BR112019015777A2

BR112019015777A2 - Nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas, métodos de fabricação e métodos terapêuticos contra o câncer

Info

Publication number: BR112019015777A2
Application number: BR112019015777-8A
Authority: BR
Inventors: Katti Kattesh; Khhobchandani Menka; Katti Kavita; Khan Alsam; Joshi Chintamani; Mutalik Vinay
Original assignee: The Curators Of The University Of Missouri
Priority date: 2017-02-15
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2020-03-17
Also published as: WO2018152002A1; US11547720B2; EP3582757B1; EP3582757A4; EP3582757C0; US20210008103A1; JP2020507631A; EP3582757A1

Abstract

são fornecidas nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas, métodos de fabricação e métodos de tratamento. um método de fabricação inclui mistura dos produtos de groselha seca ou produto de casca de manga ou fitoquímicos existentes, em um meio líquido para formar uma solução de agente redutor. os sais de ouro são misturados na solução do agente redutor. a reação dos sais de ouro prossegue, na ausência de qualquer outro agente redutor, para formar uma solução em nanopartículas, das nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas estabilizadas, biocompatíveis. um medicamento ayurvédico consiste em uma nanopartícula de ouro não radioativa encapsulada com fitoquímicos existentes na casca da manga ou groselha em uma cápsula com extrato de curcumina e goma arábica.

Description

“NANOPARTÍCULAS DE OURO ENCAPSULADAS AYURVÉDICAS,

MÉTODOS DE FABRICAÇÃO

E MÉTODOS TERAPÊUTICOS CONTRA O CÂNCER”

RELATÓRIO DESCRITIVO

REIVINDICAÇÃO E REFERÊNCIA DE PRIORIDADE

COM RELAÇÃO AO PEDIDO [0001] O Pedido reivindica prioridade de acordo com a norma 35 U.S.C. § 119 e todos os estatutos e tratados aplicáveis com relação ao Pedido Provisório número de série 62/459.388, depositado em 15 de fevereiro de 2017.

CAMPO [0002] Os campos da invenção incluem nanopartículas de ouro, nanomedicina e terapia contra o câncer. Um exemplo de aplicação da invenção é na imunoterapia para o tratamento do câncer da próstata e outros cânceres.

ANTECEDENTES [0003] A medicina ayurvédica é uma antiga modalidade de cura que tem raízes de sua origem na índia há cerca de 5.000 anos. Este é o sistema médico mais antigo do mundo, defendendo princípios de medicina holística destinados a alcançar a prevenção e terapias curativas para restaurar o equilíbrio no corpo humano, a fim de prevenir doenças em longo prazo e promover o bem-estar natural. Na maioria dos países, a medicina ayurvédica ainda é considerada uma modalidade médica “alternativa”. No entanto, nos Estados Unidos, Japão, Alemanha e muitos países, a Ayurveda está ganhando destaque

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2/33 devido ao seu poder inerente de fornecer um mecanismo de cura para tratar todo o corpo humano e doenças, identificando causas primárias das doenças - todas com mínimo ou nenhum efeito tóxico colateral. Os medicamentos ayurvédicos conhecidos são administrados em combinação com uma infinidade de ervas, metais e ions metálicos na forma de cinzas, referidos como “Bhasma” na literatura ayurvédica. As cinzas de ouro (Swarna Bhasma), misturadas com coquetel de ervas, têm sido amplamente utilizadas no tratamento contra o câncer, artrite (tanto Osteo como reumatoide), várias doenças infecciosas e na remoção de artérias bloqueadas na terapia cardiovascular. Formulações de cinzas de ouro também são usadas no tratamento de vários distúrbios neurológicos.

[0004] As formulações químicas indefinidas das cinzas de ouro tornam as preparações imprevisíveis. Espécies químicas improdutivas causam alta imprevisibilidade na administração de ingredientes ativos bem definidos através de doses medidas cientificamente aceitáveis. Esses desafios muitas vezes resultaram em alta toxicidade de espécies metálicas, bem como na biodisponibilidade abaixo do ideal de espécies biologicamente ativas. Isso resulta em desafios significativos para uma aceitação mais ampla dos medicamentos ayurvédicos pelas agências reguladoras, como a US/European Food and Drug Administrations (FDAs).

[0005] Pacientes com câncer de próstata localizado são frequentemente tratados com sucesso através de cirurgia ou radioterapia, enquanto aqueles com condições metastáticas são tratados através de terapia de privação de andrógeno (ADT). Vide, A. J. Chang, K. A. Autio, M. Roach, 3rd and Η. I. Scher, “High-risk prostate cancer-classification and therapy,” Nat Rev Clin Oncol. 11:308-23 (2014). Há um consenso emergente de que as terapias atuais são menos eficazes para pacientes com câncer de próstata resistente à castração (CRPC), onde a doença se manifesta de uma doença não metastática assintomática ou minimamente sintomática a uma condição sintomática ou altamente

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3/33 metastática (dependendo do tempo de diagnóstico com significativa variação interpessoal). A FDA dos Estados Unidos aprovou vários agentes quimioterápicos, incluindo docetaxel, cabazitaxel, abiraterona e enzalutamida para o tratamento desses pacientes. A resistência ao fármaco atribuível à modulação de células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs) é observada em uma proporção significativa de pacientes. Vide, Y. Rong, C. H. Yuan, Z. Qu, H. Zhou, Q. Guan, N. Yang, e outros, “Doxorubicin resistant cancer cells activate myeloid-derived suppressor cells by releasing PGE2,” Sei Rep. 6:23824 (2016). As MDSCs induzem um microambiente imunossupressor e promovem macrófagos associados a tumores polarizados M2 (TAMs) que apoiam a angiogênese e a metástase. Inúmeros estudos mostraram que os exossomas teciduais e séricos de pacientes com câncer de próstata induzem altos níveis de polarização de macrófagos em um fenótipo M2 alternativamente ativado. Vide, P. C. Chen, H. C. Cheng, J. Wang, S. W. Wang, H. C. Tai, C. W. Lin, e outros, “Prostate cancer-derived CCN3 induces M2 macrophage infiltration and contributes to angiogenesis in prostate cancer microenvironment” Oncotarget, 5:1595-608 (2014). Portanto, um tratamento para o câncer enfatizando a terapia personalizada por meio da medicina de precisão, com um bloqueio do ponto de checagem imunológica que atinja os macrófagos M2, seria distinguido de uma infinidade de abordagens de tratamento do “denominador comum” no uso atual. Existe uma necessidade clínica urgente e não satisfeita que pode ser satisfeita combinando diferentes abordagens imunoterapêuticas, colhendo benefícios terapêuticos sinérgicos para as populações de pacientes com câncer. No desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de CRPC resistente a fármacos, o direcionamento efetivo de TAMs assume um foco central. Resultados experimentais indicam que os TAMs são os principais contribuintes para efeitos protetores de fármacos e rádio, e que um número elevado de TAMs e seus perfis de M2 estão correlacionados com a falha da terapia e mau prognóstico em pacientes

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4/33 com câncer de próstata. Vide, B. Ruffell and L. M. Coussens, “Macrophages and therapeutic resistance in cancer,” Cancer Cell. 27:462-72 (2015).

[0006] A próstata e a maioria dos tumores sólidos apresentam elevação da sinalização de NF-κΒ, regulada pela liberação de citocinas pelos macrófagos M2 no microambiente tumoral. Evidências convincentes mostram que o tratamento quimioterápico contra os cânceres sólidos em geral, e tumores de próstata em particular, ativa o NF-κ, um importante fator de transcrição que desempenha um papel crítico no desenvolvimento e progressão do câncer e, consequentemente, auxiliando na quimioterapia e na resistência multi-terapia medicamentosa. A atividade de NF-κΒ regulada positivamente pode regular as vias pró-sobrevivência, incluindo BCL-2. A mangiferina (MGF) mostrou, em estudos independentes, inibir tanto o NF-κΒ quanto o BCL-2 quando administrados por via oral. Vide, F. Gold-Smith, A. Fernandez and K. Bishop, “Mangiferin and Cancer: Mechanisms of Action,” Nutrients. 8 (2016). Os autores observaram que outros agentes anticancerígenos foram encapsulados para melhorar as propriedades farmacocinéticas. Os autores também discutiram, na página 19, a necessidade de um “veículo inteligente” para a liberação de mangiferina às células tumorais, embora observando que tal veículo não existia e que tal veículo teria que ser exclusivo da mangiferina.

