BR112021005670A2 - tetrameric her2 binding polypeptides - Google Patents
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Abstract
Polipeptídeo tetramérico compreendendo uma primeira cadeia polipeptídica compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno VL e um primeiro domínio constante CL, uma segunda cadeia polipeptídica compreendendo um primeiro domínio de ligação ao antígeno VH, um primeiro domínio constante CH1, um primeiro domínio constante CH2 e um primeiro domínio constante CH3, um primeiro ligante de ligação a um epítopo D4 de HER2 ligado ao terminal N do dito primeiro domínio de ligação ao antígeno VL ou dito primeiro domínio de ligação ao antígeno VH por um primeiro ligante de aminoácido de interdomínio, uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo um segundo domínio de ligação ao antígeno VL e um segundo domínio constante CL, uma quarta cadeia polipeptídica compreendendo um segundo domínio de ligação ao antígeno VH, um segundo domínio constante CH1, um segundo domínio constante CH2 e um segundo domínio constante CH3 e um terceiro ligante que se liga a um epítopo D4 de HER2 ligado ao terminal N do dito segundo domínio de ligação ao antígeno VL ou o dito segundo domínio de ligação ao antígeno VH por um segundo ligante de aminoácido de interdomínio, em que os domínios de ligação ao antígeno VL e os domínios de ligação ao antígeno VH juntos constituem um segundo ligante e um quarto ligante que se liga a um epítopo D1 de HER2. A invenção também se refere ao polipeptídeo tetramérico para uso em um método para a prevenção ou tratamento de uma doença neoplásica maligna, um ácido nucleico isolado e uma célula hospedeira para expressão do polipeptídeo e um método para obter o polipeptídeo.A tetrameric polypeptide comprising a first polypeptide chain comprising a first VL antigen binding domain and a first constant CL domain, a second polypeptide chain comprising a first VH antigen binding domain, a first constant CH1 domain, a first constant CH2 domain, and a first constant domain CH3, a first linker binding to a D4 epitope of HER2 linked to the N-terminus of said first VL antigen binding domain or said first VH antigen binding domain by a first interdomain amino acid linker, a third chain A polypeptide comprising a second VL antigen binding domain and a second CL constant domain, a fourth polypeptide chain comprising a second VH antigen binding domain, a second constant CH1 domain, a second constant CH2 domain, and a second constant CH3 domain, and a third ligand that binds to a terminal-bound HER2 D4 epitope N of said second VL antigen binding domain or said second VH antigen binding domain by a second interdomain amino acid linker, wherein the VL antigen binding domains and the VH antigen binding domains together constitute a second ligand and a fourth ligand that binds to a D1 epitope of HER2. The invention also relates to a tetrameric polypeptide for use in a method for the prevention or treatment of a malignant neoplastic disease, an isolated nucleic acid and a host cell for expressing the polypeptide, and a method for obtaining the polypeptide.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ- DEOS TETRAMÉRICOS DE LIGAÇÃO A HER?2".Patent Descriptive Report for "HER-2 BINDING TETRAMERIC POLYPEPTIDES".
[0001] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo tetraméri- co que possui dois sítios de ligação ao epítopo D1 de HER?2 e dois sí- tios de ligação ao epítopo D4 de HER?2. Antecedentes da invençãoThe present invention relates to a tetrameric polypeptide that has two binding sites to the D1 epitope of HER?2 and two binding sites to the D4 epitope of HER?2. Background of the invention
[0002] Os membros da família HER de tirosina quinases recepto- ras são mediadores importantes do crescimento, diferenciação, migra- ção e sobrevivência celular. A família de receptores inclui quatro membros distintos, incluindo o receptor do fator de crescimento epi- dérmico (EGFR, ErbB1 ou HER1), HER2 (ErbB2 ou p185<neu>), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4). Os membros da família EGFR são glicoproteínas modulares de cadeia única intimamente relacionadas com uma região de ligação de ligante extracelular, um único domínio transmembranar e uma tirosina quinase intracelular, seguido por sítios de fosforilação específicos que são importantes para a ancoragem de proteínas de sinalização a jusante.[0002] Members of the HER family of receptor tyrosine kinases are important mediators of cell growth, differentiation, migration and survival. The receptor family includes four distinct members, including the epidermal growth factor receptor (EGFR, ErbB1 or HER1), HER2 (ErbB2 or p185<neu>), HER3 (ErbB3) and HER4 (ErbB4). Members of the EGFR family are single-chain modular glycoproteins closely related to an extracellular ligand binding region, a single transmembrane domain, and an intracellular tyrosine kinase, followed by specific phosphorylation sites that are important for anchoring downstream signaling proteins .
[0003] As regiões extracelulares da família do receptor HER con- têm dois domínios de ligação do ligante homólogo (domínios 1 e 3) e dois domínios ricos em cisteína (domínios 2 e 4), que são importantes para a dimerização do receptor. Na ausência de um ligante, os recep- tores HER normalmente existem como monômeros inativos, conheci- dos como a estrutura "amarrada", que é caracterizada pela interação próxima dos domínios 2 e 4. A ligação do ligante ao domínio extracelu- lar inicia um rearranjo conformacional, expondo os domínios de dime- rização 2 e 4. Portanto, a ligação de fatores de crescimento a recepto- res HER induz mudanças conformacionais que permitem a dimeriza- ção do receptor. Após a dimerização do receptor extracelular, as héli- ces transmembranares mudam para uma conformação ativa que per- mite que os domínios da quinase intracelular se transautofosforilem.[0003] The extracellular regions of the HER receptor family contain two homologous ligand binding domains (domains 1 and 3) and two cysteine-rich domains (domains 2 and 4), which are important for receptor dimerization. In the absence of a ligand, HER receptors normally exist as inactive monomers, known as the "tied" structure, which is characterized by the close interaction of domains 2 and 4. Ligand binding to the extracellular domain initiates a conformational rearrangement, exposing dimerization domains 2 and 4. Therefore, the binding of growth factors to HER receptors induces conformational changes that allow dimerization of the receptor. After dimerization of the extracellular receptor, the transmembrane helices change to an active conformation that allows the domains of the intracellular kinase to transautophosphoryle.
Este evento de fosforilação permite o recrutamento de proteínas de sinalização específicas a jusante.This phosphorylation event allows for the recruitment of specific downstream signaling proteins.
[0004] O receptor 1 do fator de crescimento epidérmico (EGFR), foi causalmente implicado na malignidade em humanos. Em particular, o aumento da expressão de EGFR foi observado em câncer de mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estômago, assim como em glioblastomas.[0004] Epidermal growth factor receptor 1 (EGFR) has been causally implicated in malignancy in humans. In particular, increased EGFR expression has been observed in breast, bladder, lung, head, neck and stomach cancers, as well as in glioblastomas.
[0005] O receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2, também conhecido como ErbB2 ou Neu; UniProtKB/Swiss-Prot Nº PO4626) consiste em 1233 aminoácidos e é estruturalmente seme- lhante ao EGFR, com um domínio extracelular consistindo em quatro subdomínios 1-4, um domínio transmembranar, um domínio justa- membranar, uma tirosina quinase citoplasmática intracelular e uma região C-terminal reguladora. Contudo, a estrutura da região extracelu- lar de HER? é diferente em aspectos importantes dos outros recepto- res de EGF. Nos outros receptores de EGF, em um estado não ativa- do, o domínio 2 se liga ao domínio 4. Após a ligação aos domínios 1 e 3, o fator de crescimento de ativação (ligante) seleciona e estabiliza uma conformação que permite que um braço de dimerização se es- tenda do domínio 2 para interagir com um par de dímero de ErbB. O HER2, por outro lado, tem uma conformação fixa que se assemelha ao estado ativado por ligante dos outros membros do receptor: a intera- ção do domínio 2-4 está ausente e a alça de dimerização no domínio 2 está continuamente exposta. O HER2 é ativado através da formação de complexos heterodiméricos com outros membros da família ErbB e, assim, indiretamente regulado por ligantes EGFR e HER3. O HER2 é o parceiro de heterodimerização preferido dos três outros receptores ErbB, aumentando a afinidade dos outros receptores ErbB a seus |li- gantes ao reduzir a taxa de dissociação do complexo ligante- receptor,pelo qual o HER2 aumenta e prolonga a sinalização.[0005] Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2, also known as ErbB2 or Neu; UniProtKB/Swiss-Prot No. PO4626) consists of 1233 amino acids and is structurally similar to EGFR, with an extracellular domain consisting of four subdomains 1-4, a transmembrane domain, a juxtamembrane domain, an intracellular cytoplasmic tyrosine kinase, and a regulatory C-terminal region. However, the structure of the extracellular region of HER? it is different in important respects from other EGF receptors. In the other EGF receptors, in an unactivated state, domain 2 binds to domain 4. After binding to domains 1 and 3, the activating growth factor (ligand) selects and stabilizes a conformation that allows a dimerization arm extends from domain 2 to interact with an ErbB dimer pair. HER2, on the other hand, has a fixed conformation that resembles the ligand-activated state of the other members of the receptor: the domain 2-4 interaction is absent and the dimerization loop in domain 2 is continuously exposed. HER2 is activated through the formation of heterodimeric complexes with other members of the ErbB family and thus indirectly regulated by EGFR and HER3 ligands. HER2 is the preferred heterodimerization partner of the three other ErbB receptors, increasing the affinity of the other ErbB receptors for their ligands by reducing the dissociation rate of the ligand-receptor complex, whereby HER2 increases and prolongs signaling.
[0006] Um excesso de HER2 na superfície celular causa a trans- formação de células epiteliais de vários tecidos. A amplificação do ho- mólogo humano do gene neu (também conhecido como HER2) é ob- servada em cânceres de mama e ovário, e se correlaciona com um prognóstico ruim (US 4.968.603). A superexpressão de HER2 também foi observada em outros carcinomas, incluindo carcinomas de estôma- go, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tireoide, pâncreas e bexiga. Anticorpos direcionados ao HER2[0006] An excess of HER2 on the cell surface causes the transformation of epithelial cells of various tissues. Amplification of the human homolog of the neu gene (also known as HER2) is seen in breast and ovarian cancers, and correlates with poor prognosis (US 4,968,603). HER2 overexpression has also been observed in other carcinomas, including carcinomas of the stomach, endometrium, salivary gland, lung, kidney, colon, thyroid, pancreas, and bladder. Antibodies targeting HER2
[0007] Drebin e colegas criaram anticorpos contra o produto do gene neu de rato, p185<neu> descrito no documento US 6.733.752.[0007] Drebin and colleagues raised antibodies against the mouse neu gene product, p185<neu> described in US 6,733,752.
[0008] Hudziak et a/. (1989, Mol. Cell. Biol. 9 (3), 1165-1172) des- crevem a geração de um painel de anticorpos de HER2 que foram ca- racterizados usando a linha de célula tumoral de mama humano SKBr-[0008] Hudziak et al. (1989, Mol. Cell. Biol. 9(3), 1165-1172) describe the generation of a panel of HER2 antibodies that have been characterized using the human breast tumor cell line SKBr-
3. Usando um ensaio de proliferação celular, a inibição máxima foi ob- tida com um anticorpo denominado 4D5. Verificou-se, ainda, que o an- ticorpo 4D5 sensibiliza linhas de célula tumoral de mama com supe- rexpressão de HER?2 aos efeitos citotóxicos de TNF-[alfa]; ver também US 5.677.171. Uma versão humanizada recombinante do anticorpo HER2 murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumabe ou HERCEPTIN; US 5.821.337) é clinicamente ativa em pacientes com câncer de mama metastático com superexpressão de HER2 que rece- beram terapia anticâncer extensiva anteriormente. O herceptin é apro- vado em combinação com quimioterapia para uso em pacientes com câncer de estômago (gástrico) metastático positivo para HER2.3. Using a cell proliferation assay, maximal inhibition was achieved with an antibody called 4D5. It was also found that the 4D5 antibody sensitizes breast tumor cell lines with HER?2 overexpression to the cytotoxic effects of TNF-[alpha]; see also US 5,677,171. A recombinant humanized version of the 4D5 murine HER2 antibody (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab, or HERCEPTIN; US 5,821,337) is clinically active in patients with HER2 overexpression metastatic breast cancer who have previously received extensive anticancer therapy. Herceptin is approved in combination with chemotherapy for use in patients with HER2-positive metastatic stomach (gastric) cancer.
[0009] O herceptin é amplamente utilizado no tratamento de paci- entes com câncer de mama tanto precoce quanto metastático, cujos tumores superexpressam a proteína HER2 e/ou têm amplificação do gene HER2. O tratamento de pacientes com câncer de mama com Herceptin/trastuzumabe é, por exemplo, recomendado e agora rotina para pacientes com doença positiva para HER2; ver US 2002/0064785, US 2003/0170234A1, US2003/0134344 e US 2003/0147884. A técnica anterior, portanto, se concentra na elegibili- dade de pacientes com câncer de mama para terapia com trastuzu- mabe/Herceptin com base em um alto nível de expressão da proteína HER?2 (por exemplo, definido como HER2(3+) por imuno-histoquímica (IHC)). A doença positiva para HER2 no câncer de mama é definida como presente se um alto nível de expressão de HER2 (proteína) for detectado por métodos imuno-histoquímicos (por exemplo, HER2(+++) ou como amplificação do gene HER2 (por exemplo, um número de có- pias do gene HER2 maior que 4 cópias do gene HER2 por célula tu- moral) ou ambos), encontrados em amostras obtidas dos pacientes, como biópsias de tecido mamário ou ressecções de tecido mamário ou em tecido derivado de sítios metastáticos. Um método frequentemente aplicado para detectar a superexpressão e amplificação de HER2 no nível do gene é a hibridização in situ por fluorescência (FISH), que também é descrita no documento US 2003/0152987.[0009] Herceptin is widely used in the treatment of patients with both early and metastatic breast cancer, whose tumors overexpress the HER2 protein and/or have HER2 gene amplification. Treatment of breast cancer patients with Herceptin/trastuzumab is, for example, recommended and now routine for patients with HER2 positive disease; see US 2002/0064785 , US 2003/0170234A1 , US2003/0134344 and US 2003/0147884 . The prior art therefore focuses on the eligibility of breast cancer patients for trastuzumab/Herceptin therapy based on a high level of HER?2 protein expression (eg, defined as HER2(3+) by immunohistochemistry (IHC)). HER2 positive disease in breast cancer is defined as present if a high level of HER2 (protein) expression is detected by immunohistochemical methods (eg HER2(+++) or as amplification of the HER2 gene (eg , a number of copies of the HER2 gene greater than 4 copies of the HER2 gene per tumor cell) or both), found in samples obtained from patients, such as breast tissue biopsies or breast tissue resections or in tissue derived from sites metastatic. A frequently applied method to detect HER2 overexpression and amplification at the gene level is fluorescence in situ hybridization (FISH), which is also described in US 2003/0152987.
[0010] O pertuzumabe, um anticorpo humanizado, é o primeiro de uma nova classe de agentes conhecidos como inibidores da dimeriza- ção de HER (HDIs). O pertuzumabe se liga ao HER2 em seu domínio de dimerização, inibindo, assim, sua capacidade de formar complexos de receptor de heterodímero ativo, bloqueando, deste modo, a cascata de sinal a jusante que, em última análise, resulta em crescimento e divisão celular. O pertuzumabe é direcionado contra o domínio extra- celular 2 de HER2. Ao contrário do trastuzumabe, que atua pela liga- ção ao domínio 4 de HER2, o pertuzumabe é um inibidor de dimeriza- ção de HER que inibe a dimerização de HER2 com HER3 e os outros membros da família de receptores EGFR na presença dos respectivos ligantes ativadores. Ao bloquear a formação do complexo, o pertuzu- mabe impede os efeitos estimuladores do crescimento e os sinais de sobrevivência celular ativados por ligantes de HER1, HER3 e HER4. O pertuzumabe foi aprovado pelo FDA sob o nome de Perjeta para tra- tamento em combinação com trastuzumabe e docetaxel para pacien- tes com câncer de mama metastático positivo para HER2, que não re- ceberam terapia anti-HER2 anteriormente ou quimioterapia para doen- ça metastática. O pertuzumabe é um anticorpo monoclonal recombi- nante totalmente humanizado baseado nas sequências estruturais da IgG1 humana ([kappa]). Publicações de patentes relativas ao pertuzu- mabe e seleção de pacientes para terapia com ele incluem: US20060073143A1; US20030086924; US20040013667A1 e US20040106161A1.[0010] Pertuzumab, a humanized antibody, is the first of a new class of agents known as HER dimerization inhibitors (HDIs). Pertuzumab binds to HER2 in its dimerization domain, thereby inhibiting its ability to form active heterodimer receptor complexes, thereby blocking the downstream signal cascade that ultimately results in cell growth and division . Pertuzumab is targeted against extracellular domain 2 of HER2. Unlike trastuzumab, which acts by binding to domain 4 of HER2, pertuzumab is an inhibitor of HER dimerization that inhibits the dimerization of HER2 with HER3 and the other members of the EGFR receptor family in the presence of their respective ligands activators. By blocking complex formation, pertuzumab prevents growth-stimulating effects and cell survival signals activated by HER1, HER3 and HER4 ligands. Pertuzumab has been approved by the FDA under the name Perjeta for treatment in combination with trastuzumab and docetaxel for patients with HER2-positive metastatic breast cancer who have not received prior anti-HER2 therapy or chemotherapy for the disease metastatic. Pertuzumab is a fully humanized recombinant monoclonal antibody based on the framework sequences of human IgG1 ([kappa]). Patent publications relating to pertuzumab and patient selection for therapy with it include: US20060073143A1; US20030086924; US20040013667A1 and US20040106161A1.
[0011] Para trastuzumabe, embora seja conhecido por apresentar benefícios clínicos em termos de, por exemplo, sobrevida prolongada em combinação com quimioterapia quando comparado à quimioterapia isolada, a maioria das pacientes com câncer de mama positivo para HER?2 foram não respondedores (taxa de resposta geral de 45% para Herceptin + quimioterapia vs. 29% para quimioterapia isolada).[0011] For trastuzumab, although known to have clinical benefits in terms of, for example, prolonged survival in combination with chemotherapy compared to chemotherapy alone, the majority of patients with HER?2 positive breast cancer were non-responders (rate of 45% overall response for Herceptin + chemotherapy vs. 29% for chemotherapy alone).
[0012] Assim, embora a terapia com anticorpos monoclonais dire- cionada contra HER2 tenha demonstrado proporcionar um tratamento melhorado, por exemplo, em câncer de mama metastático que supe- rexpressa HER2, ainda há espaço considerável para melhorias. Andaimes de não-anticorpos direcionados a HER2[0012] Thus, although monoclonal antibody therapy directed against HER2 has been shown to provide an improved treatment, for example, in metastatic breast cancer that overexpresses HER2, there is still considerable room for improvement. Non-antibody scaffolds targeting HER2
[0013] Recentemente foram propostas proteínas de direcionamen- to alternativas, que são mais diversas na estrutura molecular do que fragmentos de anticorpos derivados de imunoglobulinas humanas e construtos e formatos derivados de anticorpos, permitindo, assim, for- matos moleculares adicionais ao criar conjuntos heterodiméricos e multiméricos, levando a novas funções biológicas. Várias dessas pro- teínas de direcionamento foram descritas (revisadas em (Binz et al, 2005, Nat. Biotech, 23, 1257-1268)). Exemplos não limitativos de tais proteínas de direcionamento são anticorpos de camelídeo, andaimes de proteína derivados de domínios de proteína A (denominados "Affi- bodies", Affibody AB), tendamistate (um inibidor de alfa-amilase, uma proteína de folha beta de 74 aminoácidos de Streptomyces tendae), fibronectina, lipocalina ("Anticalinas", Pieris), receptores de células T, anquirinas (proteínas de repetição de anquirina designadas denomina- das "DARPins", Univ. Zurich and Molecular Partners; ver US20120142611), domínios A de vários receptores ("Avimers", Avidia) e domínios PDZ, domínios de fibronectina (FN3) ("Adnectinas", Adne- xus), domínios de fibronectina de consenso ("Centyrins", Cen- tyrex/Johnson & Johnson) e Ubiquitina ("Affilins ", SCIL Proteins) e no- tinas (Moore e Cochrane, 2012, Methods in Enzymology 503, 223-251 e referências aqui citadas).[0013] Recently, alternative targeting proteins have been proposed, which are more diverse in molecular structure than antibody fragments derived from human immunoglobulins and antibody-derived constructs and formats, thus allowing for additional molecular formats when creating heterodimeric sets and multimeric, leading to new biological functions. Several of these targeting proteins have been described (reviewed in (Binz et al, 2005, Nat. Biotech, 23, 1257-1268)). Non-limiting examples of such targeting proteins are camelid antibodies, protein scaffolds derived from protein A domains (termed "Affi-bodies", Affibody AB), tendamistat (an alpha-amylase inhibitor, a 74 beta sheet protein amino acids from Streptomyces tendae), fibronectin, lipocalin ("Anticalins", Pieris), T cell receptors, ankyrins (designated ankyrin repeat proteins termed "DARPins", Univ. Zurich and Molecular Partners; see US20120142611), A domains of various receptors ("Avimers", Avidia) and PDZ domains, fibronectin domains (FN3) ("Adnectins", Adnexus), consensus fibronectin domains ("Centyrins", Centyrex/Johnson & Johnson) and Ubiquitin ("Affilins", SCIL Proteins) and notins (Moore and Cochrane, 2012, Methods in Enzymology 503, 223-251 and references cited therein).
[0014] A partir dessas proteínas, conjuntos multiméricos e multies- pecíficos podem ser construídos (Caravella e Lugovskoy, 2010, Cur- rent Opinions in Chemical Biology, 14, 520-528; Vanlandschoot et al., 2011, Antiviral Research 92, 389-407; Lófblom et a/., 2011, Current Opinion in Biotechnology, 22, 843-848, Boersma et al., 2011, Curr. Opin. Biotechnol., 22, 849-857). Também é possível fundir estes e ou- tros domínios peptídicos a anticorpos para criar os chamados Zybodi- es (Zyngenia Inc., Gaithersburg, MD).[0014] From these proteins, multimeric and multispecific sets can be constructed (Caravella and Lugovskoy, 2010, Current Opinions in Chemical Biology, 14, 520-528; Vanlandschoot et al., 2011, Antiviral Research 92, 389 -407; Lófblom et al., 2011, Current Opinion in Biotechnology, 22, 843-848, Boersma et al., 2011, Curr. Opin. Biotechnol., 22, 849-857). It is also possible to fuse these and other peptide domains to antibodies to create so-called Zybodies (Zygenia Inc., Gaithersburg, MD).
[0015] Todos esses andaimes, com diferentes propriedades ine- rentes, têm em comum que podem ser direcionados para ligar epíto- pos específicos, usando tecnologias de seleção bem conhecidas por profissionais da área (Binz et al., Ibid.).[0015] All of these scaffolds, with different inherent properties, have in common that they can be targeted to link specific epitopes, using selection technologies well known to professionals in the field (Binz et al., Ibid.).
[0016] Por exemplo, os diferentes domínios individuais de HER2 podem ser expressos individualmente em células de inseto, usando um sistema de expressão de baculovírus, conforme demonstrado para o domínio 1 e o domínio 4 (Frei et al/., 2012, Nat Biotechnol., 30, 997- 1001). Desse modo, é garantido que os conectores selecionados se-[0016] For example, the different individual domains of HER2 can be expressed individually in insect cells, using a baculovirus expression system, as demonstrated for domain 1 and domain 4 (Frei et al/., 2012, Nat Biotechnol , 30, 997-1001). In this way, it is guaranteed that the selected connectors will be
rão direcionados ao domínio de interesse.will be directed to the domain of interest.
Os domínios HER2 podem então ser biotinilados conforme descrito anteriormente (Zahnd et al., 2006, J.The HER2 domains can then be biotinylated as previously described (Zahnd et al., 2006, J.
Biol.Biol.
Chem. 281 (46), 35167-75) e, assim, serem imobilizados em esferas magnéticas revestidas com estreptavidina ou em placas de microtitulação revestidas com estreptavidina ou neutravidina (Steiner et al., 2008, J.Chem. 281 (46), 35167-75) and thus immobilized on streptavidin coated magnetic beads or on streptavidin or neutrovidin coated microtiter plates (Steiner et al., 2008, J.
Mol.Mol.
Biol. 382, 1211-1227; Zahnd et al., 2007, J.Biol. 382, 1211-1227; Zahnd et al., 2007, J.
Mol.Mol.
Biol. 369, 1015-1028.). Os domínios de HER2 imobilizados assim po- dem então servir como alvos para diversas bibliotecas de proteínas em formato de exibição de fago ou exibição de ribossomo.Biol. 369, 1015-1028.). The HER2 domains immobilized in this way can then serve as targets for various protein libraries in phage display or ribosome display format.
Uma grande variedade de diferentes bibliotecas de anticorpos foi publicada (Mon- don P. et a/., 2008, Frontiers in Bioscience. 13, 1117-1129) e a tecno- logia de seleção de anticorpos de ligação é bem conhecida por profis- sionais da área.A wide variety of different antibody libraries have been published (Mondon P. et a/., 2008, Frontiers in Bioscience. 13, 1117-1129) and the technology of selection of binding antibodies is well known by the profession. professionals in the area.
A exibição de fagos é um formato adequado para fra- gmentos de anticorpo (fragmentos de Fab, fragmentos de scFv ou an- ticorpos de domínio único) (Hoogenboom, 2005, Nature Biotechno- logy., 23(9), 1105-1116) e qualquer outro andaime que contenha liga- ções dissulfeto, mas também pode ser usado para andaimes que não contenham ligações de dissulfeto (por exemplo, Steiner et at., 2008, J.Phage display is a suitable format for antibody fragments (Fab fragments, scFv fragments or single domain antibodies) (Hoogenboom, 2005, Nature Biotechnology., 23(9), 1105-1116) and any other scaffolds that contain disulfide bonds, but can also be used for scaffolds that do not contain disulfide bonds (eg Steiner et at., 2008, J.
Mol.Mol.
Biol., 382, 1211-1227) (Rentero et al., 2011, Chimia., 65(11), 843- 5, Skerra A., 2007, Current Opinion in Biotechnology., 18(4), 295-304). Da mesma forma, a exibição de ribossomo pode ser usada para frag- mentos de anticorpo (Hanes et a/l., 2000, Nat.Biol., 382, 1211-1227) (Rentero et al., 2011, Chimia., 65(11), 843-5, Skerra A., 2007, Current Opinion in Biotechnology., 18(4), 295-304) . Likewise, ribosome display can be used for antibody fragments (Hanes et a/l., 2000, Nat.
Biotechnol., 18, 1287- 1292) e para outros anjdaimes (Zahnd et a/l., 2007, Nat.Biotechnol., 18, 1287-1292) and for other anjdaimes (Zahnd et al., 2007, Nat.
Methods, 4, 269-279 ; Zahnd et al., 2007, J.Methods, 4, 269-279; Zahnd et al., 2007, J.
Mol.Mol.
Biol., 369, 1015-28.). Uma tercei- ra tecnologia poderosa é a exibição de levedura (Pepper et a/., 2008, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 11(2), 127- 134). Neste caso, uma biblioteca da proteína de ligação de interesse é exibida na superfície da levedura, e o respectivo domínio de HER2 é marcado diretamente com um corante fluorescente ou sua marca his é detectada com um anticorpo anti-histag que, por sua vez, é detectado com um anticorpo secundário. Tais métodos são bem conhecidos por profissionais da área (Boder et a/., 2000, Methods in Enzymology, 328, 430-44).Biol., 369, 1015-28.). A powerful third technology is yeast display (Pepper et al., 2008, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 11(2), 127-134). In this case, a library of the binding protein of interest is displayed on the yeast surface, and the respective domain of HER2 is directly labeled with a fluorescent dye or its his-tag is detected with an anti-histag antibody which, in turn, is detected with a secondary antibody. Such methods are well known to professionals in the field (Boder et al., 2000, Methods in Enzymology, 328, 430-44).
[0017] Outra possibilidade de engenharia representa a conexão desses conectores para criar moléculas de ligação biespecíficas ou multivalentes superiores. Tal conexão pode ser alcançada genetica- mente por fusões de duas ou mais dessas moléculas de ligação, ou quimicamente por reticulação de moléculas expressas separadamente, ou pela adição de um domínio de dimerização, incluindo reivindicações dependentes separadas para cada uma ou qualquer combinação das mesmas (ver, por exemplo, Stefan et a/., 2011, J. Mol. Biol., 413, 826- 843; Boersma et al., 2011, J. Biol. Chem., 286, 41273-41285).[0017] Another engineering possibility represents the connection of these connectors to create superior bispecific or multivalent binding molecules. Such a connection can be achieved genetically by fusions of two or more of these binding molecules, or chemically by crosslinking separately expressed molecules, or by adding a dimerization domain, including separate dependent claims for each or any combination thereof ( see, for example, Stefan et al., 2011, J. Mol. Biol., 413, 826-843; Boersma et al., 2011, J. Biol. Chem., 286, 41273-41285).
[0018] Um construto de anticorpo biespecífico anti-H[ER2 de came- lídeos (Nanocorpo Biespecífico) é mostrado no documento US2011[0018] A camelid anti-H[ER2 bispecific antibody construct (Bispecific Nanobody) is shown in the US2011 document
0059090. O documento se refere a uma molécula biespecífica que di- reciona simultaneamente HER2 no domínio extracelular 2, definido pe- la competição com pertuzumabe, e no domínio 4, definido pela compe- tição com trastuzumabe. Esta molécula foi descrita como exibindo ati- vidade antiproliferativa mais forte que a do trastuzumabe (Herceptin) em uma comparação direta em um modelo de cultura de células in vi- tro usando a linha celular SKBr3.0059090. The document refers to a bispecific molecule that simultaneously targets HER2 in extracellular domain 2, defined by competition with pertuzumab, and in domain 4, defined by competition with trastuzumab. This molecule was described as exhibiting stronger antiproliferative activity than trastuzumab (Herceptin) in a direct comparison in an in vitro cell culture model using the SKBr3 cell line.
