BR112022013285B1

BR112022013285B1 - METHOD FOR PRODUCING ERGOTHIONEIN

Info

Publication number: BR112022013285B1
Application number: BR112022013285-9A
Authority: BR
Inventors: Tatsuyuki KOSHIYAMA; Mutsumi KANEKO; Yukihiro Higashiyama; Shun SATO; Tomotake Morita; Azusa SAIKA
Original assignee: National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology; Kureha Corporation
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2023-09-19

Abstract

MICRO-ORGANISMO E MÉTODO PARA PRODUZIR ERGOTIONEÍNA. Um microorganismo da presente invenção é Dirkmeia churashimaensis (NITE BP-03054), Papiliotrema flavescens (NITE BP-03051), Papiliotrema flavescens (NITE BP-03052), ou Apiotrichum porosum (NITE BP-03053).MICRO-ORGANISM AND METHOD FOR PRODUCING ERGOTHIONEIN. A microorganism of the present invention is Dirkmeia churashimaensis (NITE BP-03054), Papiliotrema flavescens (NITE BP-03051), Papiliotrema flavescens (NITE BP-03052), or Apiotrichum porosum (NITE BP-03053).

Description

[TECHNICAL FIELD]

[0001] A presente invenção se refere a um micro-organismo inovador e a um método para produzir ergotioneína pela cultura do micro-organismo inovador para obter ergotioneína.[0001] The present invention relates to an innovative microorganism and a method for producing ergothioneine by culturing the innovative microorganism to obtain ergothioneine.

[BACKGROUND OF THE INVENTION]

[0002] Ergotioneína é um dos aminoácidos contendo enxofre. Ergotioneína tem um efeito antioxidante mais alto do que aquele da vitamina E, e tem atraído atenção como um composto elevadamente útil nos campos de saúde, beleza e similares.[0002] Ergothioneine is one of the sulfur-containing amino acids. Ergothioneine has a higher antioxidant effect than that of vitamin E, and has attracted attention as a highly useful compound in the fields of health, beauty and the like.

[0003] Por exemplo, o Documento de Patente 1 e o Documento de Não Patente 1 descrevem fungos filamentosos transformados com intensificada capacidade de produção de ergotioneína.[0003] For example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 describe transformed filamentous fungi with enhanced ergothioneine production capacity.

[0004] O Documento de Não Patente 2 descreve um micro-organismo transformado do gênero Methylobacrium com intensificada capacidade de produção de ergotioneína. O Documento de Não Patente 2 descreve que os microorganismos dos gêneros Aureobasidium e Rhodotorula têm capacidade de produção de ergotioneína.[0004] Non-Patent Document 2 describes a transformed microorganism of the genus Methylobacrium with enhanced ergothioneine production capacity. Non-Patent Document 2 describes that microorganisms of the genera Aureobasidium and Rhodotorula have the capacity to produce ergothioneine.

[0005] O Documento de Não Patente 3 descreve que um micro organismo do gênero Pleurotus tem capacidade de produção de ergotioneína. [LISTA DE REFERÊNCIAS] [Documento de patente] Documento de Patente 1: WO 2016/121285 Literatura de não patente Documento de Não Patente 1: S. Takusagawa, Biosci. Biotechnol. Biochem., 83, 181-184 (2019) Documento de Não Patente 2: Y. Fujitani et al., J. Biosci. Bioeng., 126, 715-722 (2018) Documento de Não Patente 3: SY. Lin, Int. J. Med. Mushrooms, 17, 749-761 (2015)[0005] Non-Patent Document 3 describes that a microorganism of the genus Pleurotus has the capacity to produce ergothioneine. [LIST OF REFERENCES] [Patent Document] Patent Document 1: WO 2016/121285 Non-Patent Literature Non-Patent Document 1: S. Takusagawa, Biosci. Biotechnol. Biochem., 83, 181-184 (2019) Non-Patent Document 2: Y. Fujitani et al., J. Biosci. Bioeng., 126, 715-722 (2018) Non-Patent Document 3: SY. Lin, Int. J. Med. Mushrooms, 17, 749-761 (2015)

[SUMMARY OF THE INVENTION] [Technical problem]

[0006] Sabe-se que a ergotioneína não é biossintetizada no corpo humano, mas biossintetizada em alguns micro-organismos. Dessa forma, a pesquisa e o desenvolvimento de micro-organismos que produzem ergotioneína e modificação de micro-organismos para intensificar a produção de ergotioneína estão em progresso, conforme descrito nos documentos da técnica anterior. Entretanto, os microorganismos descritos nos documentos da técnica anterior têm uma baixa produção de ergotioneína, e pesquisa e desenvolvimento de micro-organismos que têm uma alta produção de ergotioneína são desejados.[0006] It is known that ergothioneine is not biosynthesized in the human body, but biosynthesized in some microorganisms. Thus, research and development of microorganisms that produce ergothioneine and modification of microorganisms to enhance ergothioneine production are in progress, as described in prior art documents. However, the microorganisms described in the prior art documents have a low production of ergothioneine, and research and development of microorganisms that have a high production of ergothioneine are desired.

[0007] Técnicas de recombinação gênica podem ser usadas para modificar micro-organismos para intensificar a produção de ergotioneína. No entanto, a ergotioneína produzida pelos microorganismos não pode ser usada na indústria de alimentos ou semelhantes. Consequentemente, há um forte desejo de pesquisar micro-organismos com alta produção de ergotioneína, que não foram submetidos à recombinação gênica e não estão modificados.[0007] Gene recombination techniques can be used to modify microorganisms to enhance the production of ergothioneine. However, ergothioneine produced by microorganisms cannot be used in the food industry or the like. Consequently, there is a strong desire to research microorganisms with high ergothioneine production, which have not undergone gene recombination and are not modified.

[0008] A presente invenção foi realizada considerando o problema acima, e um objetivo da mesma é fornecer um novo micro-organismo com alta produção de ergotioneína.[0008] The present invention was carried out considering the above problem, and an objective of it is to provide a new microorganism with high production of ergothioneine.

[Solution to the problem]

[0009] Como um resultado de triagem, os presentes inventores descobriram um novo micro-organismo que tem produção de ergotioneína mais alta do que aquela de micro-organismos conhecidos, e completaram a presente invenção.[0009] As a result of screening, the present inventors discovered a new microorganism that has higher ergothioneine production than that of known microorganisms, and completed the present invention.

[0010] O micro-organismo de acordo com a presente invenção é um micro-organismo pertencente a Dirkmeia churashimaensis (NITE BP- 03054), um micro-organismo pertencente a Papiliotrema flavescens (NITE BP-03051), um micro-organismo pertencente a Papiliotrema flavescens (NITE BP-03052), ou um micro-organismo pertencente a Apiotrichum porosum (NITE BP-03053).[0010] The microorganism according to the present invention is a microorganism belonging to Dirkmeia churashimaensis (NITE BP-03054), a microorganism belonging to Papiliotrema flavescens (NITE BP-03051), a microorganism belonging to Papiliotrema flavescens (NITE BP-03052), or a microorganism belonging to Apiotrichum porosum (NITE BP-03053).

[Advantageous effects of the invention]

[0011] De acordo com um aspecto da presente invenção, pode ser fornecido um micro-organismo que tem alta produção de ergotioneína.[0011] According to one aspect of the present invention, a microorganism can be provided that has high production of ergothioneine.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0012] A Figura 1 é um gráfico que mostra os resultados da primeira triagem.[0012] Figure 1 is a graph showing the results of the first screening.

