BR122020000253B1 - Biomarcadores para avaliação de hiv - Google Patents

Abstract

a presente invenção diz respeito a conjuntos de biomarcadores metabólicos para avaliar hiv. em modalidades preferidas, a presente invenção diz respeito ao uso de conjuntos de biomarcadores para procurar e/ou diagnosticar infecção de hiv, para previsão de resposta imune de um sujeito mamífero a terapia antirretroviral e/ou prognóstico da progressão da doença hiv, e para monitorar atividade da doença hiv em um sujeito mamífero. em outras modalidades, a invenção diz respeito a métodos para procurar e/ou diagnosticar infecção por hiv, para previsão de resposta imune de um sujeito mamífero à terapia antirretroviral e/ou prognóstico da progressão da doença hiv, e para monitorar a atividade da doença hiv em um sujeito mamífero, bem como a um kit adaptado para realizar os métodos. empregando os biomarcadores específicos e o método de acordo com a presente invenção se torna possível mais propriamente e confiavelmente avaliar hiv. em particular, se torna possível pesquisar e diagnosticar hiv em um paciente com alta precisão e prever cedo em avanço a resposta terapêutica do paciente à terapia antirretroviral.

Description

Campo Técnico

[0001] A presente invenção refere-se a novos biomarcadores para avaliar o HIV. Em particular, a presente invenção proporciona novos biomarcadores para o rastreio e diagnóstico de HIV em pacientes, a previsão de resposta imune à terapia antirretroviral e prognóstico da progressão da doença e monitorar a atividade da doença HIV. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para a avaliação do HIV em um indivíduo mamífero, e a um kit para realizar o método. Mais particularmente, a presente invenção é dirigida a novos biomarcadores preditivos e de diagnóstico capazes de identificar pacientes em maior risco de desenvolver restauração incompleta do sistema imune após o tratamento antirretroviral, bem como pacientes progressores rápidos.

Fundamentos da Técnica

[0002] Metabolômica

[0003] Metabolômica é uma medida quantitativa completa de compostos de baixo peso molecular que cobrem sistematicamente os metabolitos principais, que representam toda a gama de vias de metabolismo intermediário. A capacidade de analisar grandes conjuntos de metabólitos extrai informação bioquímica refletindo verdadeiros pontos finais funcionais de eventos biológicos evidentes, enquanto outras tecnologias genômicas funcionais, tais como transcriptômica e proteômica, embora altamente valioso, mas apenas indicar a causa potencial de resposta fenotípica. Portanto, eles não podem necessariamente prever efeitos de drogas, resposta toxicológica ou estados de doença a nível fenótipo a menos validação funcional é adicionado.

[0004] Metabolômica liga esta lacuna de informação, descrevendo em particular tais informações funcionais uma vez que as diferenças de metabólitos em fluídos biológicos e tecidos fornecem a ligação mais próxima das várias respostas fenotípicas. Desnecessário dizer que tais mudanças no fenótipo bioquímico são de interesse direto para indústrias farmacêuticas, de biotecnologia e de saúde, uma vez tecnologia adequada permite que a mineração de custo- eficiente e integração dessas informações.

[0005] Em geral, fenótipo não é necessariamente previsto pelo genótipo. A diferença entre genótipo e fenótipo é atravessado por muitas reações bioquímicas cada com dependências individuais para várias influências, incluindo drogas, nutrição e fatores ambientais. Nesta cadeia de biomoléculas a partir dos genes para o fenótipo, os metabolitos são as moléculas de ligação quantificáveis com o mais próximo de fenótipo. Muitos estados genotípicos e fenotípicos, como uma resposta tóxica para uma prevalência de drogas ou de doença são previsíveis por diferenças nas concentrações de metabolitos funcionalmente relevantes dentro de fluidos biológicos e tecidos.

HIV/AIDS

[0006] Infecção por vírus da imunodeficiência humana/síndrome da imunodeficiência adquirida (HIV/SIDA) é uma doença do sistema imune humano causada pela infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Durante a infecção inicial, uma pessoa pode experimentar um breve período de influenza como doença. Isto é normalmente seguido por um período de tempo prolongado sem sintomas. À medida que a doença progride, ela interfere cada vez mais com o sistema imune, fazendo com que a pessoa muito mais propensos a ter infecções, incluindo infecções oportunistas e tumores que geralmente não afetam as pessoas que têm sistemas imunológicos de trabalho. Atualmente, não há cura ou vacina eficaz contra o HIV. O tratamento consiste em terapia antirretroviral (ART), tais como terapia antirretroviral de alta potência (HAART), que retarda a progressão da doença e a partir de 2010, mais de 6,6 milhões de pessoas foram tomá- los em países de baixa e média renda.

[0007] Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos criou um sistema de classificação para o HIV, e atualizado em 2008. Este sistema classifica infecções por HIV com base na contagem de CD4 e sintomas clínicos, e descreve a infecção em três etapas:

[0008] Fase 1: contagem de CD4> 500 c0lulas/μl e sem condições definidoras de AIDS

[0009] Fase 2: contagem de CD4 de 200 a 500 c0lulas/μl e sem condições definidoras de AIDS

[0010] Fase 3: contagem de CD4 <200 c0lulas/μl ou AIDS condições definidoras

[0011] Para fins de vigilância, o diagnóstico de AIDS ainda está de pé, mesmo que, após o tratamento, a contagem de células CD4+ T sobe para acima de 200 por μl, de sangue ou outras doenças à SIDA são curados.

[0012] No entanto, é cada vez mais evidente que a contagem de CD4 e carga viral não fornecem um quadro completo do estado subjacente do sistema imune para pacientes com HIV. Na verdade, a extensão da vida como consequência de terapias antirretrovirais já anunciou uma nova era de doenças não relacionadas com a SIDA e recuperação incompleta da função imune, apesar de um bom controle das cargas virais. Portanto, a identificação e incorporação de novos marcadores preditivos para o diagnóstico e classificação de HIV é de extrema importância.

[0013] Nos locais onde as drogas antirretrovirais têm sido amplamente utilizadas desde meados dos anos 90, o uso de terapia antirretroviral (ART) mudou o curso natural da infecção pelo HIV, melhorando o sistema imune do paciente e resultando assim em ambos redução da incidência de infecções oportunistas e aumento da sobrevida dos pacientes infectados pelo HIV. Dados recentes mostram que, no Brasil, tem havido um aumento na sobrevivência entre os pacientes com diagnóstico de AIDS, com 63,97% dos pacientes alcançar uma sobrevivência de 108 meses. Recentemente, vários esforços têm sido feitos, a fim de compreender a patogênese do HIV por meio da avaliação do seu impacto sobre as células infectadas, na descoberta de biomarcadores da doença e a compreensão da progressão da doença, através do estudo de um subgrupo especifico de pacientes.

[0014] Consequentemente, existe uma necessidade urgente na técnica para novo rastreio e procedimentos de diagnóstico, as quais podem ser facilmente realizados e que podem proporcionar resultados mais precisos e eficazes, assim como para uma previsão mais confiável da resposta do paciente à terapia antiretroviral.

[0015] Uma abordagem promissora para o rastreio, diagnóstico e classificando o HIV é o uso de marcadores, tal como o biomarcadores de plasma (ou soro) (tais como os antígenos e os padrões de proteína). No entanto, eles são ainda longe de uso clínico.

[0016] Pendyala G. e Fox HS. (Proteômica e estratégias metabolômica para investigar transtornos neurocognitivos associados ao HIV, Genome Med 2010; 2(3):22) descreve proteínas biomarcadores para transtornos neurocognitivos associados ao HIV que foram descobertos usando proteômica, que incluem C3 complementar, superóxido de dismutase solúvel e uma sintase de prostaglandina. De acordo com os autores, os marcadores moleculares confiáveis podem auxiliar na previsão de desenvolvimento da doença.

[0017] Cassol et al. (Metabolômica de Plasma identifica anormalidades lipídicas ligadas a marcadores de inflamação, translocação microbiana e função hepática em doentes infectados pelo HIV tratados com inibidores da protease. BMC Infectious Diseases (2013) 13:203) descrevem que um mapeamento de assinatura de 35 metabólitos de lipídios, aminoácidos e metabolismo de nucleotídeos pode distinguir pacientes com HIV com doença avançada em ART baseada em Pi dos controles, independentemente do status sorológico do HCV. Os autores concluem que as alterações lipídicas em pacientes com HIV que recebem ART baseada em Pi estão ligados a marcadores de inflamação, translocação microbiana e função hepática, sugerindo que estratégias terapêuticas atenuando ativação imune inata desregulado e disfunção hepática pode ser benéfica para a prevenção e tratamento de distúrbios metabólicos em pacientes com HIV.

[0018] Consequentemente, existe uma necessidade urgente na especialidade para o desenvolvimento de novas técnicas de rastreio e diagnóstico adequados para prever a progressão do HIV, resultado da doença, bem como da resposta terapêutica do paciente à terapia antirretroviral (ART). Em particular, novos biomarcadores eficazes para a detecção do HIV que podem ser usados individualmente ou em combinação com outros métodos existentes são urgentemente necessárias.

