BR112020015149A2 - Materiais de automontagem coordenados por interface de complexos vivos (clicsam) - Google Patents

Materiais de automontagem coordenados por interface de complexos vivos (clicsam) Download PDF

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BR112020015149A2
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Nikolai Sopko
Pratima Labroo
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Abstract

é revelada na presente invenção uma composição compreendendo um agregado celular da interface do tecido de mamífero heterogêneo estimulado que é capaz de produzir tecido polarizado funcional quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo.

Description

MATERIAIS DE AUTOMONTAGEM COORDENADOS POR INTERFACE DE COMPLEXOS VIVOS (CLICSAM) REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica prioridade ao pedido provisório U.S. nº 62/622,489 depositado 26 de janeiro de 2018, conteúdo do qual é incorporado por referência em sua totalidade na presente invenção.
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente invenção refere-se geralmente a uma composição sintetizada de interface, materiais celulares e não celulares autopropagáveis (um agregado) que podem ser usados para gerar ou regenerar material(is) funcional(is), tecido(s), sistema(s) de tecido e/ou compartimento(s) de tecido em uma área na qual esse agregado de materiais é colocado, tornado presente ou materializado. A presente invenção também se refere geralmente a: 1.) um método de produção de tal composição; 2.) manutenção, propagação, e/ou armazenamento de tal composição 3.) uso de tal composição. Essa composição pode ser chamada de Material de Automontagem Coordenado por Interface de Complexo Vivo (“CLICSAM”).
[003] Mais particularmente, a presente invenção está no(s) campo(s) técnico(s) de materiais e substratos neogerativos e regenerativos que podem ser utilizados em uma variedade de campos técnicos relacionados que podem incluir, mas não estão limitados a: a) Medicina, b) Prática médica, c) Dispositivos, d) Biologia, e) Terapêutica, f) Síntese de pequenas moléculas, g) Síntese macromolecular, h) Síntese de materiais celulares, i) Síntese subcelular, j) Manipulação de tecidos, k) Desenvolvimento de biorreatores e/ou suporte de suporte biorreativo, l) Pesquisa médica, m) Fabricação médica e/ou biomédica, n) Prática veterinária, o) Pesquisa veterinária, p) Aplicações em biologia molecular, q) Química e/ou fabricação química e/ou manipulação química, r)
Ciências materiais, s) Fabricação de alimentos e/ou produção de alimentos, t) Fabricação de nutracêuticos, u) Fabricação de suplementos, v) Desenvolvimento de cosméticos, w) Sistemas de vida composta, x) Sistemas de inteligência artificial, y) Agricultura, z) Exploração e/ou esforços de pesquisa espacial, aa) Defesa, armas ou aplicação(ões) militar(es), bb) Transplante, imunologia, tolerância e/ou modulação imune de materiais.
ANTECEDENTES
[004] Uma variedade de tecnologias e/ou sistemas sintéticos, inorgânicos, orgânicos e compostos foram desenvolvidos que dependem de forças termodinâmicas intrínsecas para causar memória estrutural ou memória de montagem para promover mudanças nos sistemas. Esse tipo de recuperação de estrutura ou montagem em um sistema é porque é termodinamicamente favorável para que tais materiais se organizem de tal maneira, não porque o material reconheça, detecte, calcule e autodetermine a resposta ao ambiente em que o material é/foi colocado.
[005] A geração, regeneração, materialização e/ou propagação de materiais, substratos, tecido(s) e/ou sistema(s) de tecido organizados hierarquicamente polarizados funcionalmente permaneceram de interesse em uma variedade de campos. Apesar de muitos interesses e pesquisas significativas sobre o desenvolvimento de composições de materiais e/ou mecanismos de criação de formas sintéticas, substitutivas ou alteradas de materiais, substratos ou elementos de tecido autopropagáveis, esse assunto não foi criado, estabelecido ou desenvolvido de maneira tangível.
[006] A teoria, o ensino e a prática convencionais continuaram a iterar três abordagens tradicionalmente reducionistas para aqueles esforços em busca de manipulação, geração, regeneração, desenvolvimento e/ou materialização de sistemas de tecidos vivos dinâmicos. Essas três abordagens iterativas tradicionais têm sido comumente referidas na literatura publicada como uma tríade de manipulação de tecidos, com cada ponto da tríade sendo associado à base do(s) material(is) manipulado(s). Essas abordagens podem ser resumidas como: 1.) uma abordagem com base em célula; 2.) uma abordagem com base molecular; e 3.) uma abordagem com base em suporte e/ou matriz.
[007] Em teoria, ensino e prática, essas abordagens foram classicamente promovidas e utilizadas em singularidade, sistemas singulares derivatizados, combinação(ões) iterativa(s) e/ou associações combinatórias.
[008] A abordagem com base em células geralmente se concentra em isolamento, cultivo, desenvolvimento ou desenvolvimento de ação diretiva de uma entidade celular para regenerar célula(s), produto(s) relacionado(s) a tecido(s) e/ou promover, acionar, dirigir ou comandar células, processos celulares e/ou tecidos em direção a uma via biológica ou resultado funcional.
[009] A abordagem com base molecular geralmente foca na liberação de um agente (por exemplo fator(es), fármaco(s), um agente(s) diretivo(s) de gene(s), partícula(s)) para promover, acionar, direcionar ou comandar células, processos celulares e/ou tecidos em direção a uma via biológica ou resultado funcional.
[010] A abordagem com base em suporte ou matriz foca no uso de alguma forma de uma estrutura de suporte (por exemplo, um suporte, matriz, fibra, partícula), vetorial e/ou veículo, em um sistema que promove: 1.) migração, diferenciação e/ou propagação celular dos tecidos nativos circundantes e/ou
2.) atua como um veículo de agentes e/ou entidades celulares no sistema de tecido.
[011] As três abordagens tradicionais são reducionistas e incompletas uma vez que tais abordagens são montadas de uma maneira que visa a busca pelo desenvolvimento, síntese e/ou manipulação de sistemas complexos resultantes a partir de células, agentes e estruturas finitos e restritos que são sinteticamente limitadas e faltam capacidade dinâmica. Como tal, essas abordagens limitadas são incongruentes com a vida, pois tentam agir como uma resposta finita e completa a um sistema complexo e em evolução (um vazio de substrato de tecido e/ou material vivo que requer geração, regeneração e/ou autopropagação substantiva e funcional).
[012] Além disso, após a liberação de tal(is) abordagem(s) convencional(is) porém limitada(s), o sistema receptor, complexo, em evolução, reativo e dinâmico que existe dentro de um organismo, sistema ou ambiente reage de forma aguda e/ou crônica reage ou responde para ou ao material estrangeiro, sintético, diferente e/ou alterado compreendendo a estrutura derivada da tríade, célula e/ou agente liberada. Essas reações, por sua vez, geralmente resultam em alterações drásticas para e/ou no produto liberado, bem como no ambiente nativo local, no(s) sistema(s) e via(s) associado(s) interdependente(s).
[013] As ações incongruentes entre 1.) abordagens incompletas derivadas da tríade tradicional implementada (célula, agente e/ou estruturas) e 2.) o sistema complexo reativo resulta em falha na liberação da verdadeira geração, regeneração e/ou propagação do sistema completo (ou seja, materiais, substratos, tecido(s) e/ou sistema(s) de tecido organizados hierarquicamente polarizados funcionalmente.
[014] Assim, permanece a necessidade de uma tecnologia que possa ser utilizada para a geração, regeneração, materialização e/ou propagação de materiais, substratos, tecido(s) e/ou sistema(s) de tecido organizados hierarquicamente polarizados funcionalmente.
SUMÁRIO
[015] Um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição compreendendo um agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado que é capaz de produzir tecido polarizado funcional quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[016] Um aspecto da presente invenção refere-se a uma composição compreendendo pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero. A interface de material de mamífero compreende entidades celulares de núcleo potente e entidades de suporte. A composição é capaz de montar material funcional.
[017] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de produção de uma composição. O método compreende isolar pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero compreendendo entidades celulares de núcleo potente e entidades de suporte. O método compreende adicionalmente desenvolver uma interface reativa e estimulada para fornecer a composição. A composição é capaz de montar material funcional.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[018] A patente ou arquivo do pedido contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) em cores serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[019] As Figuras 1a-1e ilustram uma composição de origem óssea em um sistema de modelo de defeito craniano.
[020] As Figuras 2a e 2b ilustram uma composição de origem cutânea em um sistema modelo cutâneo.
[021] A Figura 3 mostra um mapa de calor exibindo mudanças dobradas na expressão gênica de fatores de angiogênese para um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) em comparação com osso nativo no estudo de ossos longos de coelho do Exemplo 5.
[022] A Figura 4 mostra um mapa de calor exibindo mudanças dobradas na expressão gênica de genes da osteogênese para um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) em comparação com osso nativo no estudo de ossos longos de coelho.
[023] A Figura 5 mostra um mapa de calor exibindo mudanças dobradas na expressão gênica de genes de cicatrização de feridas para um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) em comparação com osso nativo no estudo de ossos longos de coelho.
[024] A Figura 6 mostra imagens DSLT de osso nativo, criação de defeitos, tratamento e imagens de ponto final ex vivo na semana pós-operatória (POW) 12 para um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) e o grupo não tratado no estudo de ossos longos de coelho.
[025] A Figura 7 mostra imagens de CT em série Vimago 3D e 2D adquiridas para um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) e o grupo não tratado no estudo de ossos longos de coelho pós-operatório e a cada 2 semanas por 12 semanas. Cada grupo é representado por um animal.
[026] A Figura 8 mostra imagens de microCT em 3D e 2D adquiridas para um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) e o grupo não tratado no estudo de ossos longos de coelho ex vivo na semana pós- operatória (POW) 12. Cada grupo é representado por um animal.
[027] A Figura 9 mostra imagens de luz tiradas usando o Leica M205 FA de ambos os lados A e B de duas amostras de um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) e o grupo não tratado no estudo de ossos longos de coelho. Antes das imagens do grupo tratado com AHBC serem tiradas o rádio foi removido da ulna para dar uma representação mais clara da região de recrescimento. O grupo não tratado possui um rádio anexado devido à falta de recrescimento na área do defeito.
[028] A Figura 10 mostra, para o estudo de ossos longos de coelho, uma amostra não tratada na Fileira 1 com o rádio ainda intacto devido à falta de recrescimento e uma amostra tratada com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) na Fileira 2. A e B são fotografias de lados opostos da mesma amostra. C e D são micrografias de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de lados opostos da mesma amostra. E é uma segunda imagem harmônica multifotônica (MP).
[029] A Figura 11 mostra varreduras de pontos de superfície médias a partir de osso nativo, defeitos não tratados e um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de ossos longos de coelho.
[030] A Figura 12 mostra varreduras de linha de superfície a partir de osso nativo, defeitos não tratados e um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de ossos longos de coelho. O vermelho representa uma intensidade de Raman alta, enquanto o azul representa uma intensidade baixa. Vista combinada de intensidade de varredura de linha (esquerda) e vista z de varredura de linha (direita).
[031] A Figura 13 mostra varreduras da área de superfície de osso nativo, defeitos não tratados e um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de ossos longos de coelho. As varreduras foram feitas na interface com defeito nativo. O vermelho representa uma intensidade de Raman alta, enquanto o azul representa uma intensidade baixa. A intensidade de hidroxiapatita está na faixa de 950 a 965 cm-1.
[032] A Figura 14 ilustra a frequência de fusão espinhal no estudo de coluna vertebral de coelho do Exemplo 6.
[033] A Figura 15 mostra a densidade mineral óssea em comparação com o tratamento com autoenxerto no estudo de coluna vertebral de coelho usando um teste de comparação múltipla de Dunnett.
[034] A Figura 16 mostra varreduras de pontos de seção transversal médias a partir de osso nativo e grupos tratado incluindo um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de coluna vertebral de coelho.
[035] A Figura 17 mostra varreduras de linha de seção transversal a partir de grupos tratados incluindo um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de coluna vertebral de coelho.
[036] A Figura 18 mostra imagens CT em série Vimago tomadas ao longo de 8 semanas incluindo um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de crânio de coelho. Imagens CT 3D e 2D são mostradas para um animal representativo de cada grupo.
[037] A Figura 19 mostra imagens microCT ex vivo capturadas na semana pós-operatória (POW) 8 no estudo de crânio de coelhos. Imagens CT 3D e 2D são mostradas para um animal representativo de cada grupo.
[038] A Figura 20 mostra as medições de densidade mineral óssea para grupos de tratamento, incluindo um grupo de tratamento com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de crânio de coelho na semana pós-operatória (POW) 8. Os valores representam média ± desvio padrão. As comparações foram feitas usando uma ANOVA unidirecional comum com o Teste de Comparações Múltiplas de Dunnett e um p <0,05 considerado significativo.
[039] A Figura 21 mostra as medições de densidade mineral óssea trabecular para grupos de tratamento, incluindo um grupo de tratamento com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de crânio de coelho na semana pós-operatória (POW) 8. Os valores representam média ± desvio padrão. As comparações foram feitas usando uma ANOVA unidirecional comum com o Teste de Comparações Múltiplas de Dunnett e um p <0,05 considerado significativo.
[040] A Figura 22 mostra porcentagem de volume ósseo para volume tecidual (BV/TV) para grupos de tratamento incluindo um grupo de tratamento com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de crânio de coelho na semana pós-operatória (POW) 8. Os valores representam média ± desvio padrão. As comparações foram feitas usando uma ANOVA unidirecional comum com o Teste de Comparações Múltiplas de Dunnett e um p <0,05 considerado significativo.
[041] A Figura 23 mostra varreduras de pontos de superfície médias a partir de osso nativo, defeitos não tratados e um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de crânio de coelho.
[042] A Figura 24 mostra varreduras de linha de superfície representativa a partir de osso nativo, defeitos não tratados e um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de crânio de coelho. O vermelho representa uma intensidade de Raman alta, enquanto o azul representa uma intensidade baixa. Vista combinada de intensidade de varredura de linha (esquerda) e vista z de varredura de linha (direita).
[043] A Figura 25 mostra varreduras de área de seção transversal a partir de osso nativo, defeitos não tratados e um grupo tratado com composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) no estudo de crânio de coelho. O vermelho representa uma intensidade de Raman alta, enquanto o azul representa uma intensidade baixa. Intensidade de colágeno na faixa de 880 a 840 cm-1 (esquerda), intensidade de hidroxiapatita na faixa de 950 a 965 cm-1 (centro) e imagem de referência (direita).
[044] A Figura 26 mostra imagens DSLT de osso nativo, criação de defeitos, tratamento e imagens de ponto final ex vivo na semana pós- operatória (POW) 8 para cada grupo de tratamento no estudo de crânio de coelho.
[045] A Figura 27 mostra imagens microscópicas compostas V16 representativas de crânio ex vivo para cada grupo de tratamento no estudo de crânio de coelho.
[046] A Figura 28 mostra a microscopia de uma composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) tratada e defeitos não tratados no estudo de crânio de coelhos. Seções transversais de osso craniano de 1 mm de espessura ex vivo foram retratadas usando microscopia de segunda geração harmônica (Fileira A), corada para núcleos (azul) com Sondas Prontas NucBlue (nº de catálogo: R37605, Sondas Moleculares, Eugene, OR, EUA), Hidroxiapatita (verde) com Ensaio de Mineralização de Osteoimagem (nº de catálogo: PA-1503, Lonza, Walkersville, MD, EUA) e actina (vermelho) com ActinRed-555 (nº de catálogo: R37112, Thermofisher, Eugene, OR, EUA), retratado com microscopia confocal usando uma objetiva 10X (Fileira B), microscopia de luz composta (Fileira C), detector HDBSD em SEM (Fileira D) e detector C2DX em SEM (Fileira E). São mostradas imagens SHG, SEM e imagens de campo claro de amostras seccionadas de 4uM desmineralizadas e montadas em lâmina de vidro (Fileiras F-J).
[047] A Figura 29 mostra um mapa de calor produzido a partir do agrupamento hierárquico dos genes de via de osteogênese, cicatrização de feridas e angiogênese (eixo y) a partir de 4 amostras de crânio de coelho pré e 5 pós-processadas (eixo x) representativas de vias moleculares alteradas em composições de origem óssea versus tecido ósseo nativo. Vermelho escuro e amarelo estão associados aos níveis mais alto e mais baixo de expressão gênica, respectivamente.
[048] A Figura 30 mostra um gráfico de vulcão mostrando diferenças de expressão gênica entre pré (n = 4) e pós (n = 5) crânio de coelho para genes de via de osteogênese.
[049] A Figura 31 mostra um gráfico de vulcão mostrando diferenças na expressão gênica entre pré (n = 4) e pós (n = 5) crânio de coelho para genes de via de cicatrização de feridas.
[050] A Figura 32 mostra um gráfico de vulcão mostrando diferenças de expressão gênica entre pré (n = 4) e pós (n = 5) crânio de coelho para genes de via de angiogênese.
[051] A Figura 33 mostra um mapa de calor representativo das vias moleculares alteradas em uma composição de origem hepática (por exemplo, AHLC) versus tecido hepático nativo. Vermelho escuro e amarelo estão associados aos níveis mais alto e mais baixo de expressão gênica, respectivamente.
[052] A Figura 34A mostra um mapa de calor representativo da análise de transcriptoma direcionada avaliando as vias de marcadores de cicatrização de feridas, células-tronco e superfície celular em uma composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) versus tecido cutâneo nativo. Vermelho escuro e amarelo estão associados aos níveis mais alto e mais baixo de expressão gênica, respectivamente.
[053] A Figura 34B mostra um gráfico de vulcão mostrando aumento da expressão de marcadores de células-tronco em uma composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) em relação ao tecido cutâneo nativo.
[054] A Figura 35 mostra força versus deslocamento para uma composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) versus osso longo de coelho nativo.
[055] A Figura 36 mostra mapas químicos de hidroxiapatita para uma composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) (direita) versus osso longo de coelho nativo (esquerda).
[056] A Figura 37 mostra força versus deslocamento para uma composição derivada de gordura versus gordura nativa (humana).
[057] A Figura 38 mostra força versus deslocamento para uma composição derivada de músculo versus músculo nativo (humano).
[058] A Figura 39 mostra força versus deslocamento para uma composição derivada de cartilagem versus cartilagem (porco).
[059] A Figura 40 mostra força versus deslocamento para uma composição de origem óssea (fêmur) versus osso nativo.
[060] As Figuras 41A-C mostram imagens in vivo de cicatrização de feridas capturadas em cada grupo de tratamento dos suínos em comparação com espécimes de suínos nativos em vários dias pós-operatórios (POD). A Figura 41A mostra imagens representativas da cicatrização de feridas em POD 0, 19, 35, 42 e 70 para um tamanho de ferida. A Figura 41B mostra imagens representativas da cicatrização de feridas em POD 0, 48, 98, 146 e 196 para outro tamanho de ferida. A Figura 41C mostra imagens representativas da cicatrização de feridas em POD 0, 34, 62, 105, 132 para ainda outro tamanho de ferida.
[061] As Figuras 42A-C representam uma contração relativa em relação ao POD para cada grupo de tratamento dos suínos. A contração relativa foi calculada. 0 é sem contração e 1 é totalmente contraído.