[0007] Estudos recentes mostraram a relação da presença de NF-KB com a sobrevivência das células cancerígenas e a resposta das células imunes às células cancerígenas. B. Kuhnemuth, L. Muhlberg, M. Schipper, H. Griesmann, A. Neesse, N. Milosevic, e outros, “CUX1 modulates polarization of tumor-associated macrophages by antagonizing NF-kappaB signaling,” Oncogene. 34:177-87 (2015). As células-tronco do câncer também manifestam ο NF-κ ativado, contribuindo para a promoção de um ambiente pró-inflamatório que leva à inibição da apoptose. O NF-κ ativado polariza os macrófagos em direção ao fenótipo M2 alternativamente ativado responsável por

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5/33 catalisar o crescimento do tumor e até mesmo por trazer resistência ao tratamento medicamentoso. A correlação direta de NF-κΒ no desencadeamento de macrófagos M2 na angiogênese de tumor de próstata, invasão, metástase, imunossupressão e resistência ao tratamento quimioterápico singular e coletivamente torna um caso convincente para o projeto de fármacos direcionadas a macrófagos NF-k eTAM-M2.

[0008] Evidências crescentes a partir de dados clínicos levaram os presentes inventores a supor que os macrófagos em pacientes com câncer da próstata humano contribuem tanto para o crescimento do tumor primário como para o subsequente desenvolvimento de metástases. Em pacientes com Gleason Score (GS) 7-10 e estágios pT3a, maior densidade de macrófagos encontrados em sítios primários de tumor de próstata foram caracterizados como sendo do fenótipo de macrófagos M2. Os macrófagos M2 dentro do microambiente tumoral promovem a angiogênese, o crescimento do tumor e a metástase, levando, em última análise, à transição para o CRPCa e ao estado de doença de mau prognóstico. Várias investigações concluíram que, para alcançar efeitos imunomoduladores efetivos por agentes imunoterapêuticos, é importante desenvolver tecnologias de liberação intratumoral de agentes imunoterapêuticos para alcançar as células efetoras imunossupressoras, incluindo os macrófagos M2, que estão localizados dentro do microambiente tumoral. De fato, existem evidências pré-clínicas e clínicas que sugerem que a resposta imune antitumoral sistêmica, terapêutica melhora quando os agentes imunoterapêuticos são administrados através de imunomodulação intratumoral em vez de sistemicamente. Vide, K. Van der Jeught, L. Bialkowski, L. Daszkiewicz, K. Broos, C. Goyvaerts, D. Renmans, et al., “Targeting the tumor microenvironment to enhance antitumor immune responses” Oncotarget 6:1359-81 (2015). Métodos clássicos, como cateterização para liberação contínua ou liberação lenta de fármacos PEGilados intratumoralmente, estão ganhando vantagem como uma

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6/33 abordagem. As plataformas imunoterapêuticas de nanomoléculas, que permitem uma penetração eficiente na vasculatura tumoral devido ao seu tamanho, bem como direcionamento ativo (receptor mediador) e passivo (permeação e retenção aumentada (EPR)), estão sendo desenvolvidas para alcançar a captação e retenção de doses ideais. [0009] Os presentes inventores e colegas desenvolveram anteriormente nanopartículas de ouro estabilizadas encapsuladas com proteínas, peptídeos e pequenas moléculas. Vide, M. Khoobchandani, K. Katti, A. Maxwell, W. P. Fay and K. V. Katti, “Laminin Receptor-Avid Nanotherapeutic EGCg-AuNPs as a Potential Alternative Therapeutic Approach to Prevent Restenosis,” Int J Mol Sei. 17, (2016); R. Shukla, N. Chanda, A. Zambre, A. Upendran, K. Katti, R. R. Kulkarni, et al., “Laminin receptor specific therapeutic gold nanoparticles (198AuNPEGCg) show efficacy in treating prostate cancer,” Proc Natl Acad Sei USA. 109:12426-3 (2012). Essas nanopartículas demonstraram ser retidas em tumores através da medição da emissão gama de nanopartículas encapsuladas em Au-198, o que permitiu uma estimativa precisa do ouro dentro de células tumorais/tecidos tumorais até concentrações subnanomolares através de técnicas de contagem cintilográfica.

[0010] Os presentes inventores também demonstraram anteriormente os efeitos de nanopartículas de ouro estabilizadas que foram encapsuladas com polifenol-flavonoides. Katti e outros, Publicação de Patente US US 2012/0134918, descreve nanopartículas revestidas com goma arábica Au¹⁹⁸, um método para a sua produção e a sua utilização como agente terapêutico e imagiológico. Katti e outros no documento US 8.333.994 divulgam a formação de nanopartículas de ouro através de redução utilizando chá preto, cúrcuma, curcumina ou canela, e/ou material vegetal similar rico em polifenóis ou flavonoides. Katti US 9.358.310 revela nanopartículas de ouro biocompatíveis estabilizadas que são estabilizadas com material de Gaiato de epigalocatequina (EGCg). Estas patentes demonstram que material vegetal rico em

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7/33 polifenóis ou flavonoides pode ser usado para reduzir sais de ouro e produzir nanopartículas de ouro estabilizadas.

[0011] A mangiferina (l,3,6,7-tetraidroxixantona-C2-D glucosídeo) é um xantonoide que está ligado a um açúcar. Ê uma família de fitoquímicos funcionalizados com polifenóis D-glucosídeo-xantonas, encontrados em abundância na família Anacardiaceae e Gentianaceae de espécies vegetais, especialmente na manga e no chá honeybush. Vide F. GoldSmith, A. Fernandez and K. Bishop, “Mangiferin and Cancer: Mechanisms of Action,” Nutrients. 8 (2016). Folhas de manga foram ingeridas como remédio natural durante séculos em várias culturas. Investigações antitumorais de largo espectro in vitro e in vivo recentes da mangiferina têm sido observadas pelas suas características versáteis anti-inflamatórias, imunomoduladoras, de parada do ciclo celular, antiproliferativas, antiapoptóticas, anti-oxidativas, antigenotóxicas e antivirals. Gold Smith e outros, Supra. Um estudo atribuiu a mangiferina com uma redução nos volumes tumorais em magnitude comparável, e identificou-a como um possível motivo estrutural do Dglucosídeo-xantona para a terapia do câncer. Gold-Smith e outros, supra. As propriedades anti-angiogênicas, pró-apoptóticas e cumulativas antitumorais foram teorizadas como resultado da capacidade imunomoduladora deste fitoquímico para inibir o NFKB, e têm como alvo a TAM e as vias de sinalização a jusante responsáveis pela progressão do tumor e metástases. Gold-Smith e outros, supra. A ingestão de mangiferina demonstrou produzir efeitos colaterais leves a inexistentes. Embora uma possível utilidade terapêutica para o câncer tenha sido reconhecida para a mangiferina, a rápida degradação metabólica deste fitoquímico in vivo permaneceu uma barreira significativa para atingir níveis clinicamente relevantes para uma terapia eficaz contra o câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

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8/33 [0012] Uma modalidade da invenção é um método de fabricação que inclui a mistura de produto seco de groselha, produto de casca de manga ou outro produto com o fitoquímico existente, em um meio líquido para formar uma solução de agente redutor. Os sais de ouro são misturados na solução do agente redutor. A reação dos sais de ouro prossegue, na ausência de qualquer outro agente redutor, para formar uma solução em nanopartículas de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas, biocompatíveis e estabilizadas. O meio líquido consiste em um meio alcoólico ou uma mistura de água e álcool, ou água destilada (e/ou deionizada). Os sais de ouro são sais de ouro não radioativos. Após a reação, as modalidades preferidas misturam adicionalmente em fitoquímicos de casca de manga ou groselha, extrato de curcumina e goma arábica.

[0013] Outra modalidade preferida é um medicamento ayurvédico que consiste em uma nanopartícula de ouro não radioativa, encapsulada com fitoquímicos existentes na casca da manga ou groselha, em uma cápsula com extrato de curcumina e goma arábica.