[0013] A Figura 2 é um gráfico que mostra os resultados da segunda triagem.[0013] Figure 2 is a graph showing the results of the second screening.

[0014] A Figura 3 é um gráfico que mostra os resultados de avaliação da produção de ergotioneína de cinco novas cepas de micro-organismos.[0014] Figure 3 is a graph showing the results of evaluating the production of ergothioneine from five new strains of microorganisms.

[DESCRIPTION OF MODALITIES]

[0015] O micro-organismo da presente modalidade é um micro organismo pertencente ao gênero Dirkmeia capaz de produzir ergotioneína, um micro-organismo pertencente ao gênero Papiliotrema capaz de produzir ergotioneína, ou um micro-organismo pertencente ao gênero Apiotrichum capaz de produzir ergotioneína.[0015] The microorganism of the present modality is a microorganism belonging to the genus Dirkmeia capable of producing ergothioneine, a microorganism belonging to the genus Papiliotrema capable of producing ergothioneine, or a microorganism belonging to the genus Apiotrichum capable of producing ergothioneine.

[0016] O micro-organismo da presente modalidade tem alta produção de ergotioneína. Ergotioneína é um dos aminoácidos contendo enxofre e tem excelente efeito antioxidante. Além disso, o micro-organismo da presente modalidade não foi modificado pela técnica de recombinação gênica ou semelhantes, e, dessa forma, também pode ser usado na indústria de alimentos.[0016] The microorganism of the present modality has high production of ergothioneine. Ergothioneine is one of the sulfur-containing amino acids and has excellent antioxidant effects. Furthermore, the microorganism of the present modality has not been modified by gene recombination or similar techniques, and, therefore, can also be used in the food industry.

[0017] Doravante, o micro-organismo da presente modalidade será descrito em detalhes.[0017] From now on, the microorganism of the present embodiment will be described in detail.

[1. Dirkmeia churashimaensis S111]

[0018] Dirkmeia churashimaensis S111 (doravante abreviado como "levedura S111" em alguns casos) é um micro-organismo que é primeiro isolado usando, como uma fonte de isolamento, folhas (folhas jovens) coletadas em Tsukuba-shi, Ibaraki.[0018] Dirkmeia churashimaensis S111 (hereinafter abbreviated as "yeast S111" in some cases) is a microorganism that is first isolated using, as an isolation source, leaves (young leaves) collected in Tsukuba-shi, Ibaraki.

[0019] Foram determinadas as sequências de bases das regiões gênicas 26S rDNA-D1/D2 e ITS de RNA ribossômico. A pesquisa de homologia por BLAST foi realizada através da base de dados DB- FU10.0 do sistema de identificação de micro-organismos do TechnoSuruga Laboratory (TechostSuruga Laboratory, Japão) e das Bases de Dados de Sequências de Nucleotídeos Internacionais (DDBJ/ENA (EMBL)/GenBank). Como um resultado, a levedura S111 foi atribuída a Dirkmeia churashimaensis. Também, como ilustrado nos Exemplos, a levedura S111 apresenta propriedades fisiológicas/bioquímicas quase semelhantes àquelas de Dirkmeia churashimaensis, exceto que diferenças foram observadas em termos da assimilação de eritritol e succinatos como fontes de carbono e de nitratos como fontes de nitrogênio e a viabilidade a 37 °C.[0019] The base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS ribosomal RNA gene regions were determined. The homology search by BLAST was carried out using the DB-FU10.0 database of the microorganism identification system of the TechnoSuruga Laboratory (TechostSuruga Laboratory, Japan) and the International Nucleotide Sequence Databases (DDBJ/ENA (DDBJ/ENA (DDBJ/ENA) EMBL)/GenBank). As a result, yeast S111 was assigned to Dirkmeia churashimaensis. Also, as illustrated in the Examples, yeast S111 displays physiological/biochemical properties almost similar to those of Dirkmeia churashimaensis, except that differences were observed in terms of the assimilation of erythritol and succinates as carbon sources and nitrates as nitrogen sources and the viability to 37°C.

[0020] A levedura S111 foi depositada no NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (doravante abreviado como "NITE") (n°122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japão) (data de depósito original: 25 de outubro de 2019, N° de Acesso: NITE BP-03054).[0020] Yeast S111 has been deposited at the NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (hereinafter abbreviated as "NITE") (no. 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japan ) (original filing date: October 25, 2019, Accession No.: NITE BP-03054).

[0021] O método para cultivar a levedura S111 pode ser realizado de acordo com métodos de cultura comuns para micro-organismos do gênero Dirkmeia. A forma de cultura é cultura em batelada com o uso de um meio líquido ou uma cultura em batelada alimentada na qual uma fonte de carbono e/ou uma fonte de nitrogênio é continuamente adicionada ao sistema de cultura, e agitação por aeração é desejavelmente realizada. Como o meio, pode ser usado um meio contendo fontes de carbono e nitrogênio que são assimiláveis pelos micro-organismos pertencentes ao gênero Dirkmeia ou uma fonte de nutriente necessária como um sal inorgânico. O pH para cultura é, de preferência, de 3 a 8, a temperatura de cultura é, de preferência, de 20 °C a 37 °C, e o tempo de incubação é, de preferência, de 2 a 14 dias.[0021] The method for cultivating yeast S111 can be carried out according to common culture methods for microorganisms of the genus Dirkmeia. The form of culture is batch culture using a liquid medium or a fed-batch culture in which a carbon source and/or a nitrogen source is continuously added to the culture system, and aeration agitation is desirably carried out. As the medium, a medium containing carbon and nitrogen sources that are assimilable by microorganisms belonging to the genus Dirkmeia or a necessary nutrient source such as an inorganic salt can be used. The pH for culture is preferably 3 to 8, the culture temperature is preferably 20°C to 37°C, and the incubation time is preferably 2 to 14 days.

[two. Papiliotrema flavescens EA071]

[0022] Papiliotrema flavescens EA071 (doravante abreviado como "levedura EA071", em alguns casos) é um micro-organismo que é primeiro isolado usando, como uma fonte de isolamento, folhas de capim dos pampas japonês coletado em torno do Lago Motosu.[0022] Papiliotrema flavescens EA071 (hereinafter abbreviated as "EA071 yeast" in some cases) is a microorganism that is first isolated using, as a source of isolation, leaves of Japanese pampas grass collected around Lake Motosu.

[0023] Foram determinadas as sequências de bases das regiões gênicas 26S rDNA-D1/D2 e ITS de RNA ribossômico. A pesquisa de homologia por BLAST foi realizada através da base de dados DB- FU10.0 do sistema de identificação de micro-organismos do TechnoSuruga Laboratory (TechostSuruga Laboratory, Japão) e das Bases de Dados de Sequências de Nucleotídeos Internacionais (DDBJ/ENA (EMBL)/GenBank). Como um resultado, a levedura EA071 foi atribuída a Papiliotrema flavescens. Também, como ilustrado nos Exemplos, a levedura EA071 apresenta propriedades fisiológicas/bioquímicas quase semelhantes àquelas de Papiliotrema flavescens, exceto que foram observadas diferenças em termos de inulina e amido solúvel em água como fontes de carbono.[0023] The base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS ribosomal RNA gene regions were determined. The homology search by BLAST was carried out using the DB-FU10.0 database of the microorganism identification system of the TechnoSuruga Laboratory (TechostSuruga Laboratory, Japan) and the International Nucleotide Sequence Databases (DDBJ/ENA (DDBJ/ENA (DDBJ/ENA) EMBL)/GenBank). As a result, yeast EA071 was assigned to Papiliotrema flavescens. Also, as illustrated in the Examples, EA071 yeast presents physiological/biochemical properties almost similar to those of Papiliotrema flavescens, except that differences were observed in terms of inulin and water-soluble starch as carbon sources.

