BR112019013600A2 - uso do gene regulador cpcr para obtenção de novas cepas recombinantes de bacillus thuringiensis com capacidade de esporulação reduzida - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se ao uso de um gene regulador cpcr, que direciona a expressão de promotores de genes que codificam proteínas cry, para reduzir a esporulação de uma cepa de bacillus thuringiensis, novas cepas recombinantes de bacillus thuringiensis e seus usos como biopesticida.
Description
“USO DO GENE REGULADOR CPCR PARA OBTENÇÃO DE NOVAS CEPAS RECOMBINANTES DE BACILLUS THURINGIENSIS COM CAPACIDADE DE ESPORULAÇÃO REDUZIDA”.
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se ao uso de um gene regulador cpcR para reduzir a esporulação de uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis compreendendo o gene cpcRe seus usos em particular como biopesticidas.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
Bactérias e Esporulação [002] Espécies de Bacillus são bactérias gram-positivas, aeróbicas ou anaeróbicas, formadoras de endósporos, em formato de bastonete. As muitas espécies do gênero são capazes de vive em todos os ambientes naturais. Apenas um endósporo é formado por célula. Os esporos são resistentes ao calor, frio, radiação, dessecação e desinfetantes. No início da esporulação, metabolites secundários são produzidos por Bacillus sp. Esses metabolites secundários podem ser: enzimas, antibióticos e inseticidas.
[003] Bacillus larvae, Bacillus lentimorbus, Bacillus popilliae, Bacillus sphaericus e Bacillus thuringiensis são patógenos de grupos específicos de insetos (Bacillus, Medical Microbiology). Dessa forma, alguns bacillus são usados como os ingredientes ativos de inseticidas.
[004] Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria presente no solo, que produz esporos e sintetiza proteínas de liberação de cristais que são tóxicas para insetos e classificadas como Cryl, -2, -3, -4,..., de acordo com suas sequências de peptídeos (Crickmore et al., 1998). Mais particularmente, cepas de Bt produzem cristais inseticidas na célula-mãe de bactérias de esporulação que são usados como biopesticidas para controle de insetos indesejáveis, tais como Lepidópteros,
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Coleópteros e mosquitos (Schnepf et al., 1998). No final da esporulação, o cristal é encontrado ao lado do esporo. Os promotores de genes que codificam essas toxinas de cristal são conhecidos. Eles são, por exemplo, os promotores que controlam a expressão de genes cry1, cry2, cry3, cry4 (Agaisse etal., 1995; Deng etal., 2014). Os promotores dos genes cry1, cry2 e cry4 são reconhecidos por RNA polimerases associadas aos fatores sigma específicos, Sigma E ou Sigma K; os promotores dos genes cry3 são reconhecidos por RNA polimerase associada ao fator sigma vegetativo, Sigma A.
Toxinas Cry [005] Toxinas Cry têm atividades específicas contra espécies de insetos das ordens Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros, Himenópteros e contra nematódeos. Quando os insetos ingerem cristais, seus tratos digestivos alcalinos desnaturam os cristais, tornando-os solúveis e, portanto, passíveis de serem cortados com proteases encontradas no intestino do inseto, que liberam a toxina do cristal (Schnepf et al., 1998). A toxina Cry é, então, inserida na membrana das células do intestino do inseto, paralisando o trato digestivo e formando um poro. O inseto deixa de comer e morre de fome (Schnepf et al., 1998).
Biopesticidas à Base de Bt [006] Bt é utilizado de forma eficaz como biopesticida há mais de 50 anos (Bravo et al., 2011 e Sanahuja et al., 2011). No entanto, a eficiência desses biopesticidas à base de Bt é avaliada em apenas alguns dias na superfície foliar. De fato, a química da superfície foliar, proteases e luz solar contribuem para a degradação de proteínas Cry.
[007] Hoje, todos os biopesticidas à base de Bt usados no mundo consistem em uma mistura de esporos e cristais. Entretanto, as toxinas presentes nos cristais são rapidamente destruídas, pois são liberadas no meio externo ao final de um processo de esporulação. Além disso, a disseminação de esporos bacterianos pode
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3/18 ser prejudicial para seres humanos e para o meio ambiente.
[008] Permanece a necessidade de fornecer biopesticidas à base de Bt mais seguros, em que a estabilidade das toxinas Cry é melhorada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [009] A fim de resolver esses problemas, os inventores estudaram uma cepa de Bt, chamada LM1212, que apresenta a capacidade única de se diferenciar em produtores de cristais ou formadores de esporos. A análise transcricional sugeriu que o fenótipo de cristal parasporal resulta de um novo tipo de diferenciação celular associado a um novo modo de regulação de expressão de gene cry (Deng et al., 2015). Como especificado acima, todos os biopesticidas conhecidos até agora consistem em uma mistura de esporos e cristais. A caracterização da cepa LM1212 incomum, na qual o cristal não é produzido na célula-mãe de células esporulantes, mas apenas em uma subpopulação de células não esporulantes, ampliou a compreensão do inventor do fenótipo de cristal parasporal em Bt. Assim, os inventores identificaram de forma surpreendente e inesperada um gene único de sequência reguladora presente nesta LM1212 e denominado “regulador de células produtoras de cristal” (cpcR). Eles mostraram que a introdução desse gene cpcR em uma cepa de Bt típica permite reduzir drasticamente a taxa de esporulação.
