BR112021013752A2

BR112021013752A2 - Planta de tomate resistente a vírus de fruto rugoso marrom de tomate

Info

Publication number: BR112021013752A2
Application number: BR112021013752-1A
Authority: BR
Inventors: Marieke Ykema; Cornelis Walter Verweij; Sergio De La Fuente Van Bentem; Frederic Michel Pierre PEREFARRES
Original assignee: Enza Zaden Beheer B.V.
Priority date: 2019-01-14
Filing date: 2019-12-09
Publication date: 2021-09-28
Also published as: US20220220499A1; IL311290A; WO2020147921A1; CN113365493B; MX2021008313A; KR20210113675A; AU2019422681A1; CA3124735A1; CL2021001857A1; EP3911147A1; US11168336B2; IL284795A; JP2022516735A; CN113365493A; WO2020148021A1; JOP20210190A1; US20210238627A1; PE20211661A1

Abstract

planta de tomate resistente a vírus de fruto rugoso marrom de tomate. a presente invenção refere-se a uma planta da espécie s. lycopersicum que é resistente ao tobamovirus, em que a planta compreende uma ou mais sequências genômicas. mais especificamente, a invenção se refere a tomateiros (s. lycopersicum) que são resistentes ao vírus do fruto rugoso marrom do tomate (tbrfv). a presente invenção se refere ainda a uma sequência genômica ou locus que fornece resistência a tobamovirus. além disso, a presente invenção se refere a métodos para fornecer uma planta s. lycopersicum que é resistente ao tobamovirus.

Description

“PLANTA DE TOMATE RESISTENTE A VÍRUS DE FRUTO RUGOSO MARROM DE TOMATE”

[001] A presente invenção refere-se a uma planta da espécie S. lycopersicum que é resistente ao Tobamovirus, em que a planta compreende uma ou mais sequências genômicas. Mais especificamente, a invenção se refere a tomateiros (S. lycopersicum) que são resistentes ao vírus do fruto rugoso marrom do tomate (TBRFV). A presente invenção se refere ainda a uma sequência genômica ou locus que fornece resistência a Tobamovirus. Além disso, a presente invenção se refere a métodos para fornecer uma planta S. lycopersicum que é resistente ao Tobamovirus.

[002] Tobamovirus é um gênero da espécie viral Virgaviridae que infecta plantas, incluindo plantas da família Solanaceae, como tabaco, batata, tomate e berinjela e está entre as ameaças mais sérias às hortaliças no mundo. Tobamovirus são particularmente um problema em plantações de tomate cultivadas em ambientes protegidos e são transmitidos por longas distâncias por meio da contaminação externa de sementes e mecanicamente de planta em planta por meio de práticas de cultura comuns através das mãos dos trabalhadores, roupas, ferramentas e são têm a capacidade de preservar a infectividade nas sementes e solo contaminado. Além disso, ervas daninhas comuns, muitas vezes assintomáticas quando infectadas pelo vírus, constituem um reservatório críptico entre os ciclos de crescimento.

[003] As infecções por Tobamovirus podem ter efeitos desastrosos nas lavouras quando as mesmas são contaminadas. A prevenção da infecção, por exemplo, cultivando mudas em um ambiente livre de vírus é geralmente cara e/ou hostil ao meio ambiente. Além disso, esses métodos nem sempre fornecem resultados satisfatórios.

[004] Tobamovirus não são envelopados, com geometrias de bastão helicoidal e simetria helicoidal. As partículas virais são em forma de bastonete e têm um diâmetro de cerca de 18 nm e um comprimento de 300 a 310 nm. Seus genomas de RNA de fita simples de sentido positivo são lineares e não segmentados e têm cerca de 6,3 a 6,5 kb de comprimento. Existem mais de 35 espécies de vírus nesse gênero, incluindo o Vírus do Mosaico do Tomate (ToMV) ou o Vírus do Mosaico do

Tabaco (TMV), o Vírus da Mancha Suave do Tomate (ToMMV) e o recém-revelado Vírus do Fruto Rugoso Marrom do Tomate (TBRFV).

[005] No tomate, a nomeação das quatro cepas de Tobamovirus (mais especificamente ToMV) atualmente reconhecidas (Tm-0, Tm-1, Tm-2 e Tm-22) é baseada nos genes de resistência introgressada (R) Tm1, Tm2 e Tm22 de espécies selvagens relacionadas. O gene Tm1 foi introgressado a partir de Solanum habrochaites e é incompletamente dominante. Os genes Tm2 e Tm22 foram introgressados de Solanum peruvianum e conferem resistência completa dominante ao ToMV. No entanto, novas cepas de Tobamovirus surgiram à medida que a resistência foi superada e, recentemente, espécies do Tobamovirus que quebraram a resistência foram relatadas em campos comerciais no México, Jordânia e Israel.

[006] No final de 2014 e início de 2015, ocorreu um surto de uma nova doença infectando o tomate em Israel e na Jordânia. As plantas sintomáticas mostraram um padrão de mosaico nas folhas acompanhado ocasionalmente por estreitamento das folhas e frutos com manchas amarelas. A pesquisa mostrou que esta nova doença era um novo Tobamovirus, denominado TBRFV. A infecção por TBRFV está associada a lesões necróticas nas folhas e as plantas de tomate apresentam sintomas foliares leves no final da temporada, mas fortes sintomas de rugosidade marrom nas frutas, tornando os frutos impróprios para consumo. Além disso, no que diz respeito a outros membros da família Solanaceae, parece que o TBRFV tem capacidade de infectar plantas de pimenta também, por exemplo, quando plantado em solo contaminado do ciclo anterior de crescimento de tomateiros infectados em altas temperaturas acima de 30 °C.

[007] Na batalha contra o Tobamovirus, a resistência foi introduzida no tomate por introgressão dos genes R Tm2 e Tm22, resultando em resistência a ToMV. No entanto, esses genes R não fornecem resistência ao novo TBRFV, uma vez que diferentes domínios nas proteínas virais compostos por diferentes estruturas proteicas e um novo mecanismo de resistência e/ou genes resistentes são necessários para um mecanismo de resistência diferente. Além disso, é altamente provável que, com o tempo, a resistência seja quebrada, uma vez que o vírus se adaptará e evoluirá,

resultando na revelação viral. Portanto, novos genes de resistência precisam ser identificados e/ou combinados para fornecer culturas resistentes, especialmente contra o novo TBRFV.

[008] Considerando o disposto acima, existe uma necessidade na técnica de tomateiros resistentes a TBRFV, mais especificamente S. lycopersicum resistente a TBRFV. Além disso, há uma necessidade na técnica de fornecer métodos e meios para fornecer plantas de S. lycopersicum resistentes a TBRFV.

[009] É um objeto da presente invenção, entre outros objetos, abordar a necessidade disposta acima na técnica. O objeto da presente invenção, entre outros objetos, é alcançado pela presente invenção conforme descrito nas reivindicações anexas.