[062] As Figuras 43A-C representam microscopia de luz composta, coloração histológica, SEM, confocal e imagem multifotônica de feridas tratadas com composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC). As Figuras 43A-C mostram imagens representativas de diferentes tamanhos de feridas. Visões gerais de amostra de microscopia de luz composta (coluna A) e seções transversais (coluna B), coloração tricrômica de Masson (coluna C), SEM
(coluna D), microscopia confocal (coluna E) e imagem multifotônica (coluna F). Notavelmente, a cicatrização foi melhorada em feridas tratadas (A-8) com composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) em comparação com feridas não tratadas (A-12). O desenvolvimento de ECM organizado foi observado em amostras histológicas, SEM e análise multifotônica (Colunas C, D e F). Elementos ultraestruturais foram observados em feridas tratadas com composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) como mostrado por microscopia confocal (E).
[063] As Figuras 44A-C mostram a comparação de varredura de pontos de superfície de Raman dos grupos de tratamento de suínos contra a pele nativa para diferentes tamanhos de feridas, respectivamente. Os picos em 854 cm-1 (Prolina), 875 cm-1 (hidroxiprolina), 1003 cm-1 (fenilalanina), 1450 cm-1 (elastina) e 1650 cm-1 (queratina) estão presentes nas feridas tratadas e na pele nativa.
[064] As Figuras 45A-C representam a comparação de varredura de ponto de superfície Raman (esquerda) e varredura de linha de superfície (direita) de grupos de tratamento de suínos contra pele nativa e/ou feridas não tratadas para diferentes tamanhos de feridas, respectivamente. Os picos em 854 cm-1 (Prolina), 875 cm-1 (hidroxiprolina), 1003 cm-1 (fenilalanina), 1450 cm-1 (elastina) e 1650 cm-1 (queratina) estão presentes nas feridas tratadas e na pele nativa.
[065] A Figura 46A-B representa varreduras de linhas de seção transversal Raman para diferentes tamanhos de feridas, respectivamente. Figuras abrangentes de Raman mostram a impressão digital molecular da pele de suínos. A vista combinada das varreduras de linha na seção transversal da pele é para tratamentos diferentes. Os quimigramas comparam a distribuição de colágeno tipo IV na seção transversal da pele.
[066] A Figura 47A representa curvas típicas de força versus deslocamento a partir dos testes de tração (Instron 3343) para feridas de pele de suínos. O módulo elástico, ou seja, a medida da elasticidade da pele foi medida usando a inclinação da porção linear do gráfico.
[067] A Figura 47B representa os resultados de um módulo de Young a partir dos testes de tração (Instron 3343) para feridas de pele de suínos.
[068] A Figura 48A representa in vivo resultado balistométrico para feridas. O impacto inicial chamado "entalhe" que mede a profundidade do impacto da sonda na pele foi estimado a partir da curva de amortecimento.
[069] A Figura 48B representa medição de módulo de elasticidade in vivo usando Elastografia por Ultrassom (Nativo, Ferida 1, Ferida 2). Medição de elasticidade in vivo usando Elastografia por Ultrassom. A elastografia por ondas de cisalhamento por ultrassom em tempo real foi realizada para avaliar a elasticidade da pele. O módulo de elasticidade calculado a partir da compressibilidade do tecido representa a rigidez da pele. Na legenda, verde e vermelho indicam tecidos moles e duros, respectivamente. A elastografia por onda de cisalhamento de pele nativa e ferida tratada mostram zonas homogêneas e moles com valores médios de elastografia abaixo de 120 kPa.
[070] A Figura 49 representa resultado balistométrico ex-vivo para feridas. O impacto inicial chamado "entalhe" que mede a profundidade do impacto da sonda na pele foi estimado a partir da curva de amortecimento.
[071] A Figura 50 mostra mapas de calor de análise molecular de tecidos que exibem expressão gênica diferencial de feridas cicatrizadas com composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) em comparação com a pele nativa.
[072] A Figura 51 representa uma mudança dobrada de transcritos cuja expressão foi significativamente diferente (p <0,05) em feridas cicatrizadas com composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) quando comparadas à pele nativa.
[073] A Figura 52 mostra mapas de calor que exibem expressão gênica diferencial de feridas tratadas com composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) em comparação com feridas não tratadas e gráficos de barras que descrevem mudanças dobradas de transcritos para os quais a expressão foi significativamente diferente (p <0,05) em feridas tratadas com composição de origem cutânea quando comparadas a feridas não tratadas. Os marcadores de células-tronco também são geralmente aumentados. Diferenças significativas na expressão gênica foram observadas para 12 genes: CDH1, COL7A1, COL4A3, CTNNA1, CTNND1, ITGAE, ANOS1, ITGB4 e MMP12. CDH1 é regulado 235 vezes em feridas tratadas com composição de origem cutânea em comparação com feridas não tratadas e COL7A1 é regulado 17 vezes.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[074] A referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade" ou "alguma modalidade" ou linguagem similar significa que uma característica, estrutura ou traço específicos descritos em conexão com a modalidade estão incluídos em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, ocorrências das frases “em uma modalidade", "em alguma modalidade" e linguagem similar ao longo deste relatório descritivo podem, mas não necessariamente, todas se referirem à mesma modalidade.
[075] Além disso, os recursos, estruturas ou características descritos da invenção podem ser combinadas de qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades. Na descrição a seguir, inúmeros detalhes específicos são incluídos para fornecer um entendimento completo de modalidades da invenção. Um técnico no assunto reconhecerá, no entanto, que a invenção pode ser praticada sem um ou mais dos detalhes específicos, ou com outros métodos, componentes, materiais e assim por diante. Em outros casos, estruturas, materiais ou operações bem conhecidos não são mostrados ou descritos em detalhes para evitar obscurecer aspectos da invenção. Assim, deve ser entendido que outras modalidades podem ser utilizadas e mudanças podem ser feitas sem se afastar do escopo da presente invenção. A descrição detalhada a seguir, portanto, não deve ser tomada em um sentido limitante.
[076] As composições descritas na presente invenção têm utilidade em uma variedade de campos técnicos, incluindo, mas não se limitando a medicina, ciências, engenharia e fabricação. A presente invenção refere-se a composições sintetizadas de um agregado de entidades tridimensionalmente interfaceadas reativas, dinâmicas que contêm entidades celulares de núcleo vivo potente, interativas (por exemplo, células-tronco, células progenitoras, células amplificadoras de trânsito) e entidades de suporte.
[077] É revelada na presente invenção uma composição de materiais celulares e não celulares de interface, autopropagáveis (um agregado) que podem ser usados para alterar o ambiente em que esse agregado de materiais é/foi colocado. Esse agregado pode ser chamado de Materiais de Automontagem Coordenado por Interface de Complexo Vivo (CLICSAM).
[078] As composições reveladas na presente invenção quando desenvolvidas ou sintetizadas promovem a propagação coordenada de expansão celular potente e a formação organizada de material e/ou substrato para a propagação continuada do CLICSAM e os derivados intermediários progressivos que formam material(is) funcionalmente polarizado(s).
[079] As composições reveladas na presente invenção têm a capacidade e/ou aptidão de superar barreiras mecânicas, elétricas, químicas, bem como vazios, defeitos ou erros no(s) material(is), substrato(s), tecido(s) porque as composições reveladas na presente invenção têm a capacidade reconhecer, sentir, calcular, coordenar e autodeterminar a resposta ao ambiente ou sistema no qual as composições são colocadas.
[080] As composições reveladas na presente invenção têm a capacidade de autopropagar, diferenciar, adaptar, evoluir, replicar, migrar, autossintetizar, automodular e autorregular todos os elementos nas composições, bem como impactar o ambiente e/ou sistema em que as composições são colocadas.
[081] As composições reveladas na presente invenção têm a capacidade de alterar o ambiente em que são colocadas ou materializadas direcionando e/ou coordenando a: síntese, alteração, modificação, modulação, regulação, montagem ou destruição de materiais, incluindo, mas não limitado a: - ambientes químicos, eletroquímicos e/ou elétricos; - materiais genômicos, epigenômicos, transcriptômicos, epitrascriptômicos, proteômicos, epiproteômicos; - organelas subcelulares ou estruturas subcelulares, bem como derivados dessas estruturas; - matrizes, suportes, partículas, fibras e/ou elementos estruturais intracelulares e/ou extracelulares; - processos e materiais anabólicos, catabólicos e/ou metabólicos, bem como derivados de tais materiais; - mecânicas materiais, forças materiais, cinéticas materiais e/ou termodinâmicas materiais; - outros materiais vivos e/ou vivos ou entidades celulares; - sistemas de órgãos e/ou tecidos; - sistemas celulares e/ou células; e - sistemas compostos.
[082] Aspectos da presente invenção também se referem a métodos de preparação de composições reveladas na presente invenção. Além disso, aspectos da presente invenção referem-se a métodos de tratamento usando as composições reveladas na presente invenção.
Composições
[083] São reveladas na presente invenção composições compreendendo estrutura(s) sintetizada(s) de um agregado de entidades celulares tridimensionalmente interfaceadas reativas, dinâmicas que contêm entidades celulares de núcleo vivo potente, interativas e entidades de suporte. Mais particularmente, as entidades celulares de núcleo potente são interfaceadas com entidades de suporte (por exemplo, progênie celular) em uma orientação derivada de interface que direciona a formação de materiais funcionais, polarizados e auto-organizados.
[084] Em uma modalidade, uma composição compreende um agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado que é capaz de produzir tecido polarizado funcional quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo.
[085] Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado a partir de uma interface de tecido ósseo. A interface de tecido ósseo pode ser selecionada a partir de uma interface de tecido pericortical, uma interface de tecido perilamelar, uma interface de tecido peritrabecular, uma interface de tecido córtico-esponjoso ou uma combinação dos mesmos.
[086] Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado a partir de uma interface de tecido cutâneo. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido musculoesquelético. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido muscular liso. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado a partir de uma interface de tecido muscular cardíaco.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido cartilaginoso.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado a partir de uma interface de tecido adiposo.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido gastrointestinal.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido pulmonar.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado a partir de uma interface de tecido esofágico.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido gástrico.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido renal.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido hepático.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido pancreático.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido dos vasos sanguíneos.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido linfático.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido nervoso central.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido urogenital.
Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido glandular. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido dental. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido nervoso periférico. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface de tecido do nascimento. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado a partir de uma interface de tecido óptico. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado compreende entidades celulares de núcleo vivo potente e entidades de suporte. As entidades celulares de núcleo vivo potente podem expressar transcritos de RNA e/ou polipeptídeos de um ou mais Receptores Acoplados à Proteína G Contendo Repetição Rica em Leucina e selecionados a partir do grupo que consiste em LGR4, LGR5, LGR6 e qualquer combinação dos mesmos. As entidades celulares de núcleo vivo potente podem expressar transcritos de RNA e/ou polipeptídeos de um ou mais dentre Pax 7, Pax 3, MyoD, Myf 5, queratina 15, queratina 5, cluster de diferenciação 34 (CD34), Sox9, c-Kit +, Sca- 1 +, ou qualquer combinação dos mesmos.
[087] As entidades de suporte podem compreender populações celulares derivadas de células mesenquimais. As entidades de suporte podem compreender populações celulares, elementos da matriz extracelular ou uma combinação dos mesmos. Os elementos da matriz extracelular podem compreender um ou mais dentre ácido hialurônico, elastina, colágeno, fibronectina, laminina, vesículas extracelulares, enzimas e glicoproteínas.
[088] Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado mostra níveis de expressão aumentados do hormônio da paratireoide em comparação com o observado no tecido ósseo nativo. O agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado pode mostrar aumento de 10 a 15 vezes nos níveis de expressão do hormônio da paratireoide em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
[089] Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado mostra níveis de expressão aumentados de TLR4 em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
[090] Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado mostra níveis de expressão aumentados de timidina fosforilase em comparação com o observado no tecido ósseo nativo. O agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado pode mostrar aumento de 100 a 200 vezes nos níveis de expressão de timidina fosforilase em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
[091] Em uma modalidade, o tecido polarizado funcional mostra níveis de expressão diminuídos de um ou mais dentre IL2, MIOSIN2, ITGB5 e STAT3 em comparação com o observado no tecido ósseo nativo. Em uma modalidade, o tecido polarizado funcional mostra pelo menos 98% de similaridade na expressão gênica em comparação com o tecido ósseo nativo.
[092] A composição pode compreender adicionalmente um substrato de liberação. Em uma modalidade, o substrato de liberação compreende um suporte.
[093] Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado tem um diâmetro de cerca de 50 µm. Em uma modalidade, o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado tem um diâmetro de cerca de 40-250 µm, por exemplo, cerca de 50-250 µm, cerca de 75-250 µm, cerca de 100-250 µm, cerca de 125-250 µm, cerca de 150-250 µm, cerca de 175-250 µm, cerca de 200-250 µm ou cerca de 225-250 µm.
[094] Em uma modalidade, uma composição compreende pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero compreendendo entidades celulares de núcleo potente e entidades de suporte. A composição é capaz de montar material funcional.
[095] Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido cutâneo. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido ósseo. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido musculoesquelético. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido muscular liso. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido muscular cardíaco. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido cartilaginoso. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido adiposo. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido gastrointestinal. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido pulmonar. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido esofágico. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido gástrico. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido renal. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido hepático. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido pancreático. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido dos vasos sanguíneos. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido linfático. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido nervoso central. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido urogenital. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido glandular. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido dental. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido nervoso periférico. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido do nascimento. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido óptico.
[096] Entidades celulares potentes do núcleo exemplares incluem células- tronco, células progenitoras e células amplificadoras de trânsito. As entidades celulares de núcleo potente adequadas para uso nas composições reveladas na presente invenção podem ser identificadas ou estabelecidas, por exemplo, identificando certos marcadores de sequência subcelulares (ou seja, DNA, RNA e proteínas). Em modalidades particulares, as composições reveladas na presente invenção compreendem agregados de entidades celulares de núcleo potente com interface e entidades de suporte, cujas entidades celulares de núcleo potente expressam uma sequência do Receptor Acoplado à Proteína G Contendo Repetição Rica em Leucina (LGR). Nas modalidades, entidades celulares de núcleo potente expressam uma sequência de LGR4, uma sequência de LGR5, uma sequência de LGR6 ou combinações das mesmas.
[097] Os métodos de identificação de entidades celulares de núcleo potente são conhecidos na técnica. As entidades celulares de núcleo potente podem ser identificadas, por exemplo, por microscopia eletrônica, microscopia de contraste de fase em explantes de miofibra simples ou microscopia de fluorescência. Por exemplo, populações de células satélites in vivo podem ser visualizadas usando técnicas de imagem de bioluminescência desenvolvidas. Por exemplo, as células satélites podem ser identificadas usando microscopia eletrônica com base em sua aparência "em cunha" e características morfológicas incluindo grande razão nuclear para citoplasmática, poucas organelas, núcleo pequeno e cromatina em interfase condensada. As células satélites, in vivo, também podem ser identificadas por microscopia de fluorescência, usando incluir um ou mais fatores de transcrição e/ou proteínas da membrana celular como biomarcadores, tais como Pax 7, Pax 3, MyoD e Myf 5.
[098] Como revelado na presente invenção, polaridade neogenerativa, regenerativa e/ou formação organizada de materiais podem ser induzidas e propagadas colocando, implementando e/ou materializando tal composição descrita dentro de um material e/ou substrato alvo.
[099] A(s) interface(s) das composições reveladas refere(m)-se a formas diretas ou indiretas de célula a célula, célula a intracelular, célula a substrato, célula a agente, fator(es) célula a material, célula a ambiente, célula a sistema, célula a interactoma em que tal interface permita o contato, comunicação, modulação, regulação, iniciação, efeito, resposta, interação química/mecânica, transferência de materiais e/ou energia para alterar ou impactar o ambiente ou sistema em que a composição é liberada ou implementada.
[0100] Essa interface refere-se a formas diretas ou indiretas de célula a
ECI (interactoma extracelular) ou contato substrato extracelular, comunicação, efeito, resposta, interações químicas e/ou mecânicas (por exemplo, moléculas, fatores de crescimento, peptídeos, metabólitos, DNA/RNA, microrganismos, gradientes químicos, gradientes de agentes, gradientes elétricos, fótons e/ou energia).
[0101] Nas modalidades, as composições descritas na presente invenção são capazes de montar material funcional (por exemplo, tecido funcional) in vivo.
[0102] Nas modalidades, as composições descritas na presente invenção são capazes de montar material funcional (por exemplo, tecido funcional) ex vivo.
[0103] Nas modalidades, as composições descritas na presente invenção são capazes de montar material funcional (por exemplo, tecido funcional) in vitro.
[0104] Nas modalidades, as composições descritas na presente invenção são capazes de montar material funcional (por exemplo, tecido polarizado funcional) em sistemas complexos ou compostos.
[0105] Conforme usado na presente invenção, a "administração" de uma composição a um indivíduo inclui qualquer rota de introdução ou liberação a um indivíduo de uma composição para desempenhar sua função pretendida. A administração pode ser realizada por qualquer rota adequada, incluindo, mas não se limitando a, por transplante, por via oral, intranasal, parenteral (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea), retal, intratecal ou tópica. A administração inclui a autoadministração e a administração por outro.
[0106] Conforme usado na presente invenção, "entidades celulares de núcleo potente" se referem a entidades celulares que são capazes de comunicação intercelular, migração, quimiotaxia, proliferação, diferenciação,
transdiferenciação, desdiferenciação, amplificação transitória, divisão assimétrica e incluem células-tronco, células progenitoras e células de amplificação de trânsito. As entidades celulares de núcleo potente podem ser identificadas ou estabelecidas, por exemplo, por ensaios para certos biomarcadores subcelulares (ou seja, DNA, RNA e proteínas). Em algumas modalidades, entidades celulares de núcleo potente expressam transcritos de RNA e/ou polipeptídeos de um ou mais Receptores Acoplados à Proteína G Contendo Repetição Rica em Leucina (LGR), tais como LGR4, LGR5, LGR6 e qualquer combinação dos mesmos. Adicional ou alternativamente, em algumas modalidades, entidades celulares de núcleo potente expressam transcritos de RNA e/ou polipeptídeos de um ou mais dentre Pax 7, Pax 3, MyoD, Myf 5, queratina 15, queratina 5, cluster de diferenciação 34 (CD34), Sox9, c-Kit+, Sca- 1+ e qualquer combinação dos mesmos. Exemplos adicionais de biomarcadores para entidades celulares de núcleo potente são descritos em Wong et al., International Journal of Biomaterials, vol. 2012, ID do artigo 926059, 8 páginas,
2012.
[0107] Como usado na presente invenção, o termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para alcançar um efeito terapêutico e/ou profilático desejado, por exemplo, uma quantidade que resulta na prevenção ou diminuição de uma doença ou condição descrita na presente invenção ou de um ou mais sinais ou sintomas associados a uma doença ou condição descrita na presente invenção. No contexto de aplicações terapêuticas ou profiláticas, a quantidade de uma composição administrada ao indivíduo variará dependendo da composição, grau, tipo e gravidade da doença ou condição e das características do indivíduo, como saúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a fármacos. O técnico no assunto será capaz de determinar as dosagens apropriadas dependendo desses e de outros fatores.
As composições também podem ser administradas em combinação com um ou mais compostos terapêuticos adicionais. Nos métodos descritos na presente invenção, as composições terapêuticas podem ser administradas a um indivíduo com um ou mais sinais ou sintomas de uma doença ou condição descrita na presente invenção.