[010] Os inventores caracterizaram esse gene regulador e sua sequência nucleotídica, que compreende a sequência SEQ ID NQ: 1.
[011] Dessa forma, esse regulador CpcR direciona a expressão dos promotores do gene cry em Bacillus thuringiensis LM1212.
[012] Os inventores também mostraram que o uso desse regulador permite a expressão de genes cry heterólogos, tais como o gene crylAb codificando uma toxina ativa de lepidópteros, e a produção de inclusões de cristais em células Bt não esporulantes.
[013] Além disso, a introdução do gene cpcR em uma cepa de Bt típica
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4/18 reduziu drasticamente sua taxa de esporulação, ao mesmo tempo em que manteve ou aumentou a expressão de genes cry. Os resultados obtidos pelos inventores indicam que esse sistema de expressão permite a produção de proteínas Cry inseticidas em um fundo genético Spo-. Dessa forma, a invenção fornece biopesticidas à base de Bt mais seguros, impedindo a disseminação de esporos bacterianos. Além disso, a produção e a estabilidade das toxinas Cry em células bacterianas dedicadas são melhoradas, uma vez que as toxinas são protegidas da degradação ambiental, tal como irradiação UV.
[014] Por conseguinte, a presente invenção refere-se ao uso do gene regulador cpcfí da sequência SEQ ID NQ: 1 para reduzir a esporulação de uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis.
[015] A sequência nucleotídica SEQ ID NQ: 1 é:
ATGAATCCTAATATACTTGTGATAAATGGTAATACGAAGAATCAAGAATT TATTCAAAATCTCCTGATTATAAAGAAATTCATGATTGATACGGTAAATGATGGTA TAGAAGGAATTATTCGCTTTCAAAAGAAAGTGTACGATCTAGTTATACTAGATGT TATGTCACCTAATTTAGATGGATTTAGTATATGTAAAATTATAAGATCACAATCTA AAGTGCCAATTATCATGTTATCTACAATAAAGGACGAAAGTATTGAGATTAAAGG ATTTCAATTTGGTATTGATGACTTTATTACTCTACCATGTTCAGTTGAGCTATTTT ATTATAGGATAGAAGCCATTCTACGAGGACGAAATTCAACTGATTCATTGTCATT AATACAGTTTCAAGAAATATCACTAAATCCTGATTCGTATATAGTGTATCTTAATG GGCAGAAGAAAAAGCTAACGACAAAAGAATTTGATATGCTACATATATTTTTAAG AAATCCAGGGAAAGTATTATCTAGAGAATTTTTGCTGAATCAAGTGTGGGGATAT GATTATTATGGAGATCCACGAGTCATAGATGCGTATATAAAAAAACTACGCAAAA AGTTAAGTATTCCGTATATAAAAACAATAACAGGCGTTGGTTATAAACTAGACAC ATAA [016] “Cepa recombinante” na presente invenção significa que um ou mais fragmentos de genes ou um ou mais genes inteiros são inseridos por manipulação
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5/18 genética, em uma cepa parental.
[017] “Reduzir a esporulação” na presente invenção significa que a taxa de esporulação da cepa recombinante de Bt da invenção é reduzida pelo menos 2 vezes, preferencialmente, pelo menos 5 vezes, mais preferencialmente, pelo menos 10 vezes, ainda mais preferencialmente, pelo menos 15 vezes em comparação com a taxa de esporulação da cepa de Bt parental.
[018] Para caracterizar o gene regulador cpcR, primeiramente, os inventores determinaram um fragmento de DNA de LM1212, responsável pela ativação de um promotor de um gene codificando uma proteína Cry na LM1212. Em seguida, eles reduziram esse fragmento de DNA até identificar o gene responsável por esse efeito. Após a identificação, os inventores validaram que cpcRé responsável por a) a ativação da expressão do gene cry na cepa LM1212 e b) a redução da taxa de esporulação. Finalmente, os inventores testaram o uso do cpcR em uma cepa recombinante de Bt e obtiveram uma redução da taxa de esporulação e um aumento da produção de Cry1 Ab. Esses resultados confirmam o interesse do uso do gene cpcR em uma cepa recombinante de Bt e o uso dessa cepa recombinante de Bt como novo biopesticida.
[019] O regulador cpcR direciona a expressão de vários promotores de genes que codificam proteínas Cry e Cyt, os referidos promotores tendo a sequência consenso SEQ ID NQ: 2.
