BR112021007272A2 - novos meios para modular a toxicidade mediada pelo receptor nmda - Google Patents

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Abstract

Novos meios para modular a toxicidade mediada pelo receptor NMDA. A presente invenção refere-se ao campo dos processos neurodegenerativos e meios para fornecer proteção contra os referidos processos. Em particular, a presente invenção refere-se a polipeptídeos, proteínas de fusão e outros compostos que interagem com o domínio N-terminal do receptor de potencial transitório do tipo melastatina 4 (TRPM4), que são capazes de interferir na neurotoxicidade mediada pelo receptor NMDA. A presente invenção também se refere a ácidos nucleicos que codificam os supramencionados polipeptídios ou proteínas de fusão, composições que os compreendem e o uso dos referidos polipeptídios, proteínas de fusão e outros compostos em métodos para tratar o prevenir uma doença do corpo humano ou animal, por exemplo em um método de tratamento de doenças como a doença de Alzheimer (AD), esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington (HD) ou acidente vascular cerebral.

Description

Novos meios para modular a toxicidade mediada pelo receptor NMDA
[001] A presente invenção refere-se ao campo de processos neurodegenerativos e meios para fornecer proteção contra estes. Em particular, a presente invenção refere-se a polipeptídios, proteínas de fusão e outros compostos que interagem com o domínio N-terminal do receptor de potencial transitório do tipo melastatina 4 (TRPM4), que são capazes de interferir com a neurotoxicidade mediada pelo receptor NMDA. A presente invenção também se refere a ácidos nucleicos que codificam os supramencionados polipeptídios ou proteínas de fusão, composições compreendendo estes e o uso dos referidos polipeptídios, proteínas de fusão e outros compostos em métodos para tratar ou prevenir uma doença do corpo humano ou animal, por exemplo em um método para tratar doenças como a doença de Alzheimer (AD), esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington (HD) ou acidente vascular cerebral.
[002] As doenças neurodegenerativas são doenças devastadoras que envolvem a progressiva perda de estrutura ou função dos neurônios e eventual morte dos neurônios. A neurodegeneração pode ser aguda ou lentamente progressiva, mas ambos os tipos de neurodegeneração frequentemente envolvem aumento da sinalização de morte por receptores NMDA extra-sinápticos, causada por concentrações elevadas de glutamato extracelular ou relocalização de receptores NMDA para locais extra-sinápticos. Os receptores NMDA são canais iônicos de glutamato e voltagem fechados que são permeáveis ao cálcio. Eles podem ser categorizados de acordo com sua localização subcelular como receptores NMDA sinápticos e extra-sinápticos.
A composição da subunidade dos receptores dentro e fora dos contatos sinápticos é semelhante, embora, além de transportar a Subunidade 1 do Receptor NDMA de Glutamato Ionotrópico (GRIN1) comum, os receptores NMDA extra-sinápticos contêm preferencialmente a subunidade GRIN2B, enquanto a GRIN2A é a subunidade predominante em receptores NMDA sinápticos.
As consequências celulares da estimulação sináptica versus extra-sináptica do receptor NMDA são dramaticamente diferentes.
Os receptores NMDA sinápticos iniciam mudanças fisiológicas na eficácia da transmissão sináptica.
Eles também desencadeiam vias de sinalização de cálcio para o núcleo da célula que ativam respostas de expressão gênica críticas para a implementação a longo prazo de praticamente todas as adaptações comportamentais.
Ainda mais importante, os receptores NMDA sinápticos, agindo via cálcio nuclear, são fortes ativadores de genes protetores da estrutura neuronal e promotores da sobrevivência.
Em notável contraste, os receptores NMDA extra-sinápticos desencadeiam vias de morte celular.
Poucos minutos após a ativação dos receptores de NMDA extra-sinápticos, o potencial da membrana mitocondrial se quebra, seguido pela transição da permeabilidade mitocondrial.
Os receptores NMDA extra- sinápticos também antagonizam fortemente o acoplamento de excitação-transcrição e interrompem a adaptação genômica impulsionada pelo cálcio nuclear porque eles desencadeiam uma via de desligamento da proteína de ligação ao elemento responsiva (CREB) ao monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), inativam a sinalização da quinase extracelular regulada por sinal (ERK)–MAPK, e levam à importação nuclear de histonas desacetilases de classe IIa (HDACs) e o fator de transcrição pró-apoptótico Foxo3A. Isso afeta a regulação da atividade de muitos genes, incluindo o fator neurotrófico derivado do cérebro (bdnf) e fator de crescimento endotelial vascular D (vegfd), que são vitais para a manutenção da arquitetura dendrítica complexa e a conectividade sináptica, bem como o acúmulo de um escudo neuroprotetor. Adicionalmente, dado o curto alcance de ERK1/2 ativado, seu desligamento por receptores NMDA extra- sinápticos interrompe importantes eventos de sinalização locais, incluindo tradução de mRNA dendrítico e tráfego de receptores AMPA (ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazolpropiônico) que controlam a eficácia da transmissão sináptica. Deste modo, a sinalização do receptor NMDA extra-sináptico é caracterizada pelo início de uma tríade patológica com disfunção mitocondrial, desregulação da transcrição e perda de integridade das estruturas e conectividades neuronais.
[003] Várias tentativas têm sido feitas para usar bloqueadores de receptores NMDA para o tratamento de doenças neurológicas. Em geral, os resultados dos estudos clínicos foram decepcionantes em grande parte por causa dos graves efeitos colaterais causados pela interferência dos bloqueadores com a função fisiológica dos receptores NMDA localizados sinapticamente (Ogden e Traynelis, 2011). Uma notável exceção é a memantina, antagonista do receptor NMDA (Bormann, 1989). Efeitos benéficos de tratamentos de baixa dose com memantina foram observados em vários modelos animais de neurodegeneração, que incluem a doença de
Alzheimer (AD), a doença de Huntington (HD), esclerose lateral amiotrófica (ALS), e o modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) de MS (esclerose múltipla). Além disso, a memantina é aprovada desde 2002 pela Agência Europeia de Medicamentos e pela Administração de Alimentos e Medicamentos (FDA) dos Estados Unidos para o tratamento de AD. A descoberta de que a memantina em uma determinada faixa de concentração bloqueia preferencialmente os receptores NMDA extra-sinápticos tóxicos explica a razão pela qual ela é eficaz em uma ampla gama de condições neurodegenerativas que compartilham a sinalização do receptor NMDA extra-sináptico tóxico como um patomecanismo (Bading, J Exp Med. 2017 Mar 6;214(3):569- 578).
[004] Assim, meios de atenuar seletiva e especificamente a atividade tóxica dos receptores NMDA extra-sinápticos possuem grande potencial para o desenvolvimento de terapêuticas neuroprotetoras amplamente eficazes e bem toleradas, e ainda há, no estado da técnica, uma necessidade de tais novos meios. O problema a ser resolvido pela presente invenção era, consequentemente, o de fornecer novos meios para atenuar atividade extra- sináptica tóxica do receptor NMDA, permitindo assim um tratamento melhorado (uma vez que é preferencialmente mais seletivo) de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer (AD), esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington (HD), ou acidente vascular cerebral.
[005] Tal problema é resolvido pelo objeto conforme estabelecido nas reivindicações anexas e na descrição abaixo.
[006] Os inventores da presente invenção descobriram surpreendentemente que a toxicidade mediada pelo receptor NMDA pode ser seletivamente inibida sem impacto significativo na sinalização NMDA sináptica. Os compostos para uso da invenção imitam uma porção do domínio N- terminal do receptor de potencial transitório do tipo melastatina 4 (TRPM4), ou ligam-se a e/ou formam um complexo com o domínio N-terminal de TRPM4 (e, sem estarem ligados por esta teoria, bloqueiam assim a interação do complexo do receptor NMDA extra-sináptico com o domínio N- terminal de TRPM4). Duas isoformas diferentes de TRPM4 humano estão representadas na SEQ ID NO:1 e na SEQ ID NO:2. A proteção seletiva conferida contra a citotoxicidade mediada pelo receptor NMDA permite o tratamento e a prevenção de doenças neuronais e, em particular, de doenças neurodegenerativas.
[007] Portanto, a presente invenção refere-se em um primeiro aspecto a um polipeptídeo compreendendo um fragmento de TRPM4 humano, nomeadamente contendo uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3, ou contendo uma derivada da referida sequência de acordo com a SEQ ID NO:3. O TRPM4 humano compreende um domínio N- terminal citosólico, um domínio transmembranar e um domínio C-terminal citosólico. A SEQ ID NO:3 é a porção C-terminal do domínio N-terminal de TRPM4 humano, correspondendo aos aminoácidos 633-689 da sequência de TRPM4 humano (ver as isoformas da SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, que são totalmente conservadas no domínio N-terminal). O polipeptídeo da invenção pode compreender além da SEQ ID NO:3, ou sua derivada, outras sequências TRPM4 derivadas, em particular sequências que flanqueiam a SEQ ID NO:3 no TRPM4 (por exemplo, humano). Por exemplo, o polipeptídeo pode compreender sequências N-terminal adicionais, tais como aminoácidos 347-632 do TRPM4 (por exemplo, humano). No entanto, uma vez que o polipeptídeo da presente invenção é definido como compreendendo um fragmento de TRPM4, um polipeptídeo da invenção não compreenderá a sequência de um comprimento total de proteína TRPM4 (por exemplo, humana). Tal como aqui utilizado, “proteína TRPM4” refere- se a uma sequência de comprimento total do receptor de potencial transitório do tipo melastatina 4, conhecido pelos especialistas da técnica.
Por exemplo, as duas isoformas SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 são proteínas TRPM4 humanas.
O termo abrange também todos os ortólogos de proteínas TRPM4 humanas conhecidas de outras espécies, como rato.
Exemplos de espécies com sequências TRPM4 conhecidas são listadas na tabela 1, na coluna da esquerda.
Um polipeptídeo de acordo com a presente invenção não compreende o comprimento total da sequência de aminoácidos do receptor de potencial transitório do tipo melastatina 4 (TRPM4), independentemente da isoforma, nem compreenderá o comprimento total da sequência de aminoácidos de ortólogos de TRPM4 de outras espécies.
De preferência, o polipeptídeo da invenção também não compreenderá a sequência de um fragmento funcional de uma proteína TRPM4 (independentemente da isoforma ou espécies de origem). Um “fragmento funcional de TRPM4” é um fragmento de uma proteína TRPM4 que retém a atividade biológica de TRPM4, ou seja, ainda é capaz de formar e agir como um canal de cátions, regulando assim o influxo de cátions como Na+. As técnicas para medir a atividade do canal são geralmente conhecidas no estado da técnica e a atividade do canal pode ser facilmente medida, por exemplo em células HEK293 transfectadas com vetores de expressão para TRPM4 ou o(s) respectivo(s) fragmento(s) de TRPM4. Uma técnica apropriada é revelada, por exemplo, em Amarouch et al., Neurosci Lett. 29 de abril de 2013; 541:105-10. Mais preferencialmente, o polipeptídeo não compreende o domínio C-terminal de uma proteína TRPM4 humana e/ou o domínio transmembranar de uma proteína TRPM4 humana. Mais preferencialmente, o polipeptídeo não compreende o domínio C-terminal de uma proteína TRPM4 humana nem o domínio transmembranar da proteína TRPM4 humana (independentemente da isoforma). Mais preferencialmente, qualquer sequência derivada de TRPM4 humana dentro do polipeptídeo inventivo é limitada ao fragmento do domínio N-terminal de uma proteína TRPM4, em particular aos aminoácidos 633-689 da sequência de TRPM4 humano.
