BR112019013208B1

BR112019013208B1 - COMPOUND, SWEETENER, FOOD OR BEVERAGE COMPOSITION, METHOD OF PRODUCING THE COMPOUND, USE OF THE COMPOUND, AND, FLAVOR CONTROL AGENT

Info

Publication number: BR112019013208B1
Application number: BR112019013208-2A
Authority: BR
Inventors: Kazunari Iwaki; Katsuro Miyagawa; Eiichiro Ono; Tadayoshi HIRAI; Misa Ochiai; Koji Nagao; Soichiro URAI; Takehiro Watanabe; Kohki FUJIKAWA
Original assignee: Suntory Holdings Limited
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2023-06-27

Abstract

O propósito da presente invenção é determinar a estrutura de um glicosídeo de esteviol inovador que é detectado em cultivares contendo uma abundância de Reb.C (também denominado dulcosídeo B) e que afeta a qualidade de gosto em uma pequena quantidade, e identificar a qualidade das propriedades de gosto. De acordo com a presente invenção, um composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, sal, ou hidrato dos mesmos é provido.The purpose of the present invention is to determine the structure of an innovative steviol glycoside that is detected in cultivars containing an abundance of Reb.C (also called dulcoside B) and that affects the taste quality in a small amount, and to identify the quality of the taste properties. According to the present invention, a compound represented by Formula (1), or a derivative, salt, or hydrate thereof is provided.

Description

TECHNICAL FIELD

[001] A presente invenção se refere a um glicosídeo de esteviol inovador, um método para produzir o mesmo e uma composição de adoçante contendo o mesmo. Além do mais, a presente invenção também se refere a um alimento ou bebida, uma planta, um extrato da mesma e um agente de controle de sabor contendo o glicosídeo de esteviol inovador.[001] The present invention relates to an innovative steviol glycoside, a method for producing the same and a sweetener composition containing the same. Furthermore, the present invention also relates to a food or beverage, a plant, an extract thereof and a taste control agent containing the innovative steviol glycoside.

FUNDAMENTALS OF THE TECHNIQUE

[002] Folhas de Stevia rebaudiana contêm um metabólito secundário chamado Esteviol que é um tipo de diterpenoides, onde glicosídeo de esteviol provê doçura que é quase 300 vezes a doçura do açúcar e é, desta forma, utilizado como um adoçante sem calorias na indústria alimentícia. A demanda por adoçantes sem calorias está crescendo dia a dia, uma vez que a obesidade tem se tornado um problema social sério em todo mundo e também para a promoção da saúde e redução das despesas médicas. Atualmente, aspartame e acessulfame de potássio, que são derivados de aminoácido artificialmente sintetizado, são utilizados como adoçantes artificiais, mas espera-se que os adoçantes sem calorias naturais, como os glicosídeos de esteviol, sejam mais seguros e mais prováveis de ganhar aceitação do público.[002] Stevia rebaudiana leaves contain a secondary metabolite called Steviol which is a type of diterpenoid, where steviol glycoside provides sweetness that is nearly 300 times the sweetness of sugar and is therefore used as a zero-calorie sweetener in the food industry . The demand for zero-calorie sweeteners is growing day by day, as obesity has become a serious social problem all over the world and also for health promotion and reduction of medical expenses. Currently, aspartame and acesulfame potassium, which are artificially synthesized amino acid derivatives, are used as artificial sweeteners, but natural calorie-free sweeteners such as steviol glycosides are expected to be safer and more likely to gain public acceptance. .

[003] Os glicosídeos de esteviol principais de estévia são finalmente glicosilados a um glicosídeo chamado rebaudiosídeo A (Reb.A) que tem quatro frações de açúcar (Figura 1). Esteviosídeo, a saber, um glicosídeo de esteviol triglicosilado e um precursor de Reb.A, é o glicosídeo mais abundante. Estes dois glicosídeos são as principais substâncias responsáveis pela doçura da estévia. Esteviosídeo é responsável pelo maior teor em folhas de estévia e é conhecido por prover doçura que é cerca de 250 a 300 vezes a doçura do açúcar. Reb.A é um glicosídeo tetraglicosilado de esteviol que tem forte doçura (350 a 450 vezes o açúcar) com boa qualidade de sabor. Eles chamaram a atenção como adoçantes sem calorias. Além deles, é conhecida a existência de glicosídeos que são considerados intermediários de reação e análogos com diferentes tipos de frações de açúcar. Por exemplo, embora todas as quatro frações de açúcar de glicosídeo de Reb.A sejam glicose, rebaudiosídeo C (Reb.C) é conhecido por ter ramnose em vez de glicose ligada ao C-2 da glicose em C-13, e rebaudiosídeo F (Reb.F) é conhecido por ter xilose ligada na mesma posição.[003] The main steviol glycosides of stevia are finally glycosylated to a glycoside called rebaudioside A (Reb.A) which has four sugar moieties (Figure 1). Stevioside, namely a triglycosylated steviol glycoside and a precursor of Reb.A, is the most abundant glycoside. These two glycosides are the main substances responsible for the sweetness of stevia. Stevioside is responsible for the highest content in stevia leaves and is known to provide sweetness that is about 250 to 300 times the sweetness of sugar. Reb.A is a tetraglycosylated steviol glycoside that has strong sweetness (350 to 450 times the sugar) with good flavor quality. They gained attention as zero-calorie sweeteners. In addition to them, the existence of glycosides is known, which are considered reaction intermediates and analogues with different types of sugar fractions. For example, although all four glycoside sugar moieties of Reb.A are glucose, rebaudioside C (Reb.C) is known to have rhamnose instead of glucose attached to C-2 of glucose at C-13, and rebaudioside F (Reb.F) is known to have xylose attached at the same position.

[004] Até hoje, foram feitas tentativas de obter uma planta de estévia com um maior teor de Reb.A que as plantas de estévia tipo selvagem por melhoramento genético ou semelhantes, uma vez que a qualidade do sabor de Reb.A, em que todas as quatro frações de açúcar de glicosídeo são glicose, é boa (por exemplo, Documento de patente 1).[004] To date, attempts have been made to obtain a stevia plant with a higher Reb.A content than wild-type stevia plants by genetic breeding or the like, since the taste quality of Reb.A, in which all four glycoside sugar moieties are glucose, it's good (eg, Patent Document 1).

PRIOR ART DOCUMENT patent document

[005] Documento de patente 1: Patente japonesa No. 3436317[005] Patent Document 1: Japanese Patent No. 3436317

SUMMARY OF THE INVENTION Problem to be solved by the invention

[006] No entanto, alguns dos cultivares de estévia resultantes de melhoramento genético podem conter uma quantidade diminuta de um glicosídeo de esteviol cuja estrutura não é ainda identificada, em que a presença de tal glicosídeo de esteviol presente em quantidade diminuta pode potencialmente estar contribuindo com o sabor característico do extrato de estévia. Entretanto, embora pesquisas tenham sido feitas até então em glicosídeos de esteviol obtidos afixando adicionalmente glicose a Reb.A e aos cultivares contendo os mesmos, poucas pesquisas foram feitas neste ponto em um cultivar contendo uma quantidade abundante de um glicosídeo de esteviol tendo ramnose tipo Reb.C e em um glicosídeo de esteviol como esse.[006] However, some of the stevia cultivars resulting from genetic improvement may contain a minute amount of a steviol glycoside whose structure is not yet identified, in which the presence of such steviol glycoside present in a minute amount may potentially be contributing to the characteristic taste of stevia extract. However, although research has so far been done on steviol glycosides obtained by additionally affixing glucose to Reb.A and cultivars containing the same, little research has been done at this point on a cultivar containing an abundant amount of a steviol glycoside having Reb-type rhamnose .C and a steviol glycoside like that.

[007] Dessa maneira, o objetivo da presente invenção é determinar a estrutura de um glicosídeo de esteviol inovador presente em quantidade diminuta que afeta a qualidade do gosto, e para identificar as características de sua qualidade do gosto. Além do mais, objetivos adicionais da presente invenção são prover um glicosídeo de esteviol inovador, um método para produzir o mesmo, e uma composição de adoçante contendo o mesmo.[007] Thus, the object of the present invention is to determine the structure of an innovative steviol glycoside present in minute amounts that affect the taste quality, and to identify the characteristics of its taste quality. Furthermore, further objects of the present invention are to provide an innovative steviol glycoside, a method for producing the same, and a sweetener composition containing the same.

Ways to Solve the Problem

[008] Os presentes inventores fizeram investigação extensiva direta par resolver o problema supradescrito, e em decorrência do que sucedeu em determinação da estrutura do glicosídeo de esteviol inovador presente em quantidade diminuta que afeta a qualidade do gosto. A presente invenção foi feita com base nas observações supradescritas.[008] The present inventors have made direct extensive investigation to solve the above-described problem, and as a result of what happened in determining the structure of the innovative steviol glycoside present in a minute amount that affects the quality of taste. The present invention was made based on the observations described above.

EFFECT OF THE INVENTION

[009] A presente invenção pode prover um glicosídeo de esteviol inovador presente em quantidade diminuta que afeta a qualidade do gosto. Além do mais, a presente invenção pode também prover um método para produzir o glicosídeo de esteviol inovador, e uma composição de adoçante, um alimento ou bebida, uma planta, um extrato da mesma e um agente de controle de sabor contendo o glicosídeo de esteviol inovador.[009] The present invention can provide an innovative steviol glycoside present in a minute amount that affects the quality of taste. Furthermore, the present invention can also provide a method for producing the innovative steviol glycoside, and a sweetener composition, a food or beverage, a plant, an extract thereof and a taste control agent containing the steviol glycoside. innovative.

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0010] A Figura 1 ilustra um diagrama mostrando estruturas e nomes de glicosídeos de esteviol.[0010] Figure 1 illustrates a diagram showing structures and names of steviol glycosides.

[0011] A Figura 2 ilustra um diagrama mostrando um cromatograma de íons selecionado da Amostra 1 a m/z de 1273,5.[0011] Figure 2 illustrates a diagram showing a selected ion chromatogram of Sample 1 at m/z 1273.5.

[0012] A Figura 3 ilustra diagramas mostrando espectros de massa fragmentados de MS/MS e MS3 de rebaudiosídeo N e do composto representado pela Fórmula (1).[0012] Figure 3 illustrates diagrams showing fragmented MS/MS and MS3 mass spectra of rebaudioside N and the compound represented by Formula (1).

[0013] A Figura 4 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro 1H- NMR do Composto 11 (800MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um espectro RMN 13C do composto 11 (200MHz, Pyr-d5).[0013] Figure 4 illustrates (a) a diagram showing a 1H-NMR spectrum of Compound 11 (800MHz, Pyr-d5); and (b) a diagram showing a 13C NMR spectrum of compound 11 (200MHz, Pyr-d5).

[0014] A Figura 5 ilustra (a) um diagrama mostrando um espectro COSY 1H-1H do Composto 11 (800MHz, Pyr-d5); e (b) um diagrama mostrando um espectro HSQC do Composto 11 (800MHz, Pyr-d5).[0014] Figure 5 illustrates (a) a diagram showing a COZY 1H-1H spectrum of Compound 11 (800MHz, Pyr-d5); and (b) a diagram showing an HSQC spectrum of Compound 11 (800MHz, Pyr-d5).

[0015] A Figura 6 ilustra diagramas mostrando um procedimento para identificar um glicosídeo de esteviol inovador contido em um extrato de uma planta.[0015] Figure 6 illustrates diagrams showing a procedure for identifying a breakthrough steviol glycoside contained in a plant extract.

[0016] A Figura 7 ilustra um diagrama mostrando um cromatograma de íons selecionado de uma amostra obtida por biossíntese a m/z de 1273,5.[0016] Figure 7 illustrates a diagram showing an ion chromatogram selected from a sample obtained by biosynthesis at m/z of 1273.5.

[0017] A Figura 8 ilustra diagramas mostrando resultados de avaliações sensoriais para comparação entre o glicosídeo de esteviol inovador e rebaudiosídeo A.[0017] Figure 8 illustrates diagrams showing results of sensory evaluations for comparison between the innovative steviol glycoside and rebaudioside A.

[0018] A Figura 9 ilustra gráficos mostrando resultados de avaliação de um efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para melhorar o sabor remanescente prolongado de Reb.A.[0018] Figure 9 illustrates graphs showing evaluation results of an effect of the taste control agent of the present invention to improve the prolonged aftertaste of Reb.A.

[0019] A Figura 10 ilustra gráficos mostrando resultados de avaliação de um efeito de um agente de controle de sabor da presente invenção para melhorar o sabor remanescente prolongado de Reb.D.[0019] Figure 10 illustrates graphs showing evaluation results of an effect of a taste control agent of the present invention to improve the prolonged aftertaste of Reb.D.

[0020] A Figura 11 ilustra gráficos mostrando resultados de avaliação de um efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para intensificar a doçura de açúcar (sacarose).[0020] Figure 11 illustrates graphs showing evaluation results of an effect of the taste control agent of the present invention to enhance the sweetness of sugar (sucrose).

MODES FOR CARRYING OUT THE INVENTION

[0021] Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhes. A modalidade a seguir é provida para ilustrar a presente invenção e não com a intenção de limitar a presente invenção apenas a essa modalidade. A presente invenção pode ser realizada em vários modos sem fugir do escopo da mesma. Todos os documentos, relatórios descritivos, relatórios descritivos de patente e outros documentos de patente citados aqui são incorporados aqui pela referência.[0021] Next, the present invention will be described in detail. The following embodiment is provided to illustrate the present invention and is not intended to limit the present invention to that embodiment only. The present invention can be carried out in various ways without departing from the scope thereof. All documents, disclosures, patent disclosures and other patent documents cited herein are incorporated herein by reference.

[0022] Os termos “rebaudiosídeo” e “Reb.” como usado aqui têm o mesmo significado e ambos se referem a “rebaudiosídeo”. Similarmente, os termos “dulcosídeo” e “dulcosídeo” como usado aqui têm o mesmo significado e amos se referem a “dulcosídeo”.[0022] The terms “rebaudioside” and “Reb.” as used herein have the same meaning and both refer to “rebaudioside”. Similarly, the terms "dulcoside" and "dulcoside" as used herein have the same meaning and both refer to "dulcoside".

1. Innovative Steviol Glycoside

[0023] Pela primeira vez, os presentes inventores identificaram a estrutura de uma quantidade diminuta de um glicosídeo de esteviol inovador que afeta a qualidade do gosto. O glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção (em seguida, também referido como o “glicosídeo da presente invenção”) é um composto representado pela Fórmula (1): ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.[0023] For the first time, the present inventors have identified the structure of a minute amount of a breakthrough steviol glycoside that affects taste quality. The innovative steviol glycoside of the present invention (hereinafter also referred to as the "glycoside of the present invention") is a compound represented by Formula (1): or a derivative, salt or hydrate thereof.

[0024] Como representado anteriormente, o glicosídeo da presente invenção tem uma cadeia de açúcar contendo três frações de glicose em C-19 de esteviol e uma cadeia de açúcar contendo duas frações de glicose e uma fração de ramnose em C-13.[0024] As depicted above, the glycoside of the present invention has a sugar chain containing three glucose fractions at C-19 of steviol and a sugar chain containing two glucose fractions and one rhamnose fraction at C-13.

[0025] O glicosídeo da presente invenção pode não ser apenas o composto representado pela Fórmula (1), mas pode também ser um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo. O termo “derivado” como usado aqui se refere a um composto resultante de uma mudança estrutural de uma fração secundária do composto, por exemplo, um composto no qual alguns dos grupos hidroxila são substituídos com outros substituintes. Portanto, derivados do composto representado pela Fórmula (1) incluem compostos nos quais alguns dos grupos hidroxila contidos no composto foram substituídos com um substituinte selecionado de hidrogênio, um halogênio, um grupo alquila, um grupo alquenila, um grupo alquinila, um grupo arila, um grupo amino, um grupo ciano ou similares. Como usado aqui, um “sal do composto representado pela Fórmula (1)” se refere a um sal fisiologicamente aceitável, por exemplo, um sal de sódio, do composto representado pela Fórmula (1). Além do mais, um “hidrato do composto representado pela Fórmula (1)” como usado aqui se refere a um composto resultante de adição de uma molécula de água ao composto representado pela Fórmula (1).[0025] The glycoside of the present invention may not only be the compound represented by Formula (1), but may also be a derivative, a salt or a hydrate thereof. The term "derivative" as used herein refers to a compound resulting from a structural change of a minor fraction of the compound, for example, a compound in which some of the hydroxyl groups are replaced with other substituents. Therefore, derivatives of the compound represented by Formula (1) include compounds in which some of the hydroxyl groups contained in the compound have been replaced with a substituent selected from hydrogen, a halogen, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, an amino group, a cyano group or the like. As used herein, a "salt of the compound represented by Formula (1)" refers to a physiologically acceptable salt, for example a sodium salt, of the compound represented by Formula (1). Furthermore, a "hydrate of the compound represented by Formula (1)" as used herein refers to a compound resulting from adding a molecule of water to the compound represented by Formula (1).

[0026] Embora o glicosídeo da presente invenção não seja particularmente limitado, ele pode ser um produto derivado de planta, um produto quimicamente sintetizado ou um produto biossintético. Por exemplo, ele pode ser isolado e purificado de uma planta com Reb.C abundante, ou ele pode ser obtido por síntese ou biossíntese química. Detalhes de um método para produzir um glicosídeo da presente invenção serão descritos posteriormente aqui.[0026] Although the glycoside of the present invention is not particularly limited, it may be a plant-derived product, a chemically synthesized product or a biosynthetic product. For example, it can be isolated and purified from a plant with abundant Reb.C, or it can be obtained by chemical synthesis or biosynthesis. Details of a method for producing a glycoside of the present invention will be described later here.

[0027] O glicosídeo da presente invenção é mais doce que açúcar (sacarose), tem qualidade do gosto de bom sabor remanescente de doçura prolongado, e pode afetar a qualidade do gosto de alimentos/bebidas em uma pequena quantidade. Assim, o glicosídeo da presente invenção pode ser usado como um adoçante inovador.[0027] The glycoside of the present invention is sweeter than sugar (sucrose), has a taste quality of good taste reminiscent of prolonged sweetness, and can affect the taste quality of food/beverages in a small amount. Thus, the glycoside of the present invention can be used as an innovative sweetener.

[0028] Entretanto, em um outro aspecto da presente invenção, o glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção é um composto representado pela Fórmula (a): ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.[0028] However, in another aspect of the present invention, the innovative steviol glycoside of the present invention is a compound represented by Formula (a): or a derivative, salt or hydrate thereof.

2. Innovative steviol glycoside-containing sweetener composition

[0029] Em um aspecto da presente invenção, é provida uma composição de adoçante contendo o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo (em seguida, também referida como a “composição de adoçante da presente invenção”). A composição de adoçante da presente invenção não é particularmente limitada, desde que ela contenha o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, e ela pode ser uma composição contendo um extrato contendo o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo.[0029] In one aspect of the present invention, there is provided a sweetener composition containing the compound represented by Formula (1), or a derivative, a salt or a hydrate thereof (hereinafter, also referred to as the "sweetener composition of the present invention”). The sweetener composition of the present invention is not particularly limited, as long as it contains the compound represented by Formula (1), or a derivative, a salt or a hydrate thereof, and it can be a composition containing an extract containing the represented compound. by Formula (1), or a derivative, salt or hydrate thereof.

[0030] A quantidade do glicosídeo da presente invenção contida na composição de adoçante da presente invenção não é particularmente limitada.[0030] The amount of the glycoside of the present invention contained in the sweetener composition of the present invention is not particularly limited.

[0031] Alternativamente, a composição de adoçante da presente invenção é preferivelmente uma composição contendo o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que a quantidade em um estévia ou extrato de estévia tipo selvagem em pelo menos 0,01%. Como mencionado anteriormente, o glicosídeo da presente invenção foi detectado pela primeira vez em um cultivar contendo Reb.C abundante, e ele não está contido em uma estévia ou um extrato tipo selvagem da mesma absolutamente ou, se estiver, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menos.[0031] Alternatively, the sweetener composition of the present invention is preferably a composition containing the glycoside of the present invention in an amount greater than the amount in a stevia or wild-type stevia extract by at least 0.01%. As mentioned earlier, the glycoside of the present invention was detected for the first time in a cultivar containing abundant Reb.C, and it is not contained in a stevia or a wild-type extract thereof at all or, if it is, contained in a limit amount detection or less.

[0032] A composição de adoçante da presente invenção pode conter adicionalmente outros glicosídeos de esteviol. Por exemplo, a composição de adoçante da presente invenção pode conter, além do glicosídeo da presente invenção, um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.[0032] The sweetener composition of the present invention may additionally contain other steviol glycosides. For example, the sweetener composition of the present invention may contain, in addition to the glycoside of the present invention, one or more types of steviol glycosides selected from the group consisting of rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, rebaudioside I, rebaudioside J, rebaudioside K, rebaudioside N, rebaudioside M, rebaudioside O, rebaudioside Q, rebaudioside R, dulcoside A, rubusoside, steviol, steviol monoside, steviol bioside and stevioside.

[0033] Em um caso onde outro glicosídeo de esteviol está contido, a razão da composição do glicosídeo da presente invenção e outro glicosídeo de esteviol é preferivelmente 0,01:9,99-6:4 em uma razão em massa.[0033] In a case where another steviol glycoside is contained, the composition ratio of the glycoside of the present invention and another steviol glycoside is preferably 0.01:9.99-6:4 in a mass ratio.

[0034] A composição de adoçante da presente invenção pode conter adicionalmente um adoçante geral. Exemplos de um adoçante geral como esse incluem adoçantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutose- glicose, glicose, maltose, sacarose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorii), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii, e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sucralose, neotame, aspartame e sacarina. Dentre eles, adoçantes naturais são preferivelmente usados a partir do aspecto de conferir gosto puro, facilidade de beber, sabor natural e gosto moderadamente rico, em que frutose, glicose, maltose, sacarose e açúcar são em particular preferivelmente usados. Tanto um único tipo quanto uma pluralidade de tipos desses ingredientes de doçura pode ser usado.[0034] The sweetener composition of the present invention may additionally contain a general sweetener. Examples of such a general sweetener include natural sweeteners such as fructose, sugar, fructose-glucose syrup, glucose, maltose, sucrose, high fructose syrup, sugar alcohol, oligosaccharide, honey, pressed sugar cane juice brown sugar), starch syrup, Lo Han Kuo powder (Siraitia grosvenorii), Lo Han Kuo extract, licorice powder, licorice extract, Thaumatococcus daniellii seed powder and Thaumatococcus daniellii seed extract, and artificial sweeteners such such as acesulfame potassium, sucralose, neotame, aspartame and saccharin. Among them, natural sweeteners are preferably used from the aspect of imparting pure taste, ease of drinking, natural taste and moderately rich taste, wherein fructose, glucose, maltose, sucrose and sugar are particularly preferably used. Either a single type or a plurality of types of these sweetness ingredients can be used.