[020] A sequência nucleotídica SEQ ID NQ: 2 é:
Xi TG AAX2AAAAX3X4X5X6CAX7X8AX9ATTTX10CX11TCX12X13X14X15X16TX17X1 8AX19ATGTX20X21TX22GX23TAX24AX25TX26X27X28X29AX30X31TX32X33, com:
Xi=A ou G; X2 =C ou T; Xs=A ou T; X4=A, T ou G; Xs=A, C ou T; Xe=A ou G; X7=C ou T; Xs=A ou C Χθ=Α, T ou G; Xio=A ou C; Xh= A ou C; Xi2=A, C ou T;Xi3=A, G ou T; Xi4=A ou C; Xis=A, G ou T; Xw=A ou G; Xi7=A ou T; Xis=A, C ou T; Xi9=C ou T; X2o=A ou C; X21=A, C ou G; X22=A ou T; X23= C ou T; X24=G ou T; X2õ=C ou T;
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X26=G ou T; X27=A ou G; X28=A ou T; X29=A, G ou T; X30=C, G ou T; Xai=A ou G; X32=A ou G;X33=C ou T.
[021] Preferencialmente, o promotor ativado por CpcR é selecionado do grupo que consiste em: P32 da sequência SEQ ID NQ: 3, P41 da sequência SEQ ID NQ: 4, P35 da sequência SEQ ID NQ: 5, P45 da sequência SEQ ID: 6.
[022] Mais preferencialmente, 0 promotor ativado por CpcR é P35.
[023] De acordo com a invenção, genes que codificam as proteínas ativadas por CpcR na cepa LM1212 são preferencialmente genes cry, mais preferencialmente semelhantes a cry32Va1, cry41Ca1, cry45Ba1, cry74Aa1, cry32Wa1 e cry35, ainda mais preferencialmente semelhantes a cry32Wa1 e cry35.
[024] De acordo com a invenção, genes que codificam proteínas, em particular, toxinas, produzidos pela cepa recombinante de Bacillus thuringiensis são preferencialmente genes cry ou genes cyt.
[025] Preferencialmente, os genes cry e cyt que codificam toxinas produzidas pela cepa recombinante da invenção sob 0 controle de CpcR são:
1) genes cry codificando toxinas ativas contra pragas de culturas, especificamente insetos lepidópteros e coleópteros. Esses genes cry pertencem, por exemplo, às classes cry1, cry2, cry3, cry8 ou cry9.
2) genes cry codificando toxinas ativas contra vetores de inseto de doenças humanas, especificamente insetos dípteros como mosquitos e simúlios. Esses genes cry pertencem, por exemplo, às classes cry4 e cry11.
3) genes cry codificando toxinas ativas contra nematódeos. Esses genes cry pertencem, por exemplo, às classes cry5, cry6, cry14 e cry21.
4) genes cyt codificando toxinas ativas contra vetores de inseto de doenças humanas, especificamente insetos dípteros, como mosquitos e simúlios. Esses genes cyt pertencem, por exemplo, às classes cyt1 e cyt2.
[026] Mais preferencialmente, os genes que codificam toxinas produzidos
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7/18 pela cepa recombinante da invenção sob o controle de CpcR são genes cry1, cry2, cry3, cry4, cry5, cry 6, cry8, cry9, cry11, cry14, cry21, cyt1 ou cyt2.
[027] O espectro de atividade das toxinas Cry e Cyt contra pragas de insetos é descrito em: Van Frankenhuizen, K., et al., 2009. O espectro de atividade das toxinas Cry contra nematódeos é descrito em: Wei etal., 2003.
[028] Mais preferencialmente, a toxina produzida pela cepa recombinante da invenção é Cry1 Ab, uma toxina ativa de lepidópteros, codificada pelo gene crylAb.
[029] Os inventores mostraram que a expressão do gene cpcR permite a expressão de genes cry heterólogos, tais como o gene crylAb, e a produção de inclusões de cristal em células de Bt não esporulantes.
[030] A presente invenção também se refere a uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, que é caracterizada pelo fato de que compreende:
a) pelo menos um gene codificando toxinas Cry e/ou Cyt,
b) pelo menos um promotor tendo a sequência SEQ ID NQ: 2, permitindo a expressão do referido pelo menos um gene codificando toxinas Cry e/ou Cyt, e,
c) um gene regulador cpcR da sequência SEQ ID NQ: 1, que direciona a expressão do referido pelo menos um promotor.
[031] A principal característica dessa cepa recombinante, na presente invenção, é sua taxa de esporulação reduzida em comparação com a cepa parental.
[032] De acordo com a invenção, essa bactéria pode ser usada viva ou morta. De fato, a viabilidade das bactérias não é necessária para assegurar a atividade inseticida ou nematicida dessa cepa recombinante de Bacillus thuringiensis. Uma vez que CpcR afeta negativamente a esporulação, o número de esporos viáveis será reduzido ou mesmo abolido.