[0108] Como usado na presente invenção, o termo "estimulante reativo eficaz" refere-se a qualquer aditivo que ativa células, populações de células, tecidos celulares e agregados de células de interface de tecidos de mamíferos heterogêneas, que podem ativar ou alterar a fisiologia das referidas células e podem ser realizadas por um ou uma combinação de sinais, incluindo ligação ao receptor de quimiocina, ligação ao receptor parácrino, alteração da membrana celular, alteração citoesquelética, manipulação física da célula, alteração de gradientes fisiológicos, alteração de temperatura, interações de pequenas moléculas, introdução de nucleotídeos e ribonucleotídeos tais como pequenos RNAs inibitórios.
[0109] Como usado na presente invenção, "estimulado" refere-se à ativação (por exemplo, alteração) do estado fisiológico de um agregado de células de interface de tecido de mamífero heterogêneas que pode ser realizado por um ou por uma combinação de sinais incluindo estimulação elétrica, gradiente de oxigênio, ligação ao receptor de quimiocina, ligação ao receptor parácrino, alteração na membrana celular, alteração citoesquelética, manipulação física de células, alteração de gradientes fisiológicos, alteração de temperatura, interações de pequenas moléculas, introdução de nucleotídeos e ribonucleotídeos, tais como pequenos RNAs inibitórios, que são suficientes para induzir um ou mais dos seguintes fenótipos/resultados: expressão gênica alterada (ver, por exemplo, mapas de calor e gráficos de vulcão nas Figuras 29- 34), tradução alterada de proteínas, sinalização intracelular e intercelular alterada, ligação alterada de vesículas a membranas, produção e consumo alterados de ATP e mobilidade celular alterada.
[0110] Como usado na presente invenção, "entidades de suporte" se referem a populações de células não tronco (por exemplo, entidades celulares de suporte) e/ou materiais de matriz extracelular que fornecem suporte estrutural e bioquímico para entidades celulares de núcleo potente. Em algumas modalidades, entidades celulares de suporte podem compreender células de proliferação e/ou diferenciação. Adicional ou alternativamente, em algumas modalidades, entidades celulares de suporte podem ser identificadas pela expressão de biomarcadores tais como BMPr1a, BMP2, BMP6, FGF, receptores Notch, ligantes Delta, CXCL12, Sonic Hedge Hog, VEGF, TGFβ, Wnt, HGF, NG2 e actina alfa de músculo liso. Em algumas modalidades, as entidades celulares de suporte compreendem populações celulares derivadas de células mesenquimais.
[0111] Como usado na presente invenção, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma composição refere-se a níveis de composição em que os efeitos fisiológicos de uma doença ou condição são melhorados ou eliminados. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser dada em uma ou mais administrações.
[0112] Como usado na presente invenção, "matriz extracelular” e “elementos da matriz extracelular” se referem a macromoléculas extracelulares, tais como ácido hialurônico, elastina, colágeno, fibronectina, laminina, vesículas extracelulares, enzimas e glicoproteínas, que são organizadas como uma rede tridimensional para fornecer estruturas e suporte bioquímico para células circundantes.
[0113] Como usado na presente invenção, o termo "AHBC" refere-se a um constructo de osso homólogo autólogo. Como usado na presente invenção, o termo "AHLC" refere-se a um constructo de fígado homólogo autólogo. Como usado na presente invenção, o termo "AHSC” refere-se a um constructo de pele homólogo autólogo.
[0114] Como usado na presente invenção, "expressão" inclui um ou mais dos seguintes: transcrição do gene no mRNA precursor; entrançamento e outro processamento do mRNA precursor para produzir mRNA maduro; estabilidade de RNAm; tradução do mRNA maduro em proteína (incluindo uso de códons e disponibilidade de tRNA); e glicosilação e/ou outras modificações do produto de tradução, se necessário para expressão e função adequadas.
[0115] Como usado na presente invenção, os termos "material funcional", "tecido funcional" e "tecido polarizado funcional" se referem a um conjunto de células e sua matriz extracelular tendo a mesma origem e executando funções biológicas semelhantes às observadas no tecido da contraparte nativa. Em algumas modalidades, o "material funcional", "tecido funcional" ou "tecido polarizado funcional" exibe características tais como polaridade, densidade, flexibilidade, etc., semelhante ao observado no tecido da contraparte nativa.
[0116] São reveladas na presente invenção composições que desenvolvem e promovem a polaridade de material e sistema.
[0117] Como usado na presente invenção, o termo "interface de material" refere-se à região, área e/ou localização onde duas ou mais células diferentes ou distinguíveis se aproximam, contatam, fundem, integram, incorporam, unem, coalescem, combinam, compõem, fundem, apoiam, tocam, delimitam, fundem, comunicam, sinapse, junção, interagem, compartilham, agregam, conectam, penetram, circundam ou formam entre si em um ambiente e/ou sistema que pode ou não conter outros materiais, substratos ou fatores. Esse(s) outro(s) ambiente(s) e/ou sistema(s) pode(m) ser usado(s) para interagir com as composições reveladas na presente invenção.
[0118] Como usado na presente invenção, uma "interface de tecido" refere-se a um local no qual sistemas de tecidos independentes e opcionalmente não relacionados interagem e se comunicam entre si. Em algumas modalidades, os componentes de uma interface de tecido atualmente promovem/promoveram a histogênese e o desenvolvimento e/ou metabolismo celular, incluindo, mas não se limitando a proliferação, diferenciação, migração, anabolismo, catabolismo, estimulação ou pelo menos um dentre comunicação intracelular, intercelular, extracelular, transcelular e pericelular ou qualquer combinação das mesmas.
[0119] As composições reveladas na presente invenção são compostas por um compartimento de interface completo ou uma interface de subcompartimento que pode então ser utilizada para sintetizar uma interface completa. Um compartimento de interface completo refere-se aos materiais de conteúdo localizados dentro da referida região, área e/ou localização que quando processados conforme revelado na presente invenção supririam ou poderiam suprir, através de processamento adicional, aqueles materiais necessários para o desenvolvimento das composições reveladas na presente invenção. Como descrito em mais detalhes abaixo, para cada substrato material e/ou tecido de interesse, um compartimento de interface completo incluiria aquelas camadas essenciais desse tecido que contribuem para sua função exclusiva.
[0120] Uma interface de subcompartimento também se refere aos materiais de conteúdo localizados dentro da referida região, área e/ou localização que quando processados conforme revelado na presente invenção supririam ou poderiam suprir, através de processamento adicional, aqueles materiais necessários para o desenvolvimento das composições reveladas na presente invenção. Uma subinterface se refere a uma parte de uma interface completa.
[0121] No caso de tecido cutâneo, uma interface de tecido cutâneo pode incluir interface epidérmico-dérmica, interface dérmica papilar-reticular, interface dérmico-hipodérmica, interface hipodérmica-subdérmica, interface apêndice-substrato e combinações das mesmas.
[0122] No caso de tecido ósseo, uma interface de tecido ósseo pode incluir uma interface de tecido pericortical, uma interface de tecido perilamelar, uma interface de tecido peritrabecular, uma interface de tecido córtico-esponjoso e combinações das mesmas.
[0123] No caso de tecido musculoesquelético, uma interface de tecido musculoesquelético pode incluir uma interface de tecido mio-epimisial, uma interface de tecido mio-perimisial, uma interface de tecido mio-endomisial, uma interface de tecido miofascial, uma interface de tecido do tendão- músculo, uma interface de tecido do tendão-osso, uma interface tecido ligamento-osso e combinações das mesmas.
[0124] No caso de tecido muscular liso, uma interface de tecido muscular liso pode incluir uma interface de tecido perivascular, uma interface de tecido perivisceral, uma interface de tecido perineural e combinações das mesmas.
[0125] No caso de tecido muscular cardíaco, uma interface de tecido muscular cardíaco pode incluir uma interface de tecido endocárdico- miocárdico, uma interface de tecido miocárdico-epicárdico, uma interface de tecido epicárdico-pericárdico, uma interface de tecido pericárdico-adiposo e combinações das mesmas.
[0126] No caso de tecido cartilaginoso, uma interface de tecido cartilaginoso pode incluir uma interface de tecido condrial-pericondrial, uma interface de tecido condrial-endocondrial, uma interface de osso endocondrial- subcondral, uma interface de osso condrial-endocondrial, uma interface de osso endocondrial-subcondral e combinações das mesmas.
[0127] No caso de tecido adiposo, uma interface de tecido adiposo pode incluir uma interface de tecido adipo-perivascular, uma interface de tecido adipo-peristromal e combinações das mesmas.
[0128] No caso de tecido gastrointestinal, uma interface de tecido gastrointestinal pode incluir uma interface de tecido mucoso-submucoso, uma interface de tecido sub-mucoso-muscular, uma interface de tecido muscular- seroso, uma interface de tecido seroso-mesentérico, uma interface de tecido mio-neural, uma interface de submucoso-neural e combinações dos mesmos.
[0129] No caso de tecido pulmonar, uma interface de tecido pulmonar pode incluir uma interface de tecido mucoso-submucoso, uma interface de tecido sub-mucoso-muscular, uma interface de tecido submucoso de cartilagem, interface de tecido muscular-adventício, uma interface de tecido ducto-adventício, uma interface de tecido parenquimatoso-seroso, uma interface de tecido seroso-mesentério, uma interface de tecido mio-neural, uma interface de tecido submucoso-neural e combinações dos mesmos.
[0130] No caso de tecido esofágico, uma interface de tecido esofágico pode incluir uma interface de tecido mucoso-submucoso, uma interface de tecido sub-mucoso-muscular, uma interface de tecido muscular-adventício, uma interface de tecido mio-neural, uma interface de tecido submucoso-neural e combinações das mesmas.
[0131] No caso de tecido gástrico, uma interface de tecido gástrico pode incluir uma interface de tecido mucoso-submucoso, uma interface de tecido sub-mucoso-muscular, uma interface de tecido muscular-seroso, uma interface de tecido mio-neural, uma interface de submucoso-neural e combinações das mesmas.
[0132] No caso de tecido renal, uma interface de tecido renal pode incluir uma interface de tecido cápsula-cortical, uma interface de tecido cortical- medular, uma interface de tecido peritrabecular, uma interface de tecido neuro-parenquimatoso e combinações das mesmas.
[0133] No caso de tecido hepático, uma interface de tecido hepático pode incluir uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso ductal, uma interface de tecido capsular-parenquimatoso e combinações das mesmas.
[0134] No caso de tecido pancreático, uma interface de tecido pancreático pode incluir uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso ductal, uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso glandular e combinações das mesmas.
[0135] No caso de vasos sanguíneos, uma interface de tecido dos vasos sanguíneos pode incluir uma interface de tecido endotelial-túnica, uma interface de tecido tunica-tunica e combinações das mesmas.
[0136] No caso de tecido linfático, uma interface de tecido linfático pode incluir uma interface de tecido córtico-medular, uma interface de tecido cápsula medular, uma interface de tecido cápsula-polpa e combinações das mesmas.
[0137] No caso de tecido nervoso central, uma interface de tecido nervoso central pode incluir uma interface de tecido do córtex dural, uma interface de tecido de substância cinzenta cortical-substância branca medular, uma interface de tecido meníngeo-neural e combinações das mesmas.
[0138] No caso de tecido urogenital, uma interface de tecido urogenital pode incluir uma interface de tecido epitelial-mucoso, uma interface de tecido mucoso-muscular, uma interface de tecido muscular-adventício, uma interface de tecido corporal-vascular, uma interface de tecido corporal-muscular e combinações das mesmas.
[0139] No caso de tecido glandular, uma interface de tecido glandular pode incluir uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso.
[0140] No caso de tecido dental, uma interface de tecido dental pode incluir uma interface de tecido de polpa de dentina.
[0141] No caso de tecido nervoso periférico, uma interface de tecido nervoso periférico pode incluir uma interface de tecido epineural-perineural, uma interface de tecido perineural-endoneural, uma endoneural-axonal e combinações das mesmas.
[0142] No caso de tecido do nascimento, uma interface de tecido do nascimento pode incluir uma interface de tecido âmnio-fluido, uma interface de tecido epitelial-subepitelial, uma interface de tecido epitelial-estroma, uma interface de tecido compacto fibroblástico, uma interface de tecido intermediário de fibroblastos, uma interface de tecido intermediário reticular, uma interface de tecido âmnio-córion, uma interface de tecido trofoblástico reticular, uma interface de tecido trofoblástico uterino, uma interface de tecido trofoblástico de decídua e combinações das mesmas.
[0143] No caso de tecido óptico, uma interface de tecido óptico pode incluir uma interface de tecido de membrana epitelial, uma interface de tecido de estroma de membrana, uma interface de tecido de membrana estromal, uma interface de tecido endotelial de membrana, uma interface de tecido de fluido endotelial, uma interface de tecido coroide escleral, uma interface de tecido epitelial coroide, uma interface de tecido fotorreceptor epitelial segmentar, uma interface de tecido de membrana fotorreceptora segmentar, uma interface de tecido da camada nuclear externa da membrana, uma interface de tecido plexiforme externo da camada nuclear externa, uma interface de tecido plexiforme externo-plexiforme interno, uma interface de tecido plexiforme interno-ganglionar, uma interface de tecido de ganglionar- fibra neural, uma interface de tecido de membrana-interface de tecido de fibra neural, uma interface de tecido fluido de membrana e combinações das mesmas.
[0144] As entidades de suporte podem incluir materiais celulares e não celulares. Em uma modalidade, as entidades de suporte incluem entidades celulares que compreendem populações celulares com interface não-tronco. Em outra modalidade, os materiais de suporte incluem entidades celulares que compreendem populações de progênies celulares com interface e/ou entidades diferenciadoras.
[0145] Nas modalidades, as entidades de suporte compreendem populações celulares derivadas de células mesenquimais. Em modalidades, as entidades de suporte compreendem populações celulares, elementos da matriz extracelular ou combinações dos mesmos.
[0146] A composição pode também incluir um substrato de liberação. O substrato de liberação pode ser selecionado a partir de uma variedade de meios de veículos que incluem, mas não estão limitados a, moléculas, materiais, fluidos, suportes, matrizes, partículas, células, fibras, estruturas subcelulares, biológicos, dispositivos e/ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o substrato de liberação é selecionado a partir de um suporte, matriz, partícula, células, fibra ou combinações dos mesmos.
[0147] A composição também pode compreender um suplemento selecionado a partir de um fator de crescimento, um analito, um elemento interativo LGR ou combinações dos mesmos. O analito pode ser selecionado a partir de um analito migratório, um analito de recrutamento, um agente estimulador, um agente inibidor ou combinações dos mesmos.
[0148] Alternativamente, as composições reveladas podem atuar como um substrato de liberação, implementação e/ou veículo e/ou vetor para outras formas de matéria ativa ou atuante.
[0149] Alternativamente, a composição revelada pode ser usada como uma barreira ou cobertura de outros materiais que requerem tal ação.
[0150] Alternativamente, a composição revelada pode ser usada para melhorar outros materiais em que a composição interage ou faz interface com de formas diretas e indiretas.
[0151] Nas modalidades, as composições reveladas na presente invenção compreendem adicionalmente um sistema capaz de ações intencionais pelas quais agentes, substâncias, materiais, substratos, fatores, analitos, suplementos, moléculas são desenvolvidos a partir da composição descrita na presente invenção que pode atuar localmente, em todo o sistema, em outras formas de matéria e/ou de maneira autorreativa.
[0152] Nas modalidades, as composições reveladas na presente invenção compreendem adicionalmente um material que se desenvolve e/ou atua para melhorar a disposição, propagação, proliferação, diferenciação, migração, estimulação, alteração, aumento, modulação de sistemas e entidades em comunicação com a referida composição revelada na presente invenção.
[0153] Nas modalidades, as composições reveladas na presente invenção compreendem adicionalmente um material que se desenvolve e/ou atua para melhorar a regulação, inibição, estagnação, terminação, destruição, obliteração, cessação de sistemas e entidades em comunicação com a referida composição revelada na presente invenção.
[0154] Nas modalidades, a composição pode ser colocada diretamente em sistemas vivos, sistemas vivos parciais, sistemas não vivos, sistemas artificiais e/ou sistemas de suporte sintético que permitem que o(s) material(is) persistam e/ou se propaguem.
[0155] Nas modalidades, a composição pode ser alterada, mudada, regulada, manipulada, ajustada, modificada, transformada, convertida,
mutada, reconstruída, evoluída, adaptada, integrada e/ou subtraída de e/ou adicionada a outros material(is) diretamente e/ou indiretamente de modo a mudar o(s) material(is) primário(s) em função, aparência, estrutura, composição, comportamento e/ou existência em tais sistemas ou ambientes. Métodos de Produção
[0156] A presente invenção também fornece um método para produzir uma composição como revelada na presente invenção. O método envolve isolar pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero compreendendo entidades celulares de núcleo potente e entidades de suporte. O método envolve adicionalmente desenvolver uma interface reativa e estimulada para fornecer a composição. A composição é capaz de montar material funcional.
[0157] Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido cutâneo. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido ósseo. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido musculoesquelético. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido muscular liso. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido muscular cardíaco. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido cartilaginoso. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido adiposo. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido gastrointestinal. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido pulmonar. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido esofágico. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido gástrico. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido renal. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido hepático. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido pancreático. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido dos vasos sanguíneos. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido linfático. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido nervoso central. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido urogenital. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido glandular. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido dental. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido nervoso periférico. Em uma modalidade, a interface de material de mamífero é uma interface de tecido do nascimento. Em uma modalidade, a interface de tecido de mamífero é uma interface de tecido óptico. Interfaces de tecido exemplares são descritas acima.
[0158] Em modalidades, as entidades de suporte compreendem populações celulares derivadas de células mesenquimais. Em modalidades, as entidades de suporte são selecionadas a partir de populações celulares, elementos da matriz extracelular ou combinações dos mesmos.
[0159] Os materiais para o desenvolvimento das composições reveladas podem ser obtidos a partir de um ambiente e/ou sistema(s) de tecido celular em compartimentos de interface completos ou interfaces de subcompartimentos. Uma vez localizada, a população que contém as entidades celulares de núcleo potente e entidades de suporte que cercam a interface de material de mamífero pode ser obtida através de uma variedade de métodos que seriam entendidos por um técnico no assunto. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, colheita, biópsia, punção, clivagem, restrição, digestão,
extração, excisão, desassociação, separação, remoção, partição e/ou isolamento. Uma vez que são obtidas a população celular contendo as entidades celulares de núcleo potente e as entidades de suporte, a interface ou subinterface de material de mamífero é interrompida de modo a interromper a organização do material sem destruição completa do material e obter polarização mínima. Como usado na presente invenção, "polarização mínima" refere-se ao grau de polarização alcançado pela manipulação artificial de material biológico necessário para que uma unidade de tecido seja capaz de montar tecido polarizado funcional. A manipulação artificial pode ser obtida usando métodos mecânicos, químicos, enzimáticos, energéticos, elétricos, biológicos e/ou outros métodos físicos.
[0160] Uma variedade de métodos de interrupção seria entendida pelos técnicos no assunto, incluindo, mas não se limitando a, mecanismos mecânicos, químicos, enzimáticos, energéticos, elétricos, biológicos e/ou físicos. Essa interrupção desenvolve uma interface reativa e estimulada.
[0161] É também revelado na presente invenção um método para preparar uma composição compreendendo um agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado que é capaz de produzir tecido polarizado funcional quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o método compreende isolar pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero para obter um agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo, em que a interface de material de mamífero compreende células de interface de tecido de mamífero heterogêneas; e estimular as células de interface de tecido de mamífero heterogêneas.
