae, Phytophthora kernoviae, Phytophthora lateralis, Phytophthora medicaginis, Phytophthora megakarya, Phytophthora megasperma, Phytophthora hora nicotianae, Phytophthora palmivora, Phytophthora phaseoli, Phytophthora plurivora, Phytophthora ramorum, Phytophthora soya seeds, Phytophthora syringae, Phytophthora tentaculata, Phytoplasma, Pichia membranifaciens, Pichia subpelliculosa, Pileolaria terebinthi, Pilidiella quercicola, Plasmodiophora brassicae, Plasmopara, Plasmopara halstedii, Plasmopara helianthi f. helianthi, Plasmopara lactucae-radicis, Plasmopara nivea, Plasmopara obducens, Plasmopara penniseti, Plasmopara pygmaea, Plasmopara viticola, Platychora ulmi, Plenodomus destruens, Plenodomus meliloti, Pleochaeta, Pleosphaerulina sojicola, Pleospora alfalfae, Pleospora betae, Pleospora her barum, Pleospora lycopersici, Pleospora tarda , Pleospora theae, Pleurotus dryinus, Podosphaera, Podosphaera clandestina var. clandestine, Podosphaera fusca, Podosphaera leucotricha, Podosphaera macularis, Podosphaera pannosa, Podosphaera tridactyla, Podosphaera tridactyla var. tridactyla, Podosphaera xanthii, Polymyxa graminis, Polyscytalum pustulans, Polystigma fulvum, Poria Pseudoepicoccum cocos, Pseudomonas amygdali, Pseudomonas asplenii, Pseudomonas avellanae, Pseudomonas caricapapayae, Pseudomonas cichorii, Pseudomonas coronafaciens, Pseudomonas corrugate, Pseudomonas ficuserectae, Pseudomonas flavescens, Pseudomonas fuscovaginae, Pseudomonas helianthi , Pseudomonas marginalis, Pseudomonas Pseudomonas palleroniana, salomonii, Pseudomonas Pseudomonas tomato, turbinellae, Pseudomonas viridiflava, Pseudoperonospora cannabina, Pseudoperonospora cubensis, Pseudoperonospora humuli, Pseudopezicula tetraspora, Pseudopezicula tracheiphila, Pseudopeziza jonesii, Pseudopeziza medicaginis, Pseudopeziza trifolii, Pseudoseptoria donacis, Puccinia, Puccinia angustata , Puccinia arachidis, Puccinia aristidae, Puccinia asparagi, Puccinia cacabata, Puccinia campanulae, Puccinia carthami, Puccinia coronate, Puccinia coronata var. hordei, Puccinia dioicae, Puccinia erianthi, Puccinia extensicola var. hieraciata, Puccinia helianthi, Puccinia hordei, Puccinia jaceae var. solstitialis, Puccinia kuehnii, Puccinia mariae-wilsoniae, Puccinia melanocephala, Puccinia menthae, Puccinia pelargonii- zonalis, Puccinia pittieriana, Puccinia poarum, Puccinia psidii, Puccinia purpurea, Puccinia recondita, Puccinia schedonnardii, Puccinia sessilis, Puccinia striiformis f. sp. hordei, Puccinia striiformis var. striiformis, Puccinia subnitens, Puccinia substriata var. indica, Puccinia verruca, Puccinia xanthii, Pucciniaceae, Pucciniastrum, Pucciniastrum americanum, Pucciniastrum arcticum, Pucciniastrum coryli, Pucciniastrum epilobii, Pucciniastrum hydrangeae, Punctodera chalcoensis, Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus, Pycnostysanus aza leae, Pyrenochaeta lycopersici, Pyrenochaeta terrestris, Pyrenopeziza brassicae, Pyrenophora, Pyrenophora avenae, Pyrenophora chaetomioides, Pyrenophora graminea, Pyrenophora seminiperda, Pyrenophora teres, Pyrenophora teres f. maculata, Pyrenophora teres f. teres, Pyrenophora tritici-repentis, Pythiaceae, Pythiales, Pythium, Pythium acanthicum, Pythium aphanidermatum, Pythium aristosporum, Pythium arrhenomanes, Pythium buismaniae, Pythium debaryanum, Pythium deliense, Pythium dissotocum, Pythium graminicola, Pythium heterothallicum, Pythium hypogynum, Pythium irregulare , Pythium iwayamae, Pythium mastophorum, Pythium middletonii, Pythium myriotylum, Pythium okanoganense, Pythium paddicum, Pythium paroecandrum, Pythium perniciosum, Pythium rostratum, Pythium scleroteichum, Pythium spinosum, Pythium splendens, Pythium sulcatum, Pythium sylvaticum, Pythium tardicrescens, Pythium tracheiphilum, Pythium ultimum, Pythium ultimum var. ultimum, Pythium vexans, Pythium violae, Pythium volutum, Quinisulcius acutus, Quinisulcius capitatus, Radopholous similis, Radopholus similis, Ralstonia solanacearum, Ramichloridium musae, Ramularia, Ramularia beticola, Ramularia brunnea, Ramularia coryli, Ramularia cyclaminicola, Ramularia macrospora, Ramularia menthic Hello, Ramularia necator, Ramularia primulae, Ramularia spinaciae, Ramularia subtilis, Ramularia tenella, Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Resinicium bicolor, Rhabdocline pseudotsugae, Rhabdocline weirii Rhabdoviridae, Rhinocladium corticola, Rhizoctonia, Rhizoctonia leguminicola, Rhizoctonia rubi, Rhizoctonia solani, Rhizomorpha subcorticalis, Rhizophydium graminis, Rhizopus arrhizus, Rhizopus circinans, Rhizopus microsporus var. microspores, Rhizopus oryzae, Rhodococcus fascians, Rhynchosporium, Rhynchosporium secalis, Rhytidhysteron rufulum, Rhytisma acerinum, Rhytisma vitis, Rigidoporus lineatus, Rigidoporus microporus, Rigidoporus ulmarius, Ritidoporus vinctus, Rosellinia arcuata, Rosellinia bunodes, Rosellinia necatrix, Rose llinia pepo, Rosellinia subiculata, Rotylenchulus , Rotylenchulus parvus, Rotylenchulus reniformis, Rotylenchus brachyurus, Rotylenchus robustus, Saccharicola taiwanensis, Saccharomyces florentinus, Saccharomyces kluyveri, Sarocladium oryzae, Sawadaea, Sawadaea tulasnei, Schiffnerula cannabis, Schizoparme straminea, Schizophyllum commune, Schizopora flavipora , Schizothyrium pomi, Scleroderris canker, Sclerophthora macrospora Sclerophthora rayssiae llonema cavenessi, Scytinostroma galactinum, Seimatosporium mariae, Seimatosporium rhododendri , Selenophoma linicola, Septobasidium, Septobasidium bogoriense, Septobasidium pilosum, Septobasidium pseudopedicellatum, Septobasidium theae, Septocyta ruborum, Septogloeum potentillae, Septoria, Septoria aciculosa, Septoria ampelina, Septoria azalea, Septoria Bataticola, Septoria campanulae, Septoria cannabis, Septoria caryae, Se ptoria citri, Septoria cucurbitacearum, Septoria darrowii, Septoria dianthi, Septoria eumusae, Septoria fragariae, Septoria fragariaecola, Septoria glycines, Septoria helianthi, Septoria humuli, Septoria hydrangeae, Septoria lactucae, Septoria liquidambaris, Septoria lycopersici, Septoria lycopersici var. malagutii, Septoria menthae, Septoria ostryae, Septoria passerinii, Septoria pisi, Septoria pistaciae, Septoria platanifolia, Septoria rhododendri, Septoria secalis, Septoria selenophomoides, Setosphaeria rostrata, Setosphaeria turcica, Sirosporium diffusum, Sparassis, Sphaceloma, Sphaceloma arachidis, Sphaceloma cor yli, Sphaceloma menthae , Sphaceloma perseae, Sphaceloma poinsettiae, Sphaceloma pyrinum, Sphaceloma randii, Sphaceloma sacchari, Sphaceloma theae, Sphacelotheca reiliana, Sphaerella platanifolia, Sphaeropsis tumefaciens, Sphaerotheca, Sphaerotheca castagnei, Sphaerotheca fuliginea, Sphaerulina oryzina, Spha erulina rehmiana, Sphaerulina rubi, Sphenospora kevorkianii, Spiniger meineckellus , Spiroplasma, Spongipellis unicolor, Sporisorium cruentum, Sporisorium ehrenbergi, Sporisorium scitamineum, Sporisorium sorghi, Sporonema phacidioides, Stagonospora avenae f.sp. triticae, Stagonospora meliloti, Stagonospora recedens, Stagonospora sacchari, Stagonospora tainanensis, Steccherinum ochraceum, Ste gocintractia junci, Stegophora ulmea, Stemphylium alfalfa, Stemphylium bolickii, Stemphylium cannabinum, Stemphylium globuliferum, Stemphylium lycopersici, Stemphylium sarciniforme, Stemphylium solani, Stemphylium vesicarium, Stenella anthuriicola, Stereum, Stereum hirsutum, Stereum rameale, Stereum sanguinolentum, Stigmatomycosis, Stigmella platani- racemosae, Stigmina carpophila, Stigmina liquidambaris , Stigmina palmivora, Stigmina platani, Stigmina platani-racemosae, Subanguina radicicola, Subanguina wevelli, Sydowia polyspora, Sydowiella depressula, Sydowiellaceae, Synchytrium endobioticum, Synchytrium fragariae, Synchytrium liquidambaris, Taiwanofungus camphoratus, Tapesia acuformis, Tapesia yallundae, Taphrina aurea, Taphrina bullata, Taphrina caerulescens, Taphrina coryli, Taphrina deformans, Taphrina entomospora, Taphrina johansonii, Taphrina potentillae, Taphrina ulmi, Taphrina wiesneri, Thanatephorus cucumeris, Thielaviopsis, Thielaviopsis basicola, Thyrostroma compactum, Tilletia barclayana, Tilletia caries, Tilletia controversial, Tilletia laevis, Tillet I was tritici, Tilletia walkeri, Tilletiariaceae, Tobacco necrosis virus, Togniniaceae, Trachysphaera fructigena, Trametes gibbosa, Trametes hirsute, Trametes nivosa, Trametes pubescens, Tranzschelia discolor f.sp. persica, Tranzschelia pruni-spinosae var. discolor, Trichaptum biforme, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma viride, Trichothecium roseum, Tripospermum acerinum, Truncatella, Truncatella laurocerasi, Tubercularia lateritia, Tubercularia ulmea, Tubeufia pezizula, Tunstallia aculeata, Tylenchorhynchus, Tylenchorhynchus brevilineatus, Tylenchor hynchus claytoni, Tylenchorhynchus dubius, Tylenchorhynchus maximus , Tylenchorhynchus nudus, Tylenchorhynchus phaseoli, Tylenchorhynchus vulgaris, Tylenchorhynchus zeae, Tylenchorhynchus semipenetrans, Typhula idahoensis, Typhula incarnate, Typhula ishikariensis, Typhula ishikariensis var. canadensis, Typhula variabilis, Typhulochaeta, Tyromyces calkinsii, Tyromyces chioneus, Tyromyces galactinus, Ulocladium atrum, Ulocladium consortiale, Uncinula, Uncinula macrospora, Uncinula necator, Uredo behnickiana, Uredo kriegeriana, Uredo musae, Uredo nigropuncta, Uredo rangelii, Urocystis, U rocystis agropyri, Urocystis brassicae, Urocystis occulta, Uromyces, Uromyces apiosporus, Uromyces beticola, Uromyces ciceris-arietini, Uromyces dianthi, Uromyces euphorbiae, Uromyces graminis, Uromyces inconspicuus, Uromyces lineolatus subsp. nearcticus, Uromyces medicaginis, Uromyces musae, Uromyces oblongus, Uromyces pisi-sativi, Uromyces proêminens var. poinsettiae, Uromyces trifolii-repentis var. fallens, Uromyces viciae-fabae var. viciae-fabae, Urophlyctis leproides, Urophlyctis trifolii, Urophora cardui, Ustilaginales, Ustilaginoidea virens, Ustilaginomycetes, Ustilago, Ustilago avenae, Ustilago hordei, Ustilago maydis, Ustilago nigra, Ustilago nuda, Ustilago scitaminea, Ustilago tritici, Valsa abietis, Valsa ambiens, Val sa auerswaldii, Valsa ceratosperma, Valsa kunzei, Valsa nivea, Valsa sordida, Valsaria insitiva, Venturia carpophila, Venturia inaequalis, Venturia pirina, Venturia pyrina, Veronaea musae, Verticillium, Verticillium albo-atrum, Verticillium albo-atrum var. menthae, Verticillium dahliae, Verticillium longisporum, Verticillium theobromae, Villosiclava virens, Virescence, Waitea circinata, Wuestneiopsis Georgiana, Xanthomonas ampelina, Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Xanthomonas campestris pv. campestris, Xanthomonas oryzae, a, Zygosaccharomyces bailii and Zygosaccharomyces florentinus.

[00126] Os patógenos de insetos e larvas incluem Acalymma, Acyrthosiphon pisum, largarta do cartucho africana, abelha africanizada, Agromyzidae, Agrotis munda, Agrotis porphyricollis, Aleurocanthus woglumi, Aleyrodes proletella, Alphitobius diaperinus, Altica chalybea, Anasa tristis, Anguina tritici, Anisoplia austriaca, Anthonomus pomorum, Anthonomus signatus, Aonidiella aurantii, Apamea apamiformis, Apamea niveivenosa, Aphelenchoides spp., aphid, Aphis gossypii, apple maggot, formiga argentina, Euxoa auxiliaris, Arotrophora arcuatalis, Asterolecanium coffeae, Athous haemorrhoidalis, Aulacophora, praga de gafanhotos australiana, Bactericera cockerelli, Bactrocera, Bactrocera correcta, Bagrada hilaris, broca listrada da nogueira, lagarta militar da beterraba, Belonolaimus spp., pulgão do feijão, Blepharidopterus chlorionis, mariposa Bogon, bicudo-do-algodoeiro, Bradysia similigibbosa, mosquito da vagem Brassica, Brevicoryne brassicae, gafanhoto marrom, percevejo da sementes de soja, Fulguroidea marrom, Bursephelenchus spp., mariposa do repolho, lagarta do repolho, Callosobruchus maculatus, besouro-da-cana, mosca da cenousa, nemátodo de cisto de cereal, Cecidomyiidae, Ceratitis capitata, Ceratitis rosa, besouro de folha de cereal, Chlorops pumilionis, escaravelho dos citros, Coccus viridis, lagarta, broca-do-café, besouro- da-batata, gorgulho confuso da farinha, crambus, besouro do pepino, Curculio nucum, Curculio occidentis, lagarta-rosca, Cyclocephala borealis, Agrotis ipsilon, Coccotrypes dactyliperda, Delia spp., Delia antiqua, Delia floralis, Delia radicum, Desert locust, Diabrotica, Diabrotica balteata, Diabrotica speciosa, traça das crucíferas, Diaphania indica, Diaphania nitidalis, Diaphorina citri, Diaprepes abbreviatus, Diatraea saccharalis, gafanhoto diferencial, Ditylenchus spp., Dociostaurus maroccanus, Drosophila suzukii, Dryocosmus kuriphilus, Earias perhuegeli, Epicauta vittata, Epilachna varivestis, Erionota thrax, Eriosomatinae, Euleia heraclei, Eumetopina flavipes, Eupoecilia ambiguella, broca europeia do milho, Eurydema oleracea, Eurygaster integriceps, Pentatoma rufipes, Frankliniella tritici, Galleria mellonella, Euxoa nigricans, cigarrinha, mosca branca das estufas, Gryllotalpa orientalis, Gryllus pennsylvanicus, mariposa-cigana, Helicoverpa armigera, Helicoverpa gelotopoeon, Helicoverpa punctigera, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Henosepilachna vigintioctopunctata, Hessian fly, Heterodera spp., Jacobiasca formosana, besouro japonês, besouro Khapra, Lampides boeticus, minador, Lepidiota consobrina, Lepidosaphes beckii, Lepidosaphes ulmi, Leptoglossus zonatus, Leptopterna dolabrata, Achroia grisella, Leucoptera (mariposa), Leucoptera caffeina, mariposa-das-maçãs, Lissorhoptrus oryzophilus, long-tailed Skipper, Lygus, Lygus hesperus, Maconellicoccus hirsutus, Macrodactylus subspinosus, Macrosiphum euphorbiae, gorgulho-do-milho, Manduca sexta, Mayetiola hordei, Mealybug, Meloidogyne spp., Megacopta cribraria, Metcalfa pruinosa, mariposas, Acrolepiopsis assectella, Myzus persicae, Naccobus spp., Nezara viridula, processionário do carvalho, mosca-da-azeitona, Ophiomyia simplex, Opisina arenosella, Opomyza, Opomyza florum, Opomyzidae, Oscinella frit, Ostrinia furnacalis, Oxycarenus hyalinipennis, Paracoccus marginatus, Papilio demodocus, Paratachardina pseudolobata, Pentatomoidea, Phthorimaea operculella, Phyllophaga, Phylloxera, Phylloxeridae, Phylloxeroidea, Pieris brassicae, pink bollworm, Planococcus citri, Platynota idaeusalis, Plum curculio, Pratylenchus spp., Prionus californicus, Pseudococcus viburni, Pyralis farinalis, formiga-de-fogo, gafanhoto vermelho, nemátodos de raízes, nemátodo de nódulos radiculares, Radopholus spp., Rotylenchulus spp., Rhagoletis cerasi, Rhagoletis indifferens, Rhagoletis mendax, Rhopalosiphum maidis, Rhyacionia frustrana, Rhynchophorus ferrugineus, Rhynchophorus palmarum, Rhyzopertha, mariposa do arroz, percevejo do arroz, afídeo russo do trigo, escala de San Jose, Coccoidea, Schistocerca americana, Sciaridae, Scirtothrips dorsalis, Scutelleridae, Scutiphora pedicellata, Anguina tritici, bicho mineiro, mosca-branca-da-folha-prateada, Sipha flava, pequeno besouro das colmeias, broca do milho do sudoeste, afídeo da sementes de soja, Spodoptera cilium, Spodoptera litura, besouro do pepino manchado, broca da abóbora, nemátodos dos caules, Stenotus binotatus, Strauzia longipennis, pulga listrada, percevejos-escudo, besoudo da batata doce, Lygus lineolaris, tisanópteros, Thrips angusticeps, Thrips palmi, Toxoptera citricida, Trichodorus spp., Trioza erytreae, Agrotis segetum, Tuta absoluta, Tylenchulus spp., vários percevejos de carpete, Virachola isocrates, Galleria mellonella, crisomelídeo do milho, tripes Frankliniella occidentalis, mosca do trigo, gorgulho do trigo, mosca branca, mariposa do inverno e Xiphenema spp.[00126] Insect and larval pathogens include Acalymma, Acyrthosiphon pisum, African armyworm, Africanized bee, Agromyzidae, Agrotis munda, Agrotis porphyricollis, Aleurocanthus woglumi, Aleyrodes proletella, Alphitobius diaperinus, Altica chalybea, Anasa tristis, Anguina tritici, Anisoplia austriaca, Anthonomus pomorum, Anthonomus signatus, Aonidiella aurantii, Apamea apamiformis, Apamea niveivenosa, Aphelenchoides spp., aphid, Aphis gossypii, apple maggot, Argentine ant, Euxoa auxiliaris, Arotrophora arcuatalis, Asterolecanium coffeae, Athous haemorrhoidalis, Aulacophora, Australian locust plague , Bactericera cockerelli, Bactrocera, Bactrocera correcta, Bagrada hilaris, striped walnut borer, beet armyworm, Belonolaimus spp., bean aphid, Blepharidopterus chlorionis, Bogon moth, boll weevil, Bradysia similigibbosa, Brassica pod midge, Brevicoryne brassicae, brown grasshopper, soybean bug, brown Fulguroidea, Bursephelenchus spp., cabbage moth, cabbage caterpillar, Callosobruchus maculatus, sugarcane beetle, carrot fly, cereal cyst nematode, Cecidomyiidae, Ceratitis capitata , Ceratitis rosa, cereal leaf beetle, Chlorops pumilionis, citrus beetle, Coccus viridis, caterpillar, coffee borer, potato beetle, confused flour weevil, crambus, cucumber beetle, Curculio nucum, Curculio occidentis , screwworm, Cyclocephala borealis, Agrotis ipsilon, Coccotrypes dactyliperda, Delia spp., Delia antiqua, Delia floralis, Delia radicum, Desert locust, Diabrotica, Diabrotica balteata, Diabrotica speciosa, diamondback moth, Diaphania indica, Diaphania nitidalis, Diaphorina citri , Diaprepes abbreviatus, Diatraea saccharalis, differential grasshopper, Ditylenchus spp., Dociostaurus maroccanus, Drosophila suzukii, Dryocosmus kuriphilus, Earias perhuegeli, Epicauta vittata, Epilachna varivestis, Erionota thrax, Eriosomatinae, Euleia heraclei, Eumetopina flavipes, Eupoecilia ambiguella , European corn borer , Eurydema oleracea, Eurygaster integriceps, Pentatoma rufipes, Frankliniella tritici, Galleria mellonella, Euxoa nigricans, leafhopper, greenhouse whitefly, Gryllotalpa orientalis, Gryllus pennsylvanicus, gypsy moth, Helicoverpa armigera, Helicoverpa icetopoeon, Helicoverpa punctigera, Helicoverpa zea, Heliothis virescens , Henosepilachna vigintioctopunctata, Hessian fly, Heterodera spp., Jacobiasca formosana, Japanese beetle, Khapra beetle, Lampides boeticus, leafminer, Lepidiota consobrina, Lepidosaphes beckii, Lepidosaphes ulmi, Leptoglossus zonatus, Leptopterna dolabrata, Achroia grisella, Leucoptera (moth), Leuco caffeina ptera , apple moth, Lissorhoptrus oryzophilus, long-tailed Skipper, Lygus, Lygus hesperus, Maconellicoccus hirsutus, Macrodactylus subspinosus, Macrosiphum euphorbiae, corn weevil, Manduca sexta, Mayetiola hordei, Mealybug, Meloidogyne spp., Megacopta cribraria, Metcalfa pruinosa, moths, Acrolepiopsis assectella, Myzus persicae, Naccobus spp., Nezara viridula, oak processionary, olive fly, Ophiomyia simplex, Opisina arenosella, Opomyza, Opomyza florum, Opomyzidae, Oscinella frit, Ostrinia furnacalis, Oxycarenus hyalinipennis, Paracoccus marginatus, Papilio demodocus, Paratachardina pseudolobata, Pentatomoidea, Phthorimaea operculella, Phyllophaga, Phylloxera, Phylloxeridae, Phylloxeroidea, Pieris brassicae, pink bollworm, Planococcus citri, Platynota idaeusalis, Plum curculio, Pratylenchus spp., Prionus californicus, Pseu dococcus viburni, Pyralis farinalis, fire ant, red grasshopper, root nematodes, root knot nematode, Radopholus spp., Rotylenchulus spp., Rhagoletis cerasi, Rhagoletis indifferens, Rhagoletis mendax, Rhopalosiphum maidis, Rhyacionia frustrationna, Rhynchophorus ferrugineus, Rhynchophorus palmarum, Rhyzopertha, marip osa rice bug, rice stink bug, Russian wheat aphid, San Jose scale, Coccoidea, Schistocerca americana, Sciaridae, Scirtothrips dorsalis, Scutelleridae, Scutiphora pedicellata, Anguina tritici, leaf miner, silverleaf whitefly, Sipha flava , small hive beetle, southwestern corn borer, soybean aphid, Spodoptera cilium, Spodoptera litura, spotted cucumber beetle, pumpkin borer, stem nematodes, Stenotus binotatus, Strauzia longipennis, striped flea, shield bugs, sweet potato beetle, Lygus lineolaris, tisanoptera, Thrips angusticeps, Thrips palmi, Toxoptera citricida, Trichodorus spp., Trioza erytreae, Agrotis segetum, Tuta absolute, Tylenchulus spp., various carpet bugs, Virachola isocrates, Galleria mellonella, corn chrysomelid , thrips Frankliniella occidentalis, wheat fly, wheat weevil, whitefly, winter moth and Xiphenema spp.

[00127] Por exemplo, o patógeno de inseto ou larva pode ser uma lagarta de cereais, lagarta-rosca, broca de milho europeia, lagarta-do- cartucho-do-milho, besouro japonês, lagarta-elasmo, gorgulho, verme da semente do milho, lagarta-elasmo do sul, Diabrotica de milho do sul, larva os elaterídeos da batata do sul, Papaipema nebris, besouro-da- cana, Dermolepida albohirtum, larvas de folhas, bicudo-do-algodoeiro, lagarta-do-cartucho com listras amarelas, Oulema melanopus, Blissus leucopterus, afídeos, lagarta-do-cartucho-da-beterraba, Epilachna varivestis, lagarta-falsa-medideira-de-soja, Dectes texanus ou combinações destes.[00127] For example, the insect pathogen or larva may be a bollworm, cutworm, European corn borer, fall armyworm, Japanese beetle, elasm caterpillar, weevil, seed worm corn bollworm, southern elasm caterpillar, southern corn Diabrotica, southern potato elaterid larvae, Papaipema nebris, sugarcane beetle, Dermolepida albohirtum, leaf maggots, boll weevil, fall armyworm yellow-striped, Oulema melanopus, Blissus leucopterus, aphids, beet armyworm, Epilachna varivestis, soybean leafworm, Dectes texanus or combinations thereof.

[00128] Proteínas e peptídeos que aumentam a resistência a estresse nas plantas.[00128] Proteins and peptides that increase stress resistance in plants.

[00129] A invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreender uma sequência de escolha, proteína do exosporium, ou fragmento da proteína do exosporium, e pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumenta a resistência a estresse em um vegetal.[00129] The invention also relates to fusion proteins that comprise a sequence of choice, exosporium protein, or exosporium protein fragment, and at least one protein or peptide that increases stress resistance in a vegetable.

[00130] Por exemplo, a proteína ou peptídeo que aumenta a resistência a estresse em um vegetal compreende uma enzima que degrada um composto relacionado a estresse. Os compostos relacionados a estresse incluem, mas não se limitam a, ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), espécie de oxigênio reativo, óxido nítrico, oxilipinas e fenólicos. A espécie de oxigênio reativo específica inclui hidroxil, hidrogênio, peróxido, oxigênio e superóxido. A enzima que degrada um composto relacionado a estresse pode compreender uma dismutase de superóxido, uma oxidase, uma catalase, uma deaminase de ácido aminoccropano-1-carboxílico, uma peroxidase, uma enzima antioxidante ou um peptídeo antioxidante.[00130] For example, the protein or peptide that increases stress resistance in a vegetable comprises an enzyme that degrades a stress-related compound. Stress-related compounds include, but are not limited to, aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC), reactive oxygen species, nitric oxide, oxylipins, and phenolics. The specific reactive oxygen species includes hydroxyl, hydrogen, peroxide, oxygen and superoxide. The enzyme that degrades a stress-related compound may comprise a superoxide dismutase, an oxidase, a catalase, an aminocropan-1-carboxylic acid deaminase, a peroxidase, an antioxidant enzyme or an antioxidant peptide.

[00131] A proteína ou peptídeo que aumenta a resistência a estresse em um vegetal pode compreender ainda uma proteína ou um peptídeo que protege um vegetal da estresse ambiental. A estresse ambiental pode compreender, por exemplo, seca, enchente, aquecimento, congelamento, sal, metais pesados, pH baixo, pH alto ou uma combinação destes. Por exemplo, a proteína ou o peptídeo que protege um vegetal de uma estresse ambiental pode compreender uma proteína de nucleação de gelo, uma prolinase, uma liase de amônia de fenilalanina, uma sintase de isocorismato, uma liase de piruvato de isocorismato ou uma dehidrogenase de colina.[00131] The protein or peptide that increases stress resistance in a vegetable can further comprise a protein or peptide that protects a vegetable from environmental stress. Environmental stress may include, for example, drought, flooding, warming, freezing, salt, heavy metals, low pH, high pH, or a combination of these. For example, the protein or peptide that protects a vegetable from an environmental stress may comprise an ice nucleation protein, a prolinase, a phenylalanine ammonium lyase, an isochorismate synthase, an isochorismate pyruvate lyase, or an isochorismate dehydrogenase. hill.

Plant binding peptides and proteins

[00132] A invenção relaciona-se também a proteínas de fusão que compreender uma sequência de escolha, proteína do exosporium, ou fragmento da proteína do exosporium e pelo menos uma proteína ou peptídeo vegetal. A proteína ou peptídeo de ligação vegetal pode ser qualquer proteína ou peptídeo que seja capaz de ligar-se especificamente ou não-especificamente a qualquer parte de um vegetal (por exemplo, uma raiz de um vegetal ou uma parte aérea de um vegetal, como uma folha, um caule, uma flor ou uma fruta) ou um material de origem vegetal. Assim, por exemplo, o peptídeo ou proteína de ligação vegetal pode ser um peptídeo ou uma proteína de ligação de raiz, ou um peptídeo ou uma proteína de ligação de folha.[00132] The invention also relates to fusion proteins that comprise a sequence of choice, exosporium protein, or exosporium protein fragment and at least one plant protein or peptide. The plant-binding protein or peptide can be any protein or peptide that is capable of binding specifically or non-specifically to any part of a vegetable (e.g., a root of a vegetable or an aerial part of a vegetable, such as a leaf, stem, flower or fruit) or material of plant origin. Thus, for example, the plant binding peptide or protein may be a root binding peptide or protein, or a leaf binding peptide or protein.

[00133] Os peptídeos e as proteínas de ligação vegetal apropriados incluem adesinas (por exemplo, ricadesina), flagelinas, omptinas, lectinas, expansinas, proteínas estruturais de biopelícula (por exemplo, TasA ou YuaB), proteínas pilus, proteínas curlus, intiminas, invasinas, aglutininas e proteínas afimbriais.[00133] Suitable plant binding peptides and proteins include adhesins (e.g., ricadhesin), flagellins, omptins, lectins, expansins, biofilm structural proteins (e.g., TasA or YuaB), pilus proteins, curlus proteins, intimins, invasins, agglutinins and afimbrial proteins.

Other fusion proteins

[00134] A presente invenção relaciona-se ainda a proteínas de fusão que compreendem pelo menos uma proteína ou peptídeo de interesse e proteína de exosporium compreendendo uma proteína exosporium compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 71, 75, 80, 81, 82, 83 e 84. Alternativamente, a proteína de exosporium pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 71, 75, 80, 81, 82, 83 e 84.[00134] The present invention further relates to fusion proteins comprising at least one protein or peptide of interest and exosporium protein comprising an exosporium protein comprising an amino acid sequence having at least 85% identity with any of SEQ ID NOs: 71, 75, 80, 81, 82, 83 and 84. Alternatively, the exosporium protein may comprise an amino acid sequence that is at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99% or at least 100% identity with any of the SEQ ID NOs: 71, 75, 80, 81, 82, 83 and 84.

[00135] A proteína ou peptídeo de interesse pode compreender qualquer proteína ou peptídeo. Por exemplo, a proteína ou peptídeo de interesse pode compreender quaisquer das proteínas ou peptídeos descritos aqui. Por exemplo, a proteína ou peptídeo de interesse pode compreender qualquer uma das proteínas ou peptídeos estimulantes de crescimento da planta descritos aqui, qualquer das proteínas ou peptídeos que protegem um vegetal de um patógeno descritos aqui, qualquer proteína ou peptídeo que aumente a resistência a estresse em um vegetal descritos aqui ou qualquer planta ou peptídeo de ligação vegetal descritos aqui.[00135] The protein or peptide of interest can comprise any protein or peptide. For example, the protein or peptide of interest may comprise any of the proteins or peptides described herein. For example, the protein or peptide of interest may comprise any of the plant growth-stimulating proteins or peptides described herein, any of the proteins or peptides that protect a plant from a pathogen described herein, any protein or peptide that increases resistance to stress in a plant described herein or any plant or plant-binding peptide described herein.

[00136] Assim, onde a proteína ou peptídeo de interesse compreende uma proteína ou peptídeo estimulantes de crescimento da planta, o peptídeo ou proteína estimulantes de crescimento da planta podem compreender um hormônio de peptídeo, um peptídeo não- hormonal ou uma enzina envolvida na produção ou ativação de um composto estimulador de crescimento da planta. De modo alternativo, a proteína ou peptídeo estimulantes de crescimento da planta podem compreender qualquer enzina que degrade ou modifique uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutriente vegetal descrita a partir de então.[00136] Thus, where the protein or peptide of interest comprises a plant growth-stimulating protein or peptide, the plant growth-stimulating peptide or protein may comprise a peptide hormone, a non-hormonal peptide or an enzyme involved in the production or activation of a plant growth-stimulating compound. Alternatively, the plant growth-stimulating protein or peptide may comprise any enzyme that degrades or modifies a bacterial, fungal or plant nutrient source described hereinafter.

Recombinant Bacillus cereus family members expressing fusion proteins

[00137] A presente invenção também se relaciona a um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão. A proteína da fusão pode ser qualquer uma dentre as proteínas de fusão discutidas acima.[00137] The present invention also relates to a member of the recombinant Bacillus cereus family that expresses a fusion protein. The fusion protein can be any of the fusion proteins discussed above.

[00138] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode coexpressar duas ou mais de qualquer uma dentre as proteínas de fusão discutidas acima. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode coexpressar pelo menos uma proteína de fusão que compreende uma proteína ou peptídeo de ligação vegetal, juntamente com pelo menos uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo estimulantes de crescimento vegetal, pelo menos uma proteína de fusão compreendendo uma proteína ou peptídeo que protegem um vegetal de um patógeno ou pelo menos uma proteína ou peptídeo que aumentam a resistência a estresse em um vegetal.[00138] The recombinant Bacillus cereus family member can coexpress two or more of any of the fusion proteins discussed above. For example, the recombinant Bacillus cereus family member may coexpress at least one fusion protein comprising a plant binding protein or peptide, together with at least one fusion protein comprising a plant growth stimulating protein or peptide, at least one fusion comprising a protein or peptide that protects a vegetable from a pathogen or at least one protein or peptide that increases stress resistance in a vegetable.

