BR112020026592A2 - Kit, método para analisar um composto e uso - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a um kit compreendendo um microdispositivo de co-cultura contendo neurônios sensoriais periféricos (psn) e queratinócitos epidérmicos humanos (hek) em uma cultura de células adaptada para ambos os tipos de células. também é descrito um método para analisar um composto ativo usando o kit de acordo com a presente invenção, bem como o uso do mesmo para testes de drogas in vitro e para produzir um produto cosmético para várias aplicações dermatológicas, tais como dermatite atópica, pele sensível, fotoenvelhecimento, cicatrização de feridas e espessura epidérmica em pele envelhecida.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um kit compreendendo um microdispositivo de co-cultura contendo neurônios sensoriais periféricos (PSN) e queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) em uma cultura de células adaptada para ambos os tipos de células. Também é descrito um método para analisar um composto ativo in vitro usando o kit de acordo com a presente invenção, bem como o uso do mesmo para testes de drogas in vitro e para produzir um produto cosmético para várias aplicações dermatológicas, tais como dermatite atópica, pele sensível, fotoenvelhecimento, cicatrização de feridas e espessura epidérmica em pele envelhecida.
[002] Os queratinócitos e os neurônios sensoriais periféricos (PSN) possuem uma interação extensa durante o desenvolvimento e na pele madura. Por exemplo, os queratinócitos liberam fatores neurotróficos que induzem a arborização das terminações nervosas livres e o aparecimento de neuritos em direção à superfície da pele (Albers & Davis, The skin as a neurotrophic organ. Neuroscientist. 2007; 13:371-82). Eles também liberam mediadores inflamatórios envolvidos na resposta a danos nos tecidos e reações de hipersensibilidade, bem como na resposta ao frio e ao calor através de receptores da família TRP de canais catiônicos (Chung et al., TRPV3 and TRPV4 mediate warmth-evoked currents in primary mouse keratinocytes. J Biol Chem. 2004; 279:21569-75).
[003] Por outro lado, terminações sensoriais não apenas transduzem sinais sensoriais, mas têm um papel importante no metabolismo cutâneo e na homeostase através da secreção de neuropeptídeos pró- inflamatórios e mediadores inflamatórios que controlam a vascularização e a renovação tecidual (Roosterman et al., Neuronal control of skin function: the skin as a neuroimmunoendocrine organ. Physiol Rev. 2006; 86:1309-79).
Particularmente, os nociceptores positivos para TRPV1 também regulam a longevidade e o metabolismo da pele, bem como a resposta imune ao longo do envelhecimento (Riera et al., TRPV1 pain receptors regulate longevity and metabolism by neuropeptide signaling. Cell 2014; 157, 1023-1036).
[004] Os neuropeptídeos produzidos pelos neurônios sensoriais que inervam a pele modulam a proliferação celular, a cicatrização de feridas, a pigmentação e a resposta imune inata dos queratinócitos. Sabe-se que os neuropeptídeos são capazes de estimular mediadores inflamatórios produzidos pelos queratinócitos, mas ainda há poucas informações sobre o(s) mecanismo(s), desse modo, a ativação neuropeptídica dos receptores da superfície celular dos queratinócitos, por fim, leva à regulação positiva desses mediadores.
[005] Os achados da interação entre queratinócitos e neurônios sensoriais periféricos (PSN) podem ajudar a tratar e/ou prevenir uma variedade de condições e distúrbios dermatológicos, por exemplo, a cicatrização de feridas e o envelhecimento da pele. Durante o envelhecimento da pele, uma diminuição na neurotroficidade, proliferação, diferenciação e número e taxa de neurites resultam em sensações e espessura da pele reduzidas. Assim, a restauração das terminações nervosas livres sensíveis deve restabelecer a neurossensibilização da pele e a espessura epidérmica, com aumento da troficidade em direção à epiderme, aumento da neuritogênese e, consequentemente, a inervação da pele.
[006] De acordo com o mencionado acima, o objetivo da presente invenção é fornecer uma neuropele na forma de um kit compreendendo um microdispositivo de co-cultura contendo neurônios sensoriais periféricos (PSN) e queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) em um meio de cultura de células adequado que permitem avaliar a interação entre terminações sensoriais livres e queratinócitos epidérmicos. Esse kit destina-se a estudar a biologia e farmacologia de terminações sensoriais livres e interação de queratinócitos epidérmicos e analisar possíveis novas drogas de interesse para a indústria cosmética.
[007] A presente invenção revela um kit novo e eficaz compreendendo um microdispositivo de co-cultura, neurônios sensoriais periféricos (PSN), queratinócitos epidérmicos humanos e um meio de cultura de células adequado que mimetiza a conexão entre terminações nervosas livres e queratinócitos epidérmicos na pele humana.
[008] Essa neuropele é vantajosamente usada em um método para analisar um composto ativo in vitro compreendendo as etapas de (a) fornecer o kit de acordo com a presente invenção e um composto de teste e (b) colocar em contato o referido composto de teste com o kit e medir a função sensorial periférico, em que medir a função consiste em medir a atividade de pelo menos um marcador neuronal.
[009] Além disso, a presente invenção também revela o uso do kit aqui definido para a realização de testes in vitro e para a produção de um produto cosmético.
[010] A Figura 1 mostra a imuno-histoquímica para (A) Nestina, (B) β-Tubulina III (TUJ1), (C) Periferina, (D) TRPV1, (E) Nav1 e (F) CGRP em células progenitoras de crista neural (NCPC) obtidas de células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC) e células-tronco neurais humanas (NSC). As células são positivas para todos os marcadores em ambas as condições.
[011] A Figura 2 mostra a quantificação de marcadores neuronais (A) Nestina, (B) β-Tubulina III (TUJ1), (C) Periferina, (D) TRPV1, (E) Nav1 e (F)
CGRP expressa por células progenitoras de crista neural (NCPC) obtidas a partir de células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC) e células- tronco neurais humanas (NSC).