3. Food or beverage containing innovative steviol glycoside

[0035] Em um aspecto da presente invenção, um alimento ou bebida contendo o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo (em seguida, também referido como o “alimento ou bebida da presente invenção”) é provido. O alimento ou bebida da presente invenção não é particularmente limitado, desde que ele contenha o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, e ele pode ser um alimento ou bebida contendo um extrato contendo o composto representado pela Fórmula (1), ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo. Como usado aqui, um alimento ou bebida se refere a alimentos e bebidas. Portanto, em algumas modalidades, a presente invenção provê um alimento ou bebida inovador, e um método para produzir o dito alimento ou bebida.[0035] In one aspect of the present invention, a food or beverage containing the compound represented by Formula (1), or a derivative, a salt or a hydrate thereof (hereinafter also referred to as the “food or beverage of the present invention ”) is provided. The food or beverage of the present invention is not particularly limited as long as it contains the compound represented by Formula (1), or a derivative, a salt or a hydrate thereof, and it can be a food or beverage containing an extract containing the compound represented by Formula (1), or a derivative, salt or hydrate thereof. As used herein, a food or drink refers to both food and drink. Therefore, in some embodiments, the present invention provides an innovative food or beverage, and a method of producing said food or beverage.

[0036] Embora a quantidade do glicosídeo da presente invenção contida no alimento ou bebida da presente invenção difira dependendo do alimento ou bebida específico, ela é preferivelmente em torno de 0,0004%- 0,8% e em particular preferivelmente 0,04%-0,4%. Desde que o teor fique nessa faixa, o sabor remanescente prolongado pode vantajosamente ser suprimido.[0036] Although the amount of the glycoside of the present invention contained in the food or drink of the present invention differs depending on the specific food or drink, it is preferably around 0.0004% - 0.8% and particularly preferably 0.04% -0.4%. As long as the content stays in this range, the lingering aftertaste can advantageously be suppressed.

[0037] O alimento ou bebida da presente invenção pode conter adicionalmente outros glicosídeos de esteviol. Por exemplo, a composição de adoçante da presente invenção pode conter, além do glicosídeo da presente invenção, um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.[0037] The food or beverage of the present invention may additionally contain other steviol glycosides. For example, the sweetener composition of the present invention may contain, in addition to the glycoside of the present invention, one or more types of steviol glycosides selected from the group consisting of rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, rebaudioside I, rebaudioside J, rebaudioside K, rebaudioside N, rebaudioside M, rebaudioside O, rebaudioside Q, rebaudioside R, dulcoside A, rubusoside, steviol, steviol monoside, steviol bioside and stevioside.

[0038] Em um caso onde outro glicosídeo de esteviol está contido, a razão da composição do glicosídeo da presente invenção e outro glicosídeo de esteviol é preferivelmente 0,01:9,99-6:4 em uma razão em massa.[0038] In a case where another steviol glycoside is contained, the composition ratio of the glycoside of the present invention and another steviol glycoside is preferably 0.01:9.99-6:4 in a mass ratio.

[0039] O alimento ou bebida da presente invenção pode conter adicionalmente um adoçante geral. Exemplos de um adoçante geral como esse incluem adoçantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutose- glicose, glicose, maltose, sacarose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorii), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii, e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sacralose, neotame, aspartame e sacarina. Entre eles, adoçantes naturais são preferivelmente usados do aspecto de conferir gosto puro, facilidade de beber, sabor natural e gosto moderadamente rico, em que frutose, glicose, maltose, sacarose e açúcar são em particular preferivelmente usados. Tanto um único tipo quanto uma pluralidade de tipos desses ingredientes de doçura pode ser usado.[0039] The food or beverage of the present invention may additionally contain a general sweetener. Examples of such a general sweetener include natural sweeteners such as fructose, sugar, fructose-glucose syrup, glucose, maltose, sucrose, high fructose syrup, sugar alcohol, oligosaccharide, honey, pressed sugar cane juice brown sugar), starch syrup, Lo Han Kuo powder (Siraitia grosvenorii), Lo Han Kuo extract, licorice powder, licorice extract, Thaumatococcus daniellii seed powder and Thaumatococcus daniellii seed extract, and artificial sweeteners such such as acesulfame potassium, sacralose, neotame, aspartame and saccharin. Among them, natural sweeteners are preferably used from the aspect of imparting pure taste, ease of drinking, natural taste and moderately rich taste, wherein fructose, glucose, maltose, sucrose and sugar are particularly preferably used. Either a single type or a plurality of types of these sweetness ingredients can be used.

[0040] Exemplos do alimento da presente invenção incluem, mas particularmente não se limitando a uma confecção, um pão, farinha de cereal, macarrão, arroz, um alimento agrícola/silvicultura, processado um produto de animais de fazenda processado, um produto de pesca processado, um produto de leite/laticínio, um produto de óleo e gordura/óleo e gordura processados, condimento ou outro material de alimento.[0040] Examples of the food of the present invention include, but are particularly not limited to, a confection, a bread, cereal flour, pasta, rice, an agricultural/forestry food, processed a processed farm animal product, a fishery product product, a milk/dairy product, an oil and fat/processed oil and fat product, condiment, or other food material.

[0041] Exemplos da bebida da presente invenção incluem, mas particularmente não se limitando a uma bebida carbonada, uma bebida não carbonada, uma bebida alcoólica, uma bebida não alcoólica, uma bebida de café, uma bebida de chá, uma bebida de cacau, uma bebida nutritiva e uma bebida funcional.[0041] Examples of the beverage of the present invention include, but are particularly not limited to, a carbonated beverage, a non-carbonated beverage, an alcoholic beverage, a non-alcoholic beverage, a coffee beverage, a tea beverage, a cocoa beverage, a nutritious drink and a functional drink.

[0042] A bebida da presente invenção pode ser esterilizada e embalada a quente para ser preparada como uma bebida embalada. Exemplos de tal embalagem incluem, mas particularmente não se limitando a uma garrafa PET, uma lata de alumínio, um lata de aço, uma embalagem de papel, um copo resfriado, e uma garrafa. Em um caso onde esterilização térmica tem de ser realizada, o tipo de esterilização térmica não é particularmente limitado. Por exemplo, esterilização térmica pode ser realizada empregando uma técnica comum tais como esterilização UHT, esterilização por retorta ou similares. Embora a temperatura durante o processo de esterilização térmica não seja particularmente limitado, ela é, por exemplo, 65-130°C, e preferivelmente 85-120°C, por 10-40 minutos. Esterilização, entretanto, pode ser realizada a uma temperatura apropriada por diversos segundos, por exemplo, 5-30 segundos, sem problema, desde que o mesmo valor esterilizante como aquele nas condições supradescritas possa ser obtido.[0042] The beverage of the present invention can be sterilized and hot packed to be prepared as a packaged beverage. Examples of such packaging include, but are particularly not limited to, a PET bottle, an aluminum can, a steel can, a paper package, a chilled cup, and a bottle. In a case where thermal sterilization has to be performed, the type of thermal sterilization is not particularly limited. For example, thermal sterilization can be performed employing a common technique such as UHT sterilization, retort sterilization or the like. Although the temperature during the thermal sterilization process is not particularly limited, it is, for example, 65-130°C, and preferably 85-120°C, for 10-40 minutes. Sterilization, however, can be carried out at an appropriate temperature for several seconds, for example 5-30 seconds, without problem, provided that the same sterilizing value as that under the above-described conditions can be obtained.

Plant containing innovative steviol glycoside and extract thereof

[0043] Em um aspecto da presente invenção, uma planta contendo o glicosídeo de esteviol inovador e um extrato da mesma são providos. Além do mais, em um outro aspecto da presente invenção, um alimento ou bebida, preferivelmente uma bebida, contendo a planta da presente invenção ou um extrato da planta é provido. Embora a quantidade do glicosídeo da presente invenção contido na planta da presente invenção não seja particularmente limitada, ela é preferivelmente 0,001%-1,000% e mais preferivelmente 0,01%-0,80%.[0043] In one aspect of the present invention, a plant containing the innovative steviol glycoside and an extract thereof are provided. Furthermore, in another aspect of the present invention, a food or beverage, preferably a beverage, containing the plant of the present invention or an extract of the plant is provided. Although the amount of the glycoside of the present invention contained in the plant of the present invention is not particularly limited, it is preferably 0.001%-1.000% and more preferably 0.01%-0.80%.

[0044] Preferivelmente, a planta da presente invenção é uma planta que contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que uma espécie de estévia tipo selvagem em 0,01% ou mais. Como descrito anteriormente, o glicosídeo de esteviol da presente invenção não está contido em uma estévia tipo selvagem absolutamente ou, se estiver, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menos.[0044] Preferably, the plant of the present invention is a plant that contains the glycoside of the present invention in an amount greater than a wild-type stevia species by 0.01% or more. As described above, the steviol glycoside of the present invention is not contained in a wild-type stevia at all or, if it is, contained in a limit of detection amount or less.

[0045] A expressão “contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que uma espécie de estévia tipo selvagem em 0,01% ou mais” significa que, com relação a uma quantidade (concentração) do glicosídeo da presente invenção contido por quantidade unitária (por exemplo, 10 mL) de um extrato líquido de folhas frescas (folhas não secas) de uma planta de estévia tipo selvagem, uma quantidade (concentração) do glicosídeo da presente invenção contido em uma quantidade unitária igual de um extrato líquido de folhas frescas (folhas não secas) da planta da presente invenção (a mesma quantidade daquela do extrato líquido das folhas da planta de estévia tipo selvagem) é maior em 0,01% ou mais. Aqui, a planta da presente invenção pode conter o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que de uma espécie de estévia tipo selvagem em 0,02% ou mais, 0,03% ou mais, 0,04% ou mais, 0,05% ou mais, 0,07% ou mais, 0,09% ou mais, 0,10% ou mais, 0,15% ou mais, 0,20% ou mais, 0,40% ou mais, 0,60% ou mais, 0,80% ou mais, 1,0% ou mais, 1,50% ou mais, 2,00% ou mais, 4,00% ou mais, 6,00% ou mais, 8,00% ou mais, ou 10,00% ou mais.[0045] The expression “contains the glycoside of the present invention in an amount greater than a wild-type stevia species by 0.01% or more” means that, with respect to an amount (concentration) of the glycoside of the present invention contained per amount unit (e.g., 10 ml) of a liquid extract of fresh leaves (not dried leaves) of a wild-type stevia plant, an amount (concentration) of the glycoside of the present invention contained in an equal unit amount of a liquid leaf extract fresh (not dried leaves) of the plant of the present invention (the same amount as that of the liquid extract of the leaves of the wild-type stevia plant) is greater by 0.01% or more. Here, the plant of the present invention may contain the glycoside of the present invention in an amount greater than that of a wild-type stevia species by 0.02% or more, 0.03% or more, 0.04% or more, 0, 05% or more, 0.07% or more, 0.09% or more, 0.10% or more, 0.15% or more, 0.20% or more, 0.40% or more, 0.60 % or more, 0.80% or more, 1.0% or more, 1.50% or more, 2.00% or more, 4.00% or more, 6.00% or more, 8.00% or more, or 10.00% or more.

[0046] Além disso, a expressão “a proporção do glicosídeo da presente invenção dentre os glicosídeos de esteviol totais é 0,01% ou mais” significa que o glicosídeo da presente invenção existe a uma porcentagem de 0,01% ou mais com relação ao teor total dos glicosídeos de esteviol existentes no extrato líquido das folhas frescas (folhas não secas) da planta de estévia da presente invenção. Aqui, os glicosídeos de esteviol totais nem contêm glicosídeos desconhecidos de esteviol nem nenhum glicosídeo de esteviol existente em uma quantidade menor que o limite de detecção. Preferivelmente, os glicosídeos de esteviol totais consistem de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rebaudiosídeo I, rebaudiosídeo J, rebaudiosídeo K, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo Q, rebaudiosídeo R, dulcosídeo A, rubusosídeo, esteviol, monosídeo de esteviol, biosídeo de esteviol e esteviosídeo.[0046] In addition, the expression "the proportion of the glycoside of the present invention among the total steviol glycosides is 0.01% or more" means that the glycoside of the present invention exists in a percentage of 0.01% or more with respect to to the total content of steviol glycosides existing in the liquid extract of fresh leaves (not dried leaves) of the stevia plant of the present invention. Here, the total steviol glycosides neither contain unknown steviol glycosides nor any existing steviol glycosides in an amount less than the limit of detection. Preferably, the total steviol glycosides consist of rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, rebaudioside I, rebaudioside J, rebaudioside K, rebaudioside N, rebaudioside M, rebaudioside O, rebaudioside Q, rebaudioside R , dulcoside A, rubusoside, steviol, steviol monoside, steviol bioside and stevioside.

[0047] Embora o teor do glicosídeo da presente invenção na planta da presente invenção seja como descrito anteriormente, em um caso onde folhas secas são obtidas da planta da presente invenção, o glicosídeo da presente invenção pode existir em uma quantidade de 0,01% em peso ou mais, 0,02% em peso ou mais, 0,03% em peso ou mais, 0,04% em peso ou mais, 0,05% em peso ou mais, 8,00% em peso ou mais, ou 10,00% em peso ou mais com relação ao peso das ditas folhas secas.[0047] Although the content of the glycoside of the present invention in the plant of the present invention is as described above, in a case where dried leaves are obtained from the plant of the present invention, the glycoside of the present invention may exist in an amount of 0.01% by weight or more, 0.02% by weight or more, 0.03% by weight or more, 0.04% by weight or more, 0.05% by weight or more, 8.00% by weight or more, or 10.00% by weight or more based on the weight of said dry leaves.

[0048] Aqui, folhas secas da planta da presente invenção se referem àquelas obtidas secando folhas frescas da planta da presente invenção para reduzir seu teor de água até 10% em peso ou menos, 7% em peso ou menos, 5% em peso ou menos, 4% em peso ou menos, 3% em peso ou menos, 2% em peso ou menos, ou 1% em peso ou menos. Preferivelmente, o teor de água das folhas secas da planta da presente invenção é 3-4% em peso.[0048] Here, dried leaves of the plant of the present invention refer to those obtained by drying fresh leaves of the plant of the present invention to reduce their water content to 10% by weight or less, 7% by weight or less, 5% by weight or less, 4% by weight or less, 3% by weight or less, 2% by weight or less, or 1% by weight or less. Preferably, the water content of the dried leaves of the plant of the present invention is 3-4% by weight.

[0049] Um exemplo da planta da presente invenção inclui uma planta com Reb.C abundante. Como descrito anteriormente, o glicosídeo de esteviol da presente invenção não está contido em uma estévia tipo selvagem ou um extrato da mesma absolutamente ou, se estiver, contido em uma quantidade do limite de detecção ou menos. No entanto, os presentes inventores observaram que o glicosídeo de esteviol da presente invenção está contido em uma maior quantidade em uma planta tendo Reb.C abundante. Portanto, o glicosídeo de esteviol inovador e o extrato da mesma também compreendem uma planta como essa com Reb.C abundante e um extrato da mesma.[0049] An example of the plant of the present invention includes a plant with abundant Reb.C. As described above, the steviol glycoside of the present invention is not contained in a wild-type stevia or an extract thereof at all or, if it is, contained in a limit of detection amount or less. However, the present inventors have observed that the steviol glycoside of the present invention is contained in a greater amount in a plant having abundant Reb.C. Therefore, the innovative steviol glycoside and extract thereof also comprises such a plant with abundant Reb.C and an extract thereof.

[0050] Um exemplo de uma planta como essa com Reb.C abundante incluem, mas particularmente não se limitando a uma planta de estévia não recombinante contendo alto rebaudiosídeo C que contém rebaudiosídeo C em uma quantidade maior que uma espécie de estévia tipo selvagem por 20% ou mais, e cuja proporção de rebaudiosídeo C dentre os glicosídeos de esteviol totais é 40% ou mais (em seguida, também referido como uma “planta de alto Reb.C”).[0050] An example of such a plant with abundant Reb.C include, but are particularly not limited to, a non-recombinant stevia plant containing high rebaudioside C that contains rebaudioside C in an amount greater than a wild-type stevia species per 20 % or more, and whose proportion of rebaudioside C among the total steviol glycosides is 40% or more (hereinafter also referred to as a “high Reb.C plant”).

[0051] Um exemplo de uma planta de alto Reb.C como essa incluem uma planta de estévia não recombinante contendo alto rebaudiosídeo C que contém rebaudiosídeo C em uma quantidade maior que uma espécie de estévia tipo selvagem em 20% ou mais, e cuja proporção de rebaudiosídeo C dentre os glicosídeos de esteviol totais é 40% ou mais.[0051] An example of such a high Reb.C plant would include a non-recombinant stevia plant containing high rebaudioside C which contains rebaudioside C in an amount greater than a wild-type stevia species by 20% or more, and whose proportion of rebaudioside C among the total steviol glycosides is 40% or more.

[0052] Uma planta de alto Reb.C é um cultivar derivado de uma planta de uma estévia tipo selvagem, na qual mutação genética ocorreu para aumentar rebaudiosídeo C. Exemplos de mutação genética como essa incluem, mas particularmente não se limitando a mutação genética induzida em condições de ocorrência natural, mutação genética induzida por uma técnica não recombinacional e mutação genética induzida por recombinação genética.[0052] A high Reb.C plant is a cultivar derived from a wild-type stevia plant in which genetic mutation has occurred to increase rebaudioside C. Examples of such a genetic mutation include, but are particularly not limited to, induced gene mutation under naturally occurring conditions, genetic mutation induced by a non-recombination technique and genetic mutation induced by genetic recombination.

[0053] Uma planta de alto Reb.C pode ser classificada, por exemplo, detectando polimorfismo genético no tecido da planta. Aqui, “classificação” significa identificar uma planta de alto Reb.C dentre outras plantas e selecionar a planta de alto Reb.C.[0053] A high Reb.C plant can be classified, for example, by detecting genetic polymorphism in plant tissue. Here, “sorting” means identifying a high Reb.C plant among other plants and selecting the high Reb.C plant.

[0054] A planta de alto Reb.C pode também ser classificada de acordo com um método de classificação que inclui uma etapa de identificar um polimorfismo de A no tipo selvagem sendo alterado para T no 60o nucleotídeo da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO:11 no genoma de uma planta de teste.[0054] The high Reb.C plant can also be classified according to a classification method that includes a step of identifying a polymorphism from A in the wild type being changed to T at the 60th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO :11 in the genome of a test plant.

[0055] A planta da presente invenção não apenas compreende toda a planta, mas pode também incluir órgãos de planta (por exemplo, folha, pétala, tronco, raiz, semente, etc.), tecidos de planta (por exemplo, epiderme, pólen, parênquima, xilema, feixes vasculares, tecido paliçado, tecido esponjoso, etc.), várias formas de células de planta (por exemplo, células cultivadas em suspensão), um protoplasto, uma parte da folha, calo e similares.[0055] The plant of the present invention not only comprises the whole plant, but may also include plant organs (e.g. leaf, petal, trunk, root, seed, etc.), plant tissues (e.g. epidermis, pollen , parenchyma, xylem, vascular bundles, palisade tissue, spongy tissue, etc.), various forms of plant cells (e.g., suspension cultured cells), a protoplast, a leaf part, callus, and the like.

[0056] Além do mais, a planta da presente invenção pode também compreender uma cultura de tecido ou uma cultura de célula de planta. Isto se dá em virtude de uma cultura de tecido ou cultura de célula de planta como essa poder ser cultivada para regenerar uma planta. Exemplos da cultura de tecido ou da cultura de célula de planta da planta da presente invenção incluem, mas não se limitando a um embrião, células meristemáticas, pólen, uma folha, uma raiz, um ápice de raiz, uma pétala, um protoplasto, uma parte da folha e calo.[0056] Furthermore, the plant of the present invention may also comprise a tissue culture or a plant cell culture. This is because such a tissue culture or plant cell culture can be grown to regenerate a plant. Examples of tissue culture or plant cell culture of the plant of the present invention include, but are not limited to, an embryo, meristematic cells, pollen, a leaf, a root, a root apex, a petal, a protoplast, a part of the leaf and callus.

[0057] Um extrato da planta da presente invenção pode ser obtido reagindo uma folha fresca ou uma folha seca da planta da presente invenção com um solvente apropriado (um solvente aquoso tal como água ou um solvente orgânico tais como álcool, éter ou acetona). Para condições para extração, vide um método descrito em WO2016/090460 ou um método descrito no exemplo a seguir.[0057] An extract of the plant of the present invention can be obtained by reacting a fresh leaf or a dried leaf of the plant of the present invention with an appropriate solvent (an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether or acetone). For conditions for extraction, see a method described in WO2016/090460 or a method described in the example below.

[0058] Preferivelmente, o extrato da planta da presente invenção contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que uma estévia tipo selvagem em 0,01% ou mais, onde a proporção do glicosídeo da presente invenção dentre os glicosídeos de esteviol totais é 0,01% ou mais. Aqui, a expressão “contém o glicosídeo da presente invenção em uma quantidade maior que uma estévia tipo selvagem em 0,01% ou mais” significa o mesmo como descrito anteriormente. Similarmente, expressão a “proporção do glicosídeo da presente invenção dentre os glicosídeos de esteviol totais é 0,01% ou mais” também significa o mesmo descrito anteriormente.[0058] Preferably, the plant extract of the present invention contains the glycoside of the present invention in an amount greater than a wild-type stevia by 0.01% or more, where the proportion of the glycoside of the present invention among the total steviol glycosides is 0.01% or more. Here, the expression "contains the glycoside of the present invention in an amount greater than a wild-type stevia by 0.01% or more" means the same as described above. Similarly, expression the "proportion of the glycoside of the present invention among the total steviol glycosides is 0.01% or more" also means the same as described above.