[0019] Devido à ausência de qualquer ligante específico de HER2 conhecido, as estratégias de direcionamento de HER2 atuais visam bloquear a dimerização do receptor pela ligação à interface de intera- ção. O conhecimento atual da dimerização do receptor HER2 é base- ado principalmente na estrutura cristalina da forma ligada ao ligante do homodímero EGFR, que é amplamente aceita como o modo ativo de todos os membros da família do receptor EGF (Garret et al., 2002, Cell, 110, 763-773). As duas moléculas de EGFR apresentam uma in- teração do tipo “back-to-back”. Estendendo essas descobertas ao[0019] Due to the absence of any known HER2 specific ligand, current HER2 targeting strategies aim to block receptor dimerization by binding to the interaction interface. Current knowledge of HER2 receptor dimerization is based primarily on the crystal structure of the ligand-bound form of the EGFR homodimer, which is widely accepted as the active mode of all members of the EGF receptor family (Garret et al., 2002, Cell, 110, 763-773). The two EGFR molecules have a “back-to-back” interaction. Extending these discoveries to
HER? e sua possível interação com outros membros da família EGFR, uma interface de interação está presente no domínio 2 da parte extra- celular de HER2. O pertuzumabe se liga ao domínio 2 e é conhecido por bloquear a interação do receptor nesta interface. Outra interação conhecida está presente no domínio 4 da parte extracelular de HER2. Esta interface de interação é presumivelmente bloqueada pelo tras- tuzumabe. No entanto, ambos os anticorpos, trastuzumabe e pertuzu- mabe, mesmo quando aplicados simultaneamente, não são capazes de bloquear todas as interações de HER2 por completo. Acredita-se que a interação da parte extracelular e do domínio quinase de HER2 esteja ligada de forma a permitir algumas interações residuais mesmo no estado bloqueado por trastuzumabe e pertuzumabe, o que está de acordo com os dados da estrutura cristalina (Lu et a/., 2010, Mol. Cell. Biol., 22, 5432-5443). O ligante biespecífico mencionado acima que se liga a ambos os epítopos (pertuzumabe e trastuzumabe) simultanea- mente (US 2011/0059090) reduz o crescimento celular em um modelo de cultura de células em aprox. 50%, em comparação com uma redu- ção de cerca de 40% efetuada pelo trastuzumabe. Esse mesmo efeito, no entanto, também pode ser obtido pelo tratamento com a mistura de trastuzumabe e pertuzumabe.HER? and its possible interaction with other members of the EGFR family, an interaction interface is present in domain 2 of the extracellular part of HER2. Pertuzumab binds to domain 2 and is known to block receptor interaction at this interface. Another known interaction is present in domain 4 of the extracellular part of HER2. This interaction interface is presumably blocked by trastuzumab. However, both antibodies, trastuzumab and pertuzumab, even when applied simultaneously, are not able to completely block all HER2 interactions. It is believed that the interaction of the extracellular part and the kinase domain of HER2 is linked in such a way as to allow some residual interactions even in the blocked state by trastuzumab and pertuzumab, which is in agreement with the crystal structure data (Lu et a/. , 2010, Mol. Cell. Biol., 22, 5432-5443). The bispecific ligand mentioned above that binds to both epitopes (pertuzumab and trastuzumab) simultaneously (US 2011/0059090) reduces cell growth in a cell culture model by approx. 50%, compared to a reduction of about 40% achieved by trastuzumab. This same effect, however, can also be obtained by treatment with a mixture of trastuzumab and pertuzumab.
[0020] O pedido de patente WO 2014/060365 descreve agentes biespecíficos de direcionamento ao HER2 compreendendo um primei- ro ligante polipeptídico que se liga ao domínio extracelular 1 de HER2 (epítopo D1) e um segundo ligante polipeptídico que se liga ao domí- nio extracelular 4 de HER2 (epítopo D4), em que o primeiro e o se- gundo ligante polipeptídico são separados pelo ligante. Os mais ativos desses agentes de ligação biparatópica se ligam predominantemente a duas moléculas de HER2 separadas em um modo de ligação intermo- lecular. Desse modo, esses agentes de ligação bivalente biparatópicos reticulam HER2 ECD1 de um HER2 e HER2 ECDA4 da outra molécula[0020] Patent application WO 2014/060365 describes bispecific HER2 targeting agents comprising a first polypeptide linker that binds to extracellular domain 1 of HER2 (epitope D1) and a second polypeptide linker that binds to the domain extracellular 4 of HER2 (epitope D4), in which the first and second polypeptide linker are separated by the linker. The most active of these biparatopic binding agents predominantly bind to two separate HER2 molecules in an intermolecular binding mode. Thus, these biparatopic bivalent linkers cross-link HER2 ECD1 from one HER2 and HER2 ECDA4 from the other molecule
HER?2 por meio desses paratopos e um ligante de peptídeo preferenci- almente curto, que favorece a ligação intermolecular em relação à in- tramolecular.HER?2 through these paratopes and a preferably short peptide ligand, which favors intermolecular over intramolecular binding.
O modo de ligação bivalente dos agentes de ligação bi- paratópicos induzirá uma polimerização de receptores HER2 na super- fície celular que, consequentemente, não são capazes de formar hete- rodímeros HER2Q/HER3 ou HER2/EGFR produtivos ou homodímeros HER2/HER2 (Tamaskovic et al., 2016, Jost et al., 2013). Consequen- temente, isso leva a uma inibição da fosforilação de HER2 e HER3 em células cancerosas com superexpressão de HER2, o que subsequen- temente leva à cessação da sinalização proliferativa e antiapoptótica do receptor HER2/HER3 e, finalmente, indução da morte celular por apoptose.The bivalent binding mode of bi-paratopic binding agents will induce a polymerization of HER2 receptors on the cell surface which, consequently, are not able to form productive HER2Q/HER3 or HER2/EGFR heterodimers or HER2/HER2 homodimers (Tamaskovic et al., 2016, Jost et al., 2013). Consequently, this leads to an inhibition of HER2 and HER3 phosphorylation in HER2 overexpressing cancer cells, which subsequently leads to cessation of proliferative and anti-apoptotic HER2/HER3 receptor signaling and ultimately induction of cell death by apoptosis.
No entanto, esses agentes de ligação biparatópicos não afe- tam os níveis de expressão do receptor HER?2 total (Tamaskovic et al., 2016). A expressão total do receptor HER2 permanece comparativa- mente alta, o que pode causar uma inativação incompleta dos recepto- res HER2. Além disso, esses construtos não apresentam as proprie- dades farmacocinéticas desejadas, que são necessárias para aplica- ções sistêmicas.However, these biparatopic binding agents do not affect total HER?2 receptor expression levels (Tamaskovic et al., 2016). The total expression of the HER2 receptor remains comparatively high, which can cause an incomplete inactivation of the HER2 receptors. Furthermore, these constructs do not have the desired pharmacokinetic properties, which are necessary for systemic applications.
As funções desejadas, como meia-vida sérica longa na corrente sanguínea ou mecanismos de reciclagem de proteínas por meio da ligação ao receptor FcRn, não são implementadas nesses construtos.Desired functions, such as long serum half-life in the bloodstream or mechanisms of protein recycling through binding to the FcRn receptor, are not implemented in these constructs.
Além disso, esses construtos biparatópicos não aproveitam as funções efetoras do anticorpo, como citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citotoxicidade mediada por células dependen- te de anticorpo (ADCC). Estas funções efetoras podem ser benéficas para aumentar mais a atividade antitumoral dos agentes de ligação biparatópicos in vivo.Furthermore, these biparatopic constructs do not take advantage of antibody effector functions such as complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). These effector functions may be beneficial to further enhance the antitumor activity of biparatopic binding agents in vivo.
Por fim, esses agentes de ligação biparatópicos são potencialmente propensos a induzir uma resposta imune, porque eles não foram projetados adicionalmente para evitar epítopos de célu- las T.Finally, these biparatopic binding agents are potentially likely to induce an immune response because they were not additionally designed to avoid T cell epitopes.
Isso pode levar a uma redução significativa da tolerabilidade e do nível sérico em doses repetidas em pacientes imunocompetentes.This can lead to a significant reduction in tolerability and serum level at repeated doses in immunocompetent patients.
[0021] Além disso, foi descrito um conjugado anticorpo-fármaco tetravalente biparatópico de direcionamento ao HER2 que compreende uma fusão de Trastuzumabe e sequências variáveis de anticorpo 39S que se ligam aos epítopos D4 e D2 de HER?2 (Li et a/., 2016, Cancer Cell, 29, 117-129). Este conjugado foi comercializado sob o nome MEDI4276 pela Medimmune e foi testado em um ensaio clínico de fa- se 1/2 (NOT02576548). No entanto, este construto de fusão de IgG biparatópica em sua forma sem braço, ou seja, sem a fusão da carga tóxica de Tubulisina, não é suficiente para induzir a inibição da prolife- ração de células cancerosas.In addition, a biparatopic HER2-targeting tetravalent drug-antibody conjugate has been described which comprises a fusion of Trastuzumab and 39S antibody variable sequences binding to the D4 and D2 epitopes of HER?2 (Li et al., 2016, Cancer Cell, 29, 117-129). This conjugate has been marketed under the name MEDI4276 by Medimmune and has been tested in a phase 1/2 clinical trial (NOT02576548). However, this construct of biparatopic IgG fusion in its armless form, that is, without the fusion of the toxic load of Tubulisin, is not sufficient to induce the inhibition of cancer cell proliferation.
Pelo contrário, a versão não conjugada desta molécula de fusão de IgG induz a ativação da proliferação de células cancerosas em altas concentrações em modelos de células cancerosas com superexpressão de HER?2. Isso pode ser causado pe- la ligação a HER2 ECD2 e HER2 ECDA4 de uma maneira que aumen- ta a formação de homo e heterodímeros HER2 competentes de sinali- zação.In contrast, the unconjugated version of this IgG fusion molecule induces activation of cancer cell proliferation at high concentrations in cancer cell models overexpressing HER?2. This may be caused by binding to HER2 ECD2 and HER2 ECDA4 in a way that enhances the formation of signaling competent HER2 homo- and heterodimers.
Por outro lado, a versão da proteína de fusão IgG não conjuga- da deste anticorpo biparatópico tetravalente de direcionamento ao HER?2 pode induzir a infrarregulação da expressão do receptor HER2 (Li et a/., 2016, Cancer Cell, 29, 117-129). Em suma, a proteína de fu- são scFv 4D5-lgG 398 tetravalente infrarregula a expressão de HER2, mas não mostra inibição da sinalização de HER2 e, em vez disso, leva à ativação da proliferação de células cancerosas em mode- los específicos de superexpressão de HER?2. Isso também mostra que a infrarregulação de HER2 e a inibição do crescimento das células cancerosas não são ligadas simplesmente.On the other hand, the unconjugated IgG fusion protein version of this tetravalent biparatopic HER?2 targeting antibody can induce downregulation of HER2 receptor expression (Li et a/., 2016, Cancer Cell, 29, 117- 129). In summary, the tetravalent scFv 4D5-IgG 398 fusion protein downregulates HER2 expression, but does not show inhibition of HER2 signaling and instead leads to activation of cancer cell proliferation in specific models of overexpression of HER?2. It also shows that HER2 downregulation and cancer cell growth inhibition are simply not linked.
Claramente, a inibição das vias de sinalização dependentes de HER2 de um agente de direcio- namento ao HER?2 seria essencial para aplicações clínicas.Clearly, inhibition of the HER2-dependent signaling pathways of a HER?2 targeting agent would be essential for clinical applications.
Por exem- plo, o trastuzumabe (Herceptin) bloqueia a sinalização de HER3 e mostra redução significativa da proliferação celular em cânceres com superexpressão de HER2 que não têm uma mutação de ativação da via PISK.For example, trastuzumab (Herceptin) blocks HER3 signaling and shows a significant reduction in cell proliferation in HER2 overexpressing cancers that do not have a PISK pathway activating mutation.
[0022] Com base na técnica de última geração mencionada acima, o objetivo da presente invenção é fornecer meios e métodos para for- necer um agente de direcionamento ao HER2 que é melhorado em relação às desvantagens da técnica anterior acima mencionadas, em particular para fornecer um agente de direcionamento ao HER2 exi- bindo inibição de sinalização de HER2 melhorada, infrarregulação de expressão, polimerização e agrupamento, inibição de difusão de re- ceptor, degradação e/ou inibição de reciclagem, na ausência de toxi- nas de moléculas pequenas adicionais ligadas ao agente de direcio- namento ao HER2. Este objetivo é alcançado pela matéria das reivin- dicações independentes do presente relatório descritivo. Sumário da invenção[0022] Based on the above-mentioned state-of-the-art technique, the aim of the present invention is to provide means and methods for providing a targeting agent to the HER2 that is improved in relation to the aforementioned disadvantages of the prior art, in particular to provide a HER2 targeting agent exhibiting improved inhibition of HER2 signaling, downregulation of expression, polymerization and assembly, inhibition of receptor diffusion, degradation and/or inhibition of recycling, in the absence of additional small molecule toxins linked to the targeting agent to HER2. This objective is achieved by the subject of the independent claims of this descriptive report. Invention Summary
[0023] A invenção se refere a um polipeptídeo tetramérico com- preendendo ou consistindo em[0023] The invention relates to a tetrameric polypeptide comprising or consisting of
[0024] uma primeira cadeia polipeptídica compreendendo, na ori- entação de N para C, um primeiro domínio de ligação ao antígeno VL e um primeiro domínio constante CL,[0024] a first polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a first VL antigen-binding domain and a first constant domain CL,
[0025] uma segunda cadeia polipeptídica compreendendo, na ori- entação de N para C, um primeiro domínio de ligação ao antígeno VH, um primeiro domínio constante CH1, um primeiro domínio constante CH2 e um primeiro domínio constante CH3,[0025] a second polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a first VH antigen-binding domain, a first CH1 constant domain, a first CH2 constant domain, and a first CH3 constant domain,
[0026] um primeiro ligante que se liga especificamente a um epíto- po D4 de HER2, em que o primeiro ligante está compreendido na pri- meira cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do primeiro domínio de ligação ao antígeno VL por um primeiro ligante de aminoácido de interdomínio, ou o primeiro ligante está compreendido na segunda ca- deia polipeptídica e ligado ao terminal N do primeiro domínio de liga- ção ao antígeno VH por um primeiro ligante de aminoácido de inter- domínio,[0026] a first linker that specifically binds to a D4 epitope of HER2, wherein the first linker is comprised of the first polypeptide chain and linked to the N-terminus of the first VL antigen-binding domain by a first linker of interdomain amino acid, or the first linker is comprised of the second polypeptide chain and linked to the N-terminus of the first VH antigen-binding domain by a first interdomain amino acid linker,
[0027] em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno VL da primeira cadeia polipeptídica e o primeiro domínio de ligação ao antí- geno VH da segunda cadeia polipeptídica, juntos, constituem um se- gundo ligante, particularmente um domínio Fab, que se liga especifi- camente a um epítopo D1 de HER?2,[0027] in which the first VL antigen-binding domain of the first polypeptide chain and the first VH antigen-binding domain of the second polypeptide chain, together, constitute a second linker, particularly a Fab domain, which binds specifically to a D1 epitope of HER?2,
[0028] uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo, na orien- tação de N para C, um segundo domínio de ligação ao antígeno VL e um segundo domínio constante CL,[0028] a third polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a second VL antigen-binding domain and a second constant CL domain,
[0029] uma quarta cadeia polipeptídica compreendendo, na orien- tação de N para C, um segundo domínio de ligação ao antígeno VH, um segundo domínio constante CH1, um segundo domínio constante CH2 e um segundo domínio constante CH3,[0029] a fourth polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a second VH antigen-binding domain, a second CH1 constant domain, a second CH2 constant domain, and a second CH3 constant domain.
[0030] um terceiro ligante que se liga especificamente a um epíto- po D4 de HER2, em que o terceiro ligante está compreendido na ter- ceira cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do segundo domínio de ligação ao antígeno VL por um segundo ligante de aminoácido de interdomínio, ou o terceiro ligante está compreendido na quarta cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do segundo domínio de ligação ao antígeno VH por um segundo ligante de aminoácido de interdomínio,[0030] a third linker that specifically binds to a D4 epitope of HER2, wherein the third linker is comprised of the third polypeptide chain and linked to the N-terminus of the second VL antigen-binding domain by a second linker of interdomain amino acid, or the third linker is comprised of the fourth polypeptide chain and linked to the N-terminus of the second VH antigen-binding domain by a second interdomain amino acid linker,
[0031] em que o segundo domínio de ligação ao antígeno VL da terceira cadeia polipeptídica e o segundo domínio de ligação ao antí- geno VH da quarta cadeia polipeptídica, juntos, constituem um quarto ligante, particularmente um domínio Fab, que se liga especificamente a um epítopo D1 de HER?2,[0031] in which the second VL antigen-binding domain of the third polypeptide chain and the second VH antigen-binding domain of the fourth polypeptide chain together constitute a fourth ligand, particularly a Fab domain, which specifically binds to a D1 epitope of HER?2,
[0032] O polipeptídeo tetramérico de acordo com a invenção, por- tanto, compreende duas vezes dois paratopos de ligação ao HER2 di- ferentes, em outras palavras, é tetravalente. O polipeptídeo é bipara- tópico, porque contém sítios de ligação a dois epítopos de HER?2 dis- tintos, ou seja, D1 e D4 em uma única molécula.[0032] The tetrameric polypeptide according to the invention, therefore, comprises twice two different HER2 binding paratopes, in other words, it is tetravalent. The polypeptide is biparatopic because it contains binding sites to two distinct HER?2 epitopes, namely, D1 and D4 on a single molecule.
[0033] Surpreendentemente, o polipeptídeo exibe inativação de[0033] Surprisingly, the polypeptide exhibits inactivation of
HER?2 superior em comparação com anticorpos convencionais e poli- peptídeos biparatópicos divalentes (compostos por um total de dois paratopos de ligação) e tem efeitos adicionais no crescimento e prolife- ração celular, apoptose e outras formas de morte celular, internaliza- ção de HER2 e inibição de reciclagem de HER?2, infrarregulação da expressão de HER2 e degradação de HER2, reticulação de HER?2, ini- bição da dimerização de HER2 e diminuição da mobilidade superficial do receptor HER2. Além disso, o tamanho molecular aumentado exclui a filtração renal e a reciclagem mediada por FcRn aumentará as pro- priedades farmacocinéticas. Finalmente, a presença da parte Fc tam- bém permite que ocorra citotoxicidade mediada por células dependen- te de anticorpos (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Por último, todas as sequências são de anticorpos humanos e, portanto, o construto consiste em sequências não imunogênicas. Em suma, os polipeptídeos tetraméricos, de acordo com a presente inven- ção, são candidatos promissores para terapia sistêmica de câncer que expressa HER?2.superior HER?2 compared to conventional antibodies and divalent biparatopic polypeptides (composed of a total of two binding paratopes) and has additional effects on cell growth and proliferation, apoptosis and other forms of cell death, internalization of HER2 and HER?2 recycling inhibition, downregulation of HER2 expression and HER2 degradation, HER?2 crosslinking, inhibition of HER2 dimerization, and decreased HER2 receptor surface mobility. Furthermore, the increased molecular size excludes renal filtration and FcRn-mediated recycling will increase the pharmacokinetic properties. Finally, the presence of the Fc part also allows antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC) to occur. Finally, all sequences are from human antibodies and therefore the construct consists of non-immunogenic sequences. In summary, the tetrameric polypeptides, according to the present invention, are promising candidates for systemic cancer therapy that expresses HER?2.
[0034] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um dos com- postos da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e pelo menos um veículo, diluente ou excipiente farmaceu- ticamente aceitável.[0034] In another embodiment, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising at least one of the compounds of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof and at least one pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient.
[0035] A invenção também se refere ao polipeptídeo tetramérico para uso em um método para prevenção ou tratamento de uma doen- ça neoplásica maligna, um ácido nucleico isolado que codifica o poli- peptídeo, uma célula hospedeira para produzir o polipeptídeo e um método para obter o polipeptídeo. Descrição detalhada da invenção Termos e definições[0035] The invention also relates to tetrameric polypeptide for use in a method for preventing or treating a malignant neoplastic disease, an isolated nucleic acid encoding the polypeptide, a host cell for producing the polypeptide, and a method for get the polypeptide. Detailed description of the invention Terms and definitions
[0036] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc-[0036] Unless otherwise defined, all technical terms
nicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido por um versado na técnica (por exemplo, em cultura de cé- lulas, genética molecular, química de ácido nucleico, técnicas de hibri- dização e bioquímica). Técnicas padrão são usadas para métodos mo- leculares, genéticos e bioquímicos (ver, em geral, Sambrook et a/., Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Har- bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. w Ausubel et a/., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4º Ed, John Wiley & Sons, Inc.) e métodos químicos.The unique and scientific meanings used herein have the same meaning commonly understood by one of ordinary skill in the art (eg, in cell culture, molecular genetics, nucleic acid chemistry, hybridization techniques, and biochemistry). Standard techniques are used for molecular, genetic, and biochemical methods (see, in general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.) and chemical methods.
[0037] O termo "um indivíduo compreende um objeto", no contexto do presente relatório descritivo, inclui modalidades discretas em que o indivíduo consiste no objeto, em outras palavras, onde o termo com- preender é sinônimo de "consistir em". Em outras modalidades discre- tas, o objeto é um dos vários diferentes compreendidos no objeto.[0037] The term "an individual comprises an object", in the context of this descriptive report, includes discrete modalities in which the individual consists of the object, in other words, where the term understand is synonymous with "consist of". In other discrete modalities, the object is one of several different ones comprised in the object.
[0038] O termo ligante, no contexto do presente relatório descriti- vo, se refere a uma região de um polipeptídeo que se liga a um alvo, particularmente HER?2.[0038] The term linker, in the context of this descriptive report, refers to a region of a polypeptide that binds to a target, particularly HER?2.
[0039] O termo ligante de aminoácido de interdomínio, no contexto do presente relatório descritivo, se refere a um ligante polipeptídico que conecta covalentemente o terminal C de um primeiro domínio po- lipeptídico ao terminal N de um segundo domínio polipeptídico.[0039] The term interdomain amino acid linker, in the context of this specification, refers to a polypeptide linker that covalently connects the C-terminus of a first polypeptide domain to the N-terminus of a second polypeptide domain.
[0040] O termo epítopo, no contexto do presente relatório descriti- vo, se refere a uma região de uma molécula de antígeno à qual um anticorpo se liga.[0040] The term epitope, in the context of this descriptive report, refers to a region of an antigen molecule to which an antibody binds.
[0041] O termo domínio Fab no contexto do presente relatório descritivo, se refere a uma molécula de anticorpo que compreende uma primeira cadeia consistindo em um domínio VL com terminal C ligado (covalentemente) a um domínio CL e uma segunda cadeia con- sistindo em um domínio VH com terminal C ligado (covalentemente) a um domínio CH1, em que o domínio CL e o domínio CH1 estão ligados por uma ligação de dissulfeto.[0041] The term Fab domain in the context of this specification refers to an antibody molecule comprising a first chain consisting of a C-terminal VL domain (covalently) linked to a CL domain and a second chain consisting of a C-terminally linked VH domain (covalently) to a CH1 domain, wherein the CL domain and CH1 domain are linked by a disulfide bond.
[0042] O termo domínio de ligação ao antígeno VL, no contexto do presente relatório descritivo, se refere ao domínio variável da cadeia leve de um anticorpo, particularmente de uma cadeia leve de imuno- globulina G.[0042] The term VL antigen-binding domain, in the context of this specification, refers to the variable domain of the light chain of an antibody, particularly of an immunoglobulin G light chain.
[0043] O termo domínio de ligação ao antígeno VH, no contexto do presente relatório descritivo, se refere ao domínio variável da cadeia pesada de um anticorpo, particularmente de uma cadeia pesada de imunoglobulina G.[0043] The term VH antigen binding domain, in the context of this specification, refers to the variable domain of the heavy chain of an antibody, particularly of an immunoglobulin G heavy chain.
[0044] O termo domínio constante CL, no contexto do presente relatório descritivo, se refere ao domínio constante da cadeia leve de um anticorpo, particularmente de uma cadeia leve de imunoglobulina G.[0044] The term constant domain CL, in the context of this specification, refers to the constant domain of the light chain of an antibody, particularly of an immunoglobulin G light chain.
[0045] O termo domínio constante CH1, no contexto do presente relatório descritivo, se refere ao primeiro domínio constante da cadeia pesada de um anticorpo, particularmente de uma cadeia pesada de imunoglobulina G.The term CH1 constant domain, in the context of this specification, refers to the first constant domain of the heavy chain of an antibody, particularly of an immunoglobulin G heavy chain.
[0046] O termo domínio constante CH2, no contexto do presente relatório descritivo, se refere ao segundo domínio constante da cadeia pesada de um anticorpo, particularmente de uma cadeia pesada de imunoglobulina G.The term CH2 constant domain, in the context of this specification, refers to the second constant domain of an antibody heavy chain, particularly an immunoglobulin G heavy chain.
[0047] O termo domínio constante CH3, no contexto do presente relatório descritivo, se refere ao terceiro domínio constante da cadeia pesada de um anticorpo, particularmente de uma cadeia pesada de imunoglobulina G.The term CH3 constant domain, in the context of this specification, refers to the third constant domain of an antibody heavy chain, particularly an immunoglobulin G heavy chain.
[0048] O termo fragmento variável de cadeia única, no contexto do presente relatório descritivo, se refere a um domínio de ligação ao an- tígeno VH (também denominado cadeia pesada de scFv) ligado cova- lentemente a um domínio de ligação ao antígeno VL (também denomi- nado cadeia leve de scFv) por um ligante polipeptídico (cadeia de |i-[0048] The term single-chain variable fragment, in the context of this specification, refers to a VH antigen-binding domain (also called scFv heavy chain) covalently linked to a VL antigen-binding domain (also called scFv light chain) by a polypeptide linker ( |i- chain
gante de scFv).of scFv).
[0049] No presente relatório descritivo, o termo positivo, quando usado no contexto de expressão de um marcador, se refere à expres- são de um antígeno testado por um anticorpo marcado com fluores- cência, em que a fluorescência do marcador na estrutura (por exem- plo, uma célula) referida como “positiva” é pelo menos 30% maior (> 30%), particularmente 250% ou 280%, na intensidade mediana de fluo- rescência quando comparado à coloração com um anticorpo marcado com fluorescência de isotipo compatível que não se liga especifica- mente ao mesmo alvo. Tal expressão de um marcador é indicada por um “mais” sobrescrito (*), após o nome do marcador, por exemplo, CD4*.[0049] In this descriptive report, the term positive, when used in the context of expression of a marker, refers to the expression of an antigen tested by an antibody labeled with fluorescence, in which the fluorescence of the marker in the structure ( for example, a cell) referred to as “positive” is at least 30% larger (> 30%), particularly 250% or 280%, in median fluorescence intensity when compared to staining with an antibody labeled with fluorescence of isotype-compatible that does not specifically bind to the same target. Such a marker expression is indicated by a superscript (*) after the marker name, eg CD4*.
[0050] No presente relatório descritivo, o termo negativo, quando usado no contexto de expressão de um marcador, se refere à expres- são de um antígeno testado por um anticorpo marcado com fluores- cência, em que a intensidade mediana de fluorescência é menos de 30% superior, particularmente menos de 15% maior, que a intensidade mediana de fluorescência de um anticorpo de isotipo compatível que não se liga especificamente ao mesmo alvo. Tal expressão de um marcador é indicada por um menos sobrescrito (), após o nome do marcador, por exemplo, CD127-.[0050] In this descriptive report, the term negative, when used in the context of expression of a marker, refers to the expression of an antigen tested by an antibody labeled with fluorescence, in which the median fluorescence intensity is less 30% higher, particularly less than 15% higher, than the median fluorescence intensity of an isotype-matched antibody that does not specifically bind to the same target. Such a marker expression is indicated by a minus superscript () after the marker name, eg CD127-.
[0051] Alta expressão de um marcador, por exemplo, alta expres- são de CD25, se refere ao nível de expressão de tal marcador em uma população de células claramente distinguível que é detectada por FACS, mostrando a maior intensidade de fluorescência por célula em comparação com as outras populações caracterizadas por uma menor intensidade de fluorescência por célula. Uma expressão alta é indicada pelo sobrescrito "alta" ou "hi" após o nome do marcador, por exemplo, CD25º'º, O termo “expressado de forma elevada” se refere à mesma característica.[0051] High expression of a marker, eg high expression of CD25, refers to the expression level of such a marker in a clearly distinguishable cell population that is detected by FACS, showing the highest fluorescence intensity per cell in compared to other populations characterized by a lower fluorescence intensity per cell. A high expression is indicated by the superscript "high" or "hi" after the marker name, for example, CD25º'º. The term “highly expressed” refers to the same characteristic.
[0052] Baixa expressão de um marcador, por exemplo, baixa ex- pressão de CD25, se refere ao nível de expressão de tal marcador em uma população de células claramente distinguível que é detectada por FACS mostrando a menor intensidade de fluorescência por célula em comparação com as outras populações caracterizadas por uma maior intensidade de fluorescência por célula. Uma expressão baixa é indi- cada pelo sobrescrito "baixa" ou "lo" após o nome do marcador, por exemplo, CD25”*x2. O termo “é expressado de forma baixa” refere-se à mesma característica.[0052] Low expression of a marker, eg low expression of CD25, refers to the expression level of such a marker in a clearly distinguishable cell population that is detected by FACS showing the lowest fluorescence intensity per cell compared to with the other populations characterized by a higher fluorescence intensity per cell. A low expression is indicated by the superscript "low" or "lo" after the marker name, eg CD25”*x2. The term “is lowly expressed” refers to the same characteristic.
[0053] A expressão de um marcador pode ser testada por meio de técnicas como microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, ELIS- POT, ELISA ou análises multiplex.[0053] The expression of a marker can be tested using techniques such as fluorescence microscopy, flow cytometry, ELIS-POT, ELISA or multiplex analysis.
[0054] O termo polipeptídeo, no contexto do presente relatório descritivo, se refere a uma molécula que consiste em 50 ou mais ami- noácidos que formam uma cadeia linear em que os aminoácidos estão conectados por ligações peptídicas. A sequência de aminoácidos de um polipeptídeo pode representar a sequência de aminoácidos de uma proteína inteira (como encontrada fisiologicamente) ou seus fragmen- tos. Os termos "polipeptídeos" e "proteína" são usados intercambia- velmente aqui e incluem proteínas e seus fragmentos. Os polipeptí- deos são aqui descritos como sequências de resíduos de aminoáci- dos.[0054] The term polypeptide, in the context of this specification, refers to a molecule consisting of 50 or more amino acids that form a linear chain in which the amino acids are connected by peptide bonds. The amino acid sequence of a polypeptide can represent the amino acid sequence of an entire protein (as found physiologically) or its fragments. The terms "polypeptides" and "protein" are used interchangeably herein and include proteins and fragments thereof. Polypeptides are described herein as amino acid residue sequences.
[0055] O termo peptídeo, no contexto do presente relatório descri- tivo,se refere a uma molécula que consiste em até 50 aminoácidos, em particular 8 a 30 aminoácidos, mais particularmente 8 a 15 aminoáci- dos, que formam uma cadeia linear em que os aminoácidos estão co- nectados por ligações peptídicas.[0055] The term peptide, in the context of this descriptive report, refers to a molecule consisting of up to 50 amino acids, in particular 8 to 30 amino acids, more particularly 8 to 15 amino acids, which form a linear chain in that amino acids are connected by peptide bonds.
[0056] As sequências de resíduos de aminoácidos são providas do terminal amino para o carboxila. As letras maiúsculas para as posições da sequência se referem a L-aminoácidos no código de uma letraThe amino acid residue sequences are provided from the amino terminus to the carboxyl terminus. Capital letters for sequence positions refer to L-amino acids in the one-letter code.