[008] O polipeptídeo também pode compreender, em vez da SEQ ID NO:3, uma derivada da SEQ ID NO:3. Um exemplo para uma derivada da sequência de acordo com a SEQ ID NO:3 é uma sequência que se enquadra na sequência de consenso de acordo com a SEQ ID NO:4, com a condição de que a sequência não é a SEQ ID NO:3. A SEQ ID NO:4 é uma sequência de consenso da porção C-terminal do domínio N-terminal de proteínas TRPM4 de várias espécies de mamíferos, como é mostrado na tabela 1 abaixo: Tabela 11: Motivo inventivo TRPM4 em 38 espécies de mamíferos
SEQ
ID Espécies Sequência NO:
NSEERAARLLLRRCPLWGEATCLQLAMQADARAFFAQD 1 Mus musculus 5
GVQSLLTQK WWGEMDSTTP Peromyscus NSEERAARLLLRRCPLWGEATCLQLAMQADARAFFAQD 2 6 maniculatus GVQSLLTQK WWGEMDSTTP
NSEDRAARLLLRRCPLWGEATCLQLAMQADARAFFAQD 3 Mus caroli 7
GVQSLLTQK WWGEMDSTTP Cricetulus NSEERAARLLLRRCPLWGEATCLQLAMQADARSFFAQD 4 8 griseus GVQSLLTQK WWGDMDSTTP Jaculus NNEDRAARLLLRRCPLWGEATCLQLAMQADARAFFAQD 5 9 jaculus GVQSLLTQK WWGEMDSTTP Canis lupus SSEERAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 6 10 familiaris GVQSLLTQK WWGEMDSTTP Hipposideros NSEDRAARLLLRRCPFWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 7 11 armiger GVQSLLTQK WWGEMDSTTP Rattus NSEYRAARLLLRRCPLWGEATCLQLAMQADARAFFAQD 8 12 norvegicus GVQSLLTQK WWGEMDSTNP Acinonyx SSEKRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 9 13 jubatus GVQSLLTQK WWGEMDSTTP Odobenus
SSEERAARLLVRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 10 rosmarus 14
GVQSLLTQK WWGEMDSTTP divergens Neomonachus SSEERAARLLVRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 11 15 schauinslandi GVQSLLTQK WWGEMDSTTP Manis SSEHRAARLLIRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 12 16 javanica GVQSLLTQK WWGEMDSTTP
Marmota
SSEDRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 13 marmota 17
GVQSLLTQK WWGEMDSTTP marmota Enhydra
SSEKRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 14 lutris 18
GVQSLLTQK WWGEMDSTTP kenyoni Ictidomys
SSEDRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 15 tridecemlinea 19
GVQSLLTQK WWGEMDSTTP tus
SSEKRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 16 Felis catus 20
GVQSLLTQK WWGEMDSTTP Heterocephalu SSEERASRLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 17 21 s glaber GVQSLLTQK WWGEMDSTTP
SSEERSARLLLRRCPLWGDATCLQLATQADARAFFAQD 18 Capra hircus 22
GVQSLLTQKW WGEMDSTTP
SSEERASRLLLRRCPLWGDATCFQLAMQADARAFFAQD 19 Equus asinus 23
GIQSLLTQKW WGEMDSTTP Rhinolophus NSEDRAARLLLRRCPFWGDATCFQLAMQADARAFFAQD 20 24 sinicus GVQSLLTQK WWGEMDSSTP
SSEERSARLLLRRCPLWGDATCLQLATQADARAFFAQD 21 Ovis aries 25
GVQSLLTQKW WGEMDSTTP Mesocricetus NSEERAAGLLLRRCPLWGEATCLQLAMQADARSFFAQD 22 26 auratus GVQFLLTQK WWGEMDSTTP
SEQ Espécies Sequência ID NO: 23 Bison bison SSEERSARLLLRRCPLWGDATCLQLATQADARAFFAQD 27 bison GVQSLLTQKW WGEMDSTTP 24 Bos taurus SSEERSARLLLRRCPLWGDATCLQLATQADARAFFAQD 28
GVQSLLTQKW WGEMDSTTP 25 Bubalus SSEERSARLLLRRCPLWGDATCLQLATQADARAFFAQD 29 bubalis GVQSLLTQKW WGEMDSTTP 26 Erinaceus SSEDRANRLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 30 europaeus GVQSLLTQK WWGEMDSTTP 27 Cavia SNEHRASRLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADSRAFFAQD 31 porcellus GVQSLLTQK WWGEMDSTTP 28 Equus SSEERASRLLLRRCPLWGGATCFQLAMQADARAFFAQD 32 caballus GIQSLLTQKW WGEMDSTTP 29 Camelus SSEDRAARLLLRRCPLWGDSTCLQLATQADARAFFAQD 33 dromedarius GVQSLLTQK WWGEMDSTTP 30 Homo sapiens SSEVRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 3
GVQSLLTQK WWGDMASTTP 31 Theropithecus SSEVRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 34 gelada GVQSLLTQK WWGDMASTTP 32 Orcinus orca SSEERAAHLLLWRCPLWGDATCLHLAMQADARAFFAQD 35
GVQSLLTQK WWGEMDSTTP 33 Chlorocebus SSEVRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 36 sabaeus GVQSLLTQK WWGDMASTTP 34 Chinchilla SSETRASRLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFLAQD 37 lanigera GVQSVLTQK WWGEMDSTTP 35 Elephantulus SNEKWAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADSRAFFAQD 38 edwardii GVQSLLTQK WWGEMDSTTP 36 Gorilla SNEVRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 39 gorilla GVQSLLTQK WWGDMASTTP gorilla 37 Sus scrofa NSENRAARLLLRRCPLWGDATCLQLATQADARAFFAQD 40
GVQSLLTQK WWGHMDSTTP 38 Pan SSEVRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQADARAFFAQD 41 troglodytes GVQSLLTQK WWGDMASTTP
[009] Como é evidente na tabela 1 acima, o motivo do interesse é bem conservado em várias espécies de mamíferos. O motivo humano, SEQ ID NO:3, é 100% conservado entre Homo sapiens, Theropithecus gelada, Chlorocebus sabaeus e Pan troglodytes. E nenhuma das outras espécies de mamíferos se desvia mais de 20% da sequência humana. Um polipeptídeo compreendendo uma derivada da SEQ ID NO:3 humana, em que tal derivada deriva de outra espécie de mamífero, será tipicamente usado para métodos de tratamento de um sujeito de espécie correspondente (ver, também, o nono aspecto e o décimo aspecto da presente invenção mais abaixo).No entanto, os inventores mostraram que, por exemplo, uma sequência derivada de TRPM4 de rato pode ser usada com efeitos semelhantes na linha de células HEK293 humanas como em ratos, indicando a função conservada e, portanto, a utilidade do polipeptídeo inventivo através das fronteiras das espécies de mamíferos. Em uma modalidade preferida da invenção, a derivada de SEQ ID NO:3 é, portanto, SEQ ID NO:5.
[010] A derivada da SEQ ID NO:3 humana também pode ser uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5, uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:6, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:7, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:8, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:9, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:10, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:11, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:14, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:15, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:16, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:17, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:18, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:19, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:20, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:21, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:22, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:23, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:24, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:25, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:26, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:27, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:28, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:29, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:30, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:31, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:32, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:33, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:34, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:35, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:36, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:37, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:38, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:39, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:40, uma sequência tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:41.
[011] Tal como aqui utilizado, o termo "% de identidade de sequência" deve ser entendido da seguinte forma: Duas sequências a serem comparadas estão alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. Isso pode incluir a inserção de "lacunas" em uma ou em ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. Uma % de identidade pode, então, ser determinada ao longo de todo o comprimento das sequências alinhadas que estão sendo comparadas, incluindo lacunas potenciais. No contexto acima, uma sequência de aminoácidos apresentando uma “identidade de sequência” de, pelo menos, 95% com uma sequência de aminoácidos de referência pretende significar que a sequência da sequência de aminoácidos de referência é idêntica à sequência de consulta, exceto que a sequência de aminoácidos de consulta pode incluir até cinco alterações (substituições, deleções, inserções) de resíduos de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência. Os métodos para comparar a identidade de duas ou mais sequências são bem conhecidos no estado da técnica. A porcentagem à qual duas sequências são idênticas pode ser, por exemplo, determinada usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, mas não limitativo, de um algoritmo matemático que pode ser usado é o algoritmo de Karlin et a/. (1993), PNAS USA, 90:5873-
5877. Esse algoritmo é integrado na família de programas BLAST, como por exemplo programas BLAST ou NBLAST (ver também Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 ou Altschul et al. (1 997), Nucleic Acids Res, 25:3389- 3402), accessível através da página inicial do NCBI, no site ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson (1 990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson e Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.). Sequências que são idênticas a outras sequências até certo ponto podem ser identificadas por esses programas. Além disso, os programas disponíveis em Wisconsin Sequence Analysis Package, versão
9.1 (Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395), como por exemplo os programas BESTFIT e GAP, podem ser utilizados para determinar a % de identidade entre duas sequências polipeptídicas. Se aqui for feita referência a uma sequência de aminoácidos que compartilha uma extensão particular de identidade de sequência com uma sequência de referência, então a referida diferença de sequência é preferencialmente motivada pelas substituições conservativas de aminoácidos. Preferencialmente, tal sequência retém a função e a atividade da sequência de referência, embora talvez em um grau superior ou inferior. Além disso se aqui for feita referência a uma sequência que compartilha “pelo menos” uma certa porcentagem de identidade de sequência, então 100% da identidade de sequência não está, de preferência, abrangida.
[012] Onde quer que seja feita referência aqui a uma sequência apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com uma respectiva SEQ ID NO:, por exemplo a SEQ ID NO:3, a referida sequência pode apresentar, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 83%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 88%, pelo menos 90%, pelo menos 92 %, pelo menos 93%, pelo menos 95%, ou pelo menos 97% de identidade de sequência com a respectiva referência SEQ ID NO:, por exemplo a SEQ ID NO:3. Nos casos em que a sequência de referência não é a SEQ ID NO:3, a derivada pode apresentar, também, 100% de identidade de sequência com a respectiva sequência de referência. Por exemplo, a derivada da SEQ ID NO:3 pode ser uma sequência apresentando 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5, ou seja, pode ser a respectiva sequência TRPM4 do rato. Uma derivada da SEQ ID NO:3, em particular qualquer sequência compreendendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3 ou compreendendo pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das respectivas sequências de outras espécies listadas na tabela 1, pode conter mutações, preferencialmente mutações conservadoras
(isto é, mutações que refletem uma substituição de aminoácido que altera um determinado resíduo de aminoácido da SEQ ID NO:3 para um aminoácido diferente com propriedades bioquímicas semelhantes (por exemplo: carga, hidrofobicidade e tamanho)). Por exemplo, qualquer um dos dois resíduos de fenilalanina nas posições 34 e 35 da SEQ ID NO:3, ou ambos, podem ser substituídos por tirosina (ou seja, uma substituição de um aminoácido aromático por outro aminoácido aromático) sem revogação do efeito neuroprotetor do polipeptídeo inventivo. Os inventores consideram possíveis mutações semelhantes nas sequências correspondentes das outras espécies, visto que o referido motivo de fenilalanina gêmea é conservado em todas as espécies de mamíferos listadas na tabela 1, exceto para a chinchila, que tem uma leucina na posição 35. A leucina também é, portanto, provável que seja uma substituição de aminoácido aceitável na posição 35 da SEQ ID NO:3. Como alternativa, ou adicionalmente, uma derivada pode apresentar falta de um ou mais aminoácidos no N-terminal e/ou C-terminal da SEQ ID NO:3. Por exemplo, a derivada pode apresentar falta de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 aminoácidos no N-terminal e/ou C-terminal da SEQ ID NO:3 ou sua derivada, preferencialmente essa falta é de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos no N-terminal e/ou C-terminal da SEQ ID NO:3 ou sua derivada.
[013] Entende-se que modalidades do polipeptídeo inventivo em que a derivada da sequência de acordo com a SEQ ID NO:3 é uma sequência que é abrangida na sequência de consenso de acordo com a SEQ ID NO:4, ou é uma sequência que compartilha pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das respectivas sequências das espécies listadas na tabela 1, em que o polipeptídeo reivindicado não compreenderá o comprimento total de sequência de aminoácidos de ortólogos para TRPM4 humano, da mesma forma que não compreenderá a sequência de TRPM4 humano de comprimento total (ver acima). Da mesma forma, o que foi estabelecido acima em relação à presença e ausência de outros elementos de TRPM4, tais como sequências flanqueadoras, o domínio C-terminal ou o domínio transmembranar, aplica-se da mesma forma de maneira análoga a polipeptídios em que a derivada da sequência, de acordo com a SEQ ID NO:3, é uma sequência que é abrangida na sequência de consenso de acordo com a SEQ ID NO:4, ou é uma sequência que compartilha pelo menos 80% da identidade de sequência com qualquer uma das respectivas sequências das espécies listadas na tabela 1, isto é, tais elementos podem estar presentes, mas de preferência não estão presentes.
[014] Preferencialmente, o polipeptídeo da presente invenção é neuroprotetor. Tal como aqui utilizado, um composto é “neuroprotetor” se o referido composto proteger tanto células in vitro quanto in vivo contra a morte celular provocada por condições prejudiciais. Um teste in vitro padrão envolve o tratamento de neurônios primários do hipocampo ou corticais com NMDA por 10 minutos, seguido por avaliações de morte celular 24 horas depois (ver, por exemplo, a Figura 3c em Zhang et al., 2011, Neurosci. 31, 4978-4990). Um teste in vivo padrão é o modelo de acidente vascular cerebral em rato com oclusão da artéria cerebral média (MCAO) (ver, por exemplo, a Figura 6 em Zhang et al., 2011). Diferenças estatisticamente relevantes na taxa de morte celular medida in vitro ou dano cerebral in vivo (dado como volume de enfarte) em comparação com controles apropriados (isto é, solução salina, apenas solvente, mutantes inativos) indicam neuroproteção.
[015] De preferência, o comprimento de um polipeptídeo de acordo com a presente invenção não excederá 685 aminoácidos de comprimento. O polipeptídeo inventivo pode, por exemplo, apresentar no máximo cerca de 650 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 600 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 500 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 400 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 350 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 325 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 300 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 250 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 200 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 175 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 150 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 125 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 100 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 90 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 85 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 80 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 75 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 70 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 65 aminoácidos de comprimento, no máximo cerca de 60 aminoácidos de comprimento.
[016] Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a uma ligação de polipeptídeo a um polipeptídeo do primeiro aspecto da invenção e/ou uma ligação a um TRPM4 de comprimento total na região correspondente (isto é, a SEQ ID NO:3 ou sua derivada). Um polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção também é preferencialmente neuroprotetor. De preferência, o polipeptídeo é um anticorpo ou anticalina. Ainda mais preferencialmente, o polipeptídeo deste aspecto é um anticorpo. De preferência, esse anticorpo não é um anticorpo de coelho anti-TRPM4.
[017] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a uma proteína de fusão compreendendo o polipeptídeo inventivo de acordo com o primeiro aspecto da invenção, e pelo menos um outro elemento da sequência de aminoácidos (funcional), heterólogo à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3 ou sua derivada. Neste contexto, “heterólogo” significa preferencialmente que a pelo menos uma sequência adicional não ocorre na natureza como uma fusão com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3 ou sua sequência de aminoácidos derivada. Como consequência, a proteína de fusão resultante é um polipeptídeo criado artificialmente, de ocorrência não natural. Mais precisamente, a sequência de aminoácidos resultante desta fusão não ocorre nesta forma na natureza. O pelo menos um elemento de sequência de aminoácidos heterólogo pode ser pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 100 aminoácidos, pelo menos 250 aminoácidos, ou pelo menos 500 ou mais aminoácidos de comprimento. Por exemplo, a sequência de aminoácidos adicional pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em uma fração de ancoragem da membrana, um domínio de transdução de proteína e um marcador. Frações de ancoragem de membrana particularmente preferidas são selecionadas do grupo que consiste em um motivo de caixa CaaX (para prenilação), uma sequência de ancoragem de sinal (SEQ ID NO:57) de Glicosilfosfatidilinositol (GPI) e um sinal de direcionamento C-terminal da proteína (SEQ ID NO:58) K-Ras4B (Ras). Em relação ao motivo da caixa CaaX: “C” é a cisteína que é prenilada, “a” é qualquer aminoácido alifático e a identidade de X determina qual enzima deve atuar na proteína. A Farnesiltransferase reconhece caixas CaaX onde X = M, S, Q, A ou C, enquanto a Geranilgeraniltransferase I reconhece caixas CaaX com X = L ou E. Um domínio de transdução de proteína preferido é a proteína TAT de acordo com a SEQ ID NO:42. Um marcador preferido é o marcador HA (SEQ ID NO:43) ou um marcador de proteína fluorescente, como GFP. Uma proteína de fusão, de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção, também é preferencialmente neuroprotetora.
