BR112018007592B1 - POLYNUCLEOTIDE CONSTRUCTION, METHOD FOR PRODUCING PLANT CELLS, METHOD FOR PRODUCING PLANT - Google Patents
POLYNUCLEOTIDE CONSTRUCTION, METHOD FOR PRODUCING PLANT CELLS, METHOD FOR PRODUCING PLANT Download PDFInfo
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Abstract
CONSTRUTO DE POLINUCLEOTÍDEO, CÉLULA DE PLANTA DE MAÍS, PLANTA DE MAÍS, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA DE MAÍS. São fornecidos no presente documento composições e métodos para geração de plantas de maís que exibem resistência à helmintosporiose. São fornecidos polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo que confere resistência à helmintosporiose, construtos de polinucleotídeo que compreendem o mesmo e plantas de maís que compreendem os construtos de polinucleotídeo. Os métodos incluem expressar um polinucleotídeo isolado em uma célula de maís através de métodos de transformação padrão e obter uma planta de maís da dita célula de maís.POLYNUCLEOTIDE CONSTRUCT, MALE PLANT CELL, MAI PLANT, METHOD FOR PRODUCING A MAI PLANT. Provided herein are compositions and methods for generating maize plants that exhibit resistance to helminthosporiosis. Provided are isolated polynucleotides encoding a polypeptide that confers resistance to helminthosporiosis, polynucleotide constructs comprising the same, and maize plants comprising the polynucleotide constructs. The methods include expressing an isolated polynucleotide in a maize cell by standard transformation methods and obtaining a maize plant from said maize cell.
Description
[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório no U.S. 62/242.691, depositado em 16 de outubro de 2015, cujo conteúdo integral está incorporado ao presente documento a título de referência.[0001] This application claims the benefit of the provisional application in U.S. 62/242,691, filed on October 16, 2015, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
[0002] A presente revelação refere-se a composições e métodos úteis na geração de plantas de maís com resistência à helmintosporiose otimizada.[0002] The present disclosure relates to compositions and methods useful in generating maize plants with optimized helminthosporiosis resistance.
[0003] A cópia oficial da listagem de sequências é apresentada eletronicamente por meio de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um arquivo intitulado 20160928_BB2396PCT_SequenceListing.txt criado em 28 de setembro de 2016 e com um tamanho de 65 quilobytes, e é depositada de maneira concomitante com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida nesse documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo, e está incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.[0003] The official copy of the sequence listing is presented electronically via EFS-Web as a sequence listing in ASCII format with a file titled 20160928_BB2396PCT_SequenceListing.txt created on September 28, 2016 and with a size of 65 kilobytes, and is deposited concomitantly with the descriptive report. The list of sequences contained in this document formatted in ASCII is part of the specification, and is incorporated into this document by reference in its entirety.
[0004] A helmintosporiose (NLB), induzida pelo patógeno fúngicoExserohilumturcicum (anteriormente denominado Helminthosporiumturcicum), é uma doença de murcha foliar de maís em muitos ambientes tropicais e temperados. Os sintomas podem situar-se na faixa de lesões em formato de charuto nas folhas inferiores à destruição completa da folhagem, reduzindo, assim, a quantidade de área superficial de folha disponível para a fotossíntese. Uma redução na capacidade fotossintética leva a uma falta de carboidratos necessários para o enchimento de grãos, que impacta o rendimento do grão. As regiões de atitude média dos trópicos, cerca de 900 a 1.600 m acima do nível do mar, têm um clima particularmente favorável para helmintosporiose, à medida que os períodos de orvalho são longos e as temperaturas moderadas. Entretanto, a helmintosporiose também pode render perdas de 30 a 50% em ambientes temperados, como nos Estados Unidos, durante estações chuvosas, particularmente se a infecção foi estabelecida nas folhas superiores da planta pelo estágio de floração.[0004] Helmintosporiosis (NLB), induced by the fungal pathogen Exserohilumturcicum (formerly called Helminthosporiumturcicum), is a leaf wilt disease of apples in many tropical and temperate environments. Symptoms can range from cigar-shaped lesions on lower leaves to complete destruction of foliage, thereby reducing the amount of leaf surface area available for photosynthesis. A reduction in photosynthetic capacity leads to a lack of carbohydrates needed for grain filling, which impacts grain yield. The mid-attitude regions of the tropics, about 900 to 1,600 m above sea level, have a particularly favorable climate for helminthosporiosis, as dew periods are long and temperatures are moderate. However, helminthosporiosis can also yield losses of 30 to 50% in temperate environments, such as the United States, during rainy seasons, particularly if the infection has been established in the upper leaves of the plant by the flowering stage.
[0005] O método mais eficaz e mais preferencial para o controle de helmintosporiose é o plantio de híbridos resistentes. Várias variedades ou espécies de Exserohilumturcicum estão presentes na natureza, deixando para os produtores duas opções híbridas: híbridos resistentes parciais, que oferecem proteção de amplo espectro e nível baixo contra múltiplas espécies, e híbridos resistentes à espécie específica que protegem contra uma espécie específica. As fontes genéticas de resistência a Exserohilumturcicum foram descritas, e quatro loci de resistência a Exserohilumturcicum foram identificados: Ht1, Ht2, Ht3 e Htn1. Gene Ht1 mapeia o braço longo do cromossomo 2 em que o mesmo é estritamente ligado a umc36 (Coe, E.H. et al. (1988), Corn and Corn Improvement, 3aedição, páginas 81 a 258), sgcr506 (Gupta, M. et al. (1989) Maize Genet. Coop. Newsl. 63, 112), umc150B (Bentolila, S. et al. (1991) Theor. Appl. Genet., 82:393 a 398) e pic18a (Collins et al. (1998) Molecular Plant-MicrobeInteractions, 11:968 a 978), e é estritamente flanqueado por umc22 e umc122 (Li et al. (1998) Hereditas, 129:101 a 106). Gene Ht2 mapeia o braço longo do cromossomo 8 no intervalo umc48-umc89 (Zaitlin et al. (1992) MaizeGenet. Coop. Newsl., 66, 69 a 70) e gene Ht3 mapeia o cromossomo 7 próximo a bnlg1666 (Van Staden, D et al. (2001) MaizeGeneticsConference Abstracts 43:P134). O gene Htn1 mapeia o cromossomo 8, aproximadamente 10 cM distal a Ht2 e 0,8 cM distal ao marcador RFLP umc117 (Simcox e Bennetzen (1993) MaizeGenet. Coop. Newl. 67, 118 a 119; Simcox e Bennetzen (1993) Phytopathology, 83:1.326 a 1.330).[0005] The most effective and most preferred method for controlling helminthosporiosis is the planting of resistant hybrids. Several varieties or species of Exserohilumturcicum are present in nature, leaving growers two hybrid options: partial resistant hybrids, which offer broad-spectrum, low-level protection against multiple species, and species-specific resistant hybrids that protect against a specific species. The genetic sources of resistance to Exserohilumturcicum have been described, and four loci of resistance to Exserohilumturcicum have been identified: Ht1, Ht2, Ht3, and Htn1. Ht1 gene maps to the long arm of chromosome 2 where it is strictly linked to umc36 (Coe, E.H. et al. (1988), Corn and Corn Improvement, 3rd edition, pages 81 to 258), sgcr506 (Gupta, M. et al (1989) Maize Genet. Coop Newsl. ) Molecular Plant-MicrobeInteractions, 11:968 to 978), and is strictly flanked by umc22 and umc122 (Li et al. (1998) Hereditas, 129:101 to 106). Ht2 gene maps to the long arm of chromosome 8 in the umc48-umc89 interval (Zaitlin et al. (1992) MaizeGenet. Coop. Newsl., 66, 69 to 70) and Ht3 gene maps to chromosome 7 near bnlg1666 (Van Staden, D et al. (2001) MaizeGeneticsConference Abstracts 43:P134). The Htn1 gene maps to chromosome 8, approximately 10 cM distal to Ht2 and 0.8 cM distal to the RFLP marker umc117 (Simcox and Bennetzen (1993) MaizeGenet. Coop. Newl. 67, 118 to 119; Simcox and Bennetzen (1993) Phytopathology , 83:1,326 to 1,330).
[0006] Os métodos de controle de helmintosporiose por meio da redução de inoculo fúngico exigem recursos e tempo adicional da parte do agricultor, e além disso, podem ter efeitos prejudiciais no ambiente. Isto torna o plantio de híbridos resistentes até mais atraente para os agricultores e o público geral. Dessa forma, é desejável fornecer composições e métodos para geração de plantas de maís com resistência à helmintosporiose otimizada.[0006] Methods of controlling helminthosporiosis through the reduction of fungal inoculum require additional resources and time on the part of the farmer, and in addition, can have harmful effects on the environment. This makes planting resistant hybrids even more attractive to farmers and the general public. Therefore, it is desirable to provide compositions and methods for generating maize plants with optimized helminthosporiosis resistance.
[0007] São apresentados no presente documento composições e métodos para geração de plantas de maís que exibem resistência à helmintosporiose, sendo essa resistência recém-conferida ou otimizada.[0007] Presented in this document are compositions and methods for generating maize plants that exhibit resistance to helminthosporiosis, this resistance being newly conferred or optimized.
[0008] São apresentados no presente documento polinucleotídeos isolados são que podem ser usados para gerar plantas de maís que exibem resistência à helmintosporiose. Um polinucleotídeo isolado pode ser selecionado dentre o grupo que consiste em: (a) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:1 (cDNA de PH4GP), SEQ ID NO:3 (cDNA de PH1W2) ou SEQ ID NO:9 (sequência genômica de PH4GP); (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo CC-NB-LRR que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90% de identidade de sequência quando comparada com SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, com base no método CLUSTAL W de alinhamento com parâmetros padrão; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo CC-NB-LRR que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90% de identidade de sequência quando comparada com SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, com base no método CLUSTAL W de alinhamento com parâmetros padrão, em que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:10; e (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo CC-NB- LRR que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4.[0008] Presented herein are isolated polynucleotides that can be used to generate maize plants that exhibit resistance to helminthosporiosis. An isolated polynucleotide may be selected from the group consisting of: (a) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1 (PH4GP cDNA), SEQ ID NO:3 (PH1W2 cDNA), or SEQ ID NO:9 ( PH4GP genomic sequence); (b) a nucleotide sequence encoding a CC-NB-LRR polypeptide that has an amino acid sequence of at least 90% sequence identity when compared to SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4, based on the method CLUSTAL W alignment with standard parameters; (c) a nucleotide sequence encoding a CC-NB-LRR polypeptide that has an amino acid sequence of at least 90% sequence identity when compared to SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4, based on the method CLUSTAL W of alignment with standard parameters, wherein said polypeptide comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:10; and (d) a nucleotide sequence encoding a CC-NB-LRR polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4.