(Stryer, Biochemistry, 3º ed. p. 21). As letras minúsculas para as posi- ções da sequência de aminoácidos se referem aos D- ou (2R)- aminoácidos correspondentes. As sequências são escritas da esquer- da para a direita na direção do terminal amino para o carbóxi. De acordo com a nomenclatura padrão, as sequências de resíduos de aminoácidos são denominadas por um código de três letras ou uma única letra conforme indicado a seguir: Alanina (Ala, A), Arginina (Arg, R), Asparagina (Asn, N), Ácido Aspártico (Asp, D), Cisteína (Cys, C), Glutamina (Gln, Q), Ácido Glutâmico (Glu, E), Glicina (Gly, G), Histidi- na (His, H), Isoleucina (Ile, 1), Leucina (Leu, L), Lisina (Lys, K), Metio- nina (Met, M), Fenilalanina (Phe, F), Prolina (Pro, P), Serina (Ser, S), Treonina (Thr, T), Triptofano (Trp, W), Tirosina (Tyr, Y) e Valina (Val, V). J é leucina ou isoleucina.(Stryer, Biochemistry, 3rd ed. p. 21). Lowercase letters for amino acid sequence positions refer to the corresponding D- or (2R)-amino acids. Sequences are written from left to right in the direction of the amino terminus for the carboxy. According to standard nomenclature, amino acid residue sequences are denoted by a three-letter or single-letter code as indicated below: Alanine (Ala, A), Arginine (Arg, R), Asparagine (Asn, N) , Aspartic Acid (Asp, D), Cysteine (Cys, C), Glutamine (Gln, Q), Glutamic Acid (Glu, E), Glycine (Gly, G), Histidine (His, H), Isoleucine (Ile , 1), Leucine (Leu, L), Lysine (Lys, K), Methionine (Met, M), Phenylalanine (Phe, F), Proline (Pro, P), Serine (Ser, S), Threonine ( Thr, T), Tryptophan (Trp, W), Tyrosine (Tyr, Y) and Valine (Val, V). J is leucine or isoleucine.
[0057] O termo gene se refere a um polinucleotídeo contendo pelo menos uma estrutura de leitura aberta (ORF) que é capaz de codificar um determinado polipeptídeo ou proteína após ser transcrito e traduzi- do. Uma sequência polinucleotídica pode ser usada para identificar fragmentos maiores ou sequências de codificação de comprimento to- tal do gene com o qual estão associados. Os métodos de isolamento de sequências de fragmentos maiores são conhecidos pelos versados na técnica.[0057] The term gene refers to a polynucleotide containing at least one open reading frame (ORF) that is capable of encoding a particular polypeptide or protein after being transcribed and translated. A polynucleotide sequence can be used to identify larger fragments or full-length coding sequences of the gene with which they are associated. Methods of isolating longer fragment sequences are known to those of skill in the art.
[0058] Os termos expressão gênica ou, alternativamente, produto gênico se referem aos processos - e produtos dos mesmos - de ácidos nucleicos (RNA) ou aminoácidos (por exemplo, peptídeo ou polipeptí- deo) sendo gerados quando um gene é transcrito e traduzido.[0058] The terms gene expression or, alternatively, gene product refer to the processes - and products thereof - of nucleic acids (RNA) or amino acids (eg, peptide or polypeptide) being generated when a gene is transcribed and translated .
[0059] Tal como aqui utilizado, expressão se refere ao processo pelo qual o DNA é transcrito em mRNA e/ou o processo pelo qual o mMRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, poli- peptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado de DNA ge- nômico, a expressão pode incluir splicing do MRNA em uma célula eu-As used herein, expression refers to the process by which DNA is transcribed into mRNA and/or the process by which the transcribed mMRNA is subsequently translated into peptides, polypeptides or proteins. If the polynucleotide is derived from genomic DNA, expression may include splicing the mRNA in an eu-
cariótica. A expressão pode ser ensaiada no nível da transcrição e tra- dução, em outras palavras, MRNA e/ou produto proteico.karyotic. Expression can be assayed at the level of transcription and translation, in other words, MRNA and/or protein product.
[0060] Sequências semelhantes ou homólogas (por exemplo, pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência) às sequências aqui descritas também fazem parte da invenção. Em algumas modalidades, a identidade de sequência no nível de aminoácidos pode ser cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou superior. No nível do ácido nucleico, a identidade de sequência pode ser cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou superior. Alternativamente, existe identidade substancial quando os segmentos de ácido nucleico hibridizarão sob condições de hibridização seletiva (por exemplo, condições de hibridi- zação de estringência muito alta), ao complemento da fita. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.Sequences similar or homologous (e.g., at least about 70% sequence identity) to the sequences described herein also form part of the invention. In some embodiments, the sequence identity at the amino acid level can be about 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % or superior. At the nucleic acid level, the sequence identity can be about 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or higher. Alternatively, there is substantial identity when the nucleic acid segments will hybridize under selective hybridization conditions (e.g., very high stringency hybridization conditions), to strand complement. Nucleic acids can be present in whole cells, in a cell lysate, or in a partially purified or substantially pure form.
[0061] Os cálculos de "homologia" ou "identidade de sequência" ou "similaridade" entre duas sequências (os termos são usados inter- cambiavelmente aqui) são realizados como segue. As sequências são alinhadas para fins de comparação ideais (por exemplo, lacunas po- dem ser introduzidas em um ou ambos de um primeiro e um segundo aminoácido ou sequência de ácido nucleico para alinhamento ideal e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para fins de comparação). Em uma modalidade particular, o comprimento de uma sequência de referência alinhada para fins de comparação é de pelo menos 30%, particularmente pelo menos 40%, mais particularmente pelo menos 50%, ainda mais particularmente pelo menos 60% e ainda mais particularmente pelo menos 70%, 80%, 90%, 100% do compri- mento da sequência de referência. Em seguida, os resíduos de ami- noácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são comparados. Quando uma posi- ção na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoá- cido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda se- quência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como aqui utilizado aminoácido ou "homologia" de ácido nucleico é equivalente a uma "identidade" de aminoácido ou ácido nucleico). A porcentagem de identidade entre as duas sequências é função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que precisam ser introduzidos para o alinhamento ideal das duas sequências. No caso de proteínas relacionadas circularmente, a sequência de um dos parceiros precisa ser adequadamente dividida e alinhada em duas se- ções para atingir o alinhamento ideal dos resíduos funcionalmente equivalentes necessários para calcular a porcentagem de identidade.[0061] Calculations of "homology" or "sequence identity" or "similarity" between two sequences (the terms are used interchangeably here) are performed as follows. Sequences are aligned for optimal comparison purposes (eg gaps can be introduced in one or both of a first and a second amino acid or nucleic acid sequence for optimal alignment and non-homologous sequences can be disregarded for comparison purposes) . In a particular embodiment, the length of an aligned reference sequence for comparison purposes is at least 30%, particularly at least 40%, more particularly at least 50%, even more particularly at least 60% and even more particularly at least 70%, 80%, 90%, 100% of the length of the reference sequence. Then, the amino acid or nucleotide residues at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position (as used herein amino acid or nucleic acid "homology" is equivalent to an amino acid or nucleic acid "identity"). The percentage of identity between the two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of gaps and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. In the case of circularly related proteins, the sequence from one of the partners needs to be properly split and aligned into two sections to achieve optimal alignment of the functionally equivalent residues needed to calculate percent identity.
[0062] No contexto do presente relatório descritivo, os termos identidade de sequência e porcentagem de identidade de sequência se referem aos valores determinados pela comparação de duas se- quências alinhadas. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento de se- quências para comparação pode ser realizado pelo algoritmo de ho- mologia local de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math., 2, 482, pelo algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443, pelo método de pesquisa de similaridade de Pe- arson e Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci., 85, 2444 ou por imple- mentações computadorizadas desses algoritmos, incluindo, mas não se limitando a: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível, por exemplo, através do National Center for Biotechnology-Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).[0062] In the context of this specification, the terms sequence identity and percentage of sequence identity refer to the values determined by comparing two aligned sequences. Sequence alignment methods for comparison are well known in the art. Alignment of sequences for comparison can be performed by the local homology algorithm of Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math., 2, 482, by the global alignment algorithm of Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol., 48, 443, by the similarity search method of Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Sci., 85, 2444 or by computerized implementations of these algorithms, including, but not limited to: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA and TFASTA. Software for performing BLAST analysis is publicly available, for example, through the National Center for Biotechnology-Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
[0063] Um exemplo para comparação de sequências de aminoáci-[0063] An example for comparing amino acid sequences.
dos é o algoritmo BLASTP que usa as configurações padrão: Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3; Máximo de pareamentos em um intervalo de consulta: 0; Matriz: BLOSUM62; Custos de lacuna: Exis- tência 11, Extensão 1; Ajustes composicionais: Ajuste condicional da matriz de pontuação composicional. Um exemplo para comparação de sequências de ácido nucleico é o algoritmo BLASTN, que usa as con- figurações padrão: Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 28; Má- ximo de pareamentos em um intervalo de consulta: 0; Pontuações de pareamento/mal pareamento: 1.-2; Custos de lacuna: Linear. A menos que indicado de outra forma, os valores de identidade de sequência aqui fornecidos se referem ao valor obtido usando o conjunto de pro- gramas BLAST (Altschul et a/., 1990, J. Mol. Biol., 215, 403-410) usando os parâmetros padrão identificados acima para comparação de proteína e ácido nucleico, respectivamente.dos is the BLASTP algorithm that uses the default settings: Expected Threshold: 10; Word size: 3; Maximum pairings in a query interval: 0; Matrix: BLOSUM62; Gap costs: Existence 11, Extent 1; Compositional Adjustments: Conditional adjustment of the compositional scoring matrix. An example for comparing nucleic acid sequences is the BLASTN algorithm, which uses the default settings: Expected Threshold: 10; Word Size: 28; Maximum pairings in a query interval: 0; Matching/mismatching scores: 1.-2; Gap costs: Linear. Unless otherwise indicated, sequence identity values provided herein refer to the value obtained using the BLAST software suite (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215, 403-410 ) using the standard parameters identified above for protein and nucleic acid comparison, respectively.
[0064] No contexto do presente relatório descritivo, o termo anti- corpo refere-se a anticorpos completos incluindo, mas não se limitando a, imunoglobulina tipo G (IgG), tipo A (IgA), tipo D (I9D), tipo E (IgE) ou tipo M (IgM), qualquer fragmento de ligação ao antígeno ou cadeias únicas do mesmo e construtos relacionados ou derivados. Um anticor- po completo é uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por |i- gações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (Vx) e uma região constante de cadeia pe- sada (Cr). A região constante de cadeia pesada é composta por três domínios, ChH1, ChH2 e Cx3. Cada cadeia leve é composta por uma re- gião variável de cadeia leve (aqui abreviada como V.) e uma região constante de cadeia leve (C1). A região constante de cadeia leve é composta por um domínio, Cr. As regiões variáveis das cadeias pesa- das e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antí- geno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo vá- rias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente do sistema complemento clássico. Da mesma forma, o termo abrange um denominado nanocorpo ou anticorpo de domínio único, um fragmento de anticorpo que consiste em um único domínio de anticorpo monomérico variável.[0064] In the context of this specification, the term antibody refers to whole antibodies including, but not limited to, immunoglobulin type G (IgG), type A (IgA), type D (I9D), type E (IgE) or type M (IgM), any antigen-binding fragment or single chains thereof and related constructs or derivatives. A complete antibody is a glycoprotein comprising at least two heavy (H) and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds. Each heavy chain is composed of a heavy chain variable region (Vx) and a heavy chain constant region (Cr). The heavy chain constant region is composed of three domains, ChH1, ChH2 and Cx3. Each light chain is composed of a light chain variable region (herein abbreviated as V.) and a light chain constant region (C1). The light chain constant region is composed of a domain, Cr. The variable regions of heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. Antibody constant regions can mediate immunoglobulin binding to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells) and the first component of the classical complement system. Likewise, the term encompasses a so-called nanobody or single-domain antibody, an antibody fragment that consists of a single variable monomeric antibody domain.
[0065] No contexto do presente relatório descritivo, o termo anti- corpo humanizado se refere a um anticorpo originalmente produzido por células imunes de uma espécie não humana, cujas sequências de proteína foram modificadas para aumentar sua similaridade com vari- antes de anticorpos produzidas naturalmente em humanos. O termo anticorpo humanizado, como aqui utilizado, inclui anticorpos nos quais as sequências CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, como um camundongo, foram enxertadas em sequên- cias estruturais humanas. Modificações adicionais da região estrutural podem ser feitas nas sequências estruturais humanas, bem como nas sequências CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero.[0065] In the context of this specification, the term humanized antibody refers to an antibody originally produced by immune cells of a non-human species, whose protein sequences have been modified to increase its similarity with variants of naturally produced antibodies in humans. The term humanized antibody as used herein includes antibodies in which CDR sequences derived from the germline of another mammalian species, such as a mouse, have been grafted onto human framework sequences. Additional framework region modifications can be made to the human framework sequences as well as to the CDR sequences derived from the germline of another mammalian species.
[0066] O termo molécula semelhante a um anticorpo, no contexto do presente relatório descritivo, se refere a uma molécula capaz de ligação específica a outra molécula ou alvo com alta afinidade / a Kd < 10E-8 mol/l. Uma molécula semelhante a um anticorpo liga-se ao seu alvo de maneira semelhante à ligação específica de um anticorpo. O termo molécula semelhante a um anticorpo abrange uma proteína de repetição, como uma proteína de repetição de anquirina projetada (Molecular Partners, Zurich), uma proteína mimética de anticorpo pro- jetada exibindo ligação de proteína alvo de alta afinidade e altamente específica (ver US 2012/142611, US 2016/250341, US 2016/075767 e US 2015/368302, todos os quais aqui incorporados por referência). O termo molécula semelhante a um anticorpo inclui adicionalmente, mas não está limitado a, um polipeptídeo derivado de proteínas de repeti- ção armadillo, um polipeptídeo derivado de proteínas de repetição ri- cas em leucina e um polipeptídeo derivado de proteínas de repetição tetratricopeptídicas.[0066] The term antibody-like molecule, in the context of this specification, refers to a molecule capable of specific binding to another molecule or target with high affinity / a Kd < 10E-8 mol/l. An antibody-like molecule binds to its target in a manner similar to the specific binding of an antibody. The term antibody-like molecule encompasses a repeat protein, such as a engineered ankyrin repeat protein (Molecular Partners, Zurich), a engineered antibody mimetic protein exhibiting high-affinity and highly specific target protein binding (see US 2012/142611, US 2016/250341, US 2016/075767 and US 2015/368302, all of which are incorporated herein by reference). The term antibody-like molecule additionally includes, but is not limited to, a polypeptide derived from armadillo repeat proteins, a polypeptide derived from leucine-rich repeat proteins, and a polypeptide derived from tetratricopeptide repeat proteins.
[0067] O termo molécula semelhante a um anticorpo abrange, ain- da, um polipeptídeo de ligação específica derivado de um domínio de proteína A, domínio de fibronectina FN3, domínios de fibronectina de consenso, uma lipocalina (ver Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482(1-2), 337-50), um polipeptídeo derivado de uma proteína dedo de zinco (ver Kwan et al., 2003, Structure, 11(7), 803-813), domínio de homologia Src 2 (SH2) ou domínio de homolo- gia Src 3 (SH3), um domínio PDZ, gama-cristalina, ubiquitina, um polipeptídeo de nó de cisteína ou uma notina, cistatina, Sac7d, uma bobina espiralada de hélice tripla (também conhecida como alfabodies), um domínio Kunitz ou um inibidor de protease do tipo Ku- nitz e um módulo de ligação a carboidratos 32-2.The term antibody-like molecule further encompasses a specific binding polypeptide derived from a protein A domain, fibronectin domain FN3, consensus fibronectin domains, a lipocalin (see Skerra, 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1482(1-2), 337-50), a polypeptide derived from a zinc finger protein (see Kwan et al., 2003, Structure, 11(7), 803-813), Src homology domain 2 (SH2) or Src homology domain 3 (SH3), a PDZ domain, gamma-crystalline, ubiquitin, a cysteine-knot polypeptide, or a notin, cystatin, Sac7d, a triple helix spiral coil (also known as alfabodies), a Kunitz domain or a Kunitz-type protease inhibitor and a 32-2 carbohydrate-binding module.
[0068] O termo polipeptídeo derivado de domínios de proteína A se refere a uma molécula que é um derivado da proteína A e é capaz de se ligar especificamente à região Fc e à região Fab de imunoglobu- linas.[0068] The term polypeptide derived from protein A domains refers to a molecule that is a derivative of protein A and is capable of specifically binding to the Fc region and the Fab region of immunoglobulins.
[0069] O termo proteína de repetição armadillo se refere a um po- lipeptídeo compreendendo pelo menos uma repetição armadillo, em que uma repetição armadillo é tem características de um par de héli- ces alfa que formam uma estrutura em forma de grampo.[0069] The term armadillo repeat protein refers to a polypeptide comprising at least one armadillo repeat, wherein an armadillo repeat has characteristics of a pair of alpha helices that form a staple-like structure.
[0070] O termo anticorpo de camelídeo humanizado, no contexto do presente relatório descritivo, se refere a um anticorpo que consiste apenas na cadeia pesada ou no domínio variável da cadeia pesada (domínio VHH) e cuja sequência de aminoácidos foi modificada para aumentar sua similaridade com os anticorpos produzidos naturalmente em humanos e, portanto, apresentam uma imunogenicidade reduzida quando administrados a um ser humano. Uma estratégia geral para humanizar anticorpos de camelídeos é mostrada em Vincke et al. 2009, J Biol Chem., 284(5), 3273-3284, e US 2011/165621.[0070] The term humanized camelid antibody, in the context of this specification, refers to an antibody that consists only of the heavy chain or the variable domain of the heavy chain (VHH domain) and whose amino acid sequence has been modified to increase its similarity with antibodies naturally produced in humans and therefore exhibit reduced immunogenicity when administered to a human. A general strategy for humanizing camelid antibodies is shown in Vincke et al. 2009, J Biol Chem., 284(5), 3273-3284, and US 2011/165621.
[0071] No contexto do presente relatório descritivo, o termo região do fragmento cristalizável (Fc) é usado no seu significado conhecido na técnica da biologia celular e imunologia; se refere a uma fração de um anticorpo compreendendo dois fragmentos de cadeia pesada idên- ticos compostos por um domínio Cx2 e um Cr3, ligados covalentemen- te por ligações dissulfeto.[0071] In the context of this descriptive report, the term crystallizable fragment region (Fc) is used in its known meaning in the art of cell biology and immunology; refers to a fraction of an antibody comprising two identical heavy chain fragments composed of a Cx2 and a Cr3 domain, covalently linked by disulfide bonds.
[0072] O termo ligação específica, no contexto do presente relató- rio descritivo, se refere a uma propriedade de ligantes que se ligam ao seu alvo com uma certa afinidade e especificidade ao alvo. A afinidade de tal ligante é indicada pela constante de dissociação do ligante. Um ligante especificamente reativo tem uma constante de dissociação de < 10 "mol/L ao se ligar ao seu alvo, mas uma constante de dissociação pelo menos três ordens de grandeza maior em sua interação com uma molécula com uma composição química globalmente semelhante ao alvo, mas uma estrutura tridimensional diferente.[0072] The term specific binding, in the context of this descriptive report, refers to a property of ligands that bind to their target with a certain affinity and specificity to the target. The affinity of such a linker is indicated by the dissociation constant of the linker. A specifically reactive ligand has a dissociation constant of < 10 "mol/L when binding to its target, but a dissociation constant at least three orders of magnitude greater in its interaction with a molecule with a chemical composition globally similar to the target, but a different three-dimensional structure.
[0073] No contexto do presente relatório descritivo, o termo cons- tante de dissociação (KD) é usado no seu significado conhecido na técnica da química e da física; se refere a uma constante de equilíbrio que mede a propensão de um complexo composto de [principalmente dois] componentes diferentes de se dissociar reversivelmente em seus componentes constituintes. O complexo pode ser, por exemplo, um complexo de anticorpo-antígeno ADbAg composto por anticorpo Ab e antígeno Ag. Kp é expresso em concentração molar [mol/]] e corres- ponde à concentração de [Ab] na qual metade dos sítios de ligação de [Ag] são ocupados, em outras palavras, a concentração de [Ab] não ligado é igual à concentração de complexo [AbAg]. A constante de dis- sociação pode ser calculada de acordo com a seguinte fórmula: 12 BIA lAbAg][0073] In the context of this descriptive report, the term dissociation constant (KD) is used in its known meaning in the art of chemistry and physics; refers to an equilibrium constant that measures the propensity of a complex composed of [mainly two] different components to reversibly dissociate into its constituent components. The complex can be, for example, an antibody-antigen ADbAg complex composed of antibody Ab and antigen Ag. Kp is expressed in molar concentration [mol/]] and corresponds to the concentration of [Ab] in which half of the sites of binding of [Ag] are occupied, in other words, the concentration of unbound [Ab] is equal to the concentration of complex [AbAg]. The dissociation constant can be calculated according to the following formula: 12 BIA lAbAg]
[0074] [Ab]: concentração de anticorpo; [Ag]: concentração de an- tígeno; [ADAg]: concentração do complexo anticorpo-antígeno[0074] [Ab]: antibody concentration; [Ag]: antigen concentration; [ADAg]: antibody-antigen complex concentration
[0075] No contexto do presente relatório descritivo, os termos taxa de dissociação (Koff;[1/s]) e taxa de associação (Kon; [1/s*M]) são usados em seu significado conhecido na técnica da química e da físi- ca; eles se referem a uma constante de taxa que mede a dissociação (Koff) ou associação (Kon) de 5 um anticorpo com seu antígeno alvo.[0075] In the context of this descriptive report, the terms dissociation rate (Koff;[1/s]) and association rate (Kon; [1/s*M]) are used in their known meaning in the art of chemistry and of physics; they refer to a rate constant that measures the dissociation (Koff) or association (Kon) of an antibody with its target antigen.
[0076] Koff e Kon podem ser determinados experimentalmente usando métodos bem estabelecidos na técnica. Um método para de- terminar o Koff e Kon de um anticorpo usa ressonância plasmônica de superfície. Este é o princípio por trás dos sistemas de biossensores, como o sistema Biacore& ou ProteOnêO. Eles também podem ser usa- dos para determinar a constante de dissociação KD usando a seguinte fórmula: Ko][0076] Koff and Kon can be determined experimentally using methods well established in the art. One method to determine the Koff and Kon of an antibody uses surface plasmon resonance. This is the principle behind biosensor systems such as the Biacore& or ProteOnêO system. They can also be used to determine the dissociation constant KD using the following formula: Ko]
[0077] Como aqui utilizado, o termo composição farmacêutica se refere a um composto da invenção, ou um sal farmaceuticamente acei-[0077] As used herein, the term pharmaceutical composition refers to a compound of the invention, or a pharmaceutically acceptable salt.
tável do mesmo, juntamente com pelo menos um veículo farmaceuti- camente aceitável. Em certas modalidades, a composição farmacêuti- ca de acordo com a invenção é fornecida em uma forma adequada para administração tópica, parentérica ou injetável.the same, together with at least one pharmaceutically acceptable carrier. In certain embodiments, the pharmaceutical composition according to the invention is provided in a form suitable for topical, parenteral or injectable administration.
[0078] Tal como aqui utilizado, o termo veículo farmaceuticamente aceitável inclui quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimen- tos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, agentes de retardamento de absorção, sais, conservantes, fármacos, estabilizan- tes de fármacos, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegração, lubrificantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, corantes e semelhantes e suas combinações, como seria conhecido pelos versa- dos na técnica (ver, por exemplo, Remington: the Science and Practice of Pharmacy, ISBN 0857110624).[0078] As used herein, the term pharmaceutically acceptable carrier includes any solvents, dispersion media, coatings, surfactants, antioxidants, preservatives (e.g., antibacterial agents, antifungal agents), isotonic agents, absorption delaying agents, salts, preservatives, drugs, drug stabilizers, binders, excipients, disintegrating agents, lubricants, sweetening agents, flavoring agents, colorants and the like and combinations thereof, as would be known to those skilled in the art (see, for example, Remington: the Science and Practice of Pharmacy, ISBN 0857110624).
[0079] Como aqui utilizado, o termo tratar ou tratamento de qual- quer doença ou distúrbio (por exemplo, câncer) se refere, em uma modalidade, a melhorar a doença ou distúrbio (por exemplo, retardar ou interromper ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo me- nos um dos seus sintomas clínicos). Em outra modalidade, "tratar" ou "tratamento" se refere a aliviar ou melhorar pelo menos um parâmetro físico, incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo paciente. Em ainda outra modalidade, "tratar" ou "tratamento" se refere a modu- lar a doença ou distúrbio, fisicamente (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisiologicamente (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico), ou ambos. Métodos para avaliar o tratamento e/ou prevenção de doenças são, em geral, conhecidos na técnica, a menos que especificamente descrito abaixo.[0079] As used herein, the term treating or treating any disease or disorder (for example, cancer) refers, in one modality, to ameliorating the disease or disorder (for example, delaying or interrupting or reducing the development of the disease or at least one of its clinical symptoms). In another embodiment, "treating" or "treatment" refers to alleviating or ameliorating at least one physical parameter, including those that may not be discernible by the patient. In yet another embodiment, "treating" or "treatment" refers to modulating the disease or disorder, physically (eg, stabilization of a discernible symptom), physiologically (eg, stabilization of a physical parameter), or both. Methods for evaluating the treatment and/or prevention of diseases are generally known in the art, unless specifically described below.
[0080] No contexto do presente relatório descritivo, o termo dímero se refere a uma unidade que consiste em duas subunidades.[0080] In the context of this descriptive report, the term dimer refers to a unit consisting of two subunits.
[0081] No contexto do presente relatório descritivo, o termo homo-[0081] In the context of this descriptive report, the term homo-
dímero se refere a um dímero composto por duas subunidades que são idênticas ou são membros altamente semelhantes da mesma classe de subunidades.dimer refers to a dimer composed of two subunits that are identical or are highly similar members of the same class of subunits.
[0082] No contexto do presente relatório descritivo, o termo ligante de aminoácido se refere a um polipeptídeo de comprimento variável que é usado para conectar dois polipeptídeos a fim de gerar um poli- peptídeo de cadeia única. Modalidades exemplificativas de ligantes úteis para a prática da invenção especificada aqui são cadeias de oli- gopeptídeos consistindo em 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 ou 50 aminoá- cidos. Um exemplo não limitativo de um ligante de aminoácido é o po- lipeptíideo GGGGSGGGGS (SEQ ID Nº 83).[0082] In the context of this specification, the term amino acid linker refers to a polypeptide of variable length that is used to connect two polypeptides to generate a single-chain polypeptide. Exemplary embodiments of linkers useful for the practice of the invention specified herein are oligopeptide chains consisting of 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 or 50 amino acids. A non-limiting example of an amino acid linker is the polypeptide GGGGSGGGGS (SEQ ID NO 83).
[0083] Um primeiro aspecto da invenção se refere a um polipeptí- deo tetramérico.[0083] A first aspect of the invention relates to a tetrameric polypeptide.
[0084] De acordo com uma primeira alternativa do primeiro aspec- to, o polipeptídeo tetramérico compreende ou consiste em[0084] According to a first alternative of the first aspect, the tetrameric polypeptide comprises or consists of
[0085] uma primeira cadeia polipeptídica compreendendo, na ori- entação de N para C, um primeiro domínio de ligação ao antígeno VL e um primeiro domínio constante CL,[0085] a first polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a first VL antigen-binding domain and a first constant CL domain,
[0086] uma segunda cadeia polipeptídica compreendendo, na ori- entação de N para C, um primeiro domínio de ligação ao antígeno VH, um primeiro domínio constante CH1, um primeiro domínio constante CH2 e um primeiro domínio constante CH3,[0086] a second polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a first VH antigen-binding domain, a first CH1 constant domain, a first CH2 constant domain, and a first CH3 constant domain,
[0087] um primeiro ligante que se liga especificamente a um epíto- po D4 de HER2, em que o primeiro ligante está compreendido na pri- meira cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do primeiro domínio de ligação ao antígeno VL por um primeiro ligante de aminoácido de interdomínio, ou o primeiro ligante está compreendido na segunda ca- deia polipeptídica e ligado ao terminal N do primeiro domínio de liga- ção ao antígeno VH por um primeiro ligante de aminoácido de inter- domínio,[0087] a first linker that specifically binds to a D4 epitope of HER2, wherein the first linker is comprised in the first polypeptide chain and linked to the N-terminus of the first VL antigen-binding domain by a first linker of interdomain amino acid, or the first linker is comprised of the second polypeptide chain and linked to the N-terminus of the first VH antigen-binding domain by a first interdomain amino acid linker,
[0088] em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno VL da primeira cadeia polipeptídica e o primeiro domínio de ligação ao antí- geno VH da segunda cadeia polipeptídica, juntos, constituem um se- gundo ligante, particularmente um domínio Fab, que se liga especifi- camente a um epítopo D1 de HER?2,[0088] in which the first VL antigen-binding domain of the first polypeptide chain and the first VH antigen-binding domain of the second polypeptide chain, together, constitute a second linker, particularly a Fab domain, which binds specifically to a D1 epitope of HER?2,
[0089] uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo, na orien- tação de N para C, um segundo domínio de ligação ao antígeno VL e um segundo domínio constante CL,[0089] a third polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a second VL antigen-binding domain and a second constant CL domain,
[0090] uma quarta cadeia polipeptídica compreendendo, na orien- tação de N para C, um segundo domínio de ligação ao antígeno VH, um segundo domínio constante CH1, um segundo domínio constante CH2 e um segundo domínio constante CH3,[0090] a fourth polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a second VH antigen-binding domain, a second CH1 constant domain, a second CH2 constant domain, and a second CH3 constant domain.