[0019] Tendo em vista os problemas acima mencionados existentes na técnica anterior, o objeto subjacente à presente invenção é o fornecimento de novos biomarcadores para avaliar o HIV, que permitem marcadores para o diagnóstico de confiança de HIV já em uma fase precoce da progressão da doença. Otimamente, o marcador deve ser facilmente detectável em uma amostra biológica, tal como no sangue, e o seu nível deve ser consistentemente relacionados com a fase de HIV. Além disso, é um objeto da presente invenção proporcionar um método para avaliar o HIV em uma amostra biológica. Além disso, os novos biomarcadores devem ser adequados para prever a progressão do HIV, resultado da doença, bem como da resposta terapêutica do paciente à terapia antirretroviral.

[0020] A fim de resolver os objetos subjacentes à presente invenção, os inventores com base em suas investigações metabolômicas como poderia dar uma visão nas alterações bioquímicas que ocorrem no decurso do desenvolvimento do HIV e oferecer vários novos e potencialmente melhores biomarcadores. Os inventores descobriram que uma imagem mais completa de todas as vias metabolômicas e mecanismos envolvidos no HIV é determinado quando se utiliza um painel de metabolitos que são alterados com HIV progredindo em vez de empregar técnicas convencionalmente realizadas na técnica.

Sumario da invenção

[0021] Consequentemente, a presente invenção, tal como definida nas reivindicações em anexo, fornece novos biomarcadores (isto é, um novo conjunto de biomarcadores) adequados para avaliar a infecção do HIV, especialmente em uma fase inicial da doença. Além disso, a presente invenção também proporciona um método para a avaliação do HIV em um sujeito mamífero, bem como um kit adaptado para realizar o método.

[0022] Em uma primeira modalidade, o invento é dirigido à utilização de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, uma acilcarnitina (AC) e pelo menos uma esfingomielina (SM) como um conjunto de biomarcadores para o rastreio e/ou diagnóstico de HIV.

[0023] Em uma outra modalidade, o invento é dirigido à utilização de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, uma fosfatidilcolina que compreende, pelo menos, um grupo acil-alquila na molécula (PC ae), e, pelo menos, dois aminoácidos como um biomarcador definido para a previsão da resposta imune de um sujeito mamífero para a terapia antirretroviral e/ou prognóstico da progressão da doença de HIV.

[0024] Em uma outra modalidade, o invento é dirigido à utilização de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, a proporção de quantidade total de eterlipídeos poliinsaturados araquidônicos a quantidade total de lipídeos de éter de ácidos graxos mono-insaturados e a proporção da quantidade total de éteres lipídicos de ácidos graxos mono- insaturados a quantidade total de ácidos graxos saturados como um biomarcador definido para a monitorização da atividade de HIV em um indivíduo mamífero.

[0025] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para o rastreio e/ou diagnóstico de HIV em um indivíduo mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito a quantidade de, pelo menos, uma acilcarnitina (AC) e pelo menos uma esfingomielina (SM).

[0026] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para a previsão da resposta imune de um sujeito mamífero para a terapia antirretroviral e/ou prognóstico da progressão da doença, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito a quantidade de, pelo menos, uma fosfatidilcolina com pelo menos um grupo acil-alquila na molécula (PC ae) e, pelo menos, dois aminoácidos.

[0027] Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para a monitorização da atividade de HIV em um indivíduo mamífero, compreendendo o método da medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito, pelo menos, a proporção de quantidade total de eterlipídeos poliinsaturados araquidônicos a quantidade total de gordos monoinsaturados lipídios de éter de ácido e a proporção total de lipídios de éter de ácidos graxos monoinsaturados a quantidade total de ácidos graxos saturados.

[0028] Em particular, a invenção compreende as seguintes modalidades.

[0029] [1] A utilização de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, uma acilcarnitina (AC) e pelo menos uma esfingomielina (SM) como um conjunto de biomarcadores para o rastreio e/ou diagnosticar a infecção pelo HIV.

[0030] [2] O uso de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, uma fosfatidilcolina que compreende, pelo menos, um grupo acil-alquila na molécula (PC ae), e pelo menos dois aminoácidos como um conjunto de biomarcadores para a previsão de resposta imune de um sujeito mamífero para a terapia antirretroviral e/ou prognóstico da progressão da doença de HIV.

[0031] [3] O uso de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, a proporção de quantidade total de eterlipídeos poliinsaturados araquidônicos (PUFA AE) a quantidade total de lipídeos de éter de ácidos graxos mono- insaturados (MUFA AE) e a razão da quantidade total de lipídeos de étr de ácido graxo monoinsaturados (MUFA ae) a quantidade total de ácidos graxos saturados (SFA) como um conjunto de biomarcadores para o monitoramento da atividade da doença HIV em um mamífero.

[0032] [4] Um método para o rastreio e/ou diagnóstico de infecção por HIV em um indivíduo mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito a quantidade de, pelo menos, uma acilcarnitina (AC) e pelo menos uma esfingomielina (SM).

[0033] [5] O método de [4], em que o pelo menos uma acilcarnitina é selecionada dentre as incluídas na Tabela 2 da especificação e/ou a pelo menos uma esfingomielina é selecionado dentre as incluídas na Tabela 4 da especificação, respectivamente.

[0034] [6] O método de [4] ou [5], em que o pelo menos um acilcarnitina é selecionado a partir glutaconilcarnitina, metilglutarilcarnitina, octanoilcarnitina, decanoilcarnitina e dodecanoilcarnitina.

[0035] [7] O método de qualquer uma das [4] a [6], que compreende ainda, pelo menos, uma amina biogênica e/ou, pelo menos, uma fosfatidilcolina.

[0036] [8] O método de qualquer uma das [4] a [7], em que a medição da quantidade de, pelo menos, uma esfingomielina compreende a medição da relação de quantidade de hidroxiesfingomielina com a soma resíduo de acila de C24:1 (SM (OH) C24:1) com a quantidade de esfingomielina com a soma resíduo de acila de C16: 0 (SM C16:0).

[0037] [9] Um método para a previsão da resposta imune de um sujeito mamífero para a terapia antirretroviral e/ou prognóstico da progressão da doença, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito a quantidade de, pelo menos, uma fosfatidilcolina com, pelo menos, um grupo acil-alquila na molécula (PC ae) e, pelo menos, dois aminoácidos.

[0038] [10] O modo de [9], em que o, pelo menos, uma fosfatidilcolina com, pelo menos, um grupo acil-alquila na molécula (PC ae) é selecionado dentre as incluídas na Tabela 5 da especificação.

[0039] [1 1] O método de [9] ou [10], que compreende ainda a medição da quantidade de, pelo menos, uma acilcarnitina.

[0040] [12] O modo de [11], em que o pelo menos uma acilcarnitina é selecionada dentre as incluídas na Tabela 2 da especificação.

[0041] [13] Um método para a monitorização da atividade da doença por HIV em um sujeito mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito, pelo menos, a proporção de quantidade total de eterlipídeos poliinsaturados araquidônicos (PUFA AE) a quantidade total de ácido graxo mono-insaturado lipídios éter (MUFA AE) e a razão da quantidade total de lipídios de éter de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA ae) a quantidade total de ácidos graxos saturados (AGS).

[0042] [14] O modo de [13], que compreende ainda a medição da quantidade de, pelo menos, uma acilcarnitina e/ou medição da quantidade de, pelo menos, uma esfingomielina.

[0043] [15] O modo de [14], em que o pelo menos uma acilcarnitina é selecionada dentre as incluídas na Tabela 2 da especificação e/ou a pelo menos uma esfingomielina é selecionado dentre as incluídas na Tabela 4 da especificação, respectivamente.

[0044] [16] O método de acordo com qualquer um de [4] a [15], em que a medição baseia-se em um método analítico quantitativo, de preferência cromatografia, espectroscopia, e espectrometria de massa.

[0045] [17] O método de acordo com [16], em que compreende cromatografia de GC, CE, LC, HPLC e UHPLC; espectroscopia compreende UV/Vis, IR e RMN; e analisadores de massa/espectrometria compreende ESI ou APCI-QQQ, ESI ou APCI-QqTOF, MALDI-QQQ, MALDI-QqTOF e MALDI-TOF-TOF.

[0046] [18] O método de acordo com [17], em que analisadores de massa/espectrometria compreende Analisador de massa de Quadrupolo, Analisador de massa de armadilha de íon, Analisador de Massa TOF (Tempo de Vôo), Anaisador de massa Orbitrap, Analisador de massa de setor magnético, Analisador de massa de setor eletrostático, ressonância de cíclotron de íon (ICR) e combinações de analisadores de massa, incluindo quadrupolo único (Q) e quadrupolo triplo (QqQ), QqTOF, TOF-TOF, Q-Orbitrap.

Breve Descrição das Figuras

[0047] No anexo da especificação referência é feita para os seguintes números 1-9. Estes exemplos demonstram de acordo com a invenção do aumento ou diminuição de um biomarcador metabólico em sofrimento do paciente de HIV em comparação com pacientes não infectados por HIV como controle.

