BR112021007593A2 - método para prevenir ou tratar a infecção de espécies de plantas por patógenos fúngicos e kit - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA PREVENIR OU TRATAR A INFECÇÃO DE ESPÉCIES DE PLANTAS POR PATÓGENOS FÚNGICOS E KIT. A presente invenção prove um método para prevenir e/ou tratar infecção de espécies de planta por fungos causadores do mofo, bactérias e/ou patógenos virais, sendo que dito método compreende as etapas de (a prover uma mistura de um ou mais bactérias não-patogênicas e um ou mais agentes ativadores, e (b) administrar a mistura da etapa (a) à referida espécie de planta, por meio de ambos (i) adicionar uma pluralidade de grânulos revestidos com dita mistura ao meio no qual dita planta está crescendo, e (ii) aplicar uma pulverização foliar compreendendo dita mistura às partes aéreas da referida espécie de planta.

Description

“MÉTODO PARA PREVENIR OU TRATAR A INFECÇÃO DE ESPÉCIES DE PLANTAS POR PATÓGENOS FÚNGICOS E KIT” Campo da invenção
[0001] A presente invenção refere-se a um método melhorado de proteção de espécies de plantas contra ataques patogênicos. Mais especificamente, a presente invenção fornece um método pelo qual uma composição protetora é administrada por duas rotas diferentes. Antecedentes da invenção
[0002] O uso de bactérias não-patogênicas do solo para proteger plantas e outras espécies hospedeiras de interesse agrícola e hortícola contra o ataque de bactérias e fungos é bem conhecido na técnica. Um exemplo de uma espécie bacteriana não patogênica usada em tais sistemas é Bacillus subtilis.
[0003] O pedido de patente internacional co-propriedade PCT/IL2017/051038 (publicado como WO 2018/051344) divulga uma composição e método para proteger espécies vegetais e animais, em que a composição compreende uma mistura de uma espécie bacteriana não patogênica (de preferência B. subtilis) um ou mais agentes ativadores (preferencialmente compostos com altos níveis de atividade anti-inflamatória). Os dois componentes desta mistura agem juntos sinergicamente, aumentando assim as atividades antibacteriana, antiviral e antifúngica que são observadas com qualquer um dos componentes isoladamente.
[0004] No entanto, os presentes inventores descobriram agora que o efeito protetor de alto nível causado pelo fornecimento da composição sinérgica acima mencionada pode ser significativamente aumentado por meio do uso de um método melhorado de distribuição de composição. Sumário da invenção
[0005] A presente invenção é primariamente dirigida a um método melhorado para aumentar a capacidade de uma espécie hospedeira de planta ou animal para resistir aos danos causados por patógenos fúngicos, bacterianos e/ou virais e/ou por outros patógenos, tais como organismos formadores de mofo. Em particular, este aspecto da invenção é dirigido a um método para prevenir e/ou tratar a infecção de espécies de plantas por patógenos fúngicos, causadores de mofo, patógenos bacterianos e/ou virais. Na sua forma mais geral, este método compreende as etapas de: (a) prover uma mistura de uma ou mais bactérias não patogênicas e um ou mais agentes ativadores; e (b) administrar a mistura da etapa (a) às referidas espécies de plantas, por meio de ambos: (i) adicionar uma pluralidade de grânulos ou outras formulações contendo ou revestidas com a referida mistura ao meio no qual a referida planta está crescendo; e (ii) aplicar um pulverizante (“spray”) foliar compreendendo a referida mistura às partes aéreas das referidas espécies de plantas.
[0006] Em uma concretização, a mistura da etapa (a) que é adicionada ao meio de crescimento da planta na etapa (b) (i) está contida dentro e/ou na superfície de uma pluralidade de grânulos.
[0007] Em uma concretização altamente preferida, as bactérias não patogênicas são bactérias da espécie Bacillus subtilis. Uma cepa particularmente preferida de B. subtilis é a cepa QST 713.
[0008] Embora muitos agentes ativadores diferentes possam ser usados, em particular agentes com certas propriedades anti-inflamatórias (como descrito em co-propriedade WO 2018/051344), Assim, em uma concretização, o um ou mais agentes ativadores são substâncias com atividade anti- inflamatória em uma concretização preferida do presente método, o um ou mais agentes de ativação são selecionados do grupo consistindo de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de esteviol e canabidiol.
[0009] Numa forma de realização particularmente preferida deste método, os agentes de ativação compreendem uma mistura de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de esteviol e canabidiol.
[0010] Embora o método presentemente descrito possa ser empregado a fim de tratar ou prevenir doenças de plantas causadas por muitos agentes patogênicos diferentes, em uma concretização preferida, a infecção da espécie de planta a ser prevenida e/ou tratada é causada por um patógeno causador de mofo. Exemplos de tais patógenos causadores de mofo incluem (mas não estão limitados a) organismos do gênero Peronospora. Esses são organismos pertencentes à classe dos Oomycetes, e eles (e as lesões que eles causam nos tecidos das plantas) são comumente conhecidos como mofo. Em termos gerais, o mofo é uma forma de fungo que frequentemente tem a aparência de um crescimento fino e superficial, consistindo de hifas diminutas na superfície das folhas. Na horticultura, o mofo é geralmente uma espécie de fungo da ordem Erysiphales ou organismos semelhantes a fungos da família Peronosporaceae. Outro exemplo de agente causador de mofo é o Plasmopara viticola, responsável pelo mofo na videira.