[010] Especificamente, o objeto acima, entre outros objetos, é alcançado, de acordo com um primeiro aspecto, pela presente invenção por uma planta da espécie S. lycopersicum que é resistente a Tobamovirus, em que a planta compreende um gene de resistência a TBRFV que codifica uma proteína de resistência a TBRFV, em que a proteína tem pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99%, com a máxima preferência 100% de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO.116. É previsto que o gene de resistência a TBRFV codifique uma proteína de resistência a NBS-LRR.

[011] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que o gene de resistência a TBRFV compreende uma sequência de codificação que tem pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98%, ainda mais preferencialmente pelo menos 99%, com preferência máxima 100% de identidade de sequência de nucleotídeos com SEQ ID NO.115.

[012] De acordo com outra modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que a planta compreende uma ou mais sequências genômicas selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8,

SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 e SEQ ID NO.18, ou que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs. As sequências genômicas codificam um ou mais genes ou elementos genéticos que fornecem resistência ao Tobamovirus. As sequências foram examinadas em homologia genética com o uso do banco de dados público do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Seis sequências genômicas têm homologia com sequências que codificam para proteínas de resistência a NBS-LRR (SEQ ID NO.7, 8, 9, 10, 11 e 14). Quatro sequências genômicas têm homologia com serina/treonina- proteína quinase similar a receptor LRR (SEQ ID NO. 5, 6, 12 e 13).

[013] O reconhecimento do patógeno pelas plantas ocorre por meio de dois grupos relevantes de receptores do hospedeiro envolvendo dois tipos principais de proteínas, a saber, quinases ou proteínas similares a receptores (RLK ou RLP) e proteínas de repetição ricas em leucina no sítio de ligação de nucleotídeos (proteínas de resistência a NBS-LRR). O primeiro grupo é formado por receptores de reconhecimento de padrões (PRR) especializados no reconhecimento de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPS). RLPs ou RLKs estão ligadas à membrana celular e são receptores imunológicos extracelulares. RLKs vegetais estão envolvidos na interação planta-patógeno e respostas de defesa e quinases receptoras de plantas (PRKs) podem ser definidas como proteínas que contêm um domínio extracelular, um domínio transmembrana de passagem única e um domínio citoplasmático de serina/treonina (ser/thr) proteína quinase. Os LRR-RLKs vegetais (quinase similar ao receptor de repetição rica em leucina) têm um domínio quinase citoplasmático funcional e todos os LRR-RLKs vegetais analisados até o momento têm atividade ser/thr quinase. A resistência a patógenos fornecida por esses receptores é chamada de imunidade desencadeada por PAMP (PTI). O outro grupo compreende principalmente receptores intracelulares chamados proteínas de resistência (proteínas R). A maioria dos genes de resistência a doenças em plantas codificam proteínas de repetição ricas em leucina no sítio de ligação de nucleotídeos, também conhecidas como proteínas NBS-LRR. Essas proteínas são caracterizadas por sítios de ligação de nucleotídeos (NBS) e domínios de repetição rica em leucina (LRR), bem como domínios amino e carboxi-terminais variáveis e estão envolvidas na detecção de diversos patógenos, incluindo bactérias, vírus, fungos, nematoides, insetos e oomicetos. A maioria das sequências genômicas identificadas que fornecem resistência a Tobamovirus compreende vários domínios LRR. Pensa-se que esses domínios determinam o reconhecimento efetor e, portanto, a susceptibilidade/resistência à doença.

[014] Os agentes patogênicos desenvolvem estratégias contrárias para superar a PTI por meio da modificação ou alteração de PAMPs e MAMPs. Então, as plantas desenvolverão uma maneira de reconhecer esses efetores e desencadear uma resposta de defesa secundária mais rápida e mais forte, conhecida como imunidade desencadeada por efetores (ETI). A ETI é mediada por proteínas R e acompanhada por morte celular localizada ao redor do sítio da infecção. A presença desses genes de resistência recém-identificados e/ou regiões genômicas que codificam proteínas NBS-LRR e/ou quinases receptoras de plantas diminuirão as chances de o patógeno superar a resistência ou, quando combinado com outros genes de resistência, a resistência à doença pode ainda ser melhorada.

[015] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que a planta compreende a sequência genômica representada por SEQ ID NO.3. A sequência genômica SEQ ID NO. 3 compreende múltiplas sequências que têm homologia com sequências que codificam para proteínas de resistência NBS-LRR e serina/treonina-proteína quinase similar a receptor LRR.

[016] De acordo com ainda outra modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que a planta compreende SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10 e SEQ ID NO.11.

[017] De acordo com a presente invenção, a resistência da planta ao Tobamovirus pode ser afetada por uma ou mais sequências genômicas que codificam uma proteína NBS-LRR selecionada a partir do grupo de SEQ ID NO.8, NO.9, NO.10, NO.11 e NO. 14, por exemplo, uma combinação de SEQ ID NO.8 e SEQ ID NO. 9 ou

SEQ ID NO.8 e SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.8 e SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 9 e SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO.9 e SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.10 e SEQ ID NO. 11. Adicional ou alternativamente, a resistência pode ser afetada por uma ou mais sequências genômicas que codificam uma serina/treonina-proteína quinase similar a receptor LRR selecionada do grupo SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO.13 ou SEQ ID NO.12 e SEQ ID NO.13.

[018] De acordo com ainda outra modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que a planta compreende as sequências genômicas de SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.11 e SEQ ID NO.14.

[019] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que a planta compreende SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13 e SEQ ID NO.14.

[020] De acordo com outra modalidade preferida, a presente invenção se refere à planta, em que a planta é resistente às cepas do Tobamovirus Tm-0, Tm- 1 e Tm-2. No tomate, quatro cepas de Tobamovirus foram identificadas; Tm-0, Tm-1, Tm-2 e Tm-22.

[021] De acordo com ainda outra modalidade preferida, a presente invenção se refere à planta, em que a planta é resistente ao Vírus da Fruto Rugoso Marrom do Tomate (TBRFV).

[022] De acordo com ainda outra modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que o TBRFV é o isolado de vírus AE050.

[023] De acordo com ainda outra modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que a planta é uma planta do tomate (Solanum lycopersicum).

[024] De acordo com ainda outra modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que uma ou mais sequências genômicas e/ou gene de resistência a TBRFV é heterozigoto ou homozigoto presente no genoma da dita planta. A partir dos dados experimentais pode-se concluir que a resistência é dominante e que o gene de resistência a TBRFV e/ou sequência genômica deve ser pelo menos heterozigoto presente no genoma da planta para fornecer resistência contra o Tobamovirus.