[0048] Figura 1: análise PLS-DA mostrando a clara discriminação entre pacientes com HIV em estágios agudo e crônico, com e sem carga viral detectável em relação aos controles, incluindo casos de câncer da mama HIV-negativos, como parte dos controles.

[0049] Figura 2A: Top 25 metabólitos correlacionados (Pessoa r) para HIV mostrando que o HIV está basicamente relacionado a profundas disfunções mitocondriais seguido por uma enorme diminuição nos níveis de Esfignomielinas.

[0050] Figura 2B: Aumentos significativos na glutaminólise e biossíntese de lipídeos em HIV e pacientes com câncer de mama em comparação com controles saudáveis. Infecções virais e mudanças metabolômica de sangue semelhante a compartilhamento do câncer.

[0051] Figura 3: Análise multivariada da curva ROC (A), utilizando os metabolitos descritos em (B), demonstram as enormes capacidades discriminativas do teste, mesmo depois de 1000 permutações.

[0052] Figura 4A: Vista das probabilidades de classe previstas para discriminar HIV a partir dos controles.

[0053] Figura 4B: análise de teste-T baseado em concentrações de metabolitos sanguíneos regulado para cima e para baixo de HIV e controles. A Figura mostra que esfingomielina C24: 1 é quase 100 vezes menos concentrada em pacientes com HIV quando comparados aos controles.

[0054] Figura 4C: concentrações dos metabólitos plasmáticos de Dodecanedioilcarnitina (C12- DC), Glutaconilcarnitina (C5: 1-DC) e Esfingomielinas Totais (SMS Total) em HIV a partir dos controles.

[0055] Figura 5A: A deficiência ACADM observada em pacientes com HIV está presente nos mesmos níveis em todos os grupos e não se alterou significativamente ao longo do tempo (p = 1.3892E-9, -logl0 (p) = 8,8572, FDR = 1.9757E-8)

[0056] Figura 5B: Análise da correlação entre a função ACADM (C12/C10) com os parâmetros sanguíneos em HIV e grupo de controle. Aumentos na função ACADM são seguidos de perto por aumentos na esfingomielinas e acilcarnitinas C12-DC ambos, significativamente, regulados para baixo durante a infecção pelo HIV. Por outro lado, os metabolitos elevados de HIV de tal atividade de C5-M-DC e fenilalanina hidroxilase foram, significativamente, regulados para baixo.

[0057] Figura 6A: A atividade lócus SYNE2 é altamente diminuída em pacientes com HIV em comparação com controles saudáveis particularmente no grupo de resposta não imune após 1 ano de acompanhamento.

[0058] Figura 6B: A atividade lócus SYNE2 é altamente diminuída em pacientes com HIV em particular no grupo de resposta não imune após 1 ano de acompanhamento (p = 1.2959E-7, -log10(p) = 6,8874, FDR = 1.5798E-6) (ANOVA post hoc) (Legenda: 1Cont = Controles, 6RID1 = respondedores imunes no início do estudo, 7RID2 = respondedores imunes após 1 ano, NRID1 = respondedores não imunes no início do estudo, NRID2 = respondedores não-imunológica após 1 ano).

[0059] Figura 6C: Análise da correlação entre a atividade em lócus SYNE2 (PC aa 28: 1/PC ae 40: 2) com os parâmetros sangüíneos em HIV e grupo de controle. Aumentos na função SYNE2 são seguidos de perto por argumentos significativas no total de Esfingomielinas e quedas significativas na ROS sistêmica como medido pela razão de metionina sulfoxidada a Metionina total não modificada (Met- SO/Met).

[0060] Figura 7A: Razão do PC ae Total à PC Total demonstra que em todos os grupos, mas não nos respondedores não-imunológicas a produção de lipídios de éter voltar aos níveis normais, um ano após a primeira visita. O oposto está acontecendo no grupo de não-resposta imune (p = 1.1405E-5; -log (10 (p) = 4.9429; FDR = 9.6586E- 5) (ANOVA post hoc) (Legenda: 1Cont - Controles, 2ED1 = Elite linha de base; 3ED2 = Elite após 1 ano; 4PRD1 = rápidos Progressores de linha de base; 5PRD2 = rápidos Progressores após 1 ano; 6RID1 = respondedores imunes no início do estudo, 7RID2 = respondedores imunes após 1 ano, NRID1 = respondedores não imunes no início do estudo, NRID2 = respondedores não imunes após 1 ano).

[0061] Figura 7B: Razão do PC ae total à PC Total demonstra que no grupo de resposta imune a produção de lipídios de éter é significativamente regulada negativamente um ano após a primeira visita. O oposto está acontecendo no grupo de não-resposta imune (p = 3.592E-5; -log (10 (p) = 4,4447, FDR = 3.1709E-4) (ANOVA post hoc) (abreviaturas como acima).

[0062] Figura 7C: Análise da correlação entre a atividade AGPS (PC ae total /PC Total) com os parâmetros sanguíneos em HIV e grupo de controle. Aumentos na função AGPS são seguidos de perto por decréscimos em CD4/CD8 e também na Alongase de ácidos graxos muito longos-2 (ELOVL2) medida pela razão C40:5 PC aa/PC aa 42: 5.

[0063] A Figura 7D: Comparação da quantidade de Elétron transferindo-flavoproteína-desidrogenase (ETFDH) presentes nos respectivos grupos imunológicos de pacientes (abreviaturas como acima).

[0064] Figura 7E: A análise de correlação da função ETFDH (C8/C7-DC) com os parâmetros sanguíneos em HIV e grupo de controle. Aumentos na função ETFDH são seguidos de perto por aumentos na esfingomielinas, que foram significativamente para baixo regulados durante a infecção pelo HIV. Por outro lado, os metabolitos tais C5-M-DC e carga viral, significativamente, para baixo do HIV-regulados elevada.

[0065] Figura 8: HIV Bom contra o pior prognóstico: Comparação entre as curvas ROC multivariados obtidos em treinamento e validação conjuntos utilizando os 5 metabólitos preditivos HIV descritos na Tabela 1. pValues, após 100 rodadas de permutação, também são exibidos.

[0066] Figura 9: PCA (A) e PLS-DA (B) parcelas bidimensionais de pontuação que descrevem diferenças nas concentrações plasmáticas de metabólitos (Cont = controles saudáveis, Nresp = pior prognóstico, Resp = bom prognóstico).

[0067] Figura 10: (A) Correlação dos PUFA PC ae/MUFA ae PC com proporção de células CD4/DC8 contar; (B) Correlação dos AGPI/MUFA com relação de contagem de células CD4/DC8;

[0068] Figura 11: (A) Correlação dos PUFA PC ae/SFA PC ae com proporção de células CD4/DC8 contar; (B) Correlação de PUFA/SFA com relação de contagem de células CD4/DC8;

Descrição das Modalidades Preferidas

[0069] Ao empregar o específico (conjunto de) biomarcadores e os métodos de acordo com a presente invenção tornou-se possível avaliar de forma mais adequada e confiável do HIV. "Avaliação" no sentido da presente invenção significa que o rastreio da infecção por HIV e/ou diagnosticar a infecção por HIV em pacientes, prever a resposta imune à terapia antirretroviral e de prognóstico da progressão da doença de HIV, e monitorização da atividade da doença do HIV, em particular a detecção e marcação da doença nas diferentes fases e monitorização da progressão da doença.

[0070] A presente invenção torna possível para rastrear doentes com HIV e diagnosticar o HIV de uma forma melhorada e em uma fase precoce da doença e permite uma previsão mais sensível da progressão da doença. A presente invenção permite ainda que para a previsão da resposta de um doente para discriminar entre ART e grupos imunológicos de pacientes. Na verdade, os biomarcadores de acordo com a invenção são facilmente detectáveis em amostras biológicas, em particular no sangue, e o seu nível é consistentemente relacionado com o grau de HIV.

[0071] Em geral, um biomarcador é uma ferramenta valiosa, devido à possibilidade de distinguir duas ou mais estados biológicos a partir de um outro, que trabalha como um indicador de um processo biológico normal, um processo patogênico ou como reação a uma intervenção farmacêutica. Um metabolito é um composto de baixo peso molecular (<lkDa), menor do que a maioria das proteínas, DNA e outras macromoléculas. Pequenas mudanças na atividade das proteínas resultam em grandes mudanças nas reações bioquímicas e seus metabólitos (= biomarcadores metabólicos, olhando para o metabolismo do corpo), cujas concentrações, fluxos e mecanismos de transporte são sensíveis a doenças e intervenção medicamentosa. Isto permite obter um perfil individual de substâncias fisiológicos e fisiopatológicos, refletindo tanto a genética e fatores ambientais como a nutrição, a atividade física, microbal intestino e medicação. Assim, um biomarcador metabólico dá uma informação mais completa do que, por exemplo, uma proteína ou hormona, que são biomarcadores, mas não biomarcadores metabólicos.