[033] Preferencialmente, a cepa parental de Bacillus thuringiensis é Bacillus thuringiensis kurstaki HD73 (cepa tipo do serótipo 3a, 3b, 3c).
[034] Preferencialmente, o promotor presente na cepa recombinante de
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Bacillus thuringiensis é selecionado do grupo que consiste em: P32 da sequência SEQ ID NQ: 3, P41 da sequência SEQ ID NQ: 4, P35 da sequência SEQ ID NQ: 5, P45 da sequência SEQ ID: 6.
[035] Mais preferencialmente, 0 promotor presente na cepa recombinante de Bacillus thuringiensis é P35.
[036] De acordo com a invenção, 0 promotor pode ser clonado em um plasmídeo, que é diferente do plasmídeo que transporta 0 gene regulador cpcR, ou 0 promotor pode ser clonado no mesmo plasmídeo que 0 gene regulador cpcR.
[037] Mais preferencialmente, 0 promotor é clonado no mesmo plasmídeo que 0 gene regulador cpcR.
[038] De acordo com a invenção, os genes que codificam as toxinas na cepa recombinante de Bacillus thuringiensis são preferencialmente genes cry ou cyt, mais preferencialmente, genes cry1, cry2, cry3, cry4, cry5, cry6, cry8, cry9, cry11, cry 14, cry 21, cyt1 ou cyt2, mais preferencialmente, genes cry1, cry2, cry3, cry8 ou cry9.
[039] Preferencialmente, as toxinas produzidas pela cepa recombinante da invenção são toxinas Cry) e Cry2.
[040] Mais preferencialmente, a toxina produzida pela cepa recombinante da invenção é Cry) Ab, uma toxina ativa de lepidópteros, codificada pelo gene crylAb.
[041] A presente invenção também se refere ao uso da cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, conforme descrito acima, como biopesticida.
[042] “Biopesticida”, na presente invenção, refere-se a pesticidas derivados de materiais naturais, tais como bactérias, por exemplo, na presente invenção. Esse termo geral “biopesticida” inclui 0 termo “biocida”, que é mais usado em um contexto de vetores de controle, tais como vetores que transmitem patógenos responsáveis por doenças em mamíferos.
[043] Em uma modalidade particular, a cepa recombinante de Bacillus thuringiensis é usada para a proteção de culturas. O “biopesticida” que produz
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9/18 proteínas Cry reguladas por CpcR será usado para controle de pragas de culturas, especificamente, insetos lepidópteros, tais como aqueles pertencentes às famílias Tortricidae, Noctuidae e Pyralidae que danificam culturas como algodão, repolho, milho, soja, videira e quaisquer outras culturas extensas ou de jardim.
[044] Preferencialmente, as toxinas produzidas pela cepa recombinante da invenção para a proteção de culturas são: toxinas Cry1, Cry2, Cry3, Cry 8 e Cry9.
[045] Em outra modalidade particular, a cepa recombinante de Bacillus thuringiensis é usada para controle de vetores, especialmente vetores que transmitem patógenos responsáveis por doenças em mamíferos, preferencialmente doenças humanas, tais como vetores de inseto, em particular, mosquitos ou simúlios. Em tal modalidade particular, a cepa recombinante de Bacillus thuringiensis abrigará genes cry regulados por CpcR que codificam toxinas especificamente ativas contra insetos dípteros.
[046] Preferencialmente, as toxinas produzidas pela cepa recombinante da invenção no uso para controle de vetores são toxinas pertencentes, por exemplo, às classes Cyfí, Cry4 e Cryl 1.
[047] Em outra modalidade particular, a cepa recombinante de Bacillus thuringiensis é usada para controle de nematódeos, especialmente aqueles responsáveis por doenças em mamíferos, preferencialmente doenças humanas. Em tal modalidade particular, a cepa recombinante de Bacillus thuringiensis abrigará genes cry regulados por CpcR que codificam toxinas especificamente ativas contra nematódeos.
[048] Preferencialmente, as toxinas produzidas pela cepa recombinante da invenção no uso para controle de nematódeos são toxinas pertencentes, por exemplo, às classes Cry5, Cry6, Cry14 e Cry21.
[049] A presente invenção também se refere a um método para obtenção de uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, conforme descrito acima,
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10/18 compreendendo as etapas de introduzir na referida cepa ambos:
1. uma construção genética compreendendo pelo menos um gene codificando uma toxina sob o controle de um promotor tendo a sequência SEQ ID NQ: 2, e
2. um sistema de expressão compreendendo o regulador cpcRda sequência SEQ ID NQ: 1.
[050] As duas etapas deste método podem ser executadas na ordem definida acima ou na ordem inversa, mas também simultaneamente pela introdução de um constructo que transporta os três elementos citados.
[051] Preferencialmente, a construção genética como definida na etapa 1 do referido método e o sistema de expressão como definido na etapa 2 do referido método estão no mesmo plasmídeo. Em tal modalidade, a etapa 1 e a etapa 2 podem ser realizadas simultaneamente.