[0024] A levedura EA071 foi depositada no NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (NITE) (n°122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japão) (data de depósito original: 25 de outubro de 2019, N° de Acesso: NITE BP-03051).[0024] EA071 yeast was deposited at the NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (NITE) (no. 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japan) (deposit date original: October 25, 2019, Accession No.: NITE BP-03051).

[0025] O método para cultivar a levedura EA071 pode ser realizado de acordo com métodos de cultura comuns para micro-organismos do gênero Papiliotrema. A forma de cultura é cultura em batelada com o uso de um meio líquido ou uma cultura em batelada alimentada na qual uma fonte de carbono e/ou uma fonte de nitrogênio é continuamente adicionada ao sistema de cultura, e agitação por aeração é desejavelmente realizada. Como o meio, pode ser usado um meio contendo fontes de carbono e nitrogênio que são assimiláveis pelos micro-organismos pertencentes ao gênero Papiliotrema ou uma fonte de nutriente necessária como um sal inorgânico. O pH para cultura é, de preferência, de 3 a 8, a temperatura de cultura é, de preferência, de 20 °C a 30 °C, e o tempo de incubação é, de preferência, de 2 a 14 dias.[0025] The method for cultivating yeast EA071 can be carried out according to common culture methods for microorganisms of the Papiliotrema genus. The form of culture is batch culture using a liquid medium or a fed-batch culture in which a carbon source and/or a nitrogen source is continuously added to the culture system, and aeration agitation is desirably carried out. As the medium, a medium containing carbon and nitrogen sources that are assimilable by microorganisms belonging to the genus Papiliotrema or a necessary nutrient source such as an inorganic salt can be used. The pH for culture is preferably 3 to 8, the culture temperature is preferably 20°C to 30°C, and the incubation time is preferably 2 to 14 days.

[3. Papiliotrema flavescens EA361]

[0026] O Papiliotrema flavescens EA361 (doravante abreviado como "levedura EAE361", em alguns casos) é um micro-organismo que é primeiro isolado usando, como uma fonte de isolamento, a casca coletada em torno do Lago Suwa.[0026] Papiliotrema flavescens EA361 (hereinafter abbreviated as "EAE361 yeast" in some cases) is a microorganism that is first isolated using, as a source of isolation, the bark collected around Lake Suwa.

[0027] Foram determinadas as sequências de bases das regiões gênicas 26S rDNA-D1/D2 e ITS de RNA ribossômico. A pesquisa de homologia por BLAST foi realizada através da base de dados DB- FU10.0 do sistema de identificação de micro-organismos do TechnoSuruga Laboratory (TechostSuruga Laboratory, Japão) e das Bases de Dados de Sequências de Nucleotídeos Internacionais (DDBJ/ENA (EMBL)/GenBank). Como um resultado, a levedura EA361 foi atribuída a Papiliotrema flavescens. Também, como ilustrado nos Exemplos, a levedura EA071 apresenta propriedades fisiológicas/bioquímicas quase semelhantes àquelas de Papiliotrema flavescens, exceto que foram observadas diferenças em termos de inulina e amido solúvel em água como fontes de carbono.[0027] The base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS ribosomal RNA gene regions were determined. The homology search by BLAST was carried out using the DB-FU10.0 database of the microorganism identification system of the TechnoSuruga Laboratory (TechostSuruga Laboratory, Japan) and the International Nucleotide Sequence Databases (DDBJ/ENA (DDBJ/ENA (DDBJ/ENA) EMBL)/GenBank). As a result, yeast EA361 was assigned to Papiliotrema flavescens. Also, as illustrated in the Examples, EA071 yeast presents physiological/biochemical properties almost similar to those of Papiliotrema flavescens, except that differences were observed in terms of inulin and water-soluble starch as carbon sources.

[0028] A levedura EA361 foi depositada no NITEA levedura EA361 foi depositada no NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (NITE) (n°122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japão) (data de depósito original: 25 de outubro de 2019, N° de Acesso: NITE BP-03052).[0028] Yeast EA361 was deposited at NITE Yeast EA361 was deposited at NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (NITE) (no. 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japan) (original filing date: October 25, 2019, Accession No.: NITE BP-03052).

[0029] O método para cultivar a levedura EA361 pode ser realizado de acordo com métodos de cultura comuns para micro-organismos do gênero Papiliotrema. A forma de cultura é cultura em batelada com o uso de um meio líquido ou uma cultura em batelada alimentada na qual uma fonte de carbono e/ou uma fonte de nitrogênio é continuamente adicionada ao sistema de cultura, e agitação por aeração é desejavelmente realizada. Como o meio, pode ser usado um meio contendo fontes de carbono e nitrogênio que são assimiláveis pelos micro-organismos pertencentes ao gênero Papiliotrema ou uma fonte de nutriente necessária como um sal inorgânico. O pH para cultura é, de preferência, de 3 a 8, a temperatura de cultura é, de preferência, de 20 °C a 30 °C, e o tempo de incubação é, de preferência, de 2 a 14 dias.[0029] The method for cultivating yeast EA361 can be carried out according to common culture methods for microorganisms of the genus Papiliotrema. The form of culture is batch culture using a liquid medium or a fed-batch culture in which a carbon source and/or a nitrogen source is continuously added to the culture system, and aeration agitation is desirably carried out. As the medium, a medium containing carbon and nitrogen sources that are assimilable by microorganisms belonging to the genus Papiliotrema or a necessary nutrient source such as an inorganic salt can be used. The pH for culture is preferably 3 to 8, the culture temperature is preferably 20°C to 30°C, and the incubation time is preferably 2 to 14 days.

[4. Apiotrichum porosum EA702]

[0030] Apiotrichum porosum EA702 (doravante abreviado como "levedura EA702" em alguns casos) é um micro-organismo que é primeiro isolado usando, como uma fonte de isolamento, do solo coletado em Iwaki-shi.[0030] Apiotrichum porosum EA702 (hereinafter abbreviated as "EA702 yeast" in some cases) is a microorganism that is first isolated using, as an isolation source, soil collected in Iwaki-shi.

[0031] Foram determinadas as sequências de bases das regiões gênicas 26S rDNA-D1/D2 e ITS de RNA ribossômico. A pesquisa de homologia por BLAST foi realizada através da base de dados DB-FU10.0 do sistema de identificação de micro-organismos do TechnoSuruga Laboratory (TechostSuruga Laboratory, Japão) e das Bases de Dados de Sequências de Nucleotídeos Internacionais (DDBJ/ENA (EMBL)/GenBank). Como um resultado, a levedura EA702 foi atribuída a Apiotrichum porosum. Também, como ilustrado nos Exemplos, a levedura EA702 apresenta propriedades fisiológicas/bioquímicas quase semelhantes àquelas de Papiliotrema flavescens, exceto que foram observadas diferenças em termos de inulina como uma fonte de carbono e 50% de D-glicose no teste de resistência.[0031] The base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS ribosomal RNA gene regions were determined. Homology search by BLAST was carried out using the DB-FU10.0 database of the microorganism identification system of the TechnoSuruga Laboratory (TechostSuruga Laboratory, Japan) and the International Nucleotide Sequence Databases (DDBJ/ENA (DDBJ/ENA ( EMBL)/GenBank). As a result, the yeast EA702 was assigned to Apiotrichum porosum. Also, as illustrated in the Examples, EA702 yeast shows physiological/biochemical properties almost similar to those of Papiliotrema flavescens, except that differences were observed in terms of inulin as a carbon source and 50% D-glucose in the resistance test.