[018] Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere a um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos inventivos da presente invenção de acordo com o primeiro aspecto, o segundo aspecto, e/ou uma ou mais proteínas de fusão de acordo com o terceiro aspecto da invenção. O ácido nucleico inventivo pode assumir todas as formas concebíveis para um ácido nucleico. Em particular, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser RNA, DNA ou híbridos destes. Eles podem ser de fita simples ou dupla. Eles podem ter o tamanho de pequenos transcritos ou de genomas inteiros, como um genoma viral.
Tal como aqui utilizado, um ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos inventivos da presente invenção pode ser um ácido nucleico refletindo a fita senso. Da mesma forma, a fita anti-senso também é incluída. O ácido nucleico pode abranger um promotor heterólogo para a expressão do polipeptídeo inventivo, tal como um promotor viral ou promotor bacteriano. Entende-se que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção não pode codificar um gene TRPM4 de comprimento total e, de preferência, também não codificará a sequência do domínio transmembranar e/ou C-terminal de TRPM4.
[019] Em um quinto aspecto, a presente invenção se refere a um vetor que compreende um ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Tal vetor pode ser, por exemplo, um vetor de expressão que permite a expressão de um polipeptídeo inventivo. Esse vetor pode ser, por exemplo, um vetor de expressão viral. A referida expressão pode ser constitutiva ou induzível. O vetor também pode ser um vetor de clonagem compreendendo a sequência do ácido nucleico da presente invenção para fins de clonagem.
[020] Em um sexto aspecto, a presente invenção refere- se a células (de preferência isoladas) compreendendo um polipeptídeo, uma proteína de fusão, um ácido nucleico e/ou um vetor de acordo com a presente invenção. As células podem ser selecionadas em particular a partir do grupo que consiste em células bacterianas e células de levedura (por exemplo, para fins de produção), bem como células de mamíferos (por exemplo, para fins terapêuticos, mas possivelmente também para fins de produção).
[021] No sétimo aspecto, a presente invenção refere-se a um animal não humano, em particular um mamífero não humano, compreendendo um polipeptídeo, uma proteína de fusão, um ácido nucleico, um vetor e/ou uma célula de acordo com a presente invenção. Tal animal pode, por exemplo, ser selecionado a partir do grupo que consiste em rato, ratazana, cachorro, gato, vaca, macaco, cavalo, hamster, porquinho-da-índia, porco, ovelha, cabra, coelho etc. Se o respectivo polipeptídeo puder ser expresso de forma adequada, esse animal estará melhor protegido contra a citotoxicidade induzida pelo receptor NMDA e poderá suportar melhor as complicações neurológicas do que os seus homólogos sem esse ácido nucleico. Além disso, tais animais também poderiam ser usados para estudar mais detalhadamente os mecanismos envolvidos na sinalização do receptor NMDA tóxico extra-sináptico.
[022] No oitavo aspecto, a presente invenção se refere a uma composição compreendendo um polipeptídeo, uma proteína de fusão, um ácido nucleico, um vetor e/ou uma célula de acordo com a presente invenção, e contendo, ainda, uma carreadora, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade preferida, a composição compreende uma nanopartícula contendo o referido polipeptídeo, a proteína de fusão, o ácido nucleico, o vetor e/ou a célula de acordo com a presente invenção. A nanopartícula pode ser programada para liberar o referido polipeptídeo, proteína de fusão, ácido nucleico, vetor e/ou célula ao longo do tempo.
[023] Um nono aspecto da presente invenção se refere a um composto para uso em um método para tratar ou prevenir uma doença do corpo humano ou animal, em que o método é selecionado a partir do grupo que consiste em: i) um polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção,
ii) um polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção,
iii) uma proteína de fusão de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção,
iv) um ácido nucleico de acordo com o quarto aspecto da presente invenção,
v) um composto não polipeptídeo que se liga à SEQ ID NO:3 ou sua derivada conforme definido no primeiro aspecto da invenção, vi) uma composição de acordo com o oitavo aspecto da presente invenção,
vii) um composto da fórmula geral I:
(fórmula I), em que: R1 e R2 são, cada um, independentemente selecionados dentre hidrogênio, alquil(C≤12), e alquil (C≤12) substituído; e R3, R4 e R5 são, cada um, independentemente selecionados dentre hidrogênio, hidroxi e halo; ou um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitáveis destes; ou viii) um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em:
,
, e e um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitos de qualquer um desses compostos.
[024] Como mencionado acima, o composto para uso de acordo com o nono aspecto pode ser um composto de acordo com a fórmula geral I. De acordo com a referida fórmula, R1 e R2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquil(C≤12), e alquil(C≤12) substituído. O termo “alquil”, quando utilizado sem o modificador “substituído”, se refere a um grupo alifático saturado monovalente com um átomo de carbono como o ponto de ligação, uma estrutura acíclica linear ou ramificada e nenhum átomo diferente de carbono e hidrogênio. De preferência, o alquil é linear. Os grupos −CH3 (Me), −CH2CH3 (Et), −CH2CH2CH3 (n Pr ou propil), −CH(CH3)2 (i Pr, iPr ou isopropil), −CH2CH2CH2CH3 (n Bu), −CH(CH3)CH2CH3 (sec-butil), −CH2CH(CH3)2 (isobutil), −C(CH3)3 (tert-butil, t butil, t Bu ou tBu), e −CH2C(CH3)3 (neo-pentil) não são exemplos limitantes de grupos de alquil. Quando o alquil é usado com o modificador “substituído”, um ou mais átomos de hidrogênio foram independentemente substituídos por −OH, −F, −Cl, −Br, −I, −NH2, −NO2, −CO2H, −CO2CH3, −CN, −SH, −OCH3, −OCH2CH3, −C(O)CH3, −NHCH3, −NHCH2CH3, −N(CH3)2, −C(O)NH2, −C(O)NHCH3, −C(O)N(CH3)2, −OC(O)CH3, −NHC(O)CH3, −S(O)2OH, ou −S(O)2NH2. De preferência, o um ou mais átomos de hidrogênio foram substituídos por −NH2 ou –OH, ainda mais preferencialmente por −NH2. De preferência, apenas um átomo de hidrogênio foi substituído. Mais preferencialmente, apenas um átomo de hidrogênio em um átomo de carbono terminal foi substituído. De preferência, R1 e/ou R2 são alquil(C≤12), e alquil(C≤12) substituído. Ainda mais preferencialmente, R1 e/ou R2 são selecionados de alquil(C≤6) e alquil(C≤6) substituído. Ainda mais preferencialmente, R1 e/ou R2 são selecionados de alquil(C≤4) e alquil(C≤4) substituído. De preferência, um dentre R1 e R2 é alquil, enquanto o outro é selecionado de alquil substituído. Mais preferencialmente, R1 é –CH2CH2NH2. Mais preferencialmente, R2 é um alquil(C≤4) linear ou – CH2CH2OH. Ainda mais preferencialmente, R1 é –CH2CH2NH2 e R2 é um alquil(C≤4) linear.
[025] Além disso, de acordo com a fórmula geral I, R3, R4 e R5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, hidroxi e halo. De preferência, R3, R4 e R5 são selecionados a partir de hidrogênio e halo. Preferencialmente, um, ou ainda mais preferencialmente, dois dentre R3, R4 e R5 são hidrogênio. De preferência, R5 é hidrogênio. Preferencialmente, apenas um dentre R3, R4 e R5 é halo. Mais preferencialmente, R3 ou R4 é um halo. Ainda mais preferencialmente, R3 ou R4 é selecionado a partir de Cl, Br, e I. Ainda mais preferencialmente, R3 ou R4 é selecionado a partir de Cl e Br. Mais preferencialmente, R3 ou R4 é Cl.
[026] Os compostos preferidos de acordo com a fórmula geral I são: , ,
, , , , , , , e bem como qualquer sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitável de qualquer um desses compostos. O mais preferido é o composto de acordo com a seguinte fórmula bem como qualquer sal farmaceuticamente aceitável desta.
[027] Onde quer que sejam fornecidas aqui fórmulas químicas específicas, as respectivas formas carregadas/protonadas da referida fórmula são também especificamente contempladas como sendo divulgadas aqui, bem como sendo úteis na realização da presente invenção. Preferencialmente, qualquer resíduo amino da referida fórmula é protonado e, portanto, carregado positivamente.
[028] De preferência, a doença (a ser tratada de acordo com o nono aspecto da invenção) é tratada ou prevenida pela inibição da citotoxicidade mediada pelo receptor NMDA, em particular pela inibição da formação do receptor NMDA/complexo TRPM4.
[029] Em um décimo aspecto, a presente invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de uma doença do corpo humano ou animal, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto a um sujeito em necessidade de tratamento ou prevenção da doença, em que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em: i) um polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, ii) um polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, iii) uma proteína de fusão de acordo com o terceiro aspecto da presente invenção, iv) um ácido nucleico de acordo com o quarto aspecto da presente invenção,
v) um composto não polipeptídico que se liga à SEQ ID NO:3 ou seu derivado conforme definido no primeiro aspecto da invenção, vi) uma composição de acordo com o oitavo aspecto da presente invenção,
vii) um composto de fórmula geral I:
(fórmula I), em que: R1 e R2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquil (C≤12), e alquil (C≤12) substituído ; e R3, R4 e R5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, hidroxi e halo; ou um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitáveis destes; ou viii) um composto selecionado a partir do grupo de compostos que consiste em:
, ,
, , , e e um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um desses compostos.
[030] Se o composto a ser administrado de acordo com o décimo aspecto da invenção for um composto de acordo com a fórmula geral I, então as mesmas modalidades e preferências respectivas estabelecidas acima para o novo aspecto são especificamente consideradas. Em particular, o composto de acordo com a seguinte fórmula bem como qualquer sal farmaceuticamente aceitável deste, é uma modalidade preferida para realizar o décimo aspecto da invenção.
[031] O método no contexto do décimo aspecto da invenção pode ser um método para inibir a toxicidade mediada pelo receptor NMDA, em que uma quantidade eficaz de um composto supramencionado é administrada ao sujeito, inibindo assim a toxicidade mediada pelo receptor NMDA.
[032] A doença no contexto do nono aspecto ou décimo aspecto da invenção é de preferência uma doença neurológica, em particular uma doença neurodegenerativa, ou doenças que potencialmente levam a ou envolvem eventos neurodegenerativos, por exemplo, infecções que levam a eventos neurodegenerativos, em particular no cérebro. A doença neurológica ou neurodegenerativa pode, em algumas modalidades, ter um componente inflamatório, ou seja, é uma doença neuroinflamatória. A doença neurodegenerativa pode ser uma doença neurodegenerativa progressiva. De preferência, a doença é selecionada a partir do grupo que consiste em acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer (AD), esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington (HD), lesão cerebral traumática, esclerose múltipla, excitotoxicidade induzida por glutamato,
distonia, epilepsia, doença do nervo óptico, retinopatia diabética, glaucoma, dor, particularmente dor neuropática, encefalite anti-receptor NMDA, encefalopatia viral, demência vascular, microangiopatia, doença de Binswanger, isquemia cerebral, hipóxia, doença de Parkinson, esquizofrenia, depressão, malária cerebral, toxoplasmose (devido ao risco de toxoplasmose - dano cerebral associado), infecção por HIV/AIDS (devido ao risco de HIV) dano cerebral associado e infecção por zika vírus (devido à possibilidade de dano cerebral associado ao zika vírus) ou qualquer outra infecção viral que pode levar a eventos neurodegenerativos e danos neuronais ou cerebrais correspondentes, respectivamente. Em uma outra modalidade, a doença pode ser um tumor cerebral, em particular um glioblastoma. Três artigos publicados recentemente na Nature (ver Nature, 2019, Vol 573 páginas 499-501) mostram que as células de glioblastoma expressam receptores NMDA e que seu crescimento é aumentado/estimulado pela ativação de receptores NMDA. Portanto, o crescimento de células de glioblastoma pode ser inibido quando a sinalização do receptor NMDA é bloqueada, por exemplo por compostos como aqui descritos. Em contraste, os bloqueadores convencionais dos receptores NMDA não podem ser usados neste caso porque interferem com o papel fisiológico dos receptores NMDA na transmissão sináptica normal e nas funções cognitivas, como a memória.
[033] O composto para uso de acordo com o nono aspecto ou usado no método do décimo aspecto da invenção pode ser um polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção. Os inventores descobriram que polipeptídios compreendendo o respectivo fragmento TRPM4 (isto é, a SEQ ID NO:3 ou uma derivada desta) podem ser usados para proteger contra a excitotoxicidade induzida pelo receptor de NMDA.
Esse polipeptídeo pode, por exemplo, ser administrado em uma quantidade eficaz a um paciente que sofre de doença neurológica e/ou neurodegenerativa.
Esse polipeptídeo pode, por exemplo, ser administrado diretamente ao sujeito.
Em alternativa, um vetor que codifica tal polipeptídeo pode ser usado para expressar o polipeptídeo nas células do sujeito.
As mesmas considerações se aplicam se o composto for polipeptídeo de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, por exemplo um anticorpo ou anticalina, ou uma proteína de fusão de acordo com o terceiro aspecto da invenção.
Se o composto for uma proteína de fusão de acordo com a presente invenção, então é particularmente preferido que a proteína de fusão compreenda meios para direcionar a proteína de fusão para a membrana celular, em particular para o lado citosólico da membrana, uma vez que é aqui que o domínio N- terminal do TRPM4 é normalmente encontrado em uma célula.
Um efeito semelhante é alcançado se a proteína de fusão compreender um domínio de transdução de proteína permitindo que o polipeptídeo passe por fora através da membrana celular e entre no citosol da célula.
Nos casos em que o composto é um ácido nucleico de acordo com o quarto aspecto da presente invenção, esse ácido nucleico também pode ser usado no contexto de uma terapia gênica, por exemplo, se for inserido permanente ou temporariamente no genoma do sujeito a ser tratado.
Nos casos em que o composto é um vetor de acordo com o quinto aspecto da presente invenção,
tal vetor é preferencialmente um vetor viral. O composto também pode ser um composto não polipeptídico que se liga à SEQ ID NO:3 ou sua derivada conforme definido no primeiro aspecto da invenção, por exemplo, um aptâmero de DNA correspondente ou uma molécula pequena.