[0091] um terceiro ligante que se liga especificamente a um epíto- po D4 de HER2, em que o terceiro ligante está compreendido na ter- ceira cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do segundo domínio de ligação ao antígeno VL por um segundo ligante de aminoácido de interdomínio, ou o terceiro ligante está compreendido na quarta cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do segundo domínio de ligação ao antígeno VH por um segundo ligante de aminoácido de interdomínio,[0091] a third linker that specifically binds to a D4 epitope of HER2, wherein the third linker is comprised of the third polypeptide chain and linked to the N-terminus of the second VL antigen-binding domain by a second linker of interdomain amino acid, or the third linker is comprised of the fourth polypeptide chain and linked to the N-terminus of the second VH antigen-binding domain by a second interdomain amino acid linker,
[0092] em que o segundo domínio de ligação ao antígeno VL da terceira cadeia polipeptídica e o segundo domínio de ligação ao antí- geno VH da quarta cadeia polipeptídica, juntos, constituem um quarto ligante, particularmente um domínio Fab, que se liga especificamente a um epítopo D1 de HER?2,[0092] wherein the second VL antigen-binding domain of the third polypeptide chain and the second VH antigen-binding domain of the fourth polypeptide chain together constitute a fourth ligand, particularly a Fab domain, which specifically binds to a D1 epitope of HER?2,
[0093] De acordo com uma segunda alternativa do primeiro aspec- to, o polipeptídeo tetramérico compreende ou consiste em[0093] According to a second alternative of the first aspect, the tetrameric polypeptide comprises or consists of
[0094] uma primeira cadeia polipeptídica compreendendo, na ori- entação de N para C, um primeiro domínio de ligação ao antígeno VL e um primeiro domínio constante CL,[0094] a first polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a first VL antigen-binding domain and a first constant CL domain,
[0095] uma segunda cadeia polipeptídica compreendendo, na ori-[0095] a second polypeptide chain comprising, in the original,
entação de N para C, um primeiro domínio de ligação ao antígeno VH e um primeiro domínio constante CH1, em que particularmente a se- gunda cadeia polipeptídica compreende, adicionalmente, um primeiro domínio constante CH2, em que mais particularmente o primeiro do- mínio constante CH2 é truncado em seu terminal C,tion of N to C, a first VH antigen-binding domain and a first constant domain CH1, in which particularly the second polypeptide chain further comprises a first constant domain CH2, in which more particularly the first constant domain CH2 is truncated at its C-terminal,
[0096] um primeiro ligante que se liga especificamente a um epíto- po D4 de HER2, em que o primeiro ligante está compreendido na pri- meira cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do primeiro domínio de ligação ao antígeno VL por um primeiro ligante de aminoácido de interdomínio, ou o primeiro ligante está compreendido na segunda ca- deia polipeptídica e ligado ao terminal N do primeiro domínio de liga- ção ao antígeno VH por um primeiro ligante de aminoácido de inter- domínio,[0096] a first linker that specifically binds to a D4 epitope of HER2, wherein the first linker is comprised in the first polypeptide chain and linked to the N-terminus of the first VL antigen-binding domain by a first linker of interdomain amino acid, or the first linker is comprised of the second polypeptide chain and linked to the N-terminus of the first VH antigen-binding domain by a first interdomain amino acid linker,
[0097] em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno VL da primeira cadeia polipeptídica e o primeiro domínio de ligação ao antí- geno VH da segunda cadeia polipeptídica, juntos, constituem um se- gundo ligante, particularmente um domínio Fab, que se liga especifi- camente a um epítopo D1 de HER?2,[0097] in which the first VL antigen-binding domain of the first polypeptide chain and the first VH antigen-binding domain of the second polypeptide chain, together, constitute a second ligand, particularly a Fab domain, which binds specifically to a D1 epitope of HER?2,
[0098] uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo, na orien- tação de N para C, um segundo domínio de ligação ao antígeno VL e um segundo domínio constante CL,[0098] a third polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a second VL antigen-binding domain and a second constant CL domain,
[0099] uma quarta cadeia polipeptídica compreendendo, na orien- tação de N para C, um segundo domínio de ligação ao antígeno VH e um segundo domínio constante CH1, em que particularmente a quarta cadeia polipeptídica compreende, adicionalmente, um segundo domí- nio constante CH2, em que mais particularmente o segundo domínio constante CH2 é truncado em seu terminal C,[0099] a fourth polypeptide chain comprising, in the N to C orientation, a second VH antigen-binding domain and a second constant domain CH1, wherein particularly the fourth polypeptide chain additionally comprises a second constant domain CH2, in which more particularly the second constant domain CH2 is truncated at its C-terminus,
[00100] um terceiro ligante que se liga especificamente a um epíto- po D4 de HER2, em que o terceiro ligante está compreendido na ter- ceira cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do segundo domínio de ligação ao antígeno VL por um segundo ligante de aminoácido de interdomínio, ou o terceiro ligante está compreendido na quarta cadeia polipeptídica e ligado ao terminal N do segundo domínio de ligação ao antígeno VH por um segundo ligante de aminoácido de interdomínio,[00100] a third linker that specifically binds to a D4 epitope of HER2, wherein the third linker is comprised of the third polypeptide chain and linked to the N-terminus of the second VL antigen-binding domain by a second linker of interdomain amino acid, or the third linker is comprised of the fourth polypeptide chain and linked to the N-terminus of the second VH antigen-binding domain by a second interdomain amino acid linker,
[00101] em que o segundo domínio de ligação ao antígeno VL da terceira cadeia polipeptídica e o segundo domínio de ligação ao antí- geno VH da quarta cadeia polipeptídica, juntos, constituem um quarto ligante, particularmente um domínio Fab, que se liga especificamente a um epítopo D1 de HER?2,[00101] wherein the second VL antigen-binding domain of the third polypeptide chain and the second VH antigen-binding domain of the fourth polypeptide chain together constitute a fourth linker, particularly a Fab domain, which specifically binds to a D1 epitope of HER?2,
[00102] Todas as modalidades abaixo podem ser combinadas com a primeira alternativa e a segunda alternativa do primeiro aspecto da invenção.[00102] All of the embodiments below can be combined with the first alternative and the second alternative of the first aspect of the invention.
[00103] O domínio de ligação ao antígeno VL e o domínio constante CL da primeira e terceira cadeia polipeptídica são domínios de uma cadeia leve de imunoglobulina G, e o domínio de ligação ao antígeno VH e os domínios constantes CH1, CH2 e CH3 do segundo e quarto polipeptídeo são domínios de uma cadeia pesada de imunoglobulina G. Em outras palavras, a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas compreendem, cada uma, uma cadeia leve de imunoglobulina G e a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas compreendem, cada uma, uma cadeia pesada de imunoglobulina G. As cadeias leve e pesada de imunoglobulina do polipeptídeo tetramérico, de acordo com a inven- ção, formam o segundo e o quarto ligantes que se ligam especifica- mente ao epítopo D1 de HER?2.[00103] The VL antigen binding domain and the CL constant domain of the first and third polypeptide chain are domains of an immunoglobulin G light chain, and the VH antigen binding domain and the CH1, CH2 and CH3 constant domains of the second and fourth polypeptide are domains of an immunoglobulin G heavy chain. In other words, the first and third polypeptide chains each comprise an immunoglobulin G light chain, and the second and fourth polypeptide chains each comprise one chain heavy immunoglobulin G. The immunoglobulin light and heavy chains of the tetrameric polypeptide according to the invention form the second and fourth linkers that specifically bind to the D1 epitope of HER?2.
[00104] Além disso, os polipeptídeos compreendendo um primeiro e terceiro ligantes que se ligam especificamente ao epítopo D4 de HER2 são fundidos ao terminal N das cadeias pesadas de imunoglobulina G ou cadeias leves de imunoglobulina G por um ligante de aminoácido de interdomínio, resultando em um polipeptídeo tetramérico com qua- tro sítios de ligação ao HER?2, dois dos quais se ligam ao epítopo D4 e dois dos quais se ligam ao epítopo D1.Furthermore, polypeptides comprising a first and third linker that specifically bind to the D4 epitope of HER2 are fused to the N-terminus of immunoglobulin G heavy chains or immunoglobulin G light chains by an interdomain amino acid linker, resulting in a tetrameric polypeptide with four HER?2 binding sites, two of which bind to the D4 epitope and two of which bind to the D1 epitope.
[00105] —Surpreendentemente, o polipeptídeo tetramérico, de acordo com a invenção, exibe inativação de HER2 superior em comparação com anticorpos convencionais e outras moléculas semelhantes a anti- corpos, como polipeptídeos biparatópicos divalentes (tendo um total de duas regiões de ligação) e tem efeitos adicionais no crescimento celu- lar, apoptose, internalização de HER2 e degradação de HER2. Portan- to, os polipeptídeos tetraméricos, de acordo com a presente invenção, são candidatos promissores para terapia de câncer que expressa HER?2.[00105] — Surprisingly, the tetrameric polypeptide according to the invention exhibits superior HER2 inactivation compared to conventional antibodies and other antibody-like molecules such as divalent biparatopic polypeptides (having a total of two binding regions) and it has additional effects on cell growth, apoptosis, HER2 internalization, and HER2 degradation. Therefore, the tetrameric polypeptides, according to the present invention, are promising candidates for cancer therapy that expresses HER?2.
[00106] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que os domínios CH1, CH2, CH3 e CL contribuam, particularmente os domí- nios CH2 e CH3, para os efeitos adicionais dos polipeptídeos tetramé- ricos da invenção, particularmente a inibição do crescimento e prolife- ração celular, indução de apoptose e outras formas de morte celular, internalização de HER2, inibição da reciclagem de HER2 e degrada- ção de HER2, reticulação de HER2, redução da mobilidade de superfí- cie de HER?2, infrarregulação da expressão de HER2, inibição de dime- rização de HER?2 e sinalização pelo posicionamento dos domínios va- riáveis em um determinado ângulo e distância.[00106] Without wishing to be bound by theory, it is believed that the CH1, CH2, CH3 and CL domains contribute, particularly the CH2 and CH3 domains, to the additional effects of the tetrameric polypeptides of the invention, particularly the inhibition of cell growth and proliferation, induction of apoptosis and other forms of cell death, HER2 internalization, inhibition of HER2 recycling and HER2 degradation, HER2 crosslinking, reduction of HER?2 surface mobility, downregulation of HER2 expression, inhibition of HER?2 dimerization and signaling by positioning the variable domains at a given angle and distance.
[00107] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia polipeptídica compreendem uma identidade de se- quência uma com a outra de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, em que mais particularmente a primeira cadeia polipep- tídica e a terceira cadeia polipeptídica são idênticas.[00107] In certain embodiments, the first polypeptide chain and the third polypeptide chain comprise a sequence identity to each other of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95 % or more, wherein more particularly the first polypeptide chain and the third polypeptide chain are identical.
[00108] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 15%, 76%, 17%, 18%, 719%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,[00108] In certain embodiments, the first polypeptide chain comprises a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 15%, 76%, 17%, 18%, 719%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ,
98%, 99% ou 100% com a terceira cadeia polipeptídica.98%, 99% or 100% with the third polypeptide chain.
[991909] — Em certas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica compreendem uma identidade de sequên- cia uma com a outra de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, em que mais particularmente a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica são idênticas.[991909] — In certain embodiments, the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain comprise a sequence identity to each other of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, wherein more particularly the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are identical.
[00110] Em certas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 175%, 76%, 77%, 718%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com a quarta cadeia polipeptídica.[00110] In certain embodiments, the second polypeptide chain comprises a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 175%, 76%, 77%, 718%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% or 100% with the fourth polypeptide chain.
[00111] Em certas modalidades, a cadeia leve de imunoglobulina da primeira cadeia polipeptídica e a cadeia leve de imunoglobulina da ter- ceira cadeia polipeptídica compreendem uma identidade de sequência uma com a outra de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, em que mais particularmente a cadeia leve de imunoglobulina da primeira cadeia polipeptídica e a cadeia leve de imunoglobulina da ter- ceira cadeia polipeptídica são idênticas.In certain embodiments, the immunoglobulin light chain of the first polypeptide chain and the immunoglobulin light chain of the third polypeptide chain comprise a sequence identity to each other of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, wherein more particularly the immunoglobulin light chain of the first polypeptide chain and the immunoglobulin light chain of the third polypeptide chain are identical.
[00112] Em certas modalidades, a cadeia leve de imunoglobulina da primeira cadeia polipeptídica compreende uma identidade de sequên- cia de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, TT%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com a cadeia leve de imunoglobulina da terceira cadeia polipeptídica.[00112] In certain embodiments, the immunoglobulin light chain of the first polypeptide chain comprises a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, TT%, 78% , 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with the immunoglobulin light chain of the third polypeptide chain.
[00113] Em certas modalidades, a cadeia pesada de imunoglobuli- na da segunda cadeia polipeptídica e a cadeia pesada de imunoglobu- lina da quarta cadeia polipeptídica compreendem uma identidade de sequência uma com a outra de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, em que mais particularmente a cadeia pesada de imu- noglobulina da segunda cadeia polipeptídica e a cadeia pesada de imunoglobulina da quarta cadeia polipeptídica são idênticas.In certain embodiments, the immunoglobulin heavy chain of the second polypeptide chain and the immunoglobulin heavy chain of the fourth polypeptide chain comprise a sequence identity to each other of 70% or more, particularly 80% or more , more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, wherein more particularly the second polypeptide chain immunoglobulin heavy chain and the fourth polypeptide chain immunoglobulin heavy chain are identical.
[00114] Em certas modalidades, a cadeia pesada de imunoglobuli- na da segunda cadeia polipeptídica compreende uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com a cadeia pesada de imunoglobulina da quarta cadeia polipeptídica.In certain embodiments, the immunoglobulin heavy chain of the second polypeptide chain comprises a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 17%, 18% , 19%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 294%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with the immunoglobulin heavy chain of the fourth polypeptide chain.
[00115] Em certas modalidades, o primeiro ligante e o terceiro ligan- te compreendem uma identidade de sequência um com o outro de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, em que mais parti- cularmente o primeiro ligante e o terceiro ligante são idênticos.[00115] In certain embodiments, the first linker and the third linker comprise a sequence identity to each other of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, in which more particularly the first binder and the third binder are identical.
[00116] Em certas modalidades, o primeiro ligante compreende uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com o terceiro ligante.[00116] In certain embodiments, the first linker comprises a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with the third binder.
[00117] Em outras palavras, o primeiro ligante é substancialmente igual ao terceiro ligante.[00117] In other words, the first binder is substantially the same as the third binder.
[00118] Em certas modalidades, o segundo ligante e o quarto ligan- te compreendem uma identidade de sequência um com o outro de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, em que mais parti- cularmente o segundo ligante e o quarto ligante são idênticos.[00118] In certain embodiments, the second linker and the fourth linker comprise a sequence identity to each other of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, in which more particularly the second ligand and the fourth ligand are identical.
[00119] Em certas modalidades, o segundo ligante compreende uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,[00119] In certain embodiments, the second linker comprises a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,
88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% com o quarto ligante.88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with the fourth binder.
[00120] Em outras palavras, o segundo ligante é substancialmente igual ao quarto ligante.[00120] In other words, the second binder is substantially the same as the fourth binder.
[00121] Em certas modalidades, o primeiro domínio constante CH2 e o primeiro domínio constante CH3 da segunda cadeia polipeptídica interagem com o segundo domínio constante CH2 e o segundo domí- nio constante CH3 da quarta cadeia polipeptídica, de modo que um polipeptídeo tetramérico seja formado. Em particular, os domínios constantes CH2 e CH3 da segunda e quarta cadeia polipeptídica dime- rizam. Em particular, combinado com a interação entre a primeira e a segunda cadeias polipeptídicas e a terceira e a quarta cadeias polipep- tídicas, particularmente por meio da dimerização entre os respectivos domínios de ligação ao antígeno VL e VH e os domínios constantes CL e CH1, isso resulta em formação de tetrâmero do primeiro, segun- do, terceiro e quarto polipeptídeo. Portanto, no que diz respeito à for- mação de multímeros, o polipeptídeo tetramérico da presente invenção é semelhante a um anticorpo.[00121] In certain embodiments, the first CH2 constant domain and the first CH3 constant domain of the second polypeptide chain interact with the second CH2 constant domain and the second CH3 constant domain of the fourth polypeptide chain, such that a tetrameric polypeptide is formed . In particular, the CH2 and CH3 constant domains of the second and fourth polypeptide chains dimerize. In particular, combined with the interaction between the first and second polypeptide chains and the third and fourth polypeptide chains, particularly through dimerization between the respective VL and VH antigen-binding domains and the constant domains CL and CH1, this results in tetramer formation of the first, second, third, and fourth polypeptides. Therefore, with respect to the formation of multimers, the tetrameric polypeptide of the present invention is similar to an antibody.
[00122] Em certas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica compreende uma primeira região de dobradiça entre o primeiro domí- nio constante de CH1 e o primeiro domínio constante de CH2, e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma segunda região de do- bradiça entre o segundo domínio constante de CH1 e o segundo do- mínio constante de CH2, em que a primeira região de dobradiça e a segunda região de dobradiça medeiam a formação de complexo entre a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica, particu- larmente por pelo menos uma ligação dissulfeto, mais particularmente por uma primeira ligação dissulfeto e uma segunda ligação dissulfeto, de modo que um polipeptídeo tetramérico seja formado. A formação de complexos entre os domínios constantes CH1 e CH2 pode, assim,In certain embodiments, the second polypeptide chain comprises a first hinge region between the first constant domain of CH1 and the first constant domain of CH2, and the fourth polypeptide chain comprises a second hinge region between the second constant domain of CH1 and the second constant domain of CH2, wherein the first hinge region and the second hinge region mediate complex formation between the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain, particularly by at least one disulfide bond, more particularly by a first disulfide bond and a second disulfide bond, such that a tetrameric polypeptide is formed. The formation of complexes between the CH1 and CH2 constant domains can thus
ocorrer pela região de dobradiça, ou seja, por formação de ligação dis- sulfeto entre resíduos de cisteína, assim como em anticorpos.occur through the hinge region, that is, by formation of a disulfide bond between cysteine residues, as well as in antibodies.
[00123] Em certas modalidades, o domínio constante CH2 e/ou o domínio constante CH3 da segunda cadeia polipeptídica é truncado em seu terminal C.[00123] In certain embodiments, the CH2 constant domain and/or the CH3 constant domain of the second polypeptide chain is truncated at its C-terminus.
[00124] Em certas modalidades, o domínio constante CH2 e/ou o domínio constante CH3 da quarta cadeia polipeptídica é truncado em seu terminal C.[00124] In certain embodiments, the CH2 constant domain and/or the CH3 constant domain of the fourth polypeptide chain is truncated at its C-terminus.
[00125] Em certas modalidades, o primeiro ligante compreende ou consiste em uma cadeia polipeptídica de fragmento variável de cadeia única que compreende uma cadeia pesada de scFv, uma cadeia de ligante de scFv e uma cadeia leve de scFv. Em certas modalidades, a cadeia pesada de scFv é o domínio VH de 4D5 (particularmente SEQ ID Nº 80), e em que a cadeia leve de scFv é o domínio VL de 4D5 (particularmente SEQ ID Nº 81).In certain embodiments, the first linker comprises or consists of a single chain variable fragment polypeptide chain comprising an scFv heavy chain, an scFv linker chain, and an scFv light chain. In certain embodiments, the scFv heavy chain is the 4D5 VH domain (particularly SEQ ID No. 80), and wherein the scFv light chain is the 4D5 VL domain (particularly SEQ ID No. 81).
[00126] Em certas modalidades, a cadeia polipeptídica do fragmen- to variável de cadeia única compreende, na orientação de N para C, uma cadeia pesada de scFv, uma cadeia de ligante de scFv e uma ca- deia leve de scFv.In certain embodiments, the single-chain variable fragment polypeptide chain comprises, in N to C orientation, an scFv heavy chain, an scFv linker chain, and an scFv light chain.
[00127] Em certas modalidades, a cadeia polipeptídica do fragmen- to variável de cadeia única compreende, na orientação de N para C, uma cadeia leve de scFv, uma cadeia de ligante de scFv e uma cadeia pesada de scFv.In certain embodiments, the single-chain variable fragment polypeptide chain comprises, in N to C orientation, an scFv light chain, an scFv linker chain, and an scFv heavy chain.
[00128] Em outras palavras, a cadeia pesada de scFv e a cadeia leve de scFv podem ser fornecidas em qualquer orientação na cadeia polipeptídica do fragmento variável de cadeia única.[00128] In other words, the scFv heavy chain and the scFv light chain can be provided in any orientation in the polypeptide chain of the single-chain variable fragment.
[00129] Em certas modalidades, o primeiro ligante compreende ou consiste em uma cadeia polipeptídica de fragmento variável de cadeia única que compreende, na orientação N para C, uma cadeia pesada de scFv, uma cadeia de ligante de scFvy e uma cadeia leve de scFv.In certain embodiments, the first linker comprises or consists of a single-chain variable fragment polypeptide chain comprising, in N to C orientation, a scFv heavy chain, a scFvy linker chain, and a scFv light chain .
Em certas modalidades, a cadeia pesada de scFv é o domínio VH de 4D5 (particularmente SEQ ID Nº 80), e em que a cadeia leve de scFv é o domínio VL de 4D5 (particularmente SEQ ID Nº 81).In certain embodiments, the scFv heavy chain is the 4D5 VH domain (particularly SEQ ID No. 80), and wherein the scFv light chain is the 4D5 VL domain (particularly SEQ ID No. 81).
[00130] Em certas modalidades,[00130] In certain modalities,
[00131] a cadeia pesada de scFv do primeiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais parti- cularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, em que mais particularmente a ca- deia pesada de scFv do primeiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo se- lecionada a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, e a cadeia leve de scFv do primeiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequên- cia de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81, em que mais particularmente a cadeia leve de scFv do primeiro ligante com- preende ou consiste em uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81.[00131] the scFv heavy chain of the first linker comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54 and SEQ ID NO. 80, wherein more particularly the scFv heavy chain of the first linker comprises or consists of a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22 , SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54, and SEQ ID NO.80, and the scFv light chain of the first linker comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70 % or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a pept sequence ide selected from SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.43 and SEQ ID NO.81, more particularly the scFv light chain of the first linker comprises or consists of a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.43 and SEQ ID NO.81.
[00132] Em certas modalidades, a cadeia pesada de scFv do pri- meiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,In certain embodiments, the scFv heavy chain of the first linker comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, 76 %, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% ou 100% com uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, e a cadeia leve de scFv do primeiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma se- quência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81.99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54 and SEQ ID No. 80, and the scFv light chain of the first linker comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID No. 43 and SEQ ID No. 81.
[00133] Em certasmodalidades, a cadeia pesada de scFv do terceiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, em que mais particularmente a ca- deia pesada de scFv do terceiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo se- lecionada a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, e a cadeia leve de scFv do terceiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81, em que mais particularmente a cadeia leve de scFv do terceiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo idênti- ca a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81.[00133] In certain embodiments, the scFv heavy chain of the third linker comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO. 54 and SEQ ID No. 80, wherein more particularly the scFv heavy chain of the third linker comprises or consists of a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 21 , SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54 and SEQ ID NO.80, and the third linker scFv light chain comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.43 and SEQ ID NO.81, more particularly the scFv light chain of the third linker comprises or consists of a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.43 and SEQ ID NO.81 .
[00134] Em certas modalidades, a cadeia pesada de scFv do terceiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma se- quência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, e a cadeia leve de scFv do terceiro ligante compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma se- quência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81.In certain embodiments, the scFv heavy chain of the third linker comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16 %, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54, and SEQ ID No. 80, and the third linker scFv light chain comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70 %, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected a from SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.43 and SEQ ID NO.81.
[00135] Em certas modalidades, a cadeia pesada de scFv do primeiro ligante e do terceiro ligante, cada uma, compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, particu- larmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo seleci- onado a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, em que mais particularmente a cadeia pesada de scFv do primeiro |i- gante e do terceiro ligante, cada uma, compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo se- lecionada a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, e a cadeia leve de scFv do primeiro ligante e do terceiro |li- gante, cada uma, compreende ou consiste em uma sequência de pep- tídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, particular- mente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo seleci- onado a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81, em que mais particularmente a cadeia leve de scFv do primeiro ligante e do terceiro ligante, cada um, compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81.[00135] In certain embodiments, the scFv heavy chain of the first linker and the third linker each comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.44 , SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54 and SEQ ID NO.80, wherein more particularly the scFv heavy chain of the first linker and the third linker each comprises or consists of a peptide sequence identical to one peptide sequence selected from SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO.23, SEQ ID NO.44, SEQ ID NO.53, SEQ ID NO.54 and SEQ ID NO.80, and the scFv light chain of the first linker and the third linker each comprise or consist of a peptide sequence with a sequence identity of 70% or greater, p particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 43, and SEQ ID No. 81, wherein more particularly the scFv light chain of the first linker and the third linker each comprises or consists of a peptide sequence identical to a selected peptide sequence a from SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.43 and SEQ ID NO.81.
[00136] Em certas modalidades, a cadeia pesada de scFv do primeiro ligante e do terceiro ligante, cada uma, compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 21, SEQ ID Nº 22, SEQ ID Nº 23, SEQ ID Nº 44, SEQ ID Nº 53, SEQ ID Nº 54 e SEQ ID Nº 80, e a cadeia leve de scFv do primeiro ligante e do terceiro |li- gante, cada uma, compreende ou consiste em uma sequência de pep- tídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,In certain embodiments, the scFv heavy chain of the first linker and the third linker each comprises or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID No.15, SEQ ID No.21, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 53, SEQ ID No. 54 and SEQ ID No. 80, and the scFv light chain of the first linker and the third linker each comprise or consists of a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% ou 100% com uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 24, SEQ ID Nº 25, SEQ ID Nº 26, SEQ ID Nº 43 e SEQ ID Nº 81.98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.14, SEQ ID NO.24, SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.43 and SEQ ID NO.81.
[00137] Ou seja, as cadeias leves e pesadas de scFv podem con- sistir completamente na sequência de peptídeo definida acima ou as cadeias leve e pesada de scFv podem compreender a sequência de peptídeo definida acima, em que as cadeias leve e pesada de scFv podem conter sequências de peptídeos adicionais.That is, the scFv light and heavy chains may consist entirely of the peptide sequence defined above or the scFv light and heavy chains may comprise the peptide sequence defined above, wherein the scFv light and heavy chains may contain additional peptide sequences.
[00138] Em certas modalidades, a cadeia leve de scFv do primeiro ligante compreende ou consiste no domínio de ligação ao antígeno VL do anticorpo 4D5 e a cadeia pesada de scFv do primeiro ligante com- preende ou consiste no domínio de ligação ao antígeno VH do anticor- po 4D5.In certain embodiments, the scFv light chain of the first linker comprises or consists of the VL antigen-binding domain of the 4D5 antibody and the scFv heavy chain of the first linker comprises or consists of the VH antigen-binding domain of the 4D5 antibody.
[00139] Em certas modalidades, a cadeia leve de scFv do terceiro ligante compreende ou consiste no domínio de ligação ao antígeno VL do anticorpo 4D5 e a cadeia pesada de scFv do terceiro ligante com- preende ou consiste no domínio de ligação ao antígeno VH do anticor- po 4D5.In certain embodiments, the scFv light chain of the third linker comprises or consists of the VL antigen-binding domain of the 4D5 antibody and the scFv heavy chain of the third linker comprises or consists of the VH antigen-binding domain of the 4D5 antibody.
[00140] No contexto do presente relatório descritivo, o termo 4D5 se refere ao anticorpo monoclonal humanizado trastuzumabe, também conhecido como Herceptin, e também referido aqui como "TZB" que é direcionado contra o domínio proximal da membrana IV de HER2 (Cho et al., 2003).[00140] In the context of this specification, the term 4D5 refers to the humanized monoclonal antibody trastuzumab, also known as Herceptin, and also referred to herein as "TZB" which is directed against the proximal domain of the membrane IV of HER2 (Cho et al ., 2003).
[00141] Em certas modalidades, a cadeia do ligante de scFv com- preende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequên- cia de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmen- te 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 16, em que mais particularmente a cadeia do ligante de scFv compreende uma sequência de peptídeo idêntica à SEQ ID Nº 16.In certain embodiments, the scFv linker chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID NO.16, wherein more particularly the scFv linker chain comprises a peptide sequence identical to SEQ ID NO.16.
[00142] Em certas modalidades, a cadeia do ligante de scFv com-[00142] In certain embodiments, the scFv linker chain with-
preende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequên- cia de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, TT%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 16.comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 16%, TT%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No.16.
[00143] Em certasmodalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, parti- cularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 50 e ID de SEQ. 76, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 50 e ID de SEQ. 76, e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, parti- cularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEQ. 77, em que mais particularmente a se- gunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEOQ. 77.In certain embodiments, the first polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO.41, SEQ ID NO.50 and SEQ ID NO. 76, wherein more particularly the first polypeptide chain comprises a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 50 and SEQ ID NO. 76, and the second polypeptide chain comprises a peptide sequence having a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a sequence of peptide selected from SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52 and SEQ ID 77, wherein more particularly the second polypeptide chain comprises a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52, and SEOQ ID. 77.
[00144] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma sequência de peptídeo seleciona- da a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 50 e ID de SEQ. 76, e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma sequência de peptídeo seleciona- da a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEQ. 77.In certain embodiments, the first polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79 %, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 50 and SEQ ID NO. 76, and the second polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80% , 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.40 , SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52 and SEQ ID NO. 77.
[00145] Em certas modalidades, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, parti- cularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 50 e ID de SEQ. 76, em que mais particularmente a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 50 e ID de SEQ. 76, e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, parti- cularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEQ. 77, em que mais particularmente a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEOQ. 77.In certain embodiments, the third polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO.41, SEQ ID NO.50 and SEQ ID NO. 76, wherein more particularly the third polypeptide chain comprises a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 50 and SEQ ID NO. 76, and the fourth polypeptide chain comprises a peptide sequence having a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a sequence of peptide selected from SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52 and SEQ ID 77, wherein more particularly the fourth polypeptide chain comprises a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52 and SEOQ ID. 77.
[00146] Em certas modalidades, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma sequência de peptídeo seleciona- da a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 50 e ID de SEQ. 76, e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma sequência de peptídeo seleciona- da a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEQ. 77.In certain embodiments, the third polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79 %, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 50 and SEQ ID NO. 76, and the fourth polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80% , 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.40 , SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 52 and SEQ ID NO. 77.
[00147] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia de poli- peptídeo, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmen- te 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 50 e ID de SEQ. 76, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia po- lipeptídica, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo idênti- ca a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQID Nº 50 e ID de SEQ. 76 e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com uma sequência de peptídeo selecionado a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEQ. 77, em que mais particularmente a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica, cada uma, compreende uma sequên- cia de peptídeo idêntica a uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEQ. 77.In certain embodiments, the first polypeptide chain and the third polypeptide chain each comprise a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID NO.32, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO.41 , SEQ ID No. 50 and SEQ ID. 76, wherein more particularly the first polypeptide chain and the third polypeptide chain each comprise a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 30, SEQ ID No. 31, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQID No. 50 and SEQ ID No. 76 and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each comprise a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95 % or more, with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.42, SEQ ID No. 51, SEQ ID No. 52 and SEQ ID. 77, wherein more particularly the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each comprise a peptide sequence identical to a peptide sequence selected from SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 27 , SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO.42, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52, and SEQ ID NO. 77.