[0032] A levedura EA702 foi depositada no NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (NITE) (n°122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japão) (data original de depósito: 25 de outubro de 2019, N° de Acesso: NITE BP-03053).[0032] Yeast EA702 was deposited at the NITE Patent Microorganisms Depositary (NPMD), National Institute of Technology and Evaluation (NITE) (no. 122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japan) (original date of deposit: October 25, 2019, Accession No.: NITE BP-03053).

[0033] O método para cultivar a levedura EA702 pode ser realizado de acordo com métodos de cultura comuns para micro-organismos do gênero Apiotrichum. A forma de cultura é cultura em batelada com o uso de um meio líquido ou uma cultura em batelada alimentada na qual uma fonte de carbono e/ou uma fonte de nitrogênio é continuamente adicionada ao sistema de cultura, e agitação por aeração é desejavelmente realizada. Como o meio, pode ser usado um meio contendo fontes de carbono e nitrogênio que são assimiláveis pelos micro-organismos pertencentes ao gênero Apiotrichum ou uma fonte de nutriente necessária como um sal inorgânico. O pH para cultura é, de preferência, de 3 a 8, a temperatura de cultura é, de preferência, de 20 °C a 27 °C, e o tempo de incubação é, de preferência, de 2 a 14 dias.[0033] The method for cultivating yeast EA702 can be carried out according to common culture methods for microorganisms of the genus Apiotrichum. The form of culture is batch culture using a liquid medium or a fed-batch culture in which a carbon source and/or a nitrogen source is continuously added to the culture system, and aeration agitation is desirably carried out. As the medium, a medium containing carbon and nitrogen sources that are assimilable by microorganisms belonging to the genus Apiotrichum or a necessary nutrient source such as an inorganic salt can be used. The pH for culture is preferably 3 to 8, the culture temperature is preferably 20°C to 27°C, and the incubation time is preferably 2 to 14 days.

[Method to produce ergothioneine]

[0034] O método para produzir ergotioneína da presente modalidade inclui cultivar o micro-organismo descrito acima para obter uma cultura contendo ergotioneína.[0034] The method for producing ergothioneine of the present embodiment includes cultivating the microorganism described above to obtain a culture containing ergothioneine.

[0035] A coleta de ergotioneína da cultura contendo ergotioneína pode ser realizada, por exemplo, por um método comum para coletar e purificar ergotioneína de uma cultura de micro-organismos. A cultura inclui, por exemplo, um sobrenadante de cultura, células microbianas cultivadas, e um produto triturado de células microbianas cultivadas. Por exemplo, as células microbianas cultivadas são coletadas por centrifugação ou similares da cultura. As células microbianas coletadas são submetidas a extração em água quente ou semelhantes para obter um líquido de extrato contendo ergotioneína. Ergotioneína pode, então, ser coletada pela purificação do líquido de extrato. A produção de ergotioneína do micro-organismo pode ser quantificada, por exemplo, pela medição do líquido de extrato resultante usando um instrumento de cromatografia líquida de alta eficiência e um espectrômetro de massa como LCMS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometer).[0035] Collection of ergothioneine from the ergothioneine-containing culture can be carried out, for example, by a common method for collecting and purifying ergothioneine from a culture of microorganisms. The culture includes, for example, a culture supernatant, cultured microbial cells, and a minced product of cultured microbial cells. For example, cultured microbial cells are collected by centrifugation or the like from the culture. The collected microbial cells are subjected to hot water extraction or the like to obtain an extract liquid containing ergothioneine. Ergothioneine can then be collected by purifying the extract liquid. The microorganism's ergothioneine production can be quantified, for example, by measuring the resulting extract liquid using a high-performance liquid chromatography instrument and a mass spectrometer such as LCMS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometer).

[Summary]

[0036] O micro-organismo de acordo com a presente modalidade é um micro-organismo pertencente a Dirkmeia churashimaensis (NITE BP- 03054), um micro-organismo pertencente a Papiliotrema flavescens (NITE BP-03051), um micro-organismo pertencente a Papiliotrema flavescens (NITE BP-03052), ou um micro-organismo pertencente à Apiotrichum porosum (NITE BP-03053).[0036] The microorganism according to the present embodiment is a microorganism belonging to Dirkmeia churashimaensis (NITE BP-03054), a microorganism belonging to Papiliotrema flavescens (NITE BP-03051), a microorganism belonging to Papiliotrema flavescens (NITE BP-03052), or a microorganism belonging to Apiotrichum porosum (NITE BP-03053).

[0037] Também, o método para produzir ergotioneína de acordo com a presente modalidade inclui cultivar o micro-organismo descrito acima para obter uma cultura contendo ergotioneína.[0037] Also, the method for producing ergothioneine according to the present embodiment includes cultivating the microorganism described above to obtain a culture containing ergothioneine.

[0038] As modalidades da presente invenção serão descritas doravante com mais detalhes usando os exemplos. A presente invenção não está limitada aos exemplos a seguir, e é evidente que vários aspectos são possíveis no que diz respeito aos pormenores dos mesmos. Adicionalmente, a presente invenção não é limitada às modalidades descritas acima, e várias modificações são possíveis dentro do escopo indicado nas reivindicações. As modalidades obtidas pela combinação, de modo adequado, dos meios técnicos revelados pelas modalidades estão também incluídas no escopo técnico da presente invenção. Além disso, todos os documentos descritos no presente relatório descritivo estão aqui incorporados, por referência.[0038] Embodiments of the present invention will now be described in more detail using examples. The present invention is not limited to the following examples, and it is clear that various aspects are possible with respect to the details thereof. Additionally, the present invention is not limited to the embodiments described above, and various modifications are possible within the scope indicated in the claims. The modalities obtained by appropriately combining the technical means revealed by the modalities are also included in the technical scope of the present invention. Furthermore, all documents described in this specification are incorporated herein by reference.

[Examples]

[0039] Nos seguintes Exemplos, o símbolo"%" representa % em massa, salvo indicação em contrário.[0039] In the following Examples, the symbol "%" represents % by mass, unless otherwise indicated.

(1) Enrichment culture using isolation source collected from the environment

[0040] Primeiro, foi realizada, em dois estágios, a amostragem de micro-organismos de ambientes como plantas e solo. Como um resultado, um total de 113 amostras (30 amostras para o primeiro estágio e 83 amostras para o segundo estágio) foram coletadas.[0040] First, sampling of microorganisms from environments such as plants and soil was carried out in two stages. As a result, a total of 113 samples (30 samples for the first stage and 83 samples for the second stage) were collected.

[0041] Então, as amostras coletadas foram, cada, imersas em um tubo de plástico de 15 mL contendo 2 mL de um meio de triagem, e cultivadas a 200 rpm e 25 °C durante 3 a 5 dias. O meio de triagem usado foi um meio YM contendo um antibiótico. Especificamente, foi usado um meio contendo 1% de glicose, 0,5% de peptona, 0,3% de extrato de levedura, 0,3% de extrato de malte, 0,01% de sulfato de estreptomicina, e 0,005% de cloranfenicol.[0041] Then, the collected samples were each immersed in a 15 mL plastic tube containing 2 mL of a screening medium, and cultured at 200 rpm and 25 °C for 3 to 5 days. The screening medium used was YM medium containing an antibiotic. Specifically, a medium containing 1% glucose, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.01% streptomycin sulfate, and 0.005% chloramphenicol.

