BR112019014738B1 - Compostos, seus usos e composição os compreendendo - Google Patents

Abstract

É descrito um sal de hemissulfato da estrutura: para tratar um hospedeiro infectado com hepatite C, bem como composições farmacêuticas e formas de dosagem, incluindo formas de dosagem sólidas do mesmo.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício dos pedidos provisórios U.S. 62/453.457 depositado em 1 de fevereiro de 2017; 62/469.912 depositado em 10 de março de 2017; 62/488.366 depositado em 21 de abril de 2017; e, 62/575.248 depositado em 20 de outubro de 2017. A totalidade destes pedidos é aqui incorporada pela referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção é o sal de hemissulfato de um composto de nucleotídeo selecionado que apresenta propriedades terapêuticas inesperadas para tratar um hospedeiro infectado com hepatite C, bem como composições farmacêuticas e formas de dosagem das mesmas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Hepatite C (HCV) é um vírus de RNA de fita simples e membro do gênero Hepacivirus. Estima-se que 75% de todos os casos de doença hepática sejam causados por HCV. Infecção por HCV pode levar à cirrose e câncer hepático e, se deixado progredir, à insuficiência hepática que pode exigir um transplante de fígado. Aproximadamente 71 milhões de pessoas em todo o mundo estão vivendo com infecções crônicas por HCV, e aproximadamente 399.000 pessoas morrem a cada ano de HCV, principalmente de cirrose e carcinoma hepatocelular.

[004] RNA polimerase é um alvo chave para o desenvolvimento de fármaco contra vírus de RNA de fita simples. A proteína não estrutural de HCV NS5B RNA polimerase dependente de RNA é uma enzima chave, responsável por iniciar e catalisar a síntese de RNA viral. Existem duas subclasses principais de inibidores de NS5B: análogos de nucleosídeo e inibidores não nucleosídeo (NNIs). Análogos de nucleosídeo são anabolizados para ativar trifosfatos que atuam como substratos alternativos para a polimerase e inibidores não nucleosídeo (NNIs) se ligarem às regiões alostéricas na proteína. Inibidores de nucleosídeo ou nucleotídeo imitam substratos naturais de polimerase e atuam como finalizadores de cadeia. Inibem o início da transcrição de RNA e alongamento de uma cadeia de RNA em crescimento.

[005] Além de alvejar RNA polimerase, outras proteínas virais de RNA também podem ser alvejadas em terapias de combinação. Por exemplo, proteínas de HCV que são alvos adicionais para abordagens terapêuticas são NS3/4A (uma serina protease) e NS5A (uma proteína não estrutural, que é um componente essencial de HCV replicase e exerce uma faixa de efeitos nas vias celulares).

[006] Em dezembro de 2013, o primeiro inibidor de NS5B polimerase no nucleosídeo, sofosbuvir (Sovaldi®, Gilead Sciences), foi aprovado. Sovaldi® é um pró-fármaco uridina fosforamidato que é absorvido por hepatócitos e passa por ativação intracelular para render o metabólito ativo, 2 ’ -des0xi-2’-α-fMor-β-C-metiluridina-5 ’ -trifosfato.

[007] Sovaldi® é o primeiro fármaco que demonstrou segurança e eficiência para tratar certos tipos de infecção por HCV, sen a necessidade de coadministração de interferon. Sovaldi® é o terceiro fármaco com designação de terapia inovadora a receber a aprovação de FDA.

[008] Em 2014, a FDA dos Estados Unidos aprovou Harvoni® (ledispasvir, um inibidor de NS5A, e sofosbuvir) para tratar infecção crônica por vírus de hepatite C genótipo 1. Harvoni® é a primeira pílula de combinação aprovada para tratar infecção crônica por HCV genótipo 1. É também o primeiro regime aprovado que não exige a administração com interferon ou ribavirina. Além disso, a FDA aprovou simeprevir (OlysioTM) em combinação com sofosbuvir (Sovaldi®) como um tratamento livre de interferon e ribavirina uma vez ao dia, totalmente oral, para adultos com infecção por HCV genótipo 1.

[009] A FDA dos Estados Unidos também aprovou VIEKIRA PakTM de AbbVie em 2014, uma embalagem de pílulas múltiplas contendo dasabuvir (um inibidor de NS5B polimerase não nucleosídeo), ombitasvir (um inibidor de NS5A), paritaprevir (um inibidor de NS3/4A), e ritonavir. O VIEKIRA PakTM pode ser usado com ou sem a ribavirina para tratar pacientes infectados com HCV genótipo 1, incluindo pacientes com cirrose compensada. VIEKIRA PakTM não exige coterapia com interferon.

[0010] Em julho de 2015, a FDA dos Estados Unidos aprovou TechnivieTM e DaklinzaTM para o tratamento de HCV genótipo 4 e HCV genótipo 3, respectivamente. TechnivieTM (Ombitasvir/paritaprevir/ritonavir) foi aprovado para uso em combinação com ribavirina, para o tratamento de HCV genótipo 4, em pacientes sem lesões e cirrose, e é a primeira opção para paciente infectados com HCV-4 que não exigem coadministração com interferon. DaklinzaTM foi aprovado para uso com Sovaldi® para tratar Infecções por HCV genótipo 3. DaklinzaTM é o primeiro fármaco que demonstrou segurança e eficiência em tratar HCV genótipo 3 sem a necessidade de coadministração de interferon ou ribavirina.

[0011] Em outubro de 2015, a FDA dos Estados Unidos orientou que tratamentos de HCV com Viekira Pak e Technivie podem causar graves lesões hepáticas, principalmente em pacientes com doença hepática avançada subjacente, e exigem que informação adicional em relação à segurança seja adicionada ao rótulo.

[0012] Outras terapias aprovadas atuais para HCV incluem interferon alfa-2b ou interferon alfa-2b peguilado (Pegintron®) que pode ser administrado com ribavirina (Rebetol®), NS3/4A telaprevir (Incivek®, Vertex e Johnson & Johnson), boceprevir (VictrelisTM, Merck), simeprevir (OlysioTM, Johnson & Johnson), paritaprevir (AbbVie), Ombitasvir (AbbVie), o NNI Dasabuvir (ABT-333) e ZepatierTM de Merck (uma combinação de único comprimido dos dois fármacos grazoprevir e elbasvir).

[0013] Inibidores de NS5B polimerase adicionais estão atualmente em desenvolvimento. Merck está desenvolvendo o pró-fármaco nucleotídico de uridina MK-3682 (anteriormente Idenix IDX21437) e o fármaco está atualmente em testes de combinação de fase II.

[0014] Patentes dos Estados Unidos e pedidos WO que descrevem inibidores de nucleosídeo polimerase para o tratamento de Flaviviridae, incluindo HCV, incluem aqueles depositados por Idenix Pharmaceuticals (6.812.219; 6.914.054; 7.105.493; 7.138.376; 7.148.206; 7.157.441; 7.163.929; 7.169.766; 7.192.936; 7.365.057; 7.384.924; 7.456.155; 7.547.704; 7.582.618; 7.608.597; 7.608.600; 7.625.875; 7.635.689; 7.662.798; 7.824.851; 7.902.202; 7.932.240; 7.951.789; 8.193.372; 8.299.038; 8.343.937; 8.362.068; 8.507.460; 8.637.475; 8.674.085; 8.680.071; 8.691.788; 8.742.101; 8.951.985; 9.109.001; 9.243.025; US2016/0002281; US2013/0064794; WO/2015/095305; WO/2015/081133; WO/2015/061683; WO/2013/177219; WO/2013/039920; WO/2014/137930; WO/2014/052638; WO/2012/154321); Merck (6.777.395; 7.105.499; 7.125.855; 7.202.224; 7.323.449; 7.339.054; 7.534.767; 7.632.821; 7.879.815; 8.071.568; 8.148.349; 8.470.834; 8.481.712; 8.541.434; 8.697.694; 8.715.638. 9.061.041; 9.156.872 e WO/2013/009737); Universidade Emory (6.348.587; 6.911.424; 7.307.065; 7.495.006; 7.662.938; 7.772.208; 8.114.994; 8.168.583; 8.609.627; US 2014/0212382; e WO2014/1244430); Gilead Sciences/ Pharmasset Inc. (7.842.672; 7.973.013; 8.008.264; 8.012.941; 8.012.942; 8.318.682; 8.324.179; 8.415.308; 8.455.451; 8.563.530; 8.841.275; 8.853.171; 8.871.785; 8.877.733; 8.889.159; 8.906.880; 8.912.321; 8.957.045; 8.957.046; 9.045.520; 9.085.573; 9.090.642; e 9.139.604) e (6.908.924; 6.949.522; 7.094.770; 7.211.570; 7.429.572; 7.601.820; 7.638.502; 7.718.790; 7.772.208; RE42.015; 7.919.247; 7.964.580; 8.093.380; 8.114.997; 8.173.621; 8.334.270; 8.415.322; 8.481.713; 8.492.539; 8.551.973; 8.580.765; 8.618.076; 8.629.263; 8.633.309; 8.642.756; 8.716.262; 8.716.263; 8.735.345; 8.735.372; 8.735.569; 8.759.510 e 8.765.710); Hoffman La-Roche (6.660.721), Roche (6.784.166; 7.608.599. 7.608.601 e 8.071.567); Alios BioPharma Inc. (8.895.723; 8.877.731; 8.871.737, 8.846.896. 8.772.474; 8.980.865; 9.012.427; US 2015/0105341; US 2015/0011497; US 2010/0249068; US2012/0070411; WO 2015/054465; WO 2014/209979; WO 2014/100505; WO 2014/100498; WO 2013/142159; WO 2013/142157; WO 2013/096680; WO 2013/088155; WO 2010/108135), Enanta Pharmaceuticals (US 8.575.119; 8.846.638; 9.085.599; WO 2013/044030; WO 2012/125900), Biota (7.268.119; 7.285.658; 7.713.941; 8.119.607; 8.415.309; 8.501.699 e 8.802.840), Biocryst Pharmaceuticals (7.388.002; 7.429.571; 7.514.410; 7.560.434; 7.994.139; 8.133.870; 8.163.703; 8.242.085 e 8.440.813), Alla Chem, LLC (8.889.701 e WO 2015/053662), Inhibitex (8.759.318 e WO/2012/092484), Janssen Products (8.399.429; 8.431.588. 8.481.510. 8.552.021. 8.933.052; 9.006.29 e 9.012.428) a Fundação da Universidade de Georgia (6.348.587; 7.307.065; 7.662.938; 8.168.583; 8.673.926. 8.816.074; 8.921.384 e 8.946.244), RFS Pharma, LLC (8.895.531; 8.859.595; 8.815.829; 8.609.627; 7.560.550; US 2014/0066395; US 2014/0235566; US 2010/0279969; WO/2010/091386 e WO 2012/158811) Universidade College Cardiff Consultants Limited (WO/2014/076490, WO 2010/081082; WO/2008/062206), Achillion Pharmaceuticals, Inc. (WO/2014/169278 e WO 2014/169280), Cocrystal Pharma, Inc. (US 9.173.893), Katholieke Universiteit Leuven (WO 2015/158913), Catabasis (WO 2013/090420) e os regentes da Universidade de Minnesota (WO 2006/004637).

[0015] Atea Pharmaceuticals, Inc. verificou nucleotídeos de β-D-2’- des(0xi-2’-α-fliu)r-2’-β-C-siibstiliiid()-2-m()dificad()-N6-(ni()ii()- e di-metil) purina para o tratamento de HCV na patente U.S. 9.828.410 e pedido PCT N(. WO 2016/144918. Atea também verific(i nicle(tíde(s de β-D-2’- des(xi-2’-sibstitiíd(-4’-sibstitiíd(-2-N6-sibstitiíd(-6-amin(pirina para ( tratament( de infecções p(r paramix(víris e (rt(mix(víris em US 2018/0009836 e WO 2018/009623.

[0016] Ainda permanece ima grande necessidade médica de desenv(lver terapias anti-HCV qie sejam segiras, eficientes e bem t(leradas. A necessidade é acentiada pela expectativa da resistência a( fármac(. Antivirais c(m açã( direta mais p(tentes p(dem diminiir significativamente a diraçã( d( tratament( e melh(rar as taxas de c(nc(rdância e SVR (resp(sta viral sistentada) para pacientes infectad(s c(m t(d(s (s gen(tip(s de HCV.

[0017] P(rtant(, é im (bjetiv( da presente invençã( pr(ver c(mp(st(s, c(mp(sições farmacêiticas, mét(d(s e f(rmas de d(sagem para tratar e/(i prevenir infecções de HCV.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0018] Verific(i-se sirpreendentemente qie ( sal de hemissilfat( d( c(mp(st( 1, qie é pr(vid( a segiir c(m( c(mp(st( 2, exibe pr(priedades terapêiticas vantaj(sas inesperadas, incliind( melh(r bi(disp(nibilidade e seletividade de (rgã( alv(, c(m relaçã( à sia base livre (C(mp(st( 1). Estas vantagens inesperadas nã( p(deriam ter sid( previstas c(m antecedência. O c(mp(st( 2 é, assim, ima c(mp(siçã( terapeiticamente siperi(r de material a ser administrada em uma quantidade eficiente em um hospedeiro que precisa da mesma, tipicamente um humano, para o tratamento de hepatite C. O composto 2 é referido como o sal de hemissulfato de isopropil((S)- (((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-(metilamino)-9H-purin-9-yi)-4-flúor-3- hidróxi-4-metiltetra-hidrofuran-2-il)metóxi)(fenóxi)fosforil)-L-alaninato. O composto 1 é descrito na patente U.S. 9.828.410.

[0019] Composto 2, como o composto 1, é convertido em seu nucleotídeo trifosfato correspondente (Composto 1-6) na célula, que é o metabólito ativo e inibidor de RNA polimerase (vide esquema 1 a seguir). Uma vez que o composto 1-6 é produzido na célula e não deixa a célula, não é mensurável no plasma. Entretanto, o composto 1-7 de metabólito 5’-OH (vide esquema 1) é exportado da célula e, portanto, é mensurável no plasma e atua como um substituto da concentração do composto 1-6 de metabólito ativo intracelular.

[0020] Verificou-se que a concentração plasmática in vivo do composto substituto 1-7 e, assim, composto intracelular 1-6, é substancialmente maior quando o composto 2 é administrado in vivo do que quando o composto 1 é administrado in vivo. Em um estudo comparativo de cachorros dosados com composto 1 e composto 2 (Exemplo 19, Tabela 28), a dosagem com composto 2 atingiu uma AUC(0-4horas) do metabólito de nucleosídeo guanina 5’-OH final (1-7) que é suas vezes tão alta quanto a AUC após dosagem com o composto 1. É inesperado que um sal não covalente apresente um efeito como este na concentração plasmática do fármaco original (Composto 1).

[0021] Adicionalmente, o composto 2 se divide seletivamente in vivo para o fígado em relação ao coração (Exemplo 19, Tabela 29), o que é benéfico, uma vez que fígado é o órgão doente em hospedeiros infectados com HCV. Os cachorros foram dosados com composto 1 ou composto 2, e a concentração do trifosfato ativo (1-6) no fígado e coração foi medida. A razão de fígado para coração da concentração de trifosfato ativo foi mais elevada após a dosagem com composto 2, comparada ao composto 1, da maneira mostrada na tabela 29. Especificamente, a razão de separação de fígado/coração para o composto 2 é 20 comparada a uma razão de separação de fígado/coração de 3:1 para o composto 1. Estes dados indicam, inesperadamente, que a administração do composto 2 resulta na distribuição preferencial da guanina trifosfato ativo (Composto 1-6) no fígado em relação ao coração, quando comparado ao composto 1, que reduz efeitos fora do alvo potenciais. Foi inesperado que a administração do composto 2 pudesse reduzir significativamente separações fora do alvo indesejadas. Isto permite a administração do composto 2 em uma dose maior que o composto 1, se desejado, pelo profissional de saúde.

[0022] Além disso, os níveis teciduais no fígado e coração do derivado de guanina trifosfato ativo do composto 2 (metabólito 1-6) foram medidos após doses orais do composto 2 em ratos e macacos (Exemplo 20). Níveis elevados da guanina trifosfato ativo (1-6) foram medidos no fígado de todas as espécies testadas. De maneira importante, os níveis não quantificáveis da guanina trifosfato (1-6) foram medidos em corações de macaco, e isto é indicativo de formação específica no fígado do trifosfato ativo. Verificou-se assim que, comparada à dosagem do composto 1, a dosagem do composto 2 melhora a distribuição de guanina trifosfato (1-6).

[0023] Quando administrado aos pacientes saudáveis e infectados com hepatite C, o composto 2 foi bem tolerado após uma única dose oral e os parâmetros farmacocinéticos Cmax, Tmax e AUCtot foram comparáveis em ambos os grupos (Tabelas 34 e 35). Da maneira descrita no exemplo 24, uma única dose do composto 2 em pacientes infectados com HCV resultou em uma atividade antiviral significativa. A exposição plasmática do metabólito 17 foi principalmente proporcional à dose, em relação à faixa estudada.

[0024] Análises farmacocinéticas/farmacodinâmicas individuais de pacientes dosados com composto 2 mostraram que a resposta viral está correlacionada com a exposição plasmática do metabólito 1-7 do composto 2 (Exemplo 24, FIGS. 23A-23F), indicando que respostas virais intensas são atingidas com doses fortes do composto 2.

[0025] O exemplo 24 confirma que, como modalidades não limitantes, doses orais únicas de 300 mg, 400 mg, e 600 mg resultam em atividade antiviral significativa em humanos. A concentração plasmática mínima C24 de metabólito 1-7, após uma dose de 600 mg do composto 2, foi o dobre da concentração plasmática mínima C24 de metabólito 1-7, após uma dose de 300 mg do composto 2.

[0026] FIG. 24 e exemplo 25 destaca a invenção notável, provida pelo composto 2, para o tratamento de hepatite C. Da maneira mostrada na FIG. 24, os níveis plasmáticos mínimos no estado estacionário (C24,ss) do metabólito 1-7, após dosagem do composto 2 em humanos (600 mg QD (550 mg de base livre equivalente) e 450 mg de QD (400 mg de base livre equivalente)), foram previstos e comparados à EC95 do composto 1 in vitro, através de uma faixa de isolados clínicos de HCV, para determinar se a concentração plasmática no estado estacionário é consistentemente maior que a EC95, que pode resultar ema maior eficiência contra múltiplos isolados clínicos in vivo. A EC95 para o composto 1 é o mesmo que a EC95 do composto 2. Para o composto 2 ser eficiente, o nível plasmático mínimo no estado estacionário do metabólito 1-7 deve exceder a EC95.

[0027] Da maneira mostrada na FIG. 24, a EC95 do composto 2 contra todos os isolados clínicos testados variou de aproximadamente 18 nM a 24 nM.

[0028] Da maneira mostrada na FIG. 24, o composto 2 em uma dose de 450 mg QD (400 mg de base livre equivalente) em humanos provê uma concentração plasmática mínima no estado estacionário prevista (C24,ss) de aproximadamente 40 ng/mL. O composto 2 em uma dose de 600 mg QD (550 mg de base livre equivalente) em humanos provê uma concentração plasmática mínima no estado estacionário prevista (C24,ss) de aproximadamente 50 ng/mL.

[0029] Portanto, a concentração plasmática no estado estacionário prevista de metabólito 1-7 substituto é quase o dobro da EC95 contra todos os isolados clínicos testados (mesmo o difícil de tratar GT3a), o que indica desempenho superior.

[0030] Ao contrário, a EC95 do padrão do nucleotídeo sofosbuvir de cuidado (Sovaldi) varia de 50 nM a 265 nM entre todos os isolados clínicos testados de HCV, com uma EC95 menor que a concentração no estado estacionário prevista na dosagem comercial de 400 mg para apenas dois isolados, GT2a e GT2b. A EC95 para a dosagem comercial de 400 mg de sofosbuvir é maior que a concentração no estado estacionário prevista para outros isolados clínicos, GT1a, GT1b, GT3a, GT4a e GT4d.

[0031] Os dados que comparam os parâmetros de eficiência e farmacocinética no estado estacionário na FIG. 24 mostram claramente a importância terapêutica inesperada do composto 2 para o tratamento de hepatite C. De fato, o nível plasmático do estado estacionário previsto (C24,ss) após administração do composto 2 é previsto para ser pelo menos 2 vezes maior que a EC95 para todos os genótipos testados, e é 3 a 5 vezes mais potente contra GT2. Estes dados indicam que o composto 2 apresenta atividade antiviral pan-genotípica potente em humanos. Da maneira mostrada na FIG. 24, a EC95 de sofosbuvir contra GT1, GT3, e GT4 é maior que 100 ng/mL. Assim, surpreendentemente, composto 2 é ativo contra HCV em uma forma de dosagem que libera uma concentração mínima no estado estacionário menor (40-50 ng/mL) que a concentração mínima no estado estacionário (aproximadamente 100 ng/mL) atingida pela forma de dosagem equivalente de sofosbuvir.

