BR112020005209B1

BR112020005209B1 - METHODS FOR CONTROLLING A BIOREACTOR SYSTEM AND BIOREACTOR CULTURE SYSTEMS

Info

Publication number: BR112020005209B1
Application number: BR112020005209-4A
Authority: BR
Inventors: Matthew ANGELINI; Ashley WITMER; Anthony DEBIASE
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2017-10-16
Filing date: 2018-10-15
Publication date: 2023-06-06

Abstract

Um método para controlar um sistema de biorreator inclui o fornecer uma cultura celular em um biorreator, em que as condições no biorreator permitem que a cultura celular produza uma proteína de interesse (POI), medir parâmetros de processo (PPs) da cultura dentro do biorreator por RAMAN, em que os parâmetros do processo são selecionados do grupo que consiste em concentração de nutrientes, concentração viável de células e atributos de proteínas, medir um peso predeterminado do biorreator com a cultura celular, remover o meio gasto sem células da cultura celular usando um primeiro conduto de saída em uma primeira taxa especificada, remover células da cultura celular usando um segundo conduto de saída a uma segunda taxa especificada e introduzir um ou ambos os meios frescos ou nutrientes na cultura celular usando um conduto de entrada a uma terceira taxa especificada.One method for controlling a bioreactor system includes feeding a cell culture into a bioreactor, where conditions in the bioreactor allow the cell culture to produce a protein of interest (POI), measuring process parameters (PPs) of the culture within the bioreactor by RAMAN, where the process parameters are selected from the group consisting of nutrient concentration, viable cell concentration and protein attributes, measure a predetermined weight of the bioreactor with the cell culture, remove spent cell-free medium from the cell culture using a first outlet conduit at a first specified rate, remove cells from the cell culture using a second outlet conduit at a second specified rate, and introduce one or both of fresh media or nutrients into the cell culture using an inlet conduit at a third specified rate .

Description

CROSS-REFERENCE TO RELATED ORDERS

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119 do Pedido de Patente Provisório U.S. 62/572.918, depositado em 16 de outubro de 2017, cuja totalidade é aqui incorporada por referência.[0001] This patent application claims benefit under 35 U.S.C. § 119 of the U.S. Provisional Patent Application 62/572,918, filed on October 16, 2017, the entirety of which is incorporated herein by reference.

TECHNICAL FIELD

[0002] Esta divulgação é direcionada a um biorreator de perfusão e métodos de uso relacionados.[0002] This disclosure is directed to a perfusion bioreactor and related usage methods.

FUNDAMENTALS

[0003] Os biorreatores podem ser usados para manter uma cultura celular com a finalidade de fabricar produtos biológicos, como proteínas. Em um biorreator em lote alimentado, um ou mais nutrientes são alimentados ao biorreator durante o cultivo, e os produtos biológicos permanecem no biorreator até o final do lote. Os biorreatores de perfusão abordam alguns dos desafios de desempenho relacionados aos reatores em lote alimentado e começaram a ganhar popularidade no final dos anos 90. No entanto, os biorreatores de perfusão de ponta sofrem com um número limitado de estratégias de controle disponíveis, lacunas de dados e alto custo.[0003] Bioreactors can be used to maintain a cell culture for the purpose of manufacturing biological products such as proteins. In a fed-batch bioreactor, one or more nutrients are fed into the bioreactor during cultivation, and the biological products remain in the bioreactor until the end of the batch. Perfusion bioreactors address some of the performance challenges related to fed-batch reactors and began to gain popularity in the late 1990s. However, state-of-the-art perfusion bioreactors suffer from a limited number of available control strategies, data gaps and high cost.

[0004] Por exemplo, as soluções de controle para reatores de perfusão tentam calibrar o fluxo volumétrico das bombas de alimentação de entrada e saída, enquanto abordam a deriva da bomba e a variabilidade do processo. No entanto, falhas na execução da produção podem resultar no enchimento ou esvaziamento do biorreator, devido a diferenças inerentes (por exemplo, variações de fabricação) entre quaisquer duas bombas e incapacidade de obter controle rígido. As soluções de controle existentes também não têm a capacidade de medir outros parâmetros, como, por exemplo, atributos de qualidade de amônia, glicose e proteína. Modalidades da presente divulgação abordam uma ou mais das limitações e desvantagens dos biorreatores de perfusão existentes.[0004] For example, control solutions for perfusion reactors attempt to calibrate the volumetric flow of inlet and outlet feed pumps, while addressing pump drift and process variability. However, production run failures can result in the bioreactor filling or emptying due to inherent differences (eg manufacturing variations) between any two pumps and inability to achieve tight control. Existing control solutions also lack the ability to measure other parameters such as ammonia, glucose and protein quality attributes. Embodiments of the present disclosure address one or more of the limitations and disadvantages of existing perfusion bioreactors.

DISCLOSURE SUMMARY

[0005] Modalidades da presente divulgação se referem a, entre outras coisas, um método para controlar um biorreator e um sistema de biorreator útil para controlar o processo de cultura celular para produção de proteínas. Cada uma das modalidades divulgadas neste documento pode incluir uma ou mais das características descritas em conexão com qualquer uma das outras modalidades.[0005] Embodiments of the present disclosure relate to, among other things, a method for controlling a bioreactor and a bioreactor system useful for controlling the cell culture process for protein production. Each of the embodiments disclosed herein may include one or more of the features described in connection with any of the other embodiments.

[0006] A divulgação está relacionada a um método para controlar um sistema de biorreator, compreendendo fornecer uma cultura celular em um biorreator; medir um ou mais parâmetros de processo da cultura celular dentro do biorreator por uma sonda RAMAN; remover meio gasto sem células da cultura celular usando um primeiro conduto de saída a uma primeira taxa especificada; remover células da cultura celular usando um segundo conduto de saída a uma segunda taxa especificada; introduzir um ou ambos os meios frescos ou nutrientes na cultura celular usando um conduto de entrada a uma terceira taxa especificada; e alterar uma ou mais da primeira taxa especificada, da segunda taxa especificada ou da terceira taxa especificada com base nas medições da sonda RAMAN.[0006] The disclosure relates to a method for controlling a bioreactor system, comprising providing a cell culture in a bioreactor; measuring one or more process parameters of the cell culture within the bioreactor by a RAMAN probe; removing cell-free spent medium from the cell culture using a first outlet conduit at a first specified rate; removing cells from the cell culture using a second output conduit at a second specified rate; introduce one or both of the fresh media or nutrients into the cell culture using an inlet conduit at a specified third rate; and changing one or more of the first specified rate, the second specified rate, or the third specified rate based on the RAMAN probe measurements.

[0007] Uma modalidade da divulgação é direcionada a um método de controle de um sistema de biorreator que compreende fornecer uma cultura celular no biorreator, em que condições em um biorreator permitem que a cultura celular produza uma proteína de interesse (POI), medir parâmetros de processo (PPs) da cultura dentro do biorreator por RAMAN, em que os parâmetros do processo são selecionados do grupo que consiste em concentração de nutrientes, concentração viável de células e atributos de proteínas, medir um peso do biorreator com o conteúdo da cultura celular, remover o meio gasto sem células da cultura celular usando um primeiro conduto de saída a uma primeira taxa especificada, remover células da cultura celular usando um segundo conduto de saída a uma segunda taxa especificada, introduzir um ou ambos os meios e nutrientes frescos na cultura celular usando um conduto de entrada em uma terceira taxa especificada e em que os condutos de entrada e saída são ajustados com base nas medições da sonda RAMAN e na medição do peso do biorreator para manter (i) um ou mais dos parâmetros do processo dentro de faixas predeterminadas, (ii) o peso do biorreator com a cultura celular dentro de faixas predeterminadas e (iii) a terceira taxa especificada do conduto de entrada e a primeira e a segunda taxas especificadas de cada um dos condutos de saída dentro de suas respectivas faixas predeterminadas.[0007] One embodiment of the disclosure is directed to a method of controlling a bioreactor system comprising providing a cell culture in the bioreactor, wherein conditions in a bioreactor allow the cell culture to produce a protein of interest (POI), measuring parameters (PPs) of the culture within the RAMAN bioreactor, where process parameters are selected from the group consisting of nutrient concentration, viable cell concentration, and protein attributes, measure a weight of the bioreactor with cell culture content , removing spent cell-free medium from the cell culture using a first outlet conduit at a specified first rate, removing cells from the cell culture using a second outlet conduit at a specified second rate, introducing one or both of fresh media and nutrients into the culture cell using an inlet conduit at a specified third rate and in which the inlet and outlet conduits are adjusted based on RAMAN probe measurements and bioreactor weight measurement to maintain (i) one or more of the process parameters within predetermined ranges, (ii) the weight of the bioreactor with the cell culture within predetermined ranges, and (iii) the third specified rate of the inlet conduit and the first and second specified rates of each of the outlet conduits within their respective ranges predetermined.

[0008] Em algumas modalidades, a medição dos um ou mais parâmetros de processo da cultura dentro do biorreator pelo RAMAN ocorre em intervalos regulares, por exemplo, pelo menos uma vez por hora. Em outras modalidades, o método é configurado para manter a cultura celular a uma concentração celular viável média de pelo menos cerca de 30 milhões de células por mL por pelo menos cerca de 30 dias no estado estacionário. Em uma modalidade, o biorreator tem um volume de pelo menos 2L, pelo menos 3L, pelo menos 10L, pelo menos 35L ou pelo menos 50L ou mais, e o método é configurado para manter o peso do biorreator com a cultura celular dentro de 0,1% do peso inicial do biorreator com a cultura celular. Por exemplo, o biorreator possui um volume de pelo menos 10 L e o método é configurado para manter o peso do biorreator e da cultura celular dentro de uma faixa de peso determinada com base no peso inicial do biorreator e no conteúdo da cultura celular, por exemplo, cerca de dentro de uma faixa de 20 ± 2 g. Em algumas modalidades, o biorreator é controlado quando um parâmetro do processo se desvia de um valor de ponto de ajuste dentro de uma respectiva faixa desejada, um ou mais de remover meio sem células, remover células e introduzir um ou ambos os meios e nutrientes frescos e, em seguida o biorreator é ajustado para diminuir o desvio. Pelo menos dois volumes de biorreator do meio gasto são removidos através do primeiro conduto de saída por dia. Até três volumes de biorreator do meio gasto são removidos pelo primeiro canal de saída por dia. Os parâmetros do processo incluem a temperatura da cultura celular e o pH da cultura celular, e a temperatura é mantida de cerca de 30 a 40 graus C, de cerca de 32 a cerca de 38 graus C, ou de cerca de 34 a cerca de 38 graus C, e o pH é mantido de cerca de 6,50 a cerca de 7,50, de cerca de 6,60 a cerca de 7,40, de cerca de 6,70 a cerca de 7,40, de cerca de 6,80 a cerca de 7,30 de cerca de 6,90 a cerca de 7,20, de cerca de 7,00 a cerca de 7,10, a cerca de 6,50, a cerca de 6,55, a cerca de 6,60, a cerca de 6,65, a cerca de 6,70, a cerca de 6,75, a cerca de 6,80, a cerca de 6,85, a cerca de 6,90, a cerca de 6,95, a cerca de 7,00, a cerca de 7,05, a cerca de 7,10, a cerca de 7,15, a cerca de 7,20 a cerca de 7,25, a cerca de 7,30, a cerca de 7,35, a cerca de 7,40, a cerca de 7,45, ou a cerca de 7,50. Os parâmetros do processo incluem produtividade específica da célula, e o método é configurado para manter as células dentro da cultura celular a uma produtividade específica da célula de pelo menos cerca de 15-60 pg/célula/dia, cerca de 15-25 pg/célula/dia, pelo menos cerca de 17-23 pg/célula/dia, ou pelo menos cerca de 19-21 pg/célula/dia durante pelo menos 25-37 dias. Os parâmetros do processo incluem a concentração de glicose, e o método é configurado para manter uma concentração de glicose de cerca de 5 mM a cerca de 85 mM, ou de cerca de 0,5 g/L a cerca de 15,5 g/L, de cerca de 1 g/L a cerca de 15,5 g/L, de cerca de 0,5 g/L a cerca de 8 g/L, de cerca de 2 g/L a cerca de 6 g/L, ou de cerca de 3 g/L a cerca de 5 g/L. Os parâmetros do processo incluem a concentração de lactato e o método é configurado para manter uma concentração de lactato menor que cerca de 60 mM, ou menor que cerca de 6 g/L, menor que cerca de 5 g/L, menor que cerca de 4 g/L, menor que cerca de 3 g/L, menor que cerca de 2 g/L ou menor que cerca de 1 g/L. Os parâmetros do processo incluem a concentração de amônia e o método é configurado para manter uma concentração de amônia menor que cerca de 15 mM, menor que cerca de 12 mM, menor que cerca de 10 mM, menor que cerca de 9 mM, menor que cerca de 8 mM, menor que cerca de 7 mM, menor que cerca de 6 mM. Cada remoção de meio gasto sem células, remoção de células e introdução de um ou ambos meios e nutrientes frescos é controlada por uma bomba respectiva. O biorreator inclui um filtro configurado para reter as células e permitir a passagem do fluido.[0008] In some embodiments, the measurement of one or more process parameters of the culture within the bioreactor by the RAMAN occurs at regular intervals, for example, at least once an hour. In other embodiments, the method is configured to maintain the cell culture at an average viable cell concentration of at least about 30 million cells per ml for at least about 30 days at steady state. In one embodiment, the bioreactor has a volume of at least 2L, at least 3L, at least 10L, at least 35L or at least 50L or more, and the method is configured to maintain the weight of the bioreactor with the cell culture within 0 .1% of the initial weight of the bioreactor with the cell culture. For example, the bioreactor has a volume of at least 10 L and the method is set to maintain the weight of the bioreactor and cell culture within a weight range determined based on the initial weight of the bioreactor and the content of the cell culture, e.g. example, about within a range of 20 ± 2 g. In some embodiments, the bioreactor is controlled when a process parameter deviates from a setpoint value within a respective desired range, one or more of removing cell-free media, removing cells, and introducing one or both of fresh media and nutrients. and then the bioreactor is adjusted to decrease the deviation. At least two bioreactor volumes of spent medium are removed through the first outlet per day. Up to three bioreactor volumes of spent medium are removed through the first outlet channel per day. Process parameters include the temperature of the cell culture and the pH of the cell culture, and the temperature is maintained from about 30 to about 40 degrees C, from about 32 to about 38 degrees C, or from about 34 to about 38 degrees C, and the pH is maintained from about 6.50 to about 7.50, from about 6.60 to about 7.40, from about 6.70 to about 7.40, from about from about 6.80 to about 7.30 from about 6.90 to about 7.20 from about 7.00 to about 7.10 to about 6.50 to about 6.55 at about 6.60, at about 6.65, at about 6.70, at about 6.75, at about 6.80, at about 6.85, at about 6.90, at about 6.95, about 7.00, about 7.05, about 7.10, about 7.15, about 7.20 about 7.25, about 7.30, about 7.35, about 7.40, about 7.45, or about 7.50. Process parameters include cell-specific productivity, and the method is configured to maintain cells within cell culture at a cell-specific productivity of at least about 15-60 pg/cell/day, about 15-25 pg/ cell/day, at least about 17-23 pg/cell/day, or at least about 19-21 pg/cell/day for at least 25-37 days. Process parameters include glucose concentration, and the method is set to maintain a glucose concentration of from about 5 mM to about 85 mM, or from about 0.5 g/L to about 15.5 g/ L, from about 1 g/L to about 15.5 g/L, from about 0.5 g/L to about 8 g/L, from about 2 g/L to about 6 g/L , or from about 3 g/L to about 5 g/L. The process parameters include the lactate concentration and the method is configured to maintain a lactate concentration of less than about 60 mM, or less than about 6 g/L, less than about 5 g/L, less than about 4 g/L, less than about 3 g/L, less than about 2 g/L, or less than about 1 g/L. The process parameters include the ammonia concentration and the method is set to maintain an ammonia concentration of less than about 15 mM, less than about 12 mM, less than about 10 mM, less than about 9 mM, less than about 8 mM, less than about 7 mM, less than about 6 mM. Each removal of spent cell-free media, removal of cells and introduction of one or both of fresh media and nutrients is controlled by a respective pump. The bioreactor includes a filter configured to trap cells and allow fluid to pass through.

[0009] Em outra modalidade, a divulgação é direcionada ao método de controle de um sistema de biorreator, compreendendo fornecer uma cultura celular em um biorreator; medir um ou mais parâmetros de processo (PPs) da cultura celular dentro do biorreator por uma sonda RAMAN; e ajustar uma ou mais entradas ou saídas do biorreator com base nas medições da sonda RAMAN.[0009] In another embodiment, the disclosure is directed to the method of controlling a bioreactor system, comprising providing a cell culture in a bioreactor; measuring one or more process parameters (PPs) of the cell culture inside the bioreactor by a RAMAN probe; and adjusting one or more inputs or outputs of the bioreactor based on measurements from the RAMAN probe.

[0010] O método de acordo com a divulgação é ilustrado como compreendendo as seguintes etapas: fornecer uma cultura celular no biorreator (302), em que condições no biorreator permitem que a cultura celular produza uma proteína de interesse (POI), medir parâmetros de processo da cultura dentro do biorreator por RAMAN (304), em que os parâmetros do processo são selecionados pelo menos do grupo que consiste em concentração de nutrientes, concentração viável de células e atributos de proteínas, medir um peso predeterminado do biorreator com a cultura celular (306), remover o meio gasto sem células da cultura celular usando um primeiro conduto de saída a uma primeira taxa especificada (308), remover células da cultura celular usando um segundo conduto de saída a uma segunda taxa especificada (310), introduzir um ou ambos os meios e nutrientes frescos na cultura celular usando um conduto de entrada em uma terceira taxa especificada e em que condutos de entrada e saída são ajustados com base nas medições da sonda RAMAN e na medição do peso do biorreator para manter (i) um ou mais dos parâmetros do processo dentro de faixas predeterminadas, (ii) o peso do biorreator com a cultura celular dentro de faixas predeterminadas e (iii) a terceira taxa especificada do conduto de entrada e a primeira e a segunda taxas especificadas de cada um dos condutos de saída dentro de suas respectivas faixas predeterminadas (312).[0010] The method according to the disclosure is illustrated as comprising the following steps: providing a cell culture in the bioreactor (302), wherein conditions in the bioreactor allow the cell culture to produce a protein of interest (POI), measuring parameters of culture process within the RAMAN bioreactor (304), wherein process parameters are selected from at least the group consisting of nutrient concentration, viable cell concentration, and protein attributes, measuring a predetermined weight of the bioreactor with the cell culture (306), removing cell-free spent medium from the cell culture using a first outlet conduit at a first specified rate (308), removing cells from the cell culture using a second outlet conduit at a second specified rate (310), introducing a or both fresh media and nutrients in cell culture using an inlet conduit at a specified third rate and in which inlet and outlet conduits are adjusted based on RAMAN probe measurements and bioreactor weight measurement to maintain (i) a or more of the process parameters within predetermined ranges, (ii) the weight of the bioreactor with the cell culture within predetermined ranges, and (iii) the third specified rate of the input conduit and the first and second specified rates of each of the output conduits within their respective predetermined ranges (312).

[0011] Em ainda outro aspecto, a divulgação é direcionada a um sistema de cultura de biorreator, compreendendo um tanque com um conduto de entrada e pelo menos um conduto de saída; pelo menos uma bomba; um filtro acoplado ao tanque; uma sonda RAMAN acoplada ao tanque; e um controlador acoplado a pelo menos uma bomba e a sonda RAMAN, sendo o controlador configurado para controlar a pelo menos uma bomba com base em uma entrada da sonda RAMAN.[0011] In yet another aspect, the disclosure is directed to a bioreactor culture system, comprising a tank with an inlet conduit and at least one outlet conduit; at least one pump; a filter attached to the tank; a RAMAN probe attached to the tank; and a controller coupled to the at least one pump and the RAMAN probe, the controller being configured to control the at least one pump based on an input from the RAMAN probe.