[034] Normalmente, o método de tratamento (do nono ou décimo aspecto) se concentrará em interromper ou desacelerar a progressão do distúrbio. Em alternativa, esse composto também pode ser administrado de forma preventiva, por exemplo em situações em que o sujeito está em (um risco aumentado) de sofrer de uma doença neurológica e/ou neurodegenerativa. Isso inclui um (aumento em) risco agudo (por exemplo, um acidente vascular cerebral trombótico após a cirurgia), bem como um risco contínuo (por exemplo, devido a uma predisposição genética e/ou familiar para um determinado distúrbio neurológico e/ou neurodegenerativo).
[035] O sujeito a ser tratado é de preferência um mamífero, de preferência selecionado do grupo que consiste em humano, rato, ratazana, cachorro, gato, vaca, macaco, cavalo, hamster e porquinho-da-índia, porco, ovelha, cabra, coelho etc. Mais preferencialmente, o sujeito é um ser humano. Se o composto, para uso de acordo com o nono aspecto, ou para uso no método do décimo aspecto da invenção, for um polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da invenção, uma proteína de fusão de acordo com o terceiro aspecto da invenção, ou um respectivo ácido nucleico ou vetor que o codifica, então, de preferência, o referido composto corresponde ao sujeito a ser tratado. Por exemplo, para o tratamento de um ser humano, o polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção compreenderá de preferência a sequência humana, isto é, uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:3. Em contraste, para o tratamento de ratos, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção compreenderia preferencialmente uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:5 etc.
[036] Para os propósitos do nono e do décimo aspectos da invenção, o especialista da técnica será prontamente capaz de selecionar uma via de administração apropriada, dependendo da doença específica a ser tratada ou prevenida e/ou parte do corpo a ser tratada. A via de administração pode ser, por exemplo, oral, tópica, intranasal, parenteral, intravenosa, retal ou qualquer outra via de administração adequada no contexto específico. Por exemplo, se a doença for uma doença cerebrovascular, como acidente vascular cerebral, então a administração intranasal é uma via de administração preferível. A administração intranasal é conhecida por especialistas na técnica como sendo particularmente adequada para a administração de compostos neuroprotetores em geral, por exemplo no contexto do tratamento do acidente vascular cerebral e lesão cerebral induzida por acidente vascular cerebral.
[037] O composto pode ser administrado em todas as formas adequadas para o propósito dado, incluindo, por exemplo, comprimido, cápsula, grânulo, pó, líquido, pomada, loção, creme, spray, inalante e similares. O composto pode ser formulado para ser administrado por via parentérica, como por injeção intravenosa ou infusão intravenosa. Em uma modalidade particularmente preferida, o composto para uso de acordo com o nono aspecto ou usado no método do décimo aspecto da invenção pode ser formulado para ser administrado por via intranasal, por exemplo, como pomada ou creme, ou como, por exemplo, solução salina para ser aplicado por meio de um spray no nariz. O composto para uso de acordo com o nono aspecto ou usado no método do décimo aspecto da invenção também pode ser formulado para liberação retardada ou sustentada e/ou encapsulado em nanopartículas ou vesículas.
[038] Num décimo primeiro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de um polipeptídeo ou proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção, respectivamente, em um ensaio de interação proteína-proteína. De preferência, o ensaio de interação proteína-proteína é um ensaio de interação proteína-proteína in vitro. É contemplado que um polipeptídeo/proteína de fusão de acordo com o primeiro, segundo ou terceiro aspectos da invenção será particularmente útil para identificar outros parceiros de ligação de proteínas TRPM4. A interação proteína-proteína sob escrutínio em tais ensaios é, de preferência, uma interação dentro da região especificada pela sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3, ou sua sequência derivada, conforme definido acima para o primeiro, segundo e terceiro aspectos da invenção. Esses parceiros de ligação podem revelar-se neurotóxicos, neuroprotetores ou nenhum dos dois. Neste contexto, o polipeptídeo/proteína de fusão não só fornecerá insights sobre seus próprios parceiros de interação, mas também lançará luz sobre as interações de outros compostos envolvidos na sinalização de TRPM4, por exemplo, se certos complexos não puderem mais ser formados devido à inibição (por exemplo, competitiva). O especialista na técnica está familiarizado com muitos ensaios possíveis para determinar as interações proteína- proteína, incluindo métodos bioquímicos, biofísicos e genéticos. Exemplos não limitantes são imunoprecipitação, complementação bimolecular de fluorescência (por exemplo, split-TEV, split-GFP), eletroforese de afinidade, imunoeletroforese, exibição de fago, purificação de afinidade em tandem, reticulação química seguida por análise de espectrometria de massa, ressonância de plasmon de superfície, transferência de energia de ressonância de fluorescência, imagem de ressonância magnética nuclear etc. O ensaio de interação proteína-proteína pode ser um ensaio in vitro, ex vivo ou an in vivo. Mais preferencialmente, o ensaio de interação proteína-proteína é um ensaio in vitro. No entanto, no contexto de imagem ao vivo, por exemplo, tal ensaio também pode ser um ensaio in vivo. Nos casos em que o ensaio é um ensaio in vivo, preferencialmente não é um ensaio em um ser humano.
[039] Em um décimo segundo aspecto, e em um contexto semelhante ao décimo primeiro aspecto, a presente invenção se refere também a um método para identificar um composto potencialmente interagindo com uma proteína TRPM4 contendo a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da invenção, em que o método compreende: i) encaixe virtual assistido por computador de um composto candidato a uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:3, ou uma derivada da referida sequência, em que a referida sequência de aminoácidos está presente em uma estrutura 3D virtual de um polipeptídeo compreendendo o referido aminoácido sequência, e ii) determinar a pontuação de encaixe e/ou deformação interna para encaixar o composto candidato virtualmente à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:3, ou sua derivada, e opcionalmente iii) contatar in vitro ou in vivo o composto candidato com uma proteína TRPM4 para determinar se o composto candidato modula a atividade da referida proteína TRPM4 ou não.
[040] Métodos para acoplamento in silico de compostos candidatos a estruturas de proteínas são bem conhecidos no estado da técnica. O composto candidato pode ser qualquer composto. Normalmente, o composto será uma pequena molécula. De preferência, a molécula pequena não é ATP. Mais preferencialmente, o pequeno composto não é um nucleotídeo e/ou não compreende uma porção de adenosina. Também é possível que o composto seja uma grande biomolécula, como um anticorpo ou semelhante. Coleções de compostos estão disponíveis, por exemplo, na Schrödinger LLC (New York, NY, USA). A estrutura 3D pode ser qualquer estrutura compreendendo uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:3, ou uma derivada da referida sequência. A estrutura 3D pode ser uma estrutura 3D de TRPM4 humano ou de suas partes. A derivada é como definida acima, por exemplo para o primeiro aspecto da invenção. De preferência, a derivada é uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, ou ii) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:4. No presente caso, várias estruturas de proteínas TRPM4 estão disponíveis para o especialista na técnica, por exemplo, no Protein Data
Bank, e podem ser usadas para o método do décimo segundo aspecto. Sem estar limitado a isso, as estruturas 3D adequadas para tal método são as estruturas de TRPM4 humano, por exemplo 5WP6, 6BQR, 6BQV etc., ou a estrutura do rato 6BCO. A estrutura 3D pode ser baseada, por exemplo, em uma estrutura obtida por análise de cristalografia de raios-X, análise de espectroscopia de NMR, crio-EM ou derivada de modelagem de homologia. Entende-se que o método de acordo com o décimo segundo aspecto da invenção incluirá o encaixe de um composto candidato à região na estrutura do TRPM4, que corresponde à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3 ou sua derivada, e não engloba o encaixe a regiões da estrutura que não se relacionam com a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3 ou sua derivada. No entanto, se o encaixe à região com a SEQ ID NO:3 ou sua derivada requer interação paralela com outros resíduos de aminoácidos fora da referida região, então esse encaixe também é abrangido pelo método de acordo com o décimo segundo aspecto da invenção. O próprio encaixe pode ser realizado por uma variedade de métodos conhecidos pelos especialistas na técnica, e o respectivo software está disponível ao público (ver, por exemplo, Schrödinger LLC, New York, NY, USA). Uma respectiva análise também pode ser solicitada de fornecedores comerciais, por exemplo Proteros Biostructures GmbH, Planegg, Germany). O método do décimo segundo aspecto da presente invenção também pode ser usado para identificar inibidores da excitotoxicidade mediada pelo receptor de NMDA.
[041] Num décimo terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um composto para utilização num método de tratamento ou prevenção de uma doença do corpo humano ou animal, em que o composto é um inibidor da formação do receptor NMDA – complexo TRPM4. Um inibidor da formação do receptor NMDA – complexo TRPM4 pode ser identificado testando um determinado composto candidato em um ensaio conforme estabelecido, por exemplo, nos exemplos da presente invenção (ver, em particular, e sem estar limitado a isso, o exemplo 1, Métodos e materiais, Exemplos 11, 12 e 15). Um inibidor da formação do receptor NMDA – complexo TRPM4 é, por exemplo, qualquer um dos compostos discutidos no contexto do nono aspecto da invenção. Todas as modalidades divulgadas neste contexto são contempladas especificamente também para o décimo terceiro aspecto da invenção. De preferência, o inibidor da formação do receptor de NMDA – complexo TRPM4 não bloqueia o canal do receptor de NMDA per se (para um teste correspondente ver Exemplo 14). De preferência, o inibidor da formação do receptor NMDA – complexo TRPM4 não bloqueia o canal TRPM4 per se (para um teste correspondente, ver Exemplo 17). A doença pode ser qualquer doença em conformidade com o que já foi discutido no contexto do nono ou décimo aspecto da invenção.
[042] Em um décimo quarto aspecto, a presente invenção se refere a um método de tratamento ou prevenção de uma doença do corpo humano ou animal, o método compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto a um sujeito em necessidade de tratamento ou prevenção da doença, em que o composto é um inibidor da formação do receptor NMDA – complexo TRPM4. Em relação ao inibidor da formação e doença do receptor NMDA – complexo TRPM4, referências são feitas ao décimo terceiro aspecto da invenção, e ao nono e décimo aspectos da invenção, respectivamente. Todas as modalidades divulgadas neste contexto são contempladas especificamente também para o décimo quarto aspecto da invenção.
[043] Em um quinto aspecto, a presente invenção se refere a uma célula, em particular uma célula não neuronal, como uma célula HEK293, em que a referida célula expressa um receptor NMDA recombinante e em que a expressão de TRPM4 está ausente, reduzida ou inativa, de preferência inativa. A célula é preferencialmente uma célula isolada, isto é, não residente em um corpo humano ou animal. A célula, de preferência, não expressa quaisquer receptores ou subunidades de glutamato. A célula é preferencialmente uma célula de mamífero, como uma célula humana. De preferência, a célula pode ser cultivada como linha celular. Tal célula é perfeitamente adequada para estudar a atividade do receptor NMDA, seja agora por inibição, ativação ou modulação. Esses estudos podem ser estudos farmacológicos que visam a descoberta e/ou caracterização de novos compostos (pequenas moléculas, peptídeos, proteínas etc.) e compostos conhecidos (pequenas moléculas, peptídeos, proteínas etc.) que bloqueiam ou aumentam um ou vários aspectos das funções do receptor NMDA, que incluem, mas não estão limitadas a: condutância de íons, cinética de ativação e desativação e bloqueio de magnésio e desbloqueio de magnésio. Tais estudos também podem incluir avaliações das relações estrutura-função do receptor NMDA nas quais os plasmídeos estão sendo transfectados, que contêm vetores de expressão para as várias subunidades de receptores NMDA (GRIN1, GRIN2A, GRIN2B ou outras subunidades GRIN2 ou GRIN3), que contêm mutação de ponto ou mutantes de deleção seguidos por análise funcional de parâmetros como os mencionados acima (condutância iônica etc.). As abordagens convencionais sofrem da desvantagem de que a expressão do receptor NMDA recombinante (por exemplo em células HEK 293) normalmente leva à toxicidade celular e morte. Portanto, as abordagens convencionais precisam fazer crescer essas células na presença de inibidores dos receptores NMDA, o que torna os estudos dos receptores NMDA e a interpretação dos resultados nessas células difíceis e complicados. Ao desacoplar a atividade do receptor NMDA da interação com TRPM4, a referida toxicidade e morte celular podem ser evitadas e, portanto, não há mais necessidade de cultura de células na presença de inibidores dos receptores NMDA.
[044] Em um décimo sexto aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de inibidores (de canal) de uma proteína TRPM4, como inibidores de TRPM4 humano, para inibir a excitotoxicidade mediada pelo receptor NMDA. O inibidor de TRPM4 (por exemplo, humano) pode ser qualquer inibidor de TRPM4 conhecido, como glibenclamida, 9- fenantrol, tolbutamida, repaglinida, nateglinida, meglitinida, midaglizol, LY397364, LY389382, gliclazida, glimepirida, estrogênio, estradiol, estrona, estriol, genisteína, estrogênio não esteroidal, fitoestrogênio, zearalenona, cloreto de 5-butil-7-cloro-6-hidroxibenzo[c]- quinolizio, ácido flufenâmico e espermina. A redução da expressão de TRPM4 também é considerada um inibidor da proteína TRPM4. O uso pode ocorrer in vitro ou in vivo. Se o uso ocorre in vivo e é de natureza terapêutica, então tal modalidade reflete um inibidor de uma proteína TRPM4 para uso em um método de tratamento de uma doença do corpo humano ou animal, em que a doença é: i) tratada ou prevenida por meio da inibição da citotoxicidade mediada pelo receptor NMDA e/ou ii) causada pela excitotoxicidade mediada pelo receptor NMDA.
[045] O termo "compreendendo", tal como aqui utilizado, não deve ser interpretado como sendo limitado ao significado "constituído por" (isto é, excluindo a presença de outra matéria adicional). Em vez disso, "compreendendo" implica que uma matéria opcional pode estar presente. O termo "compreendendo" abrange como modalidades particularmente previstas que trazem em seu escopo "constituído por" (ou seja, excluindo a presença de outra matéria adicional) e “compreendendo, mas não sendo constituído por " (ou seja, exigindo a presença de uma outra matéria adicional), com a primeira sendo mais preferida.