5. Innovative Steviol Glycoside Containing Taste Control Agent

[0059] Embora o glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção esteja contido em um extrato de estévia em uma quantidade diminuta, ele é considerado ter uma influência no sabor do extrato de estévia. Embora não se ligando a nenhuma teoria, adição de uma pequena quantidade do glicosídeo de esteviol da presente invenção é presumivelmente capaz de controlar o sabor de um alimento ou bebida. Portanto, em um aspecto da presente invenção, um agente de controle de sabor contendo o composto supradescrito representado pela Fórmula (1) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo é provido.[0059] Although the innovative steviol glycoside of the present invention is contained in a stevia extract in a minute amount, it is considered to have an influence on the taste of the stevia extract. While not bound by any theory, addition of a small amount of the steviol glycoside of the present invention is presumably capable of controlling the taste of a food or beverage. Therefore, in one aspect of the present invention, a taste control agent containing the above-described compound represented by Formula (1) or a derivative, a salt or a hydrate thereof is provided.

[0060] Como usado aqui, um “agente de controle de sabor” se refere a uma substância que pode ser adicionada a um alimento ou bebida para controlar o sabor do alimento ou bebida. Preferivelmente, o agente de controle de sabor da presente invenção pode ser adicionado a um alimento ou bebida de maneira a controlar o sabor do alimento ou bebida por si mesmo, sem que os consumidores reconheçam o gosto do próprio agente de controle de sabor. Por exemplo, uma vez que o glicosídeo de esteviol da presente invenção tem bom sabor remanescente de doçura prolongado comparado aos glicosídeos de esteviol convencionais, ele pode ser usado como um agente de controle de sabor para controlar o sabor remanescente de doçura prolongado do alimento ou bebida.[0060] As used herein, a “taste control agent” refers to a substance that can be added to a food or drink to control the taste of the food or drink. Preferably, the taste control agent of the present invention can be added to a food or drink in order to control the taste of the food or drink itself, without consumers recognizing the taste of the taste control agent itself. For example, since the steviol glycoside of the present invention has good aftertaste of prolonged sweetness compared to conventional steviol glycosides, it can be used as a taste control agent to control the aftertaste of prolonged sweetness of food or beverage. .

[0061] O agente de controle de sabor (intensificação) da presente invenção preferivelmente contém, além do composto supradescrito representado pela Fórmula (1) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo, um ou mais tipos de outros adoçantes. Exemplos de tal adoçante incluem: um ou mais tipos de glicosídeos de esteviol selecionados do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo K e rebaudiosídeo J; adoçantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutose-glicose, glicose, maltose, sacarose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorii), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii; e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sacralose, neotame, aspartame e sacarina.[0061] The taste control (enhancement) agent of the present invention preferably contains, in addition to the above-described compound represented by Formula (1) or a derivative, a salt or a hydrate thereof, one or more kinds of other sweeteners. Examples of such a sweetener include: one or more types of steviol glycosides selected from the group consisting of rebaudioside A, rebaudioside D, rebaudioside B, rebaudioside M, rebaudioside N, rebaudioside O, rebaudioside E, rebaudioside K and rebaudioside J; natural sweeteners such as fructose, sugar, fructose-glucose syrup, glucose, maltose, sucrose, high fructose syrup, sugar alcohol, oligosaccharide, honey, pressed sugar cane juice (brown sugar syrup), starch syrup, Lo Han Kuo Powder (Siraitia grosvenorii), Lo Han Kuo Extract, Licorice Powder, Licorice Extract, Thaumatococcus daniellii Seed Powder and Thaumatococcus daniellii Seed Extract; and artificial sweeteners such as acesulfame potassium, sacralose, neotame, aspartame and saccharin.

[0062] Em um aspecto da presente invenção, o agente de controle de sabor da presente invenção é um agente de controle de sabor que melhora o sabor remanescente prolongado e que contém o composto representado pela Fórmula (1) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo. Embora Brix de alimentos ou bebidas comercialmente disponíveis (por exemplo, bebidas refrescantes) seja normalmente até em torno de 15, redução na quantidade de açúcar em alimentos ou bebidas foi considerada, devido ao crescimento recente de consciência de saúde e o introdução de taxa de açúcar. Onde a quantidade de açúcar é reduzida, o uso de um adoçante não açúcar (por exemplo, um adoçante não calórico) tem sido tentado para compensar a perda de Brix devido à redução de açúcar. Por exemplo, se a quantidade de açúcar em um alimento ou bebida originalmente tendo Brix de 10 for reduzida pela metade, Brix será 5. Portanto, existe uma necessidade de adicionar um adoçante não açúcar para tornar o nível de doçura correspondente a Brix de 5. Muitos dos adoçantes não açúcar, entretanto, têm sabores exclusivos que diferem de açúcar, em que um de tais sabores característicos é sabor remanescente de doçura prolongado ruim. Uma vez que o glicosídeo de esteviol da presente invenção tem bom sabor remanescente de doçura prolongado, um agente de controle de sabor contendo o glicosídeo de esteviol da presente invenção pode ser usado como um agente de controle de sabor para melhorar o sabor remanescente prolongado. Aqui, “Brix” é uma escala de um nível de doçura de um alimento ou bebida, ou seja, um valor da concentração do teor de sólido solúvel expresso em uma concentração de porcentagem em peso em uma solução de sacarose a 20°C. Dessa maneira, ela é representada por uma quantidade de sacarose (g) em 100 g de uma solução de sacarose aquosa. Por exemplo, Brix de 5 representa um nível de doçura correspondente ao nível de doçura de 5 g de sacarose em 100 g de uma solução de sacarose aquosa.[0062] In one aspect of the present invention, the taste control agent of the present invention is a taste control agent which improves prolonged aftertaste and which contains the compound represented by Formula (1) or a derivative, a salt or a hydrate thereof. Although the Brix of commercially available foods or beverages (e.g., refreshing beverages) is normally up to around 15, reducing the amount of sugar in foods or beverages has been considered, due to recent growth in health awareness and the introduction of sugar . Where the amount of sugar is reduced, the use of a non-sugar sweetener (eg a non-caloric sweetener) has been tried to compensate for the Brix loss due to sugar reduction. For example, if the amount of sugar in a food or beverage originally having a Brix of 10 is halved, the Brix will be 5. Therefore, there is a need to add a non-sugar sweetener to bring the sweetness level to match a Brix of 5. Many of the non-sugar sweeteners, however, have unique flavors that differ from sugar, in that one such characteristic flavor is aftertaste of bad lingering sweetness. Since the steviol glycoside of the present invention has good aftertaste of prolonged sweetness, a taste control agent containing the steviol glycoside of the present invention can be used as an aftertaste control agent to improve the prolonged aftertaste. Here, “Brix” is a scale of a sweetness level of a food or drink, ie a concentration value of soluble solid content expressed as a percentage concentration by weight in a sucrose solution at 20°C. In this way, it is represented by an amount of sucrose (g) in 100 g of an aqueous sucrose solution. For example, Brix of 5 represents a sweetness level corresponding to the sweetness level of 5 g of sucrose in 100 g of an aqueous sucrose solution.

[0063] O agente de controle de sabor da presente invenção é preferivelmente adicionado ao adoçante não açúcar contido em um alimento ou bebida em uma quantidade de 1% em massa - 15% em massa com base na massa do adoçante. O agente de controle de sabor da presente invenção é adicionado mais preferivelmente em uma quantidade de 1,5% em massa - 12% em massa, e ainda mais preferivelmente em uma quantidade de 3,5% em massa - 11% em massa com base na massa do adoçante. O teor do adoçante não açúcar no alimento ou bebida adicionado com o agente de controle de sabor da presente invenção é preferivelmente 5-13, mais preferivelmente 5-12 e ainda mais preferivelmente 5-7 em termos de Brix. Aqui, a expressão “o teor do adoçante não açúcar é 5 em termos de Brix” se refere a um teor que dá a doçura da solução aquosa contendo o adoçante não açúcar equivalente a Brix de 5. Por exemplo, se o nível de doçura de um adoçante não açúcar for mais doce que açúcar por 200 vezes, a quantidade que dá “o teor do adoçante não açúcar para ser 5 em termos de Brix” é 0,025 g em 100 g de uma solução aquosa contendo o adoçante não açúcar. Em um aspecto preferível da presente invenção, um agente de controle de sabor da presente invenção é adicionado ao adoçante não açúcar contido no alimento ou bebida em uma quantidade de 1% em massa - 15% em massa com base na massa do adoçante, em que o teor do adoçante não açúcar é 5,5-12 em termos de Brix. Em outro aspecto preferível da presente invenção, o agente de controle de sabor da presente invenção é adicionado ao adoçante não açúcar contido no alimento ou bebida em uma quantidade de 1,5% em massa - 12% em massa com base na massa do adoçante, em que o teor do adoçante não açúcar é 5-13 em termos de Brix.[0063] The taste control agent of the present invention is preferably added to the non-sugar sweetener contained in a food or beverage in an amount of 1% by mass - 15% by mass based on the mass of the sweetener. The taste control agent of the present invention is most preferably added in an amount of 1.5% by mass - 12% by mass, and even more preferably in an amount of 3.5% by mass - 11% by mass based on in the sweetener mass. The content of the non-sugar sweetener in the food or beverage added with the taste control agent of the present invention is preferably 5-13, more preferably 5-12 and even more preferably 5-7 in terms of Brix. Here, the expression “the content of the non-sugar sweetener is 5 in terms of Brix” refers to a content that gives the sweetness of the aqueous solution containing the non-sugar sweetener equivalent to a Brix of 5. For example, if the sweetness level of a non-sugar sweetener is sweeter than sugar by 200 times, the amount that gives "the content of the non-sugar sweetener to be 5 in terms of Brix" is 0.025 g in 100 g of an aqueous solution containing the non-sugar sweetener. In a preferred aspect of the present invention, a taste control agent of the present invention is added to the non-sugar sweetener contained in the food or beverage in an amount of 1% by mass - 15% by mass based on the mass of the sweetener, wherein the non-sugar sweetener content is 5.5-12 in terms of Brix. In another preferred aspect of the present invention, the taste control agent of the present invention is added to the non-sugar sweetener contained in the food or beverage in an amount of 1.5% by mass - 12% by mass based on the mass of the sweetener, where the non-sugar sweetener content is 5-13 in terms of Brix.

[0064] Exemplos de outro adoçante contido no alimento ou bebida incluem, mas não se limitando a um ou mais tipos de glicosídeo de esteviol selecionado do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo K e rebaudiosídeo J; adoçantes naturais tais como frutose, xarope de frutose-glicose, glicose, maltose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorii), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii; e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sacralose, neotame, aspartame e sacarina.[0064] Examples of other sweetener contained in the food or beverage include, but are not limited to, one or more types of steviol glycoside selected from the group consisting of rebaudioside A, rebaudioside D, rebaudioside B, rebaudioside M, rebaudioside N, rebaudioside O , rebaudioside E, rebaudioside K and rebaudioside J; natural sweeteners such as fructose, fructose-glucose syrup, glucose, maltose, high fructose syrup, sugar alcohol, oligosaccharide, honey, pressed sugar cane juice (brown sugar syrup), starch syrup, Lo Han powder Kuo (Siraitia grosvenorii), Lo Han Kuo Extract, Licorice Powder, Licorice Extract, Thaumatococcus daniellii Seed Powder and Thaumatococcus daniellii Seed Extract; and artificial sweeteners such as acesulfame potassium, sacralose, neotame, aspartame and saccharin.

[0065] Em um outro aspecto da presente invenção, um agente de controle de sabor da presente invenção é um agente de controle de sabor contendo o composto supradescrito representado pela Fórmula (1) ou um derivado, um sal ou um hidrato do mesmo para intensificar a doçura. Um agente de controle de sabor para intensificar a doçura se refere a um agente de controle de sabor que pode ser adicionado a um alimento ou bebida contendo um adoçante de maneira tal que ele possa conferir doçura mais forte ao alimento ou bebida do que uma simples soma da doçura do agente de controle de sabor a isso. Por exemplo, quando um agente de controle de sabor de uma quantidade equivalente a Brix de 0,1 é adicionado a um alimento ou bebida com doçura equivalente a Brix de 9, o agente de controle de sabor deve ser capaz de conferir um nível de doçura excedendo Brix de 9,1 (por exemplo, Brix de 9,2) ao alimento ou bebida. O uso de um agente de controle de sabor como esse para intensificar a doçura pode reduzir a quantidade total dos adoçantes usados, e assim vantajoso em realizar redução de caloria e redução de custo.[0065] In another aspect of the present invention, a taste control agent of the present invention is a taste control agent containing the above-described compound represented by Formula (1) or a derivative, a salt or a hydrate thereof for enhancing the sweetness. A flavor control agent to enhance sweetness refers to a flavor control agent that can be added to a food or drink containing a sweetener in such a way that it can impart stronger sweetness to the food or drink than a simple sum from the sweetness of the flavor control agent to that. For example, when a flavor control agent of a Brix equivalent amount of 0.1 is added to a food or beverage with a sweetness equivalent to a Brix of 9, the flavor control agent must be able to impart a level of sweetness exceeding Brix of 9.1 (eg Brix of 9.2) to food or drink. The use of such a flavor control agent to enhance sweetness can reduce the total amount of sweeteners used, and thus is advantageous in realizing calorie reduction and cost reduction.

[0066] Se o nível de doçura do adoçante alvejado para intensificação de doçura for 1-10, o agente de controle de sabor para intensificar a doçura da presente invenção é preferivelmente adicionado em uma quantidade de 0,05% em massa - 2,0% em massa, mais preferivelmente adicionado em uma quantidade de 0,1% em massa - 1,5% em massa, e ainda mais preferivelmente adicionado em uma quantidade de 0,2% em massa - 1,2% em massa com base na massa do adoçante alvejado para intensificação de doçura.[0066] If the sweetener level of the target sweetener for enhancing sweetness is 1-10, the taste control agent for enhancing sweetness of the present invention is preferably added in an amount of 0.05 wt% - 2.0 % by mass, more preferably added in an amount of 0.1% by mass - 1.5% by mass, and even more preferably added in an amount of 0.2% by mass - 1.2% by mass based on the sweetener mass targeted for sweetness enhancement.

[0067] Exemplos do adoçante alvejado para intensificação de doçura incluem, mas particularmente não se limitando a um ou mais tipos de glicosídeo de esteviol selecionado do grupo que consiste de rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo M, rebaudiosídeo N, rebaudiosídeo O, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo K e rebaudiosídeo J; adoçantes naturais tais como frutose, açúcar, xarope de frutose-glicose, glicose, maltose, sacarose, xarope de alta frutose, álcool de açúcar, oligossacarídeo, mel, suco de cana de açúcar prensada (xarope de açúcar mascavo), xarope de amido, pó de Lo Han Kuo (Siraitia grosvenorii), extrato de Lo Han Kuo, pó de alcaçuz, extrato de alcaçuz, pó de semente de Thaumatococcus daniellii e extrato de semente de Thaumatococcus daniellii; e adoçantes artificiais tais como acessulfame de potássio, sacralose, neotame, aspartame e sacarina.[0067] Examples of the sweetener targeted for sweetness enhancement include, but particularly not limited to, one or more types of steviol glycoside selected from the group consisting of rebaudioside A, rebaudioside D, rebaudioside B, rebaudioside M, rebaudioside N, rebaudioside O , rebaudioside E, rebaudioside K and rebaudioside J; natural sweeteners such as fructose, sugar, fructose-glucose syrup, glucose, maltose, sucrose, high fructose syrup, sugar alcohol, oligosaccharide, honey, pressed sugar cane juice (brown sugar syrup), starch syrup, Lo Han Kuo Powder (Siraitia grosvenorii), Lo Han Kuo Extract, Licorice Powder, Licorice Extract, Thaumatococcus daniellii Seed Powder and Thaumatococcus daniellii Seed Extract; and artificial sweeteners such as acesulfame potassium, sacralose, neotame, aspartame and saccharin.

6. Method to produce innovative steviol glycoside

[0068] Como descrito anteriormente, o glicosídeo de esteviol da presente invenção pode ser produzido por (A) isolamento/purificação de uma planta, (B) uma síntese química, ou (C) uma biossíntese. Em seguida, cada um deles será descrito.[0068] As described above, the steviol glycoside of the present invention can be produced by (A) isolation/purification from a plant, (B) a chemical synthesis, or (C) a biosynthesis. Then each of them will be described.

[0069] (a) Isolamento/purificação de planta Uma vez que a planta da presente invenção contém o glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção, o glicosídeo de esteviol inovador pode ser isolado/purificado da dita planta. Uma folha fresca ou seca da planta da presente invenção é deixada reagir com um solvente apropriado (um solvente aquoso tal como água ou um solvente orgânico tais como álcool, éter ou acetona) para extrair o glicosídeo de esteviol inovador em um extrato estado líquido. Para condições de extração e mais, vide o método descrito em WO2016/090460 ou o método descrito no exemplo a seguir.[0069] (a) Isolation/purification of plant Since the plant of the present invention contains the innovative steviol glycoside of the present invention, the innovative steviol glycoside can be isolated/purified from said plant. A fresh or dried leaf of the plant of the present invention is allowed to react with an appropriate solvent (an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether or acetone) to extract the innovative steviol glycoside in a liquid state extract. For extraction conditions and more, see the method described in WO2016/090460 or the method described in the example below.

[0070] Além do mais, o extrato líquido resultante pode ser submetido a um método conhecido tais como um gradiente de acetato de etila ou outro solvente orgânico: água, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), ou cromatografia de líquida de ultra (alto) desempenho (UPLC) para isolar/purificar o glicosídeo de esteviol inovador.[0070] Furthermore, the resulting liquid extract can be subjected to a known method such as a gradient of ethyl acetate or other organic solvent: water, high performance liquid chromatography (HPLC), or ultra (high ) performance (UPLC) to isolate/purify the innovative steviol glycoside.

[0071] O teor do glicosídeo de esteviol inovador na planta pode ser determinado pelo método descrito em WO2016/090460 ou pelo método descrito no exemplo a seguir. Especificamente, o teor pode ser medido amostrando folhas frescas da planta da presente invenção e submetendo as folhas a LC-MS/MS. (2) Síntese química[0071] The content of the innovative steviol glycoside in the plant can be determined by the method described in WO2016/090460 or by the method described in the example below. Specifically, the content can be measured by sampling fresh leaves of the plant of the present invention and subjecting the leaves to LC-MS/MS. (2) Chemical synthesis

[0072] Um método para sintetizar o glicosídeo de esteviol da presente invenção será descrito em detalhes a seguir.[0072] A method for synthesizing the steviol glycoside of the present invention will be described in detail below.

[0073] Glicosídeos de esteviol têm estruturas nas quais diferentes frações de açúcar (glicose, ramnose, xilose, etc.) são afixadas ao aglicônio, isto é, esteviol, por meio de várias formas de ligação (posições e conformação de ligação). Portanto, um glicosídeo de esteviol de interesse pode ser obtido por meio de vários caminhos dependendo do material de partida selecionado. Versados na técnica aos quais a presente invenção diz respeito, entretanto, entenderiam que o tempo e o rendimento para obter o composto de interesse variam bastante dependendo dos caminhos sintéticos.[0073] Steviol glycosides have structures in which different sugar fractions (glucose, rhamnose, xylose, etc.) are affixed to the aglycon, ie steviol, through various forms of bonding (bond positions and conformation). Therefore, a steviol glycoside of interest can be obtained via various routes depending on the selected starting material. Skilled in the art to which the present invention pertains, however, would understand that the time and yield to obtain the compound of interest varies greatly depending on the synthetic paths.

[0074] Desta vez, os presentes inventores encontraram um método inovador para produzir um glicosídeo de esteviol da presente invenção com maior seletividade e maior rendimento por meio de um caminho sintético específico. De acordo com o método para sintetizar o glicosídeo de esteviol da presente invenção, um síntese química do glicosídeo de esteviol se dá separando o glicosídeo de esteviol em um “glicosídeo de esteviol” e uma “forma hemiacetal de açúcar” como mostrado no Esquema 1. Esquema 1: Método inovador para sintetizar glicosídeo de esteviol [0074] This time, the present inventors have found an innovative method to produce a steviol glycoside of the present invention with higher selectivity and higher yield through a specific synthetic pathway. According to the method for synthesizing steviol glycoside of the present invention, a chemical synthesis of steviol glycoside takes place by separating steviol glycoside into a "steviol glycoside" and a "sugar hemiacetal form" as shown in Scheme 1. Scheme 1: Innovative method to synthesize steviol glycoside

[0075] O glicosídeo de esteviol pode ser preparado por derivação de uma substância natural existente (rebaudiosídeo, dulcosídeo, esteviosídeo, biosídeo de esteviol, rubusosídeo, etc.). No entanto, a forma hemiacetal de açúcar pode ser preparada tanto a partir de uma substância natural existente quanto por uma síntese química. Os presentes inventores observaram que o glicosídeo de esteviol de interesse pode ser obtido com bom rendimento e β- seletividade extremamente alta condensando o glicosídeo de esteviol e a forma hemiacetal de açúcar através da reação de Mitsunobu.[0075] Steviol glycoside can be prepared by derivation of an existing natural substance (rebaudioside, dulcoside, stevioside, steviol bioside, rubusoside, etc.). However, the hemiacetal form of sugar can be prepared either from an existing natural substance or by chemical synthesis. The present inventors have observed that the steviol glycoside of interest can be obtained in good yield and extremely high β-selectivity by condensing the steviol glycoside and the hemiacetal form of sugar through the Mitsunobu reaction.

[0076] Em um aspecto da presente invenção, um método para produzir o composto representado pela Fórmula (1) é provido, onde o método compreende as etapas de: (A) sintetizar um composto representado pela Fórmula (3) a seguir: (em que, PGs cada qual independentemente representa um grupo protetor) de rebaudiosídeo C representado pela Fórmula (2) a seguir: ; e (B) sintetizar um composto representado pela Fórmula (4) a seguir (em que, PGs cada qual independentemente representa um grupo protetor) de um derivado de glicopiranosídeo.[0076] In one aspect of the present invention, a method for producing the compound represented by Formula (1) is provided, where the method comprises the steps of: (A) synthesizing a compound represented by Formula (3) below: (wherein, PGs each independently represent a protecting group) of rebaudioside C represented by Formula (2) below: ; and (B) synthesizing a compound represented by Formula (4) below (wherein, PGs each independently represent a protecting group) of a glycopyranoside derivative.