[0011] Em algumas outras concretizações do método presentemente descrito, o referido método compreende ainda a administração foliar de um ou mais agentes bactericidas, viricidas, fungicidas e/ou herbicidas às espécies de plantas. Em uma concretização preferida, os agentes adicionais são um ou mais agentes fungicidas. Exemplos não limitativos de agentes fungicidas adequados são dados a seguir.
[0012] Em outro aspecto, a presente invenção também provê um kit para uso no método definido acima, compreendendo: (a) um primeiro recipiente contendo grânulos ou outras formulações contendo ou revestidas com uma mistura de uma ou mais bactérias não patogênicas e uma ou mais bactérias ativadoras agentes; e (b) um segundo recipiente contendo uma composição líquida adequada para administração por pulverização foliar, compreendendo uma ou mais bactérias não patogênicas e um ou mais agentes ativadores.
[0013] Em uma concretização, a mistura de bactérias e agentes de ativação no primeiro recipiente está presente dentro e/ou na superfície de uma pluralidade de grânulos.
[0014] Em uma concretização preferida do kit da presente invenção, as bactérias não patogênicas são bactérias da espécie Bacillus subtilis.
[0015] Em uma forma de realização preferida do kit da presente invenção, o um ou mais agentes de ativação são selecionados do grupo que consiste em Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de esteviol e canabidiol.
[0016] Em uma modalidade preferida do kit da presente invenção, as bactérias não-patogênicas são a cepa QST 713 da espécie Bacillus subtilis, e os agentes ativadores compreendem uma mistura de Sclareol, Naringina, Nootkatona, glicosídeo de esteviol e canabidiol. Breve descrição dos desenhos
[0017] A Fig. 1 é uma fotografia que mostra o aparecimento de mofo em folhas de plantas de pepino tratadas com grânulos contendo o tratamento de combinação, mas não tratadas com pulverização foliar.
[0018] A Fig. 2 é uma fotografia que mostra o aparecimento de mofo nas folhas da planta do pepino no grupo de controle negativo (sem tratamento algum).
[0019] A Fig. 3 é uma fotografia que mostra a aparência das folhas da planta do pepino que receberam o tratamento de combinação da presente invenção apenas por pulverização foliar.
[0020] A Fig. 4 é uma fotografia que mostra a aparência das folhas da planta do pepino que receberam o tratamento de combinação da presente invenção tanto como grânulos quanto como um pulverizante foliar. Descrição detalhada da invenção
[0021] Conforme descrito acima, a presente invenção é principalmente dirigida a um método para aumentar a capacidade de uma espécie hospedeira de planta ou animal para resistir aos danos causados por patógenos fúngicos, bactérias e/ou patógenos virais e/ou por outros patógenos, tais como organismos formadores de mofo, compreendendo as etapas de: (a) prover uma mistura de uma ou mais bactérias não patogênicas e um ou mais agentes ativadores; e (b) administrar a mistura da etapa (a) às referidas espécies de plantas, por meio de ambos: (i) adicionar uma pluralidade de grânulos revestidos com a referida mistura ao meio em que a referida planta está crescendo (isto é, solo ou outro meio de crescimento); e (ii) aplicar um pulverizante foliar compreendendo a referida mistura às partes aéreas das referidas espécies de plantas.
[0022] Em outras palavras, uma característica chave da presente invenção é a administração da mistura de bactérias e agente de ativação por duas rotas separadas (ou seja, (i) pulverizante foliar, e (ii) grânulos ou outras formulações adicionadas ao solo ou outro meio de crescimento).
[0023] Em certos casos, os dois componentes mencionados na etapa (a) do método definido acima (ou seja, as bactérias não patogênicas e o(s) agente(s) de ativação) podem ser administrados separadamente.
[0024] No contexto da presente invenção, o termo "agente de ativação" é usado para denotar uma substância que, quando presente em uma mistura junto com as bactérias não patogênicas ou quando administrada separadamente das mesmas, é capaz de aumentar os efeitos benéficos das referidas células bacterianas patogênicas nas espécies hospedeiras de plantas ou animais tratadas. Esse aumento pode, em alguns casos, ser resultado de uma interação sinérgica entre as bactérias não patogênicas e os agentes ativadores. Em alternativa, os agentes ativadores e as bactérias não patogênicas podem ser desprovidos de qualquer efeito benéfico significativo no hospedeiro quando usados sozinhos, mas podem causar efeitos antimicrobianos, imunoestimuladores e/ou outros efeitos benéficos significativos na espécie hospedeira quando as duas classes de substâncias são administradas juntas ou consecutivamente.
[0025] Conforme relatado em co-propriedade WO 2018/051344,
muitos dos agentes de ativação adequados para uso no método da presente invenção compartilham uma característica comum, nomeadamente a sua capacidade de inibir mediadores inflamatórios que estão mais geralmente associados a espécies animais superiores (tais como Fator de necrose tumoral alfa [TNF-α]) em vez de espécies de plantas. Assim, em uma modalidade preferida da presente invenção, o um ou mais agentes ativadores são substâncias com atividade anti- inflamatória.