[00139] O membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacilluspseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillusgaemokensis, Bacillus weihenstephensis ou uma combinação destes. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseudomycoides ou Bacillus mycoides. Em especial, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender Bacillus thuringiensis ou Bacillus mycoides.[00139] The recombinant Bacillus cereus family member may comprise Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacilluspseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillusgaemokensis, Bacillus weihenstephensis or a combination thereof. For example, the recombinant Bacillus cereus family member may comprise Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseudomycoides or Bacillus mycoides. In particular, the recombinant Bacillus cereus family member may comprise Bacillus thuringiensis or Bacillus mycoides.

[00140] Para gerar um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão, qualquer membro da família Bacillus cereus pode ser conjugado, transduzido ou transformado com um vetor que codifica a proteína de fusão usando métodos padrão conhecidos na técnica (por exemplo, por eletroporação). As bactérias podem então ser selecionadas para identificar transformantes por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, onde o vetor inclui um gene de resistência a antibiótico, a bactéria pode ser triada para resistência a antibiótico. Alternativamente, o DNA que codifica a proteína de fusão pode ser integrado ao DNA cromossômico de um hospedeiro de um membro da família B. cereus. O membro da família Bacillus cereus recombinante pode então ser exposto a condições que induzirão a esporulação. As condições apropriadas para induzir a esporulação são conhecidas na técnica. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode ser laminado em lâminas de ágar e incubado a uma temperatura de cerca de 30°C por vários dias (por exemplo, por 3 dias).[00140] To generate a recombinant Bacillus cereus family member that expresses a fusion protein, any member of the Bacillus cereus family can be conjugated, transduced or transformed with a vector encoding the fusion protein using standard methods known in the art (e.g. , by electroporation). Bacteria can then be selected to identify transformants by any method known in the art. For example, where the vector includes an antibiotic resistance gene, the bacteria can be screened for antibiotic resistance. Alternatively, the DNA encoding the fusion protein can be integrated into the chromosomal DNA of a host from a member of the B. cereus family. The recombinant Bacillus cereus family member can then be exposed to conditions that will induce sporulation. Appropriate conditions for inducing sporulation are known in the art. For example, the recombinant Bacillus cereus family member can be plated on agar slides and incubated at a temperature of about 30°C for several days (e.g., for 3 days).

[00141] As cepas tóxicas, as cepas não-tóxicas ou as cepas geneticamente manipuladas de qualquer uma das espécies acima podem também ser usadas de maneira apropriada. Por exemplo, um Bacillus thuringiensis sem a critoxina pode ser usado. Alternativamente, ou adicionalmente, uma vez que os esportos da família B. cereus recombinante expressando a proteína de fusão tiverem sido gerados, eles podem ser desativados a fim de evitar novas germinações quando estiver em uso. Qualquer método para desativar os esporos bacterianos que seja conhecido na técnica pode ser usado. Os métodos apropriados incluem, sem limitação, tratamento de calor, irradiação gama, irradiação de raio-x, irradiação UV-A, irradiação UV-B, tratamento químico (por exemplo, tratamento com gluteraldeído, formaldeído, peróxido de hidrogênio, ácido acético, alvejante ou qualquer combinação destes) ou uma combinação destes. Alternativamente, os esporos derivados de cepas não-toxigênicas, ou cepas geneticamente ou fisicamente desativadas, podem ser usados.[00141] Toxic strains, non-toxic strains or genetically manipulated strains of any of the above species can also be used appropriately. For example, a Bacillus thuringiensis without the crytoxin can be used. Alternatively, or additionally, once recombinant B. cereus family sports expressing the fusion protein have been generated, they can be deactivated in order to prevent further germination when in use. Any method for deactivating bacterial spores that is known in the art can be used. Suitable methods include, without limitation, heat treatment, gamma irradiation, x-ray irradiation, UV-A irradiation, UV-B irradiation, chemical treatment (e.g., treatment with gluteraldehyde, formaldehyde, hydrogen peroxide, acetic acid, bleach or any combination thereof) or a combination thereof. Alternatively, spores derived from non-toxigenic strains, or genetically or physically inactivated strains, can be used.

Recombinant Bacillus cereus family members that have plant growth-promoting effects and/or beneficial attributes

[00142] Muitos membros das cepas dos membros da família Bacillus cereus possuem atributos benéficos inerentes. Por exemplo, algumas cepas possuem efeitos de promoção de crescimento vegetal. Algumas das proteínas da fusão descritas aqui poder ser expressadas nessas cepas.[00142] Many members of strains of members of the Bacillus cereus family have inherent beneficial attributes. For example, some strains have plant growth-promoting effects. Some of the fusion proteins described here may be expressed in these strains.

[00143] Por exemplo, o membro da família Bacillus cereusrecombinante pode compreender uma cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria.[00143] For example, the recombinant Bacillus cereus family member may comprise a plant growth-promoting strain of the bacteria.

[00144] A cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria pode compreender uma cepa da bactéria que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma critoxina), produz um composto fungicida (por exemplo, uma ß-1,3-glucanase, uma quitosinase, uma liticase ou uma combinação destes), produz um composto nematocida (por exemplo, uma critoxina), produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se às raízes da planta, coloniza as raízes da planta, forma biopelículas, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou uma combinação destes.[00144] The plant growth-promoting strain of bacteria may comprise a strain of the bacteria that produces an insecticidal toxin (e.g., a krytoxin), produces a fungicidal compound (e.g., a ß-1,3-glucanase, a chitosinase , a lyticase or a combination thereof), produces a nematocidal compound (e.g., a krytoxin), produces a bactericidal compound, is resistant to one or more antibiotics, comprises one or more freely replicating plasmids, binds to plant roots , colonizes plant roots, forms biofilms, solubilizes nutrients, secretes organic acids or a combination of these.

[00145] Por exemplo, onde o membro da família Bacillus cereus recombinante compreende uma cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria, a cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria pode compreender Bacillus mycoides BT155 (NRRL n° B- 50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL n° B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL n° B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL n° B-50922), o membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL n° B- 50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL n° B-50924) ou membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL n° B-50928). Cada uma dessas cepas foi depositada com o United StatesDepartment of Agriculture (USDA) Agricultural ResearchService (ARS), com o endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 EUA, em 10 de março de 2014, e é identificado pelo número de depósito NRRL fornecido em parêntese.[00145] For example, where the recombinant Bacillus cereus family member comprises a plant growth-promoting strain of the bacteria, the plant growth-promoting strain of the bacteria may comprise Bacillus mycoides BT155 (NRRL No. B-50921), Bacillus mycoides EE118 (NRRL no. B-50918), Bacillus mycoides EE141 (NRRL no. B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL no. B-50922), the Bacillus cereus family member EE128 (NRRL no. B- 50917 ), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL no. B-50924) or Bacillus cereus family member EE349 (NRRL no. B-50928). Each of these strains was deposited with the United StatesDepartment of Agriculture (USDA) Agricultural ResearchService (ARS), at 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604 USA, on March 10, 2014, and is identified by the deposit number NRRL given in parenthesis.

[00146] Essas cepas de promoção de crescimento vegetal foram isoladas das rizosferas de várias plantas vigorosas e foram identificadas por suas sequências de 16S rRNA (fornecidas aqui como SEQ ID NOs. 104-110), e através de análises bioquímicas. As cepas foram identificadas pelo menos à sua designação de gênero por meio de indicadores morfológicos e bioquímicos convencionais. As análises bioquímicas para as cepas Gram-positivas confirmadas, como Bacillus , incluíram crescimento em meio de PEA e ágar nutriente, examinação microscópica, crescimento em meio de 5% e 7,5% de NaCl, crescimento em pH 5 e pH 9, crescimento a 42°C e 50°C, a capacidade de produzir ácido a partir da fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glicose, sucarose, d-manitol e amido; produção de pigmento fluorescente, hidrólise de gelatina, redução de nitrato; produção de catalase, hidrólise de amido; reação de oxidase; produção de urease e motilidade. A identificação dessas cepas e a demonstração de seus efeitos de promoção de crescimento vegetal são descritos com mais detalhes nos exemplos abaixo.[00146] These plant growth-promoting strains were isolated from the rhizospheres of several vigorous plants and were identified by their 16S rRNA sequences (provided here as SEQ ID NOs. 104-110), and through biochemical analysis. Strains were identified to at least their genus designation using conventional morphological and biochemical indicators. Biochemical analyzes for confirmed Gram-positive strains, such as Bacillus, included growth on PEA and nutrient agar media, microscopic examination, growth on 5% and 7.5% NaCl media, growth on pH 5 and pH 9, growth at 42°C and 50°C, the ability to produce acid from fermentation with cellobiose, lactose, glycerol, glucose, sucrose, d-mannitol and starch; fluorescent pigment production, gelatin hydrolysis, nitrate reduction; catalase production, starch hydrolysis; oxidase reaction; urease production and motility. The identification of these strains and the demonstration of their plant growth-promoting effects are described in more detail in the examples below.

[00147] Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante compreendendo uma cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria pode compreenderBacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141 ou Bacillus thuringiensis BT013A. O membro da família Bacillus cereus recombinante pode expressar qualquer uma das proteínas de fusão descritas aqui, por exemplo, a proteína de fusão que compreende a sequência de escolha do SEQ ID NO: 60 e um peptídeo não-hormonal (por exemplo, um inibidor de tripsina kunitz (KTI)), uma enzina envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento vegetal (por exemplo, uma quitosinase), um peptídeo ou proteína de ligação vegetal (por exemplo, TasA); uma proteína ou peptídeo que protegem um vegetal de um patógeno (por exemplo, TasA) ou uma enzina que degrada ou modifica a fonte bacteriana, fúngica ou nutriente vegetal (por exemplo, uma fosfatase, como PhoA ou fitase ou uma endoglucanase).[00147] For example, the recombinant Bacillus cereus family member comprising a plant growth-promoting strain of the bacteria may comprise Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141 or Bacillus thuringiensis BT013A. The recombinant Bacillus cereus family member can express any of the fusion proteins described herein, for example, the fusion protein comprising the sequence of choice of SEQ ID NO: 60 and a non-hormonal peptide (e.g., an inhibitor of kunitz trypsin (KTI)), an enzyme involved in the production or activation of a plant growth-stimulating compound (e.g., a chitosinase), a plant-binding peptide or protein (e.g., TasA); a protein or peptide that protects a plant from a pathogen (e.g., TasA) or an enzyme that degrades or modifies the bacterial, fungal, or plant nutrient source (e.g., a phosphatase such as PhoA or phytase or an endoglucanase).

Promoters

[00148] Em qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descritos aqui, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um promotor que é nativo para a sequência de escolha, para a proteína de exosporium ou para o fragmento da proteína de exosporium da proteína de fusão. Por exemplo, onde a proteína de fusão compreende uma sequência de escolha derivada do B. anthracis Sterne BclA (por exemplo, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 60) ou onde a proteína de fusão compreende o BclA de comprimento total (SEQ ID NO: 2) ou um fragmento do BclA de comprimento total (por exemplo, SEQ ID NO: 59), a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um promotor que é nominalmente associado ao gene BclA no genoma do B. anthracis Sterne (por exemplo, o promotor da SEQ ID NO: 85).[00148] In any of the recombinant Bacillus cereus family members described here, the fusion protein can be expressed under the control of a promoter that is native to the sequence of choice, to the exosporium protein or to the exosporium protein fragment. fusion protein exosporium. For example, where the fusion protein comprises a sequence of choice derived from B. anthracis Sterne BclA (e.g., amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 60) or where the fusion protein comprises full-length BclA (SEQ ID NO: 2) or a fragment of full-length BclA (e.g., SEQ ID NO: 59), the fusion can be expressed under the control of a promoter that is nominally associated with the BclA gene in the B. anthracis Sterne genome (e.g., the promoter of SEQ ID NO: 85).

[00149] Alternativamente, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um Promotor de esporulação de alta expressão. Em alguns casos, o promotor que é nativo para a sequência de escolha, para a proteína de exosporium ou para o fragmento da proteína de exosporium será um Promotor de esporulação de alta expressão. Em outros casos, o promotor que é nativo para a sequência de escolha, para a proteína de exosporium ou para o fragmento da proteína de exosporium será um Promotor de esporulação de alta expressão. Nestes casos, será vantajoso substituir o promotor nativo por um Promotor de esporulação de alta expressão. A expressão da proteína de fusão sob o controle de um Promotor de esporulação de alta expressão proporciona uma expressão aumentada da proteína de fusão no exosporium do membro da família Bacillus cereus.[00149] Alternatively, the fusion protein can be expressed under the control of a high expression sporulation promoter. In some cases, the promoter that is native to the sequence of choice, to the exosporium protein or to the exosporium protein fragment will be a high expression sporulation promoter. In other cases, the promoter that is native to the sequence of choice, to the exosporium protein or to the exosporium protein fragment will be a high expression sporulation promoter. In these cases, it will be advantageous to replace the native promoter with a high expression sporulation promoter. Expression of the fusion protein under the control of a high-expression sporulation promoter provides increased expression of the fusion protein in the exosporium of the Bacillus cereus family member.

[00150] O Promotor de esporulação de alta expressão pode compreender uma ou mais sequências de promotores de polimerase específicos para esporulação de sigma-K.[00150] The High Expression Sporulation Promoter may comprise one or more polymerase promoter sequences specific for sigma-K sporulation.

[00151] Promotores de esporulação de alta expressão apropriados para uso na expressão de proteínas de fusão em um membro da família Bacillus cereus inclui aqueles listados na Tabela 2 abaixo: Tabela 2. Sequências de promotor [00151] High expression sporulation promoters suitable for use in expressing fusion proteins in a member of the Bacillus cereus family include those listed in Table 2 below: Table 2. Promoter sequences

[00152] Nas sequências do promotor listadas na Tabela 2 acima, os locais das sequências de Promotor de polimerase específica para esporulação de sigma-K são indicados por texto em negrito e sublinhado. O Promotor de Cry1A (B. thuringiensis HD-73; SEQ ID NO: 90) tem um total de quatro sequências de sigma-K, duas das quais sobrepõem-se uma a outra, como indicado pelo duplo sublinhado na Tabela 2.[00152] In the promoter sequences listed in Table 2 above, the locations of the sigma-K sporulation-specific polymerase promoter sequences are indicated by bold and underlined text. The Cry1A Promoter (B. thuringiensis HD-73; SEQ ID NO: 90) has a total of four sigma-K sequences, two of which overlap each other, as indicated by the double underlining in Table 2.

[00153] Os promotores de esporulação de alta expressão preferidos para uso na expressão de proteínas de fusão em um membro da família Bacillus cereus incluem o promotor BetA (B. anthracis Sterne; SEQ ID NO: 86), o Promotor de BclA (B. anthracis Sterne; SEQ ID NO: 85), os promotores de óperons de transferase de glicosil do agrupamento BclA 1 e 2 (B. anthracis Sterne; SEQ ID NOs: 101 e 102), e o Promotor de proteína de hélice YVTN ß (B. weihenstephensis KBAB 4; SEQ ID NO: 89).[00153] Preferred high expression sporulation promoters for use in expressing fusion proteins in a member of the Bacillus cereus family include the BetA promoter (B. anthracis Sterne; SEQ ID NO: 86), the BclA Promoter (B. anthracis Sterne; SEQ ID NO: 85), the glycosyl transferase operon promoters of the BclA cluster 1 and 2 (B. anthracis Sterne; SEQ ID NOs: 101 and 102), and the YVTN ß helix protein promoter (B . weihenstephensis KBAB 4; SEQ ID NO: 89).

[00154] Em qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descritos aqui, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de um Promotor de esporulação compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 85-103.[00154] In any of the recombinant Bacillus cereus family members described herein, the fusion protein can be expressed under the control of a Sporulation Promoter comprising a nucleic acid sequence having at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99% or 100% identity with a nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 85-103.

[00155] Quando o Promotor de esporulação compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com uma sequência de ácido nucleico de qualquer uma das SEQ ID NOs: 85-103, a sequência ou as sequências do Promotor de polimerase específica para esporulação de sigma-K têm preferencialmente 100% de identidade com os nucleotídeos correspondentes da SEQ ID NO: 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 ou 103. Por exemplo, como ilustrado na Tabela 2 acima, o Promotor de BclA do B. anthracis Sterne (SEQ ID NO: 85) tem sequências do Promotor de polimerase específica para esporulação de sigma-K nos nucleotídeos 24-32, 35-43 e 129-137. Assim, se o Promotor de esporulação compreender uma sequência tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 85, é preferível que os nucleotídeos do Promotor de esporulação correspondente aos nucleotídeos 24-32, 35-43 e 129-137 da SEQ ID NO: 85 tenham 100% de identidade com os nucleotídeos 24-32, 35-43 e 129-137 da SEQ ID NO: 85.[00155] When the Sporulation Promoter comprising a nucleic acid sequence having at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% identity with a nucleic acid sequence of any of SEQ ID NOs: 85-103, the sequence or sequences of the sigma-K sporulation-specific polymerase Promoter preferably have 100% identity with the corresponding nucleotides of SEQ ID NO: 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 or 103. For example, as illustrated in Table 2 above, the BclA Promoter from B. anthracis Sterne (SEQ ID NO: 85) has polymerase promoter sequences specific for sigma-K sporulation at nucleotides 24-32, 35-43 and 129-137. Thus, if the Sporulation Promoter comprises a sequence having at least 90% identity with the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 85, it is preferred that the Sporulation Promoter nucleotides corresponding to nucleotides 24-32, 35-43 and 129-137 of SEQ ID NO: 85 have 100% identity with nucleotides 24-32, 35-43 and 129-137 of SEQ ID NO: 85.

Formulations

[00156] A presente invenção se relaciona também a formulações que compreendem qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutido na seção anterior e um transportador aceitável agricolamente.[00156] The present invention also relates to formulations comprising any of the members of the recombinant Bacillus cereus family discussed in the previous section and an agriculturally acceptable carrier.

[00157] O transportador aceitável agricolamente pode ser qualquer transportador compatível com o uso agrícola. Por exemplo, os transportadores aceitáveis agricolamente incluem, mas não se limitam a, dispersantes, surfactantes, aditivos, água, espessantes, agentes anti- rachaduras, quebra de resíduo, formulações de compostagem, aplicações granulares, terra diatomácea, óleos, agentes de colorização, estabilizadores, conservantes, polímeros, revestimentos e combinações destes.[00157] The agriculturally acceptable carrier can be any carrier compatible with agricultural use. For example, agriculturally acceptable carriers include, but are not limited to, dispersants, surfactants, additives, water, thickeners, anti-cracking agents, residue breakdown, composting formulations, granular applications, diatomaceous earth, oils, coloring agents, stabilizers, preservatives, polymers, coatings and combinations thereof.

[00158] O aditivo pode compreender um óleo, uma goma, uma resina, uma argila, um glicol de polioxietileno, um terpeno, um orgânico pegajoso, um éster de ácido graxo, um álcool sulfatado, um sulfonato de alquil, um sulfonato de petróleo, um sulfonato de álcool, um diamato de alquil butano de sódio, um poliéster de dioato de tiobutano de sódio, um derivado de acetonitrilo de benzeno, um material proteináceo (por exemplo, um produto derivado do leite, farinha de trigo, farinha de sementes de soja, sangue, albumina, gelatina ou uma combinação destes) ou uma combinação destes.[00158] The additive may comprise an oil, a gum, a resin, a clay, a polyoxyethylene glycol, a terpene, a sticky organic, a fatty acid ester, a sulfated alcohol, an alkyl sulfonate, a petroleum sulfonate , an alcohol sulfonate, a sodium alkyl butane diamate, a sodium thiobutane dioate polyester, an acetonitrile derivative of benzene, a proteinaceous material (e.g., a product derived from milk, wheat flour, seed flour soy, blood, albumin, gelatin or a combination thereof) or a combination thereof.

[00159] O espessante pode compreender uma longa cadeia de alquilsulfonato de glicol de polietileno, um oleato de polioxietileno ou uma combinação destes.[00159] The thickener may comprise a long chain of polyethylene glycol alkylsulfonate, a polyoxyethylene oleate or a combination thereof.

[00160] O surfactante pode compreender um óleo de petróleo pesado, um distilado de petróleo pesado, um éster de ácido graxo de poliol, um éster de ácido graxo polietoxilado, um glicol de aril alquil polioxietileno, um acetado de amina de alquil, um alquil aril sulfonato, um álcool polihídrico, um fosfato de alquil ou uma combinação destes.[00160] The surfactant may comprise a heavy petroleum oil, a heavy petroleum distillate, a polyol fatty acid ester, a polyethoxylated fatty acid ester, an aryl alkyl polyoxyethylene glycol, an alkyl amine acetate, an alkyl aryl sulfonate, a polyhydric alcohol, an alkyl phosphate or a combination thereof.

[00161] O agente antiglutinante compreende um sal de sódio, um carbonato de cálcio, terra diatomácea ou uma combinação destes. Por exemplo, o sal de sódio pode compreender um sal de sódio de sulfonato de monometilnaftaleno, um sal de sódio de sulfonato de dimetilnaftaleno, um sulfito de sódio, um sulfato de sódio ou uma combinação destes.[00161] The anti-caking agent comprises a sodium salt, a calcium carbonate, diatomaceous earth or a combination thereof. For example, the sodium salt may comprise a monomethylnaphthalene sulfonate sodium salt, a dimethylnaphthalene sulfonate sodium salt, a sodium sulfite, a sodium sulfate, or a combination thereof.

[00162] Os transportadores agricolamente aceitáveis apropriados incluem vermiculite, carvão vegetal, lama de prensa de carbonação de indústria açucareira, casca de arroz, celulose de carboximetil, turfa, perlite, areia fina, carbonato de cálcio, farinha, alume, um amido, falco, pirrolidona de polivinil ou uma combinação destes.[00162] Suitable agriculturally acceptable carriers include vermiculite, charcoal, sugar industry carbonation press mud, rice husk, carboxymethyl cellulose, peat, perlite, fine sand, calcium carbonate, flour, alum, a starch, falcon , polyvinyl pyrrolidone or a combination thereof.

[00163] A formulação pode compreender uma formulação de revestimento de semente, uma formulação líquida para aplicação em plantas ou a um meio de crescimento vegetal ou uma formulação sólida para aplicação a plantas ou a um meio de crescimento vegetal.[00163] The formulation may comprise a seed coating formulation, a liquid formulation for application to plants or a plant growth medium or a solid formulation for application to plants or a plant growth medium.

[00164] Por exemplo, a formulação de revestimento de semente pode compreender uma solução aquosa ou à base de óleo para aplicação a sementes. Alternativamente, a formulação de revestimento de semente pode compreender um pó ou uma formulação granular para aplicação a sementes.[00164] For example, the seed coating formulation may comprise an aqueous or oil-based solution for application to seeds. Alternatively, the seed coating formulation may comprise a powder or granular formulation for application to seeds.

[00165] A formulação líquida para a aplicação a vegetais ou a um meio de crescimento vegetal pode compreender uma formulação concentrada ou uma formulação pronta para uso.[00165] The liquid formulation for application to plants or a plant growth medium may comprise a concentrated formulation or a ready-to-use formulation.

[00166] A formulação sólida para aplicação a vegetais ou a um meio de crescimento vegetal pode compreender uma formulação granular ou um agente pulverizador.[00166] The solid formulation for application to plants or a plant growth medium may comprise a granular formulation or a spraying agent.

[00167] Algumas das formulações acima podem também compreender produto agroquímico, por exemplo, um fertilizante, um material fertilizante de micronutriente, uma inseticida, um herbicida, uma emenda de crescimento vegetal, um fungicida, um inseticida, um moluscocida, um algicida, um inoculante bacteriano, um inoculante fúngico ou uma combinação destes.[00167] Some of the above formulations may also comprise an agrochemical product, for example, a fertilizer, a micronutrient fertilizer material, an insecticide, a herbicide, a plant growth amendment, a fungicide, an insecticide, a molluscicide, an algaecide, a bacterial inoculant, a fungal inoculant or a combination thereof.

[00168] O fertilizante pode compreender um fertilizante líquido.[00168] The fertilizer may comprise a liquid fertilizer.

[00169] O fertilizante pode compreender um sulfato de amônio, um nitrato de amônio, um nitrato de sulfato de amônio, um cloreto de amônio, um bissulfato de amônio, um polissulfeto de amônio, um tiossulfato de amônio, uma amônia aquosa, uma amônia anidrosa, um polifosfato de amônio, um sulfato de alumínio, um nitrato de cálcio, um nitrato de amônio de cálcio, um sulfato de cálcio, magnesita calcinada, pedra calcária calcítica, óxido de cálcio, nitrato de cálcio, pedra calcária dolomítica, cal hidratado, carbonato de cálcio, fosfato de diamônio, fosfato de monoamônio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, nitrato de potássio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio de potássio, sulfato de potássio, nitratos de sódio, pedra calcária magnesiana, magnésia, ureia, formaldeídos de ureia, nitrato de amônio de ureia, ureia revestida de enxofre, ureia revestida de polímero, diureia de isobutileno, K2SO4-2MgSO4, cainita, silvinita, quieserita, sais Epsom, enxofre elementar, marga, conchas de ostras, farinha de peixe, bagaços oleaginosos, comida de peixe, farinha de sangue, fosfato de rocha, superfosfatos, entulho, farinha de osso, cinza de madeira, esterco, guano de morcego, turfa, adubo, areia verde, farinha de semente de algodão, farinha de pena, farinha de caranguejo, emulsão de peixe, ácido húmico ou uma combinação destes.[00169] The fertilizer may comprise an ammonium sulfate, an ammonium nitrate, an ammonium sulfate nitrate, an ammonium chloride, an ammonium bisulfate, an ammonium polysulfide, an ammonium thiosulfate, an aqueous ammonia, an ammonia anhydrous, an ammonium polyphosphate, an aluminum sulfate, a calcium nitrate, a calcium ammonium nitrate, a calcium sulfate, calcined magnesite, calcitic limestone, calcium oxide, calcium nitrate, dolomitic limestone, hydrated lime , calcium carbonate, diammonium phosphate, monoammonium phosphate, magnesium nitrate, magnesium sulfate, potassium nitrate, potassium chloride, potassium magnesium sulfate, potassium sulfate, sodium nitrates, magnesian limestone, magnesia, urea , urea formaldehydes, urea ammonium nitrate, sulfur-coated urea, polymer-coated urea, isobutylene diurea, K2SO4-2MgSO4, kainite, sylvinite, kieserite, Epsom salts, elemental sulfur, marl, oyster shells, fish meal , oilcake, fish food, blood meal, rock phosphate, superphosphates, rubble, bone meal, wood ash, manure, bat guano, peat, compost, green sand, cottonseed meal, feather meal , crab meal, fish emulsion, humic acid or a combination of these.

[00170] O material fertilizante de micronutriente pode compreender um ácido bórico, um borato, um boro frito, um sulfato de cobre, uma frita de cobre, um quelato de cobre, um decahidrato tetraborato de sódio, um sulfato de ferro, um óxido de ferro, um sulfato de amônio de ferro, uma frita de ferro, um quelato de ferro, um sulfato de manganês, um óxido de manganês, um quelato de manganês, um cloreto de manganês, uma frita de manganês, um molibdato de sódio, um ácido molíbdico, um sulfato de zinco, um óxido de zinco, um carbonato de zinco, uma frita de zinco, um fosfato de zinco, um quelato de zinco ou uma combinação destes.[00170] The micronutrient fertilizer material may comprise a boric acid, a borate, a boron frit, a copper sulfate, a copper frit, a copper chelate, a sodium tetraborate decahydrate, an iron sulfate, a iron, an iron ammonium sulfate, an iron frit, an iron chelate, a manganese sulfate, a manganese oxide, a manganese chelate, a manganese chloride, a manganese frit, a sodium molybdate, a molybdic acid, a zinc sulfate, a zinc oxide, a zinc carbonate, a zinc frit, a zinc phosphate, a zinc chelate or a combination thereof.

[00171] O insecticida pode compreender um organofosfato, um carbamato, um piretroide, uma acaricida, um ftalato de alquil, um ácido bórico, um borato, um fluorídeo, uma ureia substituída com um haloaromático, um éster de hidrocarboneto, uma inseticida de base biológica ou uma combinação destes.[00171] The insecticide may comprise an organophosphate, a carbamate, a pyrethroid, an acaricide, an alkyl phthalate, a boric acid, a borate, a fluoride, a urea substituted with a haloaromatic, a hydrocarbon ester, a base insecticide biological or a combination of these.

[00172] O herbicida pode compreender um composto clorofenóxi, um composto nitrofenólico, um composto nitrocresólico, um composto de dipiridil, uma acetamida, um ácido alifático, uma anilida, uma benzamida, um ácido benzoico, um derivado do ácido benzoico, um ácido anísico, um derivado de ácido anísico, um benzonitrilo, um dióxido de benzotiadiazinona, um tiocarbamato, um carbamato, um carbanilato, um cloropiridinil, um derivado da ciclohexenona, um derivado do dinitroaminobenzeno, um composto de fluorodinitrotoluidina, uma isoxazolidinona, um ácido nicotínico, uma isopropilamina, derivados da isopropilamina, oxadiazolinona, um fosfato, um ftalato, um composto de ácido picolínico, uma triazina, um triazol, um uracil, um derivado de ureia, endotal, clorato de sódio ou uma combinação destes.[00172] The herbicide may comprise a chlorophenoxy compound, a nitrophenolic compound, a nitrocresolic compound, a dipyridyl compound, an acetamide, an aliphatic acid, an anilide, a benzamide, a benzoic acid, a benzoic acid derivative, an anisic acid , an anisic acid derivative, a benzonitrile, a benzothidiazinone dioxide, a thiocarbamate, a carbamate, a carbanylate, a chloropyridinyl, a cyclohexenone derivative, a dinitroaminobenzene derivative, a fluorodinitrotoluidine compound, an isoxazolidinone, a nicotinic acid, a isopropylamine, isopropylamine derivatives, oxadiazolinone, a phosphate, a phthalate, a picolinic acid compound, a triazine, a triazole, a uracil, a urea derivative, endothal, sodium chlorate or a combination thereof.

[00173] O fungicida pode compreender um benzeno substituído, um tiocarbamato, um etileno bis ditiocarbamato, uma tioftalidamida, um composto de cobre, um composto de organomercúrio, um composto de organotina, um composto de cádmio, uma anilazina, benomil, ciclohexamida, dodina, etridiazol, iprodiona, metlaxil, tiamimefona, triforina ou uma combinação destes.[00173] The fungicide may comprise a substituted benzene, a thiocarbamate, an ethylene bis dithiocarbamate, a thiophthalidamide, a copper compound, an organomercury compound, an organotin compound, a cadmium compound, an anilazine, benomyl, cyclohexamide, dodine , etridiazole, iprodione, metlaxyl, thiamimephone, triporin or a combination of these.

[00174] O inoculante fúngico pode compreender um inoculante fúngico da família Glomeraceae, um inoculante fúngico da família Claroidoglomeraceae, um inoculante fúngico da família Gigasporaceae, um inoculante fúngico da família Acaulosporaceae, um inoculante fúngico da família Sacculosporaceae, um inoculante fúngico da família Entrophosporaceae, um inoculante fúngico da família Pacidsporaceae, um inoculante fúngico da família Diversisporaceae, um inoculante fúngico da família Paraglomeraceae, um inoculante fúngico da família Archaeosporaceae, um inoculante fúngico da família Geosiphonaceae, um inoculante fúngico da família Ambisporaceae, um inoculante fúngico da família Scutellosporaceae, um inoculante fúngico da família Dentiscultataceae, um inoculante fúngico da família Racocetraceae, um inoculante fúngico do filo Basidiomycota, um inoculante fúngico do filo Ascomycota, um inoculante fúngico do filo Zygomycota ou uma combinação destes.[00174] The fungal inoculant may comprise a fungal inoculant from the Glomeraceae family, a fungal inoculant from the Claroidoglomeraceae family, a fungal inoculant from the Gigasporaceae family, a fungal inoculant from the Acaulosporaceae family, a fungal inoculant from the Sacculosporaceae family, a fungal inoculant from the Entrophosporaceae family, a fungal inoculant from the Pacidsporaceae family, a fungal inoculant from the Diversisporaceae family, a fungal inoculant from the Paraglomeraceae family, a fungal inoculant from the Archaeosporaceae family, a fungal inoculant from the Geosiphonaceae family, a fungal inoculant from the Ambisporaceae family, a a fungal inoculant from the family Dentiscultataceae, a fungal inoculant from the family Racocetraceae, a fungal inoculant from the phylum Basidiomycota, a fungal inoculant from the phylum Ascomycota, a fungal inoculant from the phylum Zygomycota, or a combination thereof.

[00175] O inoculante bacteriano pode compreender um inoculante bacteriano do gênero Rhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Bradyrhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Mesorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Azorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Allorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Sinorhizobium, um inoculante bacteriano do gênero Kluyvera, um inoculante bacteriano do gênero Azotobacter, um inoculante bacteriano do gênero Pseudomonas, um inoculante bacteriano do gênero Azospirillium, um inoculante bacteriano do gênero Bacillus, um inoculante bacteriano do gênero Streptomyces, um inoculante bacteriano do gênero Paenibacillus, um inoculante bacteriano do gênero Paracoccus, um inoculante bacteriano do gênero Enterobacter, um inoculante bacteriano do gênero Alcaligenes, um inoculante bacteriano do gênero Mycobacterium, um inoculante bacteriano do gênero Trichoderma, um inoculante bacteriano do gênero Gliocladium, um inoculante bacteriano do gênero Glomus, um inoculante bacteriano do gênero Klebsiella ou uma combinação destes.[00175] The bacterial inoculant may comprise a bacterial inoculant of the genus Rhizobium, a bacterial inoculant of the genus Bradyrhizobium, a bacterial inoculant of the genus Mesorhizobium, a bacterial inoculant of the genus Azorhizobium, a bacterial inoculant of the genus Allorhizobium, a bacterial inoculant of the genus Sinorhizobium, an bacterial inoculant of the genus Paracoccus, a bacterial inoculant of the genus Enterobacter, a bacterial inoculant of the genus Alcaligenes, a bacterial inoculant of the genus Mycobacterium, a bacterial inoculant of the genus Trichoderma, a bacterial inoculant of the genus Gliocladium, a bacterial inoculant of the genus Glomus, an inoculant bacterial species of the genus Klebsiella or a combination thereof.