[0032] Em uma modalidade, portanto, a invenção inclui uma forma de dosagem do composto 2 que provê uma concentração plasmática mínima no estado estacionário (C24,ss) do metabólito 1-7 entre aproximadamente 15-75 ng/mL, por exemplo, 20-60 ng/mL, 25-50 ng/mL, 40-60 ng/mL, ou mesmo 40-50 ng/mL. Isto é inesperado, à luz do fato de que a concentração no estado estacionário do metabólito de sofosbuvir equivalente é aproximadamente 100 ng/mL.

[0033] Adicionalmente, verificou-se que o composto 2 é um sal não hidroscópico, muito solúvel, incomumente estável com atividade contra HCV. Isto é surpreendente em decorrência de inúmeros sais do composto 1 sem ser o sal de hemissulfato (Composto 2), incluindo o sal monossulfato (Composto 3), não serem fisicamente estáveis, mas em vez disso, se liquefazem ou se tornam sólidos gomosos (Exemplo 4) e, assim, não são adequados para formas de dosagens farmacêuticas sólidas estáveis. Surpreendentemente, embora o composto 2 nãos e torne gomoso, é até 43 vezes mais solúvel em água, comparado ao composto 1 e é mais de 6 vezes mais solúvel que o composto 1 em condições de fluido gástrico simulado (SGF) (Exemplo 15).

[0034] Da maneira discutida no exemplo 16, o composto 2 permanece um sólido branco com IR que corresponde ao padrão de referência por 6 meses em condições de estabilidade acelerada (40°C/75% de RH). O composto 2 é estável por 9 meses em condições ambientes (25°C/60% de RH) e condições refrigeradas (5°C).

[0035] As formas de dosagem sólidas (comprimidos de 50 mg e 100 mg) do composto 2 também são quimicamente estáveis em condições aceleradas (40°C/75% de RH) e de refrigeração (5°C) por 6 meses (Exemplo 26). O composto 2 é estável em condições ambientes (25°C/60% de RH), em uma forma de dosagem sólida por pelo menos 9 meses.

[0036] O esquema 1 provê a via metabólica do composto 1 e composto 2, que envolve a desesterificação inicial do fosforamidato (metabólito 1-1) para formar o metabólito 1-2. Metabólito 1-2 é então convertido no derivado de N6-metil-2,6-diaminopurina-5’-monofosfato (metabólito 1-3), que é por sua vez metabolizado no nucleotídeo 5’-hidroxil- N6-metil-2,6-diaminopurina livre (metabólito 1-8) e ((2R,3R,4R,5R)-5-(2- amino-6-oxo-1,6-di-hidro-9H-purin-9-il)-4-flúor-3-hidróxi-4-metiltetra- hidrofuran-2-il)metil di-hidrogênio fosfato como o 5’-monofosfato (metabólito 1-4). Metabólito 1-4 é anabolizado no difosfato correspondente (metabólito 1-5) e a seguir no derivado de trifosfato ativo (metabólito 1-6). O 5’-trifosfato pode ser metabolizado adicionalmente para gerar 2-amino-9- ((2R,3R,4R,5R)-3-flúor-4-hidróxi-5-(hidroximetil)-3-metiltetra-hidrofuran-2- il)-1,9-di-hidro-6H-purin-6-ona (1-7). Metabólito 1-7 é mensurável no plasma e é, portanto, um substituto para o trifosfato ativo (1-6), que não é mensurável no plasma.

[0037] Em uma modalidade, a invenção é o composto 2 e seu uso para tratar hepatite C (HCV) em um hospedeiro que precisa do mesmo, opcionalmente em um carreador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto, o composto 2 é usado como um sólido amorfo. Em um outro aspecto, o composto 2 é usado como um sólido cristalino.

[0038] A presente invenção inclui adicionalmente um processo no limite exemplar para a preparação do composto 2 que inclui: (i) uma primeira etapa de dissolver o composto 1 em um solvente orgânico, por exemplo, acetona, etil acetato, metanol, acetonitrila, ou éter ou similares, em um frasco ou recipiente; (ii) carregar um segundo frasco ou recipiente com um segundo solvente orgânico, que pode ser o mesmo ou diferente do solvente orgânico na etapa (i), opcionalmente resfriar o segundo solvente em 0-10 graus C, e adicionar H2SO4 gota a gota ao segundo solvente orgânico para criar uma mistura H2SO4/solvente orgânico; e em que o solvente pode ser, por exemplo, metanol; (iii) adicionar gota a gota a mistura H2SO4/solvente em uma razão molar de 0,5/1,0 da etapa (ii) na solução do composto 1 da etapa (i) em temperatura ambiente ou levemente aumentada ou diminuída (por exemplo, 23-35 graus C); (iv) agitar a reação da etapa (iii) até a precipitação do composto 2 ser formada, por exemplo, em temperatura ambiente ou levemente aumentada ou diminuída; (v) filtrar opcionalmente o precipitado resultante da etapa (iv) e lavar com um solvente orgânico; e (vi) secar opcionalmente o composto 2 resultante em um vácuo, opcionalmente em uma temperatura elevada, por exemplo, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60°C.

[0039] Em uma modalidade, o solvente orgânico na etapa (i) é 3- metil-2-pentanona. Em uma modalidade, o solvente orgânico na etapa (i) é etil isopropil cetona. Em uma modalidade, o solvente orgânico na etapa (i) é metil propionato. Em uma modalidade, o solvente orgânico na etapa (i) é etil butirato.

[0040] Apesar do volume de depósitos de patente e literatura sobre nucleosídeo antiviral, o composto 2 não foi especificamente descrito. Dessa maneira, a presente invenção inclui o composto 2, ou uma composição farmaceuticamente aceitável ou forma de dosagem da mesma, da maneira aqui descrita.

[0041] Compostos, métodos, formas de dosagem e composições são providos para o tratamento de um hospedeiro infectado com um vírus HCV por meio da administração de uma quantidade eficiente do composto 2. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado em uma dose de pelo menos cerca de 100, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,750, 800, 850, 900, 950, ou 1.000 mg. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado por até 12 semanas, por até 10 semanas, por até 8 semanas, por até 6 semanas, ou por até 4 semanas. Em modalidades alternativas, o composto 2 é administrado por pelo menos 4 semanas, por pelo menos 6 semanas, por pelo menos 8 semanas, por pelo menos 10 semanas, ou por pelo menos 12 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia ou qualquer outro dia. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que atinge um nível plasmático mínimo no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 entre aproximadamente 15-75 ng/mL. Em uma modalidade, composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que atinge um nível plasmático mínimo no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 entre aproximadamente 20-60 ng/mL. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que atinge uma AUC de metabólito 1-7 entre aproximadamente 1.200 ng*h/mL e 3.000 ng*h/mL. Em uma modalidade, composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que atinge uma AUC de metabólito 1-7 entre aproximadamente 1.500 e 2.100 ng*h/mL.

[0042] Os compostos, composições e formas de dosagem também podem ser usados para tratar condições relacionadas tais como condições positivas para anticorpo anti-HCV e positivas para antígeno, inflamação hepática crônica com base viral, câncer hepático resultante de hepatite C avançada (carcinoma hepatocelular (HCC)), cirrose, hepatite C crônica e aguda, hepatite C fulminante, hepatite C persistente crônica e fadiga baseada em anti-HCV. O composto ou formulações que incluem os compostos também podem ser usados profilaticamente para prevenir ou restringir a progressão de doença clínica em indivíduos que são positivos ao anticorpo anti-HCV ou positivos ao antígeno, ou que foram expostos à hepatite C.

[0043] A presente invenção inclui assim as seguintes características: (a) Composto 2 da maneira aqui descrita; (b) Pró-fármacos do composto 2 (c) Uso do composto 2 na fabricação de um medicamento para tratamento de uma infecção por vírus de hepatite C; (d) Composto 2 para uso para tratar hepatite C, opcionalmente em um carreador farmaceuticamente aceitável; (e) Um método para fabricar um medicamento pretendido para o uso terapêutico para tratar uma infecção por vírus de hepatite C, distinguido pelo fato de que o composto 2, ou um sal farmaceuticamente aceitável, da maneira aqui descrita é usado na fabricação; (f) Uma formulação farmacêutica compreendendo uma quantidade eficiente para tratar o hospedeiro do composto 2 com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; (g) Processos para a preparação de produtos terapêuticos que contêm uma quantidade eficiente do composto 2; (h) Formas de dosagem sólidas, incluindo aquelas que provêm um perfil farmacocinético vantajoso; e (i) Processos para a fabricação do composto 2, da maneira aqui descrita.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0044] FIG. 1A é uma sobreposição de difratogramas de XRPD das amostras 1-1 (composto amorfo 1), 1-2 (composto cristalino 1), e 1-3 (composto amorfo 2) antes de estudos de estabilidade com propósitos de caracterização, da maneira descrita no exemplo 2 e exemplo 5. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0045] FIG. 1B é o cromatógrafo HPLC do composto amorfo 1 (amostra 1-1) para determinar a pureza, da maneira descrita no exemplo 2. A pureza da amostra foi 98,7%. O eixo X é a medida do tempo em minutos e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0046] FIG. 2A é o cromatógrafo HPLC do composto cristalino 1 (amostra 1-2) para determinar a pureza, da maneira descrita no exemplo 2. A pureza da amostra foi 99,11%. O eixo X é a medida do tempo em minutos e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0047] FIG. 2B é um gráfico de DSC e TGA do composto cristalino 1 (amostra 1-2) antes de qualquer dos estudos de estabilidade com propósitos de caracterização, da maneira descrita no exemplo 2. O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual.

[0048] FIG. 3 é uma imagem de cristalografia de raios-X do composto 1 que mostra a estereoquímica absoluta, da maneira descrita no exemplo 2.

[0049] FIG. 4A é uma sobreposição de difratogramas de XRPD das amostras 1-1 (composto amorfo 1), 1-2 (composto cristalino 1), e 1-3 (composto amorfo 2) após armazenamento a 25°C e 60% de umidade relativa por 14 dias, da maneira descrita no exemplo 2. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0050] FIG. 4B é uma sobreposição de difratogramas de XRPD das amostras 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, e 1-9 após armazenamento a 25°C e 60% de umidade relativa por 7 dias, da maneira descrita no exemplo 4. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0051] FIG. 5A é uma sobreposição de difratogramas de XRPD das amostras 1-4, 1-6, 1-7, e 1-9 após armazenamento a 25°C e 60% de umidade relativa por 14 dias, da maneira descrita no exemplo 4. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0052] FIG. 5B é o padrão de XRPD do composto amorfo 2 (amostra 1-3) da maneira descrita no exemplo 5. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0053] FIG. 6A é o cromatógrafo HPLC do composto amorfo 2 (amostra 1-3) para determinar a pureza da maneira descrita no exemplo 5. A pureza da amostra foi 99,6%. O eixo X é a medida do tempo em minutos e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0054] FIG. 6B é um gráfico de DSC e TGA para o composto amorfo 2 (amostra 1-3) antes de qualquer dos estudos de estabilidade com propósitos de caracterização, da maneira descrita no exemplo 5. O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual.

[0055] FIG. 7A é uma sobreposição de difratogramas de XRPD de amostras cristalinas (amostras 2-2, 2-6, e 2-7) e amostras pouco cristalinas (amostras 2-3, 2-4, 2-5, e 2-8), identificadas a partir da cristalização do composto 2 (Exemplo 6). O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y intensidade medida em contagens.

[0056] FIG. 7B é uma sobreposição de difratogramas de XRPD de amostras amorfas (amostras 2-9, 2-10, e 2-11) identificadas a partir da cristalização do composto 2 (Exemplo 6). O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y intensidade medida em contagens.

[0057] FIG. 8A é uma sobreposição de difratogramas de XRPD das amostras (amostras 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7 e 2-8) após 6 dias de armazenamento a 25°C e 60% de umidade relativa (Exemplo 6). O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y intensidade medida em contagens.

[0058] FIG. 8B é um gráfico de DSC e TGA para a amostra 2-2 (Exemplo 6). O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual. Procedimentos experimentais para coleta de DSC e TGA são fornecidos no exemplo 2.

[0059] FIG. 9A é um gráfico de DSC e TGA para a amostra 2-3 (Exemplo 6). O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual. Procedimentos experimentais para coleta de DSC e TGA são fornecidos no exemplo 2.

[0060] FIG. 9B é um gráfico de DSC e TGA para a amostra 2-4 (Exemplo 6). O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual. Procedimentos experimentais para coleta de DSC e TGA são fornecidos no exemplo 2.

[0061] FIG. 10A é um gráfico de DSC e TGA para a amostra 2-5 (Exemplo 6). O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual. Procedimentos experimentais para coleta de DSC e TGA são fornecidos no exemplo 2.

[0062] FIG. 10B é um gráfico de DSC e TGA para a amostra 2-6 (Exemplo 6). O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual. Procedimentos experimentais para coleta de DSC e TGA são fornecidos no exemplo 2.

[0063] FIG. 11A é um gráfico de DSC e TGA para a amostra 2-7 (Exemplo 6). O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual. Procedimentos experimentais para coleta de DSC e TGA são fornecidos no exemplo 2.

[0064] FIG. 11B é um gráfico de DSC e TGA para a amostra 2-8 (Exemplo 6). O eixo X é temperatura medida em°C, o fluxo de calor do eixo y à esquerda medido em (W/g), e o eixo y à direita é o peso medido em percentual. Procedimentos experimentais para coleta de DSC e TGA são fornecidos no exemplo 2.

[0065] FIG. 12A é o padrão de XRPD do composto amorfo 4 (amostra 3-12) da maneira discutida no exemplo 7. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens. Nenhuma cristalização de um sal malonato foi observado, independente do solvente usado.

[0066] FIG. 12B é uma sobreposição de difratogramas de XRPD de amostras amorfas (amostras 3-6, 3-10, 3-11, e 3-12) identificadas a partir da cristalização experimentada do composto 1 com sal malonato (Exemplo 7). O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0067] FIG. 13A é o cromatograma de HPLC da amostra 3-12, a partir das cristalizações experimentadas do composto 1 com sal malonato, da maneira descrita no exemplo 7. A amostra foi 99,2% pura. O eixo X é a medida do tempo em minutos e o eixo Y é intensidade medida em mAu.

[0068] FIG. 13B é uma sobreposição de difratogramas de XRPD de amostras sólidas obtidas da cristalização que usa LAG (amostras 4-13, 4-12, 4-9, 4-3, e 4-1), comparado ao composto 1 (amostra 1-2), da maneira descrita no exemplo 8. Toda a XRDP combina os padrões do contra-íon ácido cristalino sem nenhum pico adicional. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0069] FIG. 14A é uma sobreposição de difratogramas de XRPD das amostras obtidos da utilização de etil acetato como um solvente de cristalização (amostras 6-13, 6-12, 6-11, 6-10, 6-8, 6-7, 6-6, 6-5, 6-4, e 6-2), comparado ao composto cristalino 1 (amostra 1-2), da maneira descrita no exemplo 10. Observou-se que os padrões de XRPD geralmente combinavam com o padrão do composto 1, com a exceção das amostras 6-2, 6-4, e 6-5 que exibem poucas diferenças. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0070] Fig. 14B é uma sobreposição de difratograma de XRPD da amostra 5-1, após uma segunda dissolução em MEK, e a adição do antissolvente ciclo-hexano e ácido pamóico, da maneira descrita no exemplo 9. Amostra 5-1, cristalizada em ácido pamóico, era um sólido após maturação, mas o padrão de XRPD combinou com o padrão de ácido pamóico.

[0071] FIG. 15A é uma sobreposição de difratogramas de XRPD das amostras obtidas, a partir da utilização de etil acetato como um solvente de cristalização (amostras 6-5, 6-4, e 6-2), comparado ao composto cristalino 1 (amostra 1-2), da maneira descrita no exemplo 10. Observou-se em geral que os padrões de XRPD combinaram com o padrão do composto 1, com a exceção das amostras 6-2, 6-4, e 6-5 que exibem poucas diferenças. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens e marcado com o ácido usado na cristalização.

[0072] FIG. 15B é o padrão de XRPD para o composto 2 da maneira descrita no exemplo 14. O eixo X é 2Teta medido em graus e o eixo Y é intensidade medida em contagens.

[0073] FIG. 16A é um gráfico dos níveis de concentração de TP ativo (metabólito 1-6) nos fígados e corações de ratos, cachorros e macacos (Exemplo 18). O eixo X é a dosagem medida em mg/kg para cada espécie e o eixo Y é a concentração ativa de TP medida em ng/g.

[0074] FIG. 16B é um gráfico dos níveis de concentração de TP ativo (metabólito 1-6) no fígado e coração de cachorros (n=2), medidos 4 horas após uma única dose oral do composto 1 ou composto 2 (Exemplo 19). O eixo X é a dosagem de cada composto medida em mg/kg e o eixo Y é a concentração ativa de TP medida em ng/g.

[0075] FIG. 17 é o perfil plasmático do composto 1 e metabólito 1-7 em ratos, fornecido em uma única dose oral de 500 mg/kg do composto 2 (Exemplo 20), medido 72 horas após a dose. O eixo X é o tempo medido em horas e o eixo Y é a concentração plasmática medida em ng/mL.

[0076] FIG. 18 é o perfil plasmático do composto 1 e metabólito 1-7 em macacos, fornecido em doses orais únicas de 30 mg, 100 mg, ou 300 mg do composto 2 (Exemplo 20), medido 72 horas após a dose. O eixo X é tempo medido em horas e o eixo Y é concentração plasmática medida em ng/mL.

[0077] FIG. 19 é um gráfico de EC95 medido em nM de sofosbuvir e composto 1 contra isolados clínicos de HCV. Os valores de EC95 para o composto 1 são 7-33 vezes menores que sofosbuvir (Exemplo 22). O eixo X é marcado com o genótipo e o eixo Y é EC95 medido em nM.

[0078] FIG. 20 é um gráfico de EC50 medido em nM de sofosbuvir e composto 1 contra cepas de laboratório de HCV genótipos 1a, 1b, 2a, 3a, 4a e 5a. O composto 1 é aproximadamente 6-11 vezes mais potente do que sofosbuvir nos genótipos 1-5 (Exemplo 22). O eixo X é marcado com o genótipo e o eixo Y é EC50 medido em nM.

[0079] FIG. 21 é um gráfico do perfil de concentração plasmática média-tempo do composto 1, após a administração de uma única dose do composto 2, em todos os coortes da parte B do estudo, da maneira descrita no exemplo 24. O composto 1 foi prontamente absorvido e rapidamente metabolizado em aproximadamente 8 horas em todos os coortes da parte B. O eixo X é o tempo medido em horas e o eixo Y é a concentração plasmática média geométrica medida em ng/mL.

[0080] FIG. 22 é um gráfico do perfil de concentração plasmática média-tempo do metabólito 1-7, após a administração de uma única dose do composto 2, em todos os coortes da parte B do estudo, da maneira descrita no exemplo 24. Metabólito 1-7 exibiu concentração plasmática contínua em todos os coortes da parte B. O eixo X é o tempo medido em horas e o eixo Y é a concentração plasmática média geométrica medida em ng/mL.

[0081] FIG. 23A é uma análise farmacocinética/farmacodinâmica individual de um sujeito incluído no coorte 1b, da maneira descrita no exemplo 24. O gráfico mostra exposição plasmática de metabólito 1-7 e níveis de redução de RNA de HCV. A linha tracejada representa a concentração mínima de metabólito 1-7 exigida para manter uma resposta viral maior que o valor de EC95 contra GT1b. O eixo X é o tempo medido em horas. O eixo Y à esquerda é a concentração plasmática de metabólito 1-7 medida em ng/mL, e o eixo y à direita é a redução de RNA de HCV medida em log10 IU/mL.

[0082] FIG. 23B é uma análise farmacocinética/farmacodinâmica individual de um sujeito incluído no coorte 1b, da maneira descrita no exemplo 24. O gráfico mostra exposição plasmática do metabólito 1-7 e níveis de redução de RNA de HCV. A linha tracejada representa a concentração mínima de metabólito 1-7 exigida para manter uma resposta viral maior que o valor de EC95 contra GT1b. O eixo X é o tempo medido em horas. O eixo Y à esquerda é a concentração plasmática de metabólito 1-7 medida em ng/mL, e o eixo y à direita é a redução de RNA de HCV medida em log10 IU/mL.