[0026] Como mencionado, foi descoberto pelos presentes inventores que a atividade anti-inflamatória acima mencionada, que está associada aos agentes de ativação da presente invenção é mediada, pelo menos em parte, pela inibição de um ou mais mediadores inflamatórios chave, como TNF-α e/ou óxido nítrico (NO). Consequentemente, em uma modalidade preferida da presente invenção, o um ou mais agentes ativadores usados no método acima mencionado são substâncias capazes de inibir a produção de NO e/ou TNF-α.
[0027] Em outra concretização preferida da presente invenção, os agentes de ativação têm, cada um, um IC50 para a inibição da produção de NO inferior a 1,5 mg/ml e/ou um IC50 para a inibição da produção de TNF-α inferior a 2,5 mg/mL.
[0028] Em outra concretização preferida, cada agente de ativação individual (seja usado sozinho ou em combinação com outros tais agentes) tem um IC50 para a inibição da produção de NO inferior a 0,1 mg/ml e/ou um IC50 para a inibição da produção de TNF-α inferior a 0,2 mg/ml.
[0029] Em ainda outra concretização preferida, cada agente de ativação individual (seja usado sozinho ou em combinação com outros tais agentes) tem um IC50 para a inibição da produção de NO inferior a 0,05 mg/ml e/ou um IC50 para a inibição de TNF-α produção inferior a 0,1 mg/ml.
[0030] Deve-se notar que o uso do valor IC50 (ou seja, a concentração de um agente que causa 50% da inibição máxima de um mediador, agonista ou outra molécula biologicamente ativa) como um meio para comparar a potência de antagonistas e de outras moléculas biologicamente ativas - e moléculas farmacologicamente ativas, que é bem conhecido de todos os técnicos no assunto. Resumidamente, os valores de IC50 podem ser obtidos traçando curvas de dose-resposta para um parâmetro como a inibição de um mediador inflamatório particular e extraindo os referidos valores das referidas curvas.
[0031] Em outra concretização preferida, os agentes de ativação são selecionados a partir do grupo que consiste em Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de esteviol e canabidiol e suas combinações.
[0032] Em ainda outra concretização preferida, os agentes de ativação (incluindo aquelas com as propriedades anti- inflamatórias qualitativas e quantitativas descritas acima) são derivados de material vegetal (como extratos vegetais brutos, como extratos aquosos de plantas inteiras, extratos parcialmente purificados ou fracionados, extratos purificados e análogos sintéticos de moléculas ativas presentes nos referidos extratos).
[0033] Em uma modalidade preferida deste aspecto da invenção, os agentes de ativação derivados de plantas são extratos de ervas selecionados a partir do grupo que consiste em Aster tataricus, Cyperus rotundus e suas combinações.
[0034] Em uma concretização preferida, a espécie hospedeira
(ou seja, a espécie alvo em que o método atualmente descrito é usado para prevenir e/ou tratar a infecção) é uma espécie de planta, incluindo (mas não se limitando a) vegetais, leguminosas, grãos, espécies tropicais como bananas), espécies subtropicais (como frutas cítricas), outras árvores e arbustos, plantas com flores de interesse hortícola e assim por diante.
[0035] Foi descrito acima que em algumas implementações dos vários métodos da presente invenção, as bactérias não patogênicas e os agentes de ativação podem ser administrados separadamente, ou seja, um após o outro. Em tais implementações, a primeira composição a ser administrada pode ser a composição que compreende as bactérias não patogênicas ou a composição que compreende um ou mais agentes de ativação. Em certas outras concretizações do tipo em que as bactérias não patogênicas e os agentes de ativação são administrados separadamente, ambos são administrados à espécie hospedeira aproximadamente ao mesmo tempo.
[0036] Numa forma de realização preferida, os grânulos usados no presente método são grânulos de Perlite que foram revestidos com as substâncias a serem administradas. Em alguns casos, esses grânulos podem compreender ainda um polímero de controle de liberação, que geralmente está presente como um revestimento externo na superfície do grânulo.
[0037] Em algumas concretizações, a mistura da etapa (a) no método definido acima é administrada aos organismos hospedeiros a serem tratados de maneira contínua, por períodos entre algumas horas e cerca de 180 dias.
[0038] Quando o método de emulsão é usado, o período de tratamento é geralmente de algumas horas e um segundo tratamento pode ser administrado após cerca de 10 dias.
[0039] Quando uma membrana de liberação controlada ou substrato é usado, o tratamento levará cerca de 180 dias. O substrato de liberação controlada pode ser de vários tipos diferentes. Numa forma de realização preferida, este substrato é formado em grânulos, tais como grânulos de Perlite, como são bem conhecidos do técnico no assunto. Outras opções para substratos de liberação controlada incluem vários grânulos, grânulos, micro-grânulos, fibras com capacidade de absorção de água acima de 1:15 em relação ao seu peso seco. A fim de alcançar as características de liberação controlada desejadas, os substratos podem ser revestidos com cera, Ethocel, outros polímeros de controle de liberação (como bem conhecidos nos campos agrícola, pesticida e farmacêutico) e óleos vegetais.
[0040] Em uma concretização preferida, tanto a formulação de grânulos quanto a formulação de pulverização foliar líquida podem compreender ainda um ou mais componentes adicionais, incluindo agentes penetrantes, estabilizadores, solventes, sequestrantes, emulsificantes e agentes de controle de liberação (por exemplo, liberação lenta).