[012] A Figura 3 mostra as células neurais 5 dias após o plaqueamento no microdispositivo de co-cultura cultivado com 20 µg/ml de laminina (A) e 5 µg/ml de laminina (B).
[013] A Figura 4 mostra agregados neuronais nos microdispositivos de co-cultura mais baixos (A) e mais altos (B).
[014] A Figura 5 mostra fotomicrografias de neurônios sensoriais periféricos (PSN) exibindo axônios saudáveis e a presença de cones de crescimento.
[015] A Figura 6 mostra imuno-histoquímica para (A) β-Tubulina III (TUJ1), (B) Periferina, (C) Núcleos corados com DAPI e (D) fusão.
[016] A Figura 7 mostra neurônios sensoriais periféricos (PSN) co-cultivados com queratinócitos no microdispositivo de co-cultura. Os neuritos migram através dos canalículos para a câmara de queratinócitos. Setas vermelhas indicam varicosidades.
[017] A Figura 8 mostra fotomicrografias mostrando a heterogeneidade celular observada após o protocolo de diferenciação. F: tipo fibroblasto, P: tipo neurônio piramidal, ?: morfologia não identificada.
[018] A Figura 9 mostra as neuroesferas obtidas a partir de células progenitoras de crista neural (NCPC).
[019] A Figura 10 mostra neuroesferas plaqueadas no dispositivo de co-cultura, exibindo heterogeneidade celular reduzida.
[020] A Figura 11 mostra o tropismo de neuritos das neuroesferas em relação aos queratinócitos epidérmicos humanos (HEK). A: microdispositivo de co-cultura. B: neuritos migrando das neuroesferas para a câmara de queratinócitos epidérmicos humanos (HEK). C: contato entre neuritos e queratinócitos epidérmicos humanos (HEK). D: presença de varicosidades.
[021] A Figura 12 mostra a imuno-histoquímica para β-Tubulina III (TUJ1, verde), Periferina (vermelho), Núcleos foram corados com DAPI.
[022] A Figura 13 mostra o microdispositivo de co-cultura com um orifício de perfuração médio adicionado. As setas vermelhas em A indicam o orifício perfurado. A seta azul mostra a linha desenhada para medir o crescimento de neuritos.
[023] A Figura 14 mostra a quantificação do crescimento de neuritos, dependendo das condições de cultura no microdispositivo de co- cultura.
[024] A Figura 15 mostra que o matrigel impede a migração de queratinócitos epidérmicos humanos (HEK). A: Células HEK cultivadas sobre matrigel são restritas à área do orifício (seta vermelha), B: Células HEK cultivadas sem matrigel podem ser vistas invadindo os canalículos do microdispositivo de co-cultura (seta azul).
[025] As células-tronco são células indiferenciadas definidas por sua capacidade, no nível de célula única, de se renovar e se diferenciar. As células-tronco podem produzir células descendentes, incluindo progenitores auto-renováveis, progenitores não renováveis e células diferenciadas terminalmente. As células-tronco também são caracterizadas por sua capacidade de diferenciar in vitro em células funcionais de várias linhagens celulares de múltiplas camadas germinativas (endoderme, mesoderme e ectoderme). As células-tronco também dão origem a tecidos de múltiplas camadas germinativas após o transplante e contribuem substancialmente para a maioria dos tecidos, se não todos, após a injeção em blastocistos. As células- tronco são classificadas por seu potencial de desenvolvimento.
[026] Como aqui utilizado, o termo “pluripotente” refere-se à capacidade de se desenvolver nas três camadas germinativas de desenvolvimento do organismo, incluindo endoderme, mesoderme e ectoderme.
[027] As características das células-tronco pluripotentes são bem conhecidas dos técnicos no assunto e características adicionais de células- tronco pluripotentes continuam a ser identificadas. Marcadores de células- tronco pluripotentes incluem, por exemplo, a expressão de um ou mais dos seguintes: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-
81. Em uma forma de realização, as células-tronco pluripotentes adequadas para uso na presente invenção expressam um ou mais dentre NANOG, SOX2, TRA-1-60 e TRA-1-81, e não possuem expressão de um marcador para marcadores neurais de diferenciação Islet1, BRN3A, periferina e TRPV1.
[028] O termo “células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC)”, como aqui utilizado, refere-se a uma célula-tronco induzida a partir de uma célula somática, por exemplo, uma célula somática diferenciada, e que possui uma potência maior que a referida célula somática. As células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC) são capazes de auto-renovação e diferenciação em células maduras, tais como as células progenitoras de crista neural (NCPC).
[029] O termo “neurônios sensoriais periféricos (PSN) humanos”, como aqui utilizado, refere-se aos principais tipos neuronais presentes nas camadas da pele, tais como derme e epiderme, interagindo com células e estruturas da pele, tais como queratinócitos epidérmicos, fibroblastos, melanócitos, glândulas sudoríparas, folículos capilares etc.
[030] “Cultura de células” ou “cultura” geralmente se referem a células retiradas de um organismo vivo e cultivadas sob condições controladas
(“em cultura” ou “cultivadas”). Uma cultura de células primária é uma cultura de células, tecidos ou órgãos retirados diretamente de um organismo antes da primeira subcultura. As células são expandidas em cultura quando são colocadas em um meio de crescimento sob condições que facilitam um ou ambos o crescimento e a divisão celular, resultando em uma população maior de células. Quando as células são expandidas em cultura, às vezes a taxa de proliferação celular é medida pela quantidade de tempo necessária para que as células dobrem de número (referido como tempo de duplicação).
[031] Um recipiente de cultura usado para cultivar a(s) célula(s)- tronco pode incluir, mas não está limitado particularmente a: balão, balão para cultura de tecidos, prato, placa de petri, prato para cultura de tecidos, prato múltiplo, recipiente de microcultura, placa de micropoços, placa múltipla, placa de vários poços, micro lâmina, lâmina de câmara, placa (schale), tubo, bandeja, saco de cultura e garrafa de roletes, desde que seja capaz de cultivar as células-tronco nele.