[0012] O pelo menos um conduto de saída inclui um primeiro conduto de saída para conexão com uma segunda bomba configurada para controlar a remoção de fluido do tanque e um segundo conduto de saída para conexão com uma terceira bomba configurada para controlar a remoção de células do tanque. O filtro está configurado para reter células no tanque e permitir que o fluido passe através do filtro. A sonda RAMAN é disposta dentro do tanque. O controlador é acoplado à primeira bomba, à segunda bomba e à terceira bomba. O biorreator inclui uma balança configurada para medir um peso do tanque com uma cultura celular dentro do tanque; em que o controlador está configurado para receber dados de peso da balança. O controlador está configurado para comparar o peso do tanque com um ponto definido para o peso e, com base na comparação, ajustar uma ou mais de uma saída da primeira bomba, da segunda bomba e da terceira bomba. O controlador está configurado para receber dados espectrais da sonda RAMAN; determinar, com base nos dados espectrais recebidos, um parâmetro da cultura celular; comparar o parâmetro determinado com um ponto de ajuste do parâmetro; e com base na comparação, ajustar uma ou mais de uma saída da primeira bomba, da segunda bomba ou da terceira bomba. O ajuste da saída de uma ou mais da primeira bomba, da segunda e da terceira bomba reduz um desvio entre o parâmetro determinado e o ponto de ajuste do parâmetro, ou um desvio entre o peso recebido e o ponto de ajuste do peso. O método é configurado para manter a cultura celular a uma concentração celular viável média de pelo menos 30 milhões de células por mL por 30 dias no estado estacionário. O tanque tem um volume de pelo menos 10 L e o método é configurado para manter o peso do tanque com a cultura celular dentro de uma faixa de 20 g. O tanque tem um volume de pelo menos 10 L e o método é configurado para manter o peso do biorreator com a cultura celular dentro de 0,1% do peso inicial do tanque com a cultura celular. O controlador está configurado para determinar, com base nos dados espectrais recebidos, uma pluralidade de parâmetros da cultura de biorreator; comparar cada um da pluralidade de parâmetros com um respectivo ponto de ajuste para cada um da pluralidade de parâmetros; e com base na comparação, ajustar a saída de uma ou mais da primeira bomba, da segunda bomba e da terceira bomba, para diminuir um desvio entre os parâmetros determinados e os respectivos pontos de ajuste. A pluralidade de parâmetros inclui temperatura, pH, concentração de nutrientes, concentração de lactato, concentração de amônia e produtividade específica da célula. O filtro é configurado para reter as células e permitir a passagem do fluido. O biorreator inclui uma balança, em que o tanque e o filtro repousam na balança. O biorreator inclui uma balança, em que o tanque repousa sobre a balança. O biorreator inclui uma balança, em que o tanque está em contato físico com a balança.[0012] The at least one outlet conduit includes a first outlet conduit for connection to a second pump configured to control fluid removal from the tank and a second outlet conduit for connection to a third pump configured to control cell removal from the tank. The filter is configured to trap cells in the tank and allow fluid to pass through the filter. The RAMAN probe is placed inside the tank. The controller is coupled to the first pump, the second pump and the third pump. The bioreactor includes a scale configured to measure a tank weight with a cell culture inside the tank; where the controller is configured to receive weight data from the scale. The controller is configured to compare the tank weight to a defined weight point and, based on the comparison, adjust one or more of the outputs of the first pump, the second pump and the third pump. The controller is configured to receive spectral data from the RAMAN probe; determining, based on the received spectral data, a cell culture parameter; comparing the determined parameter with a parameter setpoint; and based on the comparison, adjusting one or more of the outputs of the first pump, the second pump or the third pump. Adjusting the output of one or more of the first, second, and third pumps reduces a deviation between the determined parameter and the parameter setpoint, or a deviation between the received weight and the weight setpoint. The method is set up to maintain the cell culture at an average viable cell concentration of at least 30 million cells per ml for 30 days at steady state. The tank has a volume of at least 10 L and the method is set to keep the weight of the cell culture tank within a 20 g range. The tank has a volume of at least 10 L and the method is set to keep the weight of the bioreactor with the cell culture within 0.1% of the initial weight of the tank with the cell culture. The controller is configured to determine, based on received spectral data, a plurality of bioreactor culture parameters; comparing each of the plurality of parameters with a respective set point for each of the plurality of parameters; and based on the comparison, adjusting the output of one or more of the first pump, the second pump and the third pump to decrease a deviation between the determined parameters and the respective setpoints. The plurality of parameters include temperature, pH, nutrient concentration, lactate concentration, ammonia concentration, and cell-specific productivity. The filter is configured to trap cells and allow fluid to pass through. The bioreactor includes a balance, where the tank and filter rest on the balance. The bioreactor includes a balance, where the tank rests on the balance. The bioreactor includes a balance, where the tank is in physical contact with the balance.

[0013] Um sistema de cultura de biorreator, compreendendo: um tanque com um conduto de entrada e pelo menos um conduto de saída; pelo menos uma bomba; um filtro em contato com o tanque; uma sonda RAMAN acoplada ao tanque; uma balança em contato com o tanque; e um controlador acoplado a pelo menos uma bomba, a balança e a sonda RAMAN. Em algumas modalidades, o filtro e o tanque estão em contato com a balança. Em outra modalidade, o filtro compreende material de malha. Em algumas modalidades, o filtro compreende malhas com tamanhos de poros variando de 0,2 μM a 30 μM.[0013] A bioreactor culture system, comprising: a tank with an inlet conduit and at least one outlet conduit; at least one bomb; a filter in contact with the tank; a RAMAN probe attached to the tank; a scale in contact with the tank; and a controller coupled to at least one pump, the scale and the RAMAN probe. In some embodiments, the filter and tank are in contact with the balance. In another embodiment, the filter comprises mesh material. In some embodiments, the filter comprises meshes with pore sizes ranging from 0.2 µM to 30 µM.

[0014] Em ainda outra modalidade, a divulgação é direcionada a um sistema de cultura de biorreator, compreendendo um tanque com um conduto de entrada e pelo menos um conduto de saída; pelo menos uma bomba; um filtro acoplado ao tanque; uma balança em contato com o tanque; uma sonda RAMAN acoplada ao tanque; e um controlador acoplado a pelo menos uma bomba, a balança, e a sonda RAMAN, sendo o controlador configurado para controlar a pelo menos uma bomba com base em uma entrada da sonda RAMAN e uma entrada da balança.[0014] In yet another embodiment, the disclosure is directed to a bioreactor culture system, comprising a tank with an inlet conduit and at least one outlet conduit; at least one bomb; a filter attached to the tank; a scale in contact with the tank; a RAMAN probe attached to the tank; and a controller coupled to at least one pump, the scale, and the RAMAN probe, the controller being configured to control the at least one pump based on an input from the RAMAN probe and an input from the scale.

[0015] Em outra modalidade, um sistema de cultura de biorreator é divulgado. O sistema de cultura de biorreator inclui um tanque com um conduto de entrada para conexão com uma primeira bomba configurada para controlar a distribuição de fluido ao tanque, um primeiro conduto de saída para conexão com uma segunda bomba configurada para controlar a remoção de fluido do tanque e um terceiro conduto de saída para conexão com uma terceira bomba configurada para controlar a remoção de células do tanque, um filtro acoplado ao tanque, em que o filtro está configurado para reter células no tanque e permitir que o fluido passe através do filtro, uma balança configurada para medir um peso do tanque com uma cultura celular dentro do tanque, uma sonda RAMAN disposta dentro do tanque. A modalidade inclui um controlador acoplado à primeira bomba, à segunda bomba, à terceira bomba, à balança e à sonda RAMAN, em que o controlador está configurado para receber dados de peso da balança, comparar o peso do tanque com um ponto de ajuste para o peso, receber dados espectrais da sonda RAMAN, determinar, com base nos dados espectrais recebidos, um parâmetro da cultura celular, comparar o parâmetro determinado com um ponto de ajuste do parâmetro e, com base nas comparações, ajustar um ou mais de um rendimento da primeira bomba, a segunda bomba e a terceira bomba.[0015] In another embodiment, a bioreactor culture system is disclosed. The bioreactor culture system includes a tank having an inlet conduit for connection to a first pump configured to control fluid delivery to the tank, a first outlet conduit for connection to a second pump configured to control fluid removal from the tank and a third outlet conduit for connection to a third pump configured to control the removal of cells from the tank, a filter coupled to the tank, wherein the filter is configured to retain cells in the tank and allow fluid to pass through the filter, a scale configured to measure a tank weight with a cell culture inside the tank, a RAMAN probe disposed inside the tank. The modality includes a controller coupled to the first pump, the second pump, the third pump, the scale and the RAMAN probe, where the controller is configured to receive weight data from the scale, compare the tank weight with a set point for the weight, receive spectral data from the RAMAN probe, determine, based on the received spectral data, a cell culture parameter, compare the determined parameter with a parameter set point and, based on the comparisons, adjust one or more yields of the first bomb, the second bomb and the third bomb.

[0016] O ajuste do rendimento de uma ou mais da primeira bomba, da segunda e da terceira bomba reduz um desvio entre o parâmetro determinado e o ponto de ajuste do parâmetro, ou um desvio entre o peso recebido e o ponto de ajuste do peso. O controlador é configurado para manter a cultura celular a uma concentração celular viável média de pelo menos 30 milhões de células por mL por 30 dias no estado estacionário. O tanque tem um volume de pelo menos 3 L e o controlador é configurado para manter o peso do tanque com a cultura celular dentro de uma faixa de 20 g. O tanque tem um volume de pelo menos 3 L e o controlador é configurado para manter o peso do biorreator com a cultura celular dentro de 0,1% do peso inicial do tanque com a cultura celular. O controlador está configurado para determinar, com base nos dados espectrais recebidos, uma pluralidade de parâmetros da cultura de biorreator, comparar cada um da pluralidade de parâmetros com um respectivo ponto de ajuste para cada um da pluralidade de parâmetros, e com base na comparação, ajustar o rendimento de uma ou mais da primeira bomba, da segunda bomba e da terceira bomba, para diminuir um desvio entre os parâmetros determinados e os respectivos pontos de ajuste. A pluralidade de parâmetros inclui temperatura, pH, concentração de nutrientes, concentração de lactato, concentração de amônia e produtividade específica da célula. O sistema de cultura do biorreator inclui um filtro configurado para reter as células e permitir a passagem do fluido. O tanque e o filtro estão na balança. O tanque repousa sobre a balança.[0016] Adjusting the efficiency of one or more of the first, second and third pumps reduces a deviation between the determined parameter and the parameter setpoint, or a deviation between the received weight and the weight setpoint . The controller is set to maintain the cell culture at an average viable cell concentration of at least 30 million cells per ml for 30 days at steady state. The tank has a volume of at least 3 L and the controller is set to keep the weight of the cell culture tank within a 20 g range. The tank has a volume of at least 3 L and the controller is set to maintain the weight of the bioreactor with the cell culture within 0.1% of the initial weight of the tank with the cell culture. The controller is configured to determine, based on the received spectral data, a plurality of parameters of the bioreactor culture, compare each of the plurality of parameters to a respective set point for each of the plurality of parameters, and based on the comparison, adjust the efficiency of one or more of the first pump, the second pump and the third pump, to decrease a deviation between the determined parameters and the respective setpoints. The plurality of parameters include temperature, pH, nutrient concentration, lactate concentration, ammonia concentration, and cell-specific productivity. The bioreactor culture system includes a filter configured to trap cells and allow fluid to pass through. The tank and filter are on the scale. The tank rests on the scale.

[0017] Em certas modalidades, o sistema de cultura do biorreator de acordo com a divulgação é ilustrado como compreendendo os seguintes elementos: um tanque (10) tendo um conduto de entrada para conexão com uma primeira bomba (30) configurada para controlar a entrega de fluido ao tanque, um primeiro conduto de saída para conexão com uma segunda bomba (40) configurada para controlar a remoção de fluido do tanque e um terceiro conduto de saída para conexão com uma terceira bomba (50) configurada para controlar a remoção de células do tanque; um filtro (100) acoplado a, conectado ou de outro modo em comunicação fluida com o tanque, em que o filtro está configurado para reter células no tanque e permitir que o fluido passe através do filtro; uma balança (110) configurada para medir um peso do tanque com uma cultura celular dentro do tanque; uma sonda RAMAN (18) disposta dentro do tanque; e um controlador (200) acoplado à primeira bomba (30), à segunda bomba (40), à terceira bomba (50), à balança (110) e à sonda RAMAN (18).[0017] In certain embodiments, the bioreactor culture system according to the disclosure is illustrated as comprising the following elements: a tank (10) having an inlet conduit for connection to a first pump (30) configured to control delivery of fluid to the tank, a first outlet conduit for connection to a second pump (40) configured to control fluid removal from the tank, and a third outlet conduit for connection to a third pump (50) configured to control cell removal from the tank; a filter (100) coupled to, connected to, or otherwise in fluid communication with the tank, the filter being configured to retain cells in the tank and allow fluid to pass through the filter; a scale (110) configured to measure a tank weight with a cell culture within the tank; a RAMAN probe (18) disposed inside the tank; and a controller (200) coupled to the first pump (30), the second pump (40), the third pump (50), the scale (110) and the RAMAN probe (18).

[0018] No sistema de cultura do biorreator, o controlador (200) está configurado para: receber dados de peso da balança (110); comparar o peso do tanque (10) com um ponto definido para o peso; receber dados espectrais da sonda RAMAN (18); determinar, com base nos dados espectrais recebidos, um parâmetro da cultura celular; comparar o parâmetro determinado com um ponto de ajuste do parâmetro; e com base nas comparações, ajustar uma ou mais de uma taxa de transferência da primeira bomba, da segunda bomba e da terceira bomba.[0018] In the bioreactor culture system, the controller (200) is configured to: receive weight data from the scale (110); comparing the weight of the tank (10) with a defined weight point; receiving spectral data from the RAMAN probe (18); determining, based on the received spectral data, a cell culture parameter; comparing the determined parameter with a parameter set point; and based on the comparisons, adjust one or more of the first pump, second pump, and third pump throughput.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[0019] Os desenhos anexos, que são incorporados e constituem uma parte deste relatório descritivo, ilustram vários exemplos e, juntamente com a descrição, servem para explicar os princípios dos exemplos e modalidades divulgados.[0019] The attached drawings, which are incorporated and constitute a part of this descriptive report, illustrate several examples and, together with the description, serve to explain the principles of the examples and modalities disclosed.

[0020] Aspectos da divulgação podem ser implementados em conexão com modalidades ilustradas nos desenhos anexos. Estes desenhos mostram diferentes aspectos da presente divulgação e, quando apropriado, números de referência que ilustram estruturas, componentes, materiais e/ou elementos similares em figuras diferentes são rotulados de maneira semelhante. Entende-se que várias combinações das estruturas, componentes e/ou elementos, diferentes daqueles especificamente mostrados, são contempladas e estão dentro do escopo da presente divulgação.[0020] Aspects of the disclosure may be implemented in connection with embodiments illustrated in the accompanying drawings. These drawings show different aspects of the present disclosure and, where appropriate, reference numerals illustrating similar structures, components, materials and/or elements in different figures are similarly labeled. It is understood that various combinations of structures, components and/or elements, other than those specifically shown, are contemplated and are within the scope of the present disclosure.

[0021] Além disso, existem muitas modalidades descritas e ilustradas aqui. A presente divulgação não se limita a nenhum aspecto isolado nem modalidade do mesmo, nem a combinações e/ou permutações de tais aspectos e/ou modalidades. Além disso, cada um dos aspectos da presente divulgação, e/ou modalidades da mesma, pode ser empregado sozinho ou em combinação com um ou mais dos outros aspectos da presente divulgação e/ou modalidades da mesma. Por uma questão de brevidade, certas permutações e combinações não são discutidas e/ou ilustradas separadamente na presente invenção. Notavelmente, uma modalidade ou implementação aqui descrita como "exemplar" não deve ser interpretada como preferida ou vantajosa, por exemplo, em relação a outras modalidades ou implementações; em vez disso, pretende-se refletir ou indicar que a modalidade (ou modalidades) é "exemplo" de modalidade (ou modalidades).[0021] In addition, there are many embodiments described and illustrated here. The present disclosure is not limited to any single aspect or embodiment thereof, nor to combinations and/or permutations of such aspects and/or embodiments. Furthermore, each of the aspects of the present disclosure, and/or embodiments thereof, may be employed alone or in combination with one or more of the other aspects of the present disclosure and/or embodiments thereof. For the sake of brevity, certain permutations and combinations are not discussed and/or illustrated separately in the present invention. Notably, an embodiment or implementation described herein as "exemplary" is not to be construed as preferred or advantageous, for example, over other embodiments or implementations; rather, it is intended to reflect or indicate that modality (or modalities) is an "example" of modality (or modalities).

[0022] A FIG. 1 é uma vista esquemática de um sistema de biorreator, de acordo com um exemplo da divulgação.[0022] FIG. 1 is a schematic view of a bioreactor system in accordance with an example of the disclosure.

[0023] A FIG. 2 é uma vista esquemática de um controlador exemplificativo do sistema de biorreator da FIG. 1, e suas respectivas entradas e saídas.[0023] FIG. 2 is a schematic view of an exemplary controller for the bioreactor system of FIG. 1, and their respective inputs and outputs.

[0024] A FIG. 3 é um fluxograma de um método exemplificativo da divulgação;[0024] FIG. 3 is a flowchart of an exemplary method of disclosure;

[0025] A FIG. 4 é um gráfico que compara a concentração de células viáveis medida em um biorreator de perfusão no dia 37 de um lote com a concentração de células viáveis medida em um biorreator em lote alimentado no dia 6 de um lote.[0025] FIG. 4 is a graph comparing the viable cell concentration measured in a perfusion bioreactor on day 37 of a batch with the viable cell concentration measured in a fed batch bioreactor on day 6 of a batch.

[0026] A FIG. 5 é um gráfico que mostra a produtividade específica da célula normalizada ao longo do tempo entre o biorreator de perfusão e o biorreator em lote alimentado descrito com referência à FIG. 4.[0026] FIG. 5 is a graph showing cell specific productivity normalized over time between the perfusion bioreactor and the fed batch bioreactor described with reference to FIG. 4.

[0027] A FIG. 6 é um gráfico que mostra a concentração de células viáveis ao longo do tempo para um biorreator de perfusão que não controlou a concentração de células viáveis ou glicose.[0027] FIG. 6 is a graph showing viable cell concentration over time for a perfusion bioreactor that did not control viable cell concentration or glucose.

[0028] A FIG. 7 é um gráfico que mostra a concentração de glicose ao longo do tempo no biorreator de perfusão descrito na FIG. 6.[0028] FIG. 7 is a graph showing glucose concentration over time in the perfusion bioreactor depicted in FIG. 6.

[0029] A FIG. 8 é um gráfico que mostra a viabilidade celular ao longo do tempo no biorreator de perfusão descrito na FIG. 6.[0029] FIG. 8 is a graph showing cell viability over time in the perfusion bioreactor depicted in FIG. 6.

[0030] A FIG. 9 é um gráfico que mostra a concentração de células viáveis ao longo do tempo para um biorreator de perfusão que controlava a concentração de células viáveis.[0030] FIG. 9 is a graph showing the concentration of viable cells over time for a perfusion bioreactor that controlled the concentration of viable cells.

[0031] A FIG. 10 é um gráfico que mostra a viabilidade celular em estado estacionário no biorreator de perfusão descrito na FIG. 9.[0031] FIG. 10 is a graph showing steady-state cell viability in the perfusion bioreactor depicted in FIG. 9.

[0032] A FIG. 11 é um gráfico que mostra a produção de proteína normalizada (título) ao longo do tempo no biorreator de perfusão descrito na FIG. 9.[0032] FIG. 11 is a graph showing normalized protein production (titer) over time in the perfusion bioreactor depicted in FIG. 9.

[0033] A FIG. 12 é um gráfico que mostra a concentração de glicose ao longo do tempo no biorreator de perfusão descrito na FIG. 9.[0033] FIG. 12 is a graph showing glucose concentration over time in the perfusion bioreactor depicted in FIG. 9.

[0034] A FIG. 13 é um gráfico comparando concentrações viáveis de células de um biorreator de perfusão e um biorreator em lote alimentado.[0034] FIG. 13 is a graph comparing viable cell concentrations from a perfusion bioreactor and a fed batch bioreactor.

[0035] A FIG. 14 é um gráfico comparando a produção de proteína normalizada (título) alcançada nos biorreatores descritos na FIG. 13.[0035] FIG. 14 is a graph comparing the normalized protein production (titre) achieved in the bioreactors depicted in FIG. 13.