[025] De acordo com ainda outra modalidade preferencial, a presente invenção se refere à planta, em que o dito gene de resistência a TBRFV e/ou uma ou mais sequências genômicas são encontradas no número de acesso de depósito NCIMB 43279. NCIMB 43279, sementes de Solanum lycopersicum foram depositadas em 16 de novembro de 2018 na NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate Bucksburn, AB21 9YA Aberdeen, Reino Unido.

[026] A presente invenção, de acordo com um segundo aspecto, se refere a plantas, partes de plantas, tecidos, células e/ou sementes derivadas da planta da presente invenção.

[027] A presente invenção, de acordo com um outro aspecto, se refere a um gene de resistência (gene de resistência a TBRFV) para fornecer resistência a um Tobamovirus em uma planta de S. lycopersicum, em que o dito gene de resistência é representado por uma sequência de codificação com pelo menos 90% da sequência de nucleotídeos identidade com SEQ ID NO.115.

[028] A presente invenção, de acordo com outro aspecto, se refere a uma sequência genômica para fornecer resistência a um Tobamovirus em uma planta S. lycopersicum, em que a sequência genômica é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6 , SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 e SEQ ID NO.18, ou que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer um das ditas SEQ ID NOs. De preferência, a sequência genômica é SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.11 ou SEQ ID NO.14.

[029] A presente invenção, de acordo com outro aspecto, se refere a um locus de resistência para fornecer resistência a um Tobamovirus em uma planta de S. lycopersicum, em que o locus é representado por SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO. 3 ou SEQ ID NO.4, de preferência SEQ ID NO.3.

[030] De acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção, o gene de resistência, sequência genômica ou locus de resistência fornece resistência a um TBRFV.

[031] A presente invenção, de acordo com um outro aspecto, se refere a um método para fornecer uma planta da espécie S. lycopersicum que é resistente ao Tobamovirus, em que o método compreende as etapas de:

[032] a) selecionar uma planta S. habrochaites que é resistente a Tobamovirus, em que a dita seleção compreende estabelecer a presença da sequência genômica do gene de resistência ou locus de resistência da presente invenção,

[033] b) transferir a sequência genômica identificada ou locus da etapa a) em uma planta S. lycopersicum, conferindo assim resistência ao Tobamovirus à dita planta S. lycopersicum.

[034] A transferência pode ser realizada por meio do cruzamento da planta selecionada de S. habrochaites com S. lycopersicum. Posteriormente, uma planta S. lycopersicum resistente a Tobamovirus pode ser selecionada.

[035] De acordo com outra modalidade preferencial, a presente invenção se refere ao método, em que após a etapa b) uma primeira planta S. lycopersicum é selecionada que é resistente a Tobamovirus e é cruzada com uma segunda planta S. lycopersicum que não é resistente a Tobamovirus, e subsequentemente, selecionar plantas S. lycopersicum que são resistentes a Tobamovirus.

[036] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção se refere ao método, em que na etapa a) estabelecer a presença do gene de resistência (gene de resistência TBRFV), a sequência genômica que confere resistência ou o locus de resistência em uma planta de S. habrochaites é realizada por um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111 e SEQ ID NO. 112, preferencialmente SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111 e SEQ ID NO. 112.

[037] A presente invenção, de acordo com um outro aspecto, se refere ao uso de um marcador para estabelecer a presença do gene de resistência a TBRFV, a sequência genômica conferindo resistência a TBRFV ou o locus de resistência em uma planta S. lycopersicum, em que o marcador é um ou mais selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111 e SEQ ID NO. 112, preferencialmente SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111 e SEQ ID NO. 112.

[038] A presente invenção será ainda mais detalhada nos seguintes exemplos e figuras em que:

[039] Figura 1: Visão geral do mapeamento do locus que fornece resistência contra Tobamovirus, mais especificamente TRBFV em S. lycopersicum. As plantas F1 foram criadas por meio do cruzamento da linha 90479-3 de S. habrochaites que foi selecionada para o fenótipo de resistência com as linhas OT9 e OT1317 de S. lycopersicum para criar duas populações para mapeamento. Mais de 700 plantas foram testadas quanto à resistência a TRBFV e várias plantas recombinantes (21 plantas) foram selecionadas e os resultados do teste da doença foram combinados com os dados do marcador. Vários marcadores moleculares (M1 a M42) têm sido usados para determinar a posição e o tamanho da sequência genômica que fornece resistência a TRBFV. Uma clara segregação foi observada entre plantas resistentes (R) e suscetíveis (S). Os resultados indicaram que uma região genômica localizada entre os marcadores M16 e M17 estava fornecendo a resistência ao TRBFV; o locus correspondente (denominado LYC4943 R Locus) tem 133,515 pb de comprimento e compreende vários genes putativos. Com base em mapeamento fino adicional, o tamanho e a localização da sequência genômica que abriga a resistência a TBRFV são determinados como estando entre os marcadores M33 e M38 e é aproximadamente 68,000 bp maior em comparação com o genoma de referência

SL2.40 de S. lycopersicum (85,240 bp vs. 17,328 bp, respectivamente). Portanto, é mais provável que um ou mais genes estejam localizados nessa região, indicada como “região TBRFV”, esteja fornecendo a resistência a TBRFV.

[040] Figura 2: mostra os resultados de um qPCR para a detecção de TBRFV em plantas de tomate infectadas e não infectadas (S. lycopersicum) da presente invenção e em plantas que não compreendem o locus de resistência a TBRFV. Valores baixos de Ct (ou seja, abaixo de 30) indicam a alta presença de RNA viral presente nas amostras. OT9 é uma planta de tomate que não compreende o locus de resistência a TBRFV. A amostra controle (OT9 não infectado) apresentou um valor Ct entre 35 e 40 ciclos e a amostra controle infectada (OT9 infectado) apresentou um valor Ct entre 20 e 25. Plantas que apresentam valor de Ct acima de 30 ciclos, preferencialmente em torno de 35 ciclos, foram consideradas resistentes, enquanto plantas que apresentam valor de Ct abaixo de 30 são consideradas suscetíveis. As plantas de tomate que compreendem o locus de resistência a TBRFV, homozigoto (B) ou heterozigoto (H) têm um valor de Ct acima de 30 ciclos e são consideradas resistentes. Além disso, os resultados mostram que a resistência é dominante. As plantas que não compunham o locus de resistência a TBRFV (infectados com A e OT9) apresentaram um valor Ct entre 20 e 25, indicando que a planta era suscetível à infecção por TBRFV.

[041] Figura 3: mostra uma visão geral esquemática das sequências genômicas SEQ ID NO.1 a SEQ ID NO.18 da presente invenção que codificam para um ou mais genes ou elementos genéticos que fornecem resistência a Tobamovirus.