[0014] Os métodos terapêuticos preferidos incluem a obtenção de uma solução de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas e injeção intraperitoneal, injeção intravenosa ou administração oral da solução a um indivíduo com câncer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0015] As FIGS. 1A-1C representam dados de análise espectrofotométrica UV-visível, uma imagem TEM (microscopia eletrônica de transmissão) e uma distribuição de tamanho de núcleo de nanopartículas de ouro de produto de groselha experimental, respectivamente, [0016] As FIGS. 2A-2C representam dados de análise espectrofotométrica UV-visível, uma imagem TEM e uma distribuição de tamanho de núcleo de nanopartículas de ouro encapsuladas

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9/33 ayurvédicas complexas, experimentais (produto de nanopartículas de ouro groselha/goma arábica) GA-GB-AuNP respectivamente, [0017] A FIG. 3 é um dado de imagem da distribuição do tamanho do núcleo do complexo experimental de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas (produto de partículas de ouro groselha/produto de manga/extrato de curcumina/goma arábica) (GBAuNPs-A + B + C + D); Onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0018] A FIG. 4 representa dados espectrais de UV-Vis mostrando a estabilidade in vitro de GA-GB-AuNPs em soluções aquosas após 24 horas de incubação, [0019] A FIG. 5 representa dados espectrais de UV-Vis que mostram a estabilidade in vitro de GA-GB-AuNPs em várias diluições, [0020] As FIGS. 6A-6D são imagens microscópicas de imagens microscópicas de campo escuro cytoviva a partir de uma análise in vitro (endocitose) de GB-AuNPs em que: A = Groselha, B = Casca de Manga, C = curcumina, D = Goma arábica, [0021] A FIG. 7 é uma imagem TEM da análise de internalização celular de GB-AuNPs, [0022] As FIGS. 8A-8B representam dados de eficácia de GB-AuNPs-A + B + C + D em células de câncer de mama (MDA-MB-231 e MCF-7; onde: A = Groselha, B = casca de Manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0023] As FIGS. 9A-9B representam dados de eficácia de GB-AuNPs-A + B + C + D em células de câncer pancreático (PANC-1 e MIA-PACA-1; onde: A = Groselha, B = casca de Manga, C = curcumina, D = Goma arábica, [0024] As FIGS. 10A-10B representam dados de eficácia de células de câncer da próstata humanas GB-AuNPs-A + B + C + D (PC-3 e LNCaP); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0025] A FIG. 11 apresenta dados de eficácia de GB-AuNPs-A + B + C + D em células de câncer da próstata de cão (ACE-1); onde: A = groselha,

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Β = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0026] A FIG. 12 representa dados de eficácia de GB-AuNPs-A + B + C + D em células de câncer do cólon humano (SW-480); onde: A = groselha, Β = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0027] As FIGS. 13A-13B representam dados da eficácia de GB-AuNPsA + B + C + D em células de câncer da mama (MDA-MB-231 e MCF-7); onde: A = groselha, B = Casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0028] As FIGS. 14A-14B representam dados de eficácia de GB-AuNPsA + B + C + D em células de câncer pancreático (MIA-PACA-1 e PANC1); onde: A = Groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0029] As FIGS. 15A-15B representam dados de eficácia de GB-AuNPsA + B + C + D em células de câncer da próstata humanas (PC-3 e LNCaP); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0030] A FIG. 16 representa dados de eficácia de GB-AuNPs-A + B + C + D na viabilidade das células do câncer da próstata do cão (ACE-1); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0031] A FIG. 17 representa dados de eficácia de GB-AuNPs-A + B + C + D em células cancerígenas de cólon humano (SW-480); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0032] A FIG. 18 ilustra um modo para a síntese de mangiferina a partir de nanopartículas de ouro conjugadas com fitoquímicos de casca de manga (MP-AuNPs), [0033] A FIG. 19 representa dados espectrais de UV-Vis de MP-AuNPs;

[0034] As FIGS. 20A-20B representam dados de espectro UV-Visível de MP-AuNPs 2x e uma distribuição de tamanho de núcleo mostrada por imagem TEM;

[0035] As FIGS. 21A-21C representam dados incluindo uma imagem de distribuição de tamanho de núcleo TEM de MP-AuNPs A + B + C + D,

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11/33 uma imagem TEM mostrando a estrutura de rede de MP-AuNPs e um gráfico demonstrando a presença de MP-AuNPs A + B + C + D por EELS (Electron Energy Loss Spectroscopy); isto confirma a presença de metal dourado na formulação global de fármaco preparada a partir da mistura; onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0036] As FIGS. 22A-22B representam dados de eficácia de MP-AuNPs lx na viabilidade da célula (PC-3) de câncer de próstata, [0037] As FIGS. 23A-23B representam dados de eficácia de MP-AuNPs 2x na viabilidade de células PC-3, [0038] As FIGS. 24A-24B são dados de eficácia de MP-AuNPs-A + B + C + D e mangiferina livre (MGF) como um controle na viabilidade de células cancerígenas da próstata (PC-3); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0039] As FIGS. 25A-25B representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de próstata (LNCaP); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0040] As FIGS. 26A-26B representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de próstata de cão (ACE-1); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0041] As FIGS. 27A-27B representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de mama (MCF-7); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0042] As FIGS. 28A-28B representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de mama (MDA-MB-231); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0043] As FIGS. 29A-29B representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do

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12/33 câncer pancreático (PANC-1); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0044] As FIGS. 30A-30B representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer pancreático (MIA-PACA-1); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0045] As FIGS. 31A-31B representam dados da eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de cólon (SW-480); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0046] As FIGS. 32A-32C representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre, como controle da viabilidade celular das células endoteliais normais (HAECs); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0047] As FIGS. 33A-33B representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de próstata (PC-3); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0048] As FIGS. 34A-34B representam dados de eficácia de MP-AuNPsG + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de próstata (LNCaP); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0049] As FIGS. 35A-35B representam dados de eficácia de MP-AuNPsG + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de próstata de cão (ACE-1); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0050] As FIGS. 36A-36B representam dados de eficácia de MP-AuNPsG + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de mama (MCF-7); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0051] As FIGS. 37A-37B representam dados de eficácia de MP-AuNPsA + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do

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13/33 câncer de mama (MDA-MB-231); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0052] As FIGS. 38A-38B representam dados de eficácia de MP-AuNPsG + B+ C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer pancreático (PANC-1); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0053] As FIGS. 39A-39B representam dados de eficácia de MP-AuNPsG + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer pancreático (MIA-PACA-1); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0054] As FIGS. 40A-40B representam dados de eficácia de MP-AuNPsG + B + C + De MGF livre como controle da viabilidade celular do câncer de cólon (SW-480); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0055] As FIGS. 41A-41C representam dados de eficácia de MP-AuNPsG + B + C+ De MGF livre, como controle da viabilidade celular endotelial normal (HAECs); onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica, [0056] As FIGS. 42A-42B são respectivamente imagens de células PC-3 não tratadas e células PC-3 tratadas com MP-AuNPs; as figuras 42C e 42D são, respectivamente, imagens de células MDA-MB-231 não tratadas e células MDA-MB-231 tratadas com MP-AuNPs;

[0057] A FIG. 43 ilustra os efeitos terapêuticos de AuNPs de MGF (mangiferina) quando injetados intraperitonealmente em camundongos portadores de tumor de próstata humano;

[0058] A FIG. 44 representa dados de testes que demonstram a eficácia de MP-AuNPs A + B + C + D para controlar ou reduzir o tamanho do tumor em camundongos SCID portadores de tumor da próstata humano; onde: A = groselha, B = casca de manga, C = curcumina, D = goma arábica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

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14/33 [0059] A presente invenção fornece nanopartículas de ouro encapsuladas reproduzíveis através de métodos de produção derivados da nanotecnologia, iniciadas por ervas, obtidas por meio de um método de fabricação que aplica “Princípios Ayurvédicos” (sem uso de produtos químicos tóxicos ou artificiais). As nanopartículas de ouro encapsuladas simples e encapsuladas complexas podem ser formadas. As partículas encapsuladas ayurvédicas únicas preferidas e um fármaco de tratamento preferido consistem em nanopartículas de ouro encapsuladas em produto de groselha em uma solução ou material de fármaco seco para distribuição o a um paciente. Outras partículas encapsuladas ayurvédicas únicas preferidas incluem partículas encapsuladas em mangiferina. As partículas de ouro encapsuladas ayurvédicas complexas preferidas e um fármaco de tratamento preferido consistem em produto de groselha, produto de manga, produto de curcumina, goma arábica e nanopartículas de ouro encapsuladas em uma solução ou material de fármaco seco para liberação a um paciente. Os produtos de groselha ou manga são um coquetel de fitoquímicos de casca de groselha ou manga. Um corolário seria um coquetel de fitoquímicos que são existentes em cascas de groselha ou manga, e são derivados de uma ou mais outras plantas comparáveis que têm alguma combinação de uma pluralidade dos coquetéis fitoquímicos existentes obtidos a partir de cascas de groselha ou manga. Outras partículas encapsuladas ayurvédicas únicas preferidas e um fármaco de tratamento preferido consistem em nanopartículas de ouro encapsuladas em casca de manga e produto de groselha em uma solução ou material de fármaco seco para liberação a um paciente. As nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas complexas preferidas e uma fármaco de tratamento preferido consistem em produto de casca de manga, produto de groselha, produto de curcumina, goma arábica e nanopartículas de ouro em uma solução ou material de fármaco seco para liberação a um paciente. A reação para criar as nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas é conduzida na ausência de qualquer

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15/33 outro agente redutor, e forma uma solução nanoparticulada de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas biocompatíveis e estabilizadas, simples ou complexas. As nanopartículas de ouro não são radioativas e os métodos preferidos para administração de partículas encapsuladas ayurvédicas simples e complexas incluem administração oral, injeção intravenosa e/ou injeção intraperitoneal.