[0041] Exemplos de agentes de penetração adequados - solventes polares apróticos DMSO, DMSO-d6, Dimetilformamida (DUF).
[0042] Exemplos de surfactantes não iônicos adequados incluem Triton X-100, Tergitol 15-S-3, 15-S-5, 15-S-7.
[0043] Exemplos de sequestrantes adequados incluem fosfatos de sódio, gluconato de sódio, cloreto de cálcio, gluconato de potássio.
[0044] Exemplos de emulsificantes incluem polialdo-l0-6-O, E-471, E-475 e E-476.
[0045] Exemplos de agentes de liberação controlada incluem revestimentos compreendendo diciclopentadieno e óleo de linhaça ou um alquídico de óleo de soja (por exemplo, a composição de revestimento comercialmente disponível, vendida sob a marca registrada "Osmocote®" e distribuída por ICL Specialty Fertilizers, Israel, e descrito em US 4.657.576), e o polímero E603 que pode ser obtido na Sekisui Specialty Chemicals, Japan.
[0046] Claro, os componentes adicionais listados acima são fornecidos apenas para fins de ilustração, e muitos outros aditivos e excipientes diferentes também podem ser incluídos nas composições aqui descritas.
[0047] Deve-se notar que em algumas das concretizações preferidas da presente invenção, a mistura de agentes de ativação inclui substâncias hidrofílicas e hidrofóbicas. Como resultado, é em muitos casos necessário preparar a composição como uma mistura emulsionada de dois componentes separados: uma porção aquosa contendo os agentes mais solúveis em água dissolvidos em água e uma porção hidrofóbica contendo os agentes menos solúveis em água dissolvidos em gordura ácidos, triglicerídeos de cadeia média, etanol, outros solventes e suas combinações.
[0048] Conforme mencionado acima, no contexto do método presentemente descrito, em algumas outras concretizações, o referido método compreende ainda a administração foliar de um ou mais agentes bactericidas, viricidas, fungicidas e/ou herbicidas às espécies de plantas. Geralmente, os referidos agentes adicionais são administrados por pulverização foliar separadamente da pulverização foliar contendo a mistura de bactérias não-patogênicas e agentes ativadores descritos acima. Em um conjunto particular de concretizações, o método compreende a administração foliar de uma ou mais substâncias com atividade fungicida.
[0049] Muitos tipos diferentes de agentes fungicidas podem ser administrados como parte da modalidade da invenção descrita imediatamente acima. A lista parcial a seguir fornece exemplos de grupos adequados de agentes fungicidas, bem como exemplos específicos não limitantes de tais agentes:
[0050] Um fungicida de estrobilurina, como azoxistrobina, dimoxistrobina, fluoxastrobina, cresoxim-metil, metominostrobina, orisastrobina, picoxistrobina, piraclostrobina, trifloxistrobina, cizofamida; um fungicida azol, como azaconazol, bromuconazol, ciproconazol, difenoconazol, diniconazol, diniconazol-M, epoxiconazol, fenbuconazol, fluquinconazol, flusilazol, flutriafol, hexaconazol, imazalazol, penconazol, imibenazol, metoconazol, metoconazol, peiconazol, oxoconazol, peiconazol, propiconazol, protioconazol, simeconazol, tebuconazol, tetraconazol, triadimefon, triadimenol, triflumizol, triticonazol, diclobutrazol, etaconazol, furconazol, furconazol-cis e quinconazol; um fungicida fenilpirrol, como fenpiclonil e fludioxonil; um fungicida anilino-pirimidina, como ciprodinil, mepanipirim e pirimetanil; um fungicida morfolina, tal como aldimorfo, dimetimorfo, dodemorfo, fenpropimorfo, tridemorfo, fenpropidina, espiroxamina; piperalina, clorotalonil; famoxadona; fenamidona; benalaxil; benalaxil-M; benomil; bitertanol; boscalid; carboxina; carpropamida; cobre (diversos sais); carbonato de cobre e amônio; octanoato de cobre; oleato de cobre; sulfato de cobre; hidróxido de cobre; captana, ciazofamida; cimoxanil; diethofencarb; ditianon; fenhexamida; fenoxicarbe; fluazinam; flutolanil; folpete; fosetil-AI, guazatina; hymexazole; iprodione; mancozeb; metalaxil; mefenoxam; metrafenona; nuarimol; paclobutrazol; pencicuron; pentiopirade; procimidona; piroquilon; quinoxifeno; siltiofam; enxofre; tiabendazol; tirame; triazoxido; triciclazol; proquinazida; captan; trinexapac-etil; cloreto de clormequat; ethephon; e acibenzolar-5-metil; óleos minerais e suas formulações com atividade fungicida, por exemplo, EnsprayTM 99 da SK; e óleos essenciais e suas formulações, por exemplo, óleo da árvore do chá, TimorexTM e TimorexTM Gold.
[0051] Em algumas das concretizações em que um agente fungicida é dado por pulverização foliar, uma interação sinérgica é vista entre o referido agente fungicida e as bactérias não patogênicas e/ou agentes ativadores administrados às plantas nas formas de grânulos e um foliar administrado separadamente spray.