[00176] O inoculante bacteriano pode compreender uma cepa de promoção de crescimento vegetal da bactéria. A cepa de promoção de crescimento de planta da bactéria pode compreender uma cepa da bactéria que produz uma toxina inseticida (por exemplo, uma critoxina), produz um composto fungicida (por exemplo, uma ß-1,3-glucanase, uma quitosinase, uma liticase ou uma combinação destes), produz um composto nematocida (por exemplo, uma critoxina), produz um composto bactericida, é resistente a um ou mais antibióticos, compreende um ou mais plasmídeos de replicação livre, liga-se às raízes da planta, coloniza as raízes da planta, forma biopelículas, solubiliza nutrientes, secreta ácidos orgânicos ou uma combinação destes.[00176] The bacterial inoculant may comprise a plant growth-promoting strain of bacteria. The plant growth promoting strain of the bacterium may comprise a strain of the bacterium that produces an insecticidal toxin (e.g., a krytoxin), produces a fungicidal compound (e.g., a ß-1,3-glucanase, a chitosinase, a lyticase or a combination thereof), produces a nematocidal compound (e.g., a crytoxin), produces a bactericidal compound, is resistant to one or more antibiotics, comprises one or more freely replicating plasmids, binds to plant roots, colonizes the roots of the plant, form biofilms, solubilize nutrients, secrete organic acids or a combination of these.

[00177] Por exemplo, o inoculante bacteriano pode compreender Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL n° B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL n° B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL n° B-50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL n° B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL n° B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL n° B- 50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL n° NRRL B-50821), Bacillus mycoides EE118 (NRRL n° B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL n° B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL n° B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL n° B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 (NRRL No. B-50922) , membro da família Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B- 50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL No. B-50923), um membro da família Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL No. B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL No. B- 50925) ou uma combinação destes. Cada uma dessas cepas foi depositada junto ao Serviço de Pesquisa Agrícola (ARS) do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), tendo como endereço 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, EUA, em 11 de março de 2013 (Bacillus aryabhattai CAP53, Bacillus aryabhattai CAP56, Bacillus flexus BT054, Paracoccus kondratievae NC35, Enterobacter cloacae CAP12 e Bacillus nealsonii BOBA57) ou em 10 de março de 2014 (Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus subtilis EE148, Alcaligenes faecalis EE107, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, um membro da família Bacillus cereus EE128, Bacillus thuringiensis BT013A, Paenibacillus massiliensis BT23, um membro da família Bacillus cereus EE349, Bacillus subtilis EE218 e Bacillus megaterium EE281), e são identificadas pelos números de NRRL fornecidos entre parêntesis.[00177] For example, the bacterial inoculant may comprise Bacillus aryabhattai CAP53 (NRRL no. B-50819), Bacillus aryabhattai CAP56 (NRRL no. B-50817), Bacillus flexus BT054 (NRRL no. B-50816), Paracoccus kondratievae NC35 (NRRL no. B-50820), Bacillus mycoides BT155 (NRRL no. B-50921), Enterobacter cloacae CAP12 (NRRL no. B- 50822), Bacillus nealsonii BOBA57 (NRRL no. NRRL B-50821), Bacillus mycoides EE118 ( NRRL no. B-50918), Bacillus subtilis EE148 (NRRL no. B-50927), Alcaligenes faecalis EE107 (NRRL no. B-50920), Bacillus mycoides EE141 (NRRL no. B-50916), Bacillus mycoides BT46-3 ( NRRL No. B-50922), a member of the family Bacillus cereus EE128 (NRRL No. B-50917), Bacillus thuringiensis BT013A (NRRL No. B-50924), Paenibacillus massiliensis BT23 (NRRL No. B-50923), a member of family Bacillus cereus EE349 (NRRL No. B-50928), Bacillus subtilis EE218 (NRRL No. B-50926), Bacillus megaterium EE281 (NRRL No. B-50925) or a combination thereof. Each of these strains was deposited with the Agricultural Research Service (ARS) of the United States Department of Agriculture (USDA) at 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, on March 11, 2013 (Bacillus aryabhattai CAP53, Bacillus aryabhattai CAP56, Bacillus flexus BT054, Paracoccus kondratievae NC35, Enterobacter cloacae CAP12 and Bacillus nealsonii BOBA57) or on March 10, 2014 (Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE118, Bacillus subtilis EE148, Alcaligenes faecalis EE107, Bacillus mycoides EE141, Bacillus mycoides BT46-3, a member of the Bacillus cereus family EE128, Bacillus thuringiensis BT013A, Paenibacillus massiliensis BT23, a member of the Bacillus cereus family EE349, Bacillus subtilis EE218 and Bacillus megaterium EE281), and are identified by the NRRL numbers provided in parentheses.

[00178] Essas cepas de promoção de crescimento de planta foram isoladas das rizosferas de várias plantas vigorosas e foram identificadas por suas sequências de 16S rRNA (fornecidas aqui como SEQ ID NOs. 104-121), e através de análises bioquímicas. As cepas foram identificadas pelo menos à sua designação de gênero por meio de indicadores morfológicos e bioquímicos convencionais. As análises bioquímicas para as cepas Gram-negativas confirmadas, como Paracoccus kondratievae, Alcaligenes faecalis e Enterobacter cloacae incluíram crescimento em meio MacConkey e ágar nutriente, examinação microscópica, crescimento em meio de 5% e 7,5% de NaCl, crescimento em pH 5 e pH 9, crescimento a 42°C e 50°C, a capacidade de produzir ácido a partir da fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glicose, sucarose, d-manitol e amido; produção de pigmento fluorescente, hidrólise de gelatina, redução de nitrato; produção de catalase, hidrólise de amido; reação de oxidase; produção de urease e motilidade. De modo semelhante, análises bioquímicas para as cepas Gram-positivas confirmadas, como Bacillus e Paenibacillus, incluíram crescimento em meio de PEA e ágar nutriente, examinação microscópica, crescimento em meio de 5% e 7,5% de NaCl, crescimento em pH 5 e pH 9, crescimento a 42°C e 50°C, a capacidade de produzir ácido a partir da fermentação com celobiose, lactose, glicerol, glicose, sucarose, d-manitol e amido; produção de pigmento fluorescente, hidrólise de gelatina, redução de nitrato; produção de catalase, hidrólise de amido; reação de oxidase; produção de urease e motilidade. A identificação dessas cepas e a demonstração de seus efeitos de promoção de crescimento de planta são descritos com mais detalhes nos exemplos abaixo.[00178] These plant growth-promoting strains were isolated from the rhizospheres of several vigorous plants and were identified by their 16S rRNA sequences (provided here as SEQ ID NOs. 104-121), and through biochemical analysis. Strains were identified to at least their genus designation using conventional morphological and biochemical indicators. Biochemical analyzes for confirmed Gram-negative strains such as Paracoccus kondratievae, Alcaligenes faecalis and Enterobacter cloacae included growth on MacConkey medium and nutrient agar, microscopic examination, growth on 5% and 7.5% NaCl medium, growth at pH 5 and pH 9, growth at 42°C and 50°C, the ability to produce acid from fermentation with cellobiose, lactose, glycerol, glucose, sucrose, d-mannitol and starch; fluorescent pigment production, gelatin hydrolysis, nitrate reduction; catalase production, starch hydrolysis; oxidase reaction; urease production and motility. Similarly, biochemical analyzes for confirmed Gram-positive strains such as Bacillus and Paenibacillus included growth on PEA and nutrient agar media, microscopic examination, growth on 5% and 7.5% NaCl media, growth at pH 5 and pH 9, growth at 42°C and 50°C, the ability to produce acid from fermentation with cellobiose, lactose, glycerol, glucose, sucrose, d-mannitol and starch; fluorescent pigment production, gelatin hydrolysis, nitrate reduction; catalase production, starch hydrolysis; oxidase reaction; urease production and motility. The identification of these strains and the demonstration of their plant growth-promoting effects are described in more detail in the examples below.

[00179] Por exemplo, a formulação pode compreender uma cepa de promoção de crescimento vegetal de bactéria compreendendo Paracoccus kondratievae NC35, Bacillus aryabhattai CAP53, or Bacillus megaterium EE281, em que a formulação compreende ainda qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante descritos aqui, incluindo qualquer uma das cepas de membros da família Bacillus cereus de promoção de crescimento vegetal recombinante aqui presentes (por exemplo, Bacillus mycoides recombinante BT155, Bacillus mycoides EE141 ou Bacillus thuringiensis BT013A). A cepa do membro da família Bacillus cereus de promoção de crescimento vegetal recombinante pode expressar qualquer uma das proteínas de fusão descritas aqui, por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo a sequência de escolha da SEQ ID NO: 60 e um peptídeo não-hormonal (por exemplo, um inibidor de tripsina kunitz (KTI)), uma enzina envolvida na produção ou ativação de um composto estimulante de crescimento de planta (por exemplo, uma quitosinase), um peptídeo ou proteína de ligação vegetal (por exemplo, TasA); uma proteína ou peptídeo que protegem um vegetal de um patógeno (por exemplo, TasA) ou uma enzina que degrada ou modifica a fonte bacteriana, fúngica ou nutriente vegetal (por exemplo, uma fosfatase, como PhoA ou fitase ou uma endoglucanase). Métodos de promoção de crescimento vegetal[00179] For example, the formulation may comprise a plant growth-promoting strain of bacteria comprising Paracoccus kondratievae NC35, Bacillus aryabhattai CAP53, or Bacillus megaterium EE281, wherein the formulation further comprises any of the recombinant Bacillus cereus family members described herein , including any of the strains of recombinant plant growth-promoting Bacillus cereus family members present herein (e.g., recombinant Bacillus mycoides BT155, Bacillus mycoides EE141, or Bacillus thuringiensis BT013A). The recombinant plant growth promoting Bacillus cereus family member strain can express any of the fusion proteins described herein, for example, a fusion protein comprising the sequence of choice of SEQ ID NO: 60 and a non-hormonal peptide ( for example, a kunitz trypsin inhibitor (KTI)), an enzyme involved in the production or activation of a plant growth-stimulating compound (e.g., a chitosinase), a plant binding peptide or protein (e.g., TasA); a protein or peptide that protects a plant from a pathogen (e.g., TasA) or an enzyme that degrades or modifies the bacterial, fungal, or plant nutrient source (e.g., a phosphatase such as PhoA or phytase or an endoglucanase). Plant Growth Promotion Methods

[00180] A presente invenção relaciona-se ainda a métodos para estimular o crescimento vegetal. O método para estimular o crescimento vegetal compreende a introdução em um meio de crescimento vegetal de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima. Alternativamente, qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutido acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima pode ser aplicada a um vegetal, a uma semente vegetal ou uma área em torno de um vegetal ou de uma semente vegetal. Em tais métodos, a proteína ou o peptídeo de estímulo de crescimento vegetal é fisicamente acoplado ao exosporium do membro da família Bacillus recombinante.[00180] The present invention also relates to methods for stimulating plant growth. The method for stimulating plant growth comprises introducing into a plant growth medium any of the recombinant Bacillus cereus family members discussed above or any of the formulations discussed above. Alternatively, any of the recombinant Bacillus cereus family members discussed above or any of the formulations discussed above can be applied to a vegetable, a vegetable seed or an area surrounding a vegetable or a vegetable seed. In such methods, the plant growth stimulating protein or peptide is physically coupled to the exosporium of the recombinant Bacillus family member.

[00181] Alternativamente, o método para estimular o crescimento vegetal compreende a introdução de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão em um meio de crescimento vegetal ou a aplicação de um membro da família Bacillus cereus recombinante que expressa uma proteína de fusão para um vegetal, uma semente de vegetal ou uma área em torn de um vegetal ou de uma semente de vegetal. A proteína de fusão compreende pelo menos uma proteína de estímulo de crescimento vegetal e uma sequência de escolha, uma proteína de exosporium ou um fragmento da proteína do exosporium. A proteína ou o peptídeo de estímulo de crescimento vegetal é fisicamente acoplado ao exosporium do membro da família Bacillus recombinante. A sequência de escolha, a proteína do exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode ser qualquer uma das sequências de direcionamento, das proteínas do exosporium ou fragmentos de proteína do exosporium listados acima no parágrafo [0005].[00181] Alternatively, the method for stimulating plant growth comprises introducing a recombinant Bacillus cereus family member that expresses a fusion protein into a plant growth medium or applying a recombinant Bacillus cereus family member that expresses a protein melting point for a vegetable, a vegetable seed, or an area around a vegetable or a vegetable seed. The fusion protein comprises at least one plant growth stimulating protein and a sequence of choice, an exosporium protein or a fragment of the exosporium protein. The plant growth stimulating protein or peptide is physically coupled to the exosporium of the recombinant Bacillus family member. The sequence of choice, the exosporium protein or exosporium protein fragment can be any of the targeting sequences, exosporium proteins or exosporium protein fragments listed above in paragraph [0005].

[00182] Além disso, a sequência de escolha pode consistir em 16 aminoácidos e ter pelo menos aproximadamente 43% de identidade com os aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 54%. Alternativamente, a sequência de escolha pode consistir em aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1, ou SEQ ID NO: 60.[00182] Furthermore, the sequence of choice may consist of 16 amino acids and have at least approximately 43% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 54%. Alternatively, the sequence of choice may consist of amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1, amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1, or SEQ ID NO: 60.

[00183] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%.[00183] Furthermore, the targeting sequence may comprise an amino acid sequence having at least 50% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 63 %. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 50% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 63%.

[00184] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 50% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%.[00184] Furthermore, the targeting sequence may comprise an amino acid sequence having at least 50% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 72 %. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 50% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 72%.

[00185] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 56% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 56% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 63%.[00185] Furthermore, the targeting sequence may comprise an amino acid sequence having at least 56% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 63 %. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 56% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 63%.

[00186] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 62% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 62% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é de pelo menos 72%.[00186] Furthermore, the targeting sequence may comprise an amino sequence having at least 62% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 72% . Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 62% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein identity with amino acids 25-35 of SEQ ID NO :1 is at least 72%.

[00187] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 68% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%.[00187] Furthermore, the targeting sequence may comprise an amino acid sequence having at least 68% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 81 %. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 68% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 81%.

[00188] Além disso, a sequência de escolha pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 72%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é de pelo menos 72%.[00188] Furthermore, the sequence of choice may comprise an amino sequence having at least 75% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 72% . Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 75% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein identity with amino acids 25-35 of SEQ ID NO :1 is at least 72%.

[00189] Além disso, a sequência de escolha pode compreender uma sequência de amino tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 81%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 75% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 da SEQ ID NO:1 é de pelo menos 81%.[00189] Furthermore, the sequence of choice may comprise an amino sequence having at least 75% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 81% . Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 75% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein identity with amino acids 25-35 of SEQ ID NO :1 is at least 81%.

[00190] Além disso, a sequência de escolha pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO:1, em que a identidade com aminoácidos de 25-35 é de pelo menos aproximadamente 81%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO:1, em que a identidade com aminoácidos de 25-35 é de pelo menos aproximadamente 81%.[00190] Furthermore, the sequence of choice may comprise an amino acid sequence having at least 81% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO:1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least approximately 81%. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 81% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO:1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least minus approximately 81%.

[00191] Além disso, a sequência de direcionamento pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 90%. Alternativamente, a sequência de escolha consiste em uma sequência de aminoácidos consistindo em 16 aminoácidos e tendo pelo menos 81% de identidade com aminoácidos de 20-35 da SEQ ID NO: 1, em que a identidade com aminoácidos 25-35 é de pelo menos 90%.[00191] Furthermore, the targeting sequence may comprise an amino acid sequence having at least 81% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 90 %. Alternatively, the sequence of choice consists of an amino acid sequence consisting of 16 amino acids and having at least 81% identity with amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1, wherein the identity with amino acids 25-35 is at least 90%.

[00192] Alternativamente, a proteína de exosporium ou fragmento de proteína do exosporium pode compreender uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 e 84.[00192] Alternatively, the exosporium protein or exosporium protein fragment may comprise an amino acid sequence that has at least 90%, at least 95%, at least 98%, at least 99% or at least 100% identity with any of the SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 44, 46, 48, 50 , 52, 54, 56, 58, 59, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 and 84.

[00193] A proteína estimulante de crescimento vegetal pode compreender uma enzima. Por exemplo, a enzima pode compreender uma enzima que degrada ou modifica uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutriente vegetal. Tais enzimas incluem celulases, lipases, oxidases de lignina, proteases, hidrolases de glicosídeo, fosfatases, nitrogenases, nucleases, amidases, reductases de nitrato, reductases de nitrito, amilases, oxidases de amônia, ligninases, glicosidases, fosfolipases, fitases, pectinases, glucanases, sulfatases, ureases, xilanases e sideróforos. Quando introduzido em um meio do crescimento vegetal ou aplicado a uma planta, semente ou uma área em torno de uma planta ou de uma semente vegetal, as proteínas de fusão compreendendo enzimas que degradam ou modificam uma fonte bacteriana, fúngica ou de nutriente vegetal pode auxiliar no processamento de nutrientes nos arredores da planta e resultar em uma melhor absorção de nutrientes por parte da planta ou pelas bactérias benéficas ou fungos nos arredores da planta.[00193] The plant growth stimulating protein may comprise an enzyme. For example, the enzyme may comprise an enzyme that degrades or modifies a bacterial, fungal or plant nutrient source. Such enzymes include cellulases, lipases, lignin oxidases, proteases, glycoside hydrolases, phosphatases, nitrogenases, nucleases, amidases, nitrate reductases, nitrite reductases, amylases, ammonia oxidases, ligninases, glycosidases, phospholipases, phytases, pectinases, glucanases , sulfatases, ureases, xylanases and siderophores. When introduced into a plant growth medium or applied to a plant, seed or an area surrounding a plant or plant seed, fusion proteins comprising enzymes that degrade or modify a bacterial, fungal or plant nutrient source can assist in the processing of nutrients in the plant's surroundings and result in better nutrient absorption by the plant or by the beneficial bacteria or fungi in the plant's surroundings.

[00194] As celulases apropriadas incluem endocelulases (por exemplo, endogliconases como uma endoglucanase Bacillus subtilis, uma endoglucanase Bacillus thuringiensis, uma endoglucanase Bacillus cereus ou uma endoglucanase Bacillus clausii), exocelulases (por exemplo, uma exocelulase Trichoderma reesei) e ß-glucosidases (por exemplo, uma ß-glucosidase Bacillus subtilis, uma ß-glucosidase Bacillus thuringiensis, uma ß-glucosidase Bacillus cereus ou uma ß- glucosidase Bacillus clausii).[00194] Suitable cellulases include endocellulases (e.g., endoglyconases such as a Bacillus subtilis endoglucanase, a Bacillus thuringiensis endoglucanase, a Bacillus cereus endoglucanase or a Bacillus clausii endoglucanase), exocellulases (e.g., a Trichoderma reesei exocellulase) and ß-glucosidases ( for example, a Bacillus subtilis ß-glucosidase, a Bacillus thuringiensis ß-glucosidase, a Bacillus cereus ß-glucosidase or a Bacillus clausii ß-glucosidase).

[00195] A lipase pode compreender uma lipase Bacillus subtilis, uma lipase Bacillus thuringiensis, uma lipase Bacillus cereus ou uma lipase Bacillus clausii.[00195] The lipase may comprise a Bacillus subtilis lipase, a Bacillus thuringiensis lipase, a Bacillus cereus lipase or a Bacillus clausii lipase.

[00196] As oxidases de lignina apropriadas compreendem peroxidases de lignina, lacases, oxidases glioxais, ligninases e peroxidases de manganês.[00196] Suitable lignin oxidases comprise lignin peroxidases, laccases, glyoxal oxidases, ligninases and manganese peroxidases.

[00197] A protease pode compreender uma subtilisina, uma protease ácida, uma protease alcalina, uma proteinase, uma peptidase, uma endopeptidase, uma exopeptidase, uma termolisina, uma papaína, uma pepsina, uma tripsina, uma pronase, uma carboxilase, uma protease de serina, uma protease glutâmica, uma protease de aspartato, uma protease cisteína ou uma metaloprotease.[00197] The protease may comprise a subtilisin, an acidic protease, an alkaline protease, a proteinase, a peptidase, an endopeptidase, an exopeptidase, a thermolysin, a papain, a pepsin, a trypsin, a pronase, a carboxylase, a protease serine protease, a glutamic protease, an aspartate protease, a cysteine protease or a metalloprotease.

[00198] O fosfato pode compreender uma hidrolase de monoéster fosfórica, uma fosfomonoesterase (por exemplo, PhoA4), uma hidrolase de diéster fosfórica, fosfodiesterase, uma hidrolase de monoéster trifosfórica, uma hidrolase de anidrido de fosforil, fitase (por exemplo, fitase de Bacillus subtilis EE148 ou fitase de Bacillus thuringiensisBT013A), uma trimetafosfatase ou uma trifosfatase.[00198] The phosphate may comprise a phosphoric monoester hydrolase, a phosphomonoesterase (e.g., PhoA4), a phosphoric diester hydrolase, phosphodiesterase, a triphosphoric monoester hydrolase, a phosphoryl anhydride hydrolase, phytase (e.g., Bacillus subtilis EE148 or Bacillus thuringiensis phytaseBT013A), a trimetaphosphatase or a triphosphatase.

[00199] A nitrogenase pode compreender uma nitrogenase da família Nif (por exemplo, Paenibacillus massiliensis NifBDEHKNXV).[00199] The nitrogenase may comprise a nitrogenase from the Nif family (for example, Paenibacillus massiliensis NifBDEHKNXV).

[00200] Em qualquer um dos métodos acima para estímulo de crescimento vegetal, os vegetais cultivados no meio de crescimento vegetal compreendendo um membro da família Bacillus cereus recombinante exibe um crescimento maior em comparação ao crescimento dos vegetais em um meio de crescimento vegetal idêntico que não contém o membro da família Bacillus cereus recombinante.[00200] In any of the above methods for stimulating plant growth, vegetables grown in the plant growth medium comprising a member of the recombinant Bacillus cereus family exhibit greater growth compared to growing the plants in an identical plant growth medium that does not contains the recombinant Bacillus cereus family member.

[00201] Em qualquer um dos métodos para estimular o crescimento vegetal, o membro da família Bacillus cereus recombinante pode compreender qualquer uma das cepas de promoção de crescimento vegetal recombinante das bactérias descritas acima.[00201] In any of the methods for stimulating plant growth, the recombinant Bacillus cereus family member can comprise any of the recombinant plant growth promoting strains of the bacteria described above.

[00202] Em alguns dos métodos acima para estimular o crescimento vegetal, a proteína de fusão pode ser expressada sob o controle de qualquer um dos promotores descritos acima.[00202] In some of the above methods for stimulating plant growth, the fusion protein can be expressed under the control of any of the promoters described above.

Methods for protecting a vegetable against a pathogen

[00203] A presente invenção relaciona-se ainda a métodos para proteger um vegetal contra um patógeno. Tais métodos compreendem a introdução em um meio de crescimento vegetal de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima em um meio de crescimento vegetal. Alternativamente, tais métodos compreendem a aplicação de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima a um vegetal, a uma semente vegetal ou uma área em torno de um vegetal ou de uma semente vegetal. Nesses métodos, a proteína ou o peptídeo que protegem um vegetal contra um patógeno encontram-se fisicamente acoplados ao exosporium do membro da famíliaBacillus cereus recombinante.[00203] The present invention further relates to methods for protecting a vegetable against a pathogen. Such methods comprise introducing into a plant growth medium any of the recombinant Bacillus cereus family members discussed above or any of the formulations discussed above into a plant growth medium. Alternatively, such methods comprise applying any of the recombinant Bacillus cereus family members discussed above or any of the formulations discussed above to a vegetable, a vegetable seed or an area surrounding a vegetable or a vegetable seed. In these methods, the protein or peptide that protects a plant against a pathogen is physically coupled to the exosporium of the recombinant Bacillus cereus family member.

[00204] Os vegetais cultivados no meio de crescimento vegetal compreendendo o membro da família Bacillus cereus recombinante são menos suscetíveis à infecção com o patógeno em comparação a vegetais cultivados em um meio de crescimento vegetal idêntico que não contenha o membro da família Bacillus cereus recombinante. A suscetibilidade reduzida do patógeno pode ser um resultado do estímulo do sistema imunológico do vegetal por parte da proteína ou do peptídeo que protegem o vegetal de um patógeno, ou pode resultar de um efeito direto ou indireto da proteína ou do peptídeo que protegem o vegetal contra um patógeno no patógeno.[00204] Vegetables grown in plant growth medium comprising the recombinant Bacillus cereus family member are less susceptible to infection with the pathogen compared to vegetables grown in an identical plant growth medium that does not contain the recombinant Bacillus cereus family member. Reduced pathogen susceptibility may be a result of stimulation of the plant's immune system by the protein or peptide that protects the plant from a pathogen, or it may result from a direct or indirect effect of the protein or peptide that protects the plant against a pathogen in the pathogen.

Methods to increase stress resistance in a vegetable

[00205] A presente invenção relaciona-se ainda a métodos para aumentar a resistência a estresse em um vegetal. Tais métodos compreendem a introdução em um meio de crescimento vegetal de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima em um meio de crescimento vegetal. Alternativamente, tais métodos compreendem a aplicação de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima a um vegetal, a uma semente vegetal ou uma área em torno de um vegetal ou de uma semente vegetal. Nesses métodos, a proteína ou o peptídeo que aumentam a resistência a estresse em um vegetal encontram-se fisicamente acoplados ao exosporium do membro da famíliaBacillus cereus recombinante.[00205] The present invention also relates to methods for increasing stress resistance in a vegetable. Such methods comprise introducing into a plant growth medium any of the recombinant Bacillus cereus family members discussed above or any of the formulations discussed above into a plant growth medium. Alternatively, such methods comprise applying any of the recombinant Bacillus cereus family members discussed above or any of the formulations discussed above to a vegetable, a vegetable seed or an area surrounding a vegetable or a vegetable seed. In these methods, the protein or peptide that increases stress resistance in a plant is physically coupled to the exosporium of the recombinant Bacillus cereus family member.

[00206] Os vegetais cultivados no meio de crescimento vegetal compreendendo o membro da família Bacillus cereus recombinante são menos suscetíveis a estresse em comparação a vegetais cultivados em um meio de crescimento vegetal idêntico que não contenha o membro da família Bacillus cereus recombinante.[00206] Vegetables grown in plant growth medium comprising the recombinant Bacillus cereus family member are less susceptible to stress compared to vegetables grown in an identical plant growth medium that does not contain the recombinant Bacillus cereus family member.

Methods for immobilizing spores of a member of the Bacillus cereus family on a vegetable

[00207] A presente invenção também se dirige a métodos de imobilização de um esporo de um membro da família Bacillus cereus recombinante em um vegetal. Esses métodos compreendem a introdução em um meio de crescimento vegetal de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima em um meio de crescimento vegetal. Alternativamente, tais métodos compreendem a aplicação de qualquer um dos membros da família Bacillus cereus recombinante discutidos acima ou qualquer uma das formulações discutidas acima a um vegetal, a uma semente vegetal ou uma área em torno de um vegetal ou de uma semente vegetal. O peptídeo ou a proteína de ligação do vegetal é fisicamente acoplado ao exosporium do membro da família Bacillus recombinante.[00207] The present invention also addresses methods of immobilizing a spore of a member of the recombinant Bacillus cereus family on a vegetable. These methods comprise introducing into a plant growth medium any of the recombinant Bacillus cereus family members discussed above or any of the formulations discussed above into a plant growth medium. Alternatively, such methods comprise applying any of the recombinant Bacillus cereus family members discussed above or any of the formulations discussed above to a vegetable, a vegetable seed or an area surrounding a vegetable or a vegetable seed. The peptide or binding protein from the plant is physically coupled to the exosporium of the recombinant Bacillus family member.

[00208] Esses métodos permitem que o esporo de um membro da família Bacillus cereus recombinante se ligue a um vegetal, de modo que o esporo seja mantido no vegetal. Por exemplo, esses métodos permitem que o esporo de um membro da família Bacillus cereus se ligue a uma raiz de um vegetal ou uma parte aérea de um vegetal (por exemplo, folhagem, caules, frutos ou flores), de modo que o esporo seja mantido na estrutura da raiz ou em uma parte aérea de um vegetal em vez de dissipar-se no meio de crescimento vegetal ou no ambiente em torno da porção aérea do vegetal.[00208] These methods allow the spore of a member of the recombinant Bacillus cereus family to attach to a vegetable, so that the spore is maintained on the vegetable. For example, these methods allow the spore of a member of the Bacillus cereus family to attach to a root of a plant or an aerial part of a plant (e.g., foliage, stems, fruits, or flowers) so that the spore is maintained in the root structure or aerial portion of a plant rather than dissipating into the plant growing medium or the environment surrounding the aerial portion of the plant.

[00209] Em alguns dos métodos de imobilização de um esporo de um membro da família Bacillus cereus recombinante em um vegetal, o peptídeo ou a proteína de ligação do vegetal pode direcionar-se seletivamente ao membro da família Bacillus cereus e mantê-lo no vegetal ou na estrutura ou substrutura do vegetal (por exemplo, nas raízes do vegetal e substruturas das raízes do vegetal ou em uma parte aérea de um vegetal ou de uma substrutura de uma parte aérea de um vegetal).[00209] In some of the methods of immobilizing a spore of a recombinant Bacillus cereus family member on a vegetable, the plant-binding peptide or protein can selectively target the Bacillus cereus family member and maintain it in the vegetable or in the structure or substructure of the plant (for example, in the roots of the plant and substructures of the roots of the plant or in an aerial part of a plant or a substructure of an aerial part of a vegetable).

Plant Growth Medium

[00210] Em qualquer um dos métodos acima, o meio de crescimento vegetal é um material capaz de sustentar o crescimento de um vegetal. O meio de crescimento vegetal pode compreender solo, água, uma solução aquosa, areia, cascalho, um polissacarídeo, adubação verde, compostagem, turfa, palha, argila, farinha de sementes de soja, extrato de levedura ou uma combinação destes. Por exemplo, o meio de crescimento vegetal compreende solo, compostagem, turfa ou uma combinação destes.[00210] In any of the above methods, the plant growth medium is a material capable of supporting the growth of a plant. The plant growth medium may comprise soil, water, an aqueous solution, sand, gravel, a polysaccharide, green manure, compost, peat, straw, clay, soybean meal, yeast extract or a combination thereof. For example, the plant growing medium comprises soil, compost, peat or a combination thereof.

[00211] O meio de crescimento vegetal pode, opcionalmente, ser suplementado com um substrato por uma enzima. Por exemplo, o substrato pode compreender triptofano, monofosfato de adenosina, difosfato de adenosina, trifosfato de adenosina, (por exemplo 3-trifosfato de adenosina), indol, trimetafosfato, ferrodoxina, acetoína, diacetil, piruvato, acetolactato, pectina, celululose, metilcelulose, amido, quitina, pectina, uma farinha proteica, um derivado de celulose, fosfato, acetoína, quitosano, um derivado inativo do ácido indol-3-acético, um derivado inativo do ácido giberélico, um xilano, colina, um derivado de colina, prolina, poliprolina, uma farinha rica em prolina, uma proteína rica em prolina, fenilalanina, corismato, um arabinoxilano, uma gordura, um graxo, um óleo, ácido fítico, lignina, ácido húmico, colina, um derivado de colina ou uma combinação destes. Métodos de aplicação[00211] The plant growth medium can optionally be supplemented with a substrate by an enzyme. For example, the substrate may comprise tryptophan, adenosine monophosphate, adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, (e.g. adenosine 3-triphosphate), indole, trimetaphosphate, ferrodoxin, acetoin, diacetyl, pyruvate, acetolactate, pectin, cellulose, methylcellulose , starch, chitin, pectin, a protein flour, a cellulose derivative, phosphate, acetoin, chitosan, an inactive derivative of indole-3-acetic acid, an inactive derivative of gibberellic acid, a xylan, choline, a choline derivative, proline, polyproline, a flour rich in proline, a protein rich in proline, phenylalanine, chorismate, an arabinoxylan, a fat, a fatty, an oil, phytic acid, lignin, humic acid, choline, a choline derivative or a combination thereof . Application methods

[00212] Em qualquer um dos métodos acima, o membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma formulação pode ser introduzido no meio de crescimento vegetal ou aplicado a um vegetal, a uma semente do vegetal ou a uma área em torno do vegetal ou da semente do vegetal.[00212] In any of the above methods, the recombinant Bacillus cereus family member or a formulation can be introduced into the plant growth medium or applied to a vegetable, a seed of the vegetable or an area surrounding the vegetable or seed of the vegetable.

[00213] Por exemplo, o método pode compreender o revestimento de sementes com o membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma formulação contendo o membro da família Bacillus cereus recombinante antes do plantio.[00213] For example, the method may comprise coating seeds with the recombinant Bacillus cereus family member or a formulation containing the recombinant Bacillus cereus family member before planting.

[00214] De modo alternativo, o método pode compreender a aplicação do membro da família Bacillus cereus recombinante ou uma formulação a uma parte aérea de uma planta, por exemplo, a folhagem, caules, frutos ou flores. Por exemplo, o membro da família Bacillus cereus recombinante ou formulação pode ser esguichado, esfregado, pingato ou aplicado de alguma outra forma às folhas ou outras partes aéreas de um vegetal.[00214] Alternatively, the method may comprise applying the recombinant Bacillus cereus family member or a formulation to an aerial part of a plant, for example, the foliage, stems, fruits or flowers. For example, the recombinant Bacillus cereus family member or formulation can be squirted, rubbed, dripped or otherwise applied to leaves or other aerial parts of a vegetable.