[00148] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a terceira polipeptídeo, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo com uma identi- dade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 76%, TT%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 18, SEQ ID Nº 30, SEQ ID Nº 31, SEQ ID Nº 32, SEQ ID Nº 39, SEQ ID Nº 41, SEQ ID Nº 50 e ID de SEQ. 76, e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí-[00148] In certain embodiments, the first polypeptide chain and the third polypeptide each comprise a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 76%, TT%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.18, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.31, SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 50 and SEQ ID No. 76, and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain.
dica, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com uma sequência de peptídeo selecionada a partir de SEQ ID Nº 19, SEQ ID Nº 20, SEQ ID Nº 27, SEQ ID Nº 28, SEQ ID Nº 29, SEQ ID Nº 40, SEQ ID Nº 42, SEQ ID Nº 51, SEQ ID Nº 52 e ID de SEOQ. 77.tip each comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with a peptide sequence selected from SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.20, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.40, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO.51, SEQ ID NO.52 and SEOQ ID. 77.
[00149] Portanto, o domínio de ligação ao antígeno VL e VH da primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas pode ser substancialmente idêntico aos domínios de ligação ao antígeno VL e VH do fragmento scFv denominado A21 (Hu S. et a/., 2008, Proteins, 70, 938-949) que se liga especificamente ao domínio | de HER2.Therefore, the VL and VH antigen-binding domain of the first, second, third and fourth polypeptide chains may be substantially identical to the VL and VH antigen-binding domains of the scFv fragment termed A21 (Hu S. et a/. , 2008, Proteins, 70, 938-949) that specifically binds to the domain | of HER2.
[00150] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, parti- cularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 38 e SEQ ID Nº 78, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo idêntica à SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 388 e SEQ ID Nº 78, e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, parti- cularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nº 79, em que mais particularmente a segun- da cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo idên- tica à SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nº 79.In certain embodiments, the first polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID NO.36, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.38, and SEQ ID NO.78, wherein more particularly the first polypeptide chain comprises a peptide sequence identical to SEQ ID NO.36, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.388 and SEQ ID No. 78, and the second polypeptide chain comprises a peptide sequence having a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35 and SEQ ID NO.79, wherein more particularly the second polypeptide chain comprises a peptide sequence identical to SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID No. 35 and SEQ ID No. 79.
[00151] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 38 e SEQID Nº 78, e a segunda cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nº 79.In certain embodiments, the first polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79 %, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38 and SEQID No. 78, and the second polypeptide chain comprises a peptide sequence having a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% , 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 35 and SEQ ID No. 79.
[00152] Em certas modalidades, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, parti- cularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 38 e SEQ ID Nº 78, em que mais particularmente a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo idêntica à SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 388 e SEQ ID Nº 78, e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, parti- cularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nº 79, em que mais particularmente a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo idêntica à SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nº 79.In certain embodiments, the third polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID NO.36, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.38, and SEQ ID NO.78, wherein more particularly the third polypeptide chain comprises a peptide sequence identical to SEQ ID NO.36, SEQ ID NO.37, SEQ ID NO.388 and SEQ ID No. 78, and the fourth polypeptide chain comprises a peptide sequence having a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35 and SEQ ID NO.79, wherein more particularly the fourth polypeptide chain comprises a peptide sequence identical to SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35 and SEQ ID No. 79.
[00153] Em certasmodalidades, a terceira cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,In certain embodiments, the third polypeptide chain comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79% , 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 38 e SEQID Nº 78, e a quarta cadeia polipeptídica compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nº 79.85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38 and SEQID No. 78, and the fourth polypeptide chain comprises a peptide sequence having a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75% , T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35 and SEQ ID NO.79.
[00154] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 38 e SEQ ID Nº 78, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica, cada uma, compreende uma sequên- cia de peptídeo idêntica à SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 38 e SEQID Nº 78,e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nº 79, em que mais particularmente a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica, cada uma, compreende uma sequên- cia de peptídeo idêntica à SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nº 79.In certain embodiments, the first polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each comprise a peptide sequence with a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more , even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38 and SEQ ID No. 78, wherein more particularly the first polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each comprise a sequence - peptide sequence identical to SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38 and SEQID No. 78, and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each comprise a peptide sequence with an identity of sequence of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 35 and SEQ ID No. 79, in that more particularly the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each buy end a peptide sequence identical to SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.34, SEQ ID NO.35 and SEQ ID NO.79.
[00155] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia polipeptí-[00155] In certain embodiments, the first polypeptide chain and the third polypeptide chain.
dica, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 36, SEQ ID Nº 37, SEQ ID Nº 38 e SEQ ID Nº 78,e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, compreende uma sequência de peptídeo com uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 33, SEQ ID Nº 34, SEQ ID Nº 35 e SEQ ID Nºtip each comprises a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38 and SEQ ID No. 78, and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each comprise a peptide sequence with a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 35 and SEQ ID No.
79.79.
[00156] Portanto, as cadeias leve e pesada de imunoglobulina da primeira, segunda, terceira e quarta cadeias polipeptídicas podem compreender domínios IgG (VL, CL, VH, CH1, CH2 e/ou CH3) subs- tancialmente idênticos aos domínios correspondentes do anticorpo ErbB2 denominado 7C2 (US 7.371.376), que se liga especificamente ao domínio | de HER2.Therefore, the immunoglobulin light and heavy chains of the first, second, third and fourth polypeptide chains may comprise IgG domains (VL, CL, VH, CH1, CH2 and/or CH3) substantially identical to the corresponding domains of the antibody ErbB2 termed 7C2 (US 7,371,376), which specifically binds to the domain | of HER2.
[00157] Em certas modalidades particulares, o polipeptídeo tetra- mérico, de acordo com a invenção, é essencialmente um anticorpo do tipo imunoglobulina G (particularmente um anticorpo IgG monoclional humano ou humanizado) tendo duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, em que as cadeias pesada e leve variáveis específicas do antígeno juntas formam um ligante (o segundo e o quarto ligantes) especificamente reativo ao domínio D1 de Her2, e ca- da uma das cadeias leves, ou cada uma das cadeias pesadas, contém um polipeptídeo ligado no terminal N compreendendo uma cadeia po- lipeptídica de scFv constituída por uma região variável pesada e leve ligada por uma cadeia de ligante de scFv, e a cadeia polipeptídica scFv está ligada ao terminal N da cadeia pesada ou leve de imunoglo- bulina por meio de um ligante de aminoácido de interdomínio consis- tindo em 1 a 20 aminoácidos.In certain particular embodiments, the tetrameric polypeptide according to the invention is essentially an antibody of the immunoglobulin G type (particularly a human or humanized IgG monoclonal antibody) having two identical heavy chains and two identical light chains, in that the antigen-specific variable heavy and light chains together form a linker (the second and fourth linkers) specifically reactive to the D1 domain of Her2, and that each of the light chains, or each of the heavy chains, contains a linked polypeptide at the N-terminus comprising an scFv polypeptide chain made up of a heavy and light variable region linked by an scFv linker chain, and the scFv polypeptide chain is linked to the N-terminus of the heavy or light chain of immunoglobulin by means of an interdomain amino acid linker consisting of 1 to 20 amino acids.
[00158] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 1, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptí- dica é idêntica à SEQ ID Nº 1.In certain embodiments, the first polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 1, in which more particularly the first polypeptide chain is identical to SEQ ID No. 1.
a segunda cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 2, em que mais particularmente a segunda cadeia polipep- tídica é idêntica à SEQ ID Nº 2.the second polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 2, in which more particularly the second polypeptide chain is identical to SEQ ID No. 2.
[00159] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº le a segunda cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº[00159] In certain embodiments, the first polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 1 and the second polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77 %, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO.
2.two.
[00160] Em certas modalidades, a terceira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 1, em que mais particularmente a terceira cadeia polipeptí-[00160] In certain embodiments, the third polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 1, in which more particularly the third polypeptide chain.
dica é idêntica à SEQ ID Nº 1.tip is identical to SEQ ID No. 1.
a quarta cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 2, em que mais particularmente a quarta cadeia polipeptídi- ca é idêntica à SEQ ID Nº 2.the fourth polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 2, in which more particularly the fourth polypeptide chain is identical to SEQ ID No. 2.
[00161] Em certas modalidades, a terceira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº le a quarta cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID NºIn certain embodiments, the third polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 1 and the fourth polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77 %, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO.
2.two.
[00162] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ain- da mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 1, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia po- lipeptídica são idênticas à SEQID Nº 1 e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ain- da mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 2, em que mais particularmente a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia poli- peptídica são idênticas à SEQ ID Nº 2.In certain embodiments, the first polypeptide chain and the third polypeptide chain each have a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 1, wherein more particularly the first polypeptide chain and the third polypeptide chain are identical to SEQID No. 1 and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each have a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 2, more particularly the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are identical to SEQ ID No. 2.
[00163] Em certasmodalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQIDNº 1 e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 17%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 2.In certain embodiments, the first polypeptide chain and the third polypeptide chain each have a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, T6%, 77% , 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQID No. 1 and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each have a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 17%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 2.
[00164] O polipeptídeo tetramérico resultante é referido como "441" (para identidade). Neste construto, as cadeias leves de IgG (da primei- ra e terceira cadeia polipeptídica) compreendendo o domínio de liga- ção ao antígeno VL do anticorpo A21 são fundidas no terminal N a um fragmento de scFv compreendendo os domínios de ligação ao antíge- no VL e VH de 4D5 (trastuzumabe ou HERCEPTIN, conector de HER2 D4) e combinado com cadeias pesadas de IgG (a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas), compreendendo o domínio de ligação ao antí- geno VH do anticorpo A21. Os domínios de ligação ao antígeno VL e VH de A21 juntos constituem um conector de D1 de HER?2.[00164] The resulting tetrameric polypeptide is referred to as "441" (for identity). In this construct, IgG light chains (from the first and third polypeptide chains) comprising the VL antigen-binding domain of the A21 antibody are fused at the N-terminus to a scFv fragment comprising the antigen-binding domains 4D5 VL and VH (trastuzumab or HERCEPTIN, HER2 D4 connector) and combined with IgG heavy chains (the second and fourth polypeptide chains), comprising the VH antigen-binding domain of antibody A21. The VL and VH antigen-binding domains of A21 together constitute a D1 connector of HER?2.
[00165] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 3, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptí- dica é idêntica à SEQ ID Nº 3.In certain embodiments, the first polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 3, in which more particularly the first polypeptide chain is identical to SEQ ID No. 3.
a segunda cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, comthe second polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with
SEQ ID Nº 4, em que mais particularmente a segunda cadeia polipep- tídica é idêntica à SEQ ID Nº 4.SEQ ID No. 4, more particularly the second polypeptide chain being identical to SEQ ID No. 4.
[00166] Em certasmodalidades, a primeira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 3e a segunda cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº[00166] In certain embodiments, the first polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80% , 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 3 and the second polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77% , 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO.
4.4.
[00167] Em certas modalidades, a terceira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 3, em que mais particularmente a terceira cadeia polipeptí- dica é idêntica à SEQID Nº 3 e a quarta cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 4, em que mais particularmente a quarta cadeia polipeptídi- ca é idêntica à SEQ ID Nº 4.In certain embodiments, the third polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 3, in which more particularly the third polypeptide chain is identical to SEQID No. 3 and the fourth polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 4, wherein more particularly the fourth polypeptide chain is identical to SEQ ID No. 4.
[00168] Em certasmodalidades, a terceira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 3e a quarta cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº[00168] In certain modalities, the third polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80% , 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 3 and the fourth polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77% , 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO.
4.4.
[00169] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ain- da mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 3, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia po- lipeptídica são idênticas à SEQID Nº 3 e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ain- da mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 4, em que mais particularmente a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia poli- peptídica são idênticas à SEQ ID Nº 4.In certain embodiments, the first polypeptide chain and the third polypeptide chain each have a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 3, wherein more particularly the first polypeptide chain and the third polypeptide chain are identical to SEQID No. 3 and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each have a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 4, more particularly the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are identical to SEQ ID No. 4.
[00170] Em certas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica e a terceira cadeia polipep- tídica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 76%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 3 e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 4.[00170] In certain embodiments, the second polypeptide chain and the third polypeptide chain each have a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, T5%, 76%, 77 %, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 3 and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each have a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 75%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID #4.
[00171] O polipeptídeo tetramérico resultante é referido como[00171] The resulting tetrameric polypeptide is referred to as
"47C2" (para identidade). Neste construto, as cadeias leves de IgG (da primeira e terceira cadeia polipeptídica) compreendendo o domínio de ligação ao antígeno VL do anticorpo 7C2 são fundidas no terminal N a um fragmento de scFv compreendendo os domínios de ligação ao an- tígeno VL e VH de 4D5 (trastuzumabe ou HERCEPTIN, conector de HER2 D4) e combinado com cadeias pesadas de IgG (a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas) compreendendo o domínio de ligação ao antígeno VH do anticorpo 7C2. Os domínios de ligação ao antígeno VL e VH de 7C2 juntos constituem um conector de D1 de HER2)."47C2" (for identity). In this construct, IgG light chains (from the first and third polypeptide chains) comprising the VL antigen-binding domain of the 7C2 antibody are fused at the N-terminus to a scFv fragment comprising the VL and VH antigen-binding domains of 4D5 (trastuzumab or HERCEPTIN, HER2 D4 connector) and combined with IgG heavy chains (the second and fourth polypeptide chains) comprising the VH antigen binding domain of the 7C2 antibody. The VL and VH antigen-binding domains of 7C2 together constitute a D1 connector of HER2).
[00172] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 11, em que mais particularmente a primeira cadeia polipep- tídica é idêntica à SEQID Nº 11 e a segunda cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 12, em que mais particularmente a segunda cadeia polipep- tídica é idêntica à SEQ ID Nº 12.In certain embodiments, the first polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 11, in which more particularly the first polypeptide chain is identical to SEQID No. 11 and the second polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 12, wherein more particularly the second polypeptide chain is identical to SEQ ID No. 12.
[00173] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, T7T%, 718%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 11e a segunda cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, T7T%, 718%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID NºIn certain embodiments, the first polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, T7T%, 718%, 79%, 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 11 and the second polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, T7T %, 718%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO.
12.12.
[00174] Em certas modalidades, a terceira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 11, em que mais particularmente a terceira cadeia polipep- tídica é idêntica à SEQID Nº 11 e a quarta cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particu- larmente 90% ou mais, ainda mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 12, em que mais particularmente a quarta cadeia polipeptí- dica é idêntica à SEQ ID Nº 12.In certain embodiments, the third polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 11, in which more particularly the third polypeptide chain is identical to SEQID No. 11 and the fourth polypeptide chain has a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 12, wherein more particularly the fourth polypeptide chain is identical to SEQ ID No. 12.
[00175] Em certas modalidades, a terceira cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 11e a quarta cadeia polipeptídica tem uma identidade de se- quência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID NºIn certain embodiments, the third polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77%, 78%, 79%, 80 %, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 11 and the fourth polypeptide chain has a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, 16%, 77 %, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 291%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID NO.
12.12.
[00176] Em certas modalidades, a primeira cadeia polipeptídica e a terceira cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ain- da mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 11, em que mais particularmente a primeira cadeia polipeptídica e a terceira ca- deia polipeptídica são idênticas à SEQID Nº 11 e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70% ou mais, particularmente 80% ou mais, mais particularmente 90% ou mais, ain- da mais particularmente 95% ou mais, com SEQ ID Nº 12, em que mais particularmente a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica são idênticas à SEQ ID Nº 12.In certain embodiments, the first polypeptide chain and the third polypeptide chain each have a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 11, wherein more particularly the first polypeptide chain and the third polypeptide chain are identical to SEQID No. 11 and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each have a sequence identity of 70% or more, particularly 80% or more, more particularly 90% or more, even more particularly 95% or more, with SEQ ID No. 12, where more particularly the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain are identical to SEQ ID No. 12.
[00177] Em certas modalidades, a segunda cadeia polipeptídica e a terceira cadeia polipep- tídica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 713%, T4%, T5%, 16%, 77%, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 11 e a segunda cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptí- dica, cada uma, tem uma identidade de sequência de 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% com SEQ ID Nº 12.In certain embodiments, the second polypeptide chain and the third polypeptide chain each have a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 713%, T4%, T5%, 16%, 77 %, 18%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID No. 11 and the second polypeptide chain and the fourth polypeptide chain each have a sequence identity of 70%, 71%, 72%, 73%, T4%, 15%, T6%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87% , 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% with SEQ ID #12.
[00178] O polipeptídeo tetramérico resultante é referido como "241" (para identidade). Neste construto, as cadeias pesadas de IgG (da se- gunda e quarta cadeia polipeptídica) compreendendo o domínio de ligação ao antígeno VH do anticorpo A21 são fundidas no terminal N a um fragmento de scFv compreendendo os domínios de ligação ao an- tígeno VL e VH de 4D5 (trastuzumabe ou HERCEPTIN, conector de D4 de HER2) e combinado com cadeias leves de IgG (a primeira e a terceira cadeias polipeptídicas) compreendendo o domínio de ligação ao antígeno VL do anticorpo A21. Os domínios de ligação ao antígeno VL e VH de A21 juntos constituem um conector de D1 de HER?2.The resulting tetrameric polypeptide is referred to as "241" (for identity). In this construct, IgG heavy chains (from the second and fourth polypeptide chains) comprising the VH antigen-binding domain of the A21 antibody are fused at the N-terminus to a scFv fragment comprising the VL and antigen-binding domains 4D5 VH (trastuzumab or HERCEPTIN, HER2 D4 connector) and combined with IgG light chains (the first and third polypeptide chains) comprising the VL antigen binding domain of antibody A21. The VL and VH antigen-binding domains of A21 together constitute a D1 connector of HER?2.
[00179] Em certas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno VH é selecionado a partir do domínio de ligação ao antígeno VH de A21 (particularmente SEQ ID Nº 40, 42, 51, 52 ou 77) e o domínio de ligação ao antígeno VH de 7C2 (particularmente SEQ ID Nº 79 ) e em que o domínio de ligação ao antígeno VL é selecionado a partir do domínio de ligação ao antígeno VL de A21 (particularmente SEQ ID Nº 39, 41, 50 ou 76) e o domínio de ligação ao antígeno VL de 7C2 (parti- cularmente SEQ ID Nº 78).[00179] In certain embodiments, the VH antigen binding domain is selected from the VH antigen binding domain of A21 (particularly SEQ ID NOs. 40, 42, 51, 52 or 77) and the VH antigen binding domain of 7C2 (particularly SEQ ID No. 79) and wherein the VL antigen binding domain is selected from the VL antigen binding domain of A21 (particularly SEQ ID No. 39, 41, 50 or 76) and the binding domain to the 7C2 VL antigen (particularly SEQ ID No. 78).
[00180] Em certas modalidades, a primeira e a terceira cadeias po- lipeptídicas são idênticas à SEQ ID Nº 1 ou uma sequência de peptí- deo funcional equivalente com uma identidade de sequência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% ou 99%, e a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas são idênticas à SEQ ID Nº 2 ou uma sequência de peptídeo funcional equivalente com uma iden- tidade de sequência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (construto 441 no caso de identidade de se- quência).[00180] In certain embodiments, the first and third polypeptide chains are identical to SEQ ID No. 1 or an equivalent functional peptide sequence with a sequence identity of at least 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, and the second and fourth polypeptide chains are identical to SEQ ID No. 2 or an equivalent functional peptide sequence with a sequence identity of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% (construct 441 in the case of sequence identity).
[00181] Em certas modalidades, a primeira e a terceira cadeias po- lipeptídicas são idênticas à SEQ ID Nº 3 ou uma sequência de peptí- deo funcional equivalente com uma identidade de sequência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% ou 99%, e a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas são idênticas à SEQ ID Nº 4 ou uma sequência de peptídeo funcional equivalente com uma iden- tidade de sequência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (construto 47C2 no caso de identidade de se- quência).[00181] In certain embodiments, the first and third polypeptide chains are identical to SEQ ID No. 3 or an equivalent functional peptide sequence with a sequence identity of at least 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, and the second and fourth polypeptide chains are identical to SEQ ID No. 4 or an equivalent functional peptide sequence with a sequence identity of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% (construct 47C2 in the case of sequence identity).
[00182] Em certas modalidades, a primeira e a terceira cadeias po- lipeptídicas são idênticas à SEQ ID Nº 11 ou uma sequência de peptí- deo funcional equivalente com uma identidade de sequência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98% ou 99%, e a segunda e a quarta cadeias polipeptídicas são idênticas à SEQ ID Nº 12 ou uma sequência de peptídeo funcional equivalente com uma identidade de sequência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,[00182] In certain embodiments, the first and third polypeptide chains are identical to SEQ ID No. 11 or an equivalent functional peptide sequence with a sequence identity of at least 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%, and the second and fourth polypeptide chains are identical to SEQ ID No. 12 or an equivalent functional peptide sequence with a sequence identity of at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% ou 99% (construto 241 no caso de identidade de sequência).95%, 96%, 97%, 98% or 99% (construct 241 in the case of sequence identity).
[00183] O ligante de aminoácido de interdomínio não é restrito na composição de aminoácidos, mas os aminoácidos que contribuem pa- ra a flexibilidade do ligante são escolhidos em modalidades particula- res aqui contempladas. Os inventores mostraram que os ligantes fun- cionam que consistem em resíduos G, S e/ou T, por exemplo, repeti- ções de (GGmS) e (GGmT) com m selecionado de 1 a 3, e todo o com- primento do ligante não excedendo 20, 25 ou até 30. Demonstrou-se que ligantes de interdomínios com apenas um ou dois aminoácidos funcionam. O primeiro e o terceiro polipeptídeo podem compreender o mesmo ligante de aminoácido de interdomínio ou diferentes ligantes de aminoácido de interdomínio.The interdomain amino acid linker is not restricted in amino acid composition, but amino acids that contribute to the flexibility of the linker are chosen in the particular embodiments contemplated herein. The inventors showed that the linkers work consisting of residues G, S and/or T, for example, repeats of (GGmS) and (GGmT) with m selected from 1 to 3, and the entire length of the linker not exceeding 20, 25 or even 30. Interdomain linkers with only one or two amino acids have been shown to work. The first and third polypeptides can comprise the same interdomain amino acid linker or different interdomain amino acid linkers.
[00184] Em certas modalidades, o ligante de aminoácido de inter- domínio consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos.In certain embodiments, the interdomain amino acid linker consists of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 amino acids.
[00185] — No que diz respeito ao comprimento e à composição de se- quência do ligante de aminoácidos de interdomínios, os resultados dos inventores indicam que qualquer ligante com um comprimento equiva- lente de um máximo de 25 aminoácidos que não se espera que, por causa da previsão da estrutura, interfira com a solubilidade da proteína resultante, espera-se que funcione.[00185] — With regard to the length and sequence composition of the interdomain amino acid linker, the inventors' results indicate that any linker with an equivalent length of a maximum of 25 amino acids would not be expected to, because the structure prediction interferes with the solubility of the resulting protein, it is expected to work.
[00186] O polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das modali- dades anteriores, em que o ligante de aminoácido de interdomínio compreende ou consiste nos aminoácidos G, A, J, S, TT, P, C, V, MeFE, particularmente em que o ligante de aminoácido interdomínio compre- ende ou consiste nos aminoácidos G, S, Ae T.[00186] The polypeptide, according to any of the above embodiments, wherein the interdomain amino acid linker comprises or consists of the amino acids G, A, J, S, TT, P, C, V, MeFE, particularly in that the interdomain amino acid linker comprises or consists of amino acids G, S, A, and T.
[00187] Em modalidades particulares, o ligante de aminoácido de interdomínio é (GG))) com n sendo um número inteiro e n 2 4 (particu- larmente n é 4, 5, 6, 7 ou 8), e com selecionado de S e T.[00187] In particular embodiments, the interdomain amino acid linker is (GG))) with n being an integer and n 2 4 (particularly n is 4, 5, 6, 7 or 8), and with selected from S and T.
[00188] Em modalidades particulares, o ligante de aminoácido de interdomínio é (GGS), com n sendo um número inteiro e n 2 4 (particu- larmente n é 4, 5, 6,7 ou 8).[00188] In particular embodiments, the interdomain amino acid linker is (GGS), with n being an integer and n being 2 4 (particularly n being 4, 5, 6,7 or 8).
[00189] Em modalidades particulares, o ligante de aminoácido de interdomínio é (GGT), com n sendo um número inteiro e n 2 4 (particu- larmente n é 4, 5, 6,7 ou 8).[00189] In particular embodiments, the interdomain amino acid linker is (GGT), with n being an integer and n being 2 4 (particularly n being 4, 5, 6,7 or 8).
[00190] Em modalidades particulares, o ligante de aminoácido de interdomínio é (GXG), com n sendo um número inteiro e n 2 4 (particu- larmente n é 4, 5, 6, 7 ou 8), e com Z selecionado de S e T.[00190] In particular embodiments, the interdomain amino acid linker is (GXG), with n being an integer and n 2 4 (particularly n is 4, 5, 6, 7 or 8), and with Z selected from S and T.
[00191] Em modalidades particulares, o ligante de aminoácido de interdomínio é (TTZ), com n sendo um número inteiro e n 2 4 (particu- larmente n é 4, 5, 6, 7 ou 8), e com cada Iº independentemente de qualquer outro Iº sendo selecionado a partir de A, Ge V, e Z sendo selecionados a partir de Se T.[00191] In particular embodiments, the interdomain amino acid linker is (TTZ), with n being an integer and n 2 4 (particularly n being 4, 5, 6, 7, or 8), and with each Iº independently of any other Iº being selected from A, Ge V, and Z being selected from Se T.
[00192] “Considerações importantes no momento da escolha da se- quência de ligante foram a solubilidade e a flexibilidade. O versado na técnica será prontamente capaz de variar esta sequência em composi- ção e comprimento, com base no ensinamento aqui contido e no co- nhecimento disponível sobre o projeto de ligante, conforme exemplifi- cado por Chen et al., 2013, Advanced Drug Delivery Reviews, 65, 1357-1369 e Evers et a/l., 2006, Biochemistry, 45, 13183-13192.[00192] “Important considerations when choosing the binder sequence were solubility and flexibility. One skilled in the art will readily be able to vary this sequence in composition and length, based on the teaching contained herein and available knowledge about binder design, as exemplified by Chen et al., 2013, Advanced Drug Delivery Reviews, 65, 1357-1369 and Evers et al., 2006, Biochemistry, 45, 13183-13192.
[00193] Em certas modalidades, o ligante de aminoácido de interdo- mínio é caracterizado por uma sequência de aminoácidos (GGGGS),, com n sendo 1,2,3,4ou5.[00193] In certain embodiments, the interdomain amino acid linker is characterized by an amino acid sequence (GGGGS), with n being 1,2,3,4or5.
[00194] Em certas modalidades, o ligante de aminoácido de inter- domínio compreende ou é uma sequência tem características de uma das SEQ ID Nº 17, SEQ ID Nº 55 a SEQ ID Nº 69 e SEQ ID Nº 82 a ID de SEQ. 91.In certain embodiments, the inter-domain amino acid linker comprises or is a sequence having features of one of SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.55 to SEQ ID NO.69, and SEQ ID NO.82 to SEQ ID NO. 91.
[00195] Em certas modalidades, o ligante de aminoácido de inter- domínio compreende ou consiste em uma sequência de peptídeos se-[00195] In certain embodiments, the inter-domain amino acid linker comprises or consists of a sequence of se-
lecionada a partir de uma das SEQ ID Nº 17, SEQ ID Nº 55 a SEQ ID Nº 69 e SEQ ID Nº 82 a SEQ ID Nº 91 ou uma sequência de peptídeos funcional equivalente com uma identidade de sequência de pelo me- nos 70%.selected from one of SEQ ID NO.17, SEQ ID NO.55 to SEQ ID NO.69, and SEQ ID NO.82 to SEQ ID NO.91 or an equivalent functional peptide sequence with a sequence identity of at least 70%.
[00196] Um segundo aspecto da invenção se refere ao polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto para uso em um método para a pre- venção ou tratamento de uma doença neoplásica maligna associada à expressão de HER2 (um câncer positivo para HER2).A second aspect of the invention relates to the polypeptide according to the first aspect for use in a method for the prevention or treatment of a malignant neoplastic disease associated with the expression of HER2 (a cancer positive for HER2).
[00197] Da mesma forma, é fornecida uma forma de dosagem para a prevenção ou tratamento de uma doença neoplásica maligna asso- ciada à expressão de HER2, compreendendo um polipeptídeo tetra- mérico da invenção.[00197] Likewise, a dosage form for the prevention or treatment of a malignant neoplastic disease associated with the expression of HER2 comprising a tetrameric polypeptide of the invention is provided.
[00198] O versado está ciente de que qualquer fármaco especifica- mente mencionado pode estar presente como um sal farmaceutica- mente aceitável do dito fármaco. Os sais farmaceuticamente aceitáveis compreendem o fármaco ionizado e um contra-íon com carga oposta. Exemplos não limitativos de formas de sal aniônicas farmaceuticamen- te aceitáveis incluem acetato, benzoato, besilato, bitatrato, brometo, carbonato, cloreto, citrato, edetato, edisilato, embonato, estolato, fuma- rato, gluceptato, gluconato, bromidrato, cloridrato, iodeto, lactato, lac- tobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, brometo de metila, sulfato de metila, mucato, napsilato, nitrato, pamoato, fosfato, difosfa- to, salicilato, dissalicilato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tosila- to, trietiodeto e valerato. Exemplos não limitativos de formas de sal ca- tiônico farmaceuticamente aceitáveis incluem alumínio, benzatina, cál- cio, etilenodiamina, lisina, magnésio, meglumina, potássio, procaína, sódio, trometamina e zinco.[00198] The skilled person is aware that any drug specifically mentioned may be present as a pharmaceutically acceptable salt of said drug. Pharmaceutically acceptable salts comprise the ionized drug and an oppositely charged counterion. Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable anionic salt forms include acetate, benzoate, besylate, bitatrate, bromide, carbonate, chloride, citrate, edetate, edisylate, embonate, estolate, fumarate, gluceptate, gluconate, hydrobromide, hydrochloride, iodide , lactate, lactobionate, malate, maleate, mandelate, mesylate, methyl bromide, methyl sulfate, mucote, napsylate, nitrate, pamoate, phosphate, diphosphate, salicylate, disalicylate, stearate, succinate, sulfate, tartrate, tosylate - to, triethodide and valerate. Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable cationic salt forms include aluminum, benzathine, calcium, ethylenediamine, lysine, magnesium, meglumine, potassium, procaine, sodium, tromethamine and zinc.
[00199] As formas de dosagem podem ser para administração enté- rica, tal como administração nasal, bucal, retal, transdérmica ou oral, ou como uma forma de inalação ou supositório. Alternativamente, a administração parentérica pode ser usada, tal como formas de injeção subcutânea, intravenosa, intra-hepática ou intramuscular. Opcional- mente, um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável pode estar presente.The dosage forms may be for enteral administration, such as nasal, buccal, rectal, transdermal or oral administration, or as an inhalation or suppository form. Alternatively, parenteral administration can be used, such as subcutaneous, intravenous, intrahepatic or intramuscular injection forms. Optionally, a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient can be present.