[0060] Um método preferido para obtenção de nanopartículas de ouro encapsuladas com produtos de groselha inclui mistura de pó de groselha seca caseiro com sal de ouro em água. O coquetel de fitoquímicos ricos em elétrons de groselha reduz o sal de ouro para produzir nanopartículas de ouro em uma forma 100% reproduzível. Este processo pode ser escalonado para produção comercial. Espera-se que as nanopartículas de ouro encapsuladas com produtos de groselha em uma solução para liberação a um paciente tenham aplicação para o tratamento de uma miríade de doenças e perturbações humanas, incluindo doenças e distúrbios frequentemente abordados pela medicina ayurvédica tradicional.

[0061] Um método preferido para obtenção de nanopartículas de ouro revestidas ayurvédicas complexas inclui a mistura de pó de groselha seca caseiro com sal de ouro em água, seguido pela adição de goma arábica ou uma combinação de fitoquímicos de casca de manga, extrato de curcumina e goma arábica. A mistura destes componentes é conduzida. O material de fármaco seco pode ser obtido removendo o excesso de água, por exemplo, por liofilização.

[0062] Experiências demonstraram que os presentes fármacos têm eficácia no tratamento contra os cânceres humanos. O efeito dos presentes materiais medicamentosos foi testado em células de câncer da mama, células de câncer pancreático, células de câncer da próstata (humano e canino) e células de câncer do cólon.

[0063] A presente invenção proporciona um resultado surpreendente tendo em vista o trabalho anterior dos presentes inventores e colegas utilizando polifenóis como o gaiato de epigalocatequina (EGCg) e

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16/33 materiais vegetais ricos em flavonoides, que têm a propensão para reduzir o sal de ouro e produzir as nanopartículas de ouro correspondentes. Espera-se que a mangiferina, que tem funcionalidades químicas de xantanoides e glicose, se comporte de maneira diferente. Espera-se que a extremidade de glicose da mangiferina reduza o sal de ouro, assim como o xantanoide. O poder de redução combinado das unidades de xantanoide e glicose é forte, e espera-se que tais reações químicas resultem na conversão completa do sal de ouro no metal dourado correspondente. Contrariamente a esta expectativa, a presente invenção demonstrou em experimentos que as unidades de xantanoide e glicose em magiferina trabalham em sinergia para transformar o sal de ouro em nanopartículas de ouro correspondentes com subsequente estabilização de nanopartículas de ouro. A mangiferina em uma solução atua como um agente redutor na ausência de qualquer outro agente redutor. Não são necessários produtos químicos agressivos. A groselha é um reservatório de um espectro de fitoquímicos, incluindo ácido ascórbico, alcalóides, benzenoides, flavonoides, terpenos, carboidratos, ácido gálico, emblicanina A, emblicanina B, ácido chebulágico, corilagina, ácido muco, pedunculagina, quercetina, kaempferol e esteróis. A combinação de fitoquímicos em groselha fornece uma alta capacidade antioxidante cumulativa para uso no tratamento de um grande número de doenças, incluindo câncer, bem como várias doenças e distúrbios inflamatórios. A presença de uma grande quantidade de vitamina C na groselha é única, e evidências experimentais sugerem que os efeitos deste forte antioxidante não são perdidos após a fervura de coquetéis de soluções fitoquímicas, nem por armazenar os extratos por longos períodos de tempo. Isto está em nítido contraste com os efeitos antioxidantes altamente instáveis do gaiato de epigalocatequina (EGCG) do chá e fitoquímicos de outras fontes vegetais. Essas substâncias se decompõem rapidamente em solução quando armazenadas à temperatura ambiente. Portanto, o EGCg não é uma fonte confiável

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17/33 para eliminar os radicais hidroxila e superóxido para estimular vários sistemas enzimáticos antioxidantes, incluindo a catalase, a superóxido dismutase e a glutationa peroxidase. Estes sistemas têm importantes necessidades antitumorais e antipiréticas, analgésicas, antitussivas, antiaterogénicas, adaptogénicas, cardioprotetoras, gastroprotetoras, antianemia, antihipercolesterolémicas, cicatrizantes, antidiarreicas, antiateroscleróticas, hepatoprotetoras, nefroprotetoras e neuroprotetoras. Além disso, os altos efeitos antioxidantes dos fitoquímicos, como ácido gálico, ácido elágico, pirogalol, alguns norsesquiterpenoides, corilagina, geranina, elaeocarpusina e prodelfinidinas Bl e B2 de groselha fornecem efeitos antineoplásicos. Os efeitos antioxidantes e moduladores da sinalização celular dos fitoquímicos da groselha são significativamente diferentes, em comparação com qualquer outro fitoquímico e, assim, oferecem novos usos médicos, incluindo aplicações radiomodulatórias, quimiomoduladoras e quimiopreventivas. No geral, a capacidade antioxidante robusta de um coquetel de fitoquímicos de groselha e casca de manga é completamente inesperada para versados/não versados na técnica. As atividades antioxidantes, anti-inflamatórias, antimutagênicas e imunomoduladoras do coquetel de radicais livres podem ser amplificadas por meio do encapsulamento desses fitoquímicos em nanopartículas de ouro para o desenvolvimento de fármacos nano-ayurvédicos no tratamento e prevenção do câncer.

[0064] Um método terapêutico preferido da invenção é a injeção intravenosa de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvdicas em um indivíduo com câncer ou uma doença inflamatória. Portanto, esta invenção fornece uma nova modalidade para o tratamento do câncer de próstata através de uma injeção direta inovadora de nanotecnologiafitomedicina.

[0065] Os presentes inventores reconheceram que, ao projetarem novas modalidades de tratamento para o câncer de próstata, a conversa cruzada entre o fator de transcrição NF-KB e os macrófagos no

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18/33 microambiente tumoral é de suma importância, e descobriram que as nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédica são uma efetiva modalidade para suprimir esta conversa cruzada, especialmente com injeção intraperitoneal, que também é um modelo para ingestão oral e injeção intravenosa. Experimentos fornecem evidências de eficácia.

[0066] Exemplos de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvéticas conjugadas incluem imunomodulação de nanopartculas de ηνβ3integrina e de receptor de laminina. As presentes nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvdicas proporcionam uma via clinicamente significativa para amplificar: (i) citotoxicidade específica das células tumorais; (ii) supressão imunomoduladora da ativação de NF-k e (iii) direcionamento de macrófagos M2 ativados alternativamente associados aos tumores.

[0067] As modalidades preferidas da invenção serão agora discutidas em relação às experiências. Os versados na técnica reconhecerão aspectos mais amplos da invenção a partir dos experimentos.

[0068] Sem estar vinculado à teoria ou à teoria sendo necessária para praticar a presente invenção, os inventores acreditam que as nanopartículas de ouro funcionalizadas com mangiferina abrigam células tumorais/tecido tumoral através de pelo menos três mecanismos diferentes. Um primeiro mecanismo é atribuído ao tamanho e carga dessas nanopartículas, que auxiliam os efeitos de permeação e retenção. Um segundo mecanismo é atribuído ao alto metabolismo dos açúcares nas células tumorais. A mangiferina inclui uma estrutura de açúcar. Um terceiro mecanismo é atribuído ao fato de que a unidade xantanoide na mangiferina fornece um arsenal adicional para a afinidade aumentada de AuPPs de MGF em direção às células tumorais. Os inventores acreditam que estes três mecanismos funcionam em conjunto para proporcionar uma afinidade sem precedentes para a retenção de MGF-AuNPs nas células tumorais, o que foi demonstrado através de experiências.

[0069] Exemplos experimentais de nanopartículas de ouro

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19/33 encapsuladas em grânulos de produtos de groselha (GB-AuNP) foram sintetizados e caracterizados. Os GB-AuNPs foram caracterizados pela combinação de técnicas incluindo espectrofotometria UV-visível e TEM (microscopia eletrônica de transmissão). A análise espectrofotométrica UV-visível confirmou a ressonância de plasmônio de superfície (SPR) de GB-AuNPs a 530± 3 nm, que é mostrada na figura IA, com as figuras 1B-1C mostrando uma imagem TEM e um histrograma de distribuição do tamanho do núcleo, respectivamente.

[0070] Exemplos de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas complexas incluem nanopartículas de ouro de produto de groselha/goma arábica (GA-GB-AuNPs), que foram caracterizadas por múltiplas técnicas incluindo Espectrofotometria UV-Visível e TEM. A análise espectrofotométrica de UV-visível confirmou o SPR de GA-GBAuNPs a 530 ± 3 nm, o que é mostrado na figura 2A, com as figuras 2B2C mostrando uma imagem TEM e um histograma de distribuição de tamanho do núcleo. Os resultados obtidos pelo instrumento dinâmico de espalhamento de luz revelaram que AuNPs GA-GB- mostraram um tamanho hidrodinâmico de 137 ± 5 nm (Tabela 1).