[0072] Em vista do mesmo, o termo biomarcador metabólico ("biomarcador") tal como aqui utilizado, é definido como sendo um composto adequado como um indicador do estado do HIV ser um metabolito ou composto metabólico que ocorrem durante os processos metabólicos no corpo de um mamífero. O termo "biomarcador", "biomarcador metabólico" e "metabolito" são em geral usados como sinônimos no contexto da presente invenção. Em particular, a presença de uma certa quantidade (tipicamente % massa ou % mol, de preferência % mol) de um metabolito e/ou a proporção (de uma quantidade) de um metabolito com respeito a (a montante de) um outro metabolito é usado como "biomarcador" e é utilizado na presente invenção no domínio das utilizações e métodos como aqui descritos. Assim, o termo biomarcador metabólico ou biomarcador pretende também compreender proporções entre dois ou mais metabolitos/biomarcadores. Assim, o termo "biomarcador" também pode abranger a relação entre a quantidade de dois ou mais metabolitos.

[0073] O biomarcador metabólico (conjunto) medido de acordo com a presente invenção compreende mandatoriamente as seguintes classes de metabólitos (ou seja, analitos): aminoácidos e aminas biogênicas, acilcarnitinas, hexoses, esfingolipídeos, e glicerofosfolipídeos. Os lipídeos são de preferência éteres lipídicos araquidônicos, de preferência aqueles tendo mais do que 38 átomos de carbono por molécula. As definições destas classes são conhecidas do perito na arte, no entanto, os membros preferidos destas classes estão resumidos nas Tabelas 1-5 abaixo. Além disso, aminas biogênicas são entendidas como um grupo de ocorrendo naturalmente compostos biologicamente ativos derivados de descarboxilação enzimática dos aminoácidos naturais. Uma substância é uma substância biogênica fornecida por processos de vida, e as aminas biogênicas contêm um grupo amina.

[0074] Tem sido surpreendentemente encontrado que a medição de um conjunto de biomarcadores que compreendem estas classes de metabolitos permite o rastreio para o diagnóstico de HIV e de uma forma melhorada e em uma fase precoce da doença. Em particular, ele permite uma previsão mais sensível da progressão do HIV, bem como a previsão da resposta terapêutica do paciente à terapia antiretroviral.

[0075] Se uma classe de metabólitos deste grupo é omitida ou se o número diminuiu mesmo a avaliação do HIV torna-se menos sensível e menos confiável. Isto aplica-se especialmente para as fases iniciais da doença a ser confiavelmente não detectável de acordo com métodos conhecidos, utilizando biomarcadores conhecidos em tudo. De fato, a medição dos metabolitos aqui descritos, ao mesmo tempo permite um diagnóstico mais confiável do HIV, de preferência, com uma sensibilidade de 100%. Tal fato não foi nem descrita nem feita em óbvio a partir da técnica anterior.

[0076] A amostra biológica é obtida a partir de um mamífero, de preferência a partir de um murganho, um rato, uma cobaia, um cão, um mini-porco, ou um ser humano, de um modo preferido de um humano. A amostra biológica é de preferência uma amostra de sangue. A amostra de sangue é, tipicamente, de sangue total, soro ou plasma, em que o plasma sanguíneo é preferido. No entanto, qualquer outra amostra biológica conhecida para o perito na arte, que permite que as medições de acordo com a presente invenção são também adequadas. Assim, o método de acordo com a invenção é um método in vitro.

[0077] Para a medição das concentrações do metabolito na amostra biológica de um método de análise quantitativa, tal como cromatografia, espectroscopia, espectrometria de massa e é empregue, enquanto a espectrometria de massa é particularmente preferida. A cromatografia pode compreender GC, LC, HPLC e UPLC; espectroscopia pode compreender UV/Vis, IR e RMN; e espectrometria de massa pode compreender ESI-QQQ, ESI-QqTOF, MALDI-QQQ, MALDI-QqTOF e MALDI-TOF-TOF. Prefere-se a utilização de FIA e espectrometria de massa de HPLC-tandem. Estes métodos de análise são geralmente conhecidos da pessoa perita.

[0078] Ainda preferencialmente, analisadores de massa/espectrometria compreendem Analisador de massa de Quadrupolo, Analisador de massa de armadilha de íon, Analisador de Massa TOF (Tempo de Vôo), Anaisador de massa Orbitrap, Analisador de massa de setor magnético, Analisador de massa de setor eletrostático, ressonância de cíclotron de íon (ICR) e combinações de analisadores de massa, incluindo quadrupolo único (Q) e quadrupolo triplo (QqQ), QqTOF, TOF- TOF, Q-Orbitrap.

[0079] Para a medição da metabolômicas quantidades metabolito alvo é utilizada para quantificar os metabolitos na amostra biológica incluindo as classes de analitos de aminoácidos, aminas biogênicas, acilcarnitinas, hexoses, esfingolipídeos e glicerofosfolipídeos. Os aminoácidos incluem preferencialmente os 20 aminoácidos proteinogênicos conhecidos. A quantificação é feita usando na presença de padrões internos isotopicamente marcados e determinada pelos métodos como descrito acima.

[0080] Uma lista de analitos incluindo as abreviaturas (códigos BC) ser adequado como metabolitos de ser medido de acordo com a invenção está indicada nas tabelas seguintes. A classificação de metabolitos por o código AC é tal como se explica em EP 2 284 540 Al usando as seguintes abreviaturas:

[0082] Tabela 1: Os aminoácidos e aminas biogênicas (μM)

[0083] Tabela 2: Acilcarnitina (μM)

[0084] Tabela 3: Hexoses (NIM)

[0085] Tabela 4: Esfingolipídeos (como secundário)

[0086] Tabela 5: Glicerofosfolipídeos (mm)

[0087] Outras modalidades preferidas da presente invenção são descritas a seguir. No entanto, a sua combinação com as características descritas mais acima não se destina a ser excluída.

Triagem/Diagnóstico de pacientes

[0088] Em uma modalidade preferida, os biomarcadores e os conjuntos de biomarcadores da presente invenção são utilizados para o rastreio de pacientes potencialmente sofrendo de HIV e o diagnóstico de HIV nestes doentes. Tem sido surpreendentemente verificado na presente invenção que os biomarcadores e os conjuntos de biomarcadores como aqui descritos são particularmente úteis para a rápida e fácil triagem, e/ou diagnóstico de um grande número de pacientes com uma maior precisão dos resultados. Assim, nesta modalidade preferida compreende a avaliação de triagem e dignóstico da infecção por HIV em um sujeito mamífero, preferencialmente em um ser humano. Em particular, é possível rastrear/diagnosticar a doença em indivíduos independentes da atividade do vírus, isto é, de forma assintomática.

[0089] Assim, em uma modalidade preferida, a invenção é dirigida à utilização de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, uma acilcarnitina (AC) e pelo menos uma esfingomielina (SM) como um conjunto de biomarcadores para o rastreio e/ou diagnóstico de HIV.

[0090] A presente invenção é ainda dirigida a um método para o rastreio e/ou diagnóstico de HIV em um indivíduo mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito a quantidade de, pelo menos, uma acilcarnitina (Ac) e, pelo menos, uma esfingomielina (SM).

[0091] Em particular, é possível discriminar entre sujeitos que sofrem de HIV e controles saudáveis, p.ex. indivíduos infectados não-HIV, usando a combinação acima de metabolitos.

[0092] De um modo preferido, a, pelo menos, uma acilcarnitina é selecionado dentre as incluídas na Tabela 2 acima. Ainda de preferência, a pelo menos uma esfingomielina é selecionada dentre as incluídas na Tabela 4 acima. Ainda de preferência, a pelo menos uma acilcarnitina é selecionada a partir glutaconilcarnitina, metilglutarilcarnitina, octanoilcarnitina, decanoilcarnitina e dodecanoilcarnitina.

[0093] Ainda de preferência, o método compreende a medição da quantidade de pelo menos uma amina biogênica e/ou de, pelo menos, uma fosfatidilcolina.

[0094] Ainda de preferência, o método compreende a medição da quantidade de, pelo menos, uma esfingomielina, em particular a medição da relação de quantidade de hidroxiesfingomielina com a soma do resíduo acila de C24: 1 (SM (OH) C24:1) para a quantidade de esfingomielina com soma do resíduo de acila C16: 0 (SM C16: 0).

[0095] Medir quantidades adicionais de metabolitos e/ou proporções adicionais de metabólitos como listados nas Tabelas 6 e 7 irá melhorar ainda mais a precisão de discriminação entre estes assuntos e, assim, vai melhorar a precisão da triagem e/ou resultados de diagnóstico.

[0096] Tabela 6: metabólitos preferidos usados para rastreamento e diagnóstico do HIV em indivíduos (códigos BC como nas Tabelas 1 -5):

[0097] Tabela 7: Razões preferidas de metabolitos usados para rastreamento e diagnóstico do HIV em indivíduos (códigos BC como nas Tabelas 1 -5, AUC: área sob a curva característica de operação (ROC) receptor):

[0098] Mais preferencialmente, os metabolites de entre os listados na Tabela 8 abaixo.