[00200] A administração tópica também está dentro do escopo dos usos vantajosos da invenção. O versado na técnica está ciente de uma ampla gama de receitas possíveis para fornecer formulações tópicas, conforme exemplificado pelo conteúdo de Benson e Watkinson (Eds.), Topical and Transdermal Drug Delivery: Principles and Practice (1st Edition, Wiley 2011, ISBN-13: 978-0470450291); e Guy and Handcraft: Transdermal Drug Delivery Systems: Revised and Expanded (2º Ed., CRC Press 2002, ISBN-13: 978-0824708610); Osborne and Amann (Eds.): Topical Drug Delivery Formulations (1º Ed. CRC Press 1989; ISBN-13: 978-0824781835).[00200] Topical administration is also within the scope of the advantageous uses of the invention. The person skilled in the art is aware of a wide range of possible recipes for delivering topical formulations, as exemplified by the contents of Benson and Watkinson (Eds.), Topical and Transdermal Drug Delivery: Principles and Practice (1st Edition, Wiley 2011, ISBN-13) : 978-0470450291); and Guy and Handcraft: Transdermal Drug Delivery Systems: Revised and Expanded (2nd Ed., CRC Press 2002, ISBN-13: 978-0824708610); Osborne and Amann (Eds.): Topical Drug Delivery Formulations (1st Ed. CRC Press 1989; ISBN-13: 978-0824781835).
[00201] Um terceiro aspecto da invenção se refere a um ácido nu- cleico isolado que codifica pelo menos um dentre a primeira cadeia polipeptídica, a segunda cadeia polipeptídica, a terceira cadeia poli- peptídica e a quarta cadeia polipeptídica do polipeptídeo tetramérico, de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Em particular, o ácido nucleico isolado pode estar compreendido em um plasmídeo para ex- pressão em uma célula hospedeira bacteriana ou eucariótica. As se- quências de ácido nucleico que codificam o primeiro, o segundo, o ter- ceiro e o quarto polipeptídeo podem ser fornecidas no mesmo plasmí- deo ou em plasmídeos separados, isto é, e para coexpressão no mesmo hospedeiro.A third aspect of the invention relates to an isolated nucleic acid encoding at least one of the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain of the tetrameric polypeptide, according to with the first aspect of the invention. In particular, the isolated nucleic acid can be comprised on a plasmid for expression in a bacterial or eukaryotic host cell. Nucleic acid sequences encoding the first, second, third, and fourth polypeptide can be provided on the same plasmid or on separate plasmids, i.e., and for co-expression in the same host.
[00202] Um quarto aspecto da invenção se refere a uma célula hospedeira que está adaptada para produzir pelo menos um dentre a primeira cadeia polipeptídica, a segunda cadeia polipeptídica, a tercei- ra cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica do polipeptídeo tetramérico, de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Em parti-A fourth aspect of the invention relates to a host cell that is adapted to produce at least one of the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain of the tetrameric polypeptide, according to with the first aspect of the invention. In part
cular, a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula euca- riótica. Mais particularmente, a célula hospedeira é uma célula de ová- rio de hamster chinês (CHO).cellular, the host cell is a bacterial cell or a eukaryotic cell. More particularly, the host cell is a Chinese hamster ovary (CHO) cell.
[00203] Em certas modalidades, a célula hospedeira compreende o ácido nucleico isolado de acordo com o terceiro aspecto da invenção, de modo que a célula hospedeira seja capaz de produzir pelo menos um dentre a primeira cadeia polipeptídica, a segunda cadeia polipeptí- dica, a terceira cadeia polipeptídica e a quarta cadeia polipeptídica do polipeptídeo, de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Em parti- cular, o primeiro, segundo, terceiro e quarto polipeptídeo podem ser coproduzidos na mesma célula ou produzidos separadamente e com- binados in vitro.In certain embodiments, the host cell comprises isolated nucleic acid according to the third aspect of the invention, such that the host cell is capable of producing at least one of the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain of the polypeptide, according to the first aspect of the invention. In particular, the first, second, third and fourth polypeptides can be co-produced in the same cell or produced separately and combined in vitro.
[00204] “Um quinto aspecto da invenção se refere a um método para a obtenção do polipeptídeo de acordo com o primeiro aspecto da in- venção, em que o método compreende a cultura da célula hospedeira de acordo com o quarto aspecto da invenção, de modo que pelo me- nos uma da primeira cadeia polipeptídica, da segunda cadeia polipep- tídica, da terceira cadeia polipeptídica e da quarta cadeia polipeptídica do polipeptídeo, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, seja produzida. Composição farmacêutica e administração[00204] "A fifth aspect of the invention relates to a method for obtaining the polypeptide according to the first aspect of the invention, wherein the method comprises culturing the host cell according to the fourth aspect of the invention, of so that at least one of the first polypeptide chain, the second polypeptide chain, the third polypeptide chain and the fourth polypeptide chain of the polypeptide, according to the first aspect of the invention, is produced. Pharmaceutical composition and administration
[00205] “Outro aspecto da invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo tetramérico da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um ve- ículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades adicionais, a composição compreende pelo menos dois veículos farmaceuticamente aceitáveis, como os aqui descritos.[00205] "Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a tetrameric polypeptide of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a pharmaceutically acceptable carrier. In additional embodiments, the composition comprises at least two pharmaceutically acceptable carriers as described herein.
[00206] Em certas modalidades da invenção, o polipeptídeo tetra- mérico da presente invenção é tipicamente formulado em formas de dosagem farmacêutica para fornecer uma dosagem facilmente contro-In certain embodiments of the invention, the tetrameric polypeptide of the present invention is typically formulated into pharmaceutical dosage forms to provide an easily controlled dosage.
lável do fármaco e para dar ao paciente um produto elegante e de ma- nuseio fácil.drug and to give the patient an elegant and easy-to-handle product.
[00207] Em modalidades da invenção relacionadas a usos tópicos do polipeptídeo tetramérico da invenção, a composição farmacêutica é formulada de uma forma que seja adequada para administração tópi- ca, como soluções aquosas, suspensões, pomadas, cremes, géis ou formulações pulverizáveis, por exemplo, para entrega por aerossol ou semelhante, compreendendo o ingrediente ativo juntamente com um ou mais dos solubilizantes, estabilizantes, agentes de aumento da to- nicidade, tampões e conservantes que são conhecidos pelos versados na técnica.[00207] In embodiments of the invention related to topical uses of the tetrameric polypeptide of the invention, the pharmaceutical composition is formulated in a manner that is suitable for topical administration, such as aqueous solutions, suspensions, ointments, creams, gels or sprayable formulations, by for example, for aerosol delivery or the like, comprising the active ingredient together with one or more of the solubilizers, stabilizers, tonicity enhancing agents, buffers and preservatives that are known to those of skill in the art.
[00208] A composição farmacêutica pode ser formulada para admi- nistração oral, administração parentérica ou administração retal. Além disso, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser feitas na forma sólida (incluindo, sem limitação, cápsulas, comprimi- dos, pílulas, grânulos, pós ou supositórios), ou na forma líquida (inclu- indo, sem limitação, soluções, suspensões ou emulsões).The pharmaceutical composition can be formulated for oral administration, parenteral administration or rectal administration. Furthermore, the pharmaceutical compositions of the present invention can be made in solid form (including, without limitation, capsules, tablets, pills, granules, powders or suppositories), or in liquid form (including, without limitation, solutions, suspensions or emulsions).
[00209] O regime de dosagem para os compostos da presente in- venção varia dependendo de fatores conhecidos, como as característi- cas farmacodinâmicas do agente particular e seu modo e via de admi- nistração; a espécie, idade, sexo, saúde, condição médica e peso do receptor; a natureza e extensão dos sintomas; o tipo de tratamento concomitante; a frequência do tratamento; a via de administração, a função renal e hepática do paciente e o efeito desejado. Em certas modalidades, os compostos da invenção podem ser administrados em uma única dose diária, ou a dosagem diária total pode ser administra- da em doses divididas de duas, três ou quatro vezes ao dia.[00209] The dosage regimen for the compounds of the present invention varies depending on known factors such as the pharmacodynamic characteristics of the particular agent and its mode and route of administration; the species, age, sex, health, medical condition, and weight of the recipient; the nature and extent of symptoms; the type of concomitant treatment; the frequency of treatment; the route of administration, the renal and hepatic function of the patient and the desired effect. In certain embodiments, the compounds of the invention can be administered in a single daily dose, or the total daily dosage can be administered in divided doses of two, three or four times a day.
[00210] As composições farmacêuticas da presente invenção po- dem ser submetidas a operações farmacêuticas convencionais, como esterilização e/ou podem conter diluentes inertes convencionais, agen-[00210] The pharmaceutical compositions of the present invention may be subjected to conventional pharmaceutical operations, such as sterilization and/or may contain conventional inert diluents,
tes lubrificantes ou agentes tamponantes, bem como adjuvantes, como conservantes, estabilizantes, agentes umidificantes, emulsificantes e tampões etc. Elas podem ser produzidas por processos convencionais, por exemplo, por processos convencionais de mistura, granulação, dissolução ou liofilização. Muitos desses procedimentos e métodos para preparar composições farmacêuticas são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, L. Lachman et al. The Theory and Practice of Indus- trial Pharmacy, 4th Ed, 2013 (ISBN 8123922892).lubricating agents or buffering agents, as well as adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers and buffers etc. They can be produced by conventional processes, for example by conventional mixing, granulating, dissolving or lyophilizing processes. Many such procedures and methods for preparing pharmaceutical compositions are known in the art, see, for example, L. Lachman et al. The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 4th Ed, 2013 (ISBN 8123922892).
[00211] A invenção se refere adicionalmente aos seguintes itens, que também podem ser formulados como reivindicações:[00211] The invention further refers to the following items, which may also be formulated as claims:
[00212] ltem 1: Um polipeptídeo tetramérico compreendendo ou consistindo em[00212] item 1: A tetrameric polypeptide comprising or consisting of
[00213] - uma primeira cadeia polipeptídica compreendendo um primeiro ligante que se liga a um epítopo D4 de HER2, um ligante de aminoácido de interdomínio e um primeiro domínio de imunoglobulina,[00213] - a first polypeptide chain comprising a first linker that binds to a D4 epitope of HER2, an interdomain amino acid linker and a first immunoglobulin domain,
[00214] - uma segunda cadeia polipeptídica compreendendo um segundo domínio de imunoglobulina, em que o primeiro domínio de imunoglobulina e o segundo domínio de imunoglobulina, juntos, consti- tuem um segundo ligante, particularmente um domínio Fab, que se liga a um epítopo D1 de HER?2,[00214] - a second polypeptide chain comprising a second immunoglobulin domain, wherein the first immunoglobulin domain and the second immunoglobulin domain, together, constitute a second linker, particularly a Fab domain, which binds to a D1 epitope of HER?2,
[00215] - uma terceira cadeia polipeptídica compreendendo um ter- ceiro ligante que se liga a um epítopo D4 de HER2, um ligante de ami- noácido de interdomínio e um terceiro domínio de imunoglobulina, e[00215] - a third polypeptide chain comprising a third linker that binds to a D4 epitope of HER2, an interdomain amino acid linker and a third immunoglobulin domain, and
[00216] -uma quarta cadeia polipeptídica compreendendo um quar- to domínio de imunoglobulina, em que o terceiro domínio de imunoglo- bulina e o quarto domínio de imunoglobulina, juntos, constituem um quarto ligante, particularmente um domínio Fab, que se liga a um epí- topo D1 de HER?2.- a fourth polypeptide chain comprising a fourth immunoglobulin domain, wherein the third immunoglobulin domain and the fourth immunoglobulin domain together constitute a fourth linker, particularly a Fab domain, which binds to a D1 epitope of HER?2.
[00217] Item 2: O polipeptídeo de acordo com o item 1, em que o dito primeiro domínio de imunoglobulina é substancialmente o mesmo que o dito terceiro domínio de imunoglobulina e/ou em que o dito se- gundo domínio de imunoglobulina é substancialmente o mesmo que o dito quarto domínio de imunoglobulina.Item 2: The polypeptide according to item 1, wherein said first immunoglobulin domain is substantially the same as said third immunoglobulin domain and/or wherein said second immunoglobulin domain is substantially the same same as said fourth immunoglobulin domain.
[00218] ltem3:O polipeptídeo de acordo com o item 1 ou 2, em que o dito primeiro ligante é substancialmente igual ao dito terceiro ligante.[00218] ltem3: The polypeptide according to item 1 or 2, wherein said first linker is substantially the same as said third linker.
[00219] Item 4: O polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito primeiro ligante e/ou o dito terceiro |i- gante compreende ou consiste em uma cadeia polipeptídica de frag- mento variável de cadeia única compreendendo uma cadeia pesada de scFv, uma cadeia de ligante de scFv e uma cadeia leve de scFv.[00219] Item 4: The polypeptide according to any of the foregoing items, wherein said first linker and/or said third linker comprises or consists of a single chain variable fragment polypeptide chain comprising one scFv heavy chain, one scFv linker chain and one scFv light chain.
[00220] Item 5: O polipeptídeo de acordo com o item 4, em que a dita cadeia pesada de scFv é o domínio VH de 4D5 e em que a dita cadeia leve de scFv é o domínio VL de 4D5.Item 5: The polypeptide according to item 4, wherein said scFv heavy chain is the VH domain of 4D5 and wherein said scFv light chain is the VL domain of 4D5.
[00221] Item 6: O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5, em que[00221] Item 6: The polypeptide according to any one of items 1 to 5, wherein
[00222] -odito primeiro domínio de imunoglobulina é um domínio VL e o dito segundo domínio de imunoglobulina é um domínio VH e/ou em que o dito terceiro domínio de imunoglobulina é um domínio VLe o dito quarto domínio de imunoglobulina é um domínio VH; ou- said first immunoglobulin domain is a VL domain and said second immunoglobulin domain is a VH domain and/or wherein said third immunoglobulin domain is a VLe domain said fourth immunoglobulin domain is a VH domain; or
[00223] -odito primeiro domínio de imunoglobulina é um domínio VH e o dito segundo domínio de imunoglobulina é um domínio VL e/ou em que o dito terceiro domínio de imunoglobulina é um domínio VHe o dito quarto domínio de imunoglobulina é um domínio VL.[00223] - said first immunoglobulin domain is a VH domain and said second immunoglobulin domain is a VL domain and/or wherein said third immunoglobulin domain is a VHe domain said fourth immunoglobulin domain is a VL domain.
[00224] ltem 7: O polipeptídeo de acordo com o item 6, em que o dito domínio VH está ligado, no terminal C, a um domínio CH1.[00224] item 7: The polypeptide according to item 6, wherein said VH domain is linked, at the C-terminus, to a CH1 domain.
[00225] ltem 8: O polipeptídeo de acordo com o item 7, em que o dito domínio CH1 está ligado, no terminal C, a um domínio CH2 ou um domínio CH2 e um domínio CH3.[00225] Item 8: The polypeptide according to item 7, wherein said CH1 domain is linked, at the C-terminus, to a CH2 domain or a CH2 domain and a CH3 domain.
[00226] Item 9: O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 6 a 8, em que o dito domínio VL está ligado, no terminal C, a um domínio CL.[00226] Item 9: The polypeptide according to any one of items 6 to 8, wherein said VL domain is linked, at the C-terminus, to a CL domain.
[00227] Item 10: O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 6 a 9, em que o dito domínio VH é selecionado a partir do domí- nio VH de A21 e o domínio VH de 7C2, e em que o dito domínio VL é selecionado a partir do domínio VL de A21 e o domínio VL de 7C2.[00227] Item 10: The polypeptide according to any one of items 6 to 9, wherein said VH domain is selected from the VH domain of A21 and the VH domain of 7C2, and wherein said VL domain is selected from the VL domain of A21 and the VL domain of 7C2.
[00228] Item 11: O polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito ligante de aminoácido de interdomínio consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos.[00228] Item 11: The polypeptide according to any of the above items, wherein said interdomain amino acid linker consists of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acids.
[00229] Item 12: O polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito ligante de aminoácido de interdomínio compreende ou consiste nos aminoácidos G, A, J, S, TT, P, C, V, MeFE, particularmente em que o dito ligante de aminoácido interdomínio compreende ou consiste nos aminoácidos G, S, Ae T.[00229] Item 12: The polypeptide according to any of the preceding items, wherein said interdomain amino acid linker comprises or consists of amino acids G, A, J, S, TT, P, C, V, MeFE, particularly wherein said interdomain amino acid linker comprises or consists of amino acids G, S, A and T.
[00230] Item 13: O polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito ligante de aminoácido de interdomínio é caracterizado por uma sequência de aminoácidos (GGGGS)r, com n sendo 1,2,3,4 ou 5.[00230] Item 13: The polypeptide according to any of the preceding items, wherein said interdomain amino acid linker is characterized by an amino acid sequence (GGGGS)r, with n being 1,2,3,4 or 5.
[00231] Item 14: O polipeptídeo de HER2 biespecífico, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito ligante de amino- ácido de interdomínio compreende ou é uma sequência tem caracte- rísticas de uma de ID de SEQ. 17, ID de SEQ. 55 a ID de SEQ. 69 e ID de SEQ. 82 a ID de SEQ. 91.Item 14: The bispecific HER2 polypeptide according to any of the above items, wherein said interdomain amino acid linker comprises or is a sequence having characteristics of one of SEQ ID. 17, SEQ ID. 55 the SEQ ID. 69 and SEQ ID. 82 the SEQ ID. 91.
[00232] Item 15: O polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o dito ligante de aminoácido de interdomínio compreende ou consiste em uma sequência de peptídeo selecionada de uma das ID de SEQ. 17, ID de SEQ. 55 a ID de SEQ. 69 e ID de SEQ. 82 a ID de SEQ. 91 ou uma sequência de peptídeos funcional equivalente com uma identidade de sequência de pelo menos 70%.[00232] Item 15: The polypeptide according to any of the preceding items, wherein said interdomain amino acid linker comprises or consists of a peptide sequence selected from one of the SEQ ID. 17, SEQ ID. 55 the SEQ ID. 69 and SEQ ID. 82 the SEQ ID. 91 or an equivalent functional peptide sequence with a sequence identity of at least 70%.
[00233] Item 16: O polipeptídeo, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, para uso em um método para prevenção ou tratamen- to de uma doença neoplásica maligna associada à expressão de Her2.[00233] Item 16: The polypeptide, according to any of the above items, for use in a method for the prevention or treatment of a malignant neoplastic disease associated with the expression of Her2.
[00234] Onde quer que alternativas para características separáveis individuais, como, por exemplo, uma proteína de isotipo ou sequência de codificação, tipo de ligante ou indicação médica sejam apresenta- das aqui como "modalidades", deve ser entendido que tais alternativas podem ser combinadas livremente para formar modalidades discretas da invenção aqui descrita. Assim, qualquer uma das modalidades al- ternativas para um marcador detectável pode ser combinada com qualquer uma das modalidades alternativas de ligante, e essas combi- nações podem ser combinadas com qualquer indicação médica ou método de diagnóstico aqui mencionado.Wherever alternatives to individual separable characteristics, such as, for example, a protein isotype or coding sequence, type of linker or medical indication are presented here as "modalities", it should be understood that such alternatives may be freely combined to form discrete embodiments of the invention described herein. Thus, any of the alternative modalities for a detectable marker can be combined with any of the alternative ligand modalities, and these combinations can be combined with any medical indication or diagnostic method mentioned herein.
[00235] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos e figuras, a partir dos quais outras modalidades e vantagens podem ser extraídas. Estes exemplos pretendem ilustrar a invenção, mas não limitar o seu escopo. Descrição das Figuras[00235] The invention is further illustrated by the following examples and figures, from which other embodiments and advantages can be drawn. These examples are intended to illustrate the invention, but not to limit its scope. Description of Figures
[00236] AFig 1 mostra esquemas de agentes de ligação anti- HER?2 biparatópicos.[00236] Fig 1 shows schematics of biparatopic anti-HER?2 binding agents.
[00237] AfFig 2 mostra outros esquemas de agentes de ligação anti-HER2 biparatópicos[00237] AfFig 2 shows other schematics of biparatopic anti-HER2 binding agents
[00238] AFig.3 mostra um mapa de vetor de um plasmídeo para a coexpressão da cadeia leve e pesada do construto 441 em células CHO (vetor à base de Pymex10 com cassete de expressão dupla [CMV GO! poliA]).[00238] Fig.3 shows a vector map of a plasmid for co-expression of the light and heavy chain of construct 441 in CHO cells (Pymex10-based vector with double expression cassette [CMV GO! polyA]).
[00239] AFig.4 mostra um mapa de vetor de um plasmídeo para a coexpressão da cadeia leve e pesada do construto 47C2 em células CHO (vetor à base de Pymex10 com cassete de expressão dupla [CMV GO! poliA]).[00239] Fig.4 shows a vector map of a plasmid for co-expression of the light and heavy chain of the 47C2 construct in CHO cells (Pymex10-based vector with dual expression cassette [CMV GO! polyA]).
[00240] AFig.5 mostra um mapa de vetor de um plasmídeo para a expressão de construto 841 em células CHO.[00240] Fig.5 shows a vector map of a plasmid for the expression of construct 841 in CHO cells.
[00241] A Fig. 6 mostra um perfil de eluição de construto 441 da cromatografia de afinidade de Proteína A.[00241] Fig. 6 shows an elution profile of construct 441 from Protein A affinity chromatography.
[00242] AFig 7 mostra um perfil de eluição de construto 441 da cromatografia de troca catiônica.[00242] Fig 7 shows an elution profile of construct 441 from cation exchange chromatography.
[00243] AFig 8 mostra um perfil de eluição de construto 441 da cromatografia de exclusão por tamanho.[00243] Fig 8 shows an elution profile of construct 441 from size exclusion chromatography.
[00244] AFig.9 mostra um gel SDS-PAGE corado com Coumassie de frações da purificação do construto 441.[00244] Fig.9 shows a Coumassie-stained SDS-PAGE gel of fractions from the purification of construct 441.
[00245] AFig.10 mostra o teste de viabilidade de CHOs durante a expressão do construto 441 (scFV-IgG). Otimização da expressão do construto 441 em células CHO para o tempo indicado. As células fo- ram cultivadas em meio CHOgro de Mlrus (MIR 6260) e adicionalmen- te alimentadas com cisteína livre (forma reduzida) (2), glutationa (3), soro fetal de bezerro (4) ou todos os aditivos, respectivamente (5). As células CHO foram analisadas no contador de células CASY (Sistema Schãrfe).[00245] Fig.10 shows the CHO viability test during the expression of the 441 construct (scFV-IgG). Optimization of construct 441 expression in CHO cells for the indicated time. Cells were cultivated in Mlrus' CHOgro medium (MIR 6260) and additionally fed with free cysteine (reduced form) (2), glutathione (3), fetal calf serum (4) or all additives, respectively ( 5). CHO cells were analyzed in the CASY cell counter (Schärfe System).
[00246] AFig 11 mostra um Western blot da expressão do cons- truto 441, secretada ao meio de células CHO após os tempos indica- dos. As células foram cultivadas em meio CHOgro de Mlirus (MIR 6260) (1) e adicionalmente alimentadas com cisteína livre (forma redu- zida) (2), glutationa (3), soro fetal de bezerro (4) ou todos os aditivos juntos (5), respectivamente. A proteína foi precipitada do meio por pre- cipitação com acetona e ressolubilizada em tampão SDS PAGE. As proteínas foram resolvidas em gel de gradiente de 4-12% e o Western blot foi analisado em um sistema Odyssey (LI-COR). O construto 441 de comprimento total intacto purificado é mostrado como controle (A) e corre acima do marcador de 170 kDa. Marcador de peso molecular Page ruler da Thermo Scientific é mostrado em vermelho.[00246] Fig 11 shows a Western blot of the expression of construct 441, secreted into the medium of CHO cells after the indicated times. Cells were grown in Mlirus' CHOgro medium (MIR 6260) (1) and additionally fed with free cysteine (reduced form) (2), glutathione (3), fetal calf serum (4) or all additives together ( 5), respectively. Protein was precipitated from the medium by precipitation with acetone and resolubilized in SDS PAGE buffer. Proteins were resolved on a 4-12% gradient gel and the Western blot was analyzed on an Odyssey system (LI-COR). The purified intact full-length construct 441 is shown as a control (A) and runs above the 170 kDa marker. Thermo Scientific Page ruler molecular weight marker is shown in red.
[00247] AFig. 12 mostra os ensaios de proliferação celular (XTT)[00247] Fig. 12 shows cell proliferation assays (XTT)
com células BT474 após 4 dias de tratamento. Trastuzumabe (TZB), DARPin biparatópico (6L1G) e diferentes variantes de fusão do cons- truto biparatópico. LF IgG HL (progenitor murino do construto 441), HF IgG HL (progenitor murino do construto 241) mostram atividade anti- proliferativa semelhante em comparação com o DARPin 6L1G bipara- tópico, que é superior ao trastuzumabe (TZB). HF IgG LH (variante murina, sem seg.) E LF IgG LH (variante murina, sem seq.) mostram atividade antiproliferativa reduzida em comparação com DARPin bipa- ratópico e concentrações mais elevadas de ICso.with BT474 cells after 4 days of treatment. Trastuzumab (TZB), biparatopic DARPin (6L1G) and different fusion variants of the biparatopic construct. LF IgG HL (murine parent of construct 441), HF IgG HL (murine parent of construct 241) show similar antiproliferative activity compared to biparatopic DARPin 6L1G, which is superior to trastuzumab (TZB). HF IgG LH (murine variant, no seq.) and LF IgG LH (murine variant, no seq.) show reduced antiproliferative activity compared to biparatopic DARPin and higher ICso concentrations.
[00248] AFig.13 mostra os ensaios de proliferação celular (XTT) com células BT474 após 4 dias de tratamento para testar o efeito do comprimento do ligante. DARPin biparatópico (6L1G) e diferentes vari- antes de ligante de fusão do construto biparatópico (construto progeni- tor murino de 441) são comparados. O ligante 2-AA (GS) mostra a maior atividade antiproliferativa. Os ligantes 4-, 7- e 12-AA mostram atividade semelhante. A variante do ligante 22-AA mostra atividade reduzida.[00248] Fig.13 shows cell proliferation assays (XTT) with BT474 cells after 4 days of treatment to test the effect of ligand length. Biparatopic DARPin (6L1G) and different fusion ligand variants of the biparatopic construct (murine parent construct of 441) are compared. The 2-AA ligand (GS) shows the greatest antiproliferative activity. Ligands 4-, 7- and 12-AA show similar activity. The 22-AA ligand variant shows reduced activity.
[00249] AFig. 14 mostra os ensaios de proliferação celular (XTT) com células BT474 após 4 dias de tratamento. DARPin biparatópico (6G; 6L1G), construto biparatópico 441 (441), construto biparatópico 411 (VH1 kappa1l humanizado) e construto biparatópico 443 (VH3 kappa4 humanizado). Todos mostram níveis semelhantes de platô de atividade antiproliferativa, exceto 443, que mostra atividade reduzida.[00249] Fig. 14 shows cell proliferation assays (XTT) with BT474 cells after 4 days of treatment. Biparatopic DARPin (6G; 6L1G), biparatopic construct 441 (441), biparatopic construct 411 (humanized VH1 kappa1l) and biparatopic construct 443 (humanized VH3 kappa4). All show similar plateau levels of antiproliferative activity, except 443, which shows reduced activity.
[00250] AFig.15 mostra os ensaios de proliferação celular (XTT) com células BT474 após 4 dias de tratamento com diferentes versões humanizadas de IgG A21, quando fundido ao TZB scFv. A estratégia de humanização está descrita acima. Variantes diferentes usam VH3 kappa1 humanizado ou um enxerto de núcleo de VH kappa1 humani- zado.[00250] Fig.15 shows cell proliferation assays (XTT) with BT474 cells after 4 days of treatment with different humanized versions of IgG A21, when fused to TZB scFv. The humanization strategy is described above. Different variants use humanized kappa1 VH3 or a humanized kappa1 VH core graft.
[00251] AFig.16 mostra o ensaio de proliferação de células XTT com células BT474 após 4 dias de tratamento. IgG tetravalente (HF IgG HL e LF IgG HL murino) versus fusões de Fab bivalente (HF Fab HL e LF Fab HL murino). Todos os construtos mostram valores de pla- tô e IC50 semelhantes.[00251] Fig.16 shows the XTT cell proliferation assay with BT474 cells after 4 days of treatment. Tetravalent IgG (murine HF IgG HL and murine LF IgG HL) versus bivalent Fab fusions (murine HF Fab HL and murine LF Fab HL). All constructs show similar plateau and IC50 values.
[00252] AFig. 17 mostra o ensaio de proliferação de células XTT com células SKBR3 após 4 dias de tratamento. DARPin biparatópico (6G) construto biparatópico (441 tf), trastuzumabe (TZB).[00252] Fig. 17 shows the XTT cell proliferation assay with SKBR3 cells after 4 days of treatment. Biparatopic DARPin (6G) biparatopic construct (441 tf), trastuzumab (TZB).
[00253] AFig.18 mostra os ensaios de proliferação celular (XTT) com células CALU-3 após 4 dias de tratamento. DARPin biparatópico (6G), construto biparatópico (construto 441 (441tf), trastuzumabe (TZB).[00253] Fig.18 shows cell proliferation assays (XTT) with CALU-3 cells after 4 days of treatment. Biparatopic DARPin (6G), biparatopic construct (construct 441 (441tf), trastuzumab (TZB).
[00254] AFig.19 mostra os ensaios de proliferação celular (XTT) com células BT474 após 4 dias de tratamento testando o efeito da uni- dade de ligação do domínio 1. O construto biparatópico com A21 (construto 441tf) ou as fusões 7C2 mostram diferentes IC50 e nível de platô.Fig.19 shows cell proliferation assays (XTT) with BT474 cells after 4 days of treatment testing the effect of domain 1 binding unit. Biparatopic construct with A21 (construct 441tf) or 7C2 fusions show different IC50 and plateau level.
[00255] AFig.20 mostra os ensaios de proliferação celular (XTT) com células BT474 após 4 dias de tratamento testando o efeito da uni- dade de ligação do domínio 1. Construto biparatópico com A21 (cons- truto 441) ou com 398 (39s HF IgG HL)[00255] Fig.20 shows cell proliferation assays (XTT) with BT474 cells after 4 days of treatment testing the effect of domain 1 binding unit. Biparatopic construct with A21 (construct 441) or with 398 ( 39s HF IgG HL)
[00256] AFig.21 mostra os ensaios de proliferação de células XTT com células HCC1419 após 4 dias de tratamento. DARPin biparatópi- co (6G; 6L1G), construto biparatópico 441 (441tf) e LF-oaFabFc biva- lente (A21-TZB-40a). 441 e 6G mostram inibição semelhante da proli- feração celular após 4 dias. LF-oaFabFc mostra inibição ligeiramente reduzida da proliferação celular em comparação com 441.[00256] Fig.21 shows XTT cell proliferation assays with HCC1419 cells after 4 days of treatment. Biparatopic DARPin (6G; 6L1G), biparatopic construct 441 (441tf) and bivalent LF-oaFabFc (A21-TZB-40a). 441 and 6G show similar inhibition of cell proliferation after 4 days. LF-oaFabFc shows slightly reduced inhibition of cell proliferation compared to 441.