[00215] O método pode compreender a introdução de um membro da família Bacillus cereus recombinante em um meio de crescimento vegetal aplicando-se uma formulação sólida ou líquida contendo o membro da família Bacillus cereus recombinante ao meio (por exemplo, solo, compostagem, turfa ou uma combinação destes).[00215] The method may comprise introducing a recombinant Bacillus cereus family member into a plant growth medium by applying a solid or liquid formulation containing the recombinant Bacillus cereus family member to the medium (e.g., soil, compost, peat or a combination of these).

[00216] A formulação pode ser aplicada ao meio de crescimento vegetal para, concomitantemente ao, ou após o plantio das sementes, mudas, bulbos ou vegetais no meio de crescimento vegetal.[00216] The formulation can be applied to the plant growth medium for, concomitantly with, or after planting the seeds, seedlings, bulbs or vegetables in the plant growth medium.

Co-application of agrochemical products

[00217] Qualquer um dos métodos acima pode compreender ainda a introdução de pelo menos um produto agroquímico no meio de crescimento vegetal ou a aplicação de pelo menos um produto agroquímico aos vegetais ou às sementes. O produto agroquímico pode ser qualquer um daqueles listados acima para inclusão nas formulações ou qualquer combinação deles.[00217] Any of the above methods may further comprise introducing at least one agrochemical into the plant growth medium or applying at least one agrochemical to vegetables or seeds. The agrochemical product can be any of those listed above for inclusion in the formulations or any combination of them.

Vegetables

[00218] Os métodos acima podem ser praticados com uma variedade de vegetais. Por exemplo, o vegetal pode ser uma dicotiledônea, uma monocotiledônea ou um gimnosperma.[00218] The above methods can be practiced with a variety of vegetables. For example, the plant may be a dicotyledon, a monocot or a gymnosperm.

[00219] Por exemplo, onde o vegetal for uma monocotiledônea, a monocotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em feijão, ervilha, tomate, pimenta, abóbora, alfalfa, amêndoa, semente de anis, maçã, damasco, arrachá, alcachofra, abacate, vigna subterrânea, beterraba, bergamota, pimenta preta, barbilhão preto, amora, mirtilo, laranja amarga, bok-choi, castanha-do-pará, fruta-pão, brócolis, fava, couve-de-bruxelas, trigo mourisco, repolho, camelina, repolho chinês, cacau, cantalupo, sementes de cominho, cardo, alfarroba, cenoura, castanha de caju, mandioca, mamona, couve-flor, aipo, salsão, cereja, castanha, grão de bico, chicória, pimenta malagueta, crisântemo, canela, cidra, clementina, cravo, café, semente de cola, colza, milho, algodão, semente de algodão, feijão-frade, crambe, oxicoco, agrião, pepino, passa de Corinto, anona, acácia branca, ervilha da terra, berinjela, endívia, funchi, feno-grego, figo, avelã, linho, gerânio, groselha, cabaça, uva, toranja, goiaba, cânhamo, semente de cânhamo, hena, lúpulo, fava de cavalo, rábano, anil, jasmim, alcachofra de Jerusalém, juta, couve, sumaúma, kenaf, couve- rábano, kumquat, lavanda, limão, lentilha, lespedeza, alface, lima, alcaçuz, litchi, nespereira, lupino, noz de macadâmia, macis, mandarina, mangel, manga, ameixa, melão, menta, amora, mostarda, nectarina, bagaço de níger, noz-moscada, quiabo, azeitona, ópio, laranja, mamão papaia, pastinaca, esvilha, pêssego, amendoim, pêra, noz de pécan, diospiro, guandu, noz de pistácio, plátano, ameixa, romã, pomelo, semente de papoula, batata, batata doce, ameixa seca, abóbora, quebracho, marmelo, árvores do gênero Cinchona, quínoa, rabanete, rami, colza, framboesa, rhea, ruibarbo, rosa, borracha, couve- nabo, cártamo, sanfeno, cercefi, sapotilha, Satsuma, scorzonera, gergelim, frutos de karité, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, girassol, rutabaga, pimentão-doce, tangerina, chá, teff, tabaco, tomate, trifólio, tungue, nabo, urena, ervilhaca, noz, melancia, erva-mate, erva-de-santa-bárbara, bolsa-de- pastor, agrião de jardim, agrião picante, agrião aquático, pennycress (Thlaspi arvense), anis estrelado, loureiro, louro, cássia, jamelão, endro, tamarindo, hortelã, orégano, alecrim, salva, graviola, centela, calophyllum, pera de bálsamo, noz da Índia, castanha do Taiti, manjericão, uveira, hibisco, maracujazeiro, maçã estrela, sassafrás, cacto, hipericão, salicária, espinheiro, coentro, erva-caril, kiwi, tomilho, abobrinha, olluco, jicama, beldroega grande, macaco laranja, seriguela amarela, carambola, amaranto, wasabi, pimenta japonesa, ameixa amarela, mashua, toona chinesa, espinafre da Nova Zelândia, Tetragonia implexicoma, ugu, catinga-de-mulata, morrião-dos- passarinhos, jocote, jambo vermelho, jambu, serralha, batata chinesa, salsa-de-cavalo, saramago, silene dioica, ágata, cássia-de-sião, cardo, pimpinela, groselha baiana, gramata, salicórnia, alazão, samambaia vitória, couve-galega, prímula vulgar, prímula real, beldroegas, erva-de- bicho, cornalheira, Pisonia alba, bétel selvagem, pimenta da Guiné, yerba santa, estragão, salsinha, cerefólio, agrião de sequeiro, saxifraga, Cyclopia meyeriana, Petasites, shiso, pimenta aquática, perilla, fava amargosa, oca, kampong, aipo chinês, manjericão limoncino, manjericão tailandês, Neptunia oleracea, mirra, dracaena arbórea, moringa, mauka, samambaia de avestruz, erva de arroz paddy, Limnocharis flava, levístico, mastruço, maca, cabaceira, Lablab, espinafre d'água, leiterigas, planta-peixe, espinafre Okinawa, Glinus lotoides, bravos soldados, culantro, rúcula, cardo, maxixe-do-reino, mitsuba, chipilín, perrexil, mampat, ebolo, Coccinia grandis, Cirsium oleraceum, Crambe maritima, chaya, Chenopodium nuttalliae, mostarda da Abissínia, árvore de espinafre, Chenopodium bonus-henricus, ambrósia do México, fedegoso, celósia plumosa, alcaparra, grelo, Brassica rapa, mizuna, couve chinesa, kai-lan, mostarda castanha, bertalha, acelga, marshmallow, Senegalia pennata, juta chinesa, paprika, semente de urucum, hortelã verde, segurelha, marjerona, cominho, camomila, bálsamo de limão, pimenta-da-jamaica, arano, cherimoia, amora ártica, ameixa pequena, pitaya, durião, baga de sabugueiro, feijoa, jaca, jamelão, jujuba, physalis, mangostão, rambutão, groselha vermelha, groselha preta, salal, satsuma, ugli, feijão azuki, feijão preto, feijão-frade, feijão borlotti, feijão comum, feijão verde, feijão, feijão de sete anos, feijão mungo, feijão branco, feijão carioca, feijão-escarlate, ervilhas de vagem comestível, snap ervilhas, romanesco, brócolis americano, urtiga, pimentão, chicória, daikon, rabanete branco, cherovia, tat soi, broccolini, rabanete preto, raiz de bardana, fava, brócolis rabe, lablab, lupino, sterculia, Mucuna pruriens, feijão-de-asa, jícama, acácia do tipo mulga, Vernonia, Acacia ligulata, Acacia murrayana, Acacia tetragonophylla, Acacia kampeana, Acacia coriacea, chia, noz de faia, noz da Índia, Citrullus colocynthis, mamoncillo, noz maia, mongongo, manga de arbusto, sapucaia e cempedak.[00219] For example, where the vegetable is a monocot, the monocot may be selected from the group consisting of beans, peas, tomatoes, peppers, pumpkins, alfalfa, almonds, anise seed, apples, apricots, arracha, artichokes , avocado, underground vigna, beetroot, bergamot, black pepper, black barbel, blackberry, blueberry, bitter orange, bok-choi, Brazil nut, breadfruit, broccoli, broad bean, Brussels sprouts, buckwheat, cabbage, camelina, Chinese cabbage, cocoa, cantaloupe, cumin seeds, thistle, carob, carrot, cashew nuts, cassava, castor beans, cauliflower, celery, celery, cherry, chestnut, chickpeas, chicory, chili pepper, chrysanthemum, cinnamon, citron, clementine, clove, coffee, kola seed, rapeseed, corn, cotton, cottonseed, cowpea, crambe, cranberry, watercress, cucumber, currant, custard apple, white acacia, field pea , eggplant, endive, funchi, fenugreek, fig, hazelnut, flax, geranium, gooseberry, gourd, grape, grapefruit, guava, hemp, hemp seed, henna, hops, horse bean, horseradish, indigo, jasmine, artichoke of Jerusalem, jute, kale, kapok, kenaf, kohlrabi, kumquat, lavender, lemon, lentil, lespedeza, lettuce, lime, licorice, litchi, loquat, lupine, macadamia nut, mace, mandarin orange, mangel, mango, plum , melon, mint, blackberry, mustard, nectarine, niger pomace, nutmeg, okra, olive, opium, orange, papaya, parsnip, peas, peach, peanut, pear, pecan nut, persimmon, pigeon pea, pecan nut pistachio, plantain, plum, pomegranate, pomelo, poppy seed, potato, sweet potato, prune, pumpkin, shattercho, quince, trees of the genus Cinchona, quinoa, radish, ramie, rapeseed, raspberry, rhea, rhubarb, rose, rubber , turnip, safflower, sainfoin, salsify, sapodilla, Satsuma, scorzonera, sesame, shea fruits, soybeans, spinach, pumpkin, strawberry, sugar beet, sugar cane, sunflower, rutabaga, sweet pepper, tangerine, tea, teff, tobacco, tomato, trefoil, tung, turnip, urena, vetch, walnut, watermelon, yerba mate, Santa Barbara herb, shepherd's purse, garden cress, spicy cress, water cress, pennycress (Thlaspi arvense), star anise, laurel, laurel, cassia, jamelão, dill, tamarind, mint, oregano, rosemary, sage, soursop, centella, calophyllum, balsam pear, Indian walnut, Tahitian chestnut, basil, grapefruit , hibiscus, passion fruit, star apple, sassafras, cactus, St. John's wort, salicaria, hawthorn, coriander, curry herb, kiwi, thyme, zucchini, olluco, jicama, large purslane, orange monkey, yellow seriguela, carambola, amaranth, wasabi, pepper Japanese, yellow plum, mashua, Chinese toona, New Zealand spinach, Tetragonia implexicoma, ugu, mulatto catinga, chickweed, jocote, red jambo, jambu, milkweed, Chinese potato, horse parsley, saramago, silene dioica, agate, cassia-de-Sião, thistle, pimpernel, Bahian gooseberry, grass, salicornia, sorrel, victory fern, kale, common primrose, royal primrose, purslane, weed, cornelheira, Pisonia alba, wild betel, Guinea pepper, yerba santa, tarragon, parsley, chervil, watercress, saxifraga, Cyclopia meyeriana, Petasites, shiso, water pepper, perilla, bitter bean, oca, kampong, Chinese celery, limoncino basil, sweet basil Thai, Neptunia oleracea, myrrh, arboreal dracaena, moringa, mauka, ostrich fern, rice paddy herb, Limnocharis flava, lovage, mastroot, maca, bottle gourd, Lablab, water spinach, milkweed, fish plant, Okinawa spinach, Glinus lotoides, brave soldiers, culantro, arugula, thistle, gherkin, mitsuba, chipilín, perrexil, mampat, ebolo, Coccinia grandis, Cirsium oleraceum, Crambe maritima, chaya, Chenopodium nuttalliae, Abyssinian mustard, spinach tree, Chenopodium bonus-henricus, Mexican ragweed, fedegoso, celósia plumosa, caper, greens, Brassica rapa, mizuna, Chinese cabbage, kai-lan, brown mustard, bertalha, chard, marshmallow, Senegalia pennata, Chinese jute, paprika, annatto seed , green mint, savory, marjoram, cumin, chamomile, lemon balm, allspice, arano, cherimoya, arctic mulberry, small plum, pitaya, durian, elderberry, feijoa, jackfruit, jamelão, jujube, physalis, mangosteen, rambutan, red currant, black currant, salal, satsuma, ugli, adzuki bean, black bean, cowpea, borlotti bean, common bean, green bean, kidney bean, seven-year bean, mung bean, white bean, pinto bean , scarlet bean, edible snap peas, snap peas, romanesco, American broccoli, nettle, pepper, chicory, daikon, white radish, parsnip, tat soi, broccolini, black radish, burdock root, fava bean, broccoli rabe, lablab, lupine, sterculia, Mucuna pruriens, wing bean, jícama, mulga acacia, Vernonia, Acacia ligulata, Acacia murrayana, Acacia tetragonophylla, Acacia kampeana, Acacia coriacea, chia, beech nut, Indian walnut, Citrullus colocynthis, mamoncillo, Mayan nut, mongongo, bush mango, sapucaia and cempedak.

[00220] De modo alternativo, a dicotiledônea pode ser de uma família selecionada a partir do grupo que consiste em Acanthaceae (acanto), Aceraceae (bordo), Achariaceae, Achatocarpaceae (achatocarpus), Actinidiaceae (groselha chinesa), Adoxaceae (moscatelina), Aextoxicaceae, Aizoaceae (calêndula da figueira), Akaniaceae, Alangiaceae, Alseuosmiaceae, Alzateaceae, Amaranthaceae (amaranto), Amborellaceae, Anacardiaceae (sumagre), Ancistrocladaceae, Anisophylleaceae, Annonaceae (anoneira), Apiaceae (cenoura), Apocynaceae (Luobuma), Aquifoliaceae (azevinho), Araliaceae (ginseng), Aristolochiaceae (papo-de-peru), Asclepiadaceae (milkweed), Asteraceae (asteráceas), Austrobaileyaceae, Balanopaceae, Balanophoraceae (balanophora), Balsaminaceae (Maris-sem-vergonha), Barbeyaceae, Barclayaceae, Basellaceae (basella), Bataceae (gramata), Begoniaceae (begônia), Berberidaceae (bérberis), Betulaceae (bétula), Bignoniaceae (trombeta americana), Bixaceae (urucum), Bombacaceae (sumaumeira), Boraginaceae (borragem), Brassicaceae (mostarda ou Cruciferae), Bretschneideraceae, Brunelliaceae (brunellia), Bruniaceae, Brunoniaceae, Buddlejaceae (Buddleia), Burseraceae (olíbano), Buxaceae (buxo), Byblidaceae, Cabombaceae (espelho d'água), Cactaceae (cacto), Caesalpiniaceae, Callitrichaceae (lentilhas-da- água), Calycanthaceae (morango-arbusto), Calyceraceae (calycera), Campanulaceae (campânula), Canellaceae (Canella), Cannabaceae (cânhamo), Capparaceae (alcaparra), Caprifoliaceae (madressilva), Cardiopteridaceae, Caricaceae (papaia), Caryocaraceae (pequi), Caryophyllaceae (cravos), Casuarinaceae (casuarina), Cecropiaceae (embaúba), Celastraceae (algoz-das-árvores), Cephalotaceae, Ceratophyllaceae (Anthocerotophyta), Cercidiphyllaceae (árvore katsura), Chenopodiaceae (erva-de-santa-maria), Chloranthaceae (chloranthus), Chrysobalanaceae (ameixa-bicha), Circaeasteraceae, Cistaceae (esteva), Clethraceae (clethra), Clusiaceae (mangostão ou Guttiferae), Cneoraceae, Columelliaceae, Combretaceae (amendoeira indiana), Compositae (asteráceas), Connaraceae (cannarus), Convolvulaceae (ipomeia), Coriariaceae, Cornaceae (corniso), Corynocarpaceae (karaka), Crassulaceae (erva-pinheira), Crossosomataceae (crossosoma), Crypteroniaceae, Cucurbitaceae (pepino), Cunoniaceae (Cunonia), Cuscutaceae (cuscuta), Cyrillaceae (cyrilla), Daphniphyllaceae, Datiscaceae (datisca), Davidsoniaceae, Degeneriaceae, Dialypetalanthaceae, Diapensiaceae (diapensia), Dichapetalaceae, Didiereaceae, Didymelaceae, Dilleniaceae (dillenia), Dioncophyllaceae, Dipentodontaceae, Dipsacaceae (cardo-penteador), Dipterocarpaceae (meranti), Donatiaceae, Droseraceae (drósera), Duckeodendraceae, Ebenaceae (ébano), Elaeagnaceae (zambujeiro), Elaeocarpaceae (Elaeocarpus), Elatinaceae (Elatine), Empetraceae (camarinheira), Epacridaceae (Epacris), Eremolepidaceae , Ericaceae (urze), Erythroxylaceae (coca), Eucommiaceae, Eucryphiaceae, Euphorbiaceae (Eufórbia), Eupomatiaceae, Eupteleaceae, Fabaceae (ervilha ou leguminosa), Fagaceae (faia), Flacourtiaceae (Flacourtia), Fouquieriaceae (Ocotillo), Frankeniaceae (Frankenia), Fumariaceae (Fumaria), Garryaceae (Garrya elliptica), Geissolomataceae, Gentianaceae (genciana), Geraniaceae (gerânio), Gesneriaceae (Gesneriáceas), Globulariaceae, Gomortegaceae, Goodeniaceae (Goodenia), Greyiaceae, Grossulariaceae (passa de Corinto), Grubbiaceae, Gunneraceae (Gunnera), Gyrostemonaceae, Haloragaceae (pinheirinha-da-água), Hamamelidaceae (hamamélis), Hernandiaceae (Hernandia), Himantandraceae, Hippocastanaceae (castanha-da-índia), Hippocrateaceae (Hippocratea), Hippuridaceae (Hippuris vulgaris), Hoplestigmataceae, Huaceae, Hugoniaceae, Humiriaceae, Hydnoraceae, Hydrangeaceae (hortênsia), Hydrophyllaceae (caruru), Hydrostachyaceae, Icacinaceae (Icacina), Idiospermaceae, Illiciaceae (anis estrelado), Ixonanthaceae, Juglandaceae (nogueira), Julianiaceae, Krameriaceae (Krameria), Lacistemataceae, Lamiaceae (menta ou Labiatae), Lardizabalaceae (Lardizabala), Lauraceae (loureiro), Lecythidaceae (castanha-do-pará), Leeaceae, Leitneriaceae (cortiça), Lennoaceae (Lennoa), Lentibulariaceae (utricularia), Limnanthaceae (Limnanthes alba), Linaceae (linho), Lissocarpaceae, Loasaceae (Loasa), Loganiaceae (Logania), Loranthaceae (Loranthus), Lythraceae (Lythrum), Magnoliaceae (magnólia), Malesherbiaceae, Malpighiaceae (Cereja de Barbados), Malvaceae (malva), Marcgraviaceae (hera-das-árvores), Medusagynaceae, Medusandraceae, Melastomataceae (melastoma), Meliaceae (mogno), Melianthaceae, Mendonciaceae, Menispermaceae (Menispermum canadense), Menyanthaceae (Menyanthes), Mimosaceae, Misodendraceae, Mitrastemonaceae, Molluginaceae (capim-tapete), Monimiaceae (Monimia), Monotropaceae (Monotropa uniflora), Moraceae (amoreira), Moringaceae (árvore de rábano), Myoporaceae (Myoporum), Myricaceae (faia), Myristicaceae (noz- moscada), Myrothamnaceae, Myrsinaceae (capororoca), Myrtaceae (murta), Nelumbonaceae (flor de lótus), Nepenthaceae (Nepenthes khasiana), Neuradaceae, Nolanaceae, Nothofagaceae, Nyctaginaceae (four-o’clock), Nymphaeaceae (nenúcar), Nyssaceae (tupelo), Ochnaceae (Ochna), Olacaceae (Olax), Oleaceae (oliveira), Oliniaceae, Onagraceae (onagra), Oncothecaceae, Opiliaceae, Orobanchaceae (Orobanche), Oxalidaceae (azedinha), Paeoniaceae (peônia), Pandaceae, Papaveraceae (papoula), Papilionaceae, Paracryphiaceae, Passifloraceae (maracujazeiro), Pedaliaceae (gergelim), Pellicieraceae, Penaeaceae, Pentaphragmataceae, Pentaphylacaceae, Peridiscaceae, Physenaceae, Phytolaccaceae (Phytolacca), Piperaceae (pimenta), Pittosporaceae (Pittosporum), Plantaginaceae (violeta do campo), Platanaceae (plátano), Plumbaginaceae (plumbago), Podostemaceae (ervas daninhas), Polemoniaceae (Phlox), Polygalaceae (Polygala), Polygonaceae (trigo mourisco), Portulacaceae (beldroegas), Primulaceae (prímula), Proteaceae (Protea), Punicaceae (romã), Pyrolaceae (medronheiro), Quiinaceae, Rafflesiaceae (Rafflesia), Ranunculaceae (ranúnculo), Resedaceae (mignonette), Retziaceae, Rhabdodendraceae, Rhamnaceae (espinheiro), Rhizophoraceae (mangue vermelho), Rhoipteleaceae, Rhynchocalycaceae, Rosaceae (rosa), Rubiaceae (granza), Rutaceae (arruda), Sabiaceae (sabia), Saccifoliaceae, Salicaceae (salgueiro), Salvadoraceae, Santalaceae (sândalo), Sapindaceae (Sapindus), Sapotaceae (sapotilha), Sarcolaenaceae, Sargentodoxaceae, Sarraceniaceae (planta-jarro), Saururaceae (lizard’s tail ou Saururus cernuus), Saxifragaceae (Saxifraga), Schisandraceae (esquisandra), Scrophulariaceae (escrofulária), Scyphostegiaceae, Scytopetalaceae, Simaroubaceae (Quassia), Simmondsiaceae (jojoba), Solanaceae (batata), Sonneratiaceae (Sonneratia), Sphaerosepalaceae, Sphenocleaceae (Spenoclea), Stackhousiaceae (Stackhousia), Stachyuraceae, Staphyleaceae (Staphylea), Sterculiaceae (cacau), Stylidiaceae, Styracaceae (Storax), Surianaceae (Suriana), Symplocaceae (estévia), Tamaricaceae (Tamarix), Tepuianthaceae, Tetracentraceae, Tetrameristaceae, Theaceae (chá), Theligonaceae, Theophrastaceae (Theophrasta), Thymelaeaceae (Mezereum), Ticodendraceae, Tiliaceae (tília), Tovariaceae, Trapaceae (castanha de água), Tremandraceae, Trigoniaceae, Trimeniaceae, Trochodendraceae, Tropaeolaceae (Nasturtium), Turneraceae (Turnera), Ulmaceae (olmo), Urticaceae (urtiga), Valerianaceae (valeriana), Verbenaceae (verbena), Violaceae (violeta), Viscaceae (visco do Natal), Vitaceae (videira), Vochysiaceae, Winteraceae (Wintera), Xanthophyllaceae e Zygophyllaceae (creosoto).[00220] Alternatively, the dicot may be from a family selected from the group consisting of Acanthaceae (acanthus), Aceraceae (maple), Achariaceae, Achatocarpaceae (achatocarpus), Actinidiaceae (Chinese gooseberry), Adoxaceae (muscatella), Aextoxicaceae, Aizoaceae (fig marigold), Akaniaceae, Alangiaceae, Alseuosmiaceae, Alzateaceae, Amaranthaceae (amaranth), Amborellaceae, Anacardiaceae (sumac), Ancistrocladaceae, Anisophylleaceae, Annonaceae (anonymous), Apiaceae (carrot), Apocynaceae (Luobuma), Aquifoliaceae ( holly), Araliaceae (ginseng), Aristolochiaceae (turkey crop), Asclepiadaceae (milkweed), Asteraceae (asteraceae), Austrobaileyaceae, Balanopaceae, Balanophoraceae (balanophora), Balsaminaceae (Shameless Maris), Barbeyaceae, Barclayaceae, Basellaceae (basella), Bataceae (gramata), Begoniaceae (begonia), Berberidaceae (barberry), Betulaceae (birch), Bignoniaceae (American trumpet), Bixaceae (annatto), Bombacaceae (kapok), Boraginaceae (borage), Brassicaceae (mustard or Cruciferae ), Bretschneideraceae, Brunelliaceae (brunellia), Bruniaceae, Brunoniaceae, Buddlejaceae (Buddleia), Burseraceae (frankincense), Buxaceae (boxwood), Byblidaceae, Cabombaceae (water mirror), Cactaceae (cactus), Caesalpiniaceae, Callitrichaceae (lentils - water), Calycanthaceae (strawberry bush), Calyceraceae (calycera), Campanulaceae (bellflower), Canellaceae (Canella), Cannabaceae (hemp), Capparaceae (caper), Caprifoliaceae (honeysuckle), Cardiopteridaceae, Caricaceae (papaya), Caryocaraceae ( pequi), Caryophyllaceae (carnations), Casuarinaceae (casuarina), Cecropiaceae (embaúba), Celastraceae (tree tormentor), Cephalotaceae, Ceratophyllaceae (Anthocerotophyta), Cercidiphyllaceae (katsura tree), Chenopodiaceae (santa maria herb) , Chloranthaceae (chloranthus), Chrysobalanaceae (fag plum), Circaeasteraceae, Cistaceae (cistus), Clethraceae (clethra), Clusiaceae (mangosteen or Guttiferae), Cneoraceae, Columelliaceae, Combretaceae (Indian almond), Compositae (asteraceae), Connaraceae (cannarus ), Convolvulaceae (morning glory), Coriariaceae, Cornaceae (dogwood), Corynocarpaceae (karaka), Crassulaceae (pine grass), Crossosomataceae (crossosoma), Crypteroniaceae, Cucurbitaceae (cucumber), Cunoniaceae (Cunonia), Cuscutaceae (cuscuta), Cyrillaceae ( cyrilla) Droseraceae (Drosera), Duckeodendraceae, Ebenaceae (Ebony), Elaeagnaceae (Horn), Elaeocarpaceae (Elaeocarpus), Elatinaceae (Elatine), Empetraceae (Combine), Epacridaceae (Epacris), Eremolepidaceae, Ericaceae (Heather), Erythroxylaceae (Coca), Eucommiaceae , Eucryphiaceae, Euphorbiaceae (Euphorbia), Eupomatiaceae, Eupteleaceae, Fabaceae (pea or legume), Fagaceae (beech), Flacourtiaceae (Flacourtia), Fouquieriaceae (Ocotillo), Frankeniaceae (Frankenia), Fumariaceae (Fumaria), Garryaceae (Garrya elliptica), Geissolomataceae, Gentianaceae (gentian), Geraniaceae (geranium), Gesneriaceae (Gesneriaceae), Globulariaceae, Gomortegaceae, Goodeniaceae (Goodenia), Greyiaceae, Grossulariaceae (currant), Grubbiaceae, Gunneraceae (Gunnera), Gyrostemonaceae, Haloragaceae (pine tree). water), Hamamelidaceae (witch hazel), Hernandiaceae (Hernandia), Himantandraceae, Hippocastanaceae (horse chestnut), Hippocrateaceae (Hippocratea), Hippuridaceae (Hippuris vulgaris), Hoplestigmataceae, Huaceae, Hugoniaceae, Humiriaceae, Hydnoraceae, Hydrangeaceae (hydrangea), Hydrophyllaceae (pigweed), Hydrostachyaceae, Icacinaceae (Icacina), Idiospermaceae, Illiciaceae (star anise), Ixonanthaceae, Juglandaceae (walnut), Julianiaceae, Krameriaceae (Krameria), Lacistemataceae, Lamiaceae (mint or Labiatae), Lardizabalaceae (Lardizabala), Lauraceae ( laurel), Lecythidaceae (Brazil nut), Leeaceae, Leitneriaceae (cork), Lennoaceae (Lennoa), Lentibulariaceae (utricularia), Limnanthaceae (Limnanthes alba), Linaceae (flax), Lissocarpaceae, Loasaceae (Loasa), Loganiaceae (Logania ), Loranthaceae (Loranthus), Lythraceae (Lythrum), Magnoliaceae (magnolia), Malesherbiaceae, Malpighiaceae (Barbados Cherry), Malvaceae (mallow), Marcgraviaceae (tree ivy), Medusagynaceae, Medusandraceae, Melastomataceae (melastoma), Meliaceae (mahogany) horseradish tree), Myoporaceae (Myoporum), Myricaceae (beech), Myristicaceae (nutmeg), Myrothamnaceae, Myrsinaceae (capororoca), Myrtaceae (myrtle), Nelumbonaceae (lotus flower), Nepenthaceae (Nepenthes khasiana), Neuradaceae, Nolanaceae , Nothofagaceae, Nyctaginaceae (four-o'clock), Nymphaeaceae (water lily), Nyssaceae (tupelo), Ochnaceae (Ochna), Olacaceae (Olax), Oleaceae (olive tree), Oliniaceae, Onagraceae (evening primrose), Oncothecaceae, Opiliaceae, Orobanchaceae ( Orobanche), Oxalidaceae (sorrel), Paeoniaceae (peony), Pandaceae, Papaveraceae (poppy), Papilionaceae, Paracryphiaceae, Passifloraceae (passion fruit), Pedaliaceae (sesame), Pellicieraceae, Penaeaceae, Pentaphragmataceae, Pentaphylacaceae, Peridiscaceae, Physenaceae, Phytolaccaceae (Phytolacca) , Piperaceae (pepper), Pittosporaceae (Pittosporum), Plantaginaceae (field violet), Platanaceae (plane tree), Plumbaginaceae (plumbago), Podostemaceae (weeds), Polemoniaceae (Phlox), Polygalaceae (Polygala), Polygonaceae (buckwheat), Portulacaceae (purslane), Primulaceae (Primrose), Proteaceae (Protea), Punicaceae (pomegranate), Pyrolaceae (strawberry tree), Quiinaceae, Rafflesiaceae (Rafflesia), Ranunculaceae (ranunculus), Resedaceae (mignonette), Retziaceae, Rhabdodendraceae, Rhamnaceae (hawthorn) , Rhizophoraceae (red mangrove), Rhoipteleaceae, Rhynchocalycaceae, Rosaceae (rose), Rubiaceae (Granza), Rutaceae (rue), Sabiaceae (sage), Saccifoliaceae, Salicaceae (willow), Salvadoraceae, Santalaceae (sandalwood), Sapindaceae (Sapindus), Sapotaceae (sapotilha), Sarcolaenaceae, Sargentodoxaceae, Sarraceniaceae (pitcher plant), Saururaceae (lizard's tail or Saururus cernuus), Saxifragaceae (Saxifraga), Schisandraceae (schisandra), Scrophulariaceae (scrofularia), Scyphostegiaceae, Scytopetalaceae, Simaroubaceae (Quassia), Simmondsiaceae (jojoba), Solanaceae (potato), Sonneratiaceae (Sonneratia), Sphaerosepalaceae, Sphenocleaceae (Spenoclea), Stackhousiaceae (Stackhousia), Stachyuraceae, Staphyleaceae (Staphylea), Sterculiaceae (cocoa), Stylidiaceae, Styracaceae (Storax), Surianaceae (Suriana), Symplocaceae (stevia), Tamaricaceae (Tamarix), Tepuianthaceae, Tetracentraceae, Tetrameristaceae, Theaceae (tea), Theligonaceae, Theophrastaceae (Theophrasta), Thymelaeaceae (Mezereum), Ticodendraceae, Tiliaceae (linden tree), Tovariaceae, Trapaceae (water chestnut), Tremandraceae , Trigoniaceae, Trimeniaceae, Trochodendraceae, Tropaeolaceae (Nasturtium), Turneraceae (Turnera), Ulmaceae (elm), Urticaceae (nettle), Valerianaceae (valerian), Verbenaceae (verbena), Violaceae (violet), Viscaceae (Christmas mistletoe), Vitaceae (vine), Vochysiaceae, Winteraceae (Wintera), Xanthophyllaceae and Zygophyllaceae (creosote).

[00221] Onde a planta for uma monocotiledônea, a monocotiledônea pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em milho, trigo, aveia, arroz, cevada, painço, banana, cebola, alho, aspargo, azevém, painço, fonio, raishan, nipa, cúrcuma, açafrão, galangal, cebolinha, cardamomo, tamareira, abacaxi, chalota, alho-poró, castanha de água, alecrim-de-cheiro, lágrimas-de-Jó, bambu, capim coracana, Wolffia arrhiza, orelha de elefante, espinafre do Taiti, abacá, areca, mexoeira, noz de bétel, Proso millet, Sorghum bicolor, citronella, coco, taro, milho, dasheen, durra, trigo macarrão, edo, fique, formio, gengibre, Dactylis, esparto, sorgo-Sudão, milho-da-guiné, cânhamo de manilha, henequen, milho híbrido, sorgo, capim-limão, pita, bulrush millet, finger millet, Setaria italica, Echinochloa esculenta, Panicum miliaceum, linho da Nova Zelândia, aveia, azeite de dendê, Borassus, palmeira-sagu, Agrostis gigantea, sisal, sorgo, espelta, milho doce, sorgo doce, taro, teff, rabo-de-gato, triticale, baunilha, trigo e inhame.[00221] Where the plant is a monocot, the monocot may be selected from the group consisting of corn, wheat, oats, rice, barley, millet, banana, onion, garlic, asparagus, ryegrass, millet, fonio, raishan, nipa, turmeric, saffron, galangal, chives, cardamom, date palm, pineapple, shallot, leek, water chestnut, rosemary, Job's tears, bamboo, coracana grass, Wolffia arrhiza, elephant ear, Tahitian spinach, abaca, areca, millet, betel nut, Proso millet, Sorghum bicolor, citronella, coconut, taro, corn, dasheen, durra, wheat macaroni, edo, stay, formio, ginger, Dactylis, esparto, sorghum-Sudan , Guinea corn, manila hemp, henequen, hybrid corn, sorghum, lemongrass, pita, bulrush millet, finger millet, Setaria italica, Echinochloa esculenta, Panicum miliaceum, New Zealand flax, oats, palm oil, Borassus, sago palm, Agrostis gigantea, sisal, sorghum, spelt, sweet corn, sweet sorghum, taro, teff, cattail, triticale, vanilla, wheat and yam.