[032] O recipiente de cultura pode ser adesivo celular ou não adesivo e selecionado dependendo da finalidade. O recipiente de cultura de adesivo celular pode ser revestido com qualquer um dos substratos para adesão celular, como matriz extracelular (ECM), para melhorar a adesividade da superfície do recipiente às células. O substrato para adesão celular pode ser qualquer material destinado a anexar células-tronco ou células alimentadoras (se usado).
[033] As condições de cultura podem ser definidas adequadamente. Por exemplo, a temperatura de cultura pode ser de cerca de 30 a 40 °C e, de preferência, cerca de 37 °C, mas particularmente não se limita a ela. A concentração de CO2 pode ser de cerca de 1 a 10% e, preferencialmente, de cerca de 2 a 5%. A tensão de oxigênio pode ser de 1 a 10%.
[034] Diferenciação é o processo pelo qual uma célula não especializada (“não comprometida”) ou menos especializada adquire as características de uma célula especializada, tal como uma célula nervosa ou uma célula muscular. Uma célula diferenciada ou uma célula induzida por diferenciação é aquela que assumiu uma posição mais especializada (“comprometida”) na linhagem de uma célula. O termo “comprometido”, quando aplicado ao processo de diferenciação, refere-se a uma célula que prosseguiu no caminho da diferenciação até um ponto em que, em circunstâncias normais, continuará a se diferenciar em um tipo de célula específico ou subconjunto de tipos de células, e não pode, em circunstâncias normais, diferenciar-se em um tipo de célula diferente ou reverter para um tipo de célula menos diferenciado.
[035] Como aqui utilizado, o termo “inibidor” refere-se a um composto que reduz ou anula a função ou atividade biológica da via de sinalização recitada, interferindo em um alvo específico que faz parte dessa via de sinalização ou interferindo na interação entre dois ou mais alvos. Um inibidor pode executar qualquer um ou mais dos seguintes efeitos para reduzir ou anular a função ou atividade biológica da proteína a ser inibida: (i) a transcrição do gene que codifica a proteína a ser inibida é reduzida, ou seja, o nível de mRNA é reduzido, (ii) a tradução do mRNA que codifica a proteína a ser inibida é reduzida, (iii) a proteína desempenha sua função bioquímica com menor eficiência na presença do inibidor e (iv) a proteína executa sua função celular com eficiência reduzida na presença do inibidor.
[036] Tais compostos podem incluir, sem se limitar a, molécula pequena, peptídeo, peptidomimético, composto natural, siRNA, ácido nucleico anti-senso, aptâmero ou anticorpo.
[037] Em outras palavras, um inibidor é qualquer composto ou molécula que altera qualquer atividade de uma proteína nomeada (molécula de sinalização, qualquer molécula envolvida na molécula de sinalização nomeada,
uma molécula associada nomeada, tal como uma glicogênio sintase quinase 3β (GSK3β), por exemplo, por meio do contato direto com a sinalização SMAD, contato com o mRNA SMAD, causando alterações conformacionais de SMAD, diminuindo os níveis de proteína de SMAD ou interferindo nas interações de SMAD com os parceiros de sinalização e afetando a expressão dos genes-alvo de SMAD.
[038] Os inibidores também incluem moléculas que regulam indiretamente a atividade biológica de SMAD, interceptando moléculas de sinalização a montante (por exemplo, dentro do domínio extracelular, exemplos de uma molécula de sinalização e um efeito incluem: Noggin que sequestra proteínas morfogênicas ósseas, inibindo a ativação de receptores ALK 1, 2, 3 e 6, impedindo assim a ativação de SMAD a jusante. Da mesma forma, Chordin, Cerberus, Follistatin, sequestram de maneira semelhante os ativadores extracelulares da sinalização SMAD. Bambi, uma proteína transmembranar, também atua como um pseudo-receptor para sequestrar moléculas de sinalização extracelulares de TGFβ. Os anticorpos que bloqueiam ativinas, nodal, TGFβ e BMPs são contemplados para uso para neutralizar ativadores extracelulares de sinalização SMAD e similares).
[039] O termo “mitógenos”, como aqui utilizado, refere-se aos compostos que são membros da família de fatores de crescimento de fibroblastos, tais como FGF-2 (FGF básico) e FGF-4. Também exemplificativo é o fator de crescimento epidérmico (EGF), homólogos funcionais e outros fatores que se ligam ao receptor de EGF. Outros fatores de crescimento candidatos são fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF). Esses mitógenos são usados para aumentar o número de células de uma linhagem, fazendo com que elas proliferem ainda mais em uma cultura.
[040] “Fatores neurotróficos” são peptídeos endógenos,
encontrados no sistema nervoso ou em tecidos não nervosos inervados pelo sistema nervoso, que funcionam para promover a sobrevivência e manter a diferenciação fenotípica do nervo e/ou células gliais. A família de fatores tróficos, denominada neurotrofinas, atualmente inclui o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF), neurotrofina-3 (NT- 3), NT-4/5 e NT-6. Todos os fatores neurotróficos podem ser usados isolados ou em combinação.
[041] As quantidades preferidas de cada fator neurotrófico a ser empregado estão entre cerca de 1 ng/ml e cerca de 25 ng/ml, mais preferencialmente entre cerca de 5 ng/ml e cerca de 15 ng/ml, mais preferencialmente cerca de 10 ng/ml.
[042] Como aqui utilizado, a expressão “indutor de diferenciação” refere-se ao ácido ascórbico (AA).
[043] As quantidades preferidas do indutor de diferenciação a ser empregado estão entre cerca de 50 µM e cerca de 500 µM, mais preferencialmente entre cerca de 100 µM e cerca de 300 µM, mais preferencialmente cerca de 200 µM.
[044] Como aqui utilizado, a expressão “indutor de transdução celular” refere-se a um composto que medeia a transdução de sinal, como, por exemplo, cAMP.