[0099] Tabela 8: Mais metabólitos preferenciais rastreamento e diagnóstico do HIV em indivíduos (códigos BC como nas Tabelas 1 -5):

[0100] Opcionalmente, o método compreende ainda o passo de identificação na base das quantidades e proporções medidos para os respectivos biomarcadores e razões de biomarcadores daqueles indivíduos que sofrem de HIV e ainda mais preferencialmente o tratamento do HIV nestes sujeitos pela arte, tais como a HAART.

[0101] Como o método da presente modalidade pode ser realizada a partir de amostras de sangue, o método aumenta grandemente a conformidade do sujeito em comparação com a técnica da arte anterior de triagem. Em particular, o método aumenta grandemente a fiabilidade e sensibilidade dos resultados de triagem, em particular reduz o número de resultados falso negativos e falso positivo, e é menos demorado, e, portanto, pode ser realizada com um elevado número de pacientes.

Previsão de resposta imune à terapia antiretrovitral e prognóstico de HIV

[0102] Em uma outra modalidade preferida, os biomarcadores e os conjuntos de biomarcadores da presente invenção são utilizados para prever se um paciente que sofra de HIV é susceptível de responder a terapia antirretroviral (ART), v.g. alta terapia antirretroviral (HAART). Nesta modalidade, o paciente HIV é tipicamente um paciente que não tenha sido submetido a tratamento para o HIV, de um modo preferido um paciente que não tenha sido submetido a tratamento para o HIV por ART. Assim, os biomarcadores e os conjuntos de biomarcadores da presente invenção são utilizados para prever se um paciente que sofra de HIV é susceptível de responder a terapia antirretroviral (ART) antes de iniciar a terapia.

[0103] Em particular, podem ser discriminados entre os indivíduos com boa resposta (bom prognóstico) e indivíduos com pior resposta (pior prognóstico). Normalmente, indivíduos com bom prognóstico incluem controladores de elite (CE) e responder imunológica (IR), enquanto sujeitos com pior resposta compreendem não- respondedores imunes (INR) e progressores rápidos (RP).

[0104] Os controladores de elite são pacientes capazes de controlar a replicação do vírus a um nível de <50 cópias/ml durante pelo menos um ano sem a utilização de HAART infectado com HIV.

[0105] Respondedores imunes são pacientes que são caracterizadas por uma resposta eficaz no que diz respeito a células T CD4 + e as contagens de carga viral de HIV, isto é, têm carga viral indetectável (viremia) e níveis elevados de células T CD4 +, mesmo após longos períodos de HAART.

[0106] Não-respondedores imunes são pacientes que são caracterizadas por uma resposta discordante e ineficaz em relação a células T CD4 + e as contagens de carga viral de HIV, isto é, têm carga viral indetectável (viremia) mas persistem com baixos níveis de células T CD4 +, mesmo após longos períodos de HAART.

[0107] Progressores lentos são pacientes infectados pelo HIV que mantêm níveis estáveis de células CD4+ T e que permanecem assintomáticos sem o uso de HAART.

[0108] Assim, em uma modalidade preferida, a invenção é dirigida à utilização de uma combinação de metabolitos descritos no seguinte para prever se um paciente que padeça de mamíferos a partir de HIV é provavelmente responder à ART, p.ex. HAART.

[0109] Em particular, a presente invenção é ainda dirigida à utilização de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, uma fosfatidilcolina que compreende, pelo menos, um grupo acil-alquila na molécula (PC ae), e, pelo menos, dois aminoácidos como um biomarcador definido para a previsão da resposta imune de um sujeito mamífero para a terapia antirretroviral e/ou prognóstico da progressão da doença. Em uma outra modalidade, a presente invenção é dirigida a um método para a previsão da resposta imune de um sujeito mamífero para a terapia antirretroviral e/ou prognóstico da progressão da doença de HIV, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito a quantidade de pelo menos uma fosfatidilcolina com, pelo menos, um grupo acil-alquila na molécula (PC ae) e, pelo menos, dois aminoácidos.

[0110] De um modo preferido, o, pelo menos, uma fosfatidilcolina com, pelo menos, um grupo acil-alquila na molécula (PC ae) é selecionado dentre as incluídas na Tabela 5 da especificação.

[0111] Os pelo menos dois aminoácidos são preferencialmente selecionados a partir de aminoácidos proteinogênicos, mais preferencialmente selecionados a partir de Glu, Tyr e Phe. Uma combinação preferida de aminoácidos é Tyr e Phe.

[0112] Ainda de preferência, o método compreende a medição da quantidade de, pelo menos, uma acilcarnitina. A pelo menos uma acilcarnitina é de preferência selecionado dentre as incluídas na Tabela 2 da especificação.

[0113] Mais preferencialmente, o método compreende a medição na amostra de sangue a razão entre

[0114] a) AC-DC total/C3-OH,

[0115] b) Tyr/Phe/PC ae C38: 4,

[0116] c) Tyr/Phe/PC ae C40: 6,

[0117] d) C3-OH/C14: 2-OH, e

[0118] e) Tyr/Phe/Sum Arac PC ae.

[0119] Foi surpreendentemente verificado na presente invenção que a previsão da resposta terapêutica à arte utilizando a combinação acima de proporções de metabolitos era mais confiável e eficaz do que com os métodos do estado da técnica.

[0120] Além disso, foi surpreendentemente verificado na presente invenção que é possível discriminar entre os subgrupos de pacientes e prever a resposta imune à arte sobre a base da sua assinatura metabolito. Assim, ele pode ser discriminado entre os subtipos imunológicos de controladores de elite

[0121] (CE) e os respondentes imunológicas (IR) em relação ao grupo de progressores rápidos (RP) e os não respondedores imunes (NIR), em função do bioassinatura metabólica da doença por HIV nestes doentes. A discriminação entre estes grupos imunológicos de pacientes pode aumentar ainda mais a precisão da previsão da resposta terapêutica à ART, e, portanto, pode melhorar significativamente o sucesso terapêutico. Particularmente, o prognóstico Grupo bom é composto por pacientes de Controladores de elite e respondedores imunes, que são os pacientes com maior chance de sobrevivência de longa data. O Grupo pior prognóstico é composto de pacientes que ou desenvolver SIDA em menos de 1 ou 2 anos (progressores rápidos) ou não mostram a recuperação de imunidade, como revelado pelos níveis baixa de CD4/CD8, após o tratamento antirretroviral. Em particular, é possível receber um prognóstico ACCURAT da progressão da doença imunológica e resposta independente do estado de doença no momento da realização dos métodos da presente invenção.

[0122] Medição de quantidades adicionais de metabolitos e/ou proporções de metabolitos adicionais como listados nas Tabelas 9 e 10 irá melhorar ainda mais a precisão de discriminação entre estes grupos imunológicos e, assim, vai melhorar a precisão da previsão da resposta terapêutica à técnica, tal como a HAART.

[0123] Tabela 9: Metabolitos que discriminam controladores de elite (ER) dos grupos imunológicos NIR, IR e RP

[0124] Tabela 10: Razões de metabólitos que discriminam controladores de elite (ER) dos grupos imunológicos NIR, IR e RP

Monitoramento da atividade da doença HIV

[0125] Além disso, é possível com os metabolitos acima mencionados monitorar a atividade da doença do HIV em um paciente.

[0126] Assim, em uma outra modalidade, o invento é dirigido à utilização de uma combinação de metabolitos contidos em uma amostra de sangue, que compreende, pelo menos, a proporção de quantidade total de eterlipídeos poliinsaturados araquidônicos a quantidade total de lipídeos de éter de ácidos graxos mono-insaturados e a razão entre quantidade total de lipídeos de éter de ácidos graxos mono-insaturados a quantidade total de ácidos graxos saturados como um biomarcador definido para a monitorização da atividade de HIV em um indivíduo mamífero.

[0127] Em uma outra modalidade, a invenção é dirigida a um método para a monitorização da atividade de HIV em um indivíduo mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida a partir do sujeito, pelo menos, a proporção de quantidade total de eterlipídeos poliinsaturados araquidônicos a quantidade total de mono fatty lipídios éter ácido e a razão da quantidade total de lipídios de éter de ácidos graxos monoinsaturados a quantidade total de ácidos graxos saturados.

[0128] Em modalidades preferenciais da etherlipid poliinsaturados araquidônico é ácidos graxos poliinsaturados (AGPI) PC ae, o éter lipídico de ácido graxo monoinsaturado é ácido graxo monoinsaturado (MUFA) PC ae, e o ácido graxo saturado é ácido graxo saturado (SFA) PC ae. Assim, as proporções preferidas compreendem PUFA PC ae/MUFA PCAE e/ou PUFA PC ae/SFA PC ae.

[0129] O método compreende ainda de preferência a medição da quantidade de, pelo menos, uma acilcarnitina e/ou medição da quantidade de, pelo menos, uma esfingomielina.

[0130] Ainda de preferência, a pelo menos uma acilcarnitina é selecionado dentre as incluídas na Tabela 2 da especificação e/ou a pelo menos uma esfingomielina é selecionada dentre as incluídas na Tabela 4 da especificação, respectivamente.