[0036] A FIG. 15 é um gráfico que mostra a concentração de células viáveis ao longo do tempo para um biorreator de perfusão que controla a concentração de células viáveis usando uma sonda RAMAN.[0036] FIG. 15 is a graph showing viable cell concentration over time for a perfusion bioreactor that monitors viable cell concentration using a RAMAN probe.

[0037] A FIG. 16 é um gráfico que mostra a viabilidade celular ao longo do tempo no biorreator de perfusão descrito na FIG. 15.[0037] FIG. 16 is a graph showing cell viability over time in the perfusion bioreactor depicted in FIG. 15.

[0038] A FIG. 17 é um gráfico que mostra a produção de proteína normalizada (título) ao longo do tempo no biorreator de perfusão descrito na FIG. 15.[0038] FIG. 17 is a graph showing normalized protein production (titer) over time in the perfusion bioreactor depicted in FIG. 15.

[0039] A FIG. 18 é um gráfico que mostra a concentração de glicose ao longo do tempo no biorreator de perfusão descrito na FIG. 15.[0039] FIG. 18 is a graph showing glucose concentration over time in the perfusion bioreactor depicted in FIG. 15.

[0040] A FIG. 19 é um gráfico que mostra a concentração de células viáveis ao longo do tempo para biorreatores de perfusão que controla a concentração de células viáveis usando uma sonda RAMAN.[0040] FIG. 19 is a graph showing viable cell concentration over time for perfusion bioreactors that monitor viable cell concentration using a RAMAN probe.

[0041] A FIG. 20 é um gráfico que mostra a produção de proteína normalizada (título) ao longo do tempo nos biorreatores de perfusão descrito na FIG. 19.[0041] FIG. 20 is a graph showing normalized protein production (titer) over time in the perfusion bioreactors depicted in FIG. 19.

[0042] A FIG. 21 é um gráfico que mostra a concentração de células viáveis ao longo do tempo para um biorreator de perfusão que controla a concentração de células viáveis usando uma sonda RAMAN.[0042] FIG. 21 is a graph showing viable cell concentration over time for a perfusion bioreactor that controls viable cell concentration using a RAMAN probe.

[0043] Novamente, existem muitas modalidades descritas e ilustradas aqui. A presente divulgação não se limita a nenhum aspecto isolado nem modalidade do mesmo, nem a combinações e/ou permutações de tais aspectos e/ou modalidades. Cada um dos aspectos da presente divulgação, e/ou modalidades da mesma, pode ser empregado sozinho ou em combinação com um ou mais dos outros aspectos da presente divulgação e/ou modalidades da mesma. Por uma questão de brevidade, muitas dessas combinações e permutações não são discutidas separadamente aqui.[0043] Again, there are many embodiments described and illustrated here. The present disclosure is not limited to any single aspect or embodiment thereof, nor to combinations and/or permutations of such aspects and/or embodiments. Each of the aspects of the present disclosure, and/or embodiments thereof, may be employed alone or in combination with one or more of the other aspects of the present disclosure and/or embodiments thereof. For the sake of brevity, many of these combinations and permutations are not discussed separately here.

[0044] Notavelmente, por simplicidade e clareza de ilustração, certos aspectos das figuras representam a estrutura geral e/ou o modo de construção das várias modalidades. Descrições e detalhes de recursos e técnicas conhecidas podem ser omitidos para evitar obscurecer desnecessariamente outras características. Os elementos nas figuras não são necessariamente desenhados em balança; as dimensões de alguns recursos podem ser exageradas em relação a outros elementos para melhorar a compreensão das modalidades de exemplo. Por exemplo, um versado na técnica entende que as vistas em seção transversal não são desenhadas em balança e não devem ser vistas como representando relações proporcionais entre diferentes componentes. As vistas em seção transversal são fornecidas para ajudar a ilustrar os vários componentes do conjunto representado e para mostrar seu posicionamento relativo um ao outro.[0044] Notably, for simplicity and clarity of illustration, certain aspects of the figures represent the general structure and/or mode of construction of the various modalities. Descriptions and details of known features and techniques may be omitted to avoid unnecessarily obscuring other features. Elements in the figures are not necessarily drawn on scales; dimensions of some features can be exaggerated in relation to other elements to improve understanding of example modalities. For example, one skilled in the art understands that cross-sectional views are not drawn on scales and should not be viewed as representing proportional relationships between different components. Cross-sectional views are provided to help illustrate the various components of the depicted assembly and to show their placement relative to one another.

DETAILED DESCRIPTION

[0045] Agora será feita referência em detalhes a exemplos da presente divulgação, que são ilustrados nos desenhos anexos. Sempre que possível, os mesmos números de referência serão usados em todo os desenhos para se referir a peças iguais ou parecidas. Na discussão a seguir, termos relativos como "cerca de", "substancialmente", "aproximadamente" etc. são usados para indicar uma possível variação de ± 10% em um valor numérico declarado. Além disso, nas reivindicações, valores, limites e/ou faixas significa o valor, limite e/ou faixa ± 10%.[0045] Reference will now be made in detail to examples of the present disclosure, which are illustrated in the accompanying drawings. Whenever possible, the same reference numbers will be used throughout the drawings to refer to the same or similar parts. In the following discussion, relative terms such as "about", "substantially", "approximately", etc. are used to indicate a possible ±10% variation in a stated numerical value. Furthermore, in claims, values, limits and/or ranges means the value, limit and/or range ± 10%.

[0046] O termo "conduto" refere-se a um canal, tubulação, conexão, passagem ou semelhantes, através do qual um fluido pode se deslocar. Em um exemplo, um conduto pode incluir tubos termoplásticos de Bioprene da Watson-Marlow.[0046] The term "conduit" refers to a channel, pipe, connection, passage or the like, through which a fluid can move. In one example, a conduit may include Watson-Marlow Bioprene thermoplastic tubing.

[0047] “Cultura em lote” ou “modo em lote” refere-se a uma unidade (por exemplo, recipiente de cultura) que é preenchida com células e com um volume inicial de trabalho do meio de cultura celular que nunca é trocado. Em tal cultura em lote, todos os componentes para cultura celular são fornecidos ao recipiente de cultura no início do processo de cultura. A cultura pode continuar até que os nutrientes se esgotem ou os resíduos atinjam níveis tóxicos, desencadeando apoptose.[0047] “Batch culture” or “batch mode” refers to a unit (eg, culture vessel) that is filled with cells and an initial working volume of cell culture medium that is never changed. In such a batch culture, all components for cell culture are supplied to the culture vessel at the beginning of the culture process. Culture can continue until nutrients are depleted or wastes reach toxic levels, triggering apoptosis.

[0048] A frase "cultura celular em lote alimentado" ou "cultura em lote em lote" refere-se a uma cultura em lote em que as células animais e o meio de cultura são fornecidos inicialmente ao recipiente de cultura e nutrientes de cultura adicionais são alimentados, continuamente ou como adições em bolus discretas, à cultura durante a cultura, com ou sem colheita periódica de células e/ou produtos antes do término da cultura. A cultura em lote alimentado inclui "cultura em lote alimentado semicontínua", em que periodicamente toda a cultura (que pode incluir células e meio) é removida e substituída por meio fresco. A cultura em lotes alimentados é diferenciada da “cultura em lotes” simples pela adição (ou remoção) de componentes ao recipiente durante a cultura. A cultura em lote alimentado pode ser ainda diferenciada da cultura de perfusão, na medida em que o meio não é trocado durante o processo em lote alimentado, enquanto na cultura de perfusão, todas ou algumas células são mantidas na cultura, por exemplo, usando um filtro ou célula dispositivo de retenção e o meio de cultura é fornecido de forma contínua ou intermitente enquanto os subprodutos que inibem o crescimento são removidos constante ou periodicamente do recipiente de cultura. Em um processo em lote alimentado, que difere de um processo de perfusão, a cultura continua até que seja determinado que o volume de trabalho máximo ou determinado de outra forma e/ou produção de proteína é alcançado e, em seguida, os produtos da cultura em lote alimentado são colhidos.[0048] The phrase "fed-batch cell culture" or "batch-batch culture" refers to a batch culture in which animal cells and culture medium are initially supplied to the culture vessel and additional culture nutrients are fed, either continuously or as discrete bolus additions, to the culture during culture, with or without periodic collection of cells and/or products prior to termination of culture. Fed-batch culture includes "semi-continuous fed-batch culture," in which periodically the entire culture (which may include cells and media) is removed and replaced with fresh media. Fed-batch culture is distinguished from simple "batch culture" by the addition (or removal) of components to the vessel during culture. Fed-batch culture can be further differentiated from perfusion culture in that the medium is not changed during the fed-batch process, whereas in perfusion culture all or some cells are maintained in culture, for example using a filter or cell holding device, and the culture medium is supplied continuously or intermittently while by-products that inhibit growth are constantly or periodically removed from the culture vessel. In a fed-batch process, which differs from a perfusion process, the culture continues until it is determined that the maximum or otherwise determined working volume and/or protein production is reached, and then the culture products fed batch are harvested.

[0049] A cultura de perfusão como um método para a produção da proteína de interesse também é contemplada para uso nos métodos da presente divulgação. Os métodos de cultura celular de perfusão para a produção de uma proteína de interesse ou de um anticorpo são conhecidos por um versado na técnica.[0049] Perfusion culture as a method for producing the protein of interest is also contemplated for use in the methods of the present disclosure. Perfusion cell culture methods for producing a protein of interest or an antibody are known to one skilled in the art.

[0050] O termo “célula” inclui qualquer célula que for apropriada para expressar uma sequência recombinante de ácido nucleico. As células incluem as dos procariontes e eucariotos. As células eucarióticas incluem, mas não estão limitadas a leveduras e todas as células de mamífero (humanas e não humanas), e fusões celulares como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em determinadas modalidades, a célula é uma célula de ser humano, de macaco, de símio, de hamster, de rato ou de camundongo. Em outras modalidades, a célula é selecionada dentre as seguintes células:CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), células da retina, linfócitos, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (epidérmico), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, célula MMT, célula de tumor, e uma linha celular derivada de uma célula mencionada acima. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula da retina que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula de PER. C6®). Em algumas modalidades, a célula é uma célula CHO. Em outras modalidades, a célula é uma célula CHO K1.[0050] The term "cell" includes any cell that is suitable for expressing a recombinant nucleic acid sequence. Cells include those of prokaryotes and eukaryotes. Eukaryotic cells include, but are not limited to, yeast and all mammalian cells (human and non-human), and cell fusions such as, for example, hybridomas or quadromas. In certain embodiments, the cell is a human, monkey, simian, hamster, rat or mouse cell. In other embodiments, the cell is selected from the following cells: CHO (e.g., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (e.g., COS-7), retinal cells, lymphocytes, Vero, CV1 , kidney (eg HEK293, EBNA 293, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV- 1, U937, 3T3, L cell, C127 cell, SP2/0, NS-0, MMT cell, tumor cell, and a cell line derived from a cell mentioned above. In some embodiments, the cell comprises one or more viral genes, for example, a retinal cell that expresses a viral gene (for example, a PER.C6® cell). In some embodiments, the cell is a CHO cell. In other embodiments, the cell is a CHO K1 cell.

[0051] Uma "linhagem celular" refere-se a uma célula ou células que são derivadas de uma linhagem específica por meio de passagem em série ou subcultura celular. O termo "células" é usado de forma intercambiável com "população celular".[0051] A "cell line" refers to a cell or cells that are derived from a specific lineage through serial passage or cell subculture. The term "cells" is used interchangeably with "cell population".

[0052] Dadas as atuais estratégias de alimentação de ponta, as células CHO atingiram números de células superiores a 10x106 células/mL (após cerca de uma semana) e títulos de, por exemplo, > 2 g/L de IgG humana (colhida após cerca de duas semanas), números que são valores industriais típicos para culturas em lotes alimentados por células CHO. Ver Kim, B J, et al., Biotechnol Bioeng. 2012 January; 109(1):137-45. Foi relatada uma produção de mais de 10 g/L de anticorpo a partir de células CHO que foram bem estabelecidas como uma importante linhagem celular de mamíferos industriais. Ver Omasa et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11:233-240.[0052] Given current state-of-the-art feeding strategies, CHO cells achieved cell numbers greater than 10x106 cells/ml (after about a week) and titers of, for example, > 2 g/L of human IgG (harvested after about two weeks), numbers that are typical industrial values for CHO cell-fed batch cultures. See Kim, BJ, et al., Biotechnol Bioeng. 2012 January; 109(1):137-45. Production of over 10 g/L of antibody has been reported from CHO cells that have been well established as an important industrial mammalian cell line. See Omasa et al., Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11:233-240.

[0053] Os termos "meio de cultura celular" e "meio de cultura" se referem a uma solução nutritiva usada para o cultivo de células de mamíferos que normalmente fornece os nutrientes necessários para aumentar o crescimento das células, como fonte de energia de carboidratos, aminoácidos essenciais, oligoelementos, vitaminas, etc. O meio de cultura celular pode conter extratos, por exemplo, soro ou peptonas (hidrolisados), que fornecem matérias-primas que sustentam o crescimento celular. Os meios podem conter extratos de soja ou derivados de levedura, em vez de extratos de origem animal. Meio quimicamente definido refere-se a um meio de cultura celular no qual todos os componentes químicos são conhecidos. O meio quimicamente definido é totalmente livre de componentes derivados de animais, como peptonas derivadas de soro ou animal. O meio também pode estar livre de proteínas. “Meio fresco” é um meio que ainda não foi introduzido na cultura celular e/ou ainda não foi utilizado pelas células da cultura celular. Meios frescos podem incluir geralmente altos níveis de nutrientes e pouco ou nenhum resíduo. “Meio gasto” pode se referir ao meio usado por células na cultura celular e geralmente pode incluir níveis mais baixos de nutrientes (como esses nutrientes podem ser utilizados pelas células da cultura celular) e níveis mais altos de desperdício do que os níveis presentes em meio fresco.[0053] The terms "cell culture medium" and "culture medium" refer to a nutrient solution used for the cultivation of mammalian cells that normally provides the nutrients needed to enhance cell growth, as a source of energy from carbohydrates , essential amino acids, trace elements, vitamins, etc. The cell culture medium may contain extracts, for example serum or peptones (hydrolysates), which provide raw materials that support cell growth. Media may contain soy extracts or yeast derivatives rather than extracts of animal origin. Chemically defined medium refers to a cell culture medium in which all chemical components are known. The chemically defined medium is completely free of animal-derived components such as serum or animal-derived peptones. The medium can also be free of protein. “Fresh medium” is a medium that has not yet been introduced into cell culture and/or has not yet been utilized by the cells in the cell culture. Fresh media can generally include high levels of nutrients and little or no residue. “Spent medium” can refer to the medium used by cells in cell culture and can generally include lower levels of nutrients (how those nutrients can be utilized by cells in cell culture) and higher levels of waste than levels present in medium. fresh.

[0054] Num biorreator de perfusão, o meio de cultura pode ser continuamente removido da cultura celular e substituído por meio fresco. A adição constante de meio fresco enquanto elimina os resíduos pode fornecer às células da cultura celular os nutrientes necessários para atingir altas concentrações de células. Ao contrário das condições em constante mudança durante as culturas em lote e em lote alimentado, o método de perfusão oferece os meios para alcançar e manter uma cultura em estado estacionário. Tipicamente, cerca de um volume de cultura é trocado por dia e a concentração celular alcançada na perfusão é tipicamente duas a mais de dez vezes a alcançada no pico da cultura em lote ou em lote alimentado. A substituição de nutrientes e/ou remoção de células apoptóticas permite que a viabilidade celular seja mantida a longo prazo no estado estacionário. Em uma produção em estado estacionário, os atributos de qualidade da proteína (ou outros compostos de interesse) produzidos no início do lote podem ser substancialmente idênticos aos atributos de qualidade da proteína (ou outros compostos de interesse) produzidos no final do lote. A proteína pode ser avaliada com base em várias modificações pós-traducionais, como glicoformas, heterogeneidade de carga, agregação e várias medidas de pureza. A identidade substancial da qualidade da proteína não é alcançável em reatores em lote alimentado, pois as condições de cultura celular nesses reatores estão mudando constantemente.[0054] In a perfusion bioreactor, the culture medium can be continuously removed from the cell culture and replaced with fresh medium. Constant addition of fresh medium while flushing out waste can provide cell culture cells with the necessary nutrients to achieve high cell concentrations. Unlike the ever-changing conditions during batch and fed-batch cultures, the perfusion method offers the means to achieve and maintain a steady-state culture. Typically about one volume of culture is exchanged per day and the cell concentration achieved in the perfusion is typically two to more than ten times that achieved at the peak of the batch or fed batch culture. Substitution of nutrients and/or removal of apoptotic cells allows cell viability to be maintained long term at steady state. In a steady-state production, the quality attributes of the protein (or other compounds of interest) produced at the beginning of the batch can be substantially identical to the quality attributes of the protein (or other compounds of interest) produced at the end of the batch. Protein can be evaluated based on various post-translational modifications such as glycoforms, charge heterogeneity, aggregation, and various measures of purity. Substantial identity of protein quality is not achievable in fed batch reactors as the cell culture conditions in these reactors are constantly changing.

[0055] As condições de cultura no biorreator permitem que a cultura celular produza uma proteína de interesse (POI), com o objetivo de fornecer material proteico consistente. Em algumas condições de cultura da cultura celular, um ou mais parâmetros do processo podem ser selecionados de pelo menos o grupo que consiste em concentração de nutrientes, como concentração de glicose, concentração de glutamato e concentração de glutamina; concentração de amônia; concentração de lactato; densidade celular total; densidade celular viável; e atributos proteicos.[0055] The culture conditions in the bioreactor allow the cell culture to produce a protein of interest (POI), with the aim of providing consistent protein material. In some cell culture culture conditions, one or more process parameters may be selected from at least the group consisting of nutrient concentration, such as glucose concentration, glutamate concentration, and glutamine concentration; ammonia concentration; lactate concentration; total cell density; viable cell density; and protein attributes.

[0056] O método do biorreator permite definir controles sobre o fluxo de vários constituintes, como meios (incluindo, por exemplo, nutrientes), proteínas e células dentro e fora do biorreator. O método do biorreator inclui remover o meio gasto sem células da cultura celular usando um primeiro conduto de saída a uma primeira taxa de fluxo especificada. O método inclui remover células da cultura celular usando um segundo conduto de saída a uma segunda taxa de fluxo especificada. O método inclui introduzir um ou ambos os meios frescos ou nutrientes na cultura celular usando um conduto de entrada a uma terceira taxa de fluxo especificada. Uma ou mais da primeira, segunda e terceira taxas de fluxo especificadas são ajustadas com base nas medições da sonda RAMAN do biorreator. Uma ou mais da primeira, segunda e terceira taxas de fluxo especificadas são ajustadas com base nas medições da sonda RAMAN do biorreator para manter um ou mais parâmetros do processo dentro de faixas predeterminadas. A primeira, segunda e terceira taxas de fluxo especificadas são ajustadas com base nas medições da sonda RAMAN do biorreator para manter a terceira taxa de fluxo especificada do conduto de entrada e a primeira e segunda taxas de fluxo especificadas de cada um dos condutos de saída dentro das respectivas faixas predeterminadas.[0056] The bioreactor method allows you to define controls over the flow of various constituents such as media (including, for example, nutrients), proteins, and cells in and out of the bioreactor. The bioreactor method includes removing the cell-free spent medium from the cell culture using a first outlet conduit at a first specified flow rate. The method includes removing cells from the cell culture using a second outlet conduit at a second specified flow rate. The method includes introducing one or both of the fresh media or nutrients into the cell culture using an inlet conduit at a specified third flow rate. One or more of the first, second, and third specified flow rates are adjusted based on measurements from the bioreactor's RAMAN probe. One or more of the first, second, and third specified flow rates are adjusted based on measurements from the bioreactor's RAMAN probe to maintain one or more process parameters within predetermined ranges. The first, second, and third specified flow rates are adjusted based on measurements from the bioreactor RAMAN probe to maintain the third specified flow rate of the inlet conduit and the first and second specified flow rates of each of the outlet conduits within of the respective predetermined ranges.