[045] As quantidades preferidas do indutor de transdução celular a ser empregue estão entre cerca de 0,01 mM e cerca de 1 mM, mais preferencialmente entre cerca de 0,1 mM e cerca de 0,8 mM, mais preferencialmente cerca de 0,5 mM.
[046] “Marcadores”, como aqui utilizados, são moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeo que são diferencialmente expressas em uma célula de interesse. Neste contexto, expressão diferencial significa um nível aumentado para um marcador positivo e um nível diminuído para um marcador negativo em comparação com uma célula indiferenciada. O nível detectável do ácido nucleico ou polipeptídeo marcador é suficientemente mais alto ou mais baixo nas células de interesse em comparação com outras células, de modo que a célula de interesse possa ser identificada e distinguida de outras células usando qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
[047] Como aqui utilizado, uma célula é “positiva para” um marcador específico ou “positiva” quando o marcador específico é suficientemente detectado na célula. Da mesma forma, a célula é “negativa para” um marcador específico ou “negativa” quando o marcador específico não é suficientemente detectado na célula.
[048] Como aqui utilizado, o termo “ativador” “ativando” refere-se a compostos para ativar moléculas, resultando na diferenciação direcionada de células da presente invenção. Ativadores exemplares incluem, mas não estão limitados a: calor/ frio nocivos, estímulo mecânico, estímulos químicos (mentol, piperina, capsaicina aguda, cinamaldeído, resiniferatoxina, bradicinina, ATP, prostaglandinas, citocinas inflamatórias, solução salina ácida, fator de crescimento de fibroblastos (FGF) etc).
[049] Os compostos ativos, como aqui referido, referem-se a ingredientes cosméticos conhecidos, ativos dermatológicos e biológicos, tais como neuromoduladores, compostos antienvelhecimento, reguladores de neuroenvelhecimento, para controlar a taxa e densidade de crescimento de terminações nervosas livres, condutância elétrica ao longo das camadas da pele, potencial de ação desencadeante em neurônios sensoriais periféricos, aumentar a interação entre esses neurônios e outros tipos de células da pele como queratinócitos, fibroblastos e melanócitos, adipócitos, células do folículo piloso, glândulas, cartilagens, células-tronco etc.
[050] Como referido neste documento, os canais TRP (receptor de potencial transitório) compreendem uma família diversa de canais catiônicos dependentes de ligantes, principalmente não seletivos, que são expressos de maneira robusta nos sistemas sensoriais de todas as espécies (Nilius & Szallasi, Transient receptor potential channels as drug targets from the science of basic research to the art of medicine. Pharmacol Rev 2014; 66(3): 676 - 814).
Destes, o TRPV1 é o mais bem estudado e considerado o canal prototípico de TRP presente nos neurônios somatossensoriais (Basbaum et al., Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell; 2009; 139:267-284). O TRPV1 pode ser diretamente bloqueado por moléculas externas como capsaicina, resiniferatoxina e piperina, e também modulado de forma positiva ou negativa via ativação de outros receptores e sistemas de segundo mensageiro, como hidrólise de PIP2 e fosforilação de PKC (Julius, TRP channels and pain. Annu Rev Cell Dev Biol. 2013; 29:355-84). Um dos receptores que parece inibir a ativação de TRPV1 é o receptor canabinóide 1 (CB1), também presente nos neurônios somatossensoriais (Julius & Basbaum, Molecular mechanisms of nociception. Nature. 2001; 413:203- 210). Entretanto, um agonista endógeno de CB1, anandamida, também é um agonista de TRPV1, embora com um EC50, uma ordem de grandeza maior neste último (Zygmunt et al., Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide.
Nature. 1999; 400:452-457).
[051] A substância P (SP) é um membro neuropeptídeo da família das taquiquininas, sintetizado por neurônios sensoriais que emitem suas extensões do DRG para as camadas mais superficiais da pele, mediando a comunicação entre neurônios periféricos e queratinócitos epidérmicos (Ribeiro- da-Silva & Hokfelt, Neuroanatomical localization of Substance P in the CNS and sensory neurons. Neuropeptides. 2000; 34:256-271). A maioria dos neurônios que liberam a substância P é sensível à capsaicina, destacando a importância da expressão de TRPV1 e da interação dos neurônios sensoriais-queratinócitos sensoriais.
[052] A presente invenção é direcionada a um kit novo e específico que compreende: (i) um microdispositivo de co-cultura; (ii) neurônios sensoriais periféricos (PSN); (iii) queratinócitos epidérmicos humanos (HEK); e (iv) um meio de cultura de células.
[053] De acordo com a presente invenção, os neurônios sensoriais periféricos (PSN) são derivados de células-tronco neurais (NSC) humanas ou células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC). De preferência, os neurônios sensoriais periféricos (PSN) são derivados de células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC).
[054] Os neurônios sensoriais periféricos (PSN) derivados de hiPSC podem ser obtidos por qualquer método conhecido na técnica. Em uma forma de realização preferida, o método de induzir diferenciação a neurônios sensoriais periféricos (PSN) compreende as etapas de colocar em contato células-tronco humanas, tais como células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC) com pelo menos um inibidor da via SMAD, em um meio de indução neural, para produzir células primariamente diferenciadas, tais como células progenitoras de crista neural (NCPC), e obter disto os neurônios sensoriais periféricos (PSN) humanos cultivando as células primariamente diferenciadas com pelo menos um mitogênio, um fator neurotrófico, um indutor de diferenciação e um indutor de transdução celular.
[055] Em uma forma de realização preferida, os neurônios sensoriais periféricos (PSN) são induzidos a formar espontaneamente neuroesferas durante a maturação dos neurônios, a fim de reduzir a heterogeneidade das culturas.
[056] O meio de cultura de células da presente invenção é qualquer meio adequado adaptado para ambos os tipos de células, isto é, para neurônios sensoriais periféricos (PSN) e queratinócitos epidérmicos humanos.
