BR112020022239A2

BR112020022239A2 - composições nutricionais, método para fornecer nutrição para um sujeito humano em risco de desenvolver ou que sofre de alergia, método (não terapêutico) e uso de um hidrolisado de proteína

Info

Publication number: BR112020022239A2
Application number: BR112020022239-9A
Authority: BR
Inventors: Joost Willem Gouw; Laura Antoinette Petronella Maria Meulenbroek; Juandy Jo; Leon Matthieu Johannes Knippels; Johan Garssen
Original assignee: N.V. Nutricia
Priority date: 2018-04-30
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2021-02-02
Also published as: AU2019264096A2; US20210227868A1; EP3787418A1; AU2019264096A1; EP3787418B1; CN117137148A; WO2019212331A8; WO2019212331A1; CN112367860A; PH12020551770A1; WO2019212329A1; CN112367860B

Abstract

  COMPOSIÇÕES NUTRICIONAIS, MÉTODO PARA FORNECER NUTRIÇÃO PARA UM SUJEITO HUMANO EM RISCO DE DESENVOLVER OU QUE SOFRE DE ALERGIA, MÉTODO (NÃO TERAPÊUTICO) E USO DE UM HIDROLISADO DE PROTEÍNA. Uma fórmula que compreende um hidrolisado de proteína de soro do leite compreendendo peptídeos derivados de beta-lactoglobulina e probióticos para indução de tolerância imune oral à proteína do leite, prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite, e/ou redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite.

Description

COMPOSIÇÕES NUTRICIONAIS, MÉTODO PARA FORNECER NUTRIÇÃO PARA UM SUJEITO HUMANO EM RISCO DE DESENVOLVER OU QUE SOFRE DE ALERGIA, MÉTODO (NÃO TERAPÊUTICO) E USO DE UM

HIDROLISADO DE PROTEÍNA Campo da Invenção

[001] A invenção é no campo de fórmulas que compreendem proteína hidrolisada do leite de vaca para lactentes que sofrem de alergia ou estão em risco de desenvolver alergia à proteína do leite de vaca. Antecedentes

[002] Proteínas dietéticas são expostas ao sistema imune no trato gastrointestinal. Como um padrão de resposta do sistema imune, é desenvolvida tolerância oral para estas proteínas de alimentos inócuos. O desenvolvimento de tolerância imune oral é altamente presente em lactentes, que ficam expostos a inúmeras proteínas inofensivas no início da vida pela exposição a proteínas dietéticas. Se ocorrer um descarrilhamento desta resposta natural para proteínas inofensivas, ocorrerá alergia alimentar. É geralmente aceito que a prevalência de alergia alimentar tem sido crescente nas últimas décadas, em particular, em países ocidentalizados. No início da vida, a alergia ao leite de vaca é a alergia alimentar mais dominante, atualmente com 2 a 5% dos lactentes que sofrem de alergia ao leite de vaca e uma porcentagem mais alta está em risco de desenvolver a alergia.

[003] Para lactentes que sofrem de alergia à proteína do leite de vaca, estão no mercado fórmulas infantis que compreendem proteínas extensamente hidrolisadas (hidrolisado extensivo de proteína) ou até mesmo unicamente aminoácidos livres como fonte de nitrogênio. Nestas fórmulas, pouca ou nenhuma proteína ou peptídeos alérgicos estão presentes.

[004] Lactentes nascidos de pais que um ou ambos sofrem de uma doença atópica, ou que tenham um ou mais irmãos que sofrem de uma doença atópica, têm um risco mais alto de se tornarem alérgicos a proteínas dietéticas. Para este grupo, além do aleitamento preferencial, estão disponíveis fórmulas GED - 5269958v1 hipoalergênicas no mercado, que compreendem um hidrolisado parcial de proteína (proteínas parcialmente hidrolisadas). Estas proteínas parcialmente hidrolisadas têm uma alergenicidade diminuída. Esta abordagem tem sido demonstrada ser eficiente a fim de evitar a sensibilização por proteínas nativas presentes nas fórmulas adaptadas. Tipicamente, o grau de hidrólise de proteínas é menor que o de proteínas extensamente hidrolisadas para lactentes que já sofrem de alergia. Estas formulações têm a vantagem de não só reduzir o risco de desenvolver uma resposta alérgica, prevenindo a sensibilização à proteína, mas também apoiando o desenvolvimento natural de tolerância imune oral às proteínas intactas. Isto traz a vantagem de que mais tarde a proteína nativa pode ser introduzida na dieta, com um risco reduzido de reações alérgicas.

[005] A rigorosa evitação de alérgeno para a prevenção e gestão de sensibilidade alergênica tem sido aconselhada por muitas décadas. Um foco na evitação completa de alérgeno alimentar pode ter contribuído inadvertidamente para um aumento na alergia alimentar nas últimas décadas. A melhor maneira para prevenir ou tratar alergia é desenvolver estratégias que promovam a indução de tolerância oral de alérgenos, como terapia imune oral ou apresentação de alérgenos alimentares em uma forma que favoreça a indução de mecanismos naturais de tolerância (Allen et al., 2009, Pediatr Allerg Immunol 20:415-422).

[006] A patente EP 2044851 divulga uma composição nutricional com proteína do leite parcialmente hidrolisada que tem um grau de hidrólise entre 15% e 25% e 50 a 1000 ng de TGF-beta por 100 mL, para a prevenção primária de reações alérgicas à proteína dietética e a prevenção de desenvolvimento de doenças atópicas.

[007] A patente EP 0629350 divulga o uso de hidrolisados de proteína de soro do leite, os quais diz-se que são capazes de induzir tolerância à proteína do leite de vaca.

[008] A patente EP 0827697 divulga o uso de soro do leite que foi hidrolisado enzimaticamente para a preparação de composições que induzem GED - 5269958v1 tolerância oral ao leite de vaca em mamíferos suscetíveis. O soro do leite tem um nível de detecção imunológica de proteínas alergênicas >= 100 vezes menor do que de soro do leite não hidrolisado.

[009] O documento WO 00/42863 divulga uma composição hipoalergênica para a indução de tolerância à proteína em lactentes em risco de alergia à proteína, que compreende uma base de proteína não alergênica extensamente hidrolisada e/ou uma base livre de aminoácidos, a dita composição compreendendo como o ingrediente ativo pelo menos um peptídeo tolerogênico da proteína alergênica.

[010] O documento WO 2011/151059 divulga nutrição infantil com proteínas parcialmente hidrolisadas e oligossacarídeos não digeríveis para uso na indução de tolerância oral às proteínas dietéticas nativas.

[011] O documento WO 2015/090347 refere-se a peptídeos identificados que são capazes de induzir tolerância ao leite de vaca, -lactoglobulina.

[012] O documento WO 2017/144730 divulga uma estratégia para atingir a dessensibilização ou indução de tolerância aos alérgenos da proteína do leite, por exe -lactoglobulina, em humanos ou animais, que compreende formular e usar uma composição que compreende uma proteína do leite expressa intacta, purificada, juntamente com um ou mais peptídeos purificados a partir da dita proteína do leite intacta.

[013] O documento WO 2016/0148572 divulga tolerância imune oral com uma mistura específica de peptídeos de beta-lactoglobulina sintéticos e probióticos.

[014] No entanto, as composições hipoalergênicas na técnica anterior com frequência fornecem seus efeitos apenas evitando a presença de alérgenos potenciais, através disso, não resolvendo o problema subjacente e/ou exigindo a presença de ingredientes especiais, como fatores de crescimento ou peptídeos sintéticos ou purificados. Além disso, os peptídeos identificados na técnica anterior podem não ser adequados para induzir tolerância imune oral em uma GED - 5269958v1 grande parte da população humana. Então, ainda existe a necessidade de uma nutrição que compreende hidrolisado específico de beta-lactoglobulina bovina com peptídeos específicos e componentes que ainda melhoram a tolerância imune oral para sujeitos em risco de desenvolver ou que sofrem de alergia alimentar com efeitos aprimorados na indução de tolerância imune oral às proteínas alimentares, em particular, proteína do leite de vaca.

[015] Dessa forma, o problema técnico subjacente da presente invenção é fornecer composições, métodos, usos e meios para superar as desvantagens identificadas acima, em particular, fornecer uma indução aprimorada de tolerância imune oral às proteínas dietéticas em humanos, em particular, humanos em risco de desenvolver uma alergia alimentar, em particular lactentes, e em particular lactentes em risco de desenvolver alergia à proteína do leite de vaca. Descrição Resumida da Invenção

[016] Os inventores contribuem para a crença na técnica de que a melhor maneira para prevenir ou tratar alergia é desenvolver estratégias que promovam a indução de tolerância oral de alérgenos, como terapia imune oral ou apresentação de alérgenos alimentares em uma forma que favoreça a indução de mecanismos naturais de tolerância (Allen et al., 2009, Pediatr Allerg Immunol 20:415-422).

[017] A base para todas as respostas das células T, incluindo a indução de células T reguladoras (Tregs), consiste em três processos interconectados; ativação do receptor de células T, co-estimulação e sinalização de citocinas. A ativação do receptor de células T em células T CD4 + é facilitada pelo reconhecimento de peptídeos específicos, chamados epítopos de células T, apresentados por moléculas de MHC classe II em células apresentadoras de antígenos. A presença de epítopos de células T em um hidrolisado de proteína é essencial para a indução de Tregs específicas de leite de vaca. Aminoácidos (AA) nº 13-48 de beta-lactoglobulina madura (BLG) é de particular interesse porque peptídeos sintéticos cobrindo esta região são capazes, em um ambiente GED - 5269958v1 preventivo, de reduzir significativamente a resposta alérgica aguda da pele em um modelo murino para alergia ao leite de vaca. Tomados em conjunto, esta região na BLG parece ser importante para o desenvolvimento de tolerância à proteína de soro do leite.

[018] Os investigadores descobriram, com o uso de um novo método, que uma fórmula infantil específica à base de soro do leite parcialmente hidrolisado continha peptídeos de beta-lactoglobulina (BLG) exatos, específicos, que funcionam como epítopos de células T para apoiar o desenvolvimento de tolerância oral à proteína do leite de vaca em uma população mais ampla de sujeitos humanos, por exemplo, a existência de diferentes alelos HLA-DRB1. Estes alelos específicos são os mais relevantes, visto que alelos HLA-DR são o isotipo predominante do MHC classe II e desempenham um papel central na seleção e ativação de células T CD4+. HLA-DR é uma molécula heterodimérica compreendida por cadeias HLA-DRA e HLA-DRB. Enquanto o gene HLA-DRA é altamente conservado em humanos, há vários genes HLA-DRB. Entre estes, HLA-DRB1 é o gene mais polimórfico e é expresso cinco vezes mais que seus parálogos funcionais.

[019] Em primeiro lugar, um novo método de cromatografia líquida- espectrometria de massa (LC-MS) foi desenvolvido para identificar uma lista limitada de peptídeos derivados de BLG exatos, específicos, que estavam naturalmente presentes com maior incidência em uma fórmula com hidrolisado de proteína de soro do leite, com foco na região de AA nº 13-48 da BLG de bovinos maduros. Os inventores puderam identificar no total treze peptídeos BLG de no mínimo nove aminoácidos nesta área de interesse, dos quais seis foram identificados consistentemente em diferentes lotes de produção.

[020] Em segundo lugar, a fórmula foi submetida ao ensaio de apresentação de antígeno ProImmune ProPresent® e a um algoritmo de ligação ao MHC classe II para identificar os peptídeos restritos a HLA-DRB1 relevantes. Foi confirmado que esses peptídeos foram processados e apresentados pelas células dendríticas humanas. Os peptídeos acima foram agrupados em dois GED - 5269958v1

- 23-39). Foi avaliado que fragmentos dos dois grupos de sequência única de BLG identificados tiveram alta afinidade para se ligar aos alelos HLA-DRB1 selecionados. Descobriu-se que uma mistura de peptídeos de BLG foi a mais preferencial para assegurar a cobertura de interação com vários alelos HLA- DRB1 comumente presentes na população humana. Particularmente, uma mistura de peptídeos que compreende pelo menos peptídeo BLG de SEQ ID NO: 5, juntamente com um dos peptídeos de BLG de SEQ ID NO: 2, 3 ou 4 abrange a maioria dos alelos HLA-DRB1 testados. É feita referência aos Exemplos 2 e 3.

[021] Em terceiro lugar, as sequências dos peptídeos de BLG identificadas foram testadas e descobriu-se que são reconhecidas por linhagens de células T humanas específicas do leite de vaca, obtidas a partir de diferentes doadores alérgicos, e induzem a proliferação/ativação de células T. É feita referência aos Exemplos 4 e Figura 2 associada e este. Quando testados nestas diferentes linhagens de células T, foram observados diferentes padrões de reatividade de células T, e embora nem todos os peptídeos tenham reagido com cada linha celular, quando tomados em conjunto (em particular o peptídeo BLG de SEQ ID NO: 4 isoladamente), ou uma combinação de peptídeo BLG de SEQ ID NO: 1 com uma das SEQ ID NOs: 2, 3 ou 5), a reatividade de cada linhagem celular foi abrangida. Estes resultados são indicativos de um efeito aprimorado de hidrolisados com estes peptídeos derivados de BLG exatos sobre o desenvolvimento de tolerância imune oral à proteína de soro do leite, ou um risco diminuído de desenvolvimento de tolerância imune oral.