[0077] Em um outro aspecto da presente invenção, o método para produzir o composto representado pela Fórmula (1) é provido, em que o método compreende adicionalmente uma etapa de permitir reação entre o composto representado pela Fórmula (3) anterior e o composto representado pela Fórmula (4) anterior na presença de um reagente de fosfina e um composto azo para obter um composto representado pela Fórmula (5) a seguir (em que, PGs cada qual independentemente representa um grupo protetor).[0077] In another aspect of the present invention, the method for producing the compound represented by Formula (1) is provided, wherein the method further comprises a step of allowing reaction between the compound represented by Formula (3) above and the compound represented by Formula (4) above in the presence of a phosphine reagent and an azo compound to obtain a compound represented by Formula (5) below (wherein, PGs each independently represent a protecting group).

[0078] Aqui, exemplos do grupo protetor incluem um grupo protetor acila, um grupo silila trissubstituído, um grupo protetor acetal e um grupo protetor éter. Exemplos preferíveis incluem um grupo silila trissubstituído (um grupo trimetilsilila, um grupo trietilsilila, um grupo t-butildimetilsilila, etc.) e um grupo protetor acila (um grupo acetila, um grupo benzoíla, etc.). (A) Primeira etapa (síntese de glicosídeo de esteviol)[0078] Here, examples of the protecting group include an acyl protecting group, a trisubstituted silyl group, an acetal protecting group and an ether protecting group. Preferable examples include a trisubstituted silyl group (a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a t-butyldimethylsilyl group, etc.) and an acyl protecting group (an acetyl group, a benzoyl group, etc.). (A) First step (steviol glycoside synthesis)

[0079] Um glicosídeo de esteviol pode ser obtido, por exemplo, seguindo o Esquema 2 a seguir usando rebaudiosídeo de ocorrência natural C (dulcosídeo B) como uma matéria-prima. Esquema 2: Síntese de glicosídeo de esteviol Rebaudiosídeo C (1) 2 Glicosídeo de esteviol (3)[0079] A steviol glycoside can be obtained, for example, by following Scheme 2 below using naturally occurring rebaudioside C (dulcoside B) as a starting material. Scheme 2: Synthesis of steviol glycoside Rebaudioside C (1) 2 Steviol Glycoside (3)

[0080] Primeiramente, rebaudiosídeo C é dissolvido em um solvente tais como metanol e água, adicionado com uma base forte tal como hidróxido de sódio, e refluxado a 60°C-120°C por 2 horas ou mais de maneira tal que a molécula de glicose é removida de C-19 de rebaudiosídeo C para dar o Composto 2 anteriormente. Assim procedendo, o solvente pode ser evaporado após neutralização da solução da reação com uma resina de troca catiônica ou similares.[0080] First, rebaudioside C is dissolved in a solvent such as methanol and water, added with a strong base such as sodium hydroxide, and refluxed at 60°C-120°C for 2 hours or more so that the molecule of glucose is removed from C-19 of rebaudioside C to give Compound 2 above. By so doing, the solvent can be evaporated after neutralizing the reaction solution with a cation exchange resin or the like.

[0081] O Composto 2 é dissolvido adicionalmente em um solvente tal como piridina, e adicionado com anidrido acético ou similares para proteger os grupos hidroxila contidos no Composto 2, por meio disso obtendo o Composto 3.[0081] Compound 2 is further dissolved in a solvent such as pyridine, and added with acetic anhydride or the like to protect the hydroxyl groups contained in Compound 2, thereby obtaining Compound 3.

[0082] (B) Segunda etapa (síntese de trissacarídeo hemiacetal) O trissacarídeo hemiacetal pode ser obtido, por exemplo, seguindo o Esquema 3 a seguir usando um derivado de glicopiranosídeo comercialmente disponível como uma matéria-prima. Esquema 3: Síntese de forma hemiacetal de trissacarídeo [0082] (B) Second step (hemiacetal trisaccharide synthesis) The hemiacetal trisaccharide can be obtained, for example, by following Scheme 3 below using a commercially available glycopyranoside derivative as a starting material. Scheme 3: Synthesis of the hemiacetal form of trisaccharide

[0083] Primeiramente, 4-metoxifenil β-D-glicopiranosideo (4) é dissolvido em um solvente tal como acetonitrila, adicionado com dimetil acetal benzaldeído e ácido canforsulfônico (catalisador ácido), e agitado a 25°C-80°C por 2 horas ou mais para dar o Composto 5. Subsequentemente, o Composto 5, 2,2,2-tricloroacetimidato de 2,3,4,6-tetra-O-acetil-β-D- glicosipiranosila(6) e peneiras moleculares 4Â são dissolvidos em um solvente tal como diclorometano, adicionados com trifluormetanossulfonato de trimetililsilila a uma baixa temperatura (por exemplo, 0°C), e agitados à temperatura ambiente por 2 horas ou mais para dar o Composto 7.[0083] First, 4-methoxyphenyl β-D-glucopyranoside (4) is dissolved in a solvent such as acetonitrile, added with dimethyl acetal benzaldehyde and camphorsulfonic acid (acid catalyst), and stirred at 25°C-80°C for 2 hours or more to give Compound 5. Subsequently, Compound 5, 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glycosypyranosyl(6) 2,2,2-trichloroacetimidate and 4A molecular sieves are dissolved in a solvent such as dichloromethane, added with trimethylylsilyl trifluoromethanesulfonate at a low temperature (e.g. 0°C), and stirred at room temperature for 2 hours or longer to give Compound 7.

[0084] O Composto 7 é dissolvido em um solvente tal como etanol, adicionado com ácido P-toluenossulfônico à temperatura ambiente, agitado a 60°C-80°C por 2 horas ou mais para completar a reação, então neutralizado com trietilamina, e concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante é dissolvido em um solvente tal como piridina, e adicionado com anidrido acético ou similares para dar o Composto 8 com grupos hidroxila protegidos. O Composto 8 é dissolvido em acetonitrila e água, adicionado com um oxidante tal como nitrato de cério e amônio, e agitado por 5 minutos a 2 horas, por meio disso obtendo o Composto 9.[0084] Compound 7 is dissolved in a solvent such as ethanol, added with P-toluenesulfonic acid at room temperature, stirred at 60°C-80°C for 2 hours or more to complete the reaction, then neutralized with triethylamine, and concentrated under low pressure. The resulting syrup is dissolved in a solvent such as pyridine, and added with acetic anhydride or the like to give Compound 8 with protected hydroxyl groups. Compound 8 is dissolved in acetonitrile and water, added with an oxidant such as cerium ammonium nitrate, and stirred for 5 minutes to 2 hours, thereby obtaining Compound 9.

[0085] (C) Terceira etapa (Síntese do composto representado pela Fórmula (1)) O composto representado pela Fórmula (1) pode ser sintetizado, por exemplo, seguindo o Esquema 4 a seguir usando os Compostos 3 e 9 obtidos nas Etapas 1 e 2 anteriormente. Esquema 4: Síntese do composto representado pela Fórmula (1) (Composto 11) [0085] (C) Third step (Synthesis of the compound represented by Formula (1)) The compound represented by Formula (1) can be synthesized, for example, following Scheme 4 below using Compounds 3 and 9 obtained in Steps 1 and 2 previously. Scheme 4: Synthesis of the compound represented by Formula (1) (Compound 11)

[0086] Primeiramente, a forma hemiacetal de trissacarídeo e o glicosídeo de esteviol obtidos nas Etapas 1 e 2 são deixados passar pela reação de Mitsunobu de maneira tal que apenas o Composto 10 na forma β possa ser seletivamente obtido com rendimento muito alto (45% ou mais). Especificamente, adicionados com dimetilformamida) (TMAD) à temperatura ambiente, e agitados a 50°C-80°C por 2 horas ou mais para dar apenas o Composto 10 na forma β. Finalmente, os grupos protetores do composto 10 são desprotegidos para dar o composto representado pela Fórmula (1) (Composto 11).[0086] First, the trisaccharide hemiacetal form and the steviol glycoside obtained in Steps 1 and 2 are allowed to pass through the Mitsunobu reaction in such a way that only Compound 10 in the β form can be selectively obtained with very high yield (45% or more). Specifically, added with dimethylformamide) (TMAD) at room temperature, and stirred at 50°C-80°C for 2 hours or more to give only Compound 10 in β form. Finally, the protecting groups of compound 10 are deprotected to give the compound represented by Formula (1) (Compound 11).

(3) Biosynthesis

[0087] O glicosídeo de esteviol da presente invenção pode também ser gerado transferindo um polinucleotídeo que codifica para uma proteína predeterminada em uma célula hospedeira derivada de uma bactéria, uma planta, um inseto, um mamífero não humano ou similares, e usando esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose e/ou UDP-ramnose como um substrato. Esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose ou UDP-ramnose como o substrato podem ser tanto provido quanto biossintetizado na célula. Embora exemplos da proteína predeterminada incluam UGT85C2 derivado de estévia (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:2), UGT74G1 (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:4), UGT91D2 (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:6), UGT76G1 (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:8) e UDP-ramnose sintase AtRHM2 derivada de Arabidopsis thaliana (a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO:10), ela não está limitada a esses desde que ela tenha uma atividade equivalente.[0087] The steviol glycoside of the present invention can also be generated by transferring a polynucleotide encoding a predetermined protein into a host cell derived from a bacterium, a plant, an insect, a non-human mammal or the like, and using steviol, a steviol glycoside, UDP-glucose and/or UDP-rhamnose as a substrate. Steviol, a steviol glycoside, UDP-glucose or UDP-rhamnose as the substrate can either be supplied or biosynthesized in the cell. Although examples of the predetermined protein include stevia-derived UGT85C2 (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2), UGT74G1 (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4), UGT91D2 (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: :6), UGT76G1 (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:8) and UDP-rhamnose synthase AtRHM2 derived from Arabidopsis thaliana (the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:10), it is not limited to these since it has an equivalent activity.

[0088] A proteína supradescrita é uma enzima derivada de Arabidopsis thaliana ou estévia, que espera-se seja altamente ativa em um ambiente fora das células de planta tais como Arabidopsis thaliana e estévia (por exemplo, em um ambiente extracelular, ou dentro de uma célula hospedeira sem ser estévia). Neste caso, o polinucleotídeo que codifica a proteína supradescrita (por exemplo, gene UGT85C2 é representado por SEQ ID NO:1, gene UGT74G1 é representado por SEQ ID NO:3, UGT91D2 gene é representado por SEQ ID NO:5, gene UGT76G1 é representado por SEQ ID NO:7 e gene AtRHM2 é representado por SEQ ID NO:9) é transferido para uma célula hospedeira derivada de uma bactéria, um fungo, uma planta, um inseto ou um mamífero não humano de maneira a permitir expressão da proteína da presente invenção, na qual esteviol, um glicosídeo de esteviol, UDP-glicose ou UDP-ramnose como o substrato é provido para gerar o composto da presente invenção. Alternativamente, dependendo do hospedeiro, a proteína supradescrita é expressa na célula hospedeira, na qual um substrato apropriado é provido para gerar o composto da presente invenção.[0088] The above-described protein is an enzyme derived from Arabidopsis thaliana or stevia, which is expected to be highly active in an environment outside of plant cells such as Arabidopsis thaliana and stevia (e.g., in an extracellular environment, or within a non-stevia host cell). In this case, the polynucleotide encoding the above-described protein (e.g., UGT85C2 gene is represented by SEQ ID NO:1, UGT74G1 gene is represented by SEQ ID NO:3, UGT91D2 gene is represented by SEQ ID NO:5, UGT76G1 gene is represented by SEQ ID NO:7 and AtRHM2 gene is represented by SEQ ID NO:9) is transferred into a host cell derived from a bacterium, a fungus, a plant, an insect or a non-human mammal in order to allow expression of the protein of the present invention, in which steviol, a steviol glycoside, UDP-glucose or UDP-rhamnose as the substrate is provided to generate the compound of the present invention. Alternatively, depending on the host, the above-described protein is expressed in the host cell, in which an appropriate substrate is provided to generate the compound of the present invention.

[0089] Em um aspecto da presente invenção, um método para produzir o glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção é provido, onde o método é caracterizado por uso de um transformante não humano que foi introduzido com pelo menos um dos polinucleotídeos (a) a (g) a seguir.[0089] In one aspect of the present invention, a method for producing the innovative steviol glycoside of the present invention is provided, wherein the method is characterized by use of a non-human transformant that has been introduced with at least one of the polynucleotides (a) to (g) next.

[0090] (a) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 e que tem uma atividade de adicionar glicose ao grupo hidroxila em C13 do glicosídeo de esteviol.[0090] (a) A polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1, or a polynucleotide encoding for a protein that has 90% or greater identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 and that has an activity to add glucose to the C13 hydroxyl group of steviol glycoside.

[0091] (b) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:3, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e que tem uma atividade de adicionar glicose ao ácido carboxílico em C-19 do glicosídeo de esteviol.[0091] (b) A polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:3, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:3, or a polynucleotide encoding for a protein that has 90% or greater identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:4 and that has an activity to add glucose to the C-19 carboxylic acid of steviol glycoside.

[0092] (c) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adicionar ramnose a glicose afixada a C-13 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1^2.[0092] (c) A polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5, or a polynucleotide encoding for a protein that has 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:6 and that has an activity of adding rhamnose to glucose attached to C-13 of steviol glycoside via a 1^2 linkage.

[0093] (d) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adicionar glicose a C-3 da glicose em C-13 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1^3.[0093] (d) A polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7, or a polynucleotide encoding for a protein that has 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:8 and that has an activity to add glucose to C-3 of glucose to C-13 of steviol glycoside via a 1^ bond 3.

[0094] (e) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 e que tem uma atividade de adicionar glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1 ^2.[0094] (e) A polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:5, or a polynucleotide encoding for a protein that has 90% or greater identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:6 and that has an activity to add glucose to the C-19 glucose of steviol glycoside via a 1^2 linkage.

[0095] (f) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:8 e que tem uma atividade de adicionar glicose à glicose em C-19 do glicosídeo de esteviol por meio de uma ligação 1^3.[0095] (f) A polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:7, or a polynucleotide encoding for a protein that has 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:8 and that has an activity to add glucose to the C-19 glucose of steviol glycoside via a 1^3 bond.

[0096] (g) Um polinucleotídeo contendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:9, um polinucleotídeo contendo uma sequência de nucleotídeos tendo 90% ou mais identidade com a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:9, ou um polinucleotídeo que codifica para uma proteína que tem 90% ou mais identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:10 e que tem uma atividade de gerar UDP-ramnose a partir de UDP- glicose. Em um aspecto preferível da presente invenção, podem ser usados polinucleotídeos independentemente tendo 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% ou mais, 99,3% ou mais, 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7% ou mais, 99,8% ou mais, ou 99,9% ou mais identidade de sequência com as sequências de nucleotídeos dos números de sequência mencionados em (a) a (g) anteriormente.[0096] (g) A polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO:9, a polynucleotide containing a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:9, or a polynucleotide encoding for a protein that has 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:10 and that has an activity to generate UDP-rhamnose from UDP-glucose. In a preferred aspect of the present invention, polynucleotides independently having 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98 % or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more , 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more sequence identity with the nucleotide sequences of the sequence numbers mentioned in (a) to (g) above.

[0097] Em um outro aspecto preferível da presente invenção, podem ser usadas proteínas que têm independentemente uma sequência de aminoácidos tendo 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, 99,1% ou mais, 99,2% ou mais, 99,3% ou mais, 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, 99,6% ou mais, 99,7% ou mais, 99,8% ou mais, ou 99,9% ou mais identidade de sequência com as sequências de aminoácidos do número de sequência mencionado em (a) a (g) anteriores e que tem a atividade predeterminada descrita em (a) a (g) anteriormente.[0097] In another preferred aspect of the present invention, proteins may be used which independently have an amino acid sequence having 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96 % or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5 % or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more sequence identity with the amino acid sequences of the sequence number mentioned in (a) to (g) above and which has the predetermined activity described in (a) to (g) above.

[0098] Preferivelmente, um polinucleotídeo que codifica a proteína supradescrita é introduzido em um hospedeiro sendo ao mesmo tempo inserido em um vetor de expressão apropriado. Os polinucleotídeos podem individualmente ser inseridos em vetores separados.[0098] Preferably, a polynucleotide encoding the above-described protein is introduced into a host while being inserted into an appropriate expression vector. Polynucleotides can individually be inserted into separate vectors.

[0099] Um vetor de expressão apropriado é geralmente produzido para conter: (i) um promotor que permite transcrição na célula hospedeira; (ii) um polinucleotídeo da presente invenção ligado ao dito promotor; e (iii) um cassete expressão que é envolvido em terminação de transcrição e poliadenilação de moléculas de RNA e que contém, como um componente dos mesmos, um sinal que funciona na célula hospedeira.[0099] An appropriate expression vector is generally produced to contain: (i) a promoter that allows transcription in the host cell; (ii) a polynucleotide of the present invention linked to said promoter; and (iii) an expression cassette which is involved in termination of transcription and polyadenylation of RNA molecules and which contains, as a component thereof, a signal which functions in the host cell.

[00100] Exemplos de um método para preparar um vetor de expressão incluem, mas particularmente não se limitando a um método que usa um plasmídeo, um fago, um cosmídeo ou similares, e moléculas de DNA tendo componentes necessários.[00100] Examples of a method for preparing an expression vector include, but particularly not limited to, a method using a plasmid, a phage, a cosmid or the like, and DNA molecules having necessary components.

[00101] O tipo do vetor não é particularmente limitado, e qualquer vetor que permita a expressão na célula hospedeira pode adequadamente ser selecionado. Especificamente, uma sequência promotora é adequadamente selecionada de acordo com o tipo da célula hospedeira para assegurar expressão do polinucleotídeo da presente invenção, e um vetor obtido integrando essa sequência promotora e o polinucleotídeo da presente invenção em um plasmídeo ou similares é usado como um vetor de expressão.[00101] The type of vector is not particularly limited, and any vector that allows expression in the host cell can suitably be selected. Specifically, a promoter sequence is suitably selected according to the host cell type to ensure expression of the polynucleotide of the present invention, and a vector obtained by integrating such a promoter sequence and the polynucleotide of the present invention into a plasmid or the like is used as a vector of expression.

[00102] O vetor de expressão da presente invenção inclui regiões de controle de expressão (por exemplo, um promotor, um terminador e/ou uma origem de replicação e similares) dependendo do tipo do hospedeiro no qual ele é introduzido. Um promotor usado em um vetor de expressão bacteriana pode ser um promotor comum (por exemplo, um promotor trc, um promotor tac, um promotor lac, etc.), um promotor usado para uma levedura pode ser, por exemplo, um promotor gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, promotor PH05, um promotor GAL1/10 ou similares, e um promotor para fungos filamentosos pode ser, por exemplo, amilase, trpC ou similares. Entretanto, exemplos de um promotor para expressar o gene de interesse em uma célula de planta incluem um promotor 35S RNA do vírus do mosaico da couve-flor, um promotor do gene rd29A, um promotor rbcS, e um promotor mac-1 nos quais a sequência intensificadora do promotor 35S RNA do vírus do mosaico da couve-flor é provido no terminal 5’ de uma sequência promotora de manopina sintase derivada de Agrobacterium. Um promotor para uma célula hospedeira animal pode ser um promotor viral (por exemplo, um promotor precoce SV40, um promotor tardio SV40 etc.). Exemplos de um promotor que é indutivamente ativado em resposta a estímulo externo incluem um promotor do vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), um promotor responsivo a tetraciclina, um promotor de metalotioneína e um promotor de proteína de choque térmico. Preferivelmente, o vetor de expressão contém pelo menos um marcador selecionável. Como um marcador como esse, um marcador autotrófico (LEU2, URA3, HIS3, TRP1, ura5, niaD), um marcador de resistência a fármaco (higromicina, zeocina), um gene de resistência a geneticina (G418r), um gene de resistência a cobre (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984), um gene de resistência a cerulenina (fas2m, PDR4) (Junji Inokoshi et al., Journal of Japanese Biochemical Society, vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991, respectivamente) ou similares podem ser usados.[00102] The expression vector of the present invention includes expression control regions (for example, a promoter, a terminator and/or an origin of replication and the like) depending on the type of host into which it is introduced. A promoter used in a bacterial expression vector can be a common promoter (for example, a trc promoter, a tac promoter, a lac promoter, etc.), a promoter used for a yeast can be, for example, a glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase, PH05 promoter, a GAL1/10 promoter or the like, and a promoter for filamentous fungi may be, for example, amylase, trpC or the like. However, examples of a promoter for expressing the gene of interest in a plant cell include a cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, an rd29A gene promoter, an rbcS promoter, and a mac-1 promoter in which the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter enhancer sequence is provided at the 5' end of an Agrobacterium-derived mannopine synthase promoter sequence. A promoter for an animal host cell can be a viral promoter (e.g., an SV40 early promoter, an SV40 late promoter, etc.). Examples of a promoter that is inductively activated in response to an external stimulus include a mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, a tetracycline-responsive promoter, a metallothionein promoter, and a heat shock protein promoter. Preferably, the expression vector contains at least one selectable marker. Such a marker, an autotrophic marker (LEU2, URA3, HIS3, TRP1, ura5, niaD), a drug resistance marker (hygromycin, zeocin), a geneticin resistance gene (G418r), a resistance gene copper (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 81, p. 337, 1984), a cerulenin resistance gene (fas2m, PDR4) (Junji Inokoshi et al., Journal of Japanese Biochemical Society, vol.64, p.660, 1992; Hussain et al., Gene, vol.101, p.149, 1991, respectively) or the like can be used.

[00103] Como um método para transformar uma célula hospedeira, um método conhecido geralmente empregado pode ser empregado. Por exemplo, um método de eletroporação (Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000), um método de distribuição de partícula (Relatório Descritivo de Patente não Examinado japonês No. 2005287403), um método de esferoplasto (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978), um método de acetato de lítio (J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983), um método descrito em Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, ou similares podem ser realizados embora a presente invenção não esteja limitada a isso.[00103] As a method for transforming a host cell, a generally employed known method can be employed. For example, an electroporation method (Mackenxie, D.A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000), a particle distribution method (Japanese Unexamined Patent Specification No. 2005287403), a spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978), a lithium acetate method (J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983 ), a method described in Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, or the like can be performed although the present invention is not limited thereto.