[046] O termo "nanopartícula", tal como aqui utilizado, refere-se preferencialmente a uma partícula entre 1 e 100 nanômetros de tamanho. A nanopartícula pode compreender um polímero. A partícula pode compreender sílica, em particular um núcleo de sílica. A partícula pode compreender uma camada externa com grupos funcionais. Esses grupos funcionais podem, por exemplo, permitir a ligação da nanopartícula a um composto de interesse.
Figuras
[047] A seguir, será fornecida uma breve descrição das figuras anexas. As figuras pretendem ilustrar aspectos da presente invenção com mais detalhes. No entanto, elas não se destinam a limitar o escopo da invenção.
[048] A Fig. 1 ilustra que a redução da proteína TRPM4 usando interferência de RNA protege os neurônios da toxicidade mediada pelo receptor NMDA. O veículo era água. shTRMP4-1 está representado na SEQ ID NO:44, shTRMP4-2 está representado na SEQ ID NO:45. Todos os dados são mostrados em média ± d.p. n=3 experimentos independentes. Teste ANOVA de duas vias seguido de um teste Dunnett post hoc. n.s. ( não significativo). * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001; **** p ≤ 0,0001.
[049] A Fig. 2 ilustra que o TRPM4 de rato contém um elemento polipeptídico que confere proteção contra a morte celular induzida por NMDA. A) Efeito neuroprotetor de 4 fragmentos diferentes de TRPM4 de rato: resíduos de aminoácidos 1-346 (SEQ ID NO:46); resíduos de aminoácidos 347-689 (SEQ ID NO:47); resíduos de aminoácidos 690-1036 (SEQ ID NO:48); resíduos de aminoácidos 1037-1213 (SEQ ID NO:49); Destes, apenas a SEQ ID NO:47 é neuroprotetora. B) Efeito neuroprotetor de 4 fragmentos diferentes de um polipeptídeo com a sequência de acordo com SEQ ID NO:47: resíduos de aminoácidos 347-467 (SEQ ID NO:50); resíduos de aminoácidos 468-548 (SEQ ID NO:51); resíduos de aminoácidos 536-648 (SEQ ID NO:52); resíduos de aminoácidos 633-689 (SEQ ID NO:5). Destes, apenas a SEQ ID NO:5 é neuroprotetora. Todos os dados são mostrados em média ± dp n=3 experimentos independentes. Teste ANOVA de duas vias seguido de um teste Dunnett post hoc. * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001.
[050] A Fig. 3 ilustra as propriedades protetoras de várias variantes do polipeptídeo com a sequência de SEQ ID NO:5. A) Análise de morte neuronal induzida por NMDA em neurônios infectados com rAAV e superexpressando SEQ ID NO:47 ou SEQ ID NO:53. A SEQ ID NO:53 corresponde à SEQ ID NO:47, mas compreende adicionalmente uma membrana-âncora (GPI). Os experimentos mostraram que a âncora GPI aumentou os efeitos protetores do polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:47, levando a menos morte celular. B) Análise de morte neuronal induzida por NMDA em neurônios cultivados infectados em DIV3 com os rAAVs expressando SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:54 ou SEQ ID NO:55 e desafiados com 20µM de NMDA por 10min em DIV17, com morte celular avaliada após 24h. A SEQ ID NO:54 é uma derivada da SEQ ID NO:5, tendo uma substituição conservativa de dois Y por dois F. É apenas levemente menos eficaz na redução da toxicidade celular mediada pelo receptor de NMDA do que a SEQ ID NO: 5. Em contraste, uma região correspondente derivando da proteína TRPM5 de rato relacionada, mas diferente, SEQ ID NO:55, compartilhando apenas cerca de 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5, não é capaz de reduzir a toxicidade celular mediada pelo receptor NMDA. Todos os dados são mostrados em média ± dp n=3 experimentos independentes. Teste ANOVA de duas vias seguido de um teste Dunnett post hoc n.s. ( não significativo). * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001; **** p ≤ 0,0001.
[051] A Fig. 4 ilustra o efeito da pré-exposição de neurônios a 1 e 10µg de um peptídeo de fusão compreendendo o peptídeo da SEQ ID NO:5 e um domínio de transdução de proteína (TAT, SEQ ID NO:42). A proteína de fusão (SEQ ID NO:5 +TAT) tinha a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:56. Os experimentos mostraram que a aplicação da SEQ ID NO:56 protegeu os neurônios da excitotoxicidade do NMDA. O veículo era água.
[052] A Fig. 5 ilustra os volumes de enfarte em cérebros isquêmicos inteiros de ratos submetidos a injeção estereotáxica de vírus adenoassociados recombinantes (rAAVs) que codificam SEQ ID NO:5 3 semanas antes de MCAO (oclusão da artéria cerebral média) ou cirurgia simulada. PBS e GFP foram usados como controle. O tamanho do enfarte foi determinado 7 dias após MCAO (média±DP). A análise estatística foi determinada pelo teste t; diferenças estatisticamente significativas são indicadas com asteriscos (n=5-8). **P<0,005; ***P<0,001.
[053] A Fig. 6 ilustra o efeito preventivo de polipeptídeos de acordo com a SEQ ID NO:5 e a SEQ ID NO:54 contra a quebra do potencial da membrana mitocondrial neuronal em neurônios primários do hipocampo do rato. A adição de carbonilcianeto-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) leva à quebra do potencial da membrana mitocondrial.
A) Quebra da membrana mitocondrial em neurônios primários do hipocampo de ratos não transfectados; B) Atraso da quebra do potencial de membrana mitocondrial na presença da SEQ ID NO:5. A adição do desacoplador FCCP no final do experimento leva à quebra do potencial da membrana mitocondrial; C) Comparação do efeito protetor de três polipeptídeos diferentes contra a quebra do potencial da membrana mitocondrial neuronal: Uni: Não infectado (controle negativo); SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 54 e SEQ ID NO: 55 (controle negativo). Teste ANOVA de uma via seguido de um teste de Tukey post hoc. n.s. (não significativo). **** p ≤ 0,0001.
[054] A Fig. 7 ilustra que os efeitos observados para a SEQ ID NO:5 e a SEQ ID NO: 54 não estão afetando a sinalização do receptor NMDA sináptico. Em particular, a ativação do receptor NMDA sináptico, que é reforçada pelo antagonista do receptor GABAA, Gabazina; e o influxo de cálcio mediado na mitocôndria não é afetado pela SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:54. Todos os dados são mostrados em média ± d.p. n=10-12 de 3 experiências independentes. Teste ANOVA de uma via seguido de um teste de Tukey post hoc. n.s. (não significativo). **** p ≤ 0,0001.
[055] A Fig. 8 ilustra o efeito neuroprotetor de compostos identificados em uma tela virtual como potencialmente interagindo com a SEQ ID NO: 5 em TRPM4 de rato. DMSO foi usado como controle negativo. A glibenclamida, um inibidor do TRPM4, foi usada como controle positivo. A) Nível de linha de base de morte celular em células HEK293 sem indução de excitotoxicidade mediada pelo receptor NMDA; B) Morte celular mediada por complexos de receptor GRIN1 + GRIN2A; C) Morte celular mediada por complexos de receptor GRIN1 + GRIN2B. Todos os dados são mostrados em média ± d.p. n=3 experiências independentes. Teste ANOVA de uma via seguido de um teste de Tukey post hoc. n.s. (não significativo). * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001; **** p ≤ 0,0001.
[056] A Fig. 9 ilustra o efeito neuroprotetor do composto P4 e do composto P15 contra a quebra do potencial da membrana mitocondrial neuronal em neurônios primários do hipocampo de rato. 30min antes da gravação, P4 e P15 foram aplicados a neurônios em cultura. Após um registro de 1min da linha de base, a excitotoxicidade levando à quebra do potencial da membrana mitocondrial foi induzida com aplicação de banho de 20µM de NMDA. Após 10 minutos, o desacoplador mitocondrial, carbonilcianeto-p- trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP), foi adicionado. A adição de FCCP leva à quebra do potencial da membrana mitocondrial. MK-801, um inibidor geral do receptor NMDA não competitivo, foi usado como controle positivo. A) Retardo da quebra do potencial de membrana mitocondrial na presença de DMSO, P4, P15 ou MK-801; B) Comparação quantitativa do efeito protetor de DMSO, P4 e P15 contra a quebra do potencial da membrana mitocondrial neuronal. Os resultados mostraram que P4 e P15 foram capazes de proteger significativamente o potencial da membrana mitocondrial da excitotoxicidade por NMDA, respectivamente. Todos os dados são mostrados em média ± d.p. n=6 de 2 experiências independentes. Teste ANOVA de uma via seguido de um teste de Tukey post hoc. n.s. (não significativo). * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001; **** p ≤ 0,0001.
[057] A Fig. 10 ilustra o efeito neuroprotetor do composto P4 e derivados do composto P4 (compostos 401 a 409) contra a excitotoxicidade NMDA em neurônios primários do hipocampo de rato. Os neurônios foram pré-tratados por 30min com 10µM do composto indicado e, em seguida, desafiados com NMDA (20µM) por 10min (toxicidade de NMDA transiente, Fig. 10A) ou com NMDA (20µM) por 24 horas (toxicidade de NMDA crônica, Fig. 10B). A morte celular foi avaliada 24 horas após o desafio com NMDA. Para avaliação da morte celular, os neurônios foram fixados com paraformaldeído 4%, sacarose 4% em PBS por 15 min, lavados com PBS e contrastados com Hoechst 33258 (1µg/ml) por 10min. As células foram montadas em Mowiol 4-88 e examinadas por microscopia de fluorescência. Os neurônios mortos foram identificados por núcleos amorfos ou encolhidos. Todos os dados são mostrados em média ± d.p. n=3-5 de 2-5 experiências independentes. Teste ANOVA de uma via seguido de um teste de Tukey post hoc, grupo de veículo vs. * p ≤ 0,05; *** p ≤ 0,001; **** p ≤ 0,0001.
[058] A Fig. 11 ilustra a capacidade de GRIN2A e GRIN2B de induzir - na presença de GRIN1 - morte celular em células HEK293 de tipo selvagem (A) e células HEK293 inativas para TRPM4 (B) nos pontos de tempo indicados após a transfecção.
[059] A Fig. 12 ilustra os efeitos do composto P4, composto P15 ou MK-801 no influxo de cálcio induzido por NMDA durante uma aplicação de NMDA (20µM) de 6 min. É fornecida uma análise quantitativa da linha de base (Fig. 12A), amplitude (Fig. 12B) e área sob a curva (AUC, Fig. 12C). Ao contrário do bloqueador de receptor de NMDA clássico, MK-801, que bloqueou completamente os transientes de cálcio induzidos por NMDA, nem o composto P4 nem o P15 reduziram os transientes de cálcio induzidos por NMDA em neurônios do hipocampo. Os compostos, portanto, não afetam o influxo de cálcio induzido por NMDA per se.
[060] A Fig. 13 fornece uma análise quantitativa das razões de GRIN2B e TRPM4 obtidas por co-imunoprecipitação do receptor NMDA/complexo de morte TRPM4 de lisados corticais obtidos de ratos de controle e de ratos em 2h, 6h e 24h após injeção intraperitoneal de composto P4 (40mg/kg). O receptor NMDA/complexo TRPM4 foi imunoprecipitado com um anticorpo anti-TRPM4. Ocorre uma redução na formação do receptor NMDA/complexo TRPM4 de 51% em 2h e 61% em 6h após uma única injeção intraperitoneal (i.p.) de 40mg/kg de composto P4, demonstrando assim que o composto P4 interferiu efetivamente com a formação de tal complexo. 24h após a injeção i.p. do composto P4, o receptor NMDA/complexo TRPM4 foi reformado.
[061] A Fig. 14 fornece uma análise quantitativa da degeneração das células ganglionares retinais positivas para Brn3a (RGC) após injeção intravítrea de ratos com NMDA (20nmol). A análise é baseada em retinas de montagem inteira coradas com anticorpos para Brn3a uma semana após a injeção intravítrea de NMDA para marcar RGCs vivos em ratos que receberam veículo ou composto P4. Todos os dados apresentados como média ± d.p. O composto P4 reduz a degeneração das células ganglionares retinais (RGC) após a injeção intravítrea de ratos com NMDA (20nmol).
[062] A Fig. 15 ilustra os efeitos do composto P4 e do composto P15 na função do canal TRPM4 na linha celular de câncer de próstata PC3. As correntes TRPM4 são caracterizadas por sua dependência de cálcio e retificação externa. O histograma de resumo mostra os parâmetros para células individuais corrigidas com 0 ou 10µM de Ca2+ livre na solução intracelular e pré-incubadas a 37°C por 30-60 min, e registradas em qualquer solução de controle ou 10µM de P4 ou P15. Os resultados indicam que 10µM de Ca2+ ativa uma corrente de retificação externa semelhante ao TRPM4 nas células PC3, e esta corrente não é afetada por P4 ou P15. Dados mostrados como média ± d.p. n = 10-17 por grupo de 3 experiências independentes. n.s. (não significativo).
Exemplos
[063] A seguir, exemplos específicos que ilustram modalidades e aspectos da invenção são apresentados. No entanto, a presente invenção não deve ser limitada em escopo pelos exemplos específicos aqui descritos. Na verdade, várias modificações da invenção, além daquelas aqui descritas, tornar-se-ão prontamente aparentes para os versados na técnica a partir da descrição anterior e do exemplo abaixo. Todas essas modificações estão dentro do escopo das reivindicações anexas.
Exemplo 1: Métodos e Materiais
[064] Os seguintes métodos e materiais foram usados pelos inventores nos exemplos subsequentes, a menos que indicado de outra forma.
Cultura de células HEK293
[065] As células HEK293 foram cultivadas em suplemento de meio modificado Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco™, 41965-039) com 10% de soro fetal bovino (Fetal Bovine Serum - FBS, Gibco™, 10270), 1% de piruvato de sódio (Gibco™, 11360070), 1% de MEM NEAA (Gibco™, 11140035) e 0,5% de penicilina-estreptomicina (P-S; Sigma, P0781), e Passage15-25 foram utilizados para os experimentos.