[0009] Também são fornecidos construtos de polinucleotídeo que compreendem os polinucleotídeos isolados, em que um polinucleotídeo isolado é ligado de modo operacional a um promotor. Um construto de polinucleotídeo pode compreender adicionalmente uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam um polipeptídeo selecionado dentre o grupo que consiste em: um polipeptídeo que confere resistência à doença, um polipeptídeo que confere resistência a herbicida, um polipeptídeo que confere resistência a inseto, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de carboidrato, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de ácido graxo, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de aminoácido, um polipeptídeo envolvido em desenvolvimento de planta, um polipeptídeo envolvido em regulação de crescimento de planta, um polipeptídeo envolvido em aprimoramento de rendimento, um polipeptídeo envolvido em resistência à seca, um polipeptídeo envolvido em resistência ao frio, um polipeptídeo envolvido em resistência ao calor e/ou um polipeptídeo envolvido em resistência ao sal, em que a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas são ligadas de maneira operacional a um promotor. Por exemplo, um polipeptídeo que confere resistência à doença pode ser um polipeptídeo que confere resistência à helmintosporiose (NLB), que pode ter adicionalmente uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90% de identidade de sequência quando comparada com SEQ ID NO:11 ou 12, com base no método CLUSTAL W de alinhamento com parâmetros padrão.[0009] Polynucleotide constructs comprising isolated polynucleotides are also provided, in which an isolated polynucleotide is operably linked to a promoter. A polynucleotide construct may further comprise one or more heterologous nucleic acid sequences encoding a polypeptide selected from the group consisting of: a polypeptide that confers disease resistance, a polypeptide that confers herbicide resistance, a polypeptide that confers insect resistance , a polypeptide involved in carbohydrate metabolism, a polypeptide involved in fatty acid metabolism, a polypeptide involved in amino acid metabolism, a polypeptide involved in plant development, a polypeptide involved in plant growth regulation, a polypeptide involved in plant growth enhancement yield, a polypeptide involved in drought resistance, a polypeptide involved in cold resistance, a polypeptide involved in heat resistance and/or a polypeptide involved in salt resistance, in which one or more heterologous nucleic acid sequences are linked in a operational manner to a promoter. For example, a polypeptide that confers resistance to disease may be a polypeptide that confers resistance to helminthosporiosis (NLB), which may additionally have an amino acid sequence of at least 90% sequence identity when compared to SEQ ID NO:11 or 12 , based on the CLUSTAL W alignment method with standard parameters.
[0010] As células de planta de maís que compreendem os construtos de polinucleotídeo e plantas de maís que compreendem as células de planta de maís também são fornecidas.[0010] Corn plant cells comprising the polynucleotide constructs and corn plants comprising corn plant cells are also provided.
[0011] São fornecidos no presente documento métodos para geração de plantas de maís que exibem resistência à helmintosporiose, em que um construto de polinucleotídeo que compreende um polinucleotídeo isolado fornecido no presente documento, em que o dito polinucleotídeo isolado é ligado de modo operacional a pelo menos uma sequência reguladora, é expresso em uma célula vegetal de maís regenerável, e uma planta de maís que exibe resistência à helmintosporiose é gerada da célula vegetal de maís. A planta de maís gerada pelo método compreende o construto de polinucleotídeo em seu genoma. A sequência reguladora pode ser um promotor e/ou um terminador e pode ser nativa ao maís. Em alguns aspectos, a sequência reguladora é nativa ao gene Ht1. Em ainda outros aspectos, o construto de polinucleotídeo compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas adicionais que codificam um polipeptídeo selecionado dentre o grupo que consiste em: um polipeptídeo que confere resistência à doença, um polipeptídeo que confere resistência a herbicida, um polipeptídeo que confere resistência a inseto, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de carboidrato, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de ácido graxo, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de aminoácido, um polipeptídeo envolvido em desenvolvimento de planta, um polipeptídeo envolvido em regulação de crescimento de planta, um polipeptídeo envolvido em aprimoramento de rendimento, um polipeptídeo envolvido em resistência à seca, um polipeptídeo envolvido em resistência ao frio, um polipeptídeo envolvido em resistência ao calor e/ou um polipeptídeo envolvido em resistência ao sal, em que cada sequência de ácidos nucleicos heteróloga é ligada de modo operacional a um promotor. O polipeptídeo pode ser aquele que confere resistência à helmintosporiose (NLB), como, por exemplo, um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90% de identidade de sequência quando comparada com SEQ ID NO:11 ou 12, com base no método CLUSTAL W de alinhamento com parâmetros padrão. Uma planta de progênie que compreende o construto de polinucleotídeo também pode ser gerada por meio do cruzamento da planta de maís gerada pelo método com uma segunda planta de maís que não compreende em seu genoma o construto de polinucleotídeo.[0011] Methods for generating maize plants exhibiting resistance to helminthosporiosis are provided herein, wherein a polynucleotide construct comprising an isolated polynucleotide provided herein, wherein said isolated polynucleotide is operably linked to at least at least one regulatory sequence, is expressed in a regenerable maize plant cell, and a maize plant that exhibits resistance to helminthosporiosis is generated from the maize plant cell. The maize plant generated by the method comprises the polynucleotide construct in its genome. The regulatory sequence may be a promoter and/or a terminator and may be native to most. In some aspects, the regulatory sequence is native to the Ht1 gene. In still other aspects, the polynucleotide construct comprises one or more additional heterologous nucleic acid sequences that encode a polypeptide selected from the group consisting of: a polypeptide that confers disease resistance, a polypeptide that confers herbicide resistance, a polypeptide that confers insect resistance, a polypeptide involved in carbohydrate metabolism, a polypeptide involved in fatty acid metabolism, a polypeptide involved in amino acid metabolism, a polypeptide involved in plant development, a polypeptide involved in plant growth regulation, a polypeptide involved in yield enhancement, a polypeptide involved in drought resistance, a polypeptide involved in cold resistance, a polypeptide involved in heat resistance, and/or a polypeptide involved in salt resistance, to which each heterologous nucleic acid sequence is linked operationally to a promoter. The polypeptide may be one that confers resistance to helminthosporiosis (NLB), such as, for example, a polypeptide that has an amino acid sequence of at least 90% sequence identity when compared to SEQ ID NO:11 or 12, based on the CLUSTAL W alignment method with standard parameters. A progeny plant comprising the polynucleotide construct can also be generated by crossing the maize plant generated by the method with a second maize plant that does not comprise the polynucleotide construct in its genome.
[0012] A invenção pode ser compreendida mais completamente a partir da descrição detalhada a seguir e dos desenhos e Listagem de Sequências anexos que formam uma parte deste pedido. A Listagem de Sequências contém o código de uma letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os códigos de três letras para aminoácidos conforme definido em conformidade com os padrões IUPAC-IUBMB descritos em NucleicAcidsResearch 13:3.021 a 3.030 (1985) e no BiochemicalJournal 219 (No 2) : 345 a 373 (1984), que estão incorporados ao presente documento a título de referência, em sua totalidade. Os símbolos e o formato usados para os dados de sequência de nucleotídeos e de aminoácidos cumprem com as regras estabelecidas no título 37 do C.F.R. § 1.822.[0012] The invention can be more fully understood from the following detailed description and the attached drawings and Sequence Listing that form a part of this application. The Sequence Listing contains the one-letter code for nucleotide sequence characters and the three-letter codes for amino acids as defined in accordance with the IUPAC-IUBMB standards described in NucleicAcidsResearch 13:3021 to 3030 (1985) and in BiochemicalJournal 219 ( No 2): 345 to 373 (1984), which are incorporated into this document by way of reference, in their entirety. The symbols and format used for nucleotide and amino acid sequence data comply with the rules set forth in title 37 of the C.F.R. § 1,822.
[0013] As Figuras 1A a 1D mostram o alinhamento das variantes CC-NB-LRR de PH4GP (SEQ ID NO:2), PH1W2 (SEQ ID NO:4) e B73 (SEQ ID NOs:6 e 8). A deleção na região LRR nos alelos B73 é enquadrada na Figura 1C.[0013] Figures 1A to 1D show the alignment of the CC-NB-LRR variants of PH4GP (SEQ ID NO:2), PH1W2 (SEQ ID NO:4) and B73 (SEQ ID NOs:6 and 8). The deletion in the LRR region in the B73 alleles is shown in Figure 1C.
[0014] A SEQ ID NO:1 é a sequência de nucleotídeos do cDNA de Ht1 encontrado na linhagem consanguínea PH4GP.[0014] SEQ ID NO:1 is the nucleotide sequence of the Ht1 cDNA found in the PH4GP inbred line.
[0015] A SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:1.[0015] SEQ ID NO:2 is the amino acid sequence of the polypeptide encoded by SEQ ID NO:1.
[0016] A SEQ ID NO:3 é a sequência de nucleotídeos do cDNA de Ht1 encontrado na linhagem consanguínea PH1W2.[0016] SEQ ID NO:3 is the nucleotide sequence of the Ht1 cDNA found in the PH1W2 inbred line.
[0017] A SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:3.[0017] SEQ ID NO:4 is the amino acid sequence of the polypeptide encoded by SEQ ID NO:3.
[0018] A SEQ ID NO:5 é a sequência de nucleotídeos do cDNA de Ht1 encontrado na linhagem consanguínea B73 e mencionado no presente documento como "alelo B73-alto".[0018] SEQ ID NO:5 is the nucleotide sequence of the Ht1 cDNA found in the B73 inbred lineage and referred to herein as "B73-high allele".
[0019] A SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:5.[0019] SEQ ID NO:6 is the amino acid sequence of the polypeptide encoded by SEQ ID NO:5.
[0020] A SEQ ID NO:7 é a sequência de nucleotídeos do cDNA de Ht1 encontrado na linhagem consanguínea B73 e mencionado no presente documento como o "alelo B73-baixo".[0020] SEQ ID NO:7 is the nucleotide sequence of the Ht1 cDNA found in the B73 inbred lineage and referred to herein as the "B73-low allele".
[0021] A SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:7.[0021] SEQ ID NO:8 is the amino acid sequence of the polypeptide encoded by SEQ ID NO:7.
[0022] A SEQ ID NO:9 é a sequência de nucleotídeos do DNA genômico de Ht1 encontrado na linhagem consanguínea PH4GP.[0022] SEQ ID NO:9 is the nucleotide sequence of the Ht1 genomic DNA found in the PH4GP inbred lineage.
[0023] A SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácidos de uma região encontrada nos polipeptídeos de Ht1 de alelos resistentes.[0023] SEQ ID NO:10 is the amino acid sequence of a region found in Ht1 polypeptides from resistant alleles.
[0024] A SEQ ID NO:11 é a sequência de aminoácidos de NLB18 da linhagem PH99N no pedido de patente no WO2011163590.[0024] SEQ ID NO:11 is the amino acid sequence of NLB18 of the PH99N strain in the patent application in WO2011163590.
[0025] A SEQ ID NO:12 é a sequência de aminoácidos de NLB18 da linhagem PH26N no pedido de patente no WO2011163590.[0025] SEQ ID NO:12 is the amino acid sequence of NLB18 of the PH26N strain in the patent application in WO2011163590.