[00104] Além do mais, como para processos biológicos moleculares gerais, vide “Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”, “Methods in Yeast Genetics, manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)” e similares.[00104] Furthermore, as for general molecular biological processes, see “Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”, “Methods in Yeast Genetics, manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)” and the like.

[00105] Um transformante não humano obtido como descrito anteriormente pode ser cultivado de maneira a permitir que o transformante não humano produza um glicosídeo de esteviol. Um transformante não humano como esse é preferivelmente uma levedura. Entretanto, o transformante não humano é preferivelmente cultivado em um meio contendo esteviol. O glicosídeo de esteviol acumulado pode ser extraído/purificado para obter o glicosídeo de esteviol da presente invenção.[00105] A non-human transformant obtained as described above can be cultured in such a way as to allow the non-human transformant to produce a steviol glycoside. Such a non-human transformant is preferably a yeast. However, the non-human transformant is preferably grown in a medium containing steviol. The accumulated steviol glycoside can be extracted/purified to obtain the steviol glycoside of the present invention.

EXAMPLE [Innovative steviol glycoside isolation]

[00106] Extratos obtidos a partir das folhas de quatro linhagens de plantas de estévia inovadoras (Amostra 1 (EM3-4), Amostra 2 (EM2-27-8), Amostra 3 (EM2-27-15) e Amostra 4 (EM2-11)) desenvolvidos em Suntory Global Innovation Center (SIC) foram submetidos a espectrometria de massa (MS) por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para a análise de classificação do glicosídeo de esteviol contido com base no pesos moleculares de um glicosídeo de esteviol que teve uma cadeia de açúcar formada de D- glicopiranosil (glc), L-ramnopiranosila (rha) e xilopiranosila (xyl). Aqui, Amostra 1 é uma planta de alto Reb.C tendo um polimorfismo de genoma de A no tipo selvagem sendo alterado para T no 60o nucleotídeo da sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO:11 no genoma de uma planta de teste. Uma análise estatística da correlação dentre o fenótipo tendo uma alta concentração de RebC e o polimorfismo da SEQ ID NO:11 revelou que o dito polimorfismo teve uma correlação estatística com o fenótipo tendo uma alta concentração de RebC.[00106] Extracts obtained from the leaves of four strains of innovative stevia plants (Sample 1 (EM3-4), Sample 2 (EM2-27-8), Sample 3 (EM2-27-15) and Sample 4 (EM2 -11)) developed at Suntory Global Innovation Center (SIC) were subjected to high performance liquid chromatography (HPLC) mass spectrometry (HPLC) for the classification analysis of the contained steviol glycoside based on the molecular weights of a steviol glycoside. steviol which had a sugar chain made up of D-glucopyranosyl (glc), L-rhamnopyranosyl (rha) and xylopyranosyl (xyl). Here, Sample 1 is a high Reb.C plant having a genome polymorphism of A in wild type being changed to T at the 60th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:11 in the genome of a test plant. A statistical analysis of the correlation between the phenotype having a high concentration of RebC and the polymorphism of SEQ ID NO:11 revealed that said polymorphism had a statistical correlation with the phenotype having a high concentration of RebC.

[00107] Um processo para preparar um líquido de teste foi como a seguir: 10,0 mg cada qual das folhas de estévia secas liofilizada foram pesados em um frasco de vidro, no qual 1,0 mL de água/metanol (1/1 vol/vol) foi adicionado como um solvente de extração, e então o resultante foi submetido a irradiação ultrassônica em um limpador ultrassônico (AS ONE, AS52GTU) a um temperatura definida de 25°C por 20 minutos, por meio disso obtendo um extrato líquido de um glicosídeo de esteviol das folhas de estévia. O resultante foi adicionalmente 10 vezes diluído com água/metanol e filtrado através de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm (Nacalai tesque, filtro S Cosmonice (solvente)) antes de ser submetido a HPLC-MS.[00107] A process for preparing a test liquid was as follows: 10.0 mg each of freeze-dried dried stevia leaves were weighed into a glass vial, in which 1.0 mL of water/methanol (1/1 vol/vol) was added as an extraction solvent, and then the resultant was subjected to ultrasonic irradiation in an ultrasonic cleaner (AS ONE, AS52GTU) at a defined temperature of 25°C for 20 minutes, thereby obtaining a liquid extract of a steviol glycoside from stevia leaves. The resultant was further diluted 10 times with water/methanol and filtered through a filter with a pore size of 0.45 µm (Nacalai tesque, S Cosmonice filter (solvent)) before being subjected to HPLC-MS.

[00108] Para HPLC, parte de HPLC-MS, Nexera LC-30AD (Shimadzu Corporation) foi usada como uma bomba de LC de unidade de distribuição de líquido, e SM-C18 (4,6x 250 mm) (da Imtakt) como uma coluna de separação. Distribuição de líquido da fase móvel LC foi realizada usando água Milli-Q contendo ácido acético 0,2% como fase móvel A e metanol como fase móvel B, em que o gradiente binário foi de maneira tal que a concentração da fase móvel B fosse constantemente mantida a 10% por 0-5 minutos, a concentração da fase móvel B foi deslocada de 10% a 70% nos 15 minutos seguintes, então de 70% a 100% nos 5 minutos seguintes, e finalmente terminou mantendo a concentração da fase móvel B a 100% por 5 minutos. A vazão da fase móvel foi 0,4 mL/min, e o extrato líquido de folha de estévia diluído e filtrado com um filtro foi injetado por 5 μL.[00108] For HPLC, part of HPLC-MS, Nexera LC-30AD (Shimadzu Corporation) was used as a liquid distribution unit LC pump, and SM-C18 (4.6x 250 mm) (from Imtakt) as a separation column. Liquid distribution of the LC mobile phase was performed using Milli-Q water containing 0.2% acetic acid as mobile phase A and methanol as mobile phase B, wherein the binary gradient was such that the concentration of mobile phase B was constantly held at 10% for 0-5 minutes, the concentration of mobile phase B was shifted from 10% to 70% over the next 15 minutes, then from 70% to 100% over the next 5 minutes, and finally ended up maintaining the mobile phase concentration B at 100% for 5 minutes. The flow rate of the mobile phase was 0.4 mL/min, and the diluted and filter-filtered liquid stevia leaf extract was injected by 5 μL.

[00109] Para a parte de MS, foi usado espectrômetro de massa triplo quadrupolo LCMS-8030 (Shimadzu Corporation) equipado com uma fonte de íon de ionização por eletropulverização (ESI). A medição de espectrometria de massa foi realizada em um modo de monitoramento do íon selecionado (SIM) selecionando o modo de medição de íon negativo e os valores m/z. Os valores m/z foram selecionados por cálculo com base nos pesos moleculares de um glicosídeo de esteviol que teve uma cadeia de açúcar formada de D- glicopiranosil (glc), L-ramnopiranosila (rha) e xilopiranosila (xyl). Dessa maneira, m/z = 641,2 (glc (2)), 773,2 (glc (2), xila (1)), 787,2 (glc (2), rha (1)), 803,2 (glc (3)), 935,3 (glc (3), xila (1)), 949,3 (glc (3), rha (1)), 965,3 (glc (4)), 1.095,4 (glc (3), rha (2)), 1.097,4 (glc (4), xila (1)), 1.111,4 (glc (4), rha (1)), 1.127,4 (glc (5)), 1.257,5 (glc (4), rha (2)), 1.259,5 (glc (5), xila (1)), 1.273,5 (glc (5), rha (1)), 1.289,5 (glc (6)), 1.435,6 (glc (6), rha (1)) foram selecionados. Além do mais, um reagente de alta pureza disponível, rebaudiosídeos A, B, D, F, M, N e O, esteviosídeo, e dulcosídeos A e B foram também medidos nas mesmas condições de maneira a confirmar os valores m/z de íon negativo e o tempo de retenção de HPLC. As áreas de pico (unidade arbitrária) dos glicosídeos de esteviol principalmente detectados são mostrados na Tabela 1. [Tabela 1] Tabela 1: Áreas de pico (unidade arbitrária) observadas por medição de STM em HPLC-MS [00109] For the MS part, a triple quadrupole mass spectrometer LCMS-8030 (Shimadzu Corporation) equipped with an electrospray ionization (ESI) ion source was used. The mass spectrometry measurement was performed in a selected ion monitoring mode (SIM) by selecting the negative ion measurement mode and m/z values. The m/z values were selected by calculation based on the molecular weights of a steviol glycoside that had a sugar chain formed from D-glucopyranosyl (glc), L-rhamnopyranosyl (rha) and xylopyranosyl (xyl). In this way, m/z = 641.2 (glc (2)), 773.2 (glc (2), xyla (1)), 787.2 (glc (2), rha (1)), 803.2 (glc (3)), 935.3 (glc (3), xyl (1)), 949.3 (glc (3), rha (1)), 965.3 (glc (4)), 1095.4 (glc (3), rha (2)), 1097.4 (glc (4), xylan (1)), 1111.4 (glc (4), rha (1)), 1127.4 (glc (5) ), 1257.5 (glc (4), rha (2)), 1259.5 (glc (5), xyla (1)), 1273.5 (glc (5), rha (1)), 1289.5 (glc(6)), 1435.6(glc(6), rha(1)) were selected. Furthermore, a high purity reagent available, rebaudiosides A, B, D, F, M, N and O, stevioside, and dulcosides A and B were also measured under the same conditions in order to confirm the ion m/z values. negative and the HPLC retention time. The peak areas (arbitrary unit) of the mostly detected steviol glycosides are shown in Table 1. [Table 1] Table 1: Peak areas (arbitrary unit) observed by STM measurement in HPLC-MS

[00110] Dois picos foram observados no cromatograma de íons selecionado do glicosídeo de esteviol (m/z 1.273,5) nos quais a cadeia de açúcar modificado conteve cinco frações de glicose (glc) e uma fração de ramnose (rha). O cromatograma de íons selecionado da Amostra 1(EM3-4) a m/z de 1.273,5 é mostrado na Figura 1.[00110] Two peaks were observed in the selected ion chromatogram of steviol glycoside (m/z 1273.5) in which the modified sugar chain contained five fractions of glucose (glc) and one fraction of rhamnose (rha). The selected ion chromatogram of Sample 1(EM3-4) at m/z of 1273.5 is shown in Figure 1.

[00111] Dos dois picos mostrados na Figura 2, o pico visto no tempo de retenção (Rt) de 28,23 minutos corresponde a amostra padrão de rebaudiosídeo N em termos do valor de massa e do tempo de retenção. No entanto, não foi ainda reportado nenhum glicosídeo de esteviol com uma massa equivalente à do rebaudiosídeo N. Dessa maneira, o pico a Rt 27,73 minutos dos dois picos mostrados na Figura 2 foi considerado de uma substância desconhecida. Para Amostra 4 cujo teor de rebaudiosídeo C foi menor que o teor de rebaudiosídeo A e cujo alongamento da cadeia de açúcar foi menor que outras amostras, o valor do pico a Rt 27.73 foi menor que o limite de detecção.[00111] Of the two peaks shown in Figure 2, the peak seen at the retention time (Rt) of 28.23 minutes corresponds to the standard sample of rebaudioside N in terms of mass value and retention time. However, no steviol glycoside with a mass equivalent to that of rebaudioside N has yet been reported. Therefore, the peak at Rt 27.73 minutes of the two peaks shown in Figure 2 was considered to be from an unknown substance. For Sample 4 whose rebaudioside C content was less than the rebaudioside A content and whose sugar chain elongation was less than other samples, the peak value at Rt 27.73 was less than the limit of detection.

[Breakthrough Steviol Glycoside Structural Analysis]

[00112] De acordo com a presente invenção, uma análise estrutural do glicosídeo de esteviol inovador detectado em um cultivar com alto teor de rebaudiosídeo C foi realizada como a seguir. (i) dedução estrutural por uma análise de fragmentação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)-espectrometria de massa de alta resolução (MS) e MS/MS, e fragmentação iônica de três estágios (fragmentação MS3), (ii) síntese química do produto padrão de glicosídeo de esteviol deduzido por meio de reação química, (iii) confirmação estrutural pela correspondência com o produto padrão quimicamente sintetizado com relação ao tempo de retenção e o padrão fragmentado de HPLC-MS de alta resolução e fragmentação MS3[00112] According to the present invention, a structural analysis of the innovative steviol glycoside detected in a cultivar with high content of rebaudioside C was performed as follows. (i) structural deduction by a fragmentation analysis through high performance liquid chromatography (HPLC)-high resolution mass spectrometry (MS) and MS/MS, and three-stage ion fragmentation (fragmentation MS3), (ii) synthesis chemistry of the steviol glycoside standard product deduced via chemical reaction, (iii) structural confirmation by matching the chemically synthesized standard product with respect to retention time and fragmented pattern from high resolution HPLC-MS and MS3 fragmentation

[00113] Em seguida, cada qual das Etapas (i)-(iii) anteriores será descrita em detalhes.[00113] Next, each of the previous Steps (i)-(iii) will be described in detail.

[00114] (i) Dedução estrutural por uma análise de fragmentação através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)-espectrometria de massa de alta resolução (MS) e MS/MS, e fragmentação iônica de três estágios (fragmentação MS3) Um processo para preparação de líquidos de teste foi como a seguir: 10,0 mg cada qual de folhas de estévia secas liofilizadas foi pesada em um frasco de vidro, no qual 1,0 mL de água/metanol (1/1 vol/vol) foi adicionado como um solvente de extração, e então o resultante foi submetido a irradiação ultrassônica em um limpador ultrassônico (AS ONE, AS52GTU) a uma temperatura definida de 25°C por 20 minutos, por meio disso obtendo o extrato líquido de um glicosídeo de esteviol das folhas de estévia. O resultante foi adicionalmente 10 vezes diluído com água/metanol e filtrado através de um filtro com um tamanho de poro de 0,45 μm (Nacalai tesque, filtro S Cosmonice (solvente)) antes de ser submetido a HPLC-MS.[00114] (i) Structural deduction by a fragmentation analysis through high-performance liquid chromatography (HPLC)-high-resolution mass spectrometry (MS) and MS/MS, and three-stage ion fragmentation (fragmentation MS3) A process for preparation of test liquids was as follows: 10.0 mg each of freeze-dried dried stevia leaves was weighed into a glass vial, into which 1.0 mL of water/methanol (1/1 vol/vol) was added. added as an extraction solvent, and then the resultant was subjected to ultrasonic irradiation in an ultrasonic cleaner (AS ONE, AS52GTU) at a defined temperature of 25°C for 20 minutes, thereby obtaining the liquid extract of a steviol glycoside of stevia leaves. The resultant was further diluted 10 times with water/methanol and filtered through a filter with a pore size of 0.45 µm (Nacalai tesque, S Cosmonice filter (solvent)) before being subjected to HPLC-MS.

[00115] Em uma configuração de equipamento para cromatografia líquida de alto desempenho- ionização por eletropulverização-espectrometria de massa precisa (HPLC-ESI-HRMS), equipamento para HPLC foi configurado usando Prominence LC-20AD (Shimadzu Corporation) como uma bomba de LC de unidade de distribuição de líquido e SM-C18 (4,6x 250 mm) (da Imtakt) como uma coluna de separação. A fase móvel LC foi distribuída usando água Milli-Q contendo ácido acético 0,2% como fase móvel A e metanol como fase móvel B, em que o gradiente binário foi de maneira tal que a concentração da fase móvel B fosse constantemente mantida a 10% por 0-5 minutos, a concentração da fase móvel B foi deslocada de 10% a 70% nos 15 minutos seguintes, e adicionalmente de 70% a 100% nos 5 minutos seguintes. Finalmente, a concentração da fase móvel B foi mantida a 100% por 5 minutos até o fim. A vazão da fase móvel foi 0,4 mL/min, e o extrato líquido de folha de estévia diluído e subsequentemente filtrado com um filtro foi injetado por 5 μL. Para a parte de espectrometria de massa, Orbitrap Elite MS (da Thermo Fisher Scientific) equipada com uma fonte de íon ESI foi usado. A medição de espectrometria de massa foi realizada em um modo de medição de íon negativo a m/z em uma faixa de 150-2.000 com resolução definida a 60.000. A medição de MS/MS foi realizada selecionando o m/z alvejado de 1.273,5 e em um modo CID em que fragmentação foi induzida por colisão com um gás inerte. Irradiação de energia exigida para fragmentação foi realizada a uma energia de colisão padrão exclusiva para o aparelho, isto é, 35.[00115] In an equipment configuration for high performance liquid chromatography- electrospray ionization-precise mass spectrometry (HPLC-ESI-HRMS), equipment for HPLC was configured using Prominence LC-20AD (Shimadzu Corporation) as an LC pump as a liquid distribution unit and SM-C18 (4.6x 250 mm) (from Imtakt) as a separation column. The LC mobile phase was distributed using Milli-Q water containing 0.2% acetic acid as mobile phase A and methanol as mobile phase B, where the binary gradient was such that the concentration of mobile phase B was constantly maintained at 10 % for 0-5 minutes, the concentration of mobile phase B was shifted from 10% to 70% over the next 15 minutes, and further from 70% to 100% over the next 5 minutes. Finally, the concentration of mobile phase B was maintained at 100% for 5 minutes until the end. The mobile phase flow rate was 0.4 mL/min, and the liquid stevia leaf extract diluted and subsequently filtered with a filter was injected by 5 μL. For the mass spectrometry part, Orbitrap Elite MS (from Thermo Fisher Scientific) equipped with an ESI ion source was used. The mass spectrometry measurement was performed in a negative ion measurement mode at m/z over a range of 150-2000 with resolution set to 60,000. The MS/MS measurement was performed by selecting the target m/z of 1273.5 and in a CID mode in which fragmentation was induced by collision with an inert gas. Energy irradiation required for fragmentation was performed at a default collision energy unique to the apparatus, i.e. 35.

[00116] A fim de estudar o padrão fragmentado do glicosídeo de esteviol inovador, rebaudiosídeos A, D e M de amostras padrões com estruturas conhecidas foram submetidos a análises padrões de MS/MS e fragmentação MS3. Em decorrência disso, MS/MS do glicosídeo de esteviol inovador deu dados mostrando que a intensidade de íon mais alta apareceu no pico onde toda a cadeia de açúcar afixada a C-19 por meio de uma união de éster foi liberada. Esse resultado mostra o peso molecular total da cadeia de açúcar afixada ao carbono de C-19 por meio de uma união de éster.[00116] In order to study the fragmented pattern of the innovative steviol glycoside, rebaudiosides A, D and M from standard samples with known structures were subjected to standard MS/MS analyzes and MS3 fragmentation. As a result, MS/MS of the innovative steviol glycoside gave data showing that the highest ion intensity appeared at the peak where the entire sugar chain attached to C-19 via an ester linkage was released. This result shows the total molecular weight of the sugar chain attached to the C-19 carbon via an ester linkage.

[00117] Os espectros de massa fragmentados MS/MS e MS3 de rebaudiosídeo N e o glicosídeo de esteviol inovador são mostrados na Figura 3. Quando os espectros MS/MS de rebaudiosídeo N e o glicosídeo de esteviol inovador tendo o mesmo valor de MS foram comparados, rebaudiosídeo N teve o pico principal a m/z de 803,37 correspondendo à liberação de duas frações de glc e uma fração de rha. Por outro lado, no espectro MS/MS do glicosídeo de esteviol inovador, o pico principal foi detectado a m/z de 787,38 correspondendo à liberação de três frações de glc. A fim de adquirir informação estrutural adicional, um espectro MS3 foi adquirido fragmentando o pico principal a m/z de 787,4 obtido por MS/MS. Em decorrência disso, um espectro tendo o mesmo padrão de pico que o espectro do MS3 de rebaudiosídeo C (949,4^787,4^) foi adquirido. Dessa maneira, a cadeia de açúcar afixada a C-13 foi suposta ser mesma do rebaudiosídeo C. Considerando que as folhas de estévia desta amostra também contiveram rebaudiosídeo M, a estrutura da cadeia de açúcar afixada a C-19 do glicosídeo de esteviol inovador supostamente foi a mesma da estrutura de rebaudiosídeo M com base no potencial de biossíntese das folhas de estévia. A estrutura deduzida é mostrada na Figura 3.[00117] The MS/MS and MS3 fragmented mass spectra of rebaudioside N and the innovative steviol glycoside are shown in Figure 3. When the MS/MS spectra of rebaudioside N and the innovative steviol glycoside having the same MS value were compared, rebaudioside N had the main peak at m/z of 803.37 corresponding to the release of two fractions of glc and one fraction of rha. On the other hand, in the MS/MS spectrum of the innovative steviol glycoside, the main peak was detected at m/z of 787.38 corresponding to the release of three glc fractions. In order to acquire additional structural information, an MS3 spectrum was acquired by fragmenting the main peak at m/z of 787.4 obtained by MS/MS. As a result, a spectrum having the same peak pattern as the MS3 spectrum of rebaudioside C (949.4^787.4^) was acquired. Thus, the sugar chain attached to C-13 was assumed to be the same as that of rebaudioside C. Considering that the stevia leaves from this sample also contained rebaudioside M, the structure of the sugar chain attached to C-19 of the innovative steviol glycoside supposedly was the same as the structure of rebaudioside M based on the biosynthetic potential of stevia leaves. The deduced structure is shown in Figure 3.