[0052] A presente invenção será agora ilustrada com referência ao seguinte exemplo de trabalho não limitativo e figuras anexas. Exemplo Materiais e métodos gerais:
1. Bactéria não patogênica Bacillus subtilis
[0053] Para os propósitos dos estudos aqui relatados, foi usada a cepa Q.ST 713 comercialmente disponível. Esta cepa foi obtida da Bayer Corporation em duas formulações diferentes: (1) Serenade® ASO; e (2) Cease®.
2. Ativando agentes
[0054] Os seguintes fitoquímicos foram selecionados para uso como agentes ativadores juntamente com B. subtilis no tratamento de combinação usado no estudo relatado abaixo:
1. Sclareol - álcool di-terpênico extraído da Salvia sclarea.
2. Naringina - flavanona-7-O-glicosídeo extraído da casca da toranja.
3. Nootkatona - sesquiterpeno - extraído da casca da laranja.
4. Glicosídeo de esteviol - extraído de Stevia rebaudiana.
5. CBD – canabidiol – extraído de maconha Exemplo 1 Administração as plantas de pepino por duas rotas (grânulos e pulverização foliar) em comparação com a administração por apenas uma rota Introdução:
[0055] O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do uso de duas rotas distintas de administração de uma combinação de B. subtilis e uma mistura de agentes de ativação anti-inflamatórios. Conforme descrito em co- propriedade WO 2018/051344, esta combinação (referida a seguir como o "tratamento de combinação" ou semelhante) é altamente eficaz na prevenção de espécies de plantas contra infecção com uma variedade de patógenos bacterianos, virais e fúngicos. As diferentes rotas de administração comparadas foram: (i) grânulos adicionados ao solo; (ii) pulverização foliar; e (iii) grânulos e pulverização foliar em combinação. Os efeitos da escolha da rota de administração foram medidos em um estudo de campo, no qual foram registrados os níveis de contaminação por mofo (com espécies de Peronospora) em plantas de pepino, bem como a produção de frutos de pepino dessas plantas. Além de comparar o efeito da rota de administração, o efeito da co-presença de vários agentes antifúngicos também foi testado. Materiais e métodos:
[0056] O pepino baby, variedade C2-16-338, foi plantado em um túnel de malha de 50, 36m de comprimento e 9 m de largura.
[0057] As plantas foram transplantadas em uma alta densidade de 6.000 plantas por 1.000 metros quadrados. Dia de semeadura: 23.8.2018 Dia de plantio: 2.9.2018
[0058] As plantas foram irrigadas com gotejamento de 1,6L e fertilizadas com NPK 7:3:7 a 2L/metro cúbico.
[0059] Vários agentes fungicidas diferentes (conforme descrito abaixo) foram aplicados em uma pulverização foliar nas datas seguintes, usando um volume de pulverização de 20 L/1000 m2.
1. 23.8.18
2. 2.9.18
3. 16.9.18
[0060] Vários regimes de tratamento foram usados a fim de comparar o efeito da administração do tratamento de combinação por meio de várias rotas de administração, com/sem fungicidas comerciais. Em cada caso (com exceção do controle, tratamento nº 2), tanto os grânulos quanto a pulverização foliar (quando usado) continham o tratamento combinado (ou seja, a combinação) de B. subtilis e os agentes ativadores. Os regimes usados foram os seguintes: # Tratamentos Combinação Combinação Fungicida ConcentraçãoReplicações de de (adminsitrado tratamento tratamento em em em pulverização grânulos Pulverização foliar) foliar 1 ✓ ✓ x 2kg/Dunam 6 2 X X (Controle) X (Controle) - 6 (Controle) 3 ✓ ✓ 722 g/l 0,25% 6 Propamocarb (Dynon) 4 X ✓ 722 g/l 0,25% 6 Propamocarb (Dynon) 5 ✓ ✓ Manzidan 250g/Dunam 6 6 X ✓ Manzidan 250g/Dunam 6 7 ✓ ✓ Rodeo 480 g/l 250 g/Dunam 6 Mefenoxam 8 X ✓ Rodeo 480 g/l 24 cm3/Dunam 6 Mefenoxam 9 ✓ ✓ x 0,05 6 10 x ✓ x 0,05 6
[0061] O tamanho da população: 40 plantas por repetição.
[0062] Conforme mostrado na tabela acima, os vários tratamentos de teste foram organizados em pares; no tratamento de número ímpar em cada par (por exemplo, no. 3, 5, etc.), o tratamento de combinação foi administrado em grânulos e na pulverização foliar. O tratamento de número par em cada par, (nos. 4, 6 etc.), era o mesmo que seu parceiro de número ímpar, com a exceção de que o tratamento de combinação estava presente apenas nos grânulos (e não na pulverização foliar). Preparação do grânulo:
[0063] Os grânulos de Perlite foram embebidos com uma solução líquida contendo o tratamento de combinação a 1,5 litros por grânulos de 1 kg.
[0064] Os grânulos embebidos foram secos e depois embebidos novamente com 1,5 litros por 1 kg e secos mais uma vez.