[022] Como evidenciado no Exemplo 6, os peptídeos têm um maior número de domínios de ligação ao MHC classe II e, dessa forma, uma probabilidade maior de serem apresentados às células T.

[023] Os peptídeos de BLG na região de AA nº 13 a 48 fornecem um efeito mais aprimorado na indução de tolerância imune oral ou um risco diminuído adicional de desenvolver intolerância imune oral quando consumidos juntamente com uma linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico, todos GED - 5269958v1 ou não juntamente com oligossacarídeos não digeríveis e, portanto, estes resultados são também indicativos de efeitos mais aprimorados de composições com proteínas hidrolisadas que compreendem uma mistura desses peptídeos derivados de BLG que consistem em uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos da proteína beta-lactoglobulina representada pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, preferencialmente juntamente com uma linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico, todos ou não juntamente com oligossacarídeos não digeríveis (probióticos ou simbióticos).

[024] Além disso, na parte experimental fixada, mostrou-se que a presença de bactérias produtoras de ácido láctico aumenta a expressão de moléculas de HLA-DR na superfície das células dendríticas (Exemplo 6). Uma expressão aumentada de HLA-DR é também indicativo de uma apresentação melhorada de peptídeos para células T e, portanto, indução de tolerância imune oral. Lista de Cláusulas Preferenciais

[025] 1. Uma composição nutricional que compreende um hidrolisado de proteína do leite de mamífero, preferencialmente leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente de leite de vaca, para uso na: - indução de tolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite, em um sujeito humano, em que o hidrolisado de proteína compreende pelo menos dois dos peptídeos tendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, a dita composição preferencialmente ainda compreende pelo menos uma GED - 5269958v1 linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico.

[026] 2. O uso de acordo com a cláusula 1, em que o hidrolisado de proteína compreende: (i) pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5 e pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou (ii) pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4 e pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5.

[027] 3. A composição nutricional para uso de acordo com a cláusula 1 ou 2, em que a composição compreende menos que 6 µg de beta- lactoglobulina alergênica, preferencialmente menos que 3,5 µg de beta- lactoglobulina alergênica, por g de proteína total.

[028] 4. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a composição compreende pelo menos 50%, em peso, preferencialmente pelo menos 95%, em peso, de proteína de soro do leite hidrolisada, com base em proteína total.

[029] 5. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, que compreende menos que 10%, em peso, preferencialmente menos que 6%, em peso, de peptídeos ou proteínas que têm um tamanho de 5 kDa ou acima, com base em proteína total.

[030] 6. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que pelo menos 1%, em peso, de peptídeos ou proteínas presentes na composição têm um tamanho de 1 kDa ou acima, com base em proteína total, preferencialmente pelo menos 5%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 10%, em peso, com base em proteína total.

[031] 7. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a composição compreende uma quantidade de beta-lactoglobulina alergênica acima de 0,8 µg por g de proteína total.

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[032] 8. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a proteína do leite é de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente proteína do leite de vaca.

[033] 9. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o sujeito humano é um lactente.

[034] 10. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que o sujeito humano está em risco de desenvolver ou sofre de alergia à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos.

[035] 11. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a composição compreende uma linhagem de bactéria produtora de ácido láctico pertencente ao gênero Bifidobacterium, preferencialmente à espécie Bifidobacterium breve.

[036] 12. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, que compreende um ou mais oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto- oligossacarídeo, dextrina não digerível, galacto-oligossacarídeo, xilo- oligossacarídeo, arabino-oligossacarídeo, arabinogalacto-oligossacarídeo, gluco-oligossacarídeo, glucomanano-oligossacarídeo, galactomanano- oligossacarídeo, manano-oligossacarídeo, quito-oligossacarídeo, oligossacarídeo de ácido urônico, sialil-oligossacarídeo e fuco-oligossacarídeo, e misturas dos mesmos, preferencialmente fruto-oligossacarídeos.

[037] 13. A composição nutricional para uso de acordo com a cláusula 12, em que os oligossacarídeos não digeríveis compreendem pelo menos dois oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos, preferencialmente uma mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia longa com fruto-oligossacarídeos de cadeia curta ou com galacto-oligossacarídeos de cadeia curta.

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[038] 14. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, que compreende 105 a 1011 ufc de uma linhagem de bactérias produtoras de ácido láctico por g de peso seco e opcionalmente pelo menos 2%, em peso, de oligossacarídeos não digeríveis, com base no peso seco.

[039] 15. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, que compreende ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa, preferencialmente ácido docosahexaenoico (DHA), mais preferencialmente pelo menos 0,35%, em peso, de DHA com base nos ácidos graxos totais.

[040] 16. A composição nutricional para uso de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, que é uma fórmula para lactentes, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância.

[041] 17. Uma composição nutricional que compreende: a. uma linhagem de bactéria produtora de ácido láctico pertencente ao gênero Bifidobacterium; b. um hidrolisado de proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, em que o hidrolisado de proteína do leite compreende pelo menos dois dos peptídeos que têm uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 c. menos que 6 µg de beta-lactoglobulina alergênica, preferencialmente menos que 3,5 µg de beta-lactoglobulina, por g de proteína total, d. menos que 10%, em peso, de peptídeos ou proteínas que têm um tamanho de 5 kDa ou acima, com base em proteína total, e e. pelo menos 50%, em peso, preferencialmente pelo menos 95%, em peso, de proteína de soro do leite hidrolisada, com base em proteína total, f. opcionalmente um ou mais oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeo, dextrina não digerível, galacto-oligossacarídeo, xilo-oligossacarídeo, arabino- GED - 5269958v1 oligossacarídeo, arabinogalacto-oligossacarídeo, gluco-oligossacarídeo, glucomanano-oligossacarídeo, galactomanano-oligossacarídeo, manano- oligossacarídeo, quito-oligossacarídeo, oligossacarídeo de ácido urônico, sialil- oligossacarídeo e fuco-oligossacarídeo, e misturas dos mesmos, preferencialmente fruto-oligossacarídeos, e g. opcionalmente ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa, preferencialmente ácido docosahexaenoico (DHA), mais preferencialmente pelo menos 0,35%, em peso, de DHA com base nos ácidos graxos totais.

[042] 18. A composição nutricional de acordo com a cláusula 17, em que o hidrolisado de proteína compreende: (i) pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5 e pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; ou (ii) pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4 e pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5.

[043] 19. A composição nutricional de acordo com a cláusula 17 ou 18, em que a quantidade de beta-lactoglobulina alergênica está acima de 0,8 µg por g proteína e/ou em que a composição compreende mais que 1%, em peso, de peptídeos ou proteínas com um tamanho de 1 kDa ou acima, com base em proteína total, mais preferencialmente pelo menos 5%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 10%, em peso.

[044] 20. A composição nutricional de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 19, em que a linhagem de bactéria produtora de ácido láctico pertence à espécie Bifidobacterium breve.

[045] 21. A composição nutricional de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que os oligossacarídeos não digeríveis compreendem pelo menos dois oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos, preferencialmente uma mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia longa com GED - 5269958v1 fruto-oligossacarídeos de cadeia curta ou com galacto-oligossacarídeos de cadeia curta.

[046] 22. A composição nutricional de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 21, que compreendendo 10 5 a 1011 ufc de bactérias produtoras de ácido láctico por g de peso seco.

[047] 23. A composição nutricional de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 22, que compreende pelo menos 2%, em peso, dos oligossacarídeos não digeríveis com base no peso seco.

[048] 24. A composição nutricional de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 23, que é uma fórmula para lactentes, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância.

[049] 25. Um método para fornecer nutrição para um sujeito humano em risco de desenvolver ou que sofre de alergia, mais preferencialmente alergia à proteína do leite, que compreende administrar ao sujeito humano a composição nutricional de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 24.

[050] 26. O método de acordo com a cláusula 25, em que o sujeito humano é um lactente ou criança de primeira infância, preferencialmente um lactente.

[051] 27. O método de acordo com a cláusula 25 ou 26, em que a proteína do leite é de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente proteína do leite de vaca.

[052] 28. Um método para: - indução de tolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite, em um sujeito humano, que compreende a administração ao sujeito de uma composição nutricional que compreende um hidrolisado de proteína do leite de GED - 5269958v1 mamífero, preferencialmente leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente do leite de vaca, em que o hidrolisado de proteína compreende pelo menos dois dos peptídeos tendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, a dita composição preferencialmente ainda compreende pelo menos uma linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico.

[053] 29. O uso de um hidrolisado de proteína para a fabricação de composição nutricional para uso na: - indução de tolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite, em que a composição nutricional compreende um hidrolisado de proteína do leite de mamífero, preferencialmente leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente do leite de vaca, em que o hidrolisado de proteína compreende pelo menos dois dos peptídeos tendo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, a dita composição preferencialmente ainda compreende pelo menos uma linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico. Descrição Detalhada da Invenção

[054] A presente invenção refere-se a uma composição nutricional que compreende um hidrolisado de proteína de leite de mamífero, - para uso na indução de tolerância imune oral à proteína do leite e/ou - para uso em prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite e/ou - para redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à GED - 5269958v1 proteína do leite e/ou - para aprimoramento ou melhora de tolerância imune oral à proteína do leite, em um sujeito humano, em que o hidrolisado de proteína compreende pelo menos dois dos peptídeos tendo uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos representados pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Em uma realização preferencial, a composição compreende a pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos representados pela SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 4. Em uma realização preferencial, a composição compreende pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que corresponde à SEQ ID NO: 4. Em uma realização preferencial, a composição compreende pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que corresponde à SEQ ID NO: 5. Em uma realização preferencial, a composição compreende pelo menos três peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, mais preferencialmente pelo menos quatro peptídeos ou até todos os cinco peptídeos selecionados a partir deste grupo.

[055] Em uma realização preferencial, o hidrolisado de proteína compreende: (i) pelo menos um peptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos representados pela sequência SEQ ID NO: 5 e pelo menos um peptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos representados pela SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; ou (ii) pelo menos um peptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos representados pela SEQ ID NO: 4; ou pelo menos um peptídeo que consiste em uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos representados pela sequência SEQ ID NO: 1 e pelo menos um peptídeo que consiste em uma GED - 5269958v1 sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos representados pela SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5.

[056] Estes peptídeos são também citados no presente pedido como compreende um linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico, mais preferencialmente ainda compreende um ou mais oligossacarídeos não digeríveis (ONDs), conforme ainda definido abaixo. O leite de mamífero é preferencialmente leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente leite de vaca. Redigido de forma diferente, a invenção refere-se ao uso de um hidrolisado de proteína ou peptídeos derivados de BLG na fabricação da composição nutricional anteriormente mencionada para indução de tolerância imune oral à proteína do leite e/ou na prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite e/ou para redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite em um sujeito humano, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente ao leite de vaca, em que a composição nutricional compreende o hidrolisado de proteína conforme definido acima, preferencialmente de acordo com (i) ou (ii), conforme definido acima no presente pedido, a dita composição preferencialmente ainda compreende uma bactéria produtora de ácido láctico, mais preferencialmente que compreende um ou mais ONDs, conforme ainda definido abaixo. Também, a invenção refere-se a um método para indução de tolerância imune oral à proteína do leite e/ou para uso na prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite e/ou para redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite em um sujeito humano, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente contra leite de vaca, o método compreendendo administrar ao sujieto humano a composição nutricional anteriormente mencionada que compreende o hidrolisado de proteína conforme definido acima, GED - 5269958v1 preferencialmente de acordo com (i) ou (ii), conforme definido acima no presente pedido, a dita composição preferencialmente ainda compreende uma linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico, mais preferencialmente que compreende um ou mais ONDs, conforme ainda definido abaixo.

[057] A presente invenção também se refere a um ou mais peptídeos derivados de BLG. - para uso na indução de tolerância imune oral à proteína do leite e/ou - para uso em prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite e/ou - para redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite e/ou - para aprimoramento ou melhora de tolerância imune oral à proteína do leite, em um sujeito humano, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente ao leite de vaca, em que os ditos um ou mais peptídeos derivados de BLG são caracterizados por compreender pelo menos dois dos peptídeos que têm uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, preferencialmente de acordo com (i) ou (ii) conforme definido acima no presente pedido. Redigido de forma diferente, a invenção refere-se ao uso de um ou mais peptídeos derivados de BLG na fabricação de uma composição nutricional para indução de tolerância imune oral à proteína do leite e/ou para uso na prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite e/ou para redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite em um sujeito humano, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente ao leite de vaca, em que os ditos um ou mais peptídeos derivados de BLG são caracterizados por compreender pelo menos dois dos peptídeos que têm uma sequência selecionada a partir do grupo que GED - 5269958v1 consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, preferencialmente de acordo com (i) ou (ii) conforme definido acima no presente pedido.

[058] A invenção também se refere a um método (não terapêutico) - para uso na indução de tolerância imune oral à proteína do leite e/ou - para uso em prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite e/ou - para redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite e/ou - para aprimoramento ou melhora de tolerância imune oral à proteína do leite, em um sujeito humano, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente ao leite de vaca, que compreende administrar um ou mais peptídeos derivados de BLG ao sujeito humano, em que os peptídeos são caracterizados por compreender pelo menos dois dos peptídeos que têm uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, preferencialmente de acordo com (i) ou (ii) conforme definido acima no presente pedido. Em uma realização preferencial do uso ou método acima, um ou mais peptídeos derivados de BLG são preferencialmente administrados em combinação com uma linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico, mais preferencialmente em combinação adicional com um ou mais oligossacarídeos não digeríveis (ONDs), conforme ainda definido abaixo.