[0057] Cada remoção de meio gasto sem células, remoção de células e introdução de um ou ambos meios ou nutrientes frescos é controlada por uma bomba respectiva. O biorreator inclui um filtro configurado para reter as células e permitir a passagem do fluido[0057] Each removal of spent cell-free medium, removal of cells and introduction of one or both of fresh media or nutrients is controlled by a respective pump. The bioreactor includes a filter configured to trap cells and allow fluid to pass through.

[0058] Os métodos e sistemas da divulgação incluem um método para controlar o peso do biorreator e seu conteúdo, para empregar um processo de produção consistente, entre outros motivos. O método inclui medir um peso do biorreator compreendendo o conteúdo da cultura celular. Em uma modalidade adicional, o método emprega o controle do peso do biorreator acoplado ao controle das taxas de fluxo, como descrito em conexão com os condutos acima. O método inclui medir um peso do biorreator com o conteúdo de cultura celular, em que uma ou mais da primeira, segunda e terceira taxas de fluxo especificadas são ajustadas com base no peso medido. A primeira, segunda e terceira taxas de fluxo especificadas são ajustadas com base no peso medido para manter a terceira taxa de fluxo especificada do conduto de entrada e a primeira e segunda taxas de fluxo especificadas de cada um dos condutos de saída dentro das respectivas faixas predeterminadas. A primeira, segunda e/ou terceira taxas especificadas são ajustadas para manter o peso da cultura celular e do biorreator dentro de uma faixa predeterminada. A medição dos parâmetros do processo (PPs) da cultura celular no biorreator pela sonda RAMAN ocorre pelo menos uma vez por hora. O método é configurado para manter a cultura celular a uma concentração celular viável média de pelo menos 30 milhões de células por mL por pelo menos cerca de 30 dias no estado estacionário. O biorreator tem um volume de pelo menos 10 L e o método é configurado para manter um peso do biorreator e da cultura celular dentro de uma faixa de 20 g. O biorreator tem um volume de pelo menos 10 L e o método é configurado para manter um peso do biorreator com a cultura celular dentro de 0,1% do peso inicial do biorreator com a cultura celular. Quando um parâmetro do processo se desvia de um valor de ponto de ajuste dentro de uma respectiva faixa desejada, um ou mais de remover meio sem células, remover células e introduzir um ou ambos os meios ou nutrientes frescos, é ajustado para diminuir o desvio. Por exemplo, pelo menos dois volumes de biorreator do meio gasto são removidos pelo primeiro canal de saída por dia ou até três volumes de biorreator do meio gasto são removidos pelo primeiro conduto de saída por dia.[0058] The methods and systems of the disclosure include a method to control the weight of the bioreactor and its contents, to employ a consistent production process, among other reasons. The method includes measuring a weight of the bioreactor comprising the contents of the cell culture. In a further embodiment, the method employs bioreactor weight control coupled with flow rate control, as described in connection with the above conduits. The method includes measuring a weight of the bioreactor with the cell culture content, wherein one or more of the first, second, and third specified flow rates are adjusted based on the measured weight. The first, second, and third specified flow rates are adjusted based on the measured weight to keep the third specified flow rate of the inlet conduit and the first and second specified flow rates of each of the outlet conduits within their respective predetermined ranges. . The first, second and/or third specified rates are adjusted to keep the cell culture and bioreactor weight within a predetermined range. Measurement of the process parameters (PPs) of the cell culture in the bioreactor by the RAMAN probe takes place at least once an hour. The method is set up to maintain the cell culture at an average viable cell concentration of at least 30 million cells per ml for at least about 30 days at steady state. The bioreactor has a volume of at least 10 L and the method is set to maintain a weight of the bioreactor and cell culture within a range of 20 g. The bioreactor has a volume of at least 10 L and the method is configured to maintain a weight of the bioreactor with cell culture within 0.1% of the initial weight of the bioreactor with cell culture. When a process parameter deviates from a setpoint value within a respective desired range, one or more of removing cell-free media, removing cells, and introducing one or both of fresh media or nutrients is adjusted to lessen the deviation. For example, at least two spent medium bioreactor volumes are removed through the first outlet conduit per day or up to three spent medium bioreactor volumes are removed through the first outlet conduit per day.

[0059] O um ou mais parâmetros do processo também incluem a temperatura da cultura celular e o pH da cultura celular, e a temperatura é mantida entre 35 e 36 graus C, e o pH é mantido entre 6,85 e 7,15. Em outras modalidades, o pH é mantido entre cerca de 6,50 a cerca de 7,50, de cerca de 6,60 a cerca de 7,40, de cerca de 6,70 a cerca de 7,40, de cerca de 6,80 a cerca de 7,30 de cerca de 6,90 a cerca de 7,20, de cerca de 7,00 a cerca de 7,10, em cerca de 6,50, a cerca de 6,55, a cerca de 6,60, a cerca de 6,65, a cerca de 6,70, a cerca de 6,75, a cerca de 6,80, a cerca de 6,85, a cerca de 6,90, a cerca de 6,95, a cerca de 7,00, a cerca de 7,05, a cerca de 7,10, a cerca de 7,15, a cerca de 7,20, a cerca de 7,25, a cerca de 7,30, a cerca de 7,35, a cerca de 7,40, a cerca de 7,45 ou a cerca de 7,50.[0059] The one or more process parameters also include the temperature of the cell culture and the pH of the cell culture, and the temperature is maintained between 35 and 36 degrees C, and the pH is maintained between 6.85 and 7.15. In other embodiments, the pH is maintained from about 6.50 to about 7.50, from about 6.60 to about 7.40, from about 6.70 to about 7.40, from about 6.80 to about 7.30 from about 6.90 to about 7.20 from about 7.00 to about 7.10 from about 6.50 to about 6.55 to about 6.60, about 6.65, about 6.70, about 6.75, about 6.80, about 6.85, about 6.90, about from 6.95, to about 7.00, to about 7.05, to about 7.10, to about 7.15, to about 7.20, to about 7.25, to about 7.30, about 7.35, about 7.40, about 7.45 or about 7.50.

[0060] O um ou mais parâmetros do processo incluem produtividade específica da célula, e o método é configurado para manter as células dentro da cultura celular a uma produtividade específica da célula de pelo menos 15-25 pg/célula/dia por pelo menos 25-37 dias.[0060] The one or more process parameters include cell-specific productivity, and the method is configured to maintain cells within cell culture at a cell-specific productivity of at least 15-25 pg/cell/day for at least 25 -37 days.

[0061] O um ou mais parâmetros do processo incluem a concentração de glicose, e o método é configurado para manter uma concentração de glicose entre cerca de 5 mM a cerca de 85 mM, ou cerca de 1 g/L a cerca de 15,5 g/L.[0061] The one or more process parameters include the glucose concentration, and the method is set to maintain a glucose concentration between about 5 mM to about 85 mM, or about 1 g/L to about 15, 5 g/L.

[0062] O um ou mais parâmetros do processo incluem a concentração de lactato, e o método é configurado para manter uma concentração de lactato menor que cerca de 60 mM ou menor que cerca de 6 g/L.[0062] The one or more parameters of the process include the lactate concentration, and the method is configured to maintain a lactate concentration of less than about 60 mM or less than about 6 g/L.

[0063] O um ou mais parâmetros do processo incluem a concentração de amônia e o método é configurado para manter uma concentração de amônia menor que cerca de 15 mM.[0063] The one or more process parameters include the ammonia concentration and the method is set to maintain an ammonia concentration of less than about 15 mM.

[0064] O termo “estado estável” se refere à manutenção da concentração de nutrientes, parâmetros de processo ou aos atributos de qualidade na cultura celular em um nível não alterado, constante ou estável. Entende-se que nível não alterado, constante ou estável se refere a um nível dentro dos pontos de ajuste predeterminados ou faixas de ajuste predeterminadas. Pontos de ajuste e, portanto, níveis de estado estável, podem ser comutados durante o período de tempo de uma cultura celular de produção por um operador. Pontos de ajuste ou níveis de estado estacionário também podem incluir faixas de valores ou limiares definidos.[0064] The term “steady state” refers to maintaining the concentration of nutrients, process parameters, or quality attributes in the cell culture at an unchanged, constant, or stable level. Unchanged, constant, or stable level is understood to refer to a level within predetermined setpoints or predetermined setpoints. Set points, and therefore steady state levels, can be switched during the time period of a production cell culture by an operator. Setpoints or steady state levels can also include ranges of defined values or thresholds.

[0065] O termo "predeterminado" pode se referir a uma quantidade ou ponto de ajuste, cujo valor é fixo ou calculado manualmente por um usuário ou por um controlador de acordo com um ou mais algoritmos.[0065] The term "predetermined" can refer to an amount or setpoint, the value of which is fixed or calculated manually by a user or by a controller according to one or more algorithms.

[0066] Durante todo o processo de fabricação de um produto proteico terapêutico específico, atributos do produto ou atributos da qualidade da proteína que necessitam de controle podem ser identificados com base em seu potencial impacto na qualidade, especialmente no impacto clínico. Atributos relevantes de qualidade da proteína podem afetar a pureza, segurança e/ou eficácia. Atributos de qualidade referem-se a propriedades ou características físicas, químicas, biológicas ou microbiológicas da droga que está sendo produzida, que devem estar dentro de um limite, faixa ou distribuição adequados para garantir a qualidade desejada do produto (proteína). Ver, por exemplo, International Council for Harmonization (ICH) Q8 (R2) Pharmaceutical Development (ICH, August 2009). Atributos de qualidade para produtos proteicos podem incluir, entre outros, espécies de alto peso molecular, agregados, variantes de carga, aparência, cor, pH, potência, modificações pós-traducionais (teor e distribuição de glicanos), condutividade, ponto isoelétrico, heterogeneidade de carga, mistura de ligações dissulfeto, cisteína livre, proteínas da célula hospedeira e podem ser considerados atributos que têm um alto impacto na qualidade do produto. Certos parâmetros do processo são controlados dentro de um limite, faixa ou distribuição apropriada durante a cultura de produção, para confiabilidade e consistência operacionais durante o processo de fabricação. Os parâmetros do processo podem incluir densidade celular inicial, viabilidade celular inicial, viabilidade celular final, proteína total (título), contagem de células viáveis (VCC), concentração de nutrientes (glicose, fosfato, aminoácidos, etc. ), amônia, pH, lactato e mais. Um produto de droga que é sensível a um parâmetro de processo específico durante o processo de fabricação pode causar alterações em um atributo de proteína acima ou abaixo de um limiar para esse atributo específico e, portanto, requer controle adequado. Como tal, os parâmetros do processo também incluem parâmetros do processo cuja variabilidade pode ter um impacto maior ou igual a um limiar definido em qualquer atributo de qualidade listado acima e, portanto, deve ser monitorado ou controlado para garantir que o processo produza material da qualidade desejada.[0066] Throughout the manufacturing process of a specific therapeutic protein product, product attributes or protein quality attributes needing control can be identified based on their potential impact on quality, especially clinical impact. Relevant protein quality attributes may affect purity, safety and/or efficacy. Quality attributes refer to the physical, chemical, biological or microbiological properties or characteristics of the drug being produced, which must be within an appropriate limit, range or distribution to ensure the desired quality of the product (protein). See, for example, International Council for Harmonization (ICH) Q8 (R2) Pharmaceutical Development (ICH, August 2009). Quality attributes for protein products may include, but are not limited to, high molecular weight species, aggregates, charge variants, appearance, color, pH, potency, post-translational modifications (glycan content and distribution), conductivity, isoelectric point, heterogeneity charge, mixture of disulfide bonds, free cysteine, host cell proteins and can be considered attributes that have a high impact on product quality. Certain process parameters are controlled within an appropriate limit, range, or distribution during the production culture for operational reliability and consistency during the manufacturing process. Process parameters may include initial cell density, initial cell viability, final cell viability, total protein (titre), viable cell count (VCC), nutrient concentration (glucose, phosphate, amino acids, etc.), ammonia, pH, lactate and more. A drug product that is sensitive to a specific process parameter during the manufacturing process may cause changes in a protein attribute above or below a threshold for that specific attribute and therefore requires adequate control. As such, process parameters also include process parameters whose variability may have an impact greater than or equal to a defined threshold on any quality attribute listed above and therefore must be monitored or controlled to ensure that the process produces quality material. desired.

[0067] Os termos "produtividade específica da célula", "taxa específica da célula" e semelhantes, referem-se à taxa de expressão do produto específica, por exemplo, por célula ou por medida de massa ou volume celular. A produtividade específica da célula é medida em, por exemplo, gramas de proteína produzida por célula por dia.[0067] The terms "cell-specific productivity", "cell-specific rate" and the like, refer to the specific product expression rate, e.g., per cell or per measure of cell mass or volume. Cell-specific productivity is measured in, for example, grams of protein produced per cell per day.

[0068] Um sistema de biorreator 1 pode incluir um tanque de biorreator 10, um reservatório de alimentação 28, uma bomba de alimentação 30, uma bomba de sangria 40 e uma bomba de colheita 50. O sistema de biorreator 1 também pode incluir uma bomba ATF 70, um tanque de sangria 80 e um tanque de colheita 90. As bombas 30, 40, 50 e 70 podem ser acopladas operacionalmente a um controlador 200. Em alguns exemplos, no entanto, a bomba ATF 70 pode ser acoplada e controlada por um controlador separado 102.[0068] A bioreactor system 1 may include a bioreactor tank 10, a feed reservoir 28, a feed pump 30, a bleed pump 40 and a harvest pump 50. The bioreactor system 1 may also include a pump ATF 70, a bleed tank 80 and a harvest tank 90. Pumps 30, 40, 50 and 70 can be operatively coupled to a controller 200. In some examples, however, the ATF pump 70 can be coupled and controlled by a separate controller 102.

[0069] O tanque de biorreator 10 pode ser uma cuba, barril, vaso, balão ou outro recipiente adequado, dimensionado para inúmeras balanças de operação. Por exemplo, o volume do tanque de biorreator 10 pode ser de cerca de 1L a cerca de 20. 000L, de cerca de 5L a cerca de 10. 000L, de cerca de 10L a cerca de 1. 000L, de cerca de 20L a cerca de 100L, cerca de 50L, pelo menos cerca de 1L, pelo menos cerca de 10L, pelo menos cerca de 50L, pelo menos cerca de 100L, pelo menos cerca de 200L, pelo menos cerca de 500L, pelo menos cerca de 1.000L, pelo menos cerca de 10.000L, inferior a cerca de 20.000L, inferior a cerca de 10.000L, inferior a cerca de 1.000L, inferior a cerca de 500L, inferior a cerca de 200L ou inferior a cerca de 100L. Em outras modalidades, o tanque de biorreator 10 tem um volume de pelo menos 2L, pelo menos 3L, pelo menos 10L, pelo menos 35L ou pelo menos 50L ou mais. O tanque de biorreator 10 pode ser feito de metal (por exemplo, aço ou aço inoxidável), uma liga de metal, vidro e/ou um polímero (por exemplo, um biorreator descartável e de uso único).[0069] The bioreactor tank 10 can be a vat, barrel, vessel, flask or other suitable container, sized for numerous operating scales. For example, the volume of the bioreactor tank 10 can be from about 1L to about 20,000L, from about 5L to about 10,000L, from about 10L to about 1,000L, from about 20L to about 100L, about 50L, at least about 1L, at least about 10L, at least about 50L, at least about 100L, at least about 200L, at least about 500L, at least about 1,000L , at least about 10,000L, less than about 20,000L, less than about 10,000L, less than about 1,000L, less than about 500L, less than about 200L, or less than about 100L. In other embodiments, the bioreactor tank 10 has a volume of at least 2L, at least 3L, at least 10L, at least 35L or at least 50L or more. The bioreactor tank 10 can be made of metal (e.g., steel or stainless steel), a metal alloy, glass, and/or a polymer (e.g., a disposable, single-use bioreactor).

[0070] As bombas 30, 40 e 50 podem incluir quaisquer bombas adequadas, como, por exemplo, bombas peristálticas, bombas de diafragma, bombas de pistão, bombas motorizadas ou semelhantes. Em um exemplo, as bombas 30, 40 e 50 podem ser substancialmente idênticas uma à outra. Em outro exemplo, uma ou mais das bombas 30, 40 e 50 podem ser diferentes das outras. Em ainda outro exemplo, a bomba 70 pode ser semelhante a qualquer uma das bombas 30, 40 e 50. O reservatório de alimentação 28 pode incluir qualquer fonte adequada de alimentação de nutrientes para o tanque de biorreator 10, e a alimentação de nutrientes pode ser direcionada para o tanque de biorreator 10 através bomba de alimentação 30 através de um conduto adequado. A alimentação de nutrientes (meio de crescimento) pode incluir uma fonte de carbono (por exemplo, glicose), água, sal, uma fonte de aminoácidos e/ou outros nutrientes.[0070] The pumps 30, 40 and 50 can include any suitable pumps, such as, for example, peristaltic pumps, diaphragm pumps, piston pumps, motorized pumps or the like. In one example, pumps 30, 40 and 50 can be substantially identical to each other. In another example, one or more of the pumps 30, 40 and 50 may be different from the others. In yet another example, the pump 70 can be similar to any of the pumps 30, 40 and 50. The feed reservoir 28 can include any suitable source of nutrient feed for the bioreactor tank 10, and the nutrient feed can be directed to bioreactor tank 10 via feed pump 30 through a suitable conduit. The nutrient feed (growth medium) may include a carbon source (eg, glucose), water, salt, an amino acid source, and/or other nutrients.

[0071] Uma tampa 12 pode cobrir uma parte superior do tanque de biorreator 10 e vários componentes e instrumentos podem se estender através da tampa 12 para um interior do tanque de biorreator 10. Por exemplo, um aerador 14, um agitador 16, uma sonda RAMAN 18, um conduto 20 e um conduto 22 podem se estender através da tampa 12. No entanto, é contemplado que todo ou qualquer aerador 14, agitador 16, sonda RAMAN 18, conduto 20 e conduto 22 possam ser acoplados operacionalmente ao tanque de biorreator 10 de qualquer outra maneira adequada, como, por exemplo, através de uma superfície lateral de tanque de biorreator 10.[0071] A lid 12 can cover an upper part of the bioreactor tank 10 and various components and instruments can extend through the lid 12 to an interior of the bioreactor tank 10. For example, an aerator 14, an agitator 16, a probe RAMAN 18, a conduit 20 and a conduit 22 may extend through the lid 12. However, it is contemplated that any or all of the aerator 14, stirrer 16, RAMAN probe 18, conduit 20 and conduit 22 may be operatively coupled to the bioreactor tank 10 in any other suitable way, such as through a side surface of bioreactor tank 10.

[0072] O aerador 14 pode ser um espargidor configurado para fornecer oxigênio e/ou outros gases a uma cultura celular dentro do tanque de biorreator 10. O aerador 14 pode ser acoplado a uma fonte de oxigênio ou outro gás e pode direcionar o gás para a cultura celular, de modo que o gás borbulhe na cultura celular, arejando a cultura celular. Em alguns exemplos, um microespargidor pode ser usado em combinação com um espargidor de tubo perfurado.[0072] The aerator 14 can be a sparger configured to supply oxygen and/or other gases to a cell culture inside the bioreactor tank 10. The aerator 14 can be coupled to a source of oxygen or other gas and can direct the gas to the cell culture, so that the gas bubbles into the cell culture, aerating the cell culture. In some examples, a microsprinkler can be used in combination with a perforated tube spreader.

[0073] O agitador 16 pode ser qualquer agitador adequado configurado para misturar a cultura celular dentro do tanque de biorreator 10. O agitador 16 pode ser acionado por cima ou por baixo por mecanismos mecânicos e/ou magnéticos. Um agitador acionado por fundo pode ser desejado em alguns casos, porque pode liberar espaço na tampa 12 para a detecção de instrumentação, como, por exemplo, temperatura, pH, oxigênio dissolvido, espuma, dióxido de carbono e outros sensores, bem como portas de entrada para ácido, álcalis, espuma, entrada de meio fresco e portas de saída. O agitador 16 pode incluir um agitador radial, um agitador axial, um impulsor Rushton, um impulsor de lâmina inclinada, um impulsor de lâmina marítima ou semelhante.[0073] The stirrer 16 can be any suitable stirrer configured to mix the cell culture within the bioreactor tank 10. The stirrer 16 can be driven from above or below by mechanical and/or magnetic mechanisms. A bottom driven stirrer may be desired in some cases because it can free up space in the lid 12 for the detection of instrumentation such as temperature, pH, dissolved oxygen, foam, carbon dioxide and other sensors, as well as inlet for acid, alkali, foam, fresh media inlet and outlet ports. The impeller 16 may include a radial impeller, an axial impeller, a Rushton impeller, an inclined blade impeller, a marine blade impeller, or the like.