[0083] FIG. 23C é uma análise farmacocinética/farmacodinâmica individual de um sujeito incluído no coorte 1b, da maneira descrita no exemplo 24. O gráfico mostra exposição plasmática de metabólito 1-7 e níveis de redução de RNA de HCV. A linha tracejada representa a concentração mínima de metabólito 1-7 exigida para manter uma resposta viral maior que o valor de EC95 contra GT1b. O eixo X é o tempo medido em horas. O eixo Y à esquerda é a concentração plasmática de metabólito 1-7 medida em ng/mL e o eixo y à direita é a redução de RNA de HCV medida em log10 IU/mL.

[0084] FIG. 23D é uma análise farmacocinética/farmacodinâmica individual de um sujeito incluído no coorte 3b, da maneira descrita no exemplo 24. Cada gráfico mostra a exposição plasmática do metabólito 1-7 e níveis de redução de RNA de HCV. A linha tracejada representa a concentração mínima de metabólito 1-7 exigida para manter uma resposta viral maior que o valor de EC95 contra GT1b. O eixo X é o tempo medido em horas. O eixo Y à esquerda é a concentração plasmática de metabólito 1-7 medida em ng/mL e o eixo y à direita é a redução de RNA de HCV medida em log10 IU/mL.

[0085] FIG. 23E é uma análise farmacocinética/farmacodinâmica individual de um sujeito incluído no coorte 3b, da maneira descrita no exemplo 24. Cada gráfico mostra exposição plasmática de metabólito 1-7 e níveis de redução de RNA de HCV. A linha tracejada representa a concentração mínima de metabólito 1-7 exigida para manter uma resposta viral maior que o valor de EC95 contra GT1b. O eixo X é o tempo medido em horas. O eixo Y à esquerda é metabólito 1-7 concentração plasmática medida em ng/mL, e o eixo y à direita é a redução de RNA de HCV medida em log10 IU/mL.

[0086] FIG. 23F é uma análise farmacocinética/farmacodinâmica individual de um sujeito incluído no coorte 3b, da maneira descrita no exemplo 24. Cada gráfico mostra exposição plasmática de metabólito 1-7 e níveis de redução de RNA de HCV. A linha tracejada representa a concentração mínima de metabólito 1-7 exigida para manter uma resposta viral maior que o valor de EC95 contra GT1b. O eixo X é o tempo medido em horas. O eixo Y à esquerda é concentração plasmática de metabólito 1-7 medida em ng/mL, e o eixo y à direita é a redução de RNA de HCV medida em log10 IU/mL.

[0087] FIG. 24 é um gráfico dos valores de EC95 do composto 1 e sofosbuvir contra isolados clínicos de pacientes infectados com HCV GT1, GT2, GT3, e GT4. A linha tracejada horizontal ( ) representa a concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de sofosbuvir nucleosídeo após uma dose de 400 mg QD de sofosbuvir. A linha reta horizontal ( ) representa a concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 após 600 mg do composto 2 (equivalente a 550 mg do composto 1). A linha pontilhada horizontal ( ) representa a concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 após 450 mg do composto 2 (equivalente a 400 mg do composto 1). Da maneira discutida no exemplo 25, o nível plasmático mínimo no estado estacionário (C24,ss) previsto de metabólito 1-7 após 600 mg e 450 mg do composto 2 excede a EC95 in vitra do composto 1 contra todos os isolados clínicos testados. O nível plasmático mínimo no estado estacionário (C24,ss) de sofosbuvir excede apenas a EC95 em isolados clínicos GT2. O eixo X é marcado com os isolados clínicos e a tabela no eixo x lista os valores de EC95 para o composto 1 e sofosbuvir. O eixo Y é a EC95 contra os isolados clínicos medidos em ng/mL. EC95 é expressa como equivalente de nucleosídeo. Sofosbuvir e composto 2 foram administrados diariamente (QD).

[0088] FIG. 25 é um diagrama de fluxo que mostra o processo de fabricação de comprimidos de 50 mg e 100 mg do composto 2, da maneira descrita no exemplo 26. Na etapa 1, celulose microcristalina, composto 2, lactose monoidratada e croscarmelose de sódio são filtrados por meio de uma tela de 600 μM. Na etapa 2, os conteúdos da etapa 1 são preenchidos em um misturador em V e misturados por 5 minutos em 25 rpm. Na etapa 3, estearato de magnésio é filtrado por meio de uma tela de 600 μM. Na etapa 4, estearato de magnésio é preenchido no misturador em V contendo os conteúdos da etapa 2 (celulose microcristalina, composto 2, lactose monoidratada e croscarmelose de sódio), e misturados por 2 minutos em 25 rpm. A mistura comum é então dividida para a produção de comprimidos de 50 mg e comprimidos de 100 mg. Para produzir comprimidos de 50 mg, a mistura da etapa 4 é comprimida de ferramenta côncava padrão redonda de 6 mm. Para produzir comprimidos de 100 mg, a mistura da etapa 4 é comprimida com ferramenta côncava padrão redonda de 8 mm. Os comprimidos são então embalados em garrafas HDPE, seladas por indução com tampas PP, com dissecante.

[0089] FIG. 26 é o sal de hemissulfato que exibe propriedades farmacológicas vantajosas em relação à sua base livre correspondente para o tratamento de um vírus HCV.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0090] A invenção aqui descrita é um composto, método, composição e forma de dosagem sólida para o tratamento de infecções em humanos e outros animais hospedeiros do vírus HCV, ou em exposição ao mesmo, que inclui a administração de uma quantidade eficiente do sal de hemissulfato de isopropil((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-(metilamino)-9H-purin-9-il)-4- flúor-3-hidróxi-4-metiltetra-hidrofuran-2-il)metóxi)(fenóxi)fosforil)-L- alaninato (Composto 2), da maneira aqui descrita, opcionalmente em um carreador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, o composto 2 é um sólido amorfo. Ainda em uma outra modalidade, o composto 2 é um sólido cristalino.

[0091] O composto, composições, e formas de dosagem também podem ser usados para tratar condições relacionadas a ou que ocorrem como um resultado de uma exposição ao vírus HCV. Por exemplo, o composto ativo pode ser usado para tratar condições positivas ao anticorpo de HCV e positivas ao antígeno de HCV, inflamação hepática crônica com base viral, câncer hepático resultante de hepatite C avançada (por exemplo, carcinoma hepatocelular), cirrose, hepatite C aguda, hepatite C fulminante, hepatite C persistente crônica, e fadiga baseada em anti-HCV.

[0092] Os compostos e composições ativos também podem ser usados para tratar a variedade de genótipos de HCV. Pelo menos seis genótipos distintos de HCV, cada um dos quais apresentando múltiplos subtipos, foram identificados globalmente. Os genótipos 1-3 são prevalentes em todo o mundo, e os genótipos 4, 5, e 6 são more limitados geograficamente. O genótipo 4 é comum no Oriente médio e África. O genótipo 5 é encontrado principalmente na África do Sul. O genótipo 6 existe predominantemente no sudeste asiático. Embora o genótipo mais comum nos Estados Unidos seja o genótipo 1, definir o genótipo e subtipo pode auxiliar no tipo e duração do tratamento. Por exemplo, genótipos diferentes respondem de maneira diferente às diferentes medicações e os tempos ideais de tratamento variam, dependendo do genótipo que causa a infecção. Nos genótipos, subtipos, tais como genótipo 1a e genótipo 1b, também respondem de maneira diferente ao tratamento. Infecção com um tipo de genótipo não impede uma infecção posterior com um genótipo diferente.

[0093] Da maneira descrita no exemplo 22, o composto 2 é ativo contra uma variedade de genótipos de HCV, incluindo genótipos 1-5. Em uma modalidade, o composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 1, HCV genótipo 2, HCV genótipo 3, HCV genótipo 4, HCV genótipo 5, ou HCV genótipo 6. Em uma modalidade, o composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 1a. Em uma modalidade, o composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 1b. Em uma modalidade, o composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 2a. Em uma modalidade, o composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 2b. Em uma modalidade, o composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 3a. Em uma modalidade, o composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 4a. Em uma modalidade, o composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 4d.

[0094] Em uma modalidade, o composto 1 ou composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 5a. Em uma modalidade, o composto 1 ou composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 6a. Em uma modalidade, o composto 1 ou composto 2 é usado para tratar HCV genótipo 6b, 6c, 6d, 6e, 6f, 6g, 6h, 6i, 6j, 6k, 6l, 6m, 6n, 6o, 6p, 6q, 6r, 6s, 6t, ou 6u.

[0095] Da maneira discutida no exemplo 25 e mostrada na FIG. 24, a concentração mínima prevista no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 após uma dose de 450 mg (400 mg de base livre) e uma dose de 600 mg (550 mg de base livre) do composto 2 é aproximadamente 40 ng/mL a 50 ng/mL. Este nível de C24,ss excedeu a EC95 do composto 1 em HCV genótipos 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 4a e 4d. Estes dados confirmam que o composto 2 apresenta potente atividade pan-genotípica. Isto é surpreendente em decorrência de o composto 2 atingir uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) menor que a concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) do metabólito nucleosídeo de sofosbuvir após dosagem equivalente de sofosbuvir. A concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) do metabólito nucleosídeo de sofosbuvir correspondente é aproximadamente 100 ng/mL, mas este nível excede a EC95 de sofosbuvir contra isolados clínicos de GT2 (FIG. 24). O composto 2 é mais potente que sofosbuvir contra GT1, GT2, GT3, e GT4 e, portanto, permite uma forma de dosagem que libera uma concentração mínima no estado estacionário menor de seu metabólito, que é, contudo, eficiente contra todos os genótipos de HCV testados. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 entre aproximadamente 15-75 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada que atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 entre aproximadamente 20-60 ng/mL, 20-50 ng/mL, ou 20-40 ng/mL.

[0096] Em uma modalidade, o composto, formulações, ou sólido formas de dosagem que incluem o composto também podem ser usados profilaticamente para prevenir ou retardar a progressão de doença clínica em indivíduos que são positivos para anticorpo de HCV ou antígeno de HCV, ou que foram expostos à hepatite C.

[0097] Em particular, verificou-se que o composto 2 é ativo contra HCV e exibe propriedades do tipo fármaco e farmacológicas superiores, comparadas à sua base livre (Composto 1). Surpreendentemente, o composto 2 é mais biodisponível e atinge uma AUC maior que o composto 1 (Exemplo 19), e o composto 2 é mais seletivo para o órgão alvo, o fígado, que o composto 1 (Exemplo 19).

[0098] O composto 2 também é vantajoso em relação ao composto 1, em termos de solubilidade e estabilidade química. Isto é surpreendente em decorrência de o sal monossulfato de isopropil((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2- amino-6-(metilamino)-9H-purin-9-il)-4-flúor-3-hidróxi-4-metiltetra- hidrofuran-2-il)metóxi)(fenóxi)fosforil)-L-alaninato (Composto 3) ser instável e exibir a aparência de uma goma pegajosa, enquanto o composto 2, o sal de hemissulfato, é um sólido branco estável. O sal de hemissulfato, tanto como um sólido quanto em uma forma de dosagem sólida, é muito estável por 9 meses, e não é hidroscópico.

[0099] Apesar do volume de depósitos de patente e literatura sobre nucleosídeo antiviral, o composto 2 não foi especificamente descrito.

[00100] O composto 2 apresenta estereoquímica S no átomo de fósforo, que foi confirmado com cristalografia de raios X (FIG. 3, exemplo 2). Em modalidades alternativas, o composto 2 pode ser usado na forma de qualquer razão desejada de R e S-enantiômeros de fósforo, incluindo até enantiômeros puros. Em algumas modalidades, o composto 2 é usado em uma forma que é pelo menos 90% livre do enantiômero oposto, e pode ser pelo menos 98%, 99% ou ainda 100% livre do enantiômero oposto. A menos que de outra forma descrita, um composto 2 enantiomericamente enriquecido é pelo menos 90% livre do enantiômero oposto. Além disso, em uma modalidade alternativa, o aminoácido do fosforamidato pode estar na configuração D ou L, ou uma mistura das mesmas, incluindo uma mistura racêmica.

[00101] A menos que de outra forma especificada, os compostos aqui descritos são providos na configuração β-D. Em uma modalidade alternativa, os compostos podem ser providos em uma configuração β-L. Da mesma forma, qualquer grupo substituinte que exibe quiralidade pode ser provido na forma racêmica, enantiomérica, diastereomérica, ou qualquer mistura das mesmas. Onde um fosforamidato exibe quiralidade, este pode ser provido como as um derivado de fósforo quiral R ou S, ou uma mistura dos mesmos, incluindo uma mistura racêmica. Todas as combinações destas configurações estéreas são modalidades alternativas na invenção aqui descrita. Em uma outra modalidade, pelo menos um dos hidrogênios do composto 2 (o nucleotídeo ou o sal de hemissulfato) pode ser substituído por deutério.

[00102] Estas configurações alternativas incluem, mas sem limitação,

I. Sal de hemissulfato de isopropil((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6- (metilamino)-9H-purin-9-il)-4-flúor-3-hidróxi-4-metiltetra-hidrofuran-2- il)metóxi)(fenóxi)fosforil)-L-alaninato (Composto 2)

[00103] O composto ativo da invenção é o composto 2, que pode ser provido em uma composição farmaceuticamente aceitável, ou forma de dosagem sólida da mesma. Em uma modalidade, o composto 2 é um sólido amorfo. Ainda em uma modalidade adicional, o composto 2 é um sólido cristalino.

Síntese do composto 2

[00104] A presente invenção inclui adicionalmente um processo ilustrativo não limitante para a preparação do composto 2 que inclui: (j) uma primeira etapa de dissolver o composto 1 em um solvente orgânico, por exemplo, acetona, etil acetato, metanol, acetonitrila, ou éter, ou similares em um frasco ou recipiente; (k) ) carregar um segundo frasco ou recipiente com um segundo solvente orgânico, que pode ser o mesmo ou diferente do solvente orgânico na etapa (i), resfriar opcionalmente o segundo solvente a 0-10 graus C, e adicionar gota a gota H2SO4 ao segundo solvente orgânico para criar uma mistura de H2SO4/solvente orgânico; e em que o solvente pode ser, por exemplo, metanol; (l) i) adicionar gota a gota a mistura H2SO4/solvente em uma razão molar de 0,5/1,0 da etapa (ii) na solução do composto 1 da etapa (i) em temperatura ambiente ou levemente aumentada ou diminuída (por exemplo, 23-35 graus C); (m) ) agitar a reação da etapa (iii) até o precipitado do composto 2 ser formado, por exemplo, em temperatura ambiente ou levemente aumentada ou diminuída; (v) filtrar opcionalmente o precipitado resultante da etapa (iv) e lavar com um solvente orgânico; e (w) ) secar opcionalmente o composto 2 resultante em um vácuo, opcionalmente em uma temperatura elevada, por exemplo, 55, 56, 57, 58, 59, ou 60°C.

[00105] Em certas modalidades, a etapa (i) anterior é realizada em acetona. Adicionalmente, o segundo solvente orgânico na etapa (ii) pode ser, por exemplo, metanol e a mistura de solventes orgânicos na etapa (v) é metanol/acetona.

[00106] Em uma modalidade, o composto 1 é dissolvido em etil acetato na etapa (i). Em uma modalidade, o composto 1 é dissolvido em tetra- hidrofurano na etapa (i). Em uma modalidade, o composto 1 é dissolvido em acetonitrila na etapa (i). Em uma modalidade adicional, o composto 1 é dissolvido em dimetilformamida na etapa (i).

[00107] Em uma modalidade, o segundo solvente orgânico na etapa (ii) é etanol. Em uma modalidade, o segundo solvente orgânico na etapa (ii) é isopropanol. Em uma modalidade, o segundo solvente orgânico na etapa (ii) é n-butanol.

[00108] Em uma modalidade, uma mistura de solventes é usada para lavagem na etapa (v), por exemplo, etanol/acetona. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é isopropanol/acetona. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é n- butanol/acetona. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é etanol/etil acetato. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é isopropanol/etil acetato. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é n-butanol/etil acetato. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é etanol/ tetra-hidrofurano. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é isopropanol/ tetra-hidrofurano. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é n-butanol/ tetra-hidrofurano. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é etanol/ acetonitrila. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é isopropanol/ acetonitrila. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é n-butanol/ acetonitrila. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é etanol/ dimetilformamida. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é isopropanol/ dimetilformamida. Em uma modalidade, a mistura de solvente para lavagem na etapa (v) é n-butanol/ dimetilformamida.

II. Metabolismo de isopropil((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6- (metilamino)-9H-purin-9-il)-4-flúor-3-hidróxi-4-metiltetra-hidrofuran-2- il)metóxi)(fenóxi)fosforil)-L-alaninato (Composto 2)

[00109] O metabolismo do composto 1 e composto 2 envolve a produção de um 5’-monofosfato e o subsequente anabolismo da base N6- metil-2,6-diaminopurina (1-3) para gerar ((2R,3R,4R,5R)-5-(2-amino-6-oxo- 1,6-di-hidro-9H-purin-9-il)-4-flúor-3-hidróxi-4-metiltetra-hidrofuran-2- il)metil di-hidrogênio fosfato (1-4) como o 5’-monofosfato. O monofosfato é a seguir anabolizado adicionalmente na espécie de trifosfato ativo: o 5’- trifosfato (1-6). O 5’-trifosfato pode ser metabolizado adicionalmente para gerar 2-amino-9-((2R,3R,4R,5R)-3-flúor-4-hidróxi-5-(hidroximetil)-3- metiltetra-hidrofuran-2-il)-1,9-di-hidro-6H-purin-6-ona (1-7). Alternativamente, 5’-monofosfato 1-2 pode ser metabolizado para gerar a base purina 1-8. A via metabólica para isopropil((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2- amino-6-(metilamino)-9H-purin-9-il)-4-flúor-3-hidróxi-4-metiltetra- hidrofuran-2-il)metóxi)(fenóxi)fosforil)-L-alaninato é ilustrada no esquema 1 (mostrado anteriormente).

III. Sais adicionais do composto 1

[00110] Em modalidades alternativas, a presente invenção provê o composto 1 como um sal de oxalato (Composto 4) ou um sal de HCl (Composto 5).

[00111] Tanto o sal de oxalato 1:1 quanto o sal de HCl 1:1 formam sólidos com propriedades razoáveis para as formas de dosagem sólidas para o tratamento de um hospedeiro, tal como um humano com hepatite C. Entretanto, o sal de oxalato pode ser menos desejado, e talvez não adequado, se o paciente for susceptível aos cálculos renais. O sal de HCl é mais hidroscópico do que o sal de hemissulfato. Assim, o sal de hemissulfato permanece a forma de sal mais desejada do composto 1 com propriedades inesperadas.

IV. Definições

[00112] O termo “D-configuração” da maneira usada no contexto da presente invenção se refere à configuração principal, que imita a configuração natural de frações de açúcar, de maneia oposta aos nucleosídeos de ocorrência não natural ou configuração “L”. O termo “β” ou “β anômero” é usado com referência aos análogos de nucleosídeo, em que a base de nucleosídeo é configurada (disposta) antes do plano da fração furanose no análogo de nucleosídeo.

[00113] Os termos “coadministrar” e “coadministração”, ou terapia de combinação são usados para descrever a administração do composto 2, de acordo com a presente invenção em combinação com pelo menos um outro agente ativo, por exemplo, onde apropriado, pelo menos um agente anti-HCV adicional. A cronometragem da coadministração é melhor determinada pelo médico especialista que trata o paciente. Algumas vezes, é preferível que os agentes sejam administrados ao mesmo tempo. Alternativamente, os fármacos selecionados para terapia de combinação podem ser administrados em tempos diferentes ao paciente. Certamente, quando mais de um vírus, ou outra infecção ou outra condição está presente, os presentes compostos podem ser combinados com outros agentes para tratar esta outra infecção ou condição da maneira exigida.

[00114] O termo “hospedeiro”, da maneira aqui usada, se refere a um organismo unicelular ou multicelular no qual um vírus HCV pode se replicar, incluindo linhagens celulares e animais, e tipicamente um humano. O termo hospedeiro se refere especificamente às células infectadas, células transfectadas com todo ou parte de um genoma de HCV, e animais, em particular, primatas (incluindo chimpanzés) e humanos. Na maioria das aplicações em animais da presente invenção, o hospedeiro é um paciente humano. Aplicações veterinárias, em certas indicações, entretanto, são claramente previstas pela presente invenção (tais como chimpanzés). O hospedeiro pode ser, por exemplo, bovino, equino, aviário, canino, felino, etc.