[0071] Tabela 1: Parâmetros de dados físico-químicos de (GB-AuNPs).

Amostra	Espectrof otometria visível UV	DLS	Carga	TEM	Cone, de Au por AAS
GB-AuNPs	530+3 nm	65±10 nm	-18,8±3 mV	25±8 nm	237 ppm
GA-GB- AuNPs	530+3 nm	137±5 nm	-18,8±3 mV	20±10 nm	237 ppm

[0072] A figura 3 mostra a distribuição do tamanho do núcleo do complexo experimental de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas (fármaco Nano-Ayurvédico GB-AuNPs-A + B + C + D). Esta formulação preferida adicionou os seguintes excipientes aos

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20/33 fitoquímicos GA-GB-AuNPs- (A) Groselha, (B) Fitoquímicos de casca de manga, (C) Extrato de curcumina, (D) Goma arábica. O fármaco nanoayurvédico GB-AuNPs-A + B + C + D foi caracterizado por uma técnica TEM para análise qualitativa de AuNPs GA-GB na formulação de fármacos. O tamanho do núcleo de GA-GB-AuNPs, obtido a partir de dados reunidos por TEM, indica que as nanopartículas são esféricas, mono-dispersas e homogêneas, com um tamanho de núcleo de 26 ± 5 nm, como mostrado na figura 3 [0073] A estabilidade in vitro de GA-GB-AuNPs foi confirmada misturando 1 mL de nanopartículas de ouro a 0,5 mL de soluções aquosas de 1% de NaCl, 0,5% de cisteína, 0,2 M de histidina, pH 7 e pH 9 separadamente. A estabilidade dos conjugados foi medida por monitoração da absorvância de UV durante um período de 1 h, 4 h, 24 h, 48 horas, 1 semana. Uma alteração insignificante na banda de plasmônio UV-vis confirmou a retenção da composição de nanoparticulada em todas as misturas, como mostrado na figura 4. A estabilidade de GA-GB-AuNPs em diferentes diluições foi também medida por espectrofotometria UV-visível, como mostrado na figura 5. Esta última propriedade de estabilidade é muito importante para aplicações biomédicas, que requerem variação nas diluições/concentrações. Os dados da figura 5 mostram que a intensidade da absorbância é proporcionalmente linear com a concentração de GA-GB-AuNPs, com R² = 0,99.

[0074] Experimentos estudados na análise de internalização celular in vitro (endocitose) análise por microscopia de campo escuro. Em um experimento, os GB-AuNPs foram analisados por uma técnica microscópica de campo escuro cytoviva. Pastas de cobertura ultra limpas e estéreis foram mantidas em placas de 6 poços. As PC-3 e PANC-1 (5xl0⁵ células) foram semeadas nas placas de 6 poços em meio RPMI e DMEM separadamente, e incubadas durante 24 horas em um incubador de CO2 a 37°C. Adicionaram-se GB-AuNPs em solução (100 gL/mL) às células, seguido de 4 horas e 24 horas de incubação a 37°C.

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As imagens foram capturadas através do software Dage Imaging. Imagens microscópicas de campo escuro inequivocamente delinearam que GB-AuNPs se internalizam eficazmente dentro de células PC-3 e PANC-1 dentro de 4 e 24 horas de tempo de incubação, como mostrado nas figuras 6A-6D.

[0075] As células PC-3 (5x10⁵ células) foram semeadas em placas de 6 poços em meio RPMI e deixadas aderir durante 24 horas em uma incubadora C02 a 37°C. O meio foi substituído por GB-AuNPs em meio contendo solução (100 pL/mL_) e incubado por 2 horas a 37°C. As amostras celulares foram examinadas para endocitose de GB-AuNPs em um microscópio TEM JEOL 1400. As imagens TEM indicaram inequivocamente que estas nanopartículas são internalizadas em vacúolos e lisossomas da linhagem celular PC-3 dentro de 24 horas, como mostrado na imagem da figura 7.

[0076] Para testar a eficácia antitumoral in vitro do fármaco NanoAyurvédico GB-AuNPs-A + B + C + D, preparou-se a solução mestra misturando 4 mg de material farmacêutico em pó seco em 1 mL de água DI. A mistura foi agitada durante 18-20 horas a temperatura ambiente para se obter os fitoquímicos desejados em água DI. A solução foi então centrifugada a 8.000 rpm durante 5 minutos a 30°C para se obter a solução de fármaco e um sedimento. A solução do fármaco contém combinações de ácido ascórbico, alcalóides, benzenoides, flavonoides, terpenos, carboidratos, ácido gálico, emblicanina A, emblicanina B, ácido chebulágico, corilagina, ácido mucílico, pedunculagina, quercetina, kaempferol e esteróis. Para estimar a quantidade de fitoquímicos liberados na mistura de fármacos, o sedimento foi ainda seco utilizando um liofilizador e o peso seco foi medido para ser 2 mg. O peso dos fitoquímicos liberados é de 2 mg. A mistura de fármacos inclui diferentes misturas de fitoquímicos em groselha: ácido ascórbico, alcalóides, benzenoides, flavonoides, terpenos, carboidratos, ácido gálico, emblicanina A e B, ácido chebulágico, corilagina, ácido mucílico, pedunculagina, quercetina, kaempferol e esteróis.

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22/33 [0077] Para verificar a quantidade de fitoquímicos na solução do fármaco, o extrato de água foi seco usando evaporação rotativa. O peso dos fitoquímicos foi medido em 2 mg, indicando que 4 mg de mistura de fármacos forneceram 2 mg de fitoquímicos.

[0078] Diluições em série foram preparadas em meio RPMI/DMEM para tratar as respectivas células. O perfil de viabilidade celular de um fármaco Nano-Ayurvédico GB-AuNPs-A + B + C + D foi avaliado em relação às células de câncer de próstata (PC-3, LNCap, ACE-1), células de câncer de mama (MDA-MB-231 e MCF-7), células de câncer pancreático (PANC-1 e MIA-PACA-1) e células de câncer do cólon (SW480) por ensaio MTT. Os perfis de viabilidade celular demonstraram que o fármaco Nano-Ayurvédico GB-AuNPs-A + B + C + D exibiu eficácia dependente da dose na morte de células cancerígenas. Isto é mostrado nas figuras 8A-17, que demonstram uma diminuição na viabilidade de células cancerígenas com o aumento da concentração do fármaco NanoAyurvédico GB-AuNPs-A + B + C + D durante períodos de 48 e 72 horas. Cada concentração reduziu a viabilidade celular em comparação com um controle e fortes reduções foram demonstradas entre 50-100 gg/mL, e uma ação letal de 90% a quase 100% das células foi alcançada com concentrações de 100-200 gg/mL.

[0079] As doses de diluições em série foram concebidas com base na quantidade de ouro presente em GB-AuNPs-A + B + C + D. A quantidade de ouro foi analisada por uma técnica de AAS (espectrofotometria de absorção atômica). Os perfis de viabilidade celular demonstraram que um fármaco Nano-Ayurvédico GB-AuNPs-A + B + C + D exibiu eficácia dependente da dose na morte de células cancerígenas. Essas partículas são formadas a partir de uma combinação de encapsulamento e fixação. Cada ingrediente não precisa anexar ou interagir diretamente com a superfície de nano-metal de ouro. O anexo/encapsulamento acontecerá de pelo menos duas maneiras diferentes. Inicialmente, MP ou GB se unirão com a superfície das nanopartículas de ouro. Então, quando A, B, C e D forem,

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23/33 misturados, eles poderão interagir com GB (ou MP), que já estão ligados à superfície do ouro, através de pontes de hidrogênio ou através de interações diretas com a superfície do ouro.