[0026] Antes de descrever a presente invenção detalhadamente, deve-se entender que a presente invenção não se limita às modalidades que podem, evidentemente, variar. Deve ser entendido também que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não pretende ser limitante. Conforme usado no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, os termos no singular e as formas singulares "um", "uma", "o” e “a”, por exemplo, incluem referentes plurais exceto se o conteúdo ditar claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, a referência a "planta", "a planta" ou "uma planta" também inclui uma pluralidade de plantas; além disso, dependendo do contexto, o uso do termo "planta" também pode incluir a progênie geneticamente idêntica ou semelhante dessa planta; o uso do termo "um ácido nucleico" inclui opcionalmente, por questões de praticidade, muitas cópias dessa molécula de ácido nucleico; de modo semelhante, o termo "sonda" abrange opcionalmente (e tipicamente) muitas moléculas de sonda semelhantes ou idênticas.[0026] Before describing the present invention in detail, it should be understood that the present invention is not limited to embodiments that may, of course, vary. It should also be understood that the terminology used herein is intended to describe particular embodiments only and is not intended to be limiting. As used in this specification and the attached claims, the singular terms and singular forms "a", "an", "the" and "a", for example, include plural referents unless the content clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to "plant", "the plant" or "a plant" also includes a plurality of plants; furthermore, depending on the context, the use of the term "plant" may also include genetically progeny; identical or similar to that plant; use of the term "a nucleic acid" optionally includes, for reasons of practicality, many copies of that nucleic acid molecule; similarly, the term "probe" optionally (and typically) encompasses many probe molecules; similar or identical.
[0027] A menos que indicado de outro modo, os ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'. As faixas numéricas citadas dentro do relatório descritivo incluem os números que definem a faixa e incluem cada número inteiro ou qualquer fração não inteira dentro da faixa definida. Salvo quando definido de outro modo, todos os termos científicos usados no presente documento têm o mesmo significado, conforme entendido comumente por uma pessoa versada na técnica à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática para teste da presente invenção, os materiais e métodos preferenciais são descritos no presente documento. Na descrição e na reivindicação da presente invenção, a terminologia a seguir será usada em conformidade com as definições definidas a seguir.[0027] Unless otherwise indicated, nucleic acids are written from left to right in the 5' to 3' orientation. The numerical ranges cited within the specification include the numbers that define the range and include each whole number or any non-whole fraction within the defined range. Unless otherwise defined, all scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in practice to test the present invention, preferred materials and methods are described herein. In the description and claim of the present invention, the following terminology will be used in accordance with the definitions defined below.
[0028] O mapeamento de um QTL associado à resistência à helmintosporiose no cromossomo 2, com o uso de uma população derivada de um cruzamento entre a linhagem resistente a helmintosporiose PH4GP e a linhagem suscetível a helmintosporiose PH5W4, foi descrito no documento sob o no US2010095395. É apresentada no presente documento a clonagem do gene Ht1 em maís e a identificação de um gene CC-NB-LRR putativo (do inglês Coiled-Coil, Nucleotide-Binding, Leucine-RichRepeat, super hélice, ligação a nucleotídeo, repetição rica em leucina) como o gene causal. As sequências de cDNA de Ht1 de PH4GP e PH1W2, as duas fontes resistentes descritas no documento sob o no US2010095395, são representadas pelas SEQ ID NOs:1 e 3, respectivamente, enquanto que as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos codificados são representadas pela SEQ ID NO:2 e 4. Ademais, um construto que contém a sequência genômica do alelo PH4GP (resistente) (SEQ ID NO:9) foi gerado e transformado em uma linhagem de transformação suscetível com o uso de transformação mediada por Agrobacterium, resultando em plantas de maís com resistência à helmintosporiose.[0028] The mapping of a QTL associated with resistance to helminthosporiosis on chromosome 2, using a population derived from a cross between the helminthosporiosis-resistant lineage PH4GP and the helminthosporiosis-susceptible lineage PH5W4, was described in document no. US2010095395 . This document presents the cloning of the Ht1 gene in maize and the identification of a putative CC-NB-LRR gene (Coiled-Coil, Nucleotide-Binding, Leucine-RichRepeat, super helix, nucleotide binding, leucine-rich repeat ) as the causal gene. The Ht1 cDNA sequences of PH4GP and PH1W2, the two resistant sources described in US2010095395, are represented by SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively, while the amino acid sequences of the encoded polypeptides are represented by SEQ ID NO:2 and 4. Furthermore, a construct containing the genomic sequence of the PH4GP (resistant) allele (SEQ ID NO:9) was generated and transformed into a susceptible transformation line using Agrobacterium-mediated transformation, resulting in plants of maize with resistance to helminthosporiosis.
[0029] O gene CC-NB-LRR (do inglês Coiled-Coil, Nucleotide- Binding, Leucine-RichRepeat, super hélice, ligação a nucleotídeo, repetição rica em leucina; também mencionado como Ht1) de Zeamays é um membro de uma família grande e complexa de genes de resistência à doença. O mecanismo de ativação de proteína NB-LRR e sinalização subsequente em uma imunidade disparada por efetora não é bem compreendido (Eitas e Dangl. 2010. CurrOpinPlantBiol 13(4):472 a 477).[0029] The CC-NB-LRR gene (Coiled-Coil, Nucleotide-Binding, Leucine-RichRepeat, super helix, nucleotide binding, leucine-rich repeat; also referred to as Ht1) of Zeamays is a member of a family large and complex array of disease resistance genes. The mechanism of NB-LRR protein activation and subsequent signaling in effector-triggered immunity is not well understood (Eitas and Dangl. 2010. CurrOpinPlantBiol 13(4):472 to 477).
[0030] Dessa forma, são apresentados no presente documento polinucleotídeos que podem ser usados para gerar plantas de maís com resistência à helmintosporiose. O polinucleotídeo pode ser (a) a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:1 (cDNA de PH4GP), SEQ ID NO:3 (cDNA de PH1W2) ou SEQ ID NO:9 (sequência genômica de PH4GP); (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo CC-NB-LRR que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência quando comparada com SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, com base no método CLUSTAL W de alinhamento com parâmetros padrão; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo CC-NB-LRR que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência quando comparada com SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, com base no método CLUSTAL W de alinhamento com parâmetros padrão, em que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:10, que é a sequência da região deletada de Ht1 em B73; e (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo CC-NB-LRR que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4.[0030] Therefore, polynucleotides are presented in this document that can be used to generate maize plants with resistance to helminthosporiosis. The polynucleotide can be (a) the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:1 (PH4GP cDNA), SEQ ID NO:3 (PH1W2 cDNA) or SEQ ID NO:9 (PH4GP genomic sequence); (b) a nucleotide sequence encoding a CC-NB-LRR polypeptide that has an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % or 99% sequence identity when compared to SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4, based on the CLUSTAL W alignment method with default parameters; (c) a nucleotide sequence encoding a CC-NB-LRR polypeptide that has an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % or 99% sequence identity when compared to SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4, based on the CLUSTAL W method of alignment with standard parameters, wherein said polypeptide comprises the amino acid sequence presented in SEQ ID NO :10, which is the sequence of the deleted region of Ht1 in B73; and (d) a nucleotide sequence encoding a CC-NB-LRR polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4.
[0031] O uso do termo "polinucleotídeo" não se destina a limitar um polinucleotídeo da revelação a um polinucleotídeo que compreende DNA. Aqueles de habilidade comum na técnica perceberão que os polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem tanto as moléculas de ocorrência natural quanto os análogos sintéticos. Os polinucleotídeos da revelação também abrangem todas as formas de sequências, incluindo, porém sem limitação, formas de fita simples, formas de fita dupla, formas de grampo, estruturas de haste e laço e similares.[0031] The use of the term "polynucleotide" is not intended to limit a polynucleotide of the disclosure to a polynucleotide comprising DNA. Those of ordinary skill in the art will appreciate that polynucleotides can comprise ribonucleotides and combinations of ribonucleotides and deoxyribonucleotides. Such deoxyribonucleotides and ribonucleotides include both naturally occurring molecules and synthetic analogues. The polynucleotides of the disclosure also encompass all forms of sequences, including, but not limited to, single-stranded forms, double-stranded forms, hairpin forms, stem and loop structures, and the like.
[0032] Para uso no presente documento, um polinucleotídeo ou polipeptídeo "isolado" ou "purificado", ou porção biologicamente ativa dos mesmos, está substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou polipeptídeo conforme encontrado no seu ambiente de ocorrência natural. Dessa forma, um polipeptídeo ou polinucleotídeo isolado ou purificado está substancialmente isento de outro material celular ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimicamente. Tipicamente, um polinucleotídeo "isolado" está isento de sequências (de modo ideal, sequências de codificação de proteínas), que naturalmente flanqueiam o polinucleotídeo (isto é, sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) no DNA genômico do organismo a partir do qual o polinucleotídeo é derivado. Com propósitos desta revelação, "isolado" ou "recombinante" quando usado se refere a moléculas de ácido nucleico que excluem cromossomos não modificados. Por exemplo, em diversas modalidades, o polinucleotídeo isolado pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de sequências nucleotídicas que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula a partir da qual o polinucleotídeo é derivado. Um polipeptídeo que é substancialmente isento de material celular inclui preparações de polipeptídeos que têm menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de proteína contaminante. Quando o polipeptídeo da revelação ou uma porção biologicamente ativa do mesmo é produzido de forma recombinante, de modo ideal, o meio de cultura representa menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou produtos químicos não proteicos de interesse.[0032] For use herein, an "isolated" or "purified" polynucleotide or polypeptide, or biologically active portion thereof, is substantially or essentially free from components that normally accompany or interact with the polynucleotide or polypeptide as found in its environment naturally occurring. Thus, an isolated or purified polypeptide or polynucleotide is substantially free from other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or substantially free from chemical precursors or other chemicals when chemically synthesized. Typically, an "isolated" polynucleotide is free of sequences (ideally, protein-coding sequences) that naturally flank the polynucleotide (i.e., sequences located at the 5' and 3' ends of the polynucleotide) in the genomic DNA of the organism to be from which the polynucleotide is derived. For purposes of this disclosure, "isolated" or "recombinant" when used refers to nucleic acid molecules that exclude unmodified chromosomes. For example, in various embodiments, the isolated polynucleotide may contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, or 0.1 kb of nucleotide sequences that naturally flank the polynucleotide in the Genomic DNA of the cell from which the polynucleotide is derived. A polypeptide that is substantially free of cellular material includes polypeptide preparations that have less than about 30%, 20%, 10%, 5% or 1% (by dry weight) of contaminating protein. When the disclosure polypeptide or a biologically active portion thereof is produced recombinantly, ideally the culture medium represents less than about 30%, 20%, 10%, 5% or 1% (by dry weight) of chemical precursors or non-protein chemicals of interest.