Substituição Isotópica

[00115] A presente invenção inclui compostos e o uso do composto 2 com substituições isotópicas desejadas de átomos em quantidades acima da abundância natural do isótopo, isto é, enriquecidas. Isótopos são átomos com o mesmo número atômico, mas diferentes números de massa, isto é, o mesmo número de prótons, mas um número diferente de nêutrons. A título de exemplo geral e sem limitação, isótopos de hidrogênio, por exemplo, deutério (2H) e trítio (3H), podem ser usados em qualquer parte nas estruturas descritas. Alternativamente, ou além disso, isótopos de carbono, por exemplo, 13C e 14C, podem ser usados. Uma substituição isotópica preferida é deutério por hidrogênio em um ou mais locais na molécula para melhorar o desempenho do fármaco. O deutério pode estar ligado em um local de quebra de ligação durante o metabolismo (um efeito de isótopo cinético a-deutério) ou próximo ou ao lado do sítio de quebra de ligação (um efeito de isótopo cinético β- deutério). Achillion Pharmaceuticals, Inc. (WO/2014/169278 e WO/2014/169280) descreve deuteração de nucleotídeo para melhorar sua farmacocinética ou farmacodinâmica, incluindo na posição 5 da molécula.

[00116] A substituição com isótopos, tal como deutério, pode fornecer certas vantagens terapêuticas que resultam da melhor estabilidade metabólica, por exemplo, tal como maior meia vida in vivo ou exigências de dosagem reduzidas. A substituição de deutério por hidrogênio em um sítio de quebra metabólica pode reduzir a taxa ou eliminar o metabolismo nesta ligação. Em qualquer posição do composto que um átomo de hidrogênio possa estar presente, o átomo de hidrogênio pode ser qualquer isótopo de hidrogênio, incluindo prótio ( 1H), deutério ( 2H) e trítio ( 3H). Assim, a referência aqui a um composto inclui todas as formas isotópicas potenciais, a menos que o contexto dite claramente de outra forma.

[00117] O termo análogo “isotopicamente marcado” se refere a um análogo que é um “análogo deuterado”, um “análogo marcado com 13C”, ou um “análogo deuterado/marcado com 13C”. O termo “análogo deuterado” significa um composto aqui descrito, por meio do qual um isótopo H, isto é, hidrogênio/prótio (1H), é substituído por um isótopo H, isto é, deutério (2H). A substituição de deutério pode ser parcial ou completa. A substituição parcial de deutério significa que pelo menos um hidrogênio é substituído por pelo menos um deutério. Em certas modalidades, o isótopo é 90, 95 ou 99% ou mais enriquecido em um isótopo em qualquer local de interesse. Em algumas modalidades, é deutério que é 90, 95 ou 99% enriquecido em um local desejado. A menos que indicado o contrário, a deuteração é pelo menos 80% no local selecionado. A deuteração do nucleosídeo pode ocorrer em qualquer hidrogênio substituível que provê o resultado desejado.

V. Métodos de tratamento ou profilaxia

[00118] Tratamento, da maneira aqui usada, se refere à administração do composto 2 a um hospedeiro, por exemplo, um humano que é ou pode se tornar infectado com um vírus HCV.

[00119] O termo “profilático” ou preventivo, quando usado, se refere à administração do composto 2 para prevenir ou reduzir a probabilidade de uma ocorrência do distúrbio viral. A presente invenção inclui tanto o tratamento quanto as terapias profiláticas ou preventivas. Em uma modalidade, o composto 2 é administrado a um hospedeiro que foi exposto e, assim, está em risco de infecção por uma infecção por vírus de hepatite C.

[00120] A invenção é direcionada a um método de tratamento ou profilaxia de um vírus de hepatite C, incluindo formas de HCV resistentes ao fármaco e resistentes a multi-fármacos e estágios da doença relacionados, condições ou complicações de uma infecção por HCV, incluindo cirrose e hepatotoxicidades relacionadas, bem como outras condições que são secundárias para uma infecção por HCV, tal como fraqueza, perda de apetite, perda de peso, aumento dos seios (especialmente em homens), erupções (especialmente nas palmas das mãos), dificuldade com a coagulação do sangue, vasos sanguíneos do tipo aranha na pele, confusão, coma (encefalopatia), acúmulo de fluido na cavidade abdominal (ascite), varizes esofágicas, hipertensão portal, insuficiência renal, aumento do baço, diminuição das células sanguíneas, anemia, trombocitopenia, icterícia e câncer hepatocelular, entre outros. O método compreende administrar a um hospedeiro que precisa do mesmo, tipicamente um humano, uma quantidade eficiente do composto 2 da maneira aqui descrita, opcionalmente em combinação com pelo menos um agente bioativo adicional, por exemplo, um agente anti-HCV adicional, adicionalmente em combinação com um carreador, aditivo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00121] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção é um método para prevenção ou profilaxia de uma infecção por HCV, ou um estágio da doença ou estágio da doença relacionado ou seguinte, condição ou complicação de uma infecção por HCV, incluindo cirrose e hepatotoxicidades relacionadas, fraqueza, perda de apetite, perda de peso, aumento dos seios (especialmente em homens), erupções (especialmente nas palmas das mãos), dificuldade com a coagulação do sangue, vasos sanguíneos do tipo aranha na pele, confusão, coma (encefalopatia), acúmulo de fluido na cavidade abdominal (ascite), varizes esofágicas, hipertensão portal, insuficiência renal, aumento do baço, diminuição das células sanguíneas, anemia, trombocitopenia, icterícia, e câncer hepatocelular (fígado), entre outros, o dito método compreendendo administrar a um paciente em risco uma quantidade eficiente do composto 2, da maneira descrita anteriormente, em combinação com um carreador, aditivo, ou excipiente farmaceuticamente aceitável, opcionalmente em combinação com um outro agente anti-HCV. Em uma outra modalidade, os compostos ativos da invenção podem ser administrados a um paciente após um transplante de fígado relacionado à hepatite para proteger o novo órgão.

[00122] Em uma modalidade alternativa, o composto 2 é provido como o sal de hemissulfato de um fosforamidato do composto 1, sem ser o fosforamidato específico descrito na ilustração do composto. Uma ampla faixa de fosforamidatos é conhecida pelos versados na técnica, os quais incluem vários ésteres e fosfo-ésteres, qualquer combinação que pode ser usada para prover um composto ativo, da maneira aqui descrita, na forma de um sal de hemissulfato.

VI. Composições farmacêuticas e formas de dosagem

[00123] Em um aspecto da invenção, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem uma quantidade eficiente do composto 2 antivírus HCV, da maneira aqui descrita, opcionalmente em combinação com um carreador, aditivo, ou excipiente farmaceuticamente aceitável, opcionalmente de maneira adicional em combinação ou alternado com pelo menos um outro composto ativo. Em uma modalidade, a invenção inclui uma forma de dosagem sólida do composto 2 em um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00124] Em um aspecto da invenção, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção compreendem uma quantidade eficiente do composto 2 anti-HCV aqui descrito, opcionalmente em combinação com um carreador, aditivo, ou excipiente farmaceuticamente aceitável, opcionalmente de maneira adicional em combinação com pelo menos um outro agente antiviral, tal como um agente anti-HCV.

[00125] A invenção inclui composições farmacêuticas que incluem uma quantidade eficiente para tratar uma infecção por vírus de hepatite C do composto 2 da presente invenção ou pró-fármaco, em um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade alternativa, a invenção inclui composições farmacêuticas que incluem uma quantidade eficiente para prevenir uma infecção por vírus de hepatite C do composto 2 da presente invenção ou pró-fármaco, em um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00126] Os versados na técnica reconhecerão que uma quantidade terapeuticamente eficiente variará com a infecção ou condição a ser tratada, sua gravidade, o regime de tratamento a ser empregado, a farmacocinética do agente usado, bem como o paciente ou sujeito (animal ou humano) a ser tratado, e tal quantidade terapêutica pode ser pelo médico ou especialista responsável.

[00127] O composto 2, de acordo com a presente invenção, pode ser formulado em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. Em geral, é preferível administrar a composição farmacêutica na forma oralmente administrável, em particular uma forma de dosagem sólida tal como uma pílula ou comprimido. Certas formulações podem ser administradas por meio de uma via parenteral, intravenosa, intramuscular, tópica, transdérmica, bucal, subcutânea, supositório ou outra via, incluindo pulverização intranasal. Formulações intravenosas e intramusculares são frequentemente administradas em salina estéril. Os versados na técnica podem modificar as formulações para torná-las mais solúveis em água ou um outro veículo, por exemplo, isto pode ser facilmente realizado por modificações menores (formulação de sal, esterificação, etc.) que são bem conhecidas pelos versados na técnica. Também está bem dentro da rotina dos versados na técnica modificar a via de administração e regime de dosagem do composto 2, a fim de administrar a farmacocinética dos presentes compostos para efeito benéfico máximo em pacientes, da maneira descrita com mais detalhes aqui.

[00128] Em certas formas de dosagens farmacêuticas, a forma de pró- fármaco dos compostos, incluindo especialmente acilados (acetilados ou outros), e derivados de éter (alquil e semelhantes), ésteres de fosfato, tiofosforamidatos, fosforamidatos, e várias formas de sal dos presentes compostos, pode ser usada para atingir o efeito desejado. Os versados na técnica reconhecerão como modificar facilmente os presentes compostos nas formas de pró-fármaco para facilitar a liberação dos compostos ativos em um sítio alvejado no organismo hospedeiro ou paciente. Os versados na técnica também aproveitarão os parâmetros favoráveis de farmacocinética das formas de pró-fármaco, onde aplicável, em liberar os presentes compostos em um sítio alvejado no organismo hospedeiro ou paciente, para potencializar o efeito pretendido do composto.

[00129] A quantidade do composto 2 incluída na formulação terapeuticamente ativa, de acordo com a presente invenção, é uma quantidade eficiente para atingir o resultado desejado, de acordo com a presente invenção, por exemplo, para tratar a infecção por HCV, reduzir a probabilidade de uma infecção por HCV ou a inibição, redução e/ou eliminação de HCV ou seus efeitos secundários, incluindo estágios da doença, condições e/ou complicações que ocorrem secundariamente em HCV. Em geral, uma quantidade terapeuticamente eficiente do presente composto em uma forma de dosagem farmacêutica pode variar de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg por dia ou mais, mais frequentemente, um pouco menos de cerca de 0,1 mg/kg a mais de cerca de 25 mg/kg por dia do paciente ou consideravelmente mais, dependendo do composto usado, da condição ou infecção tratada e da via de administração. O composto 2 é frequentemente administrado em quantidades que variam de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg por dia do paciente, dependendo da farmacocinética do agente no paciente. Esta faixa de dosagem em geral produz nível eficiente de concentrações no sangue do composto ativo, que pode variar de cerca de 0,001 a cerca de 100, cerca de 0,05 a cerca de 100 microgramas/cc de sangue no paciente.

[00130] Frequentemente, para tratar, prevenir ou retardar o início destas infecções e/ou reduzir a probabilidade de uma infecção por vírus HCV, ou um estágio secundário da doença, condição ou complicação de HCV, o composto 2 será administrado em uma forma de dosagem sólida, em uma quantidade que varia de cerca de 250 microgramas até cerca de 800 miligramas ou mais, pelo menos uma vez ao dia, por exemplo, pelo menos cerca de 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, ou 800 miligramas ou mais, uma vez, duas vezes, três ou até quatro vezes ao dia, de acordo com a direção do profissional de saúde. O composto 2 é frequentemente administrado oralmente, mas pode ser administrado parenteralmente, topicamente, ou na forma de supositório, bem como intranasalmente, como uma pulverização nasal ou como de outra forma aqui descrita. Em geral, o composto 2 pode ser administrado em um comprimido, cápsula, injeção, formulação intravenosa, suspensão, líquido, emulsão, implante, partícula, esfera, creme, emplastro, supositório, forma inalável, forma transdérmica, bucal, sublingual, tópica, gel, mucosa e similares.

[00131] Quando uma forma de dosagem se refere aqui a uma dose em peso de miligrama, essa se refere à quantidade do composto 2 (isto é, o peso do sal de hemissulfato), a menos que de outra forma especificada ao contrário.

[00132] Em certas modalidades, a composição farmacêutica está em uma forma de dosagem que contém de cerca de 1 mg a cerca de 2.000 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 1000 mg, de cerca de 100 mg a cerca de 800 mg, de cerca de 200 mg a cerca de 600 mg, de cerca de 300 mg a cerca de 500 mg, ou de cerca de 400 mg a cerca de 450 mg do composto 2 em uma forma de dosagem única. Em certas modalidades, a composição farmacêutica está em uma forma de dosagem única, por exemplo, em uma forma de dosagem sólida, que contém até cerca de 10, cerca de 50, cerca de 100, cerca de 125, cerca de 150, cerca de 175, cerca de 200, cerca de 225, cerca de 250, cerca de 275, cerca de 300, cerca de 325, cerca de 350, cerca de 375, cerca de 400, cerca de 425, cerca de 450, cerca de 475, cerca de 500, cerca de 525, cerca de 550, cerca de 575, cerca de 600, cerca de 625, cerca de 650, cerca de 675, cerca de 700, cerca de 725, cerca de 750, cerca de 775, cerca de 800, cerca de 825, cerca de 850, cerca de 875, cerca de 900, cerca de 925, cerca de 950, cerca de 975, ou cerca de 1.000 mg ou mais do composto 2 em uma forma de dosagem única. Em uma modalidade, o composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que libera pelo menos cerca de 300 mg. Em uma modalidade, o composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que libera pelo menos cerca de 400 mg. Em uma modalidade, o composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que libera pelo menos cerca de 500 mg. Em uma modalidade, o composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que libera pelo menos cerca de 600 mg. Em uma modalidade, o composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que libera pelo menos cerca de 700 mg. Em uma modalidade, o composto 2 é administrado em uma forma de dosagem que libera pelo menos cerca de 800 mg. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 12 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 10 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 8 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 6 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 4 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por pelo menos 4 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por pelo menos 6 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por pelo menos 8 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por pelo menos 10 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por pelo menos 12 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos a cada outro dia por até 12 semanas, até 10 semanas, até 8 semanas, até 6 semanas, ou até 4 semanas. Em certas modalidades, o composto 2 é administrado pelo menos a cada outro dia por pelo menos 4 semanas, pelo menos 6 semanas, pelo menos 8 semanas, pelo menos 10 semanas, ou pelo menos 12 semanas. Em uma modalidade, pelo menos cerca de 600 mg do composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 6 semanas. Em uma modalidade, pelo menos cerca de 500 mg do composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 6 semanas. Em uma modalidade, pelo menos cerca de 400 mg do composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 6 semanas. Em uma modalidade, pelo menos 300 mg do composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 6 semanas. Em uma modalidade, pelo menos 200 mg do composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 6 semanas. Em uma modalidade, pelo menos 100 mg do composto 2 é administrado pelo menos uma vez ao dia por até 6 semanas.

[00133] Metabólito 1-6 é o trifosfato ativo do composto 2, mas metabólito 1-6 não é mensurável no plasma. Um substituto para o metabólito 1-6 é o metabólito 1-7. Metabólito 1-7 é um metabólito nucleosídeo mensurável no plasma e é, portanto, uma indicação do concentrações intracelulares de metabólito 1-6. Para a atividade antiviral máxima de HCV, uma forma de dosagem do composto 2 deve atingir uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que excede o valor de EC95 do composto 2. Da maneira mostrada na FIG. 24, a EC95 do composto 1 contra isolados clínicos de GT1, GT2, GT3, e GT4 é menor que 25 ng/mL (Os valores de EC95 do composto 1 e EC95 do composto 2 são os mesmos). Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 15 a 75 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 20 a 60 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 30 a 60 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 20 a 50 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 30 a 50 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 20 a 45 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 20 a 30 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 20 a 35 ng/mL. Em uma modalidade, uma forma de dosagem do composto 2 que é liberada atinge uma concentração mínima no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7 que está entre aproximadamente 20 a 25 ng/mL. As formas de dosagem aproximadas são + 10% da concentração mínima no estado estacionário.

[00134] Em uma modalidade, o composto 2 é dosado em uma quantidade que atinge uma AUC de metabólito 1-7 (área abaixo da curva) entre aproximadamente 1.200 e 3.000 ng/mL. Em uma modalidade, o composto 2 é dosado em uma quantidade que atinge uma AUC de metabólito 1-7 entre aproximadamente 1.500 e 3.000 ng/mL. Em uma modalidade, o composto 2 é dosado em uma quantidade que atinge uma AUC de metabólito 1-7 entre aproximadamente 1.800 e 3.000 ng/mL. Em uma modalidade, o composto 2 é dosado em uma quantidade que atinge uma AUC de metabólito 1-7 entre aproximadamente 2.100 e 3.000 ng/mL. Em uma modalidade preferida, o composto 2 é dosado em quantidade que atinge uma AUC de metabólito 1-7 de aproximadamente 2.200 ng*h/mL. As formas de dosagem aproximadas são + 10% da AUC.

[00135] No caso da coadministração do composto 2 em combinação com um outro composto anti-HCV, como de outra forma aqui descrito, a quantidade do composto 2, de acordo com a presente invenção, a ser administrada nas faixas de cerca de 0,01 mg/kg do paciente a cerca de 800 mg/kg ou mais do paciente ou consideravelmente mais, dependendo do segundo agente a ser coadministrado e sua eficiência contra o vírus, da condição do paciente e da gravidade da doença ou infecção a ser tratada, e da via de administração. O outro agente anti-HCV, por exemplo, pode ser administrado em quantidades que variam de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 800 mg/kg. Exemplos de quantidades de dosagem do segundo agente ativo são quantidades que variam de cerca de 250 microgramas até cerca de 750 mg ou mais, pelo menos uma vez ao dia, por exemplo, pelo menos cerca de 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, ou 800 miligramas ou mais, até quatro vezes ao dia. Em certas modalidades preferidas, o composto 2 pode ser frequentemente administrado em uma quantidade que varia de cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg ou mais (em geral até cerca de 100 mg/kg), dependendo geralmente da farmacocinética dos dois agentes no paciente. Estas faixas de dosagem produzem geralmente níveis eficientes de concentrações do composto ativo no sangue do paciente.

[00136] Com propósitos da presente invenção, uma quantidade eficiente profilaticamente ou preventiva das composições, de acordo com a presente invenção, está na mesma faixa de concentração apresentada anteriormente para a quantidade terapeuticamente eficiente, e é em geral a mesma de uma quantidade terapeuticamente eficiente.

[00137] A administração do composto 2 pode variar de administrações contínuas (gotejamento intrevenoso) a várias administrações orais ou intranasais por dia (por exemplo, Q.I.D.), ou administração trensdérmica, e pode incluir oral, tópica, parenteral, intramuscular, intravenosa, sub-cutânea, transdérmica (que pode incluir um agente que melhora a penetração), bucal e de supositório, entre outras vias de administração. Os comprimidos orais revestidos entéricos também podem ser usados para melhorar a biodisponibilidade dos compostos para uma via de administração oral. A forma de dosagem mais eficiente dependerá da biodisponibilidade/farmacocinética do agente particular escolhido, bem como da gravidade da doença no paciente. As formas de dosagem oral são particularmente preferidas, em decorrência da facilidade de administração e conformidade do paciente favorável em perspectiva.

[00138] Para preparar as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficiente do composto 2, de acordo com a presente invenção, é frequentemente bem misturada com um carreador farmaceuticamente aceitável, de acordo com técnicas de composições farmacêuticas convencionais, para produzir uma dose. Um carreador pode apresentar uma ampla variedade de formas, dependendo da forma de preparação desejada para administração, por exemplo, oral ou parenteral. No preparo de composições farmacêuticas na forma de dosagem oral, qualquer um dos meios farmacêuticos comuns pode ser usado. Assim, para preparações orais líquidas tais como suspensões, elixires e soluções, carreadores e aditivos adequados, incluindo água, glicóis, óleos, álcoois, agentes flavorizantes, conservantes, agentes de coloração e similares podem ser usados. Para preparações orais sólidas, tais como pós, comprimidos, cápsulas, e para preparações sólidas tais como supositórios, carreadores e aditivos adequados, incluindo amidos, carreadores de açúcar tais como dextrose, múltiplo, lactose, e carreadores relacionados, diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, aglutinantes, agentes de desintegração e similares podem ser usado. Se desejado, os comprimidos ou cápsulas podem ser gastro- resistentes ou de liberação contínua por técnicas padrões. O uso destas formas de dosagem pode melhorar significativamente a biodisponibilidade dos compostos no paciente.