[059] Em uma realização, - indução de tolerância imune oral à proteína do leite e/ou - prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite e/ou - redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite e/ou GED - 5269958v1

- aprimoramento ou melhora de tolerância imune oral à proteína do leite refere-se à proteína do leite de uma espécie de mamífero particular, e a proteína do leite hidrolisada compreendida na composição é da mesma espécie de mamífero, preferencialmente ambas são do gênero Bos.

[060] olerância imune oral à proteína do leite é melhorada em comparação à tolerância imune oral à proteína do leite antes do início da administração da composição da invenção.

[061] Associado a isto, a invenção também se refere a uma nutricional composição que compreende: a. uma linhagem de bactéria produtora de ácido láctico pertencente ao gênero Bifidobacterium; b. um hidrolisado de proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, em que o hidrolisado de proteína do leite compreende pelo menos dois dos peptídeos que têm uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 c. menos que 6 µg de beta-lactoglobulina alergênica, preferencialmente menos que 3,5 µg de beta-lactoglobulina, por g de proteína total, d. menos que 3%, em peso, de peptídeos ou proteínas que têm um tamanho de 5 kDa ou acima, com base em proteína total, e. pelo menos 50%, em peso, preferencialmente pelo menos 95%, em peso, de proteína de soro do leite hidrolisada, com base em proteína total, f. opcionalmente um ou mais oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeo, dextrina não digerível, galacto-oligossacarídeo, xilo-oligossacarídeo, arabino- oligossacarídeo, arabinogalacto-oligossacarídeo, gluco-oligossacarídeo, glucomanano-oligossacarídeo, galactomanano-oligossacarídeo, manano- oligossacarídeo, quito-oligossacarídeo, oligossacarídeo de ácido urônico, sialil- oligossacarídeo e fuco-oligossacarídeo, e misturas dos mesmos, GED - 5269958v1 preferencialmente fruto-oligossacarídeos, e g. opcionalmente ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa, preferencialmente ácido docosahexaenoico (DHA), mais preferencialmente pelo menos 0,35%, em peso, de DHA com base nos ácidos graxos totais.

[062] Associado a isto, a invenção também se refere a um método para fornecer nutrição a um sujeito humano em risco de desenvolver ou que sofre de alergia, mais preferencialmente alergia à proteína do leite, que compreende administrar ao sujeito humano a composição nutricional conforme definida acima.

[063] A composição nutricional no contexto da presente invenção é definida abaixo no presente pedido, e todas as realizações se aplicam a todos os aspectos da invenção, incluindo a composição, a composição para uso, os métodos e o uso de acordo com a invenção. Peptídeos/Hidrolisado

[064] A composição de acordo com a invenção compreende pelo menos dois peptídeos que consistem em uma sequência de aminoácidos que corresponde aos aminoácidos consecutivos representados pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Estes peptídeos são derivados ou podem ser derivados a partir de beta-lactoglobulina e, assim, tratados como peptídeos derivados de beta-lactoglobulina. Ao longo de todo o relatório descritivo e reivindicações, as sequências de aminoácidos dos peptídeos BLG com SEQ ID NO: 1 a 5 são identificados abaixo no presente pedido: SEQ ID NO: 1: XIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS SEQ ID NO: 2: XIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL SEQ ID NO: 3: TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL SEQ ID NO: 4: TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ SEQ ID NO: 5: DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY

[065] No presente pedido, X define um aminoácido selecionado a partir de leucina (L), isoleucina (I), preferencialmente X é leucina. SEQ ID NO: 1 GED - 5269958v1 em que X = L é também citado no presente pedido como SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 1 em que X = I é também citado no presente pedido como SEQ ID NO: 37. SEQ ID NO: 2 em que X = L é também citado no presente pedido como SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 2 em que X = I é também citado no presente pedido como SEQ ID NO: 38. A escolha para X sendo tanto leucina como isoleucina é uma consequência direta da fonte de leite de mamífero. A leucina é preferencial, visto que o leite de mamífero do gênero Bos, preferencialmente leite de vaca, é mais preferencial.

[066] A realização preferencial (i) é baseada no ensaio de apresentação de antígeno ProImmune ProPresent ®, onde descobriu-se que esta mistura de peptídeos abrange mais alelos HLA-DRB1 testados; a realização preferencial (ii) é baseada em experimentos direcionados ao reconhecimento de células T de células T de lactentes alérgicos ao leite de vaca, onde descobriu-se que estes peptídeos abrangem a reatividade de cada linhagem celular.

[067] Os peptídeos são preferencialmente fornecidos por um hidrolisado de proteína (isto é, proteínas hidrolisadas) derivado de leite de mamífero, preferencialmente leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência do leite de vaca (Bos taurus). A sequência de aminoácidos de BLG nas espécies de Bos e Bison são similares, e SEQ ID NOs: 9, 11, 3, 4 e 5 são obtidas da proteína do leite destas espécies. Em espécies de aminoácidos de Capra e Bubalus o aminoácido 1 é diferente (uma isoleucina ao invés de uma leucina nas SEQ ID NOs: 37 e 38) e SEQ ID NOs: 37, 38, 3, 4 e 5 são obtidas nos hidrolisados da proteína do leite destas espécies. Em uma realização preferencial, os peptídeos são derivados da proteína de soro do leite. A composição nutricional compreende preferencialmente pelo menos 50%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 70%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 95%, em peso, de proteína de soro do leite hidrolisada, com base em proteína total. Uma fonte adequada é uma mistura de proteína de soro ácido e proteína de soro doce desmineralizado. Soro ácido e GED - 5269958v1 soro doce são comercialmente disponíveis. O soro doce é o subproduto do queijo coagulado com coalho e compreende caseinoglicomacropeptídeo (CGMP) e soro ácido (também chamado de soro azedo) é o subproduto de queijo coagulado com ácido, e não contém CGMP. Fontes adequadas para a proteína de soro do leite são soro do leite desmineralizado (Deminal, Friesland Campina, Países Baixos) e/ou concentrado proteico de soro do leite (WPC80, Friesland Campina, Países Baixos). A proteína de soro do leite compreende preferencialmente soro ácido, mais preferencialmente pelo menos 50%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 70%, em peso, de soro ácido, com base em proteína total de soro do leite. O soro ácido tem um perfil de aminoácidos aprimorado em comparação à proteína de soro doce.

[068] A hidrólise pode ser obtida com o uso de uma mistura de endopeptidases e exopeptidases microbianas com o uso do método conforme descrito no Exemplo 1 do documento WO 2011/151059, incorporado ao presente pedido como referência. Hidrolisados com os peptídeos BLG de acordo com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 podem ser preferencialmente preparados com o uso da receita de acordo com o Exemplo 1. Preferencialmente, é empregada uma mistura de uma endoprotease e exoprotease. Para determinar se uma dada composição compreende um ou mais dentre os peptídeos derivados de BLG, são descritos meios de identificação nas partes experimentais.

[069] A composição preferencialmente compreende menos que 10%, em peso, preferencialmente menos que 6%, em peso, de peptídeos ou proteínas com um tamanho de 5 kDa ou acima, com base em proteína total. Em uma realização, a composição compreende mais que 0,3%, em peso, preferencialmente mais que 0,5%, em peso, mais preferencialmente mais que 1%, em peso, até mais preferencialmente mais que 1,5%, em peso, destes peptídeos com um tamanho de 5 kDa ou acima, com base em proteína total. É preferencial que mais que 1%, em peso, de peptídeos ou proteínas presentes na composição tenham um tamanho de 1 kDa ou acima, com base em proteína GED - 5269958v1 total, mais preferencialmente pelo menos 5%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 10%, em peso, com base em proteína total. É mais preferencial que mais que 1%, em peso, de peptídeos ou proteínas presentes na composição têm um tamanho de 3 kDa ou acima, com base em proteína total, mais preferencialmente pelo menos 5%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 10%, em peso, com base em proteína total.

[070] A distribuição de tamanho dos peptídeos no hidrolisado de proteína pode ser determinada por meio de cromatografia líquida de alta pressão de exclusão por tamanho, como conhecido na técnica. Saint-Sauveur et al. Immunomodulating properties of a whey protein isolate, its enzymatic digest and peptide fractions Dairy Journal (2008) vol. 18(3) páginas 260-270 descreve um exemplo dos mesmos. Em resumo, a área superficial total dos cromatogramas é integrada e separada em faixas de massa expressas como porcentagem da área superficial total. As faixas de massa são calibradas com o uso de peptídeos/proteínas com uma massa molecular conhecida. O hidrolisado de proteína que compreende os ditos peptídeos é preferencialmente caracterizado por compreender entre 64 e 89%, em peso, de peptídeos com um peso molecular abaixo de 1.000 Da, entre 10 e 30%, em peso, de peptídeos com um peso molecular entre 1.000 e 5.000 Da e entre 1 e 6%, em peso, de peptídeos ou proteínas com um peso molecular acima de 5 kDa, todos com base em proteína total.

[071] Embora a distribuição de peso de peptídeos seja informativa, ela não fornece qualquer informação sobre a sequência e a atividade dos peptídeos presentes na fórmula. Informações estruturais são cruciais para entender a atividade biológica geral que uma fórmula infantil hidrolisada pode possuir.

[072] De maneira consistente, vários peptídeos específicos que se originaram de uma região conhecida em BLG por conter epítopos de células T foram identificados em diferentes lotes de produção. Somente dois estudos investigaram o perfil peptídico de pHP anteriormente (Wada et al. Peptides 2015 73:101-105; Catala-Clariana et al., Electrophoresis 2013 Jul;34(13):1886-1894).

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Embora estes estudos focassem em peptídeos bioativos, em geral, e não especificamente em epítopos de células T, nenhum dos peptídeos com SEQ ID NO: 1 a 5 identificados no presente pedido foi encontrado nestes produtos anteriormente testados. Em adição aos perfis destes produtos de proteína hidrolisada, foi determinado o perfil peptídico de um hidrolisado à base de BLG disponível não comercial (Pecquet et al. J Allergy Clin Immunol; março de 2000; 105(3):514-521). Também neste hidrolisado, dois peptídeos (AA nº 21-40 e AA nº 25-40) que se sobrepõem à região de interesse em seguimento, mas novamente nenhum peptídeo com SEQ ID NO: 1 a 5 foi identificado. Em pelo menos dois dos três estudos relatados acima, um hidrolisado de um fabricante diferente foi investigado (Wada e Pecquets) e, conforme indicado acima, o principal motivo para essas diferenças poderiam ser as diferenças nos processos de fabricação. Isto é ainda corroborado por um estudo recente em que fórmulas infantis extensamente hidrolisadas de diferentes fabricantes foram caracterizadas com peptidômica. Os autores mostraram que as fórmulas infantis de diferentes fabricantes tinham uma assinatura distinta com base em seu perfil peptídico e, portanto, podem ter um efeito diferente em ensaios clínicos (Lambers et al. Food Sci Nutr janeiro de 2015;3(1):81-90. Hochwallner et al., 2017, Allergy 72: 416-425).

[073] Em uma realização preferencial da presente invenção, a presente composição compreende, por grama de proteína total, pelo menos 10 mcg (microgramas), mais preferencialmente 10 a 5.000 mcg, mais preferencialmente 20 a 2.000 mcg, mais adequadamente 30 a 500 mcg e particularmente preferencialmente 50 a 250 mcg da soma dos peptídeos derivados de beta-lactoglobulina que consistem em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, mais preferencialmente que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Os peptídeos derivados de BLG estão preferencialmente presentes em quantidades terapeuticamente efetivas.

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[074] É preferencial que a composição nutricional compreenda menos que 6 µg de beta-lactoglobulina BLG por g de proteína, preferencialmente menos que 5 µg por g de proteína, mais preferencialmente menos que 3,5 µg por g - refere-se à BLG intacta ou imunogênica, e não considera BLG hidrolisada. É preferencial que a composição nutricional compreenda uma quantidade de beta- lactoglobulina alergênica acima de 0,8 µg por g de proteína. BLG alergênica é determinada por ELISA, como conhecido na técnica, e uma quantidade que exceda 0,8 µg por g de proteína é indicativo de um hidrolisado parcial de proteína. Para fins de comparação, uma proteína de soro do leite extensamente hidrolisada exibe menos que 0,2 µg de BLG alergênica por g de proteína. Pequenas quantidades, mas significativas, de BLG alergênica juntamente com a BLG hidrolisada ou peptídeos derivados de BLG, mais preferencialmente também em combinação com uma linhagem de bactéria produtora de ácido láctico, até mais preferencialmente também em combinação com uma bactéria produtora de ácido láctico e um ou mais ONDs, aumentam a capacidade tolerogênica da composição, mas a quantidade de BLG ainda é suficientemente baixa para reduzir a alergenicidade da composição nutricional e para a composição nutricional ser hipoalergênica. A partir desta perspectiva, é preferencial o uso de um hidrolisado de proteína que compreende a menor quantidade de beta-lactoglobulina alergênica e que compreende peptídeos derivados de BLG de acordo com a invenção, além de peptídeos sintéticos que consistem em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, mais preferencialmente que consiste em uma sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5 (sem BLG alergênica). Bactérias Produtoras de Ácido Láctico

[075] A composição de acordo com a invenção compreende preferencialmente uma linhagem de espécies de bactérias produtoras de ácido GED - 5269958v1 láctico, que aumenta a capacidade tolerogênica imune oral dos peptídeos de BLG da invenção. A linhagem da bactéria é preferencialmente uma probiótica. É fornecida evidência nos Exemplos 5 e 7. Descobriu-se que a presença de bactérias produtoras de ácido láctico aumenta a expressão de moléculas de HLA-DR na superfície das células dendríticas. Uma expressão aumentada de HLA-DR é também indicativo de uma apresentação melhorada de peptídeos para células T e, portanto, indução de tolerância imune oral.