[042] Figura 4: Visão geral de um mapeamento adicional do locus que fornece resistência contra Tobamovirus, além da Figura 1. Uma outra seleção recombinante foi realizada por outras plantas de genotipagem com M33 e M38 para identificar plantas recombinantes na região de TBRFV identificada e limitar ainda mais essa região de TBRFV. As plantas recombinantes foram ainda genotipadas com marcadores (M-SEQ 10, M-SEQ 11-1, M-SEQ 11-2 e M-SEQ 14) cobrindo o locus TBRFV e foram especificamente projetadas para eliminar regiões candidatas no locus TBRFV, isto é, as sequências genômicas SEQ ID NO.1 a SEQ ID NO.18 da presente invenção que codificam para um ou mais genes ou elementos genéticos que fornecem resistência a Tobamovirus. Plantas recombinantes 15321-02, 15321-03 e 15321-07 foram rastreadas quanto à resistência por inoculação com isolado AE50 de TBRFV. Com base nessas plantas recombinantes em combinação com dados de fenotipagem, ELISA e qPCR para a determinação da infecção por TBRFV, concluiu-se que o gene que confere resistência faz parte da SEQ ID No 14 genômica. As plantas 15321-02 e 15321-03 não compreendem a SEQ ID No 14 e se mostraram suscetíveis ao TBRFV, com altos escores de ELISA e baixos valores ct de qPCR que correspondem aos valores obtidos com a linha de controle suscetível OT9, indicando infecção por vírus. A planta 15321-07 compreende a SEQ ID No 14 e mostrou-se resistente a TBRFV, com baixos escores de ELISA e altos valores de qPCR ct.

[043] Figura 5: Mostra a infecção por TBRFV por ELISA em uma linha resistente a TBRFV homozigótica (15322-04), bem como em uma linha de controle suscetível (OT9). As plantas foram infectadas com TBRFV (+TRBFV) e infiltradas com o construto VIGS-01a que tem como alvo específico o gene de resistência a TRBFV ou com o construto VIGS-01b que tem como alvo uma região diferente dentro da região de TRBFV identificada. A leitura de ELISA foi realizada por medição de absorção a 405 nm. Plantas controle OT9 infectadas por TBRFV resultaram em níveis de absorção de 2.000 abs ou mais, enquanto as linhagens de plantas resistentes infectadas com TRBFV resultaram em níveis de absorção de aproximadamente 500 abs. Caso o gene de resistência do TRBFV tenha sido silenciado por VIGS-01a nas linhagens de plantas resistentes, níveis de absorção entre 1500 e 2250 abs foram medidos, indicando infecção viral. O silenciamento por VIGS-01b nas linhagens de plantas resistentes resultou em níveis de absorção similares aos observados nas linhagens de plantas resistentes infectadas que não foram silenciadas por VIGS.

[044] Figura 6: Mostra a infecção de TBRFV por qPCR em uma linha resistente a TBRFV homozigótica (15322-04), bem como em uma linha de controle suscetível (OT9). As plantas foram infectadas com TBRFV (+TRBFV) e infiltradas com o construto VIGS-01a que tem como alvo específico o gene de resistência a TRBFV ou com o construto VIGS-01b que tem como alvo uma região diferente dentro da região de TRBFV identificada. A amostra de controle infectada apresentou um valor Ct de aproximadamente 12 ou 13. As linhagens de plantas resistentes infectadas com TRBFV apresentaram um valor Ct de aproximadamente 30, indicando resistência a TBRFV. Caso o gene de resistência ao TRBFV tenha sido silenciado por VIGS-01a nas linhagens de plantas resistentes, os valores de Ct caíram para cerca de 12 a 20, maiores do que as células de controle infectadas, indicando claramente a infecção viral. O silenciamento por VIGS-01b nas linhagens de plantas resistentes resultou em níveis de Ct semelhantes (valor Ct de ~ 30), conforme observado nas linhagens de plantas resistentes infectadas que não foram silenciadas por VIGS.

EXEMPLOS INOCULAÇÃO DE UMA PLANTA DE TOMATE COM TBRFV

[045] O isolado AE050 de TBRFV (Origem Arábia Saudita) foi usado para a realização dos ensaios da doença. Como material vegetal, a Linha OT9, que é uma linha de planta suscetível ao TBRFV, foi usada para manutenção de vírus. Folhas sintomáticas recebidas das amostras originais foram usadas para inoculação mecânica de seiva na Linha OT9. O vírus foi mantido em plantas de tomate infectados sistemicamente OT9 por inoculação mecânica de seiva mensal em novas mudas de 3 semanas de idade.

[046] As plantas de tomate das espécies de Solanum pennellii, S. peruvianum, S. chilense, S. habrochaites, S. pimpinellifolium, S. neorickii, S. corneliomulleri, S. chmielewskii, S. cheesmaniae, S. galapagense foram selecionadas (~800 de 912 acessos de Solanum selvagem no total). Doze plantas de cada acesso foram infectadas com o isolado AE050 de TBRFV.

[047] As sementes foram semeadas em vermiculita, as mudas transplantadas em blocos de lã de rocha e inoculadas 4 semanas após a semeadura. Como material inicial, folhas sintomáticas de infectado com OT9 foram coletadas e moídas em almofariz e pilão em água desmineralizada gelada com carborundo (1 g/100 ml). A folha mais velha de mudas com 3 semanas de idade de cada planta de teste foi inoculada mecanicamente com AE050 esfregando suavemente a folha uma vez com um dedo.

[048] As plantas foram fenotipadas por pontuação visual das plantas e das folhas. As plantas são avaliadas quanto aos sintomas visuais em intervalos de tempo regulares. Os sintomas foram avaliados visualmente 2, 4 e 6 semanas após a inoculação, e os testes de ELISA nas plantas restantes foram realizados a partir de 6 semanas, com intervalos de 1 mês. Mais de 50% das plantas já apresentavam sintomas 2 semanas após a inoculação.

[049] A pontuação visual foi realizada semanalmente. As plantas são avaliadas quanto aos sintomas visuais. A presença de amarelecimento, padrão de mosaico nas folhas, deformação foliar (estreitamento, manchas) foi registrada semanalmente ao nível da planta. Os primeiros sintomas foram tipicamente observados 12-14 dias após a inoculação. As plantas foram categorizadas como “resistentes” quando nenhum desses sintomas nas folhas foi observado. As plantas que apresentam qualquer um dos sintomas nas folhas foram classificadas como “suscetíveis”. Amostras de folhas foram coletadas de plantas assintomáticas (isto é, resistentes) para testar a presença de vírus por ELISA.

[050] A triagem permitiu a seleção de vários candidatos para o melhoramento por resistência, sendo o melhor candidato o LYC4943, um acesso de S. habrochaites do Peru. LYC4943 não apresentou sintomas e foi testado como livre de vírus por ELISA por mais de 15 semanas após a inoculação.