Ensaio de Citotoxicidade Luminescente
[066] Para testar a citotoxicidade dos compostos de acordo com a presente invenção, células HEK293 (70 a 80% confluentes) foram transfectadas 24 horas após o plaqueamento com GRIN1 e GRIN2A, ou GRIN2B, respectivamente (1:1; 0,2mg/cm2) com Lipofectamine 2000, de acordo com as instruções do fabricante. O número relativo de células mortas na população nos pontos de tempo indicados após a transfecção foi medido com o ensaio de citotoxicidade CytoTox-Glo™ (Promega, G9290) de acordo com as instruções do fabricante, com pequenas modificações. Resumidamente, 10% do meio total foi misturado com 10µL de
AAF-amino luciferina para atingir um volume final de 200µL com água, as unidades de luminescência relativa das células mortas (DRLU) foram medidas por GloMax (Promega) em uma microplaca de poliestireno de fundo branco de 96 poços (Corning Costar®, 3912). Após todas as medições, os reagentes de lise foram adicionados às células e 10% do lisado foi usado para a medição das unidades de luminescência relativa da célula total (TRLU). A morte celular foi calculada pelas seguintes equações: 10 ∗ 𝐷𝑅𝐿𝑈 𝑀𝑜𝑟𝑡𝑒 𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟(%) = ∗ 100 10 ∗ 𝑇𝑅𝐿𝑈 + 𝐷𝑅𝐿𝑈
[067] Para o teste de drogas, P4, P8, P9, P13 e P15 foram adicionados ao meio na concentração indicada 6h após a transfecção. DRLU, TRLU e morte celular foram medidos e calculados 48h após a transfecção.
Culturas Neuronais Primárias
[068] Neurônios hipocampais e corticais primários de ratos foram preparados e mantidos conforme o habitual. Resumidamente, hipocampos ou córtex cerebral de ratos P0 C57Bl/6NCrl foram dissociados e semeados a uma densidade de 1,2*105/cm2 em meio de crescimento (GM), consistindo em meio Neurobasal A (Gibco™, 10888022), 2% de B27™ Supplement (Gibco™, 17504044) sem soro, 1% de soro de rato (Biowest, S2150), 0,5mM de L-Glutamina (Sigma, G7513) e 0,5% de P-S. Adicionou-se Citosina β- D-arabinofuranosídeo (AraC; Sigma, C1768; 2,8µM) em DIV3 para prevenir a proliferação de células gliais. A partir de DIV8, metade do meio foi substituído por GM sem soro de rato a cada 48h até ser usado para experimentos. 24h antes das experiências, o GM foi substituído por meio de transfecção (HEPES 10mM; pH 7,4; 114mM NaCl; 26,1mM NaHCO3; 5,3mM KCl; 1mM MgCl2; 2mMCaCl2; glucose 30mM; glicina 1mM; 0,5mM C3H3NaO3; e 0,001% de vermelho de fenol e 10% de meio essencial mínimo de Eagle sem fosfato, suplementado com 7,5µg/ml de insulina, 7,5µg/ml de transferrina e 7,5ng/ml de selenito de sódio (Suplemento de Meio Líquido ITS, Sigma-Aldrich Cat # I3146)). Neurônios primários do hipocampo foram usados em imagens de células vivas e experimentos de morte celular, enquanto os neurônios corticais foram usados para análise de mRNA e extração de proteínas.
Vírus adenoassociados recombinantes (rAAVs) e Construções
[069] Todas as partículas virais foram produzidas e purificadas conforme conhecido no estado da técnica. Todos os peptídeos derivados de TRPM4 (compreendendo SEQ ID NO:5, ou qualquer um de SEQ ID NO:46 a SEQ ID NO:56) foram clonados na estrutura de rAAV por PCR. O shRNA contra TRPM4 de rato foi projetado por BLOCK-iT™ RNAi Designer da Thermofisher para alcançar: ggacatcgcccaaagtgaact (SEQ ID NO:44, shTRPM4-1) e gcatccagagagggttcattc (SEQ ID NO:45, shTRPM4-2). O controle scramble do shRNA (shSCR) foi testado e provou não ter alvos conhecidos em ratos. As sequências-âncora GPI (LENGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP, por exemplo como é usado na SEQ ID NO:53) foram sintetizadas por Eurofins Genomics (Ebersberg, Alemanha). Todos os primers foram sintetizados e todos os plasmídeos foram confirmados por sequenciação por Eurofins Genomics.
Imagem Mitocondrial
[070] Lamínulas de cobertura com neurônios primários cultivados (DIV15-DIV17) foram usadas para examinar o potencial de membrana mitocondrial (Tm) e a sinalização de cálcio mitocondrial, que foi realizada em temperatura ambiente em meio de cultura independente de CO2 (CICM) contendo: HEPES 10mM; 140mM NaCl; 2,5mM KCl; 1,0mM MgCl2; 2,0mM CaCl2; Glicina 1,0mM; Glicose 35,6mM e piruvato de Na- 0,5mM. Todas as imagens foram obtidas por uma câmera CCD resfriada (iXon 887, Andor) em um microscópio vertical (BX51WI, Olympus). A excitação de fluorescência foi fornecida por uma lâmpada de arco de xenônio em combinação com uma roda de filtro de excitação (MT-20, Olympus). Os dados foram coletados usando o software Cell^R (Olympus), analisados usando ImageJ e quantificados usando Igor Pro (WaveMetrics). O Tm foi detectado com o indicador de fluorescência de molécula pequena Rodamina 123 (Rh123; Molecular Probe™, R302). Neurônios primários cultivados foram carregados com 4,3µM Rh123 em CICM a 37°C por 30min, então lavados e deixados em CICM por mais 30min antes da gravação. No final de cada experiência, o desacoplador mitocondrial FCCP (5µM, Sigma-Aldrich, Cat # C2920) foi aplicado às células para atingir a intensidade máxima de fluorescência Rh123. A Rh123 foi fotografada com excitação de 470±20nm e comprimentos de onda de emissão de 525±25nm usando uma objetiva de 20x. A intensidade da fluorescência Rh123 foi medida no núcleo para minimizar a contaminação do sinal mitocondrial citosólico e a intensidade da fluorescência Rh123 foi normalizada para o sinal FCCP máximo para cada região de interesse.
[071] A resposta de Ca2+ mitocondrial induzida por gabazina em neurônios primários cultivados é registrada e analisada conforme descrito em um estudo anterior (Qiu et al, Nat Commun. 2013;4:2034, incorporado neste documento por meio de referência) usando um indicador de cálcio FRET 4mtD3cpv localizado especificamente na mitocôndria. Resumidamente, os níveis de Ca2+ mitocondrial foram detectados com o indicador 4mtD3cpv de Ca2+ baseado em FRET e direcionado para a mitocôndria. 4mtD3cpv foram excitados em 430±12nm (CFP) e 500±10nm (YFP), e as emissões de CFP (470±12nm) e YFP (535±15nm) foram separadas e filtradas usando um divisor de feixe DualView (AHF Analysentechnik e MAG Biosystems), e todas as imagens de fluorescência foram registradas através de uma objetiva de imersão em água 20x a 1Hz. Quantificação e Estatística
[072] Todo o trabalho estatístico foi executado pelo Prism (GraphPad). Todos os dados plotados representam a Média ± s.d. A análise ANOVA de duas vias foi usada para análises estatísticas, a menos que indicado de outra forma.
Reagentes
[073] Os seguintes reagentes foram usados neste estudo: MK-801 maleato (BN338, Biotrend), DL-APV (BN0858, Biotrend) e NMDA (BN0385, Biotrend).
Exemplo 2:A redução de TRPM4 protege os neurônios da toxicidade mediada pelo receptor NMDA
[074] A fim de investigar o papel do TRPM4 na excitotoxicidade mediada pelo receptor NMDA, os inventores usaram estratégias de interferência de RNA para reduzir o TRPM4. Neurônios primários de hipocampo de rato cultivados foram infectados no dia 3 in vitro (DIV3) com vírus adenoassociados recombinantes (rAAVs) proporcionando a expressão de um controle scramble (shSCR), shTRPM4-1 (SEQ ID NO:44) ou shTRPM4-2 (SEQ ID NO:45). Em DIV15-16, os neurônios eram desafiados com N-metil-D-aspartato (NMDA, 20µM) por 10min. Após a lavagem do NMDA, os neurônios foram mantidos no meio de cultura por mais 24 horas antes da análise. A redução do TRPM4 por ambos os shRNAs contra o TRPM4 protegeu significativamente os neurônios da excitotoxicidade induzida pelo NMDA. Evidentemente, o TRPM4 está, portanto, envolvido no processo de excitotoxicidade mediada pelo receptor NMDA.
Exemplo 3: O domínio N-terminal de TRPM4 de rato contém uma sequência que é neuroprotetora quando expressa em células HEK293
[075] Em uma próxima etapa, os inventores tentaram identificar regiões na proteína TRPM4 de rato potencialmente envolvidas na excitotoxicidade mediada pelo receptor de NMDA. Para este propósito, fragmentos polipeptídicos da proteína TRPM4 de rato foram gerados e seu impacto na excitotoxicidade induzida por NMDA foi analisado. Para isso, as culturas de neurônios primários foram infectadas com os respectivos rAAVs em DIV3,
desafiadas com NMDA (20µM) por 10min em DIV17, e a morte celular foi avaliada 24 horas depois.
[076] A primeira série de experimentos de fragmentação (compreendendo, respectivamente, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 e SEQ ID NO:49) revelou que o domínio N-terminal do TRPM4 de rato (SEQ ID NO:47) contém um elemento neuroprotetor, que pode prevenir a morte celular induzida pelo receptor NMDA, caso expresso em neurônios do hipocampo. Em uma outra série de experiências de fragmentação da SEQ ID NO:47 conduzidas de maneira análoga à apresentada acima, os inventores restringiram o motivo de aminoácidos que confere o efeito neuroprotetor. Os polipeptídeos compreendendo os seguintes fragmentos foram testados: SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:5. Como resultado, apenas a parte mais C-terminal do N- terminal de TRPM4 de rato, aa 433-489, é surpreendentemente neuroprotetora (SEQ ID NO:5), caso expressa em neurônios do hipocampo.
Exemplo 4: A adição de uma âncora de membrana aumenta o efeito neuroprotetor do peptídeo de acordo com a SEQ ID NO:5
[077] A sequência da SEQ ID NO:5 em TRPM4 está localizada in vivo logo abaixo da membrana plasmática. Portanto, os inventores raciocinaram que uma localização próxima à membrana de um polipeptídeo compreendendo a SEQ ID NO:5 pode aumentar o efeito neuroprotetor do referido polipeptídeo. Para testar esta hipótese, os inventores criaram uma proteína de fusão compreendendo a SEQ ID NO:5 e uma âncora GPI, SEQ ID NO:57. A sequência da fusão é dada na SEQ ID NO:53. Neurônios infectados com rAAV e expressando SEQ ID NO:47 (controle) ou SEQ ID NO:53 foram expostos a NMDA (20µM) por 10min em DIV15-16, com morte celular avaliada após 24h. Como resultado, foi demonstrado que uma membrana-âncora como a GPI pode aumentar a capacidade de proteger os neurônios da excitotoxicidade.
Exemplo 5: Uma variante da sequência da SEQ ID NO:5 também reduz a toxicidade celular mediada pelo receptor NMDA
[078] Em uma próxima etapa, os inventores criaram um mutante da SEQ ID NO:5, em que dois resíduos de fenilalanina adjacentes foram substituídos por resíduos de tirosina (SEQ ID NO: 54). Além disso, os inventores também avaliaram se uma região correspondente à SEQ ID NO:5 em TRPM5 de rato também forneceria um efeito neuroprotetor. TRPM5 é uma proteína relacionada, mas, no entanto, distinta de TRPM4. A região em TRPM5 correspondente à SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:55, compartilha apenas cerca de 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:5. Os neurônios foram infectados em DIV3 com rAAVs expressando a SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 54 ou SEQ ID NO:55 e expostos a NMDA (20µM) por 10min em DIV17, com morte celular avaliada 24h mais tarde. Como resultado, foi mostrado que a mutação dupla conservadora abrigando os dois resíduos de tirosina foi apenas ligeiramente menos eficaz na redução da toxicidade celular mediada pelo receptor NMDA do que a SEQ ID NO:5, enquanto a sequência TRPM5 mais distantemente relacionada da SEQ ID NO: 55 fez não reduzir a toxicidade celular mediada pelo receptor NMDA.
Exemplo 6: A exposição de neurônios a uma proteína de fusão compreendendo a SEQ ID NO:5 fundida a um domínio de transdução de proteína protege contra a toxicidade celular mediada pelo receptor NMDA
[079] Em uma experiência adicional, os inventores testaram a fusão de SEQ ID NO:5 e o domínio de transdução de proteína TAT (SEQ ID NO:42). A proteína de fusão resultante é referenciada aqui na SEQ ID NO:56. Os neurônios cultivados foram incubados com DMSO (veículo), 1µg de SEQ ID NO:56 ou 10µg de SEQ ID NO:56 por 1h antes de expostos a NMDA (20µM) por 10min em DIV15-16, com morte celular avaliada após 24h. Como resultado, a proteína de fusão de acordo com a SEQ ID NO:56 protegeu os neurônios da excitotoxicidade por NMDA. Exemplo 7: A expressão mediada por vetor viral da SEQ ID NO: 5 no córtex de rato protege contra danos cerebrais induzidos por oclusão da artéria cerebral média (MCAO)
[080] Dado o efeito protetor robusto da SEQ ID NO:5 em neurônios em cultura, os inventores analisaram, em seguida, seu potencial neuroprotetor in vivo usando o modelo de acidente vascular cerebral com oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Esta doença neurodegenerativa aguda foi escolhida porque a excitotoxicidade induzida pelo receptor
NMDA contribui significativamente para a lesão cerebral após a indução de condições isquêmicas. Os rAAVs contendo cassetes de expressão para SEQ ID NO:5 foram entregues estereotaticamente ao córtex do rato três semanas antes da MCAO e o dano cerebral foi quantificado 7 dias após a lesão. O volume de enfarte de ratos que expressam SEQ ID NO:5 no córtex foi significativamente menor do que o dos ratos de controle injetados intracerebralmente com PBS.