[0042] Então, foram selecionadas 111 amostras (30 amostras para o primeiro estágio e 81 amostras para o segundo estágio) em que o meio foi observado visualmente como sendo turvo (micro-organismos proliferados).[0042] Then, 111 samples were selected (30 samples for the first stage and 81 samples for the second stage) in which the medium was visually observed as being cloudy (proliferated microorganisms).

(2) Selection of samples with oxidative stress burden

[0043] Soluções de cultura das 111 amostras selecionadas em (1), acima, foram, cada, diluídas 100 ou 100.000 vezes em um meio YM. A solução de cultura diluída foi aplicada a um meio de ágar YM e um meio de ágar YM adicionado com 3 mM de H2O2 (doravante abreviado como meio de ágar YM contendo H2O2), e cultivada a 25 °C durante 2 a 5 dias.[0043] Culture solutions from the 111 samples selected in (1), above, were each diluted 100 or 100,000 times in a YM medium. The diluted culture solution was applied to YM agar medium and YM agar medium added with 3 mM H2O2 (hereinafter abbreviated as YM agar medium containing H2O2), and cultured at 25 °C for 2 to 5 days.

[0044] Foram contados o número de colônias tendo crescidas no meio de ágar YM e o número de colônias tendo crescidas no meio de ágar YM contendo H2O2. Então, foram selecionadas 83 amostras nas quais as colônias haviam crescido tanto no meio de ágar YM quanto no meio de ágar YM contendo H2O2.[0044] The number of colonies growing on the YM agar medium and the number of colonies growing on the YM agar medium containing H2O2 were counted. Then, 83 samples were selected in which colonies had grown on both YM agar medium and YM agar medium containing H2O2.

[0045] Além disso, para as colônias tendo crescido no meio de ágar nas 83 amostras selecionadas, foram observadas visualmente a morfologia e a cor, e foram selecionadas 164 colônias semelhantes a levedura de diferentes tipos (51 colônias para o primeiro estágio e 113 colônias para o segundo estágio).[0045] Furthermore, for the colonies having grown on the agar medium in the 83 selected samples, the morphology and color were visually observed, and 164 yeast-like colonies of different types were selected (51 colonies for the first stage and 113 colonies for the second stage).

(3) Culture of selected colonies in 96 wells

[0046] As 164 colônias selecionadas em (2), acima, foram inoculadas em placas de 96 poços contendo 1 mL de um meio YM, e cultivadas a 1.600 rpm e 25 °C durante 3 a 4 dias. Após a cultura, as soluções de cultura coletadas foram centrifugadas a 2.000 rpm e 4 °C durante 10 minutos. Os péletes de células obtidos por centrifugação foram lavados com 1 mL puro e centrifugados de novo.[0046] The 164 colonies selected in (2), above, were inoculated into 96-well plates containing 1 mL of YM medium, and cultivated at 1,600 rpm and 25 °C for 3 to 4 days. After culture, the collected culture solutions were centrifuged at 2000 rpm and 4 °C for 10 minutes. Cell pellets obtained by centrifugation were washed with 1 ml neat and centrifuged again.

[0047] Aos péletes de células obtidos por centrifugação, 0,1 mL de água pura foi adicionado para suspender os péletes no mesmo. As suspensões resultantes foram aquecidas a 96 °C durante 10 minutos para extrair os componentes intracelulares. Os componentes intracelulares extraídos foram então centrifugados para remover os resíduos de células microbianas, obtendo assim líquidos de extrato.[0047] To the cell pellets obtained by centrifugation, 0.1 mL of pure water was added to suspend the pellets therein. The resulting suspensions were heated at 96°C for 10 minutes to extract the intracellular components. The extracted intracellular components were then centrifuged to remove microbial cell residues, thus obtaining extract liquids.

(4) Quantitative analysis of ergothioneine in extract liquid by LCMS

[0048] Uma solução misturada de 0,15 mL de cada um dos líquidos de extrato obtidos em (3), acima, e 0,35 mL de acetonitrila foi filtrada através de um filtro de PVDF de 0,45 μm. O filtrado resultante foi usado como uma amostra para medição por LCMS.[0048] A mixed solution of 0.15 mL of each of the extract liquids obtained in (3), above, and 0.35 mL of acetonitrile was filtered through a 0.45 μm PVDF filter. The resulting filtrate was used as a sample for LCMS measurement.

[0049] LCMS-2020, disponível junto à Shimadzu Corporation, foi usado para análise por LCMS. Além disso, uma coluna de guarda Asahipak NH2P-40 2D+, disponível junto à SHODEX, foi usada como a coluna para LC. Uma solução misturada de formiato de amônio 10 mM e acetonitrila (formiato de amônio 10 mM/acetonitrila = 30/70 (v/v)) foi usada como a fase móvel para LC. A taxa de fluxo foi ajustada para 0,1 mL/min, e a análise foi realizada a 25 °C.[0049] LCMS-2020, available from Shimadzu Corporation, was used for LCMS analysis. Additionally, an Asahipak NH2P-40 2D+ guard column, available from SHODEX, was used as the LC column. A mixed solution of 10 mM ammonium formate and acetonitrile (10 mM ammonium formate/acetonitrile = 30/70 (v/v)) was used as the mobile phase for LC. The flow rate was adjusted to 0.1 mL/min, and analysis was performed at 25 °C.

[0050] Em detecção por MS, a ionização foi realizada em modo DUIS para realizar ionização ESI e ionização APCI simultaneamente. A detecção também foi realizada em modo SIM de m/z = 230 (+) em que a ergotioneína poderia ser detectada.[0050] In MS detection, ionization was performed in DUIS mode to perform ESI ionization and APCI ionization simultaneously. Detection was also performed in SIM mode of m/z = 230 (+) in which ergothioneine could be detected.

[0051] Como um resultado da análise dos líquidos de extrato das 164 colônias selecionadas em (2) acima, foram selecionadas 14 colônica com alta produção de ergotioneína (5 colônias para o primeiro estágio e 9 colônias para o segundo estágio).[0051] As a result of analyzing the extract liquids from the 164 colonies selected in (2) above, 14 colonics with high ergothioneine production were selected (5 colonies for the first stage and 9 colonies for the second stage).

[0052] Também, as Figuras 1 e 2 são gráficos que mostram as quantidades de ergotioneína produzida pelas amostras de microorganismos coletadas no primeiro e no segundo estágios de amostragem de micro-organismos, respectivamente. O eixo horizontal nas Figuras 1 e 2 mostra os valores obtidos pela medição das soluções de cultura obtidas após a cultura em (3), acima, a OD600. O eixo vertical mostra as quantidades de ergotioneína (mg/L (solução de cultura)) nas soluções de cultura obtidas após a cultura em (3) acima. A quantidade de ergotioneína é um valor obtido pela análise por LCMS. Nas Figuras 1 e 2, as 14 colônias selecionadas estão encerradas em um círculo.[0052] Also, Figures 1 and 2 are graphs showing the amounts of ergothioneine produced by the microorganism samples collected in the first and second stages of microorganism sampling, respectively. The horizontal axis in Figures 1 and 2 shows the values obtained by measuring the culture solutions obtained after the culture in (3), above, at OD600. The vertical axis shows the amounts of ergothioneine (mg/L (culture solution)) in the culture solutions obtained after the culture in (3) above. The amount of ergothioneine is a value obtained by LCMS analysis. In Figures 1 and 2, the 14 selected colonies are enclosed in a circle.