[0080] Materiais e Detalhes Experimentais Adicionais [0081] Todos os químicos utilizados na síntese de nanopartículas de ouro e cultura de células, por exemplo, diidrato tetracloroaurato de sódio (III), RPMI (meio Roswell Park Memorial Institute, comumente referido como meio RPMI, é uma forma de meio usado em cultura de células e cultura de tecidos) e MEM (Mínimo Essencial Médio (MEM), um dos mais amplamente usado de todos os meios de cultura de células sintéticas), azul de tripano e MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difenil tetrazólio], DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol ) os corantes foram obtidos da Sigma (St. Louis, MO, USA). O soro de bezerro fetal e o TryplE foram obtidos da Life Invitrogen, USA. Células de câncer de próstata humano (PC-3 e LNCaP), câncer de próstata de cão (ACE-1), células de câncer de mama (MCF-7 e MDA-MB-231), células de câncer pancreático (PANC-1 e MIA-PACA-1) e as células de câncer de cólon (SW-480) foram obtidas das instalações do Cytology Core da University of Missouri, Columbia. Água bidestilada foi usada ao longo dos experimentos. O pó seco de groselha caseira foi utilizado em todas as formulações. O pó de groselha foi preparado a partir de groselhas frescas, que foram lavadas com água fria e quente. As bagas foram cortadas em pequenos pedaços após a separação do conteúdo das bagas das sementes. As fatias cortadas foram secas à sombra até as peças se transformarem em sólidos crocantes. Os pedaços secos de groselha foram pulverizados usando polarizadores de qualidade industrial. O controle de qualidade mostrou um tamanho de partícula: 100-150 micra. O produto estava livre de endotoxinas com uma contagem total de placas inferior a 1.000 por grama; levedura e mofo menos de 10 por grama; teor E Coli: ausente.

[0082] Imagens TEM foram obtidas em um JEOL 1400 TEM (JEOL, LTE, Tóquio, Japão). As medições de absorção foram realizadas

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24/33 utilizando um espectrofotômetro Varian Cary 50 UV-Vis. O diâmetro hidrodinâmico e o potencial zeta foram obtidos usando o Zetasizer Nano S90 (Malvern Instruments Ltd. USA). A concentração de metal ouro foi calculada por espectrometria de absorção atômica.

[0083] O GB-AuNP e GB-GA-AuNP foram formados pelo seguinte procedimento. A um frasco de 20 mL, adicionou-se 6 mL de água duplamente deionizada (Dl) seguido da adição de pó seco caseiro de groselha (GB em pó) (10 mg) com e sem goma arábica (12 mg) e agitouse à temperatura ambiente por 1 hora. Com 6 mL de água Dl, uma faixa de 8-15 mg para GB e goma arábica são apropriadas. Adicionou-se uma combinação de cem microlitros de NaAuCU (0,1 M) à mistura reacional e agitou-se durante mais 3 horas à temperatura ambiente. A cor mudou para rubi dentro de 5 minutos, confirmando a formação de nanopartículas. A solução foi centrifugada a 3.000 rpm durante 3 min. para obter uma solução de AuNPs límpida removendo os materiais que não reagiram. Como variação, pode-se usar o dobro do volume, por exemplo, de 200 microlitros de 0,1 m de solução de NaAuCU (0,1 M). Quando o volume de NaAuCU é dobrado, a quantidade de GB aumenta proporcionalmente. Os volumes também podem ser variados com efeitos proporcionais esperados dentro ou fora das faixas de intervalos.

[0084] O fármaco nano-ayurvédico GB-AuNPs-A + B + C + D foi formulada usando o mesmo procedimento usado para formar GBAuNPs. Para a formulação do fármaco, os seguintes excipientes foram adicionados aos 20 mL de GB-AuNPs; (A) Fitoquímicos de groselha (2 g), (B) Fitoquímicos de casca de manga (4 g), (C) extrato de curcumina (1 g) e (D) goma arábica (0,5 g). Com 20 mL de GB-AuNPs, quantidades adequadas são: para os fitoquímicos de groselha (2-2,5 g), (B) fitoquímicos de casca de manga (4-5 g), (C) extrato de curcumina (1 -1,5 g), e (D) goma arábica (0,5-1,0 g). Todos os excipientes foram adicionados aos GB-AuNPs e misturados durante 30-45 minutos à temperatura ambiente. A mistura foi liofilizada para remover o excesso de água e para obter material de fármaco seco, o rendimento foi de 6 g.

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A amostra foi armazenada em recipiente rígido a 4-8°C e usada para estudos adicionais de biologia celular antitumoral. A mistura foi liofilizada para remover o excesso de água e para obter material de fármaco seco. O rendimento foi de 6,5 a 7,5 g. A amostra foi armazenada em recipiente rígido a 4°C e usada para estudos adicionais de biologia celular antitumoral.

[0085] A pesquisa mostrou que a groselha é um reservatório de vários fitoquímicos antioxidantes fortes que incluem o ácido cumárico, o isorametina glicosídeo, o kaempferol e a quercetina. Portanto, os efeitos antioxidantes combinados de um coquetel desses fitoquímicos seriam responsáveis pela transformação do sal de ouro em nanopartículas de ouro. As formulações de medicina ayurvédica são baseadas em efeitos de coquetel de fitoquímicos. Nós otimizamos o peso do pó de groselha necessário para o peso específico do sal de ouro para alcançar a transformação completa do sal de ouro em nanopartículas de ouro. Para peso de ouro na faixa de 4-8 mg, 6-10 mg de pó de groselha é ideal para realizar reações completas em 6-10 mL de água destilada a 25-28°C.

[0086] Os estudos de estabilidade de GB-AuNPs foram conduzidos misturando nanopartículas de ouro com várias soluções biológicas, tais como soluções aquosas de NaCl a 1%, cisteína a 0,5%, histidina a 0,2 M e pH7 separadamente. A estabilidade dos conjugados foi medida monitorizando o SPR em diferentes pontos temporais durante uma semana. Uma alteração insignificante na banda SPR confirmou a retenção da composição de nanoparticulada em todas as misturas. Os GB-AuNPs também foram testados quanto à sua estabilidade em diferentes concentrações em água, e a estabilidade foi medida por espectrofotometria UV-visíveL [0087] O modo de endocitose foi investigado por incubação de AuNPs ayurvédicos simples e complexos com linhagens celulares contra o câncer da próstata e do pâncreas. A dose ideal e o tempo de incubação foram determinados com diferentes diluições para diferentes momentos. As concentrações são indicadas nas figuras. As amostras foram

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26/33 preparadas utilizando as seguintes técnicas.

[0088] Os dados do campo escuro foram obtidos como se segue. Após a incubação, as células foram lavadas 10 vezes com lxPBS e fixadas com 4% de aldeído parafórmico (PFA). As células foram adicionalmente lavadas 2 vezes com lxPBS e as linhagens foram preparadas utilizando corante nuclear DAPI e observadas com microscópio de campo escuro Cytoviva, acoplado com fluorescência de modo dual. A morfologia celular foi inicialmente observada, seguido pela captação de nanopartículas. As imagens foram capturadas através do software Dage Imaging.

[0089] As imagens TEM foram obtidas da seguinte maneira. Após a incubação, as células foram lavadas 10 vezes com PBS, centrifugadas em pastilhas e fixadas com 2% de glutaraldeído, 2% de aldeído parafórmico em um tampão de cacodilato de sódio (0,1 M). As células foram adicionalmente fixadas com tetróxido de ósmio tamponado a 1% em tampão 2-mercaptoetanol, e depois desidratadas em série de acetona graduada e embebidas em resina epóxi Epon-Spurr. Cortes foram realizados a 85 nm usando uma faca de diamante (Diatome, Hatfield PA). As seções foram coradas com a coloração de chumbo triplo de Sato e com acetato de uranila a 5% para visualização de organelos. As amostras preparadas foram examinadas no microscópio JEOL 1400 TEM (JEOL, Peabody, Mass.) operado a 80 kV na University of Missouri’s Electron Microscopy Core Facility.

[0090] Ensaios de viabilidade celular para o efeito de um fármaco NanoAyurvédica GB-AuNPs-A + B + C + D em células de câncer de próstata (PC-3 e LNCaP), câncer de próstata de cão (ACE-1), células de câncer de mama (MCF- 7 e MDA-MB-231), células de câncer pancreático (PANC-1 e MIA-PACA-1) e células de câncer de cólon (SW-480) foram determinadas a viabilidade celular utilizando o ensaio MTT (Sigma Aldrich). A intensidade da cor desenvolvida foi medida por um leitor de microplaca (Molecular device, USA) operando a um comprimento de onda de 570 nm. A viabilidade celular percentual foi calculada usando a

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27/33 seguinte fórmula: (T/C) x 100, onde C = Absorbância de controle, e T = Absorbância de tratamento. Os valores IC-50 foram calculados usando o software Origin.