[0033] Para uso no presente documento, um polinucleotídeo "recombinante" compreende uma combinação de dois ou mais segmentos de ácido nucleico quimicamente ligados que não são encontrados diretamente unidos na natureza. O termo "diretamente unido" significa que os dois segmentos de ácido nucleico são imediatamente adjacentes e unidos um ao outro por uma ligação química. Em modalidades específicas, o polinucleotídeo recombinante compreende um polinucleotídeo de interesse de modo que um segmento de ácido nucleico quimicamente ligado adicional esteja situado em 5', 3' ou interno ao polinucleotídeo de interesse. Alternativamente, o segmento de ácido nucleico quimicamente ligado do polinucleotídeo recombinante pode ser formado pela deleção de uma sequência. O segmento de ácido nucleico quimicamente ligado adicional ou a sequência deletada para unir os segmentos de ácido nucleico ligados pode ter qualquer comprimento, incluindo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou maiores nucleotídeos. Diversos métodos para fabricação de tais polinucleotídeos recombinantes são revelados no presente documento, incluindo, por exemplo, por síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de polinucleotídeos por meio de técnicas de engenharia genética. Em modalidades específicas, o polinucleotídeo recombinante pode compreender uma sequência de DNA recombinante ou uma sequência de RNA recombinante.[0033] For use herein, a "recombinant" polynucleotide comprises a combination of two or more chemically linked nucleic acid segments that are not found directly joined together in nature. The term "directly joined" means that the two nucleic acid segments are immediately adjacent and joined to each other by a chemical bond. In specific embodiments, the recombinant polynucleotide comprises a polynucleotide of interest such that an additional chemically linked nucleic acid segment is situated 5', 3' or internal to the polynucleotide of interest. Alternatively, the chemically linked nucleic acid segment of the recombinant polynucleotide may be formed by deleting a sequence. The additional chemically linked nucleic acid segment or deleted sequence to join the linked nucleic acid segments can be any length, including, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 or longer nucleotides. Various methods for manufacturing such recombinant polynucleotides are disclosed herein, including, for example, by chemical synthesis or by manipulating isolated segments of polynucleotides through genetic engineering techniques. In specific embodiments, the recombinant polynucleotide may comprise a recombinant DNA sequence or a recombinant RNA sequence.
[0034] Um "polinucleotídeo recombinante" compreende uma combinação de dois ou mais segmentos de aminoácido quimicamente ligados que não são encontrados diretamente unidos na natureza. Em modalidades específicas, o polipeptídeo recombinante compreende um segmento de aminoácido ligado quimicamente que está situado no N-terminal, C-terminal ou interno ao polipeptídeo recombinante. Alternativamente, o segmento de aminoácido quimicamente ligado do polipeptídeo recombinante pode ser formado pela deleção de pelo menos um aminoácido. O segmento de aminoácido quimicamente ligado adicional ou o segmento de aminoácido quimicamente ligado deletado podem ter qualquer comprimento, incluindo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou mais aminoácidos.[0034] A "recombinant polynucleotide" comprises a combination of two or more chemically linked amino acid segments that are not found directly joined together in nature. In specific embodiments, the recombinant polypeptide comprises a chemically linked amino acid segment that is located N-terminally, C-terminally or internally to the recombinant polypeptide. Alternatively, the chemically linked amino acid segment of the recombinant polypeptide can be formed by deleting at least one amino acid. The additional chemically linked amino acid segment or the deleted chemically linked amino acid segment may be any length, including, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 or more amino acids.
[0035] Os alinhamentos de sequência e os cálculos de identidade de porcentagem podem ser determinados com o uso de uma variedade de métodos de comparação projetados para detectar as sequências homólogas que incluem, mas sem limitação, o programa MEGALIGN® do pacote de programas de computação de bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI). A menos que declarado de outro modo, o alinhamento múltiplo das sequências fornecidas no presente documento foi realizado com o uso do método CLUSTAL V de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151 a 153 (1989)) com os parâmetros padrão (PENALIDADE POR LACUNA=10, PENALIDADE POR COMPRIMENTO DE LACUNA=10). Os parâmetros para alinhamentos em pares e cálculo de identidade de porcentagem de sequências de proteína com o uso do método CLUSTAL V são KTUPLE=1, PENALIDADE POR LACUNA=3, JANELA=5 e DIAGONAIS SALVAS=5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros são K-TUPLA=2, PENALIDADE POR LACUNA=5, JANELA=4 e DIAGONAIS SALVAS=4. Após o alinhamento das sequências, com o uso do programa CLUSTAL V, é possível obter valores de “porcentagem de identidade" e "divergência" visualizando-se a tabela de “distâncias de sequência" no mesmo programa; a menos que declarado de outro modo, as identidades de porcentagem e divergências fornecidas e reivindicadas no presente documento foram calculadas dessa maneira.[0035] Sequence alignments and percentage identity calculations can be determined using a variety of comparison methods designed to detect homologous sequences that include, but are not limited to, the MEGALIGN® software package program. LASERGENE® bioinformatics system (DNASTAR® Inc., Madison, WI). Unless otherwise stated, multiple alignment of the sequences provided herein was performed using the CLUSTAL V alignment method (Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151 to 153 (1989)) with the default parameters (PENALTY PER GAP=10, PENALTY PER GAP LENGTH=10). The parameters for pairwise alignments and percentage identity calculation of protein sequences using the CLUSTAL V method are KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5, and SAVEDIAGONALS=5. For nucleic acids, these parameters are K-TUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4, and SAVEDIAGONALS=4. After aligning the sequences, using the CLUSTAL V program, it is possible to obtain “identity percentage” and “divergence” values by viewing the “sequence distances” table in the same program; Unless otherwise stated, the percentage identities and divergences provided and claimed herein have been calculated in this manner.
[0036] Alternativamente, o método CLUSTAL W de alinhamento pode ser usado. O método CLUSTAL W de alinhamento (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151 a 153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189 a 191 (1992)) pode ser encontrado no programa MegAlign™ v6.1 do pacote de programas de computação de bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, Wis.). Os parâmetros padrão para alinhamento múltiplo correspondem a PENALIDADE POR LACUNA=10, PENALIDADE POR COMPRIMENTO DE LACUNA=0,2, sequências de divergência de atraso=30%, peso de transição de DNA=0,5, matriz de peso de proteína =Série Gonnet, matriz de peso de DNA=IUB. Para alinhamentos em pares, os parâmetros padrão são Alinhamento=Lento-Preciso, Penalidade por Lacuna=10,0, Comprimento de Lacuna=0,10, Matriz de peso de proteína=Gonnet 250 e Matriz de peso de DNA=IUB. Após o alinhamento das sequências com o uso do programa Clustal W, é possível obter valores de “porcentagem de identidade” e "divergência" visualizando-se a tabela de “distâncias de sequência” no mesmo programa.[0036] Alternatively, the CLUSTAL W alignment method can be used. The CLUSTAL W alignment method (described by Higgins and Sharp, CABIOS. 5:151 to 153 (1989); Higgins, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8:189 to 191 (1992)) can be found in MegAlign™ v6.1 program from the LASERGENE® bioinformatics computing software suite (DNASTAR® Inc., Madison, Wis.). The default parameters for multiple alignment correspond to PENALTY PER GAP=10, PENALTY PER GAP LENGTH=0.2, Sequence Divergence Delay=30%, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Series Gonnet, DNA weight matrix=IUB. For pairwise alignments, the default parameters are Alignment=Slow-Accurate, Gap Penalty=10.0, Gap Length=0.10, Protein Weight Matrix=Gonnet 250, and DNA Weight Matrix=IUB. After aligning the sequences using the Clustal W program, it is possible to obtain “identity percentage” and “divergence” values by viewing the “sequence distances” table in the same program.
[0037] Os polinucleotídeosHt1 revelados no presente documento podem ser fornecidos em cassetes de expressão (como, por exemplo, sob a forma de construtos de polinucleotídeo) para a expressão na planta de interesse ou qualquer organismo de interesse. O cassete pode incluir sequência reguladoras 5' e 3' ligadas de maneira operacional a um polinucleotídeoHt1. "Ligado de maneira operacional" se destina a significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operacional entre um polinucleotídeo de interesse e uma sequência reguladora (isto é, um promotor) é uma ligação funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Elementos ligados de modo operacional podem ser contíguos ou não contíguos. Quando usados para se referir à união de duas regiões de codificação de proteína, por ligado de modo operacional entende-se que as regiões de codificação estão no mesmo quadro de leitura. O cassete pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o gene (ou genes) adicional pode ser fornecido em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é dotado de uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção do polinucleotídeoHt1 a estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode adicionalmente conter genes marcadores selecionáveis.[0037] The Ht1 polynucleotides disclosed herein may be provided in expression cassettes (such as, for example, in the form of polynucleotide constructs) for expression in the plant of interest or any organism of interest. The cassette may include 5' and 3' regulatory sequences operably linked to an Ht1 polynucleotide. "Operably linked" is intended to mean a functional connection between two or more elements. For example, an operative linkage between a polynucleotide of interest and a regulatory sequence (i.e., a promoter) is a functional linkage that allows expression of the polynucleotide of interest. Operably linked elements may be contiguous or non-contiguous. When used to refer to the union of two protein coding regions, by operatively linked it is meant that the coding regions are in the same reading frame. The cassette may additionally contain at least one additional gene to be cotransformed in the organism. Alternatively, the additional gene (or genes) may be provided in multiple expression cassettes. Such an expression cassette is provided with a plurality of restriction sites and/or recombination sites for insertion of the Ht1 polynucleotide to be under the transcriptional regulation of the regulatory regions. The expression cassette may additionally contain selectable marker genes.
[0038] O cassete de expressão pode incluir na direção 5'-3’ da transcrição, uma região de iniciação da transcrição e tradução (isto é, um promotor), um polinucleotídeoHt1 e uma região de terminação da transcrição e tradução (isto é, região de terminação) funcional em plantas. As regiões reguladoras (isto é, promotores, regiões reguladoras de transcrição e regiões de terminação de tradução) e/ou o polinucleotídeoHt1 podem ser nativos/análogos à célula vegetal de maís ou um ao outro. Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou o polinucleotídeoHt1 podem ser heterólogos à célula vegetal de maís ou um ao outro.[0038] The expression cassette may include in the 5'-3' direction of transcription, a transcription and translation initiation region (i.e., a promoter), an Ht1 polynucleotide, and a transcription and translation termination region (i.e., termination region) functional in plants. The regulatory regions (i.e., promoters, transcription regulatory regions and translation termination regions) and/or the Ht1 polynucleotide may be native/analogous to the maize plant cell or each other. Alternatively, the regulatory regions and/or the Ht1 polynucleotide may be heterologous to the maize plant cell or to each other.