[0065] A solução líquida (tratamento de combinação) em que os grânulos foram embebidos continha os seguintes agentes:
1. Agente de ativação Emulsão P 91 (veja abaixo) - 1/20 do volume do líquido.
2. Bacillus subtilis (Serenata) 3% V/V
3. Calirus - 1% V/V
[0066] A composição da Emulsão P 91 é a seguinte:
Ingredientes Por 1 litro, g Peso, g % Fase oleosa 3 8,00 0,8% Fase oleosa 5 8,00 0,8% Fase oleosa 7 8,00 0,8% Fase oleosa Giralec HE-60 50,00 50 5,00% (lecitina) Fase oleosa MCT 80,00 80 8,00% Fase oleosa Soma da fase 154,00 15,40% oleosa Fase aquosa PS 750 22,00 20 2,20% Fase aquosa 4 8,00 0,80% Fase aquosa 6 14,00 1,40% Fase aquosa Água 20,00% Fase aquosa Glycerol 60,20% 24,40% Emulsão 1000 100,00% Ingrediente 4,60% ativo %
[0067] A emulsão foi preparada usando um misturador de alto cisalhamento ajustado para tamanho de gota 214.
[0068] Os ingredientes da emulsão numerados listados na tabela acima se referem aos cinco agentes ativadores: 3 - Sclareol 98% 4 - Naringin 98% 5 - Nootkatona 98% 6 - Steviol 90% 7 - Óleo de maconha Resultados e discussão:
[0069] No primeiro conjunto de resultados foi realizada uma avaliação do grau em que as plantas de pepino foram atacadas por organismos do gênero Peronospora. Esses são organismos pertencentes à classe dos Oomycetes, e eles (e as lesões que eles causam nos tecidos das plantas) são comumente conhecidos como mofo. Este tipo de mofo é caracterizado por apresentar sintomas iniciais que incluem grandes áreas amarelas visíveis na superfície superior da folha. Conforme as lesões envelhecem e amadurecem, elas se expandem rapidamente e tornam-se marrons.
[0070] O aparecimento deste mofo nas folhas retiradas do grupo de plantas do tratamento 1 (grânulos contendo o tratamento de combinação; sem pulverização foliar) em três pontos de tempo é mostrado na Fig. 1. Nesta figura, a presença de um pequeno número de lesões amarelas discretas pode ser vista na fotografia superior, que foi tirada em 17 de setembro de 2018. Um aumento no número de lesões amarelas discretas pode ser visto na fotografia do meio (23 de setembro de 2018), enquanto um aumento acentuado no número e tamanho das lesões (que começaram a coalescer) é observado na fotografia inferior (26 de setembro de 2018).
[0071] A título de comparação, as fotografias das plantas do grupo de tratamento 2 (controle negativo; nenhum tratamento) são mostradas na Fig. 2. Nesse caso, é claro que em todos os três momentos (17 de setembro, 23 de setembro e 26 de setembro; de cima para baixo), o grau de infecção é muito maior do que visto com o tratamento apenas de grânulos administrado às plantas mostradas na Fig. 1. Isso é em relação ao número de lesões discretas, o grau de coalescência das referidas lesões, e o fato de que no segundo e terceiro pontos de tempo, uma série de lesões de cor marrom mais avançada foram observadas.
[0072] A Fig. 3 apresenta os resultados comparáveis para o grupo de plantas do tratamento 10, que foram as plantas que receberam o tratamento de combinação apenas por pulverização foliar. Será notado que os resultados deste tratamento são muito semelhantes aos observados no tratamento apenas com grânulos mostrado na Fig. 1. O número total de lesões, a coloração e o grau de coalescência são muito semelhantes em ambos os grupos de tratamento.
[0073] A Fig. 4 mostra os resultados nos mesmos três pontos temporais para o grupo de tratamento 9 (tratamento de combinação administrado como grânulos e como pulverização foliar). É muito claro pelas fotografias desta figura que esta combinação de duas rotas de administração causou um aumento dramático na proteção conferida pelo tratamento à infecção por organismos formadores de míldio. Assim, no primeiro momento (17 de setembro de 2018; foto superior), há apenas um número muito pequeno de lesões amarelas discretas de tamanho muito pequeno. Mesmo no último ponto temporal (26 de setembro, foto inferior), ainda é visto apenas um número muito pequeno de lesões, que não progrediram além do estágio inicial de desenvolvimento da lesão.
[0074] Para quantificar os resultados do número de lesões observadas em cada tratamento, os números reais contados foram expressos como número médio por folha e número médio por planta. Esses valores são mostrados na tabela a seguir, que apresenta os resultados para os vários grupos de tratamento em ordem crescente de eficácia no que diz respeito à prevenção da formação de mofo:
No. Rx Detalhes do Rx % de % de inoculação inoculação (media por (media por folha) planta) 2 Controle não tratado 66 55 1 Grânulos do viveiro 60 51 (Magen) 2kg/Dunam 8 (Rodeo) Mefonoxam 480 58 50 g/l, 25 cm3/d 10 Emulsão Foliar 0,05% 55 48 3 Grânulos do viveiro 47 43 (Magem) + (Dynone) Propamocarb 722 g/l, SL 0,25% 4 (Dynone) Propamocarb 44 41 722 g/l, SL 0,25% 6 (Manzidan) Mancozeb 750 38 40 G.R. 250 g/d 7 Grânulos no viveiro 19 24 (Magen)+(Rodeo) Mefenoxam 480 g/l, SL 25 cm3/d 9 Grânulos no viv~erio 9 14 (Magen)+emulsão foliar 0,05% 5 Grânulos no viveiro 6 11 (Magen)+(Manzidan) Mancozeb 750 G.R. 250 g/d
[0075] Pode ser visto a partir desta tabela que, como discutido acima com referência às figuras, tanto o tratamento de grânulos apenas (grupo de tratamento 1) e a pulverização foliar apenas (grupo de tratamento 10) proporcionaram às plantas um certo grau de proteção contra a formação de mofo. No entanto, efeitos inibitórios significativamente maiores foram observados com alguns dos outros tratamentos, particularmente o grânulo de tratamento duplo e pulverização foliar (tratamento 9) e o mesmo tratamento duplo com a adição do fungicida disponível comercialmente, Mancozeb (tratamento 5).