[0162] Em modalidades, estimular compreende estimulação mecânica, estimulação química, estimulação enzimática, estimulação energética,
estimulação elétrica, estimulação biológica ou qualquer combinação das mesmas. Em modalidades, o estímulo compreende dissociação, dissecção, corte, cisalhamento, vórtice ou qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades, estimulação química ou biológica compreende pelo menos uma dentre ligação de receptor de quimiocina, ligação de receptor parácrino, alteração da membrana celular, alteração citoesquelética, alteração de gradientes fisiológicos, adição de pequenas moléculas ou adição de nucleotídeos e ribonucleotídeos.
[0163] Em modalidades, o material de interface interrompido (ou seja, a interface reativa e estimulada) pode então ser coletada e/ou segregada. Isto pode ser conseguido de várias maneiras conhecidas pelos técnicos no assunto incluindo, mas não limitado a, filtração funcional, fracionamento, seleção de captura, centrifugação, enriquecimento, redução auxiliar, separação, gradação, partição, precipitação do(s) referido(os) material(is).
[0164] Em modalidades, o material sem interface (restante do material de espécime de mamífero do qual pelo menos uma porção de interface de material de mamífero é isolada) pode então ser coletado e/ou segregado. Os técnicos no assunto compreenderão que isso pode ser conseguido de várias maneiras, incluindo, mas não se limitando a, filtragem funcional, fracionamento, seleção de captura, centrifugação, enriquecimento, redução auxiliar, separação, gradação, partição, precipitação do(s) referido(s) material(is).
[0165] Nas modalidades, o material de interface interrompido e o material sem interface são combinados, no todo ou em parte, para criar uma composição capaz de montar material funcional. Alternativamente, o material de interface interrompido pode ser usado sozinho (ou seja, sem o material sem interface). A interface reativa e estimulada alcançada por ex vivo ou estimulação artificial fornece a composição que é capaz de montar material funcional. Nas modalidades, a composição pode também ser colocada diretamente em sistemas vivos, sistemas vivos parciais e/ou sistemas de suporte sintético que permitem que o(s) material(is) persistam e/ou se propaguem.
[0166] Nas modalidades, um substrato de liberação pode ser adicionado à composição. O substrato de liberação pode incluir um sólido, semissólido, líquido, semilíquido, fluido, partícula, fibra, suporte, matriz, molécula, substrato, material, entidade celular, entidade de tecido, dispositivo, biológico, terapêutico, macromolécula, produto químico, agente, organismo, meio e/ou substância sintética e combinações das mesmas. Em uma modalidade, o substrato de liberação é selecionado a partir de um suporte, matriz, partícula, células, fibra ou combinações dos mesmos.
[0167] Nas modalidades, o método pode adicionalmente envolver adicionar um suplemento selecionado a partir de um fator de crescimento, um analito, um elemento interativo LGR ou combinações dos mesmos. O analito pode ser selecionado a partir de um analito migratório, um analito de recrutamento, um agente estimulador, um agente inibidor ou combinações dos mesmos.
[0168] Durante os eventos estimulantes do(s) material(is) de interface e sem interface, um agente material associado é produzido e/ou gerado. Nas modalidades, este agente pode ser combinado com a interface reativa e estimulada e material sem interface para gerar uma composição capaz de montar o material funcional. Alternativamente, esse agente pode ser usado independentemente. Como outra alternativa, esse agente pode ser adicionado a outro assunto ou combinado com outros sistemas.
[0169] Nas modalidades, a composição produzida pelo método descrito na presente invenção é capaz de montar material funcional in vivo. Nas modalidades, a composição produzida pelo método descrito na presente invenção é capaz de montar material funcional ex vivo. Nas modalidades, a composição produzida pelo método descrito na presente invenção é capaz de montar material funcional in vitro. Um técnico no assunto reconheceria meios de crescimento apropriados e convencionais para usar em conjunto com as composições reveladas na presente invenção, a fim de montar tecido polarizado funcional ex vivo ou in vitro.
[0170] A composição pode então ser sujeita a estabilização, preservação, imortalização, cultivo, expansão ou distribuição fracionária por métodos compreendidos por um técnico no assunto.
[0171] A composição também pode ser criopreservada ou liofilizada (ou seja, seca por congelamento) de acordo com métodos conhecidos. Os métodos de liofilização podem incluir um ou mais pré-tratamentos (por exemplo, concentrar a composição; adicionar um crioprotetor à composição; aumentar a área da superfície da composição; congelar a composição; e secar da composição tal como, por exemplo, expondo a composição a uma pressão atmosférica reduzida para resultar em sublimação da água presente na composição). Métodos de Uso
[0172] As composições reveladas derivadas de cada tecido podem ser usadas em uma variedade de campos aplicáveis incluindo mas limitados, a medicina/pesquisa/medicina regenerativa/manipulação de tecidos/alimentos/fabricação/militar através da liberação, implementação, acoplamento, integração, síntese combinada, adição das composições reveladas para alguma forma de um tipo integrado de sistema de liberação, plataforma ou arranjo composto que inclui, mas não está limitado a um vetor,
substrato, fluido, suporte, suporte, matriz, dispositivo, biológico, célula, tecido, polímeros, moléculas, partículas, fibras, terapias para aplicações diretas ou indiretas.
[0173] Também é revelado na presente invenção um método para o tratamento de um indivíduo com necessidade de reparo de tecidos compreendendo administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição como revelada na presente invenção.
[0174] Também revelado aqui é um método para promover regeneração de tecido (por exemplo, tecido ósseo, tecido cutâneo, tecido musculoesquelético, tecido muscular liso, tecido muscular cardíaco, tecido cartilaginoso, tecido adiposo, tecido gastrointestinal, tecido pulmonar, tecido esofágico, tecido gástrico, tecido renal, tecido hepático, tecido pancreático, tecido dos vasos sanguíneos, tecido linfático, tecido nervoso central, tecido urogenital, tecido glandular, tecido dental, tecido nervoso periférico, tecido do nascimento ou tecido óptico) em um indivíduo com necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição como revelada na presente invenção.
[0175] Nas modalidades, o indivíduo está sofrendo de um tecido degenerativo (por exemplo, tecido ósseo, tecido cutâneo, tecido musculoesquelético, tecido muscular liso, tecido muscular cardíaco, tecido cartilaginoso, tecido adiposo, tecido gastrointestinal, tecido pulmonar, tecido esofágico, tecido gástrico, tecido renal, tecido hepático, tecido pancreático, tecido dos vasos sanguíneos, tecido linfático, tecido nervoso central, tecido urogenital, tecido glandular, tecido dental, tecido nervoso periférico, tecido do nascimento ou tecido óptico). Nas modalidades, a doença de ossos degenerativa é osteoartrite ou osteoporose. Nas modalidades, o indivíduo está sofrendo de uma fratura ou quebra óssea. Nas modalidades, a fratura é uma fratura estável, uma fratura composta aberta, uma fratura transversal, uma fratura oblíqua ou uma fratura comunitiva.
[0176] As composições reveladas na presente invenção podem servir como um substituto para suportes ou preenchimentos de espaços vazios ou em conjunto com outros dispositivos para promover a cicatrização de tecidos, preencher espaços vazios, manter a estrutura essencial e unir superfícies de tecido separadas por meio de suas características biológicas e mecânicas. Assim, as composições reveladas na presente invenção podem ser aplicadas em procedimentos de enxerto, incluindo, entre outros, cirurgia ortopédica, cirurgia neurológica, cirurgia plástica, cirurgia dentária e cirurgia dermatológica.
[0177] Também é revelado na presente invenção um método para tratar um indivíduo com necessidade de reparo de tecidos compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado que é capaz de produzir tecido polarizado funcional quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a administração da composição resulta em um aumento de pelo menos um dentre hormônio da paratireoide, TLR4, timidina fosforilase no indivíduo em comparação com o observado antes da administração.
[0178] Também são revelados na presente invenção métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio de tecido que resulta em perda ou destruição de tecido ou, alternativamente, resulta em falha na formação de tecido ou, ainda alternativamente, causa formação de tecido anormal. É revelado na presente invenção um método de tratamento de uma doença ou distúrbio de tecido, compreendendo a administração de uma composição revelada na presente invenção a um local alvo de um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a doença ou distúrbio do tecido resulta em: (i) perda ou destruição do tecido; (ii) falha na formação do tecido; ou (iii) formação de tecido anormal.
[0179] Também é revelado na presente invenção um método de tratamento de uma doença ou distúrbio de tecido, compreendendo transplantar uma composição revelada na presente invenção em um local alvo de um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a doença ou distúrbio dos tecidos resulta em: (i) perda ou destruição do tecido; (ii) falha na formação do tecido; ou (iii) formação de tecido anormal.
[0180] Da mesma forma, é revelado na presente invenção um método de tratamento de uma doença ou distúrbio do tecido, compreendendo a implantação de uma composição revelada na presente invenção em um local alvo de um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a doença ou distúrbio do tecido resulta em: (i) perda ou destruição do tecido; (ii) falha na formação do tecido; ou (iii) formação de tecido anormal.
[0181] Também é revelado na presente invenção um kit compreendendo uma composição como revelada na presente invenção e instruções de uso.
[0182] Conforme usado na presente invenção, o termo "indivíduo" conforme usado na presente invenção refere-se a um mamífero. Em modalidades, o mamífero é um humano. Em outras modalidades, o mamífero é um animal não humano. O mamífero pode ser, por exemplo, selecionado a partir de ratos, camundongos, porcos, cavalos, cabras, ovelhas, coelhos, cães, gatos, primatas, vacas, bois, camelos, jumentos, porquinhos-da-índia ou bisões.
[0183] Conforme usado na presente invenção, o termo "local alvo" ou "alvo" refere-se a um local dentro, sobre ou adjacente ao tecido em que a composição procura impactar, agir sobre ou mudar direta ou indiretamente.
[0184] "Tratamento" e "tratar", conforme usado na presente invenção não requer cura completa da doença ou distúrbio ou resolução completa dos sintomas da doença ou distúrbios (por exemplo, formação ou reconstrução completa de tecido funcional). O modo de administração pode ser qualquer modo adequado. Os modos de administração representativos e não limitantes incluem a colocação, implementação, aplicação, transplante, implantação, semeadura direta, migração direcionada, rastreamento direcionado, em conjunção, laminação, injeção, absorção e combinações dos mesmos.
MODALIDADES EXEMPLARES
[0185] 1. Uma composição compreendendo pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero estimulada ex vivo ou compreendendo artificialmente entidades celulares de núcleo potente e entidades de suporte, em que a composição é capaz de montar material funcional.
[0186] 2. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido cutâneo.
[0187] 3. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface epidérmica- dérmica.
[0188] 4. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface dérmica papilar-reticular.
[0189] 5. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface dérmica- hipodérmica.
[0190] 6. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface hipodérmica- subdérmica.
[0191] 7. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface de apêndice- substrato.
[0192] 8. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido ósseo.
[0193] 9. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido ósseo compreende uma interface de tecido peri- cortical.
[0194] 10. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido ósseo compreende uma interface de tecido peri- lamelar.
[0195] 11. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido ósseo compreende uma interface de tecido peritrabecular.
[0196] 12. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido ósseo compreende uma interface de tecido córtico-esponjoso.
[0197] 13. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido musculoesquelético.
[0198] 14. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido mio-epimisial.
[0199] 15. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido mio-perimisial.
[0200] 16. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido mio-endomisial.
[0201] 17. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido miofascial.
[0202] 18. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido do tendão-músculo.
[0203] 19. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido do tendão-osso.
[0204] 20. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido de ligamento de osso.
[0205] 21. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido muscular liso.
[0206] 22. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular liso compreende uma interface de tecido perivascular.
[0207] 23. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular liso compreende uma interface de tecido perivisceral.
[0208] 24. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular liso compreende uma interface de tecido perineural.
[0209] 25. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido muscular cardíaco.
[0210] 26. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular cardíaco compreende uma interface de tecido endocárdico-miocárdico.
[0211] 27. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular cardíaco compreende uma interface de tecido miocárdico-epicárdico.
[0212] 28. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular cardíaco compreende uma interface de tecido epicárdico-pericárdico.
[0213] 29. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular cardíaco compreende uma interface de tecido pericárdico-adiposo.
[0214] 30. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido cartilaginoso.
[0215] 31. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de tecido condrial-pericondrial.
[0216] 32. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de tecido condrial-endocondrial.
[0217] 33. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de osso endocondrial-subcondral.
[0218] 34. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de osso condrial-endocondrial.
[0219] 35. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de osso endocondrial-subcondral.
[0220] 36. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido adiposo.
[0221] 37. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido adiposo compreende uma interface de tecido adipo-perivascular.
[0222] 38. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido adiposo compreende uma interface de tecido adipo-peristromal.
[0223] 39. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido gastrointestinal.
[0224] 40. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido mucoso-submucoso.
[0225] 41. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido sub-mucoso-muscular.
[0226] 42. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido muscular-seroso.
[0227] 43. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido seroso-mesentérico.
[0228] 44. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido mio-neural.
[0229] 45. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido submucoso-neural.
[0230] 46. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido pulmonar.
[0231] 47. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido mucoso-submucoso.
[0232] 48. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido sub-mucoso-muscular.
[0233] 49. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido submucoso de cartilagem.
[0234] 50. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido muscular-adventício.
[0235] 51. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido ducto-adventício.
[0236] 52. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido parenquimatoso-seroso.
[0237] 53. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido seroso-mesentérico.
[0238] 54. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido mio-neural.
[0239] 55. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido submucoso-neural.
[0240] 56. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido esofágico.
[0241] 57. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido mucoso-submucoso.
[0242] 58. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido sub-mucoso-muscular.
[0243] 59. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido muscular-adventício.
[0244] 60. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido mio-neural.
[0245] 61. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido submucoso-neural.
[0246] 62. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido gástrico.
[0247] 63. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido mucoso-submucoso.
[0248] 64. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido sub- mucoso-muscular.
[0249] 65. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido muscular-seroso.
[0250] 66. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido mio-neural.
[0251] 67. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido submucoso-neural.
[0252] 68. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido renal.
[0253] 69. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido renal compreende uma interface de tecido cápsula-cortical.
[0254] 70. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido renal compreende uma interface de tecido cortical-medular.
[0255] 71. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido renal compreende uma interface de tecido neuro- parenquimatoso.
[0256] 72. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido hepático.
[0257] 73. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido hepático compreende uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso ductal.
[0258] 74. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido hepático compreende uma interface de tecido capsular-parenquimatoso.
[0259] 75. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido pancreático.
[0260] 76. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pancreático compreende uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso ductal.
[0261] 77. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pancreático compreende uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso glandular.
[0262] 78. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido dos vasos sanguíneos.
[0263] 79. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido dos vasos sanguíneos compreende uma interface de tecido endotelial-túnica.
[0264] 80. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido dos vasos sanguíneos compreende uma interface de tecido tunica-tunica.
[0265] 81. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido linfático.
[0266] 82. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido linfático compreende uma interface de tecido córtico-medular.
[0267] 83. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido linfático compreende uma interface de tecido medular de cápsula.
[0268] 84. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido linfático compreende uma interface de tecido cápsula de polpa.
[0269] 85. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido nervoso central.
[0270] 86. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso central compreende uma interface de tecido do córtex dural.
[0271] 87. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso central compreende uma interface de tecido de substância cinzenta cortical-substância branca medular.
[0272] 88. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido nervoso central compreende uma interface de tecido meníngeo-neural.
[0273] 89. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido urogenital.
[0274] 90. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido epitelial-mucoso.
[0275] 91. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido mucoso-muscular.
[0276] 92. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido muscular-adventício.
[0277] 93. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido corporal-vascular.
[0278] 94. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido corporal-muscular.
[0279] 95. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido glandular.
[0280] 96. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido glandular compreende uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso.
[0281] 97. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido dental.
[0282] 98. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido dental compreende uma interface de tecido de polpa-dentina.
[0283] 99. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido nervoso periférico.
[0284] 100. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso periférico compreende uma interface de tecido epineural-perineural.
[0285] 101. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso periférico compreende uma interface de tecido perineural-endoneural.
[0286] 102. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso periférico compreende uma endoneural- axonal.
[0287] 103. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido do nascimento.
[0288] 104. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido fluido de âmnio.
[0289] 105. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido epitelial-subepitelial.
[0290] 106. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido epitelial-estroma.
[0291] 107. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido compacto-fibroblástico.
[0292] 108. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido intermediário-fibroblástico.
[0293] 109. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido reticular intermediário.
[0294] 110. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido âmnio-córion.
[0295] 111. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido trofoblástico-reticular.
[0296] 112. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido trofoblástico-uterino.
[0297] 113. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido trofoblástico de decídua.
[0298] 114. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido óptico.
[0299] 115. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de membrana epitelial.
[0300] 116. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de estroma de membrana.
[0301] 117. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de membrana estromal.
[0302] 118. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido endotelial de membrana.
[0303] 119. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de fluido endotelial.
[0304] 120. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido coroide escleral.
[0305] 121. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido epitelial coroide.
[0306] 122. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido fotorreceptor epitelial segmentar.
[0307] 123. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de membrana fotorreceptora segmentar.
[0308] 124. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido da camada nuclear externa da membrana.
[0309] 125. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido plexiforme externo da camada nuclear externa.
[0310] 126. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido plexiforme externo-plexiforme interno.
[0311] 127. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido plexiforme interno-ganglionar.
[0312] 128. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de ganglionar-fibra neural.
[0313] 129. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de membrana-interface de tecido de fibra neural.
[0314] 130. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido fluido de membrana.
[0315] 131. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as entidades de suporte compreendem populações celulares derivadas de células mesenquimais.
[0316] 132. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as entidades de suporte compreendem populações celulares, elementos da matriz extracelular ou combinações dos mesmos.
[0317] 133. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores,
compreendendo adicionalmente uma liberação de substrato.
[0318] 134. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o substrato de liberação é selecionado a partir de um suporte, matriz, partícula, células, fibra ou combinações dos mesmos.
[0319] 135. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente um suplemento selecionado a partir de um fator de crescimento, um analito, um elemento interativo LGR ou combinações dos mesmos.
[0320] 136. A composição de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o analito é selecionado a partir de um analito migratório, um analito de recrutamento, um agente estimulador, um agente inibidor ou combinações dos mesmos.
[0321] 137. Um método para produzir uma composição, compreendendo: isolar pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero compreendendo entidades celulares de núcleo potente e entidades de suporte; e desenvolver uma interface reativa e estimulada para fornecer a composição, em que a composição é capaz de montar material funcional.
[0322] 138. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido cutâneo.
[0323] 139. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface epidérmica- dérmica.
[0324] 140. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface dérmica papilar-
reticular.
[0325] 141. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface dérmica- hipodérmica.
[0326] 142. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface hipodérmica- subdérmica.
[0327] 143. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cutâneo compreende uma interface de apêndice- substrato.
[0328] 144. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores em , que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido ósseo.
[0329] 145. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido ósseo compreende uma interface de tecido peri- cortical.
[0330] 146. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido ósseo compreende uma interface de tecido peri- lamelar.
[0331] 147. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido ósseo compreende uma interface de tecido peritrabecular.
[0332] 148. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido ósseo compreende uma interface de tecido córtico- esponjoso.
[0333] 149. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido musculoesquelético.
[0334] 150. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido mio-epimisial.
[0335] 151. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido mio-perimisial.
[0336] 152. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido mio-endomisial.
[0337] 153. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido miofascial.
[0338] 154. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido do tendão-músculo.