[0039] Conforme usado no presente documento, "heterólogo" em referência a uma sequência é uma sequência que origina a partir de uma espécie estranha, ou, se a partir da mesma espécie, é substancialmente modificada a partir de sua forma nativa em composição e/ou locusgenômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor ligado de modo operacional a um polinucleotídeoheterólogo é de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foi derivado, ou, se de espécie igual/análoga, um ou ambos são substancialmente modificados em relação à sua forma original e/ou locusgenômico, ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo ligado de modo operacional.[0039] As used herein, "heterologous" in reference to a sequence is a sequence that originates from a foreign species, or, if from the same species, is substantially modified from its native form in composition and /or locusgenomic by deliberate human intervention. For example, a promoter operably linked to a heterologous polynucleotide is from a species different from the species from which the polynucleotide was derived, or, if from the same/analogous species, one or both are substantially modified from its original form and/or locusgenomic, or the promoter is not the native promoter for the operably linked polynucleotide.
[0040] A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com uma planta de maís ou pode ser derivada de outra fonte (i.e., estranha ou heteróloga) em relação ao promotor, ao polinucleotídeoHt1, à planta de maís ou qualquer combinação dos mesmos.[0040] The termination region may be native to the transcription initiation region, may be native to a maize plant, or may be derived from another source (i.e., foreign or heterologous) with respect to the promoter, the Ht1 polynucleotide, the plant of maí or any combination thereof.
[0041] Os cassetes de expressão podem conter adicionalmente sequências líder 5'. Tais sequências líder podem atuar para otimizar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem sequências líder de tradução viral.[0041] Expression cassettes may additionally contain 5' leader sequences. Such leader sequences may act to optimize translation. Translation leaders are known in the art and include viral translation leader sequences.
[0042] Na preparação do cassete de expressão, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a proporcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Para esse fim, podem ser empregados adaptadores ou ligantes para unir os fragmentos de DNA ou podem estar envolvidas outras manipulações para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similares. Para esse propósito, podem estar envolvidos mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, novas substituições, por exemplo, transições e transversões.[0042] In preparing the expression cassette, the various DNA fragments can be manipulated to provide the DNA sequences in the appropriate orientation and, as appropriate, in the appropriate reading frame. To this end, adapters or linkers may be employed to join the DNA fragments or other manipulations may be involved to provide convenient restriction sites, removal of superfluous DNA, removal of restriction sites or the like. For this purpose, in vitro mutagenesis, primer repair, restriction, annealing, new substitutions, e.g. transitions and transversions, may be involved.
[0043] Vários promotores podem ser usados para expressar as diversas sequências de Ht1 reveladas no presente documento, incluindo o promotor nativo da sequência de polinucleotídeos de interesse (como, por exemplo, o promotor nativo do gene Ht1). Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Tais promotores incluem, por exemplo, promotores constitutivos, induzíveis, preferenciais para tecido ou outros promotores para expressão em plantas ou em qualquer organismo de interesse. Os promotores sintéticos também podem ser usados para expressar sequências de Ht1. Os promotores sintéticos incluem, por exemplo, uma combinação de um ou mais elementos reguladores heterólogos.[0043] Various promoters can be used to express the various Ht1 sequences disclosed herein, including the native promoter of the polynucleotide sequence of interest (such as, for example, the native promoter of the Ht1 gene). Promoters can be selected based on the desired outcome. Such promoters include, for example, constitutive, inducible, tissue-preferred promoters or other promoters for expression in plants or any organism of interest. Synthetic promoters can also be used to express Ht1 sequences. Synthetic promoters include, for example, a combination of one or more heterologous regulatory elements.
[0044] Um construto de polinucleotídeo pode ser um construto de DNA recombinante. Um "construto de DNA recombinante" compreende dois ou mais segmentos de DNA ligados de maneira operacional que não são encontrados ligados de maneira operacional na natureza. Os exemplos não limitadores de construtos de DNA recombinante incluem um polinucleotídeo de interesse ligado de maneira operacional a sequências heterólogas que auxiliam na expressão, replicação autóloga e/ou inserção genômica da sequência de interesse. Tais sequências ligadas de maneira operacional e heterólogas incluem, por exemplo, promotores, sequências de terminação, intensificadores, etc ou qualquer componente de um cassete de expressão; um plasmídeo, cosmídeo, vírus, sequência de replicação autônoma, bacteriófago ou sequências de nucleotídeos de RNA ou DNA de fita dupla ou de fita simples linear ou circular; e/ou sequências que codificam polipeptídeosheterólogos.[0044] A polynucleotide construct can be a recombinant DNA construct. A "recombinant DNA construct" comprises two or more operably linked DNA segments that are not found operably linked in nature. Non-limiting examples of recombinant DNA constructs include a polynucleotide of interest operably linked to heterologous sequences that assist in the expression, autologous replication and/or genomic insertion of the sequence of interest. Such operably linked and heterologous sequences include, for example, promoters, termination sequences, enhancers, etc. or any component of an expression cassette; a plasmid, cosmid, virus, autonomously replicating sequence, bacteriophage, or linear or circular double-stranded or single-stranded RNA or DNA nucleotide sequences; and/or sequences encoding heterologous polypeptides.
[0045] "Maís" se refere a uma planta de Zeamays L. ssp. mayse também é conhecida como "milho".[0045] "Maís" refers to a plant of Zeamays L. ssp. mayse is also known as "corn".
[0046] As plantas de maís, células de planta de maís, partes e sementes de plantas de maís e grão de maís que têm as sequências de Ht1 reveladas no presente documento também são fornecidos. Em modalidades específicas, as plantas e/ou partes de plantas têm incorporado de maneira estável pelo menos um polipeptídeoheterólogo Ht1 revelado no presente documento. Além disso, as plantas ou organismo de interesse podem compreender múltiplos polinucleotídeosHt1 (isto é, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais).[0046] The maize plants, maize plant cells, parts and seeds of maize plants and maize kernels that have the Ht1 sequences disclosed herein are also provided. In specific embodiments, plants and/or plant parts have stably incorporated at least one heterologous Ht1 polypeptide disclosed herein. Furthermore, the plants or organism of interest may comprise multiple Ht1 polynucleotides (i.e., at least 1, 2, 3, 4, 5, 6 or more).
[0047] Para uso no presente documento, o termo planta inclui células de planta de maís, protoplastos planta de maís, culturas de tecido de célula vegetal de maís das quais as plantas de maís podem ser regeneradas, calos de planta de maís, tufos de planta de maís e células de planta de maís que são intactas em plantas de maís ou partes de plantas de maís, como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, caroços, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras e similares. Grão se destina a significar a semente madura produzida por produtores comerciais para propósitos diferentes de cultivo ou reprodução da espécie. D. Outros Traços de Interesse[0047] For use herein, the term plant includes maize plant cells, maize plant protoplasts, maize plant cell tissue cultures from which maize plants can be regenerated, maize plant callus, tufts of maize plant and maize plant cells that are intact in maize plants or parts of maize plants, such as embryos, pollen, ovules, seeds, leaves, flowers, pits, cobs, cobs, husks, stems, roots, tops roots, anthers and the like. Grain is intended to mean the mature seed produced by commercial producers for purposes other than cultivation or reproduction of the species. D. Other Traits of Interest
[0048] Em algumas modalidades, os polinucleotídeosHt1 revelados no presente documento podem ser manipulados em uma pilha molecular. Dessa forma, as diversas plantas de maís, células de planta de maís e sementes de maís reveladas no presente documento podem compreender adicionalmente um ou mais traços de interesse, e em modalidades mais específicas, a planta de maís, a parte de plantas de maís ou célula vegetal de maís é empilhada com qualquer combinação de sequências de polinucleotídeos de interesse a fim de criar plantas com uma combinação de traços desejada.[0048] In some embodiments, the Ht1 polynucleotides disclosed herein can be manipulated in a molecular stack. Thus, the various maize plants, maize plant cells and maize seeds disclosed herein may additionally comprise one or more traits of interest, and in more specific embodiments, the maize plant, part of maize plants or The maize plant cell is stacked with any combination of polynucleotide sequences of interest in order to create plants with a desired combination of traits.
[0049] Para uso no presente documento, o termo "empilhado" inclui ter os múltiplos traços presentes na mesma planta ou organismo de interesse. Em um exemplo não limitador, "traços empilhados" compreendem uma pilha molecular em que as sequências são fisicamente adjacentes entre si. Um traço, conforme usado no presente documento, se refere ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências.[0049] For use herein, the term "stacked" includes having multiple traits present in the same plant or organism of interest. In a non-limiting example, "stacked traces" comprise a molecular stack in which the sequences are physically adjacent to each other. A trait, as used herein, refers to the phenotype derived from a particular sequence or groups of sequences.
[0050] Um construto de DNA de polinucleotídeo descrito no presente documento também pode compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam um polipeptídeo selecionado dentre o grupo que consiste em: um polipeptídeo que confere resistência à doença, um polipeptídeo que confere resistência a herbicida, um polipeptídeo que confere resistência a inseto, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de carboidrato, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de ácido graxo, um polipeptídeo envolvido em metabolismo de aminoácido, um polipeptídeo envolvido em desenvolvimento de planta, um polipeptídeo envolvido em regulação de crescimento de planta, um polipeptídeo envolvido em aprimoramento de rendimento, um polipeptídeo envolvido em resistência à seca, um polipeptídeo envolvido em resistência ao frio, um polipeptídeo envolvido em resistência ao calor e/ou um polipeptídeo envolvido em resistência ao sal, em que cada sequência de ácidos nucleicos heteróloga é ligada de modo operacional a um promotor.[0050] A polynucleotide DNA construct described herein may also comprise one or more heterologous nucleic acid sequences encoding a polypeptide selected from the group consisting of: a polypeptide that confers resistance to disease, a polypeptide that confers resistance to herbicide, a polypeptide that confers insect resistance, a polypeptide involved in carbohydrate metabolism, a polypeptide involved in fatty acid metabolism, a polypeptide involved in amino acid metabolism, a polypeptide involved in plant development, a polypeptide involved in growth regulation plant, a polypeptide involved in yield enhancement, a polypeptide involved in drought resistance, a polypeptide involved in cold resistance, a polypeptide involved in heat resistance and/or a polypeptide involved in salt resistance, wherein each sequence of Heterologous nucleic acids are operably linked to a promoter.