[076] Bactérias produtoras de ácido láctico adequadas incluem linhagens do gênero Bifidobacteria (por exemplo, B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum), Lactobacillus (por exemplo, L. acidophilus, L. paracasei, L. johnsonii, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L. casei, L. lactis), e Streptococcus (por exemplo, S. thermophilus). Bifidobacterium breve e Bifidobacterium longum são bactérias produtoras de ácido láctico especialmente adequadas.

[077] A composição compreende preferencialmente uma linhagem de bactéria produtora de ácido láctico pertencente ao gênero Bifidobacterium, preferencialmente à espécie Bifidobacterium breve. A B. breve tem preferencialmente pelo menos 95% de identidade da sequência do 16S rRNA, em comparação à linhagem tipo B. breve ATCC 15700, mais preferencialmente pelo menos 97% de identidade (Stackebrandt & Goebel, 1994, Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849). Linhagens de B. breve adequadas podem ser isoladas das fezes de lactentes saudáveis alimentados com leite humano. Tipicamente, estas estão comercialmente disponíveis junto a produtores de bactérias ácido- lácticas, mas elas também podem ser isoladas diretamente a partir de fezes, identificadas, caracterizadas e produzidas. De acordo com uma realização, a presente composição contém pelo menos uma B. breve selecionada a partir do grupo que consiste em B. breve Bb-03 (Rhodia/Danisco), B. breve M-16V (Morinaga), B. breve R0070 (Institute Rosell, Lallemand), B. breve BR03 (Probiotical), B. breve BR92) (Cell Biotech), DSM 20091, LMG 11613, YIT4065, FERM BP-6223 e CNCM I-2219. B. breve pode ser B. breve M-16V e B. breve CNCM I-2219, com a máxima preferência B. breve M-16V. B. breve I-2219 foi GED - 5269958v1 publicada no documento WO 2004/093899 e foi depositada na Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Instituto Pasteur, Paris, França, em 31 de maio de 1999 pela Compagnie Gervais Danone. B. breve M-16V foi depositada como BCCM/LMG23729 e está comercialmente disponível junto à Morinaga Milk Industry Co., Ltd.

[078] A bactéria produtora de ácido láctico pode estar presente na composição em qualquer concentração adequada, preferencialmente em uma contexto da invenção. Preferencialmente, a linhagem de bactéria produtora de ácido láctico está incluída na presente composição em uma quantidade de 10 4 a 1013 ufc por g de peso seco da composição, preferencialmente 10 5 a 1011 ufc/g, com a máxima preferência 106 a 1010 ufc/g. Oligossacarídeos Não Digeríveis

[079] Em uma realização preferencial, a presente composição compreende adicionalmente um ou mais oligossacarídeos não digeríveis (OND). Como as bactérias produtoras de ácido láctico, estes ainda aumentam a indução de propriedades de tolerância imune oral de peptídeos da proteína BLG. É dada evidência de um efeito aumentado no Exemplo 5.

[080] Vantajosamente e com a máxima preferência, o oligossacarídeo não digerível é solúvel em água (de acordo com o método divulgado em L. Prosky et al., J. Assoc. Anal. Chem 71: 1017-1023, 1988) e é preferencialmente um oligossacarídeo com um grau de polimerização (DP) de 2 a 200. O DP médio dos oligossacarídeos não digeríveis é preferencialmente abaixo de 200, mais preferencialmente abaixo de 100, até mais preferencialmente abaixo de 60, com a máxima preferência abaixo de 40.

[081] O oligossacarídeo não digerível é preferencialmente um prebiótico. Ele não é digerido no intestino pela ação de enzimas digestivas presentes no trato digestivo superior humano (intestino delgado e estômago). O oligossacarídeo não digerível é fermentado pela microbiota intestinal humana. Por exemplo, glicose, frutose, galactose, sacarose, lactose, maltose e as GED - 5269958v1 maltodextrinas são consideradas digeríveis. As matérias-primas de oligossacarídeos podem compreender monossacarídeos como glicose, frutose, fucose, galactose, ramnose, xilose, ácido glucurônico, GalNac etc., mas estes não são parte dos oligossacarídeos. O oligossacarídeo não digerível é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em fruto- oligossacarídeo, dextrina não digerível, galacto-oligossacarídeo, xilo- oligossacarídeo, arabino-oligossacarídeo, arabinogalacto-oligossacarídeo, gluco-oligossacarídeo, glucomanano-oligossacarídeo, galactomanano- oligossacarídeo, manano-oligossacarídeo, quito-oligossacarídeo, oligossacarídeo de ácido urônico, sialil-oligossacarídeo e fuco-oligossacarídeo, e misturas dos mesmos, preferencialmente fruto-oligossacarídeos. Exemplos de sialiloligossacarídeos são 3- -sialil-lactose, sialil-lacto-N- tetraoses, disialil-lacto-N-tetraoses. Exemplos de fuco-oligosacarídeos são oligossacarídeos fucoidana dessulfatado -fucosil- -fucosil-lactose, lacto-N-fucopentose I, II, III, LNDH, lactodifucotetraose, lacto-N-difucohexose I e II.

[082] Um tipo adequado de oligossacarídeo é um oligossacarídeo de cadeia curta que tem um grau médio de polimerização menor que 10, preferencialmente no máximo 8, preferencialmente na faixa de 2 a 7. O oligossacarídeo de cadeia curta compreende preferencialmente galacto- oligossacarídeos e/ou fruto-oligossacarídeos (isto é, scGOS e/ou scFOS). Em uma realização, a composição compreende galacto-oligossacarídeos, preferencialmente beta-galacto-oligossacarídeos, preferencialmente trans- galacto-oligossacarídeos. Os galacto-oligossacarídeos têm preferencialmente um grau médio de polimerização na faixa de 2 a 8, preferencialmente 3 a 7, isto é, são oligossacarídeos de cadeia curta no contexto da invenção. (Trans)galacto- oligossacarídeos estão, por exemplo, disponíveis sob o nome comercial Vivinal®GOS (Friesland Campina Domo Ingredients, Holanda), Bimuno (Clasado), Cup-oligo (Nissin Sugar) e Oligomate55 (Yakult). A composição compreende preferencialmente fruto-oligossacarídeos de cadeia curta e/ou GED - 5269958v1 galacto-oligossacarídeos de cadeia curta, preferencialmente pelo menos fruto- oligossacarídeos de cadeia curta. Fruto-oligossacarídeos podem ser produtos hidrolisados de inulina que têm um DP médio dentro das subfaixas anteriormente mencionadas; esses produtos FOS estão, por exemplo, comercialmente disponíveis como Raftilose P95 (Orafti) ou com Cosucra.

[083] Outro tipo adequado de oligossacarídeo é fruto-oligossacarídeo de cadeia longa (lcFOS) que tem um grau médio de polimerização acima de 10, tipicamente na faixa de 10 a 100, preferencialmente 15 a 50, com a máxima preferência acima de 20. Um tipo particular de fruto-oligossacarídeo de cadeia longa é inulina, como Raftilin HP.

[084] A presente composição pode conter uma mistura de dois ou mais tipos de oligossacarídeos não digeríveis, com a máxima preferência uma mistura de dois oligossacarídeos não digeríveis. No caso do OND compreender ou consistir em uma mistura de dois oligossacarídeos distintos, um oligossacarídeo pode ser de cadeia curta conforme definido acima e outro oligossacarídeo pode ser de cadeia longa, conforme definido acima. Com a máxima preferência, oligossacarídeos de cadeia curta e oligossacarídeos de cadeia longa estão presentes em uma razão, em peso, de cadeia curta para cadeia longa na faixa de 1:99 a 99:1, mais preferencialmente 1:1 a 99:1, mais preferencialmente 4:1 a 97,3, até mais preferencialmente 5:1 a 95:5, até mais preferencialmente 7:1 a 95:5, até mais preferencialmente 8:1 a 10:1, com a máxima preferência cerca de 9:1.

[085] Em uma realização, a composição compreende pelo menos dois dentre fruto-oligossacarídeos e/ou galacto-oligossacarídeos. Misturas adequadas incluem misturas de fruto-oligossacarídeo de cadeia longa com fruto- oligossacarídeos de cadeia curta ou com galacto-oligossacarídeos de cadeia curta, com a máxima preferência fruto-oligossacarídeo de cadeia longa com fruto-oligossacarídeos de cadeia curta.

[086] A presente composição compreende preferencialmente 0,05 a 20%, em peso, dos ditos oligossacarídeos não digeríveis, mais GED - 5269958v1 preferencialmente 0,5 a 15%, em peso, até mais preferencialmente 1 a 10%, em peso, com a máxima preferência 2 a 10%, em peso, com base no peso seco da presente composição. Quando na forma líquida, a presente composição compreende preferencialmente 0,01 a 2,5%, em peso, de oligossacarídeos não digeríveis, mais preferencialmente 0,05 a 1,5%, em peso, até mais preferencialmente 0,25 a 1,5%, em peso, com a máxima preferência 0,5 a 1,25%, em peso, com base em 100 mL.

[087] Em uma realização, a mistura de OND não inclui quaisquer quantidades detectáveis de oligossacarídeos ácidos.

[088] Quando o oligossacarídeo não digerível é uma mistura, são usadas as médias dos respectivos parâmetros para definir a presente invenção.

[089] A combinação de um OND e uma bactéria produtora de ácido láctico, conforme definido acima no presente pedido, também é citada como um -se que presença de quantidades terapeuticamente efetivas do OND juntamente com a bactéria produtora de ácido láctico melhora ainda mais a indução de propriedades de tolerância imune oral de uma linhagem A de Bifidobacterium, preferencialmente B. breve, juntamente com fruto- oligossacarídeo. É feita referência ao Exemplos 5. Outros Componentes

[090] A composição ainda pode compreender ácidos graxos poli- insaturados de cadeia longa (LC-PUFA). LC-PUFA são ácidos graxos em que a cadeia acila tem um comprimento de 20 a 24 átomos de carbono (preferencialmente 20 ou 22 átomos de carbono) e em que a cadeia acila compreende pelo menos duas ligações insaturadas entre os ditos átomos de carbono na cadeia acila. Mais preferencialmente, a presente composição compreende pelo menos um LC-PUFA selecionado a partir do grupo que consiste em ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5 n3), ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 n3), ácido araquidônico (ARA, 20:4 n6) e ácido docosapentaenoico (DPA, 22:5 n3), preferencialmente DHA, EPA e/ou ARA. Esses LC-PUFAs têm um efeito benéfico adicional na redução do risco de alergia.

GED - 5269958v1

[091] O teor preferencial de LC-PUFA na presente composição não excede 15%, em peso, de ácidos graxos totais, preferencialmente não excede 10%, em peso, até mais preferencialmente não excede 5%, em peso. Preferencialmente, a presente composição compreende pelo menos 0,2%, em peso, preferencialmente pelo menos 0,25%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 0,35%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 0,5%, em peso, de LC-PUFA de ácidos graxos totais, mais preferencialmente DHA. A presente composição compreende preferencialmente ARA e DHA, em que a razão, em peso, de ARA/DHA é preferencialmente acima de 0,25, preferencialmente acima de 0,5, mais preferencialmente 0,75 a 2, até mais preferencialmente 0,75 a 1,25. A razão, em peso, é preferencialmente abaixo de 20, mais preferencialmente entre 0,5 e 5. A quantidade de DHA é preferencialmente acima de 0,2%, em peso, mais preferencialmente acima de 0,3%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 0,35%, em peso, até mais preferencialmente 0,35 a 0,6%, em peso, dos ácidos graxos totais. Composição Nutricional

[092] A composição de acordo com a invenção pode ser usada como uma composição nutricional, terapia nutricional, suporte nutricional, como um alimento medicinal, como um alimento para propósitos médicos ou como um suplemento nutricional. A presente composição é preferencialmente uma composição enteral (oral). A composição é administrada por via oral, ou destina- se a ser administrados por via oral, a um sujeito com necessidade da mesma, em particular às crianças e lactentes, incluindo crianças que estão começando a andar, preferencialmente crianças até os 6 anos de idade, preferencialmente lactentes ou crianças de primeira infância, tipicamente com uma idade de 0 a 36 meses, mais preferencialmente lactentes de 0 a 12 meses de idade, com a máxima preferência 0 a 6 meses de idade. Dessa forma, em algumas realizações, a presente composição é uma fórmula infantil, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância (também citada como leite de crescimento), preferencialmente é uma fórmula infantil ou fórmula de GED - 5269958v1 por órgãos regulatórios. Em particular, CODEX STAN 73 - Standard For Infant Formula and Formulas For Special Medical Purposes Intended for Infants é amplamente aceito. Ela recomenda o valor nutricional e a composição da fórmula, o que exige que o leite preparado contenha por 100 mL não menos que 60 kcal (250 kJ) e não mais que 70 kcal (295 kJ) de energia. FDA e outros órgaõs regulatórios estabeleceram exigências nutricionais em conformidade com a mesma.