DETERMINAÇÃO DE INFECÇÃO POR TBRFV POR ELISA

[051] A infecção foi determinada por ELISA. Uma folha apical (totalmente expandida) de cada planta foi coletada. As folhas foram esmagadas com o uso de uma máquina Tipo R302 D63N-472 (VECTOR aandrijftechniek B.V., Rotterdam, Holanda) e a seiva foi coletada por meio da adição de 2 ml de tampão PBS-Tween. 100 µl do extrato foram usados para ELISA com anticorpos contra ToMV (fornecedor Prime Diagnostics, Wageningen, Holanda). A leitura de ELISA foi realizada por medição de absorção a 405 nm com um aparelho FLUOstar Galaxy. As plantas que deram valores de absorção superiores a 1,5 vez das plantas de controle limpas foram consideradas infectadas (suscetíveis).

BIOENSAIOS E MAPEAMENTO DA SEQUÊNCIA GENÔMICA DE RESISTÊNCIA A TBRFV

[052] O lote original de sementes LYC4943 (S. habrochaites) está segregando quanto à resistência. Nove famílias F1 diferentes foram semeadas para bioensaio a fim de identificar as famílias F1 que são completamente resistentes (a resistência é fixa) e que serão usadas para posterior retrocruzamento. Quatro famílias F1 germinaram e foram testadas no bioensaio. Plantas F1 criadas com LYC4943 planta 3 (90479-3) foram selecionadas para o fenótipo de resistência para criar duas populações para mapeamento, escolhendo as linhas de S. lycopersicum OT9 e OT1317 como linhas de retrocruzamento. Os marcadores M1 a M42 (respectivamente SEQ ID NO. 19 a SEQ ID NO.102) foram usados no mapeamento e estão listados na Tabela 1.

[053] 298 plantas (OT9 x 90479-3) x OT9) e 484 plantas (OT1317 x 90479-3) = total de 782 plantas foram inoculadas com o isolado AE050 de TBRVF. Duas a três semanas após a inoculação, os sintomas de TBRFV estavam presentes e a fenotipagem ocular foi realizada. Uma segregação clara foi observada entre as plantas resistentes (R) e suscetíveis (S) e os fenótipos resistentes podem ser ligados ao marcador M1 (consulte a Tabela 1) localizado no cromossomo 8 em 2673609 bp no genoma de referência SL2.40 (S. lycopersicum). 92 plantas foram genotipadas com 26 marcadores para flanquear o QTL (M2 a M27, consulte a Tabela 1). Com base nesses resultados, a resistência pode ser mapeada entre 53118984 bp e 57038544 bp no genoma de referência SL2.40 (entre M8 e M20, consulte a Tabela 1 e a Figura 1). TABELA 1. Nome de Pos. Pos. no SEQ ID Sequência de primer primer SL2.40 Locus NO. M1_F 2672994 19 M1_R 20 M2_F 18124 21 M2_R 22 M3_F 881036 23

Nome de Pos.

Pos. no SEQ ID Sequência de primer primer SL2.40 Locus NO.

M3_R 24 M4_F 15384575 25

M4_R 26

M5_F 47887679 27 M5_R 28 M6_F 50957946 29 M6_R 30 M7_F 53082561 31 M7_R 32 M8_F 53118984 33 M8_R 34 M9_F 53452252 35 M9_R 36 M10_F 55664335 37

M10_R 38

M11_F 55720872 39

M11_R 40 M12_F 55776574 41 M12_R 42 M13_F 56448988 43 M13_R 44 M14_F 56781521 45 M14_R 46 M15_F 56874054 47 M15_R 48 M16_F 56920720 49 M16_R 50 M17_F 56990004 51

Nome de Pos.

Pos. no SEQ ID Sequência de primer primer SL2.40 Locus NO.

M17_R 52 M18_F 57003163 53 M18_R 54 M19_F 57024614 55 M19_R 56 M20_F 57038544 57 M20_R 58 M21_F 57427631 59 M21_R 60 M22_F 57441418 61 M22_R 62 M23_F 60844273 63 M23_R 64 M24_F 61412883 65 M24_R 66 M25_F 62277547 67 M25_R 68 M26_F 62418391 69 M26_R 70 M27_F 62783214 71 M27_R 72 M28_F 56924513 4076 73 M28_R 74 M29_F 56934501 12765 75 M29_R 76 M30_F 56934846 13109 77 M30_R 78 M31_F 56935054 13317 79 M31_R 80 M32_F 56935849 14113 81

Nome de Pos.

Pos. no SEQ ID Sequência de primer primer SL2.40 Locus NO.

M32_R 82 M33_F 56941043 15893 83 M33_R 84 M34_F 56942927 17777 85 M34_R 86 M35_F 56943610 18416 87 M35_R 88 M36_F 56944105 18912 89 M36_R 90 M37_F 56945167 19974 91 M37_R 92 M38_F 56958371 101133 93 M38_R 94 M39_F 56961307 104063 95 M39_R 96 M40_F 56965103 107926 97 M40_R 98 M41_F 56969685 112529 99 M41_R 100 M42_F 56981278 125792 101 M42_R 102 M-SEQ 36480 105 10_F M-SEQ 106 10_R M-SEQ 48748 107 11_1F M-SEQ 108 11_1R M-SEQ 52303 109 11_2F

Nome de Pos. Pos. no SEQ ID Sequência de primer primer SL2.40 Locus NO. M-SEQ 110 11_2R M-SEQ 77410 111 14_F M-SEQ 112 14_R

[054] Toda a população de 782 plantas foi genotipada com os marcadores de flanqueamento M8 e M20, a fim de encontrar as plantas recombinantes para mapeamento adicional preciso. Isso resultou em 21 plantas recombinantes (consulte a Figura 1). Essas 21 plantas recombinantes foram selecionadas e genotipadas com 11 marcadores M9 a M19, a fim de mapear de forma ainda mais precisa a região (Tabela 1). A resistência pode ser mapeada com precisão entre 56920720 e 56990004 (marcador M16 e M17) no genoma de referência SL2.40.

[055] O sequenciamento da região LYC4943 resistente com o uso da tecnologia de sequenciamento Oxford Nanopore resultou em um locus de 133,515 bp. As 21 plantas recombinantes foram genotipadas com marcadores extras nesse locus específico (M28 a M42) de LYC4943. Com base nas plantas recombinantes, plantas 594 e 608, foi determinado que a região resistente está localizada entre as posições 56941043 e 56958371, com base no genoma de referência SL2.40, correspondendo às posições entre 15,893 e 101,133 no locus LYC4943 (entre M33 e M38, consulte a Figura 1).