[00139] Para formulações parenterais, o carreador compreenderá em geral água estéril ou solução aquosa de cloreto de sódio, embora outros ingredientes, incluindo aqueles que auxiliam a dispersão, também possam ser incluídos. Certamente, onde a água estéril deve ser usada e mantida como estéril, as composições e carreadores também devem ser esterilizados. Suspensões injetáveis também podem ser preparadas, nas quais carreadores líquidos apropriados, agentes de suspensão e similares podem ser empregados.

[00140] Suspensões lipossomais (incluindo lipossomas alvejados em antígenos virais) também podem ser preparadas por métodos convencionais para produzir carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Isto pode ser apropriado para a liberação de nucleosídeos livres, acil/alquil nucleosídeos ou formas de pro-fármaco éster fosfato dos compostos de nucleosídeo, de acordo com a presente invenção.

[00141] Em modalidades típicas, de acordo com a presente invenção, o composto 2 e as composições descritas são usados para tratar, prevenir ou retardar uma infecção por HCV ou um estágio secundário da doença, condição ou complicação de HCV.

VII. Terapia de combinação e de revezamento

[00142] É bem reconhecido que as variações resistentes ao fármaco dos vírus podem emergir após tratamento prolongado com um agente antiviral. A resistência ao ocorre, algumas vezes, por mutação de um gene que codifica uma enzima usada na replicação viral. A eficiência de um fármaco contra uma infecção por HCV, pode ser prolongada, aumentada ou restaurada administrando o composto em combinação ou revezamento com um outro, e talvez ainda dois ou três outros, composto antiviral que induz uma mutação diferente ou atua através de uma via diferente, a partir daquela do fármaco principal. Alternativamente, a farmacocinética, bio-distribuição, meia vida ou outro parâmetro do fármaco pode ser alterado por tal terapia de combinação (que pode incluir terapia de revezamento, se considerada ajustada). Uma vez que o composto 2 descrito é um inibidor de NS5B polimerase, este pode ser usado para administrar o composto a um hospedeiro em combinação com, por exemplo, um: (1) Inibidor de protease, tal como um inibidor de protease NS3/4A; (2) Inibidor de NS5A; (3) Um outro inibidor de NS5B polimerase; (4) Inibidor de NS5B não substrato; (5) Interferon alfa-2a, que pode ser peguilado ou de outra forma modificado, e/ou ribavirina; (6) Inibidor não baseado em substrato; (7) Inibidor de helicase; (8) Oligodesoxinucleotídeo antissentido (S-ODN); (9) Aptâmero; (10) Ribozima resistente à nuclease; (11) RNAi, incluindo RNAmicro e RNASi; (12) Anticorpo, anticorpo parcial ou anticorpo de domínio para o vírus, ou (13) Antígeno viral ou antígeno parcial que induz uma resposta do anticorpo do hospedeiro.

[00143] Exemplos não limitantes de agentes anti-HCV que podem ser administrados em combinação com o composto 2 da invenção, sozinhos ou com múltiplos fármacos destas listas são: (i) inibidores de protease tais como telaprevir (Incivek®), boceprevir (VictrelisTM), simeprevir (OlysioTM), paritaprevir (ABT-450), glecaprevir (ABT-493), ritonavir (Norvir), ACH-2684, AZD-7295, BMS- 791325, danoprevir, Filibuvir, GS-9256, GS-9451, MK-5172, Setrobuvir, Sovaprevir, Tegobuvir, VX-135, VX-222, e, ALS-220; (ii) inibidor de NS5A tal como ACH-2928, ACH-3102, IDX719, daclatasvir, ledispasvir, velpatasvir (Epclusa), elbasvir (MK-8742), grazoprevir (MK-5172), e Ombitasvir (ABT-267); (iii) inibidores de NS5B tais como AZD-7295, Clemizol, dasabuvir (Exviera), ITX-5061, PPI-461, PPI-688, sofosbuvir (Sovaldi®), MK-3682, e mericitabina; (iv) inibidores de NS5B tais como ABT-333, e MBX-700; (v) anticorpo tal como GS-6624; (vi) Fármacos em combinação tais como Harvoni (ledipasvir/sofosbuvir); Viekira Pak (ombitasvir/paritaprevir/ritonavir/dasabuvir); Viekirax (ombitasvir/paritaprevir/ritonavir); G/P (paritaprevir e glecaprevir); Technivie (ombitasvir/ paritaprevir/ritonavir) e Epclusa (sofosbuvir/velpatasvir) e Zepatier (elbasvir e grazoprevir).

[00144] Se o composto 2 for administrado para tratar vírus de hepatite C avançada que leva ao câncer hepático ou cirrose, em uma modalidade, o composto pode ser administrado em combinação ou revezamento com um outro fármaco que é tipicamente usado para tratar carcinoma hepatocelular (HCC), por exemplo, da maneira descrita por Andrew Zhu em “New Agentes in the Horizon in Hepatocellular Carcinoma” Therapeutic Advances in Medical Oncology, V 5(1), Janeiro de 2013, 41-50. Exemplos dos compostos adequados para terapia de combinação, onde o hospedeiro apresenta ou está em risco de HCC, incluem agentes anti-angiogênicos, sunitinib, brivanib, linifanib, ramucirumab, bevacizumab, cediranib, pazopanib, TSU-68, lenvatinib, anticorpos contra EGFR, inibidores de mTor, inibidores de MEK, e inibidores de histona desacetilase.

EXEMPLOS Métodos gerais

[00145] Espectros RMN 1H, 19F e 31P foram registrados em um espectrômetro de Brücker com transformada de Fourier de 400 MHz. Os espectros foram obtidos em DMSO-d6, a menos que de outra forma indicada. As multiplicidades de rotação são indicadas pelos símbolos s (singleto), d (dubleto), t (tripleto), m (multipleto) e, br (amplo). As constantes de acoplamento (J) são registradas em Hz. As reações foram realizadas em geral em uma atmosfera de nitrogênio seco usando solventes anidros de Sigma- Aldrich. Todos os produtos químicos comuns foram obtidos de fornecedores comerciais.

[00146] As abreviações a seguir são usadas nos exemplos: AUC: Área abaixo da curva C24: Concentração do fármaco no plasma em 24 horas C24,ss: Concentração em 24 horas após dosagem em estado estacionário Cmax: Concentração máxima do fármaco atingida no plasma DCM: Diclorometano EtOAc: Etil acetato EtOH: Etanol HPLC: Cromatografia líquida de alta pressão NaOH: Hidróxido de sódio Na2SO4: Sulfato de sódio (anidro) MeCN: Acetonitrila MeNH2: Metilamina MeOH: Metanol Na2SO4: Sulfato de sódio NaHCO3: Bicarbonato de sódio NH4Cl: Cloreto de amônio NH4OH: Hidróxido de amônio PE: Éter de petróleo Ph3P: Trifenilfosfino RH: umidade relativa Sílica gel (malha de 230 a 400, adsorvente) t-BuMgCl: cloreto de t-Butil magnésio Tmax: Tempo no qual Cmax é atingida THF: Tetra-hidrofurano (THF), anidro TP: Trifosfato Exemplo 1. Síntese do composto 1

Etapa 1: Síntese de (2R,3R,4R,5R)-5-(2-Amino-6-(metilamino)-9H-purin- 9-il)-4-flúor-2-(hidroximetil)-4-metiltetra-hidrofuran-3-ol (2-2)

[00147] Um frasco de 50 L foi preenchido com metanol (30 L) e agitado em 10 + 5°C. NH2CH3 (3,95 Kg) foi ventilado lentamente no reator a 10 + 5°C. O composto 2-1 (3,77 kg) foi adicionado em lotes a 20 + 5°C e agitado por 1 hora para obter uma solução clara. A reação foi agitada por mais 6 - 8 horas, ponto no qual HPLC indicou que o intermediário era menos de 0,1% da solução. O reator foi preenchido com NaOH sólido (254 g), agitado por 30 minutos e concentrado em 50 + 5°C (grau do vácuo: -0,095). O resíduo resultante foi preenchido com EtOH (40 L) e transformado em pasta fluida novamente por 1 hora a 60°C. A mistura foi então filtrada por meio de celite e o bolo do filtro foi transformado em pasta fluida novamente com EtOH (15 L), por 1 hora a 60°C. O filtrado foi mais uma vez filtrado, combinado com o filtrado da filtração prévia, e a seguir concentrado em 50 + 5°C (grau do vácuo: -0,095). Uma grande quantidade de sólido foi precipitada. EtOAc (6 L) foi adicionado ao resíduo sólido e a mistura foi concentrada em 50 + 5°C (grau do vácuo: -0,095). DCM foi a seguir adicionado ao resíduo e a mistura foi transformada em pasta fluida novamente em refluxo, por 1 hora, resfriada em temperatura ambiente, filtrada e seca a 50 + 5°C em um forno a vácuo para render o composto 2-2 como um sólido esbranquiçado (1,89 Kg, 95,3%, pureza de 99,2%).

[00148] Método analítico para o composto 2-2: A pureza do composto 2-2 (15 mg) foi obtida usando um sistema HPLC Agilent 1100, com uma coluna Agilent Poroshell 120 EC-C18 4,6*150mm 4-Micron com as seguintes condições: 1 mL/min de vazão, leitura em 254 nm, temperatura da coluna 30°C, volume de injeção 15 μL, e um tempo de corrida de 31 minutos. A amostra foi dissolvida em acetonitrila - água (20:80) (v/v). O método de gradiente é mostrado a seguir.

Etapa 2: Síntese de isopropil((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2-Amino-6- (metilamino)-9H-purin-9-il)-4-flúor-3-hidróxi-4-metiltetra-hidrofuran-2- il)metóxi)(fenóxi)fosforil)-L-alaninato (Composto 1)

[00149] O composto 2-2 e composto 2-3 (isopropil ((perfluorfenóxi)(fenóxi)fosforil)-L-alaninato) foram dissolvidos em THF (1 L) e agitados em nitrogênio. A suspensão foi então resfriada em uma temperatura abaixo de -5°C, e uma solução 1,7 M de solução t-BuMgCl (384 mL) foi lentamente adicionada por 1,5 hora, enquanto uma temperatura de 510°C foi mantida. Uma solução de NH4Cl (2 L) e água (8 L) foi adicionada à suspensão em temperatura ambiente, seguido por DCM. A mistura foi agitada por 5 minutos, antes de uma solução aquosa 5% de K2CO3 (10 L) ser adicionada, e a mistura foi agitada por mais 5 minutos, antes de filtrar por meio de diatomita (500 g). A diatomita foi lavada com DCM e o filtrado foi separado. A fase orgânica foi lavada com uma solução aquosa 5% de K2CO3 (10 L x 2), salmoura (10 L x 3), e seca com Na2SO4 (500 g) por aproximadamente 1 hora. Enquanto isso, este processo na íntegra foi repetido 7 vezes em paralelo, e os 8 lotes foram combinados. As fases orgânicas foram filtradas e concentradas em 45 + 5°C (grau do vácuo de 0,09 Mpa). EtOAc foi adicionado e a mistura foi agitada por 1 hora a 60°C, e a seguir em temperatura ambiente por 18 horas. A mistura foi então filtrada e lavada com EtOAc (2 L) para render composto 1 bruto. O material bruto foi dissolvido em DCM (12 L), heptano (18 L) foi adicionado a 10-20°C, e a mistura foi agitada naturalmente por 30 minutos nesta temperatura. A mistura foi filtrada, lavada com heptano (5 L), e seca a 50 + 5°C para render composto 1 puro (1.650 g, 60%).

[00150] Método analítico para o composto 1: A pureza do composto 1 (25 mg) foi obtida usando um sistema HPLC Agilent 1100 com uma coluna Waters XTerra Phenyl 5μm 4,6*250mm, com as seguintes condições: 1 mL/min de vazão, leitura em 254 nm, temperatura da coluna 30°C, volume de injeção 15 μL, e um tempo de corrida de 25 minutos. A amostra foi dissolvida em acetonitrila - água (50:50) (v/v). O método de gradiente é mostrado a seguir.

Exemplo 2. Caracterização do composto amorfo e cristalino 1

[00151] Composto amorfo 1 e composto cristalino 1 foram inicialmente analisados por XRPD, RMN 1H e HPLC. Os padrões XRPD para ambos os compostos são mostrados na FIG. 1A, e os traços de HPLC para determinar pureza são mostrados em FIGS. 1B e 2A, respectivamente. A tabela 1 é uma lista de picos da XRPD do composto cristalino 1, e a tabela 2 é uma lista de tempos de retenção relativos (RTT) dos traços de HPLC. O composto amorfo 1 foi 98,61% puro e composto cristalino 1 foi 99,11% puro. Ambos os compostos eram um sólido branco. A FIG. 2B são gráficos de TGA e DSC do composto cristalino 1. Para o composto cristalino 1, um endoterma foi observado em 88,6°C e houve uma perda de massa de 7,8% de 80 - 110°C.

[00152] Uma amostra do composto 1 foi recristalizada a partir de EtOAc/hexano e desenhada com ORTEP. A estrutura absoluta do composto 1 foi confirmada pela recristalização de um cristal único. A FIG. 3 é o desenho ORTEP do composto 1. Os dados do cristal e dados de medição são mostrados na tabela 3. A estereoquímica absoluta do composto 1 com base na cristalografia de raios-X é mostrada a seguir:

[00153] Os dados DSC foram coletados em um TA Instruments Q2000 equipado com um amostrador automático de 50 posições. A calibração para capacidade térmica foi realizada usando safira e a calibração para energia e temperatura foi realizada usando Índio certificado. De maneira típica, aproximadamente 3 mg de cada amostra, em uma panela de alumínio com orifício, foram aquecidos em 10°C/min de 25°C a 200°C. Uma purga de nitrogênio seco em 50 mL/min foi mantida sobre a amostra. O software de controle do instrumento foi Advantage para Q Series v2.8.0.394 e Thermal Advantage v5.5.3, e os dados foram analisados usando Universal Analysis v4.5A.

[00154] Os dados de TGA foram coletados em um TA Instruments Q500 TGA, equipado com um amostrador automático de 16 posições. A temperatura do instrumento foi calibrada usando Alumel e Níquel certificados. Tipicamente, 5 - 10 mg de cada amostra foram preenchidas em uma panela de DSC de alumínio pré-tarada e aquecida a 10°C/min, de temperatura ambiente à 350°C. Uma purga de nitrogênio em 60 mL/min foi mantida sobre a amostra. O software de controle do instrumento foram Advantage para Q Series v2.5.0.256 e Thermal Advantage v5.5.3, e os dados foram analisados usando Universal Analysis v4.5.

Composto amorfo 1 (1-1):

[00155] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.01 - 1.15 (m, 9 H), 1.21 (d, J=7.20 Hz, 3 H), 2.75 - 3.08 (m, 3 H), 3.71 - 3.87 (m, 1 H), 4.02 - 4.13 (m, 1 H), 4.22 - 4.53 (m, 3 H), 4.81 (s, 1 H), 5.69 - 5.86 (m, 1 H), 6.04 (br d, J=19.33 Hz, 4 H), 7.12 - 7.27 (m, 3 H), 7.27 - 7.44 (m, 3 H), 7.81 (s, 1 H)

Composto cristalino 1 (1-2):

[00156] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,97 - 1,16 (m, 16 H), 1,21 (d, J=7,07 Hz, 3 H), 2,87 (br s, 3 H), 3,08 (s, 2 H), 3,79 (br d, J=7,07 Hz, 1 H), 4,08 (br d, J=7,58 Hz, 1 H), 4,17 - 4,55 (m, 3 H), 4,81 (quin, J=6,25 Hz, 1 H), 5,78 (br s, 1 H), 5,91 - 6,15 (m, 4 H), 7,10 - 7,26 (m, 3 H), 7,26 - 7,44 (m, 3 H), 7,81 (s, 1 H) Tabela 1. Lista de picos para composto cristalino 1 Tabela 2. Tempos de retenção relativos de cromatógrafos HPLC do composto amorfo 1 e composto cristalino 1 Tabela 3. Medição de cristal e dados do composto 1

[00157] Esta caracterização inicial foi seguida pelo armazenamento a 25°C / 60% de umidade relativa (RH) por 14 dias, com análise por HPLC e XRPD após 7 e 14 dias. A FIG. 4A é a XRPD após 14 dias a 25°C / 60% de (RH). O composto amorfo 1 (amostra 1-1) permaneceu pouco cristalino, ao passo que o composto cristalino 1 (amostra 1-2) manteve sua cristalinidade, mas ambos os compostos estavam estáveis após 14 dias a 25°C / 60% de (RH).

Exemplo 3. Formação de sal de oxalato do composto 4

[00158] Inicialmente, o sal de oxalato do composto 1, o composto 4, foi formado misturando o sal oxálico com solvente (5 vol, 100 μL) e permitindo que qualquer solução evaporasse em temperatura ambiente. Qualquer suspensão foi maturada (temperatura ambiente - 50°C) por 3 horas e a cristalinidade foi determinada.

[00159] A tabela 4 mostra os diferentes solventes usados na produção do composto 4. Todos os solventes, com a exceção de dois (ciclo-hexano e n- heptano) renderam produtos cristalinos. Apesar da alta cristalinidade e solubilidade do composto 4, sais de oxalato não são aceitáveis para o desenvolvimento clínico em virtude da formação potencial de pedra nos rins e outros sais do composto 1 serem explorados. Tabela 4. Formação de oxalato do composto 4

Exemplo 4. Compostos de sal do composto amorfo 1

[00160] Uma vez que o sal de oxalato do composto 4 (Exemplo 3) não pode ser passado adiante em testes clínicos em virtude de seu potencial para formar pedra nos rins, sais do composto amorfo 1 foram formados com os contra-íons listados na tabela 5. O composto 1 foi dissolvido em t-butanol (20 vol, 6 mL) e a solução foi tratada com os contra-íons ácidos (1 equivalente para cada amostra, com a exceção da amostra 1-9, que apresentou 0,5 equivalente de sulfato). As amostras foram então congeladas com o solvente removido por liofilização. O sólido residual em amostras 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1- 8, e 1-9 foi inicialmente analisado por XRPD e HPLC. Tabela 5. Detalhes da formação de sal amorfo

[00161] Espectro RMN 1H foi obtido para todas as amostras.

Amostra 1-4, sal de HCl (1:1):

[00162] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,93 - 1,39 (m, 16 H), 2,97 (br s, 2 H), 3,70 - 3,88 (m, 1 H), 4,10 (br s, 1 H), 4,18 - 4,49 (m, 3 H), 4,70 - 4,88 (m, 1 H), 5,71 - 5,94 (m, 1 H), 6,07 (br d, J=19,07 Hz, 2 H), 7,14 - 7,27 (m, 3 H), 7,29 - 7,44 (m, 2 H), 7,83 - 8,19 (m, 1 H)

Amostra 1-5, sal sulfúrico (1:1):

[00163] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,97 - 1,38 (m, 15 H), 2,96 (br s, 2 H), 4,06 - 4,18 (m, 1 H), 4,19 - 4,49 (m, 3 H), 4,66 - 4,91 (m, 1 H), 5,70 - 5,95 (m, 1 H), 5,96 - 6,16 (m, 2 H), 7,10 - 7,27 (m, 3 H), 7,30 - 7,43 (m, 2 H), 7,88 - 8,19 (m, 1 H)

Amostra 1-6, sal fumárico (1:1):

[00164] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,95 - 1,31 (m, 21 H), 2,87 (br s, 3 H), 3,79 (br d, J=7,20 Hz, 1 H), 4,01 - 4,13 (m, 1 H), 4,16 - 4,23 (m, 1 H), 4,16 - 4,24 (m, 1 H), 4,20 (s, 1 H), 4,18 - 4,23 (m, 1 H), 4,24 - 4,52 (m, 1 H), 4,24 - 4,52 (m, 1 H), 4,24 - 4,49 (m, 1 H), 4,72 - 4,88 (m, 1 H), 5,68 - 5,86 (m, 1 H), 6,04 (br d, J=19,33 Hz, 4 H), 6,63 (s, 1 H), 6,61 - 6,66 (m, 1 H), 7,12 - 7,27 (m, 3 H), 7,27 - 7,45 (m, 3 H), 7,81 (s, 1 H), 13,16 (br s, 2 H)

Amostra 1-7, sal benzóico (1:1):

[00165] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,96 - 1,30 (m, 15 H), 2,87 (br s, 3 H), 3,79 (br d, J=7,07 Hz, 1 H), 4,07 (br s, 1 H), 4,20 (s, 1 H), 4,25 - 4,52 (m, 3 H), 4,81 (s, 1 H), 5,71 - 5,85 (m, 1 H), 6,04 (br d, J=19,33 Hz, 4 H), 7,08 - 7,27 (m, 3 H), 7,27 - 7,43 (m, 3 H), 7,45 - 7,57 (m, 2 H), 7,63 (s, 1 H), 7,81 (s, 1 H), 7,95 (dd, J=8,27, 1,33 Hz, 2 H), 12,98 (br s, 1 H)

Amostra 1-8, sal succínico (1:1):

[00166] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,98 - 1,28 (m, 15 H), 2,42 (s, 5 H), 2,87 (br s, 3 H), 3,57 - 3,62 (m, 1 H), 3,70 - 3,86 (m, 1 H), 4,02 - 4,14 (m, 1 H), 4,20 (s, 1 H), 4,24 - 4,51 (m, 3 H), 4,70 - 4,88 (m, 1 H), 5,69 - 5,86 (m, 1 H), 6,04 (br d, J=19,33 Hz, 4 H), 7,12 - 7,27 (m, 3 H), 7,27 - 7,44 (m, 3 H), 7,81 (s, 1 H), 11,95 - 12,58 (m, 2 H)

Amostra 1-9, sal sulfúrico (0,5:1):

[00167] 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,02 - 1,31 (m, 15 H), 2,94 (br s, 3 H), 3,79 (br d, J=7,20 Hz, 2 H), 4,09 (br s, 1 H), 4,22 - 4,48 (m, 3 H), 4,72 - 4,90 (m, 1 H), 5,71 - 5,92 (m, 1 H), 6,07 (br d, J=19,07 Hz, 2 H), 7,12 - 7,28 (m, 3 H), 7,31 - 7,44 (m, 2 H), 7,75 - 8,19 (m, 1 H).