[0339] 155. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido do tendão-osso.
[0340] 156. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido musculoesquelético compreende uma interface de tecido de ligamento-osso.
[0341] 157. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido muscular liso.
[0342] 158. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular liso compreende uma interface de tecido perivascular.
[0343] 159. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular liso compreende uma interface de tecido perivisceral.
[0344] 160. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular liso compreende uma interface de tecido perineural.
[0345] 161. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido muscular cardíaco.
[0346] 162. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular cardíaco compreende uma interface de tecido endocárdico-miocárdico.
[0347] 163. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular cardíaco compreende uma interface de tecido miocárdico-epicárdico.
[0348] 164. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular cardíaco compreende uma interface de tecido epicárdico-pericárdico.
[0349] 165. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido muscular cardíaco compreende uma interface de tecido pericárdico-adiposo.
[0350] 166. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido cartilaginoso.
[0351] 167. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de tecido condrial-pericondrial.
[0352] 168. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de tecido condrial-endocondrial.
[0353] 169. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de osso endocondrial-subcondral.
[0354] 170. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de osso condrial-endocondrial.
[0355] 171. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido cartilaginoso compreende uma interface de osso endocondrial-subcondral.
[0356] 172. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido adiposo.
[0357] 173. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido adiposo compreende uma interface de tecido adipo- perivascular.
[0358] 174. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido adiposo compreende uma interface de tecido adipo- peristromal.
[0359] 175. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido gastrointestinal.
[0360] 176. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido mucoso-submucoso.
[0361] 177. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido sub-mucoso-muscular.
[0362] 178. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido muscular-seroso.
[0363] 179. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido seroso-mesentérico.
[0364] 180. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido mio-neural.
[0365] 181. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gastrointestinal compreende uma interface de tecido submucoso-neural.
[0366] 182. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido pulmonar.
[0367] 183. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido mucoso-submucoso.
[0368] 184. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido sub- mucoso-muscular.
[0369] 185. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido sub-
mucoso de cartilagem.
[0370] 186. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido muscular-adventício.
[0371] 187. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido ducto-adventício.
[0372] 188. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido parenquimatoso-seroso.
[0373] 189. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido seroso-mesentérico.
[0374] 190. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido mio- neural.
[0375] 191. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pulmonar compreende uma interface de tecido submucoso-neural.
[0376] 192. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido esofágico.
[0377] 193. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido mucoso-submucoso.
[0378] 194. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido sub-
mucoso-muscular.
[0379] 195. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido muscular-adventício.
[0380] 196. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido mio- neural.
[0381] 197. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido esofágico compreende uma interface de tecido submucoso-neural.
[0382] 198. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido gástrico.
[0383] 199. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido mucoso-submucoso.
[0384] 200. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido sub- mucoso-muscular.
[0385] 201. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido muscular-seroso.
[0386] 202. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido mio- neural.
[0387] 203. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido gástrico compreende uma interface de tecido submucoso-neural.
[0388] 204. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido renal.
[0389] 205. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido renal compreende uma interface de tecido cápsula- cortical.
[0390] 206. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido renal compreende uma interface de tecido cortical- medular.
[0391] 207. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido renal compreende uma interface de tecido neuro- parenquimatoso.
[0392] 208. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido hepático.
[0393] 209. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido hepático compreende uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso ductal.
[0394] 210. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido hepático compreende uma interface de tecido capsular-parenquimatoso.
[0395] 211. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido pancreático.
[0396] 212. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pancreático compreende uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso ductal.
[0397] 213. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido pancreático compreende uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso glandular.
[0398] 214. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido dos vasos sanguíneos.
[0399] 215. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido dos vasos sanguíneos compreende uma interface de tecido endotelial-túnica.
[0400] 216. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido dos vasos sanguíneos compreende uma interface de tecido tunica-tunica.
[0401] 217. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido linfático.
[0402] 218. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido linfático compreende uma interface de tecido córtico- medular.
[0403] 219. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido linfático compreende uma interface de tecido medular de cápsula.
[0404] 220. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido linfático compreende uma interface de tecido cápsula de polpa.
[0405] 221. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido nervoso central.
[0406] 222. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso central compreende uma interface de tecido do córtex dural.
[0407] 223. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso central compreende uma interface de tecido de substância cinzenta cortical-substância branca medular.
[0408] 224. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso central compreende uma interface de tecido meníngeo-neural.
[0409] 225. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido urogenital.
[0410] 226. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido epitelial-mucoso.
[0411] 227. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido mucoso-muscular.
[0412] 228. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido muscular-adventício.
[0413] 229. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido corporal-vascular.
[0414] 230. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido urogenital compreende uma interface de tecido corporal-muscular.
[0415] 231. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido glandular.
[0416] 232. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido glandular compreende uma interface de tecido epitelial-parenquimatoso.
[0417] 233. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido dental.
[0418] 234. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido dental compreende uma interface de tecido de polpa de dentina.
[0419] 235. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido nervoso periférico.
[0420] 236. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso periférico compreende uma interface de tecido epineural-perineural.
[0421] 237. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso periférico compreende uma interface de tecido perineural-endoneural.
[0422] 238. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido nervoso periférico compreende uma endoneural- axonal.
[0423] 239. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido do nascimento.
[0424] 240. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido fluido de âmnio.
[0425] 241. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido epitelial-subepitelial.
[0426] 242. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido epitelial-estroma.
[0427] 243. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido compacto fibroblástico.
[0428] 244. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido intermediário de fibroblastos.
[0429] 245. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido reticular intermediário.
[0430] 246. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido âmnio-córion.
[0431] 247. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido trofoblástico reticular.
[0432] 248. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido trofoblástico uterino.
[0433] 249. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido do nascimento compreende uma interface de tecido trofoblástico de decídua.
[0434] 250. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de material de mamífero é derivada a partir de uma interface de tecido óptico.
[0435] 251. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de membrana epitelial.
[0436] 252. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de estroma de membrana.
[0437] 253. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de membrana estromal.
[0438] 254. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido endotelial de membrana.
[0439] 255. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de fluido endotelial.
[0440] 256. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido coroide escleral.
[0441] 257. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido epitelial coroide.
[0442] 258. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido fotorreceptor epitelial segmentar.
[0443] 259. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de membrana fotorreceptora segmentar.
[0444] 260. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido da camada nuclear externa da membrana.
[0445] 261. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido plexiforme externo da camada nuclear externa.
[0446] 262. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido plexiforme externo-plexiforme interno.
[0447] 263. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido plexiforme interno-ganglionar.
[0448] 264. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de ganglionar-fibra neural.
[0449] 265. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido de membrana-interface de tecido de fibra neural.
[0450] 266. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a interface de tecido óptico compreende uma interface de tecido fluido de membrana.
[0451] 267. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as entidades de suporte compreendem populações celulares derivadas de células mesenquimais.
[0452] 268. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as entidades de suporte são selecionadas a partir de populações celulares, elementos da matriz extracelular ou combinações dos mesmos.
[0453] 269. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente adicionar um suplemento selecionado adicionado a partir de um fator de crescimento, um analito, um elemento interativo LGR ou combinações dos mesmos.
[0454] 270. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o analito é selecionado a partir de um analito migratório, um analito de recrutamento, um agente estimulador, um agente inibidor ou combinações dos mesmos.
[0455] 271. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente adicionar a composição a uma liberação de substrato.
[0456] 272. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o substrato de liberação é selecionado a partir de um suporte, matriz, partícula, células, fibra ou combinações dos mesmos.
[0457] 273. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente criopreservar a composição.
[0458] 274. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo adicionalmente liofilizar a composição de substrato.
[0459] 275. Uma composição produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações anteriores.
[0460] 276. Um método de tratamento de uma doença ou distúrbio de tecido, compreendendo administrar uma composição a um local alvo de um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a doença ou distúrbio do tecido resulta em: (i) perda ou destruição do tecido; (ii) falha de formação do tecido; ou (iii) formação de tecido anormal; e a composição compreendendo pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero compreendendo entidades celulares de núcleo potente e entidades de suporte, em que a composição é capaz de montar tecido funcional.
EXEMPLOS Exemplo 1
[0461] Começando com um material de espécime mamífero, coloque o material de espécime mamífero em uma série de uma ou mais lavagens usando solução biocompatível, isotônica (por exemplo, NaCl a 0,9%, HBSS, PBS, DMEM, RPMI, Ringer-lactato, dextrose a 5% em água, citrato de sódio a 3,2%) (com ou sem agente(s) antimicrobiano(s)) por aproximadamente 5 minutos cada um com agitação suave, balanço, sacudida e/ou mistura.
[0462] Depois de lavado, localize uma interface de tecido. Os métodos de localização, incluindo o uso de equipamentos e/ou sistemas de suporte, são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para localizar a(s) interface(s) de tecido apropriada(s). Se a interface completa não estiver presente, localize a área em que um subcompartimento ou subconjunto de interface (ou seja, subinterface) está presente.
[0463] Separe a interface no compartimento completo ou no subcompartimento (ou seja, subinterface) do restante do material de espécime mamífero (ou seja, os materiais sem interface). Continue com a ação de separar a interface até ter obtido material suficiente para a aplicação em questão, por exemplo, volume/massa de material necessário para tratar o tamanho da ferida. Os métodos de separação, incluindo o uso de equipamentos e/ou sistemas de suporte, são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para separar a(s) interface(s) apropriada(s).
[0464] Coloque os materiais de interface completa ou subinterface em uma solução de solução de meio de suporte (por exemplo, HBSS, PBS) e adicione um estimulante reativo eficaz e/ou um adjuvante acelerador relacionado (por exemplo, colagenase, hialuronidase testicular, tripsina) por 1 a 15 minutos em um ambiente de CO2 com temperatura controlada. Os métodos de estimulação reativa, incluindo o uso de reagentes, equipamentos e/ou sistemas de suporte, são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para fornecer a interface reativa e estimulada.
[0465] Termine a ação do estimulante reativo e/ou adjuvante acelerador relacionado com o agente, solução, fator e/ou meio de terminação adequados (por exemplo, EDTA). Os métodos de terminação, incluindo o uso de reagentes, equipamentos e/ou sistemas de suporte, são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para terminar tal(is) ação(ões).
[0466] Colete a interface estimulada a partir da solução. Mantenha a solução. Os métodos de coleção, incluindo o uso de reagentes, equipamentos e/ou sistemas de suporte, são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para coletar a interface reativa e estimulada.
[0467] Coloque a interface reativa e estimulada coletada em um vaso estéril temporário com pequena quantidade de uma solução biocompatível isotônica e armazene. Retorne aos materiais sem interface restantes (ou seja, localizado no espécime de mamífero lavado).
[0468] Coloque os materiais sem interface em uma solução de solução de meio de suporte e adicione estimulante reativo eficaz e/ou adjuvante acelerador relacionado por 1 a 15 minutos em um ambiente de CO2 com temperatura controlada. Os métodos de estimulação reativa, incluindo o uso de reagentes, equipamentos e/ou sistemas de suporte, são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para fornecer material sem interface reativo e estimulado.
[0469] Termine a ação do estimulante reativo e/ou adjuvante acelerador relacionado com o agente, solução, fator e/ou meio de terminação adequados. Os métodos de terminação, incluindo o uso de reagentes, equipamentos e/ou sistemas de suporte, são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para terminar tal(is) ação(ões).
[0470] Colete os materiais sem interface reativos e estimulados da solução. Mantenha a solução para uso posterior. Os métodos de coleção, incluindo o uso de reagentes, equipamentos e/ou sistemas de suporte, são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para coletar o material sem interface reativo e estimulado.
[0471] Adicione o material sem interface reativo e estimulado a um vaso de cultura secundário, sistema de suporte ex vivo ou biorreator, adicione materiais de meio suplementares e incube em sistema fechado que tem capacidade para controle ambiental e alteração ambiental (por exemplo, incubadora ou biorreator).
[0472] Adicione o material de interface reativo e estimulado e o fluido de processamento resultante a um vaso de cultura secundário, sistema de suporte ex vivo ou biorreator e adicione materiais de meio suplementares e incube em sistema fechado que tem capacidade para controle ambiental e alteração ambiental (por exemplo, incubadora ou biorreator).
[0473] Manter suporte e/ou cultura ex vivo do material processado, separadamente ou em forma de sistema(s) de cultura dupla se desejado ou pretendido.
[0474] Quando necessário, implemente, coloque ou combine esses materiais reativos e estimulados em combinação ou separadamente para o alvo de interesse. Exemplo 2
[0475] Um espécime de tecido ósseo foi obtido e colocado em uma série de lavagens sequenciais usando uma solução biocompatível, isotônica (por exemplo, NaCl a 0,9%, HBSS, PBS, DMEM, RPMI, Ringer-lactato, dextrose a 5% em água, citrato de sódio a 3,2%) (com ou sem um agente antimicrobiano) por aproximadamente 5 minutos cada um com agitação suave, balanço, sacudida e/ou mistura.
[0476] Depois de lavada, uma interface de tecido ósseo foi localizada e uma quantidade suficiente do material de interface de tecido ósseo foi separada do restante do espécime de tecido ósseo (ou seja, os materiais sem interface).
[0477] O material de interface de tecido ósseo foi colocado em uma solução de meio de suporte e um estimulante reativo eficaz e adjuvante acelerador relacionado (por exemplo, colagenase, hialuronidase testicular, tripsina) foram adicionados. A estimulação reativa ocorreu por 1 a 15 minutos em um ambiente de CO2 com temperatura controlada e forneceu uma interface de tecido ósseo reativa e estimulada.
[0478] A ação do estimulante reativo e adjuvante acelerador relacionado foi terminada com um agente de terminação (por exemplo, EDTA).
[0479] A interface de tecido ósseo reativa e estimulada foi coletada a partir da solução. A solução foi mantida para uso posterior.
[0480] A interface de tecido ósseo reativo e estimulado coletada foi colocada em um vaso estéril temporário com pequena quantidade de solução biocompatível isotônica e armazenada para evitar a dessecação de interface de tecido ósseo reativa e estimulada coletada.
[0481] Os materiais sem interface foram colocados em uma solução de meio de suporte (por exemplo, HBSS, PBS) e um estimulante reativo eficaz e adjuvante acelerador relacionado foram adicionados. Estimulação reativa ocorreu por 1 a 15 minutos em um ambiente de CO2 com temperatura controlada e forneceu materiais sem interface reativos e estimulados.
[0482] A ação do estimulante reativo e adjuvante acelerador relacionado foi terminada com um agente de terminação.
[0483] Os materiais sem interface reativos e estimulados foram coletados a partir da solução. A solução foi mantida para uso posterior.
[0484] Os materiais sem interface de reativos e estimulados foram adicionadas a uma incubadora, foram adicionados materiais de meio suplementar e a combinação foi incubada em um sistema fechado, controlado ambientalmente.
[0485] A interface de tecido ósseo reativa e estimulada e a solução associada foram adicionadas a uma incubadora, foram adicionados materiais de meio suplementar e a combinação foi incubada em sistema fechado, controlado ambientalmente.
[0486] Em casos separados, a interface de tecido ósseo reativa e estimulada e a combinação de interface de tecido ósseo reativa e estimulada e os materiais sem interface reativos e estimulados foram colocados em alvos de interesse. Exemplo 3
[0487] As Figuras 1a-e mostram imagens comparativas de uma composição de origem óssea, conforme revelado na presente invenção no Sistema de Modelo de Defeito Craniano de Tamanho Crítico. (a.) Osso craniano nativo tridimensional (3-D) tomografia microcomputadorizada (micro-CT) exibindo ossos parietal esquerdo e parietal direito pré-defeito de sistema de modelo in vivo no ponto de tempo TPDN. (b.) Imagem bruta de defeitos de tamanho crítico bi-parietais, criados cirurgicamente, completos, dos ossos parietais esquerdo e direito dentro de sistema de modelo in vivo no ponto de tempo T0. (c.) Micro-TC 3-D de defeitos de tamanho crítico bi-parietais, cirurgicamente criados, completos (de espessura total), dos ossos parietais esquerdo e direito dentro do sistema modelo in vivo. ① Indica a região óssea parietal direita com defeito de 8 mm de diâmetro no momento T0 que não foi tratado e mantido como controle de defeito ao longo do estudo. ② Indica a região óssea parietal esquerda com defeito de 8 mm que foi tratada com a composição de origem óssea e mantida como controle tratado com defeito ao longo do estudo. (d.) Micro-TC 3-D de defeitos de tamanho crítico bi-parietais, criados cirurgicamente, completos, dos ossos parietais esquerdo e direito dentro de sistema de modelo in vivo a 4 semanas pós-procedimento e intervenção (ponto de tempo TPPI-4WK). ❶ Indica a região óssea parietal direita não tratada (controle de defeito) em 4 semanas. ❷ Indica a região óssea parietal esquerda tratada (tratamento da composição óssea derivada) em 4 semanas. (e.) Descreve as margens relativas dos defeitos bi-parietais primários (círculos pontilhados) no ponto de tempo T0; ROI (caixa de linhas tracejadas) indica uma comparação ampliada de 4 semanas de defeitos pós-tratamento de micro-CT 3-D e plotagem de superfície colorida do espectro térmico em 3-D correlativa indicando profundidade relativa da superfície e contorno volumétrico.
Abreviações: Ponto de tempo nativo do pré-defeito (TPDN): ponto no tempo em que o crânio nativo foi retratado antes da criação do defeito;
Ponto de tempo nativo do defeito (T0 0): ponto no tempo em que defeitos completos (de espessura total) de 8 mm de tamanho crítico foram criados nas regiões parietais do crânio; Pós-procedimento e intervenção no ponto de tempo de 4 semanas (TPPI-4WK): ponto no tempo em que se passaram quatro semanas desde que os defeitos foram criados +/- tratados com intervenção. Por conseguinte, estes resultados demonstram que as composições de origem óssea como reveladas na presente invenção são úteis em métodos para promover a regeneração de ossos. Exemplo 4
[0488] As Figuras 2a e 2b mostram a progressão do desenvolvimento de tecido polarizado funcional por uma composição de origem cutânea em um Sistema de Modelo Cutâneo (porco). As Figuras 2a e 2b mostram resultados no mesmo animal com diferentes plataformas de imagem. A plataforma de imagem da Figura 2a era uma câmera DSLR de alta definição. A plataforma de imagem da Figura 2b era uma câmera polarizada sob ampliação. (a.) Fileira - Descreve a progressão da composição de origem cutânea após a colocação no vazio cutâneo e o desenvolvimento de focos de tecido cutâneo de espessura total funcionalmente polarizados. (b.) Fileira - Descreve a progressão dos focos da composição de origem cutânea convergem com propagação de composição de origem cutânea e/ou com o sistema que recebeu a referida composição de origem cutânea, resultando na geração progressiva de tecido cutâneo de espessura completa, funcionalmente polarizado em todo o espaço vazio. Exemplo 5: Estudo de ossos longos de coelho
[0489] O modelo de defeitos de ossos longos consistia em 30 coelhos Nova Zelândia Brancos. Uma incisão na linha média dorsal de 3-4 cm de comprimento foi criada sobre o membro anterior no centro aproximado da diáfise. O tecido mole entre os tendões extensor e flexor foi incisado e o músculo elevado com cuidado a partir da superfície da ulna por aproximadamente 12 a 18 mm. Uma serra oscilante foi usada para cortar a diáfise ulnar. Cuidados foram tomados para usar a irrigação por cristaloides durante o procedimento de corte para evitar lesões térmicas nos tecidos adjacentes. Cuidados foram tomados para garantir que a superfície radial vizinha não fosse pontuada ou entalhada durante a realização do procedimento de ostectomia. Após o corte da ostectomia proximal ser concluído, o corte distal foi concluído e o fragmento de osso foi removido suavemente com mínimo trauma ao ligamento intraósseo. O tamanho total do defeito ulnar foi de 10 mm.