[052] Preferencialmente, a cepa parental de Bacillus thuringiensis é a Bacillus thuringiensis kurstaki HD73.
[053] Preferencialmente, o promotor tendo a sequência SEQ ID NQ: 2 é selecionado do grupo que consiste em: P32 da sequência SEQ ID NQ: 3, P41 da sequência SEQ ID NQ: 4, P35 da sequência SEQ ID NQ: 5, P45 da sequência SEQ ID: 6.
[054] Mais preferencialmente, 0 referido promotor é P35 da sequência SEQ ID NQ: 2.
[055] Preferencialmente, os genes que codificam uma toxina são genes cry1, cry2, cry3, cry 4, cryõ, cry6, cry8, cry9, cry11, cry14, cry21 ou cyt, mais preferencialmente, genes cry1, cry2, cry3, cry8 ou cry9.
[056] Mais preferencialmente, 0 gene que codifica uma toxina é gene crylAb.
[057] O promotor que direciona a transcrição do gene cpcR é qualquer promotor funcional em Bt. A escolha do promotor mais apropriado pode depender, em
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11/18 particular, do tipo de expressão (isto é, constitutiva ou indutível) que se deseja obter. Os promotores podem ser promotores constitutivos, ou seja, promotores que são ativos em células e sob a maioria das condições ambientais, ou promotores específicos de células que são ativos apenas ou principalmente em determinados tipos de células, e promotores indutíveis que são ativados por estímulos físicos ou químicos.
[058] A construção genética será feita em plasmídeos de Bacillus com base nos replicons pBC16, pHT315 ou pHT73 e transportando um gene cry a jusante de um promotor regulado por CpcR.
[059] O constructo genético pode ser introduzido em uma cepa de Bacillus thuringiensis por eletroporação (Lereclus et ai., 1989; Bone et ai. 1989; Koehler et ai. 1994; Mahillon et ai., 1999; Peng et ai. 2009), usando procedimento de recombinação como previamente descrito (Lereclus et ai., 1992), ou por conjugação heterogrâmica (Trieu-Cuot et ai., 1987).
[060] Além das características acima descritas, a invenção compreende ainda outras características que emergirão da descrição a seguir, que se refere a exemplos que ilustram a presente invenção, bem como às figuras anexas.
[061 ] A Figura 1 mostra a construção de uma cepa de Bacillus thuringiensis.
[062] A Figura 2 mostra a caracterização do fragmento de DNA de LM1212 que transporta o gene cpcR ativando a transcrição do promotor P35.
[063] A Figura 3 mostra a expressão de crylAb sob controle de CpcR e P35 em uma cepa kurstaki. A) Plasmídeos pHT16-18QP35’-cryMb e pHT-1c. B) Microscopia de contraste de fase da cepa kurstaki HD73 transformada com plasmídeos pHT16-18QP35’-cryMb e pHT-1c. As setas indicam algumas inclusões de cristal.
[064] A Figura 4 mostra a análise de uma toxina Cry1 Ab produzida em uma cepa kurstaki sob 0 controle de CpcR e P35. A) SDS-Page. M corresponde aos
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12/18 marcadores de peso molecular. 1.20 μΙ_ de extrato bruto de colônias da cepa kurstaki HD73 (pHT16-18, pHT304). 2. 20 μΙ_ de extrato bruto de colônias da cepa kurstaki HD73 (pHT16-18QP35’-cryMb, pHT304). 3. 20 μΙ_ de extrato bruto de colônias da cepa kurstaki HD73 (pHT16-18QP35’-cryMb, pHT-1c). Os extratos brutos foram preparados da mesma forma e o uso de 20 μΙ_ de extrato bruto significa que a mesma quantidade de cada preparação é carregada em SDS-Page. B) Western blotting de faixas 1,2 e 3 com antissoros contra Cry1 Ab.
[065] A Figura 5 mostra a análise transcricional da fusão de P35’lacZ. A. Detalhe dos constructos. O painel superior mostra o fragmento de DNA 5a que transporta o gene cpcR. As duas linhas abaixo da representação esquemática do locus cpcR indicam as regiões de DNA usadas para criar o fragmento 5a. O painel do meio destacado em cinza escuro mostra a organização do plasmídeo (pHT-5a-P35’Z) e o painel inferior destacado em cinza claro mostra a organização dos plasmídeos (pHT1618-5a) e (pHT-P35’Z). B. Ensaio de β-galactosidase de cepas HD (pHT-5aP35’Z) em losangos cinza escuro e HD (pHT1618-5a) (pHT-P35’Z) em quadrados cinza claro. O tempo indicado é relativo a tO que indica o início da transição entre a fase exponencial e estacionária.