[0051] Um polipeptídeo que confere resistência à doença pode ser um outro polipeptídeo que confere resistência à helmintosporiose (NLB). Por exemplo, um construto de DNA de polinucleotídeo pode compreender um alelo resistente de Ht1 e um alelo resistente de NLB18 (no documento sob o no WO2011163590). A sequência de aminoácidos do polipeptídeo NLB18 da linhagem PH99N é apresentada no presente documento como SEQ ID NO:11; a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NLB18 da linhagem PH26N é apresentada no presente documento como SEQ ID NO:12. Tanto PH99N como PH26N são linhagens de maís que mostram resistência à helmintosporiose que reflete diferentes fontes de resistência em relação ao cromossomo 8 QTL, conforme descrito no pedido no WO2011163590. Um alelo resistente de NLB18 pode codificar um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 99% de identidade de sequência quando comparada com SEQ ID NO:11 ou 12, com base no método CLUSTAL W de alinhamento com parâmetros padrão.[0051] A polypeptide that confers resistance to the disease may be another polypeptide that confers resistance to helminthosporiosis (NLB). For example, a polynucleotide DNA construct may comprise a resistant allele of Ht1 and a resistant allele of NLB18 (in WO2011163590). The amino acid sequence of the NLB18 polypeptide of the PH99N strain is presented herein as SEQ ID NO:11; the amino acid sequence of the NLB18 polypeptide of the PH26N strain is presented herein as SEQ ID NO:12. Both PH99N and PH26N are maize lines that show resistance to helminthosporiosis that reflects different sources of resistance in relation to chromosome 8 QTL, as described in the application in WO2011163590. A resistant allele of NLB18 can encode a polypeptide that has an amino acid sequence of at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, or 99% sequence identity when compared with SEQ ID NO:11 or 12, based on the CLUSTAL W alignment method with standard parameters.
[0052] "Exserohilumturcicum", mencionado anteriormente como Helminthosporiumturcicum, é o patógeno fúngico que induz a infecção por helmintosporiose. O patógeno fúngico também é mencionado no presente documento como Exserohilum ou Et.[0052] "Exserohilumturcicum", previously mentioned as Helminthosporiumturcicum, is the fungal pathogen that induces helminthosporiosis infection. The fungal pathogen is also referred to herein as Exserohilum or Et.
[0053] "Resistência à doença" (como, por exemplo, resistência à helmintosporiose) é uma característica de uma planta, em que a planta evita os sintomas de doença que são o resultado de interações de patógeno e planta, como interações de maís e Exserohilumturcicum. Isto é, os patógenos são impedidos de causar doenças de planta e os sintomas de doença associados, ou alternativamente, os sintomas de doença causados pelo patógeno são minimizados ou reduzidos. Um versado na técnica irá observar que as composições e métodos revelados no presente documento podem ser usados com outras composições e métodos disponíveis na técnica para proteger plantas contra o ataque de patógenos.[0053] "Disease resistance" (such as, for example, resistance to helminthosporiosis) is a characteristic of a plant, in which the plant avoids disease symptoms that are the result of pathogen and plant interactions, such as apple and Exserohilumturcicum. That is, pathogens are prevented from causing plant disease and associated disease symptoms, or alternatively, disease symptoms caused by the pathogen are minimized or reduced. One skilled in the art will appreciate that the compositions and methods disclosed herein can be used with other compositions and methods available in the art to protect plants against pathogen attack.
[0054] "Resistência" é um termo relativo, que indica que a planta infectada produz um melhor rendimento de maís do que outra planta mais suscetível tratada de modo semelhante. Isto é, as condições causam uma diminuição reduzida em sobrevivência e/ou rendimento de maís em uma planta de maís tolerante, em comparação com uma planta de maís suscetível. Um versado na técnica irá observar que a resistência da planta de maís a helmintosporiose ou ao patógeno que causa a mesma, pode representar um espectro de fenótipos mais resistentes ou menos resistentes, e pode variar dependendo da gravidade da infecção. Entretanto, por meio de uma simples observação, uma pessoa de habilidade na técnica pode determinar a resistência ou suscetibilidade relativa de diferentes plantas, linhagens de planta ou famílias de planta a helmintosporiose e, adicionalmente, reconhecerão também as gradações fenotípicas de "resistente". Por exemplo, pode ser usada uma classificação visual de 1 a 9 que indica o nível de resistência à helmintosporiose. Uma pontuação maior indica uma resistência maior. Os dados deveriam ser coletados apenas quando existir pressão de seleção suficiente no experimento medido. Os termos "tolerância" e "resistência" são usados de forma intercambiável no presente documento.[0054] "Resistance" is a relative term, which indicates that the infected plant produces a better yield of apples than another more susceptible plant treated in a similar way. That is, the conditions cause a reduced decrease in survival and/or maize yield in a tolerant maize plant, compared to a susceptible maize plant. One skilled in the art will observe that the resistance of the maize plant to helminthosporiosis or the pathogen that causes it, may represent a spectrum of more resistant or less resistant phenotypes, and may vary depending on the severity of the infection. However, through simple observation, a person skilled in the art can determine the relative resistance or susceptibility of different plants, plant lines or plant families to helminthosporiosis and, additionally, will also recognize the phenotypic gradations of "resistant". For example, a visual rating from 1 to 9 may be used that indicates the level of resistance to helminthosporiosis. A higher score indicates greater resistance. Data should only be collected when there is sufficient selection pressure in the measured experiment. The terms "tolerance" and "resistance" are used interchangeably in this document.
[0055] A resistência pode ser "recém-conferida" ou "otimizada". A resistência "recém-conferida" ou "otimizada" se refere a um nível aumentado de resistência contra um patógeno particular, um amplo espectro de patógenos ou uma infecção causada pelo patógeno (ou patógenos). Um nível aumentado de resistência contra um patógeno fúngico particular, como Et, por exemplo, constitui resistência fúngica aprimorada ou "otimizada". As modalidades da invenção irão otimizar ou aprimorar a resistência a patógenos vegetais fúngicos, de modo que a resistência da planta a um patógeno ou patógenos fúngicos aumente, que, por sua vez, irá aumentar a resistência à doença causada pelo patógeno fúngico. O termo "otimizar" se refere a aprimorar, aumentar, amplificar, multiplicar, elevar, crescer e semelhantes.[0055] Resistance can be "freshly checked" or "optimized". "Newly conferred" or "optimized" resistance refers to an increased level of resistance against a particular pathogen, a broad spectrum of pathogens, or an infection caused by the pathogen (or pathogens). An increased level of resistance against a particular fungal pathogen, such as Et, for example, constitutes enhanced or "optimized" fungal resistance. Embodiments of the invention will optimize or enhance resistance to fungal plant pathogens, such that the plant's resistance to a fungal pathogen or pathogens increases, which, in turn, will increase resistance to disease caused by the fungal pathogen. The term "optimize" refers to enhancing, increasing, amplifying, multiplying, elevating, growing, and the like.
[0056] As plantas de maís geradas pelos métodos descritos no presente documento podem fornecer resistência de amplo espectro e durável para a planta de maís e pode auxiliar no melhoramento genético de plantas de maís resistentes a helmintosporiose. Por exemplo, se múltiplos genes de resistência à helmintosporiose forem empilhados em uma unidade, isso reduz o número de loci específicos que exigem introgressão de traço através de retrocruzamento e minimiza o arraste de ligação de doadores resistentes não de elite.[0056] The maize plants generated by the methods described herein can provide broad-spectrum and durable resistance to the maize plant and can assist in the genetic improvement of maize plants resistant to helminthosporiosis. For example, if multiple helminthosporiosis resistance genes are stacked into one unit, this reduces the number of specific loci that require trait introgression through backcrossing and minimizes linkage carryover from non-elite resistant donors.
[0057] Diversos métodos podem ser usados para introduzir uma sequência de interesse em uma célula vegetal de maís, planta de maís ou parte de plantas de maís. "Introduzir" se destina a significar apresentar à célula vegetal de maís, planta de maís ou parte de plantas de maís o polinucleotídeo de tal maneira que a sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta de maís. Os métodos da revelação não dependem de um método particular para introduzir uma sequência em um organismo, uma planta de maís ou parte de plantas de maís, apenas que o polinucleotídeo ganha acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta de maís. Os métodos para introduzir polinucleotídeosem diversos organismos, incluindo plantas de maís, são conhecidos na técnica, incluindo, porém sem limitação, métodos de transformação estável, métodos de transformação temporária e métodos mediados por vírus.[0057] Various methods can be used to introduce a sequence of interest into a maize plant cell, maize plant or part of maize plants. "Introduce" is intended to mean presenting to the maize plant cell, maize plant or part of maize plants the polynucleotide in such a manner that the sequence gains access to the interior of a maize plant cell. The methods of disclosure do not depend on a particular method for introducing a sequence into an organism, a maize plant or part of a maize plant, only that the polynucleotide gains access to the interior of at least one cell of the maize plant. Methods for introducing polynucleotides into various organisms, including apple plants, are known in the art, including, but not limited to, stable transformation methods, temporary transformation methods, and virus-mediated methods.
[0058] "Transformação estável" se destina a significar que o construto de polinucleotídeo introduzido em uma planta de maís se integra no genoma da planta de maís e que tem capacidade para ser herdado pela progênie do mesmo. "Transformação temporária" se destina a significar que um polinucleotídeo é introduzido na planta de maís e não se integra no genoma da planta de maís.[0058] "Stable transformation" is intended to mean that the polynucleotide construct introduced into a maize plant integrates into the maize plant genome and that it has the capacity to be inherited by its progeny. "Temporary transformation" is intended to mean that a polynucleotide is introduced into the maize plant and does not integrate into the maize plant genome.
[0059] Os protocolos de transformação, bem como os protocolos para a introdução de sequências de polinucleotídeos em plantas, como maís, podem variar. Os métodos adequados para introduzir polinucleotídeos em células de planta de maís incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 a 334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 83:5.602 a 5.606, transformação mediada por Agrobacterium (patente no U.S. 5.563.055 e patente no U.S. 5.981.840), transferência de gene direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2.717 a 2.722) e aceleração de partícula balística (consulte, por exemplo, patente no U.S. 4.945.050; patente no U.S. 5.879.918; patente no U.S. 5.886.244; e 5.932.782; Tomes et al. (1995) emPlant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923 a 926); e transformação de Lec1 (WO 00/28058). Consultetambém Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:4.305 a 4.309 (maís); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559 a 563 (maís); patentesnos U.S. 5.240.855; 5.322.783; e 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440 a 444 (maís); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833 a 839 (maís); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 311:763 a 764; patente no U.S. 5.736.369 (cereais); De Wet et al. (1985) emThe Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, Nova Iorque), páginas 197 a 209 (pólen); D'Halluin et al. (1992) PlantCell 4:1.495 a 1.505 (eletroporação); e Osjoda et al. (1996) NatureBiotechnology 14:745 a 750 (maís através de Agrobacteriumtumefaciens); todos os quais estão incorporados ao presente documento a título de referência.[0059] Transformation protocols, as well as protocols for introducing polynucleotide sequences into plants, such as maize, may vary. Suitable methods for introducing polynucleotides into maize plant cells include microinjection (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320 to 334), electroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5,602 to 5,606, Agrobacterium-mediated transformation (U.S. patent 5,563,055 and U.S. patent 5,981,840), direct gene transfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2,717 to 2,722), and ballistic particle acceleration (see, for example, U.S. Patent 4,945,050; U.S. Patent 5,879,918; U.S. Patent 5,886,244; and 5,932,782; Tomes et al. (1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods , ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. Natl. Sci. US 85:4,305 to 4,309 (Mais); al. (1988) Plant Physiol. 91:440 to 444 (more); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833 to 839 (more); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763 to 764; U.S. patent 5,736,369 (cereals); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pages 197 to 209 (pollen); D'Halluin et al. (1992) PlantCell 4:1,495 to 1,505 (electroporation); and Osjoda et al. (1996) NatureBiotechnology 14:745 to 750 (more via Agrobacteriumtumefaciens); all of which are incorporated herein by reference.