[093] Preferencialmente, a presente composição enteral, preferencialmente composição nutricional é para fornecer as necessidades nutricionais diárias de um humano, em particular para administração, em particular para alimentação de humanos, em particular lactentes incluindo crianças que estão começando a andar, preferencialmente em risco de desenvolver alergia à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, , com a máxima preferência alergia à proteína do leite de vaca. Em uma realização, a alergia à proteína do leite refere-se ao leite de uma espécie de mamífero particular e a proteína do leite hidrolisada compreendida na composição é da mesma espécie de mamífero, preferencialmente ambas são do gênero Bos.

[094] A fim de satisfazer os requisitos calóricos do lactente, a presente composição enteral compreende preferencialmente 50 a 200 kcal/100 mL de líquido, mais preferencialmente 60 a 90 kcal/100 mL de líquido, até mais preferencialmente 60 a 75 kcal/100 mL de líquido. Esta densidade calórica assegura uma ótima razão entre a água e o consumo de calorias. A osmolaridade da presente composição é preferencialmente entre 150 e 420 mOsmol/L, mais preferencialmente 260 a 320 mOsmol/L. A osmolaridade baixa visa reduzir o estresse gastrointestinal.

[095] Preferencialmente, a presente composição enteral está sob a GED - 5269958v1 forma líquida, preferencialmente com uma viscosidade abaixo de 35 mPa.s, mais preferencialmente abaixo de 6 mPa.s, conforme medido em um viscosímetro Brookfield a 20ºC a uma taxa de cisalhamento de 100 s -1. Adequadamente, a presente composição enteral está sob a forma de pó, que preferencialmente pode ser reconstituído com água para formar um líquido, ou sob a forma de líquido concentrado, que deve ser diluído com água. Quando a presente composição enteral está sob a forma líquida, o volume preferencial administrado diariamente está na faixa de cerca de 80 a 2500 mL, mais preferencialmente cerca de 450 a 1000 mL por dia.

[096] A composição de acordo com a invenção preferencialmente compreende um componente lipídeo, preferencialmente um componente lipídeo adequado para nutrição de lactente conforme conhecido na técnica. O componente lipídico da presente composição preferencialmente fornece 2,9 a 6,0 g, mais preferencialmente 4 a 6 g por 100 kcal da composição. Quando na forma líquida, a composição preferencialmente compreende 2,1 a 6,5 g de lipídeo por 100 mL, mais preferencialmente 3,0 a 4,0 g por 100 mL. Com base no peso seco, a presente fórmula para lactentes ou de seguimento preferencialmente compreende 12,5 a 40%, em peso, de lipídeos, mais preferencialmente 19 a 30%, em peso.

[097] A composição de acordo com a invenção ainda pode compreender material proteináceo, em adição aos peptídeos derivados de beta- lactoglobulina(s) de acordo com a invenção. No contexto da presente invenção, engloba proteínas, peptídeos, aminoácidos livres e proteínas parcialmente ou extensivamente hidrolisadas.

[098] Preferencialmente, o material proteináceo adicional, além de peptídeo(s) derivado(s) de beta-lactoglobulina, não evoca uma reação alérgica, ou é hipoalergênico, como aminoácidos livres e proteína hidrolisada. Como um componente proteico adicional, isto é, além de peptídeo(s) derivado(s) de beta- lactoglobulina, a composição de acordo com a presente invenção GED - 5269958v1 preferencialmente compreende aminoácidos livres, proteína de soro do leite hidrolisada, preferencialmente proteínas de soro do leite parcialmente hidrolisadas.

[099] A composição de acordo com a presente invenção preferencialmente contém menos que 1%, em peso, de proteína intacta do leite de mamífero (vaca). A composição pode compreender um componente proteico adicional selecionado a partir do grupo que consiste em aminoácidos livres, proteína de soro do leite hidrolisada e proteínas de outras fontes, como soja, ervilha, arroz, colágeno ou similares, na forma intacta, na forma parcialmente hidrolisada e/ou na forma extensivamente hidrolisada.

[0100] A presente composição preferencialmente contém pelo menos 50%, em peso, de componente proteico derivado do leite não humano, mais preferencialmente pelo menos 90%, em peso, com base no peso seco de proteína total.

[0101] A presente composição preferencialmente contém 4 a 25%, mais preferencialmente 5 a 20%, mais preferencialmente 7 a 16%, com a máxima preferência 7 a 12% de proteína, com base nas calorias totais. A presente composição, quando na forma líquida, preferencialmente contém 0,5 a 6,0 g, mais preferencialmente 0,8 a 3,0 g, até mais preferencialmente 1,0 a 2,5 g de proteína por 100 mL. A presente composição compreende preferencialmente pelo menos 7,0%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 8,0%, em peso, com a máxima preferência pelo menos 9,0% ou pelo menos 10% de proteína com base no peso seco da composição total. Preferencialmente, a presente composição compreende pelo menos 40%, em peso, mais preferencialmente no máximo 15%, em peso, preferencialmente no máximo 20%, em peso, de proteína com base no peso seco da composição total.

[0102] A composição pode compreender carboidrato(s) digerível(eis). Tipicamente, são usados carboidratos digeríveis que são conhecidos na técnica como sendo adequados para uso em composições nutricionais infantis, por exemplo, selecionados a partir de polissacarídeos digeríveis (por exemplo, GED - 5269958v1 amido, maltodextrina), monossacarídeos digeríveis (por exemplo, glicose, frutose), dissacarídeos digeríveis (por exemplo, lactose, sacarose). É particularmente adequado lactose e/ou maltodextrina. Em uma realização, a composição não compreende lactose.

[0103] O componente carboidrato digerível compreende preferencialmente pelo menos 60%, em peso, de lactose, com base no total de carboidrato digerível, mais preferencialmente pelo menos 75%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 90% de lactose, com base no total de carboidrato digerível. Sujeitos Humanos

[0104] Os sujeitos humanos ou população alvo são preferencialmente lactentes (0 a 12 meses), preferencialmente lactentes em risco de desenvolver alergia, preferencialmente alergia à proteína do leite, preferencialmente proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência alergia à proteína do leite de vaca, preferencialmente lactentes que sofrem de alergia à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência alergia à proteína do leite de vaca. Lactentes em risco são preferencialmente determinados pelo histórico familiar, preferencialmente pelo menos um dos pais sendo alérgico ou tendo um histórico de ser alérgico.

[0105] O ser humano tendo preferencialmente um alelo HLA-DRB1 específico selecionado a partir dos grupos que consistem em HLA-DRB1 *01:01, HLA-DRB1*04:01, HLA-DRB1*04:04, HLA-DRB1*04:05, HLA-DRB1 7:01 e HLA- DRB1*09:01. O HLA-DRB1 é o isotipo MHC classe II humano mais predominante (> 90%), o locus do gene HLA-DRB1 é polimórfico, enquanto o locus do gene HLA-DRA1 é monomórfico (isto é, o genótipo HLA-DRB1 determina a HLA-DR inteira), e o alelo HLA-DRB1 é expresso cinco vezes mais que seus parálogos (HLA-DRB3, -DRB4 ou -DRB5) e está presente em seres humanos. Indução de Tolerância Imune Oral GED - 5269958v1

[0106] A invenção refere-se a: - indução de tolerância imune oral à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência proteína do leite de vaca, em um sujeito ou população humana, ou - prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência proteína do leite de vaca, em um sujeito ou população humana, ou - redução do risco de ocorrência ou desenvolvimento de intolerância imune oral à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência proteína do leite de vaca, em um sujeito ou população humana, ou - aprimoramento ou melhora de tolerância imune oral à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência proteína do leite de vaca, em um sujeito ou população humana.

[0107] Conforme abordado acima no presente pedido, o sujeito humano ou população é preferencialmente um sujeito ou população de lactentes.

[0108] significa tolerância imune oral.

[0109] Em uma realização preferencial, a invenção refere-se a uma composição nutricional, conforme definido acima no presente pedido, para uso na prevenção de intolerância imune oral à proteína do leite de vaca em um sujeito lactente ou população de lactentes em risco de desenvolver alergia à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência alergia à proteína do leite de vaca. Em uma realização preferencial, a invenção refere-se a uma composição nutricional, conforme definido acima no GED - 5269958v1 presente pedido, para uso na redução do risco de ocorrência ou desenvolvimento de intolerância imune oral à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos , com a máxima preferência proteína do leite de vaca, em um sujeito lactente ou população de lactentes criança em risco de desenvolver alergia à proteína do leite, preferencialmente à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, com a máxima preferência alergia à proteína do leite de vaca, em que o hidrolisado parcial de proteína de mamífero tem pelo menos 1%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 5%, em peso, até mais preferencialmente pelo menos 10%, em peso, de peptídeos com peso molecular acima de 1 kDa e/ou mais que 0,8 µg de BLG alergênica por g de proteína total. Legendas das Figuras

[0110] Figura 1: Comparação dos espectros de fragmentação de um peptídeo representativo (SEQ ID NO: 3; mostrada na parte superior) registrado experimentalmente (B) e seu equivalente sintético (A). A diferença de massa entre os íons de fragmentos anotados do peptídeo experimental e sintético corresponde à presença de uma lisina marcada com isótopo estável no peptídeo sintético, em itálico na sequência (+8 Da). O * indica fragmentos com perda de água dos íons b correspondentes.

[0111] Figura 2: As respostas das células T após estimulação com os peptídeos identificados. Linhagens de células T específicas do leite de vaca (TCLs) de três diferentes doadores foram estimuladas com equivalentes Exemplo 1 Proteína de Soro do Leite Hidrolisada e Novo Método para Identificação de Peptídeos de Betalactoglobulina GED - 5269958v1

[0112] Uma mistura de proteína de soro ácido e proteína de soro doce desmineralizado (razão, em peso, de proteína 77:23), foi dissolvida em água (purificada por osmose reversa) e posteriormente hidrolisada sob condições específicas. Soro ácido e soro doce são comercialmente disponíveis. O soro doce é o subproduto do queijo coagulado com coalho e compreende caseinoglicomacropeptídeo (CGMP) e soro ácido (também chamado de soro azedo) é o subproduto de queijo coagulado com ácido, e não contém CGMP. Fontes adequadas para a proteína de soro ácido são soro do leite desmineralizado (Deminal, Friesland Campina, Países Baixos) e/ou concentrado proteico de soro do leite (WPC80, Friesland Campina, Países Baixos). Uma mistura de endopeptidases e exopeptidases microbianas foi usada para a hidrólise destas duas fontes de proteína com o uso do método conforme descrito no Exemplo 1 do documento WO 2011/151059. Subsequentemente, a solução de proteína hidrolisada foi seca por aspersão. A distribuição de tamanho dos peptídeos neste hidrolisado de proteína foi determinada por meio de cromatografia líquida de alta pressão de exclusão por tamanho, como conhecido na técnica. Em resumo, a área superficial total dos cromatogramas é integrada e separada em faixas de massa expressas como porcentagem da área superficial total. As faixas de massa são calibradas com o uso de peptídeos/proteínas com uma massa molecular conhecida. A proteína de soro do leite hidrolisada pode ser categorizada como hidrolisado de proteína parcial ou moderado.

[0113] O pó hidrolisado resultante foi usado como única fonte de proteína em fórmulas infantis. Dez lotes diferentes de fórmula infantil foram produzidos de maneira similar. A quantidade de betalactoglobulina, conforme determinada pelo método ELISA, como conhecido na técnica, foi entre cerca de 0,8 e 3,5 µg/g de proteína total.

[0114] A fim de determinar a presença de sequências específicas em amostras biológicas, a espectrometria de massa (MS) é o método de escolha em oposição às técnicas mais tradicionais que são atualmente usadas para GED - 5269958v1 caracterizar os hidrolisados proteicos. Um desenvolvimento recente em MS, chamado peptidômica, permite a caracterização de sequências peptídicas com grande sensibilidade e especificidade (Dallas et al. J Nutr 2015;145:425-433). Esta técnica é capaz de fechar o gap, entendendo o impacto da especificidade de sequência em relação à atividade biológica que um hidrolisado de proteína pode ter.

[0115] As amostras foram essencialmente preparadas conforme descrito por Butré et al., com a adição de uma etapa de redução e alquilação (Butre et al. Anal Bioanal Chem 2014;406):5827-5841). Todos os produtos químicos foram obtidos junto à Sigma Aldrich. Brevemente, lotes de proteína hidrolisada parcial (pHP) foram diluídos a 0,5% (v/v) com o uso de bicarbonato de amônio 50 mM, seguido pela redução de peptídeos com DTT 4 mM e alquilação com iodoacetamida 8 mM. A mistura foi clarificada por centrifugação a 20.000 x g por 10 min e diluída a 0,1% (v/v) com o uso de ácido acético 0,1 M.