[0076] Em vista do número muito reduzido de lesões vistas no grânulo de tratamento duplo e grupo de pulverização foliar (tratamento 9), quando comparado com tratamentos apenas de grânulo ou pulverização foliar (grupos 1 e 10, respectivamente), esses resultados são altamente sugestivos de uma interação sinérgica entre os dois modos diferentes de administração em combinação.
[0077] No segundo conjunto de resultados, foi feita uma avaliação do rendimento do pepino em cada grupo de tratamento e resumida na tabela a seguir:
Dia 2,9 4,9 6,9 7,9 9,9 11,9 13,9 14,9 16,9 18,9 20,9 21,9 23,9 25,9 Dados Rend. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Total Tratamento 1 4,7 9,2 4,5 4,9 5,2 7,2 15,4 4,54 16,5 21,9 22,2 6,62 19,5 11,9 154,18 2 2,2 4,1 2,1 4,35 3,5 6,9 10,7 5,28 17,2 15,7 19,3 4,3 15,1 9,42 120,1 3 4,6 8,7 4,1 4,8 5,5 7,6 14,3 2,81 14 17,9 23,8 5,48 11,4 11,9 136,82 4 3,5 7 3,2 2,88 4,5 6,9 8 5,98 13,1 16,5 13,5 4,29 15,8 12,9 118,09 5 4,9 0,1 4,5 5,83 5,6 7,5 10,2 4,85 15,3 18,5 20,5 5,08 24,5 14,6 150,74 6 3,4 6,9 3,1 5,2 4,5 7,1 7,7 5,88 9,68 13,7 23,7 5,5 10,6 9,1 115,96 7 4,5 9,1 4,4 5,8 5,5 7,2 11,7 3,52 16 19,5 14,6 4,8 14,2 23,2 143,95
23/27 8 3,6 6,2 3 5,3 4,7 5,8 8,9 3,1 12,1 12,7 17,4 4,53 13,9 8,91 110,18 9 4,9 10,3 4,6 7,46 5,9 8,7 15,4 2,87 10,2 15 14,1 3,97 10 12,6 125,99 10 3,7 5,5 3,5 5,4 5,1 7,2 11,7 4,88 11,4 14,1 16,7 4 10,4 9,03 112,52 Total 40 76 37 50 50 72 114 44 135 165 186 49 145 123 1286,9 Frutas 15 20 9 11 10 15 22 6 12 15 17 4,6 13 12 180,1 grandes
[0078] Como pode ser visto nesta tabela, todos os tratamentos contendo combinação de grânulos juntamente com a pulverização foliar (tratamentos 3, 5, 7, 9) resultaram em um rendimento de pepino significativamente maior em comparação com o mesmo tratamento sem os grânulos (tratamentos 4, 6, 8, 10).
[0079] Estes resultados fornecem assim uma confirmação adicional da eficácia muito aumentada do tratamento anti-mofo que é observada quando os grânulos contendo o tratamento de combinação são administrados juntamente com o tratamento de combinação administrado por pulverização foliar. Exemplo 2 Administração às plantas de videiras por duas rotas (grânulos e pulverização foliar) em comparação com a administração por apenas uma rota Introdução:
[0080] O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do uso de duas rotas distintas de administração de uma combinação de B. subtilis e uma mistura de agentes de ativação anti-inflamatórios. As diferentes rotas de administração comparadas foram: (i) grânulos adicionados ao solo; (ii) pulverização foliar; e (iii) grânulos e pulverização foliar em combinação.
[0081] Os efeitos da escolha da rota de administração foram medidos em um estudo de campo, no qual os níveis de contaminação por mofo (com espécie Plasmopara viticola) em videiras. Materiais e métodos:
[0082] As videiras (Vitis vinifera) com um ano de idade foram plantadas em uma mistura de solo de oleiro (40%) + areia (60%) em vasos individuais. Os vários regimes descritos abaixo foram usados para tratar quatro plantas replicadas.
[0083] Vários regimes de tratamento foram usados a fim de comparar o efeito da administração do tratamento de combinação por meio de várias rotas de administração, conforme descrito na tabela a seguir: # Tratamento Combinação Agente de B.subtilis Fungicida de ativação de (Serenade) (adminsitrado tratamentos emulsção em em em em grânulos pulverização pulverização pulverização foliar foliar foliar) 1 x x X x 3 ✓ 10g/pote X X x 6 ✓ 10g/pote ✓ 10 ml/l X x 7 ✓ 10g/pote ✓ 10 ml/l ✓ 4 ml/l x 8 X X ✓ 4ml/l x 9 x ✓ 10 ml/l x x
[0084] O estudo começou em 25 de julho de 2019 e, naquela época, grânulos contendo o tratamento de combinação (ou seja, a emulsão contendo os cinco agentes ativadores descritos acima na seção de materiais e métodos gerais e no Exemplo 1, em combinação com B. subtilis, como descritos acima nas mesmas seções) foram administrados ao solo na proximidade da planta em crescimento nos grupos de tratamento 3, 6 e 7 (como definido na tabela acima). Essa foi a única vez em que grânulos foram administrados às plantas.