[00118] (1) Esboço de caminhos sintéticos Esquema 5: Estratégia para sintetizar glicosídeo de esteviol inovador [00118] (1) Outline of synthetic pathways Scheme 5: Strategy to synthesize innovative steviol glycoside

[00119] Como pode ser percebido pelo Esquema 5, para a síntese do glicosídeo de esteviol inovador (11), o glicosídeo de esteviol (3) e a forma hemiacetal de trissacarídeo (9) foram condensados por meio da reação de Mitsunobu para obter a espinha dorsal do glicosídeo de esteviol inovador (11). Para síntese do glicosídeo de esteviol (3), uma substância natural conhecida, rebaudiosídeo C (1), foi comprada da Ark Pharm, a união de éster em C-19 de esteviol foi submetida a hidrólise alcalina e então os grupos hidroxila da cadeia de açúcar foram protegidos com grupos acetila (Ac) para obter o glicosídeo de esteviol (3). Para síntese da forma hemiacetal de trissacarídeo (9), uma espinha dorsal de trissacarídeo foi produzida por reação de condensação dentre o aceptor de glicose apropriadamente protegido (5) e o doador de glicose (6), e o grupo protetor no carbono anomérico da extremidade redutora foi desprotegido para dar a forma hemiacetal de trissacarídeo (9). O glicosídeo de esteviol resultante (3) e a forma hemiacetal de trissacarídeo (9) foram submetidos a condensação por meio da reação de Mitsunobu, em que uma reação com β-seletividade boa e completa de 47% (apenas a forma β) se deu. Os grupos protetores do composto resultante foram desprotegidos, por meio disso obtendo o glicosídeo de esteviol inovador (11).[00119] As can be seen from Scheme 5, for the synthesis of the innovative steviol glycoside (11), the steviol glycoside (3) and the hemiacetal form of trisaccharide (9) were condensed using the Mitsunobu reaction to obtain the backbone of the groundbreaking steviol glycoside (11). For the synthesis of steviol glycoside (3), a known natural substance, rebaudioside C (1), was purchased from Ark Pharm, the C-19 ester linkage of steviol was subjected to alkaline hydrolysis and then the hydroxyl groups of the steviol chain sugar were protected with acetyl groups (Ac) to obtain steviol glycoside (3). For synthesis of the hemiacetal form of trisaccharide (9), a trisaccharide backbone was produced by condensation reaction between the appropriately protected glucose acceptor (5) and the glucose donor (6), and the protecting group on the end anomeric carbon reductant was deprotected to give the trisaccharide hemiacetal form (9). The resulting steviol glycoside (3) and the trisaccharide hemiacetal form (9) were subjected to condensation via the Mitsunobu reaction, in which a reaction with good and complete β-selectivity of 47% (only the β form) took place. . The protecting groups of the resulting compound were deprotected, thereby obtaining the innovative steviol glycoside (11).

[00120] Em seguida, cada qual das etapas da síntese será descrita.[00120] Next, each synthesis step will be described.

[00121] (2) Síntese de glicosídeo de esteviol Esquema 6: Síntese de glicosídeo de esteviol Rebaudiosídeo C (1) 2 Glicosídeo de esteviol (3)[00121] (2) Synthesis of steviol glycoside Scheme 6: Synthesis of steviol glycoside Rebaudioside C (1) 2 Steviol Glycoside (3)

[00122] Como pode ser percebido pelo Esquema 6, para síntese do glicosídeo de esteviol (3), rebaudiosídeo C (1) (1,0 g, 1,05 mmol) comprado da Ark Pharm foi dissolvido em metanol (10 mL) e água (10 mL), adicionado com 4 mol/L de hidróxido de sódio (2,6 mL, 10,5 mmol) à temperatura ambiente, e refluxado a 100°C por 20 horas. O término da reação foi confirmado por TLC (clorofórmio/metanol/água = 5/4/0,1, valor de Rf = 0,9) antes de a solução da reação ter sido neutralizada com forma de hidrogênio Dowex MAC-3 de resina de troca catiônica (SIGMA-ALDRICH) (pH 7). Após a resina ter sido removida por filtração, o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi seco por 18 horas usando uma bomba de vácuo para dar o Composto 2 (828 mg, quant.).[00122] As can be seen from Scheme 6, for synthesis of steviol glycoside (3), rebaudioside C (1) (1.0 g, 1.05 mmol) purchased from Ark Pharm was dissolved in methanol (10 mL) and water (10 mL), added with 4 mol/L sodium hydroxide (2.6 mL, 10.5 mmol) at room temperature, and refluxed at 100°C for 20 hours. Completion of the reaction was confirmed by TLC (chloroform/methanol/water = 5/4/0.1, Rf value = 0.9) before the reaction solution was neutralized with Dowex MAC-3 hydrogen form of resin of cationic exchange (SIGMA-ALDRICH) (pH 7). After the resin was removed by filtration, the resultant was concentrated under reduced pressure. The resulting syrup was dried for 18 hours using a vacuum pump to give Compound 2 (828 mg, quant.).

[00123] Composto 2 (828 mg, 1,05 mmol) foi dissolvido em piridina (20 mL), adicionado com anidrido acético (5 mL) à temperatura ambiente e agitado por 48 horas à temperatura ambiente. Após confirmar o término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor de Rf = 0,5), uma solução de hidrogenocarbonato de sódio saturada (5 mL) foi adicionada, e a solução da reação foi concentrada sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de sílica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 2/1) foi usado para dar o Composto 3 (1,1 g, 92%). [Composto 3] RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 0,81 (m, 2H), 0,83-1,45 (complexo, 19H), 1,39-1,91 (complexo, 24H), 1,91-2,35 (s, 30H), 3,58 (m, 1H), 3,71-3,81 (complexo, 4H), 3,95-4,12 (complexo, 7H), 4,34-4,46 (complexo, 3H), 4,56-4,66 (complexo, 4H), 4,69-4,92 (complexo, 7H), 5,055,14 (complexo, 5H), 5,23-5,38 (complexo, 6H), 5,45 (s, 1H); RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 15,9, 17,3, 19,1, 20,5, 20,7, 20,8, 20,9, 21,1, 21,5, 21,7, 29,1, 37,8, 38,0, 39,5, 40,7, 41,4, 42,2, 43,8, 48,4, 53,8, 56,8, 61,6, 63,0, 65,5, 66,8, 68,0, 68,6, 69,3, 69,6, 69,8, 70,5, 70,9, 71,6, 71,9, 72,4, 72,8, 73,9, 74,9, 81,3, 87,3, 96,6, 96,8, 99,2, 99,4, 125,4, 128,3, 129,1, 137,9, 151,9, 168,9, 169,2, 169,5, 169,6, 169,8, 170,1, 170,2, 170,3, 170,6, 170,9, 176,8, 183,4[00123] Compound 2 (828 mg, 1.05 mmol) was dissolved in pyridine (20 mL), added with acetic anhydride (5 mL) at room temperature and stirred for 48 hours at room temperature. After confirming completion of the reaction by TLC (ethyl acetate/hexane = 2/1, Rf value = 0.5), a saturated sodium hydrogencarbonate solution (5 mL) was added, and the reaction solution was concentrated under a low pressure. The resulting syrup was subjected to silica gel column chromatography and an eluate (ethyl acetate/hexane = 2/1) was used to give Compound 3 (1.1 g, 92%). [Compound 3] 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.81 (m, 2H), 0.83-1.45 (complex, 19H), 1.39-1.91 (complex, 24H), 1, 91-2.35 (s, 30H), 3.58 (m, 1H), 3.71-3.81 (complex, 4H), 3.95-4.12 (complex, 7H), 4.34- 4.46 (complex, 3H), 4.56-4.66 (complex, 4H), 4.69-4.92 (complex, 7H), 5.055.14 (complex, 5H), 5.23-5, 38 (complex, 6H), 5.45 (s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 15.9, 17.3, 19.1, 20.5, 20.7, 20.8, 20.9, 21.1, 21.5, 21.7, 29 .1, 37.8, 38.0, 39.5, 40.7, 41.4, 42.2, 43.8, 48.4, 53.8, 56.8, 61.6, 63.0 , 65.5, 66.8, 68.0, 68.6, 69.3, 69.6, 69.8, 70.5, 70.9, 71.6, 71.9, 72.4, 72 .8, 73.9, 74.9, 81.3, 87.3, 96.6, 96.8, 99.2, 99.4, 125.4, 128.3, 129.1, 137.9 , 151.9, 168.9, 169.2, 169.5, 169.6, 169.8, 170.1, 170.2, 170.3, 170.6, 170.9, 176.8, 183 ,4

[00124] (3) Síntese de forma hemiacetal de trissacarídeo Esquema 7: Síntese de forma hemiacetal de trissacarídeo [00124] (3) Synthesis of the hemiacetal form of trisaccharide Scheme 7: Synthesis of the hemiacetal form of trisaccharide

[00125] Como pode ser percebido pelo Esquema 7, para síntese da forma hemiacetal de trissacarídeo (9), 4-metoxifenil β-D-glicopiranosideo (4) (4,0 g, 13,9 mmol) comprado da Tokyo Chemical Industry foi dissolvido em acetonitrila (70 mL), adicionado com dimetil acetal benzaldeído (3,1 mL, 20,9 mmol) e ácido canforsulfônico (323 mg, 1,39 mmol) à temperatura ambiente, e agitado a 50°C por 18 horas. Após confirmar o término da reação por TLC (clorofórmio/metanol = 10/1, valor de Rf = 0,5), o resultante foi neutralizado com trietilamina (1 mL) (pH 8) e concentrado sob uma baixa pressão. O resíduo resultante foi cristalizado (etanol) para dar o Composto 5 (4,0 g, 77%). [Composto 5] RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 3,58 (m, 1H, H-5), 3,65 (t, 1H, H-4), 3,78 (m, 5H, H-2, H-6, OMe), 3,92 (t, 1H, H-3), 4,38 (dd, 1H, H-6’), 4,92 (d, J = 7,6 Hz, 1H, H-1), 5,57 (s, 1H, CHPh), 6,84 (dd, 4H, OMePh), 7,49 (m, 5H, Ph); RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 31,1, 55,8, 66,7, 68,8, 73,4, 74,6, 80,5, 102,2, 102,5, 114,8, 118,8, 126,4, 128,5, 129,5, 136,9, 150,9, 155,9[00125] As can be seen from Scheme 7, for synthesis of the hemiacetal form of trisaccharide (9), 4-methoxyphenyl β-D-glucopyranoside (4) (4.0 g, 13.9 mmol) purchased from Tokyo Chemical Industry was dissolved in acetonitrile (70 mL), added with benzaldehyde dimethyl acetal (3.1 mL, 20.9 mmol) and camphorsulfonic acid (323 mg, 1.39 mmol) at room temperature, and stirred at 50°C for 18 hours. After confirming completion of the reaction by TLC (chloroform/methanol = 10/1, Rf value = 0.5), the resultant was neutralized with triethylamine (1 mL) (pH 8) and concentrated under reduced pressure. The resulting residue was crystallized (ethanol) to give Compound 5 (4.0 g, 77%). [Compound 5] 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 3.58 (m, 1H, H-5), 3.65 (t, 1H, H-4), 3.78 (m, 5H, H-2 , H-6, OMe), 3.92 (t, 1H, H-3), 4.38 (dd, 1H, H-6'), 4.92 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-1), 5.57 (s, 1H, CHPh), 6.84 (dd, 4H, OMePh), 7.49 (m, 5H, Ph); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 31.1, 55.8, 66.7, 68.8, 73.4, 74.6, 80.5, 102.2, 102.5, 114.8, 118 .8, 126.4, 128.5, 129.5, 136.9, 150.9, 155.9

[00126] O Composto 5 (1,0 g, 2.67 mmol), 2,2,2-tricloroacetimidato de 3,4,6-tetra-O-acetil-β-D-glicosipiranosila (6) (2,9 g, 5,88 mmol) comprado da Tokyo Chemical Industry e peneiras moleculares 4Â (2,0 g) foram dissolvidos em diclorometano (171 mL), adicionados com trifluormetanossulfonato de trimetililsilila (48 μL, 0,27 mmol) a 0°C, e agitados à temperatura ambiente por 1,5 hora. Após confirmar o término da reação por TLC (tolueno/acetato de etila = 1/1, valor de Rf = 0,7), o resultante foi neutralizado com trietilamina (100 μL) (pH 8), peneiras moleculares 4Â foram removidas por filtração, e o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de sílica gel e um eluato (tolueno/acetato de etila = 2/1) foi usado para dar o Composto 7.[00126] Compound 5 (1.0 g, 2.67 mmol), 3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glycosypyranosyl 2,2,2-trichloroacetimidate (6) (2.9 g, 5.88 mmol) purchased from Tokyo Chemical Industry and 4A molecular sieves (2.0 g) were dissolved in dichloromethane (171 mL), added with trimethylsilyl trifluoromethanesulfonate (48 µL, 0.27 mmol) at 0°C, and stirred at room temperature for 1.5 hours. After confirming completion of the reaction by TLC (toluene/ethyl acetate = 1/1, Rf value = 0.7), the resultant was neutralized with triethylamine (100 μL) (pH 8), 4Â molecular sieves were removed by filtration , and the resultant was concentrated under a reduced pressure. The resulting syrup was subjected to silica gel column chromatography and an eluate (toluene/ethyl acetate = 2/1) was used to give Compound 7.

[00127] O Composto 7 (1,9 g, 1,84 mmol) foi dissolvido em etanol (18 mL), adicionado com ácido P-toluenossulfônico (35 mg, 0,184 mmol) à temperatura ambiente, e agitado a 60°C por 5,5 horas, Após confirmar o término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor de Rf = 0,1), o resultante foi neutralizado com trietilamina (5,0 mL) (pH 8) e concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi dissolvido em piridina (18 mL), adicionado com anidrido acético (347 μL, 3,68 mmol) à temperatura ambiente, e agitado à temperatura ambiente por 18 horas, Após confirmar o término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor de Rf = 0,7), destilação azeotrópica com tolueno (30 mL) foi repetida por três vezes, e o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de sílica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 1/1 ^ 2/1) foi usado para dar o Composto 8 (1,5 g, 54%, 3 etapas). [Composto 8] RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 1,94-2,17 (complexo, 30H, OAc), 2,91 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 3,71 (m, 1H), 3,76 (m, 5H), 3,94 (t, 1H), 4,09-4,17 (complexo, 5H), 4,31 (dd, 1H), 4,88 (m, 3H), 4,96-5,08 (complexo, 4H), 5,18 (m, 2H), 5,26 (t, 1H), 6,84 (dd, OMePh); RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 20,6 x 2, 20,7 x 4, 20,8 x 2, 20,9, 21,1, 55,8, 60,3, 60,5, 61,8, 62,6, 67,6, 68,3, 71,4, 71,6, 71,9, 71,0, 72,1, 72,7, 73,1, 82,3, 98,5, 98,7 x 2, 114,9, 116,1, 150,1, 155,4, 168,9, 169,4 x 2, 169,5, 170,2, 170,3, 170,4, 170,5[00127] Compound 7 (1.9 g, 1.84 mmol) was dissolved in ethanol (18 mL), added with P-toluenesulfonic acid (35 mg, 0.184 mmol) at room temperature, and stirred at 60 °C for 5.5 hours, After confirming the completion of the reaction by TLC (ethyl acetate/hexane = 2/1, Rf value = 0.1), the resultant was neutralized with triethylamine (5.0 mL) (pH 8) and concentrated under low pressure. The resulting syrup was dissolved in pyridine (18 mL), added with acetic anhydride (347 μL, 3.68 mmol) at room temperature, and stirred at room temperature for 18 hours, after confirming completion of the reaction by TLC (ethyl acetate /hexane = 2/1, Rf value = 0.7), azeotropic distillation with toluene (30 mL) was repeated three times, and the resultant was concentrated under a reduced pressure. The resulting syrup was subjected to silica gel column chromatography and an eluate (ethyl acetate/hexane = 1/1 ^ 2/1) was used to give Compound 8 (1.5 g, 54%, 3 steps). [Compound 8] 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.94-2.17 (complex, 30H, OAc), 2.91 (m, 1H), 3.33 (m, 1H), 3.71 ( m, 1H), 3.76 (m, 5H), 3.94 (t, 1H), 4.09-4.17 (complex, 5H), 4.31 (dd, 1H), 4.88 (m , 3H), 4.96-5.08 (complex, 4H), 5.18 (m, 2H), 5.26 (t, 1H), 6.84 (dd, OMePh); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 20.6 x 2, 20.7 x 4, 20.8 x 2, 20.9, 21.1, 55.8, 60.3, 60.5, 61.8 , 62.6, 67.6, 68.3, 71.4, 71.6, 71.9, 71.0, 72.1, 72.7, 73.1, 82.3, 98.5, 98 .7x2, 114.9, 116.1, 150.1, 155.4, 168.9, 169.4x2, 169.5, 170.2, 170.3, 170.4, 170.5

[00128] Composto 8 (1,3 g, 1,26 mmol) foi dissolvido em acetonitrila (20 mL) e água (5,0 mL), adicionado com nitrato de cério e amônio (1,4 g, 2,52 mmol) a 0°C e agitado a 0°C por 15 minutos, Após confirmar o término da reação por TLC (acetato de etila/hexano = 2/1, valor de Rf = 0,3), o resultante foi diluído com acetato de etila, e a camada orgânica foi lavada com água e uma solução de hidrogenocarbonato de sódio aquosa saturada e seco com sulfato de magnésio. Sulfato de magnésio foi removido por filtração e o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de sílica gel e um eluato (acetato de etila/hexano = 2/1) foi usado para dar o Composto 9 (343 mg, 29%). [Composto 9] RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 1,95-2,33 (complexo, 55H, OAc), 3,61 (m, 6H), 3,73 (m, 1H), 3,91-4,31 (complexo, 12H), 4,40 (m, 2H), 4,61 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,65 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 4,73 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,85-4,98 (complexo, 4H), 5,01-5,21 (complexo, 9H), 5,41 (d, J = 3,2 Hz, 1H); RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 20,8, 20,9 x 3, 21,1, 21,2, 21,5, 29,4, 29,8, 61,6, 61,7 x 2, 61,9, 62,4, 62,5, 67,3, 67,5, 67,9, 68,1 x 2, 68,2, 68,3, 71,6, 71,8, 71,9 x 2, 71,1, 72,2, 72,3, 72,8, 73,0, 74,8, 77,4, 78,3, 81,7, 82,8, 92,2, 95,6, 98,9, 99,5, 100,1, 101,5, 125,4, 128,3, 129,1, 137,9, 168,9, 169,4, 169,5 x 2, 169,9, 170,0, 170,1 x 2, 170,3 x 2[00128] Compound 8 (1.3 g, 1.26 mmol) was dissolved in acetonitrile (20 mL) and water (5.0 mL), added with cerium ammonium nitrate (1.4 g, 2.52 mmol ) at 0°C and stirred at 0°C for 15 minutes. After confirming the completion of the reaction by TLC (ethyl acetate/hexane = 2/1, Rf value = 0.3), the resultant was diluted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with water and a saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution and dried with magnesium sulfate. Magnesium sulfate was removed by filtration and the resultant was concentrated under reduced pressure. The resulting syrup was subjected to silica gel column chromatography and an eluate (ethyl acetate/hexane = 2/1) was used to give Compound 9 (343 mg, 29%). [Compound 9] 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.95-2.33 (complex, 55H, OAc), 3.61 (m, 6H), 3.73 (m, 1H), 3.91- 4.31 (complex, 12H), 4.40 (m, 2H), 4.61 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.85-4.98 (complex, 4H), 5.01-5 .21 (complex, 9H), 5.41 (d, J = 3.2 Hz, 1H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 20.8, 20.9 x 3, 21.1, 21.2, 21.5, 29.4, 29.8, 61.6, 61.7 x 2, 61 .9, 62.4, 62.5, 67.3, 67.5, 67.9, 68.1 x 2, 68.2, 68.3, 71.6, 71.8, 71.9 x 2 , 71.1, 72.2, 72.3, 72.8, 73.0, 74.8, 77.4, 78.3, 81.7, 82.8, 92.2, 95.6, 98 .9, 99.5, 100.1, 101.5, 125.4, 128.3, 129.1, 137.9, 168.9, 169.4, 169.5 x 2, 169.9, 170 .0, 170.1 x 2, 170.3 x 2

[00129] (4) Síntese do composto 11 Esquema 8: Síntese do composto 11 [00129] (4) Synthesis of compound 11 Scheme 8: Synthesis of compound 11

[00130] Como pode ser percebido pelo Esquema 8, para síntese do composto 11, Composto (9) (343 mg, 0,371 mmol) e Composto (3) (289 mg, 0,247 mmol) foram dissolvidos em 1,4-dioxano (12 mL), adicionado com tributilfosfina (185 μL, 0,741 mmol) e 1,1’-azobis (N,N’-dimetilformamida) (TMAD) (128 mg, 0,741 mmol) à temperatura ambiente, e agitado a 60°C por 18 horas, Após confirmar o término da reação por TLC (tolueno/acetato de etila = 1/2, valor de Rf = 0,6), o resultante foi diluído com acetato de etila, e a camada orgânica foi lavada com água, uma solução de hidrogenocarbonato de sódio aquosa saturada e salina saturada, e seco com sulfato de magnésio. Sulfato de magnésio foi removido por filtração e o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a cromatografia de coluna de sílica gel e um eluato (tolueno/acetato de etila = 1/1) foi usado para dar o Composto 10 (240 mg, 47%). [Composto 10] RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) δ 0,50-1,05 (complexo, 7H), 1,19 (d, 3H, H-6 de Rham), 1,23 (s, 3H), 1,35-2,30 (complexo, 80H), 3,59 (m, 1H), 3,72 (m, 5H), 3,92-4,11 (complexo, 10H), 4,21 (dd, 1H), 4,31 (dd, 1H), 4,42 (m, 3H), 4,60 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,71-4,95 (complexo, 9H), 5,07 (m, 6H), 5,19 (t, 1H), 5,29 (m, 4H), 5,59 (d, J = 7,6 Hz, 1H); RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) δ 16,7, 17,4, 20,5, 20,7 x 3, 20,8, 20,9 x 4, 21,1 x 2, 21,6, 29,2, 39,5, 42,5, 44,2, 53,8, 57,4, 61,9, 66,7, 68,0, 68,3, 68,4, 68,5, 69,7, 71,1, 71,5, 71,8, 71,9, 72,0, 72,2, 72,3, 72,4, 72,9, 73,0, 75,0, 80,1, 86,8, 91,3, 96,4, 96,9, 99,2, 99,3, 99,5, 125,4, 128,3, 129,2, 152,8, 169,0, 169,1, 169,3, 169,5 x 2, 169,6, 170,1 x 2, 170,2 x 2, 170,5, 170,6, 170,9, 174,8[00130] As can be seen from Scheme 8, for the synthesis of compound 11, Compound (9) (343 mg, 0.371 mmol) and Compound (3) (289 mg, 0.247 mmol) were dissolved in 1,4-dioxane (12 mL), added with tributylphosphine (185 µL, 0.741 mmol) and 1,1'-azobis(N,N'-dimethylformamide) (TMAD) (128 mg, 0.741 mmol) at room temperature, and stirred at 60°C for 18 hours, After confirming the completion of the reaction by TLC (toluene/ethyl acetate = 1/2, Rf value = 0.6), the resultant was diluted with ethyl acetate, and the organic layer was washed with water, a solution of saturated aqueous sodium hydrogencarbonate and saturated saline, and dried over magnesium sulfate. Magnesium sulfate was removed by filtration and the resultant was concentrated under reduced pressure. The resulting syrup was subjected to silica gel column chromatography and an eluate (toluene/ethyl acetate = 1/1) was used to give Compound 10 (240 mg, 47%). [Compound 10] 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.50-1.05 (complex, 7H), 1.19 (d, 3H, Rham H-6), 1.23 (s, 3H), 1.35-2.30 (complex, 80H), 3.59 (m, 1H), 3.72 (m, 5H), 3.92-4.11 (complex, 10H), 4.21 (dd, 1H), 4.31 (dd, 1H), 4.42 (m, 3H), 4.60 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.71-4.95 (complex, 9H), 5.07 (m, 6H), 5.19 (t, 1H), 5.29 (m, 4H), 5.59 (d, J = 7.6 Hz, 1H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.7, 17.4, 20.5, 20.7x3, 20.8, 20.9x4, 21.1x2, 21.6, 29.2 , 39.5, 42.5, 44.2, 53.8, 57.4, 61.9, 66.7, 68.0, 68.3, 68.4, 68.5, 69.7, 71 .1, 71.5, 71.8, 71.9, 72.0, 72.2, 72.3, 72.4, 72.9, 73.0, 75.0, 80.1, 86.8 , 91.3, 96.4, 96.9, 99.2, 99.3, 99.5, 125.4, 128.3, 129.2, 152.8, 169.0, 169.1, 169 .3, 169.5 x 2, 169.6, 170.1 x 2, 170.2 x 2, 170.5, 170.6, 170.9, 174.8

[00131] O Composto (10) (220 mg, 0,106 mmol) foi dissolvido em metanol (2,0 mL) e THF (2,0 mL), adicionado com metóxido de sódio (0,5 M em MeOH) (0,2 mL, 0,106 mmol) à temperatura ambiente, e agitado à temperatura ambiente por 48 horas, Após confirmar o término da reação por TLC (clorofórmio/metanol/água = 5/4/1, valor de Rf = 0,3), o resultante foi concentrado sob uma baixa pressão. O xarope resultante foi submetido a coluna de filtração de gel (GE Healthcare, Sephadex LH-20, etanol) e liofilizado com água para dar o Composto 11 (135 mg, quant.).[00131] Compound (10) (220 mg, 0.106 mmol) was dissolved in methanol (2.0 mL) and THF (2.0 mL), added with sodium methoxide (0.5 M in MeOH) (0. 2 mL, 0.106 mmol) at room temperature, and stirred at room temperature for 48 hours. After confirming completion of the reaction by TLC (chloroform/methanol/water = 5/4/1, Rf value = 0.3), the The resulting mixture was concentrated under reduced pressure. The resulting syrup was subjected to column gel filtration (GE Healthcare, Sephadex LH-20, ethanol) and lyophilized with water to give Compound 11 (135 mg, quant.).