(5) Scale-up culture of ergothioneine-producing microorganisms in the flask

[0053] As 14 colônias selecionadas em (4), acima, foram inoculadas em um frasco de 300 mL contendo 50 mL de um meio YM e cultivadas a 200 rpm e 25 °C durante 7 dias (n = 1).[0053] The 14 colonies selected in (4), above, were inoculated in a 300 mL flask containing 50 mL of YM medium and cultivated at 200 rpm and 25 °C for 7 days (n = 1).

[0054] As soluções de cultura nos Dias 3 a 7 foram coletadas conforme apropriado. Como em (3) acima, após a centrifugação e a lavagem das células microbianas, os líquidos de extrato foram coletados por extração com água quente.[0054] Culture solutions on Days 3 to 7 were collected as appropriate. As in (3) above, after centrifugation and washing of microbial cells, extract liquids were collected by hot water extraction.

[0055] Os líquidos de extrato resultantes foram analisados por LCMS em uma maneira semelhante a (4), acima, para selecionar cinco cepas (S111, EA071, EA361, EA701, e EA702) com alta produção de ergotioneína.[0055] The resulting extract liquids were analyzed by LCMS in a similar manner to (4), above, to select five strains (S111, EA071, EA361, EA701, and EA702) with high ergothioneine production.

[0056] As colônias das cinco cepas selecionadas foram, cada, inoculadas em um frasco de 300 mL contendo 50 mL de um meio YM e cultivadas a 200 rpm e 25 °C durante 5 dias (n = 3). As produções de ergotioneína nos Dias 3 e 5 de cultura foram, então, medidas por LCMS. As produções ergotioneína das colônias das cinco cepas selecionadas são mostradas na Figura 3.[0056] The colonies of the five selected strains were each inoculated into a 300 mL flask containing 50 mL of YM medium and cultivated at 200 rpm and 25 °C for 5 days (n = 3). Ergothioneine productions on Days 3 and 5 of culture were then measured by LCMS. The ergothioneine productions of the colonies of the five selected strains are shown in Figure 3.

[0057] Na Figura 3, o gráfico de barras à esquerda para cada uma das cepas indica a produção de ergotioneína no Dia 3 de cultura. O gráfico de barras à direita para cada uma das cepas indica a produção de ergotioneína no Dia 5 de cultura.[0057] In Figure 3, the bar graph on the left for each of the strains indicates the production of ergothioneine on Day 3 of culture. The bar graph on the right for each of the strains indicates ergothioneine production on Day 5 of culture.

(7) Identification of five selected strains

[0058] A estimativa dos grupos de classificação aos quais as cinco cepas selecionadas foram atribuídas foi realizada por análise das sequências de bases das regiões gênicas 26S rDNA-D1/D2 e ITS de RNA ribossômico.[0058] The estimation of the classification groups to which the five selected strains were assigned was carried out by analyzing the base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS ribosomal RNA gene regions.

[0059] Como um resultado da análise das sequências de bases, foi estimado que a cepa S111 pertence a Dirkmeia churashimaensis; que as cepas EA071 e EA361 pertencem a Papiliotrema flavescens, e que as cepas EA701 e EA702 pertencem a Apiotrichum porosum.[0059] As a result of base sequence analysis, it was estimated that strain S111 belongs to Dirkmeia churashimaensis; that strains EA071 and EA361 belong to Papiliotrema flavescens, and that strains EA701 and EA702 belong to Apiotrichum porosum.

[0060] A Tabela 1 mostra as produções de ergotioneína (EGT) e as taxas de produção das cinco cepas selecionadas. A Tabela 2 mostra as produções e as taxas de produção de micro-organismos conhecidos. Nas Tabelas 1 e 2, salvo indicação em contrário, a unidade para a produção de ergotioneína (EGT) é mg/L, e a unidade para a taxa de produção de EGT é mg/L/d (produção de ergotioneína por dia). Também, as produções de EGT na Tabela 1 indicam as produções de ergotioneína no Dia 5 de cultura. Tabela 1 [Tabela 2] [0060] Table 1 shows the productions of ergothioneine (EGT) and the production rates of the five selected strains. Table 2 shows the productions and production rates of known microorganisms. In Tables 1 and 2, unless otherwise noted, the unit for ergothioneine (EGT) production is mg/L, and the unit for EGT production rate is mg/L/d (ergothioneine production per day). Also, the EGT productions in Table 1 indicate the ergothioneine productions on Day 5 of culture. Table 1 [Table 2]

[0061] Foi descoberto, das Tabelas 1 e 2, que as produções de ergotioneína das cinco cepas selecionadas foram iguais às ou mais altas que as produções de ergotioneína dos micro-organismos produtores de ergotioneína conhecidos. Foi também descoberto que as taxas de produção de ergotioneína das cinco cepas selecionadas foram também iguais às ou maiores que as taxas de produção dos micro-organismos produtores de ergotioneína conhecidos.[0061] It was discovered, from Tables 1 and 2, that the ergothioneine productions of the five selected strains were equal to or higher than the ergothioneine productions of known ergothioneine-producing microorganisms. It was also discovered that the ergothioneine production rates of the five selected strains were also equal to or greater than the production rates of known ergothioneine-producing microorganisms.

(8) Molecular phylogenetic position and physiological properties of strain S111

[0062] Para as sequências de bases das regiões 26S rDNA-D1/D2 e ITS-5.8 rDNA na cepa S111, a pesquisa de homologia por BLAST foi realizada através das Bases de Dados de Sequências de Nucleotídeos Internacionais. Como um resultado, as sequências de bases apresentaram de 98,4 a 100% de homologia com uma pluralidade de sequências bases de Dirkmeia churashimaensis como um tipo de levedura basidiomiceto. Na árvore filogenética molecular analisada com base nas sequências de bases obtidas, a cepa S111 mostrou a mesma posição filogenética molecular que aquelas da pluralidade de sequências de bases de Dirkmeia churashimaensis.[0062] For the base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS-5.8 rDNA regions in strain S111, the BLAST homology search was performed using the International Nucleotide Sequence Databases. As a result, the base sequences showed 98.4 to 100% homology with a plurality of base sequences from Dirkmeia churashimaensis as a type of basidiomycete yeast. In the molecular phylogenetic tree analyzed based on the base sequences obtained, strain S111 showed the same molecular phylogenetic position as those of the plural base sequences of Dirkmeia churashimaensis.

[0063] A cepa S111 foi cultivada em um meio de placa de ágar YM a 27 °C durante 7 dias, e as colônias formadas foram observadas. O formato da margem das colônias foi inteiro, e o estado elevado das mesmas foi plano e enrugado. O formato da superfície das colônias foi liso. Além disso, as colônias foram opacas e semelhantes à manteiga, e de cor laranja clara a creme.[0063] Strain S111 was cultivated on a YM agar plate medium at 27 ° C for 7 days, and the formed colonies were observed. The shape of the margin of the colonies was entire, and the elevated state of the colonies was flat and wrinkled. The surface shape of the colonies was smooth. Additionally, the colonies were opaque and butter-like, and light orange to cream in color.