[0116] Todas as amostras foram analisadas por cromatografia líquida nanoflow com o uso de um sistema Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies), acoplado on-line a um espectrômetro de massa LTQ Velos (Thermo Fisher Scientific). A cromatografia líquida em parte do sistema foi operada em uma configuração essencialmente conforme descrito anteriormente (14). Os peptídeos foram aprisionados a 5 µL/min em 100% de solvente A (ácido acético diâmetro interno, ReproSil-Pur C18- aproximadamente 100 nl/min em um gradiente de 90 min de 10 a 40% de solvente B (ácido acético 0,1 M em 8:2 (v/v) de acetonitrila/água). O eluente foi pulverizado através de bicos emissores de revestimento padrão (New Objective) conectados à coluna analítica. O espectrômetro de massa foi operado no modo dependente de dados, alternando automaticamente entre MS e MS/MS. A varredura completa de espectros de massa (m/z 300 a 1.200) foi obtida em taxa GED - 5269958v1 de zoom de varredura após acúmulo para um volume alvo de 3.000. Os cinco íons mais intensos em um limiar acima de 500 foram selecionados para colisão induzida em energia de colisão normalizada de 35% após acúmulo para um valor alvo de 10.000.

[0117] Todos os dados de MS foram processados por Proteome Discoverer (versão 2.1, Thermo Scientific). Listas de picos foram geradas com o uso de um fluxo de trabalho padrão. Foi realizada a identificação de peptídeos pesquisando a lista de picos individuais de espectros de fragmentação CID em relação a um banco de dados contendo soro do leite bovino selecionado e proteínas caseína com o uso de Mascot (versão 2.4.1, Matrix Science). Nenhuma enzima foi especificada e nenhuma clivagem faltante foi permitida. A tolerância de massa de íon precursor foi ajustada para 0,2 Da e a tolerância de massa de íon do produto para 0,5 Da. A carbamidometilação (C) foi definida como modificação fixa.

[0118] Dos 314 peptídeos identificados por esta abordagem, 101 poderiam ser atribuídos à betalactoglobulina (BLG), levando a uma cobertura de sequência de BLG de 90%. A maioria dos peptídeos restantes foram originados -lactoalbumina e albumina de soro. No total 13 peptídeos de betalactoglobulina de no mínimo 9 AAs foram identificados na região de interesse (AA nº 13 a 48) (ver Tabela 1 e Figura 1). Seis deles foram identificados consistentemente em todos os 10 lotes. As identificações não ambíguas de peptídeos foram obtidas comparando características (tempo de retenção, massa do peptídeo e fragmentação do espectro) do peptídeo experimental com a seu equivalente sintético marcado com isótopo estável. Um exemplo é mostrado na Figura 1, onde os espectros de fragmentação dos peptídeos experimentais e sintéticos mostram excelente correlação. Desse modo, foi confirmada a identidade dos seis peptídeos encontrados em todos os 10 lotes. Tabela 1 GED - 5269958v1

Sequências dos Peptídeos de Beta-Lactoglobulina Identificados em 10 Lotes Diferente de Uma Fórmula Infantil à Base de Soro do Leite Parcialmente Hidrolisado Número de Número de lotes onde o aminoácido peptídeo foi na Sequência identificado SEQ ID NO sequência como de BLG estando presente AA 1 a 22 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSL 7 6 AA 1 a 25 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMA 9 7 AA 1 a 26 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAA 10 8 AA 1 a 27 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS 10 9 AA 1 a 30 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDIS 2 10 AA 1 a 32 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL 10 11 AA 1 a 35 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ 5 12 AA 1 a 39 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPL 2 13 AA 1 a 42 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY 2 14 AA 5 a 35 QTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ 2 15 AA 6 a 32 TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL 10 3 AA 6 a 35 TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ 10 4 AA 11 a 42 DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY 10 5

[0119] Uma análise similar foi realizada com lotes de Nutrilon pepti, uma fórmula infantil contendo proteína de soro do leite extensamente hidrolisada, comercializada para o gerenciamento dietético de alergia ao leite de vaca. Os peptídeos de BLG da Tabela 1 não estavam presentes na Nutrilon pepti. Exemplo 2 Identificação In Vitro de Peptídeos Restritos a HLA-DR

[0120] A identificação de peptídeos derivados de BLG apresentados por DCs humanas foi realizada por ProImmune, conforme descrito (Lamberth et al., Sci Transl Med 2017 11;9(372):10.1126/scitranslmed.aag1286.). Brevemente, foram obtidas amostras de células mononucleares do sangue periférico de 12 doadores adultos saudáveis tipo HLA-DR. Os doadores foram GED - 5269958v1 selecionados com base nos 11 alelos HLA-DRB1 comuns (Tabela 2). O HLA- DRB1 foi priorizado neste estudo, devido ao fato de que a molécula de HLA-DR é o isotipo MHC classe II humano mais predominante (> 90%) (Sturniolo et al. Nat Biotechnol 1999;17:555-561.) e que o locus do gene HLA-DRB1 é polimórfico, enquanto o locus do gene HLA-DRA1 é monomórfico (isto é, o genótipo HLA-DRB1 determina a molécula HLA-DR inteira) (Marsh et al., 2010. Tissue Antigens 75:291-455.). Além disso, o alelo HLA-DRB1 é expresso cinco vezes mais que seus parálogos (HLA-DRB3, -DRB4 ou -DRB5) e está presente et al. Nucleic Acids Res 2016 4;44(D1):D733-

45.). Tabela 2 Informações de Doadores com Tipagem HLA-DRB1 ID do Doador DRB1_1 DRB1_2 P1 *03:01 *03:01 P2 *01:01 *04:01 P3 *01:01 *07:01 P4 *01:01 *04:05 P5 *04:01 *07:01 P6 *13:02 *14:01 P7 *03:01 *09:01 P8 *11:01 *15:01 P9 *03:01 *11:01 P10 *07:01 *15:01 P11 *03:01 *15:01 P12 *01:01 *04:04

[0121] DCs derivadas de monócitos imaturos foram geradas in vitro e maturadas na presença de proteína hidrolisada (HP) testada. As DCs foram coletadas e lisadas a fim de obter complexos HLA-DR pelo uso de um método de imunoafinidade específico. Os peptídeos foram eluídos a partir dos GED - 5269958v1 complexos HLA-DR e subsequentemente analisados por sequenciamento de alta resolução LC-MS/MS. A presença de seis proteínas endógenas relevantes (por exemplo, ITGAM, ApoB, CLIP, TFRC, FcER2/FcGR2 e LAMP-1/3) foi avaliada como um controle para este ensaio. Cada amostra de doador tinha que expressar um mínimo de 3 proteínas relevantes para ser qualificada para análise subsequente. Os dados resultantes de peptídeos restritos a HLA-DR foram compilados e avaliados com o uso do software de análise de sequência referenciando o Banco de Dados de Proteoma Humano Swiss-Prot com as sequências de itens de testes incorporadas. A probabilidade de peptídeos serem falsas descobertas foi determinada como sendo < 1%.

[0122] Com o uso do ensaio de apresentação de antígeno ProPresent® focando em sequências derivadas de BLG, 15 peptídeos relevantes com um 3). Estes peptídeos poderiam ser ainda agrupados em 2 grupos de sequência Com importância, ambos os grupos de sequências apresentaram sobreposição com a região de interesse (isto é, AA nº 13 a 48 de BLG madura). Este achado demonstrou que peptídeos derivados de BLG de interesse podem ser apresentados por moléculas de HLA-DR em DCs humanas quando incubadas com uma HP específica. Tabela 3 Fragmentos Significativos Identificados a Partir de Complexos Peptídeo- HLA-DR com Valor Esperado < 0,05 ID do Sequência do Fragmento Aminoácido Valor DRB1_1 DRB1_2 Doador (BLG madura) [SEQ ID NO] Inicial/Final Esperado P2 *01:01 *04:01 AMAASDISLLDAQSAPL - [16] 23-39 0,043 - MAASDISLLDAQSAPLR [17] 24-40 0,0013 P3 *01:01 *07:01 - MAASDISLLDAQSAPL - [18] 24-39 0,009 P4 *01:01 *04:05 DIQKVAGTWYSLAMAASDI - [19] 11-29 0,000052 - - - - VAGTWYSLAMAASDIS [20] 15-30 0,00021 GED - 5269958v1

- - - - - - GTWYSLAMAASDIS [21] 17-30 0,00037 P7 *03:01 *09:01 DIQKVAGTWYSLAMAASDI - - [19] 11-29 0,00019 DIQKVAGTWYSLAMAASDIS - [22] 11-30 0,00053 - - - - VAGTWYSLAMAASDI - - [23] 15-29 0,002 - - - - VAGTWYSLAMAASDIS - [20] 15-30 0,000019 - - - - - AGTWYSLAMAASDIS - [24] 16-30 0,0014 - - - - - - GTWYSLAMAASDI - - [25] 17-29 0,00023 - - - - - - GTWYSLAMAASDIS - [21] 17-30 0,000015 P12 *01:01 *04:04 AMAASDISLLDAQSAPL - [16] 23-39 0,028 - MAASDISLLDAQSAPL - [18] 24-39 0,042 Tabela 4 Associação de Alelo HLA-DR em Região Única de BLG Madura com Fragmentos Significativos foi Definida como Tendo Valor Esperado < 0,05 Número de Região Única Aminoáci Fragmentos ID do DRB1_1 DRB1_2 (BLG Madura) do inicial- Significativos e Doador [SEQ ID NO] final Fragmentos Individuais P2 *01:01 *04:01 AMAASDISLLDAQSAPLR [39] 23-40 2 (23-39 e 24-40) P3 *01:01 *07:01 MAASDISLLDAQSAPL [18] 24-39 1 (24-39) P4 *01:01 *04:05 DIQKVAGTWYSLAMAASDIS [22] 11-30 3 VAGTWYSLAMAASDIS [20] (11-29, 15-30 e GTWYSLAMAASDIS [21] 17-30) P7 *03:01 *09:01 DIQKVAGTWYSLAMAASDIS [22] 11-30 7 (11-29, 11-30, 15-29, 15-30, 16-30, 17-29, 17-30) P12 *01:01 *04:04 AMAASDISLLDAQSAPL [16] 23-39 2 (23-39, 24-39)

[0123] Nem todas as células doadoras apresentadoras de antígenos se ligaram aos peptídeos. Este em relação ao HLA-DRB1*03:01 em doador P1 homozigoto. Argumentos similares puderam ser aplicados para odoadores P6 e P11. Exemplo 3 Avaliação de Ligação ao MHC Classe II In Silico GED - 5269958v1

[0124] Uma limitação do ensaio de apresentação de antígeno ProPresent® é o uso de anticorpo anti-HLA-DR geral, e não um anticorpo específico contra um alelo HLA-DRB1 específico (por exemplo, anticorpo anti- DRB1*01:01), para isolar complexos peptídeo-HLA-DR de interesse. Então, com um doador com genótipos heterozigotos de HLA-DRB1, por exemplo, *01:01 e *04:01, não é certo que o alelo vai apresentar o peptídeo identificado.

[0125] Então, os peptídeos restritos a HLA-DR identificados foram computados no software IEDB MHC Class II Binding Prediction (http://tools.iedb.org/mhcii/) a fim de se avaliar a ligação de peptídeos descobertos aos alelos HLA-DRB1 selecionados, conforme descrito (Wang P, et al. PLoS Comput Biol 2008 4;4(4):e1000048.; Wang et al., BMC Bioinformatics 2010, 11:568-2105-11-568.) Foi selecionado o método de predição IEDB padrão. Para cada sequência peptídica (15 mers de comprimento), foi gerada uma classificação de percentil, comparando o escore do peptídeo em relação aos escores de cinco milhões aleatórios de 15 mers selecionados a partir do banco de dados Swiss-Prot. Uma classificação de percentil inferior indica uma afinidade mais alta de ligação do peptídeo a um alelo MHC classe II específico, no qual o IEDB recomenda fazer uma seleção baseada em uma classificação de percentil consenso dos melhores 10%. A fim de ser mais estringente com a avaliação in silico, foi feita uma seleção com base em uma classificação consenso de percentil dos melhores 3%.

[0126] Foi utilizado o software de predição de MHC classe II para avaliar se os fragmentos dos dois grupos de sequência única de BLG identificados teria alta afinidade para se ligar aos alelos HLA-DRB1 selecionados dos doadores caracterizados a partir do ensaio ProPresent®, isto é, HLA-DRB1 *01:01, *03:01, *04:01, *04:04, *04:05, *07:01 e *09:01. Conforme mostrado na Tabela 5, com um limiar arbitrário de classificação de percentil definido em < 3%, n º 11 a 30) foram preditos como tendo alta afinidade para se ligar aos alelos HLA-DRB1, isto é, DRB1*01:01, *04:01, *04:04, *04:05 e *09:01. Ao contrário, estima-se que GED - 5269958v1

- DRB1*07:01 com alta afinidade. Em conjunto, esses achados sugerem que fragmentos de AA nº 11 a 30 tiveram probabilidade mais alta de serem apresentados como epítopos de células T do que os de AA nº 23 a 39. Além disso, os dados sugerem que vários alelos HLA-DRB1 comuns poderiam apresentar fragmentos derivados dos dois grupos de sequência única derivada de BLG.