[0074] A sonda Raman 18 pode ser, por exemplo, uma sonda Raman de fibra óptica em, por exemplo, um gabinete de aço inoxidável e com uma janela transparente, por exemplo, de safira ou vidro. A sonda Raman 18 pode ser configurada para permitir a amostragem Raman da cultura celular 2. A sonda Raman 18 pode ser configurada para brilhar uma luz monocromática (por exemplo, um laser a 785 nm ou outro comprimento de onda adequado) na cultura celular 2 e detectar luz dispersa da cultura celular 2.[0074] The Raman probe 18 may be, for example, a fiber optic Raman probe in, for example, a stainless steel enclosure and with a transparent window, for example, sapphire or glass. Raman probe 18 can be configured to allow Raman sampling of cell culture 2. Raman probe 18 can be configured to shine a monochromatic light (e.g., a laser at 785 nm or other suitable wavelength) on cell culture 2 and detect stray light from cell culture 2.

[0075] A espectroscopia de Raman é uma forma de espectroscopia vibratória que fornece informações sobre vibrações moleculares que podem ser usadas inserindo uma sonda Raman in situ para identificação e quantificação de amostra. Em algumas modalidades, o monitoramento das variáveis de processo é realizado com o uso de espectroscopia de Raman in situ. A Análise de Raman in situ é um método para analisar uma amostra em seu local original sem ter que extrair uma porção da amostra para análise em um espectrômetro de Raman. A Análise de Raman in situ é vantajosa pelo fato de que os analisadores de espectroscopia de Raman são não invasivos, o que reduz o risco de contaminação, e não destrutivos sem impacto na viabilidade de cultura celular ou qualidade de proteína. A análise de Raman in situ pode fornecer avaliações em tempo real de uma ou mais variáveis de processo em culturas celulares. Os fabricantes de sondas Raman incluem, entre outros, tech5usa, Anton Paar, InPhotonics, Kaiser Optical Systems, Inc. e FiberTech Optica.[0075] Raman spectroscopy is a form of vibratory spectroscopy that provides information about molecular vibrations that can be used by inserting a Raman probe in situ for sample identification and quantification. In some modalities, the monitoring of process variables is performed using in situ Raman spectroscopy. In situ Raman Analysis is a method of analyzing a sample in its original location without having to extract a portion of the sample for analysis in a Raman spectrometer. In situ Raman Analysis is advantageous in that Raman spectroscopy analyzers are non-invasive, which reduces the risk of contamination, and non-destructive with no impact on cell culture viability or protein quality. In situ Raman analysis can provide real-time assessments of one or more process variables in cell cultures. Manufacturers of Raman probes include but are not limited to tech5usa, Anton Paar, InPhotonics, Kaiser Optical Systems, Inc. and FiberTech Optica.

[0076] O tanque de biorreator 10 pode ser acoplado a um sistema de filtro 100 tendo um filtro de fibra oca no mesmo. A membrana de filtro oca (por exemplo, polissulfona) pode incluir uma ou mais membranas tubulares com um diâmetro interno de cerca de 0,3 mm a cerca de 6,0 mm, de cerca de 0,5 mm a cerca de 3,0 mm, de cerca de 0,5 mm a cerca de 2,0 mm, maior que cerca de 0,3 mm, maior que cerca de 0,5 mm, menor que cerca de 6,0 mm, menor que cerca de 3,0 mm ou menor que cerca de 2,0 mm. Um material de malha na membrana pode ser escolhido de modo que o tamanho dos poros na malha seja próximo ao diâmetro das células da cultura celular 2, ajudando a garantir uma alta retenção de células, permitindo que os detritos celulares e o meio gasto passem através do filtro. Em um exemplo, o tamanho do poro da malha é de cerca de 0,2 μm a cerca de 30 μm, embora outras faixas e valores adequados também sejam contemplados. As proteínas ou outros produtos biológicos de interesse podem ser perfundidos ou retidos com base no tamanho dos poros do filtro (por exemplo, 0,2 μm ou 50 kD).[0076] The bioreactor tank 10 can be coupled to a filter system 100 having a hollow fiber filter therein. The hollow filter membrane (e.g., polysulfone) can include one or more tubular membranes having an internal diameter of from about 0.3 mm to about 6.0 mm, from about 0.5 mm to about 3.0 mm. mm, from about 0.5 mm to about 2.0 mm, greater than about 0.3 mm, greater than about 0.5 mm, less than about 6.0 mm, less than about 3, 0 mm or less than about 2.0 mm. A mesh material in the membrane can be chosen such that the pore size in the mesh is close to the diameter of the cells in the cell culture 2, helping to ensure high cell retention by allowing cell debris and spent media to pass through the mesh. filter. In one example, the pore size of the mesh is from about 0.2 µm to about 30 µm, although other suitable ranges and values are also contemplated. Proteins or other biologics of interest can be perfused or retained based on filter pore size (eg 0.2 µm or 50 kD).

[0077] O fluido do tanque de biorreator 10 pode ser distribuído ao sistema de filtro 100 via conduto 20 e bomba 70. A bomba 70 pode ser reversível para permitir que o fluido flua do sistema de filtro 100 de volta para o tanque do biorreator 10. O sistema de filtro 100 pode operar sob fluxo tangencial alternado. Em um exemplo, o fluxo tangencial alternado pode significar que existe um fluxo na mesma direção que (por exemplo, tangencial para) as superfícies da membrana das fibras ocas, cujo fluxo vai para frente e para trás e que existe outro fluxo na direção substancialmente perpendicular à referida superfície do filtro. O fluxo tangencial alternado pode ser alcançado usando uma bomba (por exemplo, bomba 70) para circular a cultura celular através de um módulo de filtro que compreende fibras ocas e outra bomba (por exemplo, bomba 50) para remover o líquido com uma densidade celular menor antes da separação do filtro. O fluxo tangencial alternado pode ajudar a evitar problemas de incrustação e cisalhamento típicos de outros mecanismos de retenção de células.[0077] Fluid from bioreactor tank 10 can be distributed to filter system 100 via conduit 20 and pump 70. Pump 70 can be reversible to allow fluid to flow from filter system 100 back to bioreactor tank 10 The filter system 100 can operate under alternating tangential flow. In one example, alternating tangential flow may mean that there is flow in the same direction as (e.g., tangential to) the membrane surfaces of hollow fibers, which flow goes back and forth, and that there is other flow in the substantially perpendicular direction. to said filter surface. Alternating tangential flow can be achieved by using one pump (e.g. pump 70) to circulate the cell culture through a filter module comprising hollow fibers and another pump (e.g. pump 50) to remove liquid with a cell density smaller before filter separation. Alternating tangential flow can help avoid fouling and shearing problems typical of other cell retention mechanisms.

[0078] Alternativamente, outros mecanismos de filtragem (incluindo mecanismos de filtragem por membrana) podem ser utilizados, como, por exemplo, ultrafiltração, microfiltração e filtragem de fluxo tangencial.[0078] Alternatively, other filtration mechanisms (including membrane filtration mechanisms) can be used, such as ultrafiltration, microfiltration and tangential flow filtration.

[0079] A bomba de sangria 40 pode ser configurada para remover células do tanque de biorreator 10 via conduto 22. O conduto 22 pode ser um tubo de imersão selecionado para evitar agregação e entupimento celular (o que, por exemplo, pode resultar se o conduto 22 for muito estreito em relação à viscosidade da cultura 2). O conduto 22 pode incluir um tubo de elastômero termoplástico (por exemplo, bioprene). A bomba de sangria 40 pode ser controlada via, por exemplo, processador 200. Uma sangria de células via bomba de sangria 40 pode remover as células da cultura celular 2 dentro do tanque de biorreator 10. A taxa de sangria celular (controlada pela saída da bomba de sangria 40 e controlador 200) pode ser determinada com base na taxa de crescimento de células na cultura celular 2. Para manter uma densidade celular constante na cultura celular 2, pode ser desejável ter a taxa de sangria e a taxa de crescimento celular aproximadamente ou substancialmente iguais entre si. Em alguns exemplos, se houver um volume significativo de cultura celular 2 sendo removida da hemorragia celular com produto valioso, a hemorragia pode ser coletada e processada para recuperar o produto.[0079] The bleed pump 40 can be configured to remove cells from the bioreactor tank 10 via conduit 22. Conduit 22 can be a dip tube selected to prevent cell aggregation and clogging (which, for example, can result if the conduit 22 is too narrow in relation to the viscosity of the culture 2). The conduit 22 may include a tube of thermoplastic elastomer (eg, bioprene). The bleed pump 40 can be controlled via, for example, processor 200. A bleed of cells via the bleed pump 40 can remove cells from the cell culture 2 within the bioreactor tank 10. The rate of cell bleed (controlled by the output of the bleed pump 40 and controller 200) can be determined based on the growth rate of cells in cell culture 2. To maintain a constant cell density in cell culture 2, it may be desirable to have the bleed rate and cell growth rate approximately or substantially equal to each other. In some instances, if there is a significant volume of cell culture 2 being removed from the cell bleed with valuable product, the bleed can be collected and processed to recover the product.

[0080] O tanque de biorreator 10 pode ser posicionado em uma balança 110 configurada para medir um peso do tanque de biorreator 10 e da cultura celular 2. A balança 110 pode ser acoplada ao controlador 200 e pode enviar continuamente um peso do tanque de biorreator 10 e da cultura celular 2 para o controlador 200. Em alguns exemplos, pelo menos uma porção do sistema de filtro 100, incluindo, por exemplo, um alojamento de filtro e um filtro de membrana oca no mesmo, também pode ser posicionada na balança 110. A balança 110 pode ser qualquer balança adequada ou célula de carga configurada para medir um peso de componentes apoiados na balança.[0080] The bioreactor tank 10 can be positioned on a scale 110 configured to measure a weight of the bioreactor tank 10 and the cell culture 2. The scale 110 can be coupled to the controller 200 and can continuously send a weight of the bioreactor tank 10 and the cell culture 2 to the controller 200. In some examples, at least a portion of the filter system 100, including, for example, a filter housing and a hollow membrane filter therein, may also be positioned on the scale 110 The scale 110 can be any suitable scale or load cell configured to measure a weight of components supported on the scale.

[0081] Com referência às FIGS. 1 e 2, o controlador 200 pode ser configurado para receber dados da sonda Raman 18, da balança 110 e outros sensores e pode ser configurado para controlar a taxa de fluxo de fluido através de uma ou mais da bomba de alimentação 30, da bomba de sangria 40 e da bomba de colheita 50 com base nos dados.[0081] With reference to FIGS. 1 and 2, the controller 200 can be configured to receive data from the Raman probe 18, the scale 110 and other sensors and can be configured to control the flow rate of fluid through one or more of the feed pump 30, the feed pump bleed 40 and harvest pump 50 based on the data.

[0082] O controlador 200 pode ser configurado para receber dados espectrais brutos da sonda Raman 18 para determinar parâmetros do processo, como, por exemplo, concentração de glicose, concentração de glutamina, concentração de glutamato, concentração de amônia, concentração de lactato, densidade celular total, título e densidade celular viável. O controlador 200 pode usar esses parâmetros de processo determinados para estabelecer um circuito de retroalimentação para ajustar um ou mais do fluxo de fluido através da bomba de alimentação 30, bomba de sangria 40 e bomba de colheita 50. Ou seja, o controlador 200 pode estabelecer pontos de ajuste para um ou mais da concentração de glicose (por exemplo, de cerca de 5 mM a cerca de 85 mM, ou de cerca de 0,5 g/L a cerca de 15,5 g/L, de cerca de 1 g/L a cerca de 15,5 g/L, de cerca de 0,5 g/L a cerca de 8 g/L, de cerca de 2 g/L a cerca de 6 g/L ou de cerca de 3 g/L a cerca de 5 g/L), concentração de glutamina (por exemplo, inferior a cerca de 8 mM, inferior a cerca de 7 mM, inferior a cerca de 6 mM, inferior a cerca de 5 mM ou inferior a cerca de 4 mM), concentração de glutamato (por exemplo, inferior a cerca de 5 mM, inferior a cerca de 4 mM, inferior a cerca de 3 mM, inferior a cerca de 2 mM ou inferior a cerca de 1 mM), concentração de amônia (por exemplo, inferior a cerca de 15 mM, inferior a cerca de 12 mM, inferior a cerca de 10 mM, inferior a cerca de 9 mM, inferior a cerca de 8 mM, inferior a cerca de 7 mM, inferior a cerca de 6 mM), concentração de lactato (por exemplo, inferior a cerca de 6 g/L, inferior a cerca de 5 g/L, inferior a cerca de 4 g/L, inferior a cerca de 3 g/L, inferior a cerca de 2 g/L ou inferior a cerca de 1 g/L), densidade total de células (por exemplo, superior a cerca de 30 MM, superior a cerca de 35 mm, superior a cerca de 40 mm, superior a cerca de 45 mm, superior a cerca de 50 mm, superior a cerca de 55 mm, superior a cerca de 60 mm ou superior a cerca de 65 mm) e densidade celular viável (por exemplo, pelo menos 30 milhões de células por mL, pelo menos 35 milhões de células por mL, pelo menos 50 milhões de células por mL ou pelo menos 75 milhões de células por mL) e comparar os valores determinados (com base nos espectros Raman da sonda Raman 18) aos seus respectivos pontos de ajuste.[0082] The controller 200 can be configured to receive raw spectral data from the Raman probe 18 to determine process parameters, such as, for example, glucose concentration, glutamine concentration, glutamate concentration, ammonia concentration, lactate concentration, density total cell, titer and viable cell density. Controller 200 may use these determined process parameters to establish a feedback loop to adjust one or more of the fluid flow through feed pump 30, bleed pump 40, and harvest pump 50. That is, controller 200 may establish set points for one or more of the glucose concentration (for example, from about 5 mM to about 85 mM, or from about 0.5 g/L to about 15.5 g/L, from about 1 g/L to about 15.5 g/L, from about 0.5 g/L to about 8 g/L, from about 2 g/L to about 6 g/L, or from about 3 g /L to about 5 g/L), glutamine concentration (e.g., less than about 8 mM, less than about 7 mM, less than about 6 mM, less than about 5 mM, or less than about 4 mM), glutamate concentration (e.g., less than about 5 mM, less than about 4 mM, less than about 3 mM, less than about 2 mM, or less than about 1 mM), ammonia concentration (e.g., less than about 15 mM, less than about 12 mM, less than about 10 mM, less than about 9 mM, less than about 8 mM, less than about 7 mM, less than about 6 mM), lactate concentration (e.g., less than about 6 g/L, less than about 5 g/L, less than about 4 g/L, less than about 3 g/L, less than about 2 g/L or less than about 1 g/L), total cell density (e.g., greater than about 30 mm, greater than about 35 mm, greater than about 40 mm, greater than about 45 mm, greater than about 50 mm, greater than about 55 mm, greater than about 60 mm, or greater than about 65 mm) and viable cell density (e.g., at least 30 million cells per mL, at least 35 million cells per mL, at least 50 million cells per mL or at least 75 million cells per mL) and compare the determined values (based on the Raman spectra of the Raman probe 18) to their respective setpoints.

[0083] O controlador 200 pode utilizar um circuito de retroalimentação negativo para corrigir qualquer diferença entre um valor de ponto de ajuste (ou uma faixa de valores definida) e um valor determinado. Por exemplo, se uma concentração de glicose determinada for maior que a concentração de glicose de ponto de ajuste, o controlador 200 pode, por exemplo, diminuir a saída da bomba de alimentação 30, diminuir a saída da bomba de sangria 40 e/ou aumentar a saída da bomba de colheita 50 em para ajudar a diminuir a concentração de glicose; ou o controlador 200 pode diminuir uma saída da bomba de alimentação 30 e diminuir uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma concentração de glutamina determinada for maior que a concentração de glutamina de ponto de ajuste, o controlador 200 pode, por exemplo, diminuir a saída da bomba de alimentação 30, diminuir a saída da bomba de sangria 40 e/ou aumentar a saída da bomba de colheita 50 para ajudar a diminuir a concentração de glutamina; ou o controlador 200 pode diminuir uma saída da bomba de alimentação 30 e diminuir uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma concentração de glutamato determinada for maior que a concentração de ponto de ajuste de glutamato, o controlador 200 pode, por exemplo, diminuir a saída da bomba de alimentação 30, diminuir a saída da bomba de sangria 40 e/ou aumentar a saída da bomba de colheita 50 para ajudar a diminuir a concentração de glutamato; ou o controlador 200 pode diminuir uma saída da bomba de alimentação 30 e diminuir uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma concentração de amônia determinada for maior que a concentração de ponto de ajuste de amônia, o controlador 200 pode, por exemplo, diminuir a saída da bomba de alimentação 30, aumentar a saída da bomba de sangria 40 e/ou diminuir a saída da bomba de colheita 50 para ajudar a diminuir a concentração de amônia; ou o controlador 200 pode aumentar uma saída da bomba de alimentação 30 e aumentar uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma concentração de lactato determinada for maior que a concentração de ponto de ajuste de lactato, o controlador 200 pode, por exemplo, aumentar a saída da bomba de alimentação 30, diminuir a saída da bomba de sangria 40 e/ou aumentar a saída da bomba de colheita 50 para ajudar a diminuir a concentração de lactato; ou o controlador 200 pode diminuir uma saída da bomba de alimentação 30 e diminuir uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma densidade celular total determinada for maior que a densidade celular total do ponto de ajuste, o controlador 200 pode, por exemplo, diminuir a saída da bomba de alimentação 30, aumentar a saída da bomba de sangria 40 e/ou diminuir a saída da bomba de colheita 50, para ajudar a diminuir a densidade celular total; ou o controlador 200 pode diminuir uma saída da bomba de alimentação 30 e diminuir uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma densidade celular viável determinada for maior que a densidade celular viável do ponto de ajuste, o controlador 200 pode, por exemplo, diminuir a saída da bomba de alimentação 30, aumentar a saída da bomba de sangria 40 e/ou diminuir a saída da bomba de colheita 50, para ajudar a diminuir a densidade celular viável; ou o controlador 200 pode diminuir uma saída da bomba de alimentação 30 e diminuir uma saída da bomba de colheita 50.[0083] The controller 200 may use a negative feedback loop to correct for any difference between a setpoint value (or a defined range of values) and a given value. For example, if a determined glucose concentration is greater than the setpoint glucose concentration, the controller 200 can, for example, decrease the output of the feed pump 30, decrease the output of the bleed pump 40 and/or increase the harvest pump output 50 in to help lower glucose concentration; or controller 200 may decrease an output from feed pump 30 and decrease an output from harvest pump 50. For example, if a determined glutamine concentration is greater than the setpoint glutamine concentration, controller 200 may, for for example, decreasing feed pump output 30, decreasing bleed pump output 40, and/or increasing harvest pump output 50 to help decrease glutamine concentration; or controller 200 may decrease an output from feed pump 30 and decrease an output from harvest pump 50. For example, if a determined glutamate concentration is greater than the glutamate setpoint concentration, controller 200 may, for for example, decreasing the output of the feed pump 30, decreasing the output of the bleed pump 40 and/or increasing the output of the harvest pump 50 to help decrease the glutamate concentration; or the controller 200 may decrease an output from the feed pump 30 and decrease an output from the harvest pump 50. For example, if a determined ammonia concentration is greater than the ammonia setpoint concentration, the controller 200 may, for for example, decreasing the feed pump output 30, increasing the bleed pump output 40, and/or decreasing the harvest pump output 50 to help lower the ammonia concentration; or the controller 200 may increase an output from the feed pump 30 and increase an output from the harvest pump 50. For example, if a determined lactate concentration is greater than the lactate setpoint concentration, the controller 200 may, for for example, increasing the output of the feed pump 30, decreasing the output of the bleed pump 40 and/or increasing the output of the harvest pump 50 to help decrease the lactate concentration; or controller 200 may decrease an output from feed pump 30 and decrease an output from harvest pump 50. For example, if a determined total cell density is greater than the setpoint total cell density, controller 200 may, for example, for example, decreasing the output of the feed pump 30, increasing the output of the bleed pump 40 and/or decreasing the output of the harvest pump 50, to help decrease the total cell density; or controller 200 may decrease an output from feed pump 30 and decrease an output from harvest pump 50. For example, if a determined viable cell density is greater than the setpoint viable cell density, controller 200 may, for for example, decreasing the output of the feed pump 30, increasing the output of the bleed pump 40, and/or decreasing the output of the harvest pump 50, to help decrease viable cell density; or controller 200 may decrease an output from feed pump 30 and decrease an output from harvest pump 50.