[0064] Além disso, a cepa S111 foi cultivada em um meio de placa de ágar YM a 27 °C durante 7 dias e, então, as propriedades morfológicas da célula também foram observadas. Foi visto que as células nutritivas foram de formato oval a ovoide, e que a cepa foi proliferada através de brotamento. Não foi observada formação de órgãos reprodutivos sexuais na placa, 4 semanas ou mais após o início da cultura.[0064] Furthermore, strain S111 was cultivated in a YM agar plate medium at 27 °C for 7 days and then the morphological properties of the cell were also observed. It was seen that the nutritive cells were oval to ovoid in shape, and that the strain was proliferated through budding. No formation of sexual reproductive organs was observed in the plate 4 weeks or more after the start of culture.

[0065] As propriedades morfológicas da cepa S111, descrita acima, quase corresponderam às características de Dirkmeia churashimaensis à qual foi atribuída de acordo com a análise da sequência de DNA das regiões D1/D2 e ITS. As propriedades fisiológicas das cepas S111 são mostradas na Tabela 3.[0065] The morphological properties of strain S111, described above, almost corresponded to the characteristics of Dirkmeia churashimaensis to which it was attributed according to analysis of the DNA sequence of the D1/D2 and ITS regions. The physiological properties of the S111 strains are shown in Table 3.

[0066] Na Tabela 3, o símbolo "+" indica positivo. O símbolo "-" indica negativo. A letra "W" indica fracamente positivo. A letra "D" indica gradualmente se tornando positivo durante um período de 1 semana ou mais após o início do teste, e a letra "L" indica rapidamente se tornando positivo 2 semanas ou mais após o início do teste. [Tabela 3] [0066] In Table 3, the symbol "+" indicates positive. The "-" symbol indicates negative. The letter "W" indicates weakly positive. The letter "D" indicates gradually becoming positive over a period of 1 week or more after starting the test, and the letter "L" indicates rapidly becoming positive 2 weeks or more after starting the test. [Table 3]

[0067] Através das medições da posição filogenética molecular e das propriedades fisiológicas, e também da produção de ergotioneína, foi determinado que a cepa S111 é um novo micro-organismo atribuído a Dirkmeia churashimaensis.[0067] Through measurements of molecular phylogenetic position and physiological properties, as well as ergothioneine production, it was determined that strain S111 is a new microorganism attributed to Dirkmeia churashimaensis.

(9) Molecular phylogenetic position and physiological properties of strain EA071

[0068] Para as sequências de bases das regiões 26S rDNA-D1/D2 e ITS-5.8 rDNA na cepa EA071, a pesquisa de homologia por BLAST foi realizada através das Bases de Dados de Sequências de Nucleotídeos Internacionais. Como um resultado, as sequências de bases apresentaram de 99,4 a 100% de homologia com uma pluralidade de sequências de bases de Cryptococcus flavescens (nome atual: Papiliotrema flavescens) como um tipo de levedura basidiomiceto. Na árvore filogenética molecular analisada com base nas sequências de bases obtidas, a cepa EA071 foi incluída no grupo filético composto do gênero Papiliotrema. Então, a cepa mostrou a mesma posição filogenética molecular que aquela de Cryptococcus flavescens (nome atual: Papiliotrema flavescens) CBS942T.[0068] For the base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS-5.8 rDNA regions in strain EA071, homology search by BLAST was performed using the International Nucleotide Sequence Databases. As a result, the base sequences showed 99.4 to 100% homology with a plurality of base sequences from Cryptococcus flavescens (current name: Papiliotrema flavescens) as a type of basidiomycete yeast. In the molecular phylogenetic tree analyzed based on the base sequences obtained, strain EA071 was included in the phyletic group composed of the genus Papiliotrema. Therefore, the strain showed the same molecular phylogenetic position as that of Cryptococcus flavescens (current name: Papiliotrema flavescens) CBS942T.

[0069] A cepa EA071 foi cultivada em um meio de placa de ágar YM a 27 °C durante 7 dias, e as colônias formadas foram observadas. O formato da margem das colônias foi inteiro, e o estado elevado da mesma foi em formato de colchão. O formato da superfície das colônias foi liso. Além disso, as colônias forma luminosas e viscosas, e de cor creme.[0069] Strain EA071 was cultivated on a YM agar plate medium at 27 ° C for 7 days, and the colonies formed were observed. The shape of the margin of the colonies was entire, and the elevated state of it was mattress-shaped. The surface shape of the colonies was smooth. Furthermore, the colonies form luminous, viscous, and cream-colored.

[0070] Além disso, a cepa EA071 foi cultivada em um meio de placa de ágar YM a 27 °C durante 7 dias e, então, as propriedades morfológicas da célula também foram observadas. Foi visto que as células nutritivas foram de formato subglobular a oval, e que a cepa foi proliferada através de brotamento. Não foi observada formação de órgãos reprodutivos sexuais na placa, 4 semanas ou mais após o início da cultura.[0070] Furthermore, strain EA071 was cultivated in a YM agar plate medium at 27 °C for 7 days and then the morphological properties of the cell were also observed. It was seen that the nutritive cells were subglobular to oval in shape, and that the strain was proliferated through budding. No formation of sexual reproductive organs was observed in the plate 4 weeks or more after the start of culture.

[0071] As propriedades morfológicas da cepa EA071, descrita acima, quase corresponderam às características de Papiliotrema flavescens à qual foi atribuída pela análise de sequência de DNA das regiões D1/D2 e ITS. As propriedades fisiológicas das cepas EA071 são mostradas na Tabela 4. [Tabela 4] [0071] The morphological properties of strain EA071, described above, almost corresponded to the characteristics of Papiliotrema flavescens to which it was attributed by DNA sequence analysis of the D1/D2 and ITS regions. The physiological properties of EA071 strains are shown in Table 4. [Table 4]

[0072] Através das medições da posição filogenética molecular e das propriedades fisiológicas, também da produção de ergotioneína, foi determinado que a cepa EA071 foi um novo micro-organismo atribuído a Papiliotrema flavescens.[0072] Through measurements of the molecular phylogenetic position and physiological properties, also the production of ergothioneine, it was determined that strain EA071 was a new microorganism attributed to Papiliotrema flavescens.

(10) Molecular phylogenetic position and physiological properties of strain EA361

[0073] Para as sequências de bases das regiões 26S rDNA-D1/D2 e ITS-5.8 rDNA na cepa EA361, a pesquisa de homologia por BLAST foi realizada através das Bases de Dados de Sequências de Nucleotídeos Internacionais. Como um resultado, as sequências de bases apresentaram de 99,4 a 100% de homologia com uma pluralidade de sequências de bases de Cryptococcus flavescens (nome atual: Papiliotrema flavescens) como um tipo de levedura basidiomiceto. Na árvore filogenética molecular analisada com base nas sequências de bases obtidas, a cepa EA361 foi incluída no grupo filético composto do gênero Papiliotrema. Então, a cepa mostrou a mesma posição filogenética molecular que aquela de Cryptococcus flavescens (nome atual: Papiliotrema flavescens) CBS942T.[0073] For the base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS-5.8 rDNA regions in strain EA361, the BLAST homology search was performed using the International Nucleotide Sequence Databases. As a result, the base sequences showed 99.4 to 100% homology with a plurality of base sequences from Cryptococcus flavescens (current name: Papiliotrema flavescens) as a type of basidiomycete yeast. In the molecular phylogenetic tree analyzed based on the base sequences obtained, strain EA361 was included in the phyletic group composed of the genus Papiliotrema. Therefore, the strain showed the same molecular phylogenetic position as that of Cryptococcus flavescens (current name: Papiliotrema flavescens) CBS942T.