[00168] As amostras foram então submetidas ao armazenamento a 25°C / 60% de umidade relativa (RH) por 14 dias, com análise por HPLC e XRPD após 7 (FIG. 4B) e 14 dias (FIG. 5A). Todos os sais preparados permaneceram amorfos e as observações são mostradas na tabela 6. Observou-se que os sais de monossulfato (amostra 1-5) e de succinato (amostra 1-8) são fisicamente instáveis e deliquescidos, ou se tornam uma goma durante o período do estudo. Observou-se que tanto os sais de fumarato (amostra 1-6) quanto os de benzoato (amostra 1-7) são sólidos vítreos. Verificou-se que o sal de HCl (amostra 1-4) foi mantém a aparência física. Surpreendentemente, o sal de hemissulfato (amostra 1-9) também manteve sua aparência física como um sólido branco, ao contrário do composto de monossulfato (amostra 1-5), que era uma goma pegajosa. Os resultados são mostrados na tabela 6. Verificou-se que o sal de HCl mono (amostra 1-4) e o sal de hemissulfato (amostra 1-9) são fisicamente e quimicamente estáveis após 2 semanas de armazenamento a 25°C / 60% de umidade relativa (RH). Embora ambos os sais tenham sido estáveis por duas semanas, o sal de hemissulfato foi superior ao sal de HCl em decorrência de o sal de HCl ser higroscópico, tornando-o menos utilizável comparado ao sal de hemissulfato pata armazenamento ou uso a longo prazo. Tabela 6. Estabilidade das amostras após 7 e 14 dias a 25°C / 60% de RH

Exemplo 5. Caracterização do composto amorfo 2

[00169] O composto amorfo 2 foi inicialmente analisado por XRPD, RMN 1H, DSC, TGA, e HPLC. O padrão de XRPD para o composto amorfo 2 sobreposto ao composto amorfo 1 e composto cristalino 1 é mostrado na FIG. 1A e o padrão de XRPD do composto amorfo 2 sozinho é mostrado na FIG. 5B. A tabela 7 é uma lista de pico do padrão de XRPD mostrado na FIG. 5B. O traço de HPLC para determinar a pureza é mostrado na FIG. 6A. A tabela 8 é uma lista de tempos de retenção relativos (RTT) do traço de HPLC mostrada na FIG. 6A. O composto amorfo 2 foi 99,68% puro. A FIG. 6B é um gráfico de TGA e DSC do composto amorfo 2. Detalhes experimentais para os experimentos TGA e DSC são fornecidos no exemplo 2. Tabela 7. Lista de pico para o composto amorfo 2 Tabela 8. cromatograma de HPLC de Composto amorfo 2

Composto amorfo 2:

[00170] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,93 - 1,29 (m, 13 H), 2,94 (br s, 3 H), 3,79 (td, J=10,04, 7,07 Hz, 2 H), 4,05 - 4,19 (m, 1 H), 4,19 - 4,50 (m, 3 H), 4,81 (quin, J=6,25 Hz, 1 H), 5,71 - 5,94 (m, 1 H), 5,97 - 6,16 (m, 2 H), 7,14 - 7,28 (m, 3 H), 7,31 - 7,44 (m, 2 H), 7,82 - 8,09 (m, 1 H)

Exemplo 6. Cristalização do composto amorfo 2

[00171] Uma vez que observou-se que o sal de hemissulfato permanece como um sólido após o estudo de estabilidade de 14 dias, da maneira mostrada na tabela 6, testes preliminares que estudam as condições de cristalização usando 11 solventes diferentes foram realizados. O composto amorfo 2 foi suspenso em 5 volumes de solvente a 25°C (amostra 2-1, 2-2, 23, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, e 2-11). À estas amostras, que não estavam fluindo livremente (2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, e 2-10), mais 5 volumes de solvente foram adicionados. As amostras foram então maturadas a 25 - 50°C (1°C/min entre as temperaturas, e 4 horas em cada temperatura) por 6 dias, exceto a amostra 2-1, que foi observada como uma solução clara após 1 dia e evaporou naturalmente em condições ambientes. Os resultados são mostrados na tabela 9. Padrões cristalinos resultaram de cristalização com isobutanol (amostra 2-1), acetona (amostra 2-2), EtOAc (amostra 2-6), e iPrOAc (amostra 2-7). Duas amostras pouco cristalinas também foram identificadas a partir da cristalização com MEK (amostra 2-4) e MIBK (amostra 2-5). Os padrões de XRPD são mostrados na FIG. 7A. Tabela 9. Condições de cristalização do composto 2

[00172] As sete amostras (Amostras 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7 e 2-8) foram analisados por DSC, TGA, RMN 1H e IC (Tabela 10, FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 9A, FIG. 9B, FIG. 10A, FIG. 10B, FIG. 11A, e FIG. 11B), bem como por XRPD após 6 dias de armazenamento a 25°C / 60% de umidade relativa (RH) (todas as amostras permaneceram cristalina / pouco cristalinas após estabilidade). Todas as amostras mantiveram aproximadamente metade de um equivalente de sulfato, mas continham uma quantidade relativamente grande de solvente residual. Uma sobreposição dos difratogramas de raios-X de amostras amorfas 2-9, 2-10, e 2-11 é mostrada na FIG. 7B. Tabela 10. Caracterização do composto cristalino de 2 amostras

[00173] Espectro RMN 1H foi obtido para todas as amostras e listado a seguir.

Amostra 2-2:

[00174] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,83 (d, J=6,69 Hz, 7 H), 0,99 - 1,26 (m, 14 H), 1,61 (dt, J=13,26, 6,63 Hz, 1 H), 3,73 - 3,87 (m, 2 H), 4,03 - 4,18 (m, 1 H), 4,18 - 4,51 (m, 4 H), 4,66 - 4,92 (m, 1 H), 4,70 - 4,90 (m, 1 H), 4,72 - 4,88 (m, 1 H), 5,81 (br s, 1 H), 5,93 - 6,11 (m, 2 H), 7,10 - 7,26 (m, 3 H), 7,14 - 7,26 (m, 1 H), 7,30 - 7,41 (m, 2 H), 7,94 (br s, 1 H)

Amostra 2-3:

[00175] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1,00 - 1,26 (m, 13 H), 2,09 (s, 3 H), 3,74 - 3,87 (m, 2 H), 4,10 (br d, J=7,70 Hz, 1 H), 4,22 - 4,50 (m, 3 H), 4,81 (quin, J=6,28 Hz, 1 H), 5,71 - 5,90 (m, 1 H), 5,96 - 6,15 (m, 2 H), 7,12 - 7,26 (m, 3 H), 7,31 - 7,41 (m, 2 H), 7,79 - 8,07 (m, 1 H)

Amostra 2-4:

[00176] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,91 (t, J=7,33 Hz, 3 H), 1,01 - 1,28 (m, 13 H), 2,08 (s, 2 H), 3,72 - 3,89 (m, 2 H), 4,10 (br d, J=8,08 Hz, 1 H), 4,23 - 4,47 (m, 3 H), 4,81 (quin, J=6,25 Hz, 1 H), 5,69 - 5,89 (m, 1 H), 5,94 - 6,13 (m, 2 H), 7,14 - 7,25 (m, 3 H), 7,32 - 7,41 (m, 2 H), 7,79 - 8,11 (m, 1 H)

Amostra 2-5:

[00177] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,86 (d, J=6,69 Hz, 1 H), 0,98 - 1,33 (m, 13 H), 2,02 - 2,09 (m, 1 H), 4,03 - 4,17 (m, 1 H), 4,22 - 4,50 (m, 3 H), 4,81 (quin, J=6,25 Hz, 1 H), 5,81 (br s, 1 H), 5,93 - 6,15 (m, 2 H), 7,11 - 7,27 (m, 3 H), 7,31 - 7,41 (m, 2 H), 7,77 - 8,21 (m, 1 H)

Amostra 2-6:

[00178] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,98 - 1,28 (m, 15 H), 2,00 (s, 3 H), 3,99 - 4,14 (m, 3 H), 4,21 - 4,49 (m, 3 H), 4,81 (quin, J=6,22 Hz, 1 H), 5,82 (br s, 1 H), 5,93 - 6,14 (m, 2 H), 7,11 - 7,26 (m, 3 H), 7,29 - 7,42 (m, 2 H), 7,79 - 8,17 (m, 1 H)

Amostra 2-7:

[00179] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,92 - 1,28 (m, 17 H), 1,97 (s, 2 H), 4,04 - 4,16 (m, 1 H), 4,20 - 4,51 (m, 3 H), 4,71 - 4,93 (m, 2 H), 5,82 (br s, 1 H), 5,95 - 6,14 (m, 2 H), 7,11 - 7,28 (m, 3 H), 7,31 - 7,43 (m, 2 H), 7,75 - 8,21 (m, 1 H)

Amostra 2-8:

[00180] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,81 - 1,11 (m, 13 H), 1,19 (s, 1 H), 1,53 - 1,66 (m, 1 H), 3,87 - 4,01 (m, 1 H), 4,06 - 4,32 (m, 3 H), 4,64 (quin, J=6,25 Hz, 1 H), 5,55 - 5,75 (m, 1 H), 5,77 - 5,97 (m, 2 H), 6,94 - 7,10 (m, 3 H), 7,13 - 7,26 (m, 2 H), 7,66 - 7,96 (m, 1 H)

Exemplo 7. Falha em cristalizar sal de malonato amorfo (Composto 4)

[00181] Da maneira mostrada no exemplo 3, um sal cristalino de oxalato foi identificado, determinando ao mesmo tempo os sais apropriados para o composto 1, mas o sal de oxalato do composto 4 não pode ser levado a diante em testes clínicos em virtude de seu potencial para causar pedra nos rins. Portanto, a cristalização do sal de malonato quimicamente relacionado (Composto 5) foi uma tentativa de usar os mesmos 11 solventes para o sal de hemissulfato. O composto 1 (12 x 50 mg, amostras 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 36, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11, e 3-12) foi dissolvido em t-butanol (20 vol) e as soluções foram então tratadas com 1 equivalência de uma solução estoque de ácido malônico (1 M em THF). As amostras foram então congeladas, com o solvente removido por liofilização. Às amostras 3-1, 3-2, 3-3, 3-4, 3-5, 3-6, 3- 7, 3-8, 3-9, 3-10, e 3-11 foi adicionado solvente relevante (5 volumes) em temperatura ambiente. Quaisquer das soluções resultantes evaporaram naturalmente em condições ambientes, enquanto gomas ou sólidos foram maturados a 25 - 50°C (1°C/min entre as temperaturas, e 4 horas em cada temperatura) por 5 dias. Os sólidos foram analisados por XRPD (FIG. 12B), mas observou-se que todas as amostras formaram uma goma quanto eram amorfas (FIG. 12B). Os resultados são mostrados na tabela 11. A amostra um de sólido (amorfa) (3-12) foi analisada por RMN 1H e HPLC, e observou-se que continha em torno de 1 equivalência de ácido malônico (picos se sobrepõem), bem como 0,6 eq. de t-BuOH. O composto foi 99,2% puro (FIG. 13A). A FIG. 12A é uma XRDP da amostra 3-12 e A FIG. 13A é a cromatografia HPLC da amostra 3-12.

Amostra 3-12:

[00182] RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0,81 - 1,11 (m, 13 H), 1,19 (s, 1 H), 1,53 - 1,66 (m, 1 H), 3,87 - 4,01 (m, 1 H), 4,06 - 4,32 (m, 3 H), 4,64 (quin, J=6,25 Hz, 1 H), 5,55 - 5,75 (m, 1 H), 5,77 - 5,97 (m, 2 H), 6,94 - 7,10 (m, 3 H), 7,13 - 7,26 (m, 2 H), 7,66 - 7,96 (m, 1 H) Tabela 11. Condições de cristalização de sal de malonato amorfo do composto 4 *Evaporou em temperatura ambiente

Exemplo 8. Falha na formação adequada de sal usando moagem auxiliada por líquido (LAG)

[00183] Um estudo de moagem auxiliada por líquido (LAG) para determinar sais apropriados, sem ser hemissulfato, foi realizado usando os 14 contra-íons acídicos na tabela 12. Tabela 12. Soluções estoque de contra-íon usadas na cristalização com LAG

[00184] O composto 1 (30 mg) foi colocado em frascos de HPLC com dois rolamentos de esferas de 3 mm. Os materiais foram umidificados com solvente (15 μL de etanol, amostra 4-1, 4-2, 4-3, 4-4, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 4-11, 4-12, 4-13, e 4-14) e 1 equivalência do contra-íon ácido foi adicionada. As amostras foram então moídas por 2 horas em 650 rpm usando um sistema de moagem Fritsch, com um adaptador Automaxion. Observou-se que a maioria das amostras após moagem era formada por gomas claras e foram analisadas adicionalmente (Tabela 13). Aquelas nas quais observou-se a presença de sólido foram analisadas por XRPD e, em todos os casos, observou-se que os padrões obtidos combinavam com aqueles do contra-íon ácido cristalino sem nenhum pico adicional (FIG. 13B). Tabela 13. Observações e resultados de XRPD a partir de LAG dos compostos 1

Exemplo 9. Falha para obter formação adequada de sal usando metil etil cetona (MEK)

[00185] Metil etil cetona (MEK) foi a seguir utilizado como um solvente para estudar sais apropriados, sem ser o sal de hemissulfato. Usando os 14 contra-íons acídicos na tabela 12, o estudo foi realizado dissolvendo o composto 1 (50 mg) em MEK (20 vol), em temperatura ambiente. As soluções foram tratadas com 1 equivalência dos contra-íons selecionados (Tabela 12). As amostras foram então resfriadas a 5°C em 0,1°C/min, e agitadas nesta temperatura por toda a noite. Todas as amostras evaporaram naturalmente em condições ambientes e quaisquer dos sólidos observados foram analisados por XRPD. Esta evaporação produziu principalmente gomas, com a exceção das amostras com ácido esteárico (amostra 4-12) e ácido palmítico (amostra 5-13), que renderam solventes vítreos. Estes sólidos foram amorfos por XRPD, mas nenhuma forma cristalina do sal foi obtida. Os resultados são mostrados na tabela 14. (FIG. 13A). Tabela 14. Resultados do composto 1 dissolvido em MEK (20 volumes) Solução estoque preparada antes da adição de ácido *Amostras foram analisados por XRPD e forneceram padrões amorfos e picos a partir do contra-íon ácido

[00186] Uma vez que todas as amostras eram amorfas, todas as amostras foram redissolvidas em MEK (5 vol) e ciclo-hexano foi adicionado (20 volumes de antissolvente) em temperatura ambiente, seguido por 1 hora de agitação a 25°C. As amostras foram então maturadas entre 50 - 5°C (1°C/min entre temperaturas, 4 horas em cada temperatura) por 2 dias antes do ciclo ser alterado para 50 - 25°C por mais 4 dias. As amostras foram observadas a olho nu após a maturação. Os resultados são mostrados na tabela 15. Após a maturação, observou-se que todas as amostras com a exceção de 5-1 (com ácido pamóico) eram gomas. Amostra 5-1, um sólido amarelo, foi analisada por XRPD, e observou-se que o padrão combinava com a forma conhecida de ácido pamóico (FIG. 14B) e, portanto, nenhuma forma cristalina do sal foi obtida. Tabela 15. Resultados do composto 1 redissolvido em MEK (5 volumes) e antissolvente **Amostra analisada por XRPD com padrão que combina com a forma conhecida de ácido pamóico (sem picos adicionais) Exemplo 10. Falha para obter formação adequada de sal usando etil acetato

[00187] Etil acetato foi a seguir utilizado para estudar sais apropriados, sem ser sal de hemissulfato. Utilizando os 14 contra-íons acídicos na tabela 12, o estudo foi realizado dissolvendo o composto 1 (50 mg) em etil acetato (20 vol) a 50°C. As soluções foram tratadas com 1 equivalente dos contra- íons selecionados (Tabela 12). As amostras foram então resfriadas a 5°C em 0,1°C/min, e agitadas nesta temperatura por 4 dias. As soluções evaporaram naturalmente em condições ambientes, enquanto quaisquer dos sólidos foram analisados por XRPD. Os resultados das cristalizações usando etil acetato estão na tabela 16. Ao contrário do Exemplo 8, onde MEK foi o solvente, observou-se que a maioria das amostras são suspensões após resfriamento do da mistura ácido:composto (aquelas que eram soluções evaporaram naturalmente em condições ambientes). Entretanto, observou-se que os difratogramas de XRPD em geral combinam com o composto cristalino 1. Amostras 6-2, 6-4, e 6-5 apresentam algumas poucas diferenças (FIG. 14A e FIG. 15A). Nenhuma das formas cristalinas do sal foi obtida. Tabela 16. Resultados do composto 1 dissolvido em EtOAc (20 volumes)

Exemplo 11. Determinação de pureza química por HPLC

[00188] A análise de pureza no exemplo 2 e exemplo 4 foi realizada em um sistema de série Agilent HP1100, equipado com um detector de arranjo de diodo e usando software ChemStation vB.04.03, que usa o método mostrado na tabela 17. Tabela 17. Método HPLC para determinações de pureza química

Exemplo 12. Técnicas de difração de raios-X em pó (XRPD)

[00189] Os padrões de XRPDs nos exemplos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 foram coletados em um difractômetro PANalytical Empyrean usando radiação com Cu KD (45 kV, 40 mA), em geometria de transmissão. Uma fenda 0,5°, máscara de 4 mm e fendas definidoras 0,4 rad com um espelho de foco foram usadas no feixe incidente. Um detector PIXcel3D, colocado no feixe difratado, foi equipado com uma fenda receptora e fendas definidoras de 0,04 rad. O instrumento tem seu desempenho verificado usando pó de silício semanalmente. O software usado para coleta de dados foi X’Pert Data Collector v. 5.3, e os dados foram analisados e apresentados usando Diffrac Plus EVA v. 15.0.0.0 ou Highscore Plus v. 4.5. Aa amostras foram preparadas e analisadas tanto em uma placa de 96 poços de metal quanto Millipore, em modo de transmissão. O filme transparente de raios-X foi usado entre as folhas de metal na placa de poços de metal, e pós (aproximadamente 1-2 mg) foram usados como receptores. A placa Millipore foi usada para isolar e analisar sólidos das suspensões adicionando uma pequena quantidade de suspensão diretamente na placa, antes da filtração em um vácuo leve.

[00190] O modo de varredura para a placa de metal usou o eixo de varredura gônio, ao passo que uma varredura 2θ foi utilizada para a placa Millipore. Uma verificação de desempenho foi realizada usando pó de silício (placa de poços de metal). Os detalhes da coleta de dados foram uma faixa angular de 2,5 a 32,0° 2θ, um tamanho de etapa de 0,0130° 2θ, e um tempo de coleta total de 2,07 minutos.