[0131] Se uma classe de metabólitos deste grupo é omitida ou se o seu número é reduzido a monitorização da atividade da doença HIV torna-se menos sensível e menos confiável. Isto aplica-se especialmente para as fases iniciais da doença a ser confiavelmente não detectável de acordo com métodos conhecidos, utilizando biomarcadores conhecidos em tudo. De fato, a medição da concentração de metabolitos, tal como aqui descrito, ao mesmo tempo, permite um controle mais preciso e mais confiável de atividade do HIV, tipicamente com uma sensibilidade de preferência mais do que 80%, mais preferencialmente mais do que 90%, ainda mais preferencialmente mais do que 98% e mais preferencialmente 100%. Tal fato não foi nem descrita nem feita em óbvio a partir da técnica anterior.

[0132] Além disso, os biomarcadores e os conjuntos de biomarcadores da presente invenção tal como aqui descrita permite um controle mais confiável e precisa da atividade de HIV com uma especificidade superior a 80%, mais preferencialmente mais do que 85%, ainda mais preferivelmente mais do que 90% e mais de preferência 100%.

[0133] Além disso, o conjunto de biomarcadores da presente invenção tal como aqui descrita permite um controle mais confiável da atividade do HIV com um valor preditivo positivo (PPV) de mais de 40%, mais preferencialmente mais do que 50%, ainda mais preferivelmente mais do que 60% e mais preferivelmente mais do que 80%.

[0134] Além disso, o conjunto de biomarcadores da presente invenção tal como aqui descrita permite um controle mais confiável da atividade do HIV com um valor preditivo negativo (NPV) de mais de 80%, mais preferencialmente mais do que 90%, ainda mais preferivelmente mais do que 98% e mais preferencialmente 100%.

[0135] Em uma modalidade preferida, o conjunto de biomarcadores da presente invenção tal como aqui descrita permite um controle mais confiável da atividade do HIV com uma sensibilidade de 100% e VPL de 100%.

[0136] Em uma modalidade mais preferida, o conjunto de biomarcadores da presente invenção tal como aqui descrita permite um controle mais confiável da atividade do HIV com uma sensibilidade de 100%, uma especificidade de 85% ou mais e VPL de 100%.

[0137] Em uma modalidade mais preferida, o conjunto de biomarcadores da presente invenção tal como aqui descrito permite uma mais monitorização da atividade de HIV com uma sensibilidade de 100%, especificidade de 90% ou mais, VPP de 80% ou mais, e um NPV de 100%.

[0138] Na modalidade mais preferida, o conjunto de biomarcadores da presente invenção tal como aqui descrita permite um controle mais confiável da atividade do HIV com uma sensibilidade de 100%, uma especificidade de 100%, VPP de 100%, e VPL de 100%.

[0139] Em particular, é possível, com o (conjunto de) biomarcadores, tal como aqui descrito para não distinguir só com precisão, entre a fase aguda da infecção do HIV, isto é, a atividade da doença caracterizado com uma carga viral elevada, e a fase crônica, isto é, o vírus HIV continua a reproduzir em níveis muito baixos, embora seja ainda ativa, da infecção, mas também para obter uma melhor compreensão dos atividade bioquímica da doença, tais como insights sobre os níveis de biooxidação, a função mitocondrial, imunidade, o metabolismo lipídico e (ou resistência à insulina . Um marcador típico de atividade de doença e progressão da doença é a progressão contagem de linfócitos CD4. Deste modo, a atividade da doença e doença pode ser eficazmente determinado na presente invenção pela determinação da correlação do biomarcador definido como aqui descrito com a contagem de células CD4, de um modo preferido a proporção de células T CD4/CD8.

[0140] Com este conhecimento, é possível ajustar com precisão e se adaptar a terapia do paciente, tais como a adaptação dose de administração de um agente ativo, ou a administração de agentes ativos alternativos com base no conhecimento recebido a partir da medição dos (conjuntos de) biomarcadores, tal como aqui descrito. Tal fato nunca foi alcançado antes.

Kit

[0141] Além disso, o invento é também dirigido a um kit adaptado para realizar o método em que o kit compreende um dispositivo que dispositivo contém um ou mais poços e uma ou mais inserções impregnadas com pelo menos um padrão interno. Um tal dispositivo é descrito em detalhe no documento WO 2007/003344 e WO 2007/003343 que as aplicações são ambos aqui incorporados por referência.

[0142] Os exemplos seguintes esclarecem ainda mais a presente invenção, sem se destinar a limitar o âmbito em qualquer forma.

Exemplos Informação geral: Pacientes e métodos

[0143] 37 amostras aleatórias foram analisadas a partir de pacientes infectados pelo HIV em perspectiva seguidos em São Paulo Aids Research Center Cohort (SPARCC). Este último é um grupo de pacientes HIV- recente infectado cujo objetivo é estudar a história natural do HIV e sua progressão para a Aids e está bem descrito em outros lugares (Kallas BJID 2004).

[0144] Dados demográficos SPARCC, HIV-1 carga viral e contagem de células CD4 + foram coletadas a cada três meses durante as visitas clínicas. As amostras foram analisadas na linha de base e após um ano de acompanhamento. Para os não-respondentes imunológicas e entrevistados imunológicas amostras da linha de base foram coletadas imediatamente pré-tratamento com contagens de células CD4 + <350 células/mm3 e amostras de um ano foram coletadas exatamente aos 12 meses de visita de tratamento.

[0145] Controles incluiram 11 indivíduos saudáveis não infectados pelo HIV pareados por idade e sexo e por causa de alterações metabólicas semelhantes induzidas por infecções virais também podem ser observadas em células cancerosas (Yu et al 2011) 64 estágio III câncer da mama pacientes não infectados com HIV sem tratamento prévio em grupo de controle foram incluídos. Identificar pacientes com HIV, mesmo na presença de fatores de confusão metabolômica representados por pacientes com câncer de mama em estágio avançado (estágio 3). Controles de câncer da mama foram utilizados devido ao fato de alterações metabólicas semelhantes induzidas por infecções virais também podem ser observados em células de câncer (glutaminólise, biossíntese de éter lipídico = soma de plasmalogênio aracdônico/ osfatidilcolinas plasmalogênio). No entanto, em pacientes com HIV o aumento da biossíntese de lipídios não foi observado para Esfingomielinas (SM); no entanto, foi brutalmente para baixo regulado.

Medição do metabólito

[0146] Perfil metabólico alvo, por ionização por espectrometria de massa em tandem de eletropulverização (ESI) (MS/MS), foi realizado em amostras de plasma colhidas 37 na linha de base e 1 ano de acompanhamento de pacientes assim distribuídos: 5 não respondedores imunes, 5 respondedores imunes, 5 progressores rápidos e 5 pacientes de elite, bem como 75 controles, em um, serviço independente, livre de taxa, em uma plataforma metabolômica quantitativa na vida Biocrates Ciências AG, Innsbruck, Áustria.

[0147] Todos os dados metabolômicos foram usados tal como foi recebido da Biocrates. A técnica de medição metabolômica experimental é descrita em detalhe por patente US 2007/0004044.

[0148] Quantificação dos metabolitos da amostra biológica é feita por referência a padrões internos adequados e o método foi provado ser em conformidade com 21 CFR (Code of Federal Regulations) Parte 11, o que implica a prova de reprodutibilidade dentro de um determinado intervalo de erro. As concentrações de todos os metabolitos analisados foram relatadas em μM e os resultados foram comparados com as taxas de resposta do tumor e dos subtipos intrínsecos de tumor.

Painel metabólito

[0149] Painel metabólito é composto por 183 metabolitos diferentes, das quais 40 acilcanitinas, 19 aminoácidos proteinogênicos, ornitina e citrulina, 19 aminas biogênicas, soma de hexoses 76 fosfatidilcolinas, 14 liso- fosfatidilcolinas e 15 Esfingomielinas, como mostrado nas Tabelas 1-5 acima.

[0150] Glicerofosfolipídeos são mais diferenciados no que diz respeito à presença de éster (a) e éter (e) ligações no radical glicerol, em que duas letras (AA = diacila, AE = acil-alquila, EE = dialquila) denotam que duas posições do glicerol são ligadas a um resíduo de ácido graxo, enquanto uma única letra (a = acila ou e = alquila) indica a presença de um único resíduo de ácido graxo.

[0151] Cadeia lateral da composição lipídica é abreviada como Cx: y, onde x indica o número de átomos de carbono na cadeia lateral e y o número de ligações duplas. Por exemplo. "PC ae C38:1" indica uma fosfatidilcolina plasmalogênio/plasmenogênio com 33 átomos de carbono em que as duas cadeias laterais de ácido graxo e uma única ligação dupla em um deles.