[00222] De modo alternativo, a monocotiledônea pode ser de uma família selecionada a partir do grupo que consiste em Acoraceae (cálamo), Agavaceae (Agave americana), Alismataceae (Alisma), Aloeaceae (Aloe), Aponogetonaceae (Aponogeton distachyos), Araceae (Arum), Arecaceae (palmeira), Bromeliaceae (bromélia), Burmanniaceae (Burmannia), Butomaceae (Butomus umbellatus), Cannaceae (Canna), Centrolepidaceae, Commelinaceae (coração- roxo), Corsiaceae, Costaceae (Costus), Cyanastraceae, Cyclanthaceae (Ciclanto), Cymodoceaceae (capim-agulha), Cyperaceae (junça), Dioscoreaceae (inhame), Eriocaulaceae (Eriocaulon), Flagellariaceae, Geosiridaceae, Haemodoraceae (Sanguinaria canadensis), Hanguanaceae (hanguana), Heliconiaceae (helicônia), Hydatellaceae, Hydrocharitaceae (valisnéria), Iridaceae (Iris), Joinvilleaceae (joinvillea), Juncaceae (juncos), Juncaginaceae (Triglochin maritima), Lemnaceae (lentinha d'água), Liliaceae (lírio), Limnocharitaceae (papoula d'água), Lowiaceae, Marantaceae (Maranta), Mayacaceae (Mayaca), Musaceae (banana), Najadaceae (ninfa d'água), Orchidaceae (orquídea), Pandanaceae (pândano), Petrosaviaceae, Philydraceae (filidráceas), Poaceae (relva), Pontederiaceae (jacinto-de-água), Posidoniaceae (posidônia), Potamogetonaceae (serralha-de-folha-redonda), Rapateaceae, Restionaceae, Ruppiaceae (Ruppia maritima), Scheuchzeriaceae (scheuchzeria), Smilacaceae (Smilax glauca), Sparganiaceae (espadana), Stemonaceae (stemona), Strelitziaceae, Taccaceae (flor-morcego), Thurniaceae, Triuridaceae, Typhaceae (amentilho), Velloziaceae, Xanthorrhoeaceae, Xyridaceae (Sisyrinchium californicum), Zannichelliaceae (Zannichellia palustris), Zingiberaceae (gengibre) e Zosteraceae (Zostera).[00222] Alternatively, the monocot may be from a family selected from the group consisting of Acoraceae (calamus), Agavaceae (Agave americana), Alismataceae (Alisma), Aloeaceae (Aloe), Aponogetonaceae (Aponogeton distachyos), Araceae (Arum), Arecaceae (palm), Bromeliaceae (bromeliad), Burmanniaceae (Burmannia), Butomaceae (Butomus umbellatus), Cannaceae (Canna), Centrolepidaceae, Commelinaceae (purple-heart), Corsiaceae, Costaceae (Costus), Cyanastraceae, Cyclanthaceae ( Ciclanto), Cymodoceaceae (needlegrass), Cyperaceae (sedge), Dioscoreaceae (yam), Eriocaulaceae (Eriocaulon), Flagellariaceae, Geosiridaceae, Haemodoraceae (Sanguinaria canadensis), Hanguanaceae (hanguana), Heliconiaceae (heliconia), Hydatellaceae, Hydrocharitaceae (valisneria ), Iridaceae (Iris), Joinvilleaceae (joinvillea), Juncaceae (reeds), Juncaginaceae (Triglochin maritima), Lemnaceae (duckweed), Liliaceae (lily), Limnocharitaceae (water poppy), Lowiaceae, Marantaceae (Maranta) , Mayacaceae (Mayaca), Musaceae (banana), Najadaceae (water nymph), Orchidaceae (orchid), Pandanaceae (pandan), Petrosaviaceae, Philydraceae (phyllidraceae), Poaceae (grass), Pontederiaceae (water hyacinth), Posidoniaceae (posidonia), Potamogetonaceae (round-leaf milkweed), Rapateaceae, Restionaceae, Ruppiaceae (Ruppia maritima), Scheuchzeriaceae (scheuchzeria), Smilacaceae (Smilax glauca), Sparganiaceae (spadana), Stemonaceae (stemona), Strelitziaceae, Taccaceae (bat flower), Thurniaceae, Triuridaceae, Typhaceae (catkin), Velloziaceae, Xanthorrhoeaceae, Xyridaceae (Sisyrinchium californicum), Zannichelliaceae (Zannichellia palustris), Zingiberaceae (ginger) and Zosteraceae (Zostera).

[00223] Onde o vegetal for uma gimnosperma, a gimnosperma pode ser de uma família selecionada a partir do grupo que consiste em Araucariaceae, Boweniaceae, Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Cycadaceae, Ephedraceae, Ginkgoaceae, Gnetaceae, Pinaceae, Podocarpaceae, Taxaceae, Taxodiaceae, Welwitschiaceae e Zamiaceae.[00223] Where the vegetable is a gymnosperm, the gymnosperm may be from a family selected from the group consisting of Araucariaceae, Boweniaceae, Cephalotaxaceae, Cupressaceae, Cycadaceae, Ephedraceae, Ginkgoaceae, Gnetaceae, Pinaceae, Podocarpaceae, Taxaceae, Taxodiaceae, Welwitschiaceae and Zamiaceae.

Examples

[00224] Os exemplos não limitantes a seguir são fornecidos para ilustrar melhor a presente invenção.[00224] The following non-limiting examples are provided to better illustrate the present invention.

Example 1. Use of a recombinant Bacillus cereus family member exhibiting an endoglucanase or a lipase to stimulate plant growth in soybean seeds

[00225] Os genes de lipase e endoglucanase Bacillus subtilis foram amplificados através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR) utilizando os seguintes acionadores exibidos abaixo, na Tabela 3: TABELA 3 [00225] The Bacillus subtilis lipase and endoglucanase genes were amplified through a polymerase chain reaction (PCR) using the following triggers shown below in Table 3: TABLE 3

[00226] Para criar construtos de fusão, os fenes foram fusionados ao promotor bclA nativo do DNA do Bacillus thuringiensis codificando os 35 primeiros aminoácidos do BclA (aminoácidos de 1-35 da SEQ ID NO:1) utilizando o splicing através da técnica de extensão de sobreposição (SOE). Os amplicons corretos foram clonados no vetor de lançadeira pHP13 E. coli/Bacillus, e os clones corretos foram triados por sequenciamento de DNA. Os clones corretos foram eletroporados no Bacillus thuringiensis (Cri-, plasmídeo-) e triados para resistência a cloranfenicol. Os transformadores corretos foram cultivados em caldo de infusão cérebro-coração durante uma noite a 30°C, cromados em placas de ágar de nutrientes e incubados por 3 dias a 30°C. Os esporos que expressam o construto de fusão (esporos de BEMD) foram coletados para fora das placas por lavagem em salina tamponada de fosfato (PBS) e purificados por centrifugação e lavagens adicionais em PBS. Bacillus thuringiensis (B.t.) de controle não-transformado os esporos foram criados de maneira idêntica.[00226] To create fusion constructs, the phenes were fused to the native bclA promoter of Bacillus thuringiensis DNA encoding the first 35 amino acids of BclA (amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1) using the splicing extension technique overlay (SOE). The correct amplicons were cloned into the pHP13 E. coli/Bacillus shuttle vector, and the correct clones were screened by DNA sequencing. The correct clones were electroporated into Bacillus thuringiensis (Cri-, plasmid-) and screened for chloramphenicol resistance. Correct transformants were grown in brain-heart infusion broth overnight at 30°C, plated on nutrient agar plates, and incubated for 3 days at 30°C. Spores expressing the fusion construct (BEMD spores) were collected off the plates by washing in phosphate-buffered saline (PBS) and purified by centrifugation and additional washes in PBS. Non-transformed control Bacillus thuringiensis (B.t.) spores were grown in an identical manner.

[00227] As sementes de sementes de soja (cepa Jake 011-28-04) foram plantadas a uma profundidade de 2,54 cm em vasos fundos de 10 cm com solo arenoso arável padrão. Os esporos foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada semente na plantação. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante um ensaio de duas semanas. Ao fim de duas semanas, a altura de cada vegetal foi medida, e as medidas foram normalizadas para controlar os esporos do Bacillus thuringiensis. Dois ensaios independentes foram realizados.[00227] Soybean seeds (strain Jake 011-28-04) were planted at a depth of 2.54 cm in 10 cm deep pots with standard topable sandy soil. The spores were diluted at a concentration of 1x104/ml in 50 ml of water and applied to each seed in the plantation. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 11 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during a two-week trial. After two weeks, the height of each vegetable was measured, and the measurements were normalized to control for Bacillus thuringiensis spores. Two independent trials were performed.

[00228] Os resultados são exibidos na Tabela 4, juntamente com o erro padrão do meio. Nos dois ensaios, as sementes de soja cultivadas na presença de esporos de BEMD, que exibiam endoglicanase, cresceu significativamente mais alto do que as sementes de soja tratadas com esporos de B.t. de controle (análise estatística avaliada através de um teste-t). Tabela 4 [00228] The results are displayed in Table 4, along with the mean standard error. In both trials, soybean seeds grown in the presence of BEMD spores, which exhibited endoglycanase, grew significantly taller than soybean seeds treated with control Bt spores (statistical analysis assessed using a t-test). Table 4

Example 2. Use of a recombinant Bacillus cereus family member exhibiting an endoglucanase to stimulate plant growth in maize

[00229] Esporos de BEMD que expressam endoglucanase foram criados de uma forma idêntica ao descrito acima no Exemplo 1. Milho foi plantado com 3,8 cm de profundidade em vasos fundos fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos, o controle e o BEMD que expressam endoglucanase foram diluídos a uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada vegetal da plantação. Um controle somente de água também foi incluído. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de uma semana. Ao fim de uma semana, a altura de cada vegetal foi medida, e as medidas foram normalizadas para controlar os esporos do Bacillus thuringiensis.[00229] BEMD spores expressing endoglucanase were created in a manner identical to that described above in Example 1. Corn was planted 3.8 cm deep in 10 cm deep pots filled with standard clay topsoil. The spores, control and BEMD expressing endoglucanase were diluted to a concentration of 1x104/ml in 50 ml of water and applied to each plant in the plantation. A water-only control was also included. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 11 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during the week-long trial. After a week, the height of each vegetable was measured, and the measurements were normalized to control Bacillus thuringiensis spores.

[00230] Os resultados são exibidos na Tabela 5, juntamente com o erro padrão do meio. O milho cultivado na presença de esporos de BEMD, que exibiam endoglucanase, cresceu significativamente mais alto do que as sementes de soja tratadas com esporos de B.t. de controle e com vegetais de controle somente com água (análise estatística avaliada através de um teste-t). Tabela 5. [00230] The results are displayed in Table 5, along with the mean standard error. Corn grown in the presence of BEMD spores, which exhibited endoglucanase, grew significantly taller than soybean seeds treated with control Bt spores and water-only control vegetables (statistical analysis assessed using a t-test). . Table 5.

Example 3. Use of a recombinant Bacillus cereus family member exhibiting an endoglucanase or a protease to stimulate plant growth in ryegrass

[00231] Esporos de BEMD que expressam endoglucanase foram criados de uma forma idêntica ao descrito acima no Exemplo 1. Os esporos de BEMD que expressão a protease E. coli PtrB foram criadas utilizando-se métodos semelhantes aos descritos acima, no Exemplo 1, e os seguintes acionadores: ggatccatgctaccaaaagcc (direto, SEQ ID NO: 41) e ggatccttagtccgcaggcgtagc (reverso, SEQ ID NO: 42).[00231] BEMD spores expressing endoglucanase were created in a manner identical to that described above in Example 1. BEMD spores expressing the E. coli PtrB protease were created using methods similar to those described above in Example 1, and the following triggers: ggatccatgctaccaaaagcc (forward, SEQ ID NO: 41) and ggatccttagtccgcaggcgtagc (reverse, SEQ ID NO: 42).

[00232] O trigo duro do inverno foi plantado a uma profundidade de 2,54 cm em vasos fundos de 10 cm com solo arenoso arável padrão. Os esporos, de controle e BEMD expressando endoglucanase ou protease, foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de uma semana. No fim de uma semana, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.[00232] Durum winter wheat was planted at a depth of 2.54 cm in deep 10 cm pots with standard sandy topsoil. The spores, control and BEMD expressing endoglucanase or protease, were diluted at a concentration of 1x104/ml in 50 ml of water and applied to each plant in the plantation. A water-only control was also included. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 11 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during the week-long trial. At the end of one week, the height of each plant was measured, and the measurements were normalized to the water-only control plants.

[00233] Os resultados são exibidos na Tabela 6, juntamente com o erro padrão do meio. O trigo cultivado na presença de esporos de BEMD, que exibiam endoglucanase ou protease cresceu significativamente mais alto do que os esporos de B.t. controles tratados ou sojas com controle de água (análise estatística analisada através de um teste-t). Tabela 6. [00233] The results are displayed in Table 6, along with the mean standard error. Wheat grown in the presence of BEMD spores that exhibited endoglucanase or protease grew significantly higher than Bt spores treated controls or water control soybeans (statistical analysis analyzed using a t-test). Table 6.

Example 4. Use of Recombinant Bacillus Cereus Family Members Displaying an Endonuclease to Stimulate Plant Growth in Ryegrass

[00234] Esporos de BEMD que expressam endoglucanase foram criados de uma forma idêntica ao descrito acima no Exemplo 1. O azevém perene foi plantado com 6,4 mm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos, de controle e BEMD expressando endoglucanase, foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml deágua e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 11 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.[00234] BEMD spores expressing endoglucanase were created in a manner identical to that described above in Example 1. Perennial ryegrass was planted 6.4 mm deep in 10 cm deep pots filled with standard clay topsoil. Spores, control and BEMD expressing endoglucanase, were diluted at a concentration of 1x104/ml in 50 ml of water and applied to each plant in the plantation. A water-only control was also included. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 11 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during the two-week trial. At the end of the two weeks, the height of each plant was measured, and the measurements were normalized to the water-only control plants.

[00235] Os resultados são mostrados na Tabela 7, juntamente com o erro padrão da média. O azevém crescido na presença de esporos de BEMD, que exibiam endocelulase, cresceu significativamente mais alto do que os esporos de B.t. controles tratados ou azevém com controle de água (análise estatística analisada através de um teste-t). Tabela 7. [00235] The results are shown in Table 7, along with the standard error of the mean. Ryegrass grown in the presence of BEMD spores, which exhibited endocellulase, grew significantly taller than Bt spores treated controls or ryegrass with water control (statistical analysis analyzed using a t-test). Table 7.

EXAMPLE 5. USE OF RECOMBINANT BACILLUS CEREUS FAMILY MEMBERS DISPLAYING ENZYMES INVOLVED IN THE SYNTHESIS OR ACTIVATION OF PLANT HORMONES TO STIMULATE PLANT GROWTH

[00236] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas envolvidas na síntese de hormônios vegetais. Por exemplo, o ácido indol-3-acético do hormônio vegetal é um estimulador de crescimento potente em plantas. O ácido indol-3-acético é sintetizado in vivo a partir do triptofano pelas enzimas triptofano mono-oxigenase e indol-3-acetamida hidrolase. O ácido indol-3-acético e outros hormônios também podem ser sintetizados in vivo a partir de trptofano e/ou indol pelas enzimas nitrilase, triptofano aminotransferase, indol-3-acetaldeído desidrogenase, indol-3-piruvato descarboxilase, amina oxidase, triptofano descarboxilase, e oxidases de cadeia lateral do triptofano.[00236] The BEMD system can also be used to display enzymes involved in the synthesis of plant hormones. For example, the plant hormone indole-3-acetic acid is a potent growth stimulator in plants. Indole-3-acetic acid is synthesized in vivo from tryptophan by the enzymes tryptophan monooxygenase and indole-3-acetamide hydrolase. Indole-3-acetic acid and other hormones can also be synthesized in vivo from tryptophan and/or indole by the enzymes nitrilase, tryptophan aminotransferase, indole-3-acetaldehyde dehydrogenase, indole-3-pyruvate decarboxylase, amine oxidase, tryptophan decarboxylase , and tryptophan side-chain oxidases.

[00237] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas envolvidas na modificação dos hormônios de crescimento da planta nas formas bioativa ou inativa. Por exemplo, a nitrilase pode ser expressa no sistema de BEMD para catalisar a conversão da indol-3- acetonitrila no ácido indol-3-acético bioativo. Adicionalmente, as formas inativas dos hormônios vegetais, tais como indol-3-acetonitrila podem ser adicionadas no meio de crescimento da planta com a nitrilase expressa por BEMD para proporcionar uma liberação gradual do hormônio ativo no meio de crescimento da planta. Muitas outras formas inativas ou menos ativas de hormônios vegetais podem ser modificadas usando suas enzimas correspondentes.[00237] The BEMD system can also be used to display enzymes involved in modifying plant growth hormones in bioactive or inactive forms. For example, nitrilase can be expressed in the BEMD system to catalyze the conversion of indole-3-acetonitrile to the bioactive indole-3-acetic acid. Additionally, inactive forms of plant hormones such as indole-3-acetonitrile can be added to the plant growth medium with nitrilase expressed by BEMD to provide a gradual release of the active hormone into the plant growth medium. Many other inactive or less active forms of plant hormones can be modified using their corresponding enzymes.

[00238] Os hormônios de crescimento da planta relacionados (auxinas) incluem ácido indol-3-pirúvico, indol-3-acetaldoxima, indol-3- acetamida, indol-3-acetonitrila, indol-3-etanol, indol-3-piruvato, ácido indol-3-butírico, ácidos fenilacéticos, ácido 4-cloroindol-3-acético, e indol-3-acetaldoxima. Esses hormônios são sintetizados a partir de triptofano e/ou indol in vivoatravés das enzimas triptofano mono- oxigenase, indol-3-acetamida hidrolase, nitrilase, nitrila hidrolase, acetolactato sintetase, alfa acetolactato descarboxilase, triptofano aminotransferase, indol-3- acetaldeído desidrogenase, indol-3-piruvato descarboxilase, amina oxidase, triptofano descarboxilase, e oxidases de cadeia lateral do triptofano.[00238] Related plant growth hormones (auxins) include indole-3-pyruvic acid, indole-3-acetaldoxime, indole-3-acetamide, indole-3-acetonitrile, indole-3-ethanol, indole-3-pyruvate , indole-3-butyric acid, phenylacetic acids, 4-chloroindole-3-acetic acid, and indole-3-acetaldoxime. These hormones are synthesized from tryptophan and/or indole in vivo through the enzymes tryptophan monooxygenase, indole-3-acetamide hydrolase, nitrilase, nitrile hydrolase, acetolactate synthetase, alpha acetolactate decarboxylase, tryptophan aminotransferase, indole-3-acetaldehyde dehydrogenase, indole-3-pyruvate decarboxylase, amine oxidase, tryptophan decarboxylase, and tryptophan side-chain oxidases.

[00239] Os hormônios de crescimento da família de citocinina também podem ser sintetizados pelas enzimas expressas no sistema de BEMD. Exemplos de citocininas incluem cinetina, zeatina (cis e trans), 6-benzilaminopurina, dihidroxizeatina, N6-(D2-isopentenil) adenina, ribosilzeatina, N6-(D2-isopentenil) adenosina, 2 metiltio-cis- ribosilzeatina, cis ribosilzeatina, ribosilzeatina-5-monosfosfato, N6- metilaminopurina, N6-dimetilaminopurina, 2’-desoxizeatina ribosídeo, 4- hidroxi-3-metil-trans-2-butenilaminopurina, orto-topolina, meta-topolina, benziladenina, orto-metiltopolina, e meta-metiltopolina. Esses compostos estimulantes do crescimento da planta são sintetizados in vivo a partir de mevalonato ou adenosina mono/di/trifosfato por enzimas, incluindo adenosina fosfato isopenteniltransferases, fosfatases, adenosina cinases, adenina fosforribosiltransferase, CYP735A, 5’ribonucleotídeo fosfohidrolase, adenosina nucleosidases, zeatina cis-trans isomerase, zeatina O-glucosiltransferases, ß-glucosidases, cis- hidroxilases, CK cis-hidroxilases, CK N-glucosiltransferases, 2,5- ribonucleotídeo fosfohidrolases, adenosina nucleosidases, purina nucleosídeo fosforilases, e zeatina redutases.[00239] Growth hormones from the cytokinin family can also be synthesized by enzymes expressed in the BEMD system. Examples of cytokinins include kinetin, zeatin (cis and trans), 6-benzylaminopurine, dihydroxyzeatin, N6-(D2-isopentenyl) adenine, ribosylzeatin, N6-(D2-isopentenyl) adenosine, 2-methylthio-cis-ribosylzeatin, cis-ribosylzeatin, ribosylzeatin -5-monosphosphate, N6-methylaminopurine, N6-dimethylaminopurine, 2'-deoxyzeatin riboside, 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine, ortho-topoline, meta-topoline, benzyladenine, ortho-methyltopoline, and meta- methyltopolin. These plant growth-stimulating compounds are synthesized in vivo from mevalonate or adenosine mono/di/triphosphate by enzymes including adenosine phosphate isopentenyltransferases, phosphatases, adenosine kinases, adenine phosphoribosyltransferase, CYP735A, 5'ribonucleotide phosphohydrolase, adenosine nucleosidases, cis zeatin -trans isomerase, zeatin O-glucosyltransferases, ß-glucosidases, cis-hydroxylases, CK cis-hydroxylases, CK N-glucosyltransferases, 2,5-ribonucleotide phosphohydrolases, adenosine nucleosidases, purine nucleoside phosphorylases, and zeatin reductases.

[00240] Usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas enzimas podem ser incorporadas no sistema de BEMD para exibir nos esporos de BEMD, criando um construto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima expressa ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode ser então adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta ou aplicado diretamente à folhagem da planta usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1 para a estimulação do crescimento da planta.[00240] Using methods similar to those described above in Example 1, any of these enzymes can be incorporated into the BEMD system for display on BEMD spores, creating a fusion construct comprising the enzyme and a targeting sequence that directs the expressed enzyme to the exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. A recombinant Bacillus cereus family member expressing such a construct can then be added to soil or other plant growth medium or applied directly to plant foliage using methods similar to those described above in Example 1 for stimulating plant growth.

[00241] O meio de crescimento da planta pode ser complementado com precursores ou substratos para as enzimas. Por exemplo, o meio de crescimento da planta pode ser complementado com triptofano, adenosina monofosfatos, adenosina difosfatos, adenosina trifosfatos, ou indol. Concentrações adequadas desses substratos estão entre 100 nM e 100 µM.[00241] The plant growth medium can be supplemented with precursors or substrates for the enzymes. For example, the plant growth medium can be supplemented with tryptophan, adenosine monophosphates, adenosine diphosphates, adenosine triphosphates, or indole. Suitable concentrations of these substrates are between 100 nM and 100 µM.

Example 6. The use of recombinant Bacillus cereus family members that exhibit proteases or peptidases that cleave proteins, peptides, proproteins, or preproproteins into bioactive peptides for stimulating plant growth

[00242] As proteases e peptidases podem ser expressas no sistema de BEMD que pode clivar enzimaticamente proteínas disponíveis no meio de crescimento da planta em peptídeos bioativos que podem agir sobre a planta direta ou indiretamente. Exemplos incluem a clivagem enzimática de farinha de soja, extrato de levedura, ou outras farinhas ricas em proteína adicionadas ao meio de crescimento da planta em peptídeos ativos que podem estimular diretamente o crescimento da planta. Peptídeos bioativos gerados pela clivagem enzimática de farinhas de proteína incluem RHPP e RKN 16D10, estimulantes potentes do desenvolvimento da raiz da planta. Adicionalmente, proproteínas ou pré-proproteínas podem ser clivadas nas formas ativas pelas proteases e peptidases expressas por BEMD em suas formas bioativas. As proproteínas ou pré-proproteínas inativas podem ser adicionadas no meio de crescimento da planta para facilitar sua clivagem gradual pelas proteases de BEMD e retardar a liberação de proteínas bioativas.[00242] Proteases and peptidases can be expressed in the BEMD system that can enzymatically cleave proteins available in the plant's growth medium into bioactive peptides that can act on the plant directly or indirectly. Examples include the enzymatic cleavage of soybean flour, yeast extract, or other protein-rich flours added to the plant growth medium into active peptides that can directly stimulate plant growth. Bioactive peptides generated by enzymatic cleavage of protein flours include RHPP and RKN 16D10, potent stimulants of plant root development. Additionally, proproteins or pre-proproteins can be cleaved into active forms by the proteases and peptidases expressed by BEMD into their bioactive forms. Inactive proproteins or preproproteins can be added to the plant growth medium to facilitate their gradual cleavage by BEMD proteases and delay the release of bioactive proteins.

[00243] Usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas proteases e peptidases podem ser incorporadas no sistema de BEMD para exibir nos esporos de BEMD, criando um construto de fusão compreendendo a protease ou peptidase e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima expressa ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode então ser adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta complementado com farinha de soja, extrato de levedura ou outra farinha rica em proteína para a estimulação do crescimento da planta. A farinha de soja, extrato de levedura ou outra farinha rica em proteína é adequadamente adicionada ao meio de crescimento da planta na forma de uma composição líquida compreendendo cerca de 10 µg/L a cerca de 100 mg/L da farinha de proteína, extrato de levedura ou outra farinha rica em proteína.[00243] Using methods similar to those described above in Example 1, any of these proteases and peptidases can be incorporated into the BEMD system for display on the BEMD spores, creating a fusion construct comprising the protease or peptidase and a targeting sequence that directs the enzyme expressed to the exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. A recombinant Bacillus cereus family member expressing such a construct can then be added to soil or other plant growth medium supplemented with soybean meal, yeast extract or other protein-rich flour for stimulation of plant growth. Soybean flour, yeast extract or other protein-rich flour is suitably added to the plant growth medium in the form of a liquid composition comprising about 10 µg/L to about 100 mg/L of the protein flour, soybean extract. yeast or other protein-rich flour.

Example 7. Use of BEMD spores expressing PtrB protease for plant growth stimulation

[00244] Os esporos de BEMD que expressam PtrB da protease de E. coli foram criados conforme descrito acima no Exemplo 3. Sementes de soja foram plantadas com 2,54 cm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos, de controle e BEMD expressando protease, foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. Farinha de soja em 25 mg/pote foi adicionada em água na plantação. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de uma semana. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.[00244] BEMD spores expressing E. coli protease PtrB were grown as described above in Example 3. Soybean seeds were planted 2.54 cm deep in 10 cm deep pots filled with standard clay topsoil . The spores, control and BEMD expressing protease, were diluted at a concentration of 1x104/ml in 50 ml of water and applied to each plant in the plantation. A water-only control was also included. Soybean flour at 25 mg/pot was added to water at plantation. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 13 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during the week-long trial. At the end of the two weeks, the height of each plant was measured, and the measurements were normalized to the water-only control plants.

[00245] Os resultados são mostrados na Tabela 8, juntamente com o erro padrão da média como uma porcentagem de controle de água. A soja crescida na presença de esporos de BEMD, que exibiam protease, cresceu significativamente mais alto do que os esporos de B.t. controles tratados ou sojas com controle de água (análise estatística analisada através de um teste-t). A adição da farinha de soja às plantas de controle de água ou de controle de B. thuringiensis teve pouco efeito. Em contraste, na presença da farinha de soja e o sistema de protease de BEMD, as plantas de soja responderam significativamente durante todos os outros tratamentos. Tabela 8. [00245] The results are shown in Table 8, along with the standard error of the mean as a percentage of water control. Soybeans grown in the presence of BEMD spores, which exhibited protease, grew significantly taller than Bt spores treated controls or water control soybeans (statistical analysis analyzed using a t-test). Addition of soybean meal to water control or B. thuringiensis control plants had little effect. In contrast, in the presence of soybean flour and the BEMD protease system, soybean plants responded significantly during all other treatments. Table 8.

Example 8. Use of recombinant Bacillus cereus family members that display proteins or peptides involved in stimulating plant growth

[00246] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir proteínas ou peptídeos que estão diretamente envolvidos na promoção do crescimento da planta. Por exemplo, hormônios vegetais peptídicos ou peptídeos não-hormonais que estimulam o crescimento da planta podem ser expressos no sistema de BEMD. Por exemplo, os peptídeos não-hormonais que se ligam diretamente e ativam receptores da planta podem ser expressos no sistema de BEMD para agir diretamente nos receptores na planta e raízes da planta alvo. Tais hormônios peptídicos e peptídeos não-hormonais incluem fitossulfocina, calcalva 3 (CLV3), sistemina, RKN 16D10, Hg-Syv46, eNOD40, proteínas da família NOD, ZmlGF, proteínas e peptídeos da família SCR/SP11, RHPP, POLARIS e KTI. Esses peptídeos e peptídeos relacionados podem ser expressos no sistema de BEMD e distribuído ao meio de crescimento da planta ou diretamente aplicados à folhagem para estimular o crescimento da planta.[00246] The BEMD system can also be used to display proteins or peptides that are directly involved in promoting plant growth. For example, peptide plant hormones or non-hormonal peptides that stimulate plant growth can be expressed in the BEMD system. For example, non-hormonal peptides that directly bind to and activate plant receptors can be expressed in the BEMD system to act directly on receptors in the plant and roots of the target plant. Such peptide hormones and non-hormonal peptides include phytosulfocin, calcalva 3 (CLV3), systemin, RKN 16D10, Hg-Syv46, eNOD40, NOD family proteins, ZmlGF, SCR/SP11 family proteins and peptides, RHPP, POLARIS and KTI. These peptides and related peptides can be expressed in the BEMD system and delivered to the plant growth medium or directly applied to foliage to stimulate plant growth.

[00247] Usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos podem ser incorporados no sistema de BEMD para exibir nos esporos de BEMD, criando um construto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima expressa ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. Um membro da família de Bacillus cereus recombinante que expressa tal construto pode ser então adicionado ao solo ou outro meio de crescimento da planta ou aplicado diretamente à folhagem da planta usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1 para a estimulação do crescimento da planta.[00247] Using methods similar to those described above in Example 1, any of these proteins or peptides can be incorporated into the BEMD system for display in the BEMD spores, creating a fusion construct comprising the enzyme and a targeting sequence that directs the enzyme expressed to the exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. A recombinant Bacillus cereus family member expressing such a construct can then be added to soil or other plant growth medium or applied directly to plant foliage using methods similar to those described above in Example 1 for stimulating plant growth.

Example 9. Use of BEMD spores expressing POLARIS or KTI to stimulate plant growth

[00248] Os esporos de BEMD que expressam o peptídeo vegetal POLARIS e peptídeo da soja KTI foram criados, sintetizando-se genes codificantes dos peptídeos POLARIS ou KIT ligados à sequência de direcionamento da SEQ ID NO: 60. Os genes foram então introduzidos em Bacillus thuringiensis e os esporos foram feitos conforme descrito no Exemplo 1. Sementes de soja foram plantadas com 2,54 cm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos de BEMD que expressam POLARIS ou KTI foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. Peptídeos POLARIS e KTI puros também foram testados para seus efeitos nas sojas em 0,05 mg/pot. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, as raízes medidas, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.[00248] BEMD spores expressing the POLARIS plant peptide and KTI soybean peptide were created by synthesizing genes encoding the POLARIS or KIT peptides linked to the targeting sequence of SEQ ID NO: 60. The genes were then introduced into Bacillus thuringiensis and spores were made as described in Example 1. Soybean seeds were planted 2.54 cm deep in 10 cm deep pots filled with standard clay topsoil. BEMD spores expressing POLARIS or KTI were diluted to a concentration of 1x104/ml in 50 ml of water and applied to each plant in the plantation. A water-only control was also included. Pure POLARIS and KTI peptides were also tested for their effects on soybeans at 0.05 mg/pot. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 13 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during the two-week trial. At the end of the two weeks, the height of each plant was measured, the roots were measured, and the measurements were normalized to the water-only control plants.

[00249] Os resultados são mostrados na Tabela 9, juntamente com o erro padrão da média como uma porcentagem de controle de água. A soja crescida na presença de esporos de BEMD, que exibem POLARIS, cresceu mais alta e teve um ligeiro aumento no desenvolvimento da raiz do que as sojas com controle de água. A presença do peptídeo KTI livre levou a uma retardamento significativo das plantas, perdendo entre 68% de sua altura, mas adicionando 15% ao comprimento das raízes. A expressão de KTI no sistema de BEMD levou ao benefício do crescimento da raiz, mas sem o efeito retardante na altura da planta. De forma relevante, a presença dos esporos de controle de Bacillus thuringiensis com o peptídeo KTI livre não impediu o efeito retardante do KTI, enquanto o BEMD com KTI não exibiu esse retardamento. Tabela 9. [00249] The results are shown in Table 9, along with the standard error of the mean as a percentage of water control. Soybeans grown in the presence of BEMD spores, which exhibit POLARIS, grew taller and had a slight increase in root development than water-controlled soybeans. The presence of the free KTI peptide led to a significant stunting of the plants, losing between 68% of their height, but adding 15% to the length of the roots. Expression of KTI in the BEMD system led to the benefit of root growth, but without the retardant effect on plant height. Importantly, the presence of control spores of Bacillus thuringiensis with free KTI peptide did not prevent the retardation effect of KTI, while BEMD with KTI did not exhibit this retardation. Table 9.