[00257] AFig. 22 mostra o ensaio de proliferação de células XTT com células BT474 e HCC1419 após 4 dias de tratamento. Todas hu- manas.[00257] Fig. 22 shows the XTT cell proliferation assay with BT474 and HCC1419 cells after 4 days of treatment. All human.
[00258] A-Fig. 23 mostra o ensaio de proliferação de células XTT com células BT474 e HCC1419 após 4 dias de tratamento. Todas hu- manas.[00258] A-Fig. 23 shows the XTT cell proliferation assay with BT474 and HCC1419 cells after 4 days of treatment. All human.
[00259] AFig.24 mostra a) no painel superior, os ensaios de proli- feração de células XTT com células BT474 (esquerda) e HCC1419 (di- reita) após 4 dias de tratamento; e no painel inferior, os ensaios de proliferação de células XTT com células BT474 (esquerda) e HCC1419 (direita) após 4 dias de tratamento (variantes com maior afinidade (NGS e GGG)); b) experimentos repetidos com uma nova expressão de NGS.[00259] Fig.24 shows a) in the upper panel, the XTT cell proliferation assays with BT474 (left) and HCC1419 (right) cells after 4 days of treatment; and in the lower panel, XTT cell proliferation assays with BT474 (left) and HCC1419 (right) cells after 4 days of treatment (higher affinity variants (NGS and GGG)); b) repeated experiments with a new NGS expression.
[00260] AFig.25 mostra os ensaios de proliferação de células XTT com células BT474 (esquerda) e HCC1419 (direita) após 4 dias de tra- tamento.[00260] Fig.25 shows XTT cell proliferation assays with BT474 (left) and HCC1419 (right) cells after 4 days of treatment.
[00261] AFig.26 mostra os ensaios de proliferação de células XTT com células HCC1419 cultivadas como esferoides 3D.[00261] Fig.26 shows XTT cell proliferation assays with HCC1419 cells cultured as 3D spheroids.
[00262] AFig.27 mostra Western Blots 24 horas após o tratamento (BT474) com os agentes indicados (murino).[00262] Fig.27 shows Western Blots 24 hours after treatment (BT474) with the indicated agents (murine).
[00263] AFig.28 mostra no painel superior a indução de apoptose em células BT474 após 3 dias de tratamento. O número médio de cé- lulas positivas para iodeto de propídio (PI) foi determinado para 4 repe- tições, contadas por perfilador de células e foi analisado com o teste t de Student. O construto biparatópico (441, 441tf) induziu significativa- mente mais morte celular que o trastuzumabe (TZB). 441 e DARPin biparatópico (6L1G) mostram nível semelhante de morte celular; e no painel inferior, a indução de apoptose em células BT474 após 3 dias de tratamento. O número médio de células positivas para anexina-V foi determinado para 3-4 repetições, contadas pelo perfilador de células e foi analisado com o teste t de Student. O construto biparatópico 441 induziu significativamente mais apoptose que o trastuzumabe (TZB). O construto 441 e 6L1G mostram nível semelhante de apoptose.[00263] Fig.28 shows in the upper panel the induction of apoptosis in BT474 cells after 3 days of treatment. The mean number of positive cells for propidium iodide (PI) was determined for 4 repetitions, counted by a cell profiler and analyzed with Student's t test. The biparatopic construct (441, 441tf) induced significantly more cell death than trastuzumab (TZB). 441 and biparatopic DARPin (6L1G) show a similar level of cell death; and in the lower panel, the induction of apoptosis in BT474 cells after 3 days of treatment. The mean number of annexin-V positive cells was determined for 3-4 replicates, counted by the cell profiler and analyzed with Student's t-test. The biparatopic construct 441 induced significantly more apoptosis than trastuzumab (TZB). Construct 441 and 6L1G show a similar level of apoptosis.
[00264] AFig 29 mostra imagens de células BT474 tratadas com os agentes indicados durante 3 dias.Fig 29 shows images of BT474 cells treated with the indicated agents for 3 days.
[00265] A Fig 30 mostra trastuizumabe marcado com Alexa647 (TZB), construto biparatópico 441 e construtos biparatópicos de cons- trutos com um braço oaLF e oaHF foram incubados por 1 h a concen- tração de 100 nM com 3 milhões de células BT474 em 3 ml de PBS contendo NaN;3 (0,1%) e BSA (1%) a 4 ºC. Observe que as células BT474 foram pré-tratadas com NaN;3 0,1% em PBS com BSA a 1% para bloquear a internalização antes da ligação. As células foram ana- lisadas posteriormente no instrumento CyFlow Space (Partec). Todos os agentes de ligação mostram ligação específica à superfície de célu- las BT474 positivas para HER?2.[00265] Fig 30 shows Alexa647-labeled trastuizumab (TZB), biparatopic construct 441 and biparatopic constructs of oaLF and oaHF arm constructs were incubated for 1 h concentration of 100 nM with 3 million BT474 cells in 3 ml of PBS containing NaN;3 (0.1%) and BSA (1%) at 4°C. Note that BT474 cells were pretreated with 0.1% NaN;3 in PBS with 1% BSA to block internalization prior to binding. The cells were later analyzed using the CyFlow Space instrument (Partec). All binding agents show specific binding to the surface of HER?2 positive BT474 cells.
[00266] AFig.31 mostra a indução de morte celular após tratamen- to com 100 nM dos agentes indicados. As células BT474, N87, HCC1419 e SKBR3 foram semeadas 24 h antes do tratamento em 96 placas de microscopia de poços límpidos pretos (Nunc), continuamen- te tratadas por 3 dias e coradas com HOECHST-33342 (Invitrogen) para células totais e com iodeto de propídio (Sigma) para células mor- tas permeáveis à membrana. As células foram analisadas em um mi- croscópio automatizado Lionheart FX (BioTek Instruments) e o número de células positivas para iodeto de propídio e HOECHST-33342 foi quantificado com software Gen5 (BioTek Instruments). A razão de cé- lulas positivas para iodeto de propídio e HOECHST-33342 foi calcula- da para 3 repetições biológicas e a média e DP são mostrados nos gráficos de coluna correspondentes. Os agentes de ligação biparatópi- cos (6L1G, 441, 841, LFoa, 241, 641, HFoa, 7C2LF) que se ligam ao domínio 1 e 4 de HER2 induzem continuamente mais células mortas que o trastuzumabe (TZB) ou a combinação de trastuzumabe e per- tuzumabe (TZB + PZB) em células cancerosas positivas para HER2.[00266] Fig.31 shows the induction of cell death after treatment with 100 nM of the indicated agents. BT474, N87, HCC1419 and SKBR3 cells were seeded 24 h before treatment in 96 black clear well microscopy plates (Nunc), continuously treated for 3 days and stained with HOECHST-33342 (Invitrogen) for whole cells and with propidium iodide (Sigma) for dead cells permeable to the membrane. The cells were analyzed in a Lionheart FX automated microscope (BioTek Instruments) and the number of positive cells for propidium iodide and HOECHST-33342 was quantified with Gen5 software (BioTek Instruments). The ratio of positive cells for propidium iodide and HOECHST-33342 was calculated for 3 biological replicates and the mean and SD are shown in the corresponding column graphs. Biparatopic binding agents (6L1G, 441, 841, LFoa, 241, 641, HFoa, 7C2LF) that bind to domain 1 and 4 of HER2 continuously induce more dead cells than trastuzumab (TZB) or the trastuzumab combination and pertuzumab (TZB + PZB) in HER2-positive cancer cells.
[00267] AFig.32 mostra a meia-vida do construto 441 no soro de camundongos NSG. Os soros colhidos de camundongos com 441 in-[00267] Fig.32 shows the half-life of the 441 construct in the serum of NSG mice. Sera collected from mice with 441 in-
jeções anteriores (3 mg/kg) foram analisados por ELISA sanduíche. 441 mostrou uma fase alfa de cerca de 4,3 horas, seguida por uma fase beta de mais de 45 horas.Previous injections (3 mg/kg) were analyzed by sandwich ELISA. 441 showed an alpha phase of about 4.3 hours, followed by a beta phase of more than 45 hours.
[00268] AFig.33 mostra a atividade in vivo de 441 em xenoenxer- tos N87 em camundongos SCID bege. Depois que os tumores N87 atingiram 150 mm? de tamanho, os camundongos foram tratados com oito injeções de 441 (10 mg/kg) durante quatro semanas. 441 levou a uma redução significativa do tamanho do tumor em comparação com camundongos não tratados e camundongos tratados com TZB (10 mg/kg) ou huA21G (10 mg/kg).[00268] Fig.33 shows the in vivo activity of 441 in N87 xenografts in beige SCID mice. After N87 tumors reached 150 mm? of size, mice were treated with eight injections of 441 (10 mg/kg) for four weeks. 441 led to a significant reduction in tumor size compared to untreated mice and mice treated with TZB (10 mg/kg) or huA21G (10 mg/kg).
[00269] AFig.34 mostra imagens de microscopia representativas de células BT-474 após o tratamento por 2 horas com trastuzumabe (TZB), huA21G (A21), sua combinação ou 441, e células não tratadas, sem ou com adição de um anticorpo primário anti-humano, como con- troles. Os núcleos foram corados usando 2-(4-amidinofenil)-1H-indol-6- carboximidamida (DAPI), os anticorpos foram detectados com um anti- corpo Fc anti-humano de cabra e compartimentos lisossomais usando um anticorpo anti-LAMP1.[00269] Fig.34 shows representative microscopy images of BT-474 cells after treatment for 2 hours with trastuzumab (TZB), huA21G (A21), their combination or 441, and untreated cells, without or with addition of an antibody IM anti-human such as controls. Nuclei were stained using 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboximidamide (DAPI), antibodies were detected with a goat anti-human Fc antibody and lysosomal compartments using an anti-LAMP1 antibody.
[00270] AFig.35 mostra o resultado de um tratamento ao longo do tempo e subsequente internalização de proteína de superfície e ensaio de degradação para os construtos 441 e 841, hA21G, trastuzumabe (TZB), a combinação de trastuzumabe e hA21G (TZB + hA21G), per- tuzumabe (PZB), a combinação de trastuzumabe e pertuzumabe (TZB + PZB), e o inibidor de HSP90, geldanamicina (GA). Listagem de sequências: SEQ ID Nº 1 (“polipeptídeo de 441 1”):[00270] Fig.35 shows the result of a treatment over time and subsequent surface protein internalization and degradation assay for constructs 441 and 841, hA21G, trastuzumab (TZB), the combination of trastuzumab and hA21G (TZB + hA21G), pertuzumab (PZB), the combination of trastuzumab and pertuzumab (TZB + PZB), and the HSP90 inhibitor geldanamycin (GA). Sequence listing: SEQ ID No. 1 ("441 1 polypeptide"):
RGEC SEQ ID Nº 2 (“polipeptídeo de 441 2”):RGEC SEQ ID No. 2 ("441 2 polypeptide"):
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 3 (“polipeptídeo de 47C2 1”):WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 3 ("47C2 1 polypeptide"):
SEQ ID Nº 4 (“polipeptídeo de 47C2 2"):SEQ ID No. 4 ("47C2 2 polypeptide"):
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 5 (“polipeptídeo de 841 2”):GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 5 ("841 2 Polypeptide"):
ESVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID Nº 6 (“polipeptídeo de 87C2 2"):ESVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID No. 6 ("87C2 polypeptide 2"):
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID Nº 7 (“polipeptídeo de 841Fc 1”):VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID No. 7 ("841Fc 1 polypeptide"):
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 8 (“polipeptídeo de 841Fc 2”):SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 8 ("841Fc 2 polypeptide"):
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 9 (“polipeptídeo de 87C2Fc 1”):WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 9 ("87C2Fc 1 polypeptide"):
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 10 (“polipeptídeo de 87C2Fc 2”):LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 10 ("87C2Fc 2 polypeptide"):
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 11 (“polipeptídeo de 241 1”):GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 11 ("241 1 polypeptide"):
SKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 12 (“polipeptídeo de 241 2”):SKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 12 ("241 2 polypeptide"):
SK SEQ ID Nº 13 (“polipeptídeo de 641 2”):SK SEQ ID No. 13 ("641 2 polypeptide"):
VDKRVEPKSC SEQ ID Nº 14 ("cadeia L (leve) de scFv TZB"):VDKRVEPKSC SEQ ID No. 14 ("L-chain (light) of scFv TZB"):
PTFGQGTKVEIK SEQ ID Nº 15 ("cadeia H (pesada) de scFv TZB"):PTFGQGTKVEIK SEQ ID No. 15 ("H (heavy) chain of scFv TZB"):
SEQ ID Nº 16 ("Ligante de scFv TZB"):SEQ ID No. 16 ("ScFv TZB Linker"):
GGGEGESCGSEGSCEGESCGGGES SEQ ID Nº 17 (“Ligante B1 para B2 (ligação 1)”):GGGEGESCGSEGSCEGESCGGGES SEQ ID No. 17 ("Linker B1 to B2 (link 1)"):
GS SEQ ID Nº 18 (“cadeia L de A21”):GS SEQ ID No. 18 ("L-chain of A21"):
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 19 (“Ligante H de A21 com Fc”):SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 19 ("H-Link of A21 with Fc"):
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 20 (“Ligante H de A21 para Fab”):WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 20 ("H-Link from A21 to Fab"):
ESVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID Nº 21 (,TZB CDR H1”):ESVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID No. 21 (,TZB CDR H1"):
GFNIKDTYIH SEQ ID Nº 22 (,TZB CDR H2”):GFNIKDTYIH SEQ ID No. 22 (,TZB CDR H2"):
RIYPTNGYTRYADSVKG SEQ ID Nº 23 (,TZB CDR H3”):RIYPTNGYTRYADSVKG SEQ ID No. 23 (,TZB CDR H3"):
WGGDGFYAMDY SEQ ID Nº 24 (,TZB CDR L1”):WGGDGFYAMDY SEQ ID No. 24 (,TZB CDR L1"):
RASQDVNTAVA SEQ ID Nº 25 (,TZB CDR L2"):RASQDVNTAVA SEQ ID No. 25 (,TZB CDR L2"):
SASFLYS SEQ ID Nº 26 (,TZB CDR L3"):SASFLYS SEQ ID No. 26 (,TZB CDR L3"):
QQHYTTPPT SEQ ID Nº 27 (,A21 CDR H1”):QQHYTTPPT SEQ ID No. 27 (.A21 CDR H1"):
GYSFTGYFIN SEQ ID Nº 28 (,A21 CDR H2”):GYSFTGYFIN SEQ ID No. 28 (.A21 CDR H2"):
HISSSYATSTYNQKFQG SEQ ID Nº 29 (“A21 CDR H3”):HISSSYATSTYNQKFQG SEQ ID No. 29 ("A21 CDR H3"):
SGNYEEYAMDY SEQ ID Nº 30 (,A21 CDR L1”):SGNYEEYAMDY SEQ ID No. 30 (.A21 CDR L1"):
RSSQTLLYSNNQKNYLA SEQ ID Nº 31 (A21 CDR L2"):RSSQTLLYSNNQKNYLA SEQ ID NO.31 (A21 CDR L2"):
WAFTRKS SEQ ID Nº 32 (,A21 CDR L3"):WAFTRKS SEQ ID NO 32 (.A21 CDR L3"):
QQYSNYPWT SEQ ID Nº 33 (,7C2 CDR H1”):QQYSNYPWT SEQ ID No. 33 (.7C2 CDR H1"):
SEQ ID Nº 34 (,7C2 CDR H2”):SEQ ID No. 34 (.7C2 CDR H2"):
MIHPLDAEIRANQKFR SEQ ID Nº 35 (,7C2 CDR H3”):MIHPLDAEIRANQKFR SEQ ID No. 35 (.7C2 CDR H3"):
GTYDGGFEY SEQ ID Nº 36 (,7C2 CDR L1”):GTYDGGFEY SEQ ID No. 36 (.7C2 CDR L1"):
RASQSVSGSRFTYMH SEQ ID Nº 37 (,7C2 CDR L2"):RASQSVSGSRFTYMH SEQ ID No. 37 (.7C2 CDR L2"):
YASILES SEQ ID Nº 38 (,7C2 CDR L3"):YASILES SEQ ID NO 38 (.7C2 CDR L3"):
QHSWEIPPWT SEQ ID Nº 39 (“cadeia L de A21 V1º):QHSWEIPPWT SEQ ID No. 39 ("L-chain of A21 V1º):
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 40 (“cadeia H de A21 V1”):SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 40 ("H chain of A21 V1"):
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID Nº 41 (“cadeia L de A21 V2”):SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID No. 41 ("L-chain of A21 V2"):
SEQ ID Nº 42 (“cadeia H de A21 V2"):SEQ ID No. 42 ("H chain of A21 V2"):
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 43 ("cadeia L de scFv TZB V1"):RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 43 ("L-chain of scFv TZB V1"):
PTFGQGTKVEIK SEQ ID Nº 44 ("cadeia H de scFv TZB V1"):PTFGQGTKVEIK SEQ ID No. 44 ("H-chain of scFv TZB V1"):
YYCSRWGGTGFYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID Nº 45 ("Parte Fc alternativa - sem mut"):YYCSRWGGTGFYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID No. 45 ("Alternative Fc Part - no mut"):
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 46 (,Parte Fc alternativa - “Knob into hole” - sítio do “knob” Vi"):QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 46 (,Alternative Fc Part - "Knob into hole" - site of the "knob" Vi"):
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 47 (,Parte Fc alternativa - “Knob into hole” - sítio do “hole” Vi"):WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 47 (,Alternative Fc Part - "Knob into hole" - site of "hole" Vi"):
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 48 (,Parte Fc alternativa - “Knob into hole” - sítio do “knob” V2"):QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 48 (,Alternative Fc Part - "Knob into hole" - site of the "knob" V2"):
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 49 (,Parte Fc alternativa - “Knob into hole” - sítio do “hole” V2"):WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 49 (,Alternative Fc Part - "Knob into hole" - site of "hole" V2"):
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 50 (“cadeia L de A21 V3”):WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 50 ("L-chain of A21 V3"):
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 51 (“cadeia H de A21 V3”):KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 51 ("H chain of A21 V3"):
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID Nº 52 (“cadeia H de A21 V4”):SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID No. 52 ("H chain of A21 V4"):
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID Nº 53 (“cadeia H de TZB V2"):SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC SEQ ID No. 53 ("TZB V2 H chain"):
YYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID Nº 54 (“cadeia H de TZB V3”):YYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID No. 54 ("TZB V3 H-chain"):
YCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID Nº 55 (Poli-Gly-ligante”):YCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS SEQ ID No. 55 (Poly-Gly-Binder"):
GGGGG SEQ ID Nº 56 (,Ova-ligante”):GGGGG SEQ ID No. 56 (,Ova-linker"):
GSGSGS SEQ ID Nº 57 (,Trans-ligante”):GSGSGS SEQ ID No. 57 (,Trans-linker"):
SEQ ID Nº 58 (,Pro-ligante”):SEQ ID No. 58 (,Pro-linker"):
PPP SEQ ID Nº 59 (,PAS-ligante 1”):PPP SEQ ID No. 59 (,PAS-linker 1"):
ASPAAPAPASPAAPAPSAPAA SEQ ID Nº 60 (,PAS-ligante 2"):ASPAAPAPASPAAPAPSAPAA SEQ ID No. 60 (,PAS-linker 2"):
ASAAAPAAASAAASAPSAAAA SEQ ID Nº 61 (,PAS-ligante 3”):ASAAAPAAASAAAASAPSAAAA SEQ ID No. 61 (,PAS-linker 3"):
AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPAA SEQ ID Nº 62 (,PAS-ligante 4"):AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPAA SEQ ID NO 62 (,PAS-linker 4"):
ASPASA SEQ ID Nº 63 (,PAS-ligante 5"):ASPASA SEQ ID No. 63 (,PAS-linker 5"):
ASPASPASA SEQ ID Nº 64 (,XS-ligante 1”):ASPASPASA SEQ ID No. 64 (.XS-linker 1"):
PAGSP SEQ ID Nº 65 (,XS-ligante 2"):PAGSP SEQ ID No. 65 (,XS-linker 2"):
STEPS SEQ ID Nº 66 (,XS-ligante 3”):STEPS SEQ ID No. 66 (.XS-linker 3"):
STEEG SEQ ID Nº 67 (,XS-ligante 4"):STEEG SEQ ID No. 67 (,XS-linker 4"):
GSAPG SEQ ID Nº 68 (,Proper-ligador1”):GSAPG SEQ ID No. 68 (,Proper-linker1"):
GASTP SEQ ID Nº 69 (,Proper-ligador2”):GASTP SEQ ID No. 69 (,Proper-linker2"):
GPSAT SEQ ID Nº 70 (,cadeia leve de 398”):GPSAT SEQ ID No. 70 (398” light chain):
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 71 (,cadeia pesada de 39sS”):KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 71 (,39sS heavy chain"):
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 72 (,.cadeia leve de H218”):RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 72 (.H218 light chain"):
DYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 73 (“cadeia pesada de H218”):DYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 73 ("H218 heavy chain"):
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 74 (,cadeia leve de MF3958”):GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 74 (, MF3958 light chain):
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 75 (“cadeia pesada de MF3958”):KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 75 ("MF3958 heavy chain"):
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 76 (“cadeia L de A21 V4”):RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 76 ("L-chain of A21 V4"):
SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 77 (“cadeia H de A21 com Fc V2”):SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 77 ("H chain of A21 with Fc V2"):
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 78 (,cadeia leve de 7C2”):WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 78 (,7C2 light chain):
ADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 79 (“cadeia pesada de 7C2”):ADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 79 ("7C2 heavy chain"):
GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 80 (,TZB-HC”*):GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLLSK SEQ ID No. 80 (,TZB-HC"*):
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID Nº 81 (,TZB-LC*):RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSK SEQ ID No. 81 (,TZB-LC*):
KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID Nº 82 (“GS-ligante 1”): GGGGS SEQ ID Nº 83 (“GS-ligante 2"): SGGGSGGGGS SEQ ID Nº 84 (“GS-ligante 3”): GCGGGSGGGGSCGGGGES SEQ ID Nº 85 (“GS-ligante 4"): CGGGSGGGGSCGGGSCGGGES SEQ ID Nº 86 (“GS-ligante 5"): CGGGSGGGESCSCGGESGCGGESGGGES SEQ ID Nº 87 (“GA-ligante”): GAAGAAG SEQ ID Nº 88 (“GT-ligante”): GGTGGT SEQ ID Nº 89 (“ST-ligante”): STISTS SEQ ID Nº 90 (“PA-ligante”): PAPAP SEQ ID Nº 91 (“SA-ligante”): SAASAAS SEQ ID Nº 92 (“cadeia leve de HF-oaFabFc” / “cadeia leve de A21- TZB-20a2"):KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID No. 82 ("GS-linker 1"): GGGGS SEQ ID No. 83 ("GS-linker 2"): SGGGSGGGGS SEQ ID No. 84 ("GS-linker 3"): GCGGGSGGGGSCGGGGES SEQ ID No. 85 ("GS -linker 4"): CGGGSGGGGSCGGGSCGGGES SEQ ID NO.86 ("GS-linker 5"): CGGGSGGGESCSCGGESGCGGESGGGES SEQ ID NO.87 ("GA-linker"): GAAGAAG SEQ ID NO.88 ("GT-linker"): GGTGGT SEQ ID NO. 89 ("ST-linker"): STISTS SEQ ID No. 90 ("PA-linker"): PAPAP SEQ ID No. 91 ("SA-linker"): SAASAAS SEQ ID No. 92 ("HF-oaFabFc light chain" / "A21-TZB-20a2 light chain"):
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID Nº 93 (“cadeia pesada de HF-oaFabFc” / “cadeia pesada de A21-TZB-202"):NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID No. 93 ("HF-oaFabFc heavy chain" / "A21-TZB-202 heavy chain"):
SPGK Exemplo 1: Agentes de ligação anti-HER2 biparatópicosSPGK Example 1: Biparatopic anti-HER2 binding agents
[00271] Os inventores geraram derivados de IgG biparatópicos. Ao contrário de outros anticorpos biparatópicos direcionados a HER2, por exemplo, o conjugado anticorpo-fármaco (ADC) da Medimmune ME- DI4276 (Li et a/., 2016), essas IgGs mostram uma atividade antitumo- ral muito forte como proteínas de ligação "nuas", ou seja, sem fármaco ligado (Kast et al., em preparação). Assim, acredita-se que esses no-[00271] The inventors have generated biparatopic IgG derivatives. Unlike other HER2-targeted biparatopic antibodies, eg Medimmune's antibody-drug conjugate (ADC) ME-DI4276 (Li et a/., 2016), these IgGs show very strong antitumor activity as binding proteins "naked", i.e. without bound drug (Kast et al., in preparation). Thus, it is believed that these
vos IgGs anti-HER2 biparatópicos combinam os mecanismos de ação de trastuzumabe mais pertuzumabe mais a ação de inibidores de pe- quenas moléculas quinases contra HER2 em uma única molécula. Além disso, espera-se que os potenciais efeitos fora do alvo dos IgGs anti-HER2 biparatópicos permaneçam muito abaixo daqueles das fu- sões de ADC, como T-DM1 ou MEDI4276, pois eles só podem agir em células “viciadas” em HER2, enquanto os ADCs podem, por meio de suas toxinas, agir em muitos tecidos saudáveis. Isso abre as janelas terapêuticas para novas terapias combinadas. Além disso, a inibição de pan-ErbB por polimerização de receptores HER2 pode bloquear passivamente a ativação compensatória de outros receptores tirosina quinases (RTKs). Os agentes de ligação anti-HER2 biparatópicos in- terferem no movimento lateral livre dos receptores HER2 na superfície celular do câncer amplificado por HER2, porém sem induzir complexos sinalizadores competentes, que podem bloquear a ativação de outros RTKs. Consequentemente, os agentes de ligação anti-HER2 biparató- picos podem mostrar fortes sinergias com inibidores de moléculas pe- quenas, que tendem a induzir a expressão de RTKs compensatórios que acabam por levar à fuga da terapia. Portanto, os IgGs anti-HER2 biparatópicos têm um potencial muito alto para desencadear fortes si- nergias antitumorais em combinação com inibidores de moléculas pe- quenas em um amplo painel de cânceres amplificados por HER2. O potencial para sinergias com inibidores de moléculas pequenas é su- perior aos atuais anticorpos de especificidade única ou combinações de anticorpos.Biparatopic anti-HER2 IgGs combine the mechanisms of action of trastuzumab plus pertuzumab plus the action of small-molecule kinase inhibitors against HER2 into a single molecule. Furthermore, the potential off-target effects of biparatopic anti-HER2 IgGs are expected to remain far below those of ADC fusions such as T-DM1 or MEDI4276, as they can only act on HER2 “addicted” cells. while ADCs can, through their toxins, act on many healthy tissues. This opens the therapeutic windows for new combination therapies. Furthermore, inhibition of pan-ErbB by polymerization of HER2 receptors can passively block the compensatory activation of other receptor tyrosine kinases (RTKs). Biparatopic anti-HER2 binding agents interfere with the free lateral movement of HER2 receptors on the HER2-amplified cancer cell surface, but without inducing competent signaling complexes, which can block the activation of other RTKs. Consequently, biparatopic anti-HER2 binding agents may show strong synergies with small molecule inhibitors, which tend to induce the expression of compensatory RTKs that ultimately lead to therapy avoidance. Therefore, biparatopic anti-HER2 IgGs have a very high potential to elicit strong antitumor synergies in combination with small molecule inhibitors in a broad panel of HER2-amplified cancers. The potential for synergies with small molecule inhibitors is greater than current single specificity antibodies or antibody combinations.