Estatística e Análise de Dados

[0152] Casos de treinamento foram utilizados para a descoberta do marcador e identificar qualquer variável clínica que pode estar associada com a resposta por meio de análise de regressão logística. Quantificação das concentrações de metabólitos e avaliação de controle de qualidade foi realizado com o pacote de software MeIQ (BIOCRATES Life Sciences AG, Innsbruck, Áustria). Normas internas servem de referência para os cálculos de concentração metabólito. Um arquivo xls foi então exportado, que continha os nomes das amostras, nomes de metabolitos e concentração de metabólitos com a unidade de μmol/L de plasma.

[0153] Os dados foram então enviados para o pipeline analítico baseado na web MetaboAnalyst 2.0 (www.metaboanalyst.ca) e utilizando protocolos de normalização do MetaboAnalyst normalizados (56) para uni e multivariada, a seleção de alta funcionalidade dimensional, agrupamento e classificação supervisionada, o enriquecimento funcional, bem como análise via metabólica.

[0154] Os dados também foram importados para ROCCET (ROC Curve Explorador & Tester), disponível em http://www.roccet.ca/ROCCET/ para a geração de curvas características uni e multivariadas da Operação de Recepção (ROC) obtidas através de Support Vector Machine (SVM), Mínimos quadrados parciais-Análise discriminante (PLS-DA) e Forests aleatórios. As curvas foram geradas por validação cruzada de Monte-Carlo (MCCV) usando subamostragem equilibrada, onde dois terços (2/3) das amostras foram utilizadas para avaliar a importância característica.

[0155] Características significativas foram então usados para construir modelos de classificação, que foram validados no 1/3 das amostras que ficaram de fora. O mesmo procedimento foi repetido várias vezes para calcular o intervalo de cada modelo de desempenho e de confiança.

Definição de termos:

[0156] (1) Sobreregulação e subregulação: uma sobre-regulação significa um aumento na concentração de um metabolito, por exemplo, um aumento na taxa de, pelo que esta reação bioquímica ocorre devido a, por exemplo, uma alteração na atividade enzimática. Para uma sub-regulação é o contrário.

[0157] (2) Teste t: o teste-t é um teste de hipótese estatística e o um utilizado é a integrada no software MarkerView e é aplicada a cada variável na tabela e determina se a média para cada grupo é significativamente diferente dado o desvio padrão e o número de amostras, por exemplo, para descobrir se há uma diferença real entre o meio (médias) de dois grupos diferentes.

[0158] (3) Valor De P: O Valor De P É A Probabilidade De Obtenção De Um Resultado Pelo Menos Tão Extremo Como O Que Foi Realmente Observado, Assumindo Que A Hipótese Nula (A Hipótese De Nenhuma Mudança Ou Efeito) É Verdadeira. O Valor De P É Sempre Positivo E Quanto Menor For O Valor Menor Será A Probabilidade De Que Ele É Uma Ocorrência De Mudança. Um Valor De P De 0,05 Ou Menos Rejeita A Hipótese Nula Ao Nível De 5%, O Que Significa Que Apenas 5% Do Tempo, A Mudança É Uma Ocorrência Casual. Este É O Nível Definido Em Nossas Mesas.

[0159] (4) Log- dobrar mudança: mudança de dobragem Log- é definida como a diferença entre as concentrações de log média transformadas em cada condição. Esta é uma maneira de descrever o quanto maior ou menor o valor está em um grupo em relação ao outro. Por exemplo, uma mudança de registo de 0,3 vezes é "equivalente" a um exp(0,3) = 1,34 aumento mudança vezes em comparação com o controle (grupo saudável). Além disso, uma alteração de registo de vezes de -0,3 é "equivalente" a um exp(-.3) = 0,74 = (1/1,34) vezes aumenta em comparação com o controle ou diminui mudança de vezes de 1,34 para a doença.

Resultados: A diferenciação entre indivíduos infectados pelo HIV, câncer da mama e controles saudáveis

[0160] Em primeiro lugar, uma análise PLS-DA foi realizada mostrando a discriminação clara entre os pacientes de HIV (n = 37) nas fases aguda e crônicas, com e sem carga viral detectável em comparação com 75 controles depois rodadas 100 permutação. É importante ressaltar que o perfil discriminativo identificado foi suficientemente robusto para identificar pacientes com HIV, mesmo na presença de fatores de confusão metabolômica representados por 64 pacientes com câncer de mama em estágio avançado (Figura 1). Uma análise de mapa de calor gerado a partir desta análise também demonstra uma perfeita discriminação entre estes três subgrupos descrito acima.

[0161] Além disso, uma análise da curva ROC (Figura 3) foi realizada para demonstrar mais uma vez para as enormes capacidades discriminativo do teste aplicada, mesmo depois de 1000 permutações (p-valor empírico: p <0,001). Outras análises estatísticas apresentado na figura 4 demonstram que, após 2000 permutação arredonda a precisão de previsão do nosso teste manteve-se altamente significativa (p <5e-04).

A análise descritiva dos metabólitos no sangue

[0162] Em terceiro lugar, uma análise descritiva dos 25 principais metabólitos sanguíneos mais correlacionadas com a doença de HIV foi realizado por meio de análise de Pearson r (Tabela 6 e Figura 2). Como mostrado, foram observados níveis muito baixos de esfignomielinas e dopamina. Este achado também pode ser observado na Figura 4, onde foi realizada uma análise de Teste-t com base em concentrações de metabólitos de sangue de HIV e controles. Esfingomielina C24: 1 é quase 100 vezes menos concentrada em pacientes com HIV quando comparados aos controles; como expresso no gráfico box plot na Figura 4A.

[0163] Por outro lado, os níveis elevados de acylcanitines C5-M-DC e C5: 1 foram observadas-DC, ao mesmo tempo que C12 e C8: l foram reguladas para baixo (Fig 4B). Pode ser concluído a partir da desregulamentação grave em acilcarnitinas e esfingomielinas metabolismo que a infecção pelo HIV é seguida por deficiências funcionais na beta- oxidação mitocondrial, bem como biossíntese de esfingolipídeos.

[0164] Para confirmar esta conclusão, as proporções de determinadas de concentrações do metabolito foram montadas como um proxy para a atividade enzimática relacionada primeiro, o passo inicial e comprometendo de beta-oxidação catalisada pela cadeia curta, média e de longa de desidrogenases acil-CoA redutase (ACADS , ACADM e ACADL, respectivamente) e, segundo, para o locus SYNE2 devido à sua relação com atividade SGPP1 (esfingosina-1-fosfato fosfatase 1).

[0165] Certamente, as experiências no show levedura que esfingosina-1-fosfato estimula a incorporação de palmitato, um substrato para ambos palmitoiltransferase serina e sintase ceramida, em C16-ceramida, e que SPP-1 (SGPP1 em levedura) expressão aumentada a incorporação de esfingosina em toda a ceramida espécies de cadeia de acila, em particular reforcem C16: 0, C18: 0, C20: 0 e ceramidas de cadeia longa. Além disso, um polimorfismo no SGPP1 foi mostrado para associar com diferentes espécies de esfingomielina.

[0166] Resultados estatísticos ANOVA confirmaram que a infecção por HIV em comparação com controles saudáveis, é seguido em primeiro lugar, por uma descida significativa na função mitocondrial, conforme revelado pela queda importante na de cadeia média de acil- CoA desidrogenase de função (ACADM) em todos os 4 grupos de pacientes no início do estudo e depois de 1 ano de acompanhamento (Rácio C12/C10, p = 1.3892E-9, -logl0 (p) = 8,8572, FDR = 1.9757E-8) (Fig 5A).

[0167] Nomeadamente, quando a análise de correlação com a relação de C12/C10 é realizada entre o HIV e os controles, quase todos os metabolitos desregulados induzidos pela infecção por HIV (Fig 4A e B) são adequadamente re-orientaddos para normalidade (Fig 5B). E em segundo lugar, por um decréscimo significativo na síntese de novo de esfingomielinas devido à diminuição lócus SYNE2, particularmente no grupo de resposta não-imune após 1 ano de acompanhamento, avaliada pela razão PC AA C28: 1/PC C40 AE: 2 (p = 8.4667E-7, -logl0 (p) = 6,0723, FDR 1.2712E- = 5) (Fig 6A e B).

[0168] Ao comparar o grupo de resposta não- imunológica com o seu homólogo, um aumento significativo na síntese de éter lipídico pode ser mostrado no primeiro grupo. Concluiu-se que a enzima metabólica Alquilgliceronefosfato sintase (AGPs), um passo fundamental na síntese de éteres lipídicos, pode ser ativado no grupo não-resposta imune. Para testar esta conclusão, a proporção de PC ae Total a PC total foi montada como um proxy para avaliar a atividade AGPS. Os resultados confirmaram claramente a conclusão (Figura 7) e, mais importante, revelou que nos respondedores imunes da atividade da enzima AGPS voltaram aos níveis normais depois de 1 ano de acompanhamento. Por outro lado, no grupo de não-respondedores imunes da atividade da enzima não retornou aos níveis normais (Fig 7).

[0169] Além disso, pode ser surpreendentemente mostrado na presente invenção que uma melhoria na precisão da triagem/diagnóstico de doentes pode ser conseguida por detecção simultânea de uma combinação de pelo menos uma acilcarnitina e, pelo menos, uma esfingomielina em comparação com os compostos individuais, ou seja, acilcarnitina sozinho ou esfingomielina sozinho, em uma única corrida analítica, como demonstrado na Tabela 1 1 abaixo.