[0490] Os defeitos foram submetidos a vários tratamentos, incluindo o tratamento por uma composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) ou deixados sem tratamento. A tabela 1 mostra os grupos de tratamento: Tabela 1 Grupo Nº N Destinatário Tratamento 1 5 Nova Zelândia Branco Defeito não tratado 2 5 Nova Zelândia Branco DBM + BMP2 3 5 Nova Zelândia Branco AHBC
[0491] Após a remoção do osso do local do defeito, ele foi colocado em meio de transporte estéril e processado no local em uma composição de origem óssea (por exemplo, AHBC). O processamento foi realizado em uma interface de tecido ósseo para criar uma composição estimulada compreendendo um agregado de entidades celulares de núcleo vivo potente e entidades de suporte em que as entidades celulares de núcleo vivo potente expressam uma sequência de LGR4, LGR5 e/ou LGR6. O AHBC foi implantado no defeito e o músculo/tecido mole sobre o local da operação foi fechado com sutura absorvível. As camadas subcutânea e de pele foram fechadas com sutura não absorvível de uma maneira em camadas.
[0492] DBM + BMP-2 foi preparado combinando DBM (humano) com 10 ug/mL de Proteína Morfogênica Óssea-2 (BMP-2). Os defeitos foram preenchidos com DBM + BMP-2 usando um volume equívoco como a quantidade de AHBC usada para animais tratados com AHBC.
[0493] No final do estudo, os tecidos colhidos incluíram o membro dianteiro em bloco. A dissecção a jusante de tecidos incluiu a remoção do músculo da pele sobrejacente e periósteo. Métodos de geração de imagem:
[0494] Imagem bruta: As fotografias DSLR foram adquiridas intraoperatórias com uma Canon 5DSR. Imagens ex vivo documentadas usando a mesma configuração com câmera montada no suporte de cópia.
[0495] Vimago CT: Os animais foram escaneados a cada duas semanas durante o estudo de oito semanas usando o Vimago CT com as seguintes configurações: • 60 mA • 80 kV • 7 ms • Tempo - 32 segundos • Resolução - 200 um
[0496] Micro-CT (µCT): Um instrumento Quantum GX2, PerkinElmer foi usado para gerar imagem de todos os espécimes de ossos longos de coelho ex vivo. Cada amostra foi fotografada em 90kV, 40µA, FOV 36mm, tamanho de voxel 90µm, filtro Al 0,5 CU 1,0 por 4 minutos para obter a melhor resolução. As imagens analisadas com o software Analyze versão 12.0 (AnalyzeDirect, Overland Park, KS, EUA).
[0497] Microscopia composta: Usando o Leica 205 FA Equipado com uma câmera DFC7000T, cada amostra é fotografada em torno de sua circunferência usando uma série de lapsos de tempo para obter uma visão 360 de cada defeito. Antes da geração de imagens dessas amostras, o rádio é removido da ulna de regeneração para mostrar a melhor representação possível da região de defeito e regeneração. No grupo não tratado, há muito pouco crescimento e, portanto, o rádio é mantido com a ulna. Isso é usado para mostrar uma imagem colorida da regeneração óssea e de outros tecidos ao redor e dentro da região de defeito.
[0498] Imagem por Microscopia Eletrônica de Varredura: Usando o microscópio eletrônico de varredura ambiental Zeiss Evo LS 10, foram obtidas imagens de todas as amostras de ossos longos de cada grupo para ajudar a determinar a viabilidade da regeneração de osso.
[0499] Imagem de Segunda Geração Harmônica (SHG): A geração de imagens da segunda geração harmônica foi realizada usando um microscópio confocal multifuncional Leica SP8 equipado com um laser de dois fótons sintonizável Chameleon ajustado para 880nm usando uma objetiva de 10x de 0,40 NA. Espectroscopia Raman:
[0500] Um microscópio confocal Raman (Thermo Fisher Raman DXR) com uma objetiva de 10x e um comprimento de onda de laser de 785 nm (potência do laser de 28 mW) foi usado para coletar espectros. Uma abertura de fenda de 25 um foi usada para coletar uma faixa espectral entre os números de onda de 500 a 3500 cm-1. A resolução estimada foi de 2,3 a 4,3 cm-1. Os dados espectrais foram coletados usando uma exposição de 1 s com uma relação sinal a ruído de 300 para garantir que os espectros coletados representassem o material em massa. Para varreduras de pontos de superfície, um total de 2-5 espectros foram coletados de posições arbitrárias pela superfície de topo do defeito. Para varreduras de linhas de superfície, foram coletados 6 espectros com espaçamento de 200 um entre cada ponto de coleta.
[0501] A análise espectroscópica Raman foi realizada usando o software OMNIC (Thermo Scientific) para Raman dispersivo. Os recursos disponíveis no software OMNIC foram usados para remover a fluorescência de fundo de todos os espectros de varredura de ponto de superfície usando ajuste de linha de base polinomial de 6ª ordem. Os espectros de pontos de superfície coletados de cada espécime foram normalizados e calculados a média para representar um animal individual. As médias gerais do grupo foram calculadas usando espectros médios de cada animal individual dentro do grupo. Os quimigramas OMNIC para varreduras de áreas transversais foram criados usando faixas de 950 a 965 cm-1 para hidroxiapatita. Métodos de Expressão Gênica:
[0502] Coleta de amostras: O tecido foi coletado a partir de feridas tratadas e não tratadas e ulna nativa após imagens brutas. O tecido foi coletado em AllProtect (Qiagen), mantido a 4C por 24 horas, e depois foi movido para -80C para armazenamento até a extração de RNA ser realizada.
[0503] Extração de RNA: A lise do tecido foi realizada com PowerLyzer (Qiagen) por dois ciclos de 45 segundos a 3500 rpm com um tempo de permanência de 30 segundos entre os ciclos. O RNA foi purificado a partir do lisado de tecido resultante usando o Mini Kit RNeasy Plus Universal (Qiagen). O RNA foi quantificado usando Nanodrop Lite (ThermoFisher Scientific).
[0504] Transcrição Reversa e qRT-PCR: 800 ng de RNA foram transcritos reversamente para cDNA usando o kit RT2 First Strand (Qiagen). O cDNA resultante foi usado como modelo para as placas de perfilador RT2 PCR que foram executadas de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen) em um QuantStudio 12K Flex ou QuantStudio 3 (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific). Os dados dessas execuções foram analisados comparando feridas cicatrizadas com tecido nativo e feridas cicatrizadas com controles não tratados. Os dados de qPCR foram analisados pelo Centro de Análise de Dados Qiagen online usando o método delta-delta Ct para determinar a regulação de dobras de genes individuais e o teste t de alunos (distribuição bicaudal e variações iguais entre as duas amostras) para determinar a significância. Resultados:
[0505] O grupo tratado com AHBC resultou em formação óssea. As imagens nas Figuras 6-8 mostram regeneração óssea qualitativa com tratamento com AHBC. As imagens nas Figuras 9 e 10 também mostram regeneração óssea qualitativa com tratamento com AHBC. AHBC também mostra integridade estrutural e, quando separado do rádio, mostra desassociação do rádio. As Figuras 9 e 10 demonstram que o tratamento com AHBC resultou em formação óssea semelhante ao osso nativo. Além disso, as Figuras 9 e 10 também demonstram indivíduos que recebem tratamento com AHBC mostram um crescimento ósseo aumentado em comparação com o dos animais não tratados com os defeitos ósseos. Por conseguinte, estes resultados demonstram que as composições de origem óssea reveladas na presente invenção são úteis em métodos para promover a regeneração de ossos em um indivíduo em necessidade da mesma.
[0506] Os espectros de pontos de superfície médios do osso nativo, defeitos não tratados e o grupo tratado com AHBC foram comparados na localização do pico de fosfato como mostrado na Figura 11. As varreduras da linha de superfície do osso nativo, defeitos não tratados e o grupo tratado com AHBC foram coletados e mostram as linhas de pico de fosfato como mostrado na Figura 12. As varreduras de área de superfície do osso nativo, defeitos não tratados e o grupo tratado com AHBC foram comparados como mostrado na Figura 13. O pico de fosfato a 961 cm-1 é uma indicação da formação de hidroxiapatita mineral óssea e a intensidade está relacionada à concentração. Como mostrado nas Figuras 11-12, o grupo tratado com AHBC mostra alta intensidade de fosfato semelhante ao mineral ósseo nativo e indicando formação de mineral ósseo como no osso nativo.
[0507] Os perfis de expressão gênica para defeitos com tratamento com AHBC foram comparados ao tecido nativo e AHBC (Grupo 3) também foi comparado com feridas não tratadas. A Figura 3 mostra um mapa de calor exibindo mudanças dobradas na expressão gênica de fatores de angiogênese para o grupo tratado com AHBC em comparação com osso nativo. A Figura 4 mostra um mapa de calor exibindo mudanças dobradas na expressão gênica de genes da osteogênese para o grupo tratado com AHBC em comparação com osso nativo. A Figura 5 mostra um mapa de calor exibindo mudanças dobradas na expressão gênica de genes de cicatrização de feridas para o grupo tratado com AHBC em comparação com osso nativo. A comparação de AHBC versus tecido nativo resultou em quatro genes desregulados (IL2, MYOSIN2, ITGB5 e STAT3) dos 252 genes testados, mostrando que 98,4% dos genes testados são semelhantes no tratamento com AHBC e no tecido nativo. Portanto, o tratamento com AHBC resultou em uma ferida cicatrizada muito semelhante ao osso nativo no nível de expressão do gene. Por conseguinte, estes resultados demonstram que as composições de origem óssea reveladas na presente invenção são úteis em métodos para promover a regeneração de ossos em um indivíduo em necessidade da mesma. Exemplo 6: Estudo da coluna vertebral do coelho
[0508] O objetivo do estudo foi determinar a eficácia da fusão espinhal na cicatrização de defeitos de uma composição de origem óssea (por exemplo, AHBC). O modelo de defeito consistiu em 36 coelhos Nova Zelândia Brancos. Foi feita uma incisão mediana no nível da crista ilíaca e as cristas ilíacas foram expostas bilateralmente. Aproximadamente 2 - 2,5 cm3 de osso foi removido de cada crista ilíaca. Esse osso foi processado para obter a interface de tecido ósseo e para criar uma composição estimulada compreendendo um agregado de entidades celulares de núcleo vivo potente e entidades de suporte em que as entidades celulares de núcleo vivo potente expressam uma sequência de LGR4, LGR5 e/ou LGR6. Em seguida, foram feitas incisões faciais paramedianas para obter acesso aos processos transversais. Uma vez através da fáscia, dissecção romba com um dedo foi usada a fim de desenvolver a área entre os músculos. A dissecção romba foi usada para afastar adicionalmente as fibras musculares longissimus do processo transverso das vértebras cefálica e caudal no nível da fusão. Em seguida, a decorticação do processo transversal foi realizada usando um diamante (burr) de alta velocidade. Uma vez que os processos transverso cefálico e caudal foram adequadamente decorticados, a composição de origem óssea foi cuidadosamente aplicada às áreas de decorticação. Esse processo foi então repetido no lado contralateral. A fáscia foi fechada no topo e as camadas restantes de tecido e pele foram fechadas em camadas.
[0509] A tabela 2 mostra os grupos de tratamento: Tabela 2 Grupo Nº n Destinatário Tratamento 1 6 Nova Zelândia Branco Autoenxerto 2 6 Nova Zelândia Branco DBM + BMP2 3 6 Nova Zelândia Branco AHBC Espectroscopia Raman:
[0510] Um microscópio confocal Raman (Thermo Fisher Raman DXR) com uma objetiva de 10x e um comprimento de onda de laser de 785 nm (potência do laser de 28 mW) foi usado para coletar espectros ao longo da seção transversal da massa de fusão espinhal. Uma abertura de fenda de 25 um foi usada para coletar uma faixa espectral entre os números de onda de 500 a
3500 cm-1. A resolução estimada foi de 2,3 a 4,3 cm-1. Os dados espectrais foram coletados usando uma exposição de 1 s com uma relação sinal a ruído de 300 para garantir que os espectros coletados representassem o material em massa.
[0511] A análise espectroscópica Raman foi realizada usando o software OMNIC (Thermo Scientific) para Raman dispersivo. Os recursos disponíveis no software OMNIC foram usados para remover a fluorescência de fundo de todos os espectros de varredura de ponto de superfície usando ajuste de linha de base polinomial de 6ª ordem. Os espectros de pontos de superfície coletados de cada espécime foram normalizados e calculados a média para representar um animal individual. As médias gerais do grupo foram calculadas usando espectros médios de cada animal individual dentro do grupo. Os quimigramas OMNIC para varreduras de áreas transversais foram criados usando faixas de 950 a 965 cm-1 para hidroxiapatita. Resultados:
[0512] O grupo tratado com AHBC mostrou a maior frequência de fusão e foi o mesmo que o autoenxerto. O gráfico na Figura 14 ilustra a frequência de fusão espinhal.
[0513] Os espectros de pontos médios do osso nativo e grupos tratados com AHBC foram comparados na localização do pico de fosfato como mostrado na Figura 16. O pico de fosfato a 961 cm-1 é uma indicação da formação de hidroxiapatita mineral óssea e a intensidade está relacionada à concentração. O grupo tratado com AHBC mostra alta intensidade de fosfato semelhante ao mineral ósseo nativo e indicando formação de mineral ósseo como no osso nativo.
[0514] As varreduras das linhas de seção transversal foram coletadas para demonstrar a distribuição do mineral ósseo ao longo de uma certa distância como mostrado na Figura 17. A intensidade do pico de hidroxiapatita é representada como uma linha a 961 cm-1. Como mostrado na Figura 17, o grupo tratado com AHBC mostra alta intensidade de fosfato semelhante ao mineral ósseo nativo e indicando formação de mineral ósseo como no osso nativo.
[0515] Como mostrado na Figura 15, a densidade mineral óssea do grupo tratado com AHBC foi comparável aos animais que receberam o autoenxerto. Além disso, os animais tratados com AHBC apresentam densidade mineral óssea superior aos animais que receberam tratamento com DBM + BMP2. Por conseguinte, estes resultados demonstram que as composições de origem óssea reveladas na presente invenção são úteis em métodos para promover a regeneração de ossos em um indivíduo em necessidade da mesma. Exemplo 7: Estudo de crânio do coelho
[0516] O propósito deste estudo foi explorar a capacidade de uma composição de origem óssea (por exemplo, AHBC) para reparar defeitos de tamanho crítico no crânio de um modelo de coelho animal de grande porte. 25 coelhos Nova Zelândia Brancos fêmeas com idade até a maturidade esquelética de 7 meses receberam dois defeitos de tamanho crítico de osso parietal de 8 mm. Um defeito serviu como controle não tratado em cada animal e o outro defeito foi tratado. A tabela 3 mostra os grupos de tratamento: Tabela 3 Grupo n Destinatário Tratamento Controle Nº Nova Zelândia Defeito de tamanho 1 5 AHBC Branco crítico não tratado Nova Zelândia Enxerto ósseo de calvária autólogo Defeito de tamanho 4 5 Branco de divisão (autoenxerto) (ABG) crítico não tratado Nova Zelândia Defeito de tamanho 5 5 DBM + BMP2 (10 ug/ml) Branco crítico não tratado
[0517] Foi feita uma incisão na linha média a partir da área nasofrontal para o aspecto anterior da protuberância occipital externa para expor o periósteo. O periósteo foi incisado e refletido bilateralmente usando dissecção romba para expor a superfície óssea de calvária parietal. Defeitos paramedianos de 8 mm foram feitos perfurando cuidadosamente com uma broca trefina com irrigação abundante com cristaloide. Quando necessário, cera óssea foi usada para obter hemostasia dentro do defeito criado. Foram feitos um total de dois defeitos por coelho com um em cada lado do seio central. Cuidados foram tomados para não danificar a dura-máter ou os vasos sanguíneos e o seio subjacentes.
[0518] Após a remoção do osso do local do defeito, ele foi colocado em meio de transporte estéril e processado no local em uma composição de origem óssea (por exemplo, AHBC). O processamento foi realizado na interface de tecido ósseo para criar uma composição estimulada compreendendo um agregado de entidades celulares de núcleo vivo potente e entidades de suporte em que as entidades celulares de núcleo vivo potente expressam uma sequência de LGR4, LGR5 e/ou LGR6. Geralmente, AHBC foi implantado no defeito esquerdo, mas nos casos de lesões durais causadas durante a criação do defeito ou o uso de cera óssea para obter artigo de teste de hemostasia foi implementado no defeito direito. Após a aplicação do artigo de teste no local do tratamento, o periósteo sobre o local operatório foi fechado usando sutura não absorvível. O tecido mole/músculo e pele foram então fechados com sutura não absorvível.
[0519] Os autoenxertos de calvária divididos foram preparados pegando os discos de calvária removidos durante a criação dos locais dos defeitos e enterrando a tábua interna e componentes esponjosos do disco. A tábua externa restante foi então implantada no local do defeito.
[0520] DBM + BMP-2 foi preparado combinando DBM (humano) com 10 ug/mL de Proteína Morfogênica Óssea-2 (BMP-2). Os defeitos foram preenchidos com DBM + BMP-2 usando um volume equívoco como a quantidade de AHBC usada para animais tratados com AHBC.
[0521] No final do estudo, os tecidos colhidos incluíram crânio em bloco. A dissecção a jusante dos tecidos incluiu a remoção do músculo da pele sobrejacente e pericrânio, seguido pela remoção em bloco do osso craniano contendo ambos os locais de defeito.
[0522] As varreduras de CT foram obtidas 2 semanas após a cirurgia e no momento da colheita de tecido 8 semanas após a cirurgia. Métodos de geração de imagem:
[0523] Imagem bruta: As fotografias DSLR foram adquiridas intraoperatórias com uma Canon 5DSR. Imagens ex vivo documentadas usando a mesma configuração com câmera montada no suporte de cópia.
[0524] Vimago CT- Os animais foram escaneados imediatamente no pós- operatório e a cada duas semanas e no final do estudo de oito semanas usando o Vimago CT com as seguintes configurações: • 60 mA • 80 kV • 7 ms • Tempo - 32 segundos • Resolução - 200 um
[0525] Micro-CT (µCT): Um instrumento Quantum GX2, PerkinElmer foi usado para gerar imagem de todos os espécimes de crânio de coelho ex vivo. Cada amostra foi fotografada em 70kV, 88µA, FOV 36mm, tamanho de voxel 90µm, filtro Al 0,5 CU 1,0 por 14 minutos para obter a melhor resolução. As imagens foram analisadas com o software Analyze versão 12.0 (AnalyzeDirect, Overland Park, KS, EUA). As densidades minerais ósseas trabeculares e corticais
(DMO) foram determinadas usando um phantom (25mm QRM BMD phantom) com densidades conhecidas de 50 mg/cm3, 200 mg/cm3, 800 mg/cm3 e 1200 mg/cm3 de hidroxiapatita. Os limiares foram fixados em 539 unidades Hounsfield, 294,34 mg/cm3.
[0526] A análise estatística foi realizada usando GraphPad Prism 7. Um teste de comparação múltipla de Dunnett foi usado para determinar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos. Os grupos nativos ou não tratados foram usados como controle no teste de comparação múltipla de Dunnett.