[0084] Por exemplo, se uma concentração de glicose determinada for menor que a concentração de ponto de ajuste de glutamina, o controlador 200 pode, por exemplo, aumentar a saída da bomba de alimentação 30, aumentar a saída da bomba de sangria 40 e/ou diminuir a saída da bomba de colheita 50 para ajudar a aumentar a concentração de glicose; ou o controlador 200 pode aumentar uma saída da bomba de alimentação 30 e aumentar uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma concentração de glutamina determinada for menor que a concentração de ponto de ajuste de glutamina, o controlador 200 pode, por exemplo, aumentar a saída da bomba de alimentação 30, aumentar a saída da bomba de sangria 40 e/ou diminuir a saída da bomba de colheita 50 para ajudar a aumentar a concentração de glutamina; ou o controlador 200 pode aumentar uma saída da bomba de alimentação 30 e aumentar uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma concentração de glutamato determinada for menor que a concentração de ponto de ajuste de glutamato, o controlador 200 pode, por exemplo, aumentar a saída da bomba de alimentação 30, aumentar a saída da bomba de sangria 40 e/ou diminuir a saída da bomba de colheita 50 para ajudar a aumentar a concentração de glutamato; ou o controlador 200 pode aumentar uma saída da bomba de alimentação 30 e aumentar uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma concentração de lactato determinada for menor que a concentração de ponto de ajuste de lactato, o controlador 200 pode, por exemplo, aumentar a saída da bomba de alimentação 30, aumentar a saída da bomba de sangria 40 e/ou diminuir a saída da bomba de colheita 50 para ajudar a aumentar a concentração de lactato; ou o controlador 200 pode aumentar uma saída da bomba de alimentação 30 e aumentar uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma densidade celular total determinada for menor que a densidade celular total do ponto de ajuste, o controlador 200 pode, por exemplo, aumentar a saída da bomba de alimentação 30, diminuir a saída da bomba de sangria 40 e/ou aumentar a saída da bomba de colheita 50, a fim de ajudar a aumentar a densidade celular total; ou o controlador 200 pode diminuir uma saída da bomba de alimentação 30 e diminuir uma saída da bomba de colheita 50. Por exemplo, se uma densidade celular viável determinada for menor que a densidade celular viável do ponto de ajuste, o controlador 200 pode, por exemplo, aumentar a saída da bomba de alimentação 30, diminuir a saída da bomba de sangria 40 e/ou aumentar a saída da bomba de colheita 50, para ajudar a aumentar a densidade celular viável; ou o controlador 200 pode aumentar uma saída da bomba de alimentação 30 e aumentar uma saída da bomba de colheita 50.[0084] For example, if a determined glucose concentration is less than the glutamine setpoint concentration, the controller 200 may, for example, increase the output of the feed pump 30, increase the output of the bleed pump 40, and /or decrease the output of the harvest pump 50 to help increase the glucose concentration; or controller 200 may increase an output from feed pump 30 and increase an output from harvest pump 50. For example, if a determined glutamine concentration is less than the glutamine setpoint concentration, controller 200 may, for for example, increasing the output of the feed pump 30, increasing the output of the bleed pump 40 and/or decreasing the output of the harvest pump 50 to help increase the glutamine concentration; or controller 200 may increase an output from feed pump 30 and increase an output from harvest pump 50. For example, if a determined glutamate concentration is less than the glutamate setpoint concentration, controller 200 may, for for example, increasing the output of the feed pump 30, increasing the output of the bleed pump 40 and/or decreasing the output of the harvest pump 50 to help increase the glutamate concentration; or the controller 200 may increase an output from the feed pump 30 and increase an output from the harvest pump 50. For example, if a determined lactate concentration is less than the lactate setpoint concentration, the controller 200 may, for for example, increasing the output of the feed pump 30, increasing the output of the bleed pump 40 and/or decreasing the output of the harvest pump 50 to help increase the lactate concentration; or the controller 200 may increase an output of the feed pump 30 and increase an output of the harvest pump 50. For example, if a determined total cell density is less than the setpoint total cell density, the controller 200 may, for for example, increasing the output of the feed pump 30, decreasing the output of the bleed pump 40, and/or increasing the output of the harvest pump 50, in order to help increase the total cell density; or controller 200 may decrease an output from feed pump 30 and decrease an output from harvest pump 50. For example, if a determined viable cell density is less than the setpoint viable cell density, controller 200 may, for for example, increasing the output of the feed pump 30, decreasing the output of the bleed pump 40, and/or increasing the output of the harvest pump 50, to help increase viable cell density; or the controller 200 may increase an output from feed pump 30 and increase an output from harvest pump 50.

[0085] No entanto, a perfusão total através do sistema é mantida em um determinado ponto de ajuste (a taxa de perfusão não varia com base nas concentrações dentro do reator). O controlador 200 pode controlar similarmente o peso do biorreator (e o peso da cultura celular 2) usando um circuito de retroalimentação negativo.[0085] However, the total perfusion through the system is maintained at a certain set point (the perfusion rate does not vary based on concentrations within the reactor). The controller 200 can similarly control the weight of the bioreactor (and the weight of the cell culture 2) using a negative feedback loop.

[0086] Deve-se notar que a adição ou subtração de vários nutrientes introduzidos no reator pode ser acoplada a uma alteração correspondente a outros insumos para garantir que a massa total e/ou o volume de material inserido no reator permaneça o mesmo. Ou seja, como a taxa de perfusão é mantida constante, o aumento de um nutriente, por exemplo, uma solução de glicose, glutamina, glutamato ou semelhante, pode ser acompanhado por uma diminuição correspondente de massa ou volume no fluxo de alimentação de nutrientes primários.[0086] It should be noted that the addition or subtraction of various nutrients introduced into the reactor can be coupled with a corresponding change to other inputs to ensure that the total mass and/or volume of material entered into the reactor remains the same. That is, as the perfusion rate is held constant, an increase in one nutrient, for example a solution of glucose, glutamine, glutamate or the like, can be accompanied by a corresponding decrease in mass or volume in the primary nutrient feed stream. .

[0087] Em uma modalidade, o sistema pode incluir pelo menos dois circuito de retroalimentação - um para controle de peso e outro para controle de parâmetros do processo (por exemplo, VCC, glicose, glutamina, glutamato, amônia, lactato, etc. )Em um exemplo, as várias bombas de entrada e saída não são controladas por circuitos concorrentes. Por exemplo, uma taxa de perfusão pode ser definida (por exemplo, 20 L/dia), após o que a sonda RAMAN 18 mede um ou mais valores de cultura e o controlador 200 avalia as etapas a serem tomadas com base nas medições da sonda RAMAN 18. Se o controlador 200 determinar que, por exemplo, o VCC é muito alto, o controlador 200 pode começar a remover as células via bomba de sangria 40 e a taxa de fluxo da bomba de colheita 50 pode ser diminuída simultaneamente, de modo que o volume total através do sistema permaneça constante. Etapas adicionais a serem tomadas pelo controlador 200 quando for detectado que outros parâmetros do processo são muito altos ou muito baixos (por exemplo, glicose, glutamina, glutamato, amônia, lactato e densidade celular total) são descritas acima.[0087] In one embodiment, the system may include at least two feedback loops - one for weight control and one for control of process parameters (e.g., VCC, glucose, glutamine, glutamate, ammonia, lactate, etc.) In one example, the multiple inlet and outlet pumps are not controlled by concurrent circuits. For example, a perfusion rate can be set (e.g. 20 L/day), after which the RAMAN probe 18 measures one or more culture values and the controller 200 evaluates the steps to be taken based on the probe measurements. RAMAN 18. If the controller 200 determines that, for example, the VCC is too high, the controller 200 can begin to remove cells via the bleed pump 40 and the flow rate of the harvest pump 50 can be decreased simultaneously so that that the total volume through the system remains constant. Additional steps to be taken by the controller 200 when other process parameters are detected to be too high or too low (eg, glucose, glutamine, glutamate, ammonia, lactate, and total cell density) are described above.

[0088] Uma segunda bomba de alimentação pode ser adicionada para adicionar glicose, lactose, glutamina, glutamato, etc. Em uma modalidade alternativa ou além disso, a sangria pode ser ajustada para reagir ao aumento de amônia removendo também as células.[0088] A second feed pump can be added to add glucose, lactose, glutamine, glutamate, etc. In an alternative embodiment or in addition, the bleed can be adjusted to react to the increased ammonia by also removing the cells.

[0089] O controlador 200 pode ser disposto em um sistema de computador sem cabeça (por exemplo, um sistema sem monitor, teclado e mouse). Assim, o controlador 200 pode estar localizado em um servidor controlado por uma conexão de rede ou alguma outra conexão, como, por exemplo, uma conexão serial. O controlador 200 pode ser clonado em um ou mais servidores redundantes em caso de falha de um ou mais servidores.[0089] The controller 200 may be arranged in a headless computer system (eg, a system without a monitor, keyboard, and mouse). Thus, controller 200 may be located on a server controlled by a network connection or some other connection, such as a serial connection. Controller 200 can be cloned to one or more redundant servers in the event of a failure of one or more servers.

[0090] O controlador 200 pode ser configurado para aplicar a filtragem de Kalman, por exemplo, estimativa quadrática linear (LQE) aos dados espectrais de Raman da sonda Raman 18. A filtragem de Kalman pode incluir aplicar um algoritmo aos dados espectrais que usa uma série de medições ao longo do tempo para produzir estimativas de variáveis desconhecidas que tendem a ser mais precisas do que aquelas baseadas apenas em uma única medição. Assim, os parâmetros de processo determinados podem ser baseados em modelos filtrados. É contemplado que outros tipos de filtragem também possam ser utilizados pelo controlador 200 para processar os dados espectrais da sonda Raman 18.[0090] The controller 200 can be configured to apply Kalman filtering, for example linear quadratic estimation (LQE) to the Raman spectral data from Raman probe 18. The Kalman filtering can include applying an algorithm to the spectral data that uses a series of measurements over time to produce estimates of unknown variables that tend to be more accurate than those based on a single measurement alone. Thus, the determined process parameters can be based on filtered models. It is contemplated that other types of filtering may also be used by the controller 200 to process the spectral data from the Raman probe 18.

[0091] O controlador 200 pode incluir ou pode ser de outro modo acoplado a um historiador de PI (informações de processo). O historiador de PI pode ser um aplicativo com um banco de dados de séries temporais que pode registrar dados de sistemas de controle de processos. O historiador de PI pode permitir que os usuários registrem, analisem e monitorem informações em tempo real. O controlador 200 pode armazenar, por exemplo, valores de peso da balança 110, dados espectrais da sonda Raman 18 e taxas de bomba da bomba de alimentação 30, bomba de sangria 40 e bomba de colheita 50, no historiador de PI.[0091] Controller 200 may include or may otherwise be coupled with a PI historian (process information). The PI Historian can be an application with a time series database that can record data from process control systems. IP Historian can allow users to record, analyze and monitor information in real time. Controller 200 may store, for example, weight values from scale 110, spectral data from Raman probe 18, and pump rates from feed pump 30, bleed pump 40, and harvest pump 50, in the PI historian.

[0092] A FIG. 3 ilustra um método 300 de acordo com a divulgação. Uma ou mais etapas do método 300 podem ser executadas fora de ordem, executadas simultaneamente com outras etapas ou totalmente eliminadas. O método 300 pode começar na etapa 302, onde o sistema de biorreator 1 pode ser montado e a cultura celular 2 pode ser fornecida dentro do tanque de biorreator 10 e inoculada com uma linha celular. O método 300 pode então prosseguir para a etapa 304, onde os parâmetros do processo da cultura celular 2 são medidos dentro do biorreator pela sonda Raman 18 e/ou por sensores adicionais ou outros. Os parâmetros do processo podem incluir qualquer um dos parâmetros mencionados acima determinados a partir dos dados espectrais Raman obtidos pela sonda Raman 18. O método 300 pode prosseguir para a etapa 306, onde um peso do tanque de biorreator 10 (incluindo a cultura celular 2 dentro) é medido pela balança 110 e fornecida ao processador 200.[0092] FIG. 3 illustrates a method 300 in accordance with the disclosure. One or more steps of method 300 may be performed out of order, performed concurrently with other steps, or eliminated entirely. Method 300 may begin at step 302, where the bioreactor system 1 may be assembled and the cell culture 2 may be fed into the bioreactor tank 10 and inoculated with a cell line. Method 300 may then proceed to step 304, where the cell culture 2 process parameters are measured within the bioreactor by the Raman probe 18 and/or by additional sensors or otherwise. The process parameters may include any of the aforementioned parameters determined from the Raman spectral data obtained by the Raman probe 18. The method 300 may proceed to step 306, where a weight of the bioreactor tank 10 (including the cell culture 2 within ) is measured by scale 110 and fed to processor 200.

[0093] Da etapa 306, o método 300 pode prosseguir para a etapa 308, em que o meio gasto sem células da cultura celular 2 é removido a uma primeira taxa especificada, ativando a bomba 70 para retirar a cultura celular (meio mais células) do tanque de biorreator 10 via conduto 20, e também ativando a bomba de colheita 50 para retirar a solução do sistema de filtro 100. Da etapa 308, o método 300 pode prosseguir para a etapa 310, onde as células podem ser removidas da cultura celular usando o conduto de saída 22 a uma segunda taxa especificada pela bomba de sangria 40. Da etapa 310, o método 300 pode prosseguir para a etapa 312, em que um ou ambos os meios e nutrientes frescos podem ser introduzidos na cultura celular a uma terceira taxa especificada usando um conduto de entrada e bomba de alimentação 30 de uma maneira que mantém a entrada total de meios e nutrientes iguais à produção combinada da bomba de sangria 40 e da bomba de colheita 50. Uma taxa especificada pode ser um ponto de ajuste ou faixa de taxas nas quais uma bomba é operada e/ou mantida. As taxas especificadas podem ser determinadas pelo controlador 200.[0093] From step 306, method 300 may proceed to step 308, where spent cell-free medium from cell culture 2 is removed at a first specified rate, activating pump 70 to withdraw cell culture (medium plus cells) from the bioreactor tank 10 via conduit 20, and also activating the harvest pump 50 to withdraw the solution from the filter system 100. From step 308, method 300 may proceed to step 310, where cells may be removed from cell culture using outlet conduit 22 at a second rate specified by bleed pump 40. From step 310, method 300 may proceed to step 312, where one or both of the fresh media and nutrients may be introduced to the cell culture at a third specified rate using an inlet conduit and feed pump 30 in a manner that keeps the total input of media and nutrients equal to the combined output of the bleed pump 40 and harvest pump 50. A specified rate may be a set point or range of rates at which a pump is operated and/or maintained. The specified rates may be determined by the controller 200.

[0094] É contemplado que cada uma das etapas 302 a 312 pode ocorrer em qualquer ordem e, em alguns casos, pode ocorrer simultaneamente em tempo real por meio de vários circuito de retroalimentação executados pelo controlador 200.[0094] It is contemplated that each of the steps 302 to 312 can occur in any order and, in some cases, can occur simultaneously in real time through several feedback loops executed by the controller 200.

[0095] As etapas 308, 310 e 312 podem ser controladas pelo controlador 200 com base nos dados recebidos da sonda Raman 18 na etapa 304 e da balança 110 na etapa 306. O peso do tanque de biorreator 10 (mais a cultura celular 2 nele contida) pode ser controlado através de um circuito PID (derivado proporcional integral). Além disso, o controlador 200 pode ser configurado para analisar os espectros Raman obtidos da sonda Raman 18 para determinar um ou mais parâmetros do processo, incluindo, por exemplo, concentração de glicose, concentração de glutamina, concentração de glutamato, concentração de amônia, concentração de lactato, densidade celular total e densidade celular viável. Cada uma dessas variáveis também pode ser controlada por um circuito de retroalimentação negativo.[0095] Steps 308, 310 and 312 can be controlled by the controller 200 based on data received from the Raman probe 18 in step 304 and from the scale 110 in step 306. The weight of the bioreactor tank 10 (plus the cell culture 2 in it contained) can be controlled via a PID (proportional integral derivative) circuit. Additionally, controller 200 can be configured to analyze Raman spectra obtained from Raman probe 18 to determine one or more process parameters, including, for example, glucose concentration, glutamine concentration, glutamate concentration, ammonia concentration, of lactate, total cell density and viable cell density. Each of these variables can also be controlled by a negative feedback loop.

[0096] Exemplos da presente divulgação podem fornecer soluções elegantes, flexíveis e baratas para as soluções de controle existentes e podem ter relativamente poucas lacunas de dados. As estratégias de controle da presente divulgação podem exibir controle consistente do nível de biorreator. Por exemplo, a variação do nível foi reduzida de +/- 0,5 L/dia para +/- 0,01 L/dia usando os sistemas de controle da presente divulgação. Também foram alcançadas melhorias na variação de peso, por exemplo, uma redução de 5-10% da variação de peso usando outros sistemas, como calibração volumétrica, para erro de 0,1-0,5%, usando os sistemas de controle aqui divulgados. A melhoria pode ser pelo menos em parte devido à alteração do sistema de uma calibração volumétrica de bombas para uma versão controlada por software com base no peso e outros parâmetros. Além disso, os sistemas de controle da presente divulgação podem ser totalmente integrados aos alarmes de informações do processo (PI) (por exemplo, alertas por e-mail) e podem ser acessados e encerrados remotamente. Além disso, os sistemas e métodos da presente divulgação podem fornecer resultados mais repetíveis e confiáveis do que sistemas e métodos anteriores.[0096] Examples of the present disclosure can provide elegant, flexible and inexpensive solutions to existing control solutions and can have relatively few data gaps. The control strategies of the present disclosure can exhibit consistent control of the bioreactor level. For example, the level variation was reduced from +/- 0.5 L/day to +/- 0.01 L/day using the control systems of the present disclosure. Improvements in weight variation have also been achieved, for example a 5-10% reduction in weight variation using other systems such as volumetric calibration to 0.1-0.5% error using the control systems disclosed here . The improvement may be at least in part due to changing the system from a volumetric calibration of pumps to a software-controlled version based on weight and other parameters. Furthermore, the control systems of the present disclosure can be fully integrated with process information (PI) alarms (e.g., email alerts) and can be remotely accessed and terminated. Furthermore, the systems and methods of the present disclosure may provide more repeatable and reliable results than prior systems and methods.

[0097] Exemplo 1 (FIGS. 4 e 5)[0097] Example 1 (FIGS. 4 and 5)

[0098] As experiências descritas no Exemplo 1 comparam um biorreator de perfusão com um biorreator em lote alimentado e mostram maiores concentrações viáveis de células atingidas e produtividade específica da célula no biorreator de perfusão versus o biorreator em lote alimentado.[0098] The experiments described in Example 1 compare a perfusion bioreactor with a fed batch bioreactor and show greater viable concentrations of targeted cells and cell-specific productivity in the perfusion bioreactor versus the fed batch bioreactor.

[0099] Em uma experiência, um biorreator com capacidade de 15 L foi cultivado usando linhagens celulares e meio. Os pontos de ajuste do biorreator incluíram temperatura (35,5 graus Celsius), agitação (250RPM), pH (controlado usando CO2 e bicarbonato de sódio) (de 6,85 a 7,15) e volume de trabalho (11L). Um Dispositivo de Retenção de Células ATF4, equipado com um filtro de fibra oca de 0,2 μm, foi acoplado ao biorreator. O filtro de fibra oca reteve as células, mas permitia a passagem de proteínas e nutrientes. Dois volumes do reator (ou 22 L de meio) foram passados através do filtro a cada 24 horas.[0099] In one experiment, a bioreactor with a capacity of 15 L was grown using cell lines and medium. Bioreactor setpoints included temperature (35.5 degrees Celsius), agitation (250RPM), pH (controlled using CO2 and sodium bicarbonate) (from 6.85 to 7.15), and working volume (11L). An ATF4 Cell Retention Device, equipped with a 0.2 μm hollow fiber filter, was attached to the bioreactor. The hollow fiber filter retained the cells but allowed proteins and nutrients to pass through. Two reactor volumes (or 22 L of medium) were passed through the filter every 24 hours.