Em uma forma de realização preferida, o meio de cultura de células é um meio 3N, em particular, um meio 3N compreendendo uma mistura 1:1 de meio contendo N2 e meio contendo B27.
[057] Em uma forma de realização preferida, o meio contendo N2 compreende DMEM/F12 suplementado com suplemento N2 (GIBCO), insulina, L-glutamina, aminoácidos não essenciais (NEAA), β-mercaptoetanol, penicilina e estreptomicina. Em uma forma de realização preferida, o meio contendo B27 compreende meio neurobasal (Invitrogen) suplementado com suplemento B27 (GIBCO), L-glutamina, penicilina e estreptomicina.
[058] De preferência, o meio 3N é suplementado com inibidores de sinalização NGF, TGFβ e/ou BMP para produzir um meio de indução neural.
[059] Em uma forma de realização preferida, o meio de cultura de células é fornecido com um gradiente médio entre os dois tipos de células.
[060] De acordo com a presente invenção, o microdispositivo de co-cultura é um dispositivo microfluídico contendo vários microcanais, dentro dos quais os neurônios sensoriais periféricos (PSN) crescem em ordem, permitindo uma boa conexão com os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK). Vantajosamente, o microdispositivo de co-cultura é usado na configuração horizontal para fornecer melhores condições de cultura para conectar os neurônios aos queratinócitos.
[061] Em uma forma de realização preferida, o microdispositivo de co-cultura é um microchip para cultura de células feito de silicone biocompatível e compreendendo quatro a vinte câmaras independentes, em que tipos de células da pele, tais como os neurônios sensoriais periféricos (PSN) e queratinócitos epidérmicos humanos (HEK), são plaqueados alternativamente em cada lado das câmaras independentes, possuindo um diâmetro de canal que permite o alongamento axonal e o crescimento de neuritos através dos microcanais entre câmaras no chip, enquanto evita a migração do corpo celular para a outra câmara e a invasão do espaço de compartimento celular co-cultivado.
[062] De preferência, o microdispositivo de co-cultura compreende um orifício em que os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) são plaqueados.
[063] Ainda em uma forma de realização preferida, o microdispositivo de co-cultura é coberto com matrigel ou laminina ou poli- ornitina ou colágeno para criar um microambiente adequado para cada tipo de célula e para impedir a migração das células humanas para outro compartimento, bem como para permitir o crescimento neuronal que fornece pistas mecânicas que induzem o destino neuronal das células progenitoras de crista neural (NCPC) ou células progenitoras neuronais (NPC) e queratinócitos epidérmicos (HEK) através das câmaras do dispositivo.
[064] Outro objetivo da presente invenção refere-se a um método para analisar um composto ativo in vitro compreendendo: a) o fornecimento de: (i) um kit como aqui definido; (ii) um composto de teste; e (b) colocar em contato o referido composto de teste com o kit e medir a função dos neurônios sensoriais periféricos, em que medir a função consiste em medir a atividade de pelo menos um marcador neuronal.
[065] De preferência, o composto ativo analisado pelo método da presente invenção atua, por exemplo, na modulação do crescimento neuronal, número de terminações nervosas, atividade neuronal e regeneração epidérmica. Mais preferencialmente, a modulação da atividade neuronal é mediada pela indução da liberação do fator de crescimento por queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) e a regeneração epidérmica é mediada pela modulação da liberação neuronal de fatores.
[066] Em uma forma de realização preferida, o composto ativo analisado pelo método da presente invenção é para tratar e/ou prevenir, por exemplo, dermatite atópica, pele sensível, impactos de fotoenvelhecimento e fotopoluição, neuroenvelhecimento, cicatrização de feridas, função de barreira cutânea controlada por neurônios, coceira, mecano-sensorialidade cutânea e espessura epidérmica em pele envelhecida.
[067] Um outro objetivo da presente invenção é o uso do kit, conforme definido aqui, para a realização de testes in vitro, de preferência testes para analisar um composto ativo que atua, por exemplo, na modulação do crescimento neuronal, número de terminações nervosas, atividade neuronal e regeneração epidérmica. Mais preferencialmente, a modulação da atividade neuronal é mediada pela indução da liberação do fator de crescimento por queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) e a regeneração epidérmica é mediada pela modulação da liberação neuronal de fatores.
[068] Em uma forma de realização preferida, o uso do kit da presente invenção é para analisar um composto ativo para tratar e/ou prevenir, por exemplo, dermatite atópica, pele sensível, impactos de fotoenvelhecimento e fotopoluição, neuroenvelhecimento, cicatrização de feridas, função de barreira cutânea controlada por neurônios, coceira, mecano-sensorialidade cutânea e espessura epidérmica em pele envelhecida.
[069] Foi surpreendente e inesperadamente descoberto que o kit novo e específico que compreende um microdispositivo de co-cultura, neurônios sensoriais periféricos (PSN), queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) e um meio de cultura de células da presente invenção permite que os neurônios sensoriais periféricos (PSN) cresçam ordenadamente e conectem-se com os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK), de modo a mimetizar a conexão entre terminações nervosas sensoriais livres e queratinócitos epidérmicos (HEK) na pele humana.