EXAMPLE 10. USE OF RECOMBINANT BACILLUS CEREUS FAMILY MEMBERS THAT DISPLAY ENZYMES THAT DEGRADE OR MODIFY A BACTERIAL, FUNGAL OR PLANT NUTRIENT SOURCE TO STIMULATE PLANT GROWTH AND/OR PROCESS NUTRIENTS

[00250] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas que degradam ou modificam beneficamente uma fonte de nutriente bacteriana, fúngica ou vegetal presente no solo ou outro meio de crescimento da planta. Essas enzimas degradam produtos presentes no solo ou outro meio de crescimento da planta nas formas que podem facilmente serem assimiladas pelas plantas e/ou bactérias e/ou fungos benéficos da rizosfera. Essas enzimas incluem, por exemplo, glucosídeo hidrolases para degradar carboidratos complexos, celulases para degradar celulose; lipases para degradar lipídios, incluindo óleo, gorduras e ceras; lignina oxidases para degradar lignina e ácidos húmicos; proteases para degradar polipeptídeos; fosfolipases para degradar membranas; amidases e nitrogenases para recuperar nitrogênio; amilases para processar amidos; nucleases para recuperar nucleotídeos, pectinases para quebrar pectina, sulfatases para recuperar enxofre, e xilanases para quebrar xilanos e arabinoxilanos. Os produtos resultantes, incluindo açúcares simples, aminoácidos, ácidos graxos, e outros nutrientes, estarão prontamente disponíveis para a absorção direta pelas plantas e/ou para estimular bactérias e/ou fungos benéficos a crescerem e se desenvolverem nas rizosferas das plantas.[00250] The BEMD system can also be used to display enzymes that beneficially degrade or modify a bacterial, fungal or plant nutrient source present in soil or other plant growth medium. These enzymes degrade products present in soil or other plant growth media into forms that can easily be assimilated by plants and/or beneficial bacteria and/or fungi in the rhizosphere. These enzymes include, for example, glucoside hydrolases to degrade complex carbohydrates, cellulases to degrade cellulose; lipases to degrade lipids, including oil, fats and waxes; lignin oxidases to degrade lignin and humic acids; proteases to degrade polypeptides; phospholipases to degrade membranes; amidases and nitrogenases to recover nitrogen; amylases for processing starches; nucleases to recover nucleotides, pectinases to break down pectin, sulfatases to recover sulfur, and xylanases to break down xylans and arabinoxylans. The resulting products, including simple sugars, amino acids, fatty acids, and other nutrients, will be readily available for direct absorption by plants and/or to encourage beneficial bacteria and/or fungi to grow and develop in plant rhizospheres.

[00251] Além disso, enzimas e outras moléculas biológicas podem ser utilizadas para liberar ou sequestrar fosfato, nitrogênio, e outros nutrientes elementares chave para a planta absorver a partir de suas diversas formas orgânicas e inorgânicas no solo. Por exemplo, as fosfatases podem ser usadas para degradar fosfatos no ambiente em fosfatos inorgânicos utilizáveis para o uso da planta. Os fosfatos podem ser fosfatos de ocorrência naturas presentes em um meio de crescimento da planta. Alternativa ou adicionalmente, o meio de crescimento da planta pode ser complementado com fosfatos, tais como trimetafosfato, uma melhoria agrícola comum. Exemplos de fosfatases úteis incluem monoéster fosfórico hidrolases, fosfomonoesterases, diéster fosfórico hidrolases, fosfodiesterases, monoéster trifosfórico hidrolases, fosforil anidrido hidrolases, pirofosfatases, fitase, trimetafosfatases, e trifosfatases. Por exemplo, as enzimas trimetafosfatase, trifosfatase e pirofosfatase quebram sequencialmente o trimetafosfato em fosfato inorgânico utilizável.[00251] Additionally, enzymes and other biological molecules can be used to release or sequester phosphate, nitrogen, and other key elemental nutrients for the plant to absorb from their various organic and inorganic forms in the soil. For example, phosphatases can be used to degrade phosphates in the environment into usable inorganic phosphates for plant use. Phosphates can be naturally occurring phosphates present in a plant's growth medium. Alternatively or additionally, the plant's growing medium can be supplemented with phosphates, such as trimetaphosphate, a common agricultural improvement. Examples of useful phosphatases include phosphoric monoester hydrolases, phosphomonoesterases, phosphoric diester hydrolases, phosphodiesterases, triphosphoric monoester hydrolases, phosphoryl anhydride hydrolases, pyrophosphatases, phytase, trimetaphosphatases, and triphosphatases. For example, the enzymes trimetaphosphatase, triphosphatase, and pyrophosphatase sequentially break down trimetaphosphate into usable inorganic phosphate.

[00252] A família de enzimas da nitrogenase converte nitrogênio atmosférico (N2) em amônia, convertendo, desse modo, nitrogênio que, de outra forma, estaria inacessível às plantas, em uma forma utilizável. Enzimas adequadas pertencem à família Nif de nitrogenases.[00252] The nitrogenase family of enzymes converts atmospheric nitrogen (N2) into ammonia, thereby converting nitrogen that would otherwise be inaccessible to plants, into a usable form. Suitable enzymes belong to the Nif family of nitrogenases.

[00253] A energia química também pode ser diretamente adicionada ao meio de crescimento da planta como adenosina-3- trifosfato, ferrodoxina ou enzimas adicionais que criam essa energia no sistema de BEMD. Esses são cofatores para as nitrogenases e estão limitados no solo. Assim, tais cofatores podem ser adicionados ao solo para intensificar as reações descritas acima.[00253] Chemical energy can also be directly added to the plant's growth medium as adenosine-3-triphosphate, ferrodoxin or additional enzymes that create this energy in the BEMD system. These are cofactors for nitrogenases and are limited in soil. Thus, such cofactors can be added to the soil to enhance the reactions described above.

[00254] Outros complementos que podem ser adicionados ao meio de crescimento da planta incluem amidos, celulose e derivados de celulose, pectinas, xilanos e arabinoxilanos, gorduras, ceras, óleos, ácidos fíticos, ligninas, ácidos húmicos, e outras fontes de nutrientes sobre as quais as classes de enzima acima exercem atividade.[00254] Other complements that can be added to the plant growth medium include starches, cellulose and cellulose derivatives, pectins, xylans and arabinoxylans, fats, waxes, oils, phytic acids, lignins, humic acids, and other sources of nutrients on which the above enzyme classes exert activity.

[00255] Usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 1, qualquer uma dessas enzimas podem ser incorporadas no sistema de BEMD para exibir nos esporos de BEMD, criando um construto de fusão compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento para direcionar o construto de fusão ao exosporium de um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão pode então ser expresso em um membro da família de Bacillus cereus, este membro da família de Bacillus cereus recombinante pode ser adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta usando métodos semelhantes descritos acima no Exemplo 1 para estimulação do crescimento da planta.[00255] Using methods similar to those described above in Example 1, any of these enzymes can be incorporated into the BEMD system for display on the BEMD spores, creating a fusion construct comprising the enzyme and a targeting sequence for directing the fusion construct. to the exosporium of a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct can then be expressed in a member of the Bacillus cereus family, this recombinant Bacillus cereus family member can be added to soil or other plant growth medium using similar methods described above in Example 1 for growth stimulation. of the plant.

Example 11. Use of phosphatase-expressing BEMD spores to stimulate plant growth

[00256] Esporos de BEMD que expressam Fosfatase A4 (PhoA4) de Bacillus subtilis foram criados, sintetizando-se um gene codificante de PhoA4 ligado à sequência de direcionamento da SEQ ID NO: 60. Este gene foi então introduzido em Bacillus thuringiensis e os esporos foram feitos como no Exemplo 1. Milho foi plantado com 2,54 cm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos de BEMD que expressam PhoA4 foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. Polifosfato foi adicionado aos potes em líquido numa taxa de 0,5 mg/pote. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.[00256] BEMD spores expressing Bacillus subtilis Phosphatase A4 (PhoA4) were created by synthesizing a gene encoding PhoA4 linked to the targeting sequence of SEQ ID NO: 60. This gene was then introduced into Bacillus thuringiensis and the spores were made as in Example 1. Corn was planted 2.54 cm deep in 10 cm deep pots filled with standard clay topsoil. BEMD spores expressing PhoA4 were diluted to a concentration of 1x104/ml in 50 ml of water and applied to each plant in the plantation. A water-only control was also included. Polyphosphate was added to the pots in liquid at a rate of 0.5 mg/pot. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 13 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during the two-week trial. At the end of the two weeks, the height of each plant was measured, and the measurements were normalized to the water-only control plants.

[00257] Os resultados são mostrados na Tabela 10. O milho crescido na presença de esporos de BEMD, que exibiam PhoA4, intensificaram o crescimento, especialmente na presença de polifosfato adicionado. Este efeito foi maior do que o efeito do polifosfato sozinho. Tabela 10. [00257] The results are shown in Table 10. Corn grown in the presence of BEMD spores, which exhibited PhoA4, intensified growth, especially in the presence of added polyphosphate. This effect was greater than the effect of polyphosphate alone. Table 10.

Example 12. Use of recombinant Bacillus cereus family members exhibiting enzymes involved in the synthesis of 2,3-butanediol or the synthesis or activation of gibberellic acid for stimulation of plant growth

[00258] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas envolvidas na síntese do composto 2,3-butanodiol promotor do crescimento da planta. In vivo, o 2,3-butanodiol é sintetizado por bactérias e fungos benéficos na rizosfera a partir de acetoína, diacetil, acetolactato, ou piruvato pelas enzimas acetolactato sintetase, a- acetolactato descarboxilase, piruvato descarboxilase, diacetil redutase, butanodiol desidrogenases, e acetoína redutase.[00258] The BEMD system can also be used to display enzymes involved in the synthesis of the plant growth-promoting compound 2,3-butanediol. In vivo, 2,3-butanediol is synthesized by beneficial bacteria and fungi in the rhizosphere from acetoin, diacetyl, acetolactate, or pyruvate by the enzymes acetolactate synthetase, α-acetolactate decarboxylase, pyruvate decarboxylase, diacetyl reductase, butanediol dehydrogenases, and acetoin reductase.

[00259] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas envolvidas na síntese ou ativação do composto ácido giberélico promotor do crescimento da planta. O ácido giberélico pode ser produzido a partir de formas inativas ou menos ativas através da ação de enzimas, incluindo, mas não se limitando a, hidroxilamina redutases, 2-oxogluturato dioxigenases, giberelina 2B/3B hidrolases, giberelina 3-oxidases, e giberelina 20-oxidases.[00259] The BEMD system can also be used to display enzymes involved in the synthesis or activation of the plant growth-promoting compound gibberellic acid. Gibberellic acid can be produced from inactive or less active forms through the action of enzymes, including, but not limited to, hydroxylamine reductases, 2-oxogluturate dioxygenases, gibberellin 2B/3B hydrolases, gibberellin 3-oxidases, and gibberellin 20 -oxidases.

[00260] Qualquer uma dessas enzimas pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para estimulação do crescimento da planta.[00260] Any of these enzymes can be incorporated into the BEMD system to display on BEMD spores using methods similar to those described above in Example 1. A fusion construct can be prepared comprising the enzyme and a targeting sequence that directs the enzyme to exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct is then expressed in a member of the Bacillus cereus family, and the Bacillus cereus family member is added to soil or other plant growth media to stimulate plant growth.

[00261] Para aumentar o efeito das enzimas exibidas em BEMD, o solo pode ser complementado com substratos para as enzimas. Por exemplo, o solo ou outro meio de crescimento da planta pode ser complementado com acetoína, que é um substrato para a acetoína redutase; piruvato, que é um substrato para a piruvato descarboxilase; diacetil, que é um substrato para a diacetil redutase; e/ou acetolatato, que é um substrato para a acetolatato descarboxilase. Alternativa ou adicionalmente, o solo ou outro meio de crescimento da planta pode ser complementado com formas menos potentes ou inativas do ácido giberélico, que se converterão em formas mais ativas pelas enzimas descritas acima no solo ou em outro meio de crescimento da planta.[00261] To increase the effect of the enzymes displayed in BEMD, the soil can be supplemented with substrates for the enzymes. For example, soil or other plant growth medium can be supplemented with acetoin, which is a substrate for acetoin reductase; pyruvate, which is a substrate for pyruvate decarboxylase; diacetyl, which is a substrate for diacetyl reductase; and/or acetolatate, which is a substrate for acetolatate decarboxylase. Alternatively or additionally, the soil or other plant growth medium may be supplemented with less potent or inactive forms of gibberellic acid, which will be converted to more active forms by the enzymes described above in the soil or other plant growth medium.

Example 13. Use of recombinant Bacillus cereus family members exhibiting proteases to protect plants from pathogens

[00262] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir proteases que protegem as plantas de um ou mais patógenos. Por exemplo, determinados patógenos bacterianos podem se comunicar entre membros individuais através da secreção de homosserinas de lactona bacteriana ou moléculas de sinalização relacionadas. Assim, proteases específicas para moléculas de sinalização de homosserina de lactona bacteriana podem proteger as plantas desses patógenos bacterianos, rompendo a comunicação entre bactérias, uma etapa essencial para que as bactérias secretem toxinas e regulem positivamente fatores de virulência. Proteases adequadas específicas para moléculas de sinalização de homosserina de lactona bacteriana incluem endopeptidases e exopeptidases.[00262] The BEMD system can also be used to display proteases that protect plants from one or more pathogens. For example, certain bacterial pathogens can communicate between individual members through the secretion of bacterial lactone homoserines or related signaling molecules. Thus, proteases specific to bacterial lactone homoserine signaling molecules can protect plants from these bacterial pathogens by disrupting communication between bacteria, an essential step for bacteria to secrete toxins and upregulate virulence factors. Suitable proteases specific to bacterial lactone homoserine signaling molecules include endopeptidases and exopeptidases.

[00263] Proteases específicas para moléculas de sinalização de homosserina de lactona bacteriana podem ser incorporadas no sistema de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a protease e uma sequência de direcionamento que direciona a protease ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para estimulação do crescimento da planta. A protease pode então degradar as moléculas de sinalização de homosserina de lactona bacteriana, bloqueando uma etapa chave na virulência desses organismos e, ajudando, desse modo, a proteger a planta desses patógenos. Outras proteases e peptidases trabalham efetivamente nesta capacidade no sistema de BEMD conforme demostrado acima no Exemplo 6 e 7.[00263] Proteases specific to bacterial lactone homoserine signaling molecules can be incorporated into the BEMD system using methods similar to those described above in Example 1. A fusion construct can be prepared comprising the protease and a targeting sequence that directs the protease to exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct is then expressed in a member of the Bacillus cereus family, and the Bacillus cereus family member is added to soil or other plant growth media to stimulate plant growth. The protease can then degrade the bacterial lactone homoserine signaling molecules, blocking a key step in the virulence of these organisms and thereby helping to protect the plant from these pathogens. Other proteases and peptidases work effectively in this capacity in the BEMD system as demonstrated above in Example 6 and 7.

Example 14. Use of recombinant Bacillus cereus family members displaying antimicrobial proteins and peptides to protect plants from pathogens

[00264] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas que exibem atividades antibacterianas e/ou antifúngicas que podem ajudar a proteger as plantas de um ou mais patógenos. Por exemplo, proteínas e peptídeos antimicrobianos, tais como bacteriocinas, lisozimas (por exemplo, LysM), sideróforos, conalbumina, albumina, lactoferrinas (por exemplo, LfcinB), ou TasA podem todos ser expressos no sistema de BEMD para exercer seu efeito sobre patógenos bacterianos e fúngicos de plantas. Bacteriocinas, albumina, conalbumina, lisozimas e lactoferrina exercem ação antimicrobiana direta sobre seus alvos, enquanto sideróforos ligam nutrientes essenciais que patógenos exigem para virulência. Por exemplo, o peptídeo LfcinB de lactoferrina, quando expresso na superfície do sistema de BEMD lisaria células bacterianas que são suscetíveis aos peptídeos de lactoferrina no meio de crescimento da planta. Essas proteínas e peptídeos têm ação específica sobre a seleção de micróbios, e podem direcionar seletivamente um grupo de patógenos sem obstruir todos os micróbios no meio de crescimento da planta.[00264] The BEMD system can also be used to display enzymes that exhibit antibacterial and/or antifungal activities that can help protect plants from one or more pathogens. For example, antimicrobial proteins and peptides such as bacteriocins, lysozymes (e.g., LysM), siderophores, conalbumin, albumin, lactoferrins (e.g., LfcinB), or TasA can all be expressed in the BEMD system to exert their effect on pathogens. bacterial and fungal diseases of plants. Bacteriocins, albumin, conalbumin, lysozymes, and lactoferrin exert direct antimicrobial action on their targets, while siderophores bind essential nutrients that pathogens require for virulence. For example, the lactoferrin peptide LfcinB, when expressed on the surface of the BEMD system would lyse bacterial cells that are susceptible to lactoferrin peptides in the plant growth medium. These proteins and peptides have specific action on microbe selection, and can selectively target a group of pathogens without obstructing all microbes in the plant's growth medium.

[00265] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para proteção das plantas de um ou mais patógenos.[00265] Any of these proteins or peptides can be incorporated into the BEMD system to display on BEMD spores using methods similar to those described above in Example 1. A fusion construct can be prepared comprising the enzyme and a targeting sequence that directs the enzyme to the exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct is then expressed in a member of the Bacillus cereus family, and the Bacillus cereus family member is added to soil or other plant growth media to protect plants from one or more pathogens.

Example 15. Use of BEMD spores expressing antimicrobial peptides to protect plants from bacteria

[00266] Foram sintetizados genes que codificam qualquer um dos dois peptídeos antimicrobianos, LfcinB (derivado da lactoferrina bovina) e LysM (derivado da lisozima de galinha), ligados a uma sequência de direcionamento de BclA (SEQ ID NO: 60), sob o controle do promotor de BclA (SEQ ID NO: 85). Os genes foram introduzidos em Bacillus thuringiensis BT013A e os esporos foram feitos, cultivando-se uma cultura durante a noite do Bacillus transformado em caldo de infusão de coração e cérebro, plaqueando em placas de ágar nutriente a 30°C e deixando crescer por 3 dias. Os esporos foram lavados das placas e lavados 3X em PBS. Culturas de Staphylococcus epidermidis foram cultivadas durante a noite em caldo TSB a 37°C. A cultura durante a noite foi então peletizada, lavada em PBS e resuspensa em PBS em um Abs595 = 0,2. 1x104 BEMD expressando os peptídeos LysM ou LfcinB foram incubados no PBS com o S. epidermidis por 3 horas a 37°C, com agitação. Uma amostra de controle de S. epidermidis foi deixada sem tratamento (nenhum esporo de BEMD). Após a incubação de 3 horas, as placas de diluição do S. epidermidis foram feitas e incubadas a 37°C durante a noite. Culturas de S. epidermidis foram contadas no dia seguinte, e a morte percentual foi quantificada. Na Tabela 11 abaixo, foi registrado um registro da atividade de morte. Os peptídeos de BEMD expressos mataram um número significativo de células de S. epidermidis. Isto se traduziria diretamente na morte de bactérias na rizosfera, sementes, ou outro material vegetal. A seleção de peptídeos específicos para determinadas classes de bactérias também poderia distorcer a população dos micro-organismos próximos à planta de uma forma benéfica, ou podem direcionar seletivamente patógenos chave. Tabela 11. [00266] Genes encoding either of two antimicrobial peptides, LfcinB (derived from bovine lactoferrin) and LysM (derived from chicken lysozyme), linked to a BclA targeting sequence (SEQ ID NO: 60) were synthesized under the BclA promoter control (SEQ ID NO: 85). Genes were introduced into Bacillus thuringiensis BT013A and spores were made by growing an overnight culture of the transformed Bacillus in heart and brain infusion broth, plating on nutrient agar plates at 30°C and allowed to grow for 3 days . Spores were washed from the plates and washed 3X in PBS. Staphylococcus epidermidis cultures were grown overnight in TSB broth at 37°C. The overnight culture was then pelleted, washed in PBS, and resuspended in PBS at an Abs595 = 0.2. 1x104 BEMD expressing LysM or LfcinB peptides were incubated in PBS with S. epidermidis for 3 hours at 37°C, with shaking. A control sample of S. epidermidis was left untreated (no BEMD spores). After the 3-hour incubation, S. epidermidis dilution plates were made and incubated at 37°C overnight. Cultures of S. epidermidis were counted the next day, and percent death was quantified. In Table 11 below, a record of death activity has been recorded. The expressed BEMD peptides killed a significant number of S. epidermidis cells. This would directly translate into the death of bacteria in the rhizosphere, seeds, or other plant material. Selection of specific peptides for certain classes of bacteria could also skew the population of microorganisms near the plant in a beneficial way, or could selectively target key pathogens. Table 11.

Example 16. Use of recombinant Bacillus cereus family members displaying enzymes to protect plants from pathogens

[00267] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas que protegem as plantas de um ou mais patógenos. Por exemplo, paredes de células de levedura e bolor são degradas por enzimas, tais como ß-1,3-glucanases, ß-1,4-glucanases, ß-1,6- glucanases, quitosinases, quitinases, proteínas semelhantes à quitosinase, e liticases. As paredes de células bacterianas são degradas por enzimas selecionadas de proteinases, proteases, mutanolisina, stafolisina e lisozimas. Cada uma dessas enzimas de degradação da parede celular pode ser expressa no sistema de BEMD e adicionada ao meio de crescimento da planta para inibição seletiva de micróbios patogênicos na rizosfera.[00267] The BEMD system can also be used to display enzymes that protect plants from one or more pathogens. For example, yeast and mold cell walls are degraded by enzymes such as ß-1,3-glucanases, ß-1,4-glucanases, ß-1,6-glucanases, chitosinases, chitosinase-like proteins, and lyticases. Bacterial cell walls are degraded by enzymes selected from proteinases, proteases, mutanolysin, stafolysin and lysozymes. Each of these cell wall degrading enzymes can be expressed in the BEMD system and added to the plant growth medium for selective inhibition of pathogenic microbes in the rhizosphere.

[00268] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir enzimas ou proteínas que protegem as plantas de patógenos de insetos ou de verme, por exemplo, suprimindo a predação do inseto e/ou verme das plantas desejadas. Exemplos de tais proteínas e enzimas de interesse incluem endotoxinas, toxinas Cty, outras toxinas de proteína inseticida, inibidores de protease, cisteína proteases, a proteína Cry5B, a proteína Cry21A, quitinase, proteínas inibidoras da protease, peptídeos inibidores da protease, inibidores de tripsina, e inibidores da protease de ponta-de-seta.[00268] The BEMD system can also be used to display enzymes or proteins that protect plants from insect or worm pathogens, for example, by suppressing insect and/or worm predation of desired plants. Examples of such proteins and enzymes of interest include endotoxins, Cty toxins, other insecticidal protein toxins, protease inhibitors, cysteine proteases, the Cry5B protein, the Cry21A protein, chitinase, protease inhibitor proteins, protease inhibitor peptides, trypsin inhibitors. , and arrowhead protease inhibitors.

[00269] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para proteção das plantas de patógenos.[00269] Any of these proteins or peptides can be incorporated into the BEMD system to display on BEMD spores using methods similar to those described above in Example 1. A fusion construct can be prepared comprising the enzyme and a targeting sequence that directs the enzyme to the exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct is then expressed in a member of the Bacillus cereus family, and the Bacillus cereus family member is added to soil or other plant growth media to protect plants from pathogens.

Example 17. Use of BEMD spores expressing an antifungal enzyme to protect plants, and demonstration of efficacy against Sacchromyces

[00270] Foi sintetizado um gene que codifica uma enzima antifúngica, ß-1,3-glucanase de Bacillus subtilis, ligado a uma sequência de direcionamento de BclA (SEQ ID NO: 60) sob o controle do promotor de BclA (SEQ ID NO: 85). O gene foi introduzido em Bacillus thuringiensis BT013A e os poros foram feitos, cultivando-se uma cultura durante a noite do Bacillus transformado em caldo de infusão de coração e cérebro, plaqueando em placas de ágar nutriente a 30°C e deixando crescer por 3 dias. Os esporos foram lavados das placas e lavados 3X em PBS. Culturas de Saccharomyces cerevisiae foram cultivadas durante a noite em caldo YZ a 37°C. A cultura durante a noite foi então peletizada, lavada em PBS e resuspensa em PBS em um Abs595 = 0,2. 1x104 BEMD expressando a ß-1,3-glucanase foi incubado em PBS com o Saccharomyces por 1 hora a 37°C, com agitação. Uma amostra de controle de Saccharomyces foi deixada sem tratamento (nenhum esporo de BEMD). Após a incubação de 3 horas, as placas de diluição do Saccharomyces foram feitas e incubadas a 37°C durante a noite. Culturas de Saccharomyces foram contadas no dia seguinte, e a morte percentual foi quantificada. A Tabela 12 abaixo mostra a atividade de morte dos esporos de BEMD que expressam a ß-1,3-glucanase. A enzima expressa por BEMD matou um número significativo de células de Saccharomyces. Isto se traduziria diretamente na morte de micro-organismosfúngicos na rizosfera, sementes, ou outro material vegetal. A seleção de proteínas específicas para determinadas classes de fungos também poderia distorcer a população dos micro-organismos próximos à planta de uma forma benéfica, ou podem direcionar seletivamente patógenos fúngicos chave. Tabela 12. [00270] A gene encoding an antifungal enzyme, ß-1,3-glucanase from Bacillus subtilis, was synthesized, linked to a BclA targeting sequence (SEQ ID NO: 60) under the control of the BclA promoter (SEQ ID NO : 85). The gene was introduced into Bacillus thuringiensis BT013A and pores were made by growing an overnight culture of the transformed Bacillus in heart and brain infusion broth, plating on nutrient agar plates at 30°C and allowed to grow for 3 days . Spores were washed from the plates and washed 3X in PBS. Cultures of Saccharomyces cerevisiae were grown overnight in YZ broth at 37°C. The overnight culture was then pelleted, washed in PBS, and resuspended in PBS at an Abs595 = 0.2. 1x104 BEMD expressing ß-1,3-glucanase was incubated in PBS with Saccharomyces for 1 hour at 37°C, with shaking. A control Saccharomyces sample was left untreated (no BEMD spores). After the 3-hour incubation, Saccharomyces dilution plates were made and incubated at 37°C overnight. Saccharomyces cultures were counted the next day, and percent death was quantified. Table 12 below shows the killing activity of BEMD spores expressing ß-1,3-glucanase. The enzyme expressed by BEMD killed a significant number of Saccharomyces cells. This would directly translate into the death of fungal microorganisms in the rhizosphere, seeds, or other plant material. Selection of proteins specific to certain classes of fungi could also skew the population of microorganisms near the plant in a beneficial way, or could selectively target key fungal pathogens. Table 12.

Example 18. Use of recombinant Bacillus cereus family members displaying plant immune system-stimulating peptides or proteins to protect plants from pathogens

[00271] O sistema de BEMD também pode ser usado para exibir peptídeos e proteínas potenciadores do sistema imune vegetal. Essas proteínas podem ser expressas na parte externa do esporo de BEMD e distribuídas no meio de crescimento da planta para estimular o sistema imune da planta para permitir que a planta se proteja dos patógenos de plantas. Exemplos de proteínas e peptídeos incluem as proteínas e peptídeos harpina, a-elastinas, ß-elastinas, sisteminas, fenilalanina amônia-liase, elicitinas, defensinas, criptogeína, e flagellina. A exposição das plantas a essas proteínas e peptídeos estimulará a resistência a vários patógenos de plantas nas plantas.[00271] The BEMD system can also be used to display peptides and proteins that enhance the plant immune system. These proteins can be expressed on the outside of the BEMD spore and distributed into the plant growth medium to stimulate the plant's immune system to allow the plant to protect itself from plant pathogens. Examples of proteins and peptides include the harpin proteins and peptides, α-elastins, β-elastins, systemins, phenylalanine ammonia lyase, elicitins, defensins, cryptogein, and flagellin. Exposure of plants to these proteins and peptides will stimulate resistance to various plant pathogens in plants.

[00272] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta para proteção das plantas de patógenos.[00272] Any of these proteins or peptides can be incorporated into the BEMD system to display on BEMD spores using methods similar to those described above in Example 1. A fusion construct can be prepared comprising the enzyme and a targeting sequence that directs the enzyme to the exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct is then expressed in a member of the Bacillus cereus family, and the Bacillus cereus family member is added to soil or other plant growth media to protect plants from pathogens.

Example 19. Use of recombinant Bacillus cereus family members displaying a root- or leaf-binding protein or peptide to immobilize the recombinant Bacillus cereus family member in a root system of a plant or in the leaves of a plant

[00273] As proteínas e peptídeos de ligação à raiz e folhas também podem ser incorporadas no sistema de BEMD para permitir que os esporos de BEMD sejam imobilizados em um sistema de raiz ou nas folhas de uma planta. A exibição desses ligantes de ligação à raiz ou folhas nos esporos de BEMD permite o direcionamento dos esporos para o sistema de raiz de uma planta ou para as subestruturas do sistema de raiz ou para as folhas ou para as subestruturas das folhas para manter os esporos de BEMD numa localização ideal para que outras moléculas biológicas e enzimas sejam eficazes.[00273] Root and leaf binding proteins and peptides can also be incorporated into the BEMD system to allow BEMD spores to be immobilized in a root system or leaves of a plant. Display of these root- or leaf-binding ligands on BEMD spores allows the targeting of spores to a plant's root system or root system substructures or to leaves or leaf substructures to maintain the spores of BEMD in an ideal location for other biological molecules and enzymes to be effective.

[00274] Por exemplo, a ricadesina é um ligante de ligação que se liga aos filamentos da raiz. Assim, a exibição da ricadesina nos esporos de BEMD direciona os esporos para os filamentos da raiz. Proteínas adicionais que poderiam ser utilizadas para a ligação seletiva às raízes da planta ou às folhas incluem adesinas, flagellina, omptinas, lectinas, proteínas do píli, proteínas do curlus, intiminas, invasinas, aglutinina, proteínas afimbriais, TasA, ou YuaB.[00274] For example, ricadesin is a binding ligand that binds to root filaments. Thus, the display of ricadhesin on BEMD spores directs the spores to the root filaments. Additional proteins that could be used for selective binding to plant roots or leaves include adhesins, flagellin, omptins, lectins, pili proteins, curlus proteins, intimins, invasins, agglutinin, afimbrial proteins, TasA, or YuaB.

[00275] Essas proteínas e peptídeos de ligação à raiz ou às folhas podem ser incorporadas no sistema de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a proteína ou peptídeo de ligação à raiz ou às folhas e uma sequência de direcionamento que direciona a proteína ou peptídeo ao exosporium quando o construto é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão contendo o ligante de ligação à raiz ou folha é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus. Tais construtos de fusão podem ser coexpressos com um ou mais construtos de fusão adicionais compreendendo qualquer uma das enzimas benéficas discutidas neste documento (por exemplo, uma enzima envolvida na síntese de um hormônio vegetal, uma enzima que degrade uma fonte de nutriente, ou uma protease que proteja uma planta de um patógeno). O membro da família de Bacillus cereus recombinante é adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta, ou aplicado às folhas de uma planta. O ligante de ligação à raiz ou folha direciona o membro da família de Bacillus cereus para o sistema de raízes da planta ou para as folhas da planta e o imobiliza, permitindo, assim, que o construto de fusão coexpresso exerça seus efeitos em estreita proximidade ao sistema de raízes ou folhas.[00275] Such root- or leaf-binding proteins and peptides can be incorporated into the BEMD system using methods similar to those described above in Example 1. A fusion construct can be prepared comprising the root- or leaf-binding protein or peptide and a targeting sequence that directs the protein or peptide to the exosporium when the construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct containing the root or leaf binding ligand is then expressed in a member of the Bacillus cereus family. Such fusion constructs may be coexpressed with one or more additional fusion constructs comprising any of the beneficial enzymes discussed herein (e.g., an enzyme involved in the synthesis of a plant hormone, an enzyme that degrades a nutrient source, or a protease that protects a plant from a pathogen). The recombinant Bacillus cereus family member is added to soil or other plant growth medium, or applied to the leaves of a plant. The root- or leaf-binding ligand directs the Bacillus cereus family member to the plant root system or plant leaves and immobilizes it, thereby allowing the co-expressed fusion construct to exert its effects in close proximity to the root or leaf system.

Example 20. Use of recombinant Bacillus cereus family members that exhibit proteins or enzymes to enhance plant stress resistance

[00276] As proteínas, peptídeos e enzimas que potencializam a resistência ao estresse em uma planta podem ser incorporados no sistema de BEMD e distribuídos às plantas alvo através da adição Às raízes, folhas, ou ao meio de crescimento da planta. Durante períodos de estresse, as plantas liberam compostos relacionados ao estresse, incluindo o ácido aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), espécies reativas de oxigênio, e outros, resultando em um impacto negativo sobre o crescimento da planta. O sistema de BEMD pode ser usado para exibir enzimas que degradam esses compostos relacionados ao estresse, tais como a ácido aminociclopropano-1-carboxílico desaminase, superóxido dismutases, oxidases, catalases, e outras enzimas que agem em espécies reativas de oxigênio. Tais enzimas reduzem a quantidade desses compostos relacionados ao estresse e permitem que as plantas continuem a crescer e até mesmo se desenvolvam sob condições de estresse.[00276] Proteins, peptides and enzymes that enhance stress resistance in a plant can be incorporated into the BEMD system and distributed to target plants through addition to the roots, leaves, or the plant's growth medium. During periods of stress, plants release stress-related compounds, including aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC), reactive oxygen species, and others, resulting in a negative impact on plant growth. The BEMD system can be used to display enzymes that degrade these stress-related compounds, such as aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase, superoxide dismutases, oxidases, catalases, and other enzymes that act on reactive oxygen species. Such enzymes reduce the amount of these stress-related compounds and allow plants to continue to grow and even develop under stressful conditions.