[0100] O biorreator e o ATF foram posicionados em uma balança. O peso do biorreator, da cultura celular e do ATF foram transmitidos via conexão Ethernet a um computador executando um software de controle. O peso foi comparado com um ponto de ajuste (11,0 kg, por exemplo, o volume de trabalho do biorreator) e um controlador PID (projetado no MATLAB, mas executado através do software de controle SynTQ) determinou se era necessário ou não acionar uma bomba de alimentação. Uma bomba de colheita foi ajustada a uma taxa constante equivalente à taxa de perfusão desejada (dois volumes de reator por dia). A bomba de alimentação e a bomba de perfusão foram controladas automaticamente usando o software SynTQ, que transmitia um sinal OPC para um servidor Kepware. O servidor Kepware transmitiu esse sinal através de uma conexão Ethernet para um módulo de saída analógica MODBUS, que converteu o valor digital em uma saída física em miliamperes entre 4 e 20 mA.[0100] The bioreactor and the ATF were positioned on a scale. The weight of the bioreactor, cell culture and ATF were transmitted via Ethernet connection to a computer running control software. The weight was compared with a setpoint (11.0 kg, for example, the working volume of the bioreactor) and a PID controller (designed in MATLAB, but executed through the SynTQ control software) determined whether or not it was necessary to trigger a feed pump. A harvest pump was set at a constant rate equivalent to the desired perfusion rate (two reactor volumes per day). The feeding pump and perfusion pump were automatically controlled using SynTQ software, which transmitted an OPC signal to a Kepware server. The Kepware server transmitted this signal through an Ethernet connection to a MODBUS analog output module, which converted the digital value into a physical output in milliamps between 4 and 20 mA.

[0101] Usando este sistema, o peso do biorreator pode ser controlado dentro de 10 g do peso inicial de 11 kg (0,09%). Antes deste sistema ser implementado, não era possível controlar o peso do biorreator dentro de mais de 0,5 kg (4,54%) durante a noite no biorreator. Dentro do mesmo sistema, uma sonda Kaiser Optical Raman foi usada para capturar os espectros Raman da cultura celular. O controlador utilizou modelos que foram desenvolvidos em lotes anteriores para prever a contagem de células, glicose, lactato, amônia e outras concentrações de nutrientes. A sonda RAMAN captura milhares de espectros diferentes que são analisados em um programa de computador, por exemplo, SIMCA. Usando a análise de múltiplos componentes e dados offline para o parâmetro fornecido, o programa cria um modelo em todas as leituras da sonda. Esse modelo SIMCA é carregado no SynTQ e é acessado em tempo real toda vez que a sonda faz uma leitura (por exemplo, a cada 15 minutos a 45 minutos).[0101] Using this system, the weight of the bioreactor can be controlled within 10 g of the initial weight of 11 kg (0.09%). Before this system was implemented, it was not possible to control the weight of the bioreactor within more than 0.5 kg (4.54%) overnight in the bioreactor. Within the same system, a Kaiser Optical Raman probe was used to capture Raman spectra from the cell culture. The controller used models that were developed in previous batches to predict cell counts, glucose, lactate, ammonia and other nutrient concentrations. The RAMAN probe captures thousands of different spectra that are analyzed in a computer program, for example SIMCA. Using multi-component analysis and offline data for the given parameter, the program creates a model across all probe readings. This SIMCA model is loaded into SynTQ and accessed in real time every time the probe takes a reading (eg every 15 minutes to 45 minutes).

[0102] O controle de vários nutrientes com a sonda Raman permite maior produtividade das linhagens celulares, maior viabilidade em cultura celular de longo prazo e melhor qualidade de múltiplos aspectos da proteína.[0102] The control of various nutrients with the Raman probe allows for greater productivity of cell lines, greater viability in long-term cell culture and better quality of multiple aspects of the protein.

[0103] A FIG. 4 ilustra que a concentração celular máxima viável em um biorreator de perfusão (Anexo "Ex." 1) de acordo com a divulgação no dia 37 de um lote, que é aproximadamente o dobro da concentração celular viável máxima de um reator em lote alimentado de tamanho equivalente no dia sete de um lote (Ex. 2). O fato de que a concentração máxima viável de células foi alcançada no dia 37 (em oposição ao dia 6 no biorreator em lote alimentado) mostra a robustez e a longevidade do processo de biorreator de perfusão.[0103] FIG. 4 illustrates that the maximum viable cell concentration in a perfusion bioreactor (Annex "Ex." 1) according to the disclosure on day 37 of a batch, which is approximately twice the maximum viable cell concentration of a batch reactor fed from equivalent size on day seven of a batch (Ex. 2). The fact that the maximum viable cell concentration was reached on day 37 (as opposed to day 6 in the fed batch bioreactor) shows the robustness and longevity of the perfusion bioreactor process.

[0104] A FIG. 5 mostra a produtividade específica da célula (cSP) para os dias 12 a 25 de um processo em lote de perfusão (Ex. 1) contra o cSP nos dias 1 a 12 de um processo em lote alimentado (Ex. 2). Produtividades semelhantes foram alcançadas nos dias 25-37 do lote de perfusão.[0104] FIG. 5 shows cell specific productivity (cSP) for days 12 to 25 of a perfusion batch process (Ex. 1) against cSP on days 1 to 12 of a fed batch process (Ex. 2). Similar productivities were achieved on days 25-37 of the infusion batch.

[0105] Foi necessária uma taxa de perfusão de três volumes de reator por dia para aumentar o VCC além de 50x106 células/mL em um lote de perfusão, o que pode ser comercialmente proibitivo em muitos casos.[0105] A perfusion rate of three reactor volumes per day was required to increase the VCC beyond 50x106 cells/mL in a perfusion batch, which can be commercially prohibitive in many cases.

[0106] A otimização média usando uma estratégia "empurrar para baixo" deve diminuir a taxa de perfusão necessária. Por exemplo, as células podem crescer para 20 x106 células/mL e mantidas em estado estacionário. A taxa de perfusão pode ser ajustada para dois volumes de reator/dia por cinco dias. No quinto dia, a taxa de perfusão pode ser reduzida para 1,5 volumes de reator/dia. Se as células forem mantidas, a taxa de perfusão pode ser reduzida para um volume de reator/dia após 5 dias. Quando as células começam a morrer, a análise de aminoácidos ou outra análise pode ser usada para determinar como fortalecer melhor o meio, por exemplo, suplementar com nutrientes ou ajustar a concentração de nutrientes nos meios. Em um exemplo não limitativo, a estratégia é descrita em “The Push to Low Approach for Optimization of High Density Perfusion Cultures of Animal Cells” by Bayer et al. Adv. BioChem. Engin. /Biotechnol. 2006, 101:75-98.[0106] Medium optimization using a "push down" strategy should decrease the required perfusion rate. For example, cells can be grown to 20 x10 6 cells/ml and maintained at steady state. The perfusion rate can be adjusted to two reactor volumes/day for five days. On the fifth day, the perfusion rate can be reduced to 1.5 reactor volumes/day. If cells are maintained, the perfusion rate can be reduced to one reactor volume/day after 5 days. When cells begin to die, amino acid analysis or other analysis can be used to determine how best to fortify the medium, for example supplementing with nutrients or adjusting nutrient concentration in the media. In a non-limiting example, the strategy is described in “The Push to Low Approach for Optimization of High Density Perfusion Cultures of Animal Cells” by Bayer et al. Adv. BioChem. Engin. /Biotechnol. 2006, 101:75-98.

[0107] Os dados NOVA Flex podem ser obtidos, onde uma leitura offline é feita analisando uma amostra. Usando dados NOVA anteriores, um modelo RAMAN pode ser construído e, nesse ponto, uma sonda pode ser colocada no reator e o modelo pode fornecer dados VCC a cada 15 a 45 minutos, a cada segundo, a cada minuto, a cada 2 minutos, a cada 3 minutos, a cada 4 minutos, a cada 5 minutos, a cada 10 minutos, a cada 15 minutos, a cada 20 minutos, a cada 25 minutos, a cada 30 minutos, a cada 35 minutos, a cada 40 minutos, a cada 45 minutos, a cada 50 minutos, a cada 55 minutos, a cada hora, a cada 2 horas, a cada 3 horas, a cada 4 horas, a cada 5 horas ou a cada 6 horas, em vez de uma vez ao dia e exigindo amostragem manual como no NOVA. A FIG. 5 mostra o dia 20 de uma execução. Os primeiros 20 dias da execução foram usados para coletar dados NOVA, que foram usados para criar um modelo RAMAN para partes posteriores da execução.[0107] NOVA Flex data can be obtained, where an offline reading is taken by analyzing a sample. Using previous NOVA data, a RAMAN model can be built, at which point a probe can be placed in the reactor and the model can provide VCC data every 15 to 45 minutes, every second, every minute, every 2 minutes, every 3 minutes every 4 minutes every 5 minutes every 10 minutes every 15 minutes every 20 minutes every 25 minutes every 30 minutes every 35 minutes every 40 minutes every 45 minutes, every 50 minutes, every 55 minutes, every hour, every 2 hours, every 3 hours, every 4 hours, every 5 hours, or every 6 hours instead of once a day and requiring manual sampling as in NOVA. FIG. 5 shows day 20 of a run. The first 20 days of the run were used to collect NOVA data, which was used to create a RAMAN model for later parts of the run.

[0108] Nos exemplos a seguir, os seguintes são intervalos gerais para determinados parâmetros do processo: pH:6,85-7,40, oxigênio dissolvido:30-60%, 3555%, 40-50% ou 45%, temperatura:34-37,5°C e agitação:150-300 RPM, 175-275 RPM, 200-250 RPM ou 225 RPM na bancada.[0108] In the examples below, the following are general ranges for certain process parameters: pH:6.85-7.40, dissolved oxygen:30-60%, 3555%, 40-50% or 45%, temperature: 34-37.5°C and agitation: 150-300 RPM, 175-275 RPM, 200-250 RPM or 225 RPM on the bench.

[0109] Exemplo 2 (FIGS. 6-8)[0109] Example 2 (FIGS. 6-8)

[0110] As experiências descritas no exemplo 2 mostram dados para um biorreator de perfusão sem controle do crescimento de VCC ou glicose. Observou-se que o VCC atingiu um pico no dia 7, quando as células cresceram rapidamente para uma grande densidade celular e depois diminuíram rapidamente até o dia 11, quando esgotaram os nutrientes no meio (FIG. 6). O controle somente de peso não foi suficiente para alcançar o estado estacionário do VCC.[0110] The experiments described in example 2 show data for a perfusion bioreactor without VCC or glucose growth control. It was observed that the VCC peaked on day 7, when the cells grew rapidly to a large cell density, and then rapidly decreased until day 11, when they depleted the nutrients in the medium (FIG. 6). Weight control alone was not sufficient to reach the VCC steady state.

[0111] A glicose também não foi controlada durante a execução da perfusão. Como a cultura dependia de glicose no meio durante a perfusão para alimentar as células, isso subsequentemente levou à morte celular durante a cultura. À medida que as células cresciam, a glicose declinava constantemente, embora o meio estivesse sendo constantemente alimentado (FIG. 7). O pico na detecção de glicose que ocorreu após o dia 10 foi devido à morte celular completa e, portanto, nenhum consumo de glicose, como pode ser visto ao monitorar a viabilidade celular, representada na FIG. 8.[0111] Glucose was also not controlled during the perfusion. As the culture relied on glucose in the medium during perfusion to feed the cells, this subsequently led to cell death during culture. As the cells grew, glucose steadily declined even though the medium was constantly being fed (FIG. 7). The spike in glucose detection that occurred after day 10 was due to complete cell death and therefore no glucose consumption, as seen by monitoring cell viability, depicted in FIG. 8.

[0112] Nesta experiência, um biorreator de bancada de 15 L foi inoculado com uma dada concentração de células de ovário de hamster chinês (CHO) que produzem mAb1. As células foram cultivadas a um oxigênio dissolvido, temperatura, agitação e pH específicos que foram mantidos constantes durante a execução. As células também receberam meio fresco e nutrientes na forma de alimentação por perfusão a uma taxa de duas vezes o volume do reator por dia. O volume do reator foi mantido constante adicionando a mesma quantidade de alimentação ao reator que estava sendo removido no perfusado usando o sistema Repligen XCell ATF4. Isso foi obtido através do monitoramento do peso do sistema de biorreator e do uso de um sistema de controle de malha de feedback auxiliado por computador para manter um peso dentro de 0,05 kg de um determinado peso alvo. Nem o controle RAMAN nem o controle de sangria foram fornecidos para controlar o VCC ou qualquer outro parâmetro do biorreator durante essa execução de produção de perfusão.[0112] In this experiment, a 15 L benchtop bioreactor was inoculated with a given concentration of Chinese hamster ovary (CHO) cells producing mAb1. Cells were cultured at a specific dissolved oxygen, temperature, agitation, and pH that were held constant during the run. The cells also received fresh medium and nutrients in the form of perfusion feed at a rate of twice the reactor volume per day. The reactor volume was kept constant by adding the same amount of feed to the reactor that was being removed in the perfusate using the Repligen XCell ATF4 system. This was achieved by monitoring the weight of the bioreactor system and using a computer-aided feedback loop control system to maintain a weight within 0.05 kg of a given target weight. Neither the RAMAN control nor the bleed control were provided to control the VCC or any other bioreactor parameter during this perfusion production run.

[0113] Em uma experiência análoga (não representada nas figuras), em que a taxa de fluxo também foi ajustada para dois biorreatores por dia, com alimentação de meio, mas o peso não foi monitorado, a variabilidade das bombas não pôde ser adequadamente controlada.[0113] In a similar experiment (not shown in the figures), in which the flow rate was also adjusted for two bioreactors per day, with medium feeding, but the weight was not monitored, the variability of the pumps could not be adequately controlled .

[0114] Nesta experiência de perfusão análoga, a bomba de alimentação e a bomba de perfusão foram ajustadas para taxas de fluxo equivalentes (determinadas pela calibração volumétrica das bombas). Esse método não podia fornecer taxas de fluxo que fossem precisas o suficiente para se combinarem e, durante a noite (por exemplo, um período em que o biorreator não era monitorado ativamente), a bomba de alimentação adicionou mais meio ao reator do que a bomba de perfusão foi capaz de remover. Isso resultou no transbordamento do reator e subsequente perda da cultura.[0114] In this analogous perfusion experiment, the feeding pump and the perfusion pump were set to equivalent flow rates (determined by the volumetric calibration of the pumps). This method could not provide flow rates that were accurate enough to match, and during the night (for example, a period when the bioreactor was not actively monitored), the feed pump added more medium to the reactor than the feed pump. of perfusion was able to remove. This resulted in reactor overflow and subsequent loss of culture.

[0115] Exemplo 3 (FIGS. 9-12)[0115] Example 3 (FIGS. 9-12)

[0116] A experiência descrita no exemplo 3 mostra dados para um biorreator de perfusão com controle VCC. O controle VCC (FIG. 9) levou a um estado estável consistente de viabilidade (FIG. 10), produção de proteínas (FIG. 11) e nutrientes (FIG. 12).[0116] The experiment described in example 3 shows data for a perfusion bioreactor with VCC control. The VCC control (FIG. 9) led to a consistent steady state of viability (FIG. 10), protein (FIG. 11) and nutrient production (FIG. 12).

[0117] Nesta experiência, um biorreator de bancada de 15 L foi inoculado com uma dada concentração de células CHO que produzem mAb2. As células foram cultivadas a um oxigênio dissolvido, temperatura, agitação e pH específicos que foram mantidos constantes durante a execução. As células também receberam meio fresco e nutrientes na forma de alimentação por perfusão a uma taxa de duas vezes o volume do reator por dia. O volume do reator foi mantido constante adicionando a mesma quantidade de alimentação ao reator que estava sendo removido no perfusado usando o sistema ATF4. Isso foi obtido monitorando o peso do sistema e usando um sistema de controle por computador para manter um peso dentro de mais ou menos 0,05 kg de um determinado alvo. O controle RAMAN não foi utilizado para esta execução e a taxa de sangria da bomba foi definida manualmente após a amostragem do VCC. Esse processo exigiu várias amostras e a taxa de sangria teve que ser ajustada várias vezes ao dia.[0117] In this experiment, a 15 L benchtop bioreactor was inoculated with a given concentration of CHO cells producing mAb2. Cells were cultured at a specific dissolved oxygen, temperature, agitation, and pH that were held constant during the run. The cells also received fresh medium and nutrients in the form of perfusion feed at a rate of twice the reactor volume per day. The reactor volume was kept constant by adding the same amount of feed to the reactor that was being removed in the perfusate using the ATF4 system. This was achieved by monitoring the weight of the system and using a computer control system to maintain a weight within plus or minus 0.05 kg of a given target. The RAMAN control was not used for this run and the pump bleed rate was set manually after sampling the VCC. This process required multiple samples and the bleed rate had to be adjusted several times a day.

[0118] O VCC foi controlado durante a cultura de produção de perfusão, com um VCC alvo de 42,5x106 células/mL (40-45x106 células/mL). Consequentemente, se o VCC subir acima do objetivo, a taxa de sangria aumentará e se o VCC cair abaixo do objetivo, a taxa de sangria diminuirá.[0118] The VCC was controlled during perfusion production culture, with a target VCC of 42.5x106 cells/ml (40-45x106 cells/ml). Consequently, if the VCC rises above the target, the bleed rate will increase, and if the VCC falls below the target, the bleed rate will decrease.

[0119] Exemplo 4 (FIGS. 13 e 14)[0119] Example 4 (FIGS. 13 and 14)

[0120] As experiências neste exemplo comparam um método de cultura de perfusão (FIG. 14) com um método de cultura em lote alimentado (FIG. 13). O método de cultura de perfusão foi capaz de atingir uma contagem máxima de células aproximadamente quatro vezes em comparação com um método de cultura celular em lote alimentado para a mesma proteína em condições análogas (FIG. 13). A cultura em lote alimentado foi realizada na balança piloto, enquanto a experiência de perfusão ocorreu na balança de bancada (15L). A estratégia de agitação e aeração foi reduzida para a balança de bancada usando uma abordagem de potência por unidade de volume para estratégia de agitação e combinação de volume por volume para aeração.[0120] The experiments in this example compare a perfusion culture method (FIG. 14) with a fed-batch culture method (FIG. 13). The perfusion culture method was able to achieve a maximum cell count approximately four times compared to a batch cell culture method fed the same protein under analogous conditions (FIG. 13). The fed-batch culture was performed on the pilot scale, while the perfusion experiment took place on the bench scale (15L). The agitation and aeration strategy was reduced to the bench scale using a power per unit volume approach to agitation strategy and volume-by-volume combination to aeration.

[0121] O método de cultura de perfusão foi capaz de produzir 3,5 vezes a quantidade de proteína em comparação com a produzida no reator em lote alimentado na mesma quantidade de tempo (FIG. 14).[0121] The perfusion culture method was able to produce 3.5 times the amount of protein compared to that produced in the batch reactor fed in the same amount of time (FIG. 14).

[0122] Um método de cultura de perfusão foi realizado fornecendo um biorreator de bancada de 15 L inoculado com uma dada concentração de células CHO produzindo mAb2 (Exs. 5 e 7). As células foram cultivadas a um oxigênio dissolvido, temperatura, agitação e pH específicos que foram mantidos constantes durante a execução. As células também receberam meio fresco e nutrientes na forma de alimentação por perfusão a uma taxa de duas vezes o volume do reator por dia. O meio nesta execução foi suplementado com concentrações aumentadas de nutrientes vitais, em comparação com as experiências anteriores, para que as células pudessem ser empurradas para densidades celulares mais altas durante uma execução de perfusão. O volume do reator foi mantido constante usando o sistema de controle de peso para manter um peso dentro de 0,05 kg de um determinado alvo. Nem o controle RAMAN nem nenhum controle de sangria foi fornecido durante a execução da produção de perfusão.[0122] A perfusion culture method was performed by supplying a 15 L benchtop bioreactor inoculated with a given concentration of CHO cells producing mAb2 (Exs. 5 and 7). Cells were cultured at a specific dissolved oxygen, temperature, agitation, and pH that were held constant during the run. The cells also received fresh medium and nutrients in the form of perfusion feed at a rate of twice the reactor volume per day. The medium in this run was supplemented with increased concentrations of vital nutrients compared to previous experiments so that cells could be pushed to higher cell densities during a perfusion run. The reactor volume was held constant using the weight control system to maintain a weight within 0.05 kg of a given target. Neither the RAMAN control nor any bleed control was provided while running the perfusion production.