[070] Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar a invenção com referência a algumas formas de realização preferidas, sem se limitar aos detalhes mostrados. Em vez disso, várias modificações podem ser feitas nos detalhes sem se afastar do escopo da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[071] As células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC) foram cultivadas em meio Essential 8 (Thermo Fisher Scientific, EUA) em placas revestidas com matrigel (BD Biosciences) em condições de cultura padrão (37 °C, 5% de CO2). As colônias foram divididas usando EDTA 0,5 mM (Thermo Fisher Scientific, EUA) a cada 4-5 dias. As culturas de células iPS humanas na confluência de 40-70% foram usadas para indução de NCPC.
hiPSCs foram expostas por 10 dias a meio de indução 3N quimicamente definido (DMEM + meio neurobasal 50:50 v/v, 1% de Glutamax, 0,5% de N2, 1% de B27, 0,5% de NEAA, β-mercaptoetanol a 55 mM e 1% de penicilina/estreptomicina, todas da Thermo Fisher Scientific, EUA), recentemente suplementado com três compostos de moléculas pequenas. A adição destes compostos foi a seguinte: dia 1: LDN 500 nM (Stemgen, EUA) + SB 10 µM (Sigma Aldrich, EUA); dia 2: LDN 500 nM + 10 µM de SB + 3 µM de CHIR (Tocris Bioscience, EUA); dia 3: 10 µM de SB +3 µM de CHIR. Nos dias 4, 6 e 8, o meio foi suplementado apenas com 3 µM de CHIR. Após 10 dias de diferenciação, as NCPCs foram posteriormente cultivadas em meio de expansão (meio 3N recentemente suplementado com 10 ng/ml de βFGF e 10 ng/ml de EGF, ambos da Thermo Fisher Scientific, EUA). No dia 11, as NCPCs foram passadas enzimaticamente (passagem 0) usando Accutase (Merck Millipore, EUA) por 2-3 minutos a 37 °C e divididas 1:3 em placas revestidas com poli-L-ornitina (100 ug/ml, Sigma Aldrich, EUA)/ laminina (20 µg/ml, Thermo Fisher Scientific, EUA) e cultivadas até confluência. O meio foi substituído a cada dois dias. Quando 70-100% de confluência foi atingida (normalmente 24-48 horas após a passagem 0), as células foram novamente passadas e cultivadas em um recipiente de cultura em densidades específicas: 1 x 106 células por placa de 60 mm ou 3 x 106 células por placa de 100 mm. O inibidor ROC 10 µM (Merck Millipore, EUA) foi adicionado no dia da passagem e removido 24 horas depois.
[072] As culturas de células progenitoras de crista neural (NCPC) com aproximadamente 80% de confluência (geralmente no dia 13) foram usadas para diferenciação neuronal. Resumidamente, as células foram mantidas por aproximadamente 23 dias em meio de indução neural contendo os seguintes fatores de diferenciação: AMPc 0,5 mM (Sigma Aldrich, EUA), AA 200 µM (Sigma Aldrich, EUA), 10 ng/ml de NT-3 (R&D Systems, EUA), 10 ng/ml de NGF (R&D Systems, EUA), 10 ng/ml de BDNF (R&D Systems, EUA) e 10 ng/ml de GDNF (R&D Systems, EUA). O meio foi substituído a cada 3-4 dias. Os neurônios foram divididos enzimaticamente (se necessário) usando Accutase (Merck Millipore, EUA) por 3-5 minutos a 37 °C em placas de Poli-L- ornitina/ Laminina preparadas recentemente. A adição do inibidor ROCK 10 µM (Merck Millipore, EUA) foi aplicada em todas as passagens para aumentar a capacidade de sobrevivência e ligação dos neurônios. No dia 35, aproximadamente, os neurônios foram coletados e cultivados em um recipiente de cultura para análise e/ou experimentos posteriores.
[073] Os queratinócitos epidérmicos humanos neonatais (HEKn) foram obtidos da Cascade Biologies (Portland, OR) e cultivados em meio isento de soro EpiLife (ThermoFischer). As células foram cultivadas em um recipiente de cultura a 10.000 células por poço. Os recipientes de cultura previamente tratados com gelatina (Sigma) e meio EpiLife (Thermo Fisher Scientific) se dividiram quando 70% a 75% de confluência durante 48 horas de condicionamento e, em seguida, foram coletados, adicionados frescos ao meio de neurônios e centrifugados para se livrar de fragmentos e células mortas.
[074] No dia 35 da diferenciação neural, os neurônios sensoriais periféricos foram coletados e cultivados em um recipiente de cultura a 30.000 células por poço em recipientes de cultura revestidos com poli-L-ornitina/ laminina de 96 poços (Perkin-Elmer, EUA) por mais dois, cinco e dez dias sob as seguintes condições: em co-cultura com células HEKn em meio de indução neural padrão; e sem células HEKn, mas com adição de meio condicionado com HEKn em três proporções diferentes (25, 50 e 75%). Os meios condicionados foram trocados a cada 3 dias.
EXEMPLO 2 COMPARAÇÃO ENTRE NCPCS OBTIDAS DE IPS E CÉLULAS-TRONCO NEURAIS (NSC)
[075] As células progenitoras de crista neural (NCPC) obtidas a partir de hiPSC e NSC foram cultivadas em recipientes de cultura de 96 poços e fixadas com paraformaldeído a 4%, permeabilizadas com Triton X-100 e bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) a 3%. As células foram incubadas por 2 horas com anticorpos primários diluídos em BSA a 3%. Após a lavagem com PBS, os anticorpos secundários conjugados foram adicionados por 40 minutos no escuro, lavados cuidadosamente com PBS, seguidos de uma incubação de 5 minutos com DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol) para coloração nuclear. Após enxágue com PBS e água, 50 µl de glicerol foram adicionados como meio de montagem e os recipientes de cultura foram selados com adesivo de alumínio antes da análise. Os anticorpos primários utilizados foram: Nestina (1:100, Sigma-Aldrich, EUA), anti-β-tubulina III (1:200, Merck- Millipore, Alemanha), anti-periferina (1:250, Santa Cruz Biotechnology), anti- TRPV1 (1:1000, Abcam), anti-Nav1 (1:1000, Abcam), anti-CGRP (1:250, Santa Cruz Biotechnology). Os anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 594 (1:400, Life Technologies, EUA) foram incubados por 40 minutos protegidos da luz. Os núcleos foram corados com 0,5 µg/ml de 4’-6- diamino-2-fenilindol (DAPI) por 5 minutos. As imagens foram adquiridas usando um microscópio de triagem de alto conteúdo, Operetta (PerkinElmer, EUA) e as análises foram realizadas usando o software de análise de imagem de alto conteúdo Harmony 5.1 (PerkinElmer, EUA).