[00277] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta ou aplicado às folhas de uma planta para potencializar a resistência ao estresse de uma planta alvo.[00277] Any of these proteins or peptides can be incorporated into the BEMD system to display on BEMD spores using methods similar to those described above in Example 1. A fusion construct can be prepared comprising the enzyme and a targeting sequence that directs the enzyme to the exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct is then expressed in a member of the Bacillus cereus family, and the Bacillus cereus family member is added to soil or other plant growth media or applied to the leaves of a plant to enhance the stress resistance of a plant. target plant.

Example 21. Preparation of BEMD spores expressing the protective enzyme catalase

[00278] Foi sintetizado um gene que codifica a enzima protetora catalase de Bacillus cereus ligado a uma sequência de direcionamento de BetA (SEQ ID NO: 61) sob o controle do promotor de BetA (SEQ ID NO: 86). Este gene foi introduzido em Bacillus thuringiensis BT013A . Os esporos foram feitos, cultivando-se uma cultura durante a noite do Bacillus transformado e da cepa do tipo selvagem em caldo de infusão de coração e cérebro, plaqueando em placas de ágar nutriente a 30°C e deixando crescer por 3 dias. Os esporos foram lavados das placas e lavados 3X em PBS. 3 gotas de peróxido de hidrogênio foram adicionadas em cada pélete de esporo. A enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em água e gás O2. Os esporos de controle não produziram bolhas, enquanto os esporos de BEMD com catalase rapidamente o fizeram, demonstrando a atividade da enzima na superfície dos esporos. Outras enzimas protetoras podem ser exibidas de uma forma semelhante e distribuídos à planta para agirem sobre radicais livres produzidos durante o estresse pelas plantas.[00278] A gene encoding the protective enzyme catalase from Bacillus cereus was synthesized linked to a BetA targeting sequence (SEQ ID NO: 61) under the control of the BetA promoter (SEQ ID NO: 86). This gene was introduced into Bacillus thuringiensis BT013A. Spores were made by growing an overnight culture of the transformed Bacillus and the wild-type strain in brain heart infusion broth, plating on nutrient agar plates at 30°C, and growing for 3 days. Spores were washed from the plates and washed 3X in PBS. 3 drops of hydrogen peroxide were added to each spore pellet. The catalase enzyme converts hydrogen peroxide into water and O2 gas. Control spores did not produce bubbles, while BEMD spores with catalase quickly did so, demonstrating enzyme activity on the spore surface. Other protective enzymes can be displayed in a similar way and distributed to the plant to act on free radicals produced during plant stress.

Example 22. Use of recombinant Bacillus cereus family members that exhibit proteins or enzymes that protect seeds or plants from environmental stress

[00279] As proteínas, peptídeos e enzimas que protegem uma planta de um estresse ambiental podem ser incorporados no sistema de BEMD e distribuídos às plantas alvo através da adição às raízes, folhas,fruto, ou ao meio de crescimento da planta. Durante períodos de congelamento, as plantas podem ser danificadas pelo efeito do gelo. O sistema de BEMD pode ser usado para exibir peptídeos, proteínas ou enzimas que protejam as plantas de tais efeitos. Por exemplo, o sistema de BEMD pode ser usado para exibir colina desidrogenases, que agem produzindo produtos protetores que protegem a planta ou semente da geada. Substratos para essas enzimas (por exemplo, colina e/ou derivados de colina) também podem ser adicionado ao meio de crescimento da planta. A adição desses substratos pode potencializar a quantidade de protetor (betaína e produtos químicos relacionados) produzida no ambiente da planta pelas enzimas expressas por BEMD. Derivados de betaína são conhecidos por proteger as sementes do estresse do frio.[00279] Proteins, peptides and enzymes that protect a plant from environmental stress can be incorporated into the BEMD system and distributed to target plants through addition to the roots, leaves, fruit, or the plant's growth medium. During periods of freezing, plants can be damaged by the effect of frost. The BEMD system can be used to display peptides, proteins or enzymes that protect plants from such effects. For example, the BEMD system can be used to display choline dehydrogenases, which act to produce protective products that protect the plant or seed from frost. Substrates for these enzymes (e.g., choline and/or choline derivatives) can also be added to the plant's growth medium. The addition of these substrates can enhance the amount of protectant (betaine and related chemicals) produced in the plant environment by the enzymes expressed by BEMD. Betaine derivatives are known to protect seeds from cold stress.

[00280] Qualquer uma dessas proteínas ou peptídeos pode ser incorporada no sistema de BEMD para se exibir em esporos de BEMD usando métodos semelhantes àqueles descritos acima no Exemplo 1. Um construto de fusão pode ser preparado compreendendo a enzima e uma sequência de direcionamento que direciona a enzima ao exosporium quando o construto de fusão é expresso em um membro da família de Bacillus cereus. O construto de fusão é então expresso em um membro da família de Bacillus cereus, e o membro da família de Bacillus cereusé adicionado ao solo ou a outro meio de crescimento da planta ou aplicado às folhas de uma planta para proteger a planta dos estresses e fatores ambientais.[00280] Any of these proteins or peptides can be incorporated into the BEMD system to display on BEMD spores using methods similar to those described above in Example 1. A fusion construct can be prepared comprising the enzyme and a targeting sequence that directs the enzyme to the exosporium when the fusion construct is expressed in a member of the Bacillus cereus family. The fusion construct is then expressed in a member of the Bacillus cereus family, and the Bacillus cereus family member is added to soil or other plant growth media or applied to the leaves of a plant to protect the plant from stresses and factors. environmental.

Example 23. Enhanced expression of fusion constructs in the BEMD system by use of enhanced or alternative promoter elements

[00281] O sistema de BEMD pode exibir uma ampla gama de proteínas, peptídeos e enzimas usando uma ou mais das sequências de direcionamento descritas neste documento. Algumas dessas sequências de direcionamento têm uma alta afinidade pelo exosporium, o que poderia ser benéfico para a expressão da proteína de fusão, mas seu baixo nível de expressão da proteína de fusão limita seu uso no sistema de BEMD. Para essas proteínas e sequências de fusão, promotores alternativos de esporulação de alta expressão podem ser usados, em vez dos promotores nativos.[00281] The BEMD system can display a wide range of proteins, peptides and enzymes using one or more of the targeting sequences described herein. Some of these targeting sequences have a high affinity for exosporium, which could be beneficial for fusion protein expression, but their low level of fusion protein expression limits their use in the BEMD system. For these proteins and fusion sequences, alternative high expression sporulation promoters can be used instead of the native promoters.

[00282] Por exemplo, a SEQ ID NO: 13 (aminoácidos 1-39 do gene 3572 deB. weihenstephensis KBAB4) fornece uma sequência N- terminal muito eficaz para a distribuição de proteínas ao exosporium dos membros da família de Bacillus cereus, como mostrado na Tabela 13 abaixo. Todos os genes foram sintetizados em sua forma completa (incluindo regiões promotoras e regiões codificantes das proteínas de fusão), conforme descrito neste documento. Quando os elementos promotores nativos para o gene 3572 de B. weihenstephensis KBAB4 (SEQ ID NO: 88) foram usados para expressar uma proteína de fusão compreendendo a sequência de direcionamento da SEQ ID NO: 13 fundida a uma enzima ß-galactosidase (de E. coli), um baixo nível da proteína de fusão foi expresso, levando a uma redução da atividade da enzima na superfície do esporo. A atividade da enzima foi medida pela conversão de 0,5M o-nitrofenilgalactosídeo em solução durante 10 minutos. A conversão da enzima foi medida com um espectrofotômetro em ABS540. A substituição dos elementos promotores nativos do gene 3572 de B. weihenstephensis KBAB4 pelos promotores de alta expressão da SEQ ID NO: 86 (B. anthracis BetA/BAS3290) ou SEQ ID NO: 89 (proteína YVTN e-hélice de B. weihenstephensis KBAB4) levou a um aumento dramático da atividade enzimática dos esporos. Por outro lado, a substituição dos elementos promotores nativos para o gene 3572 de B. weihenstephensis KBAB4 pelo promotor nativo para B. anthracis Sterne BAS1882 (SEQ ID NO: 87) levou a uma diminuição da atividade enzimática dos esporos. O nível de expressão da sequência de direcionamento da SEQ ID NO: 13 fundida à ß-galactosidase foi muito mais menor (0,38X) quando acionado pelo promotor de BAS1882 (SEQ ID NO: 87), e foi enormemente melhorado quando acionado a partir do promotor BetA (SEQ ID NO: 86) ou promotor da proteína YVTN (SEQ ID NO: 89). Tabela 13. [00282] For example, SEQ ID NO: 13 (amino acids 1-39 of B. weihenstephensis KBAB4 gene 3572) provides a very effective N-terminal sequence for delivering proteins to the exosporium of members of the Bacillus cereus family, as shown in Table 13 below. All genes were synthesized in their complete form (including promoter regions and fusion protein coding regions), as described in this document. When the native promoter elements for the B. weihenstephensis KBAB4 gene 3572 (SEQ ID NO: 88) were used to express a fusion protein comprising the targeting sequence of SEQ ID NO: 13 fused to a ß-galactosidase enzyme (from E . coli), a low level of the fusion protein was expressed, leading to a reduction in enzyme activity on the spore surface. Enzyme activity was measured by converting 0.5M o-nitrophenylgalactoside in solution for 10 minutes. Enzyme conversion was measured with a spectrophotometer in ABS540. Replacement of the native promoter elements of the B. weihenstephensis KBAB4 gene 3572 with the high expression promoters of SEQ ID NO: 86 (B. anthracis BetA/BAS3290) or SEQ ID NO: 89 (YVTN e-helix protein of B. weihenstephensis KBAB4 ) led to a dramatic increase in the enzymatic activity of the spores. On the other hand, the replacement of the native promoter elements for gene 3572 of B. weihenstephensis KBAB4 with the native promoter for B. anthracis Sterne BAS1882 (SEQ ID NO: 87) led to a decrease in the enzymatic activity of the spores. The expression level of the SEQ ID NO: 13 targeting sequence fused to ß-galactosidase was much lower (0.38X) when driven by the BAS1882 promoter (SEQ ID NO: 87), and was greatly improved when driven from of the BetA promoter (SEQ ID NO: 86) or YVTN protein promoter (SEQ ID NO: 89). Table 13.

[00283] Exemplo 24. Isolamento e identificação de cepas bacterianas promotoras do crescimento da planta[00283] Example 24. Isolation and identification of plant growth-promoting bacterial strains

[00284] Amostras de solo de rizosferas das plantas mais resistentes e mais saudáveis de batata (Solanum tuberosum), abobrinha amarela (Cucurbita pepo), tomate (Solanum lycopersicum), e feijão-da-Espanha (Phaseolus coccineus) foram coletadas, diluídas em água estéril, e espelhadas em placas de ágar nutriente. Isolados bacterianos que demonstraram altas taxas de crescimento e foram capazes de serem passados e propagados foram selecionados para estudo adicional. As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de alface por tratamento foram plantadas em uma profundidade de 1 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em potes de 4 cm com 0,5 µl de meios de ressupensos em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. Depois de uma semana, a altura da planta e diâmetros da folha, bem como a saúde geral das plantas foram coletados. A triagem inicial de isolados de rizosfera resultou na obtenção de mais de 200 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera das quatro plantas. Algumas das espécies bacterianas são descritas na Tabela 14. As cepas identificadas estão indicadas por suas identificações bacterianas adequadas. Outras cepas estão indicadas por seus números de identificação desconhecidos. Os inóculos que geraram resultados próximos ao controlo (+/- 2%) não foram incluídos na tabela. Tabela 14 [00284] Soil samples from rhizospheres of the most resistant and healthiest potato (Solanum tuberosum), yellow zucchini (Cucurbita pepo), tomato (Solanum lycopersicum), and Spanish bean (Phaseolus coccineus) plants were collected, diluted in sterile water, and mirrored on nutrient agar plates. Bacterial isolates that demonstrated high growth rates and were able to be passaged and propagated were selected for further study. The selected strains were cultivated in minimal media (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.50 g, MgSO4 7H2O 0.15 g, CaCl2 2H2O 0.013 g, and glucose 1 g, per L of dry weight) . Overnight (30°C) cultures of the selected strains were spun, the media decanted, and resuspended in an equal amount of distilled water. Ten lettuce seeds per treatment were planted to a depth of 1 cm in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The seeds were inoculated in the plantation in 4 cm pots with 0.5 µl of resuspended media in water mixed with 10 ml of H2O. Ten ml of H2O was enough to distribute the bacteria in the 3 in3 (7.62 cm3) of soil, as well as to saturate the soil for proper seed germination. Plants were grown at temperatures between 65-75°F (18-24°C) with 11 hours of light/day, and 5 ml of watering every 3 days. After a week, plant height and leaf diameters as well as overall plant health were collected. Initial screening of rhizosphere isolates resulted in obtaining more than 200 distinct species of bacteria and fungi from the rhizosphere of the four plants. Some of the bacterial species are described in Table 14. Identified strains are indicated by their appropriate bacterial identifications. Other strains are indicated by their unknown identification numbers. Inocula that generated results close to the control (+/- 2%) were not included in the table. Table 14

[00285] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito na saúde geral da planta e na altura da planta no ensaio com alface inicial foram submetidas à identificação adicional. As cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo de Luria Bertani a 37C, e as culturas de durante a noite foram giradas em uma centrífuga. Os meios foram decantados e o pélete bacteriano restante foram submetidos ao isolamento de DNA cromossômico usando o kit Bacterial Chromosomal DNA Isolation da Qiagen. O DNA cromossômico foi submetido à amplificação por PCR das regiões codificantes de rRNA 16S usando os iniciadores E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ ID NO: 122), E1099R A 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQ ID NO: 123), e E1099R B 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQ ID NO: 124). Os amplicons do PCR foram purificados usando um kit de purificação de PCR da Promega, e os amplicons resultante foram diluídos e enviados ao DNA Core da University of Missouri para o sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram comparadas ao banco de dados de isolados bacterianos do NCBI BLAST, e o gênero e espécies foram identificados por comparação direta a cepas conhecidas. As principais espécies identificadas estão indicadas na Tabela 14. Em muitos casos, as sequências de DNA de rRNA 16S foram somente capazes de delinear o gênero da cepa bacteriana selecionada. Nos casos onde uma identificação direta não aparecia, análises bioquímicas adicionais, usando métodos padrão do campo, foram realizadas para diferenciar as cepas nas espécies e níveis da cepa, e estão listadas na Tabela 15. [00285] The bacterial strains that produced the greatest effect on overall plant health and plant height in the early lettuce trial were subjected to further identification. Bacterial strains were grown overnight in Luria Bertani broth at 37°C, and overnight cultures were spun in a centrifuge. The media was decanted and the remaining bacterial pellet was subjected to chromosomal DNA isolation using the Qiagen Bacterial Chromosomal DNA Isolation kit. Chromosomal DNA was subjected to PCR amplification of the 16S rRNA coding regions using the primers E338F 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3' (SEQ ID NO: 122), E1099R A 5'-GGG TTG CGC TCG TTG C-3' (SEQ ID NO: 123), and E1099R B 5'-GGG TTG CGC TCG TTA C-3' (SEQ ID NO: 124). PCR amplicons were purified using a Promega PCR purification kit, and the resulting amplicons were diluted and sent to the University of Missouri DNA Core for DNA sequencing. DNA sequences were compared to the NCBI BLAST database of bacterial isolates, and the genus and species were identified by direct comparison to known strains. The main species identified are indicated in Table 14. In many cases, the 16S rRNA DNA sequences were only able to delineate the genus of the selected bacterial strain. In cases where a direct identification did not appear, additional biochemical analyses, using standard field methods, were performed to differentiate the strains at species and strain levels, and are listed in Table 15.

Example 25. Isolation and identification of additional plant growth-promoting bacterial strains

[00286] Amostras de solo de campos agrícolas próximos a Gas, Kansas foram coletadas, diluídas em água estéril, e espalhadas em placas de ágar nutriente. Isolados bacterianos que demonstraram altas taxas de crescimento e foram capazes de serem passados e propagados foram selecionados para estudo adicional. As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15g, CaCl2 2H20 0,013g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Sementes de milho foram revestidas com polímero de semente comercial com água sozinhas (1.6 µl por total de semente) ou polímero de semente comercial contendo as cepas bacterianas selecionadas (1,6 µl por total de semente). As sementes revestidas foram plantadas em potes de 7,62 cm de diâmetro (3 polegadas) numa profundidade de 1 polegada (2,54 cm) em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os grandes debris. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 18-24oC (65-75oF) com 11 horas de luz/dia, e 50 ml de regamento na plantação e a cada 3 dias. Depois de duas semanas, a altura da planta e diâmetros da folha, bem como a saúde geral das plantas foram coletados. Para ensaios de germinação e determinação do comprimento da raiz em 3 dias, as sementes foram revestidas conforme indicado acima e dispersas uniformemente em 10 sementes por toalha de papal. As toalhas de papel foram molhadas com 10 ml de água, enroladas, colocadas em uma pequena sacola plástica e incubadas a 30°C ou colocadas em uma esteira de aquecimento de germinação a 27-30°C (80-85°F). As medições da raiz foram registradas após 3 dias. A triagem inicial de isolados de rizosfera resultou na obtenção de mais de 100 espécies distintas de bactérias e fungos da rizosfera. Algumas das espécies bacterianas são descritas na Tabela 16. As cepas identificadas estão indicadas por suas identificações bacterianas adequadas. Tabela 16 [00286] Soil samples from agricultural fields near Gas, Kansas were collected, diluted in sterile water, and spread on nutrient agar plates. Bacterial isolates that demonstrated high growth rates and were able to be passaged and propagated were selected for further study. The selected strains were cultivated in minimal media (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.50 g, MgSO4 7H2O 0.15g, CaCl2 2H20 0.013g, and glucose 1 g, per L of dry weight). Overnight (30°C) cultures of the selected strains were spun, the media decanted, and resuspended in an equal amount of distilled water. Corn seeds were coated with commercial seed polymer with water alone (1.6 µl per total seed) or commercial seed polymer containing the selected bacterial strains (1.6 µl per total seed). The coated seeds were planted in 7.62 cm diameter (3 inch) pots at a depth of 1 inch (2.54 cm) in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The plants were grown at temperatures between 18-24oC (65-75oF) with 11 hours of light/day, and 50 ml of watering at the plantation and every 3 days. After two weeks, plant height and leaf diameters as well as overall plant health were collected. For germination assays and 3-day root length determination, seeds were coated as indicated above and dispersed evenly at 10 seeds per papad towel. Paper towels were wetted with 10 ml of water, rolled up, placed in a small plastic bag, and incubated at 30°C or placed on a germination heating mat at 27-30°C (80-85°F). Root measurements were recorded after 3 days. Initial screening of rhizosphere isolates resulted in obtaining more than 100 distinct species of rhizosphere bacteria and fungi. Some of the bacterial species are described in Table 16. Identified strains are indicated by their appropriate bacterial identifications. Table 16

[00287] As cepas bacterianas que produziram o maior efeito na saúde da planta são descritas na Tabela 16. As cepas bacterianas foram cultivadas durante a noite em caldo de Luria Bertani a 37C, e as culturas de durante a noite foram giradas em uma centrífuga. Os meios foram decantados e o pélete bacteriano restante foram submetidos ao isolamento de DNA cromossômico usando o kit Bacterial Chromosomal DNA Isolation da Qiagen. O DNA cromossômico foi submetido à amplificação por PCR das regiões codificantes de rRNA 16S usando os iniciadores E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ ID NO: 122), E1099R A 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQ ID NO: 123), e E1099R B 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQ ID NO: 124). Os amplicons do PCR foram purificados usando um kit de purificação de PCR da Promega, e os amplicons resultante foram diluídos e enviados ao DNA Core da University of Missouri para o sequenciamento de DNA. As sequências de DNA foram comparadas ao banco de dados de isolados bacterianos do NCBI BLAST, e o gênero e espécies foram identificados por comparação direta a cepas conhecidas. As principais espécies identificadas estão indicadas na Tabela 16. Em muitos casos, as sequências de DNA de rRNA 16S foram somente capazes de delinear o gênero da cepa bacteriana selecionada. Nos casos onde uma identificação direta não aparecia, análises bioquímicas adicionais, usando métodos padrão do campo, foram realizadas para diferenciar as cepas nas espécies e níveis da cepa, e as cepas diferenciadas estão listadas na Tabela 17. [00287] The bacterial strains that produced the greatest effect on plant health are described in Table 16. The bacterial strains were grown overnight in Luria Bertani broth at 37°C, and the overnight cultures were rotated in a centrifuge. The media was decanted and the remaining bacterial pellet was subjected to chromosomal DNA isolation using the Qiagen Bacterial Chromosomal DNA Isolation kit. Chromosomal DNA was subjected to PCR amplification of the 16S rRNA coding regions using the primers E338F 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3' (SEQ ID NO: 122), E1099R A 5'-GGG TTG CGC TCG TTG C-3' (SEQ ID NO: 123), and E1099R B 5'-GGG TTG CGC TCG TTA C-3' (SEQ ID NO: 124). PCR amplicons were purified using a Promega PCR purification kit, and the resulting amplicons were diluted and sent to the University of Missouri DNA Core for DNA sequencing. DNA sequences were compared to the NCBI BLAST database of bacterial isolates, and the genus and species were identified by direct comparison to known strains. The main species identified are indicated in Table 16. In many cases, the 16S rRNA DNA sequences were only able to delineate the genus of the selected bacterial strain. In cases where a direct identification did not appear, additional biochemical analyzes using standard field methods were performed to differentiate the strains at species and strain levels, and the differentiated strains are listed in Table 17.

[00288] wk = crescimento semanal ou baixo crescimento[00288] wk = weekly growth or low growth

Example 26. Testing for plant growth-promoting bacterial strains in alfalfa

[00289] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e as bactérias ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de alfafa revestidas por Zeba foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 0,6 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 µl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. A alfafa foi deixada crescer por 1 semana para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 18. Tabela 18 [00289] The selected strains were cultivated in minimal media (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.50 g, MgSO4 7H2O 0.15 g, CaCl2 2H2O 0.013 g, and glucose 1 g, per L of dry weight). Overnight cultures (30°C) of the selected strains were spun, the media decanted, and the bacteria resuspended in an equal amount of distilled water. Ten Zeba-coated alfalfa seeds were planted for each treatment at a depth of 0.6 cm in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The seeds were inoculated into the plantation in 0.5 µl of bacteria resuspended in water mixed with 10 ml of H2O. Ten ml of H2O was enough to distribute the bacteria in the 3 in3 (7.62 cm3) of soil, as well as to saturate the soil for proper seed germination. Plants were grown at temperatures between 65-75°F (18-24°C) with 11 hours of light/day, and 5 ml of watering every 3 days. Alfalfa was allowed to grow for 1 week to analyze the emergence and early development of the plants under the conditions described. The identified strains indicated by their appropriate bacterial identifications and final height data are listed in Table 18. Table 18

Example 27. Testing plant growth-promoting bacterial strains in cucumbers

[00290] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de pepino foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 1 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 µl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. Os pepinos foram deixados crescer por 2 semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 19. Tabela 19 [00290] The selected strains were cultivated in minimal media (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.50 g, MgSO4 7H2O 0.15 g, CaCl2 2H2O 0.013 g, and glucose 1 g, per L of dry weight). Overnight (30°C) cultures of the selected strains were spun, the media decanted, and resuspended in an equal amount of distilled water. Ten cucumber seeds were planted for each treatment at a depth of 1 cm in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The seeds were inoculated into the plantation in 0.5 µl of bacteria resuspended in water mixed with 10 ml of H2O. Ten ml of H2O was enough to distribute the bacteria in the 3 in3 (7.62 cm3) of soil, as well as to saturate the soil for proper seed germination. Plants were grown at temperatures between 65-75°F (18-24°C) with 11 hours of light/day, and 5 ml of watering every 3 days. Cucumbers were allowed to grow for 2 weeks to analyze the emergence and early development of the plants under the conditions described. The identified strains indicated by their appropriate bacterial identifications and final height data are listed in Table 19. Table 19

Example 28. Testing for plant growth-promoting bacterial strains in yellow zucchini

[00291] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de abobrinha amarela foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 1 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 µl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. A abobrinha foi deixada crescer por 2 semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas, dados de altura final, e dados de diâmetro de folha final (pela extensão das duas folhas) estão listadas na Tabela 20. Tabela 20 [00291] The selected strains were cultivated in minimal media (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.50 g, MgSO4 7H2O 0.15 g, CaCl2 2H2O 0.013 g, and glucose 1 g, per L of dry weight). Overnight (30°C) cultures of the selected strains were spun, the media decanted, and resuspended in an equal amount of distilled water. Ten yellow zucchini seeds were planted for each treatment at a depth of 1 cm in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The seeds were inoculated into the plantation in 0.5 µl of bacteria resuspended in water mixed with 10 ml of H2O. Ten ml of H2O was enough to distribute the bacteria in the 3 in3 (7.62 cm3) of soil, as well as to saturate the soil for proper seed germination. Plants were grown at temperatures between 65-75°F (18-24°C) with 11 hours of light/day, and 5 ml of watering every 3 days. Zucchini was allowed to grow for 2 weeks to analyze the emergence and early development of the plants under the conditions described. The identified strains indicated by their appropriate bacterial identifications, final height data, and final leaf diameter data (by the length of the two leaves) are listed in Table 20. Table 20

Example 29. Testing plant growth-promoting bacterial strains in ryegrass

[00292] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Trinta sementes de azevém foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 0,3 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 µl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. O azevém foi deixado crescer por 1,5 semana para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 21. Tabela 21 [00292] The selected strains were cultivated in minimal media (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.50 g, MgSO4 7H2O 0.15 g, CaCl2 2H2O 0.013 g, and glucose 1 g, per L of dry weight). Overnight (30°C) cultures of the selected strains were spun, the media decanted, and resuspended in an equal amount of distilled water. Thirty ryegrass seeds were planted for each treatment at a depth of 0.3 cm in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The seeds were inoculated into the plantation in 0.5 µl of bacteria resuspended in water mixed with 10 ml of H2O. Ten ml of H2O was enough to distribute the bacteria in the 3 in3 (7.62 cm3) of soil, as well as to saturate the soil for proper seed germination. Plants were grown at temperatures between 65-75°F (18-24°C) with 11 hours of light/day, and 5 ml of watering every 3 days. Ryegrass was allowed to grow for 1.5 weeks to analyze the emergence and early development of the plants under the conditions described. The identified strains indicated by their appropriate bacterial identifications and final height data are listed in Table 21. Table 21

Example 30 Testing plant growth-promoting bacterial strains in corn

[00293] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de milho foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 µl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. O milho foi deixado crescer por 2 semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 22. Tabela 22 [00293] The selected strains were cultivated in minimal media (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.50 g, MgSO4 7H2O 0.15 g, CaCl2 2H2O 0.013 g, and glucose 1 g, per L of dry weight). Overnight (30°C) cultures of the selected strains were spun, the media decanted, and resuspended in an equal amount of distilled water. Ten corn seeds were planted for each treatment at a depth of 2.5 cm in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The seeds were inoculated into the plantation in 0.5 µl of bacteria resuspended in water mixed with 10 ml of H2O. Ten ml of H2O was enough to distribute the bacteria in the 3 in3 (7.62 cm3) of soil, as well as to saturate the soil for proper seed germination. Plants were grown at temperatures between 65-75°F (18-24°C) with 11 hours of light/day, and 5 ml of watering every 3 days. Corn was allowed to grow for 2 weeks to analyze the emergence and early development of the plants under the conditions described. The identified strains indicated by their appropriate bacterial identifications and final height data are listed in Table 22. Table 22

Example 31 Testing plant growth-promoting bacterial strains in soybeans

[00294] As cepas selecionadas foram cultivadas em meios mínimos (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0,50 g, MgSO4 7H2O 0,15 g, CaCl2 2H2O 0,013 g, e glicose 1 g, por L de peso seco, ou para Bradyrhizobium ou Rhizobium em meios de levedura com manitol). As culturas de durante a noite (30°C) das cepas selecionadas foram giradas, os meios decantados, e ressupensas em uma quantidade igual de água destilada. Dez sementes de soja foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação com 0,5 µl de bactérias ressupendidas em água misturada em 10 ml de H2O. Ao testar duas cepas bacterianas, 0,5 µl de cada bactéria ressuspendida foi misturado em 10 ml de H2O. Dez ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 3 pol3 (7,62 cm3) de solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-75°F (18-24°C) com 11 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. As sojas foram deixadas crescer por 2 semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 23. A co-inoculação das cepas de bactérias na presente invenção com membros de Bradyrhizobium sp. ou Rhizobium sp. levou a um aumento no crescimento da planta em comparação a qualquer inóculo sozinho. Tabela 23 [00294] The selected strains were cultivated in minimal media (KH2PO4 3 g, Na2HPO4 6 g, NH4Cl 1 g, NaCl 0.50 g, MgSO4 7H2O 0.15 g, CaCl2 2H2O 0.013 g, and glucose 1 g, per L of dry weight, or for Bradyrhizobium or Rhizobium on yeast media with mannitol). Overnight (30°C) cultures of the selected strains were spun, the media decanted, and resuspended in an equal amount of distilled water. Ten soybean seeds were planted for each treatment at a depth of 2.5 cm in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The seeds were inoculated into the plantation with 0.5 µl of bacteria resuspended in water mixed with 10 ml of H2O. When testing two bacterial strains, 0.5 µl of each resuspended bacteria was mixed in 10 ml of H2O. Ten ml of H2O was enough to distribute the bacteria in the 3 in3 (7.62 cm3) of soil, as well as to saturate the soil for adequate seed germination. Plants were grown at temperatures between 65-75°F (18-24°C) with 11 hours of light/day, and 5 ml of watering every 3 days. Soybeans were allowed to grow for 2 weeks to analyze the emergence and early development of the plants under the conditions described. The identified strains indicated by their appropriate bacterial identifications and final height data are listed in Table 23. Co-inoculation of the bacterial strains in the present invention with members of Bradyrhizobium sp. or Rhizobium sp. led to an increase in plant growth compared to either inoculum alone. Table 23

Example 32. Members of the Bacillus cereus family with plant growth-promoting attributes

[00295] Bacillus mycoides cepa BT155, Bacillus mycoides cepa EE118, Bacillus mycoides cepa EE141, Bacillus mycoides cepa BT46- 3, membro da família de Bacillus cereus cepa EE349, Bacillus thuringiensis cepa BT013A, e Bacillus megaterium cepa EE281 foram cultivados em caldo de Luria Bertani a 37°C e as culturas de durante a noite foram giradas, os meios decantados, e ressuspensas em quantidade igual de água destilada. 20 sementes de milho foram plantadas para cada tratamento em uma profundidade de 2,5 cm em solo superficial de barro (Columbia, MO) que foi peneirado para remover os debris grandes. As sementes foram inoculadas na plantação em 0,5 µl de bactérias ressuspendidas em água misturada em 50 ml de H2O. Cinquenta ml de H2O foram suficientes para distribuir as bactérias nas 29 pol3 (442,5 cm3) do solo, bem como para saturar o solo para a germinação adequada das sementes. As plantas foram cultivadas em temperaturas entre 65-72°F com 13 horas de luz/dia, e 5 ml de regamento a cada 3 dias. As mudas foram deixadas crescer por 2 semanas para analisar o surgimento e o desenvolvimento inicial das plantas sob as condições descritas. As cepas identificadas indicadas por suas identificações bacterianas adequadas e dados de altura final estão listadas na Tabela 24. Tabela 24 [00295] Bacillus mycoides strain BT155, Bacillus mycoides strain EE118, Bacillus mycoides strain EE141, Bacillus mycoides strain BT46-3, Bacillus cereus family member strain EE349, Bacillus thuringiensis strain BT013A, and Bacillus megaterium strain EE281 were cultivated in Luria broth Bertani at 37°C and the overnight cultures were rotated, the media decanted, and resuspended in an equal amount of distilled water. 20 corn seeds were planted for each treatment at a depth of 2.5 cm in clay topsoil (Columbia, MO) that was sieved to remove large debris. The seeds were inoculated into the plantation in 0.5 µl of bacteria resuspended in water mixed with 50 ml of H2O. Fifty ml of H2O was enough to distribute the bacteria over 29 in3 (442.5 cm3) of soil, as well as to saturate the soil for proper seed germination. Plants were grown at temperatures between 65-72°F with 13 hours of light/day, and 5 ml of watering every 3 days. Seedlings were allowed to grow for 2 weeks to analyze the emergence and early development of the plants under the conditions described. The identified strains indicated by their appropriate bacterial identifications and final height data are listed in Table 24. Table 24

[00296] Todas as bactérias promotoras do crescimento da planta testadas tiveram um efeito benéfico na altura do milho em duas semanas sob as condições descritas. O membro da família de Bacillus cereus cepa EE128 teve o maior efeito neste ensaio, gerando mais de 14% de impulso na altura do milho.[00296] All plant growth-promoting bacteria tested had a beneficial effect on corn height within two weeks under the conditions described. Bacillus cereus family member strain EE128 had the greatest effect in this trial, generating more than a 14% boost in corn height.

Example 33. Enhanced selection of Bacillus cereus family members to screen for plant growth promotion and other beneficial activities as the BEMD expression host

[00297] O sistema de BEMD pode ser usado para exibir uma ampla gama de proteínas, peptídeos e enzimas usando qualquer uma das sequências de direcionamento descritas neste documento para proporcionar efeitos agrícolas benéficos. Efeitos benéficos adicionais podem ser obtidos pela seleção de um hospedeiro de expressão (um membro da família de Bacillus cereus) tendo atributos benéficos inerentes. Muitas cepas dos membros da família de Bacillus cereus têm benefícios da promoção do crescimento da planta. Adicionalmente, muitas cepas do membro da família de Bacillus cereus têm efeitos protetores, através de atividades diretas fúngicas, inseticidas, nematocidas, ou outras atividades. Ao usar tais cepas como o hospedeiro de expressão para o sistema de BEMD, o produto do esporo final teria uma combinação de benefícios positivos na agricultura.[00297] The BEMD system can be used to display a wide range of proteins, peptides and enzymes using any of the targeting sequences described herein to provide beneficial agricultural effects. Additional beneficial effects can be obtained by selecting an expression host (a member of the Bacillus cereus family) having inherent beneficial attributes. Many strains of members of the Bacillus cereus family have plant growth-promoting benefits. Additionally, many strains of the Bacillus cereus family member have protective effects, through direct fungal, insecticidal, nematocidal, or other activities. By using such strains as the expression host for the BEMD system, the final spore product would have a combination of positive benefits in agriculture.