[00132] [Composto 11] [α]D = -35,5° (c 1,0, MeOH) MALDI-TOF-MS m/z encontrado [M + Na]+ 1297, C56H90O32 calculado para [M + Na]+ 1297.[00132] [Compound 11] [α]D = -35.5° (c 1.0, MeOH) MALDI-TOF-MS m/z found [M + Na]+ 1297, C56H90O32 calculated for [M + Na]+ 1297.

[00133] (iii) Determinação estrutural correspondendo com o produto padrão quimicamente sintetizado com relação ao tempo de retenção e ao padrão fragmentado de HPLC-MS de alta resolução/MS/MS e fragmentação de MS3[00133] (iii) Structural determination corresponding to the chemically synthesized standard product with respect to retention time and fragmented pattern of high resolution HPLC-MS/MS/MS and fragmentation of MS3

[00134] O produto quimicamente sintetizado (Composto 11) e líquidos de extrato de folha de estévia foram comparados por HPLC-MS de alta resolução/MS e fragmentação MS3 nas mesmas condições de (i). Em decorrência disso, os picos do produto quimicamente sintetizado e o extrato líquido de folha de estévia correspondido ao pico com o tempo de retenção de 28,19 minutos (Figura 6). A partir desse resultado, o glicosídeo de esteviol inovador obtido a partir do extrato líquido da planta foi confirmado ter a mesma estrutura do Composto 11. [Biossíntese de glicosídeo de esteviol inovador Um glicosídeo de esteviol inovador foi gerado a partir de esteviol em levedura. Primeiramente, uma levedura capaz de coexpressar quatro tipos de genes de enzima glicosilada UGT85C2, UGT91D2, UGT74G1 e UGT76G1 derivados de estévia e gene UDP-ramnose sintase AtRHM2 derivado de Arabidopsis thaliana foram produzidos.[00134] The chemically synthesized product (Compound 11) and stevia leaf extract liquids were compared by high resolution HPLC-MS/MS and MS3 fragmentation under the same conditions as (i). As a result, the peaks of the chemically synthesized product and the liquid stevia leaf extract corresponded to the peak with the retention time of 28.19 minutes (Figure 6). From this result, the breakthrough steviol glycoside obtained from the liquid extract of the plant was confirmed to have the same structure as Compound 11. [Biosynthesis of breakthrough steviol glycoside A breakthrough steviol glycoside was generated from steviol in yeast. First, a yeast capable of co-expressing four types of glycosylated enzyme genes UGT85C2, UGT91D2, UGT74G1 and UGT76G1 derived from stevia and UDP-rhamnose synthase gene AtRHM2 derived from Arabidopsis thaliana were produced.

[00135] A menos que de outra forma especificada os processos biológicos moleculares empregados neste exemplo seguiram os métodos descritos em Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001).[00135] Unless otherwise specified the molecular biological processes employed in this example followed the methods described in Molecular Cloning (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).

[00136] A fim de clonar os quatro genes de enzima glicosilada derivados de estévia, os conjuntos de oligonucleotídeo iniciador a seguir foram sintetizados para realizar PCR usando cDNA preparado a partir das folhas de estévia como um molde. Conjunto de iniciador para gene UGT85C2 amplificação[00136] In order to clone the four stevia-derived glycosylated enzyme genes, the following oligonucleotide primer sets were synthesized to perform PCR using cDNA prepared from stevia leaves as a template. Primer Set for UGT85C2 Gene Amplification

[00137] CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw (NdeI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3 ’ (SEQ ID NO:12) BglII-SrUGT85C2-Rv (BglII-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’ - AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3 ’ (SEQ ID NO:13) Conjunto de iniciador para amplificação do gene UGT91D2 SrUGT91D2-pET15b-FW 5 ’ -TGCCGCGCGGCAGCC ATATGTACAACGTTACTTATCATC-3 ’ (SEQ ID NO:35) SrUGT91D2-pET15b-RV 5 ’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3 ’ (SEQ ID NO:36) Conjunto de iniciador para amplificação do gene UGT74G1 CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw (NdeI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’ -CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3 ’ (SEQ ID NO:14) BamHI-SrUGT74G1-Rv (BamHI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT- 3’ (SEQ ID NO:15) Conjunto de iniciador para amplificação do gene UGT76G1 CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw (NdeI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3 ’ (SEQ ID NO:16) BamHI-SrUGT76G1-Rv (BamHI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3 ’ (SEQ ID NO:17)[00137] CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw (NdeI-recognition site underlined): 5 '-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3 ' (SEQ ID NO:12) BglII-SrUGT85C2-Rv (BglII-recognition site underlined): 5 ' - AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3' (SEQ ID NO:13) Primer Set for Amplifying the UGT91D2 Gene SrUGT91D2-pET15b-FW 5' -TGCCGCGCGGCAGCC ATATGTACAACGTTACTTATCATC-3' (SEQ ID NO:35) SrUGT91D2-pET15b-RV 5'-GTTAGCAGCCG GATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3 ' (SEQ ID NO:36) Primer set for amplification of the UGT74G1 gene CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw (NdeI-recognition site underlined): 5 ' -CACCCATATGCGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3 ' (SEQ ID NO:14) BamHI-SrUGT74G1- Rv (BamHI-underlined recognition site): 5'-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3' (SEQ ID NO:15) Primer Set for UGT76G1 gene amplification CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw (underlined NdeI-recognition site): 5' -CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3 ' (SEQ ID NO:16) BamHI-SrUGT76G1-Rv (BamHI-underlined recognition site): 5 '-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3 ' (SEQ ID NO:17)

[00138] cDNA de folha de estévia foi obtido extraindo RNA total das folhas de estévia usando RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN), e submetendo 0,5 μg delas a reação de transcrição reversa (RT) usando oligonucleotídeo iniciador Random Oligo-dT.[00138] Stevia leaf cDNA was obtained by extracting total RNA from stevia leaves using RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN), and subjecting 0.5 μg of them to reverse transcription (RT) reaction using Random Oligo-dT oligonucleotide primer.

[00139] A solução da reação de PCR (50 μL) teve a composição a seguir: 1 μL de cDNA derivado de folha de estévia, 1 x KOD mais tampão (TOYOBO), dNTPs 0,2 mM, 0,4 pmol/μL de cada oligonucleotídeo iniciador, MgSO4 1 mM e KOD resistente a calor 1U mais polimerase. Reação de PCR consistiu de reação a 95°C por 5 minutos, seguido por amplificação por um total de 30 ciclos de reação a 94°C em 0,5 minutos, 50°C em 0,5 minutos e 68°C por 2 minutos. Cada produto de PCR foi submetido a eletroforese com 0,8% de gel de agarose e manchamento com brometo de etídio, pelo qual uma banda de amplificação de praticamente 1,4 kb de tamanho foi obtida como presumido de cada DNA do molde.[00139] The PCR reaction solution (50 μL) had the following composition: 1 μL of stevia leaf-derived cDNA, 1 x KOD plus buffer (TOYOBO), 0.2 mM dNTPs, 0.4 pmol/μL of each oligonucleotide primer, 1 mM MgSO4 and 1U heat resistant KOD plus polymerase. PCR reaction consisted of reaction at 95°C for 5 minutes, followed by amplification for a total of 30 reaction cycles at 94°C for 0.5 minutes, 50°C for 0.5 minutes and 68°C for 2 minutes . Each PCR product was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining, whereby an amplification band approximately 1.4 kb in size was presumably obtained from each template DNA.

[00140] Este produto de PCR foi subclonado no vetor pENTR-TOPO Directional (Invitrogen) de acordo com um método recomendado pelo fabricante. Modelo de Sequenciador de DNA 3100 (Applied Biosystems) foi usado para sequenciar por um processo de caminhada do oligonucleotídeo iniciador com um oligonucleotídeo iniciador sintetizado, por meio disso confirmando que todos os genes de interesse UGT, a saber, UGT85C2, UGT91D2, UGT74G1 e UGT76G1 foram clonados. Construção de vetor de expressão de levedura Os conjuntos de oligonucleotídeo iniciador a seguir foram projetados para integrar esses genes UGT e UDP derivado de Arabidopsis thaliana-gene de ramnose sintase AtRHM2 (J Biol Chem 2007, Oka et. al) em um vetor de expressão de levedura. conjunto SrUGT85C2 Bgl2-UGT85C2-F (BglII-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’ -AC AGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3 ’ (SEQ ID NO:18) Sal-UGT85C2-R (SalI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3 ’ (SEQ ID NO:19) conjunto SrUGT91D2 NotI-UGT91DIL3-F (NotI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3 ’ (SEQ ID NO:20) Pac-UGT91D1L3-R (PacI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3 ’ (SEQ ID NO:21) SrUGT74G1 set Não-UGT74G1-F (NotI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’ -AAGCGGCCGC ATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3 ’ (SEQ ID NO:22) Pac-UGT74G1-R (PacI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’ -CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3 ’ (SEQ ID NO:23) conjunto SrUGT76G1 Bam-UGT76G1-F (BamHI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’ -AAGGATCC ATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3 ’ (SEQ ID NO:24) Sal-UGT76G1-R (SalI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTA A-3’ (SEQ ID NO:25) Conjunto AtRHM2 Bam-AtRHM2-F (BamHI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-GGATCCATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAG-3 ’ (SEQ ID NO:26) Xho-AtRHM2-R (XhoI-sítio de reconhecimento sublinhado): 5 ’-CTCGAGTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGA-3 ’ (SEQ ID NO:27)[00140] This PCR product was subcloned into the pENTR-TOPO Directional vector (Invitrogen) according to a method recommended by the manufacturer. Model 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystems) was used to sequence by a primer walking process with a synthesized primer, thereby confirming that all UGT genes of interest, namely UGT85C2, UGT91D2, UGT74G1 and UGT76G1 have been cloned. Yeast Expression Vector Construction The following oligonucleotide primer sets were designed to integrate these Arabidopsis thaliana-derived UGT and UDP genes-rhamnose synthase gene AtRHM2 (J Biol Chem 2007, Oka et. al) into a yeast expression vector. yeast. set SrUGT85C2 Bgl2-UGT85C2-F (BglII-underlined recognition site): 5 ' -AC AGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3 ' (SEQ ID NO:18) Sal-UGT85C2-R (SalI-underlined recognition site): 5 '-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC- 3 ' (SEQ ID NO:19) set SrUGT91D2 NotI-UGT91DIL3-F (NotI-recognition site underlined): 5 '-AACGGCGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3 ' (SEQ ID NO:20) Pac-UGT91D1L3-R (PacI-recognition site underscore): 5 '-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3 ' (SEQ ID NO:21) SrUGT74G1 set Non-UGT74G1-F (NotI-recognition site underlined): 5 ' -AAGCGGCCGC ATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3 ' (SEQ ID NO:22) Pac- UGT74G1-R (PacI-underlined recognition site): 5' -CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3' (SEQ ID NO:23) set SrUGT76G1 Bam-UGT76G1-F (BamHI-underlined recognition site): 5' -AAGGATCC ATGGAAAATAAAACGGGAGACCACCG-3' (SEQ ID NO:24) Sal-UGT76G1-R (SalI-recognition site underlined): 5'-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTA A-3' (SEQ ID NO:25) Set AtRHM2 Bam-AtRHM2-F (BamHI-recognition site underlined ): 5 '-GGATCCATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAG-3 ' (SEQ ID NO:26) Xho-AtRHM2-R (XhoI-underlined recognition site): 5 '-CTCGAGTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGA-3 ' (SEQ ID NO:27)

[00141] As combinações de moldes e oligonucleotídeos iniciadores, a saber, molde UGT85C2 e conjunto SrUGT85C2, molde UGT91D2 e conjunto SrUGT91D2, molde UGT74G1 e SrUGT74G1 set, molde UGT76G1 e connjunto SrUGT76G1, e molde AtAHM2 e conjunto AtAHM2, foram usados para amplificação de PCR usando KOD DNA polimerase resistente a calor (TOYOBO) e introdução dos sítios enzima de restrição em ambas as extremidades de cada ORF. O fragmento de DNA resultante foi subclonado usando kit de clonagem de PCR Zero Blunt-TOPO (Invitrogen), e sequenciado com Modelo de Sequenciador de DNA 3100 (Applied Biosystems) por um processo de caminhada do oligonucleotídeo iniciador com um oligonucleotídeo iniciador sintetizado para confirmar que cada qual dos genes UGT de interesse foi clonado.[00141] Combinations of templates and oligonucleotide primers, namely, UGT85C2 template and SrUGT85C2 set, UGT91D2 template and SrUGT91D2 set, UGT74G1 template and SrUGT74G1 set, UGT76G1 template and SrUGT76G1 set, and AtAHM2 template and AtAHM2 set, were used for amplification of PCR using heat-resistant KOD DNA polymerase (TOYOBO) and introduction of restriction enzyme sites at both ends of each ORF. The resulting DNA fragment was subcloned using Zero Blunt-TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen), and sequenced with Model 3100 DNA Sequencer (Applied Biosystems) by a primer walking process with a synthesized primer to confirm that each of the UGT genes of interest has been cloned.

[00142] A fim de expressar os genes supradescritos em leveduras usando sistema de expressão de levedura pESC (Stratagene), os seguintes vetores de expressão foram construídos. (1) Construção de plasmídeo pESC-URA-UGT56 UGT85C2 foi clivado com enzimas de restrição BglII e SalI, e ligado ao vetor pESC-URA (Stratagene) que foi clivado com enzimas de restrição BamHI e SalI para dar plasmídeo pESC-URA-UGT-5. Este plasmídeo pESC-URA-UGT-5 foi clivado com enzimas de restrição NotI e PacI enquanto UGT91D2 foi também clivado com enzimas de restrição NotI e PacI. Os resultantes foram ligados para dar pESC-URA-UGT56. (2) Construção de plasmídeo pESC-HIS-UGT78 UGT76G1 foi clivado com enzimas de restrição BamHI e SalI, e ligado ao vetor pESC-HIS (Stratagene) que foi clivado com as mesmas enzimas de restrição para dar plasmídeo pESC-HIS-UGT-8. Este plasmídeo pESC-HIS-UGT-8 foi clivado com enzimas de restrição NotI e PacI enquanto UGT74G1 foi também clivado com NotI e PacI. Os resultantes foram ligados para dar pESC-HIS-UGT78. (3) Construção de plasmídeo pESC-TRP-AtRHM2 AtAHM2 foi clivado com enzimas de restrição BamHI e XhoI enquanto o vetor pESC-TRP (Stratagene) foi clivado com as mesmas enzimas de restrição. Os resultantes foram ligados para dar plasmídeo pESC-TRP- AtAHM2.[00142] In order to express the above-described genes in yeast using pESC yeast expression system (Stratagene), the following expression vectors were constructed. (1) Construction of plasmid pESC-URA-UGT56 UGT85C2 was cleaved with BglII and SalI restriction enzymes, and ligated to pESC-URA vector (Stratagene) which was cleaved with BamHI and SalI restriction enzymes to give plasmid pESC-URA-UGT -5. This plasmid pESC-URA-UGT-5 was cleaved with NotI and PacI restriction enzymes while UGT91D2 was also cleaved with NotI and PacI restriction enzymes. The resultants were ligated to give pESC-URA-UGT56. (2) Construction of plasmid pESC-HIS-UGT78 UGT76G1 was cleaved with restriction enzymes BamHI and SalI, and ligated to vector pESC-HIS (Stratagene) which was cleaved with the same restriction enzymes to give plasmid pESC-HIS-UGT- 8. This plasmid pESC-HIS-UGT-8 was cleaved with restriction enzymes NotI and PacI while UGT74G1 was also cleaved with NotI and PacI. The resultants were ligated to give pESC-HIS-UGT78. (3) Plasmid construct pESC-TRP-AtRHM2 AtAHM2 was cleaved with BamHI and XhoI restriction enzymes while pESC-TRP vector (Stratagene) was cleaved with the same restriction enzymes. The resultants were ligated to give plasmid pESC-TRP-AtAHM2.

[00143] Transformação de levedura Plasmídeos mostrados na Tabela 2 foram introduzidos em cepas YPH499 de Saccharomyces cerevisiae (ura3-52 lys2-801amberade2- 101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a) como um hospedeiro por técnica de acetato de lítio. Como cepas transformada, aquelas que sobreviveram em um meio ágar SC-Trp-Ura-His (6,7 g de base de nitrogênio levedura sem aminoácidos, 20 g de glicose, 1,3 g de mistura de pó de aminoácido -Trp-Ura- His e 20 g de ágar Bacto per 1L) foram selecionados. [Tabela 2] Tabela 2 [00143] Yeast Transformation Plasmids shown in Table 2 were introduced into YPH499 strains of Saccharomyces cerevisiae (ura3-52 lys2-801amberade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a) as a host by lithium acetate technique. As transformed strains, those that survived on an SC-Trp-Ura-His agar medium (6.7 g yeast nitrogen base without amino acids, 20 g glucose, 1.3 g amino acid powder mix -Trp-Ura - His and 20 g of Bacto agar per 1L) were selected. [Table 2] Table 2

[00144] Aqui, a mistura de pó de aminoácido-Trp-Ura-His foi preparada misturando sulfato de adenina (2,5 g), cloridrato de L-arginina (1,2 g), ácido L-aspártico (6,0 g), ácido L-glutâmico (6,0 g), L-leucina (3,6 g), L- lisina (1,8 g), L-metionina (1,2 g), L-fenilalanina (3,0 g), L-serina (22,5 g), L- treonina (12 g), L-tirosina (1,8 g) e L-valina (9,0 g).[00144] Here, amino acid-Trp-Ura-His powder mixture was prepared by mixing adenine sulfate (2.5 g), L-arginine hydrochloride (1.2 g), L-aspartic acid (6.0 g), L-glutamic acid (6.0 g), L-leucine (3.6 g), L-lysine (1.8 g), L-methionine (1.2 g), L-phenylalanine (3. 0 g), L-serine (22.5 g), L-threonine (12 g), L-tyrosine (1.8 g) and L-valine (9.0 g).

[00145] Indução e análise de expressão de transgene A cepa transformada resultante foi cultivada como a seguir. Primeiramente, para cultura preliminar, cada qual cepa transformada foi semeada em 10 mL de um His meio líquido SC-Trp-Ura- (meio ágar SC-Trp-Ura-His sem ágar Bacto) e agitação cultivada a 30°C por um dia. Subsequentemente, para cultura principal, 1 mL da solução de cultura preliminar foi semeada em 10 mL de meio líquido SG-Trp-Ura-His (6,7 g de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 g de galactose, e 1,3 g de mistura-Trp-Ura-His de pó de aminoácido por 1L) e agitação cultivada a 30°C por dois dias.[00145] Induction and analysis of transgene expression The resulting transformed strain was cultivated as follows. First, for preliminary culture, each transformed strain was seeded onto 10 ml of a His SC-Trp-Ura- liquid medium (SC-Trp-Ura-His agar medium without Bacto agar) and stirred at 30°C for one day . Subsequently, for the main culture, 1 mL of the preliminary culture solution was seeded into 10 mL of SG-Trp-Ura-His liquid medium (6.7 g yeast nitrogen base without amino acids, 20 g galactose, and 1, 3g Trp-Ura-His mixture of amino acid powder per 1L) and stirring cultured at 30°C for two days.