[0091] As nanopartículas de ouro conjugadas fitoquímicas de casca de manga (MP-AuNPs) foram sintetizadas utilizando-se as melhores capacidades de redução dos fitoquímicos ricos em elétrons e antioxidantes em casca de manga. O procedimento é mostrado na figura

18. A produção de MP-AuNPs foi confirmada pela observação da mudança de cor das soluções das misturas reacionais amarelo pálido para vermelho. Os fitoquímicos presentes na casca da manga são poderosos injetores de elétrons. Esses fitoquímicos também criam revestimento em uma superfície de nanopartículas de ouro e, portanto, os fitoquímicos desempenham um papel significativo na produção e estabilização de nanopartículas de ouro. As AuNPs foram caracterizadas pela combinação de técnicas, incluindo espectrofotometria UV-visível, DLS e TEM. A análise espectrofotométrica de UV-visível confirmou que o SPR de MP-AuNPs estava a 535 ± 2 nm, o que é mostrado na figura 19 Isto concluiu a síntese bem sucedida de MP-AuNPs. O tamanho do núcleo de MP-AuNPs, obtido por TEM, indicou que as nanopartículas são esféricas, monodispersas e homogêneas com o tamanho do núcleo de 35 ± 5 nm. Os resultados obtidos pelo instrumento dinâmico de espalhamento de luz revelaram que os MP-AuNPs apresentaram tamanho hidrodinâmico de 65 ± 5 nm e um potencial zeta (ζ) de -20 ± 2 mV. O potencial zeta negativo fornece as forças repulsivas necessárias para que as nanopartículas permaneçam estáveis em solução. Os MPAuNPs são estáveis em solução há mais de 3 anos. A constituição fitoquímica da casca da manga inclui glicose, xantonas, mangiferina, quercetina, kaepferol, catequinas, ramnetina e um grande número de fitonutrientes. A mangiferina, um C-glicosilxantona (1,3,6,7-tetrahidroxixantona-C2-beta-D-glicosídeo), é um xantonoide funcionalizado pela glicose encontrada em abundância na casca da manga.

[0092] As figuras 21A-21C mostram dados para caracterizar um

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28/33 fármaco MP-AuNPs-A + B + C + D nano-ayurvédica. O tamanho do núcleo de MP-AuNPs, obtido por TEM, STEM e EELS (Electron Energy Loss Spectroscopy), indica que as nanopartículas são esféricas, monodispersas e homogêneas com um tamanho de núcleo de 35 ± 5 nm. Para a formulação do fármaco, os seguintes excipientes foram adicionados às MP-AuNPs lx; (A) fitoquímicos de groselha, (B) fitoquímicos de casca de manga, (C) extrato de curcumina, e (D) goma arábica.

[0093] Avaliou-se o perfil de viabilidade celular de MP-AuNPs lx e 2x contra o câncer de próstata (PC-3) e células pancreáticas (PANC-1) pelo ensaio MTT. As células individuais foram tratadas com várias diluições de MP-AuNPs e fitoquímicos livres de casca de manga (extrato MP). Medições da viabilidade celular são apresentadas nas figuras 22A-23B. Os perfis de viabilidade celular demonstraram que os MP-AuNPs exibiram eficácia dependente da dose na morte celular de células PC-3. Entre MP-AuNPs lx e 2x (concentração única e dupla de MP), a potência 2x usada durante a síntese de MP-AuNP mostrou mais efeito na inibição da viabilidade de células de câncer de próstata, que é aparente comparando às figuras 22A e 22B para os dados nas as figuras 23A e 23B. Um fármaco Nano-Ayurvédico MP-AuNPs-A + B + C + D foi testado com várias células cancerígenas. Para testar a eficácia antitumoral in vitro de um fármaco Nano-Ayurvédico MP-AuNPs-A + B + C + D, preparou-se uma solução mestra misturando 4 mg de pó seco de material medicamentoso em 1 mL de água Dl. A solução mestra é uma solução obtida misturando 4 mg de pó seco do material do fármaco MPAuNPs-A + B + C + D em 1 mL de água Dl. Material de fármaco se refere a misturas de MP AuNP com A + B + C + D.A mistura foi agitada durante a noite durante 18 horas à temperatura ambiente para se obter os fitoquímicos desejados em água Dl. A solução foi centrifugada a 8.000 rpm durante 5 min. a 30°C para se obter a solução de fármaco e um sedimento. Para estimar a quantidade de fitoquímicos libertados na mistura de fármacos, o sedimento foi ainda seco utilizando um

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29/33 liofilizador e o peso seco foi medido para ser 2 mg. A massa de fitoquímicos liberados foi de 2 mg. A quantidade total inicial do fármaco utilizado na formulação foi de 4 mg. Quando esta solução (com 4 mg no total) foi centrifugada, produziu um sedimento pesando 2 mg. O líquido sobrenadante que ficou para trás deve conter o lembrete de 2 mg. Isso é exatamente o que foi obtido após a evaporação da água do sobrenadante, e o peso seco da massa deixada para trás foi de 2 mg. Isso demonstra que nenhum fármaco foi perdido. A experiência como indicado confirma que 4 mg de mistura de fármaco fornecem 2 mg.

[0094] Para verificar a quantidade de fitoquímicos no extrato de água do fármaco, o extrato de água foi seco usando evaporação rotativa. O peso dos fitoquímicos foi medido em 2 mg. Isso indicou que 4 mg de mistura de fármacos fornece 2 mg de fitoquímicos.

[0095] Diluições em série foram preparadas em meio RPMI/DMEM para tratar as respectivas células. O perfil de viabilidade celular do fármaco Nano-Ayurvédico MP-AuNPs-A + B + C + D foi avaliado contra células de câncer de próstata (PC-3, LNCap, ACE-1), células de câncer de mama (MDA-MB-231 e MCF-7) células de câncer pancreático (PANC-1 e MIAPACA-1), células de câncer do cólon (SW-480) e células endoteliais normais (HAECs) por ensaio MTT (Figuras 24-32). Os perfis de viabilidade celular demonstraram que o fármaco Nano-Ayurvédico MPAuNPs-G + B + C + D exibiu eficácia dependente da dose na morte celular de células cancerígenas. Os resultados corroboraram que um fármaco Nano-Ayurvédico MP-AuNPs-A + B + C + D apresentou uma toxicidade mínima ou nula contra uma linhagem celular normal (figura 32).

[0096] O perfil de viabilidade celular de um fármaco Nano-Ayurvédico MP-AuNPs-A + B + C + D foi avaliado contra células de câncer de próstata (PC-3, LNCap, ACE-1), células de câncer de mama (MDA-MB231 e MCF -7), células de câncer pancreático (PANC-1 e MIA-PACA-1), linhagem celular contra o câncer do cólon (SW480) e linhagem celular endotelial normal (HAECs) por ensaio MTT (Figuras 33A-41B). As doses

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30/33 de diluições em série foram concebidas com base na quantidade de ouro presente em MP-AuNPs-A + B + C + D. A quantidade de ouro foi analisada por uma técnica de EAA.

[0097] Os perfis de viabilidade celular demonstraram que um fármaco nano-ayurvédico MP-AuNPs-A + B + C + D exibiu eficácia dependente da dose na morte celular de células cancerígenas.

[0098] As células PC-3 e MDA-MB-231 foram incubadas com MPAuNPs. A imagiologia em campo escuro foi conduzida e os resultados revelaram que MP-AuNPs foram internalizadas em células PC-3 e MDAMB-231 dentro de 4 horas de tempo de incubação (figura 42A-42D).

[0099] Os dados sobre nanopartículas simples (MP-AuNP) e complexas (MP-AuNP-A + B + C + D) indicam eficácia muito maior que a do MGF livre. Além disso, os testes mostram que, para vários tipos de câncer, incluindo próstata, pâncreas, mama, pulmão e cólon, bem como em células normais, as faixas de concentração para o teor de ouro variam de 0,03 micrograma/mL a 0,40 micrograma/mL. Isso se traduz em faixa de concentração para o fármaco total para 12,5 a 200 micrograma/ mL.

[00100] Para a preparação de nanopartículas MP simples e complexas, foi utilizada manga (Mangifera indica) comprada de uma mercearia local em todos os experimentos. A casca de manga foi removida da manga e lavada com água duplamente ionizada para remover quaisquer contaminantes ou partículas de poeira e incubada a 50°C (40-60°C) durante 4 horas e depois moída para obter pó seco. O pó foi armazenado à temperatura ambiente e utilizado para posterior síntese de nanopartículas de ouro.

[00101] Para sintetizar MP-AuNP, adicionou-se pó seco de casca de manga com peso de 30 mg a 6 mL de água Dl em um frasco de 20 mL e agitou-se durante 10 min. à temperatura ambiente para criar uma suspensão homogênea. Em seguida, 100 pL de solução NaAuCU 0,1 M foram adicionados, e a cor da solução tornou-se vermelho-rubi dentro de 2 min., indicando a formação de nanopartículas de ouro. Em geral,

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31/33 para 25-30 mg, são necessárias cascas em pó, 6-10 mL de água Dl, agitação durante 10-20 minutos, e 80-100 gL de NaAuCU 0,1 M foi usado. A solução foi filtrada para remover o restante de pó de manga insolúvel. Mais genericamente, as nanopartículas podem ser armazenadas entre 5 e -20°C, o que é recomendado para armazenamento após a produção e antes do uso terapêutico.