[0123] A cultura celular em lote alimentado (Exs. 6 e 8) foi realizada em condições análogas (oxigênio dissolvido, temperatura, agitação e pH).[0123] Cell culture in fed batch (Exs. 6 and 8) was performed under similar conditions (dissolved oxygen, temperature, agitation and pH).

[0124] Exemplo 5 (FIGS. 15-18)[0124] Example 5 (FIGS. 15-18)

[0125] A experiência descrita nas FIGS. 15-18 mostra os resultados benéficos de viabilidade, glicose e título, bem como VCC, mantidos em estado estacionário por mais de 30 dias com este sistema de perfusão (ver, por exemplo, FIGS. 15-18).[0125] The experiment described in FIGS. 15-18 show the beneficial results of viability, glucose and titer, as well as VCC, maintained at steady state for more than 30 days with this perfusion system (see, for example, FIGS. 15-18).

[0126] Um método de cultura de perfusão com RAMAN, sangria e controle de peso foi realizado fornecendo um biorreator de bancada de 15 L inoculado com uma dada concentração de células CHO que produzem mAb2. As células foram cultivadas a um oxigênio dissolvido, temperatura, agitação e faixa de pH específicos que foram mantidos constantes durante a execução. As células também receberam meio fresco e nutrientes na forma de alimentação por perfusão a uma taxa de duas vezes o volume do reator por dia. O meio nesta execução foi suplementado com concentrações aumentadas de nutrientes vitais (em comparação com os Exemplos 2 e 3) para que as células pudessem ser empurradas para densidades celulares mais altas. O volume do reator foi mantido constante usando um sistema de controle de peso para adicionar a mesma quantidade de alimentação ao reator que estava sendo removido no perfusado usando o sistema ATF4, monitorando o peso do sistema e usando um sistema de controle de feedback do computador para manter um peso dentro de mais ou menos 0,05 kg de um determinado alvo.[0126] A culture method of perfusion with RAMAN, bleeding and weight control was performed by supplying a 15 L benchtop bioreactor inoculated with a given concentration of CHO cells producing mAb2. Cells were cultured at a specific dissolved oxygen, temperature, agitation, and pH range that were held constant during the run. The cells also received fresh medium and nutrients in the form of perfusion feed at a rate of twice the reactor volume per day. The medium in this run was supplemented with increased concentrations of vital nutrients (compared to Examples 2 and 3) so that the cells could be pushed to higher cell densities. The reactor volume was kept constant using a weight control system to add the same amount of feed to the reactor that was being removed in the perfusate using the ATF4 system, monitoring the weight of the system and using a computer feedback control system to maintain a weight within plus or minus 0.05 kg of a given target.

[0127] O controle RAMAN e o controle automatizado de sangria com base na retroalimentação RAMAN foram usados para controlar o VCC nesta execução (FIG. 15). Em uma primeira experiência (Ex. 9), a estratégia de sangria RAMAN foi definida para manter um VCC de 40x106 células/mL. A faixa do VCC foi de 35-45x106 células/mL, um pouco maior do que o alvo que ocorreu com a sangria manual na experiência anterior (Exemplo 3). No entanto, o sistema foi amostrado apenas uma vez por dia e não foram necessários ajustes nessa execução de perfusão (em comparação com várias vezes ao dia com vários ajustes com a sangria manual descrita no Exemplo 3).[0127] The RAMAN control and the automated bleed control based on the RAMAN feedback were used to control the VCC in this execution (FIG. 15). In a first experiment (Ex. 9), the RAMAN bleed strategy was set to maintain a VCC of 40x106 cells/mL. The VCC range was 35-45x106 cells/mL, slightly higher than the target that occurred with manual bleeding in the previous experiment (Example 3). However, the system was only sampled once a day and no adjustments were required in this perfusion run (compared to multiple times a day with multiple adjustments with the manual bleed described in Example 3).

[0128] Em uma segunda experiência (Ex. 10), as condições eram análogas à primeira experiência, exceto que o VCC foi estabelecido em 10x106 células/mL com uma taxa de perfusão de um volume de reator por dia.[0128] In a second experiment (Ex. 10), the conditions were analogous to the first experiment, except that the VCC was set at 10x106 cells/mL with a perfusion rate of one reactor volume per day.

[0129] Exemplo 6 (FIGS. 19 e 20)[0129] Example 6 (FIGS. 19 and 20)

[0130] Em uma experiência, três biorreatores diferentes foram cultivados usando linhagens de células e meio. A capacidade dos biorreatores era:3L (Ex. 11), 15L (Ex. 12) e 50L (Ex. 13) (biorreator de uso único). Os pontos de ajuste do biorreator incluíram temperatura (35,5 graus Celsius), agitação (250RPM), pH (controlado usando CO2 e bicarbonato de sódio) (de 6,85 a 7,15) e volume de trabalho (2L, 10L, 35L, respectivamente). Todos esses parâmetros foram mantidos constantes durante a execução. Cada biorreator foi acoplado a um dispositivo de retenção de células ATF (ATF2, ATF4, ATF6, respectivamente) equipado com filtro de 0,2 mícron. O filtro de fibra oca reteve as células, mas permitiu que a proteína passasse após 24 horas.[0130] In one experiment, three different bioreactors were grown using cell lines and medium. The capacity of the bioreactors was: 3L (Ex. 11), 15L (Ex. 12) and 50L (Ex. 13) (single-use bioreactor). Bioreactor setpoints included temperature (35.5 degrees Celsius), agitation (250RPM), pH (controlled using CO2 and sodium bicarbonate) (from 6.85 to 7.15) and working volume (2L, 10L, 35L, respectively). All these parameters were kept constant during execution. Each bioreactor was coupled to an ATF cell retention device (ATF2, ATF4, ATF6, respectively) equipped with a 0.2 micron filter. The hollow fiber filter retained the cells but allowed the protein to pass after 24 hours.

[0131] Uma cultura de perfusão foi realizada em cada sistema usando RAMAN, sangria e controle de peso nas três balanças. Como no Exemplo 5, o meio nesta experiência foi suplementado com nutrientes extras. O peso dentro de cada sistema foi controlado para:+/- 0,05 kg no ATF4 e ATF6 e +/- 1 kg (devido a limitações de equipamento da própria balança) de um determinado alvo.[0131] A perfusion culture was performed on each system using RAMAN, bleeding and weight control on the three scales. As in Example 5, the medium in this experiment was supplemented with extra nutrients. The weight within each system was controlled to: +/- 0.05 kg on ATF4 and ATF6 and +/- 1 kg (due to equipment limitations of the scale itself) of a given target.

[0132] O controle RAMAN e o controle automatizado de sangria com base no feedback RAMAN foram usados para definir o VCC nesta execução (FIG. 19) para 40x10A6 células/mL. A variabilidade da sonda RAMAN foi observada no sistema 50L ATF6, o que é esperado, uma vez que o modelo de controle RAMAN ainda não havia sido otimizado para a grande balança.[0132] The RAMAN control and the automated bleed control based on the RAMAN feedback were used to set the VCC in this run (FIG. 19) to 40x10A6 cells/mL. RAMAN probe variability was observed in the 50L ATF6 system, which is expected since the RAMAN control model had not yet been optimized for the large balance.

[0133] Nas três execuções, a taxa de perfusão foi ajustada entre 1,8 e 2 RV/dia, e todos os parâmetros de expansão foram ajustados usando métodos tradicionais.[0133] In the three runs, the perfusion rate was adjusted between 1.8 and 2 RV/day, and all expansion parameters were adjusted using traditional methods.

[0134] Os resultados desta experiência foram que uma produtividade de proteína comparável (FIG. 20) foi alcançada nos três sistemas por um período de cinco dias.[0134] The results of this experiment were that comparable protein productivity (FIG. 20) was achieved in the three systems over a period of five days.

[0135] Exemplo 7 (FIG. 21)[0135] Example 7 (FIG. 21)

[0136] Em uma experiência, um biorreator único com foi cultivado usando linhagens celulares e meio. A capacidade do biorreator era de 15L (Ex. 14). Os pontos de ajuste do biorreator incluíram temperatura (35,5 graus Celsius), agitação (250RPM), pH (controlado usando CO2 e bicarbonato de sódio) (de 6,85 a 7,15). Todos esses parâmetros foram mantidos constantes durante a execução. O biorreator foi acoplado a um Dispositivo de Retenção de Células ATF4 equipado com filtro de 0,2 mícron. O filtro de fibra oca reteve as células, mas permitiu que a proteína passasse após 24 horas.[0136] In one experiment, a single bioreactor with was cultured using cell lines and medium. The capacity of the bioreactor was 15L (Ex. 14). Bioreactor setpoints included temperature (35.5 degrees Celsius), agitation (250RPM), pH (controlled using CO2 and sodium bicarbonate) (from 6.85 to 7.15). All these parameters were kept constant during execution. The bioreactor was coupled to an ATF4 Cell Retention Device equipped with a 0.2 micron filter. The hollow fiber filter retained the cells but allowed the protein to pass after 24 hours.

[0137] Uma cultura de perfusão foi realizada no sistema usando RAMAN, sangria e controle de peso. Como no Exemplo 5, o meio nesta experiência foi suplementado com nutrientes extras. O peso dentro de cada sistema foi controlado para:+/- 0,05 kg no ATF4 de um determinado alvo.[0137] A perfusion culture was performed on the system using RAMAN, bleeding and weight control. As in Example 5, the medium in this experiment was supplemented with extra nutrients. The weight within each system was controlled to: +/- 0.05 kg in the ATF4 of a given target.

[0138] O controle RAMAN e o controle automatizado de sangria com base no feedback RAMAN foram usados para definir o VCC nesta execução (ver FIG. 21) para 70x10A6 células/mL.[0138] The RAMAN control and the automated bleed control based on the RAMAN feedback were used to set the VCC in this run (see FIG. 21) to 70x10A6 cells/mL.

[0139] A taxa de perfusão nesta execução foi fixada em 2,5 RV/dia para suplementar as células extras em cultura e garantir que a depleção média não ocorra.[0139] The perfusion rate in this run was set at 2.5 RV/day to supplement the extra cells in culture and ensure that mean depletion does not occur.

[0140] O reator conseguiu manter um VCC acima de 70x10A6 células/mL por 7 dias antes que uma falha no equipamento levasse ao final do lote. Durante esse período, as viabilidades foram mantidas acima de 90%, indicando uma cultura saudável. Antes da implementação do sistema de controle desta divulgação, a produção sustentada em densidades tão altas não teria sido possível.[0140] The reactor managed to maintain a VCC above 70x10A6 cells/mL for 7 days before an equipment failure led to the end of the batch. During this period, viabilities were maintained above 90%, indicating a healthy culture. Prior to the implementation of this disclosure control system, sustained production at such high densities would not have been possible.

[0141] Notavelmente, a referência aqui a "uma modalidade" ou "uma modalidade" significa que um recurso, estrutura ou característica específica descrita em conexão com a modalidade pode ser incluída, empregada e/ou incorporada em uma, algumas ou todas as modalidades da presente divulgação. Os usos ou aparências da frase "em uma modalidade" ou "em outra modalidade" no relatório descritivo não se referem à mesma modalidade, nem são modalidades separadas ou alternativas necessariamente mutuamente exclusivas de uma ou mais outras modalidades, nem se limitam a uma única modalidade exclusiva. O mesmo se aplica aos termos "implementação" e "exemplo". A presente divulgação não se limita a nenhum aspecto único nem modalidade da mesma, nem a quaisquer combinações e/ou permutações de tais aspectos e/ou modalidades. Além disso, cada um dos aspectos da presente divulgação, e/ou modalidades da mesma, pode ser empregado sozinho ou em combinação com um ou mais dos outros aspectos da presente divulgação e/ou modalidades da mesma. Por uma questão de brevidade, certas permutações e combinações não são discutidas e/ou ilustradas separadamente na presente invenção.[0141] Notably, reference herein to "an embodiment" or "an embodiment" means that a specific feature, structure or characteristic described in connection with the embodiment may be included, employed and/or incorporated in one, some or all of the embodiments of this disclosure. Uses or appearances of the phrase "in one embodiment" or "in another embodiment" in the specification do not refer to the same embodiment, nor are they separate embodiments or necessarily mutually exclusive alternatives to one or more other embodiments, nor are they limited to a single embodiment exclusive. The same applies to the terms "implementation" and "example". The present disclosure is not limited to any single aspect or embodiment thereof, nor to any combinations and/or permutations of such aspects and/or embodiments. Furthermore, each of the aspects of the present disclosure, and/or embodiments thereof, may be employed alone or in combination with one or more of the other aspects of the present disclosure and/or embodiments thereof. For the sake of brevity, certain permutations and combinations are not discussed and/or illustrated separately in the present invention.

[0142] Além disso, como indicado acima, uma modalidade ou implementação aqui descrita como "exemplificativa" não deve ser interpretada como preferida ou vantajosa, por exemplo, em relação a outras modalidades ou implementações; em vez disso, pretende-se transmitir ou indicar que a modalidade ou modalidades são modalidade(s) de exemplo.[0142] Furthermore, as indicated above, an embodiment or implementation described herein as "exemplary" should not be construed as preferred or advantageous, for example, over other embodiments or implementations; rather, it is intended to convey or indicate that the embodiment or embodiments are exemplary embodiment(s).

Claims

1. Method for controlling a bioreactor system, characterized in that it comprises: providing a cell culture in a bioreactor, wherein conditions in the bioreactor allow the cell culture to produce a protein of interest (POI); measuring one or more process parameters (PPs) of the culture within the bioreactor by a RAMAN probe, wherein the process parameters are selected from the group consisting of nutrient concentration, viable cell concentration and protein attributes; measuring a weight of the bioreactor with the content of the cell culture; remove the cell-free spent medium from the cell culture using a first outlet conduit at a specified first rate. remove cells from the cell culture using a second output conduit at a second specified rate. introduce one or both of the fresh media or nutrients into the cell culture using an inlet conduit at a specified third rate; and wherein the inlet and outlet conduits are adjusted based on the RAMAN probe measurements and the bioreactor weight measurement to maintain (i) one or more of the process parameters within predetermined ranges, (ii) the weight of the bioreactor with the cell culture within a predetermined range and (iii) the third specified rate of the input conduit and the first and second specified rates of each of the output conduits within their respective predetermined ranges.

2. Method, according to claim 1, characterized by the fact that the measurement of one or more process parameters of the culture inside the bioreactor by RAMAN occurs at least once per hour.

3. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the method is configured to maintain the cell culture at an average viable cell concentration of at least 30 million cells per mL for 30 days at steady state.

4. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the bioreactor has a volume of at least 10 L and the method is configured to maintain the weight of the bioreactor and cell culture within a range of 20 g .

5. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the bioreactor has a volume of at least 10 L and the method is configured to maintain the weight of the bioreactor with the cell culture within 0.1% of the initial weight of the bioreactor with the cell culture.

6. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that when a process parameter deviates from a setpoint value within a respective desired range, one or more of removing cell-free medium, removing cells or introducing one or both of fresh media or nutrients is adjusted to decrease the drift.

7. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that at least two bioreactor volumes of spent medium are removed through the first outlet conduit per day.

8. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that up to three bioreactor volumes of spent medium are removed through the first outlet conduit per day.

9. Method according to any of the preceding claims, characterized in that the process parameters include the temperature of the cell culture and the pH of the cell culture, and the temperature is maintained between 35 and 36 degrees C and the pH is maintained between 6.85 and 7.15.

10. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the process parameters include cell-specific productivity, and the method is configured to maintain cells within cell culture at a cell-specific productivity of at least 15-25 pg/cell/day for at least 25-37 days.

11. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the process parameters include the glucose concentration and the method is configured to maintain a glucose concentration between about 5 mM to about 85 mM, or about 1 g/L to about 15.5 g/L.

12. Method according to any of the preceding claims, characterized in that the process parameters include the lactate concentration and the method is configured to maintain a lactate concentration of less than about 60 mM or less than about 6 g/L.

13. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the process parameters include ammonia concentration and the method is configured to maintain an ammonia concentration of less than about 15 mM.

14. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that each of removing the spent medium without cells, removing cells and introducing one or both of the fresh media or nutrients is controlled by a respective pump.

15. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the bioreactor includes a filter configured to retain cells and allow the passage of fluid.

16. Method according to claim 1, characterized in that it further comprises: adjusting at least one of the specified rates in response to a corresponding change in another of the specified rates to maintain a perfusion rate of the perfusion bioreactor at a point constant perfusion rate adjustment; wherein the perfusion rate defines a total flow rate through the perfusion bioreactor such that the total flow rate remains constant when at least one specified rate is adjusted.

17. Method according to claim 16, characterized in that the inlet and outlet conduits are adjusted based on measurements of the RAMAN probe and weight measurement of the perfusion bioreactor to maintain the perfusion rate of the perfusion bioreactor in the constant perfusion rate setpoint.

18. Method according to claim 1, characterized by the fact that a perfusion rate through the system is maintained at a certain set point and does not vary based on concentrations within the reactor.

19. Method, according to claim 1, characterized by the fact that a perfusion rate through the system is kept constant.

20. Method for controlling a bioreactor system, characterized in that it comprises: providing a cell culture in a bioreactor; measuring one or more process parameters of the cell culture within the bioreactor by a RAMAN probe; remove the cell-free spent medium from the cell culture using a first outlet conduit at a specified first rate. remove cells from the cell culture using a second output conduit at a second specified rate. introduce one or both of the fresh media or nutrients into the cell culture using an inlet conduit at a specified third rate; and changing one or more of the first specified rate, the second specified rate, or the third specified rate based on the RAMAN probe measurements.

21. Bioreactor culture system, characterized in that it comprises: a tank with an inlet conduit and at least one outlet conduit; at least one pump; a filter attached to the tank; a RAMAN probe attached to the tank; and a controller coupled to the at least one pump and the RAMAN probe, the controller being configured to control the at least one pump based on an input from the RAMAN probe.

22. Bioreactor culture system, characterized in that it comprises: a tank with an inlet conduit and at least one outlet conduit; at least one pump; a filter attached to the tank; a scale in contact with the tank; a RAMAN probe attached to the tank; and a controller coupled to at least one pump, the scale, and the RAMAN probe, the controller being configured to control the at least one pump based on an input from the RAMAN probe and an input from the scale.

23. Bioreactor culture system, characterized in that it comprises: a tank having an inlet conduit for connection to a first pump configured to control fluid delivery to the tank, a first outlet conduit for connection to a second pump configured to control the removal of fluid from the tank and a second outlet conduit for connection to a third pump configured to control the removal of cells from the tank; a filter coupled to the tank, the filter being configured to trap cells in the tank and allow fluid to pass through the filter; a scale configured to measure a tank weight with a cell culture inside the tank; a RAMAN probe disposed inside the tank; and a controller coupled to the first pump, the second pump, the third pump, the scale and the RAMAN probe, the controller being configured to: receive weight data from the scale; compare tank weight to a weight setpoint; receive spectral data from the RAMAN probe; determining, based on the received spectral data, a cell culture parameter; comparing the determined parameter with a parameter setpoint; and based on the comparisons, adjust one or more of the first pump, second pump, and third pump throughput.

24. Bioreactor culture system, characterized in that it comprises: a tank with an inlet conduit and at least one outlet conduit; at least one pump; a filter attached to the tank; a RAMAN probe attached to the tank; and a controller coupled to the at least one pump and the RAMAN probe, the controller being configured to control the at least one pump based on an input from the RAMAN probe.

25. Bioreactor culture system, characterized in that it comprises: a tank having an inlet conduit for connection to a first pump configured to control fluid delivery to the tank, a first outlet conduit for connection to a second pump configured to control the removal of fluid from the tank and a second outlet conduit for connection to a third pump configured to control the removal of cells from the tank; a filter coupled to the tank, the filter being configured to trap cells in the tank and allow fluid to pass through the filter; a scale configured to measure a tank weight with a cell culture inside the tank; a RAMAN probe disposed inside the tank; and a controller coupled to the first pump, the second pump, the third pump, the scale.