Exemplo 1: construção de uma cepa de Bacillus thuringiensis para avaliar o regulador da expressão do promotor P35 [066] Os resultados anteriores obtidos pelos inventores sugeriram que, na cepa LM1212, um sistema de regulação limita a produção de toxinas à subpopulação de células não esporulantes. Dessa forma, para avaliar os genes de LM1212 responsáveis pela regulação do promotor P35, 0 promotor que direciona a expressão do gene cry, os inventores introduziram um sistema de relatório em uma cepa de Bacillus thuringiensis, como descrito a seguir.
1) Materiais e Métodos [067] A cepa de Bt kurstaki HD73 Cry é escolhida para clonar os genes de
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LM1212 responsáveis pela ativação do promotor P35 e pelo efeito negativo sobre a esporulação.
[068] O plasmídeo termossensível pRN5101-AmyE-HD73::tet é primeiramente construído seguindo 0 mesmo procedimento descrito em Verplaetse et al., 2015, exceto que 0 cassete de resistência a antibióticos confere resistência à tetraciclina em vez da espectinomicina e que as regiões de flanqueamento amyE usadas para recombinação homóloga foram amplificadas usando DNA genômico de Bt HD73 em vez de Bt 407. Uma fusão transcricional Pss-lacZ é então clonada entre os fragmentos amy superior e amy inferior clonados da cepa kurstaki. A fusão P35lacZ é então introduzida no locus amyE do cromossomo HD73 de kurstaki por recombinação homóloga (Figura 1).
2) Resultados [069] A cepa resultante é designada por HD73 Cry [amyE::P35-/acZ].
Exemplo 2: caracterização dos genes de LM1212 ativando a transcrição do promotor P35
i. Localização dos genes responsáveis pela expressão do promotor P35 no DNA da cepa LM1212
1) Materiais e Métodos [070] O fragmento de DNA ORF28-ORF32 do plasmídeo PLM248 da cepa LM1212 é clonado no plasmídeo pHT304 (Arantes, O. et al., 1991) e 0 plasmídeo resultante é designado por pHT-1a. O pHT-1 a é então introduzido na cepa de Bt HD73 Cry [amyE;;P35-lacZ\ e os clones recombinantes são isolados em placas de HCT (0,7% de hidrolisado de caseína, 0,5% de triptona, 0,68% de KH2 PO4, 0,012% de MgSO4_7H2 O, 0,00022% de MnSO4_4H2 O, 0,0014% de ZnSO4_7H2 O, 0,008% de citrato de amônio férrico, 0,018% de CaCI2_4H2 O, 0,3% de glicose, pH 7,2) (Lecadet et al., 1980; Verplaetse et al. 2016) contendo extrato de levedura (0,05%), glicose a 0,3% e X-Gal (100 pg/mL).
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2) Resultados [071] A cepa parental fornece colônias brancas. Em forte contraste, a cepa contendo o plasmídeo pHT-1 a fornece colônias azuis (Figura 2). Este resultado indica que os genes responsáveis pela expressão do promotor P35 estão localizados no fragmento de DNA 1a correspondente a LM1212 ORF28 a 32.
ii. Identificação dos genes envolvidos na atividade transcricional
1) Materiais e Métodos [072] A região de DNA ORF28 a 32 é subclonada no plasmídeo pHT304 e os plasmídeos resultantes são transformados na cepa de Bt HD73 Cry [amyE::P35lacZ\ (Figura 2).
2) Resultados [073] Parece que ORF28 codificando um regulador transcricional é suficiente para ativar a transcrição dirigida por P35. No entanto, essa atividade é obtida se um fragmento curto de DNA localizado a montante de ORF29 for fundido a montante de ORF28 (Fragmento 1e, Figura 2). ORF28 codifica um regulador transcricional pertencente à família de reguladores de resposta, sugerindo que ele deve atuar como um sistema de dois componentes em associação com uma histidina quinase. Tal quinase pode ser codificada por ORF32.
[074] No entanto, os resultados mostram que ORF28 sozinho é capaz de ativar 0 promotor P35. Análise in silico desses genes (ORF28 e 32) indica que 0 ORF28 é único e não encontrado nas sequências disponíveis das bactérias do grupo B. cereus (cerca de 100 genomas).
[075] Em contraste, 0 ORF32 é altamente conservado entre todas as bactérias do grupo B. cereus, incluindo LM1212.
[076] Dessa forma, ORF28 pode funcionar como um regulador de resposta ativado pela histidina quinase naturalmente presente na cepa Kurstaki HD73.
iii. Efeito do plasmídeo pHT-1 c na esporulação das bactérias
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1) Materiais e Métodos [077] pHT-1c, que corresponde ao plasmídeo pHT304 que transporta o gene ORF28 e um região promotora, é introduzido na cepa de Bt HD73 Cry [amyE::P35-lacZ\.