Métodos:
[081] Injeção estereotáxica intracerebral no córtex de ratos: Ratos machos C57BL/6N (8 semanas ± 5 dias de idade) pesando 25 1g foram agrupados aleatoriamente e anestesiados com uma mistura de Sedin©, Midazolam e Fentanyl®-Janssen e colocados em uma estrutura estereotáxica de roedor em uma almofada térmica controlada por um termômetro retal ATC1000 DC (World Precision Instruments, Berlim). O rAAV-SEQ ID NO:5 foi infundido no córtex esquerdo (coordenadas relativas a Bregma: primeiro local: AP 0,2mm; ML 2,0; DV - 2,0; segundo local: AP 0,2; ML 2,0; DV -1,8; terceiro local: AP 0,2; ML 3,0; DV -4,0; quarto local: AP 0,2; ML 3,0; DV -3,5.) usando uma Ultra Micro Pump III (World Precision Instruments, Berlim) para acionar uma seringa Nanofil de 10µl (World Precision Instruments, Berlim). Um volume total de 2µl contendo 1-2 × 109 partículas genômicas de rAAV foi injetado a uma taxa de 200nl/min, após o qual a agulha foi deixada no local em cada local de injeção por 2 minutos para evitar refluxo antes da retirada da agulha.
Ratos de controle foram injetados com o mesmo volume de PBS usando o mesmo método. Após as injeções estereotáxicas, os ratos foram autorizados a se recuperar da anestesia por aplicação subcutânea de uma mistura com ATIPAZOLE, Flumazenil e Naloxon e foram devolvidos às suas gaiolas quando estavam totalmente despertos. Três semanas após a entrega estereotáxica de rAAVs, os animais foram submetidos à oclusão da artéria cerebral média (MCAO).
[082] MCAO: A oclusão da artéria cerebral média (MCAO) induziu uma oclusão distal permanente da artéria cerebral média (MCA). Ratos machos C57BL/6N (8 semanas ± 5 dias de idade) foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 500µl de Tribrometanol (250mg/kg de peso corporal) e colocados em posição reclinada. Os animais respiraram espontaneamente e não foram ventilados. Uma incisão foi feita do olho esquerdo até a orelha. Quando o músculo temporal foi removido por eletrocoagulação, o MCA esquerdo era visível através da superfície temporal semitranslúcida do crânio. Após a realização de um pequeno orifício no osso temporal com broca dentária, a camada interna do crânio foi removida com uma pinça fina e a dura-máter foi aberta com cuidado para expor a MCA. Foi tomado cuidado para evitar danos ao tecido cerebral. Solução de NaCl (0,9%) estava presente no entorno do MCA. Um eletrocoagulador microbipolar ERBE ICC 200 (Erbe Elektromedizin GmbH, Tübingen) foi usado para ocluir permanentemente o MCA. Durante os procedimentos cirúrgicos, a temperatura retal foi mantida a 37 ± 0,5°C com uma placa de aquecimento de temperatura controlada ATC1000 DC (World Precision
Instruments, Berlim). Depois que a incisão foi fechada, os ratos foram autorizados a se recuperar da anestesia e voltaram para suas gaiolas, onde a temperatura foi mantida em 37°C, colocando a gaiola em uma placa de aquecimento HT 50 S (Minitüb, Tiefenbach). Nessas condições, os animais foram mantidos homeotérmicos até a recuperação completa da anestesia. Ratos operados de forma simulada foram submetidos a procedimentos idênticos sem a oclusão do MCA. No dia 7 após a MCAO, os animais foram sacrificados sob anestesia profunda com Narcoren® e perfundidos intracardialmente com 20ml de solução de NaCl (0,9%). Os cérebros foram removidos do crânio e imediatamente congelados em gelo seco. Seis crio-cortes coronais consecutivos de 20µm de espessura foram cortados a cada 400µm e submetidos à determinação do volume total do enfarte usando uma técnica de coloração com prata padrão. As seções coradas com prata foram escaneadas a 1200dpi e a área do enfarte foi medida usando o software ImageJ (NIH Image). A cirurgia foi realizada e o dano isquêmico foi medido por um investigador que não tinha conhecimento do grupo de tratamento, sendo o rAAV ou proteína recombinante aplicados por injeção estereotáxica ou administração intranasal.
[083] Como resultado, a expressão de um polipeptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:5 reduziu efetivamente os volumes de enfarte, protegendo assim contra danos cerebrais induzidos por oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Exemplo 8: O peptídeo compreendendo a sequência da SEQ ID NO: 5 e uma variante desta protege contra a quebra do potencial da membrana mitocondrial induzida pelo receptor NMDA
[084] A disfunção mitocondrial é uma marca registrada da excitotoxicidade do receptor NMDA e um evento precoce a caminho da morte neuronal. Um parâmetro frequentemente usado para avaliar a integridade mitocondrial é o potencial de membrana mitocondrial. Uma quebra do potencial da membrana mitocondrial pode ser observada após a exposição dos neurônios do hipocampo ou corticais ao NMDA e indica disfunção mitocondrial associada à excitotoxicidade. Portanto, os inventores investigaram o efeito de polipeptídeos compreendendo a sequência da SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:54, bem como da sequência de controle TRMP5 (SEQ ID NO:55) na quebra do potencial da membrana mitocondrial em neurônios primários do hipocampo de rato. A excitotoxicidade levando à quebra do potencial da membrana mitocondrial foi induzida com a aplicação do banho de NMDA de 20µM. Após 11 minutos, o desacoplador mitocondrial, carbonilcianeto-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) foi adicionado. A adição de FCCP leva à quebra do potencial da membrana mitocondrial e serviu como um controle do sistema de teste.
[085] Como resultado, os polipeptídeos compreendendo a sequência da SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:54, respectivamente, foram ambos capazes de prevenir a quebra do potencial da membrana mitocondrial induzida pelo receptor NMDA, enquanto a sequência TRPM5 mais distantemente relacionada da SEQ ID NO:55 não é capaz de prevenir a quebra do potencial da membrana mitocondrial induzida pelo receptor NMDA.
Exemplo 9: Os peptídeos de acordo com SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:54 não afetam a sinalização do receptor NMDA sináptico
[086] Em um outro experimento, os inventores avaliaram o impacto do polipeptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 54, respectivamente, no influxo de cálcio induzido por Gabazina (mitocôndrias), uma medida de sinalização do receptor NMDA sináptico. O experimento foi realizado em neurônios de cultura primária, conforme descrito acima. Como resultado, nem o polipeptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:5 nem o polipeptídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO:54 interferiram com o influxo de cálcio induzido por Gabazina nas mitocôndrias, indicando que nenhum destes polipeptídeos afeta a sinalização do receptor NMDA sináptico.
Exemplo 10: Triagem virtual para compostos que potencialmente se ligam a SEQ ID NO:5 em TRPM4 de rato
[087] Em uma próxima etapa, os inventores tentaram identificar compostos de moléculas pequenas capazes de interagir com o domínio importante identificado acima de TRPM4 com o objetivo de identificar compostos potencialmente capazes de anular a toxicidade induzida pelo receptor de NMDA.
Estrutura da Proteína
[088] A estrutura da proteína usada para este trabalho foi a estrutura de microscopia crioeletrônica de 2,88Å de TRPM4 de rato depositada no Protein Data Bank (PDB ID: 6BCO). Uma alternativa seria uma estrutura humana, como 5WP6, 6BQR, 6BQV etc.). Antes de outras atividades, a estrutura foi submetida ao Maestro Protein Preparation Wizard (Schrödinger Release 2017-3: Maestro, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017) para remover artefatos potenciais, adicionar átomos de hidrogênio e atribuir estados de protonação de resíduos de acordo com a um pH de 7,0. Após a preparação, todos os átomos que não pertencem à proteína (por exemplo, moléculas de ATP) foram removidos.
Definição de Local de Ligação
[089] A região usada para encaixe molecular foi definida na proximidade de 4Å de resíduos de TRPM4, como considerado relevante para a atividade de proteína (resíduos de 6BCO 633-650, 654, 655, 657, 664-668). Ver também os resíduos de aminoácidos 1 a 36 da SEQ ID NO:5.
Encaixe Molecular
[090] O encaixe à estrutura da proteína foi realizado com Schrödinger Glide (Schrödinger Release 2017-3: Glide, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2017). Os compostos iniciais foram encaixados no modo de triagem virtual de alto rendimento (HTVS). Os acertos do HTVS (pontuação de encaixe de -5kcal/mol ou mais exigida) foram transferidos para o modo de encaixe SP mais preciso e computacionalmente caro. Os acertos de SP com pontuações de encaixe de -
6kcal/mol ou melhores foram submetidos a um cálculo de deformação do ligante (diferença de energia entre a postura e uma conformação de solução de energia mínima) com o campo de força OPLS3. As cepas abaixo de 7kcal/mol foram geralmente desejadas, com exceção das moléculas com uma grande quantidade de ligações rotativas. A seleção final do composto foi feita com base nas pontuações de encaixe, valores de tensão e inspeção visual da pose encaixada. Imagens correspondentes foram geradas com o PyMOL Molecular Graphics System, Versão 2.0 Schrödinger, LLC.
Resultados
[091] A triagem rendeu os seguintes compostos promissores: Tabela 2: Compostos candidatos promissores obtidos por acoplamento Pontuação Deformação # Composto de encaixe interna [kcal/mol] [kcal/mol] P4 -7,05 0,03
P8 -6,78 3,52
P9 -6,76 5,53
P13 -6,66 3,05
Pontuação Deformação # Composto de encaixe interna [kcal/mol] [kcal/mol] P15 -6,62 4,46 Exemplo 11: As moléculas pequenas de acordo com a presente invenção protegem contra a toxicidade celular induzida pelo receptor NMDA
[092] Neste experimento, os seguintes compostos foram testados quanto à sua adequação para proteger as células HEK293 contra a citotoxicidade induzida pelo receptor NMDA:
# Composto
P4
P8
P9
# Composto
P13
P15
(Glibenclamida)
[093] A experiência foi realizada como descrito acima. Como resultado, os compostos P4, P8, P9, P13 e P15 reduziram o nível de morte celular induzida pelo receptor de NMDA. A glibenclamida é um bloqueador conhecido da função do TRPM4 e serviu como um controle positivo. O efeito observado com estas substâncias confirma a utilidade do rastreio virtual para identificar compostos candidatos adequados para inibir a toxicidade celular mediada pelo receptor NMDA e a importância do motivo TRPM4 inventivo para a toxicidade celular mediada pelo receptor NMDA.
Exemplo 12: Outras moléculas pequenas de acordo com a presente invenção
[094] Em vista dos resultados obtidos para o composto P4 do exemplo 11 acima, as seguintes nove variantes adicionais deste foram testadas como essencialmente descrito acima: P401 P402 P403
P404 P405 P406 P407 P408 P409
[095] A experiência foi realizada como descrito acima. Resumidamente, os neurônios foram pré-tratados por 30 min com 10µM do composto indicado e, em seguida, desafiados com NMDA (20µM) por 10 min (toxicidade NMDA transiente) ou com NMDA (20µM) por 24 horas (toxicidade NMDA crônica). A morte celular foi avaliada 24 horas após o desafio com NMDA. Para avaliação da morte celular, os neurônios foram fixados com paraformaldeído 4%, sacarose 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 15 min, lavados com PBS e contrastados com Hoechst 33258 (1µg/ml) por 10min. As células foram montadas em Mowiol 4-88 e examinadas por microscopia de fluorescência. Os neurônios mortos foram identificados por núcleos amorfos ou encolhidos. Como resultado, as variantes do composto P4, isto é, os compostos P401 a P409, reduziram o nível de morte celular induzida pelo receptor de NMDA.
Exemplo 13: Toxicidade mediada por receptor NMDA em eliminação de TRPM4 em células HEK293
[096] Em um experimento adicional, foi avaliado o impacto de uma eliminação do TRPM4 na toxicidade mediada pelo receptor NMDA em células HEK293. Resumidamente, células HEK293 (tanto da linha de tipo selvagem como da linha de eliminação de TRPM4) (Ozhathil et al., British Journal of Pharmacology 175, 2504-2519) foram cultivadas em suplemento de meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco™, 41965-039) com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco™, 10270), 1% de piruvato de sódio (Gibco™, 11360070), 1% de MEM NEAA (Gibco™, 11140035) e 0,5% de penicilina- estreptomicina (PS; Sigma, P0781) e as Passagens 15-25 foram usadas para experimentos. Para testar a citotoxicidade dos compostos de acordo com a presente invenção, células HEK293 (70-80% confluentes) foram transfectadas 24 horas após o plaqueamento com GRIN1 e
GRIN2A ou GRIN2B, respectivamente (1:1, 0,2mg/cm2) com Lipofectamine 2000 de acordo com as instruções do fabricante. O número relativo de células mortas na população nos pontos de tempo indicados após a transfecção foi medido com o ensaio de citotoxicidade CytoTox-Glo™ (Promega, G9290) de acordo com as instruções do fabricante, com pequenas modificações. Resumidamente, 10% do meio total foi misturado com 10µL de AAF-amino luciferina para atingir um volume final de 200µL com água, as unidades de luminescência relativa das células mortas (DRLU) foram medidas por GloMax (Promega) em uma microplaca de poliestireno de fundo branco de 96 poços (Corning Costar®, 3912). Após todas as medições, os reagentes de lise foram adicionados às células e 10% do lisado foi usado para a medição das unidades de luminescência relativa da célula total (TRLU). A morte celular foi calculada pelas seguintes equações: 10 ∗ 𝐷𝑅𝐿𝑈 𝑀𝑜𝑟𝑡𝑒 𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟(%) = ∗ 100 10 ∗ 𝑇𝑅𝐿𝑈 + 𝐷𝑅𝐿𝑈
[097] Como resultado, a toxicidade mediada pelo receptor NMDA foi muito reduzida nas células HEK293 de redução TRPM4 em comparação com as células HEK293 de tipo selvagem. Isso se alinha com os resultados relatados no Exemplo 2.
Exemplo 14: Impacto do composto P4 e P15 nos transientes de cálcio induzidos por NMDA
[098] Em um outro experimento, o impacto de P4 e P15 em transientes de cálcio induzidos por NMDA foi avaliado.