[00272] Esquemas ilustrativos de construtos de IgG biparatópicos preferidos são mostrados nas Fig. 1 e 2[00272] Illustrative schematics of preferred biparatopic IgG constructs are shown in Fig. 1 and 2
[00273] Os dados relativos à preparação e atividade biológica dos construtos de IgG biparatópica são mostrados nas Figs 3 a 26. Protocolo para a produção de IgGs biparatópicos em células CHOs[00273] Data regarding the preparation and biological activity of the biparatopic IgG constructs are shown in Figs 3 to 26. Protocol for the production of biparatopic IgGs in CHO cells
Projeto vetorialvector design
[00274] —Plasmídeos bicistrônicos contendo dois cassetes de ex- pressão ou dois sistemas de vetor foram construídos para cotransfec- ções. Derivados do plasmídeo pYMex10 (Morphosys) foram usados para a estratégia bicistrônica. Nos construtos de plasmídeo resultan- tes, as sequências de codificação das cadeias polipeptídicas dos cons- trutos multiméricos estavam cada uma sob o controle de um promotor CMV individual e terminadas por um sinal de cauda poliA como, por exemplo, retirado do hormônio de crescimento bovino ou vírus símio 40 (ver Fig. 3 e 4). Os vetores derivados de pcDNA 3.1 (Thermo) fo- ram usados para cotransfecções. Aqui, as cadeias polipeptídicas indi- viduais estão em um plasmídeo separado, reduzindo o risco de re- combinação de elementos homólogos e permitem ainda ajustar as ra- zões molares de plasmídeos para as transfecções para melhorar o rendimento. A troca de genes de interesse é possível por meio de téc- nicas de clonagem padrão. Exemplos dos construtos resultantes são representados na Fig. 5. Expressão em CHO-S[00274] —Bicistronic plasmids containing two expression cassettes or two vector systems were constructed for co-transfections. Derivatives of plasmid pYMex10 (Morphosys) were used for the bicistronic strategy. In the resulting plasmid constructs, the coding sequences of the polypeptide chains of the multimeric constructs were each under the control of an individual CMV promoter and terminated by a polyA tail signal such as, for example, taken from bovine growth hormone or simian virus 40 (see Fig. 3 and 4). Vectors derived from pcDNA 3.1 (Thermo) were used for co-transfections. Here, the individual polypeptide chains are on a separate plasmid, reducing the risk of recombination of homologous elements and even allowing to adjust the plasmid molar ratios for transfections to improve yield. The exchange of genes of interest is possible through standard cloning techniques. Examples of the resulting constructs are represented in Fig. 5. Expression in CHO-S
[00275] Células CHO-S em crescimento exponencial (Thermo) fo- ram semeadas em CHOgro (Mirrus) a uma densidade de quatro mi- lhões por ml em biorreatores TPP600. Por ml de cultura, 3 ug de polie- tilenimina linear (MW 25.000, PolySciences Inc) e 1,25 ug de DNA de plasmídeo altamente puro foram adicionados com mistura intermediá- ria. Finalmente, as culturas foram suplementadas com ácido valproico até uma concentração final de 1 MM. As proteínas foram expressas a 31º ou 37 ºC, 8% de CO2 e 180 rom com uma projeção de 50 mm em agitador Kuhner ISF1-X por até 12 dias. Purificação de moléculas[00275] Exponentially growing CHO-S cells (Thermo) were seeded in CHOgro (Mirrus) at a density of four million per ml in TPP600 bioreactors. Per ml of culture, 3 µg of linear polyethyleneimine (MW 25,000, PolySciences Inc) and 1.25 µg of highly pure plasmid DNA were added with intermediate mixing. Finally, cultures were supplemented with valproic acid to a final concentration of 1 MM. Proteins were expressed at 31º or 37 ºC, 8% CO2 and 180 mm with a 50 mm projection in a Kuhner ISF1-X shaker for up to 12 days. Molecule purification
[00276] As culturas de expressão foram colhidas por centrifugação a 1400 rpm e 4 ºC durante 30 min. Além disso, os sobrenadantes fo-[00276] Expression cultures were harvested by centrifugation at 1400 rpm and 4°C for 30 min. In addition, the supernatants fo-
ram clarificados por filtração de 0,22 um e ajustados para pH 7. Todas as etapas de purificação subsequentes foram realizadas a 4 ºC. Os sobrenadantes foram aplicados a colunas rProtein A (GE) equilibradas com PBS operadas em um sistema AEKTA Pure. Após a lavagem com PBS, a proteína ligada foi eluída por 0,1 M de glicina pH 2,75 (croma- tograma Fig. 6). As frações de interesse foram reunidas e o tampão trocado para 20 mM Bis/Tris metano 20 mM NaCl pH 6,75. As solu- ções de proteína filtrada foram carregadas em colunas Resource S (GE) e eluídas com um gradiente de 100% de Bis/Tris metano 20 nM NaCl a 1000 mM pH 6,75 (ver Fig. 7). As frações desejadas foram agrupadas e, se necessário, polidas em SEC (colunas Superdex200 de tamanho adequado; GE) para alta pureza (Fig. 8). As frações mo- noméricas foram agrupadas, filtradas e a pureza analisada em SDS page (Fig. 9). Finalmente, proteína pura foi usada para ensaios bio- químicos e celulares, bem como estudos in vivo. Efeitos relacionados a HER2 de IgGs biparatópicos tetravalenteswere clarified by 0.22 µm filtration and adjusted to pH 7. All subsequent purification steps were carried out at 4°C. Supernatants were applied to PBS equilibrated rProtein A (GE) columns operated on an AEKTA Pure system. After washing with PBS, bound protein was eluted by 0.1 M glycine pH 2.75 (chromatogram Fig. 6). The fractions of interest were pooled and the buffer exchanged to 20 mM Bis/Tris methane 20 mM NaCl pH 6.75. Filtered protein solutions were loaded onto Resource S (GE) columns and eluted with a gradient from 100% Bis/Tris methane 20 nM NaCl to 1000 mM pH 6.75 (see Fig. 7). The desired fractions were pooled and, if necessary, polished on SEC (appropriately sized Superdex200 columns; GE) to high purity (Fig. 8). Monomeric fractions were pooled, filtered and purity analyzed on the SDS page (Fig. 9). Finally, pure protein was used for biochemical and cellular assays, as well as in vivo studies. HER2-related effects of tetravalent biparatopic IgGs
[00277] Os construtos de polipeptídeo tetramérico (tetravalente e biparatópico) 441 e 47C2 foram testados em vários ensaios, os quais são todos bem conhecidos por versados, e em comparação com a fu- são de IgG tetravalente MEDI4276 (sem uma toxina), os construtos de polipeptídeo bivalente biparatópico dimérico 841, 87C2 e fusões de Fc dos mesmos, o construto DARPin bivalente biparatópico 6L1G (ver o pedido de patente WO 2014/060365 A1), IgGs únicos (TZB, PZB, A21 e 7C2) e suas combinações.[00277] The tetrameric polypeptide constructs (tetravalent and biparatopic) 441 and 47C2 have been tested in several assays, all of which are well known to be versed, and compared to the MEDI4276 tetravalent IgG fusion (without a toxin), the dimeric bivalent bivalent polypeptide constructs 841, 87C2 and Fc fusions thereof, bivalent biparatopic DARPin construct 6L1G (see patent application WO 2014/060365 A1), unique IgGs (TZB, PZB, A21 and 7C2) and combinations thereof.
[00278] A inibição do crescimento foi testada em um ensaio de via- bilidade de células XTT usando microscopia de alto teor de células vi- vas, coloração Hoechst e contagem de células. Como mostrado na Tabela 1, os construtos 441, 47C2, 841, 87C2 e as fusões de Fc de 841 e 87C2, 6L1G e a combinação de TZB com A21 resultaram na ini- bição total do crescimento, enquanto os anticorpos únicos e TZB com-[00278] Growth inhibition was tested in an XTT cell viability assay using high-content live cell microscopy, Hoechst staining and cell counting. As shown in Table 1, constructs 441, 47C2, 841, 87C2 and the Fc fusions of 841 and 87C2, 6L1G and the combination of TZB with A21 resulted in total inhibition of growth, whereas single antibodies and TZB with-
binados com PZB levam à inibição parcial. Surpreendentemente, na ausência de um fármaco citotóxico, o anticorpo MEDI4276 estimulou o crescimento de células XTT.combined with PZB lead to partial inhibition. Surprisingly, in the absence of a cytotoxic drug, the MEDI4276 antibody stimulated the growth of XTT cells.
[00279] O efeito dos construtos na apoptose/morte celular foi anali- sado por microscopia de alto teor de células vivas com coloração de anexina-V e PI ou por detecção de PARP clivada em lisados celulares por Western blot para análise de clivagem de PARP.[00279] The effect of the constructs on apoptosis/cell death was analyzed by high-content microscopy of live cells with annexin-V and PI staining or by detection of cleaved PARP in cell lysates by Western blot for analysis of PARP cleavage .
[00280] Os construtos 441, 47C2, 841, 87C2 e suas fusões de Fc, 6L1G tiveram um efeito sobre a apoptose, enquanto MEDI4276, anti- corpos únicos não influenciaram a apoptose, e TZB e A21 tiveram um efeito parcial. A combinação TZB+PZB é capaz de induzir apoptose em uma fração muito pequena de células ou em linhas celulares frá- geis.Constructs 441, 47C2, 841, 87C2 and their Fc, 6L1G fusions had an effect on apoptosis, whereas MEDI4276, single antibodies did not influence apoptosis, and TZB and A21 had a partial effect. The TZB+PZB combination is able to induce apoptosis in a very small fraction of cells or in fragile cell lines.
[00281] A reticulação de HER2 na superfície celular, também de- nominada "bloqueio", foi medida por recuperação de fluorescência após fotodegradação (FRAP) e microscopia de localização de célula única. Uma redução do sinal FRAP indica menor mobilidade das célu- las e, portanto, reticulação em resposta aos construtos polipeptídicos.[00281] Cross-linking of HER2 on the cell surface, also called "blocking", was measured by fluorescence recovery after photodegradation (FRAP) and single-cell localization microscopy. A reduction in the FRAP signal indicates lower cell mobility and, therefore, cross-linking in response to the polypeptide constructs.
[00282] 441,47C2 e 6L1G resultaram no bloqueio de receptores e o efeito de reticulação parcial foi medido para 841, 87C2 e suas fusões de Fc, bem como as combinações de anticorpos TZB+PZB e TZB+A21. Os anticorpos únicos não tiveram efeito na reticulação.[00282] 441,47C2 and 6L1G resulted in blockade of receptors and the partial crosslinking effect was measured for 841, 87C2 and their Fc fusions, as well as TZB+PZB and TZB+A21 antibody combinations. Single antibodies had no effect on crosslinking.
[00283] Além disso, a internalização de HER2 nas células foi anali- sada por um ensaio de internalização e degradação de proteínas de superfície, microscopia confocal e citometria de fluxo, conforme des- crito em detalhes no exemplo 2.[00283] In addition, the internalization of HER2 in cells was analyzed by a surface protein internalization and degradation assay, confocal microscopy and flow cytometry, as described in detail in example 2.
[00284] Os construtos biparatópicos tetravalentes 441, 47C2 e ME- DI4276 exibiram um forte efeito na internalização de HER2, enquanto uma inibição de reciclagem foi detectada para as combinações TZB+PZB e TZB+A21). Os construtos restantes não mostraram ne-[00284] The tetravalent biparatopic constructs 441, 47C2 and ME-DI4276 exhibited a strong effect on the internalization of HER2, while an inhibition of recycling was detected for the combinations TZB+PZB and TZB+A21). The remaining constructs did not show ne-
nhum efeito.no effect.
[0001] A A degradação de HER?2 foi testada por um ensaio de in- ternalização e degradação de proteínas de superfície e detecção de Western blot de HER?2 total. Aqui, 441 e 47C2 levam a uma degrada- ção forte e rápida. MEDI4276 teve um efeito na degradação, mas me- nos forte em comparação com 441 e 47C2. Ao contrário, as combina- ções de anticorpos resultaram em degradação lenta, e os construtos restantes não tiveram efeito. Construto Inibição — de| Apoptose/ |"Bloqueio"] |Internalização de |Degrada- crescimento |morte ce-|(reticulação |HER2 ção de lular nas células) HER2 441/47C2 sim Sim Sim Forte Rápido, Forte MEDI4276 Não (estimu-|Não Não determi-|lgual a 441 Menos de (sem toxina) |lante!) nado, mas 441 esperado 841/87C2 Sim Sim Parcial Não Não efusões Fc dos mesmos Anticorpos Parcial Não Não Não Não únicos TZB+PZB Parcial Não (sim) |Reticulação Inibição de reci- clagem (muito fraca) TZB+A21 Sim Parcial Reticulação Inibição de reci-|Lento clagem Tabela 1: Resultados dos ensaios que medem os efeitos relacio- nados ao HER?2 de construtos polipeptídicos[0001] A The degradation of HER?2 was tested by a surface protein internalization and degradation assay and Western blot detection of total HER?2. Here, 441 and 47C2 lead to strong and rapid degradation. MEDI4276 had an effect on degradation, but less strong compared to 441 and 47C2. In contrast, the antibody combinations resulted in slow degradation, and the remaining constructs had no effect. Inhibition construct — of| Apoptosis/ |"Block"] |Internalization of |Degradation-growth |death ce-|(crosslinking |HER2 tion of squid in cells) HER2 441/47C2 yes Yes Yes Strong Fast, Strong MEDI4276 No (stimulus-|No No deter- |equal to 441 Less than (no toxin) |lant!) nated, but 441 expected 841/87C2 Yes Yes Partial No No Fc effusions of the same Antibodies Partial No No No No unique TZB+PZB Partial No (yes) | Crosslinking Inhibition of recycling (very weak) TZB+A21 Yes Partial Cross-linking Inhibition of recycling Table 1: Results of assays measuring the HER?2-related effects of polypeptide constructs
[00285] A Tabela2 mostra os resultados dos estudos de ligação ao HER?2 realizados com os mesmos construtos que os experimentos descritos acima. A ligação foi determinada por citometria de fluxo e, adicionalmente, por cromatografia de exclusão por tamanho/espalha-[00285] Table 2 shows the results of the binding studies to HER?2 performed with the same constructs as the experiments described above. Binding was determined by flow cytometry and additionally by size/scatter exclusion chromatography.
mento de luz multi-ângulo (SEC-MALS) no caso de formação de com- plexo entre os construtos de IgG biparatópico e HER2.multi-angle light (SEC-MALS) in case of complex formation between the biparatopic IgG and HER2 constructs.
[00286] Todos os construtos ligam os domínios extracelulares 1, 2 e/ou 4 como esperado (ver Tabela 2). 441, 47C2 e a combinação TZB + A21 exibiram uma taxa de dissociação extremamente lenta que era mais lenta em comparação com os construtos restantes.All constructs bind extracellular domains 1, 2 and/or 4 as expected (see Table 2). 441, 47C2 and the TZB + A21 combination exhibited an extremely slow dissociation rate that was slower compared to the remaining constructs.
[00287] Curiosamente, todos os construtos biparatópicos resultaram em uma estequiometria de ligação de HER2 de próximo ao 1:1. Anti- corpos únicos e combinações de anticorpos levam apenas aproxima- damente a uma estequiometria de 1:2.[00287] Interestingly, all biparatopic constructs resulted in a HER2 binding stoichiometry of close to 1:1. Single antibodies and antibody combinations only lead to a stoichiometry of 1:2.
[0002] A meia-vida sérica do construto 441 foi adicionalmente tes- tada por injeção intravenosa em camundongos NSG e detecção resol- vida no tempo de IgG biparatópica em amostras de sangue por ELISA. Para determinar a meia-vida de 441, 3 mg/kg de construto purificado foram injetados por via intravenosa em camundongos NSG. Nos pon- tos de tempo indicados, os camundongos foram sangrados, permitiu- se que o sangue coagulasse e o soro foi obtido tomando sobrenadan- tes de amostras centrifugadas. Um ELISA de captura padrão foi usado para avaliar os níveis séricos de 441 (Fig. 32). O anticorpo Fc anti- humano de camundongo foi revestido diretamente em placas maxi- sorb. Os padrões 441 ligados e 441 com soros aumentados foram di- vulgados por anticorpos anticadeia kappa de cabra conjugada com fosfatase alcalina. Os dados foram ajustados a um modelo de decai- mento de duas fases e a meia-vida resultante foi calculada em 4,3 + 45,3 horas (fases a e à).[0002] The serum half-life of the 441 construct was further tested by intravenous injection into NSG mice and time-resolved detection of biparatopic IgG in blood samples by ELISA. To determine the half-life of 441, 3 mg/kg of purified construct was injected intravenously into NSG mice. At the indicated time points, mice were bled, blood was allowed to clot, and serum was obtained by taking supernatants from centrifuged samples. A standard capture ELISA was used to assess serum 441 levels (Fig. 32). Mouse anti-human Fc antibody was coated directly onto maxisorb plates. Standards 441 bound and 441 with raised sera were released by alkaline phosphatase conjugated goat anti kappa chain antibodies. Data were fitted to a two-phase decay model and the resulting half-life was calculated to be 4.3 ± 45.3 hours (phases a and a).
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[00288] Surpreendentemente, os construtos tetraméricos biparató- picos tetravalentes 441 e 47C2 levam à forte inibição da proliferação celular, induzem morte celular por apoptose e levam à reticulação de HER?2 na superfície celular e induzem forte internalização de HER2 e forte degradação de HER2, além de suas excelentes propriedades de ligação ao HER2. 441 e 47C2 foram superiores ou pontuaram igual- mente bem como todos os outros construtos em todas as categorias.[00288] Surprisingly, the tetravalent biparatopic tetrameric constructs 441 and 47C2 lead to strong inhibition of cell proliferation, induce cell death by apoptosis and lead to cross-linking of HER?2 on the cell surface and induce strong internalization of HER2 and strong degradation of HER2 , in addition to its excellent binding properties to HER2. 441 and 47C2 were superior or scored equally as well as all other constructs in all categories.
[00289] TZB+PZB e TZB+A21 resultaram em uma diminuição do HER2?2 total (muito fraco no caso de TZB + PZB) que foi atribuído à ini- bição da reciclagem, um mecanismo pelo qual HER2 é degradado sem acumulação intracelular anterior (ver Fig. 35).[00289] TZB+PZB and TZB+A21 resulted in a decrease in total HER2?2 (very weak in the case of TZB + PZB) which was attributed to the inhibition of recycling, a mechanism by which HER2 is degraded without previous intracellular accumulation (See Fig. 35).
[00290] Para determinar o efeito do construto 441 no crescimento do tumor, camundongos SCID bege (Charles River) foram inoculados no flanco direito com cinco milhões de células N87 em 50% de matri- gel (Corning). Depois que os tumores atingiram cerca de 150 mm?, os camundongos foram tratados com 441 10 mg/kg por oito vezes com um intervalo de três a quatro dias. Os camundongos tratados respon- deram a 441 com redução da carga tumoral. A interrupção do cresci- mento foi observada inicialmente para camundongos tratados com TZB (10 mg/kg) e hA21G (10 mg/kg) e tumores de camundongos de controle (rotulados como 'PBS' na Fig. 33) mostraram progressão de- simpedida (Fig. 33).To determine the effect of construct 441 on tumor growth, beige SCID mice (Charles River) were inoculated on the right flank with five million N87 cells in 50% matrigel (Corning). After the tumors reached about 150 mm?, the mice were treated with 441 10 mg/kg eight times with an interval of three to four days. Treated mice responded to 441 with reduced tumor burden. Growth arrest was initially observed for mice treated with TZB (10 mg/kg) and hA21G (10 mg/kg) and control mouse tumors (labeled 'PBS' in Fig. 33) showed unimpeded progression (Fig. 33).
[00291] “Exemplo 2: Internalização aprimorada, tráfico lisossômico e degradação de HER2 pela molécula divulgada 441[00291] "Example 2: Enhanced internalization, lysosomal trafficking and degradation of HER2 by the disclosed molecule 441
[00292] — Microscopia com células de câncer de mama BT-474 e HCC1419[00292] — Microscopy with BT-474 and HCC1419 breast cancer cells
[00293] Para microscopia de amostras fixadas, as células foram semeadas a uma densidade de 4-10º cm”? em lâminas pu (Ibidi, cat. Nº 80824) em meio completo. No dia seguinte, as células foram tratadas com as respectivas moléculas. Após 2 horas, as células foram lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e fixadas por adição de paraformaldeído 4% (p/v) dissolvido em DPBS e incubação à temperatura ambiente por 10 min. Em segui- da, as células foram lavadas duas vezes com PBSBA+T (DPBS su- plementado com 1% (p/v) de albumina de soro bovino (BSA), 0,1% (p/v) de azida de sódio e 0,5% (p/v) Tween-20). Posteriormente, as células foram incubadas em anticorpo anti-LAMP (Cell Signaling Technology, cat. Nº D401S) dissolvido a 1:150 (v/v) em PBSBA+T, su- plementado com 100 ng ml"* 2-(4-amidinofenil)-1H-indol-6-carboximi- damida (DAPI) por 30 min à temperatura ambiente. As células foram então lavadas duas vezes com PBSBA+T e, subsequentemente, anti- corpos anticamundongo, conjugado ao Alexa Fluor 488 (Thermo Fis- her Scientific, cat. Nº A11001) e anti-humano, conjugado ao Alexa Flu- or 647 (Thermo Fisher Scientific, cat. Nº A-21445) de cabra, dissolvi- dos em PBSBA+T, foram adicionados e incubados durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, as células foram lavadas duas ve- zes com PBSBA+T, fixadas mais uma vez por adição de paraformalde- ído 4% (p/v) dissolvido em DPBS e incubação à temperatura ambiente por 10 min, finalmente lavadas uma vez com PBSA e armazenadas em PBSA (DPBS suplementado com azida de sódio 0,1% (p/v)) a 4 ºC até a medição. A imagem foi realizada em um microscópio confocal de varredura a laser SP5 (Leica). As imagens mostram que, para ambas as linhagens celulares, apenas 441 foi capaz de induzir sua rápida in- ternalização e mostram forte colocalização com compartimentos lisos- somais (LAMP1 positivo).[00293] For microscopy of fixed samples, cells were seeded at a density of 4-10º cm”? in pu slides (Ibidi, cat. No. 80824) in complete medium. The next day, cells were treated with the respective molecules. After 2 hours, cells were washed once with Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) and fixed by adding 4% (w/v) paraformaldehyde dissolved in DPBS and incubating at room temperature for 10 min. Then, cells were washed twice with PBSBA+T (DPBS supplemented with 1% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.1% (w/v) sodium azide and 0.5% (w/v) Tween-20). Subsequently, the cells were incubated in anti-LAMP antibody (Cell Signaling Technology, cat. No. D401S) dissolved at 1:150 (v/v) in PBSBA+T, supplemented with 100 ng ml"* 2-(4- amidinophenyl)-1H-indole-6-carboximidamide (DAPI) for 30 min at room temperature.The cells were then washed twice with PBSBA+T and, subsequently, anti-mouse antibodies, conjugated to Alexa Fluor 488 (Thermo Fis - her Scientific, cat. No. A11001) and goat anti-human, conjugated to Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific, cat. No. A-21445), dissolved in PBSBA+T, were added and incubated for 30 min at room temperature. Then, the cells were washed twice with PBSBA+T, fixed once more by adding 4% paraformaldehyde (w/v) dissolved in DPBS and incubating at room temperature for 10 min. finally washed once with PBSA and stored in PBSA (DPBS supplemented with 0.1% sodium azide (w/v)) at 4°C until measurement.The image was performed on a microscope the SP5 laser scanning confocal (Leica). The images show that, for both cell lines, only 441 were able to induce their rapid internalization and show strong colocalization with lysosomal compartments (LAMP1 positive).
Ensaio de internalização e degradação de proteínas de superfícieSurface protein internalization and degradation assay
[00294] Para quantificar a internalização e degradação de HER2 após os tratamentos, realizamos um ensaio quantitativo de internaliza- ção e degradação de proteínas de superfície. Em suma, uma linha de células HEK293 Flp-ln TREx estável (Thermo Fisher Scientific, cat. Nº[00294] To quantify the internalization and degradation of HER2 after treatments, we performed a quantitative assay of internalization and degradation of surface proteins. In summary, a stable HEK293 Flp-ln TREx cell line (Thermo Fisher Scientific, cat.
K650001) foi gerada de acordo com as instruções do fabricante, em que uma fusão de receptor HaloTag-HER2 pode ser superexpressa após indução. Para o ensaio, as células foram semeadas dois dias an- tes do primeiro tratamento, e um dia antes do tratamento, a doxiciclina foi adicionada para induzir a superexpressão estável por 24 horas. Os tratamentos (100 nM) foram adicionados em pontos de tempo indica- dos, referindo-se ao tempo de marcação das células.K650001) was generated according to the manufacturer's instructions, in which a HaloTag-HER2 receptor fusion can be overexpressed after induction. For the assay, cells were seeded two days before the first treatment, and one day before treatment, doxycycline was added to induce stable overexpression for 24 hours. Treatments (100 nM) were added at indicated time points, referring to the time of cell labeling.
[00295] Após a conclusão dos intervalos de tempo de tratamento, as células foram marcadas em um procedimento de duas etapas. Um ligante HaloTag contendo Alexa Fluor 660 (HTL-AF660, Promega, cat. Nº G8472), que é completamente impermeável às células e, portanto, cora apenas os receptores de superfície, foi acoplado em uma primeira etapa de marcação. Um ligante HaloTag permeável às células conten- do tetrametil rodamina (HTL-TMR, Promega, cat. Nº G8252) foi, na segunda etapa, aplicado para corar toda a fusão do receptor, que resi- de nos compartimentos intracelulares. Assim, os sinais provenientes da superfície e do receptor interno são detectados em canais separa- dos em um citômetro de fluxo. Portanto, podem ser obtidas informa- ções sobre a localização e, utilizando o procedimento de re-escalona- mento descrito a seguir, sobre a distribuição quantitativa. Uma colora- ção de células mortas disponível comercialmente foi usada para exclu- são de células permeabilizadas (mortas) da análise, para as quais to- dos os receptores pareceriam estar na superfície. As intensidades de fluorescência em cada canal para 2.000-10.000 células foram registra- das usando um LSR Il Fortessa (BD) e células únicas não permeabili- zadas bloqueadas. As intensidades médias de fluorescência dessas populações foram obtidas usando FlowJo 10.4 (FlowJo). Processamento de dados[00295] Upon completion of the treatment time intervals, cells were tagged in a two-step procedure. A HaloTag ligand containing Alexa Fluor 660 (HTL-AF660, Promega, cat. No. G8472), which is completely impervious to cells and therefore stains only surface receptors, was coupled in a first labeling step. A cell-permeable HaloTag ligand containing tetramethyl rhodamine (HTL-TMR, Promega, cat. No. G8252) was, in the second step, applied to stain the entire receptor fusion, which resides in the intracellular compartments. Thus, the signals coming from the surface and the internal receiver are detected in separate channels in a flow cytometer. Therefore, information on the location and, using the rescheduling procedure described below, on the quantitative distribution can be obtained. A commercially available dead cell stain was used to exclude permeabilized (dead) cells from the analysis, for which all receptors would appear to be on the surface. Fluorescence intensities in each channel for 2000-10,000 cells were recorded using a LSR Il Fortessa (BD) and blocked non-permeabilized single cells. The mean fluorescence intensities of these populations were obtained using FlowJo 10.4 (FlowJo). Data processing
[00296] Para corrigir as diferentes eficiências de detecção do ins- trumento de citometria de fluxo nos canais para AF660 e TMR, os da-[00296] To correct the different detection efficiencies of the flow cytometry instrument in the channels for AF660 and TMR, the
dos foram dimensionados, produzindo abundâncias relativas. Uma amostra de controle (utr., s.), na qual a primeira etapa (marcação com HTL-AF660) é omitida, é necessária para esse fim. Nesta amostra, to- das as moléculas de HaloTag irão reagir com HTL-TMR neste proce- dimento de marcação “único” (s.), independentemente de sua localiza- ção. Usando as intensidades médias de fluorescência (MFI) da popu- lação de células singlete, não permeabilizada, o sinal Stmr normaliza- do (em escala de característica) no canal de TMR para uma amostra é obtido por normalização para uma amostra de controle não tratada com marcação única (utr.,s.) e subtração de fundo: onde utr.,, unlab. representa um controle não tratado, não marcado (mostrando apenas autofluorescência).have been scaled, producing relative abundances. A control sample (utr., s.), in which the first step (marking with HTL-AF660) is omitted, is required for this purpose. In this sample, all HaloTag molecules will react with HTL-TMR in this “unique” (s.) tagging procedure, regardless of their location. Using the mean fluorescence intensities (MFI) of the non-permeabilized singlet cell population, the normalized Stmr signal (in characteristic scale) in the TMR channel for a sample is obtained by normalization for an untreated control sample. with single markup (utr.,s.) and background subtraction: where utr.,, unlab. represents an untreated, unlabeled control (showing only autofluorescence).
[00297] A primeira etapa de marcação de superfície com corante impermeável a células é virtualmente saturante no procedimento com- pleto de marcação de duas etapas (duplas). O sinal de superfície nor- malizado Sareso pode, assim, ser definido em:[00297] The first step of surface marking with cell impermeable dye is virtually saturating in the complete two-step (double) marking procedure. The Sareso normalized surface signal can thus be defined in:
[00298] O sinal de uma amostra pode ser relacionado ao sinal de superfície de um controle duplo marcado (utr., d.) e não requer uma amostra separada com coloração única, no entanto, porque o receptor interno não é acessível para HTL-AF660 e, portanto, não pode ser co- rado.[00298] The signal from a sample can be related to the surface signal of a dual labeled control (utr., d.) and does not require a separate sample with single staining, however, because the internal receiver is not accessible for HTL- AF660 and therefore cannot be stained.
[00299] —AStvmR, a diferença do procedimento de marcação única pa- ra o procedimento de marcação dupla no canal TMR, agora corres- ponde exatamente ao número de moléculas que foram bloqueadas pela primeira etapa específica de superfície. O sinal no canal AF660 no mesmo experimento de marcação dupla também é uma correlação direta deste número de moléculas:[00299] —AStvmR, the difference of the single labeling procedure to the double labeling procedure in the TMR channel, now corresponds exactly to the number of molecules that were blocked by the first surface specific step. The signal in the AF660 channel in the same double tagging experiment is also a direct correlation of this number of molecules:
ASTwa = Str (Utr.,$.) — Srug (Utr., 0.) = Sazg3o, dmensicnade(Utr.,d.) — (eq.S51).ASTwa = Str (Utr.,$.) — Srug (Utr., 0.) = Sazg3o, dmensicnade(Utr.,d.) — (eq.S51).
[00300] Um fator de correção Ca pode, assim, ser definido, que re- laciona a intensidade medida Sareso(utr.d.) (registrado no canal AF660) para Sarse6o,dimensionado(Utr.,d.) (na escala do canal TMR): SaFego, dimensionado CULT .,d.) = Sarggo Cult ..d.) x Ca (eq.S1).[00300] A correction factor Ca can thus be defined, which relates the measured intensity Sareso(utr.d.) (recorded in channel AF660) to Sarse6o,scaled(Utr.,d.) (in the scale of TMR channel): SaFego, sized CULT .,d.) = Sarggo Cult ..d.) x Ca (eq.S1).
[00301] Usando sinais de células não tratadas com marcação única e dupla marcação, o cálculo de Ca é possível da seguinte forma: n= Sriar(utr.,s.) — Sus (utr.,0.) — 290% — Srvrs Cutr.,d.) Geq. 51), Sarego (utr., d.) Sareso (utr., d.)[00301] Using single tag and double tag untreated cell signals, calculation of Ca is possible as follows: n= Sriar(utr.,s.) — Sus (utr.,0.) — 290% — Srvrs Cutr.,d.) Geq. 51), Sarego (utr., d.) Sareso (utr., d.)
[00302] levando em consideração que o sinal TMR de células não tratadas com marcação única foi, usando a eq. S1, dimensionado para 100% antes. A correção dos sinais registrados no canal AF660, pode, para as amostras tratadas, agora ser feita de acordo com: Sareso, dimenslonado (18 113 = Ca x Sargenlre dd) (en 51).[00302] taking into account that the TMR signal from untreated cells with unique labeling was, using eq. S1, scaled to 100% before. The correction of the signals registered in the AF660 channel can now be done according to: Sareso, dimensioned (18 113 = Ca x Sargenlre dd) (en 51) for the treated samples.
[00303] *“Srmr(tre., d.) e Sareso,dimensicado(tre.,d.) então representam verdadeiramente a abundância de proteínas internas e de superfície, respectivamente, e a soma Sar6ço,dimensionado(tre.,d.)+SrmRr(tre.,d.) repre- senta a quantidade de proteína total, para uma amostra tratada com dupla marcação, sempre em relação a uma amostra de controle não tratada.[00303] *“Srmr(tre., d.) and Sareso, sized(tre., d.) then truly represent the abundance of internal and surface proteins, respectively, and the sum Sar6ço, sized(tre.,d. )+SrmRr(tre.,d.) represents the amount of total protein, for a double-labeled treated sample, always relative to an untreated control sample.
[00304] O dimensionamento de dados como descrito acima foi rea- lizado e os resultados foram plotados usando MATLAB R2017b (MathWorks), R 3.5.1, Prism 6.07 (GraphPad) e Excel2016 (Microsoft). Os resultados são mostrados na Fig. 35. Ao contrário de todos os ou- tros construtos, o construto 441 mostrou quase internalização de HER2 após menos de 5 minutos.[00304] The data sizing as described above was performed and the results were plotted using MATLAB R2017b (MathWorks), R 3.5.1, Prism 6.07 (GraphPad) and Excel2016 (Microsoft). The results are shown in Fig. 35. Unlike all other constructs, construct 441 showed near internalization of HER2 after less than 5 minutes.
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