2) Resultados [078] A introdução de pHT-1c na cepa de Bt HD73 Cry [amyE::P35-lacZ\ afeta de forma negativa a esporulação por um fator de 10 vezes (Tabela 1).
| Cepas | Esporos resistentes ao calor (CFU/ml)a |
| HD73 amyE::Pcry35-lacZ (pHT304) | 5,25E+08 (±5,25E+07) |
| HD73 amyE::Pcry35-lacZ (pHT304-1c) | 4,99E+07 (± 9,42E+06) |
[079] Tabela 1. Efeito do fragmento de DNA 1 c que transporta o gene cpcR na esporulação da cepa HD73 de B. thuringiensis. Os resultados são a média de dois experimentos independentes. aAs bactérias foram cultivadas em meio HCT líquido (contendo Extrato de Levedura a 0,05% e Glicose a 0,3%) a 30QC. 48 horas após a inoculação, as alíquotas foram aquecidas a 80QC durante 12 minutos. As células foram plaqueadas e CFUs correspondentes a esporos resistentes ao calor foram então contados.
iv. Conclusão [080] Esses dados indicam que o gene correspondente a ORF28 codifica o regulador (designado por CpcR) por duas funções: i) a ativação da expressão de gene cry na cepa LM1212, e ii) a redução da taxa de esporulação.
[081] Os resultados também sugerem que ORF28 funciona como um sistema de dois componentes associado a uma quinase existente em todas as cepas de Bt. Este gene é responsável pelo fenótipo específico da cepa LM1212, que é para se diferenciar em produtores de cristais ou formadores de esporos.
Exemplo 3: uso do regulador CpcR para produzir c/y1 Ab em células de bt não
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16/18 esDorulantes [082] Com o intuito de validar o uso de CpcR em uma cepa de Bt para reduzir sua esporulação, mantendo a produção de toxinas, os inventores produziram cepa recombinantes de Bt e analisaram a taxa de esporulação dessa cepa recombinante e a produção da toxina Cryl Ab.
1) Materiais e Métodos
a) O gene crylAb, um gene cry dependente de esporulação típico, é amplificado por PCR da cepa kurstaki HD1 (o biopesticida kurstaki HD1 Dipel®) e clonado a jusante do promotor P35 no plasmídeo pHT16-18 (Lereclus etal., 1992). O plasmídeo resultante, ρΗΤ16-18Ω P35’-cry1Ab (isto é, 0 plasmídeo pHT16-18 que transporta 0 gene crylAb da cepa kurstaki HSo Dipel® sob 0 controle do promotor P35) foi transformado na cepa de Bt HD73 Cry. A cepa resultante foi, então, transformada com 0 plasmídeo pHT-1c que transporta 0 gene cpcR. As bactérias foram plaqueadas em placas de HCT ágar durante 48 horas a 30QC e examinadas em microscopia de contraste de fase (Figura 3).
b) As proteínas produzidas por essas cepas recombinantes são analisadas por western blotting com antissoros contra a toxina CrylAb (Figura 4).
2) Resultados
a) Os resultados mostram uma produção de inclusão de cristal típica em células não esporulantes da cepa kurstakique contém os plasmídeos pHT 16-18ΩΡ35crylAb e pHT-1c. Além disso, a taxa de esporulação da cepa recombinante que transporta pHT16-18DP35-cryMb e pHT-1c é significativamente menor do que a da cepa de tipo selvagem.
b) A produção de CrylAb é fortemente aumentada na cepa kurstaki contendo 0 gene cpcR e a fusão P35-cry1Ab (Painéis A e B, Faixas 3).
[083] A banda fraca de CrylAb observada nas faixas 2 resulta de uma expressão de crylAb independente de CpcR.
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17/18 [084] Esses resultados mostram que a invenção fornece uma nova gama de biopesticidas pelo modo de produção de toxinas Cry inseticidas em cepas de Bt não esporulantes.
Exemplo 4: Transcrição do promotor P35 é superior ao clonado no mesmo plasmídeo que cpcR
1) Materiais e Métodos [085] O fragmento de DNA designado 5a e compreendido por ORF28, a região intergênica entre ORF28 e ORF29 e a região intergênica entre ORF29 e ORF30, foi clonado a montante de uma fusão transcricional entre P35 e 0 gene repórter lacZ no vetor pHT304.18 (que tem 0 gene mesmo esqueleto que 0 vetor pHT304, mas 0 sítio de clonagem é na orientação oposta ao do vetor pHT304), gerando 0 plasmídeo pHT-5a-P35’Z, ou sozinho no vetor pHT1618, gerando 0 plasmídeo pHT1618-5a. Este último foi transformado na cepa de Bt HD73 Cry juntamente com pHT-P35’Z, fornecendo a cepa HD (pHT1618-5a) (pHT-P35’Z). O plasmídeo pHT-5a-P35’Z também foi transformado na cepa de Bt HD73 Cry, gerando a cepa HD (pHT-5aP35’Z). As células foram cultivadas em HCT líquido contendo 0,05% de extrato de levedura e 0,3% de glicose. As amostras foram coletadas e analisadas quanto à atividade da β-galactosidase (Perchat etal., 2011).