[0060] Em outras modalidades, o polinucleotídeoHt1 revelado no presente documento pode ser introduzido em plantas colocando- se as plantas em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais. Em geral, tais métodos envolvem incorporar um construto de polinucleotídeo da revelação dentro de uma molécula de RNA ou DNA. É reconhecido que a sequência de Ht1 pode ser inicialmente sintetizada como parte de uma poliproteína viral, o que mais tarde pode ser processado por proteólise in vivo ou in vitro para produzir a proteína recombinante desejada. Adicionalmente, é reconhecido que os promotores revelados no presente documento podem também abranger promotores usados para a transcrição por RNA polimerases virais. Os métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas e expressar uma proteína codificada nos mesmos, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, as Patentes nos U.S. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931, e Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209 a 221; incorporados ao presente documento, a título de referência.[0060] In other embodiments, the Ht1 polynucleotide disclosed herein can be introduced into plants by placing the plants in contact with a virus or viral nucleic acids. In general, such methods involve incorporating a polynucleotide construct of the disclosure within an RNA or DNA molecule. It is recognized that the Ht1 sequence can be initially synthesized as part of a viral polyprotein, which can later be processed by proteolysis in vivo or in vitro to produce the desired recombinant protein. Additionally, it is recognized that the promoters disclosed herein may also encompass promoters used for transcription by viral RNA polymerases. Methods for introducing polynucleotides into plants and expressing a protein encoded therein, involving viral DNA or RNA molecules, are known in the art. See, for example, U.S. Patents 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367, 5,316,931, and Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209 to 221; incorporated into this document by reference.
[0061] São conhecidos na técnica métodos para a inserção direcionada de um polinucleotídeo em uma localização específica no genoma da planta. Em uma modalidade, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é alcançada com o uso de um sistema de recombinação específico de local. Consulte, por exemplo, os documentos nos WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, em que os mesmos são incorporados ao presente documento, a título de referência. Brevemente, o polinucleotídeo revelado no presente documento pode estar contido em cassete de transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não recombinogênicos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta que tem estavelmente incorporado em seu genoma um sítio-alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não recombinogênicos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase apropriada é fornecida e o cassete de transferência é integrado no sítio direcionado. O polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma de planta. Outros métodos para direcionar polinucleotídeos são apresentados no documento sob o no WO 2009/114321 (incorporado ao presente documento a título de referência), que descreve meganucleases "personalizadas" produzidas para modificar genomas de planta, em particular o genoma de maís. Consulte, também, Gao et al. (2010) PlantJournal 1:176 a 187.[0061] Methods for the targeted insertion of a polynucleotide at a specific location in the plant genome are known in the art. In one embodiment, insertion of the polynucleotide into a desired genomic location is achieved using a site-specific recombination system. See, for example, documents WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 and WO99/25853, where they are incorporated herein by reference. Briefly, the polynucleotide disclosed herein may be contained in a transfer cassette flanked by two non-recombinogenic recombination sites. The transfer cassette is introduced into a plant that has stably incorporated into its genome a target site that is flanked by two non-recombinogenic recombination sites that correspond to the transfer cassette sites. An appropriate recombinase is provided and the transfer cassette is integrated into the targeted site. The polynucleotide of interest is thus integrated into a specific chromosomal position in the plant genome. Other methods for targeting polynucleotides are presented in WO 2009/114321 (incorporated herein by reference), which describes "custom" meganucleases produced to modify plant genomes, in particular the maize genome. See also Gao et al. (2010) PlantJournal 1:176 to 187.
[0062] As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas, de acordo com maneiras convencionais. Consulte, porexemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 a 84. Essas plantas podem ser, então, cultivadas e polinizadas com a mesma cepa transformada ou cepas diferentes, e a progênie resultante que tem expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja estavelmente mantida e herdada e, então, as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada tenha sido atingida. Dessa maneira, a presente revelação fornece semente transformada (também mencionada como "semente transgênica") que tem um polinucleotídeo revelado no presente documento, por exemplo, como parte de um cassete de expressão, estavelmente incorporado em seu genoma.[0062] Cells that have been transformed can be grown into plants in accordance with conventional ways. See, for example, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81 to 84. These plants can then be grown and pollinated with the same transformed strain or different strains, and the resulting progeny that have constitutive expression of the desired phenotypic trait identified. Two or more generations can be grown to ensure that expression of the desired phenotypic trait is stably maintained and inherited, and then seeds harvested to ensure that expression of the desired phenotypic trait has been achieved. Thus, the present disclosure provides transformed seed (also referred to as "transgenic seed") that has a polynucleotide disclosed herein, for example, as part of an expression cassette, stably incorporated into its genome.
[0063] As células de planta de maís transformadas que são derivadas por meio de técnicas de transformação de planta, incluindo aquelas discutidas acima, podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possui o genótipo transformado (isto é, um polinucleotídeoHt1 que codifica um polipeptídeo que confere resistência à helmintosporiose), e, dessa forma, o fenótipo desejado, como resistência à helmintosporiose, se essa resistência for recém-conferira ou otimizada. Para transformação e regeneração de maís consulte Gordon-Kamm et al., The PlantCell, 2:603 a 618 (1990). A regeneração de planta a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans et al. (1983) Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124 a 176, Macmillan Publishing Company, Nova Iorque; e Binding (1985) Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21 a 73, CRC Press, Boca Raton. A regeneração também pode ser obtida a partir de calo de planta, explantes, órgãos ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração são descritas, de modo geral, em Klee et al. (1987) Ann RevofPlantPhys 38:467. Consulte também, por exemplo, Payne e Gamborg.[0063] Transformed maize plant cells that are derived through plant transformation techniques, including those discussed above, can be cultivated to regenerate a whole plant that has the transformed genotype (i.e., an Ht1 polynucleotide encoding a which confers resistance to helminthosporiosis), and thus the desired phenotype, such as resistance to helminthosporiosis, if that resistance is newly conferred or optimized. For maize transformation and regeneration see Gordon-Kamm et al., The PlantCell, 2:603 to 618 (1990). Plant regeneration from cultured protoplasts is described in Evans et al. (1983) Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pages 124 to 176, Macmillan Publishing Company, New York; and Binding (1985) Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pages 21 to 73, CRC Press, Boca Raton. Regeneration can also be obtained from plant callus, explants, organs or parts thereof. Such regeneration techniques are generally described in Klee et al. (1987) Ann RevofPlantPhys 38:467. See also, for example, Payne and Gamborg.
[0064] Um versado na técnica reconhecerá que após o cassete de expressão que contém o gene Ht1 ser estavelmente incorporado nas plantas transgênicas e confirmado como operacional, o mesmo pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer uma dentre um número de técnicas de melhoramento genético padrão pode ser usada, dependendo das espécies a serem cruzadas.[0064] One skilled in the art will recognize that after the expression cassette containing the Ht1 gene is stably incorporated into transgenic plants and confirmed as operational, it can be introduced into other plants by sexual crossing. Any of a number of standard genetic improvement techniques can be used, depending on the species to be crossed.
[0065] Em algumas modalidades, os métodos compreendem introduzir por meio da expressão em uma célula vegetal de maís regenerável um construto de polinucleotídeo que compreende um polinucleotídeo ligado de maneira operacional a pelo menos uma sequência reguladora, em que o polinucleotídeo codifica um alelo resistente do gene Ht1 apresentado no presente documento, e gerar uma planta de maís que tem resistência à helmintosporiose a partir da célula vegetal de maís. A planta de maís gerada pelo método compreende o construto de polinucleotídeo em seu genoma. A sequência reguladora pode ser um promotor e/ou um terminador e pode ser nativa ao maís. Em algumas modalidades, a sequência reguladora é nativa ao gene Ht1. Uma planta de progênie que compreende o construto de polinucleotídeo também pode ser gerada por meio do cruzamento da planta de maís gerada pelo método com uma segunda planta de maís que não compreende em seu genoma o construto de polinucleotídeo. Em algumas modalidades, o gene Ht1 é superexpresso (como um fragmento genômico ou cDNA) para conferir resistência maior que o nível de expressão no estado nativo.[0065] In some embodiments, the methods comprise introducing through expression into a regenerable maize plant cell a polynucleotide construct comprising a polynucleotide operatively linked to at least one regulatory sequence, wherein the polynucleotide encodes a resistant allele of the Ht1 gene presented in this document, and generate a maize plant that has resistance to helminthosporiosis from the maize plant cell. The maize plant generated by the method comprises the polynucleotide construct in its genome. The regulatory sequence may be a promoter and/or a terminator and may be native to most. In some embodiments, the regulatory sequence is native to the Ht1 gene. A progeny plant comprising the polynucleotide construct can also be generated by crossing the maize plant generated by the method with a second maize plant that does not comprise the polynucleotide construct in its genome. In some embodiments, the Ht1 gene is overexpressed (as a genomic fragment or cDNA) to confer resistance greater than the level of expression in the native state.
[0066] Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, as reivindicações anexas. É entendido que os exemplos e modalidades descritos no presente documento são apenas para propósitos ilustrativos e que pessoas versadas na técnica reconhecerão vários reagentes ou parâmetros que podem ser alterados sem se afastar do espírito da invenção ou do escopo das reivindicações anexas.[0066] The following examples are offered to illustrate, but not limit, the appended claims. It is understood that the examples and embodiments described herein are for illustrative purposes only and that persons skilled in the art will recognize various reagents or parameters that can be changed without departing from the spirit of the invention or the scope of the appended claims.
[0067] Uma grande população derivada do retrocruzamento foi criada para o mapeamento fino de um QTL de resistência à helmintosporiose situado no cromossomo 2. A população foi criada de um cruzamento entre a linhagem resistente PH4GP (pontuação = 9) e a linhagem suscetível PH5W4 (pontuação = 1), e a linhagem suscetível foi usada como o parental recorrente. Os indivíduos BC5 foram pontuados acerca da infecção por helmintosporiose com o uso do método de fenotipagem revelado na patente no US 8.921.646. Os dados de recombinação de marcador de um grande conjunto de indivíduos da população 2 colocaram o gene em uma região de 18 kb no genoma B73, abrangendo uma fosfatase de proteína putativa 2C, uma proteína dedo de zinco do tipo PHD putativa e uma proteína de resistência à doença putativa. Não há EST conhecido para a proteína de resistência à doença putativa; ademais, com base na sequência de genes prevista B73, a proteína de resistência à doença putativa tem baixa expressão constitutiva.[0067] A large backcross-derived population was created for fine mapping of a helminthosporiosis resistance QTL located on chromosome 2. The population was created from a cross between the resistant lineage PH4GP (score = 9) and the susceptible lineage PH5W4 ( score = 1), and the susceptible strain was used as the recurrent parent. BC5 individuals were scored for helminthosporiosis infection using the phenotyping method disclosed in US patent 8,921,646. Marker recombination data from a large set of individuals from population 2 placed the gene in an 18 kb region in the B73 genome, encompassing a putative 2C protein phosphatase, a putative PHD-type zinc finger protein, and a resistance protein to the putative disease. There is no known EST for the putative disease resistance protein; Furthermore, based on the predicted B73 gene sequence, the putative disease resistance protein has low constitutive expression.