[0085] Os vários tratamentos de pulverização foliar (emulsão de agente ativador sozinha, B. subtilis sozinha ou ambos juntos) foram administrados às plantas nos grupos de tratamento 6, 7, 8 e 9, quatro vezes, em intervalos de aproximadamente 10 dias, nas datas seguintes (todos no ano de 2019): 19 de agosto, 28 de agosto, 6 de setembro e 13 de setembro.
[0086] O grupo de tratamento 1 foi o grupo de controle negativo não-tratado. Resultados e discussão:
[0087] Em 24 de setembro de 2019, 30 folhas de cada grupo de tratamento foram amostradas, e a capacidade dos vários tratamentos para reduzir a severidade da infecção da praga (ou seja, Plasmopara viticola que infectou naturalmente as plantas durante seu crescimento) foi avaliada e medida como a porcentagem de lesões foliares observadas nas plantas de controle-negativo não-tratadas (grupo 1). Os resultados desta avaliação estão apresentados na seguinte tabela: # grupo de tratamento % de redução da tratamento severidade da praga 1 Controle negative 0 3 Grânulos apenas 55,7 6 Grânulos + emulsão 47,7 foliar 7 Grânulos + emulsão 71,5 foliar + B. subtilis foliar 8 Serenade Foliar ASO 52,5 apenas 9 Emulsão foliar 36,7 apenas
[0088] Pode-se observar nesta tabela que o tratamento com o agente ativador/B. Subtilis composição de combinação na forma de grânulos apenas (grupo de tratamento 3) proporcionou às plantas um certo grau de proteção contra a formação de mofo. Da mesma forma, o tratamento com os grânulos e pulverização de emulsão de agente ativador foliar (ou seja, sem B. subtilis foliar; grupo de tratamento 6), tratamento com pulverização de emulsão de agente ativador apenas (ou seja, sem B. subtilis foliar ou grânulos; grupo de tratamento 9) ou tratamento com foliar B. subtilis apenas (ou seja, sem grânulos ou tratamento foliar com agentes ativadores; grupo de tratamento 8), todos proporcionaram uma certa redução no grau de gravidade da infecção por mofo.
No entanto, um efeito inibitório significativamente maior foi observado quando a combinação dos agentes ativadores e B. subtilis foi administrada na forma de grânulos e como pulverização foliar (grupo de tratamento 7). Este resultado demonstra a superioridade do método da presente invenção, em relação aos métodos da técnica anterior envolvendo a administração de B. subtilis sozinho ou a administração de combinações de B. subtilis e agentes de ativação por uma única rota de administração.

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para prevenir ou tratar a infecção de espécies de plantas por patógenos fúngicos, causadores de míldio, bacterianos e/ou virais, caracterizado pelo fato de o referido método compreender as etapas de: (a) prover uma mistura de uma ou mais bactérias não- patogênicas e um ou mais agentes ativadores; e (b) administrar a mistura da etapa (a) às referidas espécies de plantas, por meio de ambos: (i) adicionar uma pluralidade de grânulos revestidos com a referida mistura ao meio no qual a referida planta está crescendo; e (ii) aplicar um pulverizante foliar compreendendo a referida mistura às partes aéreas das referidas espécies de plantas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de as bactérias não-patogênicas serem bactérias da espécie Bacillus subtilis.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de a cepa de Bacillus subtilis ser a cepa QST 713.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o um ou mais agentes ativadores serem substâncias com atividade anti-inflamatória.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de um ou mais agentes ativadores serem selecionados a partir do grupo que consiste em Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de esteviol e canabidiol.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de os agentes de ativação compreenderem uma mistura de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de esteviol e canabidiol.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a infecção da espécie de planta a ser prevenida e/ou tratada ser causada por um patógeno causador de míldio.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração foliar de um ou mais agentes bactericidas, viricidas, fungicidas e/ou herbicidas às espécies de plantas.
9. Kit, para uso no método para prevenir ou tratar a infecção de espécies de plantas por patógenos fúngicos, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de compreender: (a) um primeiro recipiente contendo grânulos revestidos com uma mistura de uma ou mais bactérias não patogênicas e um ou mais agentes ativadores; e (b) um segundo recipiente contendo uma composição líquida adequada para administração por pulverização foliar, compreendendo uma ou mais bactérias não-patogênicas e um ou mais agentes ativadores.
10. Kit, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de as bactérias não-patogênicas serem bactérias da espécie Bacillus subtilis.
11. Kit, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de um ou mais agentes ativadores serem selecionados a partir do grupo consistindo de Sclareol, Naringin, Nootkatona, Steviol glicosídeo e canabidiol.
12. Kit, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de as bactérias não patogênicas serem a cepa QST 713 da espécie Bacillus subtilis, e os agentes ativadores compreendem uma mistura de Sclareol, Naringin, Nootkatona, glicosídeo de esteviol e canabidiol.
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