[00191] As amostras também foram coletadas em um difratômetro Bruker D8 usando radiação Cu KD (40 kV, 40 mA), goniómetro θ - 2θ, e divergência de V4 e fendas receptoras, um monocromador Ge e um detector Lynxeye. O instrumento tem o desempenho verificado usando um padrão Corundum certificado (NIST 1976). O software usado para coleta de dados foi DiffracPlus XRD Commander v2.6.1 e o dados foram analisados e apresentados usando Diffrac Plus EVA v15.0.0.0.

[00192] As amostras foram corridas em condições ambientes como espécimes de placa plana usando pó como receptor. A amostra foi embalada suavemente em uma cavidade cortada em pastilha de silício polida, que não gera ruído (510). A amostra foi rotacionada em seu próprio plano durante a análise. Os detalhes da coleta de dados estavam em uma variação angular de 2 a 42° 2θ, um tamanho de etapa de 0,05° 2θ, e tempo de coleta de 0,5 s/etapa. Exemplo 13. Síntese do composto amorfo 2

[00193] Um frasco de 250 mL foi preenchido com MeOH (151 mL) e a solução foi resfriada em 0-5°C. Uma solução concentrada de H2SO4 foi adicionada gota a gota por 10 minutos. Um frasco separado foi preenchido com composto 1 (151 g) e acetona (910 mL), e a solução H2SO4/MeOH foi adicionada gota a gota em 25-30°C por 2,5 horas. Uma grande quantidade de sólido foi precipitada. Após a solução ser agitada por 12-15 horas a 25-30°C, a mistura foi filtrada, lavada com MeOH/acetona (25 mL/150 mL), e seca a 55-60°C em vácuo para render o composto 2 (121 g, 74%).

[00194] Método analítico para o composto 2: A pureza do composto 2 foi obtida usando um sistema HPLC Agilent 1100 com uma coluna Waters XTerra Phenyl 5μm 4,6*250mm com as seguintes condições: 1 mL/min de vazão, leitura em 254 nm, temperatura da coluna 30°C, volume de injeção de 10 μL, e um tempo de corrida de 30 minutos. A amostra foi dissolvida em ACN:água (90:10, v/v). O método de gradiente para separação é mostrado a seguir. Rt (min) do composto 2 foi aproximadamente 12,0 minutos.

[00195] RMN 1H: (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,41 (br, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,36 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 7,22 (d, J = 8,0 Hz, 2H ), 7,17 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 6,73 (s, 2H), 6,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,00 (dd, J = 12,0, 8,0 Hz, 1H), 5,81(br, 1H), 4,84-4,73 (m, 1H), 4,44-4,28 (m, 3H), 4,10 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,85-3,74 (m, 1H), 2,95 (s, 3H), 1,21 (s, J = 4,0 Hz, 3H), 1,15-1,10 (m, 9H).

Exemplo 14. Caracterização do composto 2

[00196] O composto 2 foi distinguido adicionalmente a olho nu, por RMN 1H, RMN 13C, RMN 19F, MS, HPLC e XRPD (FIG. 15B). O solvente residual foi medido por GC. O teor de água foi medido por titulação de Karl Fischer, e o teor de água foi apenas 0,70%. Os dados são sumarizados na tabela 18. Tabela 18. Sumário de dados de caracterização adicional do composto 2

Exemplo 15. Solubilidade do composto 1 e composto 2

[00197] O composto 1 e composto 2 foram ambos testados em relação à solubilidade em meios de teste biorrelevantes, incluindo fluido gástrico simulado (SGF), fluido gástrico simulado do estado em jejum (FaSSIF), e fluido gástrico do estado em jejum (FeSSIF). Os resultados para o composto 1 são mostrados na tabela 19 e os resultados para o composto 2 são mostrados na tabela 20. As amostras foram agitadas em temperatura ambiente (20 - 25°C). O composto 2 foi mais de 40 vezes mais solúvel que o composto 1 em água em 2 horas, e mais de 25 vezes mais solúvel em 24 horas. Em condições de SGF, o composto 2 apresentou uma solubilidade de 84,2 mg/mL em 24 horas, comparado à solubilidade de 15,6 mg/mL do composto 1 no mesmo ponto de tempo. O composto 2 também foi mais solúvel em 2 horas nas condições de SGF que o composto 1, e solúvel o suficiente para permitir teste mesmo após 48 horas, embora teste em 48 horas não tenha sido realizado com composto 1. Tabela 19. Resultados de teste de solubilidade do composto 1 *Amostra parece ser clara, ainda que uma solubilidade de apenas 1,5 mg/mL tenha sido atingida. Mediante investigação adicional, observa-se que um filme gomoso se formou na barra de agitação. O ingrediente farmacêutico ativo do composto 1 formou uma bola gomosa no diluente (90% de água/10% de acetonitrila) durante a preparação padrão, a qual exigiu um tempo de sonicação longo para dissolver completamente. Tabela 20. Resultados de teste de solubilidade do composto 2

Exemplo 16. Estabilidade química do composto 2

[00198] O composto 2 foi testado em relação à estabilidade química a 25 e 40°C por um período de tempo de 6 meses monitorando a pureza orgânica, teor de água, RMN 1H, DSC e IR Ramen IR. O sistema de recipiente fechado para o estudo foi uma combinação de bolsa de válvula medicinal com um filme laminado farmacêutico sobre a bolsa, e dissecante sílica gel entre as duas camadas. O composto 2 (1 g) foi medido em cada recipiente. As bolsas foram então armazenadas a 25°C/60% de RH (umidade relativa) e 40°C /75% de RH (umidade relativa). Pureza orgânica, teor de água, RMN 1H, DSC e Raman foram medidos no tempo 0, mês 1, mês 2, mês 3 e mês 6.

[00199] A pureza do composto 2 foi obtida usando um sistema Shimadzu LC-20AD com uma coluna Waters XTerra Phenyl, 5μm, 4,6x250mm com as seguintes condições: 1 mL/min de vazão, leitura em 254 nm, temperatura de coluna a 35°C, e 10 μL de volume de injeção. A amostra foi dissolvida em acetonitrila - água (90:10) (v/v). O método de gradiente é mostrado a seguir.

[00200] O teor de água do composto 2 (250 mg) foi determinado por um aparelho de titulação de água usando o método de titulação de Karl Fischer.

[00201] Os resultados são mostrados na tabela 21 e tabela 22. Quando o composto 2 foi armazenado por 6 meses a 25 e 40°C, a taxa de degradação foi mínima. Em 3 meses, o composto 2 foi 99,75% por cento puro nas condições de 25°C, e 99,58% puro nas condições de 40°C. Em 6 meses, o composto 2 ainda era 99,74% puro nas condições de 25°C e 99,30% puro nas condições de 40°C. Em 25°C, o percentual de produto de degradação aumentou de 0,03% no dia 0 para 0,08% após 6 meses. Em 40°C, o percentual de produto de degradação aumentou de 0,03% a 0,39%. Durante o período de 6 meses, o percentual de água aumentou aproximadamente 0,6% a 25°C e aumentou aproximadamente 0,7% a 40°C.

[00202] A caracterização por RMN 1H, Raman, e DSC do composto 2 nos 1, 2, 3, e 6 meses foi a mesma caracterização do composto 2 no dia 0 em ambas as condições de temperatura (Tabela 22), destacando a estabilidade a longo prazo do composto 2. Tabela 21. Taxa de degradação do composto 2 por 6 meses em 25 e 40°C Tabela 22. Caracterização do composto 2 durante o estudo de degradação

[00203] Estudos adicionais de estabilidade química do composto 2 foram avaliados para determinar os níveis de impureza e água. Três condições foram testadas: estabilidade acelerada (40 + 2°C / 75 + 5% de RH) por um período tempo de 6 meses, estabilidade ao ambiente (25 + 2°C / 60 + 5% de RH) por um período de 9 meses, e estabilidade em condições refrigeradas (5 + 3°C) por um período de tempo de 9 meses. Os resultados para estabilidade acelerada, estabilidade ao ambiente, e condições refrigeradas são mostrados na tabela 23, tabela 24 e tabela 25, respectivamente. Com base nos resulta destes estudos, o composto 2 é muito estável quimicamente.

[00204] No estudo de estabilidade acelerada (Tabela 23), em cada ponto de tempo (1° mês, 3o mês, e 6o mês) onde o composto 2 foi medido, a aparência do composto 2 foi sempre um sólido branco e IR combinou com o padrão de referência. Após seis meses, as impurezas totais de substância relacionada 1 foram apenas 0,08% e não houve nenhuma detecção de substância 2 relacionada 2 e isômeros. Tabela 23. Estabilidade acelerada (40 + 2°C / 75 + 5% de RH) do composto 2 N.D.: Não detectado

[00205] No estudo de estabilidade ao ambiente, onde os níveis de aparência, IR, água e impureza foram medidos por nove meses, a aparência do composto 2 foi sempre um sólido branco e IR sempre correspondeu à amostra de referência. Os resultados (Tabela 24) destacam como o composto 2 quimicamente estável é. Após 9 meses, o percentual de água na amostra foi apenas 0,20% e as impurezas totais de substância relacionada 1 foram apenas 0,02%. De maneira similar aos estudos de estabilidade acelerada, a substância relacionada 2 e qualquer dos isômeros do composto 2 não foram detectados. Tabela 24. Estabilidade ao ambiente (25 + 2°C / 60 + 5% de RH) do composto 2 N.D.: Não detectado

[00206] Os resultados da avaliação da estabilidade em condições refrigeradas são mostrados na tabela 25. As únicas impurezas detectadas mesmo após 9 meses foram aquelas da substância relacionada 1 e água. O teor de água após 9 meses foi 0,32% e as impurezas totais de substância relacionada 1 foram apenas 0,01% da amostra. O composto 2 é quimicamente muito estável em condições refrigeradas. Tabela 25. Estabilidade em condições refrigeradas (5 + 3°C) do composto 2 N.D.: Não detectado

Exemplo 17. Níveis plasmáticos de metabólitos após doses orais únicas do composto 2

[00207] Uma única dose oral do composto 2 foi administrada a ratos, cachorros e macacos, e os níveis plasmáticos de certos metabólitos mostrados no esquema 1 foram medidos.

[00208] A conversão do composto 2 no composto 1 e metabólito 1-7 são mostradas na tabela 26 e os resultados para o metabólito 1-8 e metabólito 1-2 são mostrados na tabela 27. Em ratos, níveis baixos da exposição ao composto 1 foram observados, mas altos níveis de metabólito 1-7, o metabólito nucleosídeo do trifosfato ativo (metabólito 1-6), foram observados. Em macacos, exposições mais ou menos proporcionais à dose do composto 1 foram medidas. Em cachorros, exposições acima do proporcional ao composto 1, indicativo de depuração metabólica de primeira passagem no fígado, foram medidas. Em todo o estudo, foi observado significativamente mais vômito em cachorros (5/5 em grupo e dose elevada) do que em macacos (1/5 em grupo de dose elevada). Tabela 26. Níveis plasmáticos do composto 1 e metabólito 1-7 após doses orais únicas do composto 2 3 machos por dose por espécie; * formulações da dose: a0,5% de CMC, 0,5% de Tween 80 em água; bpó em cápsulas\ Tabela 27. Níveis plasmáticos de metabólitos 1-8 e 1-2 após única dose oral do composto 2 3 machos por dose por espécie; *dose formulações: a0,5% de CMC, 0,5% de Tween 80 em água; bpó em cápsulas

Exemplo 18. Exposição tecidual de trifosfato ativo após dose oral do composto 2

[00209] Níveis teciduais do coração e fígado do trifosfato ativo (TP) do composto 2 (metabólito 1-6) foram medidos 4 horas após doses orais do composto 2. Amostras de fígado e coração foram obtidas em 4 horas após uma única dose do composto 2, congeladas rapidamente, homogeneizadas e analisadas por LC-MS/MS em relação aos níveis intracelulares do TP ativo. Os níveis teciduais foram medidos em ratos, cachorros e macacos, da maneira mostrada na FIG. 16A. Altos níveis do TP ativo foram medidos no fígado de todas as espécies testadas. Os níveis relativamente baixos do TP ativo foram medidos nos corações de cachorros em virtude da saturação do metabolismo hepático de primeira passagem, e níveis não quantificáveis de TP foram medidos em corações de rato e macaco, indicativo de formação específica no fígado do TP ativo. Embora não mostrado, comparada à dosagem do composto 1, a dosagem do composto 2 melhorou a distribuição de TP.

Exemplo 19. Comparação farmacológica do composto 1 e composto 2 em cachorros

[00210] Um estudo comparativo de cachorros dosados com composto 1 e composto 2 foi realizado. O estudo avaliou níveis plasmáticos do composto 1 e metabólito 1-7 (do esquema 1) além das 4 horas após dosagem com composto 1 (25 mg/kg) e composto 2 (30 mg/kg) (Tabela 28), e a AUC(0-4hr) de metabólito 1-7 foi duas vezes maior com composto 2, comparado ao composto 1. As exposições com dose normalizada ao composto 1 e metabólito 1-7 são mostradas na tabela 28. Os valores para AUC(0-4hr) para o composto 1, metabólito 1-7, e a soma do composto 1 + metabólito 1-7 foram maiores após dosagem com composto 2. Tabela 28. Comparação de níveis plasmáticos após dosagem com composto 1 e composto 2 Composto Dosado AUC(0-4hr)a (μM*hr) normalizada com dose média para: Valores de aAUC(0-4hr) normalizados para uma dose de 25 mg/kg

[00211] Concentrações de trifosfato na razão de fígado/coração indicam que a dosagem com composto 2, comparada ao composto 1, aumenta a liberação seletiva do trifosfato no fígado, da maneira mostrada na tabela 29. A AUC(0-4hr) do metabólito de guanina ativa (1-6) após administração do composto 1, medida no coração, foi 174 μM*hr, enquanto a AUC(0-4hr) do metabólito de guanina ativa (1-6) após a administração do composto 2, medida no coração, foi 28 μM*hr. A razão fígado/coração para o composto 2 foi 20, comparada a uma razão fígado/coração de 3.1 para o composto 1. Tabela 29. Comparação de exposição no fígado e coração após a dosagem com composto 1 e composto 2 a Concentrações de TP ativo (1-6; Esquema 1) normalizado com uma dose de 25 mg/kg b Extrapolado abaixo do limite inferior de quantificação da curva de calibração

[00212] O efeito de maior seletividade para o fígado em relação ao coração quando o composto 2 foi administrado, comparado ao composto 1, também é mostrado na FIG. 16B. Os níveis teciduais no coração e fígado do trifosfato ativo após uma dosagem do composto 2 (30 mg/kg) foram comparados aos níveis teciduais do trifosfato ativo após uma dosagem do composto 1 (25 mg/kg). A concentração do TP ativo foi maior no fígado do que no coração, tanto para o composto 1 quanto composto 2, mas o TP ativo foi mais seletivo pelo fígado em relação ao coração quando o composto 2 foi dosado, comparado ao composto 1.

Exemplo 20. Perfis plasmáticos dos metabólitos do composto 2 em ratos e macacos

[00213] Aos ratos Sprague-Dawley machos e macacos cinomolgos (3 animais por grupo de dose) foram fornecidas doses orais únicas do composto 2. Alíquotas de plasma preparadas a partir de amostras de sangue tratado com Dichlorvos foram analisadas por LC-MS/MS em relação às concentrações do composto 1 e metabólito 1-7 (o metabólito nucleosídeo do trifosfato ativo do composto 2 mostrado no esquema 1), e os parâmetros de farmacocinética foram determinados usando WinNonlin. Os resultados para uma única dose de 500 mg/kg em ratos são mostrados na FIG. 17 e os resultados para uma única dose de 30, 100, ou 300 mg/kg em macacos são mostrados na FIG. 18. Os resultados também são sumarizados na tabela 30.

[00214] Níveis plasmáticos elevados de metabólito 1-7, o metabólito nucleosídeo do trifosfato ativo (TP) do composto 2, são indicativos de formação de níveis elevados do TP, mesmo em ratos onde níveis plasmáticos muito baixos de pró-fármaco nucleotídico original são observados, em virtude da meia vida curta do composto 1 no sangue de rato (<2 min). Os níveis plasmáticos persistentes de metabólito 1-7 refletem a meia vida longa do TP.

[00215] Em macacos, exposições plasmáticas (AUC) do composto 1 foram mais ou menos proporcionais à dose, embora as exposições ao metabólito 1-7 tenham sido algumas vezes menores do que o proporcional à dose, embora os valores de AUC tanto para o fármaco original quanto para o metabólito nucleosídeo do TP ativo continuem a aumentar até a dose mais alta testada (300 mg/kg).

[00216] A administração oral do composto 2 em ratos e macacos produziu exposições plasmáticas altas e dependentes da dose para o metabólito 1-7 (o metabólito nucleosídeo do trifosfato ativo intracelular do composto 2); as exposições ao metabólito 1-7 continuaram a aumentar até a dose mais alta testada, refletindo formação substancial do TP ativo nestas espécies. Tabela 30. Níveis plasmáticos dos compostos 1 e 1-7 após única dose oral do composto 2 Formulações de dose: a0,5% de CMC, 0,5% de Tween 80 em água; bpó em cápsulas

Exemplo 21. O efeito do trifosfato ativo do composto 1 e composto 2 na integridade mitocondrial

[00217] A eficiência relativa de incorporação do trifosfato ativo (TP) do composto 1 e composto 2, metabólito 1-6 (Esquema 1), por RNA polimerase mitocondrial de humano foi comparada à eficiência relativa do TP ativo de sofosbuvir e o TP ativo de INX-189. O composto 1 e composto 2 não são prováveis de afetar integridade mitocondrial, uma vez que seu trifosfato ativo é pouco incorporado por RNA polimerase mitocondrial de humano com uma eficiência similar àquela do trifosfato de sofosbuvir; a eficiência relativa de incorporação do trifosfato de INX-189 foi até 55 vezes maior. Os resultados são mostrados na tabela 31. A incorporação destes análogos por RNA polimerase mitocondrial de humano dependente de RNA (POLRMT) foi determinada de acordo com Arnold et al. (Sensitivity of Mitochondrial Transcription and Resistance of RNA Polymerase II Dependent Nuclear Transcription to Antiviral Ribonucleotides. PLoS Pathog., 2012, 8, e1003030). Tabela 31. Parâmetros cinéticos para análogos de nucleotídeo avaliados com RNA polimerase mitocondrial de humano *Eficiência relativa = (Kpol/Kd,app) nucleotídeo análogo / (Kpol/Kd,app) nucleotídeo natural

Exemplo 22. Atividade do composto 1 contra replicons contendo a sequência de NS5B

[00218] Um painel de replicons contendo as sequências de NS5B de vários genótipos de HCV, derivados de 6 cepas de referência de laboratório (GT1a, 1b, 2a, 3a, 4a e 5a) (FIG. 19) e de 8 amostras do plasma de paciente com HCV (GT1a, 1b, 2a, 2b, 3a-1, 3a-2, 4a e 4d) (FIG. 20), foi usado para determinar a eficiência do composto 1 e sofosbuvir.

[00219] Composto 1 foi mais potente que sofosbuvir contra cepas de HCV clínicas e de laboratório. O composto 1 mostrou atividade antiviral pan- genotípica potente in vitro contra isolados clínicos tipo selvagem com EC95 < 80 nM, que é 4 a 14 vezes mais potente que sofosbuvir. Da maneira mostrada na FIG. 20, valores de EC95 para o composto 1 foram 7-33 vezes menores que sofosbuvir contra isolados clínicos de todos os genótipos de HCV testados. Os valores de EC50 para o composto 1 foram 6-11 vezes menores que sofosbuvir contra as cepas de laboratório de HCV genótipos 1-5 (FIG. 19).

Exemplo 23. Estudo de dose ascendente única (SAD) do composto 2 em voluntários saudáveis (Parte A) e pacientes infectados com GT1-HCV (Parte B)

[00220] O composto 2 foi testado em um estudo de dose ascendente única (SAD) para avaliar sua segurança, tolerabilidade, e farmacocinética em sujeitos saudáveis (Parte A). A parte A foi um estudo SAD controlado por placebo, duplo cego, randomizado. Sujeitos saudáveis na parte A receberam uma única dose do composto 2 ou placebo no estado de jejum. Os sujeitos ficaram confinados na clínica do dia 1 ao dia 6.