[00298] A Tabela 25 fornece resultados para experimentos, em que uma proteína de fusão foi expressa em várias cepas do membro da família de Bacillus cereus. Todas as cepas expressaram uma proteína de fusão que compreende os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1 e a fosfatase PhoA4 de Bacillus subtilis, uma enzima benéfica para a absorção potencializada do fosfato no milho. O gene foi sintetizado, clonado no vetor pMK4, e introduzido em cada um do Bacillus spp. indicado na Tabela 25 abaixo. As cepas foram tiradas em esporulação pela incubação a 30°C em placas de ágar nutriente contendo 10 µg/ml de cloranfenicol por três dias. Os esporos foram coletados, lavados e aplicados no milho na plantação numa taxa de 1x105 UFC/ml em 50 ml de água por pote de 7,62 cm de diâmetro com 5 mg de polifosfato por pote. O milho foi cultivado em solo de barro fino por duas semanas. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até a saturação a cada três dias durante um ensaio de duas semanas. Ao fim das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para controlar os esporos de Bacillus thuringiensis Expressão da SEQ ID NO: 1 - A proteína de fusão da fosfatase levou a um aumento na altura do milho em 2 semanas, independentemente da cepa hospedeira de expressão selecionada. Como mostradona Tabela 25, o uso de um membro da família de Bacillus cereus promotor do crescimento da planta aumentou ainda mais a altura do milho Tabela 25. [00298] Table 25 provides results for experiments, in which a fusion protein was expressed in various strains of the Bacillus cereus family member. All strains expressed a fusion protein comprising amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1 and the Bacillus subtilis PhoA4 phosphatase, an enzyme beneficial for enhanced phosphate absorption in corn. The gene was synthesized, cloned into the pMK4 vector, and introduced into each of the Bacillus spp. indicated in Table 25 below. The strains were sporulated by incubation at 30°C on nutrient agar plates containing 10 µg/ml chloramphenicol for three days. The spores were collected, washed and applied to the corn at the plantation at a rate of 1x105 CFU/ml in 50 ml of water per 7.62 cm diameter pot with 5 mg of polyphosphate per pot. Corn was grown in fine clay soil for two weeks. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 bulbs and exposed to 13 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during a two-week trial. At the end of the two weeks, the height of each plant was measured, and the measurements were normalized to control for Bacillus thuringiensis spores Expression of SEQ ID NO: 1 - Phosphatase fusion protein led to an increase in corn height by 2 weeks, regardless of the selected expression host strain. As shown in Table 25, the use of a plant growth-promoting member of the Bacillus cereus family further increased the height of Table 25 corn.

EXAMPLE 34. USE OF VARIOUS TARGETING SEQUENCES TO EXPRESS ?-GALAACTOSIDASE ON THE SURFACE OF BACILLUS THURINGIENSIS

[00299] Uma ampla variedade de sequências de direcionamento que têm uma alto grau de homologia com os aminoácidos 20–35 de BclA (aminoácidos 20–35 da SEQ ID NO: 1) pode ser usada para exibir enzimas, proteínas e peptídeos na superfície de membros da família de Bacillus cereus. Várias sequências de direcionamento foram comparadas, produzindo-se proteínas de fusão contendo as sequências de direcionamento ligadas à lipase de Bacillus subtilis. Os construtos de fusão foram sintetizados usando os promotores nativos à sequência de direcionamento, clonados no plasmídeo de replicação pMK4, e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. As cepas foram tiradas em esporulação por incubação a 30°C em placas de ágar nutriente contendo 10 μg/ml de cloranfenicol por 3 dias. Os esporos foram coletados, lavados e ressupendidos em PBS numa taxa de 1x108/ml. 1 X 105 esporos para cada construto de fusão foram suspendidos em 400 μl de dH2O. As reações foram aquecidas com os componentes da reação à temperatura de reação desejada (40°C). 200 μl de tampão de trabalho foram adicionados (9:1 de Solução A: Solução B). A solução A era 50 mM Tris pH 10 e 13,6 mM ácido deoxicólico e a Solução B era 3 mg/ml de p-nitrofenil palmitato em isopropanol. A reação foi incubada a 40°C por 10 minutos e colocada em gelo, centrifugada para remover os esporos, e a absorbância em 420 nm foi registrada. Os resultados são mostrados na Tabela 26 abaixo. A atividade foi normalizada para uma proteína de fusão compreendendo os aminoácidos 1–35 da SEQ ID NO: 1 fundidos à lipase do Bacillus subtilis. Tabela 26. [00299] A wide variety of targeting sequences that have a high degree of homology to amino acids 20–35 of BclA (amino acids 20–35 of SEQ ID NO: 1) can be used to display enzymes, proteins and peptides on the surface of members of the Bacillus cereus family. Several targeting sequences were compared, producing fusion proteins containing the targeting sequences linked to Bacillus subtilis lipase. Fusion constructs were synthesized using promoters native to the targeting sequence, cloned into the replication plasmid pMK4, and introduced into Bacillus thuringiensis BT013A. Strains were sporulated by incubation at 30°C on nutrient agar plates containing 10 μg/ml chloramphenicol for 3 days. Spores were collected, washed and resuspended in PBS at a rate of 1x108/ml. 1 X 105 spores for each fusion construct were suspended in 400 μl of dH2O. The reactions were heated with the reaction components to the desired reaction temperature (40°C). 200 μl of working buffer was added (9:1 Solution A: Solution B). Solution A was 50 mM Tris pH 10 and 13.6 mM deoxycholic acid and Solution B was 3 mg/ml p-nitrophenyl palmitate in isopropanol. The reaction was incubated at 40°C for 10 minutes and placed on ice, centrifuged to remove spores, and absorbance at 420 nm was recorded. The results are shown in Table 26 below. Activity was normalized to a fusion protein comprising amino acids 1–35 of SEQ ID NO: 1 fused to Bacillus subtilis lipase. Table 26.

[00300] Várias sequências de direcionamento ligadas à lipase resultam em níveis de expressão e atividade mais altos da enzima na superfície dos esporos. Em particular, as SEQ ID NOs. 60, 62, e 64, cada uma contendo uma sequência de direcionamento mais curta, resultaram em expressão de fusão potencializada na superfície dos esporos de BEMD. Todas as proteínas de fusão contendo sequências de direcionamento testadas resultaram na exibição da lipase na superfície.[00300] Various targeting sequences linked to lipase result in higher levels of expression and activity of the enzyme on the surface of the spores. In particular, SEQ ID NOs. 60, 62, and 64, each containing a shorter targeting sequence, resulted in enhanced fusion expression on the surface of BEMD spores. All fusion proteins containing targeting sequences tested resulted in the display of lipase on the surface.

Example 35. Use of diverse exosporium sequences to express lipase on the surface of Bacillus thuringiensis and demonstration of localization of the fusion protein on the exosporium surface

[00301] Uma ampla variedade de proteínas de exosporium pode ser usada para exibir enzimas, proteínas e peptídeos na superfície dos membros da família de Bacillus cereus. Várias proteínas do exosporium diferentes foram comparadas, produzindo-se proteínas de fusão contendo proteínas do exosporium ligadas à lipase do Bacillus subtilis, como descrito no Exemplo 34. Os construtos de fusão foram sintetizados usando o promotor nativo à proteína do exosporium indicada na Tabela 27 abaixo, clonados no plasmídeo de replicação pMK4, e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as diversas fusões de lipase de Bacillus subtilis 168 à proteína do exosporium foram feitos, cultivando-se as bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 µg/ml de cloranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutriente, e incubando a 30°C por 3 dias. Após 3 dias, os esporos foram lavados das placas, purificados por centrifugação e ressuspendidos em PBS a 1 X 108 UFC/ml.[00301] A wide variety of exosporium proteins can be used to display enzymes, proteins and peptides on the surface of members of the Bacillus cereus family. Several different exosporium proteins were compared, producing fusion proteins containing exosporium proteins linked to Bacillus subtilis lipase, as described in Example 34. Fusion constructs were synthesized using the promoter native to the exosporium protein indicated in Table 27 below. , cloned into the replication plasmid pMK4, and introduced into Bacillus thuringiensis BT013A. Spores exhibiting the various lipase fusions of Bacillus subtilis 168 to the exosporium protein were made by culturing the transformed bacteria in brain and heart infusion broth with selective pressure of 10 µg/ml chloramphenicol, plating on agar plates nutrient, and incubating at 30°C for 3 days. After 3 days, the spores were washed from the plates, purified by centrifugation and resuspended in PBS at 1 X 108 CFU/ml.

[00302] 1 X 105 esporos para cada construto de fusão foram ressuspendidos em 400 µl de dH2O. As reações foram aquecidas com os componentes de reação à temperatura desejada (40°C). 200 µl de tampão de trabalho foram adicionados (9:1 de Solução A: Solução B). A solução A era 50 mM Tris pH 10 e 13,6 mM ácido deoxicólico e a Solução B era 3 mg/ml de p-nitrofenil palmitato em isopropanol. A reação foi incubada a 40°C por 10 minutos e colocada em gelo, centrifugada para remover os esporos, e a absorbância em 420 nm foi registrada. Os resultados são mostrados na Tabela 27 abaixo. A atividade foi normalizada para a SEQ ID NO: 72 ligada à lipase. Tabela 27. [00302] 1 X 105 spores for each fusion construct were resuspended in 400 µl of dH2O. The reactions were heated with the reaction components to the desired temperature (40°C). 200 µl of working buffer was added (9:1 Solution A: Solution B). Solution A was 50 mM Tris pH 10 and 13.6 mM deoxycholic acid and Solution B was 3 mg/ml p-nitrophenyl palmitate in isopropanol. The reaction was incubated at 40°C for 10 minutes and placed on ice, centrifuged to remove spores, and absorbance at 420 nm was recorded. The results are shown in Table 27 below. Activity was normalized to SEQ ID NO: 72 bound to lipase. Table 27.

[00303] O uso das proteínas do exosporium das SEQ ID NOs. 72 e 73 resultou na maior atividade da enzima no esporo. Todas as proteínas de fusão contendo as proteínas do exosporium resultaram na exibição na superfície da lipase de Bacillus subtilis 168 ativo, embora em diferentes níveis.[00303] The use of the exosporium proteins of SEQ ID NOs. 72 and 73 resulted in greater enzyme activity in the spore. All fusion proteins containing the exosporium proteins resulted in the display on the surface of active Bacillus subtilis 168 lipase, albeit at different levels.

[00304] Proteínas do exosporium adicionais foram demonstradas resultar no direcionamento das proteínas de fusão para o exosporium usando mCherry repórter fluorescente. Foram criados construtos de fusão que continham as proteínas do exosporium das SEQ ID NOs. 74, 83 e 73 ligadas ao repórter mCherry. Os esporos cresceram por 1,5 dia, foram coletados e ressuspendidos, conforme descrito acima. 7 µl de esporos fluorescentes foram colocados sob um microscópio Nikon E1000 e imageados durante a esporulação tardia. A localização circular em um anel é indicativa da localização da camada externa de esporos, e a aparência corresponde a de uma proteína do exosporium. Os resultados da microscopia fluorescente estão mostrados na Figura 2. As FIGURA 2A, 2B e 2C são imagens de microscopia fluorescente de esporos expressando proteínas de fusão compreendendo as proteínas do exosporium das SEQ ID NOs. 74, 83 e 73, respectivamente, e o repórter mCherry. Todas as três fusões demonstraram altos níveis de fluorescência e localização do exosporium, demonstrando sua potencial utilidade para a expressão de proteínas estranhas na superfície do exosporium.[00304] Additional exosporium proteins have been shown to result in targeting of fusion proteins to the exosporium using mCherry fluorescent reporter. Fusion constructs containing the exosporium proteins of SEQ ID NOs were created. 74, 83 and 73 bound to the mCherry reporter. Spores were grown for 1.5 days, collected, and resuspended as described above. 7 µl of fluorescent spores were placed under a Nikon E1000 microscope and imaged during late sporulation. The circular location in a ring is indicative of the location of the outer spore layer, and the appearance corresponds to that of an exosporium protein. The results of fluorescent microscopy are shown in Figure 2. FIGURE 2A, 2B and 2C are fluorescent microscopy images of spores expressing fusion proteins comprising the exosporium proteins of SEQ ID NOs. 74, 83 and 73, respectively, and the mCherry reporter. All three fusions demonstrated high levels of fluorescence and exosporium localization, demonstrating their potential utility for the expression of foreign proteins on the exosporium surface.

Example 36. Use of diverse targeting sequences and exosporium proteins to express phosphatase in Bacillus subtilis spores and effects of phosphatase-expressing spores in soybean

[00305] Os esporos de BEMD que expressam a Fosfatase A4 (PhoA4) de Bacillus subtilis EE148 foram criados pela síntese gênica dos genes codificante de diversas sequências de direcionamento e proteínas do exosporium sob o controle de seus promotores nativos ligados à PhoA4. Os genes sintetizados foram clonados em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as diversas fusões de PhoA4 de Bacillus subtilis EE148 à proteína do exosporium foram feitos, cultivando-se as bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 µg/ml de cloranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutriente, e incubando a 30°C por três dias. Após três dias, os esporos foram lavados das placas, purificados por centrifugação e ressuspendidos em PBS a 1 X 108 UFC/ml.[00305] BEMD spores expressing Bacillus subtilis EE148 Phosphatase A4 (PhoA4) were created by gene synthesis of genes encoding several targeting sequences and exosporium proteins under the control of their native PhoA4-linked promoters. The synthesized genes were cloned into pMK4 and introduced into Bacillus thuringiensis BT013A. Spores exhibiting the various PhoA4 fusions of Bacillus subtilis EE148 to the exosporium protein were made by culturing the transformed bacteria in brain heart infusion broth with selective pressure of 10 µg/ml chloramphenicol, plating on agar plates nutrient, and incubating at 30°C for three days. After three days, the spores were washed from the plates, purified by centrifugation and resuspended in PBS at 1 X 108 CFU/ml.

[00306] A sojas foram plantadas com 2,54 cm de profundidade em potes fundos de 10 cm preenchidos com solo superficial de barro padrão. Os esporos de BEMD que expressam PhoA4 foram diluídos em uma concentração de 1x104/ml em 50 ml de água e aplicados em cada planta na plantação. Um controle somente de água também foi incluído. Polifosfato foi adicionado aos potes em líquido numa taxa de 0,5 mg/pote. As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água.[00306] The soybeans were planted 2.54 cm deep in 10 cm deep pots filled with standard clay topsoil. BEMD spores expressing PhoA4 were diluted to a concentration of 1x104/ml in 50 ml of water and applied to each plant in the plantation. A water-only control was also included. Polyphosphate was added to the pots in liquid at a rate of 0.5 mg/pot. Plants were grown in optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 13 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during the two-week trial. At the end of the two weeks, the height of each plant was measured, and the measurements were normalized to the water-only control plants.

[00307] Os resultados são mostrados na Tabela 28. A soja crescida na presença de esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão contendo PhoA4 ligada a várias sequências de direcionamento e proteínas de exosporium com diferentes parceiros de fusão com PhoA4, todos exibiram crescimento potencializado, mas o grau do efeito variou dependendo da sequência de direiconamento ou proteína do exosporium usada. Tabela 28. [00307] The results are shown in Table 28. Soybeans grown in the presence of BEMD spores expressing fusion proteins containing PhoA4 linked to various targeting sequences and exosporium proteins with different PhoA4 fusion partners all exhibited enhanced growth, but the degree of effect varied depending on the targeting sequence or exosporium protein used. Table 28.

Example 37. Co-application of BEMD spores and seed treatments, liquid fertilizers and other additives

[00308] Os esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão foram testados para a compatibilidade com vários tratamentos com semente. Os esporos de BEMD expressaram proteínas de fusão compreendendo a sequência de direcionamento dos aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1 ligado a uma fosfatase (PhoA4) de Bacillus subtilis EE148 ou o peptídeo POLARIS. Os genes sintetizados foram clonados em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as diversas fusões de PhoA4 ou POLARIS de Bacillus subtilis EE148 à proteína do exosporium foram feitos, cultivando-se as bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 µg/ml de cloranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutriente, e incubando a 30°C por três dias. Após três dias, os esporos foram lavados das placas, purificados por centrifugação e ressuspendidos em PBS a 1 X 108 UFC/ml.[00308] BEMD spores expressing fusion proteins were tested for compatibility with various seed treatments. BEMD spores expressed fusion proteins comprising the targeting sequence of amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1 linked to a phosphatase (PhoA4) from Bacillus subtilis EE148 or the POLARIS peptide. The synthesized genes were cloned into pMK4 and introduced into Bacillus thuringiensis BT013A. Spores exhibiting the various PhoA4 or POLARIS fusions of Bacillus subtilis EE148 to the exosporium protein were made by culturing the transformed bacteria in brain and heart infusion broth with selective pressure of 10 µg/ml chloramphenicol, plating on plates of nutrient agar, and incubating at 30°C for three days. After three days, the spores were washed from the plates, purified by centrifugation and resuspended in PBS at 1 X 108 CFU/ml.

[00309] As plantas cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até saturação a cada três dias durante o ensaio de duas semanas. No final das duas semanas, a altura de cada planta foi medida, e as medições foram normalizadas para as plantas com somente controle de água. Os resultados são mostrados na Tabela 29 abaixo. Banho = aplicado no solo a 50 ml por pote. Polímero = somente polímero de revestimento de semente ACCELERON Esporos de BEMD foram adicionado a 1 x 104 células/50 ml para aplicações de banho. Os esporos de BEMD foram adicionados a 1,3 x10 4/células/semente para aplicações de revestimento de semente. 10-34-0 e 6-24-6 são composições de fertilizantes de iniciador comercial padrão. 10-34-0 é fosfato de amônio líquido. 6-24-6 é fertilizante de fosfato líquido com pouco sal com uma formulação orto/poli. Corante = agente corante de revestimento de semente vermelho Becker Underwood. MACHO, APRON e CRUISER são fungicidas comerciais usados em sementes. MACHO contém o ingrediente ativo imidacloprida, APRON contém o ingrediente ativo mefenoxam, e CRUISER contém uma mistura dos ingredientes ativos tiametoxam, mefenoxam e fludioxonil. Encontrou-se que os esporos eram compatíveis com muitas aplicações de semente e mantinham sua capacidade de estimular o crescimento da planta no milho. Tabela 29. [00309] Plants were grown under optimal light using 54-watt T5 lamps and exposed to 13 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C. Plants were watered to saturation every three days during the two-week trial. At the end of the two weeks, the height of each plant was measured, and the measurements were normalized to the water-only control plants. The results are shown in Table 29 below. Bath = applied to the soil at 50 ml per pot. Polymer = ACCELERON seed coat polymer only BEMD spores were added at 1 x 104 cells/50 ml for bath applications. BEMD spores were added at 1.3 x10 4/cells/seed for seed coating applications. 10-34-0 and 6-24-6 are standard commercial starter fertilizer compositions. 10-34-0 is liquid ammonium phosphate. 6-24-6 is low salt liquid phosphate fertilizer with an ortho/poly formulation. Colorant = Becker Underwood Red Seed Coating Coloring Agent. MACHO, APRON and CRUISER are commercial fungicides used on seeds. MACHO contains the active ingredient imidacloprid, APRON contains the active ingredient mefenoxam, and CRUISER contains a mixture of the active ingredients thiamethoxam, mefenoxam and fludioxonil. The spores were found to be compatible with many seed applications and maintained their ability to stimulate plant growth in corn. Table 29.

[00310] Encontrou-se que os esporos de BEMD eram compatíveis com todas as melhorias de revestimento de semente testadas. Houve uma ligeira diminuição na atividade quando os esporos de PhoA4 de BEMD foram combinados com o corante e polímero sozinhos, mas os esporos recuperaram a atividade completa com o corante em combinação com outros fungicidas. Os esporos de BEMD também funcionaram bem com os fertilizantes líquidos. Os fertilizantes de iniciador contribuíram para o crescimento da planta mais provavelmente através do complemento nutricional direto. Os esporos de BEMD funcionaram com ambos os fertilizantes de iniciador, sugerindo que a atividade da fosfatase ainda pode levar a um maior crescimento da planta na presença de excesso de nutrientes. As combinações de esporos de BEMD com fungicidas exibiram maiores aumentos no crescimento da planta do que os esporos de BEMd sozinhos, provavelmente devido à proteção dada às plantas de milho jovens durante o crescimento inicial.[00310] BEMD spores were found to be compatible with all seed coating improvements tested. There was a slight decrease in activity when BEMD PhoA4 spores were combined with the dye and polymer alone, but the spores regained full activity with the dye in combination with other fungicides. BEMD spores also worked well with liquid fertilizers. Starter fertilizers contributed to plant growth most likely through direct nutritional supplementation. BEMD spores worked with both starter fertilizers, suggesting that phosphatase activity can still lead to greater plant growth in the presence of excess nutrients. Combinations of BEMD spores with fungicides exhibited greater increases in plant growth than BEMd spores alone, likely due to the protection given to young corn plants during early growth.

Example 38. Use of BEMD Spores as a Foliar Addition to Reduce Growth Inhibition Stress in Corn

[00311] O sistema de exibição de esporos de BEMD pode ser usado para distribuir enzimas que possam aliviar um pouco do estresse do crescimento de plantas no campo ou estufa. Para realizar isto, foram selecionadas enzimas que agem seletivamente sobre espécies reativas de oxigênio no solo. As espécies reativas de oxigênio são um marcador chave do estresse nas plantas.[00311] The BEMD spore display system can be used to deliver enzymes that can alleviate some of the stress of plant growth in the field or greenhouse. To accomplish this, enzymes that act selectively on reactive oxygen species in the soil were selected. Reactive oxygen species are a key marker of stress in plants.

[00312] Os esporos de BEMD que expressam proteínas de fusão compreendendo a sequência de direcionamento dos aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO: 1 ligados à quitosinase, superóxido dismutase, catalase, ou ß1,3-glucanase de Bacillus thuringiensis BT013A foram gerados. Os genes sintetizados foram clonados em pMK4 e introduzidos no Bacillus thuringiensis BT013A. Os esporos que exibem as diversas fusões de proteína foram feitos, cultivando-se as bactérias transformadas em caldo de infusão de cérebro e coração com pressão seletiva de 10 µg/ml de cloranfenicol, plaqueando em placas de ágar nutriente, e incubando a 30°C por três dias. Após três dias, os esporos foram lavados das placas, purificados por centrifugação e ressuspendidos em PBS a 1 X 108 UFC/ml.[00312] BEMD spores expressing fusion proteins comprising the targeting sequence of amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1 linked to chitosinase, superoxide dismutase, catalase, or ß1,3-glucanase from Bacillus thuringiensis BT013A were generated. The synthesized genes were cloned into pMK4 and introduced into Bacillus thuringiensis BT013A. Spores exhibiting the various protein fusions were made by culturing the transformed bacteria in brain heart infusion broth with a selective pressure of 10 µg/ml chloramphenicol, plating on nutrient agar plates, and incubating at 30°C. for three days. After three days, the spores were washed from the plates, purified by centrifugation and resuspended in PBS at 1 X 108 CFU/ml.

[00313] Plantas de milho de três semanas de idade no estágio V5 cresceram sob luz ideal usando lâmpadas T5, de 54 watts, e expostas a 13 horas de luz por dia sob condições de temperatura controlada entre 15,5-25,5°C. As plantas foram regadas até a saturação a cada três dias durante o curso do ensaio. Conforme as plantas atingem V5, os esporos de BEMD ou produtos químicos de controle positivo foram pulverizados nas folhas tanto em 1 X 105 de esporos de BEMD/ml quanto nas taxas recomendadas para os produtos químicos. Um total de 1 ml de spray foi aplicado em cada planta individualmente. As alturas das plantas foram medidas logo antes da aplicação dos sprays foliares. As plantas de milho foram então estressadas, aquecendo-se a 32,2°C e diminuindo a rega em uma vez por semana. As plantas foram mantidas sob condições de estresse por duas semanas. No final das duas semanas, as alturas das plantas foram novamente medidas, e a aparência visual registrada. Sob essas condições de estresse, o crescimento da planta foi mínimo nos tratamentos controles. A capacidade de continuar a crescer sob condições de estresse foi medida por um aumento na altura da planta ao longo das duas semanas, em comparação ao controle somente de água. Os resultados são mostrados na tabela 30 abaixo. Tabela 30. [00313] Three-week-old corn plants at the V5 stage were grown under optimal light using 54-watt T5 bulbs and exposed to 13 hours of light per day under controlled temperature conditions between 15.5-25.5°C . Plants were watered to saturation every three days during the course of the trial. As plants reached V5, BEMD spores or positive control chemicals were sprayed onto leaves at either 1 X 105 BEMD spores/ml or the recommended rates for the chemicals. A total of 1 ml of spray was applied to each plant individually. Plant heights were measured just before application of foliar sprays. The corn plants were then stressed by heating to 32.2°C and decreasing watering to once a week. The plants were kept under stress conditions for two weeks. At the end of the two weeks, plant heights were measured again, and visual appearance recorded. Under these stress conditions, plant growth was minimal in control treatments. The ability to continue to grow under stress conditions was measured by an increase in plant height over the two weeks compared to the water-only control. The results are shown in table 30 below. Table 30.

[00314] Várias enzimas desestressantes foram aplicadas ao milho usando o sistema de BEMD, como mostrado na Tabela 30 acima. Os esporos de controle não tiveram efeito significativo (diminuição da altura da planta de[00314] Various destressing enzymes were applied to corn using the BEMD system, as shown in Table 30 above. Control spores had no significant effect (decrease in plant height).

[00315] -1,6%. A enzima quitosinase de BEMD teve um efeito positivo quando combinada a seu substrato, a quitosana. As duas melhores enzimas no desempenho foram a ß-1,3-glucanase de BEMD e superóxido dismutase de BEMD. A ß-1,3-glucanase de BEMD tem uma atividade primariamente antifúngica, mas também pode ter efeitos diretos nas plantas. O ácido salicílico e BTH foram controles positivos para o ensaio foliar, e foram vistas respostas positivas para ambos. Este método de distribuição foliar pode ser usado para distribuir as enzimas desestressantes às plantas em diversos momentos da estação.[00315] -1.6%. BEMD's chitosinase enzyme had a positive effect when combined with its substrate, chitosan. The two best performing enzymes were ß-1,3-glucanase from BEMD and superoxide dismutase from BEMD. BEMD ß-1,3-glucanase has primarily antifungal activity, but can also have direct effects on plants. Salicylic acid and BTH were positive controls for the foliar assay, and positive responses were seen for both. This foliar delivery method can be used to deliver de-stressing enzymes to plants at various times throughout the season.

Example 39. Expression Levels of Fusion Proteins Using Various Promoters Containing Sigma-K

[00316] Conforme mostrado no Exemplo 23 acima, a substituição de um promotor nativo de uma sequência de direcionamento, proteína do exosporium, ou fragmento de proteína do exosporium, pode afetar enormemente o nível da proteína de fusão expressa no exosporium de um esporo da família de Bacillus cereus. Por exemplo, a substituição do promotor BclA nativo pelo promotor BclB reduz enormemente o nível da proteína de fusão na superfície dos esporos do membro da família de Bacillus cereus. Alternativamente, a substituição do promotor BclB nativo pelo promotor BclA aumenta os níveis da proteína de fusão no exosporium drasticamente.[00316] As shown in Example 23 above, replacement of a native promoter of a targeting sequence, exosporium protein, or exosporium protein fragment, can greatly affect the level of fusion protein expressed in the exosporium of a spore of the family of Bacillus cereus. For example, replacement of the native BclA promoter with the BclB promoter greatly reduces the level of the fusion protein on the spore surface of the Bacillus cereus family member. Alternatively, replacement of the native BclB promoter with the BclA promoter increases the levels of the fusion protein in the exosporium dramatically.

[00317] Níveis de expressão do promotor relativo para várias proteínas do exosporium sob o controle de seus promotores de esporulação nativos foram obtidos a partir de dados de microarranjo de Bergman et al., 2008. Os níveis de expressão relativos foram determinados durante o tempo da esporulação tardia (300 minutos após o início do experimento), quando promotores sigma K são mais eficazes. Os promotores sigma K são promotores chave para a expressão de genes localizados no exosporium e proteínas associadas. A expressão relativa é o aumento do nível de expressão de um gene quando comparado à média de todos os outros genes do cromossomo em todos os momentos. A Tabela 31 abaixo mostra os níveis de expressão relativa de uma variedade de genes acionados por sigma K nos membros da família de Bacillus cereus. Tabela 31. [00317] Relative promoter expression levels for several exosporium proteins under the control of their native sporulation promoters were obtained from microarray data from Bergman et al., 2008. Relative expression levels were determined during the time of late sporulation (300 minutes after the start of the experiment), when sigma K promoters are more effective. Sigma K promoters are key promoters for the expression of exosporium-localized genes and associated proteins. Relative expression is the increase in the expression level of a gene when compared to the average of all other genes on the chromosome at all times. Table 31 below shows the relative expression levels of a variety of K-sigma driven genes in members of the Bacillus cereus family. Table 31.

[00318] Tendo em conta o acima exposto, será visto que os vários objetos da invenção são obtidos e outros resultados vantajosos são alcançados.[00318] Taking into account the above, it will be seen that the various objects of the invention are obtained and other advantageous results are achieved.

[00319] Uma vez que várias mudanças podem ser feitas nas proteínas de fusão acima, membros da família de Bacillus cereus, formulações e métodos sem se desviar do escopo da invenção, pretende-se que todo o assunto contido na descrição acima e mostrado nas figuras acompanhantes sejam interpretados como ilustrativos e não em um sentido limitado.[00319] Since various changes can be made to the above fusion proteins, members of the Bacillus cereus family, formulations and methods without deviating from the scope of the invention, it is intended that the entire subject matter contained in the above description and shown in the figures accompanying documents be interpreted as illustrative and not in a limited sense.

Claims

1. Recombinant Bacillus bacteria, characterized in that the bacteria expresses a fusion protein, wherein the recombinant Bacillus bacteria comprises Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides, Bacillus samanii, Bacillus gaemokensis, Bacillus weihenstephensis, or a combination thereof, wherein the fusion protein comprises: (A) a protein or peptide that protects a plant from a pathogen, wherein the protein or peptide is selected from the group consisting of: a harpin, an α-elastin , a ß-elastin, a systemin, a phenylalanine ammonia-lyase, an elicitin, a defensin, a cryptogein, a flagellin protein, a flagellin peptide, a bacteriocin, a lysozyme, a lysozyme peptide, a siderophore, a non-ribosomal active peptide , a conalbumin, an albumin, a lactoferrin, a lactoferrin peptide, TasA, an insecticidal bacterial toxin, an endotoxin, a Cry toxin, a protease inhibitor protein or peptide, a chitinase, a protease, a lactonase, a ß-1, 3-glucanase, a ß-1,4-glucanase, a ß-1,6-glucanase, a chitosinase, a chitinase, a chitosinase-like enzyme, a lyticase, a peptidase, a proteinase, a mutanolysin and a stafolysin; and (B) a targeting sequence comprising: (a) amino acids 1-35 of SEQ ID NO: 1; (b) amino acids 20-35 of SEQ ID NO: 1; (c) amino acids 22-31 of SEQ ID NO: 1; (d) amino acids 22-33 of SEQ ID NO: 1; (e) amino acids 20-31 of SEQ ID NO: 1; or (f) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; wherein the protein or peptide that protects a plant from a pathogen is operably linked to the targeting sequence; and wherein plants grown in the presence of the recombinant Bacillus bacteria are less susceptible to infection with the pathogen compared to plants grown in the absence of the recombinant Bacillus bacteria, under the same conditions.

2. Plant seeds, characterized by the fact that they are coated with the recombinant Bacillus bacteria, as defined in claim 1, and a polymer or agrochemical.

3. Plant seeds according to claim 2, characterized in that the plant seed is coated with a seed coating formulation comprising recombinant Bacillus bacteria, an agriculturally acceptable carrier, and a polymer or agrochemical.

4. Recombinant Bacillus bacteria, according to claim 1, characterized by the fact that: the lysozyme peptide comprises LysM; the lactoferrin peptide comprises LfcinB; or ß-1,3-glucanase.

5. Recombinant Bacillus bacteria according to claim 1, characterized in that the insecticidal bacterial toxin comprises a VIP insecticidal toxin; the protease inhibitor protein or peptide comprises a trypsin inhibitor or an arrowhead protease inhibitor; the Cry toxin comprises a Bacillus thuringiensis Cry toxin; or the lactonase comprises 1,4-lactonase, 2-pyrone-4,6-dicarboxylate lactonase, 3-oxoadipate enol lactonase, actinomycin lactonase, deoxylimonate A-ring lactonase, gluconolactonase L-rhamnono-1,4-lactonase, limonin - D-ring-lactonase, steroid-lactonase, triacetate-lactonase or xylono-1,4-lactonase.

6. Recombinant Bacillus bacteria according to claim 1, characterized by the fact that the fusion protein comprises the 20-35 amino acid targeting sequence of SEQ ID NO: 1.

7. Formulation, characterized by the fact that it comprises recombinant Bacillus bacteria, as defined in claim 1, an agriculturally acceptable vehicle and at least one agrochemical.

8. Plant seed, characterized by the fact that it is coated with the formulation, as defined in claim 7, and a polymer or agrochemical.

9. Recombinant Bacillus bacteria according to claim 1, characterized in that the fusion protein further comprises an amino acid linker between the targeting sequence and the protein or peptide that protects a plant from a pathogen.

10. Recombinant Bacillus bacteria according to claim 1, characterized in that the linker comprises: a polyalanine linker, a polyglycine linker or a linker comprising a mixture of alanine and glycine residues; and/or a protease recognition site.