[056] Com base em mapeamento preciso, o tamanho e a localização da sequência genômica que abriga a resistência a TBRFV são determinados como estando entre os marcadores M33 e M38 e é aproximadamente 68,000 bp maior em comparação com o genoma de referência SL2.40 de S. lycopersicum (85,240 bp vs. 17,328 bp, respectivamente). É, portanto, altamente provável que um ou mais genes estejam localizados nessa região, indicada na Figura 1 como “região TBRFV”, fornecendo a resistência a TBRFV e é indicada como SEQ ID NO.3 neste pedido. Com base no genoma de referência SL2.40 e na análise de predição in silico (ITAG 2.3),

pelo menos um gene está localizado na região mapeada fina que codifica para uma proteína de resistência CC-NBS-LRR. A explosão da região TBRFV mapeada com precisão contra o banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI), resultou em sete fragmentos genômicos, dos quais cinco têm homologia com proteínas de resistência a NBS-LRR (SEQ ID NO.8, NO.9, NO.10 , NO.11 e NO.14) e dois têm homologia com serina/treonina-proteína quinases similares ao receptor LRR (SEQ ID NO.12 e SEQ ID NO.13).

[057] Em seguida, mapeamento preciso adicional foi realizado e uma seleção recombinante foi realizada por genotipagem de 668 plantas BC2 ((OT9 x 90479-3) x OT9 x OT9) com M33 e M38 a fim de identificar plantas recombinantes na região de TBRFV, resultando em três plantas 15321-02, 15321-03 e 15321-07 (consulte a Figura 4). Essas três plantas foram testadas quanto à resistência por inoculação com o isolado AE50 de TBRFV. Aproximadamente três semanas após a inoculação de TBRFV, as plantas foram fenotipadas por observação e ELISA e qPCR foram realizados para monitorar a infecção do vírus. As plantas recombinantes foram genotipadas com marcadores (M-SEQ 10, M-SEQ 11-1, M-SEQ 11-2 e M-SEQ 14, respectivamente SEQ ID NO. 105 a SEQ ID NO. 112) cobrindo o locus de TBRFV e foram especificamente concebidas para eliminar genes candidatos no locus de TBRFV. Essa abordagem fornece uma visão em qual das sequências genômicas candidatas SEQ ID NO.1 a SEQ ID NO.18 da presente invenção fornece especificamente resistência a TBRFV. Com base nas plantas recombinantes e testes de fenotipagem por doença, ELISA e qPCR, concluiu-se que o gene que confere resistência é codificado pela sequência genômica da SEQ ID NO. 14, mais especificamente a sequência de DNA codificadora da SEQ ID NO. 115 que codifica a proteína de SEQ ID NO. 116 VALIDAÇÃO DE RESISTÊNCIA À CEPA TM0, TM1 E TM2 NA PLANTA

QUE COMPREENDE O LOCUS DE RESISTÊNCIA A TBRFV

[058] Uma planta de tomate da presente invenção (S. lycopersicum) que compreende o locus de resistência a TBRFV (SEQ ID NO. 1) foi testada quanto à resistência contra as cepas Tm0, 1 e 2. A presença do locus de resistência a TBRFV foi determinada pelos marcadores M16, M17 e M33. Além disso, foi confirmado que a planta não contém o gene Tm22 (é um gene conhecido que fornece resistência contra as cepas Tm0, 1 e 2). Em alguns casos, a planta continha o gene de resistência Tm1. Como controle, foram selecionadas plantas que não continham o locus de resistência a TBRFV.

[059] Oito plantas (consulte a Tabela 2, 1 a 8), das quais seis plantas compreendem o locus de resistência a TBRFV (heterozigoto), e duas plantas (7 e 8) não têm o locus de resistência a TBRFV foram inoculadas com o isolado Tm0. Oito plantas (consulte a Tabela 2, 9 a 16), das quais seis plantas compreendem o locus de resistência a TBRFV (heterozigoto), e duas plantas (15 e 16) não têm o locus de resistência a TBRFV foram inoculadas com o isolado Tm-1. Oito plantas (consulte a Tabela 2, 17 a 28), das quais quatro plantas compreendem o locus de resistência a TBRFV (dois homozigotos 17, 18 + dois heterozigotos 19, 20), e quatro plantas sem o locus de resistência a TBRFV foram inoculadas com o isolado de Tm2. Como controle, a linhagem suscetível de tomate cultivado OT95 também foi inoculada com as três cepas.

[060] Os primeiros sintomas foram tipicamente observados após 12-14 dias após a inoculação. As plantas foram categorizadas como Resistentes (R) quando nenhum sintoma de padrão de mosaico foi observado nas folhas; as plantas que apresentam qualquer um dos sintomas nas folhas foram categorizadas como Suscetíveis (S). O fenótipo de cada planta foi comparado com o genótipo TBRFV. Os resultados estão resumidos na Tabela 2 abaixo. TABELA 2. M16 M33 M17 Tm2 Tm1 Planta Isolado Fenótipo 1 Tm0 R h h h a a 2 Tm0 R h h h a a 3 Tm0 R h h h a a 4 Tm0 R h h h a h 5 Tm0 R h h h a h

M16 M33 M17 Tm2 Tm1 6 Tm0 R h h h a h 7 Tm0 R a a a a h 8 Tm0 R a a a a h OT95 Tm0 S a a a a a OT95 Tm0 S a a a a a

9 Tm1 R h h h a a 10 Tm1 R h h h a a 11 Tm1 R h h h a a 12 Tm1 R h h h a a 13 Tm1 R h h h a h 14 Tm1 R h h h a h 15 Tm1 S a a a a a 16 Tm1 S a a a a h OT95 Tm1 S a a a a a OT95 Tm1 S a a a a a

17 Tm2 R b b b a a 18 Tm2 R b b b a a 19 Tm2 R h h h a a 20 Tm2 R h h h a a 21 Tm2 S a a a a a 22 Tm2 S a a a a a 23 Tm2 S a a a a a 24 Tm2 S a a a a a OT95 Tm2 S a a a a a OT95 Tm2 S a a a a a R = resistente, S = suscetível, a= sem locus de resistência presente, h = heterozigoto, b = homozigoto

RESULTADO TM0

[061] Todas as plantas que continham o locus de resistência a TBRFV são resistentes. As plantas 7 e 8 não continham o locus de resistência a TBRFV, mas também eram resistentes. Um motivo que poderia explicar os resultados é que o gene Tm1 está causando a resistência ao isolado Tm-0 de ToMV. Além disso, as plantas 1, 2 e 3, não continham o gene Tm1, mas continham o locus de resistência a TBRFV, mostraram-se resistentes. RESULTADO TM1

[062] Os fenótipos resistentes estão ligados aos genótipos TBRFV, fornecendo resistência contra o isolado Tm-1 de ToMV. RESULTADO TM2

[063] Os fenótipos resistentes (hetero, homozigoto) estão ligados aos genótipos TBRFV, proporcionando resistência contra o isolado Tm-2 de ToMV. DETERMINAÇÃO DE INFECÇÃO POR TBRFV NO TOMATE (S. LYCOPERSICUM) POR QPCR

[064] As plantas de tomate que compreendem o locus de resistência a TBRFV (heterozigoto ou homozigoto) e as plantas que não contêm essa região foram selecionadas para o bioensaio de TBRFV com marcadores (M16 e M17). As plantas foram infectadas com TBRFV e a linhagem de tomate suscetível OT9 foi incluída como controle (OT9 não infectado e infectado).