[0127] Estes grupos de sequência única de BLG (AA nº 11 a 30 e nº 23 a 39) se sobrepõem e poderiam estar juntos em uma sequência (isto é, AA nº 11 a 39). Esta sequência unida foi altamente correlacionada com um peptídeo a sequência de AA nº 11 a 42 foi submetida ao software de predição de MHC classe II. Com importância, os complexos preditos de AA nº 11 a 42 reconfirmaram os resultados preditos de duas sequências únicas identificadas in vitro (Tabela 6), sugerindo que ambas as sequências únicas de BLG poderiam ser derivadas do peptídeo de AA nº 11 a 42 que existe na fórmula testada. Além disso, partes de AA nº 11 a 42 foram preditas como tendo alta afinidade para os mesmos conjuntos de alelos HLA-DRB1, isto é, DRB1*01:01, *04:01, *04:04, *04:05, *07:01 e *09:01. Em conclusão, a avaliação in silico confirma os achados in vitro de que peptídeos derivados de BLG podem se ligar aos alelos HLA- DRB1. Tabela 5 Avaliação In Silico sobre Potenciais Complexos Peptídeo-HLA-DRB1 de Dois Peptídeos Derivados de BLG Identificados com Classificação de Percentil < 3% Fragmento de 15-mer Predito DIQKVAGTWYSLAMAASDIS (SEQ ID NO: 25) ou Classificação de Alelo HLA-DRB1 AMAASDISLLDAQSAPL (SEQ ID NO: 19) Percentil [SEQ ID NO] HLA-DRB1*09:01 AGTWYSLAMAASDIS [24] 0,86 GED - 5269958v1

Fragmento de 15-mer Predito DIQKVAGTWYSLAMAASDIS (SEQ ID NO: 25) ou Classificação de Alelo HLA-DRB1 AMAASDISLLDAQSAPL (SEQ ID NO: 19) Percentil [SEQ ID NO] HLA-DRB1*04:05 AGTWYSLAMAASDIS [24] 1,38

HLA-DRB1*04:05 VAGTWYSLAMAASDI [23] 1,40

HLA-DRB1*09:01 VAGTWYSLAMAASDI [23] 1,56

HLA-DRB1*04:05 KVAGTWYSLAMAASD [26] 2,26

HLA-DRB1*01:01 AGTWYSLAMAASDIS [24] 2,37

HLA-DRB1*04:04 AGTWYSLAMAASDIS [24] 2,44

HLA-DRB1*09:01 KVAGTWYSLAMAASD [26] 2,53

HLA-DRB1*04:01 AGTWYSLAMAASDIS [24] 2,84

HLA-DRB1*07:01 AASDISLLDAQSAPL [27] 2,39

Tabela 6 Avaliação In Silico sobre Potenciais Complexos PeptídeoIP-HLA-DRB1 de Um Peptídeo Longo Derivado de BLG com Classificação de Percentil < 3 (Melhores Ligantes 3%) Fragmento de 15-mer Predito de DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY (SEQ Classificação de Alelo HLA-DRB1 ID NO: 5) Percentil [SEQ ID NO] HLA-DRB1*09:01 GTWYSLAMAASDISL [28] 0,65

HLA-DRB1*09:01 AGTWYSLAMAASDIS [24] 0,86

HLA-DRB1*04:05 GTWYSLAMAASDISL [28] 1,30

HLA-DRB1*09:01 TWYSLAMAASDISLL [29] 1,32

HLA-DRB1*04:05 AGTWYSLAMAASDIS [24] 1,38

HLA-DRB1*04:05 VAGTWYSLAMAASDI [23] 1,40

HLA-DRB1*04:05 TWYSLAMAASDISLL [29] 1,40

HLA-DRB1*09:01 VAGTWYSLAMAASDI [23] 1,56

GED - 5269958v1

Fragmento de 15-mer Predito de DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY (SEQ Classificação de Alelo HLA-DRB1 ID NO: 5) Percentil [SEQ ID NO] HLA-DRB1*09:01 WYSLAMAASDISLLD [30] 2,12 HLA-DRB1*09:01 YSLAMAASDISLLDA [31] 2,14 HLA-DRB1*01:01 GTWYSLAMAASDISL [28] 2,18 HLA-DRB1*04:05 KVAGTWYSLAMAASD [26] 2,26 HLA-DRB1*01:01 AGTWYSLAMAASDIS [24] 2,37 HLA-DRB1*07:01 AASDISLLDAQSAPL [27] 2,39 HLA-DRB1*07:01 SDISLLDAQSAPLRV [32] 2,44 HLA-DRB1*04:04 AGTWYSLAMAASDIS [24] 2,44 HLA-DRB1*04:04 GTWYSLAMAASDISL [28] 2,44 HLA-DRB1*04:04 TWYSLAMAASDISLL [29] 2,44 HLA-DRB1*01:01 TWYSLAMAASDISLL [29] 2,46 HLA-DRB1*09:01 KVAGTWYSLAMAASD [26] 2,53 HLA-DRB1*04:04 YSLAMAASDISLLDA [31] 2,57 HLA-DRB1*04:01 GTWYSLAMAASDISL [28] 2,83 HLA-DRB1*04:01 AGTWYSLAMAASDIS [24] 2,84 HLA-DRB1*04:04 WYSLAMAASDISLLD [30] 2,91

[0128] Várias avaliações in silico confirmaram os achados in vitro ProPresent® sobre os complexos peptídeo-HLA-DR. No entanto, observou-se que alguns complexos preditos in silico não se correlacionaram com os encontrados no ensaio ProPresent® Esta discrepância pode ser explicada por um pequeno tamanho da coorte testada no ensaio ProPresent® (n = 12), pelo fato de que cada doador tinha uma combinação diferente de tipos de alelos HLA-DRB1 (isto é, variação interindividual) e/ou por uma tendência da avaliação in silico de ser mais preditiva (que exige um corte estringente). Portanto, é prudente combinar ambas as abordagens in vitro e in silico a fim de identificar os complexos peptídeo-MHC GED - 5269958v1 classe II. Exemplo 4 Ensaio de Proliferação de Células T

[0129] Peptídeos sintéticos foram obtidos junto à JPT technologies. Somente peptídeos contendo pelo menos 9 AAs foram levados em conta, pois esse é o tamanho mínimo para ligação às moléculas de MHC classe II e subsequente reconhecimento de células T. (Holland et al., 24 Immunol 1 de julho de 2013;4:172). Peptídeos sintéticos (JPT technologies) idênticos aos peptídeos identificados em todos os lotes da HP do Exemplo 1 foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (Sigma Aldrich) em uma concentração de 5,3 mM. Os peptídeos foram testados em linhagens de células T específicas do leite de vaca (TCLs) de três doadores diferentes. Os peptídeos foram testados nas linhagens de células T específicas para proteína do leite de vaca (TCLs) de três doadores lactentes, diagnosticados com alergia à proteína do leite de vaca, com idade < 1 ano, 7,5 meses e 6 anos de idade. Estas TCLs foram geradas anteriormente e mostraram reconhecer epítopos na região de interesse (AA nº 13 a 48 de BLG madura). A proliferação foi determinada conforme descrito anteriormente (Ruiter et al., Clin Exp Allergy 2006, 36(3):303-310). Índices de estimulação (SIs, razão entre a proliferação de células T estimuladas e não estimuladas por alérgeno/peptídeo)

[0130] Para confirmar que os peptídeos identificados na HP foram reconhecidos por células T, peptídeos sintéticos idênticos a estes peptídeos identificados foram testados nas TCLs humana específicas do leite de vaca. Como não foi considerada uma sobreposição entre os peptídeos identificados, cinco peptídeos foram testados (Tabela 7), que foram identificados em todos os lotes e diferiram com mais de 9A entre si. Todos os peptídeos testados foram capazes de induzir proliferação (Figura 2). No entanto, cada doador mostrou um padrão de reconhecimento diferente. Isto também foi observado com os dados de predição in silico (dados não mostrados). Todos os cinco peptídeos induziram proliferação de TCL B, sugerindo que esta TCL reconhece tanto a parte de GED - 5269958v1 sobreposição dos peptídeos (AA nº 11 a 27) como múltiplos epítopos de células T nesta região. TCL A também mostrou uma resposta proliferativa após (AA nº 1 a 32) não foi, a região contendo AA nº 28 a 32 (DISLL) foi essencial para a resposta de TCL A. Inesperadamente, a TCL C reconheceu o peptídeo de induzir uma resposta proliferativa indicando que peptídeos mais longos nem sempre se apresentam melhor. Tabela 7 Sequências dos Peptídeos de Beta-Lactoglobulina Identificados em 10 Lotes Diferente de uma Fórmula Infantil à Base de Soro do Leite Parcialmente Hidrolisado e Testados Quanto à Atividade de Proliferação de Células T Número de aminoácido na Sequência SEQ ID NO sequência de

BLG AA 1 a 27 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS 9 AA 1 a 32 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL 11 AA 6 a 32 TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL 3 AA 6 a 35 TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ 4 AA 11 a 42 DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY 5

[0131] Nem todos os peptídeos foram reconhecidos por cada doador, o que é um indicativo para a variação entre os doadores. Cada doador expressa um painel diferente de moléculas de MHC classe II. Para determinar se e que alelo HLA-DRB1 expresso pelos doadores apresentaram os peptídeos, foi usado o mesmo algoritmo, conforme descrito acima. A predição in silico confirmou que alelos HLA-DRB1 (*11:01 e *04:04) expressos pelo doador B foram capazes de apresentar todos os peptídeos. Com base nos dados do algoritmo, TCL A somente reconhece o peptídeo DIQ...RVY (AA nº 11 a 42), no entanto, esta TCL GED - 5269958v1 mostrou uma resposta proliferativa após estimulação com quatro dos cinco peptídeos. Uma possível explicação pode ser a de que os outros três peptídeos não foram apresentados por HLA-DRB1, mas por outras moléculas de MHC classe II.

[0132] Em conclusão, os Exemplo 1 a 4 demonstram que um hidrolisado de proteína de soro do leite contém epítopos de células T funcionais. Peptídeos de beta-lactoglobulina específicos foram identificados como estando presentes, que são peptídeos restritos a HLA-DRB1. Estes são apresentados e reconhecidos por células T de diferentes doadores, incluindo doadores saudáveis e lactentes alérgicos à proteína do leite de vaca. Esta interação foi confirmada pela análise in silico. A HP pode, portanto, estimular o desenvolvimento de imunotolerância oral à proteína. Exemplo 5 A Mistura Simbiótica Mostra Um Efeito Aprimorado Adicional de Indução de Tolerância, em Comparação aos Probióticos e Prebióticos Isoladamente

[0133] Diversos estudos publicados apoiam a noção de que antígenos dietéticos (incluindo peptídeos) dentro do lúmen intestinal podem ser absorvidos e, subsequentemente, capturados e apresentados por células apresentadoras de antígeno intestinal, isto é, mecanismos de amostragem de antígeno, sem a necessidade de uma barreira intestinal rompida. Existem pelo menos dois mecanismos distintos que trabalham continuamente para amostra de antígenos dietéticos no estado saudável, isto é, transcitose mediada por células M/microfold passagem de antígeno associado à célula caliciforme. Ambas as vias fornecem antígenos dietéticos para DCs CD103+ da lâmina própria intestinal, que em contrapartida poderiam marcar (imprint) moléculas que se alojam no intestino (gut-homing) em células T e B, poderiam promover a diferenciação de células plasmáticas produtoras de IgA, bem como poderiam gerar Tregs intestinais, uma peça chave no estado de hiper-responsividade para antígeno alimentar conhecido como tolerância oral. Isto sugere que peptídeos na GED - 5269958v1

HP testada podem ser absorvidos por via oral, seguido por captura de antígeno e apresentação por Dcs CD103+ intestinais e subsequentemente culminam na geração de Tregs funcionais.

[0134] Para o desenvolvimento de tolerância oral, epítopos de células T na HP testada precisaram ser apresentados mediante certas circunstâncias. Em adição à ativação de TCR, a co-estimulação e a sinalização de citocinas desempenham um papel importante na geração de Tregs. Probióticos ou prebióticos desempenham um papel importante na criação de um ambiente correto para esta predisposição para as Tregs. O efeito preventivo de peptídeos de BLG sintéticos foi reforçado em combinação com uma dieta probiótica ou prebiótica.

[0135] Para demonstrar o efeito de probióticos, prebióticos e simbióticos foi realizado um experimento similar, conforme descrito no exemplo 4 do documento WO 2016/148572, com o mesmo protocolo e a mesma identificados na Tabela 8. Tabela 8 Pepmix de Acordo com o documento WO 2016/148572 Peptídeo Sequência 1 (18AA) SEQ ID NO: 33 QKVAGTWYSLAMAASDIS 2 (18AA) SEQ ID NO: 34 WYSLAMAASDISLLDAQS 3 (18AA) SEQ ID NO: 35 AASDISLLDAQSAPLRVY 4 (18AA) SEQ ID NO: 36 LLDAQSAPLRVYVEELKP

[0136] Uma série de dietas foram comparadas: (a) Dieta simbiótica do Exemplo 1 do documento WO 2016/14472 (1%, em epso, de scFOS/lcFOS em uma razão, em peso, de 9:1 + 2%, em peso de 2 x 109 ufc/g de Bifidobacterium breve M-16V, (b) a dieta probiótica do Exemplo 4 do documento WO 2016/148572 com 2%, em peso, de 2 x 109 ufc/g de Bifidobacterium breve M-16V, e (c) a dieta prebiótica contendo 1%, em peso, de scFOS/lcFOS, com GED - 5269958v1 razão, em peso, de 9/1.

[0137] Fruto-oligossacarídeos de cadeia curta (sc-) e de cadeia longa (lc-) estavam comercialmente disponíveis como Raftilose P95 (Orafti) e Raftiline HP, respectivamente.