[076] As células-tronco neurais (NSCs) são produzidas a partir de células iPS e podem ser diferenciadas em neurônios e células gliais. Elas são fáceis de manusear e podem passar por vários ciclos de congelamento/ descongelamento sem perder a capacidade de se diferenciar. A obtenção de NCPCs a partir de NSCs pode evitar uma possível perda de eficiência na diferenciação de NCPCs pós-descongelamento.
[077] A expressão dos marcadores neurais: Nestina, β-Tubulina III (TUJ1), Periferina, TRPV1, Nav1 e CGRP em NCPCs derivados de iPS e de NSC foi comparada. Inicialmente, os resultados sugeriram que ambos apresentam padrões de expressão semelhantes, confirmando seu destino de células-tronco neurais (Figura 1). No entanto, foram observadas algumas diferenças quando os marcadores imunológicos foram quantificados (Figura 2).
EXEMPLO 3 ESTRATÉGIAS PARA AUMENTAR A MATURIDADE DE PSN IN VITRO E EM CO-CULTURA
[078] Alguns microdispositivos de co-cultura foram testados e vários parâmetros descritos a seguir foram ajustados para encontrar a melhor configuração para o crescimento de PSN e subsequente co-cultura com HEK.
[079] A diferenciação neuronal requer o uso de matrizes extracelulares capazes de permitir seu desenvolvimento e migração, como a laminina. 20 µg/ml de laminina são normalmente usados em protocolos convencionais. Essa concentração, no entanto, causou entupimento dos canalículos dos microdispositivos e desorganização no crescimento de neuritos (Figura 3A). Após ajustar a concentração de laminina para 5 µg/ml, os neuritos cresceram 11 µm em 5 dias, seguindo um caminho reto (Figura 3B).
[080] A segunda etapa foi adaptar o microdispositivo ao modelo celular particular da presente invenção. O protocolo de diferenciação promove a formação de agregados dos quais os neurônios migram. Os primeiros microdispositivos não permitiram a entrada de agregados, reduzindo o número final de neurônios (Figura 4A). A mudança de altura permitiu a entrada de agregados e a distribuição uniforme de neurônios no microdispositivo (Figura 4B).
[081] Posteriormente, foi realizado o co-cultivo de PSN com queratinócitos. Essas células, no entanto, não se adaptaram bem ao meio neuronal. Assim, as PSNs foram cultivadas com meio condicionado a queratinócitos, o que promoveu aumento no número de processos neuronais e expressão mais abundante de marcadores como TRPV1.
[082] Nesse teste, diferentes proporções de meio neuronal são misturadas com o meio queratinócito. A combinação consistindo em 75% de meio queratinócito e 25% de meio neuronal pareceu ser suficiente para manter os neurônios viáveis e saudáveis (Figura 5).
[083] Quando cultivados sob essas condições, os neurônios também são positivos para β-Tubulina III (TUJ1) e periferina (Figura 6).
[084] Depois disso, foi testado o plaqueamento de cada tipo de célula em momentos diferentes (por exemplo, PSNs e, em seguida, queratinócitos e vice-versa), bem como modificações no fluxo entre as câmaras. Observou-se que os neurônios emitiram seus processos para a câmara de queratinócitos, sugerindo interação entre as células (Figura 7). É interessante notar que os neurônios apresentaram varicosidades (setas vermelhas), uma característica encontrada em biópsias de pele (Cauna, 1980; McCarthy, B.G. et al., 1995; Talagas et al., 2018). Resulta do intenso transporte de vesículas, realizado principalmente por essas células.
EXEMPLO 4
[085] Recentemente, Schwartzentruber et al. (2017) realizaram um estudo em larga escala com 123 procedimentos de diferenciação de neurônios sensoriais de células iPS. Eles observaram heterogeneidade celular em cada diferenciação. De fato, as células iPS mostraram um maior grau de variabilidade do que as células-tronco embrionárias, embora tenham sido capazes de gerar os mesmos tipos de células no mesmo tempo (Hu BY et al., 2010).
[086] No protocolo da presente invenção, também foi observada variabilidade na morfologia das células variando em proporção para cada diferenciação (Figura 8).
[087] Em uma tentativa de reduzir a heterogeneidade de culturas, foram adotadas estratégias utilizadas em outros protocolos para diferenciação neuronal. Após a produção de NCPCs, a formação de neuroesferas foi induzida, tais neuroesferas foram formadas espontaneamente à medida que os neurônios amadureceram, apesar da heterogeneidade. Portanto, concluiu-se que, ao controlar a formação da neuroesfera, a heterogeneidade pode ser reduzida, facilitando potencialmente a diferenciação. A densidade celular é um fator crucial para a formação correta de neuroesferas. Assim, duas quantidades de células, 9x103 e 18x103, foram usadas e descobriu-se que a menor quantidade formou as neuroesferas saudáveis e mais homogêneas, com rendimento muito semelhante (Figura 9).
EXEMPLO 5
[088] Após a diferenciação bem-sucedida das neuroesferas, conforme descrito, elas foram plaqueadas e, como esperado, houve uma redução no número de células contaminantes e uma migração exuberante de neuritos (Figura 10). Além disso, houve uma redução de 2 semanas no tempo de diferenciação.
[089] Depois disso, foi utilizado o microdispositivo de co-cultura com 4 câmaras independentes. As neuroesferas (NS) e os queratinócitos (K) foram plaqueados alternadamente (Figura 11A). Observou-se que neuritos das neuroesferas se moviam em direção à câmara de queratinócitos (Figura 11B).
Após a remoção do microdispositivo, foram observadas regiões de contato entre neuritos e queratinócitos e a existência de varicosidades sugerindo interação entre as células (Figuras 11C-D).