[0068] Uma biblioteca de BAC de doador resistente PH4GP foi construída, e um clone de BAC que cobre o intervalo de Ht1 foi identificado e sequenciado. O intervalo de Ht1 em PH4GP foi menor que 10 kb, com apenas um único gene anotado que codifica um gene CC-NB-LRR (do inglês Coiled-Coil, Nucleotide-Binding, Leucine- RichRepeat, super hélice, ligação a nucleotídeo, repetição rica em leucina) putativo. As sequências de cDNA de Ht1 de PH4GP e de PH1W2 (uma outra fonte de um alelo resistente de Ht1; US2010095395) são representadas pelas SEQ ID NOs:1 e 3, respectivamente, enquanto que as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos codificados são representados pela SEQ ID NO:2 e 4. B73 tem duas variantes de splicing, e a variante inovadora expressa em um nível muito maior (mencionado no presente documento como B73-alto) que a variante conhecida (mencionada no presente documento como B73-baixo). A SEQ ID NO:5 é a sequência de cDNA do alelo B73-alto, enquanto que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado é representado pela SEQ ID NO:6. A SEQ ID NO:7 é a sequência de cDNA do alelo B73-baixo, enquanto que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado é representado pela SEQ ID NO:8.[0068] A PH4GP resistant donor BAC library was constructed, and a BAC clone covering the Ht1 range was identified and sequenced. The Ht1 interval in PH4GP was less than 10 kb, with only a single annotated gene encoding a CC-NB-LRR (Coiled-Coil, Nucleotide-Binding, Leucine-RichRepeat, super helix, nucleotide-binding, repeat rich in leucine) putative. The Ht1 cDNA sequences of PH4GP and PH1W2 (another source of a resistant allele of Ht1; US2010095395) are represented by SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively, while the amino acid sequences of the encoded polypeptides are represented by SEQ ID NO:2 and 4. B73 has two splice variants, and the novel variant expressed at a much higher level (referred to herein as B73-high) than the known variant (referred to herein as B73-low). SEQ ID NO:5 is the cDNA sequence of the B73-high allele, while the amino acid sequence of the encoded polypeptide is represented by SEQ ID NO:6. SEQ ID NO:7 is the cDNA sequence of the B73-low allele, while the amino acid sequence of the encoded polypeptide is represented by SEQ ID NO:8.
[0069] As Figuras 1A a 1D mostram que os domínios CC e NB são altamente similares entre o alelo suscetível (de B73) e alelos resistentes (de PH4GP e PH1W2). Entretanto, ambos os alelos B73 têm uma deleção no LRR (mostrado enquadrado na Figura 1C). A sequência de aminoácidos dessa região nos alelos resistentes de Ht1 é representada pela SEQ ID NO:10.[0069] Figures 1A to 1D show that the CC and NB domains are highly similar between the susceptible allele (from B73) and resistant alleles (from PH4GP and PH1W2). However, both B73 alleles have a deletion in the LRR (shown in frame in Figure 1C). The amino acid sequence of this region in resistant alleles of Ht1 is represented by SEQ ID NO:10.
[0070] Um construto que contém a sequência genômica do alelo PH4GP (resistente) (SEQ ID NO:9) foi gerado e transformado em uma linhagem de transformação suscetível com o uso de transformação mediada por Agrobacterium. A sequência genômica (SEQ ID NO:9) continha o promotor nativo, éxons, íntron e regiões terminadoras. As plantas transgênicas regeneradas foram plantadas em uma estufa, e uma análise quantitativa de PCR foi feita para confirmar a inserção do cassete de T-DNA que contém a sequência genômica do alelo PH4GP (resistente). Muitos dos eventos tiveram uma única cópia do inserto de T-DNA, que foi confirmada por qPCR com o uso de quatro marcadores de flanqueamento. Com base nos dados de marcador, dos 50 eventos, 41 foram positivos para o inserto e 9 foram negativos (nulos).[0070] A construct containing the genomic sequence of the PH4GP (resistant) allele (SEQ ID NO:9) was generated and transformed into a susceptible transformation line using Agrobacterium-mediated transformation. The genomic sequence (SEQ ID NO:9) contained the native promoter, exons, intron and terminator regions. The regenerated transgenic plants were planted in a greenhouse, and a quantitative PCR analysis was performed to confirm the insertion of the T-DNA cassette containing the genomic sequence of the PH4GP (resistant) allele. Many of the events had a single copy of the T-DNA insert, which was confirmed by qPCR using four flanking markers. Based on marker data, of the 50 events, 41 were positive for the insert and 9 were negative (null).
[0071] Todos os eventos foram testados na estufa acerca da eficácia contra o patógeno de helmintosporiose (Exserohilumturcicum). Primeiramente, todos os eventos foram provocados com a espécie 0 do patógeno para qual o gene Ht1 é conhecido por fornecer resistência; então, os eventos foram submetidos à espécie 1, para qual Ht1 não fornece resistência. Todos os eventos positivos, conforme determinado por qPCR, foram resistentes à espécie 0, e todos os eventos negativos foram suscetíveis à espécie 0. Conforme esperado, todos os eventos foram suscetíveis à espécie 1.[0071] All events were tested in the greenhouse for effectiveness against the helminthosporiosis pathogen (Exserohilumturcicum). First, all events were triggered with species 0 of the pathogen to which the Ht1 gene is known to provide resistance; therefore, events were subjected to species 1, to which Ht1 provides no resistance. All positive events, as determined by qPCR, were resistant to species 0, and all negative events were susceptible to species 0. As expected, all events were susceptible to species 1.
[0072] As plantas de maís resistentes a helmintosporiose que expressam o gene Ht1 de maís podem ser produzidas com o uso de transformação à base de DNA recombinante, por exemplo. Os métodos de transformação à base de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica, por exemplo, transformações à base de bombardeamento de partículas e mediadas por Agrobacteriumtumefaciens. Em relação à transformação de planta à base de Agrobacteriumtumefaciens, os vetores são construídos de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Os vetores contêm um inserto de T-DNA que tem um promotor, um íntron, um intensificador opcional, como um elemento intensificador 35S, um DNA de variante de Ht1 que confere resistência à helmintosporiose, e um terminador de planta. Os embriões imaturos de maís são removidos por excisão e infectados com um vetor de Agrobacteriumtumefaciens que contém a variante de Ht1 de interesse. Após a infecção, os embriões são transferidos e cultivados em meio de cocultivo. Após o cocultivo, os embriões imaturos infectados são transferidos em meios para desenvolver calos transgênicos. Os tecidos de calo transgênico putativo são amostrados com o uso de PCR e opcionalmente um ensaio Western para confirmar a presença do gene variante de Ht1. Os tecidos de calo transgênico putativo são mantidos em meios para o crescimento adicional e seleção antes da regeneração da planta. Na regeneração, o tecido de calo confirmado como sendo transgênico é transferido em meio de maturação e cultivado para maturação de embrião somática. Os embriões maduros são, então, transferidos em meio de regeneração para formação de raiz e broto. Depois que os brotos e raízes emergem, as plântulas individuais são transferidas em tubos com meio de enraizamento. As plântulas com brotos e raízes estabelecidas são transplantadas em vasos na estufa para o crescimento adicional e para produzir semente T1.[0072] Helminthosporiosis-resistant apple plants that express the apple Ht1 gene can be produced using recombinant DNA-based transformation, for example. Recombinant DNA-based transformation methods are well known in the art, for example, particle bombardment-based and Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformations. In relation to Agrobacteriumtumefaciens-based plant transformation, the vectors are constructed according to methods known in the art. The vectors contain a T-DNA insert that has a promoter, an intron, an optional enhancer such as a 35S enhancer element, an Ht1 variant DNA that confers resistance to helminthosporiosis, and a plant terminator. Immature apple embryos are removed by excision and infected with an Agrobacteriumtumefaciens vector that contains the Ht1 variant of interest. After infection, embryos are transferred and cultured in coculture medium. After co-cultivation, infected immature embryos are transferred into media to develop transgenic callus. Putative transgenic callus tissues are sampled using PCR and optionally a Western assay to confirm the presence of the Ht1 variant gene. Putative transgenic callus tissues are maintained in media for further growth and selection prior to plant regeneration. In regeneration, callus tissue confirmed to be transgenic is transferred into maturation medium and cultured for somatic embryo maturation. The mature embryos are then transferred into regeneration medium for root and shoot formation. After shoots and roots emerge, individual plantlets are transferred into tubes with rooting medium. Seedlings with established shoots and roots are transplanted into pots in the greenhouse for further growth and to produce T1 seed.
[0073] Adicionalmente, um construto de DNA que contém um DNA variante de Ht1 que confere resistência à helmintosporiose também pode incluir um outro gene que codifica um polipeptídeo que confere resistência à helmintosporiose, como o gene que codifica NLB18 (no documento sob o no WO2011163590) . Tanto PH99N como PH26N são linhagens de maís que mostram resistência à helmintosporiose que reflete diferentes fontes de resistência em relação ao cromossomo 8 QTL, conforme descrito no pedido no WO2011163590. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo NLB18 da linhagem PH99N é apresentada no presente documento como SEQ ID NO:11; a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NLB18 da linhagem PH26N é apresentada no presente documento como SEQ ID NO:12. A introdução de Ht1 e NLB18 em uma planta pode ter o efeito de aumento da resistência à espécie 0 do patógeno Exserohilumturcicume/ou pode fornecer resistência a uma espécie ou espécies adicionais (por exemplo, espécie 1), para qual o gene Ht1 não fornece resistência.[0073] Additionally, a DNA construct that contains an Ht1 variant DNA that confers resistance to helminthosporiosis can also include another gene that encodes a polypeptide that confers resistance to helminthosporiosis, such as the gene that encodes NLB18 (in document under WO2011163590 ) . Both PH99N and PH26N are maize lines that show resistance to helminthosporiosis that reflects different sources of resistance in relation to chromosome 8 QTL, as described in the application in WO2011163590. The amino acid sequence of the NLB18 polypeptide of the PH99N strain is presented herein as SEQ ID NO:11; the amino acid sequence of the NLB18 polypeptide of the PH26N strain is presented herein as SEQ ID NO:12. Introduction of Ht1 and NLB18 into a plant may have the effect of increasing resistance to species 0 of the pathogen Exserohilumturcicume/or may provide resistance to an additional species or species (e.g., species 1) to which the Ht1 gene does not provide resistance. .
Claims (8)
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| US201562242691P | 2015-10-16 | 2015-10-16 | |
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