[0138] Todos os grupos foram pré-tratados com o pepmix e uma das dietas acima, foram sensibilizados com soro do leite + toxina da cólera e desafiados com soro de leite.

[0139] Após desafio com soro do leite, o inchaço da orelha dos camundongos que consumiram (c) a dieta scFOS/lcFOS foi de cerca de 174 µm, dos camundongos que consumiram (b) a dieta probiótica foi de cerca de 158 µm e dos camundongos que consumiram (a) a dieta simbiótica foi de cerca de 112 µm. O inchaço na orelha no grupo simbiótico (a) foi estatisticamente significativamente menor que no grupo scFOS/lcFOS correspondente (c), e houve uma tendência de menor resposta em comparação ao grupo probiótico (b) (p = 0,08). Estes resultados são indicativos de um efeito aprimorado adicional na indução de imunotelerância oral: - ao usar uma bactéria produtora de ácido láctico, em particular, uma linhagem de Bifidobacterium da espécie B. breve, e - particularmente ao usar uma bactéria produtora de ácido láctico em combinação com ONDs. Exemplo 6 Domínios de Ligação ao MHC nos Peptídeos Naturais Identificados do Hidrolisado Versus Peptídeos de Beta-Lactoglobulina Sintéticos Método

[0140] As sequências dos peptídeos de beta-lactoglobulina que foram identificados na fórmula infantil hidrolisada (ID_PEP) e as sequências dos peptídeos de beta-lactoglobulina sintéticos que foram publicados no documento WO 2016/148572 (SYN_PEP, Tabela 9) foram testadas in silico com o Software IEDB MHC Class II Binding Prediction(http://tools.iedb.org/mhcii/) para determinar o número de domínios de ligação ao MHC classe II em cada peptídeo.

GED - 5269958v1

No software, o método de predição IEDB recomendado e o conjunto completo de referência HLA foram selecionados. Esta referência HLA fornece uma cobertura populacional de > 99%. O software calcula uma classificação de percentil, comparando a afinidade de ligação do domínio de ligação predito a um grande conjunto de peptídeos. Quanto mais alta a afinidade, menor a classificação de percentil. Neste experimento, os melhores ligantes 2% foram selecionados. Resultados

[0141] O número de domínios de ligação ao MHC classe II nos peptídeos identificados é mais alto que nos peptídeos sintéticos (consulte Tabela 9). O software previu pelo menos um domínio de ligação para todos os peptídeos identificados e, no total, seis domínios diferentes. Para os peptídeos sintéticos foram preditos quatro domínios diferentes. No entanto, estes domínios foram todos derivados de uma sequência, ou seja, SYN_PEP_1. Nenhum domínio de ligação ao MHC classe II foi predito para os outros dois peptídeos sintéticos. Tabela 9 Número de Domínios de Ligação ao MHC Classe II por Peptídeo de Beta- Lactoglobulina Predito por IEBD Número de domínios Peptídeo Sequência de ligação ao MHC classe II ID_PEP_1 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS 1 ID_PEP_2 LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL 6 ID_PEP_3 TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL 6 ID_PEP_4 TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ 6 ID_PEP_5 DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY 6 SYN_PEP_1 QKVAGTWYSLAMAASDIS 4 SYN_PEP_2 WYSLAMAASDISLLDAQS 0 SYN_PEP_3 AASDISLLDAQSAPLRVY 0

[0142] O número de domínios de ligação ao MHC classe II é maior nos peptídeos identificados do que nos peptídeos sintéticos. Em outras palavras, mais epítopos de células T podem ser derivadas dos peptídeos identificados a GED - 5269958v1 partir dos peptídeos sintéticos. Portanto, a probabilidade de que os peptídeos identificados sejam apresentados às células T é mais alta. Esta apresentação às células T é um requisito para indução de tolerância imune oral. Exemplo 7 Expressão de HLA-DR em Células Dendríticas, após Maturação com Uma Bactéria Produtora de Ácido Láctico

[0143] Método: Os monócitos (células CD14+) foram cultivadas por 7 dias com GM-CSF e IL-4 para gerar células dendríticas imaturas (DCs). Após 7 dias, as DCs imaturas foram lavadas e incubadas tanto com meio LPS (100 ng/mL) como com Bifidobacterium breve M-16V (Morinaga) em uma razão de 10:1 de bactérias:DC. Após 48 horas, as DCs maduras foram coletadas e coradas com anticorpo anti-HLA-DR humano marcado com APC-Cianina7 para determinar a expressão de HLA-DR na superfície das células. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo BD FACS Canto com o software FACS DIVA. A expressão de HLA-DR é apresentada em média de intensidade de fluorescência (IFM). Resultados

[0144] A maturação com Bifidobacterium breve M-16V (M16v-DCs) aumenta a expressão de HLA-DR para um nível similar ao LPS (LPS-DCs, consulte a Tabela 10). Tabela 10 A Expressão de HLA-DR em Diferentes Subtipos de Células Dendríticas Expressão de HLA-DR DCs IFM (SD) DCs imaturas 11338 (1919,1) LPS-DCs 24676 (9694,4) M16v-DCs 21714 (1516) DCs = células dendríticas, MFI = média de intensidade de fluorescência, SD = desvio padrão

[0145] Bifidobacterium breve M-16V aumenta a expressão de GED - 5269958v1 moléculas HLA-DR na superfície das células dendríticas. Uma expressão aumentada de HLA-DR é indicativo de uma maior apresentação de peptídeos às células T. Exemplo 8 Fórmula Infantil

[0146] Uma fórmula infantil em pó embalada com instruções que deve ser reconstituído com água a 40 ºC com 3 colheres de pó (13,74 g) adicionadas a 90 mL de água, resultando em um volume final de 100 mL. O produto é adequado desde o nascimento até aos 6 meses.

[0147] A fórmula infantil contém 66 kcal por 100 mL, 1,5 g de proteína (a proteína de soro do leite hidrolisada do Exemplo 1), 3,3 g de gordura (óleos vegetais, óleo microbiano (single cell oil) e óleo de peixe, compreendendo 0,4%, em peso, de DHA e 0,35%, em peso, de ARA, base nos ácidos graxos totais), 7,2 g de carboidratos digeríveis (principalmente lactose), 0,8 g de oligossacarídeos não digeríveis (uma mistura de 9/1 p/p de scGOS e lcFOS), Bifidobacterium breve M-16V em uma quantidade de cerca de 3*10 7 ufc/g, e vitaminas, sais minerais, oligoelementos e outros micronutrientes de acordo com diretivas internacionais para fórmulas infantis .

GED - 5269958v1

Claims

Reivindicações

1. USO DE UM HIDROLISADO DE PROTEÍNA, caracterizado por ser para a fabricação de composição nutricional para: - indução de tolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - aprimoramento ou melhora de tolerância imune oral à proteína do leite, em que a composição nutricional compreende um hidrolisado de proteína do leite de mamífero, preferencialmente leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente do leite de vaca, em que o hidrolisado de proteína compreende pelo menos um peptídeo tendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5 e pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, a dita composição preferencialmente ainda compreende pelo menos uma linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição compreender menos que 6 µg de beta-lactoglobulina alergênica, preferencialmente menos que 3,5 µg de beta-lactoglobulina alergênica, por g de proteína total.

3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela composição compreender pelo menos 50%, em peso, preferencialmente pelo menos 95%, em peso, de proteína de soro do leite hidrolisada, com base em proteína total.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender menos que 10%, em peso, preferencialmente menos que 6%, em peso, de peptídeos ou proteínas que têm um tamanho de 5 GED - 5269957v1 kDa ou acima, com base em proteína total.

5. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por pelo menos 1%, em peso, de peptídeos ou proteínas presentes na composição terem um tamanho de 1 kDa ou acima, com base em proteína total, preferencialmente pelo menos 5%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 10%, em peso, com base em proteína total.

6. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela composição compreender uma quantidade de beta- lactoglobulina alergênica acima de 0,8 µg por g de proteína total.

7. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela proteína do leite ser de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente proteína do leite de vaca.

8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo sujeito humano ser um lactente.

9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo sujeito humano estar em risco de desenvolver ou sofrer de alergia à proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, e em que o sujeito humano é preferencialmente um lactente.

10. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela composição compreender uma linhagem de bactéria produtora de ácido láctico pertencente ao gênero Bifidobacterium, preferencialmente à espécie Bifidobacterium breve.

11. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender um ou mais oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeo, dextrina não digerível, galacto-oligossacarídeo, xilo-oligossacarídeo, arabino- oligossacarídeo, arabinogalacto-oligossacarídeo, gluco-oligossacarídeo, glucomanano-oligossacarídeo, galactomanano-oligossacarídeo, manano- GED - 5269957v1 oligossacarídeo, quito-oligossacarídeo, oligossacarídeo de ácido urônico, sialil- oligossacarídeo e fuco-oligossacarídeo, e misturas dos mesmos, preferencialmente fruto-oligossacarídeos.

12. USO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelos oligossacarídeos não digeríveis compreenderem pelo menos dois oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos, preferencialmente uma mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia longa com fruto-oligossacarídeos de cadeia curta ou com galacto-oligossacarídeos de cadeia curta.

13. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa, preferencialmente ácido docosahexaenoico (DHA), mais preferencialmente pelo menos 0,35%, em peso, de DHA com base nos ácidos graxos totais.

14. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por ser uma fórmula para lactentes, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância.

15. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, caracterizada por compreender: a. uma linhagem de bactéria produtora de ácido láctico pertencente ao gênero Bifidobacterium; b. um hidrolisado de proteína do leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, em que o hidrolisado de proteína do leite compreende pelo menos um peptídeo tendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5 e pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; c. menos que 6 µg de beta-lactoglobulina alergênica, preferencialmente menos que 3,5 µg de beta-lactoglobulina, por g de proteína total, d. menos que 10%, em peso, de peptídeos ou proteínas que têm um tamanho de 5 kDa ou acima, com base em proteína total, e e. pelo menos 50%, em peso, preferencialmente pelo menos 95%, em GED - 5269957v1 peso, de proteína de soro do leite hidrolisada, com base em proteína total, f. opcionalmente um ou mais oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeo, dextrina não digerível, galacto-oligossacarídeo, xilo-oligossacarídeo, arabino- oligossacarídeo, arabinogalacto-oligossacarídeo, gluco-oligossacarídeo, glucomanano-oligossacarídeo, galactomanano-oligossacarídeo, manano- oligossacarídeo, quito-oligossacarídeo, oligossacarídeo de ácido urônico, sialil- oligossacarídeo e fuco-oligossacarídeo, e misturas dos mesmos, preferencialmente fruto-oligossacarídeos, e g. opcionalmente ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa, preferencialmente ácido docosahexaenoico (DHA), mais preferencialmente pelo menos 0,35%, em peso, de DHA com base nos ácidos graxos totais.

16. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela quantidade de beta-lactoglobulina alergênica estar acima de 0,8 µg por g proteína e/ou em que a composição compreende mais que 1%, em peso, de peptídeos ou proteínas com um tamanho de 1 kDa ou acima, com base em proteína total, mais preferencialmente pelo menos 5%, em peso, mais preferencialmente pelo menos 10%, em peso.

17. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 16, caracterizado pela linhagem de bactéria produtora de ácido láctico pertencer à espécie Bifidobacterium breve.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizada pelos oligossacarídeos não digeríveis compreenderem pelo menos dois oligossacarídeos não digeríveis selecionados a partir do grupo que consiste em fruto-oligossacarídeos e galacto-oligossacarídeos, preferencialmente uma mistura de fruto-oligossacarídeos de cadeia longa com fruto-oligossacarídeos de cadeia curta ou com galacto-oligossacarídeos de cadeia curta.

19. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada por compreender 105 a 1011 ufc de bactérias produtoras de GED - 5269957v1 ácido láctico por g de peso seco.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizada por compreender pelo menos 2%, em peso, dos oligossacarídeos não digeríveis, com base no peso seco.

21. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizada por ser uma fórmula infantil, fórmula de seguimento ou fórmula para criança de primeira infância.

22. MÉTODO PARA FORNECER NUTRIÇÃO PARA UM SUJEITO HUMANO EM RISCO DE DESENVOLVER OU QUE SOFRE DE ALERGIA, mais preferencialmente alergia à proteína do leite, caracterizado por compreender administrar ao sujeito humano a composição nutricional, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 21.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo sujeito humano ser um lactente ou criança de primeira infância, preferencialmente um lactente.

24. MÉTODO (NÃO TERAPÊUTICO), para: - indução de tolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - prevenção ou tratamento de intolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - redução do risco de desenvolver intolerância imune oral à proteína do leite; e/ou - aprimoramento ou melhora de tolerância imune oral à proteína do leite, em um sujeito humano, caracterizado por compreender a administração ao sujeito de uma composição nutricional que compreende um hidrolisado de proteína do leite de mamífero, preferencialmente leite de uma espécie do gênero Bos, Bison, Bubalus ou Capra, mais preferencialmente do gênero Bos, preferencialmente do leite de vaca, em que o hidrolisado de proteína compreende pelo menos um peptídeo tendo uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5 e pelo menos um peptídeo que tem uma sequência de acordo GED - 5269957v1 com a SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, a dita composição preferencialmente ainda compreende pelo menos uma linhagem de uma bactéria produtora de ácido láctico.

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