Resumidamente, para imagens de cálcio, neurônios primários do hipocampo em lamínulas foram carregados com o indicador de cálcio raciométrico de alta afinidade, permeável a células Fura2-AM (Invitrogen™ F1221), a 1µM em meio de cultura independente de CO2 (CICM; CICM contém: 10mM HEPES; 140mM NaCl; 2,5mM KCl; 1,0mM MgCl2; 2,0mM CaCl2; Glicina 1,0mM, Glicose 35,6mM e Na-piruvato 0,5mM) por 30min a 37°C, depois lavado e deixado em CICM por mais 30min para permitir a desesterificação.
Fura2 foi excitado a 340/11nm e 380/11nm, e a emissão de fluorescência foi obtida de uma objetiva compatível com UV 40x (LUMPLFLN, Olympus) através de um filtro de emissão 510/20nm.
Para quantificação, o ImageJ foi usado para calcular as intensidades médias de fluorescência subtraída do fundo para excitação de 340 e 380nm (F340 e F380) de cada neurônio.
Os níveis de cálcio intracelular foram representados graficamente como razões F340/F380 ao longo do tempo, a partir das quais a amplitude de resposta de NMDA e a área sob a curva (AUC) foram calculadas para quantificar o influxo de cálcio induzido por NMDA.
Surpreendentemente, ao contrário do bloqueador de receptor de NMDA clássico, MK-801, que bloqueou completamente os transientes de cálcio induzidos por NMDA, nem o composto P4, tampouco o composto P15 reduziram os transientes de cálcio induzidos por NMDA em neurônios do hipocampo.
Assim, P4 e P15 bloqueiam a excitotoxicidade do receptor NMDA, mas sem comprometer a função do canal de cálcio do receptor NMDA, que é essencial para o papel fisiológico dos receptores NMDA na sinalização da sinapse para o núcleo, regulação do gene e funções cognitivas, incluindo aprendizagem e memória.
Exemplo 15: Impacto do composto P4 na imunoprecipitação do complexo receptor NMDA/TRPM4
[099] Em uma experiência adicional, foi avaliado se o composto P4 tem algum impacto na formação do complexo receptor NMDA/TRPM4. Para este propósito, experimentos de co-imunoprecipitação usando lisados cerebrais do córtex de rato foram realizados. Resumidamente, lisados corticais foram obtidos de ratos controle e de ratos 2h, 6h e 24h após injeção intraperitoneal do composto P4 (40 mg/kg) em tampão de imunoprecipitação (10mM Tris; pH 8,0; 150mM NaCl; EDTA 1mM; NP-40 a 1%, glicerol a 10% com Protease Inhibitor Cocktail, Roche) por 60min. O lisado foi então centrifugado durante 12min a 1200g para remover resíduos celulares e núcleos. A mistura de sobrenadante foi incubada com anticorpos anti-TRPM4 durante a noite. Esferas magnéticas de proteína A (Pierce™ Protein A Magnetic Beads) foram adicionadas à mistura e misturadas por mais 12h, seguido por 3 lavagens com tampão de imunoprecipitação. Os precipitados foram subsequentemente fervidos em tampão de carga de proteína e separados em SDS-PAGE a 7,5%.
[0100] Os inventores encontraram uma redução na formação do receptor NMDA/complexo TRPM4 de 51% em 2h e 61% em 6h após uma única injeção intraperitoneal (i.p.) de 40 mg/kg do composto P4. 24h após a injeção i.p. do composto P4, o receptor NMDA/complexo TRPM4 foi reformado.
Exemplo 16: Impacto do composto P4 na degeneração induzida por NMDA de células ganglionares retinais (RGCs)
[0101] Os inventores também avaliaram se o composto P4 pode proteger as células ganglionares da retina contra a degeneração induzida por NMDA. Para tanto, 28 ratos C57BL (25 ± 3,5g) foram alocados aleatoriamente em dois grupos. Todos os ratos receberam veículo (óleo de girassol contendo 5% de etanol) ou P4 (40 mg/kg, dissolvido em óleo de girassol contendo 5% de etanol) por meio de injeção intraperitoneal em -16h, -3h, 0h, +3h e +24h em um volume de 50µL cada injeção. Em 0h, os ratos receberam 20nmol de NMDA (volume total: 2,0µL) por injeção intravítrea no olho esquerdo e solução salina (volume total: 2,0µL) no olho direito. Ambos os olhos foram removidos de ratos sacrificados 7 dias após as injeções intravítreas e fixados em formalina por 15min antes de as retinas serem dissecadas e processadas para imunocoloração de montagem inteira. As retinas foram incubadas em solução de bloqueio (FBS a 10%, Triton-X 100 a 1% em PBS) por 6h, seguido de incubação de 24h com anticorpo anti-Brn3a em solução de bloqueio a 4 □. As retinas foram lavadas 3 vezes com PBS e incubadas com Alexa Fluor-594 Donkey anti-coelho durante 24h em temperatura ambiente. As retinas foram lavadas novamente, cortadas e montadas em lâminas. Para cada retina, as imagens foram obtidas de oito campos (554µm × 554µm) em torno da retina periférica (dois de cada quadrante e localizados a ~600µm ou ~1400µm até o buraco macular) para minimizar a variabilidade associada à localização na densidade de RGCs. Todas as imagens foram obtidas usando o software Las X por meio de uma objetiva HC PL APO 20x em um Leica TCS SP8LIA em um microscópio confocal vertical DM6 CFS. As células positivas para Brn3a foram identificadas e contadas via macro no Cellprofiler. A análise dos dados foi realizada de modo simples-cego, sem conhecimento do tratamento.
[0102] Os inventores descobriram que o composto P4 reduziu a degeneração das células ganglionares da retina (RGC) após injeção intravítrea de ratos com NMDA (20nmol).
Exemplo 17: Impacto do composto P4 e do composto P15 na função do canal TRPM4
[0103] Para avaliar qualquer impacto direto do composto P4 e do composto P15 na função do canal TRPM4 independente dos receptores NMDA, os inventores usaram a linha de células de câncer de próstata PC3 e registros de patch clamp. As células PC3 são conhecidas por expressar canais TRPM4 (C. Holzmann et al., Oncotarget. 6, 41783–93 (2015)). As correntes de TRPM4, por sua vez, são caracterizadas por sua dependência de cálcio e retificação externa (P. Launay et al., Cell. 109, 397–407 (2002)). Resumidamente, gravações de patch clamp de células inteiras foram feitas de células PC3 plaqueadas em lamínulas redondas de 12mm fixadas com um anel de platina em uma câmara de gravação (OAC-1, Science Products GmbH) montada em um microscópio vertical de estágio fixo (BX51WI, Olympus). As lamínulas foram submersas com solução extracelular de fluxo contínuo (3ml/min) a 32-35°C (em mM: NaCl, 156; MgCl2, 2; CaCl2, 1,5; HEPES, 10; glicose, 10).
Eletrodos adesivos (3-4 MΩ) foram feitos de vidro borosilicato de 1,5mm e preenchidos com soluções à base de césio (em mM: CsCl, 145; NaCl, 8; HEPES, 10; MgCl2, 1; mais EGTA, 0,2 para uma concentração de Ca2+ livre de zero; ou EGTA, 10 e CaCl2, 9,4 para uma concentração calculada de Ca2+ livre de 10µM; Maxchelator, Stanford University). As gravações foram feitas com um amplificador Multiclamp 700B, digitalizadas através de um Digidata 1550B e adquiridas e analisadas no software pClamp 10 (Molecular Devices). A resistência de acesso (faixa: 10 – 20 MΩ) foi monitorada regularmente durante os registros do grampo de tensão e os dados foram rejeitados se ocorreram alterações maiores que 20%.
[0104] Como resultado, 10µM de Ca2+ ativou uma corrente de retificação externa semelhante ao TRPM4 nas células PC3 e essa corrente não foi afetada por P4 ou P15. Assim, nem P4 nem P15 comprometem a função do canal TRPM4 per se.

Claims (18)

/ 1/10 Reivindicações
1. Um polipeptídeo caracterizado por compreender: i) uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3, em que o polipeptídeo é de no máximo 685 aminoácidos em comprimento, preferencialmente no máximo 200 aminoácidos em comprimento; ii) uma sequência de aminoácidos derivada da SEQ ID NO:3, em que a sequência de aminoácidos derivada possui pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, e em que o polipeptídeo tem, no máximo, 200 aminoácidos em comprimento; ou iii) uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:4, em que o polipeptídeo tem no máximo 350 aminoácidos de comprimento, preferencialmente no máximo 200 aminoácidos em comprimento.
2. Uma proteína de fusão caracterizada por compreender o polipeptídio da reivindicação 1 e pelo menos uma outra sequência de aminoácidos heteróloga à sequência de aminoácidos de i), ii) ou iii), respectivamente.
3. A proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a sequência polipeptídica heteróloga é selecionada a partir de um grupo que consiste em um polipeptídeo de ancoragem de membrana, um domínio de transdução de proteína e um marcador.
/ 2/10
4. O polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, ou a proteína de fusão da reivindicação 2, ou a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos derivada da sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3 é: i) uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, ou é ii) uma sequência de acordo com a sequência de consenso da SEQ ID NO:4, em particular a SEQ ID NO:5, com a condição de que a referida derivada não seja a SEQ ID NO:3.
5. Um ácido nucleico caracterizado por codificar qualquer um dentre um polipeptídio, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 4, e uma proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 e 4.
6. Uma composição caracterizada por compreender qualquer um dentre um polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 4, uma proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3 e 4, e um ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5, e compreender adicionalmente pelo menos um entre um carreador, um diluente ou um excipiente farmaceuticamente aceitável.
7. A composição de acordo com a reivindicação 6,
/ 3/10 caracterizada pelo fato de que a composição contém uma nanopartícula compreendendo qualquer um dentre o referido polipeptídeo, de acordo com as reivindicações 1 ou 4, a referida proteína de fusão, de acordo com as reivindicações 2, 3 e 4, e o referido ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5.
8. Uso de um composto em um método para tratar ou prevenir uma doença do corpo humano ou animal caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em: i) um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 4, ii) um polipeptídeo que se liga à SEQ ID NO:3 ou sua derivada, em que a derivada é i) uma sequência apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, ou ii) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:4, e em que o polipeptídeo é um anticorpo ou anticalina, iii) uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 e 3, iv) um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, v) um composto de acordo com a seguinte fórmula: (fórmula I), em que:
/ 4/10 R1 e R2 são, cada um, independentemente selecionados dentre hidrogênio, alquil (C≤12) e alquil (C≤12) substituído; e R3, R4 e R5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, hidroxi e halo; ou um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitos destes, e vi) um composto selecionado a partir do grupo de compostos consistindo em: e um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitos de qualquer um desses compostos.
9. Um composto para uso em um método para tratar ou prevenir uma doença do corpo humano ou animal, caracterizado pelo fato de que o composto é um inibidor da formação do receptor de NMDA/complexo
/ 5/10 TRPM4.
10. O composto para uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado a partir do grupo consistindo em: i) um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 4, ii) um polipeptídeo ligado à SEQ ID NO:3 ou sua derivada, em que a derivada é i) uma sequência apresentando pelo menos 80% da identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, ou ii) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:4, e em que o polipeptídeo é um anticorpo ou anticalina, iii) uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 e 3, iv) um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, v) um composto de acordo com a seguinte fórmula: (fórmula I), em que: R1 e R2 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquil (C≤12), e alquil(C≤12) substituído; e R3, R4 e R5 são, cada um, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, hidroxi e
/ 6/10 halo; ou um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceutcamente aceitos destes, e vi) um composto selecionado do grupo dos compostos que consiste em:
e um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitos de qualquer um desses compostos.
/ 7/10
11. O composto para uso de acordo com as reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o composto é selecionado a partir do grupo que consiste em: , e e um sal, solvato, polimorfo, tautômero, racemato ou enantiômero farmaceuticamente aceitos de qualquer um desses compostos.
12. O composto para uso de acordo com as reivindicações 8
/ 8/10 ou 9, caracterizado pelo fato de que a doença é uma doença neurológica, em particular uma doença neurodegenerativa.
13. O composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada a partir do grupo consistindo em acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer (AD), esclerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington (HD), lesão cerebral traumática, esclerose múltipla, excitotoxicidade induzida por glutamato, distonia, epilepsia, doença do nervo óptico, retinopatia diabética, glaucoma, dor, em particular a dor neuropática, encefalite do receptor anti-NMDA, encefalopatia viral, demência vascular, microangiopatia, doença de Binswanger, isquemia cerebral, hipoxia e doença de Parkinson, esquizofrenia, depressão, malária cerebral, dano cerebral associado à toxoplasmose, dano cerebral associado à infecção pelo HIV, dano cerebral associado à infecção pelo Zika vírus e um tumor cerebral.
14. O composto para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o composto está contido em uma nanopartícula.
15. Uso de um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3 ou uma derivada desta, caracterizado pelo fato de que a derivada é i) uma sequência apresentando pelo
/ 9/10 menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, ou ii) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO4, em um ensaio de interação entre proteínas in vitro.
16. Um método para identificar um composto que potencialmente interaja com uma proteína TRPM4 compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3 ou uma derivada desta, caracterizado pelo fato de que a derivada é i) uma sequência apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, ou ii) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:4, em que o método compreende: i) encaixe virtual assistido por um computador de um composto candidato a uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3, ou uma derivada da referida sequência, em que a derivada é i) uma sequência apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, ou ii) uma sequência de acordo com a SEQ ID NO:4, em que a referida sequência de aminoácidos é proporcionada em uma estrutura virtual em 3-D de um polipeptídeo compreendendo a referida sequência de aminoácidos, e ii) determinar a pontuação do encaixe e/ou deformação interna para encaixar o composto candidato virtualmente à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:3 ou sua derivada, e opcionalmente iii) contatar de forma in vitro ou in vivo o composto
/ 10/10 candidato com uma proteína TRPM4 para determinar se o composto candidato modula a atividade da referida proteína TRPM4 ou não.
17.Uma célula, em particular uma célula não neuronal, caracterizada pelo fato de que a referida célula expressa um receptor NMDA recombinante, e em que a expressão de TRPM4 na referida célula esteja ausente, reduzida ou inativa.
18.Um inibidor de TRPM4 para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença do corpo humano ou animal, caracterizado pelo fato de que a doença seja causada por excitotoxicidade mediada por receptor de NMDA.
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