2) Resultados [086] A Figura 5 mostra que, embora ο P35 esteja ativo em ambas as cepas HD (pHT1618-5a) (pHT-P35’Z) (quadrados cinza claro) e HD (pHT-5a-P35’Z) (losangos cinza escuro), sua atividade é maior na cepa HD (pHT-5a-P35’Z), em particular, é 14 vezes maior após 4 horas (1200 unidades versus 17.000 unidades, respectivamente).
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Claims (16)
- REIVINDICAÇÕES1. Uso do gene regulador cpcR da sequência SEQ ID NQ: 1, CARACTERIZADO pelo fato de ser para redução da esporulação de uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis.
- 2. Uso do gene cpcR, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido regulador cpcR direciona a expressão de promotores de genes que codificam as proteínas Cry e Cyt, os referidos promotores tendo a sequência SEQ ID NQ: 2 conforme abaixo:Xi TG AAX2AAAAX3X4X5X6CAX7X8AX9ATTTX10CX11TCX12X13X14X15X16TX17X1 8AX19ATGTX20X21TX22GX23TAX24AX25TX26X27X28X29AX30X31TX32X33, com: Xi=A ou G; X2 =C ou T; X3=A ou T; X4=A, T ou G; Xs=A, C ou T; Xe=A ou G; X7=C ou T; Xs=A ou C Χθ=Α, T ou G; Xw=A ou C; Xn= A ou C; Xi2=A, C ou T;Xi3=A, G ou T; Xu=A ou C; Xiõ=A, G ou T; Xi6=A ou G; Xv=A ou T; Xis=A, C ou T; Xi9=C ou T; X2o=A ou C; X21=A, C ou G; X22=A ou T; X23= C ou T; X24=G ou T; X25=C ou T; X26=G ou T; X27=A ou G; X28=A ou T; X29=A, G ou T; X3o=C, G ou T; Xsi=A ou G; Xs2=A ou G; X33=C ou T.
- 3. Uso do gene cpcR, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 promotor é selecionado do grupo que consiste em: P32 da sequência SEQ ID NQ: 3, P41 da sequência SEQ ID NQ: 4, P35 da sequência SEQ ID NQ: 5, P45 da sequência SEQ ID NQ: 6.
- 4. Uso do gene cpcR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que os genes que codificam toxinas são genes cry ou genes cyt.
- 5. Uso do gene cpcR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a cepa de Bacillus compreende genes cry1, cry2, cry3, cry4, cry5, cry6, cry8, cry9, cry11, cry14, cry21, cyt1 ou cyt2.
- 6. Cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende:Petição 870190060932, de 28/06/2019, pág. 29/382/3a) pelo menos um gene codificando toxinas Cry e/ou Cyt,b) pelo menos um promotor tendo a sequência SEQ ID NQ: 2, permitindo a expressão do referido pelo menos um gene codificando toxinas Cry e/ou Cyt, ec) um gene regulador cpcR da sequência SEQ ID NQ: 1, que direciona a expressão do referido pelo menos um promotor.
- 7. Cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor é selecionado do grupo que consiste em: P32 da sequência SEQ ID NQ: 3, P41 da sequência SEQ ID NQ: 4, P35 da sequência SEQ ID NQ: 5, P45 da sequência SEQ ID NQ: 6.
- 8. Cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que 0 promotor é clonado no mesmo plasmídeo que 0 gene regulador cpcR.
- 9. Cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que os genes que codificam toxinas são genes cry ou genes cyt.
- 10. Cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a cepa de Bacillus compreende genes cry1, cry2, cry3, cry4, cryõ, cry6, cry8, cry9, cry11, cry14, cry21, cyt1 ou cyt2.
- 11. Uso de uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de ser como biopesticida.
- 12. Uso da cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a proteção de culturas.
- 13. Uso da cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de ser para controle de vetores,Petição 870190060932, de 28/06/2019, pág. 30/383/3 especialmente vetores que transmitem patógenos responsáveis por doenças em mamíferos, tais como vetores de inseto, em particular, mosquitos ou simúlios.
- 14. Uso da cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de ser para controle de nematódeos, especialmente aqueles responsáveis por doenças em mamíferos.
- 15. Método para obtenção de uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de introduzir na referida cepa ambos:1. uma construção genética compreendendo pelo menos um gene codificando uma toxina sob o controle de um promotor tendo a sequência SEQ ID NQ: 2, e2. um sistema de expressão compreendendo o regulador cpcR da sequência SEQ ID NQ: 1.
- 16. Método para obtenção de uma cepa recombinante de Bacillus thuringiensis, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a construção genética como definida na etapa 1 da reivindicação 15 e o sistema de expressão como definido na etapa 2 da reivindicação 15 estão no mesmo plasmídeo.
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|---|---|---|---|
| B350 | Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette] | ||
| B06W | Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette] |