[090] Os neurônios obtidos das neuroesferas de NCPCs são positivos para periferina, apresentam varicosidades e tropismo para queratinócitos (Figura 12).
[091] Os queratinócitos se moveram mais rápido que os dendritos e, como remover o microdispositivo às vezes significava que as neuroesferas eram puxadas do substrato, um orifício entre os poços do mesmo par foi perfurado e os queratinócitos foram colocados dentro desse orifício (Figura 13A, seta vermelha). A região onde houve predominância de neuritos migrantes foi observada e o maior raio de migração foi medido (Figura 13B, seta azul).
[092] Para testar ainda mais este microdispositivo de co-cultura modificado, o meio de cultura (3N versus 75% de CM de HEKn) e a presença (ou não) de matrigel no orifício médio foram comparados medindo-se a extensão máxima dos neuritos emergentes das neuroesferas (Figura 14A). Não houve diferenças estatisticamente significantes. Em seguida, foram comparadas as extensões de neuritos na presença ou ausência de queratinócitos no orifício. Novamente, nenhuma diferença foi observada (Figura 14B). Finalmente, outra variável foi testada: adicionar ou não NGF ao matrigel no orifício perfurado médio. Embora não tenha sido alcançada significância estatística na comparação dos tratamentos, ficou evidente a tendência do NGF de aumentar a migração, principalmente entre o meio 3N (primeira e segunda barra do gráfico) e os grupos com 75% de CM mais HEKn (quinta e última barra) (Figura 14C).
[093] Também foi notado que o matrigel impedia a HEK de sair do orifício (Figura 15A). Na ausência de matrigel, a HEK tende a migrar através do dispositivo (Figura 15B).
Claims (26)
1. KIT, caracterizado por compreender (i) um microdispositivo de co-cultura, (ii) neurônios sensoriais periféricos (PSN), (iii) queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) e (iv) um meio de cultura de células.
2. KIT, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos neurônios sensoriais periféricos (PSN) serem derivadas de células-tronco humanas pluripotentes induzidas (hiPSC).
3. KIT, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelos neurônios sensoriais periféricos (PSN) serem induzidos a formar espontaneamente neuroesferas durante a maturação dos neurônios.
4. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo meio de cultura de células ser um meio 3N compreendendo uma mistura 1:1 de meio contendo N2 e meio contendo B27.
5. KIT, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo meio contendo N2 compreender DMEM/F12 suplementado com suplemento N2, insulina, L-glutamina, aminoácidos não essenciais (NEAA), b- mercaptoetanol, penicilina e estreptomicina.
6. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 5, caracterizado pelo meio contendo B27 compreender meio neurobasal suplementado com suplemento B27, L-glutamina, penicilina e estreptomicina.
7. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo meio de cultura de células ser suplementado com inibidores de sinalização de TGFβ e BMP para produzir um meio de indução neural.
8. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo meio de cultura de células ser fornecido com um gradiente médio entre os dois tipos de células.
9. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo microdispositivo de co-cultura ser um dispositivo microfluídico contendo microcanais.
10. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelos neurônios sensoriais periféricos (PSN) crescerem horizontalmente dentro dos microcanais do microdispositivo de co-cultura.
11. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo microdispositivo de co-cultura ser um microchip para cultura de células feito de silicone biocompatível e compreendendo quatro a vinte câmaras independentes, em que os neurônios sensoriais periféricos (PSN) e queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) são plaqueados, alternativamente, em cada lado das câmaras independentes.
12. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo microdispositivo de co-cultura compreender um orifício em que os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) são plaqueados.
13. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo microdispositivo de co-cultura ser coberto com matrigel ou laminina ou poli-ornitina ou colágeno para criar um microambiente adequado para cada tipo de célula e impedir a migração das células humanas para outro compartimento.
14. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelos neurônios sensoriais periféricos (PSN) se conectarem com os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) co-cultivados mimetizando a conexão entre terminações nervosas livres e queratinócitos epidérmicos na pele humana.
15. MÉTODO PARA ANALISAR UM COMPOSTO ativo in vitro, caracterizado por compreender: a) o fornecimento de: (i) um kit, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14;
(ii) um composto de teste; e (b) colocar em contato o referido composto de teste com o kit e medir a função dos neurônios sensoriais periféricos, em que medir a função consiste em medir a atividade de pelo menos um marcador neuronal.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo composto ativo atuar na modulação do crescimento neuronal, número de terminações nervosas, atividade neuronal, regeneração epidérmica, entre outros.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela modulação da atividade neuronal ser mediada pela indução da liberação do fator de crescimento por queratinócitos epidérmicos humanos (HEK).
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela regeneração epidérmica ser mediada pela modulação da liberação neuronal de fatores.
19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo composto ativo ser para tratar e/ou prevenir dermatite atópica, pele sensível, impactos de fotoenvelhecimento e fotopoluição, neuroenvelhecimento, cicatrização de feridas, função de barreira cutânea controlada por neurônios, coceira, mecano-sensorialidade cutânea, espessura epidérmica em pele envelhecida, entre outros.
20. USO de um kit, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para realizar testes in vitro.
21. USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo teste in vitro ser realizado para analisar um composto ativo.
22. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 21, caracterizado pelo composto ativo atuar na modulação do crescimento neuronal, número de terminações nervosas, atividade neuronal, regeneração epidérmica, entre outros.
23. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela modulação da atividade neuronal ser mediada pela indução da liberação do fator de crescimento por queratinócitos epidérmicos humanos (HEK).
24. USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pela regeneração epidérmica ser mediada pela modulação da liberação neuronal de fatores.
25. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo composto ativo ser para tratar e/ou prevenir dermatite atópica, pele sensível, impactos de fotoenvelhecimento e fotopoluição, neuroenvelhecimento, cicatrização de feridas, função de barreira cutânea controlada por neurônios, coceira, mecano-sensorialidade cutânea, espessura epidérmica em pele envelhecida, entre outros.
26. USO de um kit, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para produzir um produto cosmético.
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