[00146] A fim de confirmar se o gene introduzido foi ou não expresso na cepa transformada, células foram colhidas da solução da cultura para purificar RNA total com RNeasy Mini Kit.[00146] In order to confirm whether or not the introduced gene was expressed in the transformed strain, cells were harvested from the culture solution to purify total RNA with RNeasy Mini Kit.

[00147] Com 1 μg de RNA total, cDNA foi sintetizado usando transcriptase reversa SuperScript II (Thermo Fischer Scientific) e hexâmero aleatório como um oligonucleotídeo iniciador.[00147] With 1 μg of total RNA, cDNA was synthesized using SuperScript II reverse transcriptase (Thermo Fischer Scientific) and random hexamer as an oligonucleotide primer.

[00148] A fim de confirmar expressão do transgene, os oligonucleotídeos iniciadores seguintes foram preparados. Para confirmar a expressão de UGT85C2 UGT85C2-r1: 5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ (SEQ ID NO:28) Para confirmar expressão de UGT91D2 UGT91D1L3-r1: 5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ (SEQ ID NO:29) Para confirmar expressão de UGT74G1 UGT74G1-r1: 5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ (SEQ ID NO:30) Para confirmar expressão de UGT76G1 UGT76G1-r1: 5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ (SEQ ID NO:31) Para confirmar expressão de AtAHM2 AtAHM2-r1 5’-GCTTTGTCACCAGAATCACCATT-3’ (SEQ ID NO:32)região GAL10p (região de promotor) PGAL10-f3: 5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ (SEQ ID NO:33) região GAL1p (região promotora) PGAL1-f3: 5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’ (SEQ ID NO:34)[00148] In order to confirm expression of the transgene, the following oligonucleotide primers were prepared. To confirm expression of UGT85C2 UGT85C2-r1: 5'-CAAGTCCCCAACCAAAATTCCGT-3' (SEQ ID NO:28) To confirm expression of UGT91D2 UGT91D1L3-r1: 5'-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3' (SEQ ID NO:29) To confirm expression of UGT74G1 UGT74G1-r1: 5'-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3' (SEQ ID NO:30) To confirm expression of UGT76G1 UGT76G1-r1: 5'-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3' (SEQ ID NO:31) To confirm expression of AtAHM2 AtAHM2- r1 5'-GCTTTGTCACCAGAATCACCATT-3' (SEQ ID NO:32)GAL10p region (promoter region) PGAL10-f3: 5'-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3' (SEQ ID NO:33) GAL1p region (promoter region) PGAL1-f3: 5'-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3' (SEQ ID NO:34)

[00149] Expressão de cada transgene foi confirmada realizando PCR usando ExTaq (Taraka Bio) com a combinação a seguir de oligonucleotídeos iniciadores e o cDNA previamente sintetizado como um molde e submetendo o produto resultante a eletroforese em gel de agarose. UGT85C2: UGT85C2-r1 (SEQ ID NO:28) e PGAL1-f3 (SEQ ID NO:34) UGT91D2 ou UGT91D2L3: UGT91D1L3-r1 (SEQ ID NO:29) e PGAL10-f3 (SEQ ID NO:33) UGT74G1: UGT74G1-r1 (SEQ ID NO:30) e PGAL1-f3 (SEQ ID NO:34) UGT76G1: UGT76G1-r1 (SEQ ID NO:31) e PGAL10-f3 (SEQ ID NO:33) AtAHM2: AtAHM2-r1 (SEQ ID NO:32) e PGAL10-f3 (SEQ ID NO:33) Dessa maneira, expressão do transgene na cepa transformada foi confirmada.[00149] Expression of each transgene was confirmed by performing PCR using ExTaq (Taraka Bio) with the following combination of oligonucleotide primers and the previously synthesized cDNA as a template and subjecting the resulting product to agarose gel electrophoresis. UGT85C2: UGT85C2-r1 (SEQ ID NO:28) and PGAL1-f3 (SEQ ID NO:34) UGT91D2 or UGT91D2L3: UGT91D1L3-r1 (SEQ ID NO:29) and PGAL10-f3 (SEQ ID NO:33) UGT74G1: UGT74G1-r1 (SEQ ID NO:30) and PGAL1-f3 (SEQ ID NO:34) UGT76G1: UGT76G1-r1 (SEQ ID NO:31) and PGAL10-f3 (SEQ ID NO:33) AtAHM2: AtAHM2-r1 ( SEQ ID NO:32) and PGAL10-f3 (SEQ ID NO:33) In this way, expression of the transgene in the transformed strain was confirmed.

[00150] Produção de glicosídeo de esteviol inovador Cultura foi realizada nas mesmas condições como descrito anteriormente, exceto que 0,5 μg ou 2 μg de esteviol (ChromaDex Inc.) foram adicionados ao meio líquido para a cultura principal por 1 mL do meio. Após cultura, a solução da cultura foi separada em sobrenadante e células por centrifugação. O sobrenadante da cultura foi lavado com acetonitrila, então submetido a uma coluna Sep-Pak C18, equilibrada com água lavada com 20% de acetonitrila, eluído com 80% de acetonitrila, seco para solidificar, e então dissolvido em uma pequena quantidade de 80% de acetonitrila para preparar uma amostra de glicosídeo. Essa amostra de glicosídeo foi submetida à análise a seguir.[00150] Innovative steviol glycoside production Culture was performed under the same conditions as described above, except that 0.5 μg or 2 μg of steviol (ChromaDex Inc.) was added to the liquid medium for the main culture per 1 mL of medium. After culturing, the culture solution was separated into supernatant and cells by centrifugation. The culture supernatant was washed with acetonitrile, then subjected to a Sep-Pak C18 column, equilibrated with water washed with 20% acetonitrile, eluted with 80% acetonitrile, dried to solidify, and then dissolved in a small amount of 80% acetonitrile. of acetonitrile to prepare a glycoside sample. This glycoside sample was subjected to the following analysis.

[00151] Análise por LC-MS Uma análise por LC-MS foi realizada como descrito no exemplo em “Isolamento de glicosídeo de esteviol inovador”.[00151] LC-MS Analysis An LC-MS analysis was performed as described in the example under “Innovative steviol glycoside isolation”.

[00152] O resultado é mostrado na Figura 7. Geração do glicosídeo de esteviol inovador em cepas A-5678 foi confirmada. Este resultado corresponde àquele para o glicosídeo de esteviol resultante da síntese química supradescrita.[00152] The result is shown in Figure 7. Generation of the innovative steviol glycoside in A-5678 strains was confirmed. This result corresponds to that for the steviol glycoside resulting from the chemical synthesis described above.

[00153] Avaliação de nível de doçura de glicosídeo de esteviol inovador A fim de avaliar o nível de doçura do glicosídeo de esteviol inovador, amostras foram preparadas adicionando sacarose a água pura para dar Brix de 0,5 a 3 em incrementos de 0,5. Uma amostra foi preparada adicionando o glicosídeo de esteviol inovador q água pura q 415 ppm.[00153] Innovative Steviol Glycoside Sweetness Level Assessment In order to evaluate the innovative steviol glycoside sweetness level, samples were prepared by adding sucrose to pure water to give Brix from 0.5 to 3 in 0.5 increments . A sample was prepared by adding the innovative steviol glycoside q pure water q 415 ppm.

[00154] Avaliação foi conduzida pela seleção da amostra adicionada com sacarose tendo intensidade de doçura equivalente à da amostra adicionada com o glicosídeo de esteviol inovador, em que avaliação sensorial foi conduzida por palestrantes treinados em atributos sensoriais de adoçantes (5 membros). Em decorrência disso, observou-se que a amostra preparada adicionando o glicosídeo inovador tem doçura equivalente à da amostra adicionada com sacarose com Brix de 1. Portanto, observou-se que o glicosídeo de esteviol inovador da invenção tem um nível de doçura de 24 com relação a sacarose.[00154] Evaluation was conducted by selecting the sample added with sucrose having sweetness intensity equivalent to that of the sample added with the innovative steviol glycoside, in which sensory evaluation was conducted by lecturers trained in sensory attributes of sweeteners (5 members). As a result, it was observed that the sample prepared by adding the innovative glycoside has a sweetness equivalent to that of the sample added with sucrose with Brix of 1. Therefore, it was observed that the innovative steviol glycoside of the invention has a sweetness level of 24 with relation to sucrose.

[00155] Avaliação sensorial de glicosídeo de esteviol inovador A fim de avaliar a qualidade do gosto de vários glicosídeos de esteviol, Reb.A e o glicosídeo de esteviol inovador foram adicionados a água pura em quantidades indicadas na Figura 8 para preparar amostras de bebida. Todas as amostras de bebida foram ajustadas para ter Brix final de 2 em termos de sacarose, desde que os níveis de doçura fossem RebA: 300 e glicosídeo inovador: 24.[00155] Sensory evaluation of innovative steviol glycoside In order to evaluate the taste quality of various steviol glycosides, Reb.A and innovative steviol glycoside were added to pure water in amounts indicated in Figure 8 to prepare beverage samples. All beverage samples were adjusted to have a final Brix of 2 in terms of sucrose, provided the sweetness levels were RebA: 300 and Breakthrough Glycoside: 24.

[00156] As amostras de bebida resultantes foram submetidas a avaliação sensorial para classificar atributos, a saber, fixação da doçura, amargor e sabor remanescente de doçura prolongado. Palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (5 membros) avaliaram com base nos seguintes critérios de avaliação. Muito fraco (-3), fraco (-2), ligeiramente fraco (-1), normal (0), ligeiramente forte (+1), forte (+2) e muito forte (+3).[00156] The resulting beverage samples were subjected to sensory evaluation to classify attributes, namely, fixation of sweetness, bitterness and aftertaste of prolonged sweetness. Speakers trained on sensory attributes of sweeteners (5 members) evaluated based on the following evaluation criteria. Very weak (-3), weak (-2), slightly weak (-1), normal (0), slightly strong (+1), strong (+2) and very strong (+3).

[00157] Em decorrência da avaliação sensorial, observou-se que o glicosídeo de esteviol inovador tem amargor igual e menor sabor remanescente de doçura prolongado comparado ao adoçante Reb.A convencional.[00157] As a result of the sensory evaluation, it was observed that the innovative steviol glycoside has equal bitterness and less aftertaste of prolonged sweetness compared to the conventional sweetener Reb.A.

[00158] Avaliação de agente de controle de sabor contendo glicosídeo de esteviol inovador para melhorar sabor remanescente prolongado (1) Medição de nível de doçura de adoçante alvejado para melhoria de sabor remanescente prolongado Antes da avaliação do agente de controle de sabor, o nível de doçura do adoçante alvejado para melhoria de sabor remanescente prolongado foi medido. Reb.A (pureza 100%) e Reb.D (pureza 97%) foram usados como os adoçantes. Reb.A e Reb.D foram dissolvidos em água em quantidades indicadas na tabela a seguir para preparar soluções aquosas. No entanto, soluções aquosas padrões tendo Brix de 5-7 foram preparadas usando sacarose (açúcar), para a qual palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (6 membros) avaliaram qual solução aquosa padrão teve a doçura correspondente à da solução aquosa de Reb.A e da solução aquosa Reb.D. Os resultados são mostrados na tabela a seguir. [Tabela 3] Tabela 3 Pelos resultados anteriores, avaliações nos testes seguintes foram conduzidas desde que a quantidade de vezes a doçura de Reb.A fosse 237 vezes e a quantidade de vezes a doçura de Reb.D foi 213 vezes. Aqui, a quantidade de vezes a doçura do glicosídeo de esteviol inovador usado para avaliação foi 24 vezes como descrito anteriormente.[00158] Evaluation of taste control agent containing innovative steviol glycoside to improve long aftertaste (1) Measurement of sweetener sweetener level targeted for improvement of long aftertaste Before the evaluation of the taste control agent, the level of Targeted sweetener sweetness for prolonged aftertaste improvement was measured. Reb.A (100% purity) and Reb.D (97% purity) were used as the sweeteners. Reb.A and Reb.D were dissolved in water in amounts indicated in the table below to prepare aqueous solutions. However, standard aqueous solutions having a Brix of 5-7 were prepared using sucrose (sugar), for which lecturers trained in sensory attributes of sweeteners (6 members) assessed which standard aqueous solution had the corresponding sweetness to that of the aqueous solution of Reb.A and the aqueous solution Reb.D. The results are shown in the following table. [Table 3] Table 3 By the above results, evaluations in the following tests were conducted since the amount of times the sweetness of Reb.A was 237 times and the amount of times the sweetness of Reb.D was 213 times. Here, the amount of times the sweetness of the innovative steviol glycoside used for evaluation was 24 times as previously described.

[00159] (2) Avaliação do efeito de melhorar sabor remanescente prolongado de Reb.A Soluções aquosas de três de níveis com Brix de 5, 7 e 11 foram usadas para avaliar o efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para melhorar sabor remanescente prolongado de Reb.A. Primeiramente, soluções aquosas de nível três com Brix de 5, 7 e 11 foram geradas, desde que o nível de doçura de Reb.A fosse 237 vezes. As quantidades adicionadas do agente de controle de sabor produzido do glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção foram 1, 3,5, 5 e 10% em massa em proporção com base na massa de Reb.A adicionada. Uma amostra de controle (Cont) foi adicionada com Reb.A apenas, e não foi adicionada com o agente de controle de sabor da presente invenção. Palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (7 membros) conduziram uma avaliação numérica na qual a máxima melhoria de sabor remanescente prolongado foi definida em 6 pontos, enquanto Cont foi definida em 3 pontos. Quanto mais o sabor remanescente prolongado foi melhorado, tanto maior foi o ponto. Os pontos de avaliação médios são mostrados nos gráficos na Figura 9.[00159] (2) Evaluation of the effect of improving prolonged aftertaste of Reb.A Aqueous solutions of three levels with Brix of 5, 7 and 11 were used to evaluate the effect of the aftertaste control agent of the present invention to improve the aftertaste extended remnant of Reb.A. First, level three aqueous solutions with Brix of 5, 7 and 11 were generated, provided that the sweetness level of Reb.A was 237 times. The added amounts of the innovative steviol glycoside produced taste control agent of the present invention were 1, 3.5, 5 and 10 wt% in proportion based on the mass of Reb.A added. A control sample (Cont) was added with Reb.A only, and was not added with the taste control agent of the present invention. Speakers trained in sensory attributes of sweeteners (7 members) conducted a numerical assessment in which maximum prolonged aftertaste improvement was set at 6 points, while Cont was set at 3 points. The more the prolonged aftertaste was improved, the higher the point. The average rating points are shown in the graphs in Figure 9.

[00160] (3) Avaliação de efeito de melhorar sabor remanescente prolongado de Reb.D[00160] (3) Evaluation of effect of improving prolonged aftertaste of Reb.D

[00161] Soluções aquosas de nível três com Brix de 5, 7 e 11 foram usadas para avaliar o efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para melhorar sabor remanescente prolongado de Reb.D. Primeiramente, soluções aquosas de nível três com Brix de 5, 7 e 11 foram geradas, desde que o nível de doçura de Reb.D fosse 213 vezes. As quantidades adicionadas do agente de controle de sabor feitas do glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção foram 1, 3,5, 5 e 10% em massa em proporção com base na massa de Reb.D adicionado. Uma amostra de controle (Cont) foi adicionada com Reb.D apenas, e não foi adicionada com o agente de controle de sabor da presente invenção. Palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (7 membros) conduziram uma avaliação numérica na qual a máxima melhoria de sabor remanescente prolongado foi definida a 6 pontos enquanto Cont foi definida em 3 pontos. Quanto mais o sabor remanescente prolongado foi melhorado, tanto maior foi o ponto. Os pontos de avaliação médios são mostrados nos gráficos na Figura 10.[00161] Level three aqueous solutions with Brix of 5, 7 and 11 were used to evaluate the effect of the taste control agent of the present invention to improve prolonged aftertaste of Reb.D. First, level three aqueous solutions with Brix of 5, 7 and 11 were generated, provided that the sweetness level of Reb.D was 213 times. The added amounts of the taste control agent made from the innovative steviol glycoside of the present invention were 1, 3.5, 5 and 10 wt% in proportion based on the mass of Reb.D added. A control sample (Cont) was added with Reb.D only, and was not added with the taste control agent of the present invention. Speakers trained in sensory attributes of sweeteners (7 members) conducted a numerical assessment in which maximum prolonged aftertaste improvement was set at 6 points while Cont was set at 3 points. The more the prolonged aftertaste was improved, the higher the point. The average rating points are shown in the graphs in Figure 10.

[0145] Avaliação de agente de controle de sabor contendo glicosídeo de esteviol inovador para intensificar a doçura Soluções aquosas de dois níveis com Brix de 5 e 7 foram usadas para avaliar o efeito do agente de controle de sabor da presente invenção para intensificar a doçura com relação a açúcar (sacarose). Primeiramente, soluções aquosas de dois níveis com Brix de 5 e 7 foram geradas usando açúcar. As quantidades adicionadas do agente de controle de sabor produzidas do glicosídeo de esteviol inovador da presente invenção foram 0,10, 0,44 e 0,80% em massa em proporção em termos da quantidade do açúcar adicionada para Brix de 5, e 0,10, 0,44 e 0,57% em massa em proporção para Brix de 7. Palestrantes treinados a respeito de atributos sensoriais de adoçantes (7 membros) avaliaram com base na taxa da intensidade de doçura. Os resultados são mostrados em gráficos na Figura 11. Os eixos geométricos verticais (intensidade de doçura) dos gráficos representam as taxas de intensidade de doçura realmente sentidas pelos palestrantes com relação ao nível total de doçura do açúcar e o agente de controle de sabor (calculado desde que o nível de doçura do agente de controle de sabor tivesse uma quantidade de vezes a doçura de 24). Para todas as amostras, uma intensificação de efeito de doçura de cerca 2-7% foi observada.[0145] Evaluation of taste control agent containing innovative steviol glycoside to enhance sweetness Two-level aqueous solutions with Brix of 5 and 7 were used to evaluate the effect of the taste control agent of the present invention to enhance sweetness with relation to sugar (sucrose). First, two-level aqueous solutions with Brix of 5 and 7 were generated using sugar. The added amounts of the taste control agent produced from the innovative steviol glycoside of the present invention were 0.10, 0.44 and 0.80% by mass in proportion in terms of the amount of added sugar for Brix of 5, and 0. 10, 0.44 and 0.57% by mass in proportion to a Brix of 7. Speakers trained on sensory attributes of sweeteners (7 members) rated based on the rate of sweetness intensity. The results are shown in graphs in Figure 11. The vertical (sweetness intensity) axes of the graphs represent the ratios of sweetness intensity actually felt by the panelists relative to the total sweetness level of the sugar and the flavor control agent (calculated provided that the sweetness level of the taste control agent had a number of times the sweetness of 24). For all samples, an enhancement of sweetness effect of about 2-7% was observed.

Claims

1. Compound, characterized by the fact that it is as represented by Formula (1): or a salt or a hydrate thereof.

2. Compound according to claim 1, or a salt or a hydrate thereof, characterized in that the compound or a salt or a hydrate thereof is a plant-derived product, a chemically synthesized product or a biosynthetic product.

3. Sweetener composition, characterized in that it comprises the compound as defined in claim 1 or 2, or a salt or a hydrate thereof, and one or more other types of steviol glycoside selected from the group consisting of rebaudioside B , rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, rebaudioside I, rebaudioside J, rebaudioside K, rebaudioside N, rebaudioside M, rebaudioside O, rebaudioside Q, rebaudioside R, steviol monoside, steviol bioside and stevioside.

4. Sweetener composition according to claim 3, characterized in that the ratio of the compound represented by Formula (1), or a salt or a hydrate thereof and the one or more other types of steviol glycoside is 0 ,01:9,99 - 6:4 in a mass ratio.

5. Food or beverage, characterized in that it comprises the compound as defined in claim 1 or 2, or a salt or a hydrate thereof, or the sweetener composition as defined in claim 3 or 4.

6. Food or drink according to claim 5, characterized by the fact that it is a drink.

7. Food or drink according to claim 6, characterized in that the amount of the compound represented by Formula (1), or a salt or a hydrate thereof is 0.0004%-0.8% based on total weight of food or drink.

8. Method for producing the compound as defined in claim 1, characterized in that it comprises the steps of: (A) synthesizing a compound represented by Formula (3) below: (wherein, PGs each independently represent a protecting group) from rebaudioside C represented by Formula (2) below: (B) synthesize a compound represented by Formula (4) below: (wherein, PGs each independently represent a protecting group) from a glycopyranoside derivative.

9. Method according to claim 8, characterized in that it comprises a step of allowing the reaction between the compound represented by Formula (3) above and the compound represented by Formula (4) above in the presence of a phosphine reagent and an azo compound to obtain a compound represented by Formula (5) below: (wherein, PGs each independently represent a protecting group).

10. Method according to claim 9, characterized in that it further comprises deprotecting the protective groups of the compound represented by Formula (5) to result in the compound represented by Formula (1).

11. Method according to claim 9 or 10, characterized in that the yield of the step of obtaining the compound represented by Formula (5) above is 40% or more.

12. Use of the compound as defined in claim 1 or 2, or a salt or a hydrate thereof, characterized in that it is as a sweetener.

13. Flavor control agent, characterized in that it comprises the compound, or a salt or a hydrate thereof as defined in claim 1, wherein said compound is to be added to another non-sugar sweetener contained in a food or beverage in an amount of 1% by mass - 15% by mass based on the mass of said other sweetener.

14. Flavor control agent according to claim 13, characterized in that said other sweetener contained in the food or drink is selected from steviol glycosides rebaudioside A, rebaudioside D, rebaudioside B, rebaudioside M, rebaudioside N, rebaudioside O , rebaudioside E, rebaudioside K and rebaudioside J; natural sweeteners such as fructose, fructose-glucose syrup, glucose, maltose, high fructose syrup, sugar alcohol, oligosaccharide, honey, pressed sugar cane juice, starch syrup, Lo Han Kuo powder (Siraitia grosvenorii), Lo Han Kuo Extract, Licorice Powder, Licorice Extract, Thaumatococcus daniellii Seed Powder, and Thaumatococcus daniellii Seed Extract; and artificial sweeteners acesulfame potassium, sucralose, neotame, aspartame and saccharin.