[0527] Imagem de Segunda Geração Harmônica (SHG): A geração de imagens da segunda geração harmônica foi realizada usando um microscópio confocal multifuncional Leica SP8 equipado com um laser de dois fótons sintonizável Chameleon ajustado para 880nm usando uma objetiva de NA de 10x de 0,40. Os sinais foram detectados usando o sistema de detecção Leica HyD e convertidos para o formato TIF usando o software Leica suíte de aplicativos X.
[0528] Imagem Fluorescente Confocal: A imagem fluorescente confocal foi realizada usando um microscópio confocal Leica TCS SP8 de fóton único. As amostras foram fotografadas com uma objetiva de 10x 0,40 NA. Amostras marcadas com NucBlue (Nº de catálogo: R37605, Thermofisher, Eugene, OR, EUA), Ensaio de mineralização de osteoimagem (Nº de catálogo: PA-1503, Lonza, Walkersville, MD, EUA) e Actin-555 R37112, Thermofisher, Eugene, OR , EUA) foram visualizados usando as linhas de laser 405 (diodo), 488 (argônio), 514 (diodo) e 633 (HeNe) e os sinais foram detectados usando os detectores Leica HyD e PMT. As imagens foram visualizadas e convertidas para o formato TIF usando o software Leica suíte de aplicativos X.
[0529] Microscopia composta: Ambos os defeitos excisados em bloco foram fotografados na câmera 503 de microscópio composto Zeiss V16. Imagens empilhadas e lado a lado em Z de todo topo e fundo em bloco adquiridas. Defeitos individuais no topo e no fundo também foram adquiridos. Regiões de interesse adquiridas em ampliações variadas, dependendo das características que se desviaram do osso nativo circundante.
[0530] A microscopia de compostos foi realizada em seções transversais cranianas fixas de formalina tamponada normal a 10% (NBF) usando um microscópio composto Leica M205 FA. As amostras foram visualizadas com uma lente planapo de 0,63x com zoom 2x e as imagens foram coletadas usando uma câmera Leica DFC7000 T.
[0531] Imagem por Microscopia Eletrônica de Varredura: A microscopia eletrônica de varredura foi realizada usando EVO LS10 ESEM (SEM). As amostras foram fotografadas com um detector de dispersão traseira de alta definição (HDBSD), além de um detector de corrente em cascata de alcance estendido (C2DX). As imagens foram capturadas e compiladas usando os softwares Zeiss SmartSEM e SmartStitch (Zeiss SmartSEM: Versão 6.02, Zeiss SmartStitch: Versão V01.02.09). A costura final das imagens foi concluída usando FIJI (Versão 1.52e). Espectroscopia Raman:
[0532] Um microscópio confocal Raman (Microscópio Thermo Fisher Raman DXR) com uma objetiva de 10x e um comprimento de onda de laser de 785 nm (potência do laser de 28mW) foi usado para coletar espectros. Uma abertura de fenda de 25 um foi usada para coletar uma faixa espectral entre os números de onda de 500 a 3500 cm-1. A resolução estimada foi de 2,3 a 4,3 cm-1. Os dados espectrais foram coletados usando uma exposição de 1 s com uma relação sinal a ruído de 300 para garantir que os espectros coletados representassem o material a granel. Para varreduras de pontos de superfície,
um total de 2-5 espectros foram coletados de posições arbitrárias pela superfície de topo do defeito. Para varreduras de linhas de superfície, foram coletados 6 espectros com espaçamento de 200 um entre cada ponto de coleta. Além das varreduras de ponto e linha, foram coletadas varreduras de área em seção transversal para cada defeito de animal. As varreduras de área consistiram em seções transversais de espessura total cobrindo uma área entre 3-15 mm2 com 100-320 pontos de coleta.
[0533] A análise espectroscópica Raman foi realizada usando o software OMNIC (v.32, Thermo Fisher) para Raman dispersivo. Os recursos disponíveis no software OMNIC foram usados para remover a fluorescência de fundo de todos os espectros de varredura de ponto de superfície usando ajuste de linha de base polinomial de 6ª ordem. Os espectros de pontos de superfície coletados de cada espécime foram normalizados e calculados a média para representar um animal individual. As médias gerais do grupo foram calculadas usando espectros médios de cada animal individual dentro do grupo. Os quimigramas OMNIC para varreduras de áreas transversais foram criados usando faixas de 950 a 965 cm-1 para hidroxiapatita. Resultados:
[0534] As medições de densidade mineral óssea demonstraram que o tratamento com AHBC resultou em uma densidade mineral óssea semelhante à do osso nativo. A Figura 20 mostra que a densidade mineral óssea do grupo tratado com AHBC foi comparável à do osso nativo. A Figura 21 mostra que a densidade mineral óssea trabecular do grupo tratado com AHBC foi comparável à do osso nativo.
[0535] AHBC resultou em uma porcentagem de volume de osso para volume de tecido semelhante ao osso nativo. A Figura 22 mostra que uma porcentagem de volume de osso para volume de tecido do grupo tratado com
AHBC foi comparável àquela de osso nativo.
[0536] A espectroscopia Raman indicou a presença de hidroxiapatita nas varreduras médias de pontos, varreduras de linhas de superfície e varreduras de área indicando formação de minerais ósseos para o tratamento com AHBC. Os espectros de pontos de superfície médios do osso nativo, defeitos não tratados e o grupo tratado com AHBC foram comparados na localização do pico de fosfato como mostrado na Figura 23. As varreduras da linha de superfície do osso nativo, defeitos não tratados e o grupo tratado com AHBC foram coletados e mostram as linhas de pico de fosfato como mostrado na Figura 24. As varreduras de área de seção transversal do osso nativo, defeitos não tratados e o grupo tratado com AHBC foram coletados e mostram distribuição de hidroxiapatita na Figura 25. O pico de fosfato a 961 cm-1 é uma indicação de formação de hidroxiapatita mineral óssea e a intensidade está relacionada à concentração. Como mostrado nas Figuras 23-25, o grupo tratado com AHBC mostra intensidade de fosfato indicando formação mineral óssea. Na Figura 24, as linhas de hidroxiapatita são visivelmente semelhantes às nativas para o grupo tratado com AHBC.
[0537] O grupo tratado com AHBC resultou em formação óssea. As varreduras de CT nas Figuras 18 e 19 mostram regeneração óssea com tratamento com AHBC. As imagens nas Figuras 26 -28 também mostram regeneração óssea com tratamento com AHBC. O tratamento com AHBC resultou em fechamento de craniotomia semelhante em comparação ao ABG com osso mínimo e mal formado observado com o tratamento com DBM + BMP2 na imagem de CT e inspeção bruta. A análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de varredura e segunda imagem de ressonância de harmônica mostrou que os defeitos tratados com AHBC desenvolveram osso cortical completo com lacunas e estrutura organizada de colágeno. Análises mecânicas, composicionais e estruturais demonstraram que o osso formado por AHBC era semelhante ao ABG (p <0,05), enquanto DBM + BMP2 e controles não tratados tinham propriedades que indicavam fibrose com formação óssea mínima. Estes resultados demonstram as composições de origem óssea reveladas na presente invenção são úteis em métodos para promover a regeneração de ossos. Exemplo 8: Expressão Gênica Diferencial entre a Composição de Origem Óssea e Tecido Ósseo Nativo (coelho)
[0538] Matrizes de perfilador Qiagen RT2 PCR foram usadas para avaliar a resposta molecular ao processamento. O processamento foi realizado em uma interface de tecido ósseo para criar uma composição estimulada compreendendo um agregado de entidades celulares de núcleo vivo potente e entidades de suporte em que as entidades celulares de núcleo vivo potente expressam uma sequência de LGR4, LGR5 e/ou LGR6. Osteogênese, angiogênese e vias de cicatrização de feridas foram avaliadas. Os genes expressos diferencialmente foram determinados usando o teste t de estudante para testar a associação entre a expressão gênica em amostras pré e pós- processadas. O enriquecimento para baixos valores de p (P <0,05) foi avaliado por permutação. Assinaturas específicas de pré e pós-processamento foram detectadas em vias osteogênicas, de cicatrização de feridas e angiogênicas (P empírico <0,05). A tabela 4 mostra os grupos de tratamento. Tabela 4 Nº de ID do grupo Grupo Nº de amostras 1 Pré-processamento 4 2 Pós-processamento 5
[0539] Coleta de amostras: O tecido foi coletado a partir de quatro crânios de coelho pré e cinco pós-processados. O tecido foi coletado em AllProtect (Qiagen), mantido a 4C por 24 horas, e depois foi movido para -80C para armazenamento até a extração de RNA ser realizada.
[0540] Extração de RNA: A lise do tecido foi realizada com PowerLyzer (Qiagen) por dois ciclos de 45 segundos a 3500 rpm com um tempo de permanência de 30 segundos entre os ciclos. O RNA foi purificado a partir do lisado de tecido resultante usando o Mini Kit RNeasy Plus Universal (Qiagen). O RNA foi quantificado usando Nanodrop Lite (ThermoFisher Scientific).
[0541] Transcrição Reversa e qRT-PCR: 800 ng de RNA foram transcritos reversamente para cDNA usando o kit RT2 First Strand (Qiagen). O cDNA resultante foi usado como modelo para as placas de perfilador RT2 PCR que foram executadas de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen) em um QuantStudio 12K Flex ou QuantStudio 3 (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific).
[0542] Análise estatística: Os dados dessas execuções foram analisados comparando pré e pós-amostras. Os dados de qPCR foram analisados usando Rv3.5.1. A expressão diferencial dos genes de via Qiagen (Osteogênese, Angiogênese e cicatrização de feridas) foi determinada usando um teste t de estudante (distribuição bicaudal e variações iguais entre as duas amostras). A regulação dobrada de genes individuais foi calculada usando o método delta- delta Ct. Para avaliar o enriquecimento de baixo valor de p (P <0,05) em cada uma das três matrizes testadas, permutamos o fenótipo pré/pós 10.000 vezes e, em seguida, usamos o teste t de estudante para testar a associação entre a expressão gênica e cada fenótipo permutado. Valores empíricos de p para enriquecimento foram gerados registrando o número de vezes que a proporção de valores de p menor que 0,05 foi maior no conjunto de dados permutados que os dados observados.
[0543] Resultados: Os perfis de expressão gênica foram gerados para amostras pré e pós usando matrizes de via Qiagen RT2 PCR. A significância estatística entre cada grupo e nativo foi determinada usando o teste t de estudante. O agrupamento hierárquico de assinaturas moleculares de cada amostra como mostrado na Figura 29 demonstra que as amostras de pré e pós- processamento se agrupam em grupos distintos para todas as vias testadas, indicando que as vias moleculares são alteradas após o processamento em uma composição de origem óssea como revelado na presente invenção. Nenhum dos genes foi significativo após o teste de correção múltipla em cada painel (P <5,95x10-4), provavelmente devido ao pequeno tamanho da amostra do estudo. Adicionalmente, foram realizados testes para enriquecimento de baixos valores de p (P <0,05) em nosso conjunto de dados em relação a 10.000 permutações. As permutações simulam o número de valores de p baixos que se espera encontrar por acaso. Todos os painéis foram pelo menos modestamente enriquecidos (P <0,05) para baixos valores de p, ou seja, o número de valores de p menores que 0,05 é maior do que o esperado por acaso.
[0544] Genes enriquecidos para cada painel são mostrados nas Figuras 30-
32. Nas Figuras 30-32, a mudança da dobra é mostrada no eixo x. Os valores de P (eixo y) correspondem a diferenças na expressão gênica entre amostras de crânio pré e pós. Pontos coloridos indicam uma diferença com um P <0,05. A expressão aumentada e diminuída dos genes correspondentes no crânio pós relativo ao pré-processado é mostrada por pontos vermelhos e azuis, respectivamente. Pontos pretos indicam locais com um P <0,05.
[0545] As vias de osteogênese foram modestamente enriquecidas para baixos valores de p (empírico P = 0,016). Treze por cento dos genes (N = 9) foram expressos diferencialmente. Entre o maior aumento na expressão estava o hormônio da paratireoide (PTH; aumento de 13x), que demonstrou aumentar a osteogênese em células-tronco mesenquimais humanas. Ver Kuo SW,
Rimando MG, Liu, S, Lee OK.
Intermittent Administration of Parathyroid Hormone Enhances Osteogenesis of Human Mesenchymal Stem Cells by Regulating Protein Kinase Cδ.
Int J Mol Sci. 2017; 18(10). Isso é consistente com o aumento observado na sinalização de BMP/TGF-β que é conhecida por ser aprimorada pelo PTH e também inibe a sinalização de Wnt/β-catenina (redução de β-catenina [CTNNB1]/ ácido gama-carboxiglutâmico [BGLAP]). Ver Yu B, Zhao X, Yang C, Crane J, Xian L, Lu W, Wan M, Cao X.
PTH Induces Differentiation of Mesenchymal Stem Cells by Enhancing BMP Signaling.
J Bone Miner Res. 2013; 27(9):2001-2014; Wany Y, Li Y-P, Pulson C, Shao J-Z, Zhang X, Wu M, Chen W.
Wnt and the Wnt signaling pathway in bond development and disease.
Fron Biosci. 2014; 19:379-407. As vias de cicatrização de feridas foram também enriquecidas para baixos valores de p (P = 0,0072). Quatorze por cento (9/63) dos genes são modestamente diferentes entre o pré e o pós-tratamento.
A maioria desses genes (8/9) reduziu a expressão após o processamento, sugerindo que o processamento reduz a sinalização nas vias de cicatrização de feridas.
Por exemplo, fator de crescimento do tecido conjuntivo, entre outras moléculas que são associadas ao crescimento é reduzido após o processamento.
A expressão aumentada de TLR4, um receptor de reconhecimento de padrões associado a patógenos, após o processamento indica a ativação de mecanismos de vigilância imune devido ao processamento das amostras.
As vias de angiogênese demonstram a maior quantidade de enriquecimento (P <1 x 10-5) para valores de p modestos com 24% dos genes de via (19/80 genes) associados à interrupção.
A maioria desses genes (16/19) aumenta a expressão no processamento, sugerindo que o processamento aumenta a sinalização angiogênica.
O maior aumento de vezes é 189x para a timidina fosforilase, um gene que promove a angiogênese.
Moléculas pró- angiogênicas adicionais também são observadas (TGF-α, TGF-βR1, EFNA1).
[0546] Por conseguinte, as composições de origem óssea como reveladas na presente invenção são úteis para promover a regeneração de ossos em um indivíduo em necessidade da mesma. Exemplo 9: Expressão Gênica Diferencial entre a Composição de Origem Hepática e Tecido Hepático Nativo (camundongo)
[0547] A Figura 33 mostra um mapa de calor representativo das vias moleculares alteradas em uma composição de origem hepática como revelada na presente invenção versus tecido hepático nativo. Vermelho escuro e amarelo estão associados aos níveis mais alto e mais baixo de expressão gênica, respectivamente. Esta avaliação de transcrição direcionada indica a presença de perfis de expressão gênica distintos para amostras hepáticas nativas e processadas (AHLC). Exemplo 10: Diferenças na Resistência à Compressão entre várias Composições Derivadas de Tecido e Tecido Nativo
[0548] Cada osso longo de coelho, gordura (humano), músculo (humano), cartilagem (porco) e osso (fêmur de coelho), respectivamente, foram processados para obter interfaces de tecido e criar composições estimuladas que compreendem um agregado de entidades celulares de núcleo vivo potente e entidades de suporte em que as entidades celulares de núcleo vivo potente expressam uma sequência de LGR4, LGR5 e/ou LGR6. Cada uma das composições estimuladas foi comparada mecanicamente ao respectivo tecido nativo. Uma placa plana usada para teste de compressão. Foi usado Instron 3343 com uma configuração de carga de 1kN. As Figuras 35 e 37-40 mostram força versus deslocamento. A inclinação dos gráficos define a resistência à compressão. A resposta de força versus deslocamento para tecidos nativos e processados não é comparável com diferentes inclinações (definidas como módulos). Esses dados mostram que o tecido nativo e o processado têm características físicas diferentes. Exemplo 11: Diferenças em Hidroxiapatita entre Composição de Origem Óssea e Tecido Ósseo Nativo (coelho)
[0549] A Figura 36 mostra varreduras de área de seção transversal Raman de osso longo de coelho nativo e osso longo de coelho processado por interfaces de tecido ósseo para criar uma composição estimulada compreendendo um agregado de entidades celulares de núcleo vivo potente e entidades de suporte em que as entidades celulares de núcleo vivo potente expressam uma sequência de LGR4, LGR5 e/ou LGR6. As varreduras Raman foram conduzidas conforme explicado no Exemplo 5. As varreduras de seção transversal Raman mostram a distribuição de hidroxiapatita na Figura 36. A intensidade está relacionada à concentração da hidroxiapatita mineral óssea. Como mostrado na Figura 36, a distribuição de hidroxiapatita é diferente entre os tecidos processados e os nativos. Exemplo 12: Expressão Diferencial entre a Composição de Origem Cutânea e Tecido Cutâneo Nativo (humano)
[0550] A Figura 34A mostra a análise do transcriptoma direcionado à pele que avalia as vias de cicatrização de feridas, células-tronco e marcador de superfície celular, identificando assinaturas distintas presentes na pele nativa em relação a uma composição processada (AHSC).