[065] Após 3 semanas de inoculação, uma folha do topo da planta de cada planta foi coletada em um tubo de 2 ml que contém uma bala de metal de 6,35 mm. O tubo foi congelado em nitrogênio líquido. Os tubos foram agitados com alta velocidade para pulverizar o material vegetal. Após girar o tubo, a extração de RNA padrão com o uso de Macherey-Nagel™ NucleoSpin™ RNA Plant foi realizada. A concentração de RNA foi medida com o uso de DropSense 96 (trinean) e foi diluída para uma concentração de 100 ng/ul. 900 ng foram usados para a síntese de cDNA com o uso da transcriptase reversa M-MLV (Invitrogen). 10 ng de cDNA foram usados para PCR em tempo real com o uso de LC verde como corante intercalante. Duas combinações de iniciadores para amplificar a cepa TBRFV foram usadas, consulte a

Tabela 3 (SEQ ID NO.103 e SEQ ID NO.104, respectivamente). TABELA 3.

nome de primer de qPCR Sequência TBRFV-3 Fw ACCGTTCAACGGCAATTTAGC TBRFV-3 Rev CCTATACACCTTAAAACCACTG

[066] Quanto mais RNA viral estiver presente nas amostras, menor o valor Ct na qPCR, uma vez que menos ciclos de PCR são necessários para amplificar o cDNA (do RNA viral) e captar um sinal. A amostra controle (OT9 não infectado) apresentou um valor Ct entre 35 e 40 ciclos e a amostra controle infectada (OT9 infectado) apresentou um valor Ct entre 20 e 25. Portanto, as plantas que apresentam um valor de Ct acima de 30 ciclos, de preferência em torno de 35 ciclos, foram consideradas resistentes, enquanto as plantas que apresentam um valor de Ct abaixo de 30 foram consideradas suscetíveis (consulte a Figura 2).

[067] As plantas de tomate que compreendem o locus de resistência a TBRFV, homozigoto (B) ou heterozigoto (H), todos têm um valor de Ct acima de 30 ciclos e podem ser considerados resistentes. Os resultados mostram que a resistência é dominante. As plantas que não compunham o locus de resistência a TBRFV (A) apresentaram um valor Ct entre 20 e 25, indicando que a planta era suscetível à infecção por TBRFV.

SEQUENCIAMENTO DA SEQUÊNCIA GENÔMICA DE PLANTA DE TOMATE RESISTENTE

[068] O DNA genômico foi isolado de uma planta resistente (S. lycopersicum) da presente invenção, isto é, que compreende o locus de resistência TBRFV, de acordo com o protocolo publicado em 27 de abril de 2018 na Nature, Protocol Exchange (2018), Rachael Workman et al. “High Molecular Weight DNA Extraction from Recalcitrant Plant Species for Third Generation Sequencing”. As bibliotecas de sequenciamento foram preparadas com o uso do DNA Ligation Sequencing Kit-Promethion sem PCR, sem multiplex (SQK-LSK109). O procedimento de isolamento resultou em bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade para serem usadas no sistema Oxford Nanopore para sequenciamento (sequenciamento ONT). Promethion Flowcell Packs (3000 poros/flowcell) versão R9.4.1. foram usados para o sequenciamento.

[069] Além disso, para resolver ainda mais o locus TBRFV e identificar o gene que fornece a resistência a TBRFV, realizou-se o sequenciamento ONT em uma linha resistente (LYC4943). O sequenciamento de todas as isoformas transcritas da linha LYC4943 resistente foi feito com o uso do aplicativo de análise Iso-Seq (Pacific Biosciences of California, PacBio). Isso resultou em apenas um transcrito/gene de resistência candidato localizado na região entre os marcadores M33 e M38, mais especificamente o gene de resistência a TBRFV de SEQ ID NO. 115 Esse transcrito foi predeterminado para codificar para uma proteína resistente a CC- NBS-LRR de SEQ ID NO. 116

VALIDAÇÃO DE GENE COM O USO DE VIGS

[070] Para confirmar que o gene de resistência a TBRFV (SEQ ID NO. 115) é de fato o gene que confere resistência a TBRFV, foi realizada uma análise de Silenciamento Genético Induzido por Vírus (VIGS). Os vetores VIGS derivados do vírus do chocalho do tabaco (TRV) foram abundantemente descritos para estudar a função do gene em plantas como Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Lycopersicon esculentum e outras plantas (consulte, por exemplo, Huang C, Qian Y, Li Z, Zhou X.: Virus-induced gene silencing and its application in plant functional genomics. Sci China Life Sci. 2012;55(2):99-108).

[071] Como tal, duas construções VIGS foram desenvolvidas (Tabela 4), um construto VIGS-01a para visar especificamente a SEQ ID NO. 115 e um construto de controle VIGS-01b que tem como alvo a SEQ ID NO. 7, isto é, uma sequência também localizada dentro do locus TBRFV previamente identificado. TABELA 4.

Construto VIGS Sequência

VIGS-01a (SEQ ID NO. 113) VIGS-01b (SEQ ID NO. 114)

[072] Os fragmentos VIGS foram sintetizados (IDT, gBlocks) e posteriormente clonados em um vetor TRV. As sequências de DNA foram confirmadas por sequenciamento de Sanger. O vetor contém todas as sequências que codificam para proteínas que são necessárias para partículas de TRV funcionais, incluindo as sequências alvo. Os vetores VIGS incluindo os construtos VIGS-01a e VIGS-01b foram transformados em Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 e usados em experimentos VIGS para reduzir os níveis de mRNA endógeno em plantas de tomate usados nesse experimento. Uma linha homozigótica resistente a TBRFV (15322-04), bem como uma linha de controle suscetível (OT9) foram usadas no experimento VIGS, no qual as plantas foram infiltradas com agrobacterium no estágio de plântula (cotilédones) seguido pela inoculação do isolado E50 de TBRFV três semanas após a infiltração da agrobacterium. Duas semanas após a inoculação de TBRFV, as plantas individuais foram fenotipadas por ELISA e qPCR e revelaram que a suscetibilidade foi encontrada em plantas resistentes infiltradas com o construto VIGS- 01a, ao passo que nenhuma suscetibilidade foi detectada em plantas resistentes infiltradas com o construto VIGS-01b. Os resultados do ELISA e qPCR são mostrados nas Figuras 5 e 6, e os resultados foram resumidos na Tabela 5. TABELA 5.