[0170] Tabela 11: Avaliação do desempenho de diferentes combinações de acilcarnitinas e esfingomielinas em comparação com os compostos individuais por análise ROC.

Bioassinatura de metabólitos de plasma de progressão da doença HIV

[0171] Após uni e multivariada Análise Exploratória de ROC no conjunto de validação (n = 20, dos quais 8 foram classificados como bom prognóstico e 12 foram classificados como pior prognóstico, 100 rodadas de permutação foram realizados), uma assinatura metabólito de sangue entre os não-respondentes imunológicas e/ou entre progressor rápido poderia ser identificada com uma sensibilidade de 88,89%, uma especificidade de 92,31%, um valor preditivo positivo de 88,89% e um valor preditivo negativo de 92,31% [AUC = 0,871 (IC 95%: ,619-1) , p-valor = 0,01 empírica] como mostrado na Figura 8. PLS-dA e de análise de APC representados na Figura 9 também demonstrar as diferenças nas concentrações de metabolitos, entre os controles e bom prognóstico pior prognóstico.

[0172] Cinco metabólitos (Tabela 12) desde que este plasma bioassinatura metabolômica de progressão da doença HIV: total de AC-DC/C3-OH (AUC 0,84706; p-valor de 8.5342E-5), Tyr/Phe/PC ae C38: 4 (AUC 0,83824 ; 4.6799E 4- p-valor), Tyr/Phe/PC AE C40: 6 (AUC 0,83235; p-valor 4.3552E- 4), cicloalquila C3-OH/C14: 2-OH (AUC 0,82059; valor de p de 4,6198 e-4) e Tyr/Phe/Soma Arac PC AE (AUC 0,81765; p-valor 4.558E-4).

[0173] Tabela 12: Os metabólitos utilizados na análise multivariada para predizer pior prognóstico para pacientes com HIV

[0174] Além disso, o desempenho de diferentes combinações de pelo menos um PC ae com pelo menos dois aminoácidos foi avaliado comparando os não-respondedores contra os outros e em comparação com o desempenho dos únicos metabolitos, isto é, apenas a PC ae ou apenas os dois aminoácidos. Os resultados são apresentados na Tabela 13 abaixo.

[0175] Tabela 13: Avaliação do desempenho de diferentes combinações de PC AE e dois aminoácidos em comparação com os compostos individuais por análise ROC.

[0176] Pode ser mostrado surpreendentemente que a combinação de todos os três metabolitos desempenho significativamente melhor do que a proporção de aminoácidos de dois aminoácidos por si só ou o PC AE sozinho. Metabólitos de plasma para o monitoramento da atividade da doença HIV

[0177] Como mostrado na Figura 10A a combinação de PUFA PC AE/AE MUFA PC mostra uma clara correlação com células CD4/CD8 contar como marcador de diagnóstico para a monitorização da atividade de HIV. A seleção de um subgrupo de lipídeos PC (AE), portanto, aumenta claramente esta correlação em relação a uma combinação de todos os lipídeos utilizando como mostrado na Figura 10B (AGPI/MUFA). Além disso, a combinação de AGPI/AGS (Figura 1 1B) não mostra correlação com CD4/CD8, enquanto que a seleção de PC AE também melhora a correlação (Figura 1 1A).

[0178] Por isso, poderiam surpreendentemente ser mostrado na presente invenção que uma combinação de metabolitos que compreendem a relação de quantidade total de eterlipídeos poliinsaturados araquidônicos (PUFA AE) a quantidade total de lipídeos de éter de ácidos graxos mono- insaturados (MUFA AE) e a razão da quantidade total de monoinsaturados lipídeos de éter de ácido graxo (MUFA AE) a quantidade total de ácidos graxos saturados (AGS) correlaciona-se com a contagem de células CD4/CD8, e, assim, esta combinação de metabolitos pode ser usada como um conjunto de biomarcadores para a monitorização da atividade da doença HIV em um sujeito mamífero .

[0179] Os resultados da presente invenção levaram à conclusão de que, além de previsão de desfecho HIV, o perfil metabólito desses pacientes é tão peculiar e específico que permita a identificação de um novo método de diagnóstico baseado em metabolômica sangue.

[0180] Portanto, é possível com os biomarcadores identificados na presente invenção em apenas uma amostra de sangue, para ter AVALIAÇÃO para o diagnóstico, bem como a previsão do prognóstico da doença por HIV. A assinatura foi validada em amostras com ou sem cargas virais detectáveis, bem como durante as fases agudas e crônicas da doença.

Aplicabilidade industrial

[0181] A presente invenção torna possível para rastrear de forma mais precisa e para diagnosticar o HIV de uma forma melhorada e em uma fase precoce da doença. Além disso, a presente invenção permite uma previsão mais confiável da progressão da doença, bem como a previsão da resposta terapêutica do paciente à terapia antirretroviral. Mais particularmente, os métodos do invento proporcionam novos biomarcadores preditivos e de diagnóstico capazes de identificar pacientes em maior risco de desenvolver restauração incompleta do sistema imune após o tratamento antirretroviral, bem como pacientes progressores rápidos. Na verdade, os biomarcadores de acordo com a invenção são facilmente detectáveis em amostras biológicas, em particular no sangue.

[0182] Com base nela, é possível preparar um kit sendo adequado para ser de assistência de forma mais confiável de procurar e diagnosticar HIV em um paciente, monitorar a progressão da doença e prever a resposta terapêutica do paciente à terapia antirretroviral.

Claims (7)

1. Uso de uma combinação de metabólitos contidos em uma amostra de sangue, caracterizado pelos metabólitos compreenderem pelo menos a razão da quantidade total de eterlipídeos poli-insaturados araquidônicos (PUFA ae) para a quantidade total de lipídeos de éter de ácido graxo monoinsaturado (MUFA ae) e a razão da quantidade total de lipídeos de éter de ácido graxo monoinsaturado (MUFA ae) para a quantidade total de ácidos graxos saturados (SFA), como um conjunto de biomarcador para monitorar a atividade da doença HIV em um sujeito mamífero.

2. Método para monitorar atividade de doença HIV em um sujeito mamífero, caracterizado por compreender medir em uma amostra de sangue obtida do sujeito pelo menos a razão da quantidade total de eterlipídeos poli-insaturados araquidônicos (PUFA ae) para a quantidade total de lipídeos de éter de ácido graxo monoinsaturado (MUFA ae) e a razão da quantidade total de lipídeos de éter de ácido graxo monoinsaturado (MUFA ae) para a quantidade total de ácidos graxos saturados (SFA).

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender adicionalmente medir a quantidade de pelo menos uma acilcarnitina e/ou medir a quantidade de pelo menos uma esfingomielina.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a pelo menos uma acilcarnitina ser selecionada a partir de uma acilcarnitina representada pelos códigos BC C0, C2, C3, C3:1, C3-OH, C4, C4:1, C4-OH (C3-DC), C5, C5:1, C5:1-DC, C5-DC (C6-OH), C5-M-DC, C5-OH (C3-DC-M), C6 (C4:1-DC), C6:1, C7-DC, C8, C9, C10, C10:1, C10:2, C12, C12-DC, C14, C14:1, C14:1-OH, C14:2, C14:2-OH, C16, C16:1, C16:1-OH, C16:2, C16:2-OH, C16-OH, C18, C18:1, C18:1-OH, C18:2, C10:1, C10:2, C12, C12:1, C12-DC, C14, C14:1, C14:1- DC, C14:2, C14:2-OH ou C16 e/ou a pelo menos uma esfingomielina ser selecionada a partir de esfingolipídeos representados pelo código BC SM(OH)C14:1, SM(OH)C16:1, SM(OH)C22:1, SM(OH)C22:2, SM(OH)C24:1, SM C16:0, SM C16:1, SM C18:0, SM C18:1, SM C20:2, SM C22:3, SM C24:0, SM C24:1, SM C26:0 ou SM C26:1.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pela medição ser baseada em um método analítico quantitativo, preferencialmente cromatografia, espectroscopia e espectrometria de massa.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela cromatografia compreender GC, CE, LC, HPLC e UHPLC; pela espectroscopia compreender UV/Vis, IR e NMR; e pelos analisadores/espectroscopia de massa compreender ESI ou APCI-QqQ, ESI ou APCI-QqTOF, MALDI-QqQ, MALDI-QqTOF e MALDI-TOF-TOF.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelos analisadores/espectroscopia de massa compreender Analisador de massa de Quadrupolo, Analisador de massa de armadilha de íon, Analisador de Massa TOF (Tempo de Vôo), Analisador de massa Orbitrap, Analisador de massa de setor magnético, Analisador de massa de setor eletrostático, ressonância de cíclotron de íon (ICR) e combinações de analisadores de massa, incluindo quadrupolo único (Q) e quadrupolo triplo (QqQ), QqTOF, TOF-TOF, Q-Orbitrap.