[0551] A Figura 34B mostra um ensaio de células-tronco direcionadas indica aumento da expressão de marcadores de células-tronco na composição processada (AHSC) em relação à pele nativa sugerindo a ativação de células- tronco residentes através do processamento e armazenamento. Exemplo 13: Preparação da Composição de Origem Muscular
[0552] Colha o músculo da coxa de coelho usando uma dissecação afiada. O tecido é lavado com uma solução isotônica (por exemplo, NaCl a 0,9%)
durante 5 minutos a 4 °C com agitação suave. A separação de interface de tecido muscular é iniciada colocando 10 gramas de tecido em um tubo cônico de 50 cc (Cônico A) no gelo e submerso em 20 mL de HBSS resfriado. É adicionada colagenase tipo IV (0,143 g), papaína (0,019 g), ditiotreitol (0,0028 g) e o Cônico A é transferido para um banho de aquecimento aquecido a 37,7 °C por 5 minutos. Agite a amostra em vórtice (300 VPM) e transfira o conteúdo para uma placa de cultura e incube a 37,7 °C em um ambiente de 5% de CO2 por 20 a 25 minutos, ou até que a dissociação do tecido seja suficiente. Transfira a composição para um tubo cônico de 50 mL (Cônico B), combine agente de terminação. Centrifugue a composição a 1000 RPM durante 10 minutos. Separe o material de interface de tecido muscular do material sem interface consistente com os métodos padrão incluindo filtragem de malha ou precipitação. Centrifugue a composição restante incluindo material sem interface a 1000 RPM por 5 minutos à temperatura ambiente. Transfira o sobrenadante para um 50 mL (Cônico C). Centrifugue Cônico C a 30.000 RPM durante 20 minutos. Descarte o sobrenadante. Lave Cônico C com 10 mL de uma solução isotônica biocompatível (1x HBSS, DMEM, RPMI, NaCl a 0,9%, anéis com Ringer-lactato). Combine 2:1 (v/v) com uma solução biocompatível e adicione a combinação resultante com o material de interface ativado para garantir hidratação suficiente. O processamento produz a interface dos tecidos musculares com componentes reativos e estimulados na faixa de tamanho de aproximadamente 40 a 250 µm de diâmetro. Exemplo 14: Preparação da Composição de Origem Cartilaginosa
[0553] A cartilagem articular do coelho é isolada e enxaguada três vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C. O tecido é fraccionado mecanicamente em segmentos com um volume na faixa de 1 a 5 mm3. Estes tecidos são então enxaguados duas vezes em PBS aquecido a 37 °C e transferidos para um tubo cônico de 50 cc. O PBS é pré-aquecido a 37 ° C em um volume 10:1 (v/v) para volume de tecido com 2 mg/mL de hialuronidase testicular tipo 1-S e tripsina a 0,25%/EDTA a 1 mM. Os tecidos musculares são incubados por 5 a 30 minutos. Os tecidos são enxaguados com PBS duas vezes. DMEM pré-aquecido a 37 °C em um volume de 10:1 (v/v) para volume de tecido suplementado com 4,5 mg/ml de glicose, 10 m de tampão MHEPES, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 1 mM de piruvato de sódio e colagenase tipo II de 0,05 a 2% (p/v) são adicionados e os tecidos são incubados por 1 a 20 horas a 37 °C enquanto são centrifugados a 60 rpm. A composição resultante é centrifugada a 1200 RPM por 10 minutos. O sobrenadante é transferido e salvo para uso posterior. Os tecidos reativos e estimulantes de interface e sem interface restantes são combinados 1:1 (v/v) com PBS e separados usando filtração de malha, precipitação e/ou isolamento mecânico. Os elementos de interface reativos e estimulantes resultantes do tecido processado têm um comprimento de aproximadamente 30 a 275 µm no eixo mais longo. Exemplo 15: Preparação de Composição de Origem Cartilaginosa
[0554] O tecido adiposo de coelho marrom, subcutâneo e/ou visceral é coletado e enxaguado com PBS com 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina resfriado a 4 °C três vezes. Os tecidos adiposos e as interfaces são mecanicamente dissociados por métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo centrifugação e/ou agitação em vórtice (600 VPM) por 5 minutos, durante um total de 5 ciclos. Os tecidos adiposos são então combinados com uma solução biocompatível (DMEM, RPMI, PBS, NaCl a 0,9%, Ringer-lactato) de maneira equivalente volumétrica e centrifugados a 2000 rpm por 5 minutos. A camada de óleo/adipose é removida. Este ciclo é repetido para um total de 3 ocorrências. Tecido reativo e estimulante de interface remanescente e componentes sem interface são ressuspensos com DMEM em uma forma de 0,5:1 (v/v) e centrifugado a 500 RPM por 2 minutos. O tecido reativo e estimulante de interface é separado por aspiração. Os componentes de interface ativos isolados variam em volume de 1900 a 31.400 µm 3. Exemplo 16: Estudo da pele suína
[0555] O objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento do crescimento neodérmico, expansão epidérmica, crescimento capilar e formação de vasculatura dentro de um leito de ferida de espessura total tratado com composições de origem cutânea (por exemplo, AHSC) e/ou para avaliar o fechamento da ferida com várias preparações de uma composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) com e sem vários adjuntos. Método:
[0556] 12 fêmeas suínas Yorkshire nulíparas convencionais (30-40 kg no início do estudo) foram preparadas de maneira estéril. Os leitos de ferida foram criados pela remoção de toda a espessura da pele usando uma combinação de dissecção afiada com bisturi e eletrocautério. A profundidade da ferida de espessura total foi verificada pela visualização da fáscia muscular subjacente à área pré-determinada da ferida. Uma composição de origem cutânea (por exemplo, AHSC) foi criada utilizando uma porção da derme excisada de espessura total a partir de leitos da ferida criados para criar uma composição estimulada compreendendo um agregado de entidades celulares de núcleo vivo potente e entidades de suporte em que as entidades celulares de núcleo vivo potente expressam uma sequência de LGR4, LGR5 e/ou LGR6.
[0557] Os tratamentos foram aplicados nos leitos de ferida e preparados. As feridas foram deixadas a cicatrizar por 18 a 200 dias após a cirurgia. Métodos de imagem in vivo:
[0558] Imagem bruta: Fotografias brutas foram adquiridas não menos que semanalmente (durante os procedimentos de troca de bandagem) com uma câmera digital.
[0559] Vectra: O contorno e a contração foram medidos com a utilização de uma câmera estereoscópica (Canfield Vectra H1) que processa as costas dos suínos em tridimensionalmente. Três imagens da superfície dorsal foram tiradas de maneira craniana a caudal. Os dados foram gravados e as medidas de contração foram feitas usando o software Canfield VAM.
[0560] Imagem macroscópica: Imagens macroscópicas de regiões de interesse foram adquiridas usando uma lente olloclip (zoom 7x, 14x, 21x) acoplada a um iPhone 6. Para suínos selecionados, um dermascópio (Canfield VEOS) foi introduzido para gerar imagens de regiões de interesse.
[0561] LDI: As imagens do gerador de imagens a laser de campo completo Moor (moorFLPI-2) gerador de imagens doppler a laser (LDI, WO9740/09) foram adquiridas para suínos SKN001-SKN012. Uma imagem foi adquirida por ferida e, para fins de controle, uma imagem da pele suína nativa foi adquirida logo acima das feridas mais cranianas.
[0562] Microscopia: A microscopia composta foi adquirida usando um microscópio Leica M205 FA acoplado a uma câmera Leica DFC7000 T. As imagens foram obtidas com uma objetiva de 0,63x a 0,78, 1 e 2x de zoom.
[0563] Histologia e Imagem de Tecidos: As amostras de suínos foram coletadas em formalina tamponada normal a 10% e fixadas durante a noite antes de serem transferidas para etanol a 70%. As amostras foram então processadas em etanol a 70%, 95% e 100%, limpas em xileno e infiltradas com parafina. As amostras foram então embebidas em parafina e seccionadas em fatias de 4 µm e montadas em lâminas de vidro com carga positiva antes de serem coradas com hematoxilina e eosina, tricrômico de masson ou ácido periódico schiff. As lâminas coradas foram fotografadas usando microscopia composta, SEM, confocal e multifotônica para avaliar os recursos ultraestruturais microscópicos e anatômico brutos).
[0564] Imagem Fluorescente Confocal: A imagem fluorescente confocal foi realizada usando um microscópio confocal Leica TCS SP8 de fóton único. As amostras foram fotografadas com objetiva de 10x 0,40 NA. As amostras marcadas com NucBlue (Molecular Probes), Col-F (Immunochemistry Technologies), Actina-555 (Thermofisher) e Aglutinina de gérmen de trigo-647 (Thermofisher) foram visualizadas usando linhas e sinais de laser 405 (Diode), 488 (Árgon), 514 (Diode) e 633 (HeNe) foram detectados usando o sistema de detecção de combinação Leica HyD e PMT.
[0565] Segunda imagem harmônica multifotônica: A segunda imagem harmônica foi realizada usando um microscópio confocal multifuncional Leica SP8 equipado com um laser de dois fótons Chameleon e coletada usando uma objetiva de 10x de 0,40 NA.
[0566] Imagem por Microscopia Eletrônica de Varredura: A microscopia eletrônica de varredura foi realizada usando EVO LS10 ESEM. As amostras foram fotografadas com um detector de dispersão traseira de alta definição (HDBSD) usando ampliação de 50x a 15 kilovolts (kV) e 60 Pa.
[0567] Microscopia Raman: Um microscópio confocal Raman (Thermo Fisher Raman DXR) com uma objetiva de 10× (N.A. 0.25) e um comprimento de onda de laser de 785 nm (potência do laser de 28 mW no ponto de amostragem) foi usado para coletar espectros. O tamanho estimado do ponto na amostra foi de 2,1 μm e a resolução foi de 2,3 a 4,3 cm − 1. A abertura confocal usada foi uma fenda de 25 μm e os espectros entre os números de onda de 500 a 3500 cm − 1 foram coletados. A análise espectroscópica Raman foi realizada usando o software OMNIC para Raman dispersivo. Recursos proprietários disponíveis no software OMNIC (Thermo Scientific) foram usados para remover a fluorescência em segundo plano de todos os espectros usando o ajuste de linha de base polinomial (6ª ordem) e normalizar os espectros. Os dados espectrais foram coletados usando uma exposição de 1 s com uma relação sinal a ruído de 300 para garantir que o espécime fosse homogêneo e os espectros coletados representassem o material em massa. Três técnicas de coleta de dados foram realizadas em tecidos e feridas nativas usando espectroscopia Raman, incluindo (1) área de seção transversal, (2) linha de seção transversal e (3) varreduras de linha de superfície. As varreduras de área e linha de seção transversal incluem espessura total da ferida ou pele nativa. As varreduras de linhas de seção transversal incluem 7 pontos ao longo de toda a seção transversal de tecido. As varreduras de linhas de superfície incluem 5 pontos espaçados a 20 µm ao longo da superfície de tecido.
[0568] Caracterização mecânica: As propriedades mecânicas da pele tratada e nativa foram estudadas em suínos recebendo até 120 ou 200 dias de tratamento. Três métodos foram usados: Balistometria (firmeza da pele in vivo), teste de tração (módulo elástico ex vivo) e elastografia por onda de cisalhamento por ultrassom (módulo elástico in vivo).
[0569] Teste de tração: As fatias de pele nas feridas tratadas foram testadas quanto à resistência elástica usando um UTM eletrônico (Máquina de testes universal) com capacidade de carga de 1 kN (Instron, MA, EUA) a uma velocidade de cruzada constante de 0,5 mm/min até que o deslocamento de 5 mm fosse alcançado. Os valores de carga e deslocamento foram registrados em intervalos de 0,1 s durante o teste. Amostras de pele tratadas e amostras de pele nativas foram testadas para determinar o módulo elástico da pele ex vivo.
[0570] Balistômetro: O balistômetro (Diastron Ltd., Andover, Reino Unido) foi aplicado em três áreas adjacentes, mas não sobrepostas em cada local de teste anatômico. Suínos tratados por até 200 dias foram testados com esta técnica in vivo. Para garantir a consistência dos dados, um único investigador realizou todas as medições do balistômetro. O balistômetro registrou três parâmetros principais: entalhe; alfa e coeficiente de restituição (CoR) usando o software Diastron MApp proprietário.
[0571] US SWE (Elastografia por ondas de cisalhamento por ultrassom): O GE Ultrasound (GE Medical Systems, Chicago, IL) com capacidade SWE foi usado para avaliar a elasticidade in vivo das feridas tratadas em comparação com a pele nativa. Um pulso de ARF (radiofrequência acústica) foi usado para gerar ondas de cisalhamento no tecido em uma ROI pequena (aproximadamente 8 cm3). A imagem em modo B foi usada para monitorar o deslocamento do tecido devido às ondas de cisalhamento. A velocidade da onda de cisalhamento foi usada para avaliar o módulo de Young (kPa). A média, o máximo, o mínimo e o desvio padrão da velocidade da onda de cisalhamento (em centímetros por segundo) ou do módulo de Young (em quilopascais) dentro do ROI foram exibidos. Os valores do módulo de Young em toda a ferida tratada foram plotados como um mapa de superfície (Elastograma). Métodos de Análise Molecular:
[0572] Coleta de amostras: O tecido foi coletado a partir de feridas e pele nativa após imagens brutas. O tecido foi coletado em AllProtect (Qiagen), mantido a 4C por 24 horas, e depois foi movido para -80C para armazenamento até a extração de RNA ser realizada.
[0573] Extração de RNA: A lise do tecido foi realizada com TissueLyser LT (Qiagen) a 50 hz por 60 minutos. O RNA foi purificado a partir do lisado de tecido resultante usando o Mini Kit RNeasy Plus Universal (Qiagen). O RNA foi quantificado usando Nanodrop Lite (ThermoFisher Scientific).
[0574] Transcrição Reversa e qRT- PCR- 800 ng de RNA foram transcritos reversamente para cDNA usando o kit RT2 First Strand (Qiagen). O cDNA resultante foi usado como modelo para as placas de perfilador RT2 PCR que foram executadas de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen) em um QuantStudio 12K Flex ou QuantStudio 3 (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific). Os dados dessas execuções foram analisados comparando feridas com tecido nativo e feridas AHSC com feridas controle. Os dados de qPCR foram analisados pelo Centro de Análise de Dados Qiagen online usando o método delta-delta Ct para determinar a regulação de dobras de genes individuais e o teste t de alunos (distribuição bicaudal e variações iguais entre as duas amostras) para determinar a significância. As placas Qiagen usadas incluem: Moléculas extracelulares de matriz e adesão (PASS-013Z), célula- tronco (PASS-405Z), metas de sinalização WNT (PASS-243Z), citocinas e receptores inflamatórios (PASS-011Z), cicatrização de feridas (PASS-121Z). Resultados:
[0575] As Figuras 41-52 mostram os resultados do estudo. A pele e os controles nativos demonstraram características funcionais da pele como mostrado pela contração mínima da ferida, crescimento dérmico e epidérmico e presença de cabelos, glândulas e vasculatura conforme o esperado. Os controles somente ferida (não tratados), tratados com colágeno e tratados com Puracol demonstraram cicatrizes, contração da ferida e desenvolvimento mínimo de componentes funcionais da pele, incluindo glândulas, folículos capilares e capilares. O uso de AHSC resultou em redução da contração da ferida, novo crescimento dérmico e epidérmico, novo crescimento capilar e presença de vasculatura em comparação com os controles não tratados somente ferida, tratados somente com colágeno ou somente com Puracol. A quantidade de uma composição de origem cutânea usada no estudo atual promoveu a regeneração de recursos ultraestruturais indicativos de pele totalmente funcional.
[0576] As feridas tratadas e a pele nativa foram excisadas e fotografadas. A microscopia composta mostrou melhora na cicatrização e redução da contração nas feridas tratadas com AHSC. A coloração histológica com tricrômio de Masson, SEM e imagens multifotônicas demonstrou uma matriz extracelular organizada (ECM) indicativa de espessura total da pele. A microscopia confocal fluorescente revelou a presença de folículos capilares, vasculatura e pinos de retalho na interface epidérmico-dérmica, destacando a regeneração de pele funcional.
[0577] As Figuras 50-52 representam os resultados da análise molecular de tecidos do estudo. No geral, as mudanças na expressão gênica são mínimas quando as feridas tratadas com composição de origem cutânea são comparadas ao tecido da pele nativa. Regulação negativa significativa é observada para: CDH1, CTNNB1, BMP4, EGFR, FST, GJA1, JAG1, LEF1, FZD7 e VEGFA. Sabe-se que todos esses genes têm algum papel ou são alvos da via de sinalização de WNT. No geral, as tendências não são perceptíveis para os perfis de via células-tronco, ECM e Adesão e WNT. Os marcadores de cicatrização de feridas são geralmente super-regulados e a maioria dos marcadores de inflamação testados são sub-regulados.
[0578] A expressão gênica diferencial mínima entre feridas tratadas com composição de origem cutânea e tecido de pele nativo sugere que as feridas tratadas com composição de origem cutânea são quase indistinguíveis da pele nativa no nível molecular. Mudanças significativas nos atores da via de WNT sugerem que a sinalização de WNT pode ser um mecanismo crítico pelo qual a cicatrização de feridas é mediada em tratamentos de composição derivados de origem cutânea.
[0579] Os transcritos de adesão epitelial crítica, CDH1 e COL7A1, estão presentes em feridas tratadas com composição de origem cutânea e estão ausentes em feridas de controle. O CDH1 é necessário para a adesão célula- célula de células epiteliais e o COL7A1 tem função crítica como parte da membrana basal.
[0580] A expansão da epiderme e o crescimento das ilhas neodérmicas no leito da ferida sugerem que esse tipo de crescimento continuaria até que a ferida fosse totalmente reparada. A quantidade de uma composição de origem cutânea usada no estudo atual promoveu a regeneração de recursos ultraestruturais indicativos de pele totalmente funcional.

Claims (29)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado que é capaz de produzir tecido polarizado funcional quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado é derivado de uma interface do tecido ósseo.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a interface do tecido ósseo é uma interface do tecido pericortical, uma interface do tecido perilamelar, uma interface do tecido peritrabecular, uma interface do tecido córtico-esponjoso ou qualquer combinação das mesmas.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado compreende entidades celulares com núcleo vivo potente e entidades de suporte.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as entidades celulares com núcleo vivo potente expressam transcritos de RNA e/ou polipeptídeos de um ou mais Receptores Acoplados à Proteína G Contendo Repetição Rica em Leucina selecionados a partir do grupo que consiste em LGR4, LGR5, LGR6 e qualquer combinação dos mesmos.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que as entidades celulares com núcleo vivo potente expressam transcritos de RNA e/ou polipeptídeos de um ou mais de Pax 7, Pax 3, MyoD, Myf 5 ou qualquer combinação dos mesmos.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizada pelo fato de que o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado exibe níveis de expressão aumentados do hormônio da paratireoide em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado exibe um aumento de 10 a 15 vezes nos níveis de expressão do hormônio da paratireoide em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8, caracterizada pelo fato de que o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado exibe níveis de expressão aumentados de TLR4 em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizada pelo fato de que o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado exibe níveis de expressão aumentados de timidina fosforilase em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado exibe um aumento de 100 a 200 vezes nos níveis de expressão de timidina fosforilase em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizada pelo fato de que o tecido polarizado funcional mostra níveis de expressão diminuídos de um ou mais de IL2, MIOSIN2, ITGB5 e STAT3 em comparação com o observado no tecido ósseo nativo.
13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizada pelo fato de que as entidades de suporte compreendem populações celulares derivadas de células mesenquimais.
14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizada pelo fato de que as entidades de suporte compreendem populações celulares, elementos da matriz extracelular ou qualquer combinação dos mesmos.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que os elementos da matriz extracelular compreendem um ou mais de ácido hialurônico, elastina, colágeno, fibronectina, laminina, vesículas extracelulares, enzimas e glicoproteínas.
16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um substrato de liberação.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o substrato de liberação compreende um suporte.
18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado tem um diâmetro de cerca de 40 a cerca de 250 µm.
19. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a composição definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e instruções de uso.
20. Método para promover regeneração de tecidos em um indivíduo em necessidade da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
21. Método para tratar um indivíduo em necessidade de reparo de tecidos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
22. Método, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está sofrendo de uma doença óssea degenerativa.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a doença óssea degenerativa é osteoartrite ou osteoporose.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está sofrendo de uma fratura ou quebra óssea.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a fratura é uma fratura estável, uma fratura composta aberta, uma fratura transversal, uma fratura oblíqua ou uma fratura comunitiva.
26. Método para preparar a composição definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende: isolar pelo menos uma porção de uma interface de material de mamífero para obter um agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo, em que a interface do material de mamífero compreende células de interface de tecido de mamífero heterogêneas; e estimular as células da interface de tecido de mamífero heterogêneas.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que estimular compreende estimulação mecânica, estimulação química, estimulação enzimática, estimulação energética, estimulação elétrica, estimulação biológica ou qualquer combinação das mesmas.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a estimulação química ou biológica compreende pelo menos uma de ligação de receptor de quimiocina, ligação de receptor parácrino, alteração da membrana celular, alteração citoesquelética, alteração de gradientes fisiológicos, adição de pequenas moléculas ou adição de nucleotídeos e ribonucleotídeos.
29. Método para tratar um indivíduo em necessidade de reparo de tecidos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um agregado celular de interface de tecido de mamífero heterogêneo estimulado que é capaz de produzir tecido polarizado funcional quando administrado a um indivíduo em necessidade do mesmo, em que a administração da composição resulta em um aumento de pelo menos um de hormônio da paratireoide, TLR4, timidina fosforilase no indivíduo em comparação com o observado antes da administração.
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