VIGS- infecçã n° de n° de S n° de R Plantas construt o por plantas plantas plantas o TBRFV linha R 15322- 7 VIGS- Sim 7 0

VIGS- infecçã n° de n° de S n° de R Plantas construt o por plantas plantas plantas o TBRFV 04 01a linha R 15322- VIGS- 6 Sim 0 6 04 01b linha R 15322- 10 Não Sim 0 10 04 linha S OT9 6 Não Sim 6 0

[073] Na linha OT9 todas as plantas eram suscetíveis, conforme esperado. A linha R, que foi mostrada anteriormente como totalmente resistente, tornou-se suscetível a TBRFV no caso de o gene suspeito de resistência a TBRFV ter sido silenciado com o uso do construto VIGS-01a projetado para direcionar especificamente este gene, enquanto o silenciamento com o uso do construto VIGS- 01b (construto de controle) não resultou em qualquer suscetibilidade das plantas testadas. Com base nesses resultados, pode-se concluir que o gene SEQ ID NO. 115 é o que confere resistência ao TBRFV.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ENZA ZADEN BEHEER B.V.

<120> PLANTA DE TOMATE RESISTENTE VÍRUS DO FRUTO

RUGOSO MARROM DO TOMATE <130> P128659PC01 <150> PCT/EP2019/050830 <151> 14-01-2019 <160> 104 <170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1 <211> 133515 <212> DNA <213> Solanum habrochaites

<220> <223> locus de resistência a TBRFV

<400> 1

<210> 2 <211> 15891

<212> DNA <213> Solunum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 2

<400> 2

<210> 3 <211> 85327 <212> DNA <213> Solanum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 3

<400> 3

<210> 4 <211> 33516 <212> DNA <213> Solanum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 4

<400> 4

<210> 5 <211> 4900 <212> DNA <213> Solanum habrochaites <220>

<223> >Fragmento genômico 5

<400> 5

<210> 6 <211> 2684 <212> DNA <213> Solanum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 6

<400> 6

<210> 7 <211> 4297 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 7

<400> 7

<210> 8 <211> 4357 <212> DNA <213> Solaum gabrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 8

<400> 8

<210> 9 <211> 2561 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 9

<400> 9

<210> 10 <211> 3203 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 10

<400> 10

<210> 11 <211> 4181 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 11

<400> 11

<210> 12 <211> 1479 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 12

<400> 12

<210> 13 <211> 2084 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 13

<400> 13

<210> 14 <211> 4300 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 14

<400> 14

<210> 15 <211> 9902 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 15

<400> 15

<210> 16 <211> 2863 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 16

<400> 16

<210> 17 <211> 4781 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 17

<400> 17

<210> 18 <211> 3271 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >Fragmento genômico 18

<400> 18

<210> 115 <211> 2940 <212> DNA <213> Solaum habrochaites

<220> <223> >gene de resistência a TBRFV de sequência de codificação

<400> 115

<210> 116

<211> 979 <212> PRT <213> Solaum habrochaites

<220> <223> > proteína de resistência a TBRFV

<400> 116

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Planta da espécie S. lycopersicum que é resistente a Tobamovirus, em que a planta é caracterizada pelo fato de que compreende um gene de resistência a TBRFV que codifica para uma proteína de resistência a TBRFV, em que a proteína tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com SEQ ID NO.116.

2. Planta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que que o gene de resistência a TBRFV compreende uma sequência de codificação que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de nucleotídeos com SEQ ID NO.115.

3. Planta, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a planta é caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais sequências genômicas selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 e SEQ ID NO.18, ou que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas SEQ ID NOs.

4. Planta, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a planta é caracterizada pelo fato de que compreende SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.14.

5. Planta, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a planta é caracterizada pelo fato de que compreende SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13 e SEQ ID NO.14.

6. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a planta é caracterizada pelo fato de que é resistente às cepas do Tobamovirus Tm0, Tm1 e Tm2.

7. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o Tobamovirus é o Vírus do Fruto Rugoso Marrom do Tomate (TBRFV).

8. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,

caracterizada pelo fato de que o gene de resistência a TBRFV é heterozigótico ou homozigótico presente no genoma da dita planta.

9. Planta, de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 8, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências genômicas são heterozigóticas ou homozigóticas presentes no genoma da dita planta.

10. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita uma ou mais sequências genômicas são como encontrado no número de acesso de depósito NCIMB 43279.

11. Planta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o gene de resistência a TBRFV é como encontrado no número de acesso de depósito NCIMB 43279.

12. Plantas, partes de plantas, tecidos, células e/ou sementes derivadas de uma planta caracterizadas pelo fato de que são conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. Gene de resistência para fornecer resistência a um Tobamovirus em uma planta S. lycopersicum, em que o dito gene de resistência é caracterizado pelo fato de que é representado por uma sequência de codificação que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de nucleotídeos com a SEQ ID NO.115.

14. Sequência genômica para fornecer resistência a um Tobamovirus em uma planta S. lycopersicum, em que a sequência genômica é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO.5, SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9, SEQ ID NO.10, SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.12, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.16, SEQ ID NO.17 e SEQ ID NO.18, ou que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das ditas SEQ ID NOs.

15. Locus de resistência para fornecer resistência a um Tobamovirus em uma planta S. lycopersicum, em que o locus é caracterizado pelo fato de que é representado por SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 ou SEQ ID NO.4, preferencialmente SEQ ID NO. 3

16. Gene de resistência, sequência genômica ou locus, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o Tobamovirus é TBRFV.

17. Método para fornecer uma planta da espécie S. lycopersicum que é resistente a Tobamovirus, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) selecionar uma planta S. habrochaites que é resistente a Tobamovirus, em que a dita seleção compreende o estabelecimento da presença de um gene de resistência, sequência genômica ou locus de resistência, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 16, de preferência, o dito gene de resistência b) transferir, por exemplo, por meio de cruzamento, o gene de resistência, sequência genômica ou locus identificado da etapa a) para uma planta S. lycopersicum, conferindo assim resistência ao Tobamovirus à dita planta S. lycopersicum.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que, após a etapa b), uma primeira planta S. lycopersicum é selecionada que é resistente a Tobamovirus e é cruzada com uma segunda planta S. lycopersicum que não é resistente a Tobamovirus, e subsequentemente selecionando uma planta S. lycopersicum que é resistente a Tobamovirus.

19. Método, de acordo com as reivindicações 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que na etapa a) estabelecer a presença do gene de resistência, a sequência genômica que confere resistência ou locus de resistência em uma planta S. habrochiates é realizada por um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111 e SEQ ID NO. 112, preferencialmente SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111 e SEQ ID NO. 112.

20. Uso de um marcador para estabelecer a presença de um gene de resistência a TBRFV, sequência genômica que confere resistência ou locus de resistência, conforme definido na reivindicação 13 a 16, em uma planta S. lycopersicum, caracterizado pelo fato de que o marcador é um ou mais selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111 e SEQ ID NO. 112, preferencialmente SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111 e SEQ ID NO. 112.