[00102] Uma concentração 2x de MP-AuNPs foi preparada usando duas vezes a massa de pó de casca de manga (60 mg) dissolvida em 6 mL de água DI. A mistura reacional foi agitada em um agitador magnético, à temperatura ambiente durante 18 horas. Uma quantidade de 0,1 M NaAuCI4 (100 gL) foi adicionada à mistura reacional. A cor da mistura mudou de amarelo para vermelho rubi, indicando a formação de MPAuNPs 2x.

[00103] A produção de uma formulação de fármaco Nano-Ayurvédica MP-AuNPs-A + B + C + D foi conduzida como se segue. MP-AuNPs 2x foi preparado como discutido no parágrafo anterior. Para a formulação do fármaco, os seguintes excipientes foram adicionados a 20 mL de MPAuNPs 2x-: (A) Fitoquímicos de groselha (2 g), (B) Fitoquímicos de casca de manga (4 g), (C) extrato de curcumina (1 g), e (D) goma arábica (0,5 g). Todos os excipientes foram adicionados aos MP-AuNPs e misturados durante 30 min. à temperatura ambiente. A mistura foi liofilizada para remover o excesso de água e para obter um material de fármaco seco. O rendimento foi de 6 g. A amostra foi armazenada em um recipiente hermético a 4°C. Mais genericamente, faixas adequadas para 20 mL de MP-AuNPs 2x incluem fitoquímicos de groselha (2-2,5 g), (B) fitoquímicos de casca de manga (4-5 g), (C) extrato de curcumina (1 -1,5 g), (D) goma arábica (0,5-1,0 g). Nas experiências, todos os excipientes foram adicionados aos MP-AuNPs e misturados durante 30-45 min. à temperatura ambiente. A mistura foi liofilizada para remover o excesso de água e para obter material de fármaco seco, o rendimento foi de 6 g. A amostra foi armazenada em recipiente rígido a 4-8°C e usada para estudos adicionais de biologia celular antitumoral.

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32/33 [00104] A figura 43 apresenta dados que mostram efeitos terapêuticos de MGF-AuNPs para controlar ou reduzir o tamanho do tumor em camundongos SCID portadores de tumor da próstata humano. Os animais foram randomizados e tratados intraperitonealmente no dia 0. O tratamento foi administrado por via intraperitoneal duas vezes por semana; n = 5; média ± STE. A comparação estatística foi feita entre diferentes grupos. Para p = 0,07 solução salina tratada versus MGFAuNPs 0,27 mg/kg pc, os resultados não foram estatisticamente significativos; para p = 0,021 solução salina tratada versus MGF-AuNPs 0,53 mg/kg bw, os resultados foram estatisticamente muito significativos; para p = 0,0009 salmoura tratado versus MGF 0,8 mg/kg bw, os resultados foram extrema e estatisticamente significativos.

[00105] Modalidades específicas incluem preparações de fármacos otimizadas para a produção de cápsulas para consumo humano. Um procedimento global preferido para a formulação de fármaco MP-AuNPsA + B + C+ Dé indicado abaixo. MP-AuNPs 2x foi preparado como discutido no parágrafo 102. Para a formulação do fármaco, os seguintes excipientes foram adicionados aos 10 mL de MP-AuNPs 2x; (A) Fitoquímicos de groselha (5 g), (B) Fitoquímicos de casca de manga (10 g), (C) extrato de curcumina (1 g) e (D) goma arábica (2,5 g). Todos os excipientes foram adicionados aos MP-AuNPs 2x e misturados durante 30 min. à temperatura ambiente. A mistura foi seca a 40 para remover o excesso de água e para obter material de fármaco seco. O rendimento foi de 17 g. A amostra foi armazenada em um recipiente hermético a 4°C. Mais genericamente, intervalos adequados para mistura com 10 mL de MP-AuNPs 2x incluem (A) fitoquímicos de groselha (5-6 g), (B) fitoquímicos de casca de manga (10-12 g), (C) extrato de curcumina (1 1,5 gm) e (D) goma arábica (2,5-3,0 g). Nas experiências, os excipientes foram adicionados ao MP-AuNPs-2x e misturados durante 30-45 min. à temperatura ambiente. A mistura foi seca a 40 para remover o excesso de água e para obter material de fármaco seco e o rendimento foi de 1617 g. A amostra foi armazenada em um recipiente hermético a 4-8°C e

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33/33 usada para outros estudos animais in vivo contra tumor.

[00106] A figura 44 ilustra dados que mostram os efeitos Terapêuticos de MP-AuNPs- A + B + C + D para controlar ou reduzir o tamanho do tumor em camundongos SCID portadores de tumor da próstata humano. Os animais foram randomizados e tratados por via oral no dia 0. O tratamento foi administrado duas vezes por semana; n = 5, onde MPD = MP- AuNPs-A + B + C + D fármaco.

[00107] Embora tenham sido mostradas e descritas modalidades específicas da presente invenção, deve ser entendido que outras modificações, substituições e alternativas são evidentes a um versado na técnica. Tais modificações, substituições e alternativas podem ser feitas sem sair do espírito e âmbito da invenção, o que deve ser determinado a partir das Reivindicações anexadas.

[00108] Várias características da invenção são apresentadas nas Reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, caracterizado por que o método compreende:

mistura dos produtos de groselha seca ou produto de casca de manga ou fitoquímicos existentes nos mesmos, em um meio líquido para formar uma solução de agente redutor;

mistura de sais de ouro na solução do agente redutor;

permitir a reação dos sais de ouro, na ausência de qualquer outro agente redutor, para formar uma solução em nanopartículas, de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvdicas estabilizadas, biocompatíveis.
2. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a referida mistura compreende a mistura de produto seco de groselha ou produto de casca de manga.
3. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, caracterizado por que o meio líquido consiste em água destilada (e/ ou água deionizada).
4. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, caracterizado por que o meio líquido consiste em um meio alcoólico ou em uma mistura de água e álcool.
5. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com qualquer uma das Reivindicações precedentes, caracterizado por que os sais de ouro consistem em AuCI4 não radioativo.

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6. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com qualquer uma das Reivindicações precedentes, caracterizado por que a concentração do produto de groselha na solução do agente redutor está na faixa de 1-3 ou 100-200 mM.
7. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por que a concentração para o peso do sal de ouro está na gama de 4-8 mg, com 6-10 mg de pó de groselha, em 6-10 mL de água destilada.
8. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por que a referida reação de permissão é conduzida a uma temperatura de solução de agente de 25-28°C.
9. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, caracterizado por que a concentração de produto de casca de manga na solução de agente redutor é suficiente para assegurar o consumo completo dos sais de ouro.
10. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, caracterizado por que compreende ainda a remoço dos não reagentes da solução após a referida reação de permissão.
11. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, caracterizado por que a referida mistura combina o produto de groselha e a referida mistura compreende ainda mistura de goma arábica ao meio líquido.
12. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas

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Ayurvédicas, de acordo com a Reivindicação 11, caracterizado por que compreende ainda, após a referida permissão, adição de (B) fitoquímicos de casca de manga, (C) extrato de curcumina, (D) goma arábica.
13. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, caracterizado por que a referida mistura combina produto de casca de manga, e compreende ainda, após a referida permissão, a adição de (B) fitoquímicos de groselha, (C) extrato de curcumina, (D) goma arábica.
14. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o produto de casca de manga é mangiferina.
15. Método de Terapia, caracterizado por que compreende injeção intraperitoneal, injeção intravenosa ou administração oral da solução de nanopartículas formada conforme definido em qualquer uma das Reivindicações precedentes.
16. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 14, caracterizado por que compreende ainda o processamento da solução de nanopartículas de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas estabilizadas e biocompatíveis para formar um pó seco ou uma cápsula seca de fármaco de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas.
17. Método de Terapia, caracterizado por que compreende a administração oral do pó seco ou cápsula seca formada conforme definido na Reivindicação 16.
18. Método de Terapia Contra Câncer ou Doença Inflamatória, caracterizado por que compreende a obtenção de uma solução de nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas, um pó seco de

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4/4 nanopartículas de ouro ayurvédicas encapsuladas ou cápsulas secas de nanopartículas de ouro ayurvédicas encapsuladas e injeção intraperitoneal, injeção intravenosa ou administração oral dos mesmos a um indivíduo que apresenta câncer ou doença inflamatória.
19. Método Para Formar Nanopartículas de Ouro Encapsuladas Ayurvédicas, de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por que as nanopartículas de ouro encapsuladas ayurvédicas são nanopartículas de ouro não radioativas.
20. Medicamento Ayurvédico, caracterizado por que consiste em uma nanopartícula de ouro não radioativa encapsulada com fitoquímicos existentes na casca da manga ou groselha em um pó seco ou cápsula com extrato de curcumina e goma arábica.