[0074] A cepa EA361 foi cultivada em um meio de placa de ágar YM a 27 °C durante 7 dias, e as colônias formadas foram observadas. O formato da margem das colônias foi inteiro, e o estado elevado da mesma foi em formato de colchão. O formato da superfície das colônias foi liso. Além disso, as colônias forma luminosas e viscosas, e de cor creme.[0074] Strain EA361 was cultivated on a YM agar plate medium at 27 ° C for 7 days, and the colonies formed were observed. The shape of the margin of the colonies was entire, and the elevated state of it was mattress-shaped. The surface shape of the colonies was smooth. Furthermore, the colonies form luminous, viscous, and cream-colored.

[0075] Além disso, a cepa EA361 foi cultivada em um meio de placa de ágar YM a 27 °C durante 7 dias e, então, as propriedades morfológicas da célula também foram observadas. Foi visto que as células nutritivas foram de formato subglobular a oval, e que a cepa foi proliferada através de brotamento. Não foi observada formação de órgãos reprodutivos sexuais na placa, 4 semanas ou mais após o início da cultura.[0075] In addition, strain EA361 was cultivated in a YM agar plate medium at 27 ° C for 7 days and then the morphological properties of the cell were also observed. It was seen that the nutritive cells were subglobular to oval in shape, and that the strain was proliferated through budding. No formation of sexual reproductive organs was observed in the plate 4 weeks or more after the start of culture.

[0076] As propriedades morfológicas da cepa EA361, descrita acima, quase corresponderam às características de Papiliotrema flavescens à qual foi atribuída pela análise de sequência de DNA das regiões D1/D2 e ITS. As propriedades fisiológicas das cepas EA071 são mostradas na Tabela 5. [Tabela 5] [0076] The morphological properties of strain EA361, described above, almost corresponded to the characteristics of Papiliotrema flavescens to which it was attributed by DNA sequence analysis of the D1/D2 and ITS regions. The physiological properties of EA071 strains are shown in Table 5. [Table 5]

[0077] Através das medições da posição filogenética molecular e das propriedades fisiológicas, também da produção de ergotioneína, foi determinado que a cepa EA361 foi um novo micro-organismo atribuído a Papiliotrema flavescens.[0077] Through measurements of the molecular phylogenetic position and physiological properties, also the production of ergothioneine, it was determined that strain EA361 was a new microorganism attributed to Papiliotrema flavescens.

(11) Molecular phylogenetic position and physiological properties of strain EA702

[0078] Para as sequências de bases das regiões 26S rDNA-D1/D2 e ITS-5.8 rDNA na cepa EA702, a pesquisa de homologia por BLAST foi realizada através das Bases de Dados de Sequências de Nucleotídeos Internacionais. Como um resultado, as sequências de bases apresentaram de 99,3 a 100% de homologia com uma pluralidade de sequências bases de Trichosporon porosum (nome atual: Apiotrichum porosum) como um tipo de levedura basidiomiceto. Na árvore filogenética molecular analisada com base nas sequências de bases obtidas, a cepa EA702 foi incluída no grupo filético composto do gênero Trichosporon (Apiotrichum). Então, a cepa mostrou a mesma posição filogenética molecular que aquela de T Trichosporon porosum (nome atual: Apiotrichum porosum) CBS2040T.[0078] For the base sequences of the 26S rDNA-D1/D2 and ITS-5.8 rDNA regions in strain EA702, homology search by BLAST was performed using the International Nucleotide Sequence Databases. As a result, the base sequences showed 99.3 to 100% homology with a plurality of base sequences from Trichosporon porosum (current name: Apiotrichum porosum) as a type of basidiomycete yeast. In the molecular phylogenetic tree analyzed based on the base sequences obtained, strain EA702 was included in the phyletic group composed of the genus Trichosporon (Apiotrichum). Therefore, the strain showed the same molecular phylogenetic position as that of T Trichosporon porosum (current name: Apiotrichum porosum) CBS2040T.

[0079] A cepa EA702 foi cultivada em um meio de placa de ágar YM a 27 °C durante 7 dias, e as colônias formadas foram observadas. O formato da margem das colônias foi filamentoso. O estado elevado das colônias foi plano na margem e elevado no centro. O formato da superfície das colônias foi enrugado. As colônias foram opacas. Além disso, as colônias foram úmidas a levemente secas, e de cor branca a creme.[0079] Strain EA702 was cultivated on a YM agar plate medium at 27 ° C for 7 days, and the formed colonies were observed. The shape of the colony margin was filamentous. The elevated state of the colonies was flat on the margin and elevated in the center. The surface shape of the colonies was wrinkled. The colonies were opaque. Furthermore, the colonies were moist to slightly dry, and white to cream in color.

[0080] Além disso, a cepa EA702 foi cultivada em um meio de placa de ágar YM a 27 °C durante 7 dias e, então, as propriedades morfológicas da célula também foram observadas. Foi visto que as células nutritivas foram de formato oval a ovoide, e que a cepa foi proliferada através de brotamento. Além disso, a cepa foi proliferada através de brotamento lateral, juntamente com o alongamento das hifas. Não foi observada formação de órgãos reprodutivos sexuais na placa, 4 semanas ou mais após o início da cultura.[0080] Furthermore, strain EA702 was cultivated in a YM agar plate medium at 27 °C for 7 days and then the morphological properties of the cell were also observed. It was seen that the nutritive cells were oval to ovoid in shape, and that the strain was proliferated through budding. Furthermore, the strain was proliferated through lateral budding along with hyphal elongation. No formation of sexual reproductive organs was observed in the plate 4 weeks or more after the start of culture.

[0081] As propriedades morfológicas da cepa EA702, descrita acima, quase corresponderam às características de Apiotrichum porosum à qual foi atribuída pela análise de sequência de DNA das regiões D1/D2 e ITS. As propriedades fisiológicas das cepas EA702 são mostradas na Tabela 6. [Tabela 6] [0081] The morphological properties of strain EA702, described above, almost corresponded to the characteristics of Apiotrichum porosum to which it was attributed by DNA sequence analysis of the D1/D2 and ITS regions. The physiological properties of EA702 strains are shown in Table 6. [Table 6]

[0082] Através das medições da posição filogenética molecular e das propriedades fisiológicas, também da produção de ergotioneína, foi determinado que a cepa EA702 foi um novo micro-organismo atribuído a Papiliotrema flavescens.[0082] Through measurements of the molecular phylogenetic position and physiological properties, also the production of ergothioneine, it was determined that strain EA702 was a new microorganism attributed to Papiliotrema flavescens.

[Industrial applicability]

[0083] Os micro-organismos da presente invenção têm alta produção de ergotioneína e podem ser usados nos campos de saúde, beleza, e semelhantes. [Número de acesso] NITE BP-03051 NITE BP-03052 NITE BP-03053 NITE BP-03054[0083] The microorganisms of the present invention have high production of ergothioneine and can be used in the fields of health, beauty, and the like. [Accession number] NITE BP-03051 NITE BP-03052 NITE BP-03053 NITE BP-03054

Claims

1. Method for producing ergothioneine, characterized by cultivating a microorganism belonging to strain S111 of Dirkmeia churashimaensis (NITE accession number BP-03054), a microorganism belonging to strain EA071 of Papiliotrema flavescens (NITE accession number BP- 03051), a microorganism belonging to strain EA361 of Papiliotrema flavescens (NITE accession number BP-03052), or belonging to strain EA702 of Apiotrichum porosum (NITE accession number BP-03053) to obtain a culture containing ergothioneine.