[00221] A dosagem em cada coorte foi escalonada, de maneira tal que 2 sujeitos (1 ativo:1 placebo) fossem avaliados por 48 horas após dosagem, antes do restante do coorte ser dosado. Cada coorte recebeu composto 2 em ordem ascendente. A dosagem de coortes sequenciais ocorreu com base na revisão de dados de segurança disponíveis (por 5 dias) e dados de farmacocinética do plasma (por 24 h) do coorte prévio.

[00222] O escalonamento de dose continuou após revisão satisfatória destes dados. Os dados de farmacocinética e segurança emergiram dos coortes anteriores, as doses avaliadas nos coortes 3a-4a foram ajustadas por aumentos em mais de 100 mg. A dose máxima total avaliada na parte A não excedeu 800 mg. O regime de dosagem para a parte A é mostrado na tabela 32. Tabela 32. Regime de dosagem para a administração do composto 2 na parte A do estudo *Doses clínicas são expressas em termos do composto 2, com a base do composto 1 aproximada equivalente entre parênteses

[00223] Voluntários saudáveis na porção da parte A do estudo foram sujeitos do sexo masculino e feminino, entre as idades de 18 e 65 anos. Receptores do ativo e placebo foram agrupados em cada coorte da parte A para preservar o estudo cego.

[00224] O composto 2 também foi testado em um estudo de dose ascendente única (SAD) para avaliar sua segurança, tolerabilidade, farmacocinética, e atividade antiviral em pacientes infectados com GT1-HCV (Parte B). Os sujeitos na parte B receberam uma única dose do composto 2 no estado de jejum. Os pacientes ficaram confinados na clínica do dia 1 ao dia 6.

[00225] A parte B foi iniciada após os dados de segurança (até o dia 5) e farmacocinética plasmática (por 24 h) serem revisados a partir do coorte 3a na parte A. Os dados de segurança (até o dia 5) e os dados de farmacocinética (por 24 h) disponíveis foram revisados para o primeiro coorte na parte B (Coorte 1b), antes de incluir subsequentes coortes da parte B. Subsequentes coortes da parte B foram dosados apenas após revisão dos dados de segurança e farmacocinética disponíveis das respectivas doses na parte A, bem como segurança (até o dia 5) disponível dos coortes prévios da parte B.

[00226] O escalonamento de dose até 600 mg em pacientes infectados com HCV continuou após revisão satisfatória destes dados. O regime de dosagem para a parte B é mostrado na tabela 33. Tabela 33. Regime de dosagem para o composto 2 na parte B do estudo *Doses clínicas são expressas em termos do composto 2, a base do composto 1 aproximada equivalente entre parênteses.

[00227] Pacientes infectados com HCV eram sujeitos infectados com GT1 não cirróticos, com tratamento natural, com uma carga viral de > 5 log10 IU/mL.

[00228] Nenhum evento adverso sério foi registrado e nenhuma descontinuação prematura foi exigida tanto na parte A quanto na parte B. Todos os efeitos adversos foram suaves a moderados em intensidade, e nenhum padrão relacionado à dose, incluindo parâmetros de laboratório, sinais vitais, e ECGs foram evidentes.

Exemplo 24. Resultados do estudo de dose ascendente única (SAD) do composto 2

[00229] A farmacocinética do composto 1 e metabólito nucleosídeo 17 foram medidos após a dose única do composto 2. A concentração plasmática mínima C24 (C24h) de metabólito 1-7 em pacientes infectados com HCV após uma dose do composto 2 de 600 mg foi 25,8 ng/mL, que é mais do dobro da dose de concentração plasmática após uma dose de 300 mg do composto 2. O metabólito 1-7 (mostrado no esquema 1) pode ser gerado apenas por meio de desfosforilação do fosfato intracelular do metabólito 1-4, metabólito 1-5, e metabólito 1-6, que é a espécie ativa. Portanto, metabólito 1- 7 pode ser considerado um substituto da espécie ativa. Os dados de farmacocinética para todos os coortes são mostrados na tabela 34 e tabela 35. Os valores são registrados como média± SD, exceto para Tmax, onde a mediana (faixa) é registrada. Os parâmetros de farmacocinética foram comparáveis em pacientes saudável e infectados com HCV. Tabela 34. Farmacocinética em humano do composto 1 e metabólito 1-7 após administração de uma única dose do composto 2 em voluntários saudáveis *Com base em perfil de 24 horas. Tabela 35. Farmacocinética em humanos do composto 1 e metabólito 1-7 após administração do composto 2 em pacientes infectados com GT1- HCV *Com base em perfil de 24 horas.

[00230] Os perfis de tempo-concentração plasmática média do composto 1 e metabólito 1-7 também foram calculados para todos os coortes da parte A e parte B do estudo. A FIG. 21 é a concentração plasmática média do composto 1 após uma única dose do composto 2, e a FIG. 22 é a concentração plasmática média de metabólito 1-7 após uma única dose do composto 2. Da maneira mostrada na FIG. 21, o composto 1 foi prontamente absorvido e rapidamente/extensivamente metabolizado em todos os coortes da parte B. Da maneira mostrada na FIG. 22, o metabólito 1-7 foi um metabólito principal e exibiu concentrações plasmáticas contínuas. A exposição plasmática do composto 1 foi relacionada à dose, enquanto a exposição do metabólito 1-7 foi proporcional à dose.

[00231] Para os sujeitos infectados com HCV da parte B, medições da quantificação de RNA de HCV foram realizadas antes, durante, e após a administração do composto 2. As determinações de RNA de HCV no plasma foram realizadas por meio do uso de um ensaio comercial validado. A linha de base foi definida como a média do dia -1 e dia 1 (pré-dose). Uma única dose de 300 mg do composto 2 (equivalente a 270 mg do composto 1) resultou em atividade antiviral significativa em sujeitos infectados por GT1b- HCV. A média de redução máxima de RNA de HCV 24 horas após a dose, após uma única dose de 300 mg, foi 1,7 log10 IU/mL e isto se compara a uma redução de -2 log10 IU/mL após 1 dia de 400 mg de monoterapia com sofosbuvir em sujeitos infectados com GT1a HCV. A média de redução máxima de RNA de HCV 24 horas após a dose, após uma única dose de 100 mg, foi 0,8 log10 IU/mL. A média de redução máxima de RNA de HCV foi 2,2 log10 IU/mL, após uma única dose de 400 mg. Análises farmacocinéticas/farmacodinâmicas individuais para os sujeitos individuais da parte B do estudo são mostradas nas FIGS. 23A-23F. A concentração de metabólito 1-7 é representada graficamente contra a concentração da redução de RNA de HCV, e da maneira mostrada nas FIGS. 23A-23F, a redução de RNA de HCV plasmático se correlaciona com exposição plasmática do metabólito 1-7. A resposta viral é mantida com concentrações plasmáticas de metabólito 1-7, que são maiores que o valor de EC95 contra GT1b. A correlação entre concentração plasmática e níveis de redução de RNA de HCV indica que uma resposta mais acentuada será atingida com doses maiores do composto 2.

Exemplo 25. Níveis mínimos previstos do estado estacionário de metabólito 1-7 excedem valores de EC95 do composto 1 contra isolados clínicos de HCV GT 1-4

[00232] Da maneira mostrada na FIG. 24, os níveis plasmáticos mínimos no estado estacionário (C24,ss) de metabólito 1-7, após dosagem do composto 2 em humanos (600 mg QD (550 mg de base livre equivalente) e 450 mg QD (400 mg de base livre equivalente)), foram previstos e comparados à EC95 do composto 1 in vitro em todos os isolados clínicos testados para determinar se a concentração plasmática no estado estacionário é consistentemente maior que a EC95, o que poderia resultar em muita eficiência contra qualquer ou todos os isolados clínicos testados in vivo. A EC95 para o composto 1 é a mesma da EC95 do composto 2. Para o composto 2 ser eficiente, o nível plasmático mínimo no estado estacionário do metabólito 1-7 deve exceder a EC95.

[00233] Da maneira mostrada na FIG. 24, a EC95 do composto 2 contra todos os isolados clínicos testados variou de aproximadamente 18 a 24 nM.

[00234] Da maneira mostrada na FIG. 24, o composto 2 em uma dose de 450 mg QD (400 mg de base livre equivalente) em humanos provê uma concentração plasmática mínima no estado estacionário prevista (C24,ss) de aproximadamente 40 ng/mL. O composto 2 em uma dose de 600 mg QD (550 mg de base livre equivalente) em humanos provê uma concentração plasmática mínima no estado estacionário prevista (C24,ss) de aproximadamente 50ng/mL.

[00235] Portanto, a concentração plasmática no estado estacionário prevista de metabólito substituto 1-7 é quase o dobro da EC95 contra todos os isolados clínicos testados (mesmo o GT3a difícil de tratar), que indica desempenho superior.

[00236] Ao contrário, a EC95 do padrão de nucleotídeo sofosbuvir de cuidado varia de 50 a 265 nM em todos os isolados clínicos testados de HCV, com uma EC95 menor que a concentração no estado estacionário prevista na dosagem comercial de 400 mg para apenas dois isolados, GT2a e GT2b. A EC95 para a dosagem comercial de 400 mg de sofosbuvir é maior que a concentração no estado estacionário prevista para outros isolados clínicos, GT1a, GT1b, GT3a, GT4a e GT4d.

[00237] A concentração plasmática mínima no estado estacionário (C24,ss) de 450 mg do composto 2 foi prevista usando a concentração plasmática mínima no estado estacionário (C24,ss) de 300 mg. A concentração plasmática média no estado estacionário mínima (C24,ss) em 300 mg foi 26,4 ng/mL e, portanto, o cálculo foi 26,4*450/300=39,6 ng/mL.

[00238] A concentração plasmática mínima no estado estacionário (C24,ss) de 600 mg foi prevista usando três abordagens: 1) a média de 600 mg C24 Dia 1 foi 25,8 ng/mL e um aumento de 60% foi considerado para atingir o estado estacionário. Portanto, o cálculo foi 25,8*1,6=41,3 ng/mL; 2) a média de 400 mg C24 dia 1 foi 22,5 ng/mL e um aumento de 60% foi considerado para atingir o estado estacionário. Levando em consideração a dose proporcional PK, o cálculo foi 22,5*1,6*600/400=54 ng/mL; e 3) a concentração plasmática mínima no estado estacionário (C24,ss) de 300 mg foi 26,4 ng/mL e uma PK proporcional foi considerada. Portanto, o cálculo foi 26,4*2=52,8 ng/mL. A concentração plasmática mínima no estado estacionário (C24,ss) de 600 mg é a média dos 3 pontos de dados ( (41,3+54+52,8)/3=49,3 ng/mL). Em geral, existe um aumento de cerca de 60% em C24, em estado estacionário comparado à C24 após uma única dose.

[00239] Os dados comparando os parâmetros de eficiência e farmacocinética no estado estacionário na FIG. 24 demonstram claramente a importância terapêutica inesperada do composto 2 para o tratamento de hepatite C. De fato, o nível plasmático do estado estacionário previsto após administração do composto 2 é previsto para ser pelo menos 2 vezes maior que a EC95 para todos os genótipos testados, e é 3 a 5 vezes mais potente contra GT2. Estes dados indicam que o composto 2 apresenta atividade antiviral pan-genotípica potente em humanos. Da maneira mostrada na FIG. 24, a EC95 de sofosbuvir em GT1, GT3, e GT4 é maior que 100 ng/mL. Assim, surpreendentemente, o composto 2 é ativo contra HCV em uma forma de dosagem que libera uma concentração mínima no estado estacionário menor (40-50 ng/mL) que a concentração mínima no estado estacionário (aproximadamente 100 ng/mL), atingida por uma forma de dosagem similar de sofosbuvir.

Exemplo 26. Formulação, descrição e fabricação do composto 2

[00240] Uma fórmula de lote não limitante representativa para os comprimidos do composto 2 (50 mg e 100 mg) é apresentada na tabela 36. Os comprimidos foram produzidos a partir de uma mistura comum, usando um processo de compressão direta, da maneira mostrada na FIG. 25. O ingrediente farmacêutico ativo (API) é ajustado com base no ensaio como-tal, com o modo de ajuste no percentual de celulose microcristalina. O API e excipientes (celulose microcristalina, lactose monoidratada, e croscarmelose de sódio) foram selecionados, colocados em um misturador em V (PK Blendmaster, bacia de 0,5 L) e misturados por 5 minutos em 25 rpm. Estearato de magnésio foi então selecionado, adicionado e a mistura foi misturada por mais 2 minutos. A mistura comum foi dividida para uso na produção de comprimidos de 50 mg e 100 mg. A mistura lubrificada foi então comprimida em uma velocidade de 10 comprimidos/minutos, usando uma prensa de comprimido para pesquisa com furo único (Korsch XP1) e um alimentador de pós por gravidade. Os comprimidos de 50 mg foram produzidos usando ferramenta de 6 mm côncava padrão redonda e forças de 3,5 kN. Os comprimidos de 100 mg foram produzidos usando ferramenta de 8 mm côncava padrão redonda e forças de 3,9-4,2 kN. Tabela 36. Formulação de comprimidos de 50 mg e 100 mg de composto 2

[00241] O composto 2 foi ajustado com base no ensaio como tal, com o ajuste realizado no percentual de celulose microcristalina. O composto 2 e os excipientes (celulose microcristalina, lactose monoidratada e croscarmelose de sódio) foram selecionados, colocados em um misturador em V (PK Blendmaster, bacia de 0,5 L) e misturados por 5 minutos em 25 rpm. Estearato de magnésio foi então selecionado, adicionado e a mistura foi misturada por mais 2 minutos. A mistura comum foi dividida para uso na produção de comprimidos de 50 mg e 100 mg. A mistura lubrificada foi então comprimida em uma velocidade de 10 comprimidos/minutos, usando uma prensa de comprimido para pesquisa com furo único (Korsch XP1) e um alimentador de pós por gravidade. Os comprimidos de 50 mg foram produzidos usando ferramenta de 6 mm côncava padrão redonda e forças de 3,5 kN. Os comprimidos de 100 mg foram produzidos usando ferramenta de 8 mm côncava padrão redonda e forças de 3,9-4,2 kN. As especificações dos comprimidos de 50 mg e 100 mg são mostradas na tabela 37. Tabela 37. Especificações de comprimidos de 50 mg e 100 mg do composto 2

[00242] Os comprimidos de 50 mg e 100 mg produzidos da maneira descrita anteriormente foram submetidos aos estudos de estabilidade por 6 meses em três condições: 5°C (refrigeração), 25°C/60% de RH (ambiente), e 40°C/75% de RH (acelerada). Tanto os comprimidos de 50 mg quanto de 100 mg foram quimicamente estáveis em todas estas três condições testadas.

[00243] Em condições de refrigeração (5°C), tanto os comprimidos de 50 mg quanto de 100 mg permaneceram como sólidos brancos, que não alteraram em aparência de T=0 a T=6 meses. Em todos os 6 meses de estudo, nenhuma impureza que foi relatada foi maior que 0,05% tanto para os comprimidos de 50 mg quanto os comprimidos de 100 mg. O teor de água após 6 meses também foi menor que 3,0% p/p para ambos os comprimidos. Resultados similares foram relatados quando os comprimidos foram submetidos às condições ambientes (25°C/60% de RH); nenhuma das impurezas que foi maior que 0,05% foi relatada durante todo os 6 meses para ambos os comprimidos, e o teor de água não excedeu 3.0% p/p na marca dos 6 meses. Quando os comprimidos foram submetidos às condições aceleradas (40°C/75% de RH), a aparência dos comprimidos de 50 mg e 100 mg não alterou de um comprimido branco, redondo. Uma impureza foi relatada após 3 meses, mas a impureza foi apenas 0,09%. Uma segunda impureza foi relatada após 6 meses, mas o percentual total de impureza foi apenas 0,21% tanto para os comprimidos de 50 mg quanto de 100 mg. O teor de água foi 3,4% p/p em 6 meses para os comprimidos de 50 mg e 3,2% p/p para os comprimidos de 100 mg.

[00244] Em um estudo separado, a estabilidade dos comprimidos de 50 mg e 100 mg do composto 2 em condições ambientes (25°C/60% de RH) foi medida por 9 meses. A aparência do comprimido de 50 mg e 100 mg não mudou de um comprimido branco, redondo, durante o período de 9 meses. Impurezas no comprimido de 50 mg foram menos de 0,10% após 9 meses e impurezas no comprimido de 100 mg foram menos de 0,05%. O teor de água do comprimido de 50 mg e do comprimido de 100 mg após 9 meses foi apenas 2,7% p/p e 2,6% p/p, respectivamente.

[00245] Esta especificação foi descrita com referência às modalidades da invenção. Entretanto, os versados na técnica avaliam que várias modificações e alterações podem ser realizadas sem fugir do escopo da invenção, da maneira apresentada nas reivindicações a seguir. Dessa maneira, a especificação deve ser considerada em um sentido ilustrativo, sem ser um sentido restritivo, e pretende-se que todas as tais modificações sejam incluídas no escopo da invenção.

Claims (56)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

6. Composto, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o composto é pelo menos 90% isento do enantiômero R de fósforo oposto.

8. Composto, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o composto é pelo menos 98% livre do enantiômero R de fósforo oposto.

9. Composto, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o composto é pelo menos 99% livre do enantiômero R de fósforo oposto.

10. Composto, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

11. Composto, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o composto é pelo menos 90% livre do enantiômero S de fósforo oposto.

12. Composto, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o composto é pelo menos 98% livre do enantiômero S de fósforo oposto.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o composto é pelo menos 99% livre do enantiômero S de fósforo oposto.

14. Composto de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

15. Composto, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o composto é pelo menos 90% livre do enantiômero R de fósforo oposto.

16. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é da fórmula:

17. Composto, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o composto é pelo menos 90% livre do enantiômero S de fósforo oposto.

18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-5 e 14-17, em um carreador farmaceuticamente aceitável.

19. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 6, em um carreador farmaceuticamente aceitável.

20. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em um carreador farmaceuticamente aceitável.

21. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o composto como definido na reivindicação 10, em um carreador farmaceuticamente aceitável.

22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 11-13, em um carreador farmaceuticamente aceitável.

23. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-22, caracterizada pelo fato de estar em uma forma de dosagem oral.

24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem oral é uma forma de dosagem sólida.

25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem sólida é um comprimido.

26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem sólida é uma cápsula.

27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem oral é uma forma de dosagem líquida.

28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a forma de dosagem líquida é uma suspensão ou solução.

29. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-22, caracterizada pelo fato de que é uma formulação intravenosa.

30. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-22, caracterizada pelo fato de que é uma formulação parenteral.

31. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-30, caracterizada pelo fato de que distribui pelo menos 400 mg do composto.

32. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-30, caracterizada pelo fato de que distribui pelo menos 500 mg do composto.

33. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 30, caracterizada pelo fato de que fornece pelo menos 600 mg do composto.

34. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 30, caracterizada pelo fato de que fornece pelo menos 700 mg do composto.

35. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e 14 a 17, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de infecção por hepatite C em um ser humano com necessidade do mesmo.

36. Uso de um composto, como definido na reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de infecção por hepatite C em um ser humano que dele necessite.

37. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de infecção por hepatite C em um ser humano com necessidade do mesmo.

38. Uso de um composto, como definido na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de infecção por hepatite C em um ser humano que dele necessite.

39. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 11-13, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de infecção por hepatite C em um ser humano com necessidade do mesmo.

40. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-39, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado por via oral.

41. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-39, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado por via intravenosa.

42. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-39, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado por via parenteral.

43. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-42, caracterizado pelo fato de que pelo menos 400 mg do composto são administrados.

44. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-42, caracterizado pelo fato de que pelo menos 500 mg do composto são administrados.

45. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-42, caracterizado pelo fato de que pelo menos 600 mg do composto são administrados.

46. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-42, caracterizado pelo fato de que pelo menos 700 mg do composto são administrados.

47. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-46, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado por até 12 semanas, por até 8 semanas ou por até 6 semanas.

48. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 47, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado uma vez ao dia.

49. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-47, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado duas vezes ao dia.

50. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 49, caracterizado pelo fato de que o vírus da hepatite C é o genótipo 1a ou 1b.

51. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 49, caracterizado pelo fato de que o vírus da hepatite C é o genótipo 2a ou 2b.

52. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 49, caracterizado pelo fato de que o vírus da hepatite C é o genótipo 3a.

53. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 49, caracterizado pelo fato de que o vírus da hepatite C é o genótipo 4a ou 4d.

54. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 49, caracterizado pelo fato de que o vírus da hepatite C é o genótipo 5a.

55. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizado pelo fato de que o composto é um sólido amorfo.

56. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizado pelo fato